DE2050672C3 - Durchflußküvette zur mikroskopfotometrischen Messung von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen - Google Patents

Description

Bahn des Teilchens in der Öffnung abhängt. Das ist •to der Fall, wenn die Ausleuchtung der Öffnung gleich-

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem mäßig, z. B. nach dem Köhlerschcn Beleuchtungs-Oberbegriff des Anspruchs 1 und eine Durchflußkü- prinzip erfolgt. Dann sind mit diesem Verfahren vette zur Durchführung des Verfahrens. Meßgenauigkeiten von einigen Prozent zu erzielen,

Diese Messung hat heute in der Medizin für die wie sie für viele medizinische und biologische Frage-Untersuchung von Zellen besondere Bedeutung, da 45 Stellungen erforderlich sind.

in vielen Fällen die reine Zählung oder visuelle Nachteilig an dieser Anordnung ist, daß die öff-

Beobachtung unter dem Mikroskop nicht ausreicht. nung sorgfältig zum Mikroskopobjekt ausgerichtet

So unterscheiden sich z. B. Tumorzellen von gesun- sein muß. Geringe Fehljustierungen führen bereits zu

den Körperzellen oft durch die Menge der Desoxyri- einer verringerten Meßgenauigkeit, da gleiche Teil-

bonukleinsäure, die in den Zellen enthalten ist. Eine 50 chen, die auf verschiedenen Bahnen durch die öff-

schnelle und automatische Mengenbestimmung von nung treten, unterschiedliche Signale hervorrufen.

Zellinhaltsstoffen ist also ein wichtiges diagnostisches Ein weiterer Nachteil dieser Anordnung besteht

Hilfsmittel. darin, daß die parallel zur Beleuchtungs- und Beob-

Bekannt sind bereits mehrere Verfahren und Vor- achtungsnehtung durch die Öffnung strömende Teilrichtungen, die zur automatischen Zählung von ein- 5,5 chensuspension vor dem Mikroskopobjektiv rechtzelnen Teilchen in Suspension, insbesondere von winklig zur Seite hin abgelenkt werden muß, um sie Blutzellen, geeignet sind. Diesen Verfahren ist ge- aus dem Meßbereich zu führen. Dadurch entsteht meinsam, daß die Suspension durch eine Öffnung mit eine Unsymmetrie der Teilchenbahnen in bezug auf kleinem Querschnitt strömt, den die Teilchen nach- Beleuchtungs- und Beobachtungsrichtung, die zu einander passieren. Bei einem Verfahren werden die 60 einer verringerten Meßgenauigkeit führt. Wenn es Teilchen in dieser Öffnung auf Grund einer elektri- nicht gelingt, den Teilchenstrom vor Erreichen des sehen Widerstands- oder Kapazitätsänderung nach- Deckglases, das die Flüssigkeit vom Mikroskopobgevviesen. Dieses Nachweisverfahren ergibt für jedes jektiv fernhält, abzulenken, so verschmutzt das Teilchen ein elektrisches Signal, dessen Amplitude Deckglas, und kontinuierliche Messungen sind nicht vom Volumen des Teilchens und von seiner Bahn in- 65 möglich.

nerhalb der Öffnung abhängt. Eine genaue Messung Nachteilig an dieser Anordnung ist weiterhin die des Teilchenvolumcns ist möglich, wenn die Teil- Möglichkeit, daü die enge öffnung durch in der Teilchenbahn durch die MiUe der Öffnung führt. Um schensuspension niitgefiihrte größere Partikeln ver-

wenn die Wand aus durchsichtigem Material besteht und die Intensität des durchgehenen Lichtes gemessen wird. Dabei kann sowohl bei dieser Durchlichtanordnung als auch bei der Auflichtanordnung die Beleuchtung und/oder Beobachtung durch die Platte oder durch die Wand erfolgen.

Eine Verschiebung des Mikroskopobjektivs in Strömungsrichtung hat auf die Meßgenauigkeit keinen Einfluß, da längs der Strömung die Meßbedingungen, wie Abstand zwischen Teilchensuspension und Mikroskopobjektiv, Ausleuchtung, Teilchengeschwindigkeit, Breite der Strömung usw., konstant sind. Dadurch ergibt sich eine unkritische Justierung. Eine Verschmutzung der einen Wand durch die Teilschensuspension ist bei der Küvette nach dem Anspruch 2 ausgeschlossen, da sie lediglich von der teilchenfreien Flüssigkeit berührt wird. Eine Verstopfung des Kanals durch größere Partikeln kann nicht

.... _σ eintreten, da der Kanal einen konstanten Querschnitt

Richtung strömende Flüssigkeit injiziert, die die Sus- »o aufweist und die Abmessungen dieser Partikeln nicht pension allseitig umhüllt. Bei geeigneten Abmessun- auf die Schichtdicke der Teilchensuspension begen und Strömungsgeschwindigkeiten bleibt die Teil- schränkt sein müssen.

chensuspension in dem Hüllstrom auf einem zylindri- Eine parallele Strömung von Teilchensuspension

sehen Bereich mit kleinem Querschnitt beschränkt. und teilchenfreier Flüssigkeit gelingt bei Durchströ-Dadurch entfällt eine Störung der von den Teilchen as mungskammern mit den hier erforderlichen Abmeshervorgerufenen Signale durch die begrenzenden sungen von Bruchteilen eines Millimeters leicht, da Wände (deutsche Auslegeschrift 1 134 223). Nachtei- es sich nicht um turbulente, sondern um rein lamilig an diesen beiden Anordnung ist, daß eine genaue nare Strömungen handelt. So beträgt bei einer typi-Messung von Inhaltsstoffen mit Hilfe von Fluores- sehen Strömungsgeschwindigkeit von 5 m/s und einer zenzlicht mit dieser Hüllstromanordnung nicht mög- 30 Kanaltiefe von 0,1 mm die Reynolds-Zahl Re - 500. lieh ist, da zur Erzielung von Fluoreszenzlichtsigna- Dieser Wert liegt weit unter dem kritischen "'"*

stopft wird, wodurch ebenfalls die Messung unterbrochen wird.

Bei anderen bekannten Verfahren erfolgt die Beleuchtung und Beobachtung der Teilchen senkrecht zu deren Bewegungsrichtung. Dazu fließt die Teilchensuspension statt durch eine öffnung durch eine längere Kapillare von kleinem Querschnitt. Die Änderung der Intensität des beleuchtenden Lichtes durch die Absorption der Teilchen oder die Intensität des von Teilchen gestreuten Lichtes wird mit einem fotoelektrischen Detektor gemessen. Die Signalamplitude hängt auch hier außer von der Größe der Teilchen von seiner Bahn in der Kapillare, insbesondere von seinem Abstand von der seitlichen Begrenzung ab (USA.-Patentschrift 3 413 464).

Bei einer weiteren bekannten Anordnung werden diese seitlichen Begrenzungen durch einen Hüllstrom ersetzt. Dabei wird die Teilchensuspension durch eine enge Röhre in eine teilchenfreie, in gleicher

len ausreichender Intensität die Verwendung von Mikroskopobjektiven hoher Apertur erforderlich ist, diese besitzen aber nur einen Tiefenschärfenbereich von wenigen Mikrometern, in dem alle Teilchenbahnen während der Messung verlaufen müssen. Bei der bekannten Hüllstromanordnung treten stets Verlagerungen der mitgeführten Teilchensuspension senkrecht zur Bewegungsrichtung auf, die die Teilchen aus dem Tiefenschärfenbereich weit herausführen.

Daraus resultiert die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, mit welchem eine genaue optische Messung von Teilcheneigenschaften, insbesondere eine Mengenmessung von

..__e. ..... Wert

Re - 2300.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. Das Prinzip der Anordnung zeigt F i g. 1. Die Anordnung besteht aus einem Durchströmungskanal, der durch die Wand 1 und eine Platte 2 aus lichtdurchlässigem Material begrenzt wird. Die Frontlinse 3 des beleuchtenden und/oder beobachtenden Mikroskopobjektivs hoher Apertur ist so angeordnet daß die von der Wand 1 und der teilchenfreien Flüssigkeit 4 begrenzte Teilchensuspension 5 im Bereich 6 der Tiefenschärfe des Mikroskopobjektivs liegt. Durch die Wand 1 ist damit

Inhaltsstoffen möglich ist. Die Teilchen sollen dabei 45 die Lage des Teilchensuspensionsstromes zum Tiein einem strömungsförmigen Medium mitgeführt und fenschärfenbereich fixiert, während durch die teilchenfreie Flüssigkeit verhindert ist, daß Teilchen in den Bereich außerhalb der Tiefenschärfe gelangen,

automatisch eines nach dem anderen der Messung unterzogen werden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im wo sie falsche Meßergebnisse erzeugen würden.

Die Teilchensuspension und die teilchenfreie Flüssigkeit müssen vor der Meßstelle zusammengeführt werden, wobei sich mehrere Lösungen anbieten.

In der Anordnung nach F i g. 2 wird die Teilchen-

Kennzeichen des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst.

Insbesondere durch die Fluoreszenzlichtmessung werden die bekannten cytofotometrischen Identifizierungs- und Meßmöglichkeiten diesem automatischen

Durchflußverfahren zugänglich. Der Nachteil der cy- 55 suspension S durch eine öffnung 7 in der Wand 1 dei tofotometrischen Verfahren, bei denen sich die Teil- bereits im Kanal strömenden teilchenfreien Flüssigehen auf Objektträgern befinden und jeweils vom Bedienungspersonal einzeln ausgesucht, eingestellt und
gemessen werden müssen, entfällt dabei. Die MeBg¹V
schwindigkcil kann auf das Hunterttausendfache er- 60
höht und die statistischen Fehler der kleinen Zahl
vermieden werden. Dieses Verfahren ermöglicht weiter eine genaue optische Auswertung von Teilcheneigenschaftcn. da die Teilchensuspension ausschließlich im Bereich der Tiefenschärfe die Meßstelle pas- 65 Teilchensuspension wird dann auch seitlich von dei siert. Insbesondere kann mit diesem Verfahren im teilchenfreien Flüssigkeit begrenzt, so daß die Seitli Gegensatz zu den bekannten eine genaue Absorp- chen Wände des Kanals größere Abstände voneinan· tionsmessung an den Teilchen ausgeführt werden, der haben können.

keit zugegeben.

Dabei ist die Form dieser öffnung und ihr Durchmesser in Strömungsrichtung unkritisch, was einfache Herstellungsverfahren zuläßt. Senkrecht zui Strömungsrichtung muß der Durchmesser der öffnung gleich der durch die Größe des Mikroskopobjektivs gleichmäßig ausgeleuchteten Feldes bestimmten Breite des Teilchensuspensionsstromes sein. Die

Da der Durchmesser des vom Mikroskopobjektiv gleichmäßig ausgeleuchteten Feldes groß ist gegen den Bereich der Tiefenschärfe (etwa 10:!) ist eine seitliche Fixierung der Teilchensuspension durch eine feste Wand nicht erforderlich. Verlagerungen in dieser Richtung beeinflussen die Meßgenauigkeit kaum, während, wie oben ausgeführt, Änderungen des Abstandes zwischen Teilchensuspension und Mikroskopobjektiv starke Strömungen verursachen.

Größere öffnungen zur Zuführung der Teilchensuspension können benutzt werden, wenn eine kontinuierliche Verjüngung des Kanalquerschnitts zwischen der öffnung und der Meßstelle vorgesehen wird, womit eine geringere Verstopfungsgefahr bewirkt ist.

In dieser Anordnung können auch andere Formen der Zusammenführung der Teilchensuspension und der teilchenfreien Flüssigkeit benutzt werden. Die kontinuierliche Verjüngung des Kanalquerschnitts erlaubt dabei große, leicht herstellbare und nicht verstopfende Zuführungskanäle. Eine Ausführung zeigt Fig. 3. Sie besteht aus einem Zuführungskanal 12 für die teilchenfreie Flüssigkeit und dem Zuführungskanal 11 für die Teilchensuspension. Eine kontinuierliche Verjüngung 13 des Kanals führt in den Kanalabschnitt, in dem die Messung stattfindet.

Fig.4 zeigt eine Aufsicht auf diese Ausführung. Dabei ist der Zuführungskanal 11 für die Teilchensuspension so breit gehalten, daß sich nach der kontinuierlichen Verjüngung 13 ein Teilchensuspen-

sionsstrom gewünschter Breite im Meßbereich 14 ergibt.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

ι 2 dies zu erreichen, sind ein Hüllstromverfahren und Patentansprüche· eine Einspritzung der Teilchen in die Mitte der öffnung bekannt. Andere Verfahren weisen die Teilchen

1. Verfahren zum Führen der Suspension in in dieser Öffnung mit optischen Methoden nach. Bei einer Durchflußküvette bei der mikroskopfoto- 5 einem Verfahren wird die Öffnung intensiv beleuchmetrischen Messung der Eigenschaften von in tet und die Lichtintensität hinter der Öffnung mit einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen, bei dem einem fotoelektrischen Detektor gemessen. Die Teildie Suspension im Meßbereich der Küvette senk- chensuspension strömt durch die Öffnung parallel recht zur optischen Achse der Mikroskopanord- zur Richtung des Lichteinfalls. Ein in der Öffnung nung geführt wird, dadurch gekenn- io befindliches Teilchen absorbiert Licht und ruft so am zeichnet, daß die Suspension als Schicht mit Ausgang des Detektors ein Signal hervor, dessen einer Dicke von der Größenordnung des Tiefen- Amplitude unter anderem von der Größe des Teilschärfebereichs der Mikroskopanordnung zwi- chens abhängt (deutsche Patentschrift 1200 577). sehen einer ebenen Wand der Küvette und einer Dieses Verfahren ist zur genauen Messung der Teilparallel dazu strömenden teilchenfreien Flüssi»- 15 chengröße ungeeignet, da diese Amplitude auch vom keit geführt wird. " Ort des Teilchens in der Öffnung abhängt und

2. Durchflußküvette zur Durchführung des gleich große Teilchen mit unterschiedlichen Bahnen Verfahrens nach dem Anspruch 1, gekennzeich- unterschiedliche Signale auslösen.

nel durch zwei im Abstand zueinander angeord- Eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens mißt

riete planparallele Wände (1,2), von denen min- 20 statt dessen die Intensität des vom beleuchteten Teil-

destens eine (2) aus einem lichtdurchlässigen Ma- chen ausgehenden Streu- und Fluoreszenzlichtes, terial besteht durch einen ersten Zuführungskanal Man erhäh dafür besonders einfache optische An-

(12) für die teilchenfreie Flüssigkeit (4) in den Ordnungen, wenn die Beleuchtung und Beobachtung

durch die beiden Wände (1, 2) gebildeten Zwi- der von der Teilchensuspension durchfloss^nen Öff-

schenraum, durch einen stromaufwärts zur 25 nung durch dasselbe optische System in der soge-

Meßstelle und stromabwärts zum ersten Zufüh- nannten Auflichtanordnung erfolgt, rungskanal (12) angeordneten zweiten Zufüh- Das von einem Teilchen ausgehende Streu- oder

rungskanal (7,11) für die Suspension (5), der als Fluoreszenzlicht wird dabei durch halbdurchläs:,igc

Öffnung (7,11) in einer (1) der beiden Wände Spiegel und geeignete Filter vom Beleuchtungslicht

ausgeführt, sowie durch einen Auslaßkanal für 30 abgetrennt und einem fotoelektrischen Detektor zu-

die gesamte Flüssigkeit. geführt. Die Signalamplituden an dessen Ausgang

3. Durchflußküvette nach Anspruch 2, dadurch sind proportional zur Fluoreszenzfärbung des Teilgekennzeichnet, daß sich der Strömungsquer- chens, die wiederum je nach dem gewählten Fluoschnitt stromaufwärts vor der Meßstelle (14) in rochromierungsverfahren proportional der Menge Strömungsrichtung kontinuierlich verjüngt (13). 35 eines bestimmten Stoffes in dem Teilchen ist. Durch

bekannte elektronische Auswertungsmethoden für die Signalamplitude kann somit diese Menge gemes-

sen werden, wenn die Signalamplitude nicht von der