DE19732136A1 - Gefrorenes Nahrungsmittelprodukt - Google Patents

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft gefrorene Nahrungsmittelprodukte, die GSPe enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Gefrierschutzproteine (GSPe) sind in der Literatur beschrie­ ben worden, siehe z. B. Marilyn Griffith und K. Vanya Ewart in Biotechnology Advances, Bd. 13, Nr. 3, S. 375-402, 1995. Gefrierschutzproteine besitzen im allgemeinen eine oder meh­ rere der folgenden Eigenschaften: Thermische Hysterese, In­ hibierung von Eisrekristallisation, Kontrolle der Kristall­ form von Eis und Wechselwirkung mit Eiskeimbildnern.

Die thermische Hysterese ist die bekannteste Eigenschaft von GSPen und die Eigenschaft wird normalerweise verwendet, um auf die Anwesenheit von GSPen hin zu prüfen. Die thermische Hysterese ergibt sich aus einer Erniedrigung der scheinbaren Gefriertemperatur einer Lösung, die ein in thermischer Hy­ sterese aktives GSP enthält, ohne die Schmelztemperatur zu beeinflussen. Die Identifizierung von GSP-Quellen durch thermische Hysteresetests ist in der Literatur umfassend be­ schrieben, siehe z. B. John G. Duman in Cryobiology 30, 322-328 (1993).

Die Inhibierung von Eisrekristallisation ist eine andere Eigenschaft von GSPen. Diese Aktivität wird auch als Eiskri­ stallwachstumsunterdrückung bezeichnet. Diese Eigenschaft kann durch Vergleich der Eiskristallgröße von Kristallen in Gegenwart von GSP und in der Abwesenheit von GSP an einem bestimmten Punkt in der Zeit getestet werden. Die Anwendung dieser Methode beim Testen von Fisch-GSPen wird in dem US- Patent 5,118,792 (DNA Plant Technology Corporation) be­ schrieben .

Eine dritte Eigenschaft von GSPen ist ihre Fähigkeit, die Form von Eiskristallen zu beeinflussen. Diese Eigenschaft rührt von der selektiven Bindung von GSPen an bestimmte Flä­ chen des Eiskristalls und das damit begrenzte Kristallwachs­ tum in bestimmte Richtungen her. Das Vorliegen von Eiskri­ stallen mit einer hexagonal bipyramidalen Form wird dann als Anzeichen für das Vorliegen von GSP angenommen. Dieses Ver­ fahren wird z. B. zum Testen der Aktivität von extrazellulä­ ren Winterroggen-GSPen in der WO 92/22581 (University of Waterloo) beschrieben.

Eine vierte Eigenschaft von GSPen ist ihre Fähigkeit, die Aktivität von eiskeimbildenden Substanzen zu inhibieren. Diese Wechselwirkung zwischen einem GSP und einem Eiskeim­ bildner kann z. B. zu erhöhter thermischer Hysterese führen. Diese Eigenschaft wird z. B. in der WO 96/40973 (University of Notre dame du Lac) getestet.

GSPe sind zur Steigerung der Gefriertoleranz von Produkten vorgeschlagen worden. Viele Anwendungen sind in diesem Zu­ sammenhang vorgeschlagen worden.

Zum Beispiel sind GSPe zur Verbesserung der Kryokonservie­ rung von biologischen Materialien vorgeschlagen worden (WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, WO 91/10361, The Regents of the University of California). Auch sind GSPe zum Verhin­ dern des Auslaufens aus Liposomen z. B. in Kosmetika oder pharmazeutischen Mitteln vorgeschlagen worden (siehe WO 96/20695). Eine weitere mögliche Anwendung ist es, die Ge­ friertoleranz von Pflanzen durch Einschluß von einem GSP darin (oder das transgenetische Erzeugen eines GSPs darin) zu erhöhen (siehe J. Cell. Biochem. Suppl. Bd. 14e, 1990, Seite 303 XP002030248, Lee et al., Abstract R228). Auch Fisch-GSPe sind für eine Verwendung in Nahrungsmittel­ produkten vorgeschlagen werden, z. B. in gefrorenem Yoghurt oder Eiscreme (US 5,620,732 Pillsbury und WO 96/11586, HSC Research and development limited partnership).

Bis jetzt ist die Verwendung von GSPen jedoch nicht in einem kommerziellem Maßstab angewandt worden. Die Anmelder sind der Meinung, daß einer der Gründe für das Fehlen einer kommerziellen Implementierung darin besteht, daß, obwohl viele GSPe beschrieben worden sind, in der Praxis die Implementierung in tatsächliche kommerzielle Produkte ernste Probleme mit sich bringt.

Die Anmelder haben gefunden, daß einer der Schlüsselgründe für diese Probleme darin besteht, daß aus der großen Anzahl von GSPen, die in der Literatur beschrieben worden sind, nur eine begrenzte Gruppe von GSPen für jede Anwendung geeigne­ terweise angewandt werden kann; auch haben die Anmelder ge­ funden, daß diese Auswahl geeigneter GSPe von der gewünsch­ ten Anwendung und/oder den zu erreichenden Produkteigen­ schaften abhängig ist.

Eine besonders erwünschte Quelle für GSPe ist Pflanzenmate­ rial. Pflanzenmaterialien können ziemlich einfach in relativ großen Mengen erhalten werden und relativ einfache Isolie­ rungsverfahren können zum Erhalten eines GSP-enthaltenden Konzentrats verwendet werden. Darüber hinaus wird angenom­ men, daß die Verwendung von GSPen aus Pflanzenmaterial von den Verbrauchern bevorzugt wird, die dazu neigen, natürliche Pflanzenquellen gegenüber z. B. Fisch-GSPen zu bevorzugen.

Marilyn Griffith und K. Vanya Ewart in Biotechnology Advances, Bd. 13, Nr. 3, S. 375-402, 1995, haben eine Liste von 27 höheren Pflanzenarten gegeben, in denen eine Gefrier­ schutzaktivität gefunden wird. Dieser Artikel schlägt auch einen weiten Bereich möglicher Anwendungen für GSPe vor.

Die Anmelder haben nun gefunden, daß, wenn eine spezielle Anwendung für die Verwendung von Pflanzen-GSPen ausgewählt wird, dies die Notwendigkeit nach einem spezielle Test zur Auswahl der begrenzten Gruppe von GSPen schafft, die vor­ teilhaft in dieser Anwendung eingesetzt werden können.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, diejenigen Pflanzen-GSPe zur Verfügung zu stellen, die vorteilhaft in gefrorenen Konfektprodukten verwendet werden können.

Überraschenderweise haben die Anmelder gefunden, daß, entge­ gen der Tatsache, daß eine große Anzahl von Pflanzen GSPe enthalten, nur eine begrenzte Gruppe von Pflanzen GSPe ent­ halten, die in der Lage sind, gefrorenen Konfektprodukten eine gute Textur zu verleihen. Überraschenderweise hat man gefunden, daß eine relativ einfache Testmethode zur Auswahl der geeigneten GSPe verwendet werden kann.

Demgemäß betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ge­ frorene Konfektprodukte, die ein oder mehrere aus Pflanzen stammende GSPe umfassen, worin die GSPe in Wasser eine Eiskristallgröße nach schnellem Gefrieren auf -40°C gefolgt von einer Lagerung für 1 Stunde bei -6°C (wie unten be­ schrieben gemessen) von weniger als 15 µm aufweisen.

Hintergrund der Erfindung

Eine Anzahl von Literaturstellen hat vorgeschlagen, daß GSPe möglicherweise zur vorteilhaften Beeinflussung der Textur­ eigenschaften von gefrorenen Konfektprodukten, wie Eiscreme, verwendet werden können. Jedoch geben die meisten dieser Dokumente keine Lehre, wie diese vorteilhaften Eigenschaften in der Praxis tatsächlich erreicht werden können.

Eine weitere Gruppe von Dokumenten beschreibt die Verwendung von Fisch-GSPen.

Die WO 96/11586 lehrt die Anwendung von Fisch-Gefrierschutz­ polypeptiden in gefrorenen, fermentierten Nahrungsmittelpro­ dukten. Dieses Dokument lehrt nicht die Verwendung speziel­ ler GSPe, die aus Pflanzen stammen, in diesen Produkten.

Die WO 96/39878 beschreibt die Anwendung von GSP in Eis­ creme. Geeignete GSPe für diese Anwendung können aus Blut und Muskelgewebe antarktischer Fische, arktischer Fische, Würmern und Insekten stammen. Wieder wird keine Lehre bereitgestellt, daß Pflanzen-GSP verwendet werden kann.

Das US 5,118,792 beschreibt in Beispiel 3B die Inhibierung der Rekristallisation durch ein gereinigtes A-Saf5 Fusions­ protein in einer Eis am Stiel-Mischung. Wieder lehrt dieses Dokument nicht die Verwendung von aus Pflanzen abstammenden GSPen.

Die WO 92/22581 beschreibt eine Vielzahl von Polypeptiden, die aus den extrazellulären Räumen von Winterroggen stammen. Mehrere mögliche Anwendungen dieser Polypeptide sind allge­ mein beschrieben, unter diesen ist Eiscreme. Es wird jedoch keine Lehre zur Verfügung gestellt, welches der Polypeptide ausgewählt werden sollte, um eine Eiscreme guter Qualität zu erhalten. Die Anmelder haben gefunden, daß nur bestimmte Proteine aus Winterroggen für eine Verwendung in Eiscreme geeignet sind (siehe die Beispiele).

Die Anmelder haben gefunden, daß eine große Anzahl von Pflanzen, die bislang als solche nicht aufgelistet worden sind, einen signifikanten Gehalt an GSPen enthalten. Ande­ rerseits hat man gefunden, daß nicht alle GSP-enthaltenden Pflanzen die richtige Art GSP zur vorteilhaften Beeinflus­ sung der Textur gefrorenen Konfekts bereitstellen. Die An­ melder zielen nun darauf, eine besondere, neue Auswahl an Pflanzenquellen zur Verfügung zu stellen, die überraschen­ derweise einerseits gute GSP-Eigenschaften bereitstellen und andererseits in der Lage sind, die Textureigenschaften von Eiscreme vorteilhaft zu beeinflussen.

Insbesondere hat man gefunden, daß geeignete GSPe durch Ein­ bringen einer GSP-umfassenden Zusammensetzung in eine wäß­ rige Zusammensetzung und das schnelle Gefrieren dieser Zu­ sammensetzung auf -40°C oder weniger, gefolgt von der Lage­ rung für 1 Stunde bei -6°C, ausgewählt werden können. Ge­ eignete GSPe führen zu einer Eiskristallgröße nach Lagerung für 1 Stunde bei diesen Bedingungen von weniger als 15 µm, bevorzugter 5-14 µm, am bevorzugtesten 8 bis 12 µm. Die Tem­ peratur des schnellen Gefrierens ist vorteilhaft -40 bis -100°C, bevorzugt -80°C. Eine genaue Beschreibung eines ge­ eigneten Tests zur Bestimmung dieser Eigenschaft wird in Beispiel 1 gegeben.

Allgemein kann der Test auf jede geeignete Zusammensetzung, die GSP und Wasser umfaßt, angewandt werden. Allgemein ist der Gehalt an GSP in einer solchen Testzusammensetzung nicht sehr kritisch und kann z. B. von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, be­ vorzugter 0,0005 bis 0,1 Gew.-%, am bevorzugtesten 0,001 bis 0,05 Gew.-%, z. B. 0,01 Gew.-% sein. Der Wassergehalt in der wäßrigen Zusammensetzung ist vorteilhaft 30 Gew.-% oder mehr, z. B. 50 Gew.-% bis 99,9999 Gew.-%.

Jede geeignete Zusammensetzung, die GSP und Wasser umfaßt, kann zur Ausführung des Tests verwendet werden. Wenn gewünscht, können Zusätze vorliegen, z. B. Saccharose oder Puffermittel. Im allgemeinen ist es jedoch nicht notwendig, das GSP in gereinigter Form zu erhalten. Für praktische Anwendungen ist es normalerweise ausreichend, ein flüssiges Extrakt oder einen Saft aus Pflanzenmaterial herzustellen, wobei dieser Extrakt oder Saft dann getestet werden kann. Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung geeigneter flüssiger Zusammensetzungen wird in Beispiel II gegeben.

Normalerweise sind auf geeignete GSPe zu testende Pflanzen der Kälte ausgesetzt gewesen. Zum Beispiel können Pflanzen getestet werden, die in kalten Klimata wachsen, z. B. antark­ tische Pflanzen. Alternativ können Pflanzen während der Win­ terperiode, bevorzugt von Dezember bis März, bevorzugter von Januar bis Februar, am bevorzugtesten im Januar (nördliche Hemisphäre) oder von Juni bis September, bevorzugter von Juli bis August, am bevorzugtesten im Juli (südliche Hemi­ sphäre) geerntet werden.

Die Anmelder haben eine große Anzahl von Pflanzen dem oben beschriebenen Test unterworfen. Die Ergebnisse werden in den Beispielen III und IV gegeben.

Bevorzugte Quellen für GSPe stammen von Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix fragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccheraroides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (Karotte), Vinca minor (Immergrün), Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua ("speargrass"), Poa pratensis (Wiesenrispengras), Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis und Festuca contracta.

Die Anmelder sind der Meinung, daß basierend auf den in der Beschreibung der Erfindung gegebenen Richtlinien der Fach­ mann wohl in der Lage sein wird, weitere GSPe auszuwählen, die geeigneterweise aus Pflanzen hergeleitet werden können. Die Verwendung dieser GSPe ist in den Bereich der vorliegen­ den Erfindung auch eingeschlossen.

In einer Ausführungsform sind solche Pflanzen-GSPe für eine Anwendung in Nahrungsmittelprodukten besonders nützlich, die den oben definierten Kristallgrößentest bestehen und die aus nicht- oder gering toxischen Pflanzen stammen. In diesem Zu­ sammenhang sind GSPe bevorzugt, die von Karotten, Gräsern, Bambus etc. stammen.

Eine weitere bevorzugte Auswahl aus den oben genannten Quel­ len sind die GSPe, die aus der Flechtenfamilie stammen, ins­ besondere Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana. Diese GSPe zeigen besonders gute Eigenschaften in gefrorenen Konfektprodukten.

Andere GSPe, die eine besonders gute Aktivität zeigen, stam­ men von Juncus squarrosus oder Geranium.

Für einige Anwendungen werden solche GSPe ausgewählt, die ihre Fähigkeit zur Begrenzung des Eiskristallwachstums (wie in dem obengenannten Test nachgewiesen) selbst nach einer Wärmebehandlung oberhalb einer Temperatur von 60°C, am be­ vorzugtesten von 80 bis 105°C für einen Zeitraum von minde­ stens 30 Sekunden, bevorzugter mehr als 1 Minute, 10 Minuten oder selbst mehr als 1 Stunde beibehalten. Geeignete Pflan­ zenquellen, die wärmestabil sind, sind z. B. Acer saccharoides, Bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis und Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua.

Zusätzlich zu den oben genannten Pflanzen haben die Anmelder die GSPe von Secale cereale (Winterroggen) getestet. Mehrere Winterroggen-GSPe sind in der WO 92/22581 beschrieben wor­ den. Überraschenderweise haben die Anmelder gefunden, daß das 32 kDa-Protein, das aus Winterroggen stammt, den oben beschriebenen Kristallgrößentest besteht, während andere Proteine aus Winterroggen dem Test nicht genügen (siehe Bei­ spiel IX). Für den Zweck der Erfindung wird daher, wenn von Winterroggen stammende GSPe verwendet werden, bevorzugt das 32 kDa-Protein angewandt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung be­ trifft die Verwendung von Pflanzen-GSPen, die dem obenge­ nannten Test genügen und die nicht aus Winterroggen stammen, in gefrorenen Konfektprodukten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gefrorene Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens ein GSP, das aus Pflanzenquellen stammen kann.

Die GSPe können aus den Pflanzenquellen durch jedes ge­ eignete Verfahren erhalten werden, z. B. die in den oben genannten Dokumenten beschriebenen Isolationsverfahren. Al­ ternativ können die GSPe aus den Pflanzen extrahiert werden, z. B. durch die Herstellung eines Pflanzenextrakts aus (Tei­ len) der Pflanze, gefolgt von einem wahlweisen Aufkonzentra­ tionsschritt. Beispiele für geeignete Verfahren zum Erhalten der Extrakte sind in den Beispielen gegeben.

Auch können Mikroorganismen oder Pflanzen genetisch verän­ dert werden, um GSPe zu exprimieren und die GSPe können dann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Genetische Manipulationstechniken können zur Herstellung von GSPen mit mindestens 80%, bevorzugter mehr als 95%, am be­ vorzugtesten 100% Homologie zu den GSPen, die direkt aus Pflanzenquellen erhalten werden, die natürlich die GSPe enthalten, verwendet werden. Für den Zweck der Erfindung werden diese GSPe, die diesen hohen Grad an Homologie besitzen, auch in den Ausdruck "von Pflanzen stammendes GSP" eingeschlossen. Für den Zweck der Erfindung schließt der Ausdruck "von Pflanzen stammendes GSP" bevorzugt GSPe, die natürlich in Nicht-Pflanzenquellen, z. B. Fisch, vorkommen und die durch transgenetische Wege durch Pflanzen hergestellt werden, nicht ein.

Die genetischen Manipulationstechniken können wie folgt ver­ wendet werden: Eine geeignete Wirtszelle oder -organismus würde durch eine Genkonstruktion transformiert, die den Co­ dierungsbereich für das gewünschte Polypeptid enthält.

Die Nucleotidsequenz, die für das Polypeptid codiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden. Der Vektor codiert die notwendigen Elemente für die Trans­ kription und Translation in einer solchen Art und Weise, daß sie unter geeigneten Bedingungen exprimiert werden (z. B. in richtiger Orientierung und in richtigem Leserahmen und mit geeigneter Ziel- und Expressionssequenz).

Die zur Erzeugung dieser Expressionsvektoren benötigten Ver­ fahren sind dem Fachmann wohl bekannt.

Eine Anzahl von Expressionssystemen kann verwendet werden, um die Polypeptidcodierungssequenz zu exprimieren. Diese schließen ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Bakterien, Hefe, Insektenzellsysteme, Pflanzenzellenzuchtsysteme und Pflanzen, alle mit den geeigneten Expressionsvektoren transformiert.

Aus den obengenannten Quellen erhältliche GSPe können in je­ dem geeigneten gefrorenen Konfektprodukt verwendet werden. Für den Zweck der Erfindung schließt der Begriff gefrorenes Konfektprodukt Milch, die gefrorenes Konfekt enthält, wie Eiscreme, gefrorener Joghurt, Fruchteis, Sorbet, Milcheis und gefrorene Eiercreme, Wassereissorten, Granitas und ge­ frorene Fruchtpürees ein. Für einige Zwecke ist die Verwen­ dung in fermentierten gefrorenen Nahrungsmittelprodukten we­ niger bevorzugt.

Bevorzugt ist der Gehalt an GSPen in dem gefrorenen Konfekt­ produkt von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, basierend auf dem Endpro­ dukt, bevorzugter 0,0005 bis 0,3 Gew.-%, am bevorzugtesten 0,001 bis 0,2 Gew.-%.

Bevorzugt ist der Gehalt an Feststoffen in dem gefrorenen Konfekt (z. B. Zucker, Fett, Geschmacksstoffe, etc.) mehr als 2 Gew.-%, bevorzugter von 4 bis 70 Gew.-%.

Wenn gewünscht, können die gefrorenen Konfektprodukte der Erfindung lufthaltig sein, z. B. bis auf einen Überlauf von 50 bis 500%.

Das Verfahren zur Herstellung des gefrorenen Konfektprodukts der Erfindung kann aus jedem geeigneten Herstellungsverfah­ ren ausgewählt werden. Die GSPe können im allgemeinen an verschiedenen Stufen der Herstellung zugegeben werden, z. B. können sie in die erste Vormischung der Bestandteile zugege­ ben werden oder sie können später während einer späteren Stufe des Herstellungsverfahrens zugegeben werden. Für einige Anwendungen ist es manchmal bevorzugt, die GSPe in einem relativ späten Stadium des Herstellungsverfahrens zu­ zugeben, z. B. nach (teilweisem) Vorgefrieren des Produkts.

Das Gefrierverfahren für gefrorene Konfektprodukte kann aus jedem geeigneten Gefrierverfahren ausgewählt werden und kann wahlweise einen Belüftungsschritt umfassen, z. B. auf einen Überlauf von 50 bis 300%. Für einige Zwecke ist es vorteil­ haft, daß das Gefrierverfahren einen kalten Härtungsschritt beinhaltet, z. B. bei einer Temperatur von -34°C (-30 Fahren­ heit) oder niedriger.

Für einige Anwendungen kann es vorteilhaft sein, eine Mi­ schung aus zwei oder mehreren verschiedenen GSPen in das gefrorene Konfektprodukt einzuschließen. Ein Grund hierfür kann z. B. sein, daß die Pflanzenquelle für die zu verwendenden GSPe mehr als ein GSP enthält und es bequemer ist, diese zuzusetzen, z. B. weil sie beide in dem zu verwendenden Pflanzenextrakt vorliegen. Alternativ kann es manchmal wünschenswert sein, mehr als ein GSP von verschiedenen Quellen zuzusetzen.

Die Erfindung wird nun mittels der folgenden Beispiele ver­ anschaulicht.

Beispiel I Test zur Bestimmung der Eiskristallteilchengröße nach schnellem Abkühlen, gefolgt von einer Lagerung bei -6°C für 1 Stunde

Die bevorzugte Methode ist wie folgt:

Ia: Die Gefrierschutzaktivität wurde unter Verwendung eines modifizierten "splat assay" (Knight et al., 1988) gemessen. 2,5 µl der untersuchten Lösung in 30% (Gew./Gew.) Saccha­ rose wurden auf ein sauberes, geeignet markiertes, 16 mm kreisförmiges Deckglas überführt. Ein zweites Deckglas wurde auf den Lösungstropfen plaziert und das Sandwich wurde zwi­ schen Finger und Daumen zusammengepreßt. Man ließ das Sand­ wich in ein Hexanbad fallen, das in einer Trockeneiskiste auf -80°C gehalten wurde. Als alle Sandwiches hergestellt waren, wurden die Sandwiches aus dem -80°C Hexanbad unter Verwendung einer in dem Trockeneis vorgekühlten Pinzette in die Betrachtungskammer überführt, die bei -6°C gehaltenes Hexan enthielt. Beim Überführen nach -6°C konnte man sehen, daß die Sandwiches von einer transparenten zu einer undurchsichtigen Erscheinung wechselten. Bilder wurden unter Verwendung eines 20×-Objektivs mit einer Videokamera aufgenommen und in einem Bildanalysesystem (LUCIA, Nikon) erfaßt. Bilder von jedem Splat wurden zur Zeit = 0 und wieder nach 60 Minuten aufgenommen.

Alternativ (weniger bevorzugt) können die Eigenschaften wie folgt gemessen werden:

Ib: Eine Probe eines GSP-enthaltenden Produkts, die Wasser enthält, wird auf einen Saccharosegehalt von 30 Gew.-% ein­ gestellt (wenn der Anfangsgehalt der Probe größer als 30% war, wurde dies durch Verdünnen gemacht, wenn der Anfangsge­ halt niedriger war, wurde Saccharose auf einen Gehalt von 30% zugegeben).

Ein 3 µl Tropfen der Probe wird auf ein 22 mm Deckglas pla­ ziert. Ein Deckglas mit 16 mm Durchmesser wird dann darauf gelegt und ein 200 g Gewicht wird auf die Probe gelegt, um eine gleichmäßige Objektglasdicke sicherzustellen. Die Kanten des Deckglases werden mit klarem Nagellack versiegelt.

Das Objektglas wird auf einen Linkham THM 600 temperaturge­ regelten Mikroskoptisch gelegt. Der Tisch wird schnell (50°C pro Minute) auf -40°C gekühlt, um eine große Menge kleiner Kristalle zu erzeugen. Die Tischtemperatur wird dann schnell (50°C pro Minute) auf -6°C erhöht und bei dieser Temperatur gehalten.

Die Eisphase wird bei -6°C unter Verwendung eines Leica Ari­ stoplan-Mikroskops beobachtet. Bedingungen polarisierten Lichts in Verbindung mit einer Lambda-Platte wurden verwen­ det, um den Kontrast der Eiskristalle zu erhöhen. Der Zu­ stand der Eisphase (Größe der Eiskristalle) wird durch 35 mm Photomikrographie bei T=0 und T=1 Stunde aufgezeichnet. Da­ bei zeigt eine durchschnittliche Teilchengröße (visuelle Be­ stimmung, Zahlenmittel) von unter 15 µm ein geeignetes GSP zur Verwendung in gefrorenen Konfektprodukten an.

Beispiel II Verfahren zum Erhalten von Zusammensetzungen, die GSP und Wasser enthalten

A. Frisches Gewebe von Pflanzenteilen, z. B. Wurzeln, Sten­ gel, Knospen oder Blätter, kann mit einem Pistill und einem Mörser (auf 4°C gekühlt) in einem gleichen Volumen Puffer A (z. B. 10 mM EDTA, 20 mM Ascorbinsäure, mit Tris auf pH 7,4 gepuffert) auf Eis gehalten, zerkleinert werden. Die Homo­ genisate werden durch eine oder mehrere Schichten aus Musselin filtriert und vor einer weiteren Verwendung auf Eis gehalten.

Dieses Verfahren kann im allgemeinen auf die meisten Pflan­ zen angewandt werden und stellt einen frischen Pflanzensaft bereit, der das GSP enthält. Im allgemeinen kann die gesamte Pflanze für diesen Zweck verwendet werden, obwohl aus prak­ tischen Gründen manchmal nur Teile verwendet werden können (z. B. Blätter von holzigen Bäumen, Wurzeln von Wurzelpflanzen und Stengel von grasartigen Pflanzen).

B. Verfahren zum Extrahieren von GSPen aus Quellen, die in der Lage sind, Hitze zu widerstehen, wie beispielsweise Grä­ ser. Dieses Verfahren wird unter Verwendung eines gemischten Grases veranschaulicht. Es versteht sich jedoch, daß dieses Verfahren genauso auf andere hitzebeständige Sorten ange­ wandt werden kann.

Gewebe von gemischtem Gras (Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus Lanatus, Bromus Sterilis) wurde im Januar geschnitten (die Durchschnittstemperatur in dem Monat war 3,5°C, was die geeignete Kälteakklimatisation der Pflanzen sicherstellte). Das Grasgewebe wurde schnell zur weiteren Behandlung in das Labor transportiert und gründlich mit Wasser gewaschen, um Schmutz zu entfernen.

500 g Grasschnitzel wurden in einen 650 Watt Mikrowellenofen gegeben und bei voller Stärke für 5 Minuten erhitzt, wobei die Temperatur auf 85 bis 100°C stieg. Die Grasschnitzel wurden dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt.

Nach dem Erwärmungsschritt wurde der GSP-reiche Saft durch Filtrieren von den Schnitzeln getrennt. Die Masse wurde in Gegenwart eines gleichen Volumens Wasser für 5 Minuten durchgehend gerührt und dann durch 3 Schichten Musselin ge­ drückt.

Beispiel III Screening verschiedener Pflanzen

Nicht-antarktische Pflan­ zen wurden im Januar (mitten im Winter) geerntet. Die ant­ arktischen Pflanzen wurden mitten im Sommer geerntet (Fe­ bruar-März).

Wenn nicht anders angegeben, wurden Wurzeln zur Herstellung eines GSP-enthaltenden Safts gemäß dem in Beispiel IIa beschriebenen Verfahren verwendet.

Die Proben wurden dem Test aus Beispiel Ia unterworfen. Ge­ eignete GSPe für eine Anwendung in gefrorenen Konfektproduk­ ten sind mit einem Positivzeichen (+) angegeben.

Zusätzlich wurden die thermischen Hystereseeigenschaften der Säfte wie folgt gemessen: Die thermische Hysterese einer Produktprobe, die GSPe enthielt, wurde dadurch bestimmt, daß man das geschmolzene Produkt auf ein Mikroobjektglas gab (Camlab Cambridge, Weglänge 0,1 mm). Die Enden des Mikroob­ jektglases wurden mit Rohvaseline verschlossen. Eis wurde unter Verwendung eines Aerosolgefriersprays in der Probe erzeugt. Das Objektglas wurde dann in ein temperaturge­ regeltes Ethanolbad bei -0,1°C eingetaucht. Nach 5 minütiger Gleichgewichtseinstellung wurde die Probe überprüft. Wenn das Eis vollständig schmolz, wurde die Temperatur des Bades in 0,1°C Schritten erniedrigt, gefolgt von einer Gleichgewichtseinstellung. Diese Schritte wurden wiederholt, bis eine Temperatur erreicht wurde, bei der eine kleine Menge Eiskristalle in der Probe vorlag. Nach Gleichgewichtseinstellung bei dieser Temperatur wurde die Badtemperatur in Schritten von 0,01°C pro Minute herabgesetzt. Der Gefrierpunkt der Probe wurde als die Temperatur aufgezeichnet, an der die Eisausbreitung von den ins Gleichgewicht gebrachten Kristallen beginnt. Die Schmelztemperatur der Probe wurde dann durch Erhöhen der Temperatur ausgehend vom Gefrierpunkt in Schritten von 0,01°C pro Minute bis alle Eiskristalle schmolzen, bestimmt. Diese Temperatur ist die Schmelztemperatur der Probe. Die thermische Hysterese der Probe ist die Differenz zwischen der Schmelztemperatur und der Gefriertemperatur. GSPe mit einem wesentlichen Grad an thermischer Hysterese sind mit einem Positivzeichen (+) angegeben. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Diese Ergebnisse zeigen klar, daß, obwohl eine große Zahl von Pflanzen thermische Hystereseeigenschaften zeigt, nur ein kleiner Teil von diesen den Rekristallisationstest be­ steht.

Beispiel IV Screening verschiedener Pflanzen

Nicht-antarktische Pflan­ zen wurden im Januar (mitten im Winter) geerntet. Die ant­ arktischen Pflanzen wurden mitten im Sommer geerntet (Fe­ bruar-März).

Wenn nicht anders angegeben, wurden Wurzeln zur Herstellung eines GSP-enthaltenden Safts gemäß dem in Beispiel IIa be­ schriebenen Verfahren verwendet.

Die Proben wurden dem Test aus Beispiel Ia unterworfen. Ge­ eignete GSPe für eine Anwendung in gefrorenen Konfektproduk­ ten sind mit einem Positivzeichen (+) angegeben.

Beispiel V

Eine flüssige Vormischung zur Herstellung von Eiscreme wurde hergestellt durch Mischen von:

Bestandteil
Gew.-%
Magermilchpulver
11,390
Saccharose	3,410
Maltodextrin (MD40)	4,000
Johannisbrotgummi	0,072
Stärkezuckersirup aus Mais 63DE	20,705
Guar-gummi	0,048
Genulacta L100	0,020
Butter	9,015
Avicel RC581	0,240
Gelatine	0,140
Monoglycerid (palmitat)	0,450
Vanillin	0,010
GSP (aus Beispiel IIb)	0,100 oder keines (Kontrolle)
Wasser	Ausgleich

* Beachte: Das GSP wird als konzentrierte GSP-Lösung unter Verwendung eines Teils des zugegebenen Wassers als Verdün­ nungsmittel zugegeben, die Prozentangabe bezieht sich auf die Menge an GSP.

Diese Mischung kann bequem bei 85°C für 15 Sekunden pasteu­ risiert und in einer Dose gekühlt gelagert werden.

Die Mischungen können bei der Herstellung von Eiscreme durch Schlagen mit einem herkömmlichen Haushaltsmischer auf einen Überlauf von etwa 100% gefolgt von ruhigem Einfrieren in einer Haushaltsgefriertruhe verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung hatte eine ausgespro­ chen bessere Textur als die Kontrollprobe.

Gleiche Ergebnisse können unter Verwendung der folgenden Pflanzenquellen erhalten werden: Acer saccharoides, Bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa, flabellata, Deschamspia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis und Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua.

Beispiel VI

Eine flüssige Vormischung für die Herstellung von Eiscreme wurde hergestellt durch Mischen von:

Bestandteil
Gew.-%
Magermilchpulver
10,00
Saccharose	13,00
Maltodextrin (MD40)	4,00
Johannisbrotgummi	0,14
Butteröl	8,00
Monoglycerid (palmitat)	0,30
Vanillin	0,01
GSP (aus Beispiel IIb)	0,01 oder keines (Kontrolle)
Wasser	Ausgleich

* Beachte: Das GSP wird als konzentrierte GSP-Lösung in einem Teil des Wassers zugegeben, die Prozentangabe be­ zieht sich auf die Menge an GSP.

Die Mischungen wurden bei Raumtemperatur gemischt, gefolgt von einer Pasteurisation für 60 Sekunden bei 89°C. Die Mi­ schung wurde in Verpackungen von 500 ml aseptisch einge­ füllt, verschlossen und bei Raumtemperatur gelagert.

Die Mischung kann für die Herstellung von Eiscreme durch Schlagen mit einem herkömmlichen Haushaltsmischer bis zu einem Überlauf von etwa 70% gefolgt von Einfrieren unter ruhigen Bedingungen in einer Haushaltsgefriertruhe verwendet werden. Nach 2-monatiger Lagerung hatte die erfindungsgemäße Zusammensetzung eine ausgesprochen bessere Textur als die Kontrollprobe.

Beispiel VII

Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung und Sequenzierung von Karotten-GSP. Ähnliche Verfahren können für andere Pflanzen-GSPe verwendet werden.

Karottenwurzelgewebe von an Kälte akklimatisierte Karotten wurde in drei Volumina (Gew./Vol.) Puffer (20 mM Ascorbinsäure, 10 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,2) in einem vorgekühlten Mörser mit einem Pistill homogenisiert und durch eine Schicht Musselin filtriert. Das Filtrat wurde bei 6000 g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert; der Überstand wurde gesammelt und bei 100 000 g für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert. Der 100 000 g Überstand aus diesem Schritt wird als lösliche Fraktion und das Pellet als mikrosomale Fraktion bezeichnet.

Der Überstand wurde auf eine 30 ml Schnellauf-Q-Sepharose- (Pharmacia) -Säule, die in 50 mM Tris/HCl pH 7,4 voräquilibriert worden war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min, die von einer HiLoad-Pumpe P-50, geregelt von einem Gradifrac-Niederdruckchromatographiesystem (Pharma­ cia), geliefert wurde, bei 4°C aufgegeben, und das Eluat wurde bei OD 280 durch ein UV-Kontrollgerät (Monitor UV1, Pharmacia) überwacht und auf einem Schreiber (REC 102, Pharmacia) aufgezeichnet. 5 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Säule wurde mit 50 mM Tris/HCl pH 7,4 mit derselben Fließgeschwindigkeit gewaschen, bis die OD 280 auf Null zurückging. Ein 150 ml Gradient von 0-0,4 M NaCl in Tris/HCl pH 7,4 wurde dann aufgegeben, gefolgt von einer 2 M NaCl- Säulenspülung. Die Eluatfraktionen wurden dem Splat-Assay wie in Beispiel I unterworfen.

Fraktionen, die eine Gefrierschutzaktivität enthielten, wur­ den vereinigt, und unter Verwendung von Polyethylenglykol wie folgt aufkonzentriert: Die Fraktionen wurden in einen Dialyseschlauch mit 10 kDa Rückhaltevermögen (Sigma) über­ führt, der in Leitungswasser gewaschen, in 50 mM EDTA pH 7,5 für 10 Minuten gekocht und in Milli-Q-Wasser gespült worden war. Der die auf zukonzentrierende Probe enthaltende Dialyseschlauch wurde mit einer festen Polyethylenglykolver­ bindung mit einem Mol.-Gew. von 15 000-20 000 (Sigma) be­ deckt und bei 4°C für bis zu 4 Stunden inkubiert oder bis das Probenvolumen im Inneren des Dialyseschlauchs um bis zum 10-fachen reduziert war.

Das vereinigte Konzentrat von der Q-Sepharose-Säule wurde entweder auf eine Phenyl-Sepharose-Säule, eine SMART Super­ dex 75 Gelpermeationssäule oder eine FPLC Superdex 75 Gel­ permeationssäule gegeben.

Gefrierschutzproteine aus Karottenwurzel wurden durch Gel­ permeationschromatographie wie folgt gereinigt:

20 µl Probenaliquote wurden auf eine SMART Superdex 75 Säule (Pharmacia), die in 50 mM Tris/HCl pH 7,4 enthaltend 0,15 M NaCl (Puffer E) voräquilibriert worden war, mit einer Fließ­ geschwindigkeit von 40 µl/min aufgetragen und die Bestand­ teile wurden durch Gelpermeation bei der gleichen Fließge­ schwindigkeit in Äquilibrierungspuffer getrennt. Das Eluat wurde bei OD 280 und OD 215 überwacht. 80 µl Fraktionen wur­ den zwischen 0,85 und 0,89 ml gesammelt, 40 µl Fraktionen zwischen 0,89 und 1,24 ml und 100 µl Fraktionen zwischen 1,24 und 3,0 ml. Das Hohlraumvolumen (Vo) der Säule betrug 0,91 ml, wie durch das Rückhaltevolumen einer Lösung von blauem Dextran (Blue Dextran) bestimmt. Die Superdex-Säule wurde durch Auftragen von 10 µl einer Lösung kalibriert, die 5 mg/ml BSA (Mr 66 kDa, Retention (Ve)=1,02 ml), 3 mg/ml Carbonatdehydrase (Mr 29 kDa, Ve=1,22 ml), 2 mg/ml Cyto­ chrome C (Mr 12,4 kDa, Ve=1,41 ml) und 2 mg/ml Aprotinin (Mr 6,5 kDa, Ve=1,59 ml) enthielt, und eine Standardkurve von Ve/Vo gegen log Mr wurde aufgetragen. Gefrierschutzaktivität enthaltende Fraktionen wurden durch die Splat-Assays in Beispiel I identifiziert, mit einem Aktivitätspeak, der ein Retentionsvolumen von 1,16 ml und ein scheinbares Molekulargewicht von 40 kDa zeigte. Diese Messung bestätigte, daß die 38 kDa-Bande von an Kälte akklimatisierten Karotten ein Gefrierschutzpeptid war.

SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli (1970) unter Verwendung des Biorad-Mini-Systems ausgeführt. Die durch SDS-PAGE zu analy­ sierenden Proben wurden in SDS-PAGE Probenpuffer (Laemmli 1970) gelöst, für 5 Minuten bei 100°C auf einem trockenen Heizblock (Techne) erhitzt und für 3 Minuten bei 10 000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Proben (10-50 µl) wurden auf Mini-Gele (Biorad, 0,75, 1,0 oder 1,5 mm Dicke, 10, 12, 15% Acrylamid oder 10-20% Gradient Acrylamid {von Biorad vorgegossen}) aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Die getrennten Polypeptide wurden in dem Gel fixiert und angefärbt, entweder mit Coomassie-Blau (0,1% (Gew./Vol.} Coomassie-Brilliantblau in Essigsäure/Methanol/miliQ-Wasser {5 : 4:31, in Vol.}) oder mit Silberfärbung, unter Verwendung des Biorad-Silberanfärbungskits gemäß der Anleitung des Herstellers. Die Gele wurden zwischen zwei Blättern Gelair Collophan in einem Giorad Gelair-Trockner gemäß der Anlei­ tung des Herstellers getrocknet. Sigma-Molekulargewichtsmar­ kerkits für den hohen und niedrigen Bereich wurden gemäß der Anleitung des Herstellers zur Bestimmung des scheinbaren Mr auf SDS-PAGE verwendet.

Die Ionenaustauschchromatographie wurde mit an die Kälte ak­ klimatisierten Karottenwurzeln und nicht an die Kälte akkli­ matisierten Karottenwurzeln ausgeführt. Die sich ergebenden Gel-SDS-PAGE-Gele zeigten das Vorliegen einer etwa 38 kDa- Bande in der an die Kälte akklimatisierten Probe. Diese Bande war in der nicht an die Kälte akklimatisierten Wurzel viel weniger ausgeprägt. Diese (etwa) 38 kDa-Bande wurde da­ her einer Gefrierschutzaktivität zugeschrieben.

Für die Proteinsequenzierung wurde das Karottenwurzelprotein mit etwa 38 kDa wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrie­ ben, gereinigt und dann wurde die zu sequenzierende Probe, um eine weitere Reinigung sicherzustellen, aus dem SDS-PAGE- Gel herausgelöst und dann in situ in dem Polyacrylamidgel­ stück proteolytisch aufgeschlossen.

Ansätze aus weitgehend reinem Protein von etwa 38 kDa, die immer noch einige wenige verunreinigende Proteine aufwie­ sen, wurden auf ein 12% Polyacrylamidgel aufgegeben. Drei Bahnen, jeweils mit 2 µg Protein, wurden aufgegeben und in dem Gel einer Elektrophorese unterworfen, bis die Farbfront den Boden des Gels erreichte. Das Gel wurde dann in 0,2% Coomassie-Brilliantblau (Gew./Vol.), 30% Methanol (Vol./Vol.), 1% Essigsäure (Vol./Vol.) für 20 Minuten ange­ färbt und dann mit 30% Methanol entfärbt, bis die Protein­ banden sichtbar gemacht werden konnten. Die 38 kDa-Bande wurde durch Vergleich mit Molekulargewichtsmarkern, die in benachbarten Bahnen aufgetragen waren, identifiziert und die Bande aus jeder Bahn wurde mit einem Skalpellblatt herausgeschnitten, wobei man darauf achtete, verunreinigende Banden auszuschließen.

Die Gelstücke wurden in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überführt und zweimal mit 0,5 ml 50% Acetonitril (Vol./Vol.) 100 mM Tris/HCl, pH 8,5 gewaschen. Das Waschen entfernte einen Teil der Coomassiefärbung und dehydrati­ sierte die Gelstücke auch teilweise. Die Gelstückchen wurden dann aus dem Röhrchen entfernt und einer Lufttrocknung auf der Laborbank unterworfen, bis sie wesentlich zusammenge­ schrumpft waren und anfingen sich aufzurollen. Sie wurden dann in das Eppendorf-Röhrchen zurück überführt und mit zunächst 10 µl 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, das 1 µg Endopro­ teinase Lys C (Boehringer Mannheim) enthielt, rehydrati­ siert. Dies ist eine Proteinase, die Polypeptidketten an der C-terminalen Seite von Lysinresten spezifisch spaltet. Weiterer Tris-Puffer wurde zu den Gelstücken zugegeben, bis sie vollständig rehydratisiert waren und sie wurden dann bei 37°C für 16 Stunden inkubiert.

Nach der Inkubation wurde 1 µl Trifluoressigsäure zu dem Röhrchen zugegeben, um die Reaktion zu stoppen, und dann wurden die Gelstücke zweimal mit 0,3 ml 60% Acetonitril (Vol./Vol.), 0,1% TFA (Vol./Vol.) bei 30°C für 30 Minuten gewaschen. Dies wurde gemacht, um die Gelstücke wieder teil­ weise zu dehydratisieren, um sie schrumpfen zu lassen und die Peptide, die erzeugt worden waren, zu eluieren. Der Überstand wurde in ein anderes sauberes Eppendorf-Röhrchen überführt und dann in einem Zentrifugalverdampfer für 2 Stunden getrocknet, bis die Probe nahezu trocken war und sie wurde auf ein Volumen von 0,1 ml mit 0,1% TFA resuspen­ diert.

Die Peptide wurden dann durch Umkehrphasen-HPLC in einem Smart-Mikroaufreinigungssystem (Pharmacia) getrennt. Der Peptidaufschluß wurde auf eine C18-Säule (2,1 × 100 mm), die in 0,1% TFA (Lösungsmittel A) äquilibriert war, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,1 ml/min aufgegeben. Die Säule wurde dann mit einem Gradienten von 0-70% Lösungsmittel B (90% Acetonitril Vol./Vol., 0,085% TFA Vol./Vol.) über 70 Minuten mit der gleichen Fließgeschwindigkeit eluiert. Die optische Dichte wurde bei 214 nm überwacht und einzelne Pep­ tidpeaks wurden in dem Fraktionssammler durch manuelles Vor­ schieben gesammelt. Die Polypeptide wurden durch Aufgeben in einen Modell 492 Perkin Elmer-Proteinsequenzer unter Verwen­ dung der Flüssigphasenchemie-Zyklen wie vom Hersteller empfohlen sequenziert.

Mehrere Polypeptidfragmente (A-E) wurden in der 38 kDA-Bande analysiert und sie hatten Sequenzen, die im wesentlichen ho­ molog waren zu:

• (A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS
• (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS
• (C) LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS
• (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLY-PRO-VAL- PRO-LEU-PHE-PHE-PRO-GLN-LEU-X-LYS
• (E) X-X-GLU-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEU-PRO-ASN-LEU- LYS

Zellkulturen zur Erzeugung von Gefrierschutzproteinen wurden wie folgt hergestellt:

Neue Zellkulturen wurden basierend auf den in Gamborg und Wetter 1975, Torres 1989, Dodds und Roberts 1985 beschriebe­ nen Methoden initiiert.

An Kälte akklimatisierte Karotte (Herbstkönig ("Autumn King")): die Oberfläche der Lagerwurzel wurde zunächst durch Waschen mit 10% Teepol-Detergens, gefolgt von Scheuern un­ ter fließendem Wasser und dann Abspülen unter fließendem Wasser für 15 Minuten sterilisiert. Wo es praktikabel war (auf der Basis der Größe), wurde die Wurzel geschält. Die Wurzel wurde dann aseptisch in 0,5 cm Scheiben geschnitten, die für 10 Minuten mit Schütteln in 70% Vol./Vol. Ethanol gelegt wurden, gefolgt von 10% Vol./Vol. Domestos + 2 Trop­ fen Tween 20 (Sigma) für 25 Minuten, auch mit Schütteln. Teile wurden dann 3 × mit sterilem, destilliertem Wasser ge­ waschen. Zylinder von etwa 0,5 cm Durchmesser wurden unter Verwendung eines sterilen Skalpels durch die Scheiben ge­ schnitten und der Rest wurde in 2-3 mm Längen geschnitten. Diese Gewebescheiben (verpflanzten Gewebestücke) wurden aseptisch auf festes MS-Medium, das 30 g/l Saccharose, 10 mg/l Indolessigsäure (IAA), 0,1 mg/l Kinetin und 8 g/l tech­ nisches Agar enthielt, überführt, das in 60 ml Sterilin-Be­ hältern enthalten war. Die verpflanzten Gewebestücke wurden im Dunkeln bei 20°C inkubiert.

Wenn notwendig, wurden die resultierenden Kalli in kleinere Teile unterteilt, die auffrisches Medium aufgebracht wur­ den. Suspensionskulturen wurden dann von dem aktiv wachsen­ den Kallus gestartet.

Zusätzliche Karottenzellen-Suspensionskulturlinien (NOR und OX6) wurden von dem Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Leeds, erhalten. 10 ml dieser Kul­ turen wurden alle 7 Tage in 90 ml frisches Murashige und Skoog-Medium (Sigma), das 25 g/l Saccharose und 1 mg/l 2,4-D enthielt, abgeimpft. Die Kulturen wurden in einem Orbital- Schüttelinkubator bei 150 UpM bei 25°C im Dunkeln inkubiert.

Die NOR-Kultur wurde wie folgt kalt behandelt:
18 × 5 ml einer 7d alten NOR-Kultur wurden zu 18 × 100 ml Erlenmeyer-Kolben zugegeben, die 45 ml Karotten MS-Medium enthielten. Die Kulturen wurden bei 25°C wie zuvor beschrie­ ben für 4 Tage inkubiert, dann wurde die Inkubatortemperatur auf 4°C reduziert. 2 Kolben wurden sofort entnommen und die Zellen und das Medium wurden wie zuvor beschrieben, als t=0 geerntet. Die verbleibenden Kolben wurden doppelt bei t=8h, 1d, 2d, 4d, 7d, 9d, 11d und 14d geerntet.

Die Behandlung zur Akklimatisation an die Kälte wurde unter Verwendung größerer Kulturen von sowohl NOR als auch OX6 wiederholt, die nach 4d und 7d Wachstum bei 25°C nach 4°C überführt wurden. Die Kulturen wurden bei t=0, t=7d und t=14d geerntet. Zusätzlich zum Ernten wurde der PCV für jede Kultur zu jedem Zeitpunkt bestimmt.

Die an die Kälte akklimatisierten NOR-Zellen wurden für die Splat-Analyse wie in Beispiel I wie folgt vorbereitet:
Schnell gefrorene Zellen wurden in flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Mörsers und eines Pistills zu einem feinen Pulver verrieben. Die gepulverten Proben wurden in 2 × Volumen 10 mM EDTA + 20 mM Ascorbinsäure resuspendiert, für 30 Sekunden wirbelgemischt und dann bei 10 000 g für 10 Minuten zentrifugiert. 10 µl Aliquote der Überstände wurden unter Verwendung der Pufferkontrolle als eine negative Kontrolle gesplattet. Eine RI-Aktivität konnte in an die Kälte akklimatisierten Zellen und dem Medium bestimmt werden, aber nicht in den nicht an die Kälte akklimatisier­ ten Proben.

Die Medienproben aus der NOR-Suspension wurden wie folgt analysiert. Das NOR-Karottenmedium wurde durch Zugabe von 100 µl 1 M Tris/HCl pH 7,4 gepuffert. Dies wurde dann mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min auf die 1 ml Q-Sepharosesäule (Pharmacia) aufgegeben und gebundene Moleküle wurden mit 3 ml Aliquote 50 mM Tris/HCl pH 7,4, die 0,5 M NaCl Konzentrationen enthielten, eluiert. 1 ml Fraktionen wurden gesammelt.

Dieses Anionenaustauschverfahren wurde auch zur Fraktionie­ rung von t=0, 2d, 4d, 7d, 11d an die Kälte akklimatisierte und t=7d nicht an die Kälte akklimatisierte Mediumproben verwendet. Die Fraktionen wurden auf ihre Aktivität durch das wie in Beispiel I beschriebene Sandwich-Splat-Assay ge­ testet.

Die Gefrierschutzaktivität in dem Kulturmedium wurde durch Gelpermeationschromatographie wie folgt gereinigt. Das 14d an die Kälte akklimatisierte 0,5 M NaCl Eluat von der Q-Sepharose-Säule (Fraktion 2) von oben wurde mit Aceton gefällt und das Pellet wurde in 50 µl 50 mM Tris/HCl + 0,15 M NaCl, pH 7,2 resuspendiert. Dies wurde dann für 10 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert und 20 µl wurden auf eine Superdex 75 Gelpermeationssäule an dem Pharmacia SMART-System aufgegeben. Die Fließgeschwindigkeit betrug 40 µl/min und die mobile Phase war 50 mM Tris/HCl + 0,15 M NaCl, pH 7,2. 80 µl-Fraktionen wurden gesammelt und gesplattet. Dieses Vorgehen wurde unter Verwendung des t=14d nicht an die Kälte akklimatisierten 0,5 M NaCl Eluats von der Q-Sepharose-Säule und frischem Medium wiederholt.

Eine weitere Isolierung der aktiven Proteine kann durch SDS- PAGE-Analyse wie oben beschrieben durchgeführt werden.

Beispiel VIII

Ein Wurzelextrat aus an die Kälte akklimatisierten Karotten­ wurzeln wurde durch Scheuern frisch gezogener an die Kälte akklimatisierter Karotten in kaltem Wasser hergestellt. Die Oberteile wurden entfernt und der Saft wurde unter Verwen­ dung eines Haushaltssaftextraktors (Russell Hobbs, Modell Nr. 9915) extrahiert. Der Saft wurde in 1 Liter Blöcken ge­ froren und bei -20°C vor dem Herausnehmen für eine Verwen­ dung in Eiscremeversuchen gelagert.

Der Karotten-GSP-Saft wurde zu der folgenden Eiscremeformu­ lierung zugegeben:

Bestandteil
Gewichtsteile
Magermilchpulver
10,000
Saccharose	13,000
MD40	4,000
Johannesbrotgummi	0,144
Genulacta L100	0,016
MGP	0,300
Butteröl	8,000
Vanillin	0,012
Wasser	64,528

*Karottenextrakt (aus an die Kälte akklimatisierten Karotten, die 1-10 mg GSP pro kg enthalten)

4,472

Eiscreme wurde durch Einfrieren der oben genannten Formulie­ rung und Belüften bis auf 106% Überlauf hergestellt.

Messungen wurden an frischen Proben und an Proben gemacht, die durch Lagerung bei -10°C über einen Zeitraum von 10 Ta­ gen behandelt worden waren.

Als ein Vergleich wurde eine Probe ohne Karottenextrakt in gleicher Weise gemessen. Die Messungen wurden wie folgt durchgeführt:
Proben wurden bei -18°C in einer Prolan-Klimakammer für etwa 12 Stunden äquilibriert. Drei Proben wurden repräsentativ aus jedem Eiscremeansatz ausgewählt und von jeder wurde ein Objektglas in einer Cryostattemperaturkontrollkammer durch Schmieren einer dünnen Schicht Eiscreme aus dem Zentrum jeden Blocks auf einen Mikroskopobjektträger hergestellt. Ein einzelner Tropfen Testbenzin ("white spirit") wurde auf das Objektglas aufgetragen und ein Deckglas wurde dann auf­ gelegt. Jedes Objektglas wurde dann der Reihe nach auf einen temperaturgeregelten Mikroskoptisch überführt (Leit LaborLux S, Leica x10 Objektiv, Temperatur -18°C). Bilder von Eiskri­ stallen (etwa 400 einzelne Eiskristalle) wurden aufgenommen und durch eine Videokamera (Sanyo CCD) in ein Bildspeicher- und Analysesystem (LEICA Q520MC) übertragen.

Die gespeicherten Eiskristallbilder wurden durch Herumzeich­ nen um die äußere Begrenzungslinie manuell hervorgehoben, was dann den ganzen Kristall hervorhebt. Bilder der hervor­ gehobenen Kristalle wurden dann unter Verwendung der Bild­ analyse-Software vermessen, die die Anzahl der Pixel zählt, die benötigt werden, um die längste gerade Linie (Länge), kürzeste gerade Linie (Breite) und das Seitenverhältnis (Länge/Breite) zu vervollständigen. Die Daten für jeden ein­ zelnen Eiskristall einer Eiscremeprobe wurden in eine Kalkulationstabelle ("spreadsheet") übertragen, wo eine Analyse des Datensatzes ausgeführt wurde, um die mittlere und Standardabweichung zu finden.

Die Messungen der Eiscremehärte wurden unter Verwendung eines Hounsfield H10KM Universal-Testgeräts, einer Hounsfield 100N-Belastungszelle und einer 10 cm zylindrischen Rostfrei-Stahlprobe durchgeführt. Die Eiscremeproben wurden durch 16 Stunden Inkubation von 486 ml Eiscremeblöcken in einer auf -18°C gesetzten Prolan- Temperaturkontrollkammer vorbereitet.

Der Eiscremeblock wurden aus der Prolan-Temperaturkontroll­ kammer entfernt und in das Houndsfield H10KM-Universaltest­ gerät gegeben. Die 10 cm zylindrische Probe wurde in den Eiscremeblock mit einer konstanten Geschwindigkeit von 400 mm/min auf eine Tiefe von 20 mm gedrückt. Die während der Kompression aufgezeichnete maximale Kraft wurde verwendet und als die Eiscremehärte ausgedrückt. Wenn Rißbildung oder Sprödbruch der Probe beobachtet wurde, wurde dies in der rechten Spalte angegeben.

Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

Die folgenden Schlußfolgerungen können gezogen werden.

• a) Die anfängliche Eiskristallgröße ist kleiner in Eis­ creme, das Karotten-GSP enthält, somit zeigt Karotten- GSP eine Rekristallisationsinhibierung.
• b) Eiskristalle in Karotten-GSP-Eiscreme werden in ihren Rekristallisationsprozessen verzögert.
• c) Die Eiskristallform in Karotten-GSP-Eiscremes unter­ scheiden sich nicht wesentlich von Kristallformen, die man in herkömmlichen Eiscremes beobachten kann.
• d) Die Materialeigenschaften von Eiscreme, das Karotten-GSP enthält, sind gegenüber denen für herkömmliche Eiscreme beobachteten verändert. Die Eiscremes sind nämlich här­ ter als herkömmliche Eiscreme, aber immer noch weicher als Eiscreme, die z. B. Fisch-GSPe enthält. Zweitens hat man beobachtet, daß Karotten-GSP enthaltende Eiscreme bricht.

Sehr gute Ergebnisse können gleichfalls unter Verwendung von Geranium oder Juncus squarrosus erhalten werden.

Beispiel IX

Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung verschiedener Pro­ teine aus Winterroggen und deren Untersuchung.

Die Blätter von 30 Tage an Kälte akklimatisierte Roggen­ pflanzen wurden in 3 cm Längen geschnitten und in destil­ liertem Wasser gründlich gewaschen, um jegliche Zellinhalte zu entfernen. Die Blattstücke wurden auf einem Papierhand­ tuch trocken getupft und in ein Extraktionsmedium aus 5 mM EDTA, 10 mM Ascorbinsäure, 2 mM Capronsäure, 2 mM Benzamidin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) vollständig untergetaucht. Sie wurden dann in einem Büchner-Kolben für 60 Minuten Vakuum infiltriert und nach dieser Zeit wurden die Blätter entfernt und vollständig trockengetupft. Sie wurden dann in Längsrichtung in einer aufgeschnittenen Pla­ stikspritzenhülse angeordnet und bei 2000 X g für 30 Minuten sanft zentrifugiert. Das apoplastische Extrakt wurde in einem Eppendorf-Röhrchen unter der Spritze gesammelt.

Das apoplastische Extrakt wurde unter Verwendung eines Ami­ con-Ultrafilters mit einer PM10 Membran 7 mal konzentriert. Die anfängliche Aufreinigung wurde durch Beladen von 50 µl des konzentrierten apoplastischen Extrakts auf eine Größen­ ausschluß -Superdex 75 PC 3.2/3.0 (Trennungsbereich 3-70 kDa) Säule an einem SMART-Trennungssystem, beide von Pharmacia, durchgeführt. Der Puffer war 50 mM Tris/HCl bei pH 9,5. Die Trennung wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 µl pro Minute durchgeführt und 50 µl Fraktionen wurden bis zu einem Volumen von 2,5 ml gesammelt und auf Rekristallisation wie in Beispiel I beschrieben, durchgesehen.

Die aktiven Fraktionen wurden auf eine starke Anionenaus­ tausch-MonoQ-FPLC-Säule von Pharmacia gegeben, die in 50 mM Tris/HCl bei pH 9,5 äquilibriert war, und die Proteine wur­ den unter Verwendung des gleichen Puffers mit einem linearen Gradienten bis 0,5 M NaCl eluiert. Der Elutionspuffer wurde bis zu einer Konzentration von 0,5 M NaCl über 25 Minuten zugegeben, für 10 Minuten gehalten und auf 0 M über 15 Minu­ ten reduziert. Die Chromatographie wurde bei einer Fließge­ schwindigkeit von 1 ml pro Minute durchgeführt und 1 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen, die in dem Test gemäß Beispiel I positiv waren, wurden an einer Centrican PM10 Zentrifugalkonzentriervorrichtung bei 7000 UpM aufkon­ zentriert, bis das Volumen auf 50 µl reduziert war und sie wurden ein zweites Mal auf die 575-Säule gegeben. Die Frak­ tion, die den Test aus Beispiel I erfüllte, war ein einzel­ ner Peak bei etwa 150 mM Salz.

Diese aktive Fraktion wurde an SDS-PAGE (gleiches Vorgehen wie in Beispiel VII) getrennt. Dies bestätigte, daß die 32 kDa-Fraktion die aktive Fraktion war.

Die 32 kDa-Fraktion aus Winterroggenprotein kann vorteilhaft bei der Herstellung gefrorener Konfektprodukte verwendet werden.

Claims (9)

1. Gefrorenes Konfektprodukt, umfassend ein oder mehrere aus Pflanzen stammende GSPe, worin die GSPe in einer wäßrigen Zusammensetzung nach schnellem Gefrieren auf -40°C oder weniger, gefolgt von einer Lagerung für 1 Stunde bei -6°C eine Eiskristallgröße von weniger als 15 µm aufweisen.

2. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 1, worin das GSP aus Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontanum, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix fragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer saccharoides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (Karotte), Vinca minor (Immergrün), Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa annua ("speargrass"), Poa pratensis (Wiesenrispengras), Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis und Festuca contracta stammt.

3. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 2, worin das GSP aus der Flechtenfamilie stammt, insbesondere Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, Usnea subfloridana.

4. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 2, worin das GSP aus Juncus squarrosus oder Geranium stammt.

5. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 2, worin das GSP seine Fähigkeit zur Begrenzung des Eiskristallwachstums nach einer Wärmebehandlung über eine Temperatur von 60°C für einen Zeitraum von mindestens 30 Sekunden, bevorzug­ ter mehr als 1 Minute, beibehält.

6. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 5, worin das GSP aus Acer saccharoides, Bambus, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis und Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua stammt.

7. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 1, worin das GSP aus einer nicht-toxischen Pflanze stammt.

8. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 2, worin das GSP, das aus Winterroggen stammende 32 kDa-Protein ist.

9. Gefrorenes Konfektprodukt nach Anspruch 2, worin das Produkt im wesentlichen frei ist von GSPen aus Winter­ roggen.