DE1227615B

DE1227615B - Verfahren zur Herstellung stabiler Impfstoffpraeparate

Info

Publication number: DE1227615B
Application number: DEP32328A
Authority: DE
Inventors: Wilton Adair Rightsel; Edward Emerson Schuler; Grose Ponite Woods
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1962-08-16
Filing date: 1963-08-01
Publication date: 1966-10-27
Also published as: SE314774B; BR6351350D0; CH412201A; FI40108C; DK104193C; FR1594506A; US3186908A; FI40108B; ES290512A1; GB1049386A

Description

Verfahren zur Herstellung stabiler Impfstoffpräparate Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung stabiler Impfstoffpräparate, z. B. Virusimpflösungen' durch Gefriertrocknung. Das neue Verfahren ist gekennzeichnet durch den Zusatz von Calciumlactobionat und gegebenenfalls von Lactose.
Bekanntlich verlieren technische Virusmassen leicht ihre antigene Wirksamkeit bei der Lagerung.
Es wurde bereits vorgeschlagen, eine stabilisierende Substanz zuzusetzen, z.-B. Sorbit oder Dimethylsulfoxyd. Bei der Herstellung von Impflösungen wirkt erschwerend, daß die Impfmasse durch Ausfrieren getrocknet wird, um ein wasserfreies Produkt zu erhalten, oder einfach gefroren wird, um einen Zustand maximaler Beständigkeit zu erzielen, wobei dann nach Bedarf zum Einfüllen in Flaschen aufgetaut wird. Wenn, wie bei der technischen Herstellung, die Impfmasse größer ist als zum sofortigen Einfüllen erforderlich ist, muß die überschüssige Impflösung wieder gefroren und bis zum weiteren Einfüllen aufbewahrt werden. Dieses führt - zu mehrfachem Gefrieren und Auftauen, was ohne stabilisierende Substanzen zu einem vorzeitigen Verlust an Antigenwirkung führt. Hohe Salzkonzentrationen üben einen schädlichen Einfluß auf die Antigenwirkung aus, daher sind Salze als Stabilisatoren schädlich. Die Salzkonzentration erhöht sich beim Trocknen durch Entfernung von Wasser fortschreitend, wodurch die antigenen Faktoren ansteigend einer möglichen Zerstörung ausgesetzt werden. Auch erniedrigen Salze die Gefriertemperatur. Hygroskopische Stoffe sind gleichfalls ungünstig, da sie in hoher Konzentration Sirupmassen bilden, die insbesondere während der Trocknung schwierig zu handhaben sind.
Calciumlactiobionat ist insbesondere gegenüber Sorbit und Dimethylsulfoxyd vorteilhafter, da es, wie Versuche an Poliomyelitisviren ergeben haben, durch Trocknung bei - 76, 0 und + 200 C nicht nur bei sehr tiefen Temperaturen stabilisierend wie Sorbit wirkt, sondern auch bei höheren Temperaturen. Dies zeigen die nachstehenden Versuche: Poliomyelitisvirus-Vaccine Eine Stammlösung von wäßrigen, lebenden nicht abgeschwächten Poliomyelitisvirus-Vaccinen (Typ III, Stamm Saukett) wurde in üblicher Weise hergestellt, indem man eine Virusimpflösung auf Nierenzellen von Affen mit dem Gemisch 199 als Erhaltungsmedium für die Zellen entwickelte und anschließend das anfallende Viruskulturmedium abfiltrierte, wobei man eine gewebefreie Virusflüssigkeit erhielt. Bei Untersuchungen in zwei Reihen nach der Plattentitrationsmethode (Journal of Immunology, 76, S. 464 bis 474, 1956) betrug der Infektivitätstiter der Flüssigkeit (ausgedrückt als. 50°/., Infektionsgewebekulturdosis, TGID56) 10-5.6 und 10-5 'Um die Wirkung der Gefriertrocknung auf die Infektivität (Lebensfähigkeit) der Impflösung mit und ohne Stabilisator zu bestimmen7 wurden vier aliquote Teile der Flüssigkeit ausgewählt. Einer wurde ohne Stabilisator verwendet, und den anderen drei wurde je eine der folgenden drei Stabilisierungssubstanzen zugegeben, nämlich Dimethylsulfoxyd (2 Gewichtsprozent), Sorbit (5 Gewichtsprozent) und Calciumlactobionat (1 Gewichtsprozent) mit Eiweiß (Menschenalbumin 1 Gewichtsprozent).
Es wurden folgende Proben erstellt: eine nichtgefrorene Kontrollprobe, eine gefrorene Kontrollprobe und Proben nach Trocknung bei 0, - 76 und +200 C, Doppelproben wurden für jede Variation mit Ausnahme der Trocknung bei + 200 C, für die nur eine Probe vorgesehen wurde, ausgewählt.
Die Proben wurden langsam 5 Sekunden bei 760 C gefroren. Die Proben für die Trocknung wurden dann durch Sublimation unter Vakuum bei den genannten Temperaturen getrocknet. Die Trock- nungszeit betrug 18 Stunden bei 0°C, 72 Stunden bei -76° C und 12 Stunden bei +20° C. Nach der Bearbeitung wurden alle Proben bei -65° C gelagert.
7 Tage nach dem Trocknen wurden alle Proben auf die Infektivität nach der Plattentitrierungsmethode untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuche, der sich ergebenden Infektivitätstiter (TCID50) sind nachstehend wiedergegeben.
Stabilität von Poliomyelitisvirus Nichtstabilisierte Vaccine Titer (TCID50) Nichtgefrorene Kontrollprobe.. 10-5,6 10-5,7 Gefrorene Kontrollprobe .. 10-5,7 10-5,6 Gefrorene Probe, getrocknet bei 0° C... 10-3,6 10-3,3 Gefrorene Probe,getrocknet bei -76° C < 10-3,0 < 10-3,0 Gefrorene Probe,getrocknet bei +20° C < 10-3,0 Vaccine mit Dimethylsulfoxyd Nichtgefrorene Kontrollprobe .. 10-5,9 10-5,6 Gefrorene Kontrollprobe .. 10-5,8 10-5,6 Gefrorene Probe,getrocknet bei 0° C... < 10-3,0 < 10-3,0 Gefrorene Probe,getrocknet bei -76° C < 10-3,0 < 10-3,0 Gefrorene Probe,getrocknet +20° C < 10-3,0 Vaccine mit Sorbit Nichtgefrorene Kontrollprobe .. 10-6,2 10-5,7 Gefrorene Kontrollprobe .. 10-5,6 10-5,6 Gefrorene Probe,getrocknet bei 0° C... < 10-3,0 < 10-3,0 Gefrorene Probe,getrocknet bei -76° C < 10-3,0 10-3,7 Gefrorene Probe,getrocknet bei +20° C < 10-3,0 Vaccine mit Calciumlactobionat-Eiweiß Nichtgefrorene Kontrollprobe ... 10-5,6 10-5,7 Gefrorene Kontrollprobe .. 10-5,4 10-5,4 Gefrorene Probe,getrocknet bei 0° C.. 10-4,2 10-4,5 Gefrorene Probe,getrocknet bei -76° C 10-4,4 10-4,4 Gefrorene Probe,getrocknet bei +20° C 10-3,6 Die Ergebnisse zeigen also, daß ein Stabilisator notwendig ist, um eine merkliche Stabilität der Infektivität unter verschiedenen Trockenbedingungen aufrechtzuerhalten. Weiter ergibt sich, daß Calciumlactobionat ein wesentlich besserer Stabilisator als die üblichen untersuchten Stabilisatoren ist und daß das Trocknen mittels Lactobionat-Stabilisierung auch bei relativ hohen Temperaturen mit Erfolg durchgeführt werden kann.
Da Salze in Impflösungen und Antigenmassen außerordentlich unerwünscht sind, ist es über- raschend, daß die Produkte nach der Erfindung, die zusätzlich Calciumlactobionat enthalten, hinsichtlich der Antigenbeständigkeit weit besser sind als gleichartige Massen, die kein Calciumlactobionat enthalten.
Außerdem können die flüssigen Antigene nach der Erfindung in trockene, schuppenartige Pulver übergeführt werden ohne Bildung von schwierig zu handhabenden Sirupmassen oder anderen hygroskopischen Formen. Ein weiterer unerwarteter Vorteil besteht darin, daß, während es im allgemeinen bei zahlreichen Impflösungen notwendig ist, sie auszufrieren und bei einer außerordentlich tiefen Temperatur zu halten, um eine höchste Stabilität während der Lagerung zu erzielen, die Produkte nach der Erfindung, wenn sie gefroren sind, bei merklich höheren Temperaturen über lange Zeiten ohne wesentlichen Verlust an Wirksamkeit aufbewahrt werden können. Zum Beispiel können gewöhnliche Masernvaccinen, die normalerweise etwas Calciumchlorid enthalten, bei Temperaturen unter etwa 600 C aufbewahrt werden. Außerdem können die Produkte nach der Erfindung mehrmaligem Frieren und Wiederauftauen unterworfen werden ohne unmäßigen Verlust an Antigenwirksamkeit.
Die Erfindung bezieht sich, im Breiten gesehen, auf antigene Virusmassen und umfaßt insbesondere Virusmassen in trockener und wasserhaltiger Form, die entweder Impflösungen sind oder zur Herstellung von Impflösungen oder Antiseren verwendet werden können.
Die Erfindung ist allgemein auf Virusimpflösungen einschließlich lebender, abgeschwächter Virusimpflösungen anwendbar. Als Beispiele seien einige der vielen Impflösungen, bei denen die Erfindung angewendet werden kann, genannt: Poliomyelitis, Masern, infektiöse Hepatitis, gelbes Fieber, Mumps, Tollwut und Windpocken. Diese Impflösungen werden- erhalten durch übliche bekannte Verfahren der Technik. Die Erfindung ist auch anwendbar auf die Stabilisierung von Virusimpflösungsausgangsstoffen, wie Viruskulturfiltrate, Zentrifugate und ähnliche Produkte, unfertige Virusimpflösungen, Impflösungsmassen oder andere antigene Stoffe, die sich in der Verarbeitung befinden. In der nachfolgenden Beschreibung wird die Erfindung zwecks Erläuterung mit besonderer Betonung auf fertige Impflösungen und deren Herstellung beschrieben, die Erfindung ist allgemein auf stabilisierte Virusmassen gerichtet und nicht auf fertige Impflösungen beschränkt.
Calciumlactobionat ist relativ billig und technisch in hoher Reinheit verfügbar. Technische Massen sind im allgemeinen zufriedenstellend, aber raffinierte Qualitäten, die sich der nachstehenden Analyse nähern oder sie überschreiten, werden bevorzugt.
Calcium . . . ...... . 4,94 °/o Feuchtigkeit . . .. 5,14e/o Gesamtreduzierende Stoffe, wie Lactose H2O . . 0,27% Schwermetalle . . 10 Teile je Million pH-Wert in 100/oiger Lösung . . 6,5 bis 7,5 Die anzuwendende Menge Calciumlactobionat kann in Abhängigkeit von der Art der Impflösung, der relativen Labilität des vorhandenen Antigens und anderer Faktoren variiert werden. Zweckmäßig wird das Calciumlactobionat als trockenes Pulver oder als verdünnte wäßrige Lösung unter kräftigem Durchmischen bei niedriger Temperatur zugesetzt, um eine homogene Suspension oder Lösung zu erhalten. Im allgemeinen wird eine Konzentration von mindestens 0,1 Gewichtsprozent je Volumen angewendet. Für höchste Stabilität wird eine Konzentration von 1 Gewichtsprozent je Volumen bevorzugt. Konzentrationen von etwa 5 Gewichtsprozent je Volumen sind ebenfalls zufriedenstellend. Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung hoher Konzentrationen, obgleich der gewünschte Stabilisiereffekt mit steigender Konzentration weniger kennzeichnend wird. Trockene stabilisierte Produkte werden aus den erwähnten flüssigen Produkten zweckmäßig durch-übliche technische Trockenverfahren, z. B. durch Trocknen durch Ausfrieren gewonnen. Bezogen auf das Gewicht, enthalten solche wasserfreien Produkte eine hohe Konzentration an Calciumlactobionat relativ zu den gesamten Feststoffen. Die Erfindung umfaßt wie angegeben nicht nur flüssige, wäßrige Virusmassen und Impflösungen, sondern auch trockene, nichtwäßrige Produkte, wie sie durch Trocknen der erwähnten wäßrigen Produkte erhalten werden können.
Als eventuelles Merkmal der Erfindung zur Verstärkung des antigenen Effektes können die Produkte zusätzlich kleine Mengen von immunogen verträglichem Eiweiß oder Polypeptid, z. B. menschliches Albumin, Protamin, Pepton u. ä., enthalten, z.B. kann man etwa 1 bis 5 Gewichtsprozent je Volumen Protein oder Polypeptid verwenden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung, die sich auf das Trocknen von flüssigen Produkten bezieht und nicht nur eine leichtere Handhabung ergibt, sondern auch den Stabllisiereffekt verstärkt, wird zusätzlich zu dem Calciumlactobionat eine kleine Menge, z. B. etwa 2 bis 10 Gewichtsprozent je Volumen, vorzugsweise etwa 50/0, Lactose zugesetzt. Das Trocknen wird dadurch erleichtert, indem die Lactose eine besonders verträgliche und gut verarbeitbare Grundmasse ergibt. Darüber hinaus sind trockene Produkte, die Lactose enthalten, im allgemeinen hinsichtlich der Antigenwirkung stabiler als solche ohne Lactose.
Die Produkte nach der Erfindung werden vorteilhaft unter aseptischen Bedingungen unter Verwendung von Komponenten, die vorzugsweise bakteriell steril gemacht sind, verarbeitet. Sterilität beim Lagern kann durch Zusatz einer mit dem Antigen verträglichen keimtötenden Substanz, wie Thimerosal oder Benzethoniumchlorid, erreicht werden, jedoch ist für Produkte, die in den trockenen, festen Zustand übergeführt sind, die Verwendung eines germiziden oder sterilisierenden Mittels im allgemeinen unnötig.
Wenn nicht anders angegeben, werden die antigenen Stoffe vorzugsweise, wenn möglich während ihrer Herstellung, in der Kälte von etwa 40 C gehalten.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert, aber nicht begrenzt. Die Konzentration der Bestandteile ist in Gewichtsprozent je Volumen angegeben, falls nichts anderes vermerkt ist.
Beispiel 1 a) Herstellung von Gewebekulturzellen Gewebekulturzellen, hergestellt aus 11 oder 12 Tage alten bebrüteten Hühnereiern unter Verwendung der üblichen Trypsinierung, werden stationär in Flaschen gezüchtet und 3 bis 5 Tage entwickelt. Das -Wachstumsmedium der Zellen ist ein synthetisches Medium 199. Die Zellmonoschichten werden zweimal mit 100 ccm Medium 199, das 1 Mikrogramm-Streptomycin enthält, bei pH 7,4 bis 7,6 gewaschen. b) Beimpfung der Zellen Nach dem Waschen werden 50 ccm Lösung mit 1000 bis 10 000 500/oigen Gewebekulturinfektionsdosen TCID50 von abgeschwächtem Masernvirus Edmonston-Stamm, suspendiert in Medium 199, zu jeder Gewebekulturflasche versetzt. Der Virusstamm ist erhältlich von der Research Division of Infectious Diseases, The Children's Medical Center, Boston, Mass., Cf., American Journal of Publish Health 47, S. 275 bis 282 (1927), Connecticut Medecine, 23, S. 561 bis 677 (1959). c) Entwicklung Die beimpften Kulturen werden stationär bei 320 C -entwickelt, bis etwa zwei Drittel bis drei Viertel der -Monoschicht einen cytopathischen Effekt zeigen, gewöhnlich 7 bis 14 Tage nach der Beimpfung, zu welcher Zeit der Virusgehalt optimal ist. d) Ernte Die Zellschichten der entwickelten Kulturen werden in den Flüssigkeiten suspendiert und als gemeinsame Masse in einem gekühlten Behälter gesammelt.
Die anfallende Suspension wird 10 Minuten bei 40 C bei 1500 Umdrehungen je Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird von den dicht gepackten Zellbruchstücken kalt durch ein Filter (mittlere Glasfritte) filtriert, um etwa zurückbleibende kleine Bruchstücke zu entfernen. Die anfallende überstehende Flüssigkeit ist als Masernimpflösung geeignet, aber hinsichtlich der Antigenwirksamkeit relativ unbeständig, wenn sie länger gelagert wird, bei einem mehrmaligen Gefrieren und Auftauen, bei einem Trocknen durch Gefrieren u. ä.
Das Nachstehende ist eine Beschreibung der Herstellung von stabilisierten Masernimpflösungen aus Antigenausgangsstoffen, hergestellt gemäß den vorstehenden Arbeitsweisen. Ebenso wird ein Vergleich des Antigenverhaltens von nichtstabilisierten und stabilisierten Masernimpflösungen beschrieben, wenn sie verschiedenen Umgebungsbedingungen unterworfen werden, wie sie beim Gefrieren, Trocknen und Lagern auftreten. Die verwendeten, nichtstabilisierten Impflösungen waren überstehende Flüssigkeiten, wie sie bei der Arbeitsweise nach 1, d) erhalten werden, hernach als Kontrolle bezeichnet und die gleichen Flüssigkeiten, denen 1 0/o menschliches Albumin zugesetzt war, hernach bezeichnet als Kontrolle mit Albumin.

Stabilisierte Impflösungen Getrennte, aliquote Teile von überstehenden Flüssigkeiten aus Masernvirus, erhalten nach der Arbeitsweise nach 1, d), wurden mit 1 O/o Calciumlactobionat vermischt (Reinheitsgrad Sheffield Chemical Div., Sheffield Farms Co., Inc., Norwich, Conn); ferner mit 1 und 5 0/o Calciumlactobionat und 1 6/o menschlischem Albumin, weiter mit Calciumlactobionat, 1?/o menschlichem Albumin und 5 0/o Lactose. In jedem Fall wurden die Bestandteile gründlich in der Kälte durchgemischt, um eine homogene Flüssigkeit zu ergeben. Die anfallenden Produkte hatten die nachstehende Zusammensetzung, bezogen auf das Gesamtvolumen der Impflösung: Vaccine A 10/o Calciumlactobionat Vaccine B 1 °/o Calciumlactobionat 14/o Albumin Vaccine C 50/0 Calciumlactobionat 10/o menschliches Albumin Vaccine D 10/o Calciumlactobionat 1% menschliches Albumin 5% Lactose Die Beständigkeit gegen Wirksamkeitsverlust während des Trocknens durch Gefrieren wird gezeigt, indem man die Vaccine C und D sowie eine Kontrollimpflösung einem üblichen Trocknen durch Gefrieren bei 0°C, Virtistrockner (Modell P-24-PR der Virtis Company Inc., in Gardiner N.Y.) unterwirft. Die Wirksamkeit vor und nach dem Trocknen, ausgedrückt als Infektivitätstiter, wurde für jede Impflösung bestimmt. Diese Bestimmung wurde ausgeführt, indem man Monoschichtkulturen von Hühnerembryozellen mit aliquoten Mengen der entsprechenden Impflösung versetzte, beimpfte und die Entwicklung von Plattenbildung beobachtete gemäß dem Verfahren, wie es beschrieben ist von Dulbecco et al in J. Exper. Med., 99, S. 167 (1954). Der Infektivitätstiter, der sich direkt auf die Antigenwirksamkeit der Impfprobe bezieht, wird ausgedrückt als Plattenbildungseinheit (PFU) je Kubikzentimeter Impflösung. Es wurden die nachstehenden Ergebnisse erhalten: Tabelle I

PFU

Infektivitäts-

je Kubik-

Impflösung titer

zentimeter

vorgetrocknet getrocknet

Kontrolle mit Albumin .. 33 110 5 888

Vaccine . . 10 000 8511

Vaccine D .. . | 19 950 | 18 200

Diese Ergebnisse zeigen, daß, während die stabilisierten Masernimpflösungen C und D nur einen mäßigen Verlust an Wirkung beim Trocknen erlftten, die Kontrollprobe, die keinen Stabilisator enthielt, über 80% ihrer Wirkung verlor.

Der stabilisierende Effekt beim Trocknen (Sublimation unter Vakuum) und der Lagerung während 7 Tagen wurde ebenfalls bestimmt. Bei dieser Arbeitsweise wurden verschiedene Muster der lmpflösung B der Kontrolle mit Albumin, verschiedenen Trocknungstemperaturen, O, 400 C und einem Bereich von 0 bis 400 C unterworfen und einer Lagerung bei + 15 und - 800 C. Die Wirkung (Infektivitätstier) wurde zu Beginn und am Ende jedes Versuchs bestimmt. Es wurden nachstehende Ergebnisse erhalten: Tabelle II

Endinfektivitätstiter(PFU/ccm)

Sublimations- Lager-

Kontrolle

temperatur temperatur mit Albumin, Impflösung B

zu Beginn zu Beginn

°C °C 8 913 000 8 913 000

0 15 5 248 2138000

O -80 31620 2951000

-40 15 5 248 1288000

-40 -80 <5012 2239000

Obis-40 15 <5012 1698000

Obis-40 -80 <5012 2512000

| . | Diese Ergebnisse zeigen, daß die Kontrollimpflösung in jedem Fall über 900/0 ihrer anfänglichen Wirkung verlor. Im Gegensatz hierzu zeigen die Ergebnisse auch, daß eine Impflösung, die gemäß der Erfindung stabilisiert war, während des Trocknens und Lagerns eine bemerkenswerte Wirkung beibehält.

Eine Beständigkeit gegen Wirksamkeitsverlust bei Gefrieren und Auftauen im Kreislauf wurde ebenfalls bestimmt. Bei dieser Arbeitsweise wurden Impflösung B und eine Kontrolle mit Albumin nacheinander bei -760C gefroren und bei +37,50C wieder aufgetaut, bei achtmaliger Wiederholung. Die Wirkung der Impflösungen wurde vor dem ersten -Kreislauf und nach dem ersten, zweiten und vierten und achten Kreislauf mit nachstehenden Ergebnissen bestimmt.

Tabelle III

Gefrier-Auftau- Infektivitätstiter (PFU/ccm)

Kreisläufe KontrollemitAlbumin - Impflösung B

0- 16220000 19050000

1 15 490 000 18 620 000

2 11 220 000 18 620 000

4 9 333 000 15 140 000

8 5 129 000 11 480 000

Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Impflösung gemäß der Erfindung eine gute Beständigkeit bei den Gefrier- und Taukreisläufen zeigt. Obgleich diese Impflösung und eine Kontrollimpflösung beide fortschreitend an Wirkung verloren, je mehr die Zahl der Kreisläufe anstieg, behielt die erste ihre Wirksamkeit über eine mittlere Kreislaufzahl bei doppeltem Ausmaß bei.

Zur weitere Erläuterung wurde die Beständigkeit gegenüber einem Wirkungsverlust für getrocknete Produkte bei längerer Lagerung bei 40 C gezeigt. Die Produkte der Masernimpflösung (measles control) und Impflösung A und B nach einem Trocknen durch Gefrieren wurden gelagert und von Zeit zu Zeit auf Wirksamkeit untersucht mit dem nachstehenden Ergebnis: Tabelle IV

Infektivitätstiter (PFU/ccm)
Lagerungszeit Kontrolle Impflösung A Impflösung B
(Wochen) vorgetrocknet - vorgetrocknet vorgetrocknet
10000 - 12590 3162
1 692 -
8 \| - \| - \| 3467
9 50 -
17 <10 - 3800
19 - 870
28 - 646
40 - . - 3310

Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Kontrollimpflösung ohne Stabilisator nach 4 Monaten Lagerung praktisch alle Antigenwirkung verloren hat, während die Impflösungen gemäß der Erfindung eine bemerkenswerte Antigenwirkung über viel längere Zeitdauer beibehalten.

In einem anderen Versuch wurde die Beständigkeit gegenüber dem Wirkungsverlust bei einem gefrorenen Impfprodukt gezeigt, das gelagert wurde im Vergleich zu einer Kontrollimpflösung. Es wurden zwei Temperaturen zum Gefrieren mit dem nachstehenden Ergebnis verwendet: Tabelle V

Gefrier- Lager- Infektivitätstiter in Intervallen (PFU/ccm)

temperatur temperatur Kontrollimpflösung | Vaccine B

o C o C Zeit: 0 l nach 1 Woche I nach 1 Monat I Zeit: 0 j nach 1 Woche Zu nach 1 Monat

-20 -40 10 230 000 3 162 000 2 630 000 14 790 000 5 012 000 10 000 000

-65 -40 12 590 000 794 300 631 000 14 450 000 17 380 000 15 850 000

Die Ergebnisse zeigen, daß die nichtstabilisierte Kontrollimpflösung, die bei niedriger Temperatur gelagert wurde, einem größeren Wirkungsverlust unterliegt, während die Impflösung gemäß der Erfindung unter den gleichen Bedingungen innerhalb der Grenzen der experimentellen Genauigkeit seine ursprüngliche Wirkung ohne Verlust beibehält.

Die stabilisierten Masernimpflösungen, hergestellt wie beschrieben, können direkt für immunogene Zwecke verwendet werden. Ein bevorzugtes Produkt ist eine zellfreie Maserngewebekulturflüssigkeit, der 10/o Calciumlactobionat und 1 °/o menschliches Albumin zugefügt sind, das durch Gefrieren getrocknet und in einer Einzeldosisfiasche unter aseptischen Bedingungen verpackt wurde, um eine Mindesteinheitswirksamkeit von 1000 PFU zu ergeben.
Dieses Produkt besitzt eine gute Beständigkeit, wobei es geeignet ist für die Verabreichung, wenn es wieder mit Wasser versetzt ist, und ist, wie gefunden wurde, klinisch verwendbar.
Das vorstehende Verfahren kann auch für die Stabilisierung von anderen Impflösungen verwendet werden, die sich von verschiedenen Virusimpflösungsausgangsmaterialien ableiten. Zum Beispiel kann man an Stelle von Masernimplösungen eine nichtaktivierende Mumpsvirusimpflösung verwenden (100 Kükenzellenagglutinierungseinheiten CCA je Kubikzentimeter) mit 1: 10 000 Thimerosal, insbesondere wurden zu dieser Lösung 1 °/o Lactobionat und 1 0/o menschliches Albumin zugesetzt, und das Gemisch wurde in der Kälte gerührt, um eine homogene Lösung zu geben. Die Lösung wurde bei 40 C gelagert und nach Bedarf zur Verteilung in Flaschen eingefüllt.
Beispiel 2 Eine zellfreie Kuhpocken-Virusgewebekultur als überstehende Flüssigkeit wurde wie folgt hergestellt: Unter Verwendung der üblichen Trypsinierung wurde eine 7 Tage alte Monoschichtkultur von Rinderembryohaut hergestellt. Es wurde synthetisches Medium 199 zu den Kulturen gegeben und alle Kulturen wurden beimpft mit je 50 ccm einer Suspension, die Kuhpockenvirus 1000 TCID<o enthielt. Die beimpften Kulturen wurden 4 bis 7 Tage entwickelt, und die Flüssigkeiten wurden geerntet, gereinigt und zentrifugiert.

Um den Stabilisierungseffekt von Calciumlactobionat in Kuhpocken-Virusimpflösungen zu bestim- men wurde ein aliquoter Teil der überstehenden Flüssigkeit aufbewahrt für Kontrollzwecke, und ein anderer aliquoter Teil wurde durch Zumischen von Calciumlactobionat bis zu einer Konzentration von 10/o stabilisiert. Die anfallende stabilisierte Impflösung und die Kontrollimpflösung wurden beide ausgefroren und in einem Virtistrockner getrocknet. Die Antigenwirkung als Infektivitätstiter wurde vor und nach der Trocknung mit den nachstehenden Ergebnissen bestimmt.

Infektivitätstiter (PFU/ml)

vor dem nach dem

Gefrier- Gefrier-

trocknen trocknen

Kontrollimpflösung . 3 981 000 1585000

Impflösung, stabilisiert mit

lo/o Calciumlactobionat 4169000 5000000 +

Diese Ergebnisse zeigen, daß die nichtstabilisierte Kontrollimpflösung während der Gefriertrocknung über die Hälfte ihrer Wirkung verlor. Unter den gleichen Bedingungen behielt die Impflösung, die mit Calciumlactobionat stabilisiert war, ihre Wirkung in großer Höhe ohne merklichen Verlust bei.

Das vorstehende Verfahren kann auch für die Stabilisierung anderer antigener Stoffe verwendet werden, z. B. kann man an Stelle von Kuhpocken-Virusfiüssigkeit ein wäßriges Medium verwenden, das Poliomyelitisvirusantigen enthält, z. B. ein Affengewebekulturfiltrat, mit einer oder mehreren Arten 1-, 2-, oder 3-Poliomyelitisvirus, die durch Behandlung mit Formaldehyd und teilweise indem sie ultraviolettem Licht ausgesetzt waren, abgetötet waren (vgl. britische Patentschrift 802 048). Man kann auch ein Zentrifugat von Embryo-Amniotic-Kulturffüssigkeit verwenden, das Mumpsvirus enthält. Infektivitätstiter (Blutagglutination) 10-4.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung stabiler Impfstoffpräparate durch Gefriertrocknung von Virussuspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Suspensionen Calciumlactobionat und gegebenenfalls Lactose zusetzt.

In Betracht gezogene Druckschriften: USA.-Patentschrift Nr. 2 879 202.