DE10132211A1

DE10132211A1 - Nachweis spezifischer Dinukleotide in DNA-Proben durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)

Info

Publication number: DE10132211A1
Application number: DE10132211A
Authority: DE
Inventors: David Guetig
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2003-01-16
Also published as: WO2003002759A2; EP1412524A2; WO2003002759A3; US20040248120A1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Detektion spezifischer Dinukleotide in einer DNA-Probe beschrieben. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird unter Verwendung a) eines Nukleotids, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, von dem eine ausreichende Menge durch ein Donor-Fluorophor markiert und b) ein anderes Nukleotid, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, von dem eine ausreichende Menge mit einem Akzeptor-Fluorophor markiert ist, durchgeführt. Das Verfahren bestimmt oder quantifiziert die Anwensenheit des Dinukleotids durch Messung des Ausmaßes des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) zwischen dem Donor- und Akzeptor-Fluorophor.

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf die Analyse von Nukleinsäuren, insbesondere auf die Analyse bestimmter Dinukleotide in einem bestimmten DNA-Fragment. Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in genomischer DNA, indem sie ein Mittel zur Detektion von CpG-Dinukleotiden bereitstellt, die charakteristisch für methylierte Stellen der genomischen DNA nach der Bisulfit-Behandlung sind. Das Verfahren nutzt den Einbau von Fluorophoren und die Detektion von Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) der amplifizierten Proben-DNA im doppesträngigen und einzelsträngigem Zustand.

Stand der Technik

DNA-Methylierung

Die in den letzten Jahren in der Molekularbiologie studierten Beobachtungsebenen konzentrierten sich auf Gene, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die Transkription der RNA in Proteine. Die Analyse der Regulationsmechanismen in Zusammenhang mit der Genkontrolle war stärker beschränkt. Die Genregulation, zum Beispiel auf welcher Stufe der Entwicklung eines Individuums ein Gen aktiviert oder inhibiert wird, und der gewebsspezifische Charakter dieser Regulierung werden weniger gut verstanden. Jedoch kann dies mit einem hohen Grad an Wahrscheinlichkeit mit dem Ausmaß und Charakter der Methylierung des Gens oder Genoms korreliert werden. Aus dieser Beobachtung kann sinnvollerweise gefolgert werden, dass pathogene genetische Störungen mittels abweichender genetischer Methylierungsmuster detektiert werden können.
Die Bemühungen des Humangenom-Projektes konzentrieren sich auf die Sequenzierung des menschlichen Genoms. Man erwartet, dass dies bedeutenden therapeutischen und diagnostischen Nutzen für die Behandlung von Krankheiten erbringt. Diese Bemühungen waren bisher jedoch außerstande, sich einem signifikanten Aspekt genetischer Störungen, dem epigenetischen Faktor, zuzuwenden. Es hat sich gezeigt, dass die epigentische Regulation der Gentranskription viele Störungen verursacht. Einer der signifikantesten bisher identifizierten epigenetischen Mechanismen ist die Methylierung von Cytosin. Die Methylierung von Cytosin in der 5-Position ist die einzige bekannte Modifikation genomischer DNA. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche die DNA-Methylierung die DNA-Transkription beeinflusst, unbekannt sind, ist der Zusammenhang zwischen Krankheit und Methylierung gut belegt. Insbesondere scheinen Methylierungsmuster von CpG-Inseln innerhalb regulatorischer Bereiche des Genoms hoch gewebsspezifisch zu sein. Daraus folgt daher, dass die Fehlregulation von Genen durch Vergleich ihres Methylierungsmusters mit phänotypisch "normalen" Expressionsmustern vorhergesagt werden kann. Die folgenden Beispiele sind Krankheitsfälle, die mit modifizierten Methylierungsmustern assoziiert sind.

- Hals- und Nacken-Krebs (Sanchez-Cespedes, M. et al., "Gene promoter hypermethylation in tumours and serum of head and neck cancer patients", Cancer Res. 2000 Feb. 15; 60 (4): 892-5)
- Hodgkinsche Krankheit (Garcia, J. F. et al., "Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin's disease", Lab. invest. 1999 Dec; 79 (12): 1453-9)
- Magenkrebs (Yanagisawa, Y. et al., "Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability", Int. J. Cancer 2000 Jan 1; 85 (1): 50-3)
- Prader-Willi/Angelman-Syndrom (Zeschnigh et al., "Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method", Human. Mol. genetics (1997) (6) 3pp 387-395)
- ICF-Syndrom (Tuck-Muller et al., "CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients", Cytogenet. Call. Genet. 2000; 89(1-2): 121-8)
- Dermatofibrom (Chen, T. C. et al., "Dermatofibroma is a clonal proliferative disease", J. Cutan Pathol. 2000 Jan; 27 (1): 36-9
- Hypertonie (Lee, S. D. et al. "Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertension", J. clin. Invest. 1998 Mar 1, 101 (5): 927-34
- Autismus (Klauck, S. M. et al. "Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients" Human Genet. 1997 Aug; 100 (2): 224-9
- Fragiles-X-Syndrom (Hornstra, I. K. et al., "High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome", Hum. Mol. Genet. 1993 Oct, 2(10): 1659-65)
- Huntingtonsche Krankheit (Ferluga, J. et al., "Possible organ and age related epigenetic factors in Huntington's disease and colorectal carcinoma", Med. hypotheses 1989 May; 29 (1); 51-4)

Alle obigen Dokumente werden hiermit durch Bezugnahme in die Offenbarung mit einbezogen.

Bisulfit-Behandlung

Ein ralativ neues und gegenwärtig am häufigsten verwendetes Verfahren zur Analyse von DNA in Bezug auf 5- Methylcytosin, basiert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, welches durch nachfolgende alkalische Hydrolyse in Uracil überführt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten mit Thymidin übereinstimmt. 5- Methylcytosin bleibt unter diesen Reaktionsbedingungen jedoch unverändert. Folglich wird die Original-DNA in einer solchen Art umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten nicht von Cytosin unterschieden werden konnte, nun unter Verwendung "normaler" molekularbiologischer Techniken, wie zum Beispiel durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, als das einzige verbleibende Cytosin detektiert werden kann. Alle diese Techniken basieren auf der Basenpaarung, die nun vollständig ausgewertet werden kann. Hinsichtlich der Empfindlichkeit wird der Stand der Technik durch ein Verfahren bestimmt, bei welchem die zu analysierende DNA in eine Agarose-Matrix eingeschlossen wird, wodurch die Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert wird (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) und welches alle Ausfällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A.; Oswald, J.; Walter, J. A.; A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis; Nucleic Acid Res., 1966, Dec. 1524(24): 5064-6). Durch Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, individuelle Zellen zu analysieren, was das Potential dieses Verfahrens veranschaulicht. Gegenwärtig werden jedoch nur individuelle Regionen bis zu einer Länge von ungefähr 3000 Basenpaaren analysiert, eine umfassende Analyse von Zellen auf tausende mögliche Methylierungsereignisse ist nicht möglich. Dieses Verfahren kann jedoch auch keine sehr kleinen Fragmente aus kleinen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz des Diffusionsschutzes durch die Matrix verloren.
Ein Überblick über weitere bekannte Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin kann aus dem folgenden Übersichtartikel entnommen werden: Rein, T.; DePamphilis, M. L.; Zorbas, H.; Nucleic Acids Res., 1998, 26, 2255.
Bis heute, abgesehen von wenigen Ausnahmen (z. B. Zeschnigk, M.; Lich, C.; Buiting, K.; Doerfler, W.; Horsthemke, B.; A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman- and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus, Eur. J. Hum. Genet., 1997, Mar-Apr; 5(2): 94-8), wird die Bisulfit- Technik nur in der Forschung angewendet. Es werden jedoch immer kurze, spezifische Fragmente eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder vollständig sequenziert (Olek, A.; Walter, J.; The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint; Nat. Genet., 1997, Nov; 17(3): 275-6) oder es werden individuelle Cytosin-Positionen durch eine Primerextensionsreaktion (Gonzales, M. L.; Jones, P. A.; Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE); Nucleic Acids Res., 1997, Jun. 15; 25(12): 2529-31, WO Patent 9500669) oder durch enzymatischen Verdau detektiert (Xion, Z.; Laird, P. W.; COBRA; A sensitive and quantitative DNA methylation assay; Nucleic Acids Res., 1997, Jun. 15; 25(12): 2532-4). Weiterhin ist auch die Detektion durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Verwendung der Bisulfit-Technik zur Methylierungs-Detektion in individuellen Genen beschäftigen sind: Grigg, G.; Clark, S.; Sequencing 5-Methylcytosin residues in genomic DNA, Biossays, 1994, Jun; 16(6): 431-6, 431; Zechnigk, M., Schmitz, B.; Dittrich, B.; Buiting, K.; Horstehmke, B.; Doerfler, W.; Imprinted Segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method; Hum. Mol. Genet., 1997, Mar; 6(3):387-95; Feil. R.; Cahrlton, J.; Bird, A. P.; Walter, J.; Reik, W.; Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing; Nucleic Acids Res., 1994, Feb25; 22(4): 695-6; Martin, V.; Ribieras, S.; Song-Wang, X; Rio, M. C.; dante, R.; Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines; Gene., 1995, May19; 157(1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 95/45560.

Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)

Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist eine Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, bei der der angeregte Zustand eines Moleküls (der Donor) Energie auf das andere Molekül (der Akzeptor) überträgt. Das Donor-Molekül ist ein Fluorophor während das Akzeptor-Molekül einer sein oder auch nicht sein kann. Der Energietransfer findet ohne die Emission von Photonen statt und basiert auf der Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen. Moleküle, die im allgemeinen beim FRET verwendet werden, schließen Fluorescein, N,N,N',N'-Tetramethyl-6- carboxyrhodamin (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 4- (4'-Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL) und 5- (2'-Aminoethyl)aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS) ein. Standardbedingungen für FRET schließen die folgenden ein:

- Große Nähe zwischen den Donor- und Akzeptor-Molekülen (typisch sind 10-100 × 10^-10 m).
- Das Emissionsspektrum des Donor-Moleküls muss mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptor-Moleküls überlappen.
- Die Orientierungen der Übergangsdipole von Donor- und Akzeptor-Molekülen müssen annähernd parallel sein.

Das Ausmaß des Energietransfers ist abhängig vom Abstand zwischen den beiden Molekülen und der Überlappung der Donor- und Akzeptor-Spektren. Er kann durch die folgende Gleichung beschrieben werden:
kt(r) = tD-1.(R0/r)6
worin r der Abstand zwischen Donor und Akzeptor, tD die Lebensdauer des Donors in Abwesenheit von Energietransfer ist und R0 als Förster-Abstand bezeichnet wird.
Die Effizienz des Energietransfers (für ein einzelnes Donor-Akzeptor-Paar) ist gegeben durch:
E = R06/(R06 + r6).
Förster-Abstände sind gewöhnlich in einem Bereich von 30-60 × 10^-10 m. Deshalb kann FRET als ein hochempfindliches Verfahren zur Messung mikroskopischer Abstände verwendet werden, was auf dem Gebiet der Molekularbiologie besonders nützlich ist, wo es bei einer Anzahl von Verfahren verwendet wurde. Er wurde bei der Untersuchung von Proteinstruktur, -anordnung, -verteilung, -konformation und -wechselwirkung genauso verwendet wie bei der Untersuchung von Zellmembranen und Immunoassys. FRET ist auch bei einer Anzahl von Methoden bei der Analyse von Nukleinsäuren verwendet worden. Diese schließen die Struktur- und Konformationsanalyse von Nukleinsäuren, Hybridisierung, PCR, Sequenzierung und Primerextensionsassays ein.

Enzymatische Amplifikation

PCR ist eine allgemein verwendete Technik, die zum Beispiel in den US-Patenten 4683195, 4683202 und 4800159 beschrieben worden ist. Kurz gesagt ist es die Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz durch repetetive Zyklen von Annealing und Verlängerung eines Primers an einzelsträngigen Nukleinsäuren, gefolgt von der Denaturierung des resultierenden, doppelsträngigen Moleküls. PCR (und Variationen davon) hat eine Vielzahl von Anwendungen und ist eine der Schlüsseltechnologien, die in den meisten Formen der Nukleinsäureanalyse und -manipulation enthalten ist. Es gibt verschiedene allgemein verwendete Verfahren zur Detektion von PCR-Produkten, wie Gelelektrophorese und die Verwendung markierter Primer-Oligonukleotide und Nukleosid-Triphosphate. Die Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotide und Oligomere zur Nukleinsäureanalyse bei der PCR ist auch bekannt.
Genomische DNA zur weiteren Amplifikation wird aus DNA von Zellen, Gewebe oder anderen Test-Proben durch Anwendung von Standardverfahren erhalten. Diese Standard- Methodologie findet man in Referenzen wie Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Echtzeit-PCR

Echtzeit-PCR-Monitoring unter Verwendung von Fluoreszenz ist in verschiedenen Arten beschrieben worden. Als erstes ermöglicht die Bindung von spezifischen Fluoreszenz- Farbstoffen wie Ethidiumbromid an die doppelsträngige DNA das Monitoring der Akkumulation des PCR-Produkts durch Korrelation mit steigender Fluoreszenz. Ein zweites Detektions-Verfahren, die Polymerase-unterstützte Exonuklease-Spaltung, macht Gebrauch von der 5'- Exonuklease-Aktivität von Polymerasen wie Taq. Eine Oligonukleotid-Sonde, die komplementär zum PCR-Produkt ist, aber noch verschieden vom PCR-Primer, wird mit einem FRET-Paar markiert, so dass das Donor-Molekül durch ein Akeptor-Molekül gequencht wird. Während der PCR- Amplifikation beginnt die 5'-Exonuklease die Sonde zu verdauen und trennt das FRET-Paar, was zu steigender Fluoreszenz führt. Eine Abwandlung dieser Technologie verwendet eine Nukleinsäure, in der das FRET-Paar intern gequencht ist, zum Beispiel dadurch, dass sie eine Haarnadel- Konformation besitzt. Durch Hybridisierung an eine interessierende Sequenz wird das FRET-Paar getrennt und das Donor-Molekül emittiert Fluoreszenz. Diese Technologie kann zum Beispiel zur Analyse von SNPs verwendet werden.
Eine alternative Technologie basiert auf der Verwendung zweier Spezies von Hybridisierungs-Sonden, jede markiert mit einem Bestandteil des FRET-Paares. Durch Hybridisierung beider Sonden an die Target-Sequenz in angemessenem Abstand, wird ein Fluoreszenz-Signal emittiert. Diese Technologie kann wiederum zur Detektion von SNPs verwendet werden.
Ein Hauptvorteil der Verwendung solcher FRET-basierter PCR-Technologien ist es, dass die Reaktion in einer Closed- Tube-Reaktion überwacht werden kann, die geeignet ist für großen und mittleren Durchsatz und damit die Wahrscheinlichkeit der Kontamination reduziert.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren, zum Nachweis der Anwesenheit eines spezifischen Nukleotids in einem DNA- Fragment, unter Verwendung von Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET). Dieses kann verwendet werden, um Informationen über Sequenzeigenschaften eines Proben-DNA- Fragments zu erhalten. Zum Beispiel könnte eine Punktmutaion in einem Fragment detektiert werden, falls ein Dinukleotid, als ein Ergebnis seiner Mutation, in seiner Sequenz anwesend ist, welches im Wildtyp nicht vorliegt. Jedoch wird dieses dann am besten funktionieren, wenn das durch die Mutation gebildete Dinukleotid in dem Fragment sehr selten ist oder im Wildtyp nicht vorliegt. Das beschränkt die Anwendung dieses Verfahrens zur Detektion von Mutationen, da es sehr selten der Fall ist, dass sogar ein sehr kurzes Amplifikat ein bestimmtes Dinukleotid nicht enthält oder zum Beispiel nur einmal. Deshalb wird das vorgestellte Verfahren zur Detektion von Dinukleotiden zur Bestimmung von Sequenzcharakteristika genomischer DNA-Proben in vielen Fällen nicht anwendbar sein.
Jedoch ist die Situation für genomische DNA, die mit Bisulfit behandelt wurde, eine ganz andere. Wie oben erwähnt, führt Bisulfit zu einer selektiven Deaminierung von Cytosin und lässt 5-Methylcytosin grundlegend unverändert. Die Methylierung von Cytosin tritt fast ausschließlich im Sequenz-Zusammenhang 5'-CG-3' auf. Deshalb treten bestimmte Dinukleotide, die C enthalten, nach der Bisulfitbehandlung in einem Strang nicht mehr auf, aber sie können noch im komplementären Strang auftreten, der durch Amplifikation von Bisulfit-behandelter DNA gebildet wird. Speziell ist die Situation für 5'-CG-3'- Dinukleotide. Diese treten nur dann in beiden Strängen auf, wenn das Cytosin des jeweiligen CG-Dinukleotids methyliert war und während der Bisulfit-unterstützten Deaminierung unverändert geblieben ist. Deshalb ist die Existenz eines CG-Dinukleotids in einem Amplifikat, vorausgesetzt, dass in den Primern keine CGs enthalten sind, ein klarer Hinweis auf die Anwesenheit eines methylierten Cytosins in der korrespondierenden genomischen DNA-Probe.
Diese Erfindung stellt ein sehr empfindliches Verfahren, mit einem niedrigen Hintergrundsignal, zur Sichtbarmachung dieser Dinukleotide bereit. Obwohl, wie oben erwähnt, die Detektion von CG-Nukleotiden eine bevorzugte Anwendung ist, können prinzipiell jedoch auch alle anderen Dinukleotide detektiert werden.
Dieses Verfahren zur Detektion spezifischer Dinukleotide in einer DNA-Probe ist durch einen Amplifizierungsschritt unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gekennzeichnet, a) ein Nukleotid, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, wovon eine geeignete Menge mit einem Donor-Fluorophor markiert ist und b) ein anderes Nukleotid, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, wovon eine geeignete Menge mit einem Akzeptor- Fluoreszenz markiert ist, enthaltend. Dieses Verfahren ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Anwesenheit des Dinukleotids durch das Ausmaß des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) zwischen Donor- und Akzeptor- Fluorophor bestimmt wird.
Das bedeutet, dass markierte Fluorophore nur dann in direkter Nähe in das PCR-Produkt eingebaut werden, wenn das bestimmte, zu analysierende Dinukleotid gebildet wird. Wenn zum Beispiel die Anwesenheit eines CG-Dinukleotids im PCR-Produkt detektiert werden soll, kann eine Fraktion der C-Nukleotide in der PCR-Reaktion mit dem Fluoreszenz- Donor und eine Fraktion des G-Nukleotids mit Akzeptor- Fluorophor markiert werden, oder umgekehrt. Nur wenn ein C und G im PCR-Produkt dicht beieinander sind, kann FRET beobachtet werden. Auf diesem Weg können die CG- Dinukleotide identifiziert werden. Wenn dagegen ein TG- Nukleotid anwesend ist, kann kein FRET beobachtet werden. Deshalb kann dieses Verfahren direkt angewendet werden, um DNA-Methylierung zu beobachten. Das wird in den Zeichnungen und deren Beschreibungen weiter herausgearbeitet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Echtzeit-Monitoring des FRET-Signals während der PCR durchgeführt. Auf diesem Weg kann der Fortschritt der PCR untersucht werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das zu detektierende Dinukleotid selbst-komplementär. Das ist zum Beispiel bei CG- Dinukleotiden der Fall.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung tritt das zu detektierende Dinukleotid nur einmal im PCR-Produkt auf. Wie oben umrissen, ist dies sehr hilfreich, wenn die Anwesenheit des FRET-Signals direkt verwendet wird, um Schlüsse über die Sequenz-Charakteristika der DNA-Probe zu ziehen. Wenn zum Beispiel nur ein CG im PCR-Produkt der Bisulfit-behandelten DNA-Probe anwesend ist, kann direkt geschlossen werden, dass ein methyliertes Cytosin in einer bestimmten Position in der genomischen DNA-Probe enthalten war.
Aber es ist auch möglich und bevorzugt, dass das Dinukleotid mehrere Male im PCR-Produkt auftritt und die durchschnittliche Menge der Dinukleotide im PCR-Produkt bestimmt wird. In diesem Fall zum Beispiel wird das FRET- Signal quantifiziert und wieder wird, beispielsweise im Fall von CG-Dinukleotiden, ihre Menge im PCR-Fragment im Wesentlichen proportional zum beobachteten FRET-Signal sein. Dies kann verwendet werden, um den Grad der Cytosin- Methylierung in einem größeren DNA-Fragment zu bestimmen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Erzeugung von PCR-Produkt durch den Anstieg der emittierten Fluoreszenz in sukzessiven Annealing- Phasen bestimmt, wohingegen die Anwesenheit des zu detektierenden Dinukleotids in sukzessiven Denaturierungsphasen bestimmt wird.
Bevorzugter Weise wird die Probe während der Denaturierung mit Licht geeigneter Wellenlänge beleuchtet und die Fluoreszenz als Funktion des Naturierungszustandes der Probe beobachtet.
Das Können der Erfindung liegt auch in der Interpretation eines FRET-Signals in Stadien, in denen die Probe doppelsträngige Konformation hat, als Indikator für eine erfolgreiche Amplifizierungsreaktion und des FRET-Signals der selben Probe in denaturiertem Zustand, um Kenntnisse über den Gehalt and CpG-Dinukleotiden in der Probe zu erhalten. Dies ist möglich, weil ein FRET-Paar, gebildet durch ein C und ein G, das ein Dinukleotid bildet, unabhängig vom Naturierungszustand der Probe ist, wohingegen ein FRET-Paar, das durch C und G während einer Watson- Crick-Bindung gebildet wird, nur in der doppelsträngigen Konformation der Probe vorliegt, wie in den Abbildungen illustriert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden vor der PCR entweder im Wesentlichen alle Cytosine in der DNA-Probe selektiv deaminiert, aber die 5-Methylcytosine bleiben im Wesentlichen unverändert oder alle 5- Methylcytosine werden im Wesentlichen deaminiert aber die Cytosine bleiben im Wesentlichen unverändert. Cytosin- Guanin- (CpG) Dinukleotide werden detektiert und lassen Schlüsse über den Methylierungszustand der Cytosine in diesen CpG-Dinukleotiden in dieser DNA-Probe zu. Diese Deaminierung wird bevorzugt unter Verwendung eines Bisulfit-Reagenzes durchgeführt.
Bevorzugter Weise wird die Proben-DNA nur durch ausgewählte PCR-Primer amplifiziert, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer bestimmten Stelle in der Proben-DNA, deren Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren der genannten ausgewählten PCR-Primer ist. Dies kann, unter Verwendung der Primer- Annealing-Selektivität gegenüber Bisulfit-behandelter DNA getan werden, welche in einer bestimmten Position entweder TG oder CG enthält, abhängig vom Methylierungsstatus in der genomischen DNA. Primer können für beide Fälle konstruiert werden. Ein Primer könnte ein G an seinem 3'- Ende enthalten, weshalb er dann nur an eine DNA binden würde, die ein C an der entsprechenden Position enthält und deshalb wird dieser Primer nur oder bevorzugt methylierte DNA amplifizieren, weil das C nach der Bisulfit- Behandlung auf eine Methylierung in dieser Position hinweist. Dieses Verfahren ist als MSP, methylierungssensitive PCR, bekannt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Proben-DNA nur amplifiziert, wenn ein bestimmter Methylierungs-Zustand an einer bestimmten Stelle in der Proben-DNA vorliegt, deren Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren ist, die zusätzlich in der PCR-Reaktion verwendet werden. Diese Oligonukleotide oder PNA-Oligomere binden selektiv an die Templat-DNA und verhindern deren Amplifikation in Abhängigkeit vom Methylierungszustand der DNA vor der Bisulfit-Umsetzung.
Bevorzugter Weise werden die Donor- und Akzeptor- Fluorophor-Paare ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fluorescein/Rhodamin, Phycoerythrin/Cy7, Fluorescein/Cy5, Fluorescein/Cy5.5, Fluorescein/LC Rot 640 und Fluorescein/LC Rot 705.
In einer anderen bevorzugten Variante der Erfindung, wird die Proben-DNA vor der Deaminierungsbehandlung (zum Beispiel Bisulfit) mit Restriktionendonukleasen gespalten.
Bevorzugt ist auch ein Verfahren, worin die enzymatische Amplifizierung der chemisch behandelten DNA so geschieht, dass nur ein Strang der DNA-Probe amplifiziert wird.
Bevorzugterweise wird die DNA-Probe aus Quellen vom Säugetier, z. B. Zell-Linien, Blut, Sputum, Fäkalien, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gewebe aus Augen, Gedärmen, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Schnitten und allen möglichen Kombinationen gewonnen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Primer der PCR-Reaktion an eine Feststoffoberfläche gebunden. Dies ermöglicht es, die Amplifikationen an der Oberfläche durchzuführen. Der komplementäre Strang kann nach der Amplifikation entfernt werden und es werden nur die Dinukleotide im verbleibenden, an der Oberfläche gebundenen, Strang analysiert. Das ist besonders vorteilhaft, wenn das Dinukleotid nur in einem Strang und nicht in den anderen Strängen auftritt, weil die Menge an Dinukleotiden für beide Stränge unabhängig bestimmt werden kann. Auch können mehrere verschiedene PCR-Reaktionen auf einer Oberfläche durchgeführt werden, wenn mehrere verschiedene Primer an ihr derart befestigt sind, dass die Position der Primer auf der Oberfläche mit deren Sequenz korrelliert, so dass die Auswertung der Ergebnisse möglich wird.
Bevorzugter Weise umfasst die Oberflächenzusammensetzung genannter Festphasen Silikon, Glas, Polystrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein diagnostisches Kit zur Detektion der Methylierung der Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, das Reagenzien zur selektiven Deaminierung von Cytosin- Basen in genomischer DNA, einen oder mehrere Primer und Fluoreszenz-markierte Dinukleotide für den Amplifizierungsschritt und wahlweise Vorschriften oder Anleitungen für eines der Verfahren gemäß einem der voran stehenden Ansprüche umfasst. Dieses Kit kann auch aus mehreren zusätzlichen Gegenständen bestehen.
Als Beispiel könnten die Komponenten des genannten Kits Behältnisse in ausreichend großer Menge für folgendes umfassen, um die Verfahren durchzuführen:

1. Reagenzien für die Bisulfit-Umwandlung der Proben-DNA.
2. Reagenzien für die Amplifizierung der umgewandelten Probe und den Einbau der Fluorophor-markierten Nukleotide, umfassend:
- a) Nukleinsäure-Primer,
- b) geeignete Mischung von nicht-markierten und Fluorophor-markierten Nukleotiden,
- c) DNA-Polymerase, die geeignet ist, die Fluorophor- markierten Nukleotide einzubauen,
- d) Gebrauchsanweisung.

Der Begriff "Gebrauchsanweisung" sollte einen fassbaren Ausdruck abdecken, um die Reagenz-Konzentrationen für das Assay-Verfahren, Parameter wie relative Mengen der zusammenzuführenden Reagenzien, Reaktionszeiten für Reagenzien/Proben-Mischungen, Temperatur, Pufferbedingungen und dergleichen zu beschreiben.
Im Folgenden werden die Schritte der bevorzugten Ausführungsformen detaillierter beschrieben.

DNA-Isolierung

Zuerst muß die genomische DNA-Probe aus Geweben oder zellulären Quellen isoliert werden. Bei Säugetieren, vorzugsweise Menschen, kann die DNA-Probe aus jedem Gewebe entnommen werden, von dem vermutet wird, dass die Target- Region im Genom exprimiert wird und zum Beispiel auch aus Zell-Linien, Blut, Sputum, Fäkalien, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gewebe aus Darm, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Schnitte, ist jedoch nicht beschränkt auf diese. Die Extraktion kann mit für den Fachmann geläufigen Mitteln erfolgen, einschließlich der Verwendung von detergenten Lysaten, Ultraschall und Vortexing mit Glasperlen. Wenn die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische, doppelsträngige DNA für die Analyse verwendet.

DNA-Restriktion

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden, und zwar durch alle im Stand der Technik bekannten Mittel, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen. Genannte Nukleasen können Cytosin im 5'-CpG-3'-Kontext in ihrer Erkennungssequenz enthalten, so dass die DNA nur dann gespalten wird, wenn die Cytosine in der Erkennungssequenz in unmethylierter Form vorliegen.

Bisulfit-Behandlung

Die Proben-DNA wird dann chemisch behandelt, um die methylierten Cytosin-Basen zu Uracil umzusetzen. Diese chemische Modifikation kann zum Beispiel mittels einer Bisulfit-Lösung erfolgen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Diese chemische Umsetzung kann in jedem im Stand der Technik bekannten Format stattfinden. Das schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf, die Modifizierung innerhalb von Agarose-Gelen oder in denaturierenden Lösemitteln.
In dem Fall, dass die chemische Modifizierung als Bisulfit-Behandlung der DNA erfolgt, können sich die folgenden Schritte anschließen.
Die doppelsträngige DNA muß denaturiert werden. Das kann als Hitze-Denaturierung geschehen, die bei variablen Temperaturen ausgeführt wird. Für hochmolekulare DNA ist die Denaturierungstemperatur gewöhnlich größer als 90°C. Jedoch kann die Analyse von kleineren Fragmenten erfolgen, die keine so hohen Denaturierungs-Temperaturen benötigen. Zusätzlich nimmt die Komplementarität zwischen den Strängen ab, wenn die Reaktion voranschreitet und die Cytosin- Reste zu Uracil umgesetzt werden. Deshalb kann ein cyclisches Reaktionsprotokoll verschiedene Denaturierungs- Temperaturen erfassen.
Die Bisulfit-Umsetzung umfasst des weiteren zwei wichtige Schritte, die Sulfonierung des Cytosins und die nachfolgende Deaminierung. Die Reaktionsgleichgewichte sind bei zwei unterschiedlichen Temperaturen für jede Stufe der Reaktion auf der richtigen Seite. Wenn man die Reaktionskinetiken berücksichtigt, ist es bevorzugt, dass die Reaktion unter cyclischen Bedingungen, mit wechselnden Temperaturen, stattfindet. Die Temperaturen und Reaktionszeiten, bei denen jeder Schritt durchgeführt wird, können je nach den spezifischen Anforderungen im Einzelfall variiert werden. Jedoch umfasst eine bevorzugte Variante des Verfahrens eine Temperaturänderung von 4°C (10 Minuten) auf 50°C (20 Minuten). Diese Art der Bisulfit-Behandlung ist Stand der Technik in Bezug auf WO 99/28498.
Diese chemische Umsetzung kann in jeder im Stand der Technik bekannten Form stattfinden. Das schließt ein, ist aber nicht begrenzt auf, die Modifizierung innerhalb von Agarose-Gelen, in denaturierenden Lösemitteln oder innerhalb von Kapillaren. Die Bisulfit-Umsetzung innerhalb von Agarose-Gelen ist Stand der Technik und wurde von Olek et al., Nucl. Acids Res. 1996, 24, 5064-5066 beschrieben. Das DNA-Fragment wird in Agarose-Gel eingebettet, und die Umsetzung von Cytosin zu Uracil findet mittels Hydrogensulfit und einem Radikalfänger statt. Die DNA kann dann amplifiziert werden, ohne dass weitere Reinigungsschritte nötig sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die DNA-Umsetzung ohne Agarose-Matrix stattfinden. Die DNA kann bei erhöhten Temperaturen mit Hydrogensulfit und einem Radikalfänger inkubiert werden. Diese Reaktion findet in einem organischen, denaturierenden Lösemittel statt. Beispiele für denaturierende Lösemittel umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Polyethylenglykoldialkyl Polyethylenglykoldialkylether, Dioxan und substituierte Derivate, Harnstoff oder Derivate, Acetonitril, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, DMSO oder THF.
In einer weiteren Ausführungsform wird die DNA-Probe vor der chemischen Behandlung in eine beheizbare Kapillare überführt, die für kleine Moleküle permeabel ist. Die Reaktionsschritte der chemischen Modifikation können dann mittels Zugabe und Entfernen von Reagenzien durch verbundene Kapillaren in den Kapillarenröhrchen ausgeführt werden.
Im Anschluss an die chemische Behandlung könnten die zwei DNA-Stränge nicht länger komplementär sein.

Amplifikation und Einbau markierter Nukleotide

Fraktionen der so behandelten genomischen DNA werden dann unter Verwendung von Oligonukleotid-Primeren enzymatisch amplifiziert. Die Länge und Gestaltung dieser Primer kann für den zu analysierenden Bereich des Genoms spezifisch sein. Als solche ist eine große Auswahl an Primern zur Verwendung für diese Technik geeignet. Diese Primer- Gestaltung ist Stand der Technik.
Eine geeignete Fraktion der C- und G-Nukleotide, die in der Amplifizierungs-Reaktion eingeführt wurden, sind in solcher Weise markiert, dass ein C und ein G ein FRET- Paar bilden können, wenn sie nah beieinander sind. Fluorophor-Paare die geeignet sind, die Nukleotide so zu markieren, dass sie befähigt werden, FRET-Paare zu bilden, sind dem Fachmann geläufig und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fluorescein/Rhodamin, Phytoerythrin/Cy7, Fluorescein/Cy5, Fluorescein/Cy5.5, Fluorescein/LC Rot 640 und Fluorescein/LC-Rot 705. Die Anbindung dieser Fluorophore an die Nukleotide ist Stand der Technik.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Probe während der Amplifizierungsreaktion mit Licht einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt und die Fluoreszenz als Funktion des Naturierungszustandes der Probe aufgezeichnet.
Das Besondere der Erfindung liegt in der Interpretation eines FRET-Signals in Phasen, in denen die Probe doppelsträngige Konformation besitzt, als Indikator für eine erfolgreiche Amplifizierungs-Reaktion und des FRET- Signals derselben Probe in denaturiertem Zustand, um Kenntnisse über den Gehalt an CpG-Dinukleotiden in der Probe zu erhalten. Das ist möglich, weil ein FRET-Paar, das durch ein C und ein G gebildet wird, die ein Dinukleotid ausbilden, unabhängig vom Naturierungszustand der Probe ist, wohingegen ein FRET-Paar, das durch ein C und G im Rahmen der Watson-Crick-Bindung ausgebildet wird, nur in der doppelsträngigen Konformation vorliegt, was durch die Abbildungen verdeutlicht wird.

Fest-Phasen-Assay

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Primer auf einer Oberfläche immobilisiert werden. Die Oberfläche oder feste Phase kann beispielsweise sein, ist jedoch nicht beschränkt auf, eine Perle, ein Mikroplate Well oder DNA-Chip. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können auch andere Reaktionsteilnehmer, wie die Polymerase, an die Oberfläche gebunden werden. In einer solchen Ausführungsform können alle Reagenzien so in einem Mikroplate Well lokalisiert sein, dass das Assay einfach durch Addition eines geeigneten Puffers und der Bisulfit-behandelten DNA-Probe durchgeführt werden kann.

Weitergehende Datenverarbeitung

Es wird vorausgesetzt, dass dieses Verfahren für die Analyse genomischer DNA-Proben mit hohem Durchsatz verwendet wird. Deshalb umfasst die Erfindung auch die Analyse von Daten unter Verwendung einer Rechneranlage. In einer bevorzugten Ausführungsform kann diese Vorrichtung eine oder mehrere Datenbanken umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann diese Vorrichtung einen oder mehrere "lernende Algorithmen" umfassen. Andere Mittel zur Evaluierung von Assay-Ergebnissen im Bereich von hohem Umsatz sind Stand der Technik.

Beschreibung der Zeichnungen

Abb. 1a

Doppelsträngiges PCR-Fragment einer Bisulfit-DNA-Sonde, in der ein Cytosin (C) unverändert geblieben ist, weil es methyliert war. Die Gs und Cs sind jeweils mit einem Donor-Fluorophor und einem Akzeptor-Fluorophor markiert und bilden FRET-Paare, weil sie sich in großer Nähe zu einander befinden.

Abb. 1b

Doppelsträngiges PCR-Fragment einer Bisulfit-DNA-Sonde mir der gleichen Original-Sequenz wie in Abb. 1a, worin ein C zu T umgesetzt wurde, weil es nicht methyliert war. Durch ein markiertes G und ein markiertes C an den gegenüberliegenden Strängen wird noch ein FRET-Paar gebildet.

Abb. 2a

Ein PCR-Fragment der Abb. 1a unter Denaturierungs- Bedingungen, wobei die einzelnen Stränge in einem solchen Maß getrennt werden, dass sich an den gegenüberliegenden Strängen durch Gs und Cs kein FRET-Paar bilden kann. Es kann noch ein FRET-Signal detektiert werden, weil sich FRET-Paare durch Gs und Cs auf den einzelnen Strängen bilden.

Abb. 2b

Ein PCR-Fragment der Abb. 1a unter Denaturierungs- Bedingungen, wobei die einzelnen Stränge in einem solchen Maß getrennt werden, dass weder ein FRET-Paar durch Gs und Cs auf gegenüberliegenden Strängen gebildet wird, noch ein FRET-Paar auf den einzelnen Strängen gebildet wird, weil entweder nur ein G oder ein C vorhanden ist. Deshalb kann kein FRET-Signal detektiert werden.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis spezifischer Dinukleotide in einer DNA-Probe, dadurch gekennzeichnet, dass eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ausgeführt wird unter Verwendung

a) eines Nukleotids, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, von dem eine geeignete Menge mit einem Donor-Fluorophor markiert ist,

b) ein anderes Nukleotid, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, von dem eine geeignete Menge mit einem Akzeptor-Fluorophor markiert ist und dadurch gekennzeichnet, dass die Anwesenheit des Dinukleotids durch das Ausmaß des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) zwischen Donor- und Akzeptor- Fluorophor bestimmt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Echtzeit-Monitoring des FRET-Signals während der PCR durchgeführt wird.

3. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zu detektierende Dinukleotid selbst-komplementär ist.

4. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zu detektierende Dinukleotid im PCR-Produkt nur einmal auftritt.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Dinukleotid mehrere Male im PCR-Produkt auftritt und die durchschnittliche Menge der Dinukleotide im PCR-Produkt bestimmt wird.

6. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Entstehung des PCR- Produkts durch den Anstieg der emittierten Fluoreszenz in sukzessiven Annealing-Phasen, beobachtet wird, wohingegen die Anwesenheit der zu detektierenden Dinukleotide in sukzessiven Denaturierungsphasen bestimmt wird.

7. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der PCR
entweder
im Wesentlichen alle Cytosine in der DNA-Probe selektiv deaminiert sind, aber die 5-Methylcytosine jedoch im Wesentlichen unverändert bleiben
oder
im Wesentlichen alle 5-Methylcytosine in der DNA- Probe selektiv deaminiert werden, aber die Cytosine im Wesentlichen unverändert bleiben
und
dadurch gekennzeichnet, dass Cytosin-Guanin-(CpG)- Dinukleotide detektiert werden, was Rückschlüsse auf den Methylierungsstatus der Cytosine in diesen CpG- Dinukleotiden dieser DNA-Probe erlaubt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Deaminierung durch ein Bisulfit-Reagenz durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-DNA durch ausgewählte DNA-Primer nur dann amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer spezifischen Stelle in der Proben-DNA vorliegt, dessen Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren der ausgewählten Primer ist.

10. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-DNA durch ausgewählte PCR-Primer nur dann amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand in der Proben-DNA vorliegt, dessen Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren ist, die zusätzlich in der PCR-Reaktion verwendet werden.

11. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Donor- und Akzeptor-Fluorophor-Paare ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Fluorescein/Rhodamin, Phytoerythrin/Cy7, Fluorescein/Cy5, Fluorescein/CY5.5, Fluorescein/LC Rot 640 und Fluorescein/LC Rot 705.

12. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die DNA-Probe vor der Deaminierungs-Behandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten wird.

13. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die enzymatische Amplifikation der chemisch behandelten DNA solcher Art ist, dass nur ein Strang der DNA-Probe amplifiziert wird.

14. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die DNA-Probe aus Quellen vom Säugetier isoliert wird, z. B. Zell-Linien, Blut, Sputum, Fäkalien, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gewebe aus Augen, Gedärme, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Schnitten und alle mögliche Kombinationen.

15. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Primer in der PCR- Reaktion an eine Feststoffoberfläche gebunden ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Oberflächenzusammensetzung Silikon, Glas Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold umfasst.

17. Diagnostisches Kit zum Nachweis der Methylierung von Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, umfassend Reagenzien zur selektiven Deaminierung von Cytosin- Basen in genomischer DNA, einen oder mehrere fluoreszierend markierte Nukleotide für den Amplifizierungsschritt und optional Protokolle oder Anleitungen für ein Verfahren, gemäß einem der voranstehenden Ansprüche.