DE10044543A1 - Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsgrades von bestimmten Cytosinen in genomischer DNA im Sequenzkontext 5'-CpG-3' - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Detektion des Methylierungsgrades eines bestimmten Cytosins im Sequenzkontext 5'-CpG-3' einer genomischen DNA-Probe. Im ersten Schritt wird die genomische DNA chemisch derart behandelt, dass die Cytosinbasen in Uracil umgewandelt werden, nicht aber die 5-Methylcytosinbasen. Anschließend werden Teile der genomischen DNA amplifiziert, die das besagte bestimmte Cytosin enthalten, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung erhalten und in den folgenden Schritten wird das Ausmaß der Hybridisierung der Amplifikate an die zwei Klassen von Oligonukleotiden durch Detektion der Markierung der Amplifikate bestimmt und aus dem Verhältnis der an den zwei Klassen von Oligonukleotiden in Folge der Hybridisierung detektierten Markierungen auf den Methylierungsgrad besagten bestimmten Cytosins in der genomischen DNA-Probe geschlossen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion des Methylierungsgrades eines bestimmten Cytosins im Sequenz­ kontext 5'-CpG-3' einer genomischen DNA-Probe.

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe­ nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschal­ tet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Ge­ ne in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzel­ ner Gene oder des Genoms.

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, mit dem viele Cytosinbasen in einer gegebenen DNA-Probe gleichzeitig auf das Vorliegen einer Methylgruppe an der Position 5 mittels Hybridisierung untersucht werden kön­ nen.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt bei­ spielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti­ on, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Inte­ resse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR- Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlererweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5- Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewan­ delt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersu­ chende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit rea­ giert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen un­ tersucht werden, was das Potential der Methode veran­ schaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regio­ nen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine glo­ bale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese ge­ hen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü­ bersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett se­ quenziert (Olek, A. und Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung be­ schrieben worden (Olek et al., WO-A 99/28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bi­ sulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al. (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261; WO-A 97/46705, WO-A 95/15373 und WO-A 95/45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 er­ schienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Ge­ netics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungs­ fähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka­ ras, M. und Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ioni­ zation of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Ana­ lytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor frü­ her als größere.

MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur A­ nalyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nuk­ leinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995)), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ioniza­ tions and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überpro­ portional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind ei­ nige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlererweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht ver­ ringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnuklein­ säuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rück­ grats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedu­ re for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laborato­ ry Manual, 1989.

Die vorliegende Erfindung soll ein besonders effizientes und zuverlässiges Verfahren bereitstellen, das es er­ laubt, viele Cytosinbasen in einer gegebenen DNA-Probe gleichzeitig auf das Vorliegen einer Methylgruppe an der Position 5 mittels Hybridisierung zu untersuchen.

Das vorliegende Verfahren dient zur Detektion des Methy­ lierungsgrades mindestens eines bestimmten Cytosins im Sequenzkontext 5'-CpG-3' einer genomischen DNA-Probe. Be­ sonders bevorzugt wird das Verfahren zur gleichzeitigen Detektion vieler verschiedener Methylierungspositionen verwendet.

Die Aufageb wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Detektion des Methylierungsgrades eines bestimmten Cyto­ sins im Sequenzkontext 5'-CpG-3' einer genomischen DNA- Probe gelöst, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass

• a) man die genomische DNA chemisch behandelt, wobei man die Cytosinbasen in Uracil umwandelt, nicht aber die 5- Methylcytosinbasen;
• b) man Teile der genomischen DNA amplifiziert, die das besagte bestimmte Cytosin enthalten, wobei die Amplifika­ te eine nachweisbare Markierung erhalten;
• c) eine Hybridisierung der Amplifikate an zwei Klassen von Oligonukleotiden mit jeweils mindestens einem Mit­ glied erfolgt, wobei die Oligonukleotide der ersten Klas­ se bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn das besagte bestimmte Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und wobei die Oligonukleotide der zweiten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn das besagte bestimmte Cytosin in der ge­ nomischen DNA unmethyliert vorläge;
• d) man das Ausmaß der Hybridisierung der Amplifikate an die zwei Klassen von Oligonukleotiden durch Detektion der Markierung der Amplifikate bestimmt;
• e) man aus dem Verhältnis der an den zwei Klassen von Oligonukleotiden in Folge der Hybridisierung detektierten Markierungen auf den Methylierungsgrad besagten bestimm­ ten Cytosins in der genomischen DNA-Probe schliesst.

Bevorzugt ist es dabei, dass man das Verfahren nicht nur mit der genomischen DNA-Probe durchführt, sondern sinngemäß auch mit bekanntermaßen an der Position des besagten bestimmten Cytosins methyliert oder aber unmethyliert vorliegender Standard-DNA, wobei die jeweils mit der un­ methylierten Standard DNA gemessenen Verhältnisse der an den beiden Klassen von Oligonukleotiden detektierten Mar­ kierungen als Eichwert für einen Methylierungsgrad von 0 und entsprechend die jeweils mit der methylierten Stan­ dard DNA gemäss gemessenen Verhältnisse der an den beiden Klassen von Oligonukleotiden detektierten Markierungen als Eichwert für einen Methylierungsgrad von 1 dienen und man diese Eichwerte für die Bestimmung des Methylie­ rungsgrades der genomischen Proben-DNA einsetzt.

Besonders bevorzugt ist es, dass man weitere bekannte Standard DNA-Proben zur Eichung verwendet, die jeweils einen beliebigen bekannten Methylierungsgrad des besagten bestimmten Cytosins aufweisen.

Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemische Behandlung mit einer Lösung eines Bisulfits (= Hydrogensulfit, Disulfit) durchführt.

Bevorzugt ist es erfindungsgemäße ferner, dass besagte Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist. Dabei ist be­ vorzugt, dass man besagte Markierung durch Chemilumines­ zenz, ihre UV-Absorption oder Fluoreszenzpolarisation nachweist.

Bevorzugt ist auch, dass die Markierungen Radionuklide sind.

Bevorzugt ist ferner, dass die Markierungen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, dass man die PCR-Produkte insgesamt oder deren charakteristische Frag­ mente im Massenspektrometer nachweist und somit durch ih­ re Masse eindeutig charakterisiert sind.

Besonders bevorzugt ist es ferner auch, dass die Oligo­ nukleotide der ersten Klasse die Sequenz 5'-CG-3' umfas­ sen und die Oligonukleotide der zweiten Klassen die Se­ quenz 5'-TG-3' und/oder die Sequenz 5'-CA-3' umfassen. Bevorzugt ist dabei, dass die Oligonukleotide der ersten und der zweiten Klasse auf einer gemeinsamen Festphase immobilisiert sind. Auch ist dabei bevorzugt, dass die Oligonukleotide auf einer ebenen Festphase in einem rechtwinkligen oder hexagonalen Raster angeordnet sind und der Ort bestimmter Oligonukleotide auf der Festphase mit deren jeweiliger Sequenz korreliert ist.

Ganz besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Ver­ fahren, wobei man den Schritt b) in zwei Teilschritten wie folgt durchführt:

• a) eine PCR Präamplifikation mit mindestens einem Primer­ paar unterschiedlicher Sequenz, die an eine nach Anspruch 1 vorbehandelte DNA-Probe unspezifisch hybridisieren und daher im PCR Schritt mehr als ein Amplifikat ergeben;
• b) eine PCR Amplifikation des in der Präamplifikation ge­ bildeten Produkts mit Primern unterschiedlicher Sequenz, die jeweils zu einem Abschnitt der nach Anspruch 1 vorbe­ handelten DNA-Probe [(+)-Strang oder (-)-Strang] iden­ tisch oder revers komplementär sind und an die zu ampli­ fizierende DNA spezifisch hybridisieren.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es ferner, dass die Ampli­ fikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktions­ gefäß durchführt wird.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass für die Amplifikation eine hitzebeständige DNA-Polymerase verwen­ det wird. Besonders bevorzugt ist auch, dass die für die Amplifikation verwendeten Primeroligonukleotide der ent­ weder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten.

Bevorzugt ist es auch, dass mindestens 10 CpG Positionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzeitig analy­ siert werden. Besonders bevorzugt ist es, dass mindestens 50 CpG Positionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzeitig analysiert werden. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass mindestens 100 CpG Positionen in unter­ schiedlichem Sequenzkontext gleichzeitig analysiert wer­ den. Höchst bevorzugt ist es, dass mindestens 500 CpG Po­ sitionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzeitig analysiert werden. Am bevorzugsten ist es, dass mindes­ tens 1000 CpG Positionen in unterschiedlichem Sequenzkon­ text gleichzeitig analysiert werden.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Verfahren, wobei die genomische DNA-Probe aus Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbet­ tetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Nie­ re, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histo­ logischen Objektträgern oder allen möglichen Kombinatio­ nen hiervon erhalten wurde.

Bevorzugt ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Ver­ fahrens zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Er­ eignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persön­ lichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin­ testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krank­ heit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infekti­ on, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krank­ heit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädi­ gung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehl­ funktion.

Weiterhin ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Ver­ fahrens zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung bevorzugt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfas­ send ein Bisulfit enthaltendes Reagenz, Primeroligonukle­ otiden zur Herstellung der Amplifikate und/oder vorzugs­ weise an einer Festphase immobilisierte Oligonukleotiden gemäß Anspruch 10 sowie eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Diese genomische DNA-Probe wird bevorzugt aus Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispiels­ weise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prosta­ ta, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern oder allen möglichen Kombinationen hiervon erhalten.

Bei diesem Verfahren wird im ersten Schritt eine genomi­ sche DNA-Probe chemisch derart behandelt, dass außer den 5-Methylcytosinbasen alle Cytosinbasen in Uracil umgewan­ delt werden. Diese chemische Behandlung wird bevorzugt mit der Lösung eines Bisulfits (= Hydrogensulfit, Disul­ fit) durchgeführt.

Dieser Verfahrensschritt kann nicht nur mit der genomi­ schen DNA-Probe durchgeführt werden, sondern vorzugsweise sinngemäß auch mit bekanntermaßen an der Position des be­ sagten bestimmten Cytosins methyliert oder aber unmethy­ liert vorliegender Standard-DNA.

Im zweiten Schritt des Verfahrens werden die Teile der genomischen DNA amplifiziert, die das besagte bestimmte Cytosin enthalten. Dieser Schritt kann besonders bevor­ zugt in zwei Teilschritten durchgeführt werden:

• 1. Zuerst wird eine PCR Präamplifikation mit mindestens einem Primerpaar unterschiedlicher Sequenz durchgeführt, die an eine chemisch vorbehandelte DNA hybridisieren. Diese Vorbehandlung erfolgte chemisch derart, dass die Cytosinbasen in Uracil umgewandelt wurden, nicht aber die 5-Methylcytosinbasen.
• 2. Eine PCR-Amplifikation des in der Präamplifikation ge­ bildeten Produkts wird mit Primern unterschiedlicher Se­ quenz durchgeführt. Diese Primer sind identisch oder re­ vers komplementär zu einem Abschnitt des chemisch vorbe­ handelten DNA [(+)-Strangs oder (-)-Strangs] und hybridi­ sieren spezifisch an die zu amplifizierende DNA. Die Amplifikate enthalten vorzugsweise eine nachweisbare Mar­ kierung.

Im folgenden dritten Schritt des Verfahrens erfolgt eine Hybridisierung der Amplifikate an zwei Klassen von Oligo­ nukleotiden mit jeweils mindestens einem Mitglied. Die Oligonukleotide der ersten Klasse umfassen die Sequenz 5'-CG-3' und die Oligonukleotide der zweiten Klasse die Sequenz 5'-TG-3' und/oder die Sequenz 5'-CA-3'. Die Oligonukleotide der ersten und der zweiten Klasse sind vor­ zugsweise auf einer gemeinsamen Festphase immobilisiert. Die Oligonukleotide sind auf einer ebenen Festphase in einem rechtwinkligen oder hexagonalen Raster angeordnet und der Ort der bestimmten Oligonukleotide ist auf der Festphase mit der jeweiligen Sequenz korreliert.

Die Oligonukleotide der ersten Klasse hybridisieren be­ vorzugt an die Sequenz, welche aus der chemischen Behand­ lung der genomischen DNA hervorgeht, wenn das besagte be­ stimmte Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorlä­ ge. Die Oligonukleotide der zweiten Klasse hybridisieren bevorzugt an die Sequenz, welche aus der chemischen Be­ handlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn das besagte bestimmte Cytosin in der genomischen DNA unmethyliert vorläge.

Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten wird be­ sonders bevorzugt in einem Reaktionsgefäß durchgeführt. Bevorzugt führt man die Amplifikation mit der Polymerase­ kettenreaktion (PCR) durch, wobei vorzugsweise eine hit­ zebeständige DNA-Polymerase verwendet wird.

Die für die Amplifikation verwendeten Primeroligonukleo­ tide enthalten bevorzugt entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G.

Im vierten Verfahrensschritt wird das Ausmaß der Hybridi­ sierung der Amplifikate an die zwei Klassen von Oligo­ nukleotiden durch die Detektion der Markierungen der Amplifikate bestimmt. Die Markierungen sind besonders be­ vorzugt Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablös­ bare Massenmarkierungen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden. Die Markierung werden vorzugsweise ebenfalls durch Chemilumineszenz, UV-Absorption oder Flu­ oreszenzpolarisation nachgewiesen. Die PCR-Produkte können auch bevorzugt insgesamt oder als deren charakteris­ tische Fragmente im Massenspektrometer nachgewiesen wer­ den. Somit sind die PCR-Produkte durch ihre Masse eindeu­ tig charakterisiert.

Im letzten Verfahrensschritt wird aus dem Verhältnis der an den zwei Klassen von Oligonukleotiden in Folge der Hybridisierung detektierten Markierungen auf den Methy­ lierungsgrad des besagten bestimmten Cytosins in der ge­ nomischen DNA-Probe geschlossen.

Die jeweils mit der unmethylierten Standard-DNA gemesse­ nen Verhältnisse der an den beiden Klassen von Oligo­ nukleotiden detektierten Markierungen dienen vorzugsweise als Eichwert für einen Methylierungsgrad von 0.

Entsprechend dienen die jeweils mit der methylierten Standard-DNA gemessenen Verhältnisse der an den beiden Klassen von Oligonukleotiden detektierten Markierungen vorzugsweise als Eichwert für einen Methylierungsgrad von 1. Diese Eichwerte werden besonders bevorzugt für die Be­ stimmung des Methylierungsgrades der genomischen DNA- Proben eingesetzt.

Für die Eichung können vorzugsweise auch weitere bekannte Standard DNA-Proben zur Eichung verwendet werden, die je­ weils einen beliebigen bekannten Methylierungsgrad des besagten bestimmten Cytosins aufweisen.

Das Verfahren ist dadurch charakterisiert, dass bevorzugt mindestens 10 CpG Positionen in unterschiedlichem Se­ quenzkontext gleichzeitig analysiert werden. Ferner kön­ nen vorzugsweise mindestens 50 CpG Positionen in unter­ schiedlichem Sequenzkontext gleichzeitig analysiert wer­ den. Bevorzugt ist außerdem, dass mindestens 100 CpG Po­ sitionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzeitig analysiert werden. Sehr bevorzugt ist die gleichzeitige Analyse von mindestens 500 CpG Positionen in unterschied­ lichem Sequenzkontext. Besonders bevorzugt ist abschlie­ ßend die gleichzeitige Analyse von mindestens 1000 CpG Positionen in unterschiedlichem Sequenzkontext.

Das beschriebene Verfahren wird bevorzugt verwendet zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Er­ eignisse mindestens einer der folgenden Kategorien ange­ hören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkran­ kungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Ag­ gressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädi­ gungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörun­ gen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskulä­ re Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssys­ tems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungspro­ zess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.

Das vorliegende Verfahren wird besonders bevorzugt ver­ wendet zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.

Durch Bestimmung der Hybrisierungsverhältnisse zwischen den zwei eingesetzten Klassen von Oligonukleotiden (z. B. enthaltend CG/TG) wird Unabhängigkeit von der Intensität der Gesamthybridisierung der unbekannten Gewebeproben er­ reicht.

Zur Kalibrierung von unbekannten Gewebeproben werden un­ methylierte und aufmethylierte Vergleichsproben als Stan­ dards eingesetzt.

Bestandteil dieses Verfahrens ist ferner ein Kit, das ein Bisulfit enthaltendes Reagenz, Primeroligonukleotide zur Herstellung der Amplifikate und/oder vorzugsweise an eine Festphase immobilisierte Oligonukleotide umfasst. Die O­ ligonukleotide (erste Klasse) umfassen die Sequenz 5'-CG- 3'. Die Oligonkleotide (zweite Klasse) umfassen die Se­ quenz 5'-TG-3' und/oder die Sequenz 5'-CA-3'. Zu dem Kit gehört auch eine Anleitung zur Durchführung des Verfah­ rens.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von nicht- und aufmethylierter DNA und Bi­ sulphit-Behandlung

Für die Herstellung aufmethylierter DNA wurden humane ge­ nomische DNA mit S-Adenosylmethion und der CpG Methylase (SssI, New England Biolabs,) nach Angaben des Herstel­ lers behandelt. Für die Herstellung nicht-methylierter DNA wurde das Genfragment ELK-1 (siehe Anhang) mit den den Primer GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA und AGGTGGTGGTGGCGGTGG ausgehend von humaner genomischer DNA, mittels PCR amplifiziert. Die so hergestellte nicht- und aufmethylierter DNA, wie auch humane genomische DNA, wur­ de unter Verwendung von Bisulphit (Hydrogensulfit, Disul­ fit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschied­ liche Base entsteht, während die in 5-Position methylier­ ten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich zwischen 0.1 M und 6 M verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinba­ sen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zuge­ gen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin- Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen.

Beispiel 2 Herstellung der Cy5-markierten Gensonden

Ausgehend von den Bisulphit behandelten DNA Proben wird je ein definiertes Fragment der Länge 595 bp aus der Pro­ moterregion des ELK-1 Gens amplifiziert (Sequenz siehe Anhang). Die Amplifikation wird mit den Primeroligonukle­ otiden ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT und TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT durchgeführt. Durch Verwenden von Primeroligonukleotiden, die mit dem Fluoreszen­ farbstoff Cy5 markiert sind, wird das Fragment direkt bei der PCR markiert. Als Matrix DNA wird Bisulphit (Hydro­ gensulfit, Disulfit) behandelte (1) nichtmethylierte, (2) aufmethylierte und (3) humane genomische DNA verwendet. Anschließend werden diese drei unterschiedlichen DNA- Fragmente in getrennten Hybridisierungen auf ihren Methy­ lierungsgrad an einer spezifischen CpG Position unter­ sucht.

Beispiel 3 Durchführung der Hybridisierung und Auswertung eines hybridisierten DNA-"Chip"

Die in Beispiel 2 hergestellte Gensonden wird auf einem DNA Chip hybridisiert. Auf dem Chip sind zuvor Oligonukleotide immobilisiert worden. Die Oligonukleotidese­ quenzen leiten sich von dem in Beispiel 2 genannten amplifizierten Fragment des Gens ELK-1 ab, und repräsen­ tierten die CG Dinukleotide, die unmittelbare Umgebung einschließend. Die Länge der Oligonukleotide beträgt 14-- 22 Nukleotide, die Position des CG Dinukleotides inner­ halb der Oligonukleotide ist variabel. Nach der Hybridi­ sierung wird der DNA Chip gescannt (siehe Fig. 1) und die Hybridisierungssignale numerisch ausgewertet (Daten nicht gezeigt). Das Ergebnis der Hybridisierung für die Oligo­ nukleotide CTACTCAACGAAAACAAA und CTACTCAACAAAAACAAA wird in Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt. Hierbei hybridisiert CTACTCAACGAAAACAAA bevorzugt, wenn das zu Cytosin des ELK-1 Fragments, welches sich an Position 103 des Ampli­ fikates befindet, methyliert ist, CTACTCAACAAAAACAAA wenn dieses Cytosin nicht-methyliert ist.

In Fig. 1 ist ein DNA Chip nach Hybridisierung mit dem ELK-1 Fragment dargestellt. Dargestellt ist das Falsch­ farben-Bild wie es nach dem Scannen erzeugt wird. Entge­ gen der hier dargestellten schwarzweiß Abbildung wird von dem Scanner ein farbiges Bild erzeugt. Die Intensität der verschiedenen Farben repräsentiert den Grad der Hybridisierung, wobei der Hybridisierungsgrad von rot (in Fig. 1 als helle Spots zu erkennen) nach blau (in Fig. 1 als dunkle Spots zu erkennen) abnimmt.

Fig. 2A stellt eine Teilabbildung von Fig. 1 dar. Zur Verdeutlichung des Hybridisierungsschemas sind die ge­ spotteten Oligonkleotidpaare weiß umrandet: ctactcaacaaaaacaaa (links) und ctactcaacgaaaacaaa (rechts).

Teilabbildung Fig. 2B zeigt das Spottingmuster für ei­ nen unbekannten Methylierungsstatus der Gewebeprobe und

Teilabbildung Fig. 2C den Methylierungsstatus für die aufmethylierte Vergleichsprobe.

Tabelle 1

Der Mittelwert ist jeweils für eine Wellenlänge von 635 nm angegeben. In Spalte A werden die Werte für die un­ methylierte Probe, in Spalte B für einen unbekannten Me­ thylierungsstatus einer Gewebeprobe und in Spalte C die Werte für die aufmethylierte Vergleichsprobe. Die CG/CA Verhältnisse repräsentieren den Methylierungsstatus der jeweiligen Probe. Der Wert von 0,74 zeigt, dass die Probe im wesentlichen in aufmethylierter Form vorliegt.

Claims (25)

1. Verfahren zur Detektion des Methylierungsgrades eines bestimmten Cytosins im Sequenzkontext 5'-CpG-3' einer genomischen DNA-Probe, dadurch gekennzeichnet, dass

• a) man die genomische DNA chemisch behandelt, wo­ bei man die Cytosinbasen in Uracil umwandelt, nicht aber die 5-Methylcytosinbasen;
• b) man Teile der genomischen DNA amplifiziert, die das besagte bestimmte Cytosin enthalten, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung erhalten;
• c) eine Hybridisierung der Amplifikate an zwei Klassen von Oligonukleotiden mit jeweils mindestens einem Mitglied erfolgt, wobei die Oligonukleotide der ersten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Behandlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn das besagte bestimmte Cytosin in der genomischen DNA methyliert vorläge und wobei die Oligonukleotide der zweiten Klasse bevorzugt an die Sequenz hybridisieren, welche aus der chemischen Be­ handlung der genomischen DNA hervorgeht, wenn das be­ sagte bestimmte Cytosin in der genomischen DNA un­ methyliert vorläge;
• d) man das Ausmaß der Hybridisierung der Amplifi­ kate an die zwei Klassen von Oligonukleotiden durch Detektion der Markierung der Amplifikate bestimmt;
• e) man aus dem Verhältnis der an den zwei Klassen von Oligonukleotiden in Folge der Hybridisierung de­ tektierten Markierungen auf den Methylierungsgrad besagten bestimmten Cytosins in der genomischen DNA- Probe schliesst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren nicht nur mit der genomischen DNA-Probe durchführt, sondern sinngemäß auch mit be­ kanntermaßen an der Position des besagten bestimmten Cytosins methyliert oder aber unmethyliert vorliegen­ der Standard-DNA, wobei die jeweils mit der unmethy­ lierten Standard DNA gemäss Anspruch 1 gemessenen Verhältnisse der an den beiden Klassen von Oligo­ nukleotiden detektierten Markierungen als Eichwert für einen Methylierungsgrad von 0 und entsprechend die jeweils mit der methylierten Standard DNA gemäss Anspruch 1 gemessenen Verhältnisse der an den beiden Klassen von Oligonukleotiden detektierten Markierun­ gen als Eichwert für einen Methylierungsgrad von 1 dienen und man diese Eichwerte für die Bestimmung des Methylierungsgrades der genomischen Proben-DNA ein­ setzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man weitere bekannte Standard DNA-Proben zur Ei­ chung verwendet, die jeweils einen beliebigen bekann­ ten Methylierungsgrad des besagten bestimmten Cyto­ sins aufweisen.

4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Be­ handlung mit einer Lösung eines Bisulfits (= Hydrogensulfit, Disulfit) durchführt.

5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man besagte Markierung durch Chemilumineszenz, ihre UV-Absorption oder Fluores­ zenzpolarisation nachweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radionuklide sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen ablösbare Mas­ senmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die PCR-Produkte insgesamt oder deren charakteristische Fragmente im Mas­ senspektrometer nachweist und somit durch ihre Masse eindeutig charakterisiert sind.

10. Verfahren nach einem der Voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide der ersten Klasse die Sequenz 5'-CG-3' umfassen und die Oligonukleotide der zweiten Klassen die Sequenz 5'- TG-3' und/oder die Sequenz 5'-CA-3' umfassen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide der ersten und der zweiten Klasse auf einer gemeinsamen Festphase immobilisiert sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotide auf einer ebenen Festphase in einem rechtwinkligen oder hexagonalen Raster ange­ ordnet sind und der Ort bestimmter Oligonukleotide auf der Festphase mit deren jeweiliger Sequenz korre­ liert ist.

13. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche da­ durch gekennzeichnet, dass man den Schritt b) in zwei Teilschritten wie folgt durchführt:

• a) eine PCR Präamplifikation mit mindestens einem Primerpaar unterschiedlicher Sequenz, die an eine nach Anspruch 1 vorbehandelte DNA-Probe unspezifisch hybridisieren und daher im PCR Schritt mehr als ein Amplifikat ergeben;
• b) eine PCR Amplifikation des in der Präamplifikation gebildeten Produkts mit Primern unterschiedlicher Se­ quenz, die jeweils zu einem Abschnitt der nach An­ spruch 1 vorbehandelten DNA-Probe [(+)-Strang oder (-)-Strang] identisch oder revers komplementär sind und an die zu amplifizierende DNA spezifisch hybridisie­ ren.

14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, dass die Amplifikation von meh­ reren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durch­ führt wird.

15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Amplifikation eine hitzebeständige DNA-Polymerase verwendet wird.

16. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die für die Amplifikati­ on verwendeten Primeroligonukleotide der entweder nur die Basen T, A und C oder aber die Basen T, A und G enthalten.

17. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 10 CpG Posi­ tionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzei­ tig analysiert werden.

18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 50 CpG Posi­ tionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzei­ tig analysiert werden.

19. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 100 CpG Posi­ tionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzei­ tig analysiert werden.

20. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 500 CpG Posi­ tionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleichzei­ tig analysiert werden.

21. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 1000 CpG Po­ sitionen in unterschiedlichem Sequenzkontext gleich­ zeitig analysiert werden.

22. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die genomische DNA-Probe aus Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern oder allen möglichen Kombinationen hiervon erhalten wurde.

23. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranste­ henden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünsch­ te Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressions­ symptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psycho­ logische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädi­ gungen; psychotische Störungen und Persönlichkeits­ störungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kar­ diovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin­ testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehl­ funktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabo­ lische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopf­ schmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.

24. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranste­ henden Ansprüche zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferen­ zierung.

25. Kit, umfassend ein Bisulfit enthaltendes Reagenz, Primeroligonukleotiden zur Herstellung der Amplifika­ te und/oder vorzugsweise an einer Festphase immobili­ sierte Oligonukleotiden gemäß Anspruch 10 sowie eine Anleitung zur Durchführung eines Verfahrens nach ei­ nem der voranstehenden Ansprüche.