CN1910195A - 通过空间构象调节蛋白质功能 - Google Patents

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CN1910195A CNA2004800319098A CN200480031909A CN1910195A CN 1910195 A CN1910195 A CN 1910195A CN A2004800319098 A CNA2004800319098 A CN A2004800319098A CN 200480031909 A CN200480031909 A CN 200480031909A CN 1910195 A CN1910195 A CN 1910195A
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魏光文
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Abstract

本发明提供了一组调节蛋白质空间构象的方法。首先，根据宿主密码子的使用，选择用于编码目标蛋白质的氨基酸密码子。第二，从中选择可能调节空间构象的组合，并将其构建入可转染多种宿主的不同载体。第三，在组合目标蛋白质和启动子的编码序列后，通过监测碱基对的组合来对载体的启动子进行选择。最后，选择合适的表达宿主来表达目标蛋白质，重折叠并纯化，测定其活性和空间构象。

Description

通过空间构象调节蛋白质功能
本申请要求了提交于2003年8月28日的美国专利申请No.60/498,449、提交于2003年8月28日的美国专利申请No.60/498,785和提交于2003年8月28日的美国专利申请No.60/498,923的优先权。本申请同时要求了提交于2004年3月5日的印度专利申请No.279/MUM/2004和提交于2004年3月5日的印度专利申请No.280/MUM/2004的优先权。以上申请的内容全部被加入到本申请中作为参考。
在本申请中引用了各种参考文献。将这些出版物全部加入本申请作为参考，其与本发明相结合有助于全面地描述与本发明有关的技术状况。
背景技术
目前人们已完成的人类基因组计划已证实很多基因对疾病具有治疗作用，并且已采用基因重组技术开发出一些具有治疗作用的蛋白质类药物，但大部分具有治疗作用的基因在采用基因重组技术翻译成蛋白质后往往不再具有该基因在体内表现出的作用，或只具有部分作用。大量有治疗作用的基因不能顺利地利用基因重组技术获得相应的有治疗作用的蛋白质，这其中最大的障碍在于蛋白质空间构象的影响，怎样获得有效的蛋白质空间构象已成为一个充满竞争的研究领域。
在一级结构不变的情况下改变蛋白质的空间构象可使蛋白质的功能发生转变，例如：蛋白质异常的三维空间结构可以引发疾病，如：疯牛病(bovine spongiform encephalopathy)、老年性痴呆症(Alzheimer’sDisease)、囊性纤维病变(cystic fibrosis)、家族性高胆固醇症(familial hypercholestrolacemia)、家族性淀粉样蛋白质症(familialamyloid disease)、某些肿瘤(carcinoma)或白内障(cataract)。这些疾病也被叫做“折叠病”。造成疯牛病的“朊(Prion)”蛋白质可以感染正常蛋白质并在蛋白质之间传染。
在蛋白质结构研究中，大多数研究者认为，获得有效的蛋白质空间构象最主要在于重组蛋白质变性和重折叠技术。有大量文献报道各种分子伴侣、反向胶团(reverse micelles)等对重折叠有促进作用。虽然有种类繁多的使蛋白质在较天然的环境下表达的分泌型表达载体已经被研制出来，但它们都仅能对原有蛋白质的疗效产生量的提高而无质的变化。
附图说明
图1.Infergen(干复津)的圆二色谱图
波长范围：250nm-190nm
灵敏度：2m°/cm
光程：0.20cm
仪器：圆二色谱仪J-500C
样品：含30μg/ml的IFN-con1，5.9mg/ml的NaCl和3.8mg/ml的Na2PO4，pH7.0。
图2.重组高效复合干扰素(rSIFN-co)的圆二色谱图
波长范围：250nm-190nm
灵敏度：2m°/cm
光程：0.20cm
仪器：圆二色谱仪J-500C
样品：含30μg/ml的rSIFN-co，5.9mg/ml的NaCl和3.8mg/ml的Na2PO4，pH7.0。
图3.不同干扰素对乙肝病毒基因表达抑制作用的比较
图4A-1.A组受试者体温变化曲线(5位患者)
此图是A组5名受试者体温变化的记录
图4A-2.A组受试者体温变化曲线(6位患者)
此图是A组其余6名受试者体温变化的记录
图4B-1.B组受试者体温变化曲线(5位患者)
此图是B组5名受试者体温变化的记录
图4B-2.B组受试者体温变化曲线(5位患者)
此图是B组其余5名受试者体温变化的记录
图5.rsIFN-co晶体I
图6.rsIFN-co晶体II
图7.rsIFN-co晶体的X-射线衍射图谱
发明详述
本发明提供了一组调节蛋白质空间构象的方法。首先，根据宿主密码子的使用，选择用于编码目标蛋白质的氨基酸密码子。第二，从中选择可能调节空间构象改变的组合，并将其构建入可转染多种宿主的不同载体。这样，可以选择出一个适当宿主的适当载体。第三，在组合目标蛋白质和启动子的编码序列后，通过监测碱基对的组合来对载体的启动子进行选择。最后，选择合适的表达宿主来表达目标蛋白质，重折叠并纯化，测定其活性和空间构象。
本发明发现，在构建蛋白质的过程中，目标蛋白质的氨基酸编码密码子的变化、所选载体的不同、启动子的改变及宿主表达载体的选择，甚至变性复性的条件及试剂等都是调节目标蛋白质空间结构的可调因素。所以，调节蛋白质空间构象并获取新的功能和提高活性是系统分析的结果。
本发明提供了一种不改变蛋白质一级氨基酸序列而调节该蛋白质功能的方法，其步骤包括：a)改变所述蛋白质的密码子使用；b)通过改变的密码子表达所述的蛋白以得到纯化的蛋白质；和c)对改变编码密码子表达的蛋白质与原密码子表达的蛋白质进行比较，其中所获得的蛋白质的功能增强或表现出新功能即表明所述蛋白质的功能已经得到了调节。
在一个实施方案中，改变的密码子的使用使得蛋白质的表达量提高。
本发明还提供了一种用来制备具有增强的或者新的功能的蛋白质而不改变所述蛋白质一级氨基酸序列的方法，其包括以下步骤：a.改变所述蛋白质的密码子的使用；b.使用改变的密码子来表达所述蛋白质以获得纯化的蛋白质；和c.将用改变的密码子所表达的蛋白质与没有使用改变的密码子所表达的蛋白质进行比较，其中功能出现增强或鉴定出新的功能表明已经制备出了具有增强的或新的功能的蛋白质。
在一个实施方案中，改变的密码子的使用可使蛋白质的表达量提高。本发明还提供了由以上所述方法制备的蛋白质。在一个实施方案中，所述的蛋白质具有独特的二级或三级结构。
本发明还提供了一种带有改变的密码子的合成基因，当其表达时，可产生增强的或新的功能。在一个实施方案中，本发明提供了包含以上所述基因的载体。在另一个实施方案中，本发明还提供了包含以上所述基因的表达系统。在另一个实施方案中，本发明还提供了含有以上所述基因的宿主细胞。
本发明还提供了一种生产具有增强的或者新的功能的蛋白质的方法，其包括：将含有优选密码子的人工基因引入适当的宿主细胞，在适当的培养条件下培养所述的宿主细胞以使所述的蛋白质表达，和收获所表达的蛋白质。
在本发明提供的上述方法中，所述的人工基因序列被有效地与载体连接。在一个实施方案中，该方法还包括从发酵液中提取所述蛋白质，或收集包函体，并对收获的蛋白质进行变性及复性。
本发明还提供了通过以上任何方法所生产的蛋白质。
本发明提供了一种含有任何以上所述蛋白质及适当载体的组合物。本发明还提供了一种含有任何以上所生产的蛋白质及适当药用载体的药用组合物。
本发明的意义在于将具有治疗作用的基因翻译成蛋白质的过程中，对蛋白质的空间构象进行调控，从而使该蛋白质具有来源自该基因的功能，或具有传统技术生产的蛋白质所不具有的功能，或者甚至具有与那些存在的蛋白质相比较而言增强的活性。
以干扰素为例，将人IFN-α构建入逆转录表达载体得到PDOR-IFN-α表达载体，转染2.2.15细胞，测定细胞培养上清液中的HBsAg，HBeAg。结果显示，rSIFN-co对HBsAg，HBeAg的抑制率分别达到62％和67.7％。但如通过基因重组技术获得的重组干扰素蛋白质在体外就不具有抑制HBsAg，HBeAg分泌的作用。另外，用逆转录病毒载体构建了人IFN-α2的表达载体并转染至HIV细胞株-A3.01细胞内表达，证实IFN-α2能完全抑制HIV-DNA的复制和转录。但直接用干扰素对HIV感染进行治疗，效果有限。
以下实施例可以有助于更好地理解本发明。然而，具备专业技术的人员应当知道，讨论的具体的方法和结果只是对本文后所附的权利要求中所指的发明的例证。
实施例1：
对IFN-con1的构象改造
rSIFN-co是一种根据人INF-α亚型中的保守性氨基酸，用遗传工程的方法建构而成的一种新干扰素分子。该干扰素分子在美国专利4,695,263和4,897,471中已经有所描述，而且rSIFN-co已在一些文献和专利中被证明具有广谱的干扰素活性，较强的抗病毒和抗肿瘤及天然杀伤细胞活性。
本发明根据大肠杆菌密码子使用对其DNA编码序列重新进行了设计：将插入体首先构建入PHY-4载体，用PBAD启动子介导下游表达，而后将大肠杆菌选择为宿主为。产物通过6mol/L盐酸胍变性→4mol/L精氨酸复性→POROS HS/M-阳离子交换层析→Cu2+螯合亲和层析纯化，得到高纯度的目标蛋白质。
通过与IFN-con1进行抑制乙肝病毒DNA，及抑制HBsAg与HBeAg分泌的比较试验，结果表明rSIFN-co具有IFN-con1所不具备的对HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用。在另一试验中，将HBV核心/前基因组(C/P)启动子与相关的顺式作用元件放置于荧光素酶编码质粒的上游。将该报告构建体转染入HepG2细胞。然后，用不同干扰素处理该细胞，并测量荧光素酶报道基因的表达量。结果显示rSIFN-co对荧光素酶报道基因的表达抑制率是68％；而作为对照的IFN-con1及IFN-α2b仅有35％和27％。因此，rSIFN-co对HBVAg的抑制作用明显提高。
同时，圆二色谱图也证明rSIFN-co与IFN-con1的二级结构不同。
以下是具体比较实验：
1)圆二色谱图比较
实验地点：四川大学分析测试中心
仪器：圆二色谱仪J-500C(波长范围250-190nm，灵敏度：2m°/cm，光程：0.20cm，见附图1、2)
2)rSIFN-co抑制HBV-DNA的复制及HBsAg和HbeAg的分泌
材料
溶剂及配制方法：每支瓶内加入1ml生理盐水，溶解后，再根据所设不同浓度用MEM培养液调配。现用现配。
对照药品：IFN-α2b(Intron A)为冻干粉剂，购自先灵葆雅公司。每支3×106U，用培养液配成3×106IU/ml溶液。干复津(液体溶液)，购自安进公司，每支9μg，0.3ml，相当于9×106IU，用培养液配成9×106IU/ml溶液，4℃保存；2.2.15细胞：HBV DNA转染并克隆的人肝癌细胞(Hep G2)2.2.15细胞株，美国MountSinai医学中心构建。
试剂：MEM干粉，美国Gibco公司产品。胎牛血清，美国HycloneLab公司产品。G-418(Geneticin)；MEM调剂，美国Gibco公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所；卡那霉素，华北制药厂产品；Lipofectin，美国Gibco公司产品。
实验用品及仪器：培养瓶，丹麦TunclonTM；24孔和96孔培养板，美国Corning公司产品：二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；MEM培养液100ml：含胎牛血清10％，谷氨酰胺0.03％，G418 380μg/ml，卡那毒素50U/ml。
试验方法：
2.2.15细胞培养：在长满2.2.15细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液终止消化并使细胞分散。以1∶3传代，10天长满。
毒性试验：实验分无药物细胞对照组和不同药物浓度给药组。细胞消化，配制成每毫升10万个细胞的溶液，接种96孔培养板，每孔200μl，37℃5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。
将rSIFN-co配制成1.8×107IU/ml的溶液，而后2倍梯度稀释以制备一系列溶液。将其加入96孔细胞培养板，每浓度3孔，每4天换液.8天后显微镜下观察细胞病变.完全破坏为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算不同浓度药液平均细胞病变程度和抑制率。按ReedMuench法计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
TC 50 = Anti log ( B + 50 - B A - B × C )
A＝log＞50％药物浓度   B＝log＜50％药物浓度   C＝log稀释倍数
(dilution power)
对HBeAg、HBsAg抑制试验：试验设HBeAg、HBsAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及不同药物浓度给药组。每毫升70万个2.2.15细胞接种6孔细胞培养板，每孔3ml，37℃5％CO2培养24小时，3倍稀释试验药液以制备5个梯度稀释溶液(制备5个溶液，每个有不同的蛋白质浓度.溶液2比溶液1浓度低3倍，溶液3比溶液2浓度低3倍，等等)，分别为4.5×106IU/ml、1.5×106IU/ml、0.5×106IU/ml、0.17×106IU/ml、和0.056×106IU/ml，每浓度1孔，37℃5％CO2培养24小时，每4天用相同溶液换液。第8天时收获所有培养液，-20□保存。试验重复三批，分别用固相放射免疫测定盒(中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品)测定HBsAg和HBeAg。用γ-计数仪测定每孔cpm值。
药物效果计算：计算细胞对照组及每个浓度组的cpm均值及其标准差，P/N值如抑制百分率，半数有效浓度(IC50)及选择指数(SI)。
Figure A20048003190900111
A＝细胞对照组cpm；         B＝给药组cpm；
2)计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50)：
Figure A20048003190900112
A＝log＞50％药物浓度   B＝log＜50□药物浓度   C＝log稀释倍数
3)改变了空间构象的rSIFN-Co在2.2.15细胞培养内对HBsAg和HBeAg的选择指数(SI)：
SI = TC 50 IC 50
4)以t检验法(student t test)计算各稀释度和对照组间cpm的差别
DNA印迹：(1)2.2.15细胞内HBV-DNA提取：细胞培养8天，吸除培养液(通过移除培养液将细胞从培养液中分离出)。加入细胞裂解液以裂解细胞，而后用苯酚、氯仿、异戊醇混合物(1∶1∶1)抽提2次，高速10,000g离心。取上清，加无水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20μl TE缓冲液中。(2)电泳：加入6X DNA上样缓冲液，将样品加于1.5％琼脂糖胶上电泳，IV/cm，恒压，14-18小时。(3)变性和杂交：将胶分别浸于HCl、变性液、中和液中。(4)转膜：按程序将DNA转至Hybond-N膜上。同斑点杂交一同进行烤膜、杂交、曝光。扫描光片，以gel-pro凝胶分析软件分析相对密度，计算抑制率及IC50。
结果
表1、表2、表3中的结果表明：样品以最大无毒浓度指数加入2.2.15细胞培养8天，最大无毒浓度rSIFN-Co 9.0±0×106IU/ml对HBeAg的平均抑制率为46.0±5.25％(P＜0□001)，IC50为4.54±1.32×106IU/ml，选择指数SI为3.96；对HBsAg的平均抑制率为44.8±6.6％，IC50 6.49±0.42×106IU/ml，选择指数SI为2.77。因此，重组rSIFN-Co能明显的抑制HBeAg和HBsAg的活性，而对照组干扰素和干复津则不具该功能。在临床上也证实了rSIFN-Co能使HBeAg和HBsAg降低或恢复到正常水平。
表1：测定rSIFN-co对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制率的实验结果
第一批实验：(rSIFN-co)
                                                                      对e抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml) 第一孔 第二孔 第三孔 第一孔抑制率 第二孔抑制率 第三孔抑制率 平均抑制率 累加 1-累加 累加抑制率
  900   9026   8976   10476   0.436227   0.43935   0.345659   0.407079   0.945909   0.592921   0.614693546
  300   9616   12082   10098   0.3993754   0.245347   0.369269   0.337997   0.5388299   1.254924   0.300392321
  100   9822   16002   12800   0.386508   0.0005   0.2005   0.195836   0.200833   2.059088   0.08867188
  33.33333   15770   19306   16824   0.014991   0   0   0.004997   0.0049969   3.054091   0.001633453
  11.11111   19172   22270   18934   0   0   0   0   0   4.054091   0
  对照   细胞              16010   空白                                         0   稀释倍数               3   IC50           602.74446016
                                                                      对表面抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml) 第一孔 第二孔 第三孔 第一孔抑制率 第二孔抑制率 第三孔抑制率 平均抑制率 累加 1-累加 累加抑制率
  900   7706   7240   7114   0.342155   0.381936   0.392693   0.372261   0.922258   0.627739   0.595006426
  300   8856   7778   9476   0.2439816   0.336008   0.191053   0.257014   0.5499972   1.370724   0.286349225
  100   10818   10720   10330   0.07649   0.084856   0.118149   0.093165   0.292983   2.27756   0.113977019
  33.33333   10744   11114   10570   0.082807   0.051221   0.097661   0.07723   0.1998179   3.20033   0.058767408
  11.11111对照   10672   9352   10810   0.088953   0.201639   0.077173   0.122588   0.122588   4.077742   0.02918541
  细胞              11714   空白                                          0   稀释倍数               3   IC50           641.7736749
第二批实验：(rSIFN-co)
                                                                      对e抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   7818   8516   9350   0.554378   0.514592   0.467054   0.512008   1.371181   0.487992   0.737521972
  300   10344   10628   9160   0.4103967   0.394209   0.477884   0.427497   0.8591731   1.060496   0.447563245
  100   12296   14228   13262   0.299134   0.18901   0.244072   0.244072   0.4316522   1.816423   0.79201839
  33.33333   15364   17414   16188   0.124259   0.00741   0.77291   0.069653   0.1876045   2.74677   0.063933386
  11.11111   17386   13632   15406   0.009006   0.222982   0.121865   0.117951   0.117951   3.628819   0.03148073
  对照   细胞           16962   空白                         0   稀释倍数      3   IC50     365.9357846
                                                                      对表面抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   5784   6198   5792   498265   0.462353   0.497571   0.486063   0.893477   0.513937   0.634835847
  300   7150   8534   8318   0.379771   0.259715   0.278452   0.30598   0.4074138   1.207957   0.252210647
  100   9830   11212   10210   0.147294   0.027412   0.11433   0.096345   0.101434   2.111612   0.04583464
  33.33333   13942   12368   13478   0   0   0   0   0.0050891   3.111612   0.001632835
  11.11111   12418   11634   11352   0   0   0.015267   0.005089   0.005089   4.106523   0.001237728
  对照   细胞   空白                          0   稀释倍数       3   IC50      611.0919568
第三批实验：(rSIFN-co)
                                                                      对e抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   9702   9614   8110   0.428016   0.433204   0.521872   0.461031   1.316983   0.538969   709599543
  300   8914   10032   8870   0.4744723   0.40856   0.477066   0.453366   0.8559525   1.085603   0.440859127
  100   16312   12688   13934   0.038321   0.251975   0.178517   0.156271   0.402586   1.929332   0.172641621
  33.33333   15080   12814   13288   0.110954   0.244547   0.216602   0.190701   0.2463153   2.738631   0.082519158
  11.11111   21928   15366   15728   0   0.094093   0.072751   0.0055615   0.055615   3.683017   0.014875633
  对照   细胞             17544   空白                                              0   稀释倍数                 3   IC50             382.0496935
                                                                      对表面抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   5616   6228   5346   0.496864   0.442035   0.521054   0.486651   0.763125   0.513349   0.597838293
  300   8542   8590   7096   0.234725   0.230425   0.364272   0.276474   0.2764738   1.236875   0.182690031
  100   11420   11360   11394   0   0   0   0   0   2.236875   0
  33.33333   12656   11582   13110   0   0   0   0   0   0   0
  11.11111   13142   12336   13342   0   0   0   0   0   4.236875   0
  对照   细胞             11528   空白                                              0   稀释倍数                 3   IC50             694.7027149
   e抗原：IC50均值  450.2434  标准差  132315479
表面抗原：IC50均值  649.1894  标准差  42.29580
表2：Intron A(IFN-α2b)对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制率的实验结果
                                                                      对e抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  300   14918   11724   9950   0   0.029711   0.176529   0.068747   0.068747   0.931253   0.068746724
  100   14868   16890   15182   0   0   0   0   0   1.931253   0
  33.33333   16760   21716   16400   0   0   0   0   0   2.931253   0
  11.11111   20854   15042   16168   0   0   0   0   0   3.931253   0
  3.703704   12083   12083   12083   0   0   0   0   0   4.931253   0
  对照   细胞       17544   空白                                  0   稀释倍数       3   IC50      FALSE
                                                                      对表面抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  300   9226   8196   9658   0.152489   0.247106   0.521054   0.1708   0.189295   0.8292   0.185857736
  100   10946   10340   10828   0   0.050156   0.364272   0.018495   0.0184947   1.810705   0.010110817
  33.33333   12250   12980   13934   0   0   0   0   0   2.810705   0
  11.11111   12634   12342   12000   0   0   0   0   0   3.810705   0
  3.703704   10886   10886   10886   0   0   0   0   0   4.810705   0
  对照   细胞       10886   空白                                     0   稀释倍数       3   IC50       FALSE
表3：干复津对乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制率的实验结果
第一批实验：(干复津)
                                                                      对e抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   14172   12156   17306   0.091655   0.220869   0   0.104175   0.306157   0.895825   0.254710274
  300   13390   12288   16252   0.1417767   0.212409   0   0.118062   0.2019827   1.777764   0.102024519
  100   14364   18834   14194   0.079349   0   0.090245   0.056531   0.083921   2.721232   0.029916678
  33.33333   15722   16034   16340   0   0   0   0   0.0273897   3.721232   0.007306592
  11.11111   17504   17652   14320   0   0   0.082169   0.02739   0.02739   4.693843   0.005801377
  对照   细胞            15602   空白                                              0   稀释倍数     3   IC50   FALSE
                                                                      对表面抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   12080   11692   12234   0   0.01275   0   0.00425   0.025163   0.99575   0.024647111
  300   12840   11484   12350   0   0.030313   0   0.010104   0.0209125   1.985646   0.010422073
  100   12894   14696   15086   0   0   0   0   0.010808   2.985646   0.003606955
  33.33333   15032   12928   13020   0   0   0   0   0.0108081   3.985646   0.002704416
  11.11111   11794   11984   11508   0.004137   0   0.028287   0.010808   0.010808   4.974837   0.002167838
  对照   细胞            11843   空白                                              0   稀释倍数                 3   IC50      FALSE
第二批实验：(干复津)
                                                                      对e抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml) 第一孔 第二孔 第三孔 第一孔抑制率 第二孔抑制率 第三孔抑制率 平均抑制率 累加 1-累加 累加抑制率
  900   6278   6376   6408   0.200051   0.187564   0.183486   0.190367   0.274635   0.809633   0.253290505
  300   7692   9092   6394   0.0198777   0   0.18527   0.068383   0.0842678   1.74125   0.046161005
  100   8960   7474   8190   0   0.047655   0   0.015885   0.015885   2.725365   0.005794856
  33.33333   8530   8144   9682   0   0   0   0   0   3.725365   0
  11.11111   7848   7848   7848   0   0   0   0   0   4.725365   0
  对照   细胞            7848   空白                                           0   稀释倍数                 3   IC50             FALSE
                                                                      对表面抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   12364   12268   12274   0.036171   0.043655   0.043187   0.041004   0.140162   0.958996   0.12751773
  300   11590   12708   13716   0.0965076   0.009355   0   0.035287   0.0991581   1.923709   0.0490186
  100   12448   13468   13982   0.029623   0   0   0.009874   0.063871   2.913834   0.02144964
  33.33333   12616   11346   12444   0.016526   0.115529   0.029935   0.053996   0.0539965   3.859838   0.013796309
  11.11111   12828   12828   12828   0   0   0   0   0   4.859838   0
  对照   细胞           12828   空白                                            0   稀释倍数                 3   IC50             FALSE
第三批实验：(干复津)
                                                                      对e抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   7240   6642   6158   0.064599   0.14186   0.204393   0.136951   0.217399   0.863049   0.201211735
  300   11072   8786   5902   0   0   0.108269   0.03609   0.0804479   1.82696   0.042176564
  100   7016   9726   7552   0.09354   0   0.024289   0.039276   0.044358   2.787683   0.015663017
  33.33333   7622   8866   8676   0.015245   0   0   0.005082   0.0050818   3.782601   0.001341671
  11.11111   7740   7740   7740   0   0   0   0   0   4.782601   0
  对照   细胞         7740   空白                                 0   稀释倍数           3   IC50     FALSE
                                                                      对表面抗原的抑制作用
  浓度(×104IU/ml)   第一孔   第二孔   第三孔   第一孔抑制率   第二孔抑制率   第三孔抑制率   平均抑制率   累加   1-累加   累加抑制率
  900   11048   11856   11902   0.04775   0   0   0.015917   0.015917   0.984083   0.015916796
  300   13454   12896   11798   0   0   0   0   0   1.984083   0
  100   12846   13160   12546   0   0   0   0   0   2.984083   0
  33.33333   12680   12458   12360   0   0   0   0   0   3.984083   0
  11.11111   11602   11602   11602   0   0   0   0   0   4.984083   0
  对照   细胞         11602   空白                                 0   稀释倍数            3   IC50     FALSE
  e抗原：IC50均值：    0      标准差：0
  表面抗原：IC50均值： 0      标准差：0
实施例2
不同干扰素对乙肝病毒基因表达的抑制作用的比较
乙型肝炎病毒(HBV)DNA包含反式激活蛋白的共有元件，这种蛋白质的结合活性是受干扰素调控的。用干扰素处理HBV转染的肝细胞导致HBV基因表达的抑制。本研究的目的是研究不同的干扰素对HBV转录调控的影响。用含HBV增强子(EnH)I、EnH II和核心启动子控制下的萤火虫荧光素酶基因的报道质粒(reporter plasmid)来瞬时转染人类肝癌细胞，申请人研究了三种不同干扰素对转录的生物活性影响。
材料和方法：
1.干扰素：IFN-con1(干复津)、IFN-Hui-Yang(γSIFN-co)及IFN-β1b。
2.报道质粒：用PCR制备包含HBV-增强子(EnH)I、EnH II和核心启动子的DNA片段，将其末端切平克隆入无增强子且无启动子的萤火虫荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic(Promega，WI，USA)的Smal I位点。所得到的报告质粒命名为pGL3-HBV-Luc。
3.细胞培养和DNA转染：将HepG2细胞培养于DMEM培养基中，该培养基补加10％FBS，100U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素。将细胞放置于温度30℃，含5％的CO2的培养箱内。使用Boehringer的脂质体转染试剂盒用pGL3-HBV-Luc报告质粒转染细胞。经过18小时，移走含有转染试剂的培养基，注入含有或不含有干扰素的新鲜培养基，将细胞继续培养48小时。
4.荧光素酶测定：注入干扰素48小时后，收集并裂解细胞。该细胞溶解产物的蛋白质浓度由Bio-Rad蛋白质定量试剂盒检测。荧光素酶活性测定使用Promega的荧光素酶报告检测系统，按照制造商提供的指南进行。
实验结果：
不同干扰素处理的细胞溶解物中荧光素酶活性的表达
  对照   IFN-con1   IFN-Hui-Yang   IFN-β1b
  100   48+8   29+6   64+10
以上结果显示：γSIFN-co对HBV基因表达的抑制最有效。
实施例3
使用γSIFN-co的副作用及体温变化
现有干扰素类药的副反应较多。副反应包括：恶心、肌肉酸痛、食欲不振、脱发、白细胞减少(hypoleukmia；hypoleukocytosis；hypoleukia)及血小板减少等。
方法：
所有受试者分为两组。A组11名受试者注射9μg干复津，B组10名受试者注射9μg γSIFN-co。注射后，两组受试者临床观察48小时。注射1小时后进行第一次观察记录，此后每隔2小时观察记录一次。表4列出的是9μg γSIFN-co与9μg干复津注射后患者的副反应对比。
表4  副反应
  γSIFN-co9μg   干复津9μg
  人数：n＝10   人数：n＝11
  全身系统   反应   反应例数   反应例数
  总体   乏力   3   3
  脚板发热   1
  畏寒(frigolability)   3   4
  腿软   3
  腰酸   2   1
  全身疼痛   4   5
  中枢神经系统/周围神经系统   头痛   3   6
  头晕   2   11
  嗜睡   3
  胃肠   厌食   1
  腹痛   1
  腹泻   1
  肌肉骨骼系统   肌痛   1   2
  关节痛   2
  呼吸系统   鼻塞   1
  视觉障碍   眼胀   1
结论：
注射γSIFN-co受试者的副反应比较小。其副反应为一般流感样症状，如：头痛，乏力，畏寒，肌肉疼痛，出汗，关节痛(关节疼痛，关节疼)。注射干复津受试者的副反应明显比注射γSIFN-co受试者的副反应大。
由附图4A-1、4A-2、4B-1和4B-2，可以观察到A组受试者的体温明显高于B组受试者。这些结果还反映出γSIFN-co比干复津具有更好的耐受性。
实施例4
γSIFN-co晶体生长及晶体学参数测定
γSIFN-co的晶体研究。经过系统的摸索与实验，目前已获得两种晶体。(见附图5-7)
1、晶体生长
用纯水(H2O)溶解γSIFN-co蛋白质至浓度3mg/ml。结晶条件搜索使用Hampton公司的Hampton Research Crystal Screen I and II。采用气象悬滴扩散法(Drop Suspension Diffusion Method)，池液500μl，液滴1μl蛋白质+1μl池液，温度为293K。最初搜索得到两种不同类型的小晶体，见表5。
表5γSIFN-co晶体蛋白筛选
  条件   I   II
  稀释剂   0.1M Tris-HClPH＝8.75   0.1M HEPESPH＝7.13
  沉淀剂   17.5％(w/v)PEG550MME   10％(w/v)PEG6K
  添加剂   0.1M NaCl   3％(v/v)MPD
  温度   293K   293K
  晶体大小(mm)   0.2×0.2×0.1   0.6×0.02×0.02
  晶体衍射图   图5   图6
2、数据采集及处理
晶体I已用于X-射线衍射数据收集和初步晶体学分析，并完成晶体学参数测定。衍射数据收集在常温进行.将晶体I(条件I)封入薄壁石英管中。使用BrukerAXS Smart CCD探测器，光源采用Nonius FR591旋转阳极靶X光发生器产生的CuKα射线(λ＝1.5418)。光源功率2000kw(40kv×50mA)，波长1.00，曝光时间60秒，Δφ＝2°，晶体到探测器之间的距离为50mm。数据处理使用Bruker公司的Proteum程序包。晶体的衍射图谱(局部)见附图7。处理结果见表6。
表6  晶体学参数测定结果
参数
a()                 82.67
b()                 108.04
c()                 135.01
α(°)                90.00
β(°)                90.00
γ(°)                98.35
空间群                P2或P21
分辨率                5
不对称分子#           10
溶出(dissolution)     57.6％
另外，按照已发表文献，γSIFN-co未有晶体长出。与γSIFN-co最为相近的结果是huIFN-α2b，但是其筛选条件非常复杂。经过三次接种晶体长到0.5×0.5×0.3mm，其分辨率为2.9，空间群为P21，晶胞也很大，不对称分子有数为6，溶出为约60％。

Claims (16)

1、一种用于调节蛋白质功能而不改变所述蛋白质一级氨基酸序列的方法，其包括以下步骤：
1)改变所述蛋白质的密码子的使用；
2)使用改变的密码子来表达所述蛋白质以获得纯化的蛋白质；和
3)将用改变的密码子所表达的蛋白质与没有使用改变的密码子所表达的蛋白质进行比较，其中功能出现增强或鉴定出新的功能表明蛋白质的功能已经得到了调节。
2、权利要求1所述的方法，其特征在于改变的密码子的使用引起所述蛋白质的高表达。
3、一种用来制备具有增强的或者新的功能的蛋白质而不改变所述蛋白质一级氨基酸序列的方法，其包括以下步骤：
1)改变所述蛋白质的密码子的使用；
2)使用改变的密码子来表达所述蛋白质以获得纯化的蛋白质；和
3)将用改变的密码子所表达的蛋白质与没有使用改变的密码子所表达的蛋白质进行比较，其中功能出现增强或鉴定出新的功能表明已经制备出了具有增强的或新的功能的蛋白质。
4、权利要求1所述的方法，其特征在于改变的密码子的使用引起所述蛋白质的高表达。
5、由权利要求3或4所述的方法制备的蛋白质。
6、权利要求5所述的蛋白质，其具有独特的二级或三级结构。
7、一种带有改变的密码子的合成基因，其特征是当其表达时，
8、一种含有权利要求7中所述基因的载体。
9、一种含有权利要求7中所述基因的表达系统。
10、一种含有权利要求7中所述基因的宿主细胞。
11、一种生产具有增强的或者新的功能的蛋白质的方法，其包括：将含有优选密码子的人工基因引入适当的宿主细胞，在适当的培养条件下培养所述的宿主细胞以使所述的蛋白质表达，和收获所表达的蛋白质。
12、权利要求11所述的方法，其中所述的人工基因被有效连接到载体。
13、权利要求11所述的方法，其包括从发酵液中提取所述蛋白质，或收集包函体，和变性及复性收获的蛋白质。
14、由权利要求11-13所述的任一方法生产的所述蛋白质。
15、一种含有权利要求5、6或14所述的蛋白质以及适当载体的组合物。
16、一种含有权利要求5、6或14所述的蛋白质以及适当药用载体的药用组合物。
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CN1740197B (zh) * 2004-08-26 2010-05-12 辉阳科技美国公司 具有全新空间构象且功效增强的重组干扰素、其制备方法及应用
CN102101886A (zh) * 2009-12-18 2011-06-22 四川辉阳生命工程股份有限公司 构象改变的重组干扰素晶体、其三维结构及应用
SI2544705T1 (sl) * 2010-03-12 2016-11-30 Synairgen Research Limited Interferon beta za uporabo pri zdravljenju bolezni spodnjega dihalnega trakta, povzročene z influenco
TWI726291B (zh) * 2013-01-07 2021-05-01 英屬維爾京群島商遠東超級實驗室有限公司 通過干擾素的經皮和/或經粘膜給藥治療骨癌、皮膚癌、皮下癌、粘膜癌和/或粘膜下癌的方法和組合物
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CN111658779A (zh) * 2020-06-22 2020-09-15 四川大学华西医院 治疗新型冠状病毒肺炎的联合用药物
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