CN1267452C - 单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗 - Google Patents

单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN1267452C
CN1267452C CNB998165425A CN99816542A CN1267452C CN 1267452 C CN1267452 C CN 1267452C CN B998165425 A CNB998165425 A CN B998165425A CN 99816542 A CN99816542 A CN 99816542A CN 1267452 C CN1267452 C CN 1267452C
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
cell
antibody
application
bat
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB998165425A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1346371A (zh
Inventor
布雷塔·哈地
亚伯拉罕·诺沃格罗斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MOR REEARCH APPLICATIONS Ltd
Mor Research Applications Ltd
Original Assignee
MOR REEARCH APPLICATIONS Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MOR REEARCH APPLICATIONS Ltd filed Critical MOR REEARCH APPLICATIONS Ltd
Publication of CN1346371A publication Critical patent/CN1346371A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1267452C publication Critical patent/CN1267452C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及新的针对类淋巴母细胞产生的单克隆抗体(mAb)的DNA和氨基酸序列以及与所述mAb结合的肽。本发明还涉及将所述抗体或肽用于检查出很可能患有恶性疾病的个体，有时用于检查出患有特定恶性疾病的个体的诊断方法。本发明还涉及包括本发明的单克隆抗体或肽的用于治疗不同恶性疾病的药物组合物，以及使用本发明的单克隆抗体或肽治疗恶性疾病的方法。

Description

单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗
发明领域
本发明涉及单克隆抗体的新序列、与该单克隆抗体结合的抗原的肽序列，以及利用单克隆抗体和肽的诊断和治疗方法。
发明背景
公开号为No.WO 95/20605，由申请人共同拥有的PCT专利申请公开了免疫刺激性单克隆抗体。该PCT申请的主题抗体针对B类淋巴母细胞而产生并表现出具有免疫刺激的效果。当向发生肿瘤的动物体内注射时，发现这些抗体也具有引发抗肿瘤的效果。
在目前的医疗程序下，对癌症的诊断一般是一个涉及身体检查、使用不同的成像技术、使用不同的癌症标示物等的多步骤程序。在癌症的诊断技术领域一直有一个长期的需求，即能够检查出癌症并确定被检查的人员所患癌症的种类。
发明的总体描述
本发明的基础是发现了针对类淋巴母细胞的单克隆抗体的序列。本发明的另一个基础是发现了这些抗体同癌症病人的T细胞的结合水平与同健康人的T细胞的结合水平不同(更高或更低)。
根据本发明的一个方面，本发明提供了具有可变区的单克隆抗体，其选自：
(a)其重链可变区包括图1所示氨基酸序列的单克隆抗体；
(b)其κ轻链可变区包括图2所示氨基酸序列的单克隆抗体；
(c)其重链可变区包括图1所示氨基酸序列且κ轻链可变区包括图2所示氨基酸序列的单克隆抗体；
(d)其重链可变区与图1所示氨基酸序列具有至少70％同一性的单克隆抗体；
(e)其轻链可变区与图2所示氨基酸序列具有至少70％同一性的单克隆抗体。
根据本发明，术语“抗体”是指IgG、IgM、IgD、IgA和IgE类中的任何一类的单克隆抗体。该术语是指完整抗体或包括抗体的抗原结合区的抗体片段，例如缺少Fc部分的抗体、单链抗体、基本上仅包括抗体的可变抗原结合区的节(article)片段等。
此外，本发明还涉及与抗原结合的抗体，上述单克隆抗体中任何一种特异性地与该抗原结合，即与上述抗体具有交叉反应性的抗体。
按照本发明的一个实施方案，所述单克隆抗体是一个嵌合的人-鼠抗体，即具有人源恒定区和鼠源可变区的单克隆抗体(mAb)。出于此种目的，本发明单克隆抗体的κ轻链和重链的可变区以PCR法克隆并测定其DNA序列。按照本发明的另一个实施方案，抗体是一个完全人源化抗体，即其可变区和恒定区均取自人。
“具有至少X％同一性”术语是指当对序列进行最佳对比时，在两个对比序列中相同的氨基酸残基的比例。因此，70％氨基酸序列同一性是指在两个或多个最佳对比的多肽序列中有70％的氨基酸是相同的。优选同一性为80％，最优选为90％。
根据本发明的另外一个方面，提供了产生本发明的任何单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系。杂交瘤可以由本领域中的任何已知技术制备(例如，Kohler，G.和Milstein，C.，Nature， 256：495-497，(1975))。杂交瘤细胞系的上清液一般通过本领域的任何已知的方法筛选其抗体结合活性，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)或放射免疫测定法(RIA)。筛选上清液以制备单克隆抗体，该单克隆抗体同本发明的任何肽链(如下文说明)结合或同与之结合的细胞，例如Daudi细胞或T淋巴细胞相结合。
编码上述单克隆抗体的重链或轻链的任何氨基酸序列的DNA序列也包括在本发明的范围内。毫无疑问，本领域的任何熟练技术人员都清楚，由于遗传密码的退化性状，多数核酸序列可编码本发明的单克隆抗体，除了图1或2所示的那些。
本发明还提供了例如具有所述DNA序列的质粒的表达载体以及包含一个或多个所述表达载体的宿主细胞。
按照本发明的另外一个方面，本发明提供了本发明的单克隆抗体能够与之结合的B细胞抗原的肽序列。针对非冗余基因库数据库和EST分区所实施的检索表明该肽序列是新的。
按照本发明的这一方面，本发明提供了选自下述的肽：
(a)具有图10所示的氨基酸序列的肽；
(b)具有图11所示的氨基酸序列的肽；
(c)具有图12所示的氨基酸序列的肽；
(d)与上述(a)、(b)和(c)肽的氨基酸序列的任何一个具有至少85％同一性的肽；
(e)包括一个或多个上述(a)-(d)肽链的蛋白质或肽。
本发明的肽可以用于不同的诊断分析，例如竞争性免疫分析，该分析可以确定本发明的单克隆抗体与存在于T细胞上的其天然抗原的结合水平。此外，该肽可以用于在免疫动物体内产生抗体，然后该抗体可以被用于上文或下文所描述的任何一种功能。
所有上述肽的类似物也形成了本发明的另外一个方面。正如精通本领域的人员所理解的，可以改变本发明的肽的氨基酸序列，例如，通过一个或多个氨基酸的添加、缺失或者保守或非保守替换进行，而不会对肽抗体的结合性能产生实质性的改变。
术语“保守替换”是指一种类型的氨基酸被同种类型的氨基酸所替换，其中类型由氨基酸侧链的普通生理化学性质和在自然界中发现的同源蛋白质的高替换频率所限定，例如通过标准Dayhoff频率交换基质或BLOSUM基质确定。已表征了六种氨基酸侧链基本类型，包括：类型I(半胱氨酸)；类型II(丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸)：类型III(天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸)；类型IV(组氨酸、精氨酸、赖氨酸)；类型V(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、Met)；以及类型VI(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。例如，以类型III中的其他氨基酸残基如天冬酰胺、谷氨酰胺或谷氨酸替换天冬氨酸即为保守替换。术语“非保守替换”是指以一种类型中的氨基酸替换另一种类型中的氨基酸；例如，以类型III中的氨基酸残基，如天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺替换类型II中的氨基酸残基丙氨酸。
上文(以及下文)所使用的用于指示特定氨基酸(aa)的字母符合由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所推荐的单字母氨基酸符号。
落入本发明范围的上述肽的类似物与如图10-12所示的肽具有实质上相同的与本发明的单克隆抗体结合的水平。结合水平可以以本领域的任何已知的方式确定。
本发明的肽和类似物也可以进行化学修饰，此种经化学修饰的肽和类似物也是本发明的组成部分。术语“化学修饰”是指其中至少一个氨基酸残基通过自然过程如加工或其他翻译后修饰，或者通过本领域中已知的化学修饰技术修饰的蛋白质。在许多已知的修饰中，典型但并不排他的修饰包括：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI锚形成、与液体或脂质衍生物的共价连接、甲基化、十四烷基化、pegylation、异戊二烯基化、磷酸化、遍在蛋白化或任何类似过程。
本发明所基于的第二个发现是本发明的单克隆抗体与取自恶性疾病病人的T细胞的结合程度和与取自健康人体的T细胞的结合程度不同。
因此，本发明的另外一个方面提供了用于识别很可能患有恶性疾病的被检查人员的检查方法，包括：
(a)从被检查人员获得体液样品；
(b)将上述样品与本发明的至少一种单克隆抗体接触；
(c)确定上述单克隆抗体与上述样品中的T细胞的结合程度；以及
(d)将(c)项中的结合程度和本发明的单克隆抗体与取自健康个体的样品中的T细胞的结合程度进行对比；上述两项结合程度的显著差异表明该被检查人员是很可能患有恶性疾病的。
根据本发明，取自被检查个体的样品可以是包括可检测数量的T细胞的任何体液。典型地，体液样品是血液样品或淋巴液样品。优选在将本发明的单克隆抗体与所取得的样品接触前，通过一种本领域中已知的方法，例如Ficoll Hypaque密度离心法将样品中的外周血单核细胞(PBMC)分离出去，分离出来的细胞然后被用于与检测抗体的接触。
本发明中的术语“恶性疾病”应理解为本领域已知的处于任何阶段的任何种类的恶性疾病。
该术语也包括处于其早期阶段，尚未表现出临床症状的恶性疾病。该术语优选指的是实体肿瘤。
术语“健康个体”是指没有患上恶性疾病的人，也可以指几个个体的平均水平，或者指将取自几个个体的体液进行混合后得到的水平。应该注意的是，一旦建立起健康个体结合程度的标准数据，则没有必要为每一次检查重新建立该标准数据，并可以连续使用已建立的数据。根据本发明，发现在健康个体中，大约25％的CD3+T细胞与本发明的抗体结合。
术语“很可能”系指本发明的检查是一种能够识别出怀疑患有恶性疾病的个体的初步筛选检查。通过本发明的方法所检查的个体确实患有恶性疾病的事实还需要通过本领域已知的其他技术在以后证实。
术语“结合程度”涉及抗体与被检查个体的T细胞上存在的抗原的结合水平，该程度可以通过本领域中已知的确定抗体的结合水平的任何方法确定，例如ELISA或Western Blotting。可以使用任何检测系统确定结合程度，例如使用与一种可检测的标记物连接的抗小鼠免疫球蛋白或其片段。此类可检测的标记物的例子是放射性基团、发荧光的基团、能够催化产生可检测产物的反应(例如一种颜色反应)的酶、能够通过抗生物素蛋白被检测到的生物素基团等。在一个优选的实施例中，本发明的单克隆抗体与T细胞的结合程度通过一种双重标记的方式测定，其中在抗T细胞抗体(例如，抗-CD3+抗体)上连接一种发荧光的标记物，在本发明的单克隆抗体上连接另一种发荧光的标记物。然后使用荧光素活化细胞分选仪(FACS)确定结合程度。结合程度的定量通过确定CD3+T细胞的百分比得到(由其与抗CD3+抗体的结合确定)，所述T细胞也与本发明的单克隆抗体相结合。
根据本发明，发现在患有恶性疾病的个体的血液样品中的CD3+细胞的总数与取自健康个体的血液样品的CD3+细胞的总数类似，因此，使用患有恶性疾病的个体和健康的个体中CD3+结合性T细胞的总数对单克隆抗体和CD3+T细胞二者的结合程度进行标准化均是有效的。然而，在患有恶性疾病的个体中CD3+结合性T细胞(该T细胞也与本发明的单克隆抗体结合，以下称：“CD3+mAb细胞”)的百分比与健康个体血液中的CD3+mAb+细胞百分比有显著差异。患有恶性疾病的个体中的CD3+mAb细胞的百分比可能显著高于或显著低于健康个体中的CD3+mAb+细胞百分比，这取决于恶性疾病的类型。
当如由在此所提到的实验方法获得的结果连同本领域中任何已知的统计方法(例如，斯氏t检验)所确定的，本发明的单克隆抗体与取自被检查个体的T细胞的结合程度和与取自健康个体的T细胞的结合程度相比在统计学上存在显著程度的差异时，则认为所述单克隆抗体的结合程度之间存在“显著差异”。
本发明不但能够识别很可能患有任何类型的恶性疾病的个体(其中，患病个体的T细胞与本发明的单克隆抗体的结合程度与健康个体相比是不同的)，而且能够通过确定上述结合程度比健康个体中相应的结合程度高或低而帮助识别患有特定类型的癌症的个体。
典型地，本发明的单克隆抗体与取自健康个体的T细胞的结合百分比在大约25％的范围，即，表达CD3+T细胞标记物的细胞中的25％(由抗CD3+抗体与细胞的结合确定)也与本发明的单克隆抗体结合。
根据本发明，已表明在取自前列腺癌症病人的样品中，与本发明的单克隆抗体结合的CD3+T细胞的百分比在约50％的范围内。
还进一步表明，当CD3+T细胞来自取自结肠或乳腺癌病人样品时，与本发明的单克隆抗体结合的细胞百分比分别是约7％和10％。
因此，根据本发明，使用以本发明的单克隆抗体与体液样品中的CD3+细胞的结合程度作为基础的简单且单一的检查即有可能确定在取自被检查个体的体液样品中很可能存在特定类型的癌。本发明诊断方法的简易性，即仅需要使用一种单克隆抗体来识别患有某一类型的癌症的个体，对于人群的大范围筛查是非常有用的。
因此，本发明的另一个方面提供了一种识别很可能患有特定恶性疾病的被检查个体的分析方法，包括：
(a)从上述个体中取得体液样品；
(b)将上述样品与本发明的单克隆抗体接触；
(c)确定上述单克隆抗体与上述样品中的T细胞的结合程度；和
(d)将(c)项中所获得的细胞结合程度和单克隆抗体与取自健康个体的T细胞的结合程度进行对比，在结合程度上存在显著差异表明被检查个体很可能患有一种恶性疾病，其中单克隆抗体与取自上述个体的T细胞的结合程度高于或低于与取自健康个体的T细胞的结合程度表明被检查个体很可能患有一种特定类型的恶性疾病。
特别地，当与本发明的单克隆抗体的结合程度显著高于健康个体中的结合程度时，被检查个体很可能患有前列腺癌。
当结合水平显著低于健康个体时，被检查个体很可能患有结肠癌或乳腺癌。
根据本发明的诊断方面，包括本发明的单克隆抗体的组合物可以被用于识别很可能患有一种恶性疾病(通常意义)的个体或被用于识别该个体可能患的特定恶性疾病的诊断。因此，本发明的另一个方面提供了包括属于至少一种上文所提到的抗体的单克隆抗体及适当的载体的诊断组合物。载体可以是可溶性载体，例如本领域中已知的任何一种生理上可以接受的缓冲液(例如，PBS)，也可以是固态的载体，例如乳胶珠。
本发明还提供了试剂盒，例如使用本发明的单克隆抗体并进行上文所公开的诊断分析的诊断分析试剂盒。在一个实施方案中，诊断试剂盒通常包括在一个或多个容器中的至少一种上述单克隆抗体，单克隆抗体的特定结合配偶体的偶联物(例如本发明的抗原或类似物)，能够产生可测信号的标记物以及使用指南。根据推理，标记物可以与单克隆抗体结合，或者，标记物可以与载体分子结合，载体分子再与单克隆抗体特异性地结合。被测试样品与诊断试剂组分的温育时间应足以使单克隆抗体与细胞结合。
本发明的另一个方面提供了药物组合物，其组分包括作为活性组分的本发明的一种或多种单克隆抗体。上述单克隆抗体在制备用于治疗个体的不同恶性疾病的药物制剂中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明的另一个方面涉及一种通过向需要的个体给予治疗有效量的上述单克隆抗体而对恶性疾病进行治疗的治疗方法。治疗有效量是指能够减轻恶性疾病的症状、减少或完全消除症状的量。
包括本发明的肽的药物组合物也构成了本发明的一个方面。该药物组合物可以用于，例如刺激个体的免疫功能以获得抗体，然后该抗体与个体的T细胞结合并诱发个体的免疫应答。
本发明内容的详细描述
下面将在随时引用附图的情况下描述本发明的主要方面。在下面的描述和附图中，术语“BAT抗体”将与术语“本发明的单克隆抗体”交互使用。
对附图的简要说明
图1表示本发明的单克隆抗体的重链可变区的DNA和肽序列；
图2表示本发明的单克隆抗体的κ轻链可变区的DNA和肽序列；
图3是对本发明的抗体的重链可变区的氨基酸序列分析(标为“BAT”，“BAT”限定了BAT抗体VH区的氨基酸序列，而“VMS2”限定了种系VMS2/VGK4的种系基因的氨基酸序列。当BAT序列与种系序列相同时，种系序列以点(.)代替；当发生错配时，标明不同的种系残基。下面的表及后续页中的序列描述了在Kabat等人的Sequences of proteins of immunological interest(1991)所述的小鼠重链亚型杂集(小鼠VHMisc.)及更大的全部已知的小鼠VH序列数据库中在特定的残基位置观察到的特定氨基酸的出现频率)；
图4是对本发明的抗体的κ轻链可变区的氨基酸序列分析(在图中标为“BAT”)。“小鼠”限定了BAT抗体Kκ区的氨基酸序列，而“种系”限定了种系H4种系基因的氨基酸序列。当BAT序列与种系序列相同时，种系序列以点(.)代替；当发生错配时，标明不同的种系残基。下面的表及后续页的内容描述了在Kabat小鼠重链亚型VI(小鼠VκVI)及更大的全部已知的鼠Vκ序列所有小鼠Vκ数据库中在特定的残基位置观察到的特定氨基酸的出现频率；
图5表示本发明嵌合抗体的κ轻链可变区的DNA和肽序列；
图6表示本发明嵌合抗体的重链可变区的DNA和肽序列；
图7是对用于表达本发明嵌合抗体的κ轻链的pKN 110哺乳动物表达载体的示意性描述；
图8是对用于表达本发明嵌合抗体的重链的pG1D 110哺乳动物表达载体的示意性描述；
图9是对以ELISA分析法对鼠和本发明的γ1/κ嵌合抗体与Daudi细胞的结合特性的测定结果的一个例子的图示；
图10表示本发明的肽1的氨基酸序列；
图11表示本发明的肽2的氨基酸序列；
图12表示本发明的肽3的氨基酸序列；
图13是对以FACS分析法确定的在取自健康个体的血液样品中，与本发明的单克隆抗体(以“BAT”表示)结合的CD3+细胞占CD3+细胞总数的百分比的示意性描述；
图14表示以FACS分析法确定的在取自患有结肠癌的病人的血液样品中，与本发明的单克隆抗体(以BAT表示)结合的CD3+占CD3+细胞总数的百分比；
图15表示在取自乳腺癌的病人的血液样品中，与本发明的单克隆抗体(以BAT表示)结合的CD3+细胞占CD3+细胞总数的百分比；
图16表示在取自前列腺癌的病人的血液样品中，与本发明的单克隆抗体(以BAT表示)结合的CD3+细胞占CD3+细胞总数的百分比；
图17表示与乳腺癌、结肠癌或前列腺癌病人相比，在健康个体中，与本发明的单克隆抗体(以BAT表示)结合的CD3+细胞平均百分比的图示；
图18是取自前列腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌病人T细胞或取自Daudi细胞的膜的肽的蛋白质印迹(Western Blot)的照片。将印迹与本发明的单克隆抗体温育，表明取自前列腺癌病人的T细胞中的抗原数量增加，而取自乳腺癌病人的T细胞的抗原水平检测不到。
I.单克隆抗体的测序
(A)缩写
胎牛血清(FCS)；核糖核酸(RNA)；信使RNA(mRNA)；脱氧核糖核酸(DNA)；复本DNA(cDNA)；聚合酶链反应(PCR)；分钟(min)；秒(sec)；Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)。
(B)原料
培养基成分及所有其他组织培养材料取自Life Technologies(UK)。RNA分离试剂盒取自Sratagene(USA)，而cDNA的第一条链合成试剂盒从Pharmacia(UK)购买。包括AmpliTaqDNA聚合酶在内的所有PCR反应组分和设备均向Perkin Elmer(USA)购买。TA Cloning试剂盒获自Invitrogen(USA)。琼脂糖(UltraPureTM)来自Life Technologies(UK)。Thermo SequencesTM预混合循环测序试剂盒及Vistra 725DNA测序仪均购自Amersham(UK)。所有其他分子生物学产品均来自New England Biolabs(USA)。
(C)实验技术：PCR克隆及小鼠BAT抗体可变区基因的克隆和测序
将小鼠BAT杂交瘤细胞系和Daudi细胞系成功地转移至MRC-CC，两种细胞系均在悬浮液中生长，悬浮液使用RPMI(不含谷氨酰胺)并添加10％(v/v)FCS，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和12.5单位/ml制霉菌素。
收获BAT杂交瘤细胞系的大约108个活细胞，按照制造商的指示使用RNA分离试剂盒将总RNA从这108个细胞中分离出来。试剂盒使用如Chromczynski和Sacchi在Anal.Biochem.， 162：156，1987中所描述的硫氢酸胍苯酚-氯仿单步骤提取程序。仍然按照制造商的指示，利用第一条链cDNA合成试剂盒，使用试剂盒所提供的NotI-(dT)18引物产生BAT杂交瘤mRNA的单链DNA拷贝。在每33μl最终反应体积中使用大约5μg总RNA。然后将最终反应混合物在90℃加热5分钟，以使RNA-cDNA双链体变性并使反转录酶失活，然后在冰上冷却。
为PCR扩增来自杂交瘤细胞系的小鼠重链可变区基因(VH基因)及小鼠κ轻链可变区基因(Vκ基因)，使用Jones和Bendig在Bio/Technology，9：8，1987中所描述的方法。实质上，使用两组简并引物，一组设计用于和小鼠重链基因的前导序列(即MHV1-12；表1)退火，另一组设计用于和小鼠轻链基因的前导序列(即MKV1-11；表2)退火，它们与设计用于和合适的恒定区基因的5’端退火的引物一起用于PCR克隆鼠可变区基因。
在特殊的PCR-室(PCR-room)中使用为尽可能减少交叉污染的可能而特别设计的程序，用其合适的恒定区引物准备针对每种简并引物的单独PCR反应。在各种情况下，使用AmplitaqDNA聚合酶扩增模板cDNA。然后将PCR反应管放入Perkin Elmer 480DNA循环变热加温器中进行每次94℃下1分钟和72℃下1分钟的循环加温，循环25次(在最初以94℃解链1.5分钟之后)。在最后一个循环完成时，在72℃下实施最后的延伸步骤10分钟，然后将反应物冷却至4℃。除在退火(50℃)和延伸步骤(72℃)之间使用的持续的间隔时间(ramp time)为2.5分钟之外，在每个循环步骤之间应用30秒的间隔时间。
取自每个PCR反应的10μl等份样品在1％的琼脂糖/TBE(pH8.8)胶上走柱，以确定哪个反应产生了合适大小的PCR-产物。那些看起来确实扩增了全长可变区基因的PCR反应被重复进行，以产生独立的PCR克隆并因此减少PCR-错误的效果。那些适当大小的PCR产物的1-6μl等分样品被直接克隆至TA Cloning试剂盒所提供的pCRIITM载体中，并按照制造商的指示转化至INAαF’感受态细胞中。按照Güssow和Clackson在Nucleic Acid Res.， 17：4000，1989中的方法使用下面的表3所示的pCRII正向和pCRII反向的寡核苷酸引物对集落进行PCR筛选，从而识别含有具有适当大小的插入子的质粒的集落。
那些所识别的假定的阳性克隆是双链质粒DNA，使用Vistra DNA测序仪以及按照制造商的说明书的描述使用Thermo SequenaseTM预混合循环测序试剂盒对其进行了测序。
实施例1：BAT抗体重链可变区的克隆和测序
如同所有人源化的项目，采用严格的PCT克隆和测序程序。这样做是为了尽可能降低向来自BAT杂交瘤细胞系的鼠VH可变区基因的野生型序列引入错误的可能。只有在来自至少两个不同的来自表达鼠BAT抗体的杂交瘤细胞系的VH基因克隆的所有DNA序列数据均完美地匹配时，该基因序列才被作为正确的序列接受。
对来自不同的总RNA制剂和后续第一链cDNA合成反应的三种单独的PCR产物，进行PCR克隆并在两条链上进行完全的DNA测序。虽然测试了全部12个重链引物(表1)，只有MHV9引物(与MHCG3一起被设计用于小鼠γ3重链基因的CH1域的退火)得以PCR扩增，得到一种大约为460bp的产物，然后将其TA-克隆进pCRIITM克隆载体(未列数据)。
对分别来自三种PCR产物(每种产物来自不同的第一链合成反应和后续的PCR反应)的几个单独的克隆的DNA序列分析最终确定了BAT抗体重链可变区的序列，如图1所示。这一序列在所研究的全部三种PCR克隆中的DNA双链上得到证实。
实施例2：BAT抗体的κ轻链可变区的克隆和测序
使用一系列κ轻链简并引物使通过第一链合成反应产生的单链cDNA模板得到PCR扩增(下文的表2)。然而，这导致来自不止一种简并引物的PCR产物被扩增，表明不止一个可变区基因至少通过杂交瘤细胞系被转录。
首先，当MKV2引物(与MKV系列引物一样与信号肽κ轻链的DNA序列5’端退火)和MKC(设计用于与小鼠κ恒定区基因5’端退火)一起使用时，观察到一种PCR产物。以前的内部实验告诉我们MKV2引物会PCT扩增一种异常的mRNA转录物。这种异常的假基因出现在衍生自原始的MOPC-21浆细胞瘤细胞系的所有标准的融合配偶体中，并被称为MOPC-21(Deyev，S.M.等人，Genetica， 85：45，1991)。NO-0是一种衍生自MOPC-21系的细胞系，正是这一细胞系被作为用于产生BAT杂交瘤的融合配偶体。因此，当使用MKV2引物时观察到PCR产物并不希奇。分析这一产物，表明其是非功能性假基因(未列举数据)。
奇怪的是，以前被认为被相关的细胞系NS-1(Hamlyn，P.H.，等人，Nucl.Acis.，Res.， 9：4485，1981)所分泌并在同时使用MKV7引物和MKC引物时正常PCR克隆的另一种假基因在目前已分析的任何PCR产物中均没有观察到。由于NS-1和NS-0细胞系具有高度的相关性，这就有一点奇怪。然而，这也表明存在于BAT杂交瘤细胞系中的κ轻链转录的混乱性。
最终成为BAT抗体的Vκ基因的另外一种PCR克隆，利用MKV5引物和MKC引物也被从BAT杂交瘤细胞系成功地PCR扩增。随着大约450bp产物转化到INVαF’感受态细胞中，使用PCR筛选分析识别出推定的阳性转化体，然后对其DNA测序。
根据对MKV5产物的两个单独的克隆(每种来自不同的第一链合成反应和后续PCR反应)的序列分析，确定了BAT抗体κ轻链可变区基因的DNA序列(图2)。这一序列被又一次在每个克隆中的两条DNA链上证实。
实施例3鼠BAT抗体可变区的序列分析
将BAT Vκ和VH区的氨基酸序列与在Kabat(Supra)数据库中所示的鼠可变区亚型的共有序列进行比较。通过这种分析，发现BAT VH区与小鼠κ亚型VI的共有序列最匹配。对BAT VH区与Kabat数据库的类似比较发现其表现出与小鼠重链亚型“杂集”的共有序列的最佳匹配。
将上述BAT抗体的可变区序列与鼠种系数据库比较，发现与BATVH基因最近的种系基因是VMS/VGK4(图3)，而与BAT Vκ基因最近的种系基因是H4(图4)。正如图3所示，发生在BAT VH基因与其最近的种系基因之间的错配毫不奇怪地主要位于CDR2和CDR3。只有三处构架改变，均位于FR3。关于BAT Vκ基因(图4)，仍然毫不奇怪的是，多数错配均位于CDR。四种位于FR的改变，除在FR3的第72位点(Kabat编号)的半胱氨酸外均为高度保守性的改变。其紧邻着一个重要的规范残基(第71位点)的位置表明半胱氨酸可能在抗原的结合中扮演着重要的角色。然而，只有通过模拟Fv域，这一假定才会被澄清。
尽管如此，这些分析仍然证实小鼠BAT可变区的VH和Vκ区是典型的小鼠可变区的代表。
表1用于克隆BAT重链可变区基因的PCR引物
  名称   序列(5’→3’)
  MHV5a(30聚体)MHV9a(30聚体)MHCG3b(21聚体)   ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTATGGATTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGC           ACAAGGGATAGACAGATGGGGC
a MHV表示与小鼠重链可变区基因的前导序列杂交的引物。
b MHCG表示与小鼠恒定区基因杂交的引物。
表2用于克隆BATκ轻链可变区基因的PCR引物
  名称   序列(5’→3’)
  MKV2a(30聚体)MKV5a(30聚体)MKV6a(30聚体)MKV11a(30聚体)MKCb(20聚体)   ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGT              TATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGCTTCA         TATGAGGTGCCCTGTTCAGTTCCTGGGGT  TT   C G  C T    AATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCACTGGATGGTGGGAAGATGG
aMKV表示与小鼠κ轻链可变区基因的前导序列杂交的引物
bMKC表示与小鼠κ轻链恒定区基因杂交的引物。
表3用于PCR筛选转化集落的引物
 名称   序列(5’→3’)
 pCRII正向引物(18聚体)pCRII反向引物(21聚体)   CTAGATGCATGCTCGAGCTACCGAGCTCGGATCCACTAG
II.本发明嵌合抗体的构建和表达
(A)缩写
使用了下列非国际标准单位的单位和其他缩写：
聚合酶链反应(PCR)；脱氧核糖核酸(DNA)；复本DNA(cDNA)；κ轻链可变区(Vκ)；重链可变区(VH)；分钟(min)；Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)；磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)；室温(RT)；牛血清白蛋白(BSA)；盐酸(HCl)；辣根过氧化物酶(HRP)；低脂牛奶(LFM)；小时(hr)；百分比(％)；邻苯二胺二盐酸(OPD)；多克隆位点(MCS)。
(B)原料
培养基成分及所有其他组织培养材料取自Life Technologies(UK)。包括AmpliTaqDNA聚合酶在内的PCR反应组分购自PerkinElmer(USA)。TA Cloning试剂盒及INVαF’感受态细胞来自Invitrogen(USA)。DH5α感受态细胞和琼脂糖(UltraPureTM)来自Life Technologies(UK)。Thermo SequenaseTM预混合循环测序试剂盒及Vistra 725DNA测序仪均购自Amersham(UK)。用于ABI Prism 310Genetic Analyzer的Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit购自PE Applied Biosystems(UK)。所有其他提到的分子生物学产品均来自New England Biolabs(USA)或Promega(USA)。Nunc-Immuno Plate MaxiSorpTM免疫板购自Life Technologies(UK)，而Corning易清洗ELISA板购自Corning Laboratory Sciences Company(UK)。山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性)抗体、山羊抗人κ轻链/HRP偶联物以及AffinPure山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性)/HRP偶联物购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.(USA)。K-Blue TMB底物和Red Stop溶液购自Neogen Inc.(USA)。所有其他用于ELISA的产品均来自Sigma(UK)。Microplate Manager数据分析软件包购自Bio-Rad(UK)。微量搅拌超滤盒和PM30过滤膜来自Amicon PLC(UK)，而Immunopure(G)IgG纯化试剂盒购自Pierce PLC(UK)。(C)实验技术
C1嵌合γ1/κBAT抗体的构建
使用特别设计的PCR引物(表1)在5’端和3’端修饰已经分离的小鼠κ轻链可变区(Vκ)基因(图1)和重链可变区(VH)基因(图2)，使得在哺乳动物细胞中BAT可变区基因表达为小鼠-人嵌合抗体的一部分。为实现这种分离，在一种特定的PCR-室中使用设计用于尽可能减少交叉污染可能的特定程序准备每个可变区基因的PCR反应。使用质粒BATVH-pCR2.1和BAT Vκ-pCR2.1作为模板并使用AmpliTaqDNA聚合酶扩增这些模板。引物B8814和B8815(表4)被用于BAT VH基因的PCR修饰，而引物C0224和C0225(表4)被用于BAT Vκ基因的PCR变异。
将PCR反应管在94℃下50秒和72℃下1分钟30秒循环加温，循环30次(在最初以94℃解链3分钟后)。在最后一个循环完成时，在72℃下实施最后的延伸步骤10分钟，然后将反应物在冰上冷却。从每个PCR反应中取5μl等份样品在1.2％的琼脂糖/TBE(pH 8.8)胶上走柱，以确定哪个反应产生了合适大小的PCR-产物。
那些适当大小的PCR产物的1-2μl等分样品被直接克隆至由TACloning试剂盒所提供的pCR2.1TM载体中，并按照制造商的指示转化至INAαF’感受态细胞中。按照Güssow和Clackson(同上)的方法使用1212和1233寡核苷酸引物(表5)对集落进行PCR筛选，从而识别含有具有适当大小插入子的质粒的集落。那些识别出的假定的阳性克隆是双链质粒DNA，使用Vistra DNA测序仪及ABI Prism 310Genetic Analyzer测定了其序列。按照制造商的说明书的描述使用Thermo SequenaseTM预混合循环测序试剂盒和Big DyeTM TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit和引物1212和1233(表5)。
将那些含有正确修改的BAT Vκ和VH基因(分别见图5和图6)的克隆作为HindIII-BamHi片段分别亚克隆至表达载体pKN110(图7)和pGID110(图8)中，以在哺乳动物细胞中表达嵌合轻链和嵌合重链。然后将连接的表达载体(即pKN110-BATVκ和pG1D110-BATVH)转化至DH5α感受态细胞中。含有正确构建的表达载体的阳性克隆最终通过限制酶切消化分析来识别。
C2嵌合γ1/κBAT抗体载体DNA共转染至COS细胞中
按照Kettleborough等人的方法将哺乳动物表达载体转染至COS细胞中。简要地说，将DNA(10μgκ轻链表达载体pKN110-BATVκ和10μg重链表达载体pG1D110-BATVH)加入到每毫升PBS含有1×107个细胞的0.70ml等分试样中，使用Bio-Red Cene Pulser仪在1900V，25μF电容下给予脉冲电流。在室温下恢复10分钟后，将经电穿孔的细胞加入8ml含有5％FCS的DMEM中并在37℃下在5％的CO2中温育72小时。温育72小时后，收集培养基，旋转以移去细胞碎片并使用ELISA分析嵌合BAT抗体的产率。
C3通过ELISA对嵌合γ1/κBAT抗体定量
首先以100μl含有0.4ng/μl的山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性)抗体的等分试样包被96孔Nunc-Immuno Plate MaxiSorpTM免疫板的每个孔，以PBS稀释并在4℃下温育过夜，并在使用前取出。然后在免疫板上加上100μl/孔等分的实验样品(即收获的COS细胞上清液—一旋转以移去细胞碎片)以及1∶2的样品稀释液(在样品酶偶联物缓冲液，即0.1M Tris-HCl(pH 7.0)、0.1M NaCl、0.02％(v/v)TWEEN-20和0.2％(w/v)BSA中稀释)。此外，作为标准物使用的并按照1∶2连续稀释的纯化的人γ1/κ抗体(1000ng/μl)也被加入到免疫板上。免疫板在37℃下温育1小时，然后以200μl/孔的洗涤缓冲液(PBS/0.1％(v/v)TWEEN-20)洗涤三次。向每个孔中加入100μl在样品-酶偶联物缓冲液中稀释5000倍的山羊抗人κ轻链/辣根过氧化物酶偶联物，然后在37℃下将免疫板温育1小时，再按照前面的内容洗涤。向每个孔中加入150μl K-Blue底物等分样品，然后免疫板在室温下在黑暗中温育10分钟。最后通过向每个孔中加入50μl Red Stop终止反应。然后使用Bio-Rad 3550微量培养板读数器结合Microplate Manager软件包确定在655nm的光密度。
C4嵌合BAT抗体的纯化
嵌合BATγ1/κ抗体从COS细胞上清液中通过两个步骤纯化。首先，按照制造商的指示使用具有PM30过滤膜的微量搅拌超滤盒，以减少未纯化的粗品上清液的体积。然后仍然按照制造商的指示使用Immunopure(G)IgG纯化试剂盒从浓缩的上清液中亲和纯化嵌合BAT抗体。
C5Daudi细胞ELISA
使用由Dr.Hardy(Felsenstein Medical Research Center，RabinMedical Center，Beilinson Campus，Petach Tikva，49100，Israel)培养自原液的Daudi细胞实施细胞ELISA分析。根据所分析的是小鼠或小鼠-人嵌合BAT抗体对分析方法进行细微的调整。在分析小鼠BAT抗体的结合亲和力时，使用山羊抗小鼠IgG(Fab特异性)/HRP偶联物(1∶15000稀释)作为第二抗体。相反地，当测量嵌合BAT抗体时，使用AffiniPure山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性)/HRP偶联物(稀释1000倍)。
将Daudi细胞(传代2天后)首先以105细胞/孔涂布在96孔的Coming易清洗ELISA板中，然后在干燥的培养箱中在37℃下温育过夜。第二天，向每个孔中加入200μl再水合缓冲液(含有10％FCS和0.05％叠氮化物的PBS)，然后静置至少1小时。滗去再水合缓冲液，向培养板的每个孔中加入不同的1∶2连续稀释的纯化BAT抗体的50μl等分样品。再一次在4℃下温育培养板过夜，以含有5％LFM的PBS以200μl/孔洗涤两次，使干。此后向每孔加入50μl HRP偶联的第二抗体，实施一连串的区别性六种洗涤(即一次以含有5％LFM的PBS洗涤，三次以加入0.05％TWEEN-20的同样的缓冲液洗涤，还有两次以PBS/LFM缓冲液洗涤)。向每孔加入溶于0.05M柠檬酸缓冲液(pH5.0)的0.4mg/ml OPD底物和60mg/ml过氧化氢200μl，在室温下在黑暗中温育ELISA板直至出现颜色(通常约30分钟)。最后，向每孔中加入50μl 2.5M的硫酸以终止反应，然后使用Bio-Rad 3550微量培养板读数器结合Microplate Manager软件包确定在490nm的光密度。
结果
实施例4嵌合γ1/κBAT抗体的构建
如同所有项目，本实施例遵守了严格的PCR克隆和测序程序。这样做是为尽可能减少在PCR修饰步骤中向小鼠可变区基因野生型序列中引入错误的可能性。使用引物C0224和C0225(表1)通过PCR修饰小鼠BAT Vκ基因(图2)产生一条418bp的带(未列数据)。这一PCR产物被连接到pCR2.1质粒并转化到INVαF’感受态细胞中。类似地，使用引物B8814和B8815(表1)使小鼠BAT VH基因(图1)PCR突变产生一条436bp的带(未列数据)。这一PCR产物也被连接到pCR2.1质粒并转化至INVαF’感受态细胞中。
然后使用PCR筛选分析(未列数据)检测推定的阳性转化体，最后在ABI Prism 310Genetic Analyzer上进行双链DNA测序。图3和图4分别表示该嵌合BAT Vκ基因和BAT VH基因的DNA序列分析结果。该分析的实施既是为了确认其成功的诱变也是为了表明可能被引入基因中的任何PCR错误的存在。针对每种可变区基因只有一种PCR反应实际发生并且只有来自每种PCR反应的两个克隆最终是完成整的DNA序列。
尽管如此，这仍足以从每种含有正确修饰的DNA序列的经修饰的可变区基因中分离出至少一种克隆。
突变的VH和Vκ基因然后作为hindIII/BamHI片段被亚克隆至适当的表达载体中以分别产生pKN110-BATVκ(7.88kb)和pG1D110-BATVH(7.55kb)。所构建的表达载体的保真性然后通过限制性酶切分析被证实(未列数据)。一旦共转染至COS细胞，这些载体会允许γ1/κ型的嵌合BAT抗体的瞬间表达。
此外，作为BAT抗体人源化项目的一种特殊成分，BAT VH基因还作为HindIII/BamHI片段被亚克隆至pG3D110和pG4D1100重链表达载体中。除了以3γ恒定区基因(在pG3D110的情况下)的cDNA拷贝或γ3恒定区基因(在pG3D110的情况下)的cDNA或γ4恒定区基因(在pG3D110的情况下)的cDNA替换γ1人恒定区基因的cDNA拷贝外，这些载体与pG1D110是一致的。这些载体的构建(即pG3D110-BATVκ)的目的是为了γ3/κ和γ4/κ型嵌合BAT抗体在COS细胞中表达。
实施例5嵌合γ1/κBAT抗体的瞬间表达
在一系列重复的瞬时表达实验中，载体pKN110-BATVκ和pG1D110-BATVH被共转染至COS细胞。在表达72小时后，通过γ1/κELISA在COS细胞共转染的上清液中检测到小鼠-人γ1/κ嵌合BAT抗体。根据这些分析，在培养基中所检测到的γ1/κ嵌合BAT抗体的平均浓度的计算值为509±272ng/ml。
有趣的是，γ3/κ和γ4/κ型嵌合BAT抗体在COS细胞中表达后，看来似乎产生更大量的抗体。特别是，当pG3D110-BATVH和pKN110BATVκ共转染至COS细胞，对上清液的初步分析(使用4.3节所描述的ELISA方法并使用IgG3/κ抗体作为标准物)测量出嵌合γ3/κBAT抗体的表达水平是6.7μg/ml。而且，当pG4D110-BATVH和pKN110-BATVκ得以在COS细胞中表达时，使用同样的ELISA(使用人IgG4/κ抗体作为标准物)测量出嵌合γ4/κBAT抗体的表达水平是8.2μg/ml。
实施例6嵌合γ1/κBAT抗体的纯化
在每次共转染中约收获8ml，实施一系列共转染直至收获200mlCOS上清液。然后使这一上清液的体积通过一个具有PM30过滤膜(其截取分子量为30kDa)的微量搅拌超滤盒而浓缩至15ml。
Immunopure(G)IgG纯化试剂盒的主要组成部分包括一个2ml的固定G蛋白柱。使用6ml洗脱缓冲液将抗体从柱上洗脱下来，以1ml级分为单位收集洗脱物。然后使用C3节中所描述的ELISA方法分析每一级分中的嵌合γ1/κBAT抗体的浓度。这一分析发现，级分3(42.05μg/ml)和级分4(20.05μg/ml)中有嵌合抗体，相当于共回收了62.1μg的嵌合γ1/κBAT抗体。将其在-20℃下保存，直至再转移至Curetech进行进一步分析。
实施例7对结合了嵌合γ1/κBAT抗体的Daudi细胞的分析
使用Daudi细胞ELISA，清晰地表明纯化的嵌合γ1/κBAT抗体与Daudi细胞结合。图9表示一个实验的典型例子。然而，不太确定的是，按照同样的ELISA，与类似浓度的小鼠BAT抗体的结合似乎比嵌合抗体更低。尽管如此，由于用于检测与Daudi细胞结合的抗体的偶联型第二抗体对于每种抗体构建体是不同的，不能合理地对两种类型的结合进行直接对比。
表4用于对小鼠BAT抗体κ轻链和重链的可变区基因进行PCR修饰，以使得其在哺乳动物细胞中表达为嵌合γ1/κBAT抗体的一部分的引物
 名称   序列(5’→3’)
 C0225(42聚体)C0224(39聚体)B8815(40聚体)B8814(42聚体)   CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCCGCGGATCCACTCACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGGGATCCACTCACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGAAGCTTGCCGCCACCATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTC
表5用于PCR筛选已转化的集落以及BAT抗体经PCR修饰的可变区基因的DNA序列的引物
  名称   序列(5’→3’)
  Huγ1(17聚体)HCMVi.3s(28聚体)FOR(18聚体)REV(18聚体)B6990(27聚体)B6991(27聚体)B8809(18聚体)B8810(18聚体)   TTGGAGGAGGGTGCCAGGTCACCGTCCTTGACACGCGTCTCGGGATGTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGCTATGACCATGCAGCATATGTTGACTCTCCACTGTCGGGTCAACATATGCTGAAGAGTTCAAGGGTGCCAGGTCAAGTGTAAGAAGCCAGGTTGGATGTCC
IV取自与本发明的单克隆抗体结合的Daudi B细胞类淋巴母细胞系抗原的3个肽的氨基酸序列
测定包含在与本发明的单克隆抗体相结合的Daudi B类淋巴母细胞的抗原决定簇中的肽的序列。其序列分别在图10、11和12中描述。
当使用TBLASTN算式(第二版)，期望值(EXPECT Value)为10以及BLASUM62矩阵，将三条肽链作为查询对象时，检索非冗余基因数据库以及EST Division，没有发现吻合。
然而，由于该肽链是小肽链，还以更高的期望值以降低检索条件的严格度对它们重新进行了检索。筛选程序还被揭示出具有低复杂性，其可从blast报告中消除潜在的混淆匹配(例如，针对富脯氨酸区或proly-A尾部的吻合)，而保留了其blast统计数据反映其成对对比的特异性的区域。即使在一个非常低严格度的标准下，本发明的三条肽链仍然没有与基因库和EST片段发生任何吻合。
因此，根据上述结果，上述三条肽链应是新肽链。
IV使用本发明的单克隆抗体诊断个体的恶性疾病
使用抗-CD3抗体以及本发明的一种单克隆抗体对取自被检查个体的外周血淋巴细胞进行双重标记。确定与本发明的单克隆抗体结合的CD3+细胞的百分比。根据本发明，已经表明在患恶性疾病的个体中的CD3+mAb+细胞数量与取自健康个体的血液样品中的这些细胞的百分比不同。与取自健康个体的CD3+mAb+细胞百分比相比，患恶性疾病的个体中的CD3+细胞百分比有显著差异以及比其更高或更低的事实，能够确定一个个体是否很可能患有恶性疾病，同时也能够确定被检查个体可能患有的特定种类的恶性疾病。
典型地，使用Ficoll Hypaque密度离心法从取自健康个体或癌症患者的20ml血液中获取外周血淋巴细胞。洗涤细胞并在含有0.5％BSA和0.05％as acid的PBS中悬浮。使用含有0.5×106个细胞的样品进行FACS分析。首先，细胞和饱和量的本发明的单克隆抗体在0℃下温育45分钟，它们和与FITC偶联的抗小鼠单克隆抗体在冰上温育30分钟。洗涤两次，在1200rpm下离心，之后，细胞和与PE抗体偶联的抗人CD3抗体在冰上温育30分钟。温育后，洗涤细胞两次，使用FACS扫描(Bectan Dickinson)分析样品。结果在图13至17中表示。
正如在图13及图17中所能看到的，取自健康个体血液样品的CD3+BAT+细胞(与CD3+细胞总量对比)的百分比在25％的范围内。如在图14所见，取自结肠癌病人的血液样品中的CD3+BAT+细胞百分比与健康个体相比明显偏低，在大约7％的范围。类似地，取自乳腺癌病人的血液样品的CD3+BAT+细胞的百分比在大约10％的范围(图15)。这些结果清楚地表明，可以通过CD3+BAT+细胞百分比与健康个体对比偏低的事实识别结肠癌和乳腺癌。
如在图16中所见，取自前列腺癌病人的血液样品的CD3+BAT+细胞百分比在大约50％的范围内，明显高于取自健康个体血样中的百分比。这些事实清楚地表明，可以通过CD3+BAT+细胞百分比与健康个体相比偏高的事实识别前列腺癌。如图18所见，在取自前列腺癌病人T细胞中所发现的与本发明的单克隆抗体相结合的抗原数量非常高，而在取自乳腺癌病人的T细胞中检测不到所述抗原。
上述结果表明本发明的单克隆抗体可以用于识别患有特定种类的恶性疾病的个体。因此，如果血液样品取自被检查个体并且本发明的单克隆抗体与样品中的CD3+细胞的结合程度很高(在大约50％的范围)，则被检查的个体极有可能患前列腺癌。与此相反，如果样品中CD3+细胞的百分比与健康个体相比明显很低(在大约7％或10％的范围)，则被检查个体很可能患乳腺癌或结肠癌。很明显地，如果被检查个体是男性，那么他很可能患结肠癌。
上述实施例不应被解释为限制，与本发明的单克隆抗体相结合的CD3+细胞百分比和其他恶性疾病之间的其他关联也在本发明的保护范围之内。
                               序列表
<110>莫尔研究应用有限公司(MOR-RESEARCH APPLICATIONS LTD.)
<120>单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗(MONOCLONAL ANTIBODIES，ANTIGENS ANDDIAGNOSIS AND THERAPY OF MALIGNANT DISEASES.)
<130>SCT011318-09
<140>PCT/IL99/00518
<141>1999-09-30
<150>IL129299
<151>1999-03-31
<160>26
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>462
<212>DNA
<213>人类
<220>
<400>1
tactagtcga catggcttgg gtgtggacct tgctattcct gatggcagct gcccaaagta 60
tccaagcaca gatccagttg gtgcagtctg gacctgagtt gaagaagcct ggagagacag 120
tcaagatctc ctgcaaggct tctggatata ctttcacaaa ctatggaatg aactgggtga 180
agcaggctcc aggaaagggt ttaaagtgga tgggctggat aaacaccgac agtggagagt 240
caacatatgc tgaagagttc aagggacggt ttgccttctc tttggaaacc tctgccaaca 300
ctgcctattt gcagatcaac aacctcaaca atgaggacac gcctacatat ttctgtgtga 360
gagtcggcta cgatgctttg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctcaa 420
ctacaacaac agccccatct gtctatccct tcccgggttc ca                    462
<210>2
<211>443
<212>DNA
<213>人类
<220>
<400>2
actagtcgac atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt    60
cataatgtcc agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc    120
aggggagaag gtcaccataa cctgcagtgc caggtcaagt gtaagttaca tgcactggtt    180
ccagcagaag ccaggcactt ctcccaaact ctggatttat aggacatcca acctggcttc    240
tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttactgtc tcacaatcag    300
ccgaatggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccag caaaggagta gtttcccact    360
cacgttcggc tcggggacaa agttggaaat aaaacgggct gatgctgcac caactgtatc    420
catcttccca ccatccaaga tct                                            443
<210>3
<211>412
<212>DNA
<213>人类
<220>
<400>3
aagcttgccg ccaccatgga tttacaggtg cagattatca gcttcctgct aatcagtgcc    60
tcagtcataa tgtccagagg acaaattgtt ctcacccagt ctccagcaat catgtctgca    120
tctccagggg agaaggtcac cataacctgc agtgccaggt caagtgtaag ttacatgcac    180
tggttccagc agaagccagg cacttctccc aaactctgga tttataggac atccaacctg    240
gcttctggag tccctgctcg cttcagtggc agtggatctg ggacctctta ctgtctcaca    300
atcagccgaa tggaggctga agatgctgcc acttattact gccagcaaag gagtagtttc    360
ccactcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaac gtgagtggat cc            412
<210>4
<211>436
<212>DNA
<213>人类
<220>
<400>4
aagcttgccg ccaccatggc ttgggtgtgg accttgctat tcctgatggc agctgcccaa    60
agtatccaag cacagatcca gttggtgcag tctggacctg agttgaagaa gcctggagag    120
acagtcaaga tctcctgcaa ggcttctgga tatactttca caaactatgg aatgaactgg    180
gtgaagcagg ctccaggaaa gggtttaaag tggatgggct ggataaacac cgacagtgga    240
gagtcaacat atgctgaaga gttcaaggga cggtttgcct tctctttgga aacctctgcc    300
aacactgcct atttgcagat caacaacctc aacaatgagg acacggctac atatttctgt    360
gtgagagtcg gctacgatgc tttggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc    420
tcaggtgagt ggatcc                                                    436
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>5
caagggatag acagatgggg c                                                21
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人类
<400>6
atggactcca ggctcaattt agttttcctt                                       30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人类
<400>7
atggmttggg tgtggamctt gctattcctg                                       30
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>8
actggatggt gggaagatgg                                                  20
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人类
<400>9
atggaagccc cagctcagct tctcttcc                                         28
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人类
<400>10
atggagwcag acacactcct gytatgggtg                                       30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人类
<400>11
atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc                                       30
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人类
<400>12
atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg                                          27
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>13
ctagatgcat gctcgagc                                                    18
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>14
taccgagctc ggatccacta g                                                21
<210>15
<211>42
<212>DNA
<213>人类
<400>15
aagcttgccg ccaccatggc ttgggtgtgg accttgctat tc                         42
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>人类
<400>16
ggatccactc acctgaggag acggtgactg aggttccttg                            40
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>人类
<400>17
cgcggatcca ctcacgtttt atttccaact ttgtccccg                             39
<210>18
<211>42
<212>DNA
<213>人类
<400>18
cccaagcttg ccgccaccat ggattttcag gtgcagatta tc                         42
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>人类
<400>19
cagcatatgt tgactctcca ctgtcgg                                          27
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人类
<400>20
gtcaacatat gctgaagagt tcaaggg                                          27
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>21
tgccaggtca agtgtaag                                                    18
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>22
aagccaggtt ggatgtcc                                                    18
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>23
tgtaaaacga cggccagt                                                    18
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人类
<400>24
gtcaccgtcc ttgacacgcg tctcggga                                         28
<210>25
<211>17
<212>DNA
<213>人类
<400>25
ttggaggagg gtgccag                                                     17
<210>26
<211>18
<212>DNA
<213>人类
<400>26
gaaacagcta tgaccatg                                                    18
1
1

Claims (23)

1.一种具有重链可变区和κ轻链可变区的单克隆抗体，其中重链可变区和κ轻链可变区含有的互补决定区分别与图1和图2所示氨基酸序列的互补决定区相同。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中重链可变区具有图1的氨基酸序列。
3.权利要求1的单克隆抗体，其中κ轻链可变区具有图2的氨基酸序列。
4.权利要求1的单克隆抗体，其中重链可变区具有图1的氨基酸序列，κ轻链可变区具有图2的氨基酸序列。
5.权利要求1的抗体，是一种嵌合人-小鼠抗体。
6.一种核酸序列，编码权利要求1的单克隆抗体的氨基酸序列。
7.一种表达载体，具有权利要求6的核酸序列。
8.权利要求7的表达载体，其为pKN110质粒。
9.权利要求7的表达载体，其为pG1D110质粒。
10.一种细胞，其是用权利要求7-9所述的表达载体中的任何一种转染的。
11.权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体在制备用于在包含外周血单核细胞(PBMC)的体液样品中诊断恶性疾病的诊断用组合物中的应用，包括：
(a)使体液样品与所述单克隆抗体接触；
(b)确定所述单克隆抗体与所述体液样品中的T细胞的结合程度；以及
(c)将(b)中所述的程度和所述单克隆抗体与标准样品中的T细胞的结合程度进行比较，上述两种结合程度间存在显著差异表示所述体液样品来自很可能患有恶性疾病的个体。
12.权利要求11的应用，其中在实施(a)步骤之前从体液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后将所述分离的PBMC在步骤(a)中与所述单克隆抗体接触。
13.权利要求11的应用，其中所述的体液是血液。
14.权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体在制备用于在包含T细胞的体液样品中诊断很可能患有特定恶性疾病的诊断用组合物中的应用，包括：
(a)将该体液样品与所述单克隆抗体接触；
(b)确定该单克隆抗体与所述体液样品中的T细胞的结合程度；以及
(c)将(b)中所述的程度和所述单克隆抗体与取自标准样品的T细胞的结合程度进行比较，结合程度间存在显著差异在很大概率上表明所述体液样品来自患有恶性疾病的测试个体，其中与所述体液样品的T细胞的结合程度高于或低于所述单克隆抗体与标准样品的T细胞的结合水平，表示特定类型的恶性疾病。
15.权利要求14的应用，其中所述特定恶性疾病是前列腺癌。
16.权利要求14的应用，其中所述恶性疾病是乳腺癌。
17.权利要求14的应用，其中所述恶性疾病是结肠癌。
18.权利要求1-4任一项的单克隆抗体在制备用于治疗癌症的药物组合物中的应用。
19.权利要求18的应用，其中所述癌症是实体肿瘤。
20.权利要求19的应用，其中所述实体肿瘤是前列腺癌。
21.权利要求19的应用，其中所述实体肿瘤是乳腺癌。
22.权利要求19的应用，其中所述实体肿瘤是结肠癌。
23.一种试剂盒，包括权利要求1-4的单克隆抗体中的一种或多种、一种针对该单克隆抗体的特异性结合性配偶体的偶联物、一种能够产生可检测信号的标记物以及使用指南。
CNB998165425A 1999-03-31 1999-09-30 单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗 Expired - Fee Related CN1267452C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL12929999A IL129299A0 (en) 1999-03-31 1999-03-31 Monoclonal antibodies antigens and diagnosis of malignant diseases
IL129299 1999-03-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1346371A CN1346371A (zh) 2002-04-24
CN1267452C true CN1267452C (zh) 2006-08-02

Family

ID=11072675

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998165425A Expired - Fee Related CN1267452C (zh) 1999-03-31 1999-09-30 单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20030026800A1 (zh)
EP (1) EP1165616B1 (zh)
JP (1) JP2003500015A (zh)
KR (1) KR20020008140A (zh)
CN (1) CN1267452C (zh)
AT (1) ATE283289T1 (zh)
AU (1) AU776464C (zh)
BR (1) BR9917218A (zh)
CA (1) CA2367901C (zh)
DE (1) DE69922261T2 (zh)
HU (1) HUP0200537A2 (zh)
IL (3) IL129299A0 (zh)
NZ (1) NZ513498A (zh)
RU (1) RU2235131C2 (zh)
WO (1) WO2000058363A1 (zh)
ZA (1) ZA200106809B (zh)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1225233A3 (en) * 2001-01-23 2003-01-08 Amsterdam Support Diagnostics B.V. Means and methods for treatment evaluation
IL145926A0 (en) * 2001-10-15 2002-07-25 Mor Research Applic Ltd Peptide epitopes of mimotopes useful in immunomodulation
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
US20090123413A1 (en) * 2004-08-23 2009-05-14 Britta Hardy Use of bat monoclonal antibody for immunotherapy
DK2044120T3 (da) * 2006-06-07 2019-04-15 Bioalliance Cv Antistoffer, der genkender en kulhydratholdig epitop på cd-43 og cea eksprimeret på cancerceller, og fremgangsmåder til anvendelse deraf
BR122017025062B8 (pt) 2007-06-18 2021-07-27 Merck Sharp & Dohme anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo para o receptor de morte programada humano pd-1, polinucleotídeo e composição compreendendo o referido anticorpo ou fragmento
ES2639857T3 (es) 2008-02-11 2017-10-30 Cure Tech Ltd. Anticuerpos monoclonales para el tratamiento del tumor
DK2734205T3 (en) 2011-07-21 2018-06-14 Tolero Pharmaceuticals Inc Heterocyclic Protein Kinase Inhibitors
BR112013032552A2 (pt) 2011-07-24 2017-12-12 Curetech Ltd variantes de anticorpos monoclonais humanizados imunomoduladores
WO2013082249A2 (en) * 2011-11-29 2013-06-06 Genentech, Inc. Compositions and methods for prostate cancer analysis
US10570204B2 (en) 2013-09-26 2020-02-25 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Methods for treating hematologic cancers
US9580504B1 (en) 2013-11-07 2017-02-28 Curetech Ltd. Pidilizumab monoclonal antibody therapy following stem cell transplantation
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
BR112017004826A2 (pt) 2014-09-13 2017-12-12 Novartis Ag terapias de combinação de inibidores de alk
MX2018002315A (es) 2015-09-01 2018-04-11 Agenus Inc Anticuerpos anti muerte programada 1 (pd 1) y metodos de uso de los mismos.
MA44236A (fr) 2016-02-17 2018-12-26 Novartis Ag Anticorps anti-tgfbêta 2
AU2017283480A1 (en) 2016-06-13 2019-01-24 Torque Therapeutics, Inc. Methods and compositions for promoting immune cell function
US11279694B2 (en) 2016-11-18 2022-03-22 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
PE20190921A1 (es) 2016-12-07 2019-06-26 Agenus Inc Anticuerpos y metodos de su utilizacion
US20200237874A1 (en) 2017-01-20 2020-07-30 Novartis Ag Combination therapy for the treatment of cancer
AU2018217963B2 (en) 2017-02-10 2020-11-19 Novartis Ag 1-(4-amino-5-bromo-6-(1 H-pyrazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)-1 H-pyrazol-4-ol and use thereof in the treatment of cancer
AR111760A1 (es) 2017-05-19 2019-08-14 Novartis Ag Compuestos y composiciones para el tratamiento de tumores sólidos mediante administración intratumoral
JOP20190279A1 (ar) 2017-05-31 2019-11-28 Novartis Ag الصور البلورية من 5-برومو -2، 6-داي (1h-بيرازول -1-يل) بيريميدين -4- أمين وأملاح جديدة
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
EA202090104A1 (ru) 2017-06-22 2020-04-09 Новартис Аг Молекулы антител к cd73 и пути их применения
US20200172628A1 (en) 2017-06-22 2020-06-04 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019006007A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag POSOLOGICAL REGIMES FOR ANTI-TIM3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
AU2018302283A1 (en) 2017-07-20 2020-02-06 Novartis Ag Dosage regimens of anti-LAG-3 antibodies and uses thereof
WO2019055579A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Tolero Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR
EP3700933A1 (en) 2017-10-25 2020-09-02 Novartis AG Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
US20200277378A1 (en) 2017-11-16 2020-09-03 Novartis Ag Combination therapies
WO2019108900A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
US20200368268A1 (en) 2018-01-08 2020-11-26 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20200399383A1 (en) 2018-02-13 2020-12-24 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
UY38247A (es) 2018-05-30 2019-12-31 Novartis Ag Anticuerpos frente a entpd2, terapias de combinación y métodos de uso de los anticuerpos y las terapias de combinación
US20210214459A1 (en) 2018-05-31 2021-07-15 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
SG11202010579XA (en) 2018-06-01 2020-12-30 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
WO2020044252A1 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Dosage regimes for anti-m-csf antibodies and uses thereof
WO2020049534A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Novartis Ag Sting agonist and combination therapy thereof for the treatment of cancer
CN112867803A (zh) 2018-10-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 单独的或与免疫标志物组合的肿瘤突变负荷作为生物标志物用于预测对靶向疗法的应答
WO2020117988A1 (en) 2018-12-04 2020-06-11 Tolero Pharmaceuticals, Inc. Cdk9 inhibitors and polymorphs thereof for use as agents for treatment of cancer
JP2022520361A (ja) 2019-02-12 2022-03-30 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド 複素環式タンパク質キナーゼ阻害剤を含む製剤
US20220160706A1 (en) 2019-02-12 2022-05-26 Novartis Ag Pharmaceutical combination comprising tno155 and a pd-1 inhibitor
WO2020191326A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Treatment of acute myeloid leukemia (aml) with venetoclax failure
MX2021011289A (es) 2019-03-22 2021-11-03 Sumitomo Pharma Oncology Inc Composiciones que comprenden moduladores de isoenzima m2 muscular de piruvato cinasa pkm2 y metodos de tratamiento que usan las mismas.
CA3145864A1 (en) 2019-07-03 2021-01-07 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Tyrosine kinase non-receptor 1 (tnk1) inhibitors and uses thereof
TW202124446A (zh) 2019-09-18 2021-07-01 瑞士商諾華公司 與ｅｎｔｐｄ２抗體之組合療法
EP4031578A1 (en) 2019-09-18 2022-07-27 Novartis AG Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies
KR20220087498A (ko) 2019-10-21 2022-06-24 노파르티스 아게 Tim-3 억제제 및 그의 용도
MX2022004766A (es) 2019-10-21 2022-05-16 Novartis Ag Terapias combinadas con venetoclax e inhibidores de tim-3.
JP2023502264A (ja) 2019-11-22 2023-01-23 スミトモ ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド 固体用量医薬組成物
CN115175937A (zh) 2019-12-20 2022-10-11 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓纤维化和骨髓增生异常综合征的抗TIM-3抗体MBG453和抗TGF-β抗体NIS793与或不与地西他滨或抗PD-1抗体斯巴达珠单抗的组合
US20230058489A1 (en) 2020-01-17 2023-02-23 Novartis Ag Combination comprising a tim-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
JP2023516155A (ja) 2020-02-28 2023-04-18 ノバルティス アーゲー ダブラフェニブ、ｅｒｋ阻害剤及びｒａｆ阻害剤又はｐｄ－１阻害剤を含む三重の医薬品の組合せ
US20230172920A1 (en) 2020-04-21 2023-06-08 Novartis Ag Dosing regimen for treating a disease modulated by csf-1r
WO2022009157A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Novartis Ag Lhc165 and spartalizumab combinations for treating solid tumors
US20230321285A1 (en) 2020-08-31 2023-10-12 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
EP4204020A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
WO2022097060A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
TW202237119A (zh) 2020-12-10 2022-10-01 美商住友製藥腫瘤公司 Ａｌｋ﹘５抑制劑和彼之用途
CN116635064A (zh) 2020-12-18 2023-08-22 世纪治疗股份有限公司 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统
JP2024505049A (ja) 2021-01-29 2024-02-02 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ７３及び抗ｅｎｔｐｄ２抗体のための投与方式並びにその使用
WO2022165260A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AU2022257621A1 (en) 2021-04-13 2023-11-23 Nuvalent, Inc. Amino-substituted heterocycles for treating cancers with egfr mutations
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5001225A (en) * 1986-12-08 1991-03-19 Georgetown University Monoclonal antibodies to a pan-malarial antigen
US5576184A (en) * 1988-09-06 1996-11-19 Xoma Corporation Production of chimeric mouse-human antibodies with specificity to human tumor antigens
US5571894A (en) * 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
IL108501A (en) * 1994-01-31 1998-10-30 Mor Research Applic Ltd Antibodies and pharmaceutical compositions containing them
US5897882A (en) * 1996-04-12 1999-04-27 Gonzalez; Juan Glass repair system
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
JP3886238B2 (ja) * 1997-02-12 2007-02-28 中外製薬株式会社 リンパ球系腫瘍の治療剤
JPH1142087A (ja) * 1997-07-29 1999-02-16 Sumitomo Electric Ind Ltd 抗ヒトプレｂ細胞レセプター抗体およびその活性フラグメントならびにヒトプロｂ細胞の検出方法
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP

Also Published As

Publication number Publication date
US20060099209A1 (en) 2006-05-11
CA2367901C (en) 2013-03-19
AU776464C (en) 2005-05-12
HUP0200537A2 (en) 2002-06-29
CN1346371A (zh) 2002-04-24
DE69922261D1 (de) 2004-12-30
IL129299A0 (en) 2000-02-17
IL145535A (en) 2008-06-05
EP1165616A1 (en) 2002-01-02
DE69922261T2 (de) 2005-12-01
ATE283289T1 (de) 2004-12-15
AU5996599A (en) 2000-10-16
CA2367901A1 (en) 2000-10-05
ZA200106809B (en) 2002-08-19
NZ513498A (en) 2004-01-30
US7695715B2 (en) 2010-04-13
IL145535A0 (en) 2002-06-30
KR20020008140A (ko) 2002-01-29
US20030026800A1 (en) 2003-02-06
AU776464B2 (en) 2004-09-09
EP1165616B1 (en) 2004-11-24
BR9917218A (pt) 2001-12-26
WO2000058363A1 (en) 2000-10-05
JP2003500015A (ja) 2003-01-07
RU2235131C2 (ru) 2004-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1267452C (zh) 单克隆抗体、抗原和恶性疾病的诊断和治疗
CN1187374C (zh) 人源化的特异于人4－1bb的抗体和含有它的药物组合物
CN1317303C (zh) 抗人腱生蛋白单克隆抗体
CN1606453A (zh) Cripto阻断抗体及其用途
CN1142855A (zh) 人源化抗体及其用途
CN1222162A (zh) 突变的无激活作用的IgG2结构域和插入该结构域的抗CD3抗体
CN1186518A (zh) 人血管内皮生长因子2
CN1105728C (zh) 用于治疗il4介导疾病的重组il4抗体
CN1200737A (zh) 用于人治疗的重组抗cd4抗体
CN1277614A (zh) 乳房珠蛋白,一种乳房特异性乳腺癌分泌蛋白
CN101035809A (zh) 抗tag－72的人源化单克隆抗体
CN1422333A (zh) 诱导细胞凋亡的多肽
CN1074458C (zh) 对细胞周期非依赖的神经胶质瘤表面抗原特异的人单克隆抗体
CN1606569A (zh) 具有mn结合和细胞粘附中和活性的人类抗体
CN1590409A (zh) 针对sars冠状病毒n蛋白抗原的抗体及其在sars冠状病毒或者其抗原检测中的用途
CN1221428A (zh) Pigr生物大分子特征性高级结构和相关配体的细胞内化作用
CN1919871A (zh) 用于治疗B淋巴细胞白血病、淋巴瘤的B7.1－CD19scFv融合基因工程蛋白及其用途
CN1703240A (zh) LFA－1α亚基抗体及使用方法
CN1590407A (zh) 多功能性造血受体激动剂
CN1210308C (zh) 人源化抗her2单克隆抗体及其制法和药物组合物
CN1189483C (zh) 人源化抗cd3单克隆抗体
CN1079400A (zh) 抗肿瘤方法和抗肿瘤剂
CN1230446C (zh) 识别抗原ior c2的抗体和fv片段
CN1842541A (zh) 调节nk细胞活性的组合物和方法
CN1310758A (zh) 基因克隆的新方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20060802

Termination date: 20180930