CN114634570A - 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，其特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且所述第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。

Description

包含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
本申请是申请日为2015年11月13日、中国申请号为201580073211.0、发明名称为“包含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及新的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a) 至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中所述抗原结合分子的特征在于，所述第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且所述第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。本发明进一步涉及产生这些分子的方法和使用它们的方法。
发明背景
与TNF(肿瘤坏死因子)受体超家族分子相互作用的配体在免疫系统的组织和功能中具有关键作用。在调节正常功能如免疫应答、造血和形态发生的同时，TNF家族配体(也称为细胞因子)在肿瘤发生、移植排斥、脓毒性休克、病毒复制、骨吸收、类风湿性关节炎和糖尿病中起作用(Aggarwal，2003)。 TNF配体家族包括编码19个II型(即细胞内N末端和细胞外C末端)跨膜蛋白的 18个基因，其特征在于构成“TNF同源结构域”(THD)的保守C末端结构域的存在。这个结构域负责受体结合，因此对TNF配体家族成员的生物活性至关重要。家族成员之间的序列同一性约为20％-30％(Bodmer，2002)。TNF配体家族的成员以自组装非共价三聚体的形式而发挥其生物学功能(Banner等人， Cell 1993,73,431-445)。因此，TNF家族配体形成能够结合并激活TNFR超家族的相应受体的三聚体。
TNF受体超家族成员4-1BB(CD137)首先被鉴定为其表达经由T细胞活化诱导的分子(Kwon和Weissman，1989)。随后的研究证实4-1BB在T和B淋巴细胞(Snell等人，2011；Zhang等人，2010)、NK细胞(Lin等人，2008)、NKT- 细胞(Kim等人)、单核细胞(Kienzle和vonKempis，2000；Schwarz等人，1995)、嗜中性粒细胞(Heinisch等人，2000)、肥大细胞(Nishimoto等人，2005)和树突细胞以及非造血来源的细胞如内皮细胞和平滑肌细胞(Broll等人，2001； Olofsson等人，2008)中表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多可由各种刺激信号诱导和驱动，例如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发，以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号转导(Diehl等人，2002；von Kempis等人，1997；Zhang等人，2010)。
4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)的表达受到更多限制，在专职抗原呈递细胞(APC)如B细胞、树突细胞(DC)和巨噬细胞上观察到表达。4-1BBL的诱导表达对于包括αβ和γδT细胞亚群在内的T细胞以及内皮细胞是特征性的 (Shao和Schwarz综述，2011)。
已知CD137信号转导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele等人， 2012；Lin等人，2008；Melero等人，1998)以及促进DC活化(表现为其存活和分泌细胞因子的能力增加)，并上调共刺激分子(Choi等人，2009；Futagawa 等人，2002；Wilcox等人，2002)。然而，CD137最好被表征为调节T细胞的 CD4+和CD8+亚群的TCR诱导性活化的共刺激分子。与TCR触发联合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞的增殖，刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(Snell等人综述，2011)。
与4-1BB抗体对体外T细胞的这些共刺激效应一致，在许多实验性肿瘤模型中将其施用于荷瘤小鼠导致有效的抗肿瘤作用(Melero等人，1997； Narazaki等人，2010)。然而，4-1BB通常仅在与其他免疫调节化合物(Curran 等人，2011；Guo等人，2013；Morales-Kastresana等人，2013；Teng等人， 2009年；Wei等人，2013)、化疗药物(Ju等人，2008；Kim等人，2009)、肿瘤特异性疫苗接种(Cuadros等人，2005；Lee等人，2011)、或放射治疗(Shi和Siemann，2006)联合给予时才显示其作为抗肿瘤剂的效力。体内消耗实验证明，CD8+T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤作用中起最关键的作用。然而，取决于肿瘤模型或包括抗4-1BB的联合疗法，已经报道了其他类型的细胞如 DC、NK细胞或CD4+T细胞的作用(Melero等人1997；Murillo等人；2009； Narazaki等人，2010；Stagg等人，2011)。
除了4-1BB激动剂对不同淋巴细胞亚群的直接作用之外，通过4-1BB介导的细胞间粘附分子1(ICAM1)和肿瘤血管内皮上的血管细胞粘附分子 1(VCAM1)的上调，4-1BB激动剂还可以诱导肿瘤中活化T细胞的浸润和保留 (Palazon等人，2011)。
4-1BB触发还可以逆转由暴露于可溶性抗原诱导的T细胞无反应性的状态，其可能有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫耐受性(Wilcox 等人，2004)。
似乎4-1BB激动性抗体在体内的免疫调节特性需要在抗体分子上野生型 Fc部分的存在，从而提示Fc-受体结合为此类试剂的药理学活性所需的重要事件，所述试剂被描述为对TNFR超家族的其他的细胞凋亡诱导或免疫调节成员特异的激动性抗体(Li和Ravetch，2011；Teng等人，2009)。然而，在小鼠中，具有功能活性Fc结构域的4-1BB特异性激动性抗体的全身给药也诱导了与肝毒性相关的CD8+T细胞扩增(Dubrot等人，2010)，在不存在功能性Fc 受体的情况下，肝毒性减弱或显著减轻。在人类临床试验(ClinicalTrials.gov,NCT00309023)中，每三周施用一次的有Fc活性的4-1BB激动性抗体 (BMS-663513)持续12周诱导了黑素瘤、卵巢癌或肾细胞癌患者的病情稳定。然而，在另一项试验(NCT00612664)中给予的相同抗体引起4级肝炎，导致试验终止(Simeone和Ascierto，2012)。
总的来说，可用的临床前和临床数据清楚地表明，有效的4-1BB激动剂的临床需求很高。然而，新一代候选药物不仅会有效地使4-1BB接合在造血细胞和内皮细胞的表面上，而且还能通过除了与Fc受体结合之外的机制来实现这种接合，以避免不可控制的副作用。后者可以通过对肿瘤特异性或肿瘤相关模块的优先结合和寡聚化来实现。
已经制造了由4-1BB配体的一个细胞外域和单链抗体片段(Mueller等人， 2008；Hornig等人，2012)或与重链C末端(Zhang等，2007)融合的单个4-1BB 配体组成的融合蛋白。WO 2010/010051公开了由彼此连接并与抗体模块融合的三个TNF配体胞外域组成的融合蛋白的产生。
然而，仍然需要新的抗原结合分子，其将能够优选地与肿瘤特异性或肿瘤相关靶标结合的模块与能够形成共刺激的TNF配体三聚体的模块组合，并且具有足够的药学上有用的稳定性。本发明的抗原结合分子包含这两者，并且它们令人惊奇地提供了三聚体的并因此具有生物活性的TNF配体，尽管三聚体化TNF配体胞外域中的一个相对于该分子的其他两个TNF配体胞外域位于另一个多肽上。
发明概述
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个另外的方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，
(i)第一多肽含有CH1或CL结构域，第二多肽对应地含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(ii)第一多肽含有CH3结构域，第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF 配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(iii)第一多肽含有VH-CL或VL-CH1结构域，第二多肽对应地含有 VL-CH1结构域或VH-CL结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与 VH或VL连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，TNF配体家族成员是共刺激人T细胞活化的成员。因此，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。更具体地说，TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
在一个方面，TNF配体家族成员是4-1BBL。
在一个另外的方面，TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO: 373、SEQ ID NO:374和SEQID NO:375的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:96的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。更具体地说， TNF配体家族成员的胞外域包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自 SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列。
在又一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:185的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1或CL结构域的第一多肽和对应地含有CL或CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与 CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，第二多肽仅包含通过肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1结构域的第一多肽和含有CL结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1结构域连接的TNF 配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CL结构域的第一多肽和含有CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CL结构域连接的TNF 配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个另外的方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是抗体片段。
具体地说，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体片段、Fab分子、交换Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单结构域抗体、aVH 和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是支架抗原结合蛋白。
在一个特定方面，本发明与如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子。
本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在另一个方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、 CD20和CD33。
在一个特定方面，靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v) 包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含 SEQ ID NO:12或SEQID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO:9的氨基酸序列的 CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的 CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH 结构域包含(i)包含SEQ IDNO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含 SEQ IDNO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够与FAP特异性结合的模块包含包括SEQID NO:106的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:107的氨基酸序列的可变轻链。
在一个另外的方面，提供了根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与重链的CH1或CL结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CL或CH1结构域融合。
在一个特定方面，本发明涉及如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(G4S)2，即，具有SEQ ID NO:13的肽接头。在一个方面，第一肽接头为(G4S)2，第二肽接头为GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，第三肽接头为(G4S)2。在另一个方面，第一、第二和第三肽接头均为(G4S)2。
本发明进一步涉及如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
具体地说，本发明的包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的 Fc结构域的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进一步包含(a)能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，其中Fab重链在C末端与Fc结构域中的 CH2结构域的N末端融合。
在一个另外的方面，Fc结构域为IgG，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc 结构域。更具体地说，Fc结构域为IgG1 Fc结构域。在一个特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基联合的修饰。
在另一个方面，本发明涉及如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。
具体地说，Fc结构域包含在IgG重链的位置234和235(EU编号)和/或 329(EU编号)处的氨基酸替代。更具体地说，提供了根据本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含具有氨基酸替代L234A、L235A和 P329G(EU编号)的IgG1 Fc结构域。
在一个另外的方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第一肽在其C末端通过第二肽接头与第二重链或轻链融合，和第二肽，其包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域，所述第二肽通过第三肽接头在其C末端对应地与第二轻链或重链融合。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CH1结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C 末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CL结构域融合。
在又另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CL结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C 末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CH1结构域融合。
在一个另外的方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的VH结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的VL结构域融合。
进一步提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近 TNF配体家族成员的CL结构域中，在位置123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，并且其中在邻近 TNF配体家族成员的CH1结构域中，在位置147(EU编号)和在位置213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。
在一个另外的方面，提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab 分子，
(b)第二重链和第二轻链，所述第二重链包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，所述第二轻链包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(a)能够与FAP特异性结合的Fab分子，和
(b)第二重链和第二轻链，所述第二重链包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，所述第二轻链包含选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含能够与FAP特异性结合的模块。在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:148的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、 SEQID NO:114和SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
在又另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与FAP特异性结合的模块。具体地说，提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链。
在另一个特定方面，本发明提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CD19。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:253的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含 SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:249的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含 SEQ ID NO:200或SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:201的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ IDNO:202的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够与 FAP特异性结合的模块包含包括SEQ IDNO:357的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:358的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112 和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与CD19特异性结合的模块。具体地说，提供了权利要求1至 14、29、30和32至34中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链，或(iv)包含SEQ IDNO:313的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链。
在另一个特定方面，本发明提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CEA。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CEA特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含 (i)包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:322 的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQID NO:323的氨基酸序列的 CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的 CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CEA特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:329的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的可变轻链。
在一个方面，提供了如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112 和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与CEA特异性结合的模块。具体地说，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:341的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，提供了如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中TNF配体家族成员是OX40L。在一个方面，提供了含有TNF 家族配体三聚体的抗原结合分子，其中TNF配体家族成员的胞外域包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的氨基酸序列，尤其是SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在一个另外的方面，提供了权利要求1至5、10至24、29、30、32至34、 38至40、44和45中任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:371或SEQ ID:372 的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)，并且其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7 或SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10或SEQID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11或 SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
具体地说，提供了如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:355的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的第二轻链。
根据本发明的另一个方面，提供了编码如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸。本发明进一步提供了包含本发明的分离的多核苷酸的载体，尤其是表达载体，和包含本发明的分离的多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。
在另一个方面，提供了产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法，该方法包括以下步骤：(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及(ii)回收抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
本发明进一步提供了包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明还涵盖用作药剂的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子、或本发明的药物组合物。在一个方面，提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子、或本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，提供了用于治疗癌症的本发明的含有 TNF家族配体三聚体的抗原结合分子、或本发明的药物组合物。
还提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂尤其是制造用于治疗癌症的药剂中的用途，以及治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的药学上可接受的形式的包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。在具体的实施方案中，该疾病是癌症。在任何上述实施方案中，个体优选为哺乳动物，尤其是人。
附图简述
图1显示了用于组装分拆三聚体的人4-1BB配体的组分。图(1A)显示了在 C末端与人CH1或CL结构域或VL或VH结构域融合的二聚体配体，图(1B)显示了与人CL或CH1结构域或VL或VH结构域融合的单体配体。图(1C)显示了在N末端与人CH3结构域融合的二聚体配体，图(1D)显示了在N末端与人CH3 结构域融合的单体配体。
图2显示了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体1.1至 1.10。这些构建体的制备和产生描述于实施例1中。VH和VL结构域是抗FAP 抗体28H1的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。*表示CH1 和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
图3显示了用于组装分拆三聚体的鼠4-1BB配体的组分。图(3A)显示了在 C末端与鼠CL结构域融合的二聚体配体，图(3B)显示了在C末端与鼠CH1结构域融合的单体配体。用于组装FAP靶向的分拆三聚体的鼠4-1BB配体的组分。图(3C)显示了如实施例1.3中更详细描述的含有组装的鼠4-1BBL-三聚体的抗原结合分子。
图4显示了本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体2.1至2.6。这些构建体的制备和产生描述于实施例2中。VH和VL结构域是抗FAP抗体 4B9的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。*表示CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
图5：图5A和图5B显示了构建体1.1和1.2的“非靶向”变体，其包含 DP47Fab分子而不是抗FAP Fab分子。分子分别命名为对照A和对照B。制备方法描述于实施例1.4中。图5C是实施例3中制备的单体4-1BB Fc(kih)构建体的图。
图6涉及FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子 (FAP分拆的4-1BBL三聚体，实心圆)或DP-47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体，空心圆)与静息(幼稚)或活化的人PMBC的结合。具体地说，与静息(幼稚)或活化的人CD8+T细胞的结合显示在图(6A)中，与静息(幼稚)或活化的人CD4+T细胞的结合显示在图(6B)中，以及与静息(幼稚)或活化的人NK细胞的结合显示在图(6C)中。结合被显示为用作第二检测抗体的红色大型藻类藻红蛋白(R-PE)标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
将不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与来自PHA-L的表达人4-1BB的T细胞以及用普留净(Proleukin)预活化且用抗人CD3/抗人CD28再活化的人PBMC的结合显示在图7A和7B中。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于实施例1的测试构建体1.1至1.10的浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分成四个不同的印迹，其中构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B(具有CH-CL交叉和带电残基的单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。在CD3+CD8+T细胞(图7A)和CD3+CD4+T细胞(图7B)上监测结合。 CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有型式均以很相似的亲和力与人4-1BB结合。
图8A和8B显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与来自新鲜的PBMC的CD4+或CD8+T细胞(图8A)或与表达人4-1BB的PHA-L以及与用普留净(Proleukin)预活化且用抗人CD3/抗人CD28 再活化的人PBMC(图8B)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fc特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于实施例2的测试构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6的以及对照分子对照B、对照C、对照E和对照 F的浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分成两个不同的印迹，其中构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体 Fc(kih))和对照B(具有CH-CL交叉和带电残基的单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。在CD45+CD3+CD8+T细胞(底部的印迹)和CD45+CD3+CD4+T细胞(顶部的印迹)上监测结合。CD8T细胞上的 4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与人 4-1BB结合，而二价构建体2.3及其非靶向的对照C显示出较低的MFI。这可能是由于4-1BB结合的空间位阻和/或由Fc缀合的分拆4-1BB配体诱导的第二检测抗体导致的较少检测的缘故。
在图9中，显示了FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP分拆的4-1BBL三聚体，实心圆)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体，空心圆)与活化的小鼠脾细胞的结合。具体地说，与活化的小鼠CD4+T细胞的结合显示在图(9A)中，与活化的小鼠CD8+T细胞的结合显示在图(9B)中。使用抗小鼠 CD137特异性人IgG1 P329G LALA抗体(克隆Lob12.3)作为阳性对照(三角形)。通过绘制用作第二检测抗体的R-PE标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的MFI来表征结合，所述MFI是相对于测试的分拆4-1BBL三聚体构建体的浓度nM而言的。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的 MFI来校正基线。
图10显示了含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(实心圆： FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)的融合抗原结合分子构建体1.1，空心圆：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子对照A)与表达成纤维细胞激活蛋白(FAP)的人黑素瘤(10A)MV-3细胞系和 (10B)WM-266-4细胞系的结合。通过绘制用作第二检测抗体的R-PE标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的MFI来表征结合，所述MFI是相对于测试的分拆4-1BBL三聚体构建体的浓度nM而言的。通过流式细胞术测量 MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
在图11A和11B中，显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人 4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞(图11A)和/或 NIH/3T3-huFAP克隆39转染的小鼠胚胎成纤维细胞(图11B)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料或荧光素-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2 片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分布到四个(图11A)或两个印迹(图11B)，而构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。除了二价的FAP靶向的构建体(构建体1.5、1.7和1.8)之外，所有构建体均以相似的亲和力与人FAP结合。它们表现出具有较低的EC50值和较低的中值荧光强度倾向。这可以用它们的二价靶向来解释(较高的亲合力，由于两个表位的占用，较少的分子可以同时结合，导致较低的MFI)。结构差异也可以解释在构建体1.8(完全二价靶向)与构建体1.5和1.7(仅部分二价靶向)之间的差异。
在图12A和12B中，显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人 4-1BB配体Fc(kih)构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6与表达人FAP的人黑素瘤MV-3 细胞(图12A)和WM-266-4细胞(图12B)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地展示，将结合曲线分布到两个印迹，而构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)) 用作比较曲线。除了二价的FAP靶向的构建体2.3之外，所有构建体均以相似的亲和力与人FAP结合。它具有显示出较低的EC50值和较低的中值荧光强度倾向。这可以用它的二价靶向来解释，其导致更高的亲合力，但在细胞表面上更少的占用或FAP分子，导致较低的MFI。
图13显示了不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的小鼠4-1BB配体 Fc(kih)构建体与来自新鲜脾细胞的CD4+或CD8+T细胞(图13A)或用表达小鼠4-1BB的抗小鼠CD3/抗小鼠CD28单克隆激动性抗体激活的小鼠脾细胞(图 13B)的结合。用FITC-荧光染料缀合的抗小鼠IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2 片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。在CD3+CD8+T细胞(左侧印迹)和CD3+CD4+T细胞(右侧印迹)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与小鼠4-1BB结合。
将不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的小鼠4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人FAP的肿瘤细胞的结合展示在图14中。用FITC-荧光染料缀合的抗小鼠IgG Fc特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。在MV-3细胞(图14A)和WM-266-4细胞(图 14B)上监测结合。FAP靶向的分拆三聚体的小鼠4-1BB配体Fc(kih)构建体M.1 和M.2以很相似的亲和力与FAP结合。
图15显示了使用报告细胞系说明在实施例6.1中描述的NFkB活性测定的一般原理的方案。显示了用表达人4-1BB的HeLa报告细胞系建立的活化测定。在报告细胞上表达的4-1BB的交联诱导了NFκB活化和NFκB介导的萤光素酶表达。细胞裂解后，萤光素酶可以催化萤光素氧化为氧化萤光素。这一化学反应与NFκB介导的萤光素酶表达的强度呈正相关，并可以通过发光强度(释放光的单位数)来量度。表达FAP的肿瘤细胞与报告细胞系 HeLa-huCD137-NFkB-luc的比率为5比1。
在图16中显示，通过FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体1.1)激活NFkB信号转导途径严格依赖于其与表达FAP的靶细胞的结合。将表达人CD137的NFkB报告HeLa细胞与展现不同水平的细胞表面FAP表达的指定肿瘤细胞共培养。在不存在或存在指定浓度的含有 4-1BBL的分子的情况下培养细胞6小时后，如实施例6.1所述评估萤光素酶活性。实心圆是指构建体1.1。空心圆是指DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照A)。细胞系NIH/3T3-人FAP克隆39用作曲线图(16A)中的靶细胞，曲线图(16B)显示以MV3细胞系作为靶细胞的活化，曲线图(16C)以WM-266-4细胞系作为靶细胞。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试的分拆的4-1BBL三聚体构建体的nM浓度的印迹来表征活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。
图17A-17C显示了用实施例6.1中所述的测定法测量的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量每秒释放光的计数(CPS)，并针对使用的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度作图。将表达人4-1BB的HeLa报告细胞在不存在(图17A)或存在表达交联的人 FAP的人黑素瘤细胞系MV-3(图17B)或WM-266-4(图17C)的情况下温育6小时。测量CPS并针对不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体 Fc(kih)构建体的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达人4-1BB的HeLa报告细胞比5个肿瘤细胞。为了更好地展示，将活化曲线分成四个不同的显示印迹，其中构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照 B(具有CH-CL交叉和带电残基的单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体 Fc(kih))用作比较曲线。图17A显示在没有表达交联FAP的肿瘤细胞的情况下的活化，图17B显示在存在表达交联FAP的MV-3肿瘤细胞的情况下的活化，图17C显示在存在表达交联FAP的WM-266-4肿瘤细胞的情况下的活化。
图18显示了对实施例2的构建体测量的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的计数(URL)，并针对使用的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度作图。将表达人4-1BB 的HeLa报告细胞在不存在或存在表达交联的人FAP的人黑素瘤细胞系MV-3 或WM-266-4的情况下温育6小时。测量URL并针对不同FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6以及对照B、 C、E和F的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达4-1BB的HeLa报告细胞比5个肿瘤细胞。为了更好地展示，将活化曲线分为具有构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))的两个不同的显示印迹。
在图19中，显示了用表达食蟹猴4-1BB的T293-HEK报告细胞系建立的活化测定。在报告细胞上表达的食蟹猴4-1BB的交联诱导了NFκB活化和NFκB 介导的萤光素酶表达。细胞裂解后，萤光素酶可以催化萤光素氧化为氧化萤光素。这一化学反应与NFκB介导的萤光素酶表达的强度呈正相关，并可以通过发光强度(释放光的单位数)来量度。
图20显示了NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的计数(URL)，并针对使用的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度作图。将表达食蟹猴4-1BB的T293-HEK报告细胞在不存在或存在表达交联的人FAP的人黑素瘤细胞系MV-3或WM-266-4的情况下温育6小时。测量URL并针对不同的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人 4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达4-1BB的T293-HEK报告细胞比5个MV-3或2个WM-266-4细胞。为了更好地显示，将活化曲线分为两个不同的印迹，其中构建体2.1用作比较曲线。
图21：这个方案图解了实施例6.3中描述的T细胞活化测定的原理。显示了在不同滴定浓度的FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih) 构建体的存在下，用HLA-A2-NLV特异性CD8T细胞和NLV脉冲的HLA-A2+ FAP+人黑素瘤细胞系MV-3建立的示意性活化测定。将细胞温育28小时，最后4小时在含有莫能菌素的Golgi-Stop的存在下温育。NLV特异性CD8 T细胞与MV-3肿瘤细胞的比率为1:8。
图22(22A-22E)和23(23A-23E)涉及在实施例1中制备的不同滴定浓度的不同FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的存在下，用HLA-A2-NLV特异性CD8 T细胞和NLV脉冲的HLA-A2+FAP+人黑素瘤细胞系MV-3进行的活化测定。为了更好地展示，将表达曲线分成几个不同的显示印迹，其中构建体1.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B(单价的非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))用作比较曲线。在四个独立的相似实验中获得结果，并且表明NLV特异性CD8+T 细胞的延长IFNγ分泌和CD137表达严格依赖于通过识别NLV-HLA-A2复合物 (信号1)的T细胞同时活化和通过FAP靶向的分拆的人4-1BBL(信号2)的4-1BB 触发。4-1BB上调的效应显示在图22的曲线图中，而CD8+T细胞的INFγ表达的效应呈现在图23的曲线图中。一直显示总CD8+T细胞群中阳性细胞百分比的频率。所有FAP靶向的变体诱导了NLV肽激活的CD8T细胞的相似活化改善，在图22中显示为4-1BB上调(正反馈环)，并且在图23中显示为刺激24小时后的IFNγ表达。曲线差异在正常误差偏差的范围内，并不显著。
图24和25指的是在实施例2的滴定浓度的不同FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的存在下，用HLA-A2-NLV特异性CD8 T 细胞和NLV脉冲的HLA-A2+FAP+人黑素瘤细胞系MV-3进行的活化测定。为了更好地展示，将表达曲线分为两个不同的显示印迹，其中构建体2.1(单价的FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih))和对照B用作比较曲线。所有FAP靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体显示出HLA-A2-NLV 肽特异性CD8T细胞的相似活化改善，在图24中显示为4-1BB上调(正反馈环)，并且在图25中显示为刺激24小时后的IFNγ表达。曲线差异在正常误差偏差的范围内，并不显著。
图26:这个方案展示了实施例6.4中所述的实验。
图27显示了CD8+T细胞增殖的诱导。显示的是增殖性CD8+T细胞相对于测试构建体浓度的频率。
图28A涉及在健康NOG小鼠中构建体1.2和对照B的单剂量PK实验。显示的是构建体浓度随着时间而下降。图28B显示了在用干细胞人源化的荷瘤 NOG小鼠中的构建体2.1、2.3、对照B和对照C的单剂量PK实验的结果。图28C 涉及在健康NOG小鼠中比较构建体2.1和2.3的单剂量PK实验。
图29显示了用于组装分拆三聚体的人4-1BB配体的组分。图(29A)显示了在C末端与具有突变E123R和Q124K(带电残基)的人CL结构域融合的二聚体配体，图(29B)显示了与具有突变K147E和K213E(带电残基)的人CH1结构域融合的单体4-1BB配体。用于组装二价CD19靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-254)抗原结合分子(构建体3.3)的组分。图(29C)显示了与人IgG1 Fc穴链的C末端融合的二聚体配体。图(29D)显示了与人IgG1 Fc节链的C末端融合的单体配体。
图30显示了本发明的含有CD19靶向的4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体3.1至3.6。这些构建体的制备和产生描述于实施例3中。VH和VL结构域是抗CD19抗体8B8-018的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。 *表示CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
在图31A中展示了亲本克隆8B8的CDR区的随机化策略。显示了根据 Kabat编号的亲本克隆8B8和CDR区(加框)的可变结构域。(X)代表随机化位置。图31B显示了文库生成策略的示意性描述。显示了用于生成具有A)轻链和重链中的随机化CDR1和CDR2区域或B)轻链中的随机化CDR1和CDR3区和重链中的CDR3区的基于8B8的文库的PCR扩增和克隆策略。指示了用于克隆到噬菌粒(phagemide)中的各种酶。
图32显示了亲本抗CD19克隆8B8与选择的亲和力成熟的结合剂的比对。显示了克隆8B8和所有选择的亲和力成熟的结合剂的序列。重链和轻链的CDR被加框。
图33涉及亲本8B8克隆及其亲和力成熟的变体的SPR分析。显示了克隆 8B8及其亲和力成熟的衍生物的传感图，其中没有LCDR1 N27d和N28热点。
图34图解了测量CD19靶向的分拆三聚体的4-1BBL与hu4-1BB和 huCD19(实施例8.2)同时结合的测定的设置。
图35中的曲线图显示了CD19靶向的三聚体4-1BBL FC融合抗原结合分子构建体3.1、3.3、3.4、3.5、3.6和4.4(分析物1)与固定的人4-1BB和人CD19(分析物2)的同时结合。
图36A和36B显示了不同的CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB 配体Fc(kih)构建体与PHB-L的表达4-1BB的CD4和CD8 T细胞和用普留净 (Proleukin)预活化且用抗人CD3/人CD28再活化的人PBMC的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地显示，将结合曲线分为三个不同的印迹，其中构建体3.4和对照F(同种型对照huIgG1 P329G LALA)用作比较曲线。在CD45+CD3+CD8+T细胞(图36A)和CD45+ CD3+CD4+T细胞(图36B)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与人4-1BB结合。
图37A-37D显示了CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体 Fc(kih)抗原结合分子与表达人CD19的B细胞淋巴瘤细胞系：弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤SU-DHL-8(37A)、急性前体B细胞淋巴样白血病Nalm6(37B)、弥漫性大细胞淋巴母细胞淋巴瘤Toledo(37C)和弥漫性大B细胞淋巴瘤 OCI-Ly18(37D)的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地显示，将结合曲线分为三个不同的印迹，其中构建体3.4和对照F(同种型对照huIgG1 P329G LALA)用作比较曲线。所有构建体均以很相似的亲和力与人CD19结合。
图38涉及CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)抗原结合分子的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的单位数(URL)，并针对使用的CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体3.1和3.3以及对照分子B和C的浓度作图。将表达人4-1BB的 HeLa报告细胞在不存在或存在表达交联的人CD19的SU-DHL-8或Pfeiffer细胞的情况下温育7.5小时。测量URL并针对不同的CD19靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体的浓度进行印迹。细胞比率为1个表达 4-1BB的HeLa报告细胞比2.5或5个肿瘤细胞。
图39显示了T84.66 IgG的不同人源化变体在表达CEA的人胃腺癌细胞上的结合。基于该数据，选择人源化变体1，将其包括在CEA靶向的三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)抗原结合分子中。
图40显示了本发明的含有CEA靶向的4-1BBL三聚体的抗原结合分子构建体5.1至5.6。这些构建体的制备和产生描述于实施例11中。VH和VL结构域是抗CEA抗体T84.66-LCHA的结构域，粗的黑点代表节入穴(knob-into-hole) 修饰。*表示CH1和CL结构域中的氨基酸修饰(所谓的带电残基)。
图41：图41A显示了人NA3B3A2-avi His的示意性描述，该抗原其用于评估CEA靶向的分拆三聚体的4-1BBL Fc(kih)抗原结合分子的结合。图41B图解了测量CEA靶向的分拆三聚体的4-1BBL与hu4-1BB和人NA3B3A2(实施例 12.1)同时结合的测定的设置。
图42中的曲线图显示了CEA靶向的三聚体4-1BBL Fc融合抗原结合分子构建体5.4、5.6、5.7和5.8(分析物1)与固定的人4-1BB和人NA3B3A2(分析物 2)的同时结合。
将不同的CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)构建体与PHA-L的表达4-1BB的CD4和CD8 T细胞以及用普留净(Proleukin)预活化且用抗人CD3/抗人CD28再活化的人PBMC的结合显示在图43中。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。为了更好地显示，将结合曲线分为两个不同的印迹，其中构建体5.4和对照F(同种型对照huIgG1 P329G LALA)用作比较曲线。在CD45+CD3+CD8+T细胞(底部的印迹)和 CD45+CD3+CD4+T细胞(顶部的印迹)上监测结合。CD8 T细胞上的4-1BB 表达水平通常高于CD4 T细胞。所有构建体均以很相似的亲和力与人4-1BB 结合。
图44显示了CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人CEA的人胃细胞系MKN-45(左)和人结肠直肠腺癌细胞系LS180(右) 的结合。用R-藻红蛋白-荧光染料缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2 片段检测结合。显示的是相对于测试构建体浓度的荧光强度中位值(MFI)。
图45涉及CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体Fc(kih)抗原结合分子的NFκB活化诱导的萤光素酶表达和活性。以0.5秒/孔测量释放光的单位数(URL)，并针对使用的CEA靶向或非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体 Fc(kih)构建体5.4、5.6、5.7和5.8以及对照分子的浓度进行印迹。将表达人 4-1BB的HeLa报告细胞在不存在或存在表达交联的人CEA的人胃癌细胞系 MKN-45的情况下温育6小时。细胞比率为1个表达4-1BB的HeLa报告细胞比3 个肿瘤细胞。
图46：在图46A和46B中，显示了用于组装单价的FAP靶向的分拆三聚体的人OX40配体(构建体6.1)的组分。图46A涉及与人IgG1-CL结构域融合的二聚体配体，图46B涉及与人IgG1-CH1结构域融合的单体配体。图46C显示了 FAP靶向的含有OX40L三聚体的抗原结合分子构建体6.1。在图46D中，显示了DP47“非靶向的”人IgG1 PGLALA(对照F)。
图47A显示了FAP靶向的分拆三聚体的人Ox40L与FAP阳性的WM-266-4 细胞的结合。WM-266-4细胞表达高水平的人成纤维细胞激活蛋白(huFAP)。只有FAP靶向的OX4O配体Fc(kih)构建体(实心正方形)而不是对照5(实心菱形)与WM-266-4细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值 (MFI)。通过流式细胞术测定MFI。x轴显示抗体构建体的浓度。图47B显示了FAP靶向的OX4O配体Fc(kih)构建体与人FAP人Ox40阴性A549 NucLight Red细胞的结合。FAP靶向的OX4O配体Fc(kih)构建体显示没有与OX40阴性 FAP阴性A549肿瘤细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的FITC标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
图48：在图48A中，显示了FAP-Ox40L与静息和活化的人CD4 T细胞的结合。在静息的人CD4 T细胞(左侧)上不表达Ox40。在没有表达人Ox40的细胞的情况下，没有观察到结合(左图)。激活人PBMC后，Ox40在CD4+T细胞上被上调(右侧)。FAP-Ox40L与Ox40+的活化CD4 T细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的FITC标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。x轴显示抗体构建体的浓度。图48B显示在静息的人CD8 T 细胞(左侧)上不表达Ox40。在没有表达人Ox40的细胞的情况下，没有观察到结合(左图)。激活人PBMC后，Ox40在CD8+T细胞上被上调(右侧)。Ox40在人CD8+T细胞上的表达低于在CD4+T细胞上的表达，并且在供体和时间点之间变化。Ox40在描绘的CD8 T细胞上的表达较低。FAp-Ox40L与Ox40+的活化CD8 T细胞结合。结合被显示为用作第二检测抗体的FITC标记的抗人 IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。x轴显示抗体构建体的浓度。
在图49中，证明了在HeLa_hOx40_NFkB_Luc1报告细胞中通过FAP靶向的分拆三聚体的人OX40L抗原结合分子(FAP-OX40L)的NFκB信号通路的激活。显示了在具有(右曲线图)或没有(左曲线图)通过第二抗体进行交联情况下的活化。以指定浓度将报告细胞在FAP-OX40L存在下在具有或没有1:2比例的交联的第二多克隆抗huIgG1 Fcγ特异性山羊IgGIgG F(ab)2片段的情况下培养5小时。如实施例6.1中所述评估萤光素酶活性。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试构建体的nM浓度的印迹来表征活性。URL 的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。
图50：在FAP阳性细胞存在下通过FAP-OX40L在 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1报告细胞中NFκB的激活显示在图50A中。显示了在表达低FAP的NIH-3T3人FAP细胞存在下通过FAP-OX40L在报告细胞中的 NFκB信号通路的激活(比率为3个FAP+肿瘤细胞比1个报告细胞)。通过在0.5 秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试化合物的nM浓度的印迹来表征NFκB介导的萤光素酶活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。通过减去空白对照的URL将这些值进行基线校正。为了更好地比较，将各个印迹的剂量-反应曲线的曲线下面积定量，作为每个构建体的激动能力的标志。在图50B中展示该比较。使用GraphPad Prism 计算该面积。通过减去空白对照的值将这些值进行基线校正。
图51显示了OX40介导的次最佳TCR触发的静息人PBMC的共刺激(实施例15.5)。通过本发明NIH/3T3-huFAP克隆39细胞的FAP-Ox40L的超交联强烈促进了人CD4和CD8T细胞的存活和增殖。显示有活力的CD4+(左)和 CD8+(右)T细胞的事件计数。减去仅含有抗人CD3(克隆V9，huIgG1)、静息的人PBMC和NIH/3T3-huFAP克隆39的样品的基线值。因此，这里显示了 OX40共刺激的增强作用，但不是次最佳抗CD3刺激本身的作用。在底部的图中，显示了具有细胞表面固定的FAP-Ox40L的静息的人PBMC的次最佳 TCR刺激的复苏-增殖。
发明详述
定义
除非另外定义，本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中通常使用的相同的含义。出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指的是特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
如本文中使用的，术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合模块能够通过其靶细胞抗原激活信号转导。在一个特定方面，抗原结合模块能够将与其连接的实体(例如，TNF家族配体三聚体)引导至靶位点，例如引导至具有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的抗体及其片段。另外，能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如，基于设计的重复蛋白或设计的重复结构域的结合结构域(参见例如WO 2002/020565)。
关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”是指分子的包含与抗原的部分或全部特异性结合并与其互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供能够进行特异性抗原结合的模块。具体地说，能够进行特异性抗原结合的模块包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
在本文中以最广义的方式使用术语“抗体”，其涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即包含该群的单独的抗体是同一的和/或结合同一表位，除了可能的变体抗体之外，例如，含有天然存在的突变的或在单克隆抗体制剂的产生过程中产生的抗体，这样变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点各自与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性地与至少两个不同的抗原决定簇结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对于不同的抗原决定簇是特异性的。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，尤其是在两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。
在本申请中使用的术语“价”意味着在抗原结合分子中特定数目的结合位点的存在。正因为因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别意味着在抗原结合分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指的是具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。“天然抗体”指的是具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成。从N末端至 C末端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，其后是三个恒定结构域(CH1、CH2、和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N末端至C末端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，其后是轻链恒定结构域(CL)，也称为轻链恒定区。抗体重链可被指定为五种类型中的一种，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体轻链可被指定为两种类型之一，称为卡帕(κ)和兰布达(λ)。
“抗体片段”指的是除了完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的所述完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv、 Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双抗体、三抗体、四抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，引自The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113, Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利Nos.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的可以是二价或双特异性的抗体片段，参见，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人， Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448(1993)。Hudson等人在Nat Med9,129-134(2003)中也描述了三抗体和四抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。可以通过各种技术制造抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中所述。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个完全相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自含有重链和轻链可变区以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文中使用的，术语“Fab片段”是指包含包括轻链的VL结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段、和重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。Fab'片段因在重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab')2片段。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”是指其中重链和轻链的可变区或恒定区之间被交换的Fab片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的并且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1) 组成的肽链、以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。这种交换Fab分子也被称为CrossFab(VLVH)。另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链、以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。这种交换Fab分子也被称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH)、抗体恒定结构域 1(CH1)、抗体轻链可变域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1 或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是具有至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键而被稳定化。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据 Kabat编号在可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些单链Fab分子可以进一步被稳定化。
“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH 和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述接头是具有至少30个氨基酸的多肽。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号在可变轻链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些 x-scFab分子可以进一步被稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是用具有10个至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白。该接头通常富含有关柔性的甘氨酸，以及有关溶解性的丝氨酸或苏氨酸，并且可将VH的N末端与 VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)。另外，抗体片段包含具有VH结构域特征或VL 结构域特征的单链多肽，所述VH结构域特征即能够与VL结构域一起组装到功能性抗原结合位点上，所述VL结构域特征即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点上，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的，例如，纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如 Gebauer和Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.CurrOpin Chem Biol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation ofprotein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701 (2008)。在本发明的一个方面，支架抗原结合蛋白选自CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子，如蛋白A的Z结构域(Affibody)、 A结构域(Avimer/Maxibody)、血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、VNAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(VNAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、诸如来自knottin家族的蛋白质的微体、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+T细胞上表达的 CD28家族受体。其细胞外域具有类似可变结构域的Ig折叠。可用异源序列取代对应于抗体的CDR的环，以赋予不同的结合特性。经过工程化而具有不同结合特异性的CTLA-4分子也被称为Evibodies(例如，US7166697B1)。 Evibodies的大小与抗体(例如，结构域抗体)的分离可变区大约相同。进一步的详情参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂质运载蛋白为细胞外蛋白质家族，其转运小的疏水性分子，如类固醇、胆红素、类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端具有可被工程化以结合不同的靶抗原的多个环。Anticalin的大小在 160-180个氨基酸之间，并且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。
亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架，其可被工程化以结合抗原。该结构域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)和EP 1641818A1。
Avimers是衍生自A结构域支架家族的多结构域蛋白。具有约35个氨基酸的天然结构域采用定义的二硫键结构。多样性是通过改变A结构域家族所显示的自然变异产生的。进一步的详情参见Nature Biotechnology 23(12),1556- 1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。
转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括Trans-body。进一步的详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基的基序。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基，它们可以被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数量(亲和力成熟法)可以增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332, 489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028 (2007)以及US20040132028A1。
单结构域抗体是由单个单体的可变抗体结构域组成的抗体片段。第一个单结构域来源于来自骆驼科动物(camelids)抗体重链的可变结构域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单结构域抗体包括自主的人重链可变结构域(aVH) 或来源于鲨鱼的VNAR片段。
纤连蛋白是一种可以被工程化为与抗原结合的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个结构域的天然氨基酸序列的主链组成。可以将β-夹心一端的三个环工程化，使Adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、 US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子，所述骨架蛋白通常是含有在活性位点插入的约束可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详情参见 ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataBI以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程化的半胱氨酸结肽结构域的更多详情参见WO2008098796。
就参考分子而言“结合相同表位的抗原结合分子”是指在竞争测定中阻断参考分子与其抗原的结合的50％或以上的抗原结合分子，相反地，参考分子在竞争测定中阻断抗原结合分子与其抗原的结合的50％或以上。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的部分或全部特异性地结合且互补的区域。在大抗原的情况下，抗原结合分子可能仅与该抗原的特定部分结合，该部分称作表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文中使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指在抗原结合模块与其结合而形成抗原结合模块-抗原复合物的多肽大分子上的位点(例如氨基酸的连续段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他病变的细胞表面上、免疫细胞表面上发现，在血清中和/或细胞外基质(ECM)中游离。用作本文中的抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况下，该术语包括“全长”未加工的蛋白质以及通过在细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”意指结合对于抗原而言是选择性的，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区别开。抗原结合分子与特异性抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如，表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229 (2002))。在一个实施方案中，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原结合的约10％，正如通过例如SPR所测量的。在某些实施方案中，与抗原结合的分子具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至 10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文中使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的 1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以通过解离常数(Kd)来表示，亲和力是解离速率常数与结合速率常数(分别为koff和 kon)的比率。因此，等同亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。可以通过本领域已知的常用方法测量亲和力，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
如本文中使用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质细胞。在某些实施方案中，靶细胞抗原是肿瘤细胞表面上的抗原。在一个实施方案中，靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD20和CD33。具体地说，靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
术语“成纤维细胞激活蛋白(FAP)”，也称为脯氨酰内肽酶FAP或分离酶 (Seprase)(EC 3.4.21)，是指任何脊椎动物来源的任何天然FAP，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的FAP以及通过在细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合人、小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列显示在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149，SEQ ID NO:20)、或 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的细胞外域 (ECD)从氨基酸位置26延伸至760。带His标签的人FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO:15和16中。小鼠FAP的氨基酸序列显示在 UniProt登录号P97321(版本126，SEQ ID NO:23)、或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP的细胞外域 (ECD)从氨基酸位置26延伸至761。SEQ ID NO:24和25分别显示了带His标签的小鼠FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO:26和27分别显示了带 His标签的食蟹猴FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。优选地，本发明的抗FAP 结合分子与FAP的细胞外域结合。示例性抗FAP结合分子描述于国际专利申请No.WO 2012/020006 A2中。
术语“癌胚抗原(CEA)”，也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子 5(CEACAM5)，是指任何脊椎动物来源的任何天然CEA，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CEA的氨基酸序列显示在UniProt登录号P06731(版本151，SEQ ID NO:28)中。CEA早已被鉴定为肿瘤相关抗原 (Gold和Freedman,J Exp Med.,121:439-462,1965；Berinstein N.L.,J Clin Oncol.,20:2197-2207,2002)。最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在若干正常的成人组织中鉴定了CEA。这些组织主要是起源于上皮，包括胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的细胞，以及结肠、子宫颈、汗腺和前列腺的细胞(Nap等人，Tumour Biol.,9(2-3):145-53,1988；Nap等人，Cancer Res., 52(8):2329-23339,1992)。上皮起源的肿瘤及其转移瘤含有作为肿瘤相关抗原的CEA。虽然CEA本身的存在不表明转化为癌细胞，但CEA的分布是指示性的。在正常组织中，CEA通常在细胞的顶端表面上表达(
Figure BDA0003454763770000361
S., Semin CancerBiol.9(2):67-81(1999))，使血流中的抗体难以接近。与正常组织相反，CEA倾向于在癌细胞的整个表面上表达(
Figure BDA0003454763770000362
S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))。这种表达模式的改变使CEA在癌细胞中可与抗体结合。另外，CEA表达在癌细胞中增加。此外，增加的CEA表达促进细胞间粘附增加，这可能导致转移(Marshall J.,Semin Oncol.,30(aSuppl.8):30-6, 2003)。CEA表达在各种肿瘤实体中的发生率通常很高。根据公开的数据，在组织样品中进行的自身分析证实其高发生率，大约在结肠直肠癌(CRC)中为95％，在胰腺癌中为90％，在胃癌中为80％，在非小细胞肺癌(NSCLC，其与HER3共表达)中为60％，在乳腺癌中为40％；发现在小细胞肺癌和胶质母细胞瘤中为低表达。
CEA容易从细胞表面裂解并直接或通过淋巴管从肿瘤脱落进入血流。由于这种特性，血清CEA水平已被用作癌症诊断和筛选癌症特别是结肠直肠癌复发的临床标志物(Goldenberg D M.,The International Journal of Biological Markers,7:183-188,1992；Chau I.等人，J Clin Oncol.,22:1420-1429,2004； Flamini等人，Clin CancerRes；12(23):6985-6988,2006)。
术语“黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)”，也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)，是指任何脊椎动物来源的任何天然MCSP，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人MCSP的氨基酸序列显示在UniProt 登录号Q6UVK1(版本103，SEQ ID NO:29)中。术语“表皮生长因子受体 (EGFR)”，也称为原癌基因c-ErbB-1或受体酪氨酸蛋白激酶erbB-1，是指任何脊椎动物来源的任何天然EGFR，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人EGFR的氨基酸序列显示在UniProt登录号P00533(版本211， SEQ ID NO:30)中。
术语“CD19”是指B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4 或T细胞表面抗原Leu-12，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD19，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴) 和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD19的氨基酸序列显示在 Uniprot登录号P15391(版本160，SEQ ID NO:31)中。该术语涵盖“全长”未加工的人CD19以及通过在细胞中加工产生的任何形式的人CD19，只要本文中报道的抗体与其结合即可。CD19是在人B细胞表面上表达的结构上不同的细胞表面受体，所述细胞包括但不限于前B细胞、早期发育中的B细胞(即未成熟B细胞)、通过终末分化成浆细胞的成熟B细胞和恶性B细胞。由大多数前B 型急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞性白血病和一些无标志型急性淋巴细胞性白血病表达CD19。CD19在浆细胞上表达进一步表明它可以在分化的B细胞肿瘤如多发性骨髓瘤中表达。因此，CD19 抗原是用于治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和/或急性淋巴细胞白血病的免疫治疗的靶标。
术语“CD20”是指B淋巴细胞抗原CD20，也称为跨膜4域亚家族A成员 1(MS4A1)、B淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD20，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD20的氨基酸序列显示在Uniprot登录号P11836(版本149，SEQ ID NO:32)中。术语“CD33”是指髓样细胞表面抗原CD33，也称为SIGLEC3或gp67，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD33，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD33的氨基酸序列显示在Uniprot登录号 P20138(版本157，SEQ ID NO:33)中。
术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL) 通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区 (HVR)。参见例如Kindt等人，Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman和Co., 第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变/或形成结构上定义的环(“高变环”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)中，三个在VL中(L1、L2、L3) 中。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性的高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3) 处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987).)示例性的CDR(CDR-L1、 CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)发生在L1的24-34、L2 的50-56、L3的89-97、H1的31-35B、H2的50-65、和H3的95-102氨基酸残基处。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991).)高变区 (HVR)也被称为互补决定区(CDR)，并且在提到形成抗原结合区的可变区的部分时，这些术语在本文中可互换地使用。这个特定的区域已经由Kabat等人在U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"(1983)和Chothia等人在J.Mol.Biol.196:901-917(1987) 中描述，其中定义包括当针对彼此进行比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，提及抗体的CDR或其变体的任一定义的应用预期在本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如以上每一篇引用的参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基在以下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将取决于 CDR的序列和大小而变化。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定的CDR。
表A：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中所有CDR定义的编号遵循Kabat等人提出的编号规则(见下文)。
2具有如表A中使用的小写“b”的“AbM”是指Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件所定义的CDR。
Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以将这个“Kabat编号”系统明确地指定给任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人在U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)中提出的编号系统。除非另有说明，抗体可变区中特定氨基酸残基位置编号的提及是根据Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR 还包含作为接触抗原的残基的“特异性测定残基”或“SDR”。SDR被包含在称为缩略CDR(或a-CDR)的CDR区域中。示例性的a-CDR(a-CDR-L1、 a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)发生在L1的 31-34、L2的50-55、L3的89-96、H1的31-35B、H2的50-58、和H3的95-102 氨基酸残基处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008).) 除非另外指明，在本文中根据上文Kabat等人将可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)编号。
如本文中使用的，在抗原结合分子(例如，抗体)的背景下，术语“亲和力成熟”是指例如通过突变而衍生自参考抗原结合分子的抗原结合分子与参考抗体结合相同的抗原，优选结合相同的表位；并且对抗原具有相比于对参考抗原结合分子更高的亲和力。亲和力成熟通常涉及抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常，亲和力成熟的抗原结合分子与初始参考抗原结合分子结合相同的表位。
“框架”或“FR”是指除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由FR1、FR2、FR3和FR4四个FR结构域组成。因此，HVR 和FR序列通常在VH(或VL)中以下列顺序出现： FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文的目的，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下所定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含相同的氨基酸序列，或者其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10个或更少，9个或更少，8个或更少，7 个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“嵌合”抗体是指其中一部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种的抗体，同时重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种。
抗体的“类”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几类可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个(通常两个)可变结构域中的基本上所有的可变结构域，其中所有或基本上所有的 HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”是指经过人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经基于原始抗体的恒定区另外加以修饰或改变以产生根据本发明的特性特别是关于C1q结合和/或 Fc受体(FcR)结合的那些抗体。
“人”抗体是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体或衍生自利用人抗体库或其他的人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中使用的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc 区包含IgG CH2和IgGCH3结构域。人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约位置 231的氨基酸残基延伸至约位置340的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链与CH2结构域附接。本文中的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含在Fc区中的C末端到CH2结构域的残基段(即从IgG的约位置341的氨基酸残基到约位置447的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如，具有在其一条链中引入的“突起”(“节”)和在其另一条链中相应的引入的“腔”(“穴”)的CH3结构域；参见美国专利5,821,333，将其明确地通过提述并入本文)。如本文中所述，这种变体CH3结构域可用于促进两个不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非在本文中另外说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统也称为EU索引进行的，如Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda, MD,1991中描述。
“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人， Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”)，使得该突起可以定位在该腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变、或通过肽合成而产生突起和腔。在具体的实施方案中，节修饰包括 Fc结构域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W，并且穴修饰包括Fc结构域的两个亚基中的另一个亚基中的氨基酸替代T366S、L368A和Y407V。在一个另外的具体实施方案中，包含节修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸替代S354C，并且包含穴修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。编号是根据 Kabat等人在Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中的EU索引进行的。
“等同于免疫球蛋白Fc区的区域”预期包括免疫球蛋白Fc区的天然存在的等位基因变体、以及具有产生取代、添加或缺失的改变但不实质性地降低免疫球蛋白介导效应器功能(如抗体依赖性细胞毒性)的能力的变体。例如，可以从免疫球蛋白Fc区的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸，而没有生物学功能的实质性丧失。可以根据本领域已知的一般规则来选择这些变体，以便对活性具有最小的影响(参见，例如Bowie,J.U.等人，Science247:1306-10 (1990))。
术语“效应器功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性 (CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调、和B细胞活化。
“激活性Fc受体”是被抗体Fc区接合之后引出信号转导事件的Fc受体，所述事件刺激带有该受体的细胞履行效应器功能。激活性Fc受体包括 FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、和FcαRI(CD89)。特定的激活性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
术语“TNF配体家族成员”或“TNF家族配体”是指促炎细胞因子。细胞因子，特别是TNF配体家族的成员，通常在免疫系统的刺激和协调中起关键作用。目前，根据序列、功能和结构相似性，已将19种细胞因子鉴定为TNF(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是具有C末端细胞外域(胞外域)、N末端胞内结构域和单个跨膜结构域的II型跨膜蛋白。称为TNF同源结构域(THD)的C末端细胞外域在超家族成员之间具有20-30％的氨基酸同一性，并且负责与受体的结合。TNF胞外域还负责TNF配体形成被其特异性受体识别的三聚体复合物。
TNF配体家族的成员选自淋巴毒素α(也称为LTA或TNFSF1)、TNF(也称为TNFSF2)、LT(也称为TNFSF3)、OX40L(也称为TNFSF4)、CD40L(也称为 CD154或TNFSF5)、FasL(也称为CD95L、CD178或TNFSF6)、CD27L(也称为 CD70或TNFSF7)、CD30L(也称为CD153或TNFSF8)、4-1BBL(也称为 TNFSF9)、TRAIL(也称为APO2L,CD253或TNFSF10)、RANKL(也称为CD254 或TNFSF11)、TWEAK(也称为TNFSF12)、APRIL(也称为CD256或TNFSF13)、 BAFF(也称为CD257或TNFSF13B)、LIGHT(也称为CD258或TNFSF14)、 TL1A(也称为VEGI或TNFSF15)、GITRL(也称为TNFSF18)、EDA-A1(也称为外异蛋白A1)和EDA-A2(也称为外异蛋白A2)。该术语是指任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族配体，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在本发明的具体实施方案中，TNF配体家族成员选自OX40L、FasL、CD27L、 TRAIL、4-1BBL、CD40L和GITRL。在特定实施方案中，TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
可以从例如Uniprot(www.uniprot.org)的可公开访问的数据库获得TNF配体家族成员的更多信息，特别是序列。例如，人TNF配体具有以下氨基酸序列：人淋巴毒素α(UniProt登录号P01374，SEQ ID NO:34)、人TNF(UniProt 登录号P01375，SEQ ID NO:35)、人淋巴毒素β(UniProt登录号Q06643，SEQ ID NO:36)、人OX40L(UniProt登录号P23510，SEQID NO:37)、人CD40L(UniProt 登录号P29965，SEQ ID NO:38)、人FasL(UniProt登录号P48023，SEQ ID NO:39)、人CD27L(UniProt登录号P32970，SEQ ID NO:40)、人CD30L(UniProt 登录号P32971，SEQ ID NO:41)、4-1BBL(UniProt登录号P41273，SEQ ID NO:42)、TRAIL(UniProt登录号P50591，SEQ ID NO:43)、RANKL(UniProt 登录号O14788，SEQ ID NO:44)、TWEAK(UniProt登录号O43508，SEQ ID NO:45)、APRIL(UniProt登录号O75888，SEQ IDNO:46)、BAFF(UniProt登录号Q9Y275，SEQ ID NO:47)、LIGHT(UniProt登录号O43557，SEQID NO:48)、 TL1A(UniProt登录号O95150，SEQ ID NO:49)、GITRL(UniProt登录号 Q9UNG2，SEQ ID NO:50)和外异蛋白A(UniProt登录号Q92838，SEQ ID NO:51)。
“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的结构域。胞外域通常是蛋白质中引发与表面接触的部分，导致信号转导。因此，如本文中定义的TNF配体家族成员的胞外域是指TNF配体蛋白中延伸进入细胞外空间的部分(细胞外域)，还包括负责三聚化和与相应TNF受体结合的较短部分或其片段。因此，术语“TNF配体家族成员的胞外域或其片段”是指形成细胞外域的TNF配体家族成员的细胞外域或其仍然能够与受体结合的部分(受体结合结构域)。
术语“共刺激TNF配体家族成员”或“共刺激TNF家族配体”是指能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子产生的TNF配体家族成员亚型。这些TNF家族配体可以在与其相应的TNF受体相互作用时共刺激TCR信号，并且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集，其引发导致T细胞活化的信号级联。共刺激TNF家族配体选自4-1BBL、OX40L、GITRL、CD70、CD30L 和LIGHT，更特具体地说，共刺激TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
如前文中所述，4-1BBL是II型跨膜蛋白，并且为TNF配体家族的一个成员。已经描述了在细胞表面上形成三聚体的具有氨基酸序列SEQ ID NO:42 的完整或全长4-1BBL。通过4-1BBL的胞外域的特定基序而启动三聚体形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区域”。人4-1BBL序列的氨基酸50-254(SEQ ID NO:52)形成4-1BBL的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“4-1BBL的胞外域或其片段”是指具有选自 SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254)、SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸 71-254)、SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254)和SEQ ID NO:2(人4-1BBL 的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽或具有选自SEQ ID NO:96(人4-1BBL 的氨基酸71-248)、SEQ IDNO:375(人4-1BBL的氨基酸52-248)、SEQ ID NO:374(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ IDNO:373(人4-1BBL的氨基酸 85-248)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
如前文中所述，OX40L是另一种II型跨膜蛋白，并且为TNF配体家族的另一个成员。完整或全长的人OX40L具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列。人OX40L序列的氨基酸51-183(SEQID NO:53)形成OX40L的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“OX40L的胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:53(人OX40L的氨基酸51-183)或 SEQ ID NO:54(人OX40L的氨基酸52-183)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸通常约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或描述于本文中。适合的非免疫原性接头肽例如是，(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为1至10之间的数字，通常为1至4，特别是2，即，这些肽选自GGGGS(SEQ ID NO:128)、 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:55)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:56)，但也包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:58)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:59)、 GGSGSGSG(SEQ ID NO:60)、GGSGSG(SEQ IDNO:61)、GGSG(SEQ ID NO:62)、GGSGNGSG(SEQ ID NO:63)、GGNGSGSG(SEQ ID NO:64)和GGNGSG(SEQ ID NO:65)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)1或GGGGS(SEQ ID NO:128)、(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，更具体地为(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)和 GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)。
在本申请中使用的术语“氨基酸”表示包含丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr， T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)的天然存在的羧基α-氨基酸的组。
如本文中使用的“单链融合蛋白”是指由与抗原结合模块或Fc部分的一部分融合的所述TNF配体家族成员的一个或两个胞外域组成的单链多肽。通过经由肽接头将抗原结合模块的N末端或C末端氨基酸直接与所述TNF配体家族成员的胞外域的C末端或N末端氨基酸连接，可以进行融合。
“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和所述TNF配体家族成员的胞外域) 通过肽键直接连接或经由一个或多个肽接头连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代)之后候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成了氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创作，并且源代码已在美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)与用户文件一起备案，在美国版权局以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech公司公开获得，或者可以从源代码编译。 ALIGN-2程序应当编译为供在包括数字UNIX V4.0D在内的UNIX操作系统上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且没有变化。在采用 ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列 A相对于(与、或针对)给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X为通过序列比对程序ALIGN-2在A与B的程序比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对于 B的氨基酸序列同一性％不会等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得在本文中使用的所有氨基酸序列同一性％值。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学性质。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码所述分子的核苷酸序列引入适当的修饰、或通过肽合成来制备。这些修饰包括，例如，抗体氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。取代型诱变的感兴趣部位包括HVR和框架(FR)。在表B中的标题“优选取代”下提供了保守取代，并且在下文中参照氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步加以描述。可以将氨基酸替代引入感兴趣的分子中，并筛选出具有期望活性的产物，所述活性例如保留/增强的抗原结合、降低的免疫原性、或增强的ADCC或CDC。
表B
Figure BDA0003454763770000461
Figure BDA0003454763770000471
可以根据常见的侧链性质将氨基酸分组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要将这些类之一的成员替换为另一类。
术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸替代的实质性变体。通常，经过选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗原结合分子在某些生物学特性(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)方面将具有改变(例如提高)和/ 或将具有基本上保留的亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟抗体，可以方便地例如使用例如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术来产生所述抗体。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定的生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个HVR内进行，只要这些改变基本上不降低抗原结合分子结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如本文中提供的保守取代)。用于鉴定可能被靶向诱变的抗体残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science, 244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在针对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。替代地，或另外地，抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可以作为取代候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。分子的其他插入变体包括与多肽的N末端或C末端的融合，以增加含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的血清半衰期。
在某些实施方案中，改变本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子以增加或降低抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地获得分子的糖基化变体。当含有 TNF配体三聚体的抗原结合分子包含Fc区时，附着于其上的碳水化合物可能被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角(biantennary) 寡糖，其通常通过N键与Fc区的CH2结构域的Asn297连接。参见，例如Wright 等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与在双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc附接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在含有TNF 家族配体三聚体的抗原结合分子进行寡糖修饰，以产生具有某些改良特性的变体。在一个方面，提供了具有缺乏与Fc区附接(直接或间接)的岩藻糖的碳水化合物结构的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的变体。这样的岩藻糖基化变体可具有增强的ADCC功能，参见，例如美国专利公开Nos.US2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的其他变体包括具有二等分寡糖的那些，例如，其中与Fc区附接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这些变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或增强的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。这样的抗体变体可以具有增强的CDC功能，并被描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764 (Raju,S.)中。
在某些实施方案中，可能希望产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化的变体，例如“thioMAb”，其中该分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在分子的可接近位置。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此反应性硫醇基团被定位在抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其他模块(例如药物模块或接头-药物模块)缀合以产生免疫缀合物。在某些实施方案中，任何一个或多个以下残基可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的 A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以按照例如美国专利No. 7,521,541中的描述产生半胱氨酸工程化的抗原结合分子。
在某些方面，本文中提供的含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子可进一步被修饰，以含有另外的本领域已知并且易于获得的非蛋白质模块。适用于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N- 乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而具有在制造方面的优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体附接的聚合物的数量可以变化，并且如果附接一种以上的聚合物的话，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑事项来确定，包括但不限于，待改进的抗体的特定性质或功能，是否将双特异性抗体衍生物在限定的条件下用于治疗中，等等。在另一个方面，提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体与非蛋白质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质模块是碳纳米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005) 11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞的波长，但所述波长将非蛋白质模块加热到杀死抗体-非蛋白质模块附近的细胞的温度。
在另一个方面，可以获得本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒性剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使 RNA(mRNA)、病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如，可见于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语“核酸分子”是指任何一个或多个核酸区段，例如，存在于多核苷酸中的DNA或 RNA片段。
关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，意指已经从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外的例子包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液形式的纯化的(部分地或基本上纯化的) 多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但多核苷酸分子在染色体外存在或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式以及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
关于具有至少例如与本发明的参考核苷酸序列95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指除了该多核苷酸序列可以包括至多该参考核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外，所述多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可以被缺失或被另一个核苷酸取代，或者，在参考序列中，总核苷酸的至多5％的多个核苷酸可被插入参考序列。参考序列的这些改变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，独立散布在参考序列的残基之间或在参考序列内的一个基团或多个连续的基团中。实际情况是，使用例如上面针对多肽所讨论的已知的计算机程序(例如ALIGN-2)，可以常规地确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％或99％同一性。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的，并且是指用于将与其可操作地相关联的特定基因引入靶细胞中并且指导所述特定基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。本发明的表达载体包括表达盒。表达载体允许大量稳定的mRNA的转录。一旦表达载体进入靶细胞内，则通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。宿主细胞是可用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，例如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63 小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。
药剂的“有效量”是指导致其所施用的细胞或组织的生理变化所必需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在剂量和时间段方面有效实现期望的治疗或预防结果所需的量。例如，治疗有效量的药剂消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如母牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人灵长类动物如猴子)、兔、和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。具体地说，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指其为这样的形式的制剂，所述形式允许其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且所述制剂不含另外的对该制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。
“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的，“治疗”(“treatment”)(及其语法变化例如“治疗”(“treat”) 或“治疗”(“treating”))是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，所述临床干预可用于预防或在临床病理过程中进行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状减轻、疾病的任何直接或间接病理结果的削减、预防转移、降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态、以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的分子用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文中使用的术语“癌症”是指增殖性疾病，例如淋巴瘤、癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺癌(NSCL)、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈部肿瘤、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌、乳腺癌癌症、三阴性乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊索瘤、脑干神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞癌(淋巴瘤)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病，包括任何上述癌症的难治性形式、或上述一种或多种癌症的组合。
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
本发明提供了具有特别有利的性质的含有新型TNF家族配体三聚体抗原结合分子，所述性质例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、靶向效率和降低的毒性。
在第一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a) 至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。
在另一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a) 至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中TNF配体家族成员的这些胞外域在所有情况下是相同的。
在一个另外的方面，提供了权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，
(i)第一多肽含有CH1或CL结构域，第二多肽对应地含有CL或CH1结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(ii)第一多肽含有CH3结构域，第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF 配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，或者
(iii)第一多肽含有VH-CL或VL-CH1结构域，第二多肽对应地含有 VL-CH1结构域或VH-CL结构域，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与 VH或VL连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含共刺激人T细胞活化的TNF配体家族成员，其选自4-1BBL和OX40L。更具体地说， TNF配体家族成员是4-1BBL。
在另一个方面，其中TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO: 373、SEQ ID NO:374和SEQID NO:375的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一个方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 和SEQ ID NO:96的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一个特定方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自 SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一个特定方面，第一多肽包含SEQ IDNO:97的氨基酸序列，第二多肽包含 SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列。
在又一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:184或SEQ ID NO:185的氨基酸序列。
在另一个方面，TNF配体家族成员是OX40L。在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中TNF配体家族成员的胞外域包含SEQ ID NO:53或SEQ IDNO:54的氨基酸序列，尤其是SEQ ID NO:53的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:371或SEQ ID:372的氨基酸序列，第二多肽对应地包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54 的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1或CL结构域的第一多肽和对应地含有CL或CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与 CH1或CL结构域连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CH1结构域的第一多肽和含有CL结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH1结构域连接的TNF 配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)含有CL结构域的第一多肽和含有CH1结构域的第二多肽，其中第二多肽通过CH1和CL结构域之间的二硫键与第一多肽连接，并且其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CL结构域连接的TNF 配体家族成员的两个胞外域或其片段，第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH1结构域连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在又另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)一个以上的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含经由肽接头与所述多肽连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域，第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3 结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF 配体家族成员的一个胞外域或其片段。具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，其中所述两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块与两种不同的靶细胞抗原结合。
在一个另外的方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，提供了如前文所述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块选自抗体片段、Fab分子、交换Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单结构域抗体、aVH和支架抗原结合蛋白。在一个方面，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是aVH 或支架抗原结合蛋白。在一个方面，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的支架抗原结合蛋白。
具体地说，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含一个或两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的 Fab分子或交换Fab分子。具体地说，能够与靶细胞抗原特异性结合的模块是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab。
此外，提供了如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、 CD20和CD33。
在一个另外的方面，提供了根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与重链的CH1结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CL结构域融合。
在另一个方面，提供了根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与重链的CL结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与轻链上的CH1结构域融合。
在一个另外的方面，本发明与根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的肽在其C末端通过第二肽接头与轻链的CL结构域融合，并且其中所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段在其C末端通过第三肽接头与重链的CH1结构域融合。
在一个特定方面，本发明涉及如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中肽接头是(G4S)2。在一个方面，第一肽接头为(G4S)2(SEQ ID NO:13)，第二肽接头为GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，第三肽接头为 (G4S)2(SEQ ID NO:13)。具体地说，本发明涉及如上所述的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子，其中第一肽接头为(G4S)2(SEQ ID NO:13)，第二肽接头为GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:13)，第三肽接头为(G4S)2(SEQ ID NO:13)。
在另一个方面，如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
具体地说，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a) 能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，其中Fab重链在C末端与Fc结构域中的CH2结构域的N末端融合，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域。
在一个另外的方面，Fc结构域为IgG，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc 结构域。更具体地说，Fc结构域为IgG1 Fc结构域。在一个特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基联合的修饰。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc结构域修饰
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG) 分子的Fc结构域是二聚体，其每个亚基包含IgG重链恒定结构域CH2和CH3。 Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定联合。
Fc结构域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面，该Fc基本上不与Fc受体结合和/或不诱导效应器功能。在一个特定方面，该Fc受体是 Fcγ受体。在一个方面，该Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面，该Fc受体是激活性人Fcγ受体，更具体地说是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地说是人FcγRIIIa。在一个方面，该Fc结构域不诱导效应器功能。降低的效应器功能可以包括但不限于以下一者或多者：降低的补体依赖性细胞毒性 (CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌减少、免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取减少、与NK细胞的结合减少、与巨噬细胞的结合减少、与单核细胞的结合减少、与多形核细胞的结合减少、直接信号转导诱导性细胞凋亡减少、降低的树突细胞成熟、或减少的T细胞引发。
在某些方面，可以在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置上含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列 (例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，在Fc结构域的两个亚基的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸突变。具体地说，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、N297、 P331和P329(EU编号)处的氨基酸替代。具体地说，Fc结构域包含在IgG重链的位置234和235(EU编号)和/或329(EU编号)处的氨基酸替代。更具体地说，提供了根据本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含具有在IgG重链中的氨基酸替代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸替代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸替代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，并被描述于国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中，该文献还描述了制备这种突变体Fc结构域的方法以及用于确定其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。“EU编号”是指根据Kabat等人在Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中的EU索引的编号。
具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc结构域还包含具有一个或多个Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329的取代的Fc结构域(美国专利No.6,737,056)。这样的Fc突变体包括具有在两个或多个氨基酸位置 265、269、270、297和327处的取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被替代为丙氨酸(美国专利No.7,332,581)。
在另一个方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体展现出对Fc受体的降低的结合亲和力和降低的效应器功能。在更具体的方面，Fc结构域是包含在位置S228(Kabat编号)处的氨基酸替代具体地为氨基酸替代S228P的IgG4 Fc结构域。在更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸替代 L235E和S228P和P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。这样的IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性也描述于WO 2012/130831中。
可以使用本领域熟知的遗传学或化学方法通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变体Fc结构域。遗传学方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以通过例如测序来验证正确的核苷酸变化。
可以例如通过ELISA或通过使用诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的标准仪器的表面等离子体共振(SPR)容易地确定与Fc受体的结合，并且可以例如通过重组表达获得Fc受体。适合的此类结合测定描述于本文中。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估 Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化性双特异性抗原结合分子针对Fc受体的结合亲和力。
可以通过本领域已知的方法测量Fc结构域或包含Fc结构域的本发明的双特异性抗体的效应器功能。适合的用于测量ADCC的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其他实例描述于美国专利No. 5,500,362；Hellstrom等人，Proc.NatlAcad Sci USA 83,7059-7063(1986)和 Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No. 5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者，可以采用非放射性测定方法(参见，例如ACTITM non-radioactivecytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；CytoTox
Figure BDA0003454763770000621
non-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地，或另外地，可以在体内，例如，在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。
在一些实施方案中，Fc结构域与补体成分特别是C1q的结合减少。因此，在其中将Fc结构域工程化以具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定本发明的双特异性抗体是否能够与C1q结合并因此具有CDC活性。参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和 Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。
在一个特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基联合的修饰。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段，并且第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。因此，它们包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同模块，所述亚基通常包含在两个不相同的多肽链(“重链”)中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两个多肽的若干可能的组合。为了在重组生产中提高含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的产率和纯度，因此在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域中引入促进期望多肽的联合的修饰将是有利的。
因此，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基的联合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，所述修饰具体地在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述修饰是所谓的“节入穴”修饰，包括在Fc结构域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc结构域的两个亚基的另一个中的“穴”修饰。因此，在一个特定方面，本发明涉及如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包括IgG分子，其中第一重链的Fc部分包含第一个二聚化模块，并且第二重链的Fc部分包含允许IgG分子的两条重链异二聚化的第二个二聚化模块；根据节入穴技术，第一个二聚化模块包括节，第二个二聚化模块包括穴。
“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人Prot Eng9,617-621(1996)and Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”)，使得该突起可以定位在该腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。
因此，在特定方面，在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在第一亚基的CH3结构域内产生可定位于第二亚基的CH3结构域内的腔中的突起；并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸酸残基，由此在第二亚基的CH3结构域内产生可将第一亚基的CH3结构域内的突起定位在其中的腔。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变、或通过肽合成而产生突起和腔。
在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W)，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)。更具体地说，在Fc 结构域的第二亚基中，另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基 (T366S)，将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)。更具体地说，在Fc结构域的第一亚基中，另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C)，而在Fc结构域的第二亚基中，第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步使该二聚体稳定(Carter,J Immunol Methods 248, 7-15(2001))。
在一个替代方面，促进Fc结构域的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰，例如，如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，这种方法包括通过将两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电氨基酸残基，使得在静电方面不利于同二聚体形成，但在静电方面有利于异二聚化。
CH1/CL结构域的修饰
为了进一步提高正确配对，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以包含不同的带电氨基酸替代(所谓的“带电残基”)。将这些修饰引入交叉或非交叉CH1和CL结构域中。在一个特定方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在CL结构域之一中在位置123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，其中在CH1结构域之一中在位置147(EU编号)和在位置213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。
更具体地说，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近TNF配体家族成员的CL结构域中，在位置123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，并且其中在邻近TNF配体家族成员的CH1结构域中，在位置147(EU编号)和在位置 213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。
特定的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
在另一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：
第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，第一肽，其包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第一肽在其C末端通过第二肽接头与第二重链或轻链融合，和第二肽，其包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域，所述第二肽通过第三肽接头在其C末端对应地与第二轻链或重链融合。
在一个另外的方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CH1结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其 C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CL结构域融合。
在又另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的CL结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其C 末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的CH1结构域融合。
在一个另外的方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段的第一肽在其C末端通过第二肽接头与作为重链的一部分的VH结构域融合，并且包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的第二肽在其 C末端通过第三肽接头与作为轻链的一部分的VL结构域融合。
在一个方面，本发明提供了权利要求21至23的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中在邻近TNF配体家族成员的CL结构域中，在位置 123(EU编号)的氨基酸已替换为精氨酸(R)，在位置124(EU编号)的氨基酸已替代为赖氨酸(K)，并且其中在邻近TNF配体家族成员的CH1结构域中，在位置147(EU编号)和在位置213(EU编号)的氨基酸已替代为谷氨酸(E)。这些修饰产生了具备有利特性的所谓的带电残基，以避免不希望的结果，例如错配。
此外，提供了如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是FAP
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii) 包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含 SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含 (iv)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含 SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合FAP的Fab 分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:8的氨基酸序列的 CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的 CDR-L3。
在另一个方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合FAP的Fab分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:101的氨基酸序列的 CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，能够与FAP特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一个方面，能够与FAP特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:106的氨基酸序列具有至少约95％、 96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:107的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或 100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链，或包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：由SEQ ID NO:106的氨基酸序列组成的VH结构域和由SEQ ID NO:107的氨基酸序列组成的VL结构域。
在一个另外的方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自 SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:106的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自 SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:106的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CH1结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CL结构域融合，并且其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112 和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在一个另外的特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，并且其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，并且其中所述分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
更具体地说，提供了包含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab 分子，其中所述第一重链包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域，并且所述第一轻链包含包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域，和
(b)第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的 TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，其中第二重链包含SEQ ID NO:119或SEQ ID NO:173的氨基酸序列，第二轻链包含SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:174的氨基酸序列。具体地说，第二重链包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列，第二轻链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列。
此外，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
更具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的第二轻链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的第二重链的分子；
f)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的第二轻链的分子；
g)包括包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
h)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的第二轻链的分子；
i)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
j)包括包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的第二轻链的分子；
在另一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中 TNF配体家族成员是OX40L并且其中靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白 (FAP)，并且其中能够与FAP特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:7或SEQID NO:100的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:101的氨基酸序列的 CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:102的氨基酸序列的 CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:105的氨基酸序列的 CDR-L3。
在一个特定方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:17的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:355的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:356的氨基酸序列的第二轻链。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CD19
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CD19。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:195或SEQ ID NO:252的氨基酸序列的 CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:196或SEQ ID NO:253的氨基酸序列的 CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:197或SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:198或SEQ ID NO:249的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:199或SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ IDNO:200或SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合CD19的Fab 分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的 CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ IDNO:199的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合CD19的 Fab分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL 结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:249的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQID NO:250的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面，能够与CD19特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:201的氨基酸序列具有至少约 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:202的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个另外的方面，能够与CD19特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:357的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:358的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:201 的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的可变轻链。
在一个特定方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链可变区。在另一个特定方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:201的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:201的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:357的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自 SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:357的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CH1结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CL结构域融合，并且其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112 和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在一个另外的特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，并且其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，并且其中所述分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:202的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链或包含包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含 SEQ ID NO:358的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
此外，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
更具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链，或
(iii)包含SEQ ID NO:309的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链，或
(iv)包含SEQ ID NO:313的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
在另一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:210的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:213的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:214的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:357的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CEA
在一个特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CEA。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够与CD19特异性结合的模块包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的 CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合CEA的Fab 分子并且包含VH结构域和VL结构域，所述VH结构域包含(i)包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:322的氨基酸序列的 CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的CDR-H3，所述VL结构域包含(iv)包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:325的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个另外的方面，能够与CEA特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:327的氨基酸序列具有至少约 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:328的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与CEA特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:327的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:328的氨基酸序列的可变轻链。
在一个另外的方面，能够与CEA特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:329的氨基酸序列具有至少约 95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:330的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，能够与CEA特异性结合的模块包含包括SEQ ID NO:329的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:330的氨基酸序列的可变轻链。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:329的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的氨基酸序列，第二多肽包含选自 SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，所述模块包含：包含SEQ IDNO:329的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:330的氨基酸序列的轻链可变区，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列，第二多肽包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CH1结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CL结构域融合，并且其中抗原结合分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:113的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112 和SEQID NO:114的氨基酸序列的第二轻链。
在另外的特定方面，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中抗原结合分子包含：第一重链和第一轻链，这两者构成能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子，
第二重链和第二轻链，所述第二重链包含通过第一肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，所述第二重链在其C末端通过第二肽接头与CL结构域融合，
所述第二轻链包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段，所述第二轻链在其C末端通过第三肽接头与CH1结构域融合，并且其中所述分子包含：
(i)包含包含SEQ ID NO:329的氨基酸序列的VH结构域的第一重链和包含包含SEQID NO:330的氨基酸序列的VL结构域的第一轻链，
(ii)包含选自SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链，和
(iii)包含选自SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链。
此外，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中抗原结合分子的特征在于，第一多肽含有CH3结构域并且第二多肽对应地含有CH3结构域，并且其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接并与CH3结构域的C末端连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3结构域的C末端连接的所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
在一个特定方面，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块。
更具体地说，这样的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：
(i)包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链，或
(ii)包含SEQ ID NO:341的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的第二重链，和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子选自：
a)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的第二轻链的分子；
b)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的第二轻链的分子；
c)包括包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:337的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:338的氨基酸序列的第二重链的分子；
d)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链的分子；
e)包括包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
f)包括包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的两条轻链、包含SEQ ID NO:341的氨基酸序列的第一重链、和包含SEQ ID NO:342的氨基酸序列的第二重链的分子。
具体地说，本发明提供了含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子，所述抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:333的氨基酸序列的第一重链、包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的第一轻链、包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的第二重链、和包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的第二轻链。
多核苷酸类
本发明进一步提供了编码如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸或其片段。
编码本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表述为编码整个抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其他手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由与免疫球蛋白的重链部分分开的多核苷酸编码。重链多肽将在共表达时与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。
在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文中描述的根据本发明的完整的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。具体地说，分离的多核苷酸编码包含在如本文中描述的根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的多肽。
在一个方面，本发明涉及编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段的多肽的序列。
在另一个方面，提供了编码含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的4-1BB的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含4-1BB的一个胞外域或其片段的多肽的序列。
在一个另外的方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含两个 4-1BBL片段的多肽的序列，所述两个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:96所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列，并且涉及包含编码包含一个4-1BBL片段的多肽的序列，所述一个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:96所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列。
此外，提供了编码含有OX40配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的OX40L的两个胞外域或其两个片段的多肽的序列，和(c)编码包含OX40L的一个胞外域或其片段的多肽的序列。
在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含两个 4-1BBL片段的多肽的序列，所述两个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:53或 SEQ ID NO:54所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列，并且涉及包含编码包含一个4-1BBL片段的多肽的序列，所述一个4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明涉及包含与本文中公开的特异性cDNA序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的序列的多核苷酸。在一个特定方面，本发明涉及包含与本文中公开的特异性cDNA序列之一相同的序列的多核苷酸。
在其他方面，核酸分子包含或其组成为编码在SEQ ID NO:5、6、97、 98、99、183、184或185任一者中提出的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个另外的方面，核酸分子包含或其组成为编码在SEQ ID NO:14、15、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、173或174任一者中提出的氨基酸序列的核苷酸序列。
还在其他方面，核酸分子包含或其组成为核苷酸序列SEQ ID NO:66、67、 68、69、129、130、131、132、133、134、137、138、141、142、143、144、 146、147、150、151、152、153、162、163、165、166、167、168、169、 170、171、172、175、176、177、178、203、204、207、208、211、212、215、216、273、274、277、278、281、282、285、286、289、290、293、 294、297、298、301、302、305、307、308、311、312、315、316、331、 332、335、336、339、340、343、344、347、348、353或354。
在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如呈信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。对于重组生产，分离一个或多个编码例如上文所述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸，并将其插入到一个或多个载体中用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离这样的多核苷酸并将其测序。在本发明的一个方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体，优选表达载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建包括含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如描述于Maniatis等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和 Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括将编码含有 TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即，编码区) 与启动子和/或其他转录或翻译控制元件以可操作地关联的方式克隆到其中的表达盒。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但如果存在的话，它可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。在单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如，在单独的(不同的)载体上可以存在两个或更多个编码区。此外，任何载体可以包含单个编码区，或者可以包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一个或多个多肽，其通过蛋白水解切割在翻译后或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作地关联是指这样一种方式：基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调节序列相关联以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则所述两个DNA片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，则启动子区与该核酸可操作地关联。启动子可以是仅在预定细胞中指导实质性DNA转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻抑物和转录终止信号，可与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。
本文中公开了适合的启动子和其他转录控制区。许多转录控制区是本领域中的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α珠蛋白的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括诸如复制起点的其他特征、和/或诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒 (AAV)反向末端重复序列(ITR)的染色体整合元件。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌肽或信号肽的编码区相关联，所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果希望分泌含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段，则编码信号序列的DNA可以位于编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链输出穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的N末端融合的信号肽，其被从翻译的多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用了天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽、或该序列的功能衍生物，所述衍生物保留了指导与其可操作地相关联的多肽分泌的能力。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以替代为人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列。
编码可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的一个另外的方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别掺入关于核苷酸和载体的单一或组合地在本文中描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的(一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。可以使用特定的表达载体适当地转染或转导这样的细胞，并且可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的抗原结合分子。适合的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，尤其是在不需要糖基化时，可以在细菌中产生多肽。表达后，可以从菌体糊分离出作为可溶性级分的多肽，并可将其进一步纯化。除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码多肽的载体的适合克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22, 1409-1414(2004)，和Li等人，Nat Biotech24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利 Nos.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978、和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是经SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾细胞系(例如，在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977))中描述的293 或293T细胞；仓鼠婴肾细胞(BHK)；小鼠sertoli细胞(如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞 (VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞 (BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)；TRI细胞(如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982) 中描述)；MRC 5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于适用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu, Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,HumanaPress,Totowa, NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞，人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在这些系统中表达外源基因的标准技术在本领域中是已知的。可以将表达包含免疫球蛋白重链或轻链的多肽的细胞工程化，以便也表达另一个免疫球蛋白链，使得所表达的产物是具有重链和轻链两者的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的含有TNF 家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养在本文中提供的包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段。
在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中，多个组分(能够与靶细胞抗原特异性结合的至少一个模块，一个多肽包含TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，一个多肽包含所述TNF家族配体家族成员的一个胞外域或其片段)在遗传上不彼此融合。多肽被设计成使得其组分(TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段和其他成分如CH或CL)直接地或通过接头序列彼此融合。可以根据本领域熟知的方法测定接头的组成和长度，并且可以测试其效果。本发明的抗原结合分子的不同组分之间的接头序列的实例见本文中提供的序列。如果需要的话，还可以包括另外的序列，例如内肽酶识别序列，以便组入切割位点来分离融合蛋白的各个组分。
在某些实施方案中，形成抗原结合分子的一部分的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块(例如Fab片段)至少包含能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并且自其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow 和Lane,"Antibodies,a laboratory manual",Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如美国专利No.4,186,567中所述)，或者可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库而获得(参见授予McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
任何动物物种的免疫球蛋白都可用于本发明。可用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类、或人来源的。如果预期融合蛋白用于人类使用，则可以使用免疫球蛋白的嵌合形式，其中免疫球蛋白的恒定区域来自人。还可以根据本领域熟知的方法制备免疫球蛋白的人源化或完全人形式(参见例如授予Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法来实现，包括但不限于(a)将非人(例如，供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)框架和具有或不具有关键框架残基(例如，对于保留良好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)保留的恒定区，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或 a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)移植到人框架和恒定区，或(c) 移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基用类似于人的区段将其“遮盖”。人源化抗体及其制备方法综述于，例如，Almagro和Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332, 323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)； Morrison和Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人， Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28, 489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36,43-60(2005) (描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人， Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”办法)。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体通常描述于van Dijk和van deWinkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459 (2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并且可以从其衍生(参见，例如，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区还可以通过向转基因动物施用免疫原加以制备，所述转基因动物已经被修饰以产生响应抗原攻击的完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见，例如，Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列来产生人抗体和人可变区(参见，例如，Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology 178,1-37 (O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人，Nature348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式展示抗体片段。
在某些方面，根据例如PCT公开WO 2012/020006(参见有关亲和力成熟的实例)或美国专利申请公开No.2004/0132066中公开的方法，将包含在本发明的抗原结合分子中的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块(例如Fab片段) 工程化，以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子与特异性抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如，表面等离子体共振技术(Liljeblad等人，Glyco J 17, 323-329(2000)))和传统结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。可使用竞争测定法鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位) 与参考抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子所结合的表位作图的详细的示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。在示例性竞争测定中，将固定抗原在包含与抗原结合的第一经标记的抗原结合分子和第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育，测试第二未标记的抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原的能力。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定抗原在包含第一颈标记的抗原结合分子但不包含第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育之后，除去过量未结合的抗体，并测量与固定抗原结合的标记物的量。如果在测试样品中与固定抗原结合的标记物的量相对于对照样品显著降低，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等来纯化如本文中描述制备的本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用与含有TNF配体三聚体的抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，为了本发明的融合蛋白的亲和色谱法纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以基本上如实施例中描述依次使用蛋白A或G亲和色谱法和尺寸排阻色谱法分离抗原结合分子。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种加以测定，包括凝胶电泳、高压液相色谱法等。例如，正如通过还原和非还原性SDS-PAGE证实，如通过实施例中描述表达的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子被显示为是完整且正确组装的。
测定法
可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定、筛选或通过其物理/化学性质和/或生物活性来表征在本文中提供的抗原结合分子。
1.亲和力测定
根据实施例中提出的通过表面等离子体共振(SPR)的方法，使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)、以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，可以测定在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的TNF受体的亲和力。通过表面等离子体共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)、以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，也可以测定含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与靶细胞抗原的亲和力。在实施例4中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。根据一个方面，使用
Figure BDA0003454763770000911
T100仪(GE Healthcare)通过表面等离子体共振在25℃测量KD。
2.结合测定和其他测定
例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，可以评价在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的受体表达细胞的结合。在一个方面，在结合测定中使用表达TNF受体的新鲜外周血单核细胞(PBMC)。在分离后(幼稚PMBC)或刺激后(活化的PMBC)直接使用这些细胞。在另一个方面，使用活化的小鼠脾细胞(表达TNF受体分子) 来证明本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的TNF受体表达细胞的结合。
在一个另外的方面，使用表达靶细胞抗原(例如FAP)的癌细胞系来证明抗原结合分子与靶细胞抗原的结合。
在另一个方面，可以使用竞争测定来鉴定与特异性抗体或抗原结合分子分别竞争结合靶标或TNF受体的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与特异性抗靶标抗体或特异性抗TNF受体抗体结合的相同。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。
3.活性测定
在一个方面，提供了用于鉴定与特异性靶细胞抗原和具有生物活性的特异性TNF受体结合的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的测定法。生物活性可以包括例如通过表达靶细胞抗原的细胞上的TNF受体的激动性信号转导。还提供了通过测定法鉴定为具有这样的体外生物活性的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在某些方面，测试了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的这种生物活性。用于检测本发明分子的生物活性的测定法是实施例6中所述的那些。此外，用于检测细胞裂解的测定法(例如通过测量LDH释放)、诱导的凋亡动力学(例如通过测量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用TUNEL 测定)是本领域熟知的。另外，可以通过评估复合物对各种淋巴细胞亚群如 NK细胞、NKT细胞或γδT细胞的存活、增殖和淋巴因子分泌的影响，或评估其调节抗原呈递细胞如树突细胞、单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力来评估此类复合物的生物活性。
药物组合物、制剂和给药途径
在一个另外的方面，本发明提供了包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的药物组合物，以供例如在任何下列治疗方法中使用。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种含有TNF 家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种另外的例如如下文所述的治疗剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。短语“药学的或药学上可接受的”是指在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物，即在适当施用于动物时例如人时不产生不利的、过敏的或其他不良的反应。根据本公开内容，包含至少一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，Mack PrintingCompany,1990所例示，通过提述将其并入本文。具体地说，组合物是冻干制剂或水溶液。如本文中使用的，正如本领域普通技术人员已知，“药学上可接受的赋形剂”包括溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂中任一种和全部及其组合。
肠胃外组合物包括通过注射给药而设计的那些，例如皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射。为了注射，可以将本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制在水溶液中，优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，融合蛋白在使用前可处于粉末形式以与适合的载体(例如无菌无热原水)组构。根据需要，通过将在适当溶剂中的本发明融合蛋白以所要求的量并入下文列举的多种其他成分中来制备无菌注射溶液。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和/或其他成分。在用于制备无菌注射溶液，悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，从而产生来自其先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何其他期望的成分的粉末。必要时应该适当缓冲该液体介质并且在注射之前首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。在制造和储存条件下该组合物必须是稳定的，并且保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解，内毒素污染应该最低限度地保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基) 多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可含有增加该悬液粘度的化合物，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。另外，这些活性化合物的悬液可制备为适当的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如ethyl cleats或甘油三酯)、或脂质体。
可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed.Mack Printing Company,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品的形式，例如薄膜、或微胶囊。在特定实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，可延长注射组合物的吸收。
本文中的示例性药学上可接受的赋形剂还包括诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)的间质药物分散剂，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003454763770000941
Baxter International,Inc.)。在美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rHuPH20的某些示例性的sHASEGP和使用方法。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体配制剂描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一种配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
除前述组合物之外，融合蛋白还可配制为贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此，例如，融合蛋白可以用适合的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如微溶盐。
包含本发明融合蛋白的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干过程进行制造。可以使用有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。适当的配制剂取决于所选择的给药途径。
可以将含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如由蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如盐酸或磷酸形成的那些，或与诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。与相应的游离碱形式相比，药物盐在水性溶剂和其他质子溶剂中的溶解度更高。
在被治疗的特殊适应症需要时，本文中的组合物还可含有一种以上的活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。这样的活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。
用于体内给药的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。
治疗方法和组合物
本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子均可在治疗方法中使用。
为了在治疗方法中使用，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体紊乱、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、紊乱的原因、药剂的递送部位、给药方法、给药方案、以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，提供了用作药剂的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在另外的方面，提供了在治疗疾病中使用尤其是在癌症治疗中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面，提供了在治疗方法中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面，本发明提供了在治疗患有疾病的个体的方法中使用的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述方法包括向个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。癌症的实例包括实体瘤、膀胱癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肾癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。因此，提供了在癌症治疗中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更具体地说是人。
在另一个方面，提供了用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个另外的方面，提供了用于治疗自身免疫病例如狼疮病的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在一个方面，提供了根据本发明的用于治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳腺癌、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌(PAC)、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC) 和间皮瘤的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原为 FAP。
在一个另外的方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂中的用途。在一个方面，所述药剂用于在治疗疾病的方法中使用，所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药剂。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性紊乱，具体地是癌症。因此，在一个方面，本发明涉及本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症的药剂中的用途。癌症的实例包括实体瘤、膀胱癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肾癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。可以使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进行治疗的其他细胞增殖紊乱包括但不限于位于腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾脏、胸部、和泌尿生殖系统的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员可以认识到，在一些情况下，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可能不能提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些方面，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此，在一些方面，提供生理变化的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。
在一个另外的方面，本发明涉及如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染或治疗自身免疫病例如狼疮病的药剂中的用途。
在一个另外的方面，本发明提供了治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面，向所述个体施用呈药学上可接受的形式的包含本发明融合蛋白的组合物。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性紊乱。在一个特定方面，该疾病是癌症。在另一个方面，该疾病是感染性疾病或自身免疫病。在某些方面，该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如果待治疗的疾病是癌症，则为抗癌剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选人。
为了预防或治疗疾病，本发明的含有TNF家族配体三聚体抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、给药途径、患者的体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和病程、给予融合蛋白是用于预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床病史、和对融合蛋白的反应、和主治医师的决定。在任何情况下，负责给药的医师将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文中考虑到各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药、推注给药和脉冲输注。
一次性地或以一系列治疗的方式适当地向患者施用含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15 mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或多次分开给药，还是通过连续输注。取决于上面提到的因素，一个典型的日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于数天或更长时间的反复给药，根据病情，治疗通常将持续到出现期望的疾病症状的抑制时为止。融合蛋白的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他实例中，剂量还可以包含每次给药从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约 50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg 体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重、至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在本文中所列数字的可推导范围的实例中，可以基于上述数字以约5mg/kg体重至约100 mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等范围进行施用。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周一次(例如使得患者接受约2个至约20个，或例如约6个剂量的融合蛋白)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测这种疗法的进展。
通常以有效实现预期目的的量使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。为了用于治疗或预防疾病状况，以治疗有效量施用或应用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在根据本文中提供的详细公开内容的情况下。
对于全身给药，可以根据体外测定法(例如细胞培养物测定法)初步估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC50在内的循环浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人的剂量。
也可以使用本领域熟知的技术根据体内数据(例如，动物模型)估计初始剂量。根据动物数据，本领域普通技术人员可以容易地优化对人的给药。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的血浆水平。通常注射给药的患者剂量通常为约0.1 至50mg/kg/天，一般为约0.5至1mg/kg/天。可以通过每天施用多个剂量来实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部给药或选择性吸收的情况下，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。
本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定融合蛋白的毒性和治疗效果。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，它可以被表示为比率LD50/ED50。表现出较大治疗指数的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中，根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适合于在人类中使用的剂量范围中加以使用。剂量优选地处在循环浓度范围内，其包括具有很小或没有毒性的ED50。取决于多种因素，例如采用的剂型、所用给药途径、受试者的状况等，剂量可以在这个范围内变化。考虑到患者的状况，个体医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量(参见，例如Fingl等人，1975,in:The Pharmacological Basis ofTherapeutics, Ch.1,p.1，通过提述将其完整并入本文)。
用本发明的融合蛋白治疗患者的主治医师知道如何并且何时由于毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调整给药。相反，如果临床反应不足(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在感兴趣紊乱的管理中，施用剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、给药途径等而变化。可以例如部分地通过标准预后评价方法来评价病症的严重程度。此外，剂量和剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。
其他药剂和治疗
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其他药剂联合给药。例如，本发明融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。术语“治疗剂”涵盖可用于治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这种另外的治疗剂可包含任何适合于被治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。在某些实施方案中，另外的治疗剂是另一种抗癌剂。
此类其他药剂以对预期目的有效的量适当地组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量、紊乱或治疗的类型、以及以上讨论的其他因素。通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以在经验/临床上确定为适当的任何剂量并通过任何途径使用含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
上述此类联合疗法涵盖联合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在同一个或分开的组合物中)和分开给药，在分开给药的情况下，本发明的含有TNF 家族配体三聚体的抗原结合分子的给药可以发生在给予另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后。
制品
在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述紊乱的物质的制品。制品包括容器和标签或在容器上或与容器相关联的包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器容纳组合物本身或连同另一种有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。
标签或包装说明书指示该组合物用于治疗选择的病症。而且，制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的含有TNF 配体三聚体的抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性治疗剂或其他治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装说明书。
替代地或另外，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括立足于商业和用户立场所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表C(序列)：
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关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见：Kabat,E.A. 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗体链的氨基酸根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))根据EU编号系统如上文定义进行编号和参考。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，根据上面提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook等人在Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York,1989中所述。按照制造商的说明使用分子生物试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见：Kabat,E.A.等人，(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Ed.,NIH公开No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
使用适当的模板通过PCR生成或由Geneart AG(Regensburg,Germany)从合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动基因合成来合成期望的基因区段。在没有可用的确切基因序列的情况下，基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从源自适当组织的RNA分离基因。将侧翼为单个限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化质粒DNA，并通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有适合的限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到对应的表达载体中。所有构建体均被设计为具有编码前导肽的5'端 DNA序列，所述前导肽靶向在真核细胞中分泌的蛋白质。
细胞培养技术
使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(eds.),John Wiley& Sons,Inc.中所述的标准细胞培养技术。
蛋白质纯化
参考标准方案，从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体应用于蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8实现抗体的洗脱，然后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS或在20mM组氨酸、150mM NaCl(pH 6.0)中从单体抗体分离聚集的蛋白质。合并单体抗体级分，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)离心浓缩机进行浓缩(如果需要的话)，在-20℃或-80℃冷冻并储存。提供部分样品用于随后例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱法(SEC)或质谱法进行蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
Figure BDA0003454763770001221
Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。具体地说，使用10％或4-12％的
Figure BDA0003454763770001231
Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和
Figure BDA0003454763770001232
MES(还原凝胶，具有
Figure BDA0003454763770001233
抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或 MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
分析尺寸排阻色谱法
通过HPLC色谱法进行尺寸排阻色谱法(SEC)，用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之，将蛋白A纯化的抗体应用于在Agilent HPLC 1100系统上的 300mM NaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4(pH 7.5)中的Tosoh TSKgel G3000SW 柱上，或者在Dionex HPLC系统上的2xPBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。通过UV吸光度和峰面积的积分将洗脱的蛋白质定量。以 BioRad凝胶过滤标准151-1901作为标准。
质谱法
本节描述了具有VH/VL交换(VH/VL CrossMabs)的多特异性抗体的表征，重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整CrossMabs和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/限制性LysC消化的CrossMabs的电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析预期的一级结构。
在37℃、以1mg/ml的蛋白质浓度将VH/VL CrossMabs用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F进行去糖基化达17个小时。用Tris缓冲液(pH 8)中的 100μg去糖基化的VH/VLCrossMabs，分别在室温下进行120小时和在37℃、进行40分钟的纤溶酶或限制性LysC(Roche)消化。在进行质谱分析之前，将样品通过HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在装备有TriVersa NanoMate来源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(BrukerDaltonik)上，通过ESI-MS测定总质量。
使用表面等离子体共振(SPR)(BIACORE)测定多特异性抗体与相应抗原的结合以及结合亲和力
使用BIACORE仪(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)，通过表面等离子体共振来研究所生成的抗体与相应抗原的结合。简言之，为了亲和力测量，将山羊抗人IgG，JIR 109-005-098抗体通过胺偶联固定在CM5芯片上，以显现针对相应抗原的抗体。在25℃(或者37℃)的HBS缓冲液 (HBS-P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％吐温20，pH 7.4))中测量结合。加入不同浓度的抗原(R&D Systems或内部纯化的)溶液。通过80秒至3分钟的抗原注射来测量结合；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量解离，并且使用1:1Langmuir结合模型估计KD值。从样品曲线中减去阴性对照数据 (例如缓冲液曲线)，以便校正系统固有的基线漂移和校正噪声信号降低。使用相应的Biacore评估软件进行传感图的分析和亲和力数据的计算。
实施例1
1.1靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P41273序列(SEQ ID NO:42)，合成了编码人4-1BB 配体的胞外域部分(氨基酸71-254、52-254和80-254)的DNA序列的不同片段。
关于组装含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的组分，克隆了包含被 (G4S)2接头分开并与人IgG1-CH1或CL结构域融合的4-1BB配体的两个胞外域的多肽，如图1A中描绘的(人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、 (G4S)2接头、人CH1或CL)，或如图1C中描绘的(人CH3、(G4S)2接头、人 4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体)。
克隆了包含4-1BB配体的一个胞外域并与人IgG1-CL或CH1结构域融合的多肽，如图1B中描绘的(人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL或CH1)，或如图1D中描绘的(人CH3、(G4S)2接头、人4-1BB配体)。
将多肽与人IgG1重链CH2和CH3结构域以及任选的肽接头进行框内亚克隆，例如对于构建体1，使用接头SEQ ID NO:13的(G4S)2或SEQ ID NO:57的(GSPGSSSSGS)，将编码与人CH1结构域融合的二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)特异的结合剂(即28H1)的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链(Carter,J.Immunol.Methods(2001), 248,7-15)或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
表1总结了所产生的构建体的特征。构建体1至10在以下方面不同：其几何形状、FAP的效价、4-1BB配体胞外域、CH1和CL结构域的交换 (CrossMab技术)、在CH1和CL结构域中的突变以及包含4-1BB配体的一个胞外域的多肽(单体4-1BBL链)中的不同肽接头。
表1：产生的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子(FAP分拆的4-1BBL 三聚体)的特征
Figure BDA0003454763770001251
为了避免错配，在大多数构建体中，一对CH1和CL结构域被彼此替换 (结构域交换)，如WO 2009/080253 A1中所述。
为了进一步提高正确的配对，在交叉或非交叉的CH1和CL结构域中引入不同的带电氨基酸替代，作为构建体2至4和6至10中的带电残基。在人CL结构域中引入突变E123R和Q124K，而将突变K147E和K213E克隆到人CH1结构域中。
对于所有构建体，使用了节入穴异源二聚化技术，其中在节链的CH3 结构域中具有S354C/T366W突变，并在穴链的CH3结构域中具有相应的 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15 (2001))。
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
例如，在构建体1中，在第一CH3结构域中含有S354C/T366W突变的配体-Fc节链与在第二CH3结构域中含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的 4-1BB配体和结合FAP的Fab(图2，曲线图1.1)。
表2显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体1.1)的cDNA和氨基酸序列。
表2：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.1的序列
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表3显示了具有CH1-CL交换和带电残基的单价的FAP靶向的含有4-1BB 配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体1.2)的cDNA和氨基酸序列。
表3：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.2的序列
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表4显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.3(FAP分拆三聚体，其具有在抗FAP Fab中的CH1-CL交换和在含 4-1BBL链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表4：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.3的序列
Figure BDA0003454763770001382
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表5显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.4(FAP分拆三聚体，其具有抗FAP、与CH1-节链融合的单体4-1BB 配体和在含4-1BBL链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表5：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.4的序列
Figure BDA0003454763770001452
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表6显示了二价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.5(FAP分拆三聚体，其具有2个抗FAP、分别在每条重链的C末端融合的二聚体和单体的4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表6：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.5的序列
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Figure BDA0003454763770001571
表7显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.6(FAP分拆三聚体，其具有抗FAP、经由(G4S)接头与CL*融合的单体4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表7：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.6的序列
Figure BDA0003454763770001572
Figure BDA0003454763770001581
Figure BDA0003454763770001591
表8显示了二价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体7(FAP分拆三聚体，其具有在Fc穴链的N末端上的抗FAP双抗、与 4-1BBL配体融合的在交叉CH1和CL上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表8：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.7的序列
Figure BDA0003454763770001592
Figure BDA0003454763770001601
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Figure BDA0003454763770001621
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表9显示了二价的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体1.8(FAP分拆三聚体，其具有与抗FAP CrossFab融合的4-1BB配体，具有在节链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表9：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.8的序列
Figure BDA0003454763770001632
Figure BDA0003454763770001641
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Figure BDA0003454763770001681
Figure BDA0003454763770001691
表10显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体(52-254)三聚体的Fc(kih) 融合分子构建体1.9(FAP分拆三聚体，其具有4-1BB胞外域氨基酸52-254和在配体链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表10：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 1.9的序列
Figure BDA0003454763770001692
Figure BDA0003454763770001701
Figure BDA0003454763770001711
Figure BDA0003454763770001721
Figure BDA0003454763770001731
Figure BDA0003454763770001741
表11显示了单价的FAP靶向的含有4-1BB配体(80-254)三聚体的Fc(kih) 融合分子构建体1.10(FAP分拆三聚体，其具有4-1BB胞外域氨基酸80-254和在配体链上的带电残基)的cDNA和氨基酸序列。
表11：FAP靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子构建体 10的序列
Figure BDA0003454763770001742
Figure BDA0003454763770001751
Figure BDA0003454763770001761
Figure BDA0003454763770001771
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1.2 FAP(28H1)靶向的分拆三聚体4-1BB配体Fc融合构建体的产生
将靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。对于构建体1、2、 3、4、6、7、8、9、10，用1:1:1:1比率的相应表达载体(例如“二聚体配体-(CH1 或CL)-节链载体”:“单体配体融合(CL或CH1)载体”:“抗FAP Fab穴重链载体”:“抗FAP轻链载体”)转染细胞。对于二价构建体5，使用1:1:1的比率(“穴重链载体”:“节重链载体”:“抗FAP轻链载体”)。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA 细胞。为了转染，细胞在210xg下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总 DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5 g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后1 天，加入12％的补料7和葡萄糖(终浓度3g/L)。培养7天后，通过在400xg下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.5)平衡的 MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少 6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、 100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度 (OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用 CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过 SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的纯度和分子量。使用在 25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v) NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱 (Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表12总结了FAP靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表12：FAP(28H1)靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的生物化学分析
Figure BDA0003454763770001801
1.3靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
与靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子相似，制备了鼠FAP靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子。
根据Uniprot数据库的Q3U1Z9-1序列(SEQ ID NO:70)，合成了编码鼠4-1BB配体的胞外域部分(氨基酸104-309)的DNA序列。对于构建M.1，通过标准PCR方法将位置137、160和246的半胱氨酸突变为丝氨酸，而对于构建体M.2，将位置160的半胱氨酸突变为丝氨酸(C160S)。
按照人4-1BBL所述组装鼠配体，如图3A和3B描绘。将由(G4S)2接头分开的二聚体4-1BBL与鼠IgG1-CL结构域融合(图3A)，并将单体4-1BBL 与鼠IgG1-CH结构域融合(图3B)。将与鼠CL结构域融合的编码二聚体 4-1BB配体的多肽与鼠IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆来构造构建体，如图3C描绘。
对于鼠构建体，将突变Lys392Asp和Lys409Asp(DD)引入到含有鼠 4-1BBL的重链中，并且将突变Glu356Lys和Asp399Lys(KK)引入到含有抗FAP Fab的重链中，从而获得不对称分子(Gunasekaran K.等人，J Biol.Chem.,2010, Jun 18；285(25):19637-46)。
将突变Asp265Ala和Pro329Gly(DAPG)引入到重链的恒定区中以消除与 Fcγ受体的结合。
表13分别显示了FAP靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体M.1的cDNA和氨基酸序列。
表13：FAP靶向的鼠构建体M.1的序列
Figure BDA0003454763770001811
Figure BDA0003454763770001821
Figure BDA0003454763770001831
Figure BDA0003454763770001841
Figure BDA0003454763770001851
Figure BDA0003454763770001861
Figure BDA0003454763770001871
Figure BDA0003454763770001881
Figure BDA0003454763770001891
表14分别显示了非靶向的(DP47)含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子对照M.1的cDNA和氨基酸序列。
表14：非靶向的鼠对照M.1的序列
Figure BDA0003454763770001892
Figure BDA0003454763770001901
Figure BDA0003454763770001911
Figure BDA0003454763770001921
表15显示了FAP靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体M.2的cDNA和氨基酸序列。
表15：FAP靶向的鼠构建体M.2的序列
Figure BDA0003454763770001922
Figure BDA0003454763770001931
Figure BDA0003454763770001941
Figure BDA0003454763770001951
Figure BDA0003454763770001961
Figure BDA0003454763770001971
表16显示了DP47非靶向的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体对照M.2的cDNA和氨基酸序列。
表16：FAP靶向的鼠对照M.2的序列
Figure BDA0003454763770001972
Figure BDA0003454763770001981
如前文中对于人4-1BBL构建体的描述，产生和纯化含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子。
表17总结了FAP靶向的和非靶向的含有鼠4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表17：FAP靶向的和非靶向的含有鼠4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的产生的总结。
Figure BDA0003454763770001982
1.4非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备和纯化
如上对于FAP靶向的构建体1和2所述制备了对照分子，唯一的区别是抗 FAP结合剂(VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照。对照是非靶向的单价的分拆三聚体人4-1BB配体Fc(kih)(对照A，图5A)，对于对照B，构建体还含有具有带电残基的CH-CL交换(图5B)。将FAP结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区用种系对照(DP47)的可变区替换，并与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
如上文对于FAP靶向的构建体的描述，产生非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。用1:1:1:1比率的相应表达载体(“二聚体配体-CH1或CL*-节链载体”:“单体配体融合-CL或CH1*载体”:“DP47 Fab穴链载体”:“DP47轻链载体”)转染细胞。
表18分别显示了DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子对照A的cDNA和氨基酸序列。
表18：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体)对照A的序列
Figure BDA0003454763770001991
Figure BDA0003454763770002001
Figure BDA0003454763770002011
Figure BDA0003454763770002021
表19显示了DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列，所述抗原结合分子具有CH4-CL交换和在含有4-1BB配体的臂中的带电残基(对照B)。
表19：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47分拆的4-1BBL三聚体)对照B的序列
Figure BDA0003454763770002022
Figure BDA0003454763770002031
表20总结了DP47非靶向的含有4-1BB三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表20：DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照分子)的生产特征。
Figure BDA0003454763770002032
实施例2
2.1 FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P41273序列(SEQ ID NO:42)，合成了编码人4-1BB 配体的胞外域部分(氨基酸71-254和71-248)的DNA序列的不同片段。
2.1.1具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体 2.1)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。
将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
使用接头(G4S)2或备选(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链 CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，将突变K147E和K213E克隆到人CH1结构域中。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
对于所有构建体，使用了节入穴异源二聚化技术，其中在节链中具有 S354C/T366W突变，并在穴链中具有相应的Y349C/T366S/L368A/Y407V突变。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP 的Fab(图4，构建体2.1)。
表21显示了含有CH1-CL交换和带电残基的单价的FAP(4B9)-人4-1BB 配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.1)的cDNA和氨基酸序列。
表21：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建体2.1的序列
Figure BDA0003454763770002051
Figure BDA0003454763770002061
Figure BDA0003454763770002071
Figure BDA0003454763770002081
2.1.2具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体 2.2)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。
将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
使用接头(G4S)2或备选地(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链 CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合(WO 2012/130831)。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP 的Fab(图4，构建体2.2)。
表22显示了无带电残基的含有CH1-CL交换的单价的FAP(4B9)-人 4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.2)的cDNA和氨基酸序列。
表22：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建体2.2的序列
Figure BDA0003454763770002091
Figure BDA0003454763770002101
Figure BDA0003454763770002111
Figure BDA0003454763770002121
Figure BDA0003454763770002131
Figure BDA0003454763770002141
2.1.3二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih) 融合抗原结合分子(构建体2.3)的制备，所述抗原结合分子在每条重链的C末端具有二聚体和单体的4-1BB配体
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图1C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254) 的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图1D描述：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
使用(G4S)2接头，在穴(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2 和CH3结构域的C末端将编码二聚体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。使用(G4S)2接头，在节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和 CH3结构域的C末端将编码单体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节、或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和 Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗FAP huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗FAP huIgG1节单体配体链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合 FAP的Fab(图4，构建体2.3)。
表23显示了二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih) 融合分子构建体2.3(FAP分拆三聚体，其具有2个抗FAP、分别在每条重链的C末端融合的二聚体和单体的4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表23：二价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子构建体2.3的序列
Figure BDA0003454763770002142
Figure BDA0003454763770002151
Figure BDA0003454763770002161
Figure BDA0003454763770002171
Figure BDA0003454763770002181
Figure BDA0003454763770002191
Figure BDA0003454763770002201
Figure BDA0003454763770002211
2.1.4具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体 2.4)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人 4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
使用接头(G4S)2或备选地(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链 CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL 中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R 和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和 Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP 的Fab(图4，构建体2.4)。
表24显示了具有带电残基的含有CH1-CL交换的单价的FAP(4B9)-人 4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.4)的cDNA和氨基酸序列。
表24：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建体2.4的序列
Figure BDA0003454763770002221
Figure BDA0003454763770002231
Figure BDA0003454763770002241
Figure BDA0003454763770002251
Figure BDA0003454763770002261
2.1.5具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体 2.5)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图1B描述：人 4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
使用接头(G4S)2或备选地(GSPGSSSSGS)，将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链 CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和 Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合FAP 的Fab(图4，构建体2.5)。
表25显示了无带电残基的含有CH1-CL交换的单价的FAP(4B9)-人 4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体2.5)的cDNA和氨基酸序列。
表25：单价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建体2.5的序列
Figure BDA0003454763770002271
Figure BDA0003454763770002281
Figure BDA0003454763770002291
Figure BDA0003454763770002301
Figure BDA0003454763770002311
Figure BDA0003454763770002321
2.1.6二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih) 融合抗原结合分子(构建体2.6)的制备，所述抗原结合分子在每条重链的C末端具有二聚体和单体的4-1BB配体
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图1C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-248) 的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图1D描述：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
使用(G4S)2接头，在穴(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2 和CH3结构域的C末端将编码二聚体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。使用(G4S)2接头，在节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和 CH3结构域的C末端将编码单体4-1BB配体的多肽进行框内亚克隆。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节、或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和 Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗FAP huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗FAP huIgG1节单体配体链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合 FAP的Fab(图4，构建体2.6)。
表26显示了二价的FAP(4B9)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih) 融合分子构建体2.6(FAP分拆三聚体，其具有2个抗FAP、分别在每条重链的C末端融合的二聚体和单体的4-1BB配体)的cDNA和氨基酸序列。
表26：二价的FAP(4B9)靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子构建体2.6的序列
Figure BDA0003454763770002331
Figure BDA0003454763770002341
Figure BDA0003454763770002351
Figure BDA0003454763770002361
Figure BDA0003454763770002371
Figure BDA0003454763770002381
Figure BDA0003454763770002391
2.2非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备
如上述实施例1.4对于对照A和B所述制备另外的对照分子。类似于二价构建体2.3和2.6制备二价变体对照C，类似于构建体2.5(含有4-1BB配体(71-248)三聚体)制备单价变体对照物E，唯一不同之处在于，抗FAP结合剂(VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照。
表27显示了二价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)融合分子对照C的cDNA和氨基酸序列。表28显示了单价的 DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合分子对照E的 cDNA和氨基酸序列。
表27：二价的DP47非靶向的含有人4-1BB配体(71-254)的Fc(kih)融合分子对照C的序列
Figure BDA0003454763770002392
Figure BDA0003454763770002401
Figure BDA0003454763770002411
Figure BDA0003454763770002421
Figure BDA0003454763770002431
Figure BDA0003454763770002441
Figure BDA0003454763770002451
Figure BDA0003454763770002461
表28：单价的非靶向的含有人4-1BB配体(71-248)的Fc(kih)融合分子对照E的序列
Figure BDA0003454763770002462
2.3作为对照F的非靶向人IgG1的制备
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831中描述的方法，在测定法中使用的另外的对照分子为非靶向的DP47、种系对照、含有Pro329Gly、 Leu234Ala和Leu235Ala突变的人IgG1，以消除与Fcγ受体的结合。
表29显示了非靶向的DP47 huIgG1 PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列。
表29：非靶向的DP47 huIgG1(对照F)的序列
Figure BDA0003454763770002471
Figure BDA0003454763770002481
Figure BDA0003454763770002491
2.4单价和二价的FAP(28H1)靶向的分拆三聚体4-1BB配体Fc融合构建体和对照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物。用相应的表达载体转染细胞。对于构建体2.1、2.2、2.4和2.5以及相应的对照分子，使用1:1:1:1的比率(例如“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合CH1载体”:“抗FAP Fab穴链载体“:”抗FAP轻链载体“)。对于构建体2.3和2.6及其对照分子，采取1:1:1 的比率(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗FAP轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA 细胞。为了转染，细胞在210xg下离心10分钟，并将上清液替换为20mL 预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg 的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L- 谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24 小时。转染后1天，加入12％的补料7和葡萄糖(终浓度3g/L)。培养7天后，通过在至少400xg下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm 过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化靶向和非靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子和人IgG1，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20 mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelectSure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液 (pH3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20 的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇) 并用CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过 SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3 的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh) 在25℃分析样品的聚集物含量。
表30总结了FAP(4B9)靶向和非靶向的含有4-1BB配体三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子和对照分子的产率和最终单体含量。
表30FAP(4B9)靶向和非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子和对照分子的生物化学分析
Figure BDA0003454763770002502
Figure BDA0003454763770002511
实施例3
4-1BB的制备、纯化和表征
将编码人、小鼠或食蟹猴4-1BB(表31)的胞外域的DNA序列与节上的人 IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant et al.,1998)。在抗原胞外域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。将用于定向生物素化的 Avi标签引入抗原-Fc节的C末端。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链的组合允许产生异二聚体，其包括单拷贝的含有4-1BB胞外域的链，从而产生单体形式的Fc连接的抗原(图 5C)。表32显示了抗原Fc融合构建体的cDNA和氨基酸序列。
表31：抗原胞外域(ECD)的氨基酸编号及其起源
SEQ ID NO: 构建体 起源 ECD
83 人4-1BB ECD 根据Q07011合成 aa 24-186
84 食蟹猴4-1BB ECD 从食蟹猴血中分离 aa 24-186
85 鼠4-1BB ECD 根据P20334合成 aa 24-187
表32：单体抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770002512
Figure BDA0003454763770002521
Figure BDA0003454763770002531
Figure BDA0003454763770002541
Figure BDA0003454763770002551
Figure BDA0003454763770002561
Figure BDA0003454763770002571
Figure BDA0003454763770002581
将所有4-1BB-Fc-融合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA 信号序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
为了制备生物素化的单体抗原/Fc融合分子，用编码融合蛋白的两种成分 (节链和穴链)的三个载体以及生物素化反应所必需的酶BirA共转染指数生长的悬液HEK293EBNA细胞。以2:1:0.05的比率使用相应的载体(“抗原 ECD-AcTEV-Fc节”:“Fc穴”:“BirA”)。
为了在500ml摇瓶中生产蛋白质，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。将表达载体重悬于含有200μg载体DNA的20mL的CD CHO培养基中。加入540μL聚乙稀亚胺(PEI)后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17 培养基，将细胞培养24小时。该生产培养基补充有5μM几夫碱(kifunensine)。转染后1天，向培养物中加入1mM丙戊酸和7％的含有补充剂的补料1。培养 7天后，通过将细胞在210g下离心15分钟收集细胞上清液。将溶液无菌过滤 (0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用40mL的20mM 磷酸钠、20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.5)平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL, GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的含有20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠的缓冲液(pH7.5)洗涤除去未结合蛋白质。使用在20个柱体积的20mM柠檬酸钠、0.01％(v/v)吐温20(pH 3.0)上产生的氯化钠的线性 pH梯度(0至500mM)洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20(pH 3.0)洗涤。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
为了测定人受体的亲和力，还将人4-1BB的胞外域与 avi(GLNDIFEAQKIEWHE)和六组氨酸标签进行框内亚克隆。
如上对Fc融合蛋白所描述进行蛋白质生产。通过螯合色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。第一个色谱步骤在20 mM磷酸钠、500nM氯化钠(pH7.4)中平衡的NiNTA Superflow Cartridge(5ml, Qiagen)上进行。通过施加超过12个柱体积的5％到45％梯度的洗脱缓冲液(20 mM磷酸钠、500nM氯化钠、500mM咪唑，pH7.4)的洗脱缓冲液进行洗脱。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 75柱(GE Healthcare)上 (表33)。
表33：单体人4-1BB His分子的序列
Figure BDA0003454763770002591
Figure BDA0003454763770002601
实施例4
通过表面等离子体共振对FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物化学表征
通过表面等离子体共振(SPR)评估FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子与重组4-1BB的结合所有SPR实验均在25℃、在Biacore T100上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、 0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore, Freiburg/Germany)。
如下所述测定FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与重组4-1BB(人、食蟹猴和鼠)之间的相互作用的亲合力。数据表明，靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子以及DP47 非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子两者都与人和食蟹猴4-1BB具有相当的亲合力，但与鼠同源物的亲合力可忽略不计。
使用标准偶联指导(Biacore,Freiburg/Germany)将重组生物素化的人、食蟹猴和鼠4-1BB Fc(kih)融合分子直接偶联在SA芯片上。固定化水平为约30 RU。使FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子或DP47 非靶向的对照以0.39至200nM的浓度范围以30μL/分钟的流速经120秒通过流动池。监测解离180秒。通过减去在空的参考流动池上获得的响应来校正本体折射率的差异。
对于亲和力测量，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，在pH 5.0的 CM5芯片上进行约7200个共振单位(RU)的抗人Fc特异性抗体的直接偶联。在流动池2上以30μl/min的流速捕获50nM的FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。使人4-1BB-avi-His的稀释系列(1.95至 1000nM)以30μl/min在两个流动池上通过180秒来记录结合相。监测解离相 180秒，并通过从样品溶液切换到HBS-EP进行触发。在每次循环后，使用10 mM甘氨酸-盐酸(pH 2.1)双重注射60秒使芯片表面再生。通过减去在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率的差异。对于含有4-1BB配体三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子与hu4-1BB avi His之间的相互作用，通过使用 Biaeval软件(GEHealthcare)拟合至1:1Langmuir结合曲线，从速率常数推导出亲和常数。
表34：与1:1Langmuir结合的拟合和亲和常数
Figure BDA0003454763770002611
实施例5
靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
5.1.FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在幼稚的人PBMC与活化的人PBMC上的结合
从Zürich献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC)，用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies，目录号14190 326) 稀释血沉棕黄层。向50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)中提供15mL Histopaque 1077(SIGMA LifeScience，目录号10771、聚蔗糖和泛影酸钠，调节至1.077g/mL密度)并且使该稀释的血沉棕黄层溶液在Histopaque 1077上分层。离心管在400xg下离心30分钟。然后从界面收集PBMC，用DPBS洗涤三次，重悬于由RPMI 1640培养基(Gibco by Life Technology，目录号 42401-042)组成的T细胞培养基中，所述RPMI 1640培养基补充有10％胎牛血清(FBS,Gibco byLife Technology,目录号16000-044，批号941273，γ照射的，无支原体且在56℃热灭活35分钟)、1％(v/v)GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies，目录号35050 038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA，目录号S8636)、 1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA，目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇 (SIGMA，M3148)。
PBMC在分离后直接加以使用或刺激，以便通过在6孔组织培养板中补充有200U/mL普留净(Proleukin)(Novartis Pharma Schweiz AG, CHCLB-P-476-700-10340)和2μg/mLPHA-L(SIGMA目录号L2769)的T细胞培养基中培养4天，然后在37℃和5％CO2下在包被有10ug/mL抗人CD3(克隆OKT3，BioLegend，目录号317315)和2μg/mL抗人CD28(克隆CD28.2，BioLegend，目录号302928)的6孔组织培养板中的T细胞培养基中培养1天而诱导4-1BB在T和NK细胞的细胞表面表达。
为了确定含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子与人PBMC的结合，将0.1x106个幼稚的或活化的PBMC加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔中。将培养板在400xg下在4℃离心 4分钟。弃去上清液。然后，将细胞在含有1:1000稀释的用于UV激发的 LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit(LifeTechnologies,Molecular Probes,L-23105)或Fixable Viability Dye eF660(eBioscience 65-0864-18)或 LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit(LifeTechnologies,Molecular Probes,L-23101)的100μL/孔DPBS中在4℃、在黑暗中染色30分钟。如果使用 DAPI作为Live/Death染料，可以跳过这个步骤。用200μL的冷FACS缓冲液(补充有2％(v/v)FBS、5mM EDTA pH8(Amresco，目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-AldrichS2002)的DPBS)将细胞洗涤一次。
然后，加入50μL/孔的含有不同滴定浓度的含4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的4℃冷FACS缓冲液，将细胞在4℃、温育120分钟，用200μL/孔的4℃的FACS缓冲液洗涤四次并重悬。将细胞用50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液进一步染色，所述FACS缓冲液含有0.67μg/mL抗人CD3-PerCP-Cy5.5(克隆 UCHT1，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号300430)或0.16μL抗人 CD3-PE/Cy7(克隆SP34-2，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号557749，批号33324597)、0.67μg/mL抗人CD45-AF488(克隆HI30，小鼠IgG1κ， BioLegend，目录号304017)或0.12μg/mL抗人CD56-FITC(克隆NCAM16.2，小鼠IgG2bκ，BD Pharmingen，目录号345811)或1μL抗人CD56-APC(克隆B159，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号555518，批号3098894)、0.25μg/mL抗人CD4-BV421(克隆RPA-T4，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号300532)或 0.23μg/mL抗人CD4-BV421(克隆OKT4，小鼠IgG2bκ，BioLegend，目录-号 317434)、0.25μL抗人CD8a-APC(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号555369)或0.67μL抗人CD8a-APC/Cy7(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ， BioLegend，目录号301016)或0.83ng/mL抗人CD8a-BV711(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BD Pharmingen，目录号301044)和5μg/mLPE缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊IgG F(ab)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109 116 098或109116 170)。用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。如果细胞用可固定活力染料染色，则用含有1％甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)的50μL/孔的 DPBS固定细胞。将细胞重悬于FACS缓冲液中，并在次日或当日使用5激光 LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)或3激光MiltenyiQuant Analyzer 10 (Mitenyi Biotec)和Flow Jo(FlowJo X 10.0.7)收获细胞。如果使用DAPI染色来检测死细胞，则将细胞重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的80μL/孔FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图6所示，FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子不与静息的人CD4+T细胞结合，并且显示没有可检测到的与静息的 CD8+T细胞和NK细胞的结合。相比之下，两种构建体都与活化的NK、CD8+ 或CD4+T细胞强烈结合，不过相对于NK细胞后者表现出低约10倍的特异性荧光强度，相对于CD8+T细胞后者表现出20倍的特异性荧光强度降低。
图7A和7B分别显示了在实施例1中制备的构建体1.1至1.10在表达4-1BB 的活化的人CD3+CD8+T细胞和表达4-1BB的活化的人CD3+CD4+T细胞上的结合。表35显示了对构建体1.1至1.10测量的EC50值。
表35：在活化的人CD3+CD8+T细胞和CD3+CD4+T细胞上的结合
Figure BDA0003454763770002631
图8A和8B分别显示在实施例2中制备的构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6 在来自新鲜人血的CD4+和CD8+T细胞上和在活化的表达4-1BB的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合。设门于活的CD45+CD3+CD4+或CD45+CD3+ CD8+T细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgGIgG Fcγ-片段特异性山羊 F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合变体的滴定浓度进行印迹。表36显示了对构建体2.1、2.3、2.4、2.5和2.6测量的EC50值。
表36：在活化的表达4-1BB的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
Figure BDA0003454763770002641
5.2 FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子与活化的小鼠脾细胞的结合
将小鼠脾脏收集在3mL PBS中，并使用gentleMACS管(Miltenyi Biotec目录号130-096-334)和gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)产生单细胞悬液。然后，将脾细胞通过30μm预分离过滤器(Miltenyi Biotec目录号 130-041-407)过滤，并在350xg和4℃、离心7分钟。吸出上清液并将细胞重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v) MEM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇和10％青霉素-链霉素(SIGMA，目录号P4333)的RPMI 1640培养基中。以106个细胞/mL在6孔组织培养板上培养2 天，所述组织培养板包被有10μg/mL的抗小鼠CD3ε亚美尼亚仓鼠IgG(克隆 145-2C11，BioLegend，目录号100331)和2μg/mL的抗小鼠CD28叙利亚仓鼠 IgG(克隆37.51，BioLegend，目录号102102)。
收集活化的小鼠脾细胞，在DPBS中洗涤，计数，将0.1x106个细胞转移到非组织培养物处理的U型底96孔板的每个孔中。除去上清液，将细胞在含有1:5000稀释的可固定活力染料eF660(Bioscience，目录号65-0864-18)的100μL/孔的DPBS中在4℃、染色30分钟。用PBS洗涤细胞，并在含有不同浓度的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆 4-1BBL三聚体)、非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)或抗小鼠CD137人IgG1 P329G LALA单抗(克隆 Lob.12.3，BioXcell目录号BE0169)的50μL FACS缓冲液中染色。细胞在4℃下温育120分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤四次，并在50μL/孔的FACS缓冲液中在4℃、染色30分钟，所述缓冲液含有10μg/mL纯化的抗小鼠CD16/CD32 大鼠IgG-Fc-Block(BD Pharmingen，目录号553142，克隆2.4G2)的、5μg/mL 抗小鼠CD8b大鼠IgG2bκ-FITC(BioLegend，目录号126606，克隆YTS156.7.7)、 0.67μg/mL抗小鼠CD3大鼠IgG2bκ-APC-Cy7(BioLegend，目录号100222，克隆17A2)、0.67μg/mL抗小鼠CD4大鼠IgG2bκ-PE-Cy7(BioLegend，目录号 100422，克隆GK1.5)、2μg/mL抗小鼠NK1.1小鼠(C3H× BALB/c)IgG2aκ-PerCp-Cy5.5(BioLegend，目录号1082728，克隆PK136)和 10μg/mL PE缀合的AffiniPure多克隆F(ab')2片段山羊抗人IgG(其为Fcγ片段特异性的，与牛、小鼠和兔血清蛋白(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-170)交叉反应最小)。细胞用200μL/孔的冷FACS缓冲液洗涤两次。细胞用含1％甲醛的50μL/孔的DPBS固定。将细胞重悬于FACS缓冲液中，并在次日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图9所示，FAP靶向的含有hu4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子 (FAP分拆hu4-1BBL三聚体)和非靶向的含有hu4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆hu4-1BBL三聚体)不与小鼠4-1BB结合。因此，不能在有免疫能力的小鼠中测试活性。对于体内作用模式研究，必须使用如图3所示的免疫无能小鼠中的人源化小鼠模型或含有小鼠4-1BBL三聚体的替代物。
5.3与表达FAP的肿瘤细胞结合
对于在表达FAP的细胞上的结合测定，采用了人黑素瘤细胞系MV-3(参见Ruiter等人，Int.J.Cancer 1991,48(1),85-91)、WM-266-4(ATTC CRL-1676) 或NIH/3T3-huFAP克隆39细胞系。为了生成后一种细胞系，用人 FAP(NIH/3T3-huFAP克隆39)转染NIH/3T3细胞。通过用在CMV启动子下的编码人FAP的pETR4921表达质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)而生成上述细胞。在1.5μg/mL的嘌呤霉素(InvivoGen，目录号 ant-pr-5)的存在下维持细胞。将0.1x106个表达FAP的肿瘤细胞加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。细胞用 200μL的DPBS洗涤一次，并将沉淀重悬。加入100μL/孔的含有1:5000稀释的可固定活力染料eFluor 450(eBioscience，目录-号65-0863-18)或可固定活力染料eFluor 660(eBioscience，目录-号65-0864-18)的4℃冷DPBS缓冲液，将板在 4℃下温育30分钟。将细胞用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次，并重悬于含有不同滴定浓度的含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子的50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液(补充有2％(v/v)FBS、5mM EDTA pH 8(Amresco，目录-号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich S2002)的DPBS)，然后在4℃、温育1小时。用200μL/孔洗涤4次后，细胞用50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液在 4℃、染色30分钟，所述FACS缓冲液含有30μg/mL FITC缀合的AffiniPure抗人 IgG Fcγ片段特异性山羊F(ab`)2片段(JacksonImmunoResearch，目录-号 109-096-098)或5μg/mL PE缀合的AffiniPure抗人IgG Fgγ片段特异性山羊 F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098或109-116-170)。细胞用200μL 4℃的FACS缓冲液洗涤两次，然后重悬于含有1％甲醛的50μL/ 孔的DPBS中。在当日或次日将细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并使用5 激光LSR-Fortessa(BDBioscience，具有DIVA软件)或3激光Miltenyi Quant Analyzer 10(Mitenyi Biotec)和Flow Jo(FlowJo X 10.0.7)收获细胞。
如图10所示，FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)构建体1.1，而不是DP47非靶向的含有Fab的构建体(DP47分拆4-1BBL三聚体)对照A，与表达人成纤维细胞激活蛋白(FAP) 的黑素瘤(10A)MV-3细胞或(10B)WM-266-4细胞有效结合。
图11A显示了实施例1中制备的构建体1.1至1.10与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞的结合，在图11B中显示了构建体1.1、1.2、1.3和1.5与表达人FAP 的NIH/3T3-huFAP克隆39转染的小鼠胚胎成纤维细胞的结合。表37显示了对构建体1.1至1.10测量的EC50值。
表37：与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
Figure BDA0003454763770002661
Figure BDA0003454763770002671
图12A和12B显示了不同的FAP(4B9)靶向或非靶向的分拆三聚体的人 4-1BB配体Fc(kih)构建体与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞(图12A)和 WM-266-4细胞(图12B)的结合。如实施例2所述制备构建体2.1、2.3、2.4、2.5 和2.6，并如前所述制备对照。设门于活的肿瘤细胞上，并将PE缀合的 AffiniPure抗人IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合构建体的滴定浓度进行印迹。表38显示了如所测量的EC50值。
表38：与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
Figure BDA0003454763770002672
5.4鼠靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
5.4.1与活化的小鼠脾细胞结合
将小鼠脾脏收集在3mL PBS中，并使用gentleMACS管(Miltenyi Biotec目录号130-096-334)和gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)产生单细胞悬液。然后，将脾细胞通过30μm预分离过滤器(Miltenyi Biotec目录号 130-041-407)过滤，并在350xg和4℃、离心7分钟。吸出上清液并将细胞重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。
对于在新鲜小鼠脾细胞上的结合，直接使用细胞。为了诱导小鼠4-1BB 在T细胞上的表达，如下激活小鼠脾细胞：以106个细胞/mL在6孔组织培养板上培养2天，所述组织培养板包被有10μg/mL的抗小鼠CD3ε亚美尼亚仓鼠 IgG(克隆145-2C11，BioLegend，目录号100331)和2μg/mL的抗小鼠CD28叙利亚仓鼠IgG(克隆37.51，BioLegend，目录号102102)。
收集新鲜的小鼠脾细胞或活化的小鼠脾细胞，在DPBS(Gibco lifetechnologies，目录号14190-136)中洗涤，计数，将0.1x106个细胞转移到非组织培养物处理的U型底96孔板(Greiner bio-one,cell star，目录号650185)的每个孔中。去除上清液，细胞在含有1:1000稀释的LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(LifeTechnologies,L34957)的100μL/孔4℃的冷DPBS中在 4℃、染色30分钟。将细胞用DPBS洗涤并且在50μL/孔的冷FACS缓冲液(补充有2％(v/v)FBS、5mM EDTA pH 8(Amresco，目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich S2002)的DPBS)中染色，所述缓冲液含有不同滴定浓度的含有小鼠4-1BBL配体三聚体的Fc(kih)融合分子或小鼠IgG1κ同种型对照(BioLegend，目录号400153，克隆MOPC-21)。将细胞在4℃、温育120分钟，用冷DPBS洗涤四次，并在含有30μg/mL FITC缀合的抗小鼠IgG Fc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2(JacksonImmunoresearch，目录号115-096-071)的50μL/的冷 FACS缓冲液中在4℃、染色30分钟。然后细胞用冷DPBS洗涤两次，并且用 50μL/孔的FACS缓冲液在4℃、染色30分钟，所述缓冲液补充有10μg/mL纯化的抗小鼠CD16/CD32大鼠IgG-Fc-Block(BD Pharmingen，目录号553142，克隆2.4G2)、0.67μg/mL抗小鼠CD8a-APC-Cy7(BioLegend，目录号100714，克隆53-6.7)、0.67μg/mL抗小鼠CD3ε-PerCP-Cy5.5(BioLegend，目录号 100328，克隆145-2C11)、0.67μg/mL抗小鼠CD4大鼠IgG2bκ-PE-Cy7 (BioLegend，目录号100422，克隆GK1.5)。细胞用200μL/孔的冷DPBS洗涤两次，用含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS固定并重悬于FACS缓冲液中。使用3 激光MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotech)和Flow Jo v10.0.7(FlowJoLLC)收获细胞。设门于CD3+CD8+或CD3+CD4+T细胞上，分析FITC-缀合的抗小鼠IgG Fc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2的中值荧光强度(MFI)，并通过减去空白对照(没有添加含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子)的MFI加以标准化。将MFI针对使用的含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子的浓度进行印迹，以显示与小鼠4-1BB细胞结合的分子的结合。
如图13可见，鼠4-1BBL构建体M.1和M.2以及相应的对照分子对照M.1 和对照M.2以很相似的亲和力与小鼠4-1BB结合。表39显示了对构建体M.1和 M.2以及对照分子测量的EC50值。
表39：在活化的表达4-1BB的CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
Figure BDA0003454763770002691
5.4.2在表达FAP的肿瘤细胞上的结合
对于在表达FAP的细胞上的结合测定，采用了人黑素瘤细胞系MV-3(参见Ruiter等人，Int.J.Cancer 1991,48(1),85-91)和WM-266-4(ATTC CRL-1676)(抗FAP特异性克隆28H1是小鼠/人交叉反应性的)。将0.1x106个表达FAP的肿瘤细胞加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。细胞用200μL冷DPBS洗涤一次，将沉淀重悬于含有1:1000稀释的LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(Life Technologies, L34957)的100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液中，并在4℃、温育30分钟。将细胞用200μL的冷DPBS缓冲液洗涤一次，并重悬于含有一系列浓度的含有鼠 4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合分子的50μL/孔的冷FACS缓冲液(补充有2％ (v/v)FBS、5mM EDTApH8(Amresco，目录号E177)和7.5mM叠氮化钠 (Sigma-Aldrich S2002)的DPBS)中，然后在4℃、温育1小时。用200μL的DPBS/ 孔洗涤四次后，用含有30μg/mL FITC缀合的抗小鼠IgGFc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2(Jackson Immunoresearch，目录号115-096-071)的50μL/孔的4℃冷 FACS缓冲液将细胞4℃、染色30分钟。细胞用200μL/孔的冷DPBS缓冲液洗涤两次，用含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS固定并重悬于FACS缓冲液中。使用3激光MACSQuantAnalyzer 10(Miltenyi Biotech)和Flow Jo v10.0.7(FlowJo LLC)收获细胞。设门于活细胞上，分析FITC-缀合的抗小鼠IgG Fc-γ特异性山羊IgG F(ab`)2的中值荧光强度(MFI)，并通过减去空白对照(没有添加含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子)的MFI加以标准化。将MFI针对使用的含有鼠4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子的浓度进行印迹，以显示与鼠4-1BB细胞结合的分子的结合。正如预期，鼠4-1BBL构建体M.1和M.2以很相似的亲和力与FAP结合，而对照分子不结合。
图14显示了FAP靶向或非靶向的分拆三聚体的鼠4-1BB配体Fc(kih)构建体M.1和M.2与表达人FAP的人黑素瘤MV-3细胞(图14A)和WM-266-4细胞(图 14B)的结合。表40显示了如所测量的EC50值。
表40：与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
Figure BDA0003454763770002701
实施例6
靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性
6.1.在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NF-κB活化
表达人4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞的生成
用基于表达载体pETR10829的质粒转导宫颈癌细胞系HeLa(ATCC CCL-2)，所述表达载体包含在CMV启动子控制下的人4-1BB(Uniprot登录号 Q07011)的序列和嘌呤霉素抗性基因。在补充有10％(v/v)FBS、1％ (v/v)GlutaMAX-I和3μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基中培养细胞。
通过流式细胞术检测4-1BB转导的HeLa细胞的4-1BB表达：将0.2x106个活细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，所述缓冲液含有0.1μg PerCP/Cy5.5缀合的抗人4-1BB小鼠IgG1κ克隆4B4-1(BioLegend目录-号309814)或其同种型对照(PerCP/Cy5.5缀合的小鼠IgG1κ同种型对照抗体克隆MOPC-21， BioLegend目录-号400150)，在4℃、温育30分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于含有0.06μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的300μL FACS缓冲液中，使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。进行有限稀释以产生如下所述的单个克隆：将人4-1BB转导的HeLa细胞重悬于培养基中达到10个、5个和2.5个细胞/ml的密度，将200μl细胞悬液转移到组织培养物处理的圆底96孔板(6个板/细胞浓度，TPP目录-号92697)中。如上所述收获单个克隆，扩增并检测4-1BB表达。选择具有最高4-1BB表达的克隆(克隆5)，以备随后用NF-κB萤光素酶表达载体5495pTranlucent HygB 进行转染。载体对转染细胞赋予潮霉素B抗性和在NF-kB应答元件(骨架载体 Panomics，目录-号LL0051，引入HyB抗性)控制下表达萤光素酶的能力。培养人4-1BBHeLa克隆5细胞至70％汇合。将50μg(40μL)线性化(限制酶AseI和 SalI)5495p TranlucentHygB表达载体加入到无菌的0.4cm Gene Pulser/MicroPulser Cuvette(Biorad，目录号165-2081)中。加入400μl无补充剂的DMEM培养基中的2.5x106个人-4-1BB HeLa克隆5细胞，与质粒溶液仔细混合。使用Gene Pulser Xcell总系统(Biorad，目录-号165-2660)，在以下设置下进行细胞的转染：指数脉冲，电容500μF，电压160V，电阻∞。在脉冲转染细胞之后立即转移到具有15mL的37℃温热DMEM培养基的75cm2的组织培养瓶(TPP，目录-号90075)中，所述培养基补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v) GlutaMAX-I。次日，加入含有3μg/mL嘌呤霉素和200μg/mL潮霉素B(Roche，目录-号10843555001)的培养基。将存活的细胞扩增并且如上所述进行有限稀释以产生单个克隆。
如上所述检测克隆的4-1BB表达并且如下检测克隆的NF-κB-萤光素酶活性：在选择培养基中收获克隆，并使用Cell Counter Vi-cell xr 2.03(Beckman Coulter，目录-号731050)进行计数。将细胞设定为0.33x106个细胞/mL的细胞密度，并将150μL该细胞悬液转移到具有盖的无菌白色96孔平底组织培养板 (greiner bio-one，目录-号655083)的每个孔中并且转移到常规的96-孔平底组织培养板(TPP目录-号92096)-作为对照-，次日检测存活和细胞密度。细胞在 37℃和5％CO2下温育过夜。次日，将50μL含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α,PeproTech，目录号300-01A)的培养基加入到96孔板的每个孔中，得到rhTNF-α的终浓度为100、50、25、12.5、6.25和0ng/孔。将细胞在 37℃和5％CO2下温育6小时，然后用200μL/孔的DPBS洗涤3次。向每个孔(40μl) 中加入报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase1000Assay System， Promega，目录-号E4550)解冻至室温。将100μL检测缓冲液加入到每个孔中，并使用SpectraMax M5/M5e酶标仪和SoftMax Pro Software(Molecular Devices)尽可能快地检测平板。采取所测得的高于对照(不添加rhTNF-α)的500毫秒/ 小时的释放光单位数(URL)作为萤光素酶活性。NF-κB-luc-4-1BB-HeLa克隆 26表现出最高的萤光素酶活性和相当程度的4-1BB表达，并被选择以备进一步使用。
与表达FAP的肿瘤细胞共培养的表达人4-1BB的Hela细胞中的NF-κB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS 和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/ml。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有滴定浓度的FAP靶向的含有4-1BB 配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)的培养基。将表达FAP的肿瘤细胞(MV3、WM-266-4或NIH/3T3-huFAP 克隆39)重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的DMEM培养基中，浓度为2x106个细胞/ml。
向每个孔中加入表达FAP的肿瘤细胞悬液(50μl，最终比率1:5)或仅加入培养基，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。细胞用200μL/孔的DPBS洗涤两次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液 (Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)在室温下解冻。将 100μL的检测缓冲液加入每个孔中，使用SpectraMax M5/M5e酶标仪和以URL计数光发射(0.5s/孔的释放光单位数)的SoftMax Pro Software(Molecular Devices)或Victor3 1420多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和将光发射计数为每秒计数(CPS)的Perkin Elmer 2030Manager Software，尽可能快地测量萤光素酶活性，并针对测试构建体的浓度进行印迹。
FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆 4-1BBL三聚体)在存在表达FAP的肿瘤细胞的情况下触发了报告细胞系中的 NFκB信号通路的激活。相比之下，相同分子的非靶向变体在任何测试浓度下都不能触发这种效应(图16)。靶向的4-1BBL的这种活性严格依赖于肿瘤细胞在细胞表面上FAP的表达，因为在培养NF-kB报告细胞系和FAP阴性肿瘤细胞时，即使在存在FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的情况下也不能检测到NF-kB活化。对构建体1.1至1.10测量的活性如图 17A-17C所示，对构建体2.1、2.4和2.5测量的数据如图18所示。
6.2.在表达食蟹猴4-1BB的HEK T293细胞中的NF-κB活化
表达食蟹猴4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HEK T293细胞的生成
为了产生病毒样颗粒(VLP)，根据制造商的方案，使用具有PLUSTM试剂(LifeTechnologies，目录号15338100)的Lipofectamine LTX试剂，用编码NFκB- 萤光素酶-IRIS-GFP报告基因盒(NFκB-luc-GFP)的载体pETR14372转染人胚胎肾(HEK)T293/17(ATCCCRL-11268)。6小时后进行DMEM培养基更换，所述培养基添加有10％FBS，4天后收获VLP。利用产生的pETR14372-VLP和 4μg/mL聚凝胺在新鲜的HEK 293T细胞出现70-80％汇合时进行转导。培养细胞24小时，并进行培养基更换。收获转导的HEK T293/17细胞，并进行1个细胞/孔的有限稀释以筛选稳定的单克隆。用在培养基中的25ng/mL TNF-α(PeproTech Inc.目录号300-01A)刺激单个克隆，并使用Incuyte Zoom Fluorescence Microscope System(Essen Bioscience)筛选单个克隆随着时间过去的阳性GFP信号。根据制造商的方案，在记录GFP信号之后，使用Nano Glo Luciferase Kit(Promega,N1120)检测细胞的萤光素酶活性。使用Victor3 1420 多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和Perkin Elmer2030Manager Software测量萤光素酶活性。以每秒计数(CPS)计数0.5秒/孔的光发射。克隆61显示出在 TNF-α激活后最高的GFP和萤光素酶表达，并进一步用于生成报告细胞系。
如上所述，使用编码食蟹猴4-1BB和嘌呤霉素抗性的载体pETR14879产生新的VLP，用产生的pETR14879-VLP和4μg/mL聚凝胺在HEK 293T NFκB-fluc-GFP克隆61细胞系出现70-80％汇合时进行转导。培养细胞24小时，并进行培养基更换。转导后4天，用PE缀合的抗人食蟹猴交叉反应性4-1BB 抗体(小鼠IgG1κ，克隆MOPC-21，BioLegend，目录号309804)在含有1％FBS 的DPBS中将细胞染色，通过FACS(ARIA，BD)分选所述细胞，并且以5个细胞/孔接种于DMEM培养基中，所述培养基补充有10％FBS，含有1μg/mL Puromycine(InvivoGen，目录号ant-pr)。在TNF-α刺激后，如所述通过流式细胞术检测生长克隆的GFP和萤光素酶活性，并检测到食蟹猴4-1BB高表达。在单价FAP靶向的构建体2.1或对照B和表达FAP的MV-3或WM-266-4细胞的存在下，选择双阳性克隆并检测萤光素酶活性。选择表达 NF-κB-luc-GFP-cy4-1BB的HEK T293/17克隆61-13用于所有进一步的实验。
与表达FAP的肿瘤细胞共培养的表达食蟹猴4-1BB的HEK T293/17报告细胞的NF-κ B活化
收获表达NFκB-luc-GFP-cy4-1BB的HEK T293/17克隆61-13细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2 x106个细胞/mL。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greinerbio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有不同滴定浓度的FAP靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的培养基。将表达 FAP的肿瘤细胞(MV3和WM-266-4)重悬于培养基中，浓度为2x106个细胞 /ml。向每个孔中加入表达FAP的肿瘤细胞悬液(50μl)，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。测定原理显示在图19中。温育后，细胞用200μL/孔的DPBS洗涤三次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液 (Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)解冻至室温。将100μL 检测缓冲液加入到每个孔中，并使用SpectraMax M5/M5e(Molecular Devices)酶标仪尽可能快地测定萤光素酶活性(500ms积分时间，未过滤收集所有波长)。以释放光的单位数(URL)计数0.5秒/孔的光照射，并且针对测试的FAP 靶向或非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的浓度进行印迹。实施例2的构建体的结果如图20所示。
6.3基于抗原特异性CD8+T细胞的测定
抗原特异性CD8 T细胞的分离和培养
从HLA-A2+的CMV感染志愿者获得新鲜血。如上所述分离PBMC。根据制造商的建议，使用阴性选择人CD8 T细胞分离试剂盒从PBMC中纯化CD8 T 细胞(Miltenyi Biotec，目录号130-094-156)。将1000万个分离的CD8T细胞重悬于补充有1％(v/v)FBS的1mL无菌DPBS中，其中DPBS还补充有50μL的含有CMV衍生的NLVPMVATV肽(ProImmune，目录号F008-2B)的PE标记的 HLA-A2-五聚体，并在室温下温育10分钟。用补充有1％(v/v)FBS的3mL无菌DPBS将细胞洗涤两次。将细胞重悬于含有1μg/mL抗人CD8-FITC(克隆 LT8，Abcam，目录号Ab28010)的补充有1％(v/v)FBS的1mL DPBS中，并在 4℃、温育30分钟。将细胞洗涤两次，以5x106个细胞/mL的浓度重悬于补充有1％(v/v)FBS的DPBS中，并通过30μm预分离尼龙网细胞过滤器(Miltenyi Biotec，目录号130-041-407)过滤。通过使用ARIA细胞分选仪(BDBioscience， DIVA软件)通过FACS分选分离NLV肽特异性CD8+T细胞，所述细胞分选仪具有以下设置：100μm喷嘴和纯度分选掩模。将分选的细胞收集在含有具备 10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I和400U/mL普留净的RPMI 1640培养基的15ml聚丙烯离心管(TPP，目录号91015)中。将分选的细胞在室温下以350x g离心7分钟，重悬于相同培养基中，浓度为0.53x106个细胞/mL。将该细胞悬液以100μL/孔加入预先准备的饲养板的每个孔中。
如前所述(Levitsky et al.,1998)从PBMC制备PHA-L激活的照射的异基因饲养细胞，并以每孔2x105个饲养细胞分配到96孔培养板中。
培养1天后，从含有分选的CD8+T细胞的孔中移除100μL培养基/孔，更换为补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I和400U/mL普留净的新的 RPMI 1640培养基，在培养期间定期重复此操作(每2-4天一次)。一旦细胞开始增殖，就将其转移到24孔平底组织培养板(TPP,92024)上。使细胞扩增/分裂，定期地用新的饲养细胞制剂再活化。
抗原特异性CD8+T细胞的活化测定
收获MV3细胞并用DPBS洗涤，并将2x107个细胞重悬于250μL的 PKH-26RedFluorescence Cell linker Kit(Sigma，目录号PKH26GL)的C稀释剂中。将1μL PKH26-Red染色溶液用250μL C稀释剂稀释，并加入到MV3细胞悬液中，然后在黑暗中在室温下温育5分钟。然后加入0.5mL FBS，将细胞温育1分钟，并用由RPMI 1640培养基组成的T细胞培养基洗涤一次，所述 RPMI 1640培养基补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸和50μM的β巯基乙醇。将1x106个MV3细胞 /mL重悬于T细胞培养基中并分到三个管中。加入合成的NLVPMVATV肽(从 Thinkpeptides获得)至终浓度为1x10- 9M或1x10-8M，将细胞温育90分钟。将 MV3细胞用T细胞培养基洗涤一次，并以0.5x106个细胞/mL的密度重悬，分配(100μL/孔)到96孔圆底细胞悬浮板(Greiner bio-one，cellstar，目录-号650185) 中，在37℃和5％CO2下温育过夜。测定原理显示在图21中。
次日，加入50μL/孔含有不同滴定浓度的靶向的含有4-1BB配体三聚体的 Fc融合抗原结合分子的T细胞培养基。收获NLV特异性CD8 T细胞，加入 CFDA-SE(5(6)-羧基荧光素二乙酸酯-N-琥珀酰亚胺酯，SIGMA-Aldrich，目录号21888-25MG-F)至终浓度为40nM，在37℃在旋转下温育细胞15分钟。通过加入FBS来终止标记，将细胞洗涤并重悬于T细胞培养基中至终浓度为 0.125x106个细胞/mL。将50μL该CFSE标记的CD8 T细胞悬液加入各孔(最终E:T比＝1:8)中。将细胞板温育24小时，取出50μL/孔，并向每孔加入50μL含有2.64μL/mL的Golgi终止液(含莫能菌素的蛋白转运抑制剂，BD Bioscience，目录号554724)的T细胞培养基(终浓度0.66μL/mL)。将细胞温育4小时，然后用200μL/孔的DPBS洗涤平板，用含有1:5000稀释的可固定活力染料 eF450(eBioscience，目录-号65-0864)的100μL/孔的4℃的DPBS在4℃染色30 分钟。用200μL/孔的DPBS洗涤细胞板，然后用荧光染料缀合的抗体染色，所述抗体如下：抗人CD137-PerCP/Cy5.5(克隆4B4-1，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号309814)、抗人CD8-BV605(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号301012)或0.67μg/mL抗人CD8a-APC/Cy7(克隆RPA-T8，小鼠IgG1κ， BioLegend，目录号301016)和抗人CD25 PE/Cy7(克隆BC96，小鼠IgG1κ， BioLegend，目录-号302612)。在4℃、温育30分钟后，用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于50μL/孔新鲜制备的FoxP3 Fix/Perm缓冲液 (eBioscience目录号00-5123和00-5223)中，在4℃下温育30分钟。用200μL/孔的Perm-Buffer(补充有2％(v/v)FBS、1％(w/v)皂苷(Sigma Life Science，S7900) 和1％(w/v)叠氮化钠(Sigma-Aldrich，S2002)的DPBS洗板，并用50μL/孔的 Perm-Buffer(eBioscience，目录号00-8333-56)染色，所述Perm-Buffer含有0.25 μg/mL的抗人IFNγ-APC(克隆B27，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录-号506510) 或0.33μg/mL的抗人IFNγ-BV510(克隆4S.B3，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号502543)。将板在4℃、温育1小时，用200μL/孔的Perm-Buffer洗涤两次。为了固定，加入含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS。在当日或次日将细胞重悬于 100μL/孔的FACS缓冲液中，并使用5激光Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience，具有DIVA软件)或3激光Miltenyi Quant Analyzer 10(Mitenyi Biotec)和Flow Jo (FlowJo X 10.0.7)收获细胞。
如图22和23所示的构建体1.1至1.10以及图24和25所示的构建体2.1、2.3 和2.4，抗原特异性CD8+T细胞，而不是未刺激的对照，在存在FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)的情况下表现出增加的表面4-1BB表达水平。4-1BBL的这种作用是剂量依赖性的并且需要FAP靶向，因为添加非靶向的对照分子不影响4-1BB表达水平。此外，在FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP分拆4-1BBL三聚体)存在下，以较高肽浓度(1x10-8M)激活的T细胞显示出持续的 INF分泌。总的来说，这些数据表明抗原靶向的含有4-1BB配体三聚体的 Fc融合抗原结合分子以靶向依赖的方式调节抗原特异性T细胞的表面表型和反应性。
6.4细胞靶向和非靶向的小鼠4-1BBL Fc融合抗原结合分子的比较
如实施例1.3所述制备靶向和非靶向的含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc 融合抗原结合分子(FAP分拆小鼠4-1BBL三聚体和DP47分拆小鼠4-1BBL三聚体)。
为了比较细胞靶向和非靶向的含有小鼠4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性，在0.5μg/mL抗小鼠CD3叙利亚仓鼠IgG(克隆145-2C11，BD，目录号553057)以及以一系列浓度添加的指示药物候选分子的存在下，将增殖染料eFlour670标记的(eBioscience，目录号65-0840-90)或CellTrace Violet细胞增殖染料标记的(Celltracer，目录号C34557)新鲜小鼠脾细胞在U 型底96孔组织培养板(TTP，目录号90997)中与粘附的50Gy辐照的在RPMI 1640培养基(Gibco，目录号440401-042)中的NIH/3T3-huFAP克隆39细胞(生成见5.3)共培养3-4天，所述培养基补充有(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM 丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸和50μMβ-巯基乙醇(图26)。三天或四天后，用FACS缓冲液洗涤细胞，在含有抗小鼠CD8大鼠 IgG2a-BV711(BioLegend，目录号100747，克隆53-6.7)、抗小鼠CD4大鼠 IgG2a-BV421(BioLegend，目录号100544，克隆RM4-5)、0.67μg/mL抗小鼠 CD137(4-1BB)叙利亚仓鼠IgG-PE(BioLegend，目录号1010106，克隆17B5) 和抗小鼠CD25-PErCP-Cy5.5大鼠IgG2b(BioLegend，目录号1019112)的25μL FACS缓冲液/孔中在4℃、染色30分钟。洗涤细胞并在制备的Fix/Perm Buffer (Foxp3/TranscriptionFactor Staining Buffer Set,eBioscience，目录 -Ni.00-5523-00)中在室温下温育1小时。用新鲜制备的Perm缓冲液洗涤细胞两次，并用含有荧光标记抗体的25μL/孔Perm缓冲液在室温下共染色1小时，所述抗体针对细胞毒性谱系转录因子Eomes，即为抗小鼠Eomes大鼠IgG2a-AlexaFluor488抗体(eBioscience，目录号534875，克隆Dan11mag)，并且-如果CD137未被染色，则所述抗体针对细胞毒性效应器分子颗粒酶B，即为抗小鼠大鼠IgG2颗粒酶B-PE抗体(eBioscience，目录号128822，克隆16G6)。然后将细胞洗涤两次，重悬于FACS缓冲液中，使用激光Fortessa流式细胞仪 (BD Bioscience，具有DIVA软件)或3激光MACSQuantAnalyzer 10(Miltenyi Biotech)和Flow Jo v10.0.7(FlowJo LLC)收获细胞。设门于活的CD8+T细胞和 CD4+T细胞上，测定增殖细胞的频率以及CD25、Eomes和颗粒酶B或CD137 的表达水平。将增殖频率以及活化标志物的频率和MFI针对使用的含有小鼠 4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子的浓度进行印迹，以显示功能活性。从图27可以看出，对于构建体M.1和M.2可以观察到增殖性CD8+T细胞增加。
6.5用抗鼠4-1BB抗体Lob 12.3(muIgG1 Wt)或用构建体M.2处理的小鼠中的肝脏变化
用靶向FAP的激动性抗鼠4-1BB抗体每周一次治疗皮下荷载 MC38-muFAP(鼠结肠直肠癌模型)的C57BL/6小鼠持续3周(Efficacy Study 020-GA1401:“Experiment to showefficacy of 4-1BB targeted therapy in combination with a-PD-L1 in MC38-muFAPs.c.model in C57B6 mice.”)。使用的抗体为Lob 12.3muIgG1 Wt(具有“野生型”Fc，来自BioXcell目录号BE0169 的克隆Lob 12.3)或具有DAPG突变的构建体M.2(无活性的Fc).给予两种抗体每周一次连续三周。最后一次治疗7天后处死4只动物/组，用显微镜检查肝脏。
仅在接受Lob 12.3muIgG1 Wt的动物中观察到肝脏变化，其组成为肝细胞变性病灶，具有F4/80阳性巨噬细胞和经常显示血管中心性分布的较少量的炎性细胞(主要是淋巴细胞)混合群的积聚。偶尔见到肝细胞的单细胞坏死、和门管区中的血管周围单核细胞浸润。在接受构建体M.2的动物的肝脏中未观察到治疗相关发现(表41)。
表41：组织病理学的发生率(n＝4/组)
Figure BDA0003454763770002781
在用Urelumab BMS-663513(Ascierto P.A.等人，2010)治疗的患者和使用小鼠替代物的小鼠中观察到肝炎，其归因于肝脏中FcγRs的交联。在用具有无活性Fc的抗体治疗的动物中肝脏发现的缺乏支持该假设。
6.6含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的药代动力学参数的确定
为了测试本发明的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子是否适合于药物用途，确定了在小鼠中的诸如清除率、分布容积或消除半衰期(t1/2) 的药代动力学参数(PK数据)。因此，进行了以下实验：
实验A：构建体1.2和对照B在健康NOG小鼠中的单剂量PK
根据确定的指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，在实验开始将平均年龄为8至10周的NOG雌性小鼠(购自Taconic，SOPF设施)保持在无特定病原的条件下，日周期为12小时光照/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府(P 2011128)审查批准。动物在到达之后被维护一周以便适应新的环境和便于观察。定期进行连续健康监测。
进行单剂量药代动力学研究(SDPK)以评价构建体1.2和对照B的暴露。向 NOG小鼠以2.5mg/kg给予静脉推注给药，并在选定的时间点取血样用于药代动力学评价。通过ELISA分析小鼠血清样品。将生物素化人4-1BB、测试样品、地高辛标记的抗huCH1抗体和抗地高辛检测抗体(POD)分步加入到链霉亲和素包被的96孔微量滴定板中，每个步骤之后在室温下温育1小时。每个步骤之后将板洗涤三次以除去未结合的物质。最后，通过加入ABTS底物溶液以形成有色反应产物将结合过氧化物酶的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)下通过光度法测定的反应产物强度与血清样品中的分析物浓度成比例。构建体的标准曲线的校准范围为0.156到10ng/ml，其中3ng/ml为定量下限(LLOQ)。图28A显示了在该实验中观察到的浓度随时间的降低。
实验B：构建体2.1、2.3、对照B和对照C在用干细胞人源化的荷瘤NOG小鼠中的单剂 量PK。
进行单剂量药物动力学研究(SDPK)以评价构建体2.1、2.3、对照B和对照C的暴露。由Jackson Laboratories输送用人干细胞移植的NSG雌性小鼠。根据确定的指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，将小鼠维持在无特定病原的条件下，日周期为12小时光照/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府 (ZH193-2014)审查批准。动物在到达之后被维护一周以便适应新的环境和便于观察。定期进行连续健康监测。
人MKN45细胞(人胃癌)最初从ATCC获得，扩增后保藏在Glycart内部细胞库中。在含有10％FCS的DMEM中培养细胞。在37℃在5％CO2的水饱和气氛中培养细胞。对于皮下注射，使用9次体外传代，活力为97％。在Roche Nutley将人成纤维细胞NIH-3T3工程化以表达人FAP。使用克隆39时的体外传代数为12次，活力为98％。将与50微升Matrigel混合的50微升细胞悬液(1x106个MKN45细胞+1x106个3T3-huFAP)皮下注射到麻醉小鼠的侧腹。当肿瘤的平均尺寸达到190mm3时，向人源化小鼠以10mg/kg给予静脉推注给药。在选定的时间点取血样进行药代动力学评价。通过ELISA分析小鼠血清样品。将生物素化人4-1BB、测试样品、地高辛标记的抗huCH1抗体和抗地高辛检测抗体(POD)分步加入到链霉亲和素包被的96孔微量滴定板中，每个步骤之后在室温下温育1小时。每个步骤之后将板洗涤三次以除去未结合的物质。最后，通过加入ABTS底物溶液以形成有色反应产物将结合过氧化物酶的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)下通过光度法测定的反应产物强度与血清样品中的分析物浓度成比例。构建体的标准曲线的校准范围为0.156 到10ng/ml，其中3ng/ml为定量下限(LLOQ)。图28B显示了在该实验中观察到的构建体浓度随时间的降低。
实验C：构建体2.1和2.3在健康NOG小鼠中的单剂量PK
根据确定的指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)，在实验开始将平均年龄为8至-10周的NOG雌性小鼠(购自Taconic，SOPF设施)保持在无特定病原的条件下，日周期为12小时光照/12小时黑暗。实验研究方案经地方政府(P 2011128)审查批准。动物在到达之后被维护一周以便适应新的环境和便于观察。定期进行连续健康监测。
进行单剂量药代动力学研究(SDPK)以评价构建体2.1和2.3的暴露。向NOG小鼠以2.5mg/kg给予静脉推注给药，并在选定的时间点取血样用于药代动力学评价。通过ELISA分析小鼠血清样品。将生物素化人4-1BB、测试样品、地高辛标记的抗huCH1抗体和抗地高辛检测抗体(POD)分步加入到链霉亲和素包被的96孔微量滴定板中，每个步骤之后在室温下温育1小时。每个步骤之后将板洗涤三次以除去未结合的物质。最后，通过加入ABTS底物溶液以形成有色反应产物将结合过氧化物酶的复合物可视化。在405nm(参考波长为490nm)下通过光度法测定的反应产物强度与血清样品中的分析物浓度成比例。构建体的标准曲线的校准范围为0.156到10ng/ml，其中3ng/ml为定量下限(LLOQ)。图28A显示了观察到的浓度随时间的降低。
经测试的构建体2.1和2.3在体内足够稳定，并且具有适用于药物开发范围的PK参数。从结果还可以得出结论，构建体2.1略微更稳定。
6.7 FAP在人类肿瘤中的发生率
如WO 2014/161845中所述评价FAP在人类肿瘤中的发生率，以了解FAP 靶向构建体的可能临床应用。
使用来自Vitatex(MABS1001)的大鼠抗人Seprase抗体(IgG2a，克隆D8)，将来自各种肿瘤指征的2.5μm FFPET切片在Ventana Benchmark XT上进行免疫染色。将切片进行标准CC1处理，然后在Dako抗体稀释液(S3022)中在37℃、以5μg/mL的浓度温育抗体60秒，使用Ultraview DAB检测系统(Ventana #760-4456)检测阳性染色。使用来自Abcam(ab18450)的匹配的同种型抗体作为阴性对照。FAP+间质浸润存在于不同指征的人类肿瘤中，包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、乳腺癌、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌(PAC)、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和间皮瘤，标志着FAP靶向构建体潜在有用的临床指征(表 42)。
表42：FAP在人类肿瘤中的发生率
Figure BDA0003454763770002811
实施例7
7.1 CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
7.1.1用于噬菌体展示活动的CD19抗原Fc融合物的制备、纯化和表征
为了以单体状态(人CD19参见SEQ ID NO:31)表达和纯化人和食蟹猴 CD19胞外域，将各个DNA片段与包含“节”突变的人IgG1 Fc基因区段(人： SEQ ID NO:SEQ ID NO:186；食蟹猴：SEQ ID NO:188)融合，并用“Fc 穴”(SEQ ID NO:86)对应物进行转染(Merchant等人，1998)。在抗原胞外域和 Fc节链之间引入IgA切割位点(PTPPTP)。在抗原Fc节链的C末端引入用于定向生物素化的Avi标签，并将突变H435R和Y436F引入Fc穴中用于纯化目的 (Jendeberg L.等人，J.Immunological methods,1997)。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链(人：SEQ ID NO:187；食蟹猴：SEQ ID NO:189)与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链(SEQ ID NO:90)的组合允许产生包括CD19胞外域的单拷贝的异二聚体Fc融合片段(类似于图5C中的4-1BB构建体)。表43列出了抗原Fc融合构建体的cDNA和氨基酸序列。
表43：单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770002821
Figure BDA0003454763770002831
Figure BDA0003454763770002841
Figure BDA0003454763770002851
Figure BDA0003454763770002861
为了产生单体抗原/Fc融合分子，使用标准方法，用编码融合蛋白的两种成分(节链和穴链)的两个质粒共转染指数生长的悬液CHO细胞。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)、0.5M氯化钠缓冲液缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure 柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用线性梯度洗脱结合的蛋白质；步骤 1，10个CV的0％至60％的洗脱缓冲液(20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠缓冲液(pH 2.5))；步骤2，2个CV的60％至100％的洗脱缓冲液。对于线性梯度，应用另外2个柱体积的100％的洗脱缓冲液进行分步洗脱。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
表44总结了单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合蛋白的产率和最终单体含量。
表44-单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合蛋白的生物化学分析
Figure BDA0003454763770002871
根据制造商的说明书，使用BirA生物素-蛋白质连接酶标准反应试剂盒(Avidity，目录号BirA500)将部分纯化抗原体外生物素化。相对于相应的食蟹猴CD19构建体的生物素化程度100％，含有人CD19的融合物的生物素化程度为94％。然后将生物素化的蛋白质用于选择、筛选和表征缺乏脱酰胺化热点N27d和N28的亲和力成熟的8B8衍生克隆。
7.1.2抗CD19克隆8B8-018的生成
7.1.2.1小鼠抗人CD19抗体(杂交瘤)的免疫和生成
将Balb/c小鼠免疫6次，并用CD19转染的HEK293细胞(平均受体密度为每细胞35,000)加强。利用人CD19转染的NIH-3T3细胞上的CD19细胞ELISA，通过检测血清样品来监测免疫应答。使用具有足够的抗人CD19 抗体滴度的小鼠的脾细胞通过与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63 Ag8.653融合进行永生化。进行三次融合，通过对人CD19转染的NIH-3T3细胞进行细胞ELISA 并且使用Daudi(CD19+)和CD19-细胞进行FACS结合测定来筛选杂交瘤上清液的抗人CD19特异性抗体(参见WO 2011/147834的实施例1)。
7.1.2.2杂交瘤筛选和抗CD19抗体的细胞生物学功能评价
用于筛选抗人CD19抗体的细胞ELISA
应用细胞ELISA筛选杂交瘤，并鉴定分泌抗人CD19抗体的杂交瘤。使用人CD19转染的NIH3T3细胞作为阳性细胞；使用未转染的NIH3T3细胞作为阴性对照细胞。为了评估阳性杂交瘤，将转染和未转染的NIH3T3细胞之间的 OD比值进行定量。
-培养基：DMEM高糖型(4.5mg/ml)、10％FCS、丙酮酸钠、 NEAA、谷氨酰胺
-抗体阳性对照：抗CD19单克隆抗体(IgG1)Pharmingen目录号 555409c＝1mg/ml
-检测抗体：山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP缀合物Bio-Rad目录号 170-06516
-稀释度1：在1x ELISA阻断剂中2000倍
-其他试剂：纤连蛋白Roche目录号838039c＝1mg/ml
-戊二醛：25％原液//Grade Agar Scientific#R102终浓度：PBS 中0.05％
-ELISA阻断剂：10x原液//Roche目录号1112589
-TMB底物：Roche目录号11432559
-终止液：1M H2SO4
-BioRad目录号170-6516稀释度1：在1x ELISA阻断剂中2000 倍
第1天：
-纤连蛋白包被：PBS中5μg/cm2；96孔板＝32cm2；160μg/ 板6ml
-PBS，50μl/孔
-在室温下温育45分钟，吸出包被溶液
-以1.25x104个细胞/孔接种于96孔板中的50μl培养液中
-在37℃、温育40小时
-向板的上半部加入：表达CD19的NIH3T3细胞
-向板的下半部加入：未转染的NIH3T3细胞
第3天：
-在50μl培养基中加入阳性对照抗体或样品(上清液或小鼠血清)
-在4℃、温育2小时
-除去培养基，用100μl戊二醛(在PBS中，0.05％)固定细胞
-用200μl PBS洗涤两次
-加入检测抗体1:2000，50μl/孔
-在室温下温育2小时
-用200μl PBS洗涤三次
-加入50μl TMB，在室温下温育30分钟，
-通过加入25μl 1M H2SO4进行终止；读取在450nm/620nm 处的消光
-结果计算：NIH3T3 CD19的OD:未转染NIH3T3的OD
与未转染的NIH3T3细胞相比，选择的抗体显示出与CD19转染的NIH3T3 细胞特异性结合(参见WO 2011/147834的实施例2)。
7.1.2.3抗CD19抗体的人源化
将鼠抗体的CD19结合特异性转移到人受体框架上以消除由于被人体识别为外来物的序列段引起的潜在免疫原性问题。这是通过将鼠(供体)抗体的整个互补决定区(CDR)移植到人(受体)抗体框架上完成的，称为CDR移植或抗体人源化。
将鼠氨基酸序列与人种系抗体V基因的集合进行比对，并根据序列同一性和同源性进行分选。在选择一个特定的受体序列之前，必须确定供体抗体的所谓规范环结构(Morea,V.等人，Methods,Vol 20,Issue 3(2000)267-279)。通过存在于所谓的规范位置处的残基的类型来确定这些规范环结构。这些位置位于(部分地)CDR区之外，并且必须在最终构建体中保持功能等效性，以便保留亲本(供体)抗体的CDR构象。选择人种系序列VBASE_VH1_1作为重链的受体，并且选择序列VBASE_VK2_5作为轻链的受体。
7.1.2.4去除脱酰胺热点
已经发现野生型人源化抗人CD19抗体具有三个脱酰胺热点在 HVR-L1:NSNGNT(SEQ ID NO:190)中。另外发现HVR-H2中的另一个脱酰胺热点存在于：KFNG(SEQ ID NO:191)。为了处理HVR-H2中的脱酰胺热点，在位置64(根据Kabat编号)处引入了N(Asn)到Q(Gln)点突变。因此，本文中报道的抗体具有包含氨基酸序列TEKFQGRVTM(SEQ ID NO:192)的HVR-H2。
为了处理轻链中的脱酰胺热点并获得具有改进的脱酰胺稳定性的人源化抗人CD19抗体，在Kabat位置27d、27e、28和29处引入了单独突变并且在位置27e和28(根据Kabat编号)处引入了双突变。已经产生野生型人源化抗体(变体0)的总共9个变体(变体1至变体9)(参见表45)。
表45：人源化野生型CD19抗体的变体
Figure BDA0003454763770002901
Figure BDA0003454763770002902
Figure BDA0003454763770002911
已经发现，在根据Kabat的位置27e处进行从S(丝氨酸)到P(脯氨酸)的单个突变可以处理HVR-L1中的所有脱酰胺热点。这是脱酰胺化不倾向于N(天冬酰胺)残基而是倾向于相邻残基的突变。
因此，本文中报道的抗体具有包含氨基酸序列LENPNGNT(SEQ ID NO:193)的HVR-L1。在一个实施方案中，人源化抗人CD19抗体包含具有氨基酸序列LENPSGNT(SEQ ID NO:194)的HVR-L1。
另外，这些抗体保持对食蟹猴CD19的交叉反应性，如下表46所示。
EC50[μg/ml] 变体0 变体5 变体9
huCD19 ECD 0.087 0.084 0.089
cyCD19ECD 0.313 0.255 0.435
野生型人源化抗人CD19抗体(变体0)在纯化后显示出大约7.5％脱酰胺。在pH 7.4保存两周后，脱酰胺抗体的量增加到大约18.5％。具有S27eP突变的变体抗体(变体5)纯化后显示出2％脱酰胺和2％琥珀酰亚胺形成。在pH 7.4 保存两周期间，仅存在大约7.5％脱酰胺抗体。变体5被命名为克隆8B8-018，并被选择用于制备CD19靶向的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
7.1.3具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-018) 靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.1)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图29B描述：人4-1BB 配体、(G4S)2接头、人CH。
将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节(Merchant, Zhu etal.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体 4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB 配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合 CD19的Fab(图30，构建体3.1)。
表47显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.1)的 cDNA和氨基酸序列。
表47：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体3.1)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
Figure BDA0003454763770002921
Figure BDA0003454763770002931
Figure BDA0003454763770002941
Figure BDA0003454763770002951
7.1.4具有不含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的 CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.2)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL 结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和 Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有 S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的 Fab(图30，构建体3.2)。
表48显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.2)的 cDNA和氨基酸序列。
表48：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体3.2)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770002961
Figure BDA0003454763770002971
7.1.5二价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.3)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人 4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、 (G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CD19 huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CD19 huIgG1节单体配体链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CD19的 Fab(图30，构建体3.3)。
表49显示了二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.3)的cDNA和氨基酸序列。
表49：二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 Fc(kih)PGLALA融合物(构建体3.3)的碱基对序列
Figure BDA0003454763770002981
Figure BDA0003454763770002991
Figure BDA0003454763770003001
Figure BDA0003454763770003011
Figure BDA0003454763770003021
Figure BDA0003454763770003031
Figure BDA0003454763770003041
7.1.6具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-018) 靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.4)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248) 的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29B 描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1 重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB 配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W 突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的 Fab(图30，构建体3.4)。
表50显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.4)的 cDNA和氨基酸序列。
表50：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体3.4)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
Figure BDA0003454763770003051
Figure BDA0003454763770003061
7.1.7具有不含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.5)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL 结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W 突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的 Fab(图30，构建体3.5)。
表51显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.5)的 cDNA和氨基酸序列。
表51：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体3.5)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003071
Figure BDA0003454763770003081
7.1.8二价的CD19(8B8-018)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.6)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人 4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、 (G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CD19(克隆8B8-018)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CD19 huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CD19 huIgG1节单体配体链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CD19的 Fab(图30，构建体3.6)。
表52显示了二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.6)的cDNA和氨基酸序列。
表52：二价的CD19(8B8-018)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合物(构建体3.6)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003082
Figure BDA0003454763770003091
Figure BDA0003454763770003101
Figure BDA0003454763770003111
Figure BDA0003454763770003121
Figure BDA0003454763770003131
Figure BDA0003454763770003141
Figure BDA0003454763770003151
7.2 CD19(8B8衍生的亲和力成熟的)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc 融合抗原结合分子以及相应对照分子的制备
7.2.1缺乏热点的8B8衍生的亲和力成熟的抗CD19结合剂的生成
7.2.1.1亲和力成熟的CD19特异性抗体的选择
位于人源化克隆8B8的轻链CDR1中的位置27d和28处的天冬酰胺残基的脱酰胺化导致生物活性的显著降低。因此，生成了2个噬菌体展示文库，其中a)在位置27d和28处的两个天冬酰胺残基都被消除，并且b)重链和轻链的其他CDR被随机化，以便选择具有亲和力提高的8B8变体。
7.2.1.2缺乏LCDR1热点的8B8亲和力成熟文库的生成
使用标准方案，通过噬菌体展示进行亲和力成熟的8B8衍生的抗体的生成，所述抗体没有位于LCDR1中的脱酰胺化位点N27d和N28(Silacci等人， 2005)。在第一步，将人源化亲本克隆8B8的VL和VH DNA序列(SEQ ID NO:215和SEQ ID NO:216)克隆到我们的噬菌粒中，然后将其用作随机化的模板。在下一步，生成了两个文库，用于通过噬菌体展示选择有利的克隆。为了消除上述热点位置，对于两个文库，使用仅允许位置27d和28处的氨基酸S TQ E的LCDR1随机化引物(SEQ ID NO:217)。成熟文库1在轻链和重链两者的CDR1和CDR2中都被随机化，而成熟文库2在轻链的CDR1和CDR3以及重链的CDR3中被随机化。在对应CDR区域中的随机化位置如图31A所示。为了生成成熟文库1，在轻链和重链的CDR1和CDR2中都加以随机化，通过“重叠延伸剪接”(SOE)PCR组装三个片段并克隆到噬菌体载体中(图31B)。使用以下引物组合生成文库片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO:222)和CD19 L1反向随机(SEQ IDNO:217)、片段2(CD19 L2正向随机(SEQ ID NO:218)和CD19 H1 反向随机(SEQ ID NO:219)、和片段3(CD19 H2正向随机(SEQ ID NO:220)和 CD19 H3反向恒定(SEQ ID NO:221)(表53)。在装配足够量的全长随机片段后，与相同处理的受体噬菌粒载体一起用NcoI/NheI进行消化。将3倍摩尔过量的文库插入物与10μg噬菌粒载体连接。纯化的连接物用于20次转化，得到 2×10个exp9转化体。通过PEG/NaCl纯化挽救并纯化展示8B8亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，以备用于选择。
在轻链的CDR1和CDR3以及重链的CDR3中随机类似地进行第二个文库的生成。使用以下引物组合生成文库片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO:222) 和CD19 L1反向随机(SEQ IDNO:217)、片段2(CD19 L1正向恒定(SEQ ID NO:223)和CD19 L3反向随机(SEQ ID NO:224)、和片段3(CD19 L3正向恒定 (SEQ ID NO:225)和CD19 H3反向随机(SEQ ID NO:226)(表54)。在装配足够量的全长随机片段后，与相同处理的受体噬菌粒载体一起用NcoI/KpnI进行消化。将3倍摩尔过量的文库插入物与20μg噬菌粒载体连接。纯化的连接物用于40次转化，得到2×10个exp9转化体。通过PEG/NaCl纯化挽救并纯化展示 8B8亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，以备用于选择。
表53：用于8B8亲和力成熟和热点去除文库L1_L2/H1_H2的引物
Figure BDA0003454763770003161
Figure BDA0003454763770003171
Figure BDA0003454763770003181
表54：用于8B8亲和力成熟和热点去除文库L1_L3/H3的引物
Figure BDA0003454763770003182
Figure BDA0003454763770003191
7.2.1.3缺乏LCDR1热点N27d和N28的亲和力成熟的8B8衍生克隆的选择
为了选择缺乏LCDR1热点N27d和N28的亲和力成熟的克隆，通过噬菌体展示进行了两种选择方法：
在第一种方法中，使用两种噬菌体展示文库对人CD19-Fc融合蛋白实施选择。根据以下模式在溶液中进行各轮淘选：1.约1012个噬菌粒颗粒与30nM 生物素化的CD19-Fc蛋白质以总体积1ml结合0.5小时；2.通过加入5.4×107个链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素化的CD19-Fc蛋白和特异性结合的噬菌体颗粒10分钟；3.使用5x1ml PBS/吐温20和5x1ml PBS洗涤珠子；4.通过加入 1ml 100mM TEA洗脱噬菌体颗粒10分钟，并通过加入500μl 1MTris/HCl pH 7.4进行中和；5.指数生长的大肠杆菌TG1细菌的再感染；以及6.用辅助噬菌体VCSM13感染以及随后的噬菌粒颗粒的PEG/NaCl沉淀，所述噬菌粒颗粒用于随后的选择轮中。使用递减的抗原浓度(30x10-9M、10x10-9M、和3x10-9M) 进行3轮以上的选择。在第2和第3轮中，使用中性亲和素板代替链霉亲和素珠进行抗原:噬菌体复合物的捕获。用5xPBS/吐温20和5xPBS洗涤中性亲和素板。在第3轮中，将中性亲和素板在2升PBS中温育过夜进行“解离速率”选择，然后从板上洗脱噬菌体。此外，在第2轮中使用食蟹猴CD19-Fc蛋白来富集交叉反应性结合剂。
在第二种选择方法中，对在细胞表面上瞬时表达人或食蟹猴CD19 ECD 的细胞实施噬菌体淘选。为了HEK细胞的瞬时转染，生成包含以下蛋白质区段的DNA序列(5'至3')的表达质粒：Flag标签、SNAP标签、人或食蟹猴来源的CD19 ECD、以及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的跨膜区(SEQ ID NO:227和228)。使用用于检测的抗Flag抗体，通过流式细胞术证实细胞表面上对应蛋白质(SEQ ID NO:229和230)的表达。在第一选择轮中，两个文库都暴露于表达含有人或食蟹猴CD19 ECD的融合蛋白的细胞。对于后续的淘选轮，适当地交替使用CD19 ECD的种类。用无关膜蛋白瞬时转染的细胞用于预清除。
根据以下模式进行各轮淘选：
1.根据前述标准程序，用表达CD19 ECD或无关跨膜蛋白的构建体转染HEK 细胞；
2.在5％CO2气氛的培养箱中在37℃、温育细胞总共48h；3.通过离心分离细胞(在250×g下3分钟)，分别将1×10E7 CD19 ECD阳性细胞和1×10E7阴性细胞重悬于PBS/5％BSA中；
3.通过使用轻轻旋转的管旋转器在4℃、用1×107CD19阴性细胞温育噬菌体文库60分钟，预先清除非特异性噬菌体；
4.将细胞在250×g下离心3分钟，将上清液转移到新鲜管中，加入1×10E7 CD19阳性细胞，并通过轻轻旋转管旋转器在4℃、温育60分钟；
5.通过在250×g下离心1分钟洗涤细胞，吸出上清液，重悬于1ml PBS(8倍)中； 6.用1ml 100mM TEA进行噬菌体洗脱，在室温下温育5分钟，用500μl 1M Tris-HCl(pH7.6)中和洗脱液；
7.指数生长的大肠杆菌TG1细菌的再感染；和
8.用辅助噬菌体VCSM13感染以及随后的噬菌粒颗粒的PEG/NaCl沉淀，所述噬菌粒颗粒用于随后的选择轮中。进行3轮以上的选择。
对于两种选择方法，通过ELISA如下鉴定特异性结合剂：将100μl 30nM 生物素化CD19-Fc蛋白/孔包被在中性亲和素板上。加入含Fab的细菌上清液，使用抗Flag/HRP二抗通过其Flag标签检测结合性Fab。
使用经过用含有人CD19 ECD的表达质粒(SEQ ID NO:227)瞬时转染的细胞，在基于细胞的ELISA中进一步测试在重组人CD19方面为ELISA阳性的克隆。该分析如下进行：转染后48h，收获HEK细胞，在250xg下离心5分钟。然后将细胞重悬于冰冷的PBS BSA 2％中至4x106个细胞/ml，在冰上温育20 分钟以阻断非特异性结合位点。将100μl中的4×105个细胞分配到96孔板的每个孔中，并在250xg和4℃、离心3分钟。吸出上清液，将含有可溶性Fab片段的50μl细菌上清液用50μl冰冷的PBS/BSA 2％稀释，加入板中，与细胞混合，在4℃下温育1小时。然后，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，然后每孔加入100μl 含有1:2000稀释的抗Fab-HRP抗体的PBS BSA 2％。温育1小时后，用冰冷的 PBS反复洗涤细胞3次。为了显色，每孔加入100μl“1步超TMB-ELISA”底物。在温育10分钟之后，将上清液转移到每孔含有40μl H2SO4的新的96孔板中，测量在450nm下的吸光度。使用ProteOn XPR36，借助于SPR分析，对显示超过背景的显著信号的克隆进行动力学筛选实验。
7.2.1.4通过SPR鉴定亲和力成熟的8B8衍生变体
为了进一步表征ELISA阳性克隆，通过表面等离子体共振测定解离速率，并与亲本人源化克隆8B8进行比较。
对于该实验，通过胺偶联(NaAcetate pH4.5，25l/min，240s)(垂直取向) 将7000RU的多克隆抗人Fab抗体固定在GLM芯片的所有6个通道上。将每种含抗体的细菌上清液过滤并用PBS稀释2倍，然后以25μl/分钟注入360s，以实现垂直取向为100-400响应单位(RU)的固定水平。单体CD19-Fc的注入：对于一步法动力学测量，将注入方向改变为水平取向，同时以50μl/min沿分开的通道1-4注入纯化的单体CD19-Fc的三倍稀释系列(在150和6nM之间的不同浓度范围)，其中结合时间为180秒，解离时间为300秒。在通道5中注入人IgGFc 片段(150nM)，作为与单体CD19-Fc缓冲液(PBST)特异性结合的阴性对照，所述缓冲液沿着第六通道注入以提供用于参考的“并列”空白。通过以 90μl/min(水平取向)进行30秒的10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH的两次脉冲进行再生。使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合传感图来计算解离速率常数(koff)。鉴定出具有最慢解离速率常数的表达Fab的克隆(表55)。值得注意的是，克隆5A07和5B08的解离速率常数由于拟合不充分而不能确定。然而，两个克隆都被选定，因为获得的结果表明解离非常缓慢。对相应噬菌体的可变结构域进行测序。重要的是， LCDR1中的两个天冬酰胺残基(位置27d和28)都被丝氨酸或苏氨酸替换，表明两个脱酰胺位点都被去除。比对显示在图32中。最佳克隆的CDR列于表 56(轻链的可变区)和表57(重链的可变区)中(克隆5H09:(SEQID NO:231-236)；克隆7H07:(SEQ ID NO:237-242)；克隆2B03:(SEQ ID NO:243-248)；克隆2B11:(SEQ ID NO:249-254)；克隆5A07:(SEQ ID NO:255-260)；克隆5B08:(SEQ ID NO:261-266)；克隆5D08:(SEQ ID NO:267-272)。
表55：在用细菌上清液的筛选分析中获得的选定克隆的解离常数
克隆 解离常数kd(1/s)
亲本8B8 3.01E-4
5H09 2.58E-4
7H07 5.75E-5
2B03 3.24E-5
2B11 4.37E-6
5A07 未检出
5B08 未检出
5D08 1.95E-4
表56：选定8B8轻链的CDR序列
Figure BDA0003454763770003221
Figure BDA0003454763770003231
表57：选定8B8重链的CDR序列
Figure BDA0003454763770003232
7.2.2亲和力成熟的8B8衍生抗体的表征
7.2.2.1可变抗体结构域克隆到表达载体中
将选择的抗CD19结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与人IgG1的恒定重链或恒定轻链进行框内亚克隆。根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831A1中描述的方法，在重链中已引入了Pro329Gly、Leu234Ala和 Leu235Ala突变，以消除与Fcγ受体的结合。
抗CD19 IgG的cDNA和氨基酸序列分别显示在表58和表59中。将抗体编码序列克隆到表达载体中，所述表达载体驱动具有嵌合MPSV启动子的插入片段的转录，并含有位于CDS3'端的合成polyA信号序列。另外，载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
表58：P329GLALA人IgG1形式的抗CD19克隆8B8的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003241
Figure BDA0003454763770003251
表59：P329GLALA人IgG1形式的亲和力成熟的抗CD19克隆的cDNA 和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003261
Figure BDA0003454763770003271
Figure BDA0003454763770003281
Figure BDA0003454763770003291
Figure BDA0003454763770003301
Figure BDA0003454763770003311
Figure BDA0003454763770003321
Figure BDA0003454763770003331
Figure BDA0003454763770003341
Figure BDA0003454763770003351
Figure BDA0003454763770003361
Figure BDA0003454763770003371
Figure BDA0003454763770003381
Figure BDA0003454763770003391
Figure BDA0003454763770003401
Figure BDA0003454763770003411
Figure BDA0003454763770003421
7.2.2.2通过SPR进行的所选抗体的亲和力测定
为了通过SPR准确测定亲和力，使用聚乙烯亚胺，通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞而产生选择的抗CD19抗体。根据标准程序，用1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”)的相应表达载体转染细胞。转染后7天，测定上清液中的抗体效价，并将所有效价平衡至10μg/ml。
使用ProteOn XPR36仪(Biorad)，通过SPR在25℃、测定亲本抗体8B8及其衍生物的亲和力(KD)。通过胺偶联(NaAcetate pH4.5，25μl/min，240s)(垂直取向)将7000RU的多克隆抗人Fab抗体固定在GLM芯片的所有6个通道上。过滤每种含抗体的HEK上清液，用PBST(10mM磷酸盐、150M氯化钠pH7.4、 0.005％吐温20)稀释至10μg/ml的浓度，然后以25μl/分钟注入360s以达到在垂直取向上在500和800响应单位(RU)之间的固定水平。单体CD19-Fc的注入：对于一步法动力学测量，将注入方向改变为水平取向，同时以50μl/min沿分开的通道1-4注入纯化的单体CD19-Fc的三倍稀释系列(在150和6nM之间的不同浓度范围)，其中结合时间为180秒，解离时间为300秒。将人IgG Fc片段(150 nM)注入通道5中，作为与单体CD19-Fc特异性结合的阴性对照。沿着第六通道注入缓冲液(PBST)以提供用于参考的“并列”空白。对应的传感图的概述如图33所示。通过以90μl/min(垂直取向)进行30秒的10mM甘氨酸pH 1.5和50 mM NaOH的两次脉冲进行再生。使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/kon比。动力学和热力学数据的总结如表60所示。与其亲本克隆8B8相比，所有亲和力成熟克隆的解离常数均提高。
表60：在抗CD19 huIgG1与人CD19之间相互作用的动力学和热力学数据总结
克隆 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
亲本8B8 5.66E+4 1.34E-4 2.36E-9
5H09 7.91E+4 1.50E-5 1.89E-10
7H07 7.45E+4 5.57E-5 7.47E-10
2B03 6.02E+4 5.00E-5 8.31E-10
2B11 6.34E+4 3.14E-5 4.95E-10
5A07 6.98E+4 3.07E-5 4.40E-10
5B08 6.81E+4 5.26E-5 7.72E-10
5D08 8.88E+4 8.44E-5 9.51E-10
7.2.2.3抗CD19 IgG1 P329G LALA的制备和纯化
使用聚乙烯亚胺，通过用哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞而产生选择的抗CD19抗体。用1:1比率(“载体重链”:“载体轻链”)的相应表达载体转染细胞。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA 细胞。在转染之前，细胞在210xg下离心5分钟，并将上清液替换为预热的 CD CHO培养基。在20mL CD CHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％的含有补充剂的补料。培养7天后，通过在210xg下离心15分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过如上所述的用于纯化抗原Fc融合物的使用蛋白A的亲和色谱法来进行来自细胞培养上清液的抗体分子的纯化。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用20mM组氨酸、140mMNaCl溶液(pH 6.0)平衡的HiLoad Superdex 200柱 (GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的OD来确定纯化抗体的蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(Invitrogen,USA)的情况下，使用LabChipGXII(Caliper)，通过CE-SDS分析抗体的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mML-精氨酸一氢氯化物、0.02％ (w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析抗体样品的聚集物含量(表61)。
表61：抗CD19 P329G LALA IgG1克隆的生物化学分析
Figure BDA0003454763770003441
为了制备双特异性构建体，选择克隆2B11是因为它缺乏三个脱酰胺热点。
根据Uniprot数据库的P41273序列，合成了编码人4-1BB配体的胞外域部分(氨基酸71-254和71-248)的DNA序列。
7.2.3具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11) 靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.1)的制备
如构建体3.1(图30)所述制备构建体4.1，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表62显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.1)的 cDNA和氨基酸序列。
表62：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体4.1)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
Figure BDA0003454763770003451
Figure BDA0003454763770003461
Figure BDA0003454763770003471
Figure BDA0003454763770003481
7.2.4具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11) 靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.2)的制备
如构建体3.2(图30)所述制备构建体4.2，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表63显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.2) 的cDNA和氨基酸序列。
表63：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体4.2)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003482
Figure BDA0003454763770003491
7.2.5二价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.3)的制备
如构建体3.3(图30)所述制备构建体4.3，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表64显示了二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.3)的cDNA和氨基酸序列。
表64：二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 Fc(kih)PGLALA融合物(构建体4.3)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003492
Figure BDA0003454763770003501
Figure BDA0003454763770003511
Figure BDA0003454763770003521
Figure BDA0003454763770003531
Figure BDA0003454763770003541
Figure BDA0003454763770003551
7.2.6具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11) 靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.4)的制备
如构建体3.4(图30)所述制备构建体4.4，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表65显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.4)的 cDNA和氨基酸序列。
表65：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体4.4)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
Figure BDA0003454763770003561
Figure BDA0003454763770003571
7.2.7具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CD19(8B8-2B11) 靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.5)的制备
如构建体3.5(图30)所述制备构建体4.5，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表66显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.5) 的cDNA和氨基酸序列。
表66：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体4.5)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003572
Figure BDA0003454763770003581
7.2.8二价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体4.6)的制备
如构建体3.6(图30)所述制备构建体4.6，不过使用编码对CD19特异的结合剂(克隆8B8-2B11)的重链和轻链DNA序列的可变区。
表67显示了二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体3.6)的cDNA和氨基酸序列。
表67：二价的CD19(8B8-2B11)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合物(构建体4.6)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003582
Figure BDA0003454763770003591
Figure BDA0003454763770003601
Figure BDA0003454763770003611
Figure BDA0003454763770003621
Figure BDA0003454763770003631
Figure BDA0003454763770003641
Figure BDA0003454763770003651
7.3非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合物和作为对照分子的人 IgG的制备
7.3.1非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备
如上对于CD19靶向的构建体3.1(称为对照B)、3.3(称为对照C)、3.4(称为对照D)和3.5(称为对照E)所述制备了对照分子，唯一的区别是抗CD19结合剂 (VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照(参见图30)。
表68分别显示了包含具有带电残基的交叉CH-CL的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物对照B的cDNA和氨基酸序列。
表69分别显示了二价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)融合物对照C的cDNA和氨基酸序列。
表70分别显示了包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物对照D的cDNA和氨基酸序列。
表71分别显示了在CH-CL交叉中无带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物对照E的cDNA和氨基酸序列。
表68：具有CH-CL交叉且具有带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(对照B)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
Figure BDA0003454763770003652
Figure BDA0003454763770003661
表69：二价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-254)Fc(kih) 融合物(对照C)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003662
表70：具有CH-CL交叉且具有带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(对照D)的cDNA和氨基酸序列。*带电残基
Figure BDA0003454763770003663
Figure BDA0003454763770003671
表71：具有CH-CL交叉且无带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的人4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(对照E)的cDNA和氨基酸序列。
Figure BDA0003454763770003672
7.3.2作为对照分子的抗体
制备含有PGLALA的两种对照人IgG1。
表72显示了抗CD19 huIgG1 PGLALA(克隆8B8-018)即对照G的cDNA和氨基酸序列。
表73显示了种系对照DP47 huIgG1 PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列。
表72：抗CD19(8B8-018)huIgG1 PGLALA(对照G)的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003681
Figure BDA0003454763770003691
Figure BDA0003454763770003701
表73：种系对照DP47 huIgG1 PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003702
7.4 CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合抗原结合分子及其对照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子。用相应的表达载体转染细胞。对于变体1、2、4、5及其对照B、D和E，比率为1:1:1:1(“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合-CH1载体”:“抗CD19 Fab穴链载体“:”抗 CD19轻链载体“)。对于变体3、6及其对照C，比率为1:1:1(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗CD19轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用1:1比率的轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA 细胞。为了转染，细胞在210xg下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总 DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后一天，加入12％补料(氨基酸和葡萄糖)。培养7天后，通过在至少400xg下离心30-40 分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化分拆三聚体的 4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子以及IgG，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM 柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度 (OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过 SDS-PAGE来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mML-精氨酸一氢氯化物、0.02％ (w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表74总结了CD19靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合抗原分子的产率和最终单体含量。
表74：CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的生物化学分析
Figure BDA0003454763770003721
Figure BDA0003454763770003731
表75总结了单价(对照B、D和E)和二价(对照C)的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合物的产率和最终单体含量。
表75：DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
Figure BDA0003454763770003732
表76总结了抗CD19(8B8-018)和种系DP47人IgG1 PGLALA(对照F)的产率和最终单体含量。
表76：人IgG1 PGLALA对照的生物化学分析
Figure BDA0003454763770003733
实施例8
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
8.1.表面等离子体共振(亲和力)
通过表面等离子体共振(SPR)评估CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合抗原结合分子(构建体3.4和3.6)与重组4-1BB Fc(kih)和CD19的结合。所有SPR实验均在25℃、在Biacore T200上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15MNaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20， Biacore,Freiburg/Germany)。
与人和食蟹猴4-1BB的相互作用
使用标准胺偶联试剂盒(Biacore,Freiburg/Germany)，将抗人Fab抗体(Biacore,Freiburg/Germany)在pH 5.0下直接偶联在CM5芯片上。固定化水平大致为8000RU。以2nM和5nM捕获CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc 融合物60秒(还注入对照D)。使2.7至2000nM浓度范围(3倍稀释)的重组人或食蟹猴4-1BB avi His以30μL/分的流速通过流动池120秒。监测解离180秒。通过减去在参考流动池上获得的响应来校正本体折射率的差异。在这里，使固定化的抗人Fab抗体在抗原的表面上流过，但在抗原表面上已经注入了除抗体之外的HBS-EP。
与CD19的相互作用
使用标准胺偶联试剂盒(Biacore,Freiburg/Germany)，将抗人Fab抗体(Biacore,Freiburg/Germany)在pH 5.0下直接偶联在CM5芯片上。固定化水平大致为8000RU。以20nM捕获CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合物或对照抗体(抗CD19(8B8-018)huIgG1 PGLALA)60秒。使7.8至500nM浓度范围(2倍稀释)的重组人CD19-Fc(kih)以30μL/分的流速通过流动池120秒。监测解离120/1800秒。通过减去在参考流动池上获得的响应来校正本体折射率的差异。在这里，使固定化的抗人Fab抗体在抗原的表面上流过，但在抗原表面上已经注入了除抗体之外的HBS-EP。
使用Biacore T200 Evaluation Software(vAA,Biacore AB, Uppsala/Sweden)推导动力学常数，通过数值积分拟合1:1 Langmuir结合的速率方程。
双特异性构建体3.4、3.6和对照D相似地与4-1BB结合。表77显示了来自两个实验(使用2nM或5nM的构建体捕获溶液)的标准偏差(括号中)的平均值。双特异性构建体3.4和3.6以与IgG相似的亲和力结合人CD19。通过拟合到1:1Langmuir结合来确定相互作用的亲和常数。对于hu4-1BB和cy4-1BB的测量，显示了平均值和标准偏差(括号中)(两个实验使用2nM或5nM捕获溶液)。
表77：CD19靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合物与重组人 (hu)4-1BB、食蟹猴(cy)4-1BB和人(hu)CD19的结合。
Figure BDA0003454763770003751
8.2.表面等离子体共振(同时结合)
通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人CD19的能力。所有SPR实验均在25℃、在Biacore T200上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPESpH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。将生物素化的人4-1BB Fc(kih)与链霉亲和素(SA)传感器芯片的流动池直接偶联。使用高达250个共振单位(RU)的固定化水平。
使200nM浓度范围的CD19靶向的三聚体的分拆的4-1BBL构建体(构建体3.1、3.3、3.4、3.5、3.6、4.4)以30μL/分的流速通过流动池90秒，并且将解离设置为零秒。以500nM的浓度将人CD19作为第二分析物以30μL/分的流速注入通过流动池90秒(图34)。监测解离120秒。通过减去在参考流动池中获得的响应来校正本体折射率的差异，其中参考流动池没有固定化的蛋白质。
从图35的曲线图可以看出，所有双特异性构建体可以同时结合人4-1BB 和人CD19。
实施例9
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
9.1.CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在活化的人PBMC上的结合
为了确定含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子与人PBMC的结合，在如实施例5.2所述的测定中使用不同滴定浓度的CD19靶向的含有4-1BBL 三聚体的Fc融合抗原结合分子。
图36A和36B分别显示在实施例7中制备的构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6 在表达4-1BB的活化CD4+和CD8+T细胞上的结合。设门于活的CD45+CD3+ CD4+或CD45+CD3+CD8+T细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 Fc融合变体的滴定浓度进行印迹。表78显示了对构建体3.1、3.3、3.4、3.5和 3.6和对照分子测量的EC50值。
表78：在表达4-1BB的活化CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
Figure BDA0003454763770003761
Figure BDA0003454763770003771
9.2与表达CD19的肿瘤细胞结合
对于表达CD19的肿瘤细胞的结合测定，使用以下表达人CD19的淋巴瘤细胞系：弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞系SU-DHL-8(DSMZ ACC573)、急性前体B细胞淋巴样白血病细胞系Nalm6(DSMZ ACC-128)、弥漫性大细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞系Toledo(ATCC CRL-2631)和弥漫性大B 细胞淋巴瘤细胞系OCI-Ly18(DSMZ ACC-699)。如实施例5.3中针对表达FAP 的MV-3和WM-266-4肿瘤细胞系所述进行测定。
设门于活的肿瘤细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合构建体的滴定浓度进行印迹。
图37A显示了实施例7.1中制备的构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6与弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞系SU-DHL-8的结合，并且在图37B中显示了构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6与急性前体B细胞淋巴样白血病细胞系 Nalm6的结合。图37C显示了构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6与弥漫性大细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞系Toledo的结合，并且图37D显示了构建体3.1、3.3、 3.4、3.5和3.6与弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系OCI-Ly18的结合。表79显示了对构建体3.1、3.3、3.4、3.5和3.6和对照分子测量的EC50值。
表79：与表达CD19的肿瘤细胞结合
Figure BDA0003454763770003772
实施例10
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性
10.1.在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NF-κB活化
如实施例6.1所述生成表达人4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞。
与表达CD19的肿瘤细胞共培养的表达人4-1BB的Hela细胞中的NF-κB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS 和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/ml。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有滴定浓度的CD19靶向的含有4-1BB 配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(CD19分拆4-1BBL三聚体)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL 三聚体)的培养基。将表达CD19的B细胞淋巴瘤细胞系(弥漫性大B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)细胞系SU-DHL-8(DSMZACC573)和人B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系Pfeiffer(ATCC CRL-2632))重悬于补充有10％(v/v)FBS和 1％(v/v)GlutaMAX-I的DMEM培养基中，浓度为2x106个细胞/ml。
向每个孔中加入表达CD19的B细胞淋巴瘤细胞悬液(50μl，最终比率 1:5)或仅加入培养基，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。细胞用200μL/ 孔的DPBS洗涤两次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液 (Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)在室温下解冻。将100μL的检测缓冲液加入每个孔中，使用SpectraMax M5/M5e 酶标仪和以URL计数光发射(0.5s/孔的释放光单位数)的SoftMax Pro Software(MolecularDevices)或Victor3 1420多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和将光发射计数为每秒计数(CPS)的Perkin Elmer 2030Manager Software，尽可能快地测量萤光素酶活性，并针对测试构建体的浓度进行印迹。
CD19靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体3.1和 3.3在存在表达CD19的B细胞淋巴瘤细胞的情况下触发了报告细胞系中的 NF-kB信号通路的激活。相比之下，非靶向的对照分子在任何测试浓度下都不能触发这种效应(图38)。
实施例11
11.1 CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
11.1.1抗CEA克隆T84.66的人源化
通过将CDR移植到人种系框架受体序列上，开发了鼠抗体T84.66的新型人源化变体(Wagener等人，J Immunol 130,2308(1983),Neumaier等人，J Immunol 135,3604(1985))。
来自非人源的抗体的人源化主要包括将来自非人抗体(供体)的CDR残基移植到人(受体)抗体的框架上。通常，通过如下方式选择受体框架：将供体的序列与潜在受体序列的集合比对并选择与供体具有合理同源性、或在某些位置显示出对结构和活性关键的相似氨基酸的受体框架。在当前的情况下，通过如下方式进行抗体受体框架的搜索：将小鼠T84.66蛋白(重链(SEQ ID NO:317)的NCBI登录号CAA36980，轻链(SEQ ID NO:318)的NCBI登录号CAA36979)序列与人类种系序列的集合进行比对，并挑选显示出高序列同一性的人序列。这里，从IMGT数据库选择序列IGHV1-69*08作为重链框架受体序列(IMGT登录号Z14309，SEQID NO:319)并且选择IGKV3-11*01序列 (IMGT登录号X01668，SEQ ID NO:320)作为轻链的框架受体。在这两个受体框架上，移植了小鼠重链和轻链可变结构域的三个互补决定区(CDR)。由于框架4(FR4)区不是种系V基因的可变区的一部分，因此单独进行该位置的比对。对于重链选择JH4序列，并且对于轻链选择JK2序列。
11.1.2 T84.66 IgG的不同人源化变体与细胞的结合
检测T84.66 IgG的不同人源化变体在表达CEA的人胃腺癌细胞 (MKN45，DSMZ ACC409)上的结合。
收获细胞，计数，检查活力，并以2x106个细胞/ml重悬于FACS缓冲液(100lPBS0.1％BSA)中。将100μl细胞悬液(含有0.2x106个细胞)在圆底96孔板中在4℃、温育30分钟，逐渐增加CEA IgG的浓度(4ng/ml-60μg/ml)，用冷 PBS 0.1％BSA洗涤两次，在4℃、用PE缀合的AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG Fcg片段特异性二抗(JacksonImmuno Research Lab PE#109-116-170)进一步在再次温育30分钟，用冷PBS 0.1％BSA洗涤两次，并使用FACS CantoII (Software FACS Diva)通过FACS立即进行分析。使用GraphPadPrism5获得并计算结合曲线和EC50值。
图39显示了选择的T84.66 IgG的人源化变体与在MKN45细胞上表达的人CEA的不同结合模式。基于计算的EC50结合值(表80)，选择人源化变体1 用于进一步评价。
表80：T84.66 IgG的不同人源化变体与细胞的结合(EC50值，基于图39 所示的结合曲线，通过Graph Pad Prism进行计算)。
EC<sub>50</sub>(μg/ml)
亲本嵌合的T84.66 0.99
人源化变体1 1.5
人源化变体2 8.6
人源化变体3 1.4
人源化变体4 3.1
人源化变体5 -
人源化变体6 -
人源化变体1在下文称为T84.66-LCHA。其CDR以及VH和VL的氨基酸序列连同亲本嵌合T84.66克隆的VH和VL结构域的氨基酸序列示于表 81中。
表81：CEA克隆T84.66-LCHA及其亲本抗体T84.66的可变结构域的氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003801
Figure BDA0003454763770003811
11.2 CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P41273序列(SEQ ID NO:42)，合成了编码人4-1BB 配体的胞外域部分(氨基酸71-254和71-248)的DNA序列的不同片段。
11.2.1具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的 CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih) 融合抗原结合分子(构建体5.1)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图29B描述：人4-1BB 配体、(G4S)2接头、人CH。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CEA-Fc穴链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA 的Fab(图40，构建体5.1)。
表82显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.1) 的cDNA和氨基酸序列。
表82：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA) 靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体5.1)的cDNA 和氨基酸序列。*为带电残基
Figure BDA0003454763770003821
Figure BDA0003454763770003831
Figure BDA0003454763770003841
Figure BDA0003454763770003851
11.2.2具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的 CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih) 融合抗原结合分子(构建体5.2)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL 结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和 Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有 S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CEA-Fc穴链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA的 Fab(图40，构建体5.2)。
表83显示了具有无带电残基的交叉CH-CL的单价的CEA(T84.66-LCHA) 靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.2) 的cDNA和氨基酸序列。
表83：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA) 靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体5.2)的cDNA 和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003861
Figure BDA0003454763770003871
11.2.3二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.3)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、 (G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据 WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala 突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴二聚体配体链、含有 S354C/T366W突变的抗CEA huIgG1节单体配体链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CEA的Fab(图 40，构建体5.3)。
表84显示了二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.3)的cDNA和氨基酸序列。
表84：二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)PGLALA融合物(构建体5.3)的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003872
Figure BDA0003454763770003881
Figure BDA0003454763770003891
Figure BDA0003454763770003901
Figure BDA0003454763770003911
Figure BDA0003454763770003921
Figure BDA0003454763770003931
Figure BDA0003454763770003941
11.2.4具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的 CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih) 融合抗原结合分子(构建体5.4)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29A描绘：人4-1BB配体、 (G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248) 的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图29B 描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH。
将与人CL结构域融合的编码二聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1 重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)。为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB 配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W 突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA的 Fab(图40，构建体5.4)。
表85显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.4) 的cDNA和氨基酸序列。
表85：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA) 靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体5.4)的cDNA 和氨基酸序列。*带电残基
Figure BDA0003454763770003942
Figure BDA0003454763770003951
11.2.5具有无带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih) 融合抗原结合分子(构建体5.5)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29A)描绘，但没有在CL 结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-248)的一个胞外域并与人IgG1-CH1结构域融合的多肽进行克隆，类似于如图(29B)描绘，但没有在CH1结构域中的氨基酸突变：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CH1。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有S354C/T366W 突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CEA-Fc穴链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CD19的 Fab(图40，构建体5.5)。
表86显示了包含无带电残基的交叉CH-CL的单价的CEA(T84.66-LCHA) 靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.5) 的cDNA和氨基酸序列。
表86：包含无带电残基的CH-CL交叉的单价的CEA(T84.66-LCHA) 靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-248)Fc(kih)融合物(构建体5.5)的cDNA 和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003961
11.2.6二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.6)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-248)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人 4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、 (G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CEA(克隆T84.66-LCHA)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala 突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴二聚体配体链、含有 S354C/T366W突变的抗CEA huIgG1节单体配体链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CEA的Fab(图 40，构建体5.6)。
表87显示了二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.6)的cDNA和氨基酸序列。
表87：二价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合物(构建体5.6)的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770003971
Figure BDA0003454763770003981
Figure BDA0003454763770003991
Figure BDA0003454763770004001
Figure BDA0003454763770004011
Figure BDA0003454763770004021
Figure BDA0003454763770004031
11.2.7具有含带电残基的交叉CH1-CL结构域的单价的CEA(T84.66) 靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.7)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域并与人 IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图29A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2 接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人CL。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图29B描述：人4-1BB 配体、(G4S)2接头、人CH。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
将编码对CEA(克隆T84.66)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗CD19-Fc穴链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和结合CEA 的Fab。构建体5.7对应于构建体5.1，如图40所示。
表88显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.7)的cDNA 和氨基酸序列。
表88：包含具有带电残基的交叉CH-CL的单价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体(71-254)Fc(kih)融合物(构建体5.7)的cDNA和氨基酸序列。*为带电残基
Figure BDA0003454763770004041
Figure BDA0003454763770004051
Figure BDA0003454763770004061
Figure BDA0003454763770004071
Figure BDA0003454763770004081
11.2.8二价的CEA(T84.66)靶向的含有4-1BB配体(71-254)三聚体的 Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.8)的制备
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254)的两个胞外域的多肽与人IgG1Fc穴链的C末端融合，如图29C描绘：人IgG1 Fc穴、(G4S)2接头、人 4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。将含有4-1BB配体(71-254)的一个胞外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端融合，如图29D描述：人IgG1 Fc节、 (G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对CEA(克隆T84.66)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。含有 Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴二聚体配体链、含有S354C/T366W突变的抗CEA huIgG1节单体配体链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CEA的Fab。构建体5.8对应于构建体5.3，如图40所示。
表89显示了二价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体5.8)的cDNA和氨基酸序列。
表89：二价的CEA(T84.66)靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)PGLALA融合物(构建体5.8)的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770004082
Figure BDA0003454763770004091
Figure BDA0003454763770004101
Figure BDA0003454763770004111
Figure BDA0003454763770004121
Figure BDA0003454763770004131
Figure BDA0003454763770004141
Figure BDA0003454763770004151
11.3非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合分子和作为对照分子的人IgG的制备
11.3.1非靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(对照分子)的制备
如上对于CEA靶向的构建体3.1(称为对照B)、3.3(称为对照C)、3.4(称为对照D)和3.5(称为对照E)所述制备了对照分子，唯一的区别是抗CD19结合剂 (VH-VL)替换为不与抗原结合的被称为DP47的种系对照(参见图40)。包含具有带电残基的交叉CH-CL的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)融合物(对照B)的cDNA和氨基酸序列显示在表68中(参见实施例7.3.1)。表69显示了二价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-254)Fc(kih)融合物(对照C)的cDNA和氨基酸序列。表70显示了包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合物(对照D)的cDNA和氨基酸序列。表71显示了在CH-CL 交叉中无带电残基的单价的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体 (71-248)Fc(kih)融合物(对照E)的cDNA和氨基酸序列。
11.3.2作为对照分子的抗体
在测定中使用的另外的对照(称为对照F)是DP47非靶向的种系对照(人 IgG1)，其含有Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除与Fcγ受体的结合。对照F的cDNA和氨基酸序列可以在上面的表73中找到。
11.4 CEA靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合抗原结合分子及其对照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物。用相应的表达载体转染细胞。对于变体1、2、4、5及其对照B、D和E，比率为1:1:1:1(“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合-CH1载体”:“抗CEA Fab穴链载体“:”抗CEA轻链载体“)。对于变体3、6及其对照C，比率为1:1:1(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗CEA轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用1:1比率的轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA 细胞。为了转染，细胞在210xg下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总 DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、 5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后一天，加入12％补料(氨基酸和葡萄糖)。培养7天后，通过在至少400xg下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化分拆三聚体的 4-1BB配体Fc(kih)融合物以及IgG，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GEHealthcare的树脂)上。通过用至少 6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、 100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度 (OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用 CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过 SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的纯度和分子量。使用在25 mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh) 在25℃分析样品的聚集物含量。
表90总结了CEA靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表90：CEA靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
Figure BDA0003454763770004171
表91总结了单价(对照B、D和E)和二价(对照C)的DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合分子以及种系DP47人IgG1 PGLALA(对照F)的产率和最终单体含量。
表91：DP47非靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
Figure BDA0003454763770004181
实施例12
CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
12.1表面等离子体共振(同时结合)
作为CEA靶向的三聚体分拆4-1BBL构建体的抗原的hu NA3B3A2的产生
用于通过SPR评估与CEA结合的抗原是由来自人CEACAM5(CEA)的A3 和B3结构域以及来自人CEACAM1(BGP1)的N和A2结构域组成的杂交分子，类似于针对NABA所述(Durbin H.等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1994May 10；91(10):4313-7)。在这里的抗原称为NA3B3A2，其示意性描述可以在图41A 中找到。
表92显示了hu NA3B3A2-avi-His的核苷酸和氨基酸序列。
表92：hu NA3B3A2-avi-His的核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA0003454763770004182
Figure BDA0003454763770004191
Figure BDA0003454763770004201
如上对Fc融合蛋白所描述(实施例7.1.1)进行蛋白质生产。通过螯合色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。第一个色谱步骤在20mM磷酸钠、500nM氯化钠(pH7.4)中平衡的NiNTA Superflow Cartridge(5ml,Qiagen)上进行。通过施加超过12个柱体积的5％到45％梯度的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、500nM氯化钠、500mM咪唑，pH7.4)的洗脱缓冲液进行洗脱。
将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用20mM组氨酸、140mM NaCl、 0.01％吐温20pH6.0平衡的HiLoad Superdex 75柱(GE Healthcare)上。表93总结了人NA3B3A2-avi-His的产率和最终单体含量。
表93：人NA3B3A2-avi-His的生物化学分析
Figure BDA0003454763770004211
通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人 NA3B3A2的能力。所有SPR实验均在25℃、在Biacore T200上进行，使用 HBS-EP作为运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、 0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。将生物素化的人4-1BB Fc(kih)与链霉亲和素(SA)传感器芯片的流动池直接偶联。使用高达250个共振单位(RU)的固定化水平。
使200nM浓度范围的CEA靶向的三聚体的分拆的4-1BBL构建体(构建体 5.4、5.6、5.7和5.8)以30μL/分的流速通过流动池90秒，并且将解离设置为零秒。以500nM的浓度将人NA3B3A2作为第二分析物以30μL/分的流速注入通过流动池90秒(图41B)。监测解离120秒。通过减去在参考流动池中获得的响应来校正本体折射率的差异，其中参考流动池没有固定化的蛋白质。
从图42的曲线图可以看出，所有双特异性构建体可以同时结合人4-1BB 和人NA3B3A2。
12.2.CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在活化的人PBMC上的结合
为了确定含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子与人PBMC的结合，在如实施例5.2所述的测定中使用不同滴定浓度的CEA靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc融合抗原结合分子。
图43显示了在实施例11中制备的构建体5.4、5.6、5.7和5.8分别在表达4-1BB的活化CD4+和CD8+T细胞上的结合。设门于活的CD45+CD3+CD4+ 或CD45+CD3+CD8+T细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ- 片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合变体的滴定浓度进行印迹。表94显示了对构建体5.4、5.6、5.7和5.8以及对照分子测量的EC50值。
表94：在表达4-1BB的活化CD4+T细胞和CD8+T细胞上的结合
Figure BDA0003454763770004212
Figure BDA0003454763770004221
12.2与表达CEA的肿瘤细胞结合
对于表达CEA的肿瘤细胞的结合测定，使用以下表达人CEA的淋巴瘤细胞系：表达CEA的肿瘤细胞系人胃癌细胞系MKN-45(ATCC TCP-1008)和人结肠直肠腺癌细胞系LS180(ATCC CL-187)。如实施例5.3中针对表达FAP的 MV-3和WM-266-4肿瘤细胞系所述进行测定。
设门于活的肿瘤细胞上，并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ-片段特异性山羊F(ab`)2片段的MFI针对靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc融合构建体的滴定浓度进行印迹。
图44显示了实施例11.2.7中制备的构建体5.7与表达人CEA的人胃细胞系 MKN-45(左)和人结肠直肠腺癌细胞系LS180(右)的结合。表95显示了对表达人CEA的人胃细胞系MKN-45测量的EC50值。
表95：与表达CEA的肿瘤细胞结合
Figure BDA0003454763770004222
实施例13
CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性
13.1.在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NF-κB活化
如实施例6.1所述生成表达人4-1BB和NF-κB-萤光素酶的HeLa细胞。
与表达人CEA的肿瘤细胞共培养的表达人4-1BB的Hela细胞中的NF-κB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS 和1％(v/v)GlutaMAX-1的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/ml。将100μl(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下过夜。次日加入50μL含有滴定浓度的CEA靶向的含有4-1BB 配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(CEA分拆4-1BBL三聚体)或DP47非靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(DP47分拆4-1BBL三聚体)的培养基。将表达CEA的肿瘤细胞系人胃癌细胞系MKN-45(ATCC TCP-1008)重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的DMEM培养基中，浓度为2x106个细胞/ml。
向每个孔中加入表达CEA的B细胞淋巴瘤细胞悬液(50μl，最终比率1:5) 或仅加入培养基，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。细胞用200μL/孔的 DPBS洗涤两次。向每个孔中加入40μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液 (Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃、保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase 1000Assay System，Promega，目录号E4550)在室温下解冻。将100μL的检测缓冲液加入每个孔中，使用SpectraMax M5/M5e 酶标仪和以URL计数光发射(0.5s/孔的释放光单位数)的SoftMax Pro Software(MolecularDevices)或Victor3 1420多标记计数器酶标仪(Perkin Elmer)和将光发射计数为每秒计数(CPS)的Perkin Elmer 2030Manager Software，尽可能快地测量萤光素酶活性，并针对测试构建体的浓度进行印迹。
CEA靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子构建体5.7和 5.8在存在人胃癌细胞系MKN-45细胞的情况下触发了报告细胞系中的NF-kB 信号通路的激活。相比之下，非靶向的对照分子在任何测试浓度下都不能触发这种效应(图45)。表96显示了相应的EC50值。
表96：与表达CEA的肿瘤细胞结合
Figure BDA0003454763770004231
Figure BDA0003454763770004241
实施例14
14.1 FAP靶向的含有OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备
根据Uniprot数据库的P23510序列，合成了编码人OX40配体的胞外域部分(氨基酸51-183)的DNA序列。为了降低由于糖基化引起的人Ox40配体的异质性，通过定点诱变将位置90和114的天冬酰胺残基突变为天冬氨酸(根据 Compaan D.M.,Hymowitz S.G.,Structure(2006)14(8),1321-30)。
将含有被(G4S)2接头分开的OX40配体的两个胞外域并与人IgG1-CL结构域融合的多肽进行克隆，如图46A描绘：人OX40配体、(G4S)2接头、人 OX40配体、(G4S)2接头、人CL。
将含有OX40配体的一个胞外域并与人IgG1-CH结构域融合的多肽进行克隆，如图46B描述：人OX40配体、(G4S)2接头、人CH。
为了提高正确的配对，在交叉CH-CL中引入以下突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中，引入突变E123R和Q124K。在与人CH1融合的单体4-1BB配体中，引入突变K147E和K213E。
FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
将编码对FAP(克隆28H11)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。根据WO 2012/130831中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的二聚体配体-Fc节链、单体CH1融合物、含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的OX40配体和结合FAP 的Fab(图46C，构建体6.1)。
表97显示了具有交叉CH-CL和带电残基的单价的CEA(T84.66-LCHA)靶向的分拆三聚体的OX40配体(51-183)Fc(kih)融合抗原结合分子(构建体6.1) 的cDNA和氨基酸序列。
表97：包含具有带电残基的CH-CL交叉的单价的FAP(28H1)靶向的分拆三聚体的OX40配体Fc(kih)融合物(构建体6.1)的cDNA和氨基酸序列。* 为带电残基
Figure BDA0003454763770004251
Figure BDA0003454763770004261
Figure BDA0003454763770004271
Figure BDA0003454763770004281
Figure BDA0003454763770004291
14.2作为对照F的非靶向人IgG1的制备
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831中描述的方法，在测定法中使用的称为对照F(图46D)的对照分子为DP47非靶向的种系对照人IgG1，其含有Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变，以消除与Fcγ受体的结合。其制备描述于实施例2.3中，表29显示了非靶向的DP47 huIgG1 PGLALA(对照F)的cDNA和氨基酸序列。
14.3 FAP靶向的分拆三聚体的OX40配体Fc融合抗原结合分子及其对
照分子的产生
将靶向和非靶向的分拆三聚体的OX40配体Fc(kih)融合物编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生分拆三聚体的OX40配体Fc(kih)融合物。用相应的表达载体转染细胞。对于变体1、2、4、5及其对照B、D和E，比率为1:1:1:1(“二聚体配体-CL-节链载体”:“单体配体融合-CH1载体”:“抗FAP Fab穴链载体“:”抗FAP轻链载体“)。对于变体3、6及其对照C，比率为1:1:1(“huIgG1 Fc穴二聚体配体链载体”:“huIgG1 Fc节单体配体链载体”:“抗FAP轻链载体”)。产生了关于双特异性构建体(为了转染，仅使用1:1比率的轻链载体和重链载体)的在测定中用作对照的人IgG。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA 细胞。为了转染，细胞在210xg下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后一天，加入12％补料(氨基酸和葡萄糖)。培养7天后，通过在至少400xg下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化分拆三聚体的 OX40配体Fc(kih)融合抗原结合分子以及IgG，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM 柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度 (OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用 CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过 SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh) 在25℃分析样品的聚集物含量。
表98总结了FAP靶向的分拆三聚体的Ox40配体Fc(kih)融合抗原结合分子以及种系DP47人IgG1 PGLALA(对照F)的产率和最终单体含量。
表98：CEA靶向的分拆三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的生物化学分析
Figure BDA0003454763770004301
Figure BDA0003454763770004311
实施例15
靶向的含有OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
15.1与表达人FAP的肿瘤细胞的结合
使用WM-266-4细胞(ATCC CRL-1676)检测与细胞表面FAP的结合。将0.5 x105个WM-266-4细胞加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。将细胞在含有逐步滴加的抗Ox40抗体构建体的 50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液(Gibco by Life Technologies，目录号14190 326) 和BSA(0.1％v/w,Sigma-Aldrich，目录号A9418)中在4℃、在黑暗中染色120 分钟。用过量的FACS缓冲液洗涤三次后，将细胞在25μL/孔4℃的含有荧光素异硫氰酸酯(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109 096 098)的4℃冷FACS缓冲液中在4℃染色45分钟。
最后将板重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598) 的90μL/孔FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience， DIVA软件)收获细胞。
如图47A所示，单价的FAP(28H1)靶向的分拆三聚体的Ox40配体Fc(kih) 融合抗原结合分子(FAP-OX40L)而不是阴性对照F有效结合于表达人FAP的靶细胞。结合FAP阳性WM-266-4的EC50值为[6.9nM]。
15.2与OX40和FAP阴性肿瘤细胞的结合
使用表达局限于细胞核的NucLight Red荧光蛋白的A549 NucLightTM Red细胞(Essenbioscience，目录号4491)，检测与OX40阴性FAP阴性肿瘤细胞结合的缺乏，以允许将其从未标记的人FAP阳性WM266-4细胞分离。遵循标准Essen方案，在8μg/ml聚凝胺的存在下，用Essen CellPlayer NucLight Red Lentivirus(Essenbioscience，目录号4476；EF1α，嘌呤霉素)以3(TU/池)的MOI 转导亲本A549(ATCC CCL-185)。
将5×104个未标记的WM266-4细胞和未标记的A549 NucLightTM Red细胞在FACS缓冲液中的混合物加入到圆底悬浮细胞96孔板的每个孔中，如第15.1 节所述进行结合测定。
如图47B所示，FAP-OX40L不与OX40阴性FAP阴性人肿瘤细胞结合。
15.3与表达人OX40的细胞：幼稚和活化的人外周血单核细胞白细胞 (PBMC)的结合
从Zürich献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单核细胞 (PBMC)，用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies，目录号14190 326) 稀释血沉棕黄层。向50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)中提供15mL Histopaque 1077(SIGMA LifeScience，目录号10771、聚蔗糖和泛影酸钠，调节至1.077g/mL密度)并且使该血沉棕黄层溶液在Histopaque 1077上分层。将管在400xg、室温以及低加速度和无中断的条件下离心30分钟。然后从界面收集PBMC，用DPBS洗涤三次，重悬于由RPMI 1640培养基(Gibco by LifeTechnology，目录号42401-042)组成的T细胞培养基中，所述RPMI 1640培养基补充有10％胎牛血清(FBS,Gibco by Life Technology,目录号16000-044，批号941273，γ照射的，无支原体且在56℃热灭活35分钟)、1％(v/v)GlutaMAX-I (GIBCO by Life Technologies，目录号35050 038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA，目录号S8636)、1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA，目录号M7145)和50μM β-巯基乙醇(SIGMA，M3148)。
在分离后直接使用PBMC(在静息的人PBMC上的结合)，或者刺激它们在 T细胞的细胞表面上接受强的人Ox40表达(在活化的人PBMC上的结合)。因此，在6孔组织培养板中将幼稚PBMC在补充有200U/mL普留净(Novartis)和 2μg/mL PHA-L(Sigma-Aldrich,L2769-10)的T细胞培养基中培养4天，然后在37℃和5％CO2下在预包被的6孔组织培养板[4μg/mL]抗人CD3(克隆OKT3, eBioscience，目录号16-0037-85)和[2μg/mL]抗人CD28(克隆CD28.2,eBioscience，目录号16-0289-85]上在补充有200U/mL普留净的T细胞培养基中培养过夜。
为了检测，将Ox40幼稚的人PBMC和活化的人PBMC混合。为了从活化的人PBMC中区分幼稚的人PBMC，使用eFluor670细胞增殖染料 (eBioscience，目录号65-0840-85)在结合测定之前标记幼稚细胞。
为了标记细胞，收获细胞，用预热的(37℃)DPBS洗涤，并在DPBS中调节至1x107个细胞/mL的细胞密度。将eFluor670细胞增殖染料(eBioscience，目录号65-0840-85)加入到幼稚的人PBMC的悬液中，终浓度为在DPBS中的 2.5mM，最终细胞密度为0.5x107个细胞/mL。然后将细胞在室温下在黑暗中温育10分钟。为了停止标记反应，加入4mL热灭活的FBS，用T细胞培养基洗涤细胞三次。然后将1x105个静息的eFluor670标记的人PBMC和0.5x105个未标记的活化的人PBMC的二比一混合物加入到圆底悬浮细胞96孔板 (greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。
在含有逐步滴加的抗Ox40抗体构建体的50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，细胞在4℃在黑暗中染色120分钟。用过量的FACS缓冲液洗涤三次后，在25μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，在4℃在黑暗中将细胞染色45分钟，所述 FACS缓冲液含有荧光标记的抗人CD4抗体(克隆RPA-T4，小鼠IgG1 k， BioLegend，目录号300532))、抗人CD8抗体(克隆RPa-T8，小鼠IgG1k， BioLegend，目录号3010441)和异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人 IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录-号 109-096-098)的混合物。
最后将板重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598) 的90μL/孔FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience， DIVA软件)收获细胞。
如图48A和48B所示，FAP-OX40L不与OX40阴性的静息的人CD4+T细胞或CD8+T细胞结合。相比之下，FAP-OX40L与表达OX40的活化的CD8+或 CD4+T细胞结合。与CD4+T细胞的结合比与CD8+T细胞的结合强得多。活化的人CD8+T细胞仅表达在活化的CD4+T细胞上检测到的OX40水平的一部分。OX40的表达水平取决于刺激的动力学和强度，在这里针对CD4+T细胞而不是针对CD8+T细胞上的OX40表达而将这些条件优化。因此，在CD8 T 细胞上仅诱导很少的OX40表达。与OX40阳性CD4+或CD8+T细胞结合的 EC50值为[0.15nM]。
15.4在表达人OX40和报告基因NFκB-萤光素酶的HeLa细胞中的 NFκB激活
Ox40与其配体的激动性结合通过激活核因子κB(NFκB)而诱导下游信号转导(A.D.Weinberg等人，J.Leukoc.Biol.2004,75(6),962-972)。生成了重组报告细胞系HeLa_hOx40_NFkB_Luc1，以便在其表面上表达人Ox40。另外，它包含报告基因质粒，所述报告基因质粒含有在NFκB敏感性增强子区段控制下的萤光素酶基因。Ox40触发诱导在细胞核中易位的NFκB的剂量依赖性激活，后者在报告基因质粒的NFκB敏感增强子上结合以增加萤光素酶蛋白的表达。萤光素酶催化萤光素氧化，生成发光的氧化萤光素。这可以通过发光计进行定量。因此，分析了各种抗Ox40分子在HeLa_hOx40_NFkB_Luc1 报告细胞中诱导NFκB激活的能力，作为生物活性的量度。
使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，目录号13151-014)在37℃收获粘附的 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞10分钟。细胞用DPBS洗涤一次，在其组成为 MEM(Invitrogen，目录号22561-021)、10％(v/v)热灭活的FBS、1mM丙酮酸钠和1％(v/v)非必需氨基酸的测定培养基中调整至1.33x105的细胞密度。将细胞以0.2*105个细胞/孔的密度接种在具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio-one，目录号655083)中，并在培养箱(Hera Cell150)中在37℃和 5％CO2下保持过夜。
次日，通过加入含有逐步滴加的FAP-Ox40L或阴性对照F的测定培养基，将HeLa_hOx40_NFkB_Luc1刺激5小时。为了检测超交联对抗Ox40抗体的作用，以1:2的比例加入(二级抗体比一级抗体多2倍)25μL/孔的含有二级抗体抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch, 109-006-098)的培养基。温育后，吸出上清液，用DPBS将板洗涤两次。根据制造商的说明，使用萤光素酶100测定系统和报告子裂解缓冲液(均来自 Promega，目录-号E4550和目录号E3971)进行光发射的定量。简言之，通过加入每孔30μL1x裂解缓冲液将细胞在-20℃下裂解10分钟。将细胞在37℃、解冻20分钟，然后加入每孔90μL的所提供的荧光素酶测定试剂。利用 SpectraMax M5/M5e酶标仪(Molecular Devices,USA)，使用500ms积分时间立即将发光定量，没有收集所有波长的任何滤光片。通过 HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞的基础发光校正发射的相对光单位(URL)，并使用Prism4(GraphPadSoftware,USA)针对一级抗体的对数浓度进行印迹。使用内置的S形剂量反应来拟合曲线。
如图49所示，通过向报告细胞系添加FAP-Ox40L(左侧)已经诱导了有限的剂量依赖性NFkB活化。借助于抗人IgG特异性二级抗体的FAP-Ox40L的超交联以浓度依赖性方式增加了NFκB介导的萤光素酶激活的诱导(右侧)。
因此，我们通过FAP+肿瘤细胞系检测了与构建体超交联的FAP-Ox40L 的NFkB激活能力。
检测的肿瘤细胞系为NIH/3T3-huFAP克隆39。通过用表达载体pETR4921 转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC CRL-1658)生成了NIH/3T3-huFAP克隆39，用于在1.5μg/mL嘌呤霉素选择下表达huFAP。根据制造商的说明，使用Quifikit(Dako目录号K0078)将FAP的表面表达定量。用于检测细胞表面FAP表达的一级抗体是人/小鼠交叉反应性克隆F11-24(小鼠 IgG1,Calbiochem，目录号OP188)。NIH/3T3-huFAP克隆39的表面表达为每个细胞大约90000huFAP。
如前文中所述，将粘附的HeLa_hOx40_NFkB_Luc1细胞以每孔0.2*105个细胞的细胞密度培养过夜，并用含有逐步滴加的FAP-Ox40L的测定培养基刺激5小时。为了检测经由细胞表面FAP结合的超交联效应，以25μL/孔的含有FAP+肿瘤细胞NIH/3T3-huFAP克隆39的培养基以3比1比率进行共培养(每孔FAP+肿瘤细胞为报告细胞的三倍)。通过使用萤光素酶100测定系统和报告子裂解缓冲液(均来自Promega，目录号E4550和目录-号E3971)测量光发射将激活的NFκB定量。
如图50A所示，当加入FAP-Ox40L时，表达FAP的肿瘤细胞的存在强烈增加了NFκB介导的萤光素酶活化的诱导。将各个印迹的剂量-反应曲线的曲线下面积定量，作为每个构建体的激动能力的标志。如图50A所示，呈现FAP 的细胞表面的存在确保了更高的交联、以及因此比加入Fc特异性二级抗体更好的FAP-Ox40L的激动效应。
15.5 OX40介导的次最佳TCR触发的静息人PBMC的共刺激和借助于细胞表面FAP的超交联
在实施例15.4中显示，通过提供OX40受体的强寡聚化，加入FAP+肿瘤细胞可以强烈增加人Ox40阳性报告细胞系中由FAP靶向的OX40L诱导的 NFkB活性。同样地，我们检测了FAP-OX40L构建体在NIH/3T3-huFAP克隆 39细胞的存在下补救静息人PBMC细胞的次最佳TCR刺激的能力。
人PBMC制剂含有(1)静息Ox40阴性CD4+和CD8+T细胞和(2)在其细胞表面上具有各种Fcγ受体分子的抗原呈递细胞，例如B细胞和单核细胞。人 IgG1同种型的抗人CD3抗体可以与其Fc部分结合至当前的Fcγ受体分子并且在静息Ox40阴性CD4+和CD8+T细胞上介导延长的TCR活化。然后，这些细胞在数小时内开始表达Ox40。针对Ox40的功能性激动化合物可以通过活化的CD8+和CD4+T细胞上存在的Ox40受体发信号并支持TCR介导的刺激。
在照射的FAP+NIH/3T3-huFAP克隆39细胞和逐步滴加的FAP-Ox40L存在的情况下，使用次最佳浓度的抗CD3抗体将静息的CFSE标记的人PBMC刺激5天。通过流式细胞术监测总细胞计数和活细胞中的CFSE稀释度，分析对 T细胞存活和增殖的影响。
使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，目录号13151-014)在37℃收获小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3-huFAP克隆39细胞(参见实施例15.4)10分钟。细胞用 DPBS洗涤一次。在无菌96孔圆底粘附组织培养板(TPP，目录号92097)中，在37℃、并且在5％CO2的培养箱(HeraCell 150)中以0.2*105个细胞/孔的密度在T细胞培养基中培养NIH/3T3-huFAP克隆39细胞过夜。次日，使用4500RAD 剂量在x射线辐照仪中将其辐照，以防止随后由于肿瘤细胞系的人PBMC的过度生长。
如实施例15.3所述，通过蔗聚糖密度离心分离人PBMC。然后将细胞以 1x106个细胞/mL的细胞密度用[50nm]终浓度的CFDA-SE(Sigma-Aldrich，目录号2188)在37℃、用CFSE标记10分钟。此后，将细胞用含有FBS(10％v/v) 的过量DPBS洗涤两次。将标记的细胞在T细胞培养基中在37℃、静置30分钟。此后，用DPBS通过两个另外的洗涤步骤除去未转化的CFDA-SE。将CFSE标记的静息人PBMC以0.5*105个细胞/孔的密度加入到每个孔中。加入终浓度 [20nM]的抗人CD3抗体(克隆V9，人IgG1，描述于Rodrigues等人，Int J Cancer Suppl7,45-50(1992)和美国专利No.6,054,297中)和指定浓度的FAP-OX40L。在37℃和5％CO2的培养箱(Hera Cell 150)中将细胞激活5天。然后，将细胞用荧光染料缀合的抗体抗人CD4抗体(克隆RPA-T4，BioLegend，目录号300532) 和抗CD8抗体(克隆RPa-T8，BioLegend，目录号3010441)在4℃进行表面染色 20分钟。在用FACS缓冲液的洗涤步骤之后，将细胞重悬于85μL/孔的FACS 缓冲液中，并使用5激光Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience，DIVA软件)收获。
如图51所示，FAP-OX40L构建体通过当前的NIH/3T3-huFAP克隆39细胞的超交联强烈促进了TCR刺激的人CD4和CD8 T细胞中的增殖(参见顶部的“事件”图)和存活(参见底部的“增殖”图)。与人CD8+T细胞上OX40的较低表达一致，FAP-OX40L对CD8+T细胞的激动作用不如对CD4+T细胞强。
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***
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 包含TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
<130> P32429-WO
<150> EP14193260.8
<151> 2014-11-14
<150> EP15183736.6
<151> 2015-09-03
<150> EP15188142.2
<151> 2015-10-02
<160> 375
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170 175
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200
<210> 5
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu 4-1BBL (71-254)通过(G4S)2连接至hu 4-1BBL (71-254)
<400> 5
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
370 375
<210> 6
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu 4-1BBL (71-254) 加 (G4S)2
<400> 6
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H1
<400> 7
Ser His Ala Met Ser
1 5
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H2
<400> 8
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H3
<400> 9
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L1
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L2
<400> 11
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L3
<400> 12
Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2肽接头
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) 加 CH1 加 Fc节链
<400> 14
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
385 390 395 400
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
405 410 415
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
420 425 430
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
435 440 445
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
450 455 460
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
465 470 475 480
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
485 490 495
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
500 505 510
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
515 520 525
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
530 535 540
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
545 550 555 560
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
565 570 575
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
580 585 590
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
595 600 605
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
610 615 620
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
625 630 635 640
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
645 650 655
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
660 665 670
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
675 680 685
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
690 695 700
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715
<210> 15
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu 4-1BBL (71-254) -CL
<400> 15
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
195 200 205
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
210 215 220
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
225 230 235 240
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
245 250 255
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
260 265 270
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
275 280 285
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
290 295 300
<210> 16
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VH
<400> 16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VL
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)重链Fc穴
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 19
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)轻链
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 20
<211> 760
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 20
Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln
325 330 335
Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 21
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu FAP外域+poly-lys标签+his6标签
<400> 21
Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn
35 40 45
Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile
225 230 235 240
Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp
290 295 300
Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr
705 710 715 720
His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 22
<211> 2244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu FAP外域+poly-lys标签+his6标签
<400> 22
cgcccttcaa gagttcataa ctctgaagaa aatacaatga gagcactcac actgaaggat 60
attttaaatg gaacattttc ttataaaaca ttttttccaa actggatttc aggacaagaa 120
tatcttcatc aatctgcaga taacaatata gtactttata atattgaaac aggacaatca 180
tataccattt tgagtaatag aaccatgaaa agtgtgaatg cttcaaatta cggcttatca 240
cctgatcggc aatttgtata tctagaaagt gattattcaa agctttggag atactcttac 300
acagcaacat attacatcta tgaccttagc aatggagaat ttgtaagagg aaatgagctt 360
cctcgtccaa ttcagtattt atgctggtcg cctgttggga gtaaattagc atatgtctat 420
caaaacaata tctatttgaa acaaagacca ggagatccac cttttcaaat aacatttaat 480
ggaagagaaa ataaaatatt taatggaatc ccagactggg tttatgaaga ggaaatgctt 540
gctacaaaat atgctctctg gtggtctcct aatggaaaat ttttggcata tgcggaattt 600
aatgatacgg atataccagt tattgcctat tcctattatg gcgatgaaca atatcctaga 660
acaataaata ttccataccc aaaggctgga gctaagaatc ccgttgttcg gatatttatt 720
atcgatacca cttaccctgc gtatgtaggt ccccaggaag tgcctgttcc agcaatgata 780
gcctcaagtg attattattt cagttggctc acgtgggtta ctgatgaacg agtatgtttg 840
cagtggctaa aaagagtcca gaatgtttcg gtcctgtcta tatgtgactt cagggaagac 900
tggcagacat gggattgtcc aaagacccag gagcatatag aagaaagcag aactggatgg 960
gctggtggat tctttgtttc aacaccagtt ttcagctatg atgccatttc gtactacaaa 1020
atatttagtg acaaggatgg ctacaaacat attcactata tcaaagacac tgtggaaaat 1080
gctattcaaa ttacaagtgg caagtgggag gccataaata tattcagagt aacacaggat 1140
tcactgtttt attctagcaa tgaatttgaa gaataccctg gaagaagaaa catctacaga 1200
attagcattg gaagctatcc tccaagcaag aagtgtgtta cttgccatct aaggaaagaa 1260
aggtgccaat attacacagc aagtttcagc gactacgcca agtactatgc acttgtctgc 1320
tacggcccag gcatccccat ttccaccctt catgatggac gcactgatca agaaattaaa 1380
atcctggaag aaaacaagga attggaaaat gctttgaaaa atatccagct gcctaaagag 1440
gaaattaaga aacttgaagt agatgaaatt actttatggt acaagatgat tcttcctcct 1500
caatttgaca gatcaaagaa gtatcccttg ctaattcaag tgtatggtgg tccctgcagt 1560
cagagtgtaa ggtctgtatt tgctgttaat tggatatctt atcttgcaag taaggaaggg 1620
atggtcattg ccttggtgga tggtcgagga acagctttcc aaggtgacaa actcctctat 1680
gcagtgtatc gaaagctggg tgtttatgaa gttgaagacc agattacagc tgtcagaaaa 1740
ttcatagaaa tgggtttcat tgatgaaaaa agaatagcca tatggggctg gtcctatgga 1800
ggatacgttt catcactggc ccttgcatct ggaactggtc ttttcaaatg tggtatagca 1860
gtggctccag tctccagctg ggaatattac gcgtctgtct acacagagag attcatgggt 1920
ctcccaacaa aggatgataa tcttgagcac tataagaatt caactgtgat ggcaagagca 1980
gaatatttca gaaatgtaga ctatcttctc atccacggaa cagcagatga taatgtgcac 2040
tttcaaaact cagcacagat tgctaaagct ctggttaatg cacaagtgga tttccaggca 2100
atgtggtact ctgaccagaa ccacggctta tccggcctgt ccacgaacca cttatacacc 2160
cacatgaccc acttcctaaa gcagtgtttc tctttgtcag acggcaaaaa gaaaaagaaa 2220
aagggccacc accatcacca tcac 2244
<210> 23
<211> 761
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 23
Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln
325 330 335
Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys
500 505 510
Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile
725 730 735
Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe
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Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
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<211> 749
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<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠FAP外域+poly-lys标签+his6标签
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Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe
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Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp
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Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu
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Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser
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705 710 715 720
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725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
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<212> DNA
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<223> 鼠FAP外域+poly-lys标签+his6标签
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cctgatcggc aatttgtgta tctagaaagt gattattcaa agctctggcg atattcatac 300
acagcgacat actacatcta cgaccttcag aatggggaat ttgtaagagg atacgagctc 360
cctcgtccaa ttcagtatct atgctggtcg cctgttggga gtaaattagc atatgtatat 420
caaaacaata tttatttgaa acaaagacca ggagatccac cttttcaaat aacttatact 480
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<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴FAP外域+poly-lys标签+his6标签
<400> 26
Arg Pro Pro Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
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Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
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Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
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Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
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Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Phe Val Arg Ile Phe Ile
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Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
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Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
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Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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<210> 27
<211> 2244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴FAP外域+poly-lys标签+his6标签
<400> 27
cgccctccaa gagttcataa ctctgaagaa aatacaatga gagcactcac actgaaggat 60
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ttcatagaaa tgggtttcat tgatgaaaaa agaatagcca tatggggctg gtcctatgga 1800
ggatatgttt catcactggc ccttgcatct ggaactggtc ttttcaaatg tgggatagca 1860
gtggctccag tctccagctg ggaatattac gcgtctgtct acacagagag attcatgggt 1920
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<210> 28
<211> 702
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 28
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Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
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Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
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Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
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Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
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Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
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Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
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Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
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Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
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Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
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260 265 270
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
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Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
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Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
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450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
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Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro
500 505 510
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515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540
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545 550 555 560
Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser
565 570 575
Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly
580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly
595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
610 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr
675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
690 695 700
<210> 29
<211> 2322
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 29
Met Gln Ser Gly Pro Arg Pro Pro Leu Pro Ala Pro Gly Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ala Ser Phe
20 25 30
Phe Gly Glu Asn His Leu Glu Val Pro Val Ala Thr Ala Leu Thr Asp
35 40 45
Ile Asp Leu Gln Leu Gln Phe Ser Thr Ser Gln Pro Glu Ala Leu Leu
50 55 60
Leu Leu Ala Ala Gly Pro Ala Asp His Leu Leu Leu Gln Leu Tyr Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Leu Phe Val Gly Gly Thr Gly Thr Leu Gly Leu Pro Tyr Leu Arg
145 150 155 160
Gly Thr Ser Arg Pro Leu Arg Gly Cys Leu His Ala Ala Thr Leu Asn
165 170 175
Gly Arg Ser Leu Leu Arg Pro Leu Thr Pro Asp Val His Glu Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Glu Phe Ser Ala Ser Asp Asp Val Ala Leu Gly Phe Ser Gly
195 200 205
Pro His Ser Leu Ala Ala Phe Pro Ala Trp Gly Thr Gln Asp Glu Gly
210 215 220
Thr Leu Glu Phe Thr Leu Thr Thr Gln Ser Arg Gln Ala Pro Leu Ala
225 230 235 240
Phe Gln Ala Gly Gly Arg Arg Gly Asp Phe Ile Tyr Val Asp Ile Phe
245 250 255
Glu Gly His Leu Arg Ala Val Val Glu Lys Gly Gln Gly Thr Val Leu
260 265 270
Leu His Asn Ser Val Pro Val Ala Asp Gly Gln Pro His Glu Val Ser
275 280 285
Val His Ile Asn Ala His Arg Leu Glu Ile Ser Val Asp Gln Tyr Pro
290 295 300
Thr His Thr Ser Asn Arg Gly Val Leu Ser Tyr Leu Glu Pro Arg Gly
305 310 315 320
Ser Leu Leu Leu Gly Gly Leu Asp Ala Glu Ala Ser Arg His Leu Gln
325 330 335
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340 345 350
Gly Cys Met Glu Asp Leu Ser Val Asn Gly Gln Arg Arg Gly Leu Arg
355 360 365
Glu Ala Leu Leu Thr Arg Asn Met Ala Ala Gly Cys Arg Leu Glu Glu
370 375 380
Glu Glu Tyr Glu Asp Asp Ala Tyr Gly His Tyr Glu Ala Phe Ser Thr
385 390 395 400
Leu Ala Pro Glu Ala Trp Pro Ala Met Glu Leu Pro Glu Pro Cys Val
405 410 415
Pro Glu Pro Gly Leu Pro Pro Val Phe Ala Asn Phe Thr Gln Leu Leu
420 425 430
Thr Ile Ser Pro Leu Val Val Ala Glu Gly Gly Thr Ala Trp Leu Glu
435 440 445
Trp Arg His Val Gln Pro Thr Leu Asp Leu Met Glu Ala Glu Leu Arg
450 455 460
Lys Ser Gln Val Leu Phe Ser Val Thr Arg Gly Ala Arg His Gly Glu
465 470 475 480
Leu Glu Leu Asp Ile Pro Gly Ala Gln Ala Arg Lys Met Phe Thr Leu
485 490 495
Leu Asp Val Val Asn Arg Lys Ala Arg Phe Ile His Asp Gly Ser Glu
500 505 510
Asp Thr Ser Asp Gln Leu Val Leu Glu Val Ser Val Thr Ala Arg Val
515 520 525
Pro Met Pro Ser Cys Leu Arg Arg Gly Gln Thr Tyr Leu Leu Pro Ile
530 535 540
Gln Val Asn Pro Val Asn Asp Pro Pro His Ile Ile Phe Pro His Gly
545 550 555 560
Ser Leu Met Val Ile Leu Glu His Thr Gln Lys Pro Leu Gly Pro Glu
565 570 575
Val Phe Gln Ala Tyr Asp Pro Asp Ser Ala Cys Glu Gly Leu Thr Phe
580 585 590
Gln Val Leu Gly Thr Ser Ser Gly Leu Pro Val Glu Arg Arg Asp Gln
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Pro Gly Glu Pro Ala Thr Glu Phe Ser Cys Arg Glu Leu Glu Ala Gly
610 615 620
Ser Leu Val Tyr Val His Arg Gly Gly Pro Ala Gln Asp Leu Thr Phe
625 630 635 640
Arg Val Ser Asp Gly Leu Gln Ala Ser Pro Pro Ala Thr Leu Lys Val
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Val Ala Ile Arg Pro Ala Ile Gln Ile His Arg Ser Thr Gly Leu Arg
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Leu Ala Gln Gly Ser Ala Met Pro Ile Leu Pro Ala Asn Leu Ser Val
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Glu Gln Gly Arg Val Arg Tyr Leu Ser Thr Asp Pro Gln His His Ala
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Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Glu Val Met Glu Arg Pro Arg His Gly Arg
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Leu Ala Trp Arg Gly Thr Gln Asp Lys Thr Thr Met Val Thr Ser Phe
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980 985 990
Glu Ser Ser Gly Asp Met Ala Trp Glu Glu Val Arg Gly Val Phe Arg
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Ser Arg Ile Phe His Val Ala Arg Gly Gly Arg Arg Leu Leu Thr
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Thr Asp Asp Val Ala Phe Ser Asp Ala Asp Ser Gly Phe Ala Asp
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1955 1960 1965
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1970 1975 1980
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2000 2005 2010
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2030 2035 2040
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<210> 30
<211> 1210
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<213> 人（Homo sapiens）
<400> 30
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340 345 350
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435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
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Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
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Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
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<210> 31
<211> 556
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 31
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<210> 32
<211> 297
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 32
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Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 33
<211> 364
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 33
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln
20 25 30
Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro
35 40 45
Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly
50 55 60
Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln
65 70 75 80
Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro
85 90 95
Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp
100 105 110
Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser
115 120 125
Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg
130 135 140
Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn
145 150 155 160
Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile
165 170 175
Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr
180 185 190
His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr
195 200 205
Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu
210 215 220
Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly
245 250 255
Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys
275 280 285
Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly
290 295 300
Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr
305 310 315 320
Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu
325 330 335
Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys
340 345 350
Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln
355 360
<210> 34
<211> 205
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 34
Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
20 25 30
Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala
35 40 45
Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala
50 55 60
Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg
65 70 75 80
Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn
85 90 95
Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln
100 105 110
Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro
115 120 125
Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe
130 135 140
His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln
145 150 155 160
Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr
165 170 175
Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val
180 185 190
Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu
195 200 205
<210> 35
<211> 233
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 35
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 36
<211> 244
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 36
Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln Gly Arg
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val Thr Leu
20 25 30
Leu Leu Ala Val Pro Ile Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Pro
35 40 45
Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gln
50 55 60
Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala Pro
85 90 95
Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe
100 105 110
Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro
115 120 125
Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg
130 135 140
Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg
145 150 155 160
Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala
180 185 190
Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly
195 200 205
Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile Ser
210 215 220
His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala
225 230 235 240
Val Met Val Gly
<210> 37
<211> 183
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 37
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 38
<211> 261
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 38
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 39
<211> 281
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 39
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210> 40
<211> 193
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 40
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1 5 10 15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
20 25 30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu
35 40 45
Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
50 55 60
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
65 70 75 80
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
85 90 95
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
100 105 110
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
115 120 125
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
180 185 190
Pro
<210> 41
<211> 234
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 41
Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly
20 25 30
Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu
35 40 45
Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg
50 55 60
Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly
65 70 75 80
Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys
85 90 95
Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp
115 120 125
Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln
130 135 140
Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu
145 150 155 160
Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val
165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln
180 185 190
Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val
195 200 205
Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val
210 215 220
Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
225 230
<210> 42
<211> 254
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 42
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 43
<211> 281
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 43
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
275 280
<210> 44
<211> 317
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 44
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu
1 5 10 15
Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met
35 40 45
Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val
50 55 60
Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn
85 90 95
Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile
100 105 110
Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
115 120 125
Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro
165 170 175
Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
180 185 190
Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val
195 200 205
Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His
210 215 220
His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val
225 230 235 240
Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
260 265 270
Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu
275 280 285
Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp
290 295 300
Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp
305 310 315
<210> 45
<211> 249
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 45
Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu
50 55 60
Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp
65 70 75 80
Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu
100 105 110
Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly
115 120 125
Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu
130 135 140
Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr
165 170 175
Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu
180 185 190
Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg
195 200 205
Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His
245
<210> 46
<211> 250
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 46
Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu
35 40 45
Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg
50 55 60
Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp
65 70 75 80
Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn
85 90 95
Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys
100 105 110
Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys
115 120 125
Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg
130 135 140
Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala
145 150 155 160
Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe
165 170 175
Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr
180 185 190
Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr
195 200 205
Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile
210 215 220
Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro
225 230 235 240
His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
245 250
<210> 47
<211> 285
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 47
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
1 5 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu
100 105 110
Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
115 120 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
130 135 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
180 185 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
195 200 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
210 215 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
275 280 285
<210> 48
<211> 240
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 48
Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser
20 25 30
Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly
35 40 45
Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg
50 55 60
Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala
85 90 95
His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu
100 105 110
Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr
115 120 125
His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr
130 135 140
Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser
145 150 155 160
Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser
180 185 190
Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His
195 200 205
Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu
210 215 220
Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
225 230 235 240
<210> 49
<211> 251
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 49
Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu
1 5 10 15
Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala
35 40 45
Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu
50 55 60
Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser
65 70 75 80
His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg
85 90 95
Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn
100 105 110
Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr
115 120 125
Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser
130 135 140
Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser
145 150 155 160
Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser
165 170 175
Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr
180 185 190
Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp
195 200 205
Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp
210 215 220
Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys
225 230 235 240
Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
245 250
<210> 50
<211> 199
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 50
Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr
1 5 10 15
Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro
20 25 30
Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu
35 40 45
Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser
50 55 60
Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys
65 70 75 80
Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser
85 90 95
Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu
100 105 110
Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn
115 120 125
Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp
130 135 140
Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly
145 150 155 160
Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser
165 170 175
Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu
180 185 190
Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
195
<210> 51
<211> 391
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 51
Met Gly Tyr Pro Glu Val Glu Arg Arg Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Pro Arg Glu Arg Gly Ser Gln Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Pro Ala
20 25 30
Arg Ala Gly Glu Gly Asn Ser Cys Leu Leu Phe Leu Gly Phe Phe Gly
35 40 45
Leu Ser Leu Ala Leu His Leu Leu Thr Leu Cys Cys Tyr Leu Glu Leu
50 55 60
Arg Ser Glu Leu Arg Arg Glu Arg Gly Ala Glu Ser Arg Leu Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Thr Pro Gly Thr Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Gly Gly Leu
85 90 95
Asp Pro Asp Ser Pro Ile Thr Ser His Leu Gly Gln Pro Ser Pro Lys
100 105 110
Gln Gln Pro Leu Glu Pro Gly Glu Ala Ala Leu His Ser Asp Ser Gln
115 120 125
Asp Gly His Gln Met Ala Leu Leu Asn Phe Phe Phe Pro Asp Glu Lys
130 135 140
Pro Tyr Ser Glu Glu Glu Ser Arg Arg Val Arg Arg Asn Lys Arg Ser
145 150 155 160
Lys Ser Asn Glu Gly Ala Asp Gly Pro Val Lys Asn Lys Lys Lys Gly
165 170 175
Lys Lys Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Ile Pro Gly Ile
195 200 205
Pro Gly Thr Thr Val Met Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
210 215 220
Pro Gln Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ala Asp Lys
225 230 235 240
Ala Gly Thr Arg Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln
245 250 255
Gly Ser Ala Ile Gln Val Lys Asn Asp Leu Ser Gly Gly Val Leu Asn
260 265 270
Asp Trp Ser Arg Ile Thr Met Asn Pro Lys Val Phe Lys Leu His Pro
275 280 285
Arg Ser Gly Glu Leu Glu Val Leu Val Asp Gly Thr Tyr Phe Ile Tyr
290 295 300
Ser Gln Val Glu Val Tyr Tyr Ile Asn Phe Thr Asp Phe Ala Ser Tyr
305 310 315 320
Glu Val Val Val Asp Glu Lys Pro Phe Leu Gln Cys Thr Arg Ser Ile
325 330 335
Glu Thr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Thr Cys Tyr Thr Ala Gly Val Cys
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Arg Gln Lys Ile Ala Val Lys Met Val His Ala Asp
355 360 365
Ile Ser Ile Asn Met Ser Lys His Thr Thr Phe Phe Gly Ala Ile Arg
370 375 380
Leu Gly Glu Ala Pro Ala Ser
385 390
<210> 52
<211> 205
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 52
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 53
<211> 133
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 53
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu
130
<210> 54
<211> 132
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 54
Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr
1 5 10 15
Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp
20 25 30
Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly
35 40 45
Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile
50 55 60
Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys
65 70 75 80
Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp
85 90 95
Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe
100 105 110
His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu
115 120 125
Phe Cys Val Leu
130
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 (SG4)2
<400> 55
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 56
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 57
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 58
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 59
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 60
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 61
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 62
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 63
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 64
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 65
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 66
<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) -CH1 FC节链
<400> 66
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 600
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 660
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 720
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 780
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 840
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 900
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 960
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 1020
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 1080
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaagggggc 1140
ggaggaagcg gagggggagg aagtgctagc accaagggcc ctagcgtgtt ccctctggcc 1200
cctagcagca agagcacaag tggaggaaca gccgccctgg gctgcctggt caaggactac 1260
ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaat tctggcgccc tgacaagcgg cgtgcacaca 1320
tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg tactctctga gcagcgtcgt gaccgtgccc 1380
tctagctctc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc 1440
aaagtggaca agaaggtgga acccaagagc tgcgacaaga cccacacctg tcccccttgc 1500
cctgcccctg aagctgctgg tggcccttcc gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac 1560
accctgatga tcagccggac ccccgaagtg acctgcgtgg tggtcgatgt gtcccacgag 1620
gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc 1680
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1740
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc 1800
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1860
accctgcccc catgccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc 1920
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1980
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2040
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2100
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 2154
<210> 67
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL(71-254) -CL
<400> 67
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctcgtacggt ggctgcacca 600
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 660
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 720
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 780
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 840
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 900
tgt 903
<210> 68
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) Fc穴重链
<400> 68
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccctccg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480
gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc 540
ctgagcagcg tggtcaccgt gccttctagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgcgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtaaa 1338
<210> 69
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1)轻链
<400> 69
gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc cggtcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccctcggct gctgatcatc ggcgcctcta ccagagccac cggcatccct 180
gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggccagg tcatccctcc cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 70
<211> 309
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 70
Met Asp Gln His Thr Leu Asp Val Glu Asp Thr Ala Asp Ala Arg His
1 5 10 15
Pro Ala Gly Thr Ser Cys Pro Ser Asp Ala Ala Leu Leu Arg Asp Thr
20 25 30
Gly Leu Leu Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Arg Pro Thr
35 40 45
Asn Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Ala Tyr Pro Ala Val Asn Val Arg
50 55 60
Asp Arg Glu Ala Ala Trp Pro Pro Ala Leu Asn Phe Cys Ser Arg His
65 70 75 80
Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala
85 90 95
Ala Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr
100 105 110
Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln
115 120 125
Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys
145 150 155 160
Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr
165 170 175
Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val
180 185 190
Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro
195 200 205
Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val
210 215 220
Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr
225 230 235 240
Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser
245 250 255
Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly
260 265 270
Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu
275 280 285
Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro
290 295 300
Asp Asn Pro Trp Glu
305
<210> 71
<211> 2298
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体4-1BBL(71-254) -CH1-Fc节链
<400> 71
agaaccgagc ccagacccgc cctgaccatc accaccagcc ctaacctggg caccagagag 60
aacaacgccg accaagtgac ccccgtgtcc cacatcggca gccccaatac cacacagcag 120
ggcagccctg tgttcgccaa gctgctggcc aagaaccagg ccagcctgag caacaccacc 180
ctgaactggc acagccagga tggcgccgga agcagctatc tgagccaggg cctgagatac 240
gaagaggaca agaaagaact ggtggtggac agccctggcc tgtactacgt gttcctggaa 300
ctgaagctga gccccacctt caccaacacc ggccacaagg tgcagggctg ggtgtcactg 360
gtgctgcagg ccaaacccca ggtggacgac ttcgacaacc tggccctgac cgtggaactg 420
ttccccagca gcatggaaaa caagctggtg gatcggagct ggtcccagct tctgctgctg 480
aaggccggac acagactgag cgtgggcctg agggcttatc tgcacggcgc ccaggacgcc 540
tacagagact gggagctgag ctaccccaac acaaccagct tcggcctgtt cctcgtgaag 600
cccgacaacc cttgggaagg cggcggagga tctggcggag gcggatctag aacagagcct 660
cggcctgccc tgacaattac cacatccccc aatctgggca cccgggaaaa caatgcagat 720
caagtgacac ctgtgtctca tattggctcc ccaaacacta cccagcaggg ctcccccgtg 780
tttgctaaac tgctggctaa aaatcaggcc tccctgtcta acacaacact gaactggcac 840
tcccaggacg gcgctggcag ctcttacctg agtcagggac tgcgctatga ggaagataag 900
aaagaactgg tggtggattc ccccggactg tactatgtgt ttctggaact gaaactgtcc 960
cctaccttta caaataccgg gcacaaagtg cagggatggg tgtccctggt gctgcaggct 1020
aagcctcagg tggacgattt tgataatctg gctctgacag tggaactgtt tcctagcagc 1080
atggaaaaca agctggtgga cagaagctgg tcccagctcc tgctgctgaa ggccggacac 1140
agactgagcg tgggcctgag agcctatctg cacggcgccc aggacgccta cagagactgg 1200
gagctgagct accccaacac aaccagcttc ggcctgttcc tcgtgaagcc cgacaaccct 1260
tgggaaggcg gcggaggatc tggcggaggc ggatccagag ctgatgctgc ccctaccgtg 1320
tccatcttcc cacccagcag cgagcagctg acatctgggg gagctagcgt cgtgtgcttc 1380
ctgaacaact tctaccccaa ggacatcaac gtgaagtgga agatcgacgg cagcgagcgg 1440
cagaacggcg tgctgaatag ctggaccgac caggacagca aggactccac ctacagcatg 1500
agcagcaccc tgaccctgac caaggacgag tacgagcggc acaacagcta cacatgcgag 1560
gccacccaca agaccagcac cagccccatc gtgaagtcct tcaaccggaa cgagtgcgtg 1620
cccagagact gcggctgcaa gccttgcatc tgcaccgtgc ctgaggtgtc cagcgtgttc 1680
atcttcccac ccaagcccaa ggacgtgctg accatcaccc tgacacccaa agtgacctgc 1740
gtggtggtgg ccatcagcaa ggatgacccc gaggtgcagt tcagttggtt cgtggacgac 1800
gtggaagtgc acaccgctca gaccaagccc agagaggaac agatcaacag caccttcaga 1860
agcgtgtccg agctgcccat catgcaccag gactggctga acggcaaaga attcaagtgc 1920
agagtgaaca gcgccgcctt tggcgcccct atcgagaaaa ccatctccaa gaccaagggc 1980
agacccaagg ccccccaggt gtacacaatc cccccaccca aagaacagat ggccaaggac 2040
aaggtgtccc tgacctgcat gatcaccaat ttcttcccag aggatatcac cgtggaatgg 2100
cagtggaacg gccagcccgc cgagaactac gacaacaccc agcctatcat ggacaccgac 2160
ggctcctact tcgtgtacag cgacctgaac gtgcagaagt ccaactggga ggccggcaac 2220
accttcacct gtagcgtgct gcacgagggc ctgcacaacc accacaccga gaagtccctg 2280
tcccacagcc ctggcaag 2298
<210> 72
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体mu 4-1BBL(71-254) -CL融合
<400> 72
agaaccgagc ccagacccgc cctgaccatc accaccagcc ctaacctggg caccagagag 60
aacaacgccg accaagtgac ccccgtgtcc cacatcggca gccccaatac cacacagcag 120
ggcagccctg tgttcgccaa gctgctggcc aagaaccagg ccagcctgag caacaccacc 180
ctgaactggc acagccagga tggcgccgga agcagctatc tgagccaggg cctgagatac 240
gaagaggaca agaaagaact ggtggtggac agccctggcc tgtactacgt gttcctggaa 300
ctgaagctga gccccacctt caccaacacc ggccacaagg tgcagggctg ggtgtcactg 360
gtgctgcagg ccaaacccca ggtggacgac ttcgacaacc tggccctgac cgtggaactg 420
ttccccagca gcatggaaaa caagctggtg gatcggagct ggtcccagct tctgctgctg 480
aaggccggac acagactgag cgtgggcctg agggcctatc tgcatggcgc ccaggacgcc 540
tacagagact gggagctgag ctaccccaac acaaccagct tcggcctgtt cctcgtgaag 600
cccgacaacc cttgggaagg cggcggaggc tccggaggag gcggaagcgc taagaccacc 660
ccccccagcg tgtaccctct ggcccctgga tctgccgccc agaccaacag catggtgacc 720
ctgggctgcc tggtgaaggg ctacttcccc gagcctgtga ccgtgacctg gaacagcggc 780
agcctgagca gcggcgtgca cacctttcca gccgtgctgc agagcgacct gtacaccctg 840
agcagctccg tgaccgtgcc tagcagcacc tggcccagcc agacagtgac ctgcaacgtg 900
gcccaccctg ccagcagcac caaggtggac aagaaaatcg tgccccggga ctgc 954
<210> 73
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP Fc KK重链
<400> 73
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc taagaccacc 360
ccccctagcg tgtaccctct ggcccctgga tctgccgccc agaccaacag catggtgacc 420
ctgggctgcc tggtgaaggg ctacttcccc gagcctgtga ccgtgacctg gaacagcggc 480
agcctgagca gcggcgtgca cacctttcca gccgtgctgc agagcgacct gtacaccctg 540
agcagctccg tgaccgtgcc tagcagcacc tggcccagcc agacagtgac ctgcaacgtg 600
gcccaccctg ccagcagcac caaggtggac aagaaaatcg tgccccggga ctgcggctgc 660
aagccctgca tctgcaccgt gcccgaggtg tccagcgtgt tcatcttccc acccaagccc 720
aaggacgtgc tgaccatcac cctgaccccc aaagtgacct gcgtggtggt ggccatcagc 780
aaggacgacc ccgaggtgca gttctcttgg tttgtggacg acgtggaggt gcacacagcc 840
cagacaaagc cccgggagga acagatcaac agcaccttca gaagcgtgtc cgagctgccc 900
atcatgcacc aggactggct gaacggcaaa gaattcaagt gcagagtgaa cagcgccgcc 960
ttcggcgccc ccatcgagaa aaccatcagc aagaccaagg gcagacccaa ggccccccag 1020
gtgtacacca tccccccacc caaaaaacag atggccaagg acaaggtgtc cctgacctgc 1080
atgatcacca actttttccc cgaggacatc accgtggagt ggcagtggaa tggccagccc 1140
gccgagaact acaagaacac ccagcccatc atgaagaccg acggcagcta cttcgtgtac 1200
agcaagctga acgtgcagaa gtccaactgg gaggccggca acaccttcac ctgtagcgtg 1260
ctgcacgagg gcctgcacaa ccaccacacc gagaagtccc tgagccactc ccccggcaag 1320
<210> 74
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP轻链
<400> 74
gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc cggtcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccctcggct gctgatcatc ggcgcctcta ccagagccac cggcatccct 180
gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggccagg tcatccctcc cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgtgcc gatgctgcac caactgtatc gattttccca 360
ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 420
taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 480
ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 540
acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 600
acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgt 645
<210> 75
<211> 766
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体mu 4-1BBL(71-254)-CH1-Fc DD重链
<400> 75
Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu
1 5 10 15
Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
20 25 30
Gly Ser Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
35 40 45
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
50 55 60
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
85 90 95
Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
100 105 110
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
115 120 125
Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Ser Ser
130 135 140
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
145 150 155 160
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
165 170 175
Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr
180 185 190
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu
210 215 220
Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp
225 230 235 240
Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Ser Pro Asn Thr Thr Gln Gln
245 250 255
Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu
260 265 270
Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser
275 280 285
Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val
290 295 300
Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu
325 330 335
Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu
340 345 350
Thr Val Glu Leu Phe Pro Ser Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg
355 360 365
Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val
370 375 380
Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp
385 390 395 400
Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys
405 410 415
Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
420 425 430
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
435 440 445
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
450 455 460
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
465 470 475 480
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
485 490 495
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
500 505 510
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
515 520 525
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Val Pro Arg Asp Cys
530 535 540
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
545 550 555 560
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
565 570 575
Lys Val Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
580 585 590
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
595 600 605
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
610 615 620
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
625 630 635 640
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
645 650 655
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
660 665 670
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
675 680 685
Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
690 695 700
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
705 710 715 720
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
725 730 735
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
740 745 750
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
755 760 765
<210> 76
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体mu 4-1BBL(71-254) -CL融合
<400> 76
Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu
1 5 10 15
Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
20 25 30
Gly Ser Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
35 40 45
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
50 55 60
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
85 90 95
Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
100 105 110
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
115 120 125
Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Ser Ser
130 135 140
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
145 150 155 160
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
165 170 175
Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr
180 185 190
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
210 215 220
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
225 230 235 240
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
245 250 255
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
260 265 270
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
275 280 285
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
290 295 300
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
305 310 315
<210> 77
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP Fc KK重链
<400> 77
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp
165 170 175
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro
180 185 190
Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile
210 215 220
Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
260 265 270
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala
305 310 315 320
Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro
325 330 335
Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln Met Ala
340 345 350
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu
355 360 365
Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr
370 375 380
Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe
405 410 415
Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys
420 425 430
Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 78
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP轻链
<400> 78
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 79
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc穴重链
<400> 79
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgtg caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctct cgtgcgcagt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tcgtgagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 80
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47轻链
<400> 80
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 81
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc穴重链
<400> 81
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 82
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47轻链
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 83
<211> 163
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 83
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln
<210> 84
<211> 163
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 84
Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln
<210> 85
<211> 164
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 85
Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys
1 5 10 15
Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe
35 40 45
Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr His Asn Ala Glu Cys Glu Cys
50 55 60
Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys
65 70 75 80
Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys
85 90 95
Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr
115 120 125
Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro Pro Val Val Ser Phe Ser Pro
130 135 140
Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu Gly Gly Pro Gly Gly His Ser
145 150 155 160
Leu Gln Val Leu
<210> 86
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc穴链
<400> 86
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 87
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu 4-1BB Fc节融合
<400> 87
ctgcaggacc cctgcagcaa ctgccctgcc ggcaccttct gcgacaacaa ccggaaccag 60
atctgcagcc cctgcccccc caacagcttc agctctgccg gcggacagcg gacctgcgac 120
atctgcagac agtgcaaggg cgtgttcaga acccggaaag agtgcagcag caccagcaac 180
gccgagtgcg actgcacccc cggcttccat tgtctgggag ccggctgcag catgtgcgag 240
caggactgca agcagggcca ggaactgacc aagaagggct gcaaggactg ctgcttcggc 300
accttcaacg accagaagcg gggcatctgc cggccctgga ccaactgtag cctggacggc 360
aagagcgtgc tggtcaacgg caccaaagaa cgggacgtcg tgtgcggccc cagccctgct 420
gatctgtctc ctggggccag cagcgtgacc cctcctgccc ctgccagaga gcctggccac 480
tctcctcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct cacccaaatc tgcagacaaa 540
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 600
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 660
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 720
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 780
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 840
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 900
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaaccag 960
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1020
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1080
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1140
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1200
ctgtctccgg gtaaatccgg aggcctgaac gacatcttcg aggcccagaa gattgaatgg 1260
cacgag 1266
<210> 88
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴4-1BB Fc节融合
<400> 88
ttgcaggatc tgtgtagtaa ctgcccagct ggtacattct gtgataataa caggagtcag 60
atttgcagtc cctgtcctcc aaatagtttc tccagcgcag gtggacaaag gacctgtgac 120
atatgcaggc agtgtaaagg tgttttcaag accaggaagg agtgttcctc caccagcaat 180
gcagagtgtg actgcatttc agggtatcac tgcctggggg cagagtgcag catgtgtgaa 240
caggattgta aacaaggtca agaattgaca aaaaaaggtt gtaaagactg ttgctttggg 300
acatttaatg accagaaacg tggcatctgt cgcccctgga caaactgttc tttggatgga 360
aagtctgtgc ttgtgaatgg gacgaaggag agggacgtgg tctgcggacc atctccagcc 420
gacctctctc caggagcatc ctctgcgacc ccgcctgccc ctgcgagaga gccaggacac 480
tctccgcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct cacccaaatc tgcagacaaa 540
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 600
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 660
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 720
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 780
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 840
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 900
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaaccag 960
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1020
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1080
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1140
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1200
ctgtctccgg gtaaatccgg aggcctgaac gacatcttcg aggcccagaa gattgaatgg 1260
cacgag 1266
<210> 89
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠4-1BB Fc节融合
<400> 89
gtgcagaaca gctgcgacaa ctgccagccc ggcaccttct gccggaagta caaccccgtg 60
tgcaagagct gcccccccag caccttcagc agcatcggcg gccagcccaa ctgcaacatc 120
tgcagagtgt gcgccggcta cttccggttc aagaagttct gcagcagcac ccacaacgcc 180
gagtgcgagt gcatcgaggg cttccactgc ctgggccccc agtgcaccag atgcgagaag 240
gactgcagac ccggccagga actgaccaag cagggctgta agacctgcag cctgggcacc 300
ttcaacgacc agaacgggac cggcgtgtgc cggccttgga ccaattgcag cctggacggg 360
agaagcgtgc tgaaaaccgg caccaccgag aaggacgtcg tgtgcggccc tcccgtggtg 420
tccttcagcc ctagcaccac catcagcgtg acccctgaag gcggccctgg cggacactct 480
ctgcaggtcc tggtcgacga acagttatat tttcagggcg gctcacccaa atctgcagac 540
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 600
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 660
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 720
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 780
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 840
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 900
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac 960
caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1020
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1080
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1140
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1200
tccctgtctc cgggtaaatc cggaggcctg aacgacatct tcgaggccca gaagattgaa 1260
tggcacgag 1269
<210> 90
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc穴链
<400> 90
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 91
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB Fc节融合
<400> 91
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys
165 170 175
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
180 185 190
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 92
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴4-1BB Fc节融合
<400> 92
Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys
165 170 175
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
180 185 190
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 93
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠4-1BB Fc节融合
<400> 93
Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys
1 5 10 15
Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe
35 40 45
Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr His Asn Ala Glu Cys Glu Cys
50 55 60
Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys
65 70 75 80
Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys
85 90 95
Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr
115 120 125
Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro Pro Val Val Ser Phe Ser Pro
130 135 140
Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu Gly Gly Pro Gly Gly His Ser
145 150 155 160
Leu Gln Val Leu Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro
165 170 175
Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
180 185 190
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
195 200 205
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
210 215 220
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
225 230 235 240
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
245 250 255
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
260 265 270
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
275 280 285
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
290 295 300
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
305 310 315 320
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
325 330 335
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
340 345 350
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
355 360 365
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
370 375 380
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
385 390 395 400
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala
405 410 415
Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 94
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB带His标签的
<400> 94
ctgcaggacc cctgcagcaa ctgccctgcc ggcaccttct gcgacaacaa ccggaaccag 60
atctgcagcc cctgcccccc caacagcttc agctctgccg gcggacagcg gacctgcgac 120
atctgcagac agtgcaaggg cgtgttcaga acccggaaag agtgcagcag caccagcaac 180
gccgagtgcg actgcacccc cggcttccat tgtctgggag ccggctgcag catgtgcgag 240
caggactgca agcagggcca ggaactgacc aagaagggct gcaaggactg ctgcttcggc 300
accttcaacg accagaagcg gggcatctgc cggccctgga ccaactgtag cctggacggc 360
aagagcgtgc tggtcaacgg caccaaagaa cgggacgtcg tgtgcggccc cagccctgct 420
gatctgtctc ctggggccag cagcgtgacc cctcctgccc ctgccagaga gcctggccac 480
tctcctcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct caggcctgaa cgacatcttc 540
gaggcccaga agatcgagtg gcacgaggct cgagctcacc accatcacca tcac 594
<210> 95
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB带His标签的
<400> 95
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu
165 170 175
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala
180 185 190
His His His His His His
195
<210> 96
<211> 178
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 96
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu
<210> 97
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2连接的二聚体hu 4-1BBL
<400> 97
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
180 185 190
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
195 200 205
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
210 215 220
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
245 250 255
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
260 265 270
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
290 295 300
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
325 330 335
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
340 345 350
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
355 360 365
<210> 98
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (80-254)
<400> 98
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
180 185 190
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
195 200 205
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
210 215 220
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
245 250 255
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
260 265 270
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
275 280 285
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
290 295 300
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
305 310 315 320
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
325 330 335
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
340 345 350
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
355 360
<210> 99
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (52-254)
<400> 99
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro
210 215 220
Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
225 230 235 240
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
245 250 255
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
260 265 270
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
275 280 285
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
290 295 300
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
305 310 315 320
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
340 345 350
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
355 360 365
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
370 375 380
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
385 390 395 400
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
405 410 415
<210> 100
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H1
<400> 100
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H2
<400> 101
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H3
<400> 102
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
1 5
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L1
<400> 103
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L2
<400> 104
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L3
<400> 105
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 106
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VH
<400> 106
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 107
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VL
<400> 107
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 108
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc节链
<400> 108
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
385 390 395 400
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
405 410 415
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
420 425 430
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
435 440 445
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
450 455 460
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
465 470 475 480
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
485 490 495
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
500 505 510
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
515 520 525
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
530 535 540
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
545 550 555 560
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
565 570 575
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
580 585 590
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
595 600 605
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
610 615 620
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
625 630 635 640
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
645 650 655
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
660 665 670
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
675 680 685
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
690 695 700
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715
<210> 109
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) -CL*
<400> 109
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
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Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
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100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
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His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
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275 280 285
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<213> 人工序列
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Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
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Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc节链
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195 200 205
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210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
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Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
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Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
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Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
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Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
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Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
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Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
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340 345 350
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355 360 365
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Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
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Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
385 390 395 400
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
405 410 415
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
420 425 430
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
435 440 445
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
450 455 460
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp
485 490 495
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
500 505 510
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
515 520 525
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
530 535 540
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
545 550 555 560
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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660 665 670
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
675 680 685
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690 695 700
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 118
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100 105 110
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290 295
<210> 119
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 119
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1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
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100 105 110
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195 200 205
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<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) - CH1*
<400> 120
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1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
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Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
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100 105 110
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115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
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195 200 205
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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275 280 285
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (28H1) Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-254)
<400> 121
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100 105 110
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165 170 175
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275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
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435 440 445
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Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
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Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
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Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser
645 650 655
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660 665 670
Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp
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Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser
690 695 700
Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr
705 710 715 720
Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly
725 730 735
Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala
740 745 750
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser
755 760 765
Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His
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Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
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Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
805 810 815
Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
820 825 830
Glu
<210> 122
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (28H1) Fc节链融合至单体hu 4-1BBL
(71-254)
<400> 122
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
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100 105 110
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115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
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195 200 205
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
450 455 460
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
465 470 475 480
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
485 490 495
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
500 505 510
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
515 520 525
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
530 535 540
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
545 550 555 560
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
565 570 575
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
580 585 590
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
595 600 605
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
610 615 620
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635
<210> 123
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-254)
<400> 123
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635 640
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu
645 650 655
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
660 665 670
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
675 680 685
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
690 695 700
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
705 710 715 720
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
725 730 735
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
740 745 750
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
755 760 765
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
770 775 780
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
785 790 795 800
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
805 810 815
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg
820 825 830
Ser Glu
<210> 124
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc节链融合至单体hu 4-1BBL
(71-254)
<400> 124
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635 640
<210> 125
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9)轻链
<400> 125
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 126
<211> 822
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-248)
<400> 126
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
625 630 635 640
Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala
645 650 655
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln
660 665 670
Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly
675 680 685
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr
690 695 700
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
705 710 715 720
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
725 730 735
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
740 745 750
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
755 760 765
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
770 775 780
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
785 790 795 800
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
805 810 815
Glu Ile Pro Ala Gly Leu
820
<210> 127
<211> 634
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc节链融合至单体hu 4-1BBL
(71-248)
<400> 127
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
625 630
<210> 128
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头 G4S
<400> 128
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 129
<211> 2166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc节链
<400> 129
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 600
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 660
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 720
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 780
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 840
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 900
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 960
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 1020
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 1080
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaagggggc 1140
ggaggttccg gagggggagg atctcgtacg gtggctgcac catctgtctt tatcttccca 1200
cccagcgacc ggaagctgaa gtctggcaca gccagcgtcg tgtgcctgct gaataacttc 1260
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaatg ccctgcagag cggcaacagc 1320
caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 1380
accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 1440
ggcctgtcta gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgcgacaa gacccacacc 1500
tgtcctccat gccctgcccc tgaagctgct ggcggcccta gcgtgttcct gttcccccca 1560
aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat 1620
gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 1680
aatgccaaga ccaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1740
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1800
aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1860
ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1920
tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1980
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 2040
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 2100
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 2160
ggtaaa 2166
<210> 130
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) -CH1*
<400> 130
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggct ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggccggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
agactgggag tgcatctgca cacagaggcc agagccaggc acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg cctgcctagc 540
cctagatctg aaggcggcgg aggttccgga ggcggaggat ctgctagcac aaagggcccc 600
agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc 660
tgcctggtgg aagattactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg 720
acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg ctgcagagca gcggcctgta ctctctgagc 780
agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 840
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacgag aaggtggaac ccaagtcctg c 891
<210> 131
<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc节链
<400> 131
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 600
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 660
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 720
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 780
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 840
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 900
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 960
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 1020
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 1080
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaagggggc 1140
ggaggaagcg gagggggagg aagtgctagc accaagggcc cctccgtgtt ccccctggcc 1200
cccagcagca agagcaccag cggcggcaca gccgctctgg gctgcctggt cgaggactac 1260
ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaac agcggagccc tgacctccgg cgtgcacacc 1320
ttccccgccg tgctgcagag ttctggcctg tatagcctga gcagcgtggt caccgtgcct 1380
tctagcagcc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc 1440
aaggtggacg agaaggtgga gcccaagagc tgcgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1500
ccagcacctg aagctgcagg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 1560
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1620
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1680
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1740
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc 1800
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1860
accctgcccc catgccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc 1920
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1980
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2040
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2100
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 2154
<210> 132
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) -CL*
<400> 132
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctcgtacggt ggctgcacca 600
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatcgg aagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 660
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 720
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 780
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 840
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 900
tgt 903
<210> 133
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (VHCL) (28H1) Fc穴链
<400> 133
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcgtggcc 360
gctcccagcg tgttcatctt cccacccagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagccagc 420
gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 480
aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa tccgtgaccg agcaggacag caaggactcc 540
acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 600
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tccagccccg tgaccaagag cttcaaccgg 660
ggcgagtgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgccctg cccctgaagc tgctggtggc 720
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt cgatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaatgcc aagaccaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 134
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (VLCH1) (28H1)轻链
<400> 134
gagatcgtgc tgacccagtc tcccggcacc ctgagcctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgagctgca gagccagcca gagcgtgagc cggagctacc tggcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccccagact gctgatcatc ggcgccagca cccgggccac cggcatcccc 180
gatagattca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatcag ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggccagg tgatcccccc caccttcggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagagcagc gcttccacca aaggcccttc cgtgtttcct 360
ctggctccta gctccaagtc cacctctgga ggcaccgctg ctctcggatg cctcgtgaag 420
gattattttc ctgagcctgt gacagtgtcc tggaatagcg gagcactgac ctctggagtg 480
catactttcc ccgctgtgct gcagtcctct ggactgtaca gcctgagcag cgtggtgaca 540
gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 600
aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc aagtcttgt 639
<210> 135
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (VHCL) (28H1) Fc穴链
<400> 135
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
130 135 140
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
180 185 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
195 200 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 136
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (VLCH1) (28H1)轻链
<400> 136
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys
210
<210> 137
<211> 1572
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) - CH1* Fc节链
<400> 137
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggct ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggccggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
agactgggag tgcatctgca cacagaggcc agagccaggc acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg cctgcctagc 540
cctagatctg aaggcggcgg aggttccgga ggcggaggat ctgctagcac caagggcccc 600
tccgtgttcc ccctggcccc cagcagcaag agcaccagcg gcggcacagc cgctctgggc 660
tgcctggtcg aggactactt ccccgagccc gtgaccgtgt cctggaacag cggagccctg 720
acctccggcg tgcacacctt ccccgccgtg ctgcagagtt ctggcctgta tagcctgagc 780
agcgtggtca ccgtgccttc tagcagcctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 840
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacgag aaggtggagc ccaagagctg cgacaaaact 900
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gctgcagggg gaccgtcagt cttcctcttc 960
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 1020
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1080
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1140
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1200
tccaacaaag ccctcggcgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1260
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1320
agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1380
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1440
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1500
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1560
tctccgggta aa 1572
<210> 138
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) -CL*
<400> 138
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 600
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 660
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 720
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 780
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 840
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 900
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 960
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 1020
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 1080
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaagggggc 1140
ggaggttccg gagggggagg atctcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 1200
ccatctgatc ggaagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 1260
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 1320
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 1380
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 1440
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 1485
<210> 139
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc节链
<400> 139
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
385 390 395 400
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
405 410 415
Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
420 425 430
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
435 440 445
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
450 455 460
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
465 470 475 480
Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
485 490 495
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
500 505 510
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
515 520 525
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
530 535 540
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
545 550 555 560
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
565 570 575
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
580 585 590
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
595 600 605
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
610 615 620
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
625 630 635 640
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
645 650 655
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
660 665 670
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
675 680 685
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
690 695 700
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715
<210> 140
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) -CL*
<400> 140
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
385 390 395 400
Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
405 410 415
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
420 425 430
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
435 440 445
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
450 455 460
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
485 490 495
<210> 141
<211> 2499
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (28H1) Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-254)
<400> 141
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccctccg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480
gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc 540
ctgagcagcg tggtcaccgt gccttctagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgcgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtggagg cggcggaagc ggaggaggag gatccagaga gggccctgag 1380
ctgagccccg atgatcctgc tggactgctg gacctgcggc agggcatgtt tgctcagctg 1440
gtggcccaga acgtgctgct gatcgatggc cccctgtcct ggtacagcga tcctggactg 1500
gctggcgtgt cactgacagg cggcctgagc tacaaagagg acaccaaaga actggtggtg 1560
gccaaggccg gcgtgtacta cgtgttcttt cagctggaac tgcggagagt ggtggccggc 1620
gaaggatctg gctctgtgtc tctggccctg catctgcagc ctctgagaag cgctgctggc 1680
gctgcagctc tggcactgac agtggatctg cctcctgcca gctccgaggc ccggaatagc 1740
gcatttgggt ttcaaggcag gctgctgcac ctgtctgccg gccagaggct gggagtgcat 1800
ctgcacacag aggccagggc tagacacgcc tggcagctga cacagggcgc tacagtgctg 1860
ggcctgttca gagtgacccc cgagattcca gccggcctgc cttctccaag aagcgaaggc 1920
ggaggcggat ctggcggcgg aggatctaga gagggacccg aactgtcccc tgacgatcca 1980
gccgggctgc tggatctgag acagggaatg ttcgcccagc tggtggctca gaatgtgctg 2040
ctgattgacg gacctctgag ctggtactcc gacccagggc tggcaggggt gtccctgact 2100
gggggactgt cctacaaaga agatacaaaa gaactggtgg tggctaaagc tggggtgtac 2160
tatgtgtttt ttcagctgga actgaggcgg gtggtggctg gggagggctc aggatctgtg 2220
tccctggctc tgcatctgca gccactgcgc tctgctgctg gcgcagctgc actggctctg 2280
actgtggacc tgccaccagc ctctagcgag gccagaaaca gcgccttcgg gttccaagga 2340
cgcctgctgc atctgagcgc cggacagcgc ctgggagtgc atctgcatac tgaagccaga 2400
gcccggcatg cttggcagct gactcagggg gcaactgtgc tgggactgtt tcgcgtgaca 2460
cctgagatcc ctgccggact gccaagccct agatcagaa 2499
<210> 142
<211> 1917
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (28H1) Fc节链融合至单体hu 4-1BBL
(71-254)
<400> 142
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccctgca gagatgagct gaccaagaac 1080
caggtgtccc tgtggtgtct ggtcaagggc ttctacccca gcgatatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaacg gccagcctga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac 1200
ggcagcttct tcctgtactc caaactgacc gtggacaaga gccggtggca gcagggcaac 1260
gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1320
agcctgagcc ccggcggagg cggcggaagc ggaggaggag gatccagaga gggccctgag 1380
ctgagccccg atgatcctgc tggactgctg gacctgcggc agggcatgtt tgctcagctg 1440
gtggcccaga acgtgctgct gatcgatggc cccctgtcct ggtacagcga tcctggactg 1500
gctggcgtgt cactgacagg cggcctgagc tacaaagagg acaccaaaga actggtggtg 1560
gccaaggccg gcgtgtacta cgtgttcttt cagctggaac tgcggagagt ggtggccggc 1620
gaaggatctg gctctgtgtc tctggccctg catctgcagc ctctgagaag cgctgctggc 1680
gctgcagctc tggcactgac agtggatctg cctcctgcca gctccgaggc ccggaatagc 1740
gcatttgggt ttcaaggcag gctgctgcac ctgtctgccg gccagaggct gggagtgcat 1800
ctgcacacag aggccagggc tagacacgcc tggcagctga cacagggcgc tacagtgctg 1860
ggcctgttca gagtgacccc cgagattcca gccggcctgc cttctccaag aagcgaa 1917
<210> 143
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) -(G4S)1- CL*
<400> 143
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctcgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 600
ccgccatctg atcggaagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 660
ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 720
tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 780
ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 840
cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 888
<210> 144
<211> 2028
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> [抗FAP (28H1)]2 Fc穴链
<400> 144
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc tagcacaaag 360
ggacctagcg tgttccccct ggcccccagc agcaagtcta catctggcgg aacagccgcc 420
ctgggctgcc tcgtgaagga ctactttccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480
gctctgacaa gcggcgtgca cacctttcca gccgtgctgc agagcagcgg cctgtactct 540
ctgagcagcg tcgtgacagt gcccagcagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggaacccaa gagctgcgac 660
ggcggagggg gatctggcgg cggaggatcc gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc 720
ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc 780
tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc 840
atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc gactctgtga agggccggtt caccatctcc 900
cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc 960
gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg ggcaacttcg actactgggg acagggcacc 1020
ctggtcaccg tgtccagcgc tagcaccaag ggcccctccg tgttccccct ggcccccagc 1080
agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 1140
gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc 1200
gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc ctgagcagcg tggtcaccgt gccttctagc 1260
agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg 1320
gacaagaagg tggagcccaa gagctgcgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1380
cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 1440
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 1500
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1560
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1620
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc 1680
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg 1740
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc 1800
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1860
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc 1920
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1980
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 2028
<210> 145
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [抗FAP (28H1)]2 Fc穴链
<400> 145
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
245 250 255
Phe Thr Phe Ser Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
260 265 270
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr
275 280 285
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
290 295 300
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
305 310 315 320
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp
325 330 335
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
340 345 350
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
355 360 365
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
370 375 380
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
385 390 395 400
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
405 410 415
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
420 425 430
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
435 440 445
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
450 455 460
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
465 470 475 480
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
485 490 495
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
500 505 510
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
515 520 525
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
530 535 540
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro
545 550 555 560
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
565 570 575
Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
580 585 590
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
595 600 605
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
610 615 620
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
625 630 635 640
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
645 650 655
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
660 665 670
Ser Pro Gly Lys
675
<210> 146
<211> 2514
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*) Fc节链
<400> 146
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 600
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 660
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 720
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 780
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 840
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 900
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 960
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 1020
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 1080
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaagggggc 1140
ggaggttccg gaggcggagg atctgaggtg cagctgctgg aatccggcgg aggcctggtg 1200
cagcctggcg gatctctgag actgtcctgc gccgcctccg gcttcacctt ctcctcccac 1260
gccatgtcct gggtccgaca ggctcctggc aaaggcctgg aatgggtgtc cgccatctgg 1320
gcctccggcg agcagtacta cgccgactct gtgaagggcc ggttcaccat ctcccgggac 1380
aactccaaga acaccctgta cctgcagatg aactccctgc gggccgagga caccgccgtg 1440
tactactgtg ccaagggctg gctgggcaac ttcgactact ggggccaggg caccctggtc 1500
accgtgtcca gcgctagcgt ggctgcacca tctgtcttta tcttcccacc cagcgaccgg 1560
aagctgaagt ctggcacagc cagcgtcgtg tgcctgctga ataacttcta cccccgcgag 1620
gccaaggtgc agtggaaggt ggacaatgcc ctgcagagcg gcaacagcca ggaaagcgtg 1680
accgagcagg acagcaagga ctccacctac agcctgagca gcaccctgac cctgagcaag 1740
gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc tgcgaagtga cccaccaggg cctgtctagc 1800
cccgtgacca agagcttcaa ccggggcgag tgcgacaaga cccacacctg tcctccatgc 1860
cctgcccctg aagctgctgg cggccctagc gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac 1920
accctgatga tcagccggac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag 1980
gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa tgccaagacc 2040
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 2100
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctcggc 2160
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 2220
accctgcccc catgccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc 2280
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 2340
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 2400
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2460
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 2514
<210> 147
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) -FAP (VLCH1*)
<400> 147
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggct ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggccggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
agactgggag tgcatctgca cacagaggcc agagccaggc acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg cctgcctagc 540
cctagatctg aaggcggcgg aggttccgga ggcggaggat ctgagatcgt gctgacccag 600
tctcccggca ccctgagcct gagccctggc gagagagcca ccctgagctg cagagccagc 660
cagagcgtga gccggagcta cctggcctgg tatcagcaga agcccggcca ggcccccaga 720
ctgctgatca tcggcgccag cacccgggcc accggcatcc ccgatagatt cagcggcagc 780
ggctccggca ccgacttcac cctgaccatc agccggctgg aacccgagga cttcgccgtg 840
tactactgcc agcagggcca ggtgatcccc cccaccttcg gccagggcac caaggtggaa 900
atcaagtcct ctgctagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 960
agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctggtgg aagattactt ccccgagccc 1020
gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 1080
ctgcagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 1140
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacgag 1200
aaggtggaac ccaagtcctg c 1221
<210> 148
<211> 838
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - FAP (VHCL*) Fc节链
<400> 148
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
385 390 395 400
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
405 410 415
Phe Ser Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
420 425 430
Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala
435 440 445
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
450 455 460
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
485 490 495
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
500 505 510
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
515 520 525
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
530 535 540
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
545 550 555 560
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
565 570 575
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
580 585 590
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
595 600 605
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
610 615 620
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
625 630 635 640
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
645 650 655
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
660 665 670
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
675 680 685
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
690 695 700
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
705 710 715 720
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
725 730 735
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
740 745 750
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
755 760 765
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
770 775 780
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
785 790 795 800
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
805 810 815
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
820 825 830
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
835
<210> 149
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) -FAP (VLCH1*)
<400> 149
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
195 200 205
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
210 215 220
Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
225 230 235 240
Leu Leu Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
245 250 255
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
260 265 270
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val
275 280 285
Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser
290 295 300
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
305 310 315 320
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr
325 330 335
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
340 345 350
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
355 360 365
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
370 375 380
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu
385 390 395 400
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
405
<210> 150
<211> 2268
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (52-254) - CH1* Fc节链
<400> 150
ccttgggctg tgtctggcgc tagagcctct cctggatctg ccgccagccc cagactgaga 60
gagggacctg agctgagccc cgatgatcct gccggactgc tggatctgag acagggcatg 120
ttcgcccagc tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgatg gccccctgtc ctggtacagc 180
gatcctggac tggctggcgt gtcactgaca ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa 240
gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga 300
gtggtggccg gcgagggatc tggatctgtg tctctggccc tgcatctgca gcccctgaga 360
agcgctgctg gcgctgcagc tctggcactg acagtggatc tgcctcctgc cagctccgag 420
gcccggaata gcgcatttgg gtttcaaggc agactgctgc acctgtctgc cggccagagg 480
ctgggagtgc atctgcacac agaggccagg gctagacacg cctggcagct gacacagggc 540
gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgacc cccgagattc cagccggact gcccagccct 600
agatctgaag gcggcggagg aagcggaggc ggaggatccc cttgggctgt gtctggcgct 660
agagcctctc ctggatctgc cgccagcccc agactgagag agggacctga gctgagcccc 720
gatgatcctg ccggactgct ggacctgcgg cagggaatgt tcgctcagct ggtggctcag 780
aatgtgctgc tgattgacgg acctctgtcc tggtactccg accctggcct ggcaggggtg 840
tccctgactg ggggactgtc ctacaaagaa gatacaaaag aactggtggt ggctaaagct 900
ggggtgtact atgtgttttt tcagctggaa ctgaggcggg tggtggctgg ggagggctca 960
ggatctgtgt ccctggctct gcatctgcag cctctgcgct ctgctgctgg cgcagctgca 1020
ctggctctga ctgtggacct gccaccagcc tctagcgagg ccagaaacag cgccttcggg 1080
ttccaaggac ggctgctgca tctgagcgcc ggacagcgcc tgggagtgca tctgcatact 1140
gaagccagag cccggcatgc ttggcagctg acccaggggg caactgtgct gggactgttt 1200
cgcgtgacac ctgagatccc cgctggcctg cctagcccaa gaagtgaagg gggaggcgga 1260
tctggcggag ggggatctgc tagcaccaag ggcccctccg tgttccccct ggcccccagc 1320
agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct ctgggctgcc tggtcgagga ctacttcccc 1380
gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc 1440
gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc ctgagcagcg tggtcaccgt gccttctagc 1500
agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg 1560
gacgagaagg tggagcccaa gagctgcgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1620
cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 1680
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 1740
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1800
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1860
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc 1920
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1980
cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc 2040
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 2100
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 2160
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 2220
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 2268
<210> 151
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (52-254) -CL*
<400> 151
ccttgggctg tgtctggcgc tagagcctct cctggatctg ccgccagccc cagactgaga 60
gagggacctg agctgagccc cgatgatcct gccggactgc tggatctgag acagggcatg 120
ttcgcccagc tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgatg gccccctgtc ctggtacagc 180
gatcctggac tggctggcgt gtcactgaca ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa 240
gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga 300
gtggtggccg gcgagggatc tggatctgtg tctctggccc tgcatctgca gcccctgaga 360
agcgctgctg gcgctgcagc tctggcactg acagtggatc tgcctcctgc cagctccgag 420
gcccggaata gcgcatttgg gtttcaaggc aggctgctgc acctgtctgc cggccagagg 480
ctgggagtgc atctgcacac agaggccagg gctagacacg cctggcagct gacacagggc 540
gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgacc cccgagattc cagccggcct gccttctcca 600
agaagcgaag gcggaggcgg atctggcggc ggaggatctc gtacggtggc tgcaccatct 660
gtcttcatct tcccgccatc tgatcggaag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 720
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 780
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 840
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 900
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 960
<210> 152
<211> 2100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (80-254) - CH1* Fc节链
<400> 152
gatcctgccg gcctgctgga tctgcggcag ggaatgtttg cccagctggt ggcccagaac 60
gtgctgctga tcgatggccc cctgagctgg tacagcgatc ctggactggc tggcgtgtca 120
ctgacaggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 180
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctggc 240
tctgtgtctc tggccctgca tctgcagccc ctgagaagcg ctgctggcgc tgcagctctg 300
gcactgacag tggatctgcc tcctgccagc tccgaggccc ggaatagcgc atttgggttt 360
caaggcagac tgctgcacct gtctgccggc cagaggctgg gagtgcatct gcacacagag 420
gccagggcta gacacgcctg gcagctgaca cagggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 480
gtgacccccg agattccagc cggactgccc agccctagat ctgaaggcgg cggaggaagc 540
ggaggcggag gatccgaccc agctggactg ctggacctgc ggcagggaat gttcgctcag 600
ctggtggctc agaatgtgct gctgattgac ggacctctgt cctggtactc cgaccctggc 660
ctggcagggg tgtccctgac tgggggactg tcctacaaag aagatacaaa agaactggtg 720
gtggctaaag ctggggtgta ctatgtgttt tttcagctgg aactgaggcg ggtggtggct 780
ggggagggct caggatctgt gtccctggct ctgcatctgc agcctctgcg ctctgctgct 840
ggcgcagctg cactggctct gactgtggac ctgccaccag cctctagcga ggccagaaac 900
agcgccttcg ggttccaagg acggctgctg catctgagcg ccggacagcg cctgggagtg 960
catctgcata ctgaagccag agcccggcat gcttggcagc tgacccaggg ggcaactgtg 1020
ctgggactgt ttcgcgtgac acctgagatc cccgctggcc tgcctagccc aagaagtgaa 1080
gggggaggcg gatctggcgg agggggatct gctagcacca agggcccctc cgtgttcccc 1140
ctggccccca gcagcaagag caccagcggc ggcacagccg ctctgggctg cctggtcgag 1200
gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc tggaacagcg gagccctgac ctccggcgtg 1260
cacaccttcc ccgccgtgct gcagagttct ggcctgtata gcctgagcag cgtggtcacc 1320
gtgccttcta gcagcctggg cacccagacc tacatctgca acgtgaacca caagcccagc 1380
aacaccaagg tggacgagaa ggtggagccc aagagctgcg acaaaactca cacatgccca 1440
ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 1500
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1560
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1620
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1680
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1740
ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1800
gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc 1860
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1920
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1980
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 2040
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2100
<210> 153
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (80-254) -CL*
<400> 153
gatcctgccg gcctgctgga tctgcggcag ggaatgtttg cccagctggt ggcccagaac 60
gtgctgctga tcgatggccc cctgagctgg tacagcgatc ctggactggc tggcgtgtca 120
ctgacaggcg gcctgagcta caaagaggac accaaagaac tggtggtggc caaggccggc 180
gtgtactacg tgttctttca gctggaactg cggagagtgg tggccggcga aggatctggc 240
tctgtgtctc tggccctgca tctgcagccc ctgagaagcg ctgctggcgc tgcagctctg 300
gcactgacag tggatctgcc tcctgccagc tccgaggccc ggaatagcgc atttgggttt 360
caaggcaggc tgctgcacct gtctgccggc cagaggctgg gagtgcatct gcacacagag 420
gccagggcta gacacgcctg gcagctgaca cagggcgcta cagtgctggg cctgttcaga 480
gtgacccccg agattccagc cggcctgcct tctccaagaa gcgaaggcgg aggcggatct 540
ggcggcggag gatctcgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 600
cggaagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 660
gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 720
gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 780
aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 840
tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgt 876
<210> 154
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc KK链 DNA
<400> 154
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagcgctaa gaccaccccc 360
cctagcgtgt accctctggc ccctggatct gccgcccaga ccaacagcat ggtgaccctg 420
ggctgcctgg tgaagggcta cttccccgag cctgtgaccg tgacctggaa cagcggcagc 480
ctgagcagcg gcgtgcacac ctttccagcc gtgctgcaga gcgacctgta caccctgagc 540
agctccgtga ccgtgcctag cagcacctgg cccagccaga cagtgacctg caacgtggcc 600
caccctgcca gcagcaccaa ggtggacaag aaaatcgtgc cccgggactg cggctgcaag 660
ccctgcatct gcaccgtgcc cgaggtgtcc agcgtgttca tcttcccacc caagcccaag 720
gacgtgctga ccatcaccct gacccccaaa gtgacctgcg tggtggtggc catcagcaag 780
gacgaccccg aggtgcagtt ctcttggttt gtggacgacg tggaggtgca cacagcccag 840
acaaagcccc gggaggaaca gatcaacagc accttcagaa gcgtgtccga gctgcccatc 900
atgcaccagg actggctgaa cggcaaagaa ttcaagtgca gagtgaacag cgccgccttc 960
ggcgccccca tcgagaaaac catcagcaag accaagggca gacccaaggc cccccaggtg 1020
tacaccatcc ccccacccaa aaaacagatg gccaaggaca aggtgtccct gacctgcatg 1080
atcaccaact ttttccccga ggacatcacc gtggagtggc agtggaatgg ccagcccgcc 1140
gagaactaca agaacaccca gcccatcatg aagaccgacg gcagctactt cgtgtacagc 1200
aagctgaacg tgcagaagtc caactgggag gccggcaaca ccttcacctg tagcgtgctg 1260
cacgagggcc tgcacaacca ccacaccgag aagtccctga gccactcccc cggcaag 1317
<210> 155
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47轻链 DNA
<400> 155
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtgcc gatgctgcac caactgtatc gattttccca 360
ccatccagtg agcagttaac atctggaggt gcctcagtcg tgtgcttctt gaacaacttc 420
taccccaaag acatcaatgt caagtggaag attgatggca gtgaacgaca aaatggcgtc 480
ctgaacagtt ggactgatca ggacagcaaa gacagcacct acagcatgag cagcaccctc 540
acgttgacca aggacgagta tgaacgacat aacagctata cctgtgaggc cactcacaag 600
acatcaactt cacccattgt caagagcttc aacaggaatg agtgt 645
<210> 156
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc KK链
<400> 156
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 157
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47轻链
<400> 157
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 158
<211> 2298
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体鼠 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD链 DNA
<400> 158
agaaccgagc ccagacccgc cctgaccatc accaccagcc ctaacctggg caccagagag 60
aacaacgccg accaagtgac ccccgtgtcc cacatcggct gccccaatac cacacagcag 120
ggcagccctg tgttcgccaa gctgctggcc aagaaccagg ccagcctgag caacaccacc 180
ctgaactggc acagccagga tggcgccgga agcagctatc tgagccaggg cctgagatac 240
gaagaggaca agaaagaact ggtggtggac agccctggcc tgtactacgt gttcctggaa 300
ctgaagctga gccccacctt caccaacacc ggccacaagg tgcagggctg ggtgtcactg 360
gtgctgcagg ccaaacccca ggtggacgac ttcgacaacc tggccctgac cgtggaactg 420
ttcccctgca gcatggaaaa caagctggtg gatcggagct ggtcccagct tctgctgctg 480
aaggccggac acagactgag cgtgggcctg agggcttatc tgcacggcgc ccaggacgcc 540
tacagagact gggagctgag ctaccccaac acaaccagct tcggcctgtt cctcgtgaag 600
cccgacaacc cttgggaagg cggcggaggc tccggaggag gcggatctag aacagagcct 660
cggcctgccc tgacaattac cacatccccc aatctgggca cccgggaaaa caatgcagat 720
caagtgacac ctgtgtctca tattgggtgc cccaacacta cccagcaggg gtccccagtg 780
tttgctaaac tgctggctaa aaatcaggcc tccctgtcta acacaacact gaattggcat 840
agtcaggacg gggctggcag cagctacctg tctcagggac tgcgctatga ggaagataag 900
aaagaactgg tggtggattc ccccggactg tactatgtgt ttctggaact gaaactgtcc 960
cctaccttta caaataccgg gcacaaagtg cagggatggg tgtccctggt gctgcaggct 1020
aagcctcagg tggacgattt tgataatctg gctctgacag tggaactgtt tccttgctct 1080
atggaaaaca aactggtgga ccgctcttgg agccagttgc tgctgctgaa agctggccac 1140
cggctgtctg tgggactgag agcatacctg catggggcac aggatgccta ccgggattgg 1200
gaactgtcct accctaacac tacttccttc ggactgttcc tcgtgaaacc tgataatccc 1260
tgggagggcg gaggcggaag tggcggaggg ggatccagag ctgatgctgc ccctaccgtg 1320
tccatcttcc cacccagcag cgagcagctg acatctgggg gagctagcgt cgtgtgcttc 1380
ctgaacaact tctaccccaa ggacatcaac gtgaagtgga agatcgacgg cagcgagcgg 1440
cagaacggcg tgctgaatag ctggaccgac caggacagca aggactccac ctacagcatg 1500
agcagcaccc tgaccctgac caaggacgag tacgagcggc acaacagcta cacatgcgag 1560
gccacccaca agaccagcac cagccccatc gtgaagtcct tcaaccggaa cgagtgcgtg 1620
cccagagact gcggctgcaa gccttgcatc tgcaccgtgc ctgaggtgtc cagcgtgttc 1680
atcttcccac ccaagcccaa ggacgtgctg accatcaccc tgacacccaa agtgacctgc 1740
gtggtggtgg ccatcagcaa ggatgacccc gaggtgcagt tcagttggtt cgtggacgac 1800
gtggaagtgc acaccgctca gaccaagccc agagaggaac agatcaacag caccttcaga 1860
agcgtgtccg agctgcccat catgcaccag gactggctga acggcaaaga attcaagtgc 1920
agagtgaaca gcgccgcctt tggcgcccct atcgagaaaa ccatctccaa gaccaagggc 1980
agacccaagg ccccccaggt gtacacaatc cccccaccca aagaacagat ggccaaggac 2040
aaggtgtccc tgacctgcat gatcaccaat ttcttcccag aggatatcac cgtggaatgg 2100
cagtggaacg gccagcccgc cgagaactac gacaacaccc agcctatcat ggacaccgac 2160
ggctcctact tcgtgtacag cgacctgaac gtgcagaagt ccaactggga ggccggcaac 2220
accttcacct gtagcgtgct gcacgagggc ctgcacaacc accacaccga gaagtccctg 2280
tcccacagcc ctggcaag 2298
<210> 159
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体鼠4-1BBL (104-309, C160S) - CH1 DNA
<400> 159
agaaccgagc ccagacccgc cctgaccatc accaccagcc ctaacctggg caccagagag 60
aacaacgccg accaagtgac ccccgtgtcc cacatcggct gccccaatac cacacagcag 120
ggcagccctg tgttcgccaa gctgctggcc aagaaccagg ccagcctgag caacaccacc 180
ctgaactggc acagccagga tggcgccgga agcagctatc tgagccaggg cctgagatac 240
gaagaggaca agaaagaact ggtggtggac agccctggcc tgtactacgt gttcctggaa 300
ctgaagctga gccccacctt caccaacacc ggccacaagg tgcagggctg ggtgtcactg 360
gtgctgcagg ccaaacccca ggtggacgac ttcgacaacc tggccctgac cgtggaactg 420
ttcccctgca gcatggaaaa caagctggtg gatcggagct ggtcccagct tctgctgctg 480
aaggccggac acagactgag cgtgggcctg agggcttatc tgcacggcgc ccaggacgcc 540
tacagagact gggagctgag ctaccccaac acaaccagct tcggcctgtt cctcgtgaag 600
cccgacaacc cttgggaagg cggcggaggc tccggaggag gcggaagcgc taagaccacc 660
ccccccagcg tgtaccctct ggcccctgga tctgccgccc agaccaacag catggtgacc 720
ctgggctgcc tggtgaaggg ctacttcccc gagcctgtga ccgtgacctg gaacagcggc 780
agcctgagca gcggcgtgca cacctttcca gccgtgctgc agagcgacct gtacaccctg 840
agcagctccg tgaccgtgcc tagcagcacc tggcccagcc agacagtgac ctgcaacgtg 900
gcccaccctg ccagcagcac caaggtggac aagaaaatcg tgccccggga ctgc 954
<210> 160
<211> 766
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体鼠 4-1BBL (104-309, C160S) - CL Fc DD链
<400> 160
Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu
1 5 10 15
Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
20 25 30
Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
35 40 45
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
50 55 60
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
85 90 95
Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
100 105 110
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
115 120 125
Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser
130 135 140
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
145 150 155 160
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
165 170 175
Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr
180 185 190
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu
210 215 220
Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp
225 230 235 240
Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln
245 250 255
Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu
260 265 270
Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser
275 280 285
Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val
290 295 300
Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu
325 330 335
Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu
340 345 350
Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg
355 360 365
Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val
370 375 380
Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp
385 390 395 400
Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys
405 410 415
Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
420 425 430
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
435 440 445
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
450 455 460
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
465 470 475 480
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
485 490 495
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
500 505 510
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
515 520 525
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Val Pro Arg Asp Cys
530 535 540
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
545 550 555 560
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
565 570 575
Lys Val Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
580 585 590
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
595 600 605
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
610 615 620
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
625 630 635 640
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
645 650 655
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
660 665 670
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
675 680 685
Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
690 695 700
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp
705 710 715 720
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
725 730 735
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
740 745 750
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
755 760 765
<210> 161
<211> 318
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体鼠4-1BBL (104-309, C160S) - CH1
<400> 161
Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu
1 5 10 15
Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
20 25 30
Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
35 40 45
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
50 55 60
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
85 90 95
Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
100 105 110
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
115 120 125
Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser
130 135 140
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
145 150 155 160
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
165 170 175
Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr
180 185 190
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
210 215 220
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
225 230 235 240
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
245 250 255
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
260 265 270
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
275 280 285
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
290 295 300
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
305 310 315
<210> 162
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链 DNA
<400> 162
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 163
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9)轻链 DNA
<400> 163
gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgacc tcctcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccctcggct gctgatcaac gtgggcagtc ggagagccac cggcatccct 180
gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggcatca tgctgccccc cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 164
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链
<400> 164
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 165
<211> 2166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - CL Fc节链 DNA
<400> 165
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 600
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 660
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 720
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 780
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 840
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 900
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 960
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 1020
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 1080
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaagggggc 1140
ggaggttccg gagggggagg atctcgtacg gtggccgctc cctccgtgtt tatctttccc 1200
ccatccgatg aacagctgaa aagcggcacc gcctccgtcg tgtgtctgct gaacaatttt 1260
taccctaggg aagctaaagt gcagtggaaa gtggataacg cactgcagtc cggcaactcc 1320
caggaatctg tgacagaaca ggactccaag gacagcacct actccctgtc ctccaccctg 1380
acactgtcta aggctgatta tgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 1440
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgtgacaa gacccacacc 1500
tgtccccctt gtcctgcccc tgaagctgct ggcggccctt ctgtgttcct gttcccccca 1560
aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggat 1620
gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac 1680
aatgccaaga ccaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1740
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1800
aaagccctcg gcgcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1860
ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1920
tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1980
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 2040
ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 2100
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 2160
ggtaaa 2166
<210> 166
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) - CH1 DNA
<400> 166
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggct ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggccggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
agactgggag tgcatctgca cacagaggcc agagccaggc acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg cctgcctagc 540
cctagatctg aaggcggcgg aggttccgga ggcggaggat ctgctagcac caaaggccct 600
tccgtgtttc ctctggctcc tagctccaag tccacctctg gaggcaccgc tgctctcgga 660
tgcctcgtga aggattattt tcctgagcct gtgacagtgt cctggaatag cggagcactg 720
acctctggag tgcatacttt ccccgctgtg ctgcagtcct ctggactgta cagcctgagc 780
agcgtggtga cagtgcccag cagcagcctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac 840
cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaggtggaac ccaagtcttg t 891
<210> 167
<211> 2502
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-254)
DNA
<400> 167
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtgg aggcggcgga agcggaggag gaggatccag agagggccct 1380
gagctgagcc ccgatgatcc tgctggactg ctggacctgc ggcagggcat gtttgctcag 1440
ctggtggccc agaacgtgct gctgatcgat ggccccctgt cctggtacag cgatcctgga 1500
ctggctggcg tgtcactgac aggcggcctg agctacaaag aggacaccaa agaactggtg 1560
gtggccaagg ccggcgtgta ctacgtgttc tttcagctgg aactgcggag agtggtggcc 1620
ggcgaaggat ctggctctgt gtctctggcc ctgcatctgc agcctctgag aagcgctgct 1680
ggcgctgcag ctctggcact gacagtggat ctgcctcctg ccagctccga ggcccggaat 1740
agcgcatttg ggtttcaagg caggctgctg cacctgtctg ccggccagag gctgggagtg 1800
catctgcaca cagaggccag ggctagacac gcctggcagc tgacacaggg cgctacagtg 1860
ctgggcctgt tcagagtgac ccccgagatt ccagccggcc tgccttctcc aagaagcgaa 1920
ggcggaggcg gatctggcgg cggaggatct agagagggac ccgaactgtc ccctgacgat 1980
ccagccgggc tgctggatct gagacaggga atgttcgccc agctggtggc tcagaatgtg 2040
ctgctgattg acggacctct gagctggtac tccgacccag ggctggcagg ggtgtccctg 2100
actgggggac tgtcctacaa agaagataca aaagaactgg tggtggctaa agctggggtg 2160
tactatgtgt tttttcagct ggaactgagg cgggtggtgg ctggggaggg ctcaggatct 2220
gtgtccctgg ctctgcatct gcagccactg cgctctgctg ctggcgcagc tgcactggct 2280
ctgactgtgg acctgccacc agcctctagc gaggccagaa acagcgcctt cgggttccaa 2340
ggacgcctgc tgcatctgag cgccggacag cgcctgggag tgcatctgca tactgaagcc 2400
agagcccggc atgcttggca gctgactcag ggggcaactg tgctgggact gtttcgcgtg 2460
acacctgaga tccctgccgg actgccaagc cctagatcag aa 2502
<210> 168
<211> 1920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc节链融合至单体hu 4-1BBL
(71-254) DNA
<400> 168
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccct gcagagatga gctgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgtggtg tctggtcaag ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggag 1140
tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggcagct tcttcctgta ctccaaactg accgtggaca agagccggtg gcagcagggc 1260
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgagcctga gccccggcgg aggcggcgga agcggaggag gaggatccag agagggccct 1380
gagctgagcc ccgatgatcc tgctggactg ctggacctgc ggcagggcat gtttgctcag 1440
ctggtggccc agaacgtgct gctgatcgat ggccccctgt cctggtacag cgatcctgga 1500
ctggctggcg tgtcactgac aggcggcctg agctacaaag aggacaccaa agaactggtg 1560
gtggccaagg ccggcgtgta ctacgtgttc tttcagctgg aactgcggag agtggtggcc 1620
ggcgaaggat ctggctctgt gtctctggcc ctgcatctgc agcctctgag aagcgctgct 1680
ggcgctgcag ctctggcact gacagtggat ctgcctcctg ccagctccga ggcccggaat 1740
agcgcatttg ggtttcaagg caggctgctg cacctgtctg ccggccagag gctgggagtg 1800
catctgcaca cagaggccag ggctagacac gcctggcagc tgacacaggg cgctacagtg 1860
ctgggcctgt tcagagtgac ccccgagatt ccagccggcc tgccttctcc aagaagcgaa 1920
<210> 169
<211> 2130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc节链 DNA
<400> 169
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg actgggaggc 540
ggcggatctg gcggcggagg atctagagaa ggacccgagc tgtcccctga cgatccagcc 600
gggctgctgg atctgagaca gggaatgttc gcccagctgg tggctcagaa tgtgctgctg 660
attgacggac ctctgagctg gtactccgac ccagggctgg caggggtgtc cctgactggg 720
ggactgtcct acaaagaaga tacaaaagaa ctggtggtgg ctaaagctgg ggtgtactat 780
gtgttttttc agctggaact gaggcgggtg gtggctgggg agggctcagg atctgtgtcc 840
ctggctctgc atctgcagcc actgcgctct gcagcagggg ctgcagcact ggccctgact 900
gtggacctgc ccccagcttc ttccgaggcc agaaacagcg ccttcgggtt ccaaggacgc 960
ctgctgcatc tgagcgccgg acagcgcctg ggagtgcatc tgcatactga agccagagcc 1020
cggcatgctt ggcagctgac tcagggggca actgtgctgg gactgtttcg cgtgacacct 1080
gagatccccg ctggactggg cggaggcggt tccggagggg gaggatctcg tacggtggct 1140
gcaccatctg tctttatctt cccacccagc gaccggaagc tgaagtctgg cacagccagc 1200
gtcgtgtgcc tgctgaataa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 1260
aatgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc 1320
acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 1380
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaaccgg 1440
ggcgagtgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgccctg cccctgaagc tgctggcggc 1500
cctagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggacccct 1560
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 1620
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaatgcc aagaccaagc cgcgggagga gcagtacaac 1680
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1740
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1800
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1860
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1920
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1980
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 2040
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2100
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2130
<210> 170
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) - CH1* DNA
<400> 170
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg actgggaggc 540
ggaggttccg gaggcggagg atctgctagc acaaagggcc ccagcgtgtt ccctctggcc 600
cctagcagca agagcacatc tggcggaaca gccgccctgg gctgcctggt ggaagattac 660
ttccccgagc ccgtgaccgt gtcctggaat tctggcgccc tgacaagcgg cgtgcacacc 720
tttccagccg tgctgcagag cagcggcctg tactctctga gcagcgtcgt gacagtgccc 780
agcagctctc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc 840
aaggtggacg agaaggtgga acccaagtcc tgc 873
<210> 171
<211> 2130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc节链 DNA
<400> 171
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg actgggaggc 540
ggcggatctg gcggcggagg atctagagaa ggacccgagc tgtcccctga cgatccagcc 600
gggctgctgg atctgagaca gggaatgttc gcccagctgg tggctcagaa tgtgctgctg 660
attgacggac ctctgagctg gtactccgac ccagggctgg caggggtgtc cctgactggg 720
ggactgtcct acaaagaaga tacaaaagaa ctggtggtgg ctaaagctgg ggtgtactat 780
gtgttttttc agctggaact gaggcgggtg gtggctgggg agggctcagg atctgtgtcc 840
ctggctctgc atctgcagcc actgcgctct gcagcagggg ctgcagcact ggccctgact 900
gtggacctgc ccccagcttc ttccgaggcc agaaacagcg ccttcgggtt ccaaggacgc 960
ctgctgcatc tgagcgccgg acagcgcctg ggagtgcatc tgcatactga agccagagcc 1020
cggcatgctt ggcagctgac tcagggggca actgtgctgg gactgtttcg cgtgacacct 1080
gagatccccg ctggactggg cggaggcggt tccggagggg gaggatctcg tacggtggcc 1140
gctccctccg tgtttatctt tcccccatcc gatgaacagc tgaaaagcgg caccgcctcc 1200
gtcgtgtgtc tgctgaacaa tttttaccct agggaagcta aagtgcagtg gaaagtggat 1260
aacgcactgc agtccggcaa ctcccaggaa tctgtgacag aacaggactc caaggacagc 1320
acctactccc tgtcctccac cctgacactg tctaaggctg attatgagaa acacaaagtc 1380
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 1440
ggagagtgtg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccctgaagc tgctggcggc 1500
ccttctgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 1560
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 1620
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaatgcc aagaccaagc cgcgggagga gcagtacaac 1680
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1740
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1800
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1860
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1920
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1980
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 2040
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2100
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2130
<210> 172
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) - CH1 DNA
<400> 172
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg actgggaggc 540
ggaggttccg gaggcggagg atctgctagc accaaaggcc cttccgtgtt tcctctggct 600
cctagctcca agtccacctc tggaggcacc gctgctctcg gatgcctcgt gaaggattat 660
tttcctgagc ctgtgacagt gtcctggaat agcggagcac tgacctctgg agtgcatact 720
ttccccgctg tgctgcagtc ctctggactg tacagcctga gcagcgtggt gacagtgccc 780
agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc 840
aaggtggaca agaaggtgga acccaagtct tgt 873
<210> 173
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-248) - CL Fc节链
<400> 173
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
180 185 190
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
195 200 205
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
210 215 220
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
245 250 255
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
260 265 270
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
290 295 300
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
325 330 335
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
340 345 350
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
370 375 380
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
385 390 395 400
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
405 410 415
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
420 425 430
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
435 440 445
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
450 455 460
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
465 470 475 480
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
485 490 495
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
500 505 510
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
515 520 525
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
530 535 540
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
545 550 555 560
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
565 570 575
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
580 585 590
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
595 600 605
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
610 615 620
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
625 630 635 640
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
645 650 655
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
660 665 670
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
675 680 685
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
690 695 700
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710
<210> 174
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) - CH1
<400> 174
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys
180 185 190
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
210 215 220
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
225 230 235 240
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
245 250 255
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
260 265 270
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
275 280 285
Lys Ser Cys
290
<210> 175
<211> 2466
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-248)
DNA
<400> 175
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtgg aggcggcgga agcggaggag gaggatccag agagggccct 1380
gagctgagcc ccgatgatcc tgctggactg ctggacctgc ggcagggcat gtttgctcag 1440
ctggtggccc agaacgtgct gctgatcgat ggccccctgt cctggtacag cgatcctgga 1500
ctggctggcg tgtcactgac aggcggcctg agctacaaag aggacaccaa agaactggtg 1560
gtggccaagg ccggcgtgta ctacgtgttc tttcagctgg aactgcggag agtggtggcc 1620
ggcgaaggat ctggctctgt gtctctggcc ctgcatctgc agcctctgag aagcgctgct 1680
ggcgctgcag ctctggcact gacagtggat ctgcctcctg ccagctccga ggcccggaat 1740
agcgcatttg ggtttcaagg caggctgctg cacctgtctg ccggccagag gctgggagtg 1800
catctgcaca cagaggccag ggctagacac gcctggcagc tgacacaggg cgctacagtg 1860
ctgggcctgt tcagagtgac ccccgagatt ccagccggcc tgggcggagg cggatctggc 1920
ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg tcccctgacg atccagccgg gctgctggat 1980
ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct 2040
ctgagctggt actccgaccc agggctggca ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac 2100
aaagaagata caaaagaact ggtggtggct aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag 2160
ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat 2220
ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca 2280
ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg 2340
agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg 2400
cagctgactc agggggcaac tgtgctggga ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc 2460
ggactg 2466
<210> 176
<211> 1902
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc节链融合至单体hu 4-1BBL
(71-248) DNA
<400> 176
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccct gcagagatga gctgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgtggtg tctggtcaag ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggag 1140
tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggcagct tcttcctgta ctccaaactg accgtggaca agagccggtg gcagcagggc 1260
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgagcctga gccccggcgg aggcggcgga agcggaggag gaggatccag agagggccct 1380
gagctgagcc ccgatgatcc tgctggactg ctggacctgc ggcagggcat gtttgctcag 1440
ctggtggccc agaacgtgct gctgatcgat ggccccctgt cctggtacag cgatcctgga 1500
ctggctggcg tgtcactgac aggcggcctg agctacaaag aggacaccaa agaactggtg 1560
gtggccaagg ccggcgtgta ctacgtgttc tttcagctgg aactgcggag agtggtggcc 1620
ggcgaaggat ctggctctgt gtctctggcc ctgcatctgc agcctctgag aagcgctgct 1680
ggcgctgcag ctctggcact gacagtggat ctgcctcctg ccagctccga ggcccggaat 1740
agcgcatttg ggtttcaagg caggctgctg cacctgtctg ccggccagag gctgggagtg 1800
catctgcaca cagaggccag ggctagacac gcctggcagc tgacacaggg cgctacagtg 1860
ctgggcctgt tcagagtgac ccccgagatt ccagccggcc tg 1902
<210> 177
<211> 2496
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-254) DNA
<400> 177
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccctccgtgt tccccctggc ccccagcagc aagagcacca gcggcggcac agccgctctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgag cccgtgaccg tgtcctggaa cagcggagcc 480
ctgacctccg gcgtgcacac cttccccgcc gtgctgcaga gttctggcct gtatagcctg 540
agcagcgtgg tcaccgtgcc ttctagcagc ctgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aaccacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggtgg agcccaagag ctgcgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgtg caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctct cgtgcgcagt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tcgtgagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtggaggcgg cggaagcgga ggaggaggat ccagagaggg ccctgagctg 1380
agccccgatg atcctgctgg actgctggac ctgcggcagg gcatgtttgc tcagctggtg 1440
gcccagaacg tgctgctgat cgatggcccc ctgtcctggt acagcgatcc tggactggct 1500
ggcgtgtcac tgacaggcgg cctgagctac aaagaggaca ccaaagaact ggtggtggcc 1560
aaggccggcg tgtactacgt gttctttcag ctggaactgc ggagagtggt ggccggcgaa 1620
ggatctggct ctgtgtctct ggccctgcat ctgcagcctc tgagaagcgc tgctggcgct 1680
gcagctctgg cactgacagt ggatctgcct cctgccagct ccgaggcccg gaatagcgca 1740
tttgggtttc aaggcaggct gctgcacctg tctgccggcc agaggctggg agtgcatctg 1800
cacacagagg ccagggctag acacgcctgg cagctgacac agggcgctac agtgctgggc 1860
ctgttcagag tgacccccga gattccagcc ggcctgcctt ctccaagaag cgaaggcgga 1920
ggcggatctg gcggcggagg atctagagag ggacccgaac tgtcccctga cgatccagcc 1980
gggctgctgg atctgagaca gggaatgttc gcccagctgg tggctcagaa tgtgctgctg 2040
attgacggac ctctgagctg gtactccgac ccagggctgg caggggtgtc cctgactggg 2100
ggactgtcct acaaagaaga tacaaaagaa ctggtggtgg ctaaagctgg ggtgtactat 2160
gtgttttttc agctggaact gaggcgggtg gtggctgggg agggctcagg atctgtgtcc 2220
ctggctctgc atctgcagcc actgcgctct gctgctggcg cagctgcact ggctctgact 2280
gtggacctgc caccagcctc tagcgaggcc agaaacagcg ccttcgggtt ccaaggacgc 2340
ctgctgcatc tgagcgccgg acagcgcctg ggagtgcatc tgcatactga agccagagcc 2400
cggcatgctt ggcagctgac tcagggggca actgtgctgg gactgtttcg cgtgacacct 2460
gagatccctg ccggactgcc aagccctaga tcagaa 2496
<210> 178
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc节链融合至单体hu 4-1BBL (71-254) DNA
<400> 178
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccctgcagag atgagctgac caagaaccag 1080
gtgtccctgt ggtgtctggt caagggcttc taccccagcg atatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaacggcc agcctgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga cagcgacggc 1200
agcttcttcc tgtactccaa actgaccgtg gacaagagcc ggtggcagca gggcaacgtg 1260
ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgagc 1320
ctgagccccg gcggaggcgg cggaagcgga ggaggaggat ccagagaggg ccctgagctg 1380
agccccgatg atcctgctgg actgctggac ctgcggcagg gcatgtttgc tcagctggtg 1440
gcccagaacg tgctgctgat cgatggcccc ctgtcctggt acagcgatcc tggactggct 1500
ggcgtgtcac tgacaggcgg cctgagctac aaagaggaca ccaaagaact ggtggtggcc 1560
aaggccggcg tgtactacgt gttctttcag ctggaactgc ggagagtggt ggccggcgaa 1620
ggatctggct ctgtgtctct ggccctgcat ctgcagcctc tgagaagcgc tgctggcgct 1680
gcagctctgg cactgacagt ggatctgcct cctgccagct ccgaggcccg gaatagcgca 1740
tttgggtttc aaggcaggct gctgcacctg tctgccggcc agaggctggg agtgcatctg 1800
cacacagagg ccagggctag acacgcctgg cagctgacac agggcgctac agtgctgggc 1860
ctgttcagag tgacccccga gattccagcc ggcctgcctt ctccaagaag cgaa 1914
<210> 179
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc穴链融合至二聚体hu 4-1BBL (71-254)
<400> 179
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635 640
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu
645 650 655
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
660 665 670
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
675 680 685
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
690 695 700
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
705 710 715 720
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
725 730 735
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
740 745 750
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
755 760 765
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
770 775 780
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
785 790 795 800
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
805 810 815
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg
820 825 830
Ser Glu
<210> 180
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc节链融合至单体hu 4-1BBL (71-254)
<400> 180
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635 640
<210> 181
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47重链(hu IgG1 PGLALA) DNA
<400> 181
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 182
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47重链(hu IgG1 PGLALA)
<400> 182
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 183
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) 加 (G4S)1接头
<400> 183
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser
180 185
<210> 184
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) 加 (G4S)2接头
<400> 184
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
180 185
<210> 185
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) 加 (G4S)1接头
<400> 185
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser
180
<210> 186
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD19抗原Fc节链 avi标签DNA
<400> 186
cccgaggaac ccctggtcgt gaaggtggaa gagggcgaca atgccgtgct gcagtgcctg 60
aagggcacct ccgatggccc tacccagcag ctgacctggt ccagagagag ccccctgaag 120
cccttcctga agctgtctct gggcctgcct ggcctgggca tccatatgag gcctctggcc 180
atctggctgt tcatcttcaa cgtgtcccag cagatgggcg gcttctacct gtgtcagcct 240
ggccccccat ctgagaaggc ttggcagcct ggctggaccg tgaacgtgga aggatccggc 300
gagctgttcc ggtggaacgt gtccgatctg ggcggcctgg gatgcggcct gaagaacaga 360
tctagcgagg gccccagcag ccccagcggc aaactgatga gccccaagct gtacgtgtgg 420
gccaaggaca gacccgagat ctgggagggc gagcctcctt gcctgccccc tagagacagc 480
ctgaaccaga gcctgagcca ggacctgaca atggcccctg gcagcacact gtggctgagc 540
tgtggcgtgc cacccgactc tgtgtctaga ggccctctga gctggaccca cgtgcaccct 600
aagggcccta agagcctgct gagcctggaa ctgaaggacg acaggcccgc cagagatatg 660
tgggtcatgg aaaccggcct gctgctgcct agagccacag cccaggatgc cggcaagtac 720
tactgccaca gaggcaacct gaccatgagc ttccacctgg aaatcaccgc cagacccgtg 780
ctgtggcact ggctgctgag aacaggcggc tggaaggtcg acgctagcgg tggtagtccg 840
acacctccga cacccggggg tggttctgca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 900
gcacctgaag ccgcaggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 960
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1020
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1080
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1140
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggagcc 1200
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1260
ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1320
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1380
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1440
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1500
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atccggaggc 1560
ctgaacgaca tcttcgaggc ccagaagatt gaatggcacg ag 1602
<210> 187
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD19抗原Fc节链 avi标签
<400> 187
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
20 25 30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
210 215 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
260 265 270
Val Asp Ala Ser Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr Pro Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
305 310 315 320
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
325 330 335
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
340 345 350
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
355 360 365
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
370 375 380
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
385 390 395 400
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
405 410 415
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
420 425 430
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
435 440 445
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
450 455 460
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
465 470 475 480
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
485 490 495
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
500 505 510
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
515 520 525
Lys Ile Glu Trp His Glu
530
<210> 188
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD19抗原Fc节链 avi标签DNA
<400> 188
ccccaggaac ccctggtcgt gaaggtggaa gagggcgaca atgccgtgct ccagtgcctg 60
gaaggcacct ccgatggccc tacacagcag ctcgtgtggt gcagagacag ccccttcgag 120
cccttcctga acctgtctct gggcctgcct ggcatgggca tcagaatggg ccctctgggc 180
atctggctgc tgatcttcaa cgtgtccaac cagaccggcg gcttctacct gtgtcagcct 240
ggcctgccaa gcgagaaggc ttggcagcct ggatggaccg tgtccgtgga aggatctggc 300
gagctgttcc ggtggaacgt gtccgatctg ggcggcctgg gatgcggcct gaagaacaga 360
agcagcgagg gccctagcag ccccagcggc aagctgaata gcagccagct gtacgtgtgg 420
gccaaggaca gacccgagat gtgggagggc gagcctgtgt gtggcccccc tagagatagc 480
ctgaaccaga gcctgagcca ggacctgaca atggcccctg gcagcacact gtggctgagc 540
tgtggcgtgc cacccgactc tgtgtccaga ggccctctga gctggacaca cgtgcggcca 600
aagggcccta agagcagcct gctgagcctg gaactgaagg acgaccggcc cgaccgggat 660
atgtgggtgg tggatacagg cctgctgctg accagagcca cagcccagga tgccggcaag 720
tactactgcc acagaggcaa ctggaccaag agcttttacc tggaaatcac cgccagaccc 780
gccctgtggc actggctgct gagaatcgga ggctggaagg tcgacgctag cggtggtagt 840
ccgacacctc cgacacccgg gggtggttct gcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 900
ccagcacctg aagccgcagg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 960
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1020
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1080
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1140
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctcgga 1200
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1260
accctgcccc catgccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc 1320
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1380
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1440
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1500
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatccgga 1560
ggcctgaacg acatcttcga ggcccagaag attgaatggc acgag 1605
<210> 189
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD19抗原Fc节链 avi标签
<400> 189
Pro Gln Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Glu Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Val
20 25 30
Trp Cys Arg Asp Ser Pro Phe Glu Pro Phe Leu Asn Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Met Gly Ile Arg Met Gly Pro Leu Gly Ile Trp Leu Leu
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Asn Gln Thr Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Leu Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Ser Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Asn Ser Ser Gln Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Met Trp Glu Gly Glu Pro Val Cys Gly Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val Arg Pro Lys Gly Pro Lys Ser Ser Leu Leu
195 200 205
Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Asp Arg Asp Met Trp Val Val
210 215 220
Asp Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Trp Thr Lys Ser Phe Tyr Leu Glu Ile
245 250 255
Thr Ala Arg Pro Ala Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Ile Gly Gly Trp
260 265 270
Lys Val Asp Ala Ser Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr Pro Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
290 295 300
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
305 310 315 320
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
325 330 335
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
340 345 350
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
355 360 365
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
370 375 380
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
385 390 395 400
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
405 410 415
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
420 425 430
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
435 440 445
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
450 455 460
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
465 470 475 480
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
485 490 495
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
500 505 510
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala
515 520 525
Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
530 535
<210> 190
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化CD19 (8B8) HVR-L1
<400> 190
Asn Ser Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 191
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化CD19 (8B8) HVR-H2
<400> 191
Lys Phe Asn Gly
1
<210> 192
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化CD19 (8B8) var.1至9 HVR-H2
<400> 192
Thr Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met
1 5 10
<210> 193
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化CD19 (8B8) var.5 HVR-L1
<400> 193
Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 194
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化CD19 (8B8) var.9 HVR-L1
<400> 194
Leu Glu Asn Pro Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 195
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-H1
<400> 195
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 196
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-H2
<400> 196
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 197
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-H3
<400> 197
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 198
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-L1
<400> 198
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 199
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-L2
<400> 199
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-L3
<400> 200
Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 201
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) VH
<400> 201
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 202
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) VL
<400> 202
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 203
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc穴链 DNA
<400> 203
caggtccagc tggtgcagtc cggcgccgag gtcaagaaac ccggggcttc tgtgaaggtt 60
tcatgcaagg caagcggata caccttcacc gactatatca tgcattgggt caggcaggcc 120
cctggccaag gtctcgaatg gatgggctac attaacccat ataatgatgg ctccaaatac 180
accgagaagt ttcagggaag agtcactatg acatctgaca ccagtatcag cactgcttac 240
atggagctgt cccgccttcg gtctgatgac accgcagtgt attactgtgc caggggcaca 300
tattactacg gctcagctct gttcgactat tgggggcagg gaaccacagt aaccgtgagc 360
tccgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 204
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018)轻链 DNA
<400> 204
gacatcgtca tgacccagac acccctgtcc ctctctgtga cccctggcca gccagcctca 60
attagctgca agtcctctca aagtctggag aaccccaatg ggaacactta ccttaattgg 120
tatctgcaga aacccggaca atcccctcaa ctcctgatct acagggtctc taagagattc 180
tcaggcgtgc cagatcgctt tagcggttcc gggtctggca cagacttcac cttgaagatt 240
agtcgggttg aagctgagga tgtgggagtc tattactgtc tgcagctcac tcatgtgccc 300
tacacctttg gtcagggcac aaaactggag atcaagcgga ccgtggccgc tccctccgtg 360
ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
tccggcaact cccaggaatc cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540
tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 657
<210> 205
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc穴链
<400> 205
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 206
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018)轻链
<400> 206
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 207
<211> 2514
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc穴 二聚体配体链 DNA
<400> 207
caggtccagc tggtgcagtc cggcgccgag gtcaagaaac ccggggcttc tgtgaaggtt 60
tcatgcaagg caagcggata caccttcacc gactatatca tgcattgggt caggcaggcc 120
cctggccaag gtctcgaatg gatgggctac attaacccat ataatgatgg ctccaaatac 180
accgagaagt ttcagggaag agtcactatg acatctgaca ccagtatcag cactgcttac 240
atggagctgt cccgccttcg gtctgatgac accgcagtgt attactgtgc caggggcaca 300
tattactacg gctcagctct gttcgactat tgggggcagg gaaccacagt aaccgtgagc 360
tccgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 1980
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 2040
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 2100
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 2160
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 2220
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 2280
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 2340
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 2400
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 2460
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaa 2514
<210> 208
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc节 单体配体 DNA
<400> 208
caggtccagc tggtgcagtc cggcgccgag gtcaagaaac ccggggcttc tgtgaaggtt 60
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cctggccaag gtctcgaatg gatgggctac attaacccat ataatgatgg ctccaaatac 180
accgagaagt ttcagggaag agtcactatg acatctgaca ccagtatcag cactgcttac 240
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acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
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aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
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atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
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agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
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<210> 209
<211> 838
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc穴 二聚体配体链
<400> 209
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu
645 650 655
Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
660 665 670
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
675 680 685
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
690 695 700
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
705 710 715 720
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
725 730 735
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
740 745 750
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
755 760 765
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
770 775 780
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
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His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
805 810 815
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Pro Ser Pro Arg Ser Glu
835
<210> 210
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc节 单体配体
<400> 210
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
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565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu
<210> 211
<211> 2478
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc穴 二聚体配体 (71-248)链 DNA
<400> 211
caggtccagc tggtgcagtc cggcgccgag gtcaagaaac ccggggcttc tgtgaaggtt 60
tcatgcaagg caagcggata caccttcacc gactatatca tgcattgggt caggcaggcc 120
cctggccaag gtctcgaatg gatgggctac attaacccat ataatgatgg ctccaaatac 180
accgagaagt ttcagggaag agtcactatg acatctgaca ccagtatcag cactgcttac 240
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tattactacg gctcagctct gttcgactat tgggggcagg gaaccacagt aaccgtgagc 360
tccgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
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aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
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<210> 212
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc节 单体(71-248) 配体 DNA
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tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccctgatgat cctgccggac tgctggacct gcggcaggga 1440
atgtttgccc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg gctc 1914
<210> 213
<211> 826
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc穴 二聚体配体 (71-248)链
<400> 213
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50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly
625 630 635 640
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
645 650 655
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
660 665 670
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
675 680 685
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
690 695 700
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
705 710 715 720
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
725 730 735
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
740 745 750
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
755 760 765
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
770 775 780
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
785 790 795 800
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
805 810 815
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
820 825
<210> 214
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc节 单体(71-248) 配体
<400> 214
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
625 630 635
<210> 215
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核苷酸序列CD19 (8B8) VH亲本克隆DNA
<400> 215
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
gcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatatta tgcactgggt gaagcagaag 120
actgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg ttctaagtac 180
actgagaagt tcaacggcaa ggccacactg acttcagaca aatcttccat cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggacc 300
tattattatg gtagcgccct ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tcg 363
<210> 216
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核苷酸序列CD19 (8B8) VL亲本克隆DNA
<400> 216
gatgctgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca ggtctagtca gagccttgaa aacagtaatg gaaacaccta tttgaactgg 120
tacctccaga aaccaggcca gtctccacaa ctcctgatct acagggtttc caaacgattt 180
tctggggtcc tagacaggtt cagtggtagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tatttctgcc tacaacttac acatgtcccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 217
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 43-45: 40% Y, 6% A/S/T/G/P/D/N/E/Q/V, 49-51: 40% N, 6%
A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 55-57: 25% S/T/Q/E, 61-63: 25% S/T/Q/E
<220>
<221> 混杂特征
<222> (43)..(45)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (61)..(63)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 217
cagctgcggg ctctgacccg gtttctggag ataccagttc agnnncgtnn ngccnnngga 60
nnnttccaga gattggctgg atttgcaaga aatg 94
<210> 218
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 40-42: 30% R, 20% E, 5% A/S/T/Y/G/P/D/N/Q/V. 49-51: 30% K, 20% S,
5% A/N/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 55-57: 40% F, 5% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V/I/L,
58-60: 40% S, 6.6% A/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 67-69: 50% P, 50% L
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (58)..(60)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (67)..(69)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 218
ctccagaaac cgggtcagag cccgcagctg ctgatctacn nngtatctnn ncgcnnnnnn 60
ggcgttnnng atcgtttcag cggttctgga tccggcacc 99
<210> 219
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 40-42: 52% H, 4% G/A/S/P/T/N/Y/D/E/Q/V/I, 46-48: 30% I, 15% Y, 5%
G/A/S/T/P/N/H/D/E/Q/V, 49-51: 52% Y, 4% G/A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I,
52-54: 30% D, 15% G, 5% A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I, 55-57: 52% T, 4%
G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I, 61-63: 52% T, 4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (46)..(48)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (52)..(54)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (61)..(63)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 219
catccactcc agaccctggc ccggggcctg acgaacccan nncatnnnnn nnnnnnngaa 60
nnngtaacca gatgctttgc agctcacttt aacggaagc 99
<210> 220
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34-36: 45% Y, 5% 其它, 40-42: 52% N, 4% 其它, 46-48: 40% Y,
5% 其它, 49-51: 30% N, 15% S, 5% 其它, 52-54: 30% D, 15% G,
5% 其它, 55-57: 52% G, 4% 其它, 61-63: 30% K, 15% N, 4%
其它, 70-72: 30% E, 15% Q, 5% 其它
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(36)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (46)..(48)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (52)..(54)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (61)..(63)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (70)..(72)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 220
caggccccgg gccagggtct ggagtggatg ggcnnnattn nnccannnnn nnnnnnntcc 60
nnntataccn nnaaattcca gggccgcgtc acgatgacc 99
<210> 221
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 H3 reverse constant
<400> 221
cgtcaccggt tcggggaagt agtccttgac cag 33
<210> 222
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LMB3
<400> 222
caggaaacag ctatgaccat gattac 26
<210> 223
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 L1正向恒定
<400> 223
tggtatctcc agaaaccggg tcagagcccg cag 33
<210> 224
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34-36: 52% Y, 4% 其它, 37-39: 52% P, 4% 其它, 40-42: 42% V,
10% L, 4% 其它, 43-45: 52% H, 4% 其它, 46-48: 42% T, 10% I,
4% 其它, 49-51: 45% L, 11% G, 4% 其它
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(36)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (37)..(39)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (43)..(45)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (46)..(48)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 224
tttaatttcc agtttagttc cttgaccgaa ggtnnnnnnn nnnnnnnnnn nctgcagaca 60
atagtagacg ccaacgtctt cagc 84
<210> 225
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 L3正向恒定
<400> 225
accttcggtc aaggaactaa actggaaatt aaacg 35
<210> 226
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pos. 59-61: 50% L, 3.8% 其它, 62-64: 50% A, 4.2% 其它, 65-67:
50% S, 4.2% 其它, 68-70: 50% G, 4.2% 其它, 71-73: 50% Y, 4.2%
其它, 74-76: 50% Y, 4.2% 其它, 77-79: 50% Y, 4.2% 其它,
80-82: 50% T, 4.2% 其它, 83-85: 50% G, 4.2% 其它.
<220>
<221> 混杂特征
<222> (54)..(58)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (59)..(61)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (62)..(64)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (65)..(67)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (68)..(70)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (71)..(73)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (74)..(76)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (77)..(79)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (80)..(82)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (83)..(85)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 226
ttggtgctag cagagcttac ggtcaccgtg gtaccttggc cccagtaatc aaannnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcgtgcacaa tagtaaacag cggtgtc 107
<210> 227
<211> 1615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAP标签人 CD19 ECD- PDGFR DNA
<400> 227
ggccgccgct agcggcatcg actacaagga cgacgatgac aaggccggca tcgatgccat 60
catggacaaa gactgcgaaa tgaagcgcac caccctggat agccctctgg gcaagctgga 120
actgtctggg tgcgaacagg gcctgcacga gatcaagctg ctgggcaaag gaacatctgc 180
cgccgacgcc gtggaagtgc ctgccccagc cgccgtgctg ggcggaccag agccactgat 240
gcaggccacc gcctggctca acgcctactt tcaccagcct gaggccatcg aggagttccc 300
tgtgccagcc ctgcaccacc cagtgttcca gcaggagagc tttacccgcc aggtgctgtg 360
gaaactgctg aaagtggtga agttcggaga ggtcatcagc taccagcagc tggccgccct 420
ggccggcaat cccgccgcca ccgccgccgt gaaaaccgcc ctgagcggaa atcccgtgcc 480
cattctgatc ccctgccacc gggtggtgtc tagctctggc gccgtggggg gctacgaggg 540
cgggctcgcc gtgaaagagt ggctgctggc ccacgagggc cacagactgg gcaagcctgg 600
gctgggtgat atccccgagg aacccctggt cgtgaaggtg gaagagggcg acaatgccgt 660
gctgcagtgc ctgaagggca cctccgatgg ccctacccag cagctgacct ggtccagaga 720
gagccccctg aagcccttcc tgaagctgtc tctgggcctg cctggcctgg gcatccatat 780
gaggcctctg gccatctggc tgttcatctt caacgtgtcc cagcagatgg gcggcttcta 840
cctgtgtcag cctggccccc catctgagaa ggcttggcag cctggctgga ccgtgaacgt 900
ggaaggatcc ggcgagctgt tccggtggaa cgtgtccgat ctgggcggcc tgggatgcgg 960
cctgaagaac agatctagcg agggccccag cagccccagc ggcaaactga tgagccccaa 1020
gctgtacgtg tgggccaagg acagacccga gatctgggag ggcgagcctc cttgcctgcc 1080
ccctagagac agcctgaacc agagcctgag ccaggacctg acaatggccc ctggcagcac 1140
actgtggctg agctgtggcg tgccacccga ctctgtgtct agaggccctc tgagctggac 1200
ccacgtgcac cctaagggcc ctaagagcct gctgagcctg gaactgaagg acgacaggcc 1260
cgccagagat atgtgggtca tggaaaccgg cctgctgctg cctagagcca cagcccagga 1320
tgccggcaag tactactgcc acagaggcaa cctgaccatg agcttccacc tggaaatcac 1380
cgccagaccc gtgctgtggc actggctgct gagaacaggc ggctggaagg tcgacgaaca 1440
aaaactcatc tcagaagagg atctgaatgc tgtgggccag gacacgcagg aggtcatcgt 1500
ggtgccacac tccttgccct ttaaggtggt ggtgatctca gccatcctgg ccctggtggt 1560
gctcaccatc atctccctta tcatcctcat catgctttgg cagaagaagc cacgt 1615
<210> 228
<211> 1620
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAP标签食蟹猴 CD19 ECD- PDGFR DNA
<400> 228
ccggccgccg ctagcggcat cgactacaag gacgacgatg acaaggccgg catcgatgcc 60
atcatggaca aagactgcga aatgaagcgc accaccctgg atagccctct gggcaagctg 120
gaactgtctg ggtgcgaaca gggcctgcac gagatcaagc tgctgggcaa aggaacatct 180
gccgccgacg ccgtggaagt gcctgcccca gccgccgtgc tgggcggacc agagccactg 240
atgcaggcca ccgcctggct caacgcctac tttcaccagc ctgaggccat cgaggagttc 300
cctgtgccag ccctgcacca cccagtgttc cagcaggaga gctttacccg ccaggtgctg 360
tggaaactgc tgaaagtggt gaagttcgga gaggtcatca gctaccagca gctggccgcc 420
ctggccggca atcccgccgc caccgccgcc gtgaaaaccg ccctgagcgg aaatcccgtg 480
cccattctga tcccctgcca ccgggtggtg tctagctctg gcgccgtggg gggctacgag 540
ggcgggctcg ccgtgaaaga gtggctgctg gcccacgagg gccacagact gggcaagcct 600
gggctgggtg atatccccca ggaacccctg gtcgtgaagg tggaagaggg cgacaatgcc 660
gtgctccagt gtctcgaggg cacctccgat ggccctacac agcagctcgt gtggtgcaga 720
gacagcccct tcgagccctt cctgaacctg tctctgggcc tgcctggcat gggcatcaga 780
atgggccctc tgggcatctg gctgctgatc ttcaacgtgt ccaaccagac cggcggcttc 840
tacctgtgtc agcctggcct gccaagcgag aaggcttggc agcctggatg gaccgtgtcc 900
gtggaaggat ctggcgagct gttccggtgg aacgtgtccg atctgggcgg cctgggatgc 960
ggcctgaaga acagaagcag cgagggccct agcagcccca gcggcaagct gaatagcagc 1020
cagctgtacg tgtgggccaa ggacagaccc gagatgtggg agggcgagcc tgtgtgtggc 1080
ccccctagag atagcctgaa ccagagcctg agccaggacc tgacaatggc ccctggcagc 1140
acactgtggc tgagctgtgg cgtgccaccc gactctgtgt ccagaggccc tctgagctgg 1200
acacacgtgc ggcctaaggg ccctaagagc agcctgctga gcctggaact gaaggacgac 1260
cggcccgacc gggatatgtg ggtggtggat acaggcctgc tgctgaccag agccacagcc 1320
caggatgccg gcaagtacta ctgccacaga ggcaactgga ccaagagctt ttacctggaa 1380
atcaccgcca gacccgccct gtggcactgg ctgctgagaa tcggaggctg gaaggtcgac 1440
gagcagaagc tgatctccga agaggacctg aacgccgtgg gccaggatac ccaggaagtg 1500
atcgtggtgc cccacagcct gcccttcaag gtggtcgtga tcagcgccat tctggccctg 1560
gtggtgctga ccatcatcag cctgatcatc ctgattatgc tgtggcagaa aaagccccgc 1620
<210> 229
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAP标签人 CD19 ECD- PDGFR
<400> 229
Pro Ala Ala Ala Ser Gly Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala
1 5 10 15
Gly Ile Asp Ala Ile Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Asp Ser Pro Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly
35 40 45
Leu His Glu Ile Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala
50 55 60
Val Glu Val Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu
65 70 75 80
Met Gln Ala Thr Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala
85 90 95
Ile Glu Glu Phe Pro Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln
100 105 110
Glu Ser Phe Thr Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys
115 120 125
Phe Gly Glu Val Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn
130 135 140
Pro Ala Ala Thr Ala Ala Val Lys Thr Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val
145 150 155 160
Pro Ile Leu Ile Pro Cys His Arg Val Val Ser Ser Ser Gly Ala Val
165 170 175
Gly Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His
180 185 190
Glu Gly His Arg Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly Asp Ile Pro Glu Glu
195 200 205
Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys
210 215 220
Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg
225 230 235 240
Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly
245 250 255
Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn
260 265 270
Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro
275 280 285
Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser
290 295 300
Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys
305 310 315 320
Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys
325 330 335
Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile
340 345 350
Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln
355 360 365
Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu
370 375 380
Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp
385 390 395 400
Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu
405 410 415
Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu
420 425 430
Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His
435 440 445
Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro
450 455 460
Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Asp Glu
465 470 475 480
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp Thr
485 490 495
Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val Val
500 505 510
Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile
515 520 525
Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
530 535
<210> 230
<211> 540
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SNAP标签食蟹猴 CD19 ECD- PDGFR
<400> 230
Pro Ala Ala Ala Ser Gly Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala
1 5 10 15
Gly Ile Asp Ala Ile Met Asp Lys Asp Cys Glu Met Lys Arg Thr Thr
20 25 30
Leu Asp Ser Pro Leu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Gly Cys Glu Gln Gly
35 40 45
Leu His Glu Ile Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Ser Ala Ala Asp Ala
50 55 60
Val Glu Val Pro Ala Pro Ala Ala Val Leu Gly Gly Pro Glu Pro Leu
65 70 75 80
Met Gln Ala Thr Ala Trp Leu Asn Ala Tyr Phe His Gln Pro Glu Ala
85 90 95
Ile Glu Glu Phe Pro Val Pro Ala Leu His His Pro Val Phe Gln Gln
100 105 110
Glu Ser Phe Thr Arg Gln Val Leu Trp Lys Leu Leu Lys Val Val Lys
115 120 125
Phe Gly Glu Val Ile Ser Tyr Gln Gln Leu Ala Ala Leu Ala Gly Asn
130 135 140
Pro Ala Ala Thr Ala Ala Val Lys Thr Ala Leu Ser Gly Asn Pro Val
145 150 155 160
Pro Ile Leu Ile Pro Cys His Arg Val Val Ser Ser Ser Gly Ala Val
165 170 175
Gly Gly Tyr Glu Gly Gly Leu Ala Val Lys Glu Trp Leu Leu Ala His
180 185 190
Glu Gly His Arg Leu Gly Lys Pro Gly Leu Gly Asp Ile Pro Gln Glu
195 200 205
Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys
210 215 220
Leu Glu Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Val Trp Cys Arg
225 230 235 240
Asp Ser Pro Phe Glu Pro Phe Leu Asn Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly
245 250 255
Met Gly Ile Arg Met Gly Pro Leu Gly Ile Trp Leu Leu Ile Phe Asn
260 265 270
Val Ser Asn Gln Thr Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Leu Pro
275 280 285
Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Ser Val Glu Gly Ser
290 295 300
Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys
305 310 315 320
Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys
325 330 335
Leu Asn Ser Ser Gln Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Met
340 345 350
Trp Glu Gly Glu Pro Val Cys Gly Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln
355 360 365
Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu
370 375 380
Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp
385 390 395 400
Thr His Val Arg Pro Lys Gly Pro Lys Ser Ser Leu Leu Ser Leu Glu
405 410 415
Leu Lys Asp Asp Arg Pro Asp Arg Asp Met Trp Val Val Asp Thr Gly
420 425 430
Leu Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys
435 440 445
His Arg Gly Asn Trp Thr Lys Ser Phe Tyr Leu Glu Ile Thr Ala Arg
450 455 460
Pro Ala Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Ile Gly Gly Trp Lys Val Asp
465 470 475 480
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp
485 490 495
Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val
500 505 510
Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu
515 520 525
Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
530 535 540
<210> 231
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 231
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Ser Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
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<210> 232
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 232
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-5H09) CDR-L3
<400> 233
Leu Gln Leu Ile Asp Tyr Pro Val Thr
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-5H09) CDR-H1
<400> 234
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 235
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-5H09) CDR-H2
<400> 235
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 237
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 240
Asp Tyr Ile Met His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 241
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 242
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 243
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Asp Tyr Ile Thr His
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Asp Leu Phe Asp Tyr
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 249
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 250
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 251
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L3
<400> 251
Leu Gln Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 252
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H1
<400> 252
Asp Tyr Ile Met His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H2
<400> 253
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H3
<400> 254
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 255
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) CDR-L1
<400> 255
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 256
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) CDR-L2
<400> 256
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 257
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) CDR-L3
<400> 257
Leu Gln Pro Gly His Tyr Pro Gly Thr
1 5
<210> 258
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) CDR-H1
<400> 258
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 259
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) CDR-H2
<400> 259
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 260
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) CDR-H3
<400> 260
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 261
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) CDR-L1
<400> 261
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 262
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) CDR-L2
<400> 262
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) CDR-L3
<400> 263
Leu Gln Leu Asp Ser Tyr Pro Asn Thr
1 5
<210> 264
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) CDR-H1
<400> 264
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 265
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) CDR-H2
<400> 265
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 266
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) CDR-H3
<400> 266
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 267
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) CDR-L1
<400> 267
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 268
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) CDR-L2
<400> 268
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) CDR-L3
<400> 269
Leu Gln Leu Thr His Glu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 270
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) CDR-H1
<400> 270
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 271
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) CDR-H2
<400> 271
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 272
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) CDR-H3
<400> 272
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 273
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8)亲本轻链 DNA
<400> 273
gatgctgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca ggtctagtca gagccttgaa aacagtaatg gaaacaccta tttgaactgg 120
tacctccaga aaccaggcca gtctccacaa ctcctgatct acagggtttc caaacgattt 180
tctggggtcc tagacaggtt cagtggtagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tatttctgcc tacaacttac acatgtcccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
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<213> 人工序列
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tattattatg gtagcgccct ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
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gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
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acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
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aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
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gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Leu Gln Leu
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Ser Val Lys Met Ala Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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<211> 1353
<212> DNA
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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<223> CD19 (8B8-7H07) 轻链
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Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 285
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B03) 轻链 DNA
<220>
<221> 混杂特征
<222> (320)..(321)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 285
gatattgtta tgactcaaac tccactgtct ctgtccgtga ccccgggtca gccagcgagc 60
atttcttgca aatccagcca atctctggaa acctccaccg gcaacacgta cctgaactgg 120
tatctccaga aaccgggtca gagcccgcag ctgctgatct accgtgtatc taagcgcttc 180
tccggcgttc ctgatcgttt cagcggttct ggatccggca ccgactttac tctgaaaatc 240
agccgtgtgg aagctgaaga cgttggcgtc tactattgtc tgcagttgac ccacgttccg 300
tacaccttcg gtcaaggaan naaactggaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 286
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B03) 重链 DNA
<400> 286
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catctggtta caccttcact gactatatca cgcactgggt tcgtcaggcc 120
ccgggccagg gtctggagtg gatgggctac attaacccat acaacgacgg ttccaaatat 180
accgagaaat tccagggccg cgtcacgatg accagcgaca cttctatctc caccgcgtac 240
atggaactgt ctagactgcg ttctgacgac accgctgttt actattgtgc acgcggtacc 300
tactactacg gtccagatct gtttgattac tggggccaag gtaccacggt gaccgtaagc 360
tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 287
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B03) 轻链
<220>
<221> 混杂特征
<222> (107)..(107)
<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸
<400> 287
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Xaa Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 288
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B03)重链
<400> 288
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Thr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Asp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 289
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) 轻链 DNA
<400> 289
gatattgtta tgactcaaac tccactgtct ctgtccgtga ccccgggtca gccagcgagc 60
atttcttgca aatccagcca atctctggaa acctccaccg gcaacacgta cctgaactgg 120
tatctccaga aaccgggtca gagcccgcag ctgctgatct accgtgtatc taagcgcttc 180
tccggcgttc ctgatcgttt cagcggttct ggatccggca ccgactttac tctgaaaatc 240
agccgtgtgg aagctgaaga cgttggcgtc tactattgtc tgcagccagg tcattaccca 300
ggtaccttcg gtcaaggaac taaactggaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 290
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) 重链DNA
<400> 290
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catctggtta caccttcact gactatatca tgcactgggt tcgtcaggcc 120
ccgggccagg gtctggagtg gatgggctac attaacccat acaacgacgg ttccaaatat 180
accgagaaat tccagggccg cgtcacgatg accagcgaca cttctatctc caccgcgtac 240
atggaactgt ctagactgcg ttctgacgac accgctgttt actattgtgc acgcggtact 300
tactactacg gttccgccct ctttgattac tggggccaag gtaccacggt gaccgtaagc 360
tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 291
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) 轻链
<400> 291
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Pro
85 90 95
Gly His Tyr Pro Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 292
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) 重链
<400> 292
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 293
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08)轻链 DNA
<400> 293
gatattgtta tgactcaaac tccactgtct ctgtccgtga ccccgggtca gccagcgagc 60
atttcttgca aatccagcca atctctggaa acctccaccg gcaacacgta cctgaactgg 120
tatctccaga aaccgggtca gagcccgcag ctgctgatct accgtgtatc taagcgcttc 180
tccggcgttc ctgatcgttt cagcggttct ggatccggca ccgactttac tctgaaaatc 240
agccgtgtgg aagctgaaga cgttggcgtc tactattgtc tgcagctgac ccatgaacca 300
tacaccttcg gtcaaggaac taaactggaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 294
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) 重链DNA
<400> 294
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catctggtta caccttcact gactatatca tgcactgggt tcgtcaggcc 120
ccgggccagg gtctggagtg gatgggctac attaacccat acaacgacgg ttccaaatat 180
accgagaaat tccagggccg cgtcacgatg accagcgaca cttctatctc caccgcgtac 240
atggaactgt ctagactgcg ttctgacgac accgctgttt actattgtgc acgcggtacc 300
tactactacg gttctgaact gtttgattac tggggccaag gtaccacggt gaccgtaagc 360
tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 295
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) 轻链
<400> 295
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 296
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08)重链
<400> 296
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> CD19 (8B8-5H09) 轻链
<400> 303
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<223> CD19 (8B8-5H09) 重链
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tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
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tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
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<212> PRT
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165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 307
<211> 2514
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc穴 二聚体配体链 DNA
<400> 307
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catctggtta caccttcact gactatatca tgcactgggt tcgtcaggcc 120
ccgggccagg gtctggagtg gatgggctac attaacccat acaacgacgg ttccaaatat 180
accgagaaat tccagggccg cgtcacgatg accagcgaca cttctatctc caccgcgtac 240
atggaactgt ctagactgcg ttctgacgac accgctgttt actattgtgc acgcggtacc 300
tactactacg gtccacagct gtttgattac tggggccaag gtaccacggt gaccgtaagc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 1980
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 2040
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 2100
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 2160
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 2220
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 2280
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 2340
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 2400
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 2460
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaa 2514
<210> 308
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc节 单体配体 DNA
<400> 308
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
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acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
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tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
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atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aa 1932
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc穴 二聚体配体链
<400> 309
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1 5 10 15
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Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu
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Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
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Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
675 680 685
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
690 695 700
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
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Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
725 730 735
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
740 745 750
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
755 760 765
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc节 单体配体
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
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435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
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485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
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Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
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565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
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Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
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Pro Arg Ser Glu
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<211> 2478
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc穴 二聚体配体 (71-248)链 DNA
<400> 311
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
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tactactacg gtccacagct gtttgattac tggggccaag gtaccacggt gaccgtaagc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
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ctgctgcatc tgagcgccgg acagcgcctg ggagtgcatc tgcatactga agccagagcc 2400
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<210> 312
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc节 单体(71-248) 配体 DNA
<400> 312
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cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccctgatgat cctgccggac tgctggacct gcggcaggga 1440
atgtttgccc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg gctc 1914
<210> 313
<211> 826
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc穴 二聚体配体 (71-248)链
<400> 313
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly
625 630 635 640
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
645 650 655
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
660 665 670
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
675 680 685
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
690 695 700
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
705 710 715 720
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
725 730 735
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
740 745 750
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
755 760 765
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
770 775 780
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
785 790 795 800
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
805 810 815
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
820 825
<210> 314
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-2B11) Fc节 单体(71-248) 配体
<400> 314
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
625 630 635
<210> 315
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)重链(huIgG1 PGLALA) DNA
<400> 315
caggtccagc tggtgcagtc cggcgccgag gtcaagaaac ccggggcttc tgtgaaggtt 60
tcatgcaagg caagcggata caccttcacc gactatatca tgcattgggt caggcaggcc 120
cctggccaag gtctcgaatg gatgggctac attaacccat ataatgatgg ctccaaatac 180
accgagaagt ttcagggaag agtcactatg acatctgaca ccagtatcag cactgcttac 240
atggagctgt cccgccttcg gtctgatgac accgcagtgt attactgtgc caggggcaca 300
tattactacg gctcagctct gttcgactat tgggggcagg gaaccacagt aaccgtgagc 360
tccgcaagta ctaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agcagctggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtccccgggc aaa 1353
<210> 316
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19(8B8-018)重链(huIgG1 PGLALA)
<400> 316
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 317
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗mu CEA T84.66 VH
<400> 317
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1 5 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val
65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 318
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗mu CEA T84.66 VL
<400> 318
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser
35 40 45
Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Ile Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 319
<211> 392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链框架受体序列
<400> 319
taaggggctt cctagtccta aggctgagga agggatcctg gtttagttaa agaggatttt 60
attcacccct gtgtcctctc cacaggtgtc cagtcccagg tccagctggt gcaatctggg 120
gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc 180
ttcagcagct atactatcag ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg 240
ggaaggatca tccctatcct tggtacagca aactacgcac agaagttcca gggcagagtc 300
acgattaccg cggacaaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct 360
gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga ga 392
<210> 320
<211> 797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链框架受体序列
<400> 320
ctgcagctgg aagctcagct cccacccagc tgctttgcat gtccctccca gctgccctac 60
cttccagagc ccatatcaat gcctgtgtca gagccctggg gaggaactgc tcagttagga 120
cccagaggga accatggaag ccccagctca gcttctcttc ctcctgctac tctggctccc 180
aggtgagggg aacatgaggt ggttttgcac attagtgaaa actcttgcca cctctgctca 240
gcaagaaata taattaaaat tcaaagtata tcaacaattt tggctctact caaagacagt 300
tggtttgatc ttgattacat gagtgcattt ctgttttatt tccaatttca gataccaccg 360
gagaaattgt gttgacacag tctccagcca ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca 420
ccctctcctg cagggccagt cagagtgtta gcagctactt agcctggtac caacagaaac 480
ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatg atgcatccaa cagggccact ggcatcccag 540
ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc agcctagagc 600
ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc agcgtagcaa ctggcctccc acagtgattc 660
cacatgaaac aaaaacccca acaagaccat cagtgtttac tagattatta taccagctgc 720
ttcctttaca gacagctagt ggggtggcca ctcagtgtta gcatctcagc tctatttggc 780
cattttggag ttcaagt 797
<210> 321
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) CDR-H1
<400> 321
Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 322
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) CDR-H2
<400> 322
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 323
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) CDR-H3
<400> 323
Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr
1 5 10
<210> 324
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) CDR-L1
<400> 324
Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His
1 5 10 15
<210> 325
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) CDR-L2
<400> 325
Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) CDR-L3
<400> 326
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 327
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本 CEA结合物VH
<400> 327
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 328
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本 CEA结合物VL
<400> 328
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 329
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) VH
<400> 329
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
115 120 125
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn
165 170 175
Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr
180 185 190
Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
195 200 205
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val
210 215 220
Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 330
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) VL
<400> 330
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 331
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) Fc穴链 DNA
<400> 331
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 332
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA)轻链 DNA
<400> 332
gagatcgtgc tgacccagag ccctgccacc ctgtcactgt ctccaggcga gagagccacc 60
ctgagctgta gagccggcga gagcgtggac atcttcggcg tgggatttct gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccaggc ccccagactg ctgatctaca gagccagcaa ccgggccaca 180
ggcatccccg ccagattttc tggctctggc agcggcaccg acttcaccct gacaatcagc 240
agcctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agaccaacga ggacccctac 300
acctttggcc agggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 333
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) Fc穴链
<400> 333
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 334
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) 轻链
<400> 334
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 335
<211> 2514
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) Fc穴 二聚体4-1BBL(71-254)链 DNA
<400> 335
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 1980
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 2040
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 2100
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 2160
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 2220
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 2280
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 2340
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 2400
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 2460
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaa 2514
<210> 336
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) Fc节 单体41-BBL (71-254) DNA
<400> 336
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aa 1932
<210> 337
<211> 838
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) Fc穴 二聚体41-BBL (71-254)链
<400> 337
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu
645 650 655
Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
660 665 670
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
675 680 685
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
690 695 700
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
705 710 715 720
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
725 730 735
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
740 745 750
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
755 760 765
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
770 775 780
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
785 790 795 800
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805 810 815
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Pro Ser Pro Arg Ser Glu
835
<210> 338
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66-LCHA) Fc节 单体4-1BBL (71-254)链
<400> 338
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu
<210> 339
<211> 2478
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) Fc穴 二聚体4-1BBL (71-248)链 DNA
<400> 339
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccctgatgat cctgccggac tgctggacct gcggcaggga 1440
atgtttgccc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagcagg cctgggaggc 1920
ggcggatctg gcggcggagg atctagagaa ggacccgagc tgtcccccga cgatcccgct 1980
gggctgctgg atctgagaca gggcatgttc gctcagctgg tggctcagaa tgtgctgctg 2040
attgacggac ctctgagctg gtactccgac ccagggctgg caggggtgtc cctgactggg 2100
ggactgtcct acaaagaaga tacaaaagaa ctggtggtgg ctaaagctgg ggtgtactat 2160
gtgttttttc agctggaact gaggcgggtg gtggctgggg agggctcagg atctgtgtcc 2220
ctggctctgc atctgcagcc actgcgctct gcagcagggg ctgcagcact ggccctgact 2280
gtggacctgc ccccagcttc ttccgaggcc agaaacagcg ccttcgggtt ccaaggacgc 2340
ctgctgcatc tgagcgccgg acagcgcctg ggagtgcatc tgcatactga agccagagcc 2400
cggcatgctt ggcagctgac tcagggggca actgtgctgg gactgtttcg cgtgacacct 2460
gagatcccag ccgggctc 2478
<210> 340
<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) Fc节 单体(71-248) 4-1BBL链 DNA
<400> 340
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcagcag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt gcgccaggcc 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
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acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
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ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccctgatgat cctgccggac tgctggacct gcggcaggga 1440
atgtttgccc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agatctgctg ctggcgccgc tgctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttcctgccgg gctc 1914
<210> 341
<211> 826
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) Fc穴 二聚体4-1BBL (71-248)链
<400> 341
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly
625 630 635 640
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
645 650 655
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
660 665 670
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
675 680 685
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
690 695 700
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
705 710 715 720
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
725 730 735
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
740 745 750
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
755 760 765
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
770 775 780
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
785 790 795 800
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
805 810 815
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
820 825
<210> 342
<211> 638
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66-LCHA) Fc节 单体(71-248) 4-1BBL链
<400> 342
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
625 630 635
<210> 343
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66) Fc穴链 DNA
<400> 343
gaggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgaa ctggtggaac ctggcgcctc tgtgaagctg 60
agctgtaccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt caagcagcgg 120
cctgagcagg gcctggaatg gatcggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcaa ggccaccatc accgccgaca ccagcagcaa cacagcctac 240
ctgcagctga ccagcctgac ctccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacaagcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 344
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CEA(T84.66)轻链 DNA
<400> 344
gacatcgtgc tgacccagag ccctgcctct ctggccgtgt ctctgggaca gagggccacc 60
atgtcttgca gagccggcga gagcgtggac atcttcggcg tgggatttct gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctaca gagccagcaa cctggaaagc 180
ggcatccccg tgcggtttag cggcaccggc agcagaaccg acttcaccct gatcatcgac 240
cccgtggaag ccgacgacgt ggccacctac tactgccagc agaccaacga ggacccctac 300
acctttggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 345
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66) Fc穴链
<400> 345
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 346
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA (T84.66) 轻链
<400> 346
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 347
<211> 2514
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66) Fc穴 二聚体4-1BBL (71-254) 链 DNA
<400> 347
gaggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgaa ctggtggaac ctggcgcctc tgtgaagctg 60
agctgtaccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt caagcagcgg 120
cctgagcagg gcctggaatg gatcggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcaa ggccaccatc accgccgaca ccagcagcaa cacagcctac 240
ctgcagctga ccagcctgac ctccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacaagcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 1980
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 2040
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 2100
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 2160
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 2220
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 2280
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 2340
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 2400
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 2460
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaa 2514
<210> 348
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66) Fc节 单体4-1BBL (72-254)链 DNA
<400> 348
gaggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgaa ctggtggaac ctggcgcctc tgtgaagctg 60
agctgtaccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tgcactgggt caagcagcgg 120
cctgagcagg gcctggaatg gatcggcaga atcgaccccg ccaacggcaa cagcaaatac 180
gtgcccaagt tccagggcaa ggccaccatc accgccgaca ccagcagcaa cacagcctac 240
ctgcagctga ccagcctgac ctccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccccttcggc 300
tactacgtgt ccgactacgc catggcctat tggggccagg gcacaagcgt gaccgtgtcc 360
tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgtctggtca agggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tactccaaac tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc ggaggcggcg gaagcggagg aggaggatcc 1380
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 1680
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aa 1932
<210> 349
<211> 838
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66) Fc穴 二聚体4-1BBL(71-254)链
<400> 349
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu
645 650 655
Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
660 665 670
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
675 680 685
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
690 695 700
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
705 710 715 720
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
725 730 735
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
740 745 750
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
755 760 765
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
770 775 780
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
785 790 795 800
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
805 810 815
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
820 825 830
Pro Ser Pro Arg Ser Glu
835
<210> 350
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(T84.66) Fc节 单体4-1BBL (71-254)链
<400> 350
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu
<210> 351
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hu NA3B3A2-avi His DNA
<400> 351
cagctgacca ccgagtccat gcccttcaac gtggccgagg gcaaagaggt gctgctgctg 60
gtccacaacc tgccccagca gctgttcggc tacagctggt acaagggcga gcgggtggac 120
ggcaaccggc agatcgtggg ctacgccatc ggcacccagc aggccacacc cggccctgcc 180
aatagcggca gagagacaat ctaccccaac gccagcctgc tgatccagaa cgtgacccag 240
aacgacaccg gcttctacac actccaagtc atcaagagcg acctggtcaa cgaggaagcc 300
accggccagt tccacgtgta ccccgagctg cccaagccca gcatcagcag caacaacagc 360
aagcccgtgg aagataagga cgccgtggcc tttacctgcg agcccgaggc ccagaacacc 420
acctacctgt ggtgggtcaa cggccagagc ctgcccgtgt cccccagact ccagctgagc 480
aacggcaaca gaaccctgac cctgttcaac gtgacccgga atgacgccag agcctacgtg 540
tgcggcatcc agaacagcgt gtccgccaac cgcagcgacc ccgtgaccct ggatgtgctg 600
tacggccccg acacccccat catcagcccc cctgacagca gctacctgag cggcgccaac 660
ctgaacctga gctgccacag cgccagcaac cccagccctc agtacagctg gcggatcaac 720
ggcatccccc agcagcacac ccaggtgctg tttatcgcca agatcacccc caacaacaac 780
ggcacctacg cctgcttcgt gtccaacctg gccaccggcc ggaacaacag catcgtgaag 840
tccatcaccg tgtccgcctc cctgagcccc gtggtggcca agcctcagat caaggccagc 900
aagaccaccg tgaccggcga caaggacagc gtgaacctga cctgctccac caacgatacc 960
ggcatcagca tccggtggtt cttcaagaat cagtccctgc ccagcagcga gcggatgaag 1020
ctgagccagg gcaacatcac cctgtccatc aaccccgtga aaagagagga cgccggcacc 1080
tattggtgcg aggtgttcaa ccccatcagc aagaaccaga gcgaccccat catgctgaac 1140
gtgaactaca acgccctgcc ccaagaaaac ctgatcaatg ttgatctgga agtgctgttc 1200
cagggcccag gcagcggcct gaacgacatc ttcgaagccc agaaaatcga gtggcacgag 1260
gccagagccc accaccacca tcaccac 1287
<210> 352
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu NA3B3A2-avi-His
<400> 352
Gln Leu Thr Thr Glu Ser Met Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly Lys Glu
1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Gln Leu Phe Gly Tyr Ser
20 25 30
Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Val Gly Tyr
35 40 45
Ala Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asn Ser Gly Arg
50 55 60
Glu Thr Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr Gln
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp Leu Val
85 90 95
Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe His Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys
100 105 110
Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala
115 120 125
Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln Asn Thr Thr Tyr Leu Trp
130 135 140
Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser
145 150 155 160
Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala
165 170 175
Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser
180 185 190
Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly Pro Asp Thr Pro Ile Ile
195 200 205
Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser
210 215 220
Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn
225 230 235 240
Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr
245 250 255
Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr
260 265 270
Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Leu
275 280 285
Ser Pro Val Val Ala Lys Pro Gln Ile Lys Ala Ser Lys Thr Thr Val
290 295 300
Thr Gly Asp Lys Asp Ser Val Asn Leu Thr Cys Ser Thr Asn Asp Thr
305 310 315 320
Gly Ile Ser Ile Arg Trp Phe Phe Lys Asn Gln Ser Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Glu Arg Met Lys Leu Ser Gln Gly Asn Ile Thr Leu Ser Ile Asn Pro
340 345 350
Val Lys Arg Glu Asp Ala Gly Thr Tyr Trp Cys Glu Val Phe Asn Pro
355 360 365
Ile Ser Lys Asn Gln Ser Asp Pro Ile Met Leu Asn Val Asn Tyr Asn
370 375 380
Ala Leu Pro Gln Glu Asn Leu Ile Asn Val Asp Leu Glu Val Leu Phe
385 390 395 400
Gln Gly Pro Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile
405 410 415
Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His
420 425
<210> 353
<211> 1860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu OX40L (51-183) - CL* Fc节链 DNA
<400> 353
caggtgtccc acagataccc cagaatccag agcatcaagg tgcagttcac cgagtacaag 60
aaagagaagg gcttcatcct gaccagccag aaagaggacg agatcatgaa ggtgcaggac 120
aacagcgtga tcatcaactg cgacggcttc tacctgatca gcctgaaggg ctacttcagc 180
caggaagtgg acatcagcct gcactaccag aaggacgagg aacccctgtt ccagctgaag 240
aaagtgcgga gcgtgaacag cctgatggtg gccagcctga cctacaagga caaggtgtac 300
ctgaacgtga ccaccgacaa caccagcctg gacgacttcc acgtgaacgg cggcgagctg 360
atcctgattc accagaaccc cggcgagttc tgcgtgctgg gaggcggagg atctggcgga 420
ggcggatctc aggtgtcaca ccgctacccc cggattcagt ccattaaggt gcagtttaca 480
gagtataaga aagaaaaagg ctttattctg acttcccaga aagaagatga gattatgaag 540
gtgcaggata attctgtgat catcaattgt gacggcttct acctgatcag cctgaagggc 600
tacttcagcc aggaagtgga catcagcctg cactaccaga aggacgagga acccctgttc 660
cagctgaaga aagtgcggag cgtgaacagc ctgatggtgg ccagcctgac ctacaaggac 720
aaggtgtacc tgaacgtgac caccgacaac accagcctgg acgacttcca cgtgaacggc 780
ggcgagctga tcctgatcca ccagaaccct ggcgagttct gcgtgctggg aggcggaggc 840
tccggagggg gaggatctcg tacggtggct gcaccatctg tctttatctt cccacccagc 900
gaccggaagc tgaagtctgg cacagccagc gtcgtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 960
cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aatgccctgc agagcggcaa cagccaggaa 1020
agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 1080
agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 1140
tctagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgcg acaagaccca cacctgtcct 1200
ccatgccctg cccctgaagc tgctggcggc cctagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc 1260
aaggacaccc tgatgatcag ccggacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc 1320
cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaatgcc 1380
aagaccaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1440
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1500
ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1560
gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc 1620
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1680
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1740
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1800
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1860
<210> 354
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu OX40L (51-183) - CH1* DNA
<400> 354
caggtgtccc acagataccc cagaatccag agcatcaagg tgcagttcac cgagtacaag 60
aaagagaagg gcttcatcct gaccagccag aaagaggacg agatcatgaa ggtgcaggac 120
aacagcgtga tcatcaactg cgacggcttc tacctgatca gcctgaaggg ctacttcagc 180
caggaagtgg acatcagcct gcactaccag aaggacgagg aacccctgtt ccagctgaag 240
aaagtgcgga gcgtgaacag cctgatggtg gccagcctga cctacaagga caaggtgtac 300
ctgaacgtga ccaccgacaa caccagcctg gacgacttcc acgtgaacgg cggcgagctg 360
atcctgattc accagaaccc cggcgagttc tgcgtgctgg gaggcggagg ttccggaggc 420
ggaggatctg ctagcacaaa gggccccagc gtgttccctc tggcccctag cagcaagagc 480
acatctggcg gaacagccgc cctgggctgc ctggtggaag attacttccc cgagcccgtg 540
accgtgtcct ggaattctgg cgccctgaca agcggcgtgc acacctttcc agccgtgctg 600
cagagcagcg gcctgtactc tctgagcagc gtcgtgacag tgcccagcag ctctctgggc 660
acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacgagaag 720
gtggaaccca agtcctgc 738
<210> 355
<211> 620
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu OX40L (51-183) - CL* Fc节链
<400> 355
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asp Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asp
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr
145 150 155 160
Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp
165 170 175
Glu Ile Met Lys Val Gln Asp Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly
180 185 190
Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asp Ile
195 200 205
Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys
210 215 220
Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp
225 230 235 240
Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe
245 250 255
His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu
260 265 270
Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr
275 280 285
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu
290 295 300
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
305 310 315 320
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
325 330 335
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
340 345 350
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
355 360 365
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
370 375 380
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
385 390 395 400
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
405 410 415
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
420 425 430
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
435 440 445
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
450 455 460
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
465 470 475 480
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
485 490 495
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
500 505 510
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
515 520 525
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
530 535 540
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
545 550 555 560
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
565 570 575
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
580 585 590
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
595 600 605
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
610 615 620
<210> 356
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu OX40L (51-183) - CH1*
<400> 356
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asp Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asp
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
180 185 190
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
195 200 205
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
210 215 220
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys
225 230 235 240
Val Glu Pro Lys Ser Cys
245
<210> 357
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) VH
<400> 357
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 358
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) VL
<400> 358
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 359
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-7H07) VH
<400> 359
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 360
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-7H07) VL
<400> 360
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala
85 90 95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 361
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B03) VH
<400> 361
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Thr His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Asp Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 362
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B03) VL
<220>
<221> 混杂特征
<222> (107)..(107)
<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸
<400> 362
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Xaa Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 363
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) VH
<400> 363
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 364
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5A07) VL
<400> 364
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Pro
85 90 95
Gly His Tyr Pro Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 365
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) VH
<400> 365
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Glu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 366
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5D08) VL
<400> 366
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 367
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) VH
<400> 367
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 368
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5B08) VL
<400> 368
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Asp Ser Tyr Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 369
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5H09) VH
<400> 369
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 370
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-5H09) VL
<400> 370
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Ser Ser
20 25 30
Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Ile Asp Tyr Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 371
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体huOX40L (51-183)
<400> 371
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr
145 150 155 160
Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp
165 170 175
Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly
180 185 190
Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile
195 200 205
Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys
210 215 220
Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp
225 230 235 240
Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe
245 250 255
His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu
260 265 270
Phe Cys Val Leu
275
<210> 372
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体huOX40L (52-183)
<400> 372
Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr
1 5 10 15
Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp
20 25 30
Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly
35 40 45
Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile
50 55 60
Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys
65 70 75 80
Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp
85 90 95
Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe
100 105 110
His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu
115 120 125
Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Ser
130 135 140
His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr
145 150 155 160
Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile
165 170 175
Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr
180 185 190
Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu
195 200 205
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg
210 215 220
Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val
245 250 255
Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys
260 265 270
Val Leu
<210> 373
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu 4-1BBL (85-248)
<400> 373
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu
<210> 374
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu 4-1BBL (80-248)
<400> 374
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
165
<210> 375
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu 4-1BBL (52-248)
<400> 375
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu
195

Claims (10)

1.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽，
其中该抗原结合分子的特征在于，该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的两个胞外域或其片段，并且该第二多肽仅包含所述TNF配体家族成员的一个胞外域或其片段。
2.权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
3.权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原选自由成纤维细胞激活蛋白(FAP)、黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20和CD33组成的组。
4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
5.一种载体，特别是表达载体，其包含权利要求4的分离的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求4的分离的多核苷酸或权利要求5的载体。
7.一种生成权利要求1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：
(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养权利要求6的宿主细胞，并
(ii)回收该抗原结合分子。
8.一种药物组合物，其包含权利要求1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
9.权利要求1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子制造用于治疗癌症的药物的用途。
10.一种在个体中治疗疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的药学上可接受形式的包含权利要求1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。
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