CN112458151B

CN112458151B - 加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用

Info

Publication number: CN112458151B
Application number: CN202011527793.4A
Authority: CN
Inventors: 邢超; 王军
Original assignee: Minjiang University
Current assignee: Minjiang University
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN112458151A

Abstract

本发明公开了加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用。该核酸传感器由探针HP和DTMB组合而成；本发明整合催化杂交组装（CHA）的无酶信号放大技术与DNA四面体分子探针于一体，制备了加速的DNA四面体分子探针，利用空间限域效应，有效的实现了细胞内miRNA的快速成像检测。局部CHA可以有效实现信号放大，同时加快检测速度和检测灵敏度。DNA四面体可以避免细胞内核酸酶的降解作用，降低假阳性信号。本分子探针具有反应迅速，灵敏度高，抗干扰能力强等优点，能够弥补现有miRNA检测方法的不足，实现miRNA的快速准确的检测。

Description

加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用

技术领域

本发明涉及加速的DNA四面体分子探针在检测、成像领域中的应用，尤其涉及一种加速的DNA四面体分子探针在活细胞内miRNA检测、成像中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

miRNA作为一种重要的肿瘤标志物，它在细胞中的分布和表达水平与癌症的发生发展有着重要关联。因此，实现细胞内miRNA的原位成像和检测对于肿瘤的早期诊断、预后监测以及相关药物研发具有重要意义。传统的miRNA检测方法包括Northern印迹杂交法，微阵列杂交和实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）等。尽管这些方法的准确性好，但在实际应用中仍存在一些不足。例如Northern印迹和微阵列杂交技术的特异性和灵敏度不高，qRT-PCR方法操作繁琐、引物设计严格且必须依赖精良仪器等，而且目前大多数的检测技术只能用于体外检测，对活细胞内miRNA的原位成像检测仍然存在困难。因此，发展用于活细胞内microRNA原位成像的新型探针具有重要的意义。

本发明将“催化杂交组装”(CHA)无酶信号放大技术与DNA四面体分子探针结合起来，制备了加速的DNA四面体分子探针。CHA可以实现信号放大，提高了待测miRNA的检测灵敏度。DNA四面体可以避免细胞内核酸酶的降解作用，降低假阳性信号。同时，DNA四面体对CHA发卡对的空间限域作用，可以有效的提高CHA反应的速率，缩短检测时间。

发明内容

本发明的目的是提出加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用。

当待测miRNA存在时，引发DNA四面体探针上的原位CHA放大过程，HP与MB杂交生成双链，FAM与Dabcyl的相对距离变大，荧光恢复，从而以miR-21分子为模型实现了活细胞内miRNA的原位成像。通过相对荧光变化值F与miRNA浓度成正比的关系，实现了对不同浓度的miR-21的定量。

所述加速的DNA四面体分子探针包含：一个DNA发卡结构（HP）和一个修饰有荧光染料的分子探针MB嵌入的DNA四面体（DNA四面体分子探针DTMB）；所述的DNA四面体分子探针DTMB由四条DNA单链S1、S2、S3和S4自组装而成；所述分子探针MB位于单链S1中，组装后位于DTMB的一条棱S1的延伸部分。荧光染料FAM 和Dabcyl分别修饰在MB的茎部两侧对应位置，所述DNA发卡结构HP通过碱基互补连接在靠近MB的顶点。所述HP与MB构成催化杂交组装（CHA）发卡对，在miRNA存在时，HP被miRNA打开后与MB杂交并释放出miRNA。

所述DNA发卡结构HP序列如SEQ ID NO.5所示；所述S1、S2、S3和S4序列如SEQ IDNO.1-4所示。

所述的加速的DNA四面体分子探针的合成步骤如下：

（1）将发卡结构HP预先溶于1xTAE/Mg²⁺缓冲液，其HP终浓度为2μM，95℃加热5分钟后，迅速放入冰浴中，维持半小时，使其形成稳定的发卡结构HP；

（2）将探针S1、S2、S3和S4等比例溶于1xTAE/Mg²⁺缓冲液中，使得各探针浓度为2μM，95℃加热8分钟，迅速放入冰浴中，维持半小时，使其完全杂交形成DNA四面体分子探针（DTMB）；

（3）等体积比例混合HP和DTMB于1xTAE/Mg²⁺缓冲液中，在37℃下反应3小时，组装形成加速的DNA四面体分子探针（accelerated-DTMB）。

上述方法中，所述的1xTAE/Mg²⁺缓冲液成分为20 mM Tris、2 mM EDTA、12.5 mMMgCl₂；pH 7.4。

所述的加速的DNA四面体分子探针在制备miRNA检测及活细胞成像试剂中的应用。

所述的加速的DNA四面体分子探针对miRNA的检测及成像步骤如下：

（1）基于加速的DNA四面体分子探针实现miRNA的检测：在1xTAE/Mg²⁺缓冲液中，将accelerated-DTMB探针（100nM）与miRNA (终浓度0，0.1，1，2，5，8，10，20，50，100 nM)混合，在室温下孵育1h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度；

（2）进一步地，基于加速的DNA四面体分子探针实现活细胞内miRNA的成像分析：将100μL accelerated-DTMB探针（500nM）混匀于900μL opti-MEM中，5min后将混合液加入细胞中，37 ℃培养2h后，用PBS进行洗涤，然后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像，通过荧光来对细胞内miRNA成像。同时，通过荧光信号强弱判断不同细胞内miRNA含量的高低。

本发明的技术原理为：

本发明的工作原理如图1所示。所述的加速的DNA四面体分子探针包含DNA发卡结构（HP）和荧光染料修饰的MB嵌入的DNA四面体分子探针（DTMB）两个组分。探针进入细胞后，在没有目标miRNA存在时，accelerated-DTMB上的HP和MB不会发生杂交。在目标miRNA存在时，待测miRNA与HP杂交，打开HP的发卡结构，暴露出能与MB杂交的结构域，进而与MB发生杂交形成HP-MB复合结构，同时目标miRNA被置换下来。HP与MB的杂交导致MB两端的FAM和Dabcyl远离，FAM荧光恢复，产生可以检测的荧光信号，用于指示细胞内miRNA的分布。同时，释放出的miRNA可以触发其他的accelerated-DTMB发生原位CHA循环以实现信号放大。此时，探针上FAM的荧光强度改变值与miRNA的浓度呈正相关，根据荧光团的荧光强度改变值判断miRNA的浓度。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

（1）单个目标miRNA可以循环催化产生多个HP/MB复合物，从而对荧光信号进行放大，可以实现细胞内低浓度目标miRNA的成像检测。

（2）DNA四面体分子探针上的HP和MB由于相对距离较近，可形成“空间限制效应”加速CHA反应速率，缩短检测时间，实现快速检测。

（3）由于DNA四面体在细胞内具有稳定性，可以避免细胞内核酸酶的降解作用影响，从而避免了检测的假阳性信号。

附图说明

图1为加速的DNA四面体分子探针用于体内miRNA检测的原理图。

图2 accelerated-DTMB的合成PAGE电泳表征图。其中Lane 1, S1; Lane 2, S1 +S2; Lane 3, S1 + S2 + S3; Lane 4, S1 + S2 + S3 + S4; Lane 5, S1 + S2 + S3 +S4 + HP。

图3为加速的DNA四面体分子探针与非加速的DNA四面体探针用于检测不同浓度的目标miRNA分子的荧光图谱及相应的荧光强度与浓度的标准曲线。其中，A为非加速的DNA四面体探针用于检测不同浓度的目标miRNA分子的荧光图谱，B为相应的荧光强度与浓度的标准曲线；C为加速的DNA四面体探针用于检测不同浓度的目标miRNA分子的荧光图谱；D为相应的荧光强度与浓度的标准曲线。

图4 accelerated-DTMB 对不同检测序列的特异性识别能力。

图5非加速的DNA四面体探针和加速的DNA四面体探针的稳定性对比。(A)accelerated-DTMB在0.5 U/ml的DNase I的稳定性；(B) MBs在0.5 U/ml的DNase I的稳定性。

图6非加速的DNA四面体探针和加速的DNA四面体探针对细胞内miRNA的成像能力对比。

图7为加速的DNA四面体分子探针与非加速的DNA四面体探针分析不同种类活细胞内的miR-21的情况对比。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明，但本发明不受下述实施例的限制。

本发明所用到的DNA序列链如下：

表1实验所用探针完整序列

实施例1

所述的加速的DNA四面体分子探针的合成步骤如下：

（1）将发卡结构HP预先溶于1xTAE/Mg²⁺缓冲液，终浓度为2μM，95℃加热5分钟后，迅速放入冰浴中，维持半小时，使其形成稳定的发卡结构HP；

使用PAGE凝胶电泳进行表征分析，如图2所示，随着DNA序列的增多，电泳条带迁移逐渐变慢，证明合成的物质分子量逐渐变大，由此可以证明accelerated-DTMB的成功合成。

实施例2 accelerated-DTMB用于体外miRNA检测

在1xTAE/Mg²⁺缓冲液中，将accelerated-DTMB探针(终浓度100nM)与不同浓度的目标miRNA (终浓度0，0.1，1，2，5，8，10，20，50，100 nM)混合，在室温下孵育1h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度。

由图3C可见，随着目标miRNA浓度的增加，体系的荧光强度逐渐升高，该荧光强度的改变值与目标miRNA浓度在0.1-8 nM范围内呈良好的线性关系（图3D），检出限为2 pM，实现了对目标miRNA的高灵敏性检测。为了论证accelerated-DTMB优于传统CHA的检测能力，此处将未结合的HP-DTMB探针（游离的HP与DTMB的混合体）同时用于检测不同浓度的靶标miRNA分子(图3A和B)，对比发现，accelerated-DTMB探针的灵敏度更高，检测效果更好。

实施例3 考察accelerated-DTMB探针对不同中miRNA的特异性识别

在1xTAE/Mg²⁺缓冲液中，将accelerated-DTMB探针(终浓度100nM)分别与终浓度10nM 的miR-429，miR-200b，let-7d以及miRNA21等miRNA分别混合，在室温下孵育1h，利用荧光光谱仪测量各体系的荧光强度。

由图4可见， miRNA 21实验组中荧光强度的荧光强度明显高于其他组，证明accelerated-DTMB可以对目标miRNA 21进行特异性识别。

实施例4 考察accelerated-DTMB探针的稳定性

将accelerated-DTMB探针（浓度3 μM）和单纯的发卡探针HP（浓度3 μM）分别与0.5U/ml的DNase I酶反应不同时间（0-60分钟），用琼脂糖凝胶来验证accelerated-DTMB探针的稳定性。结果如图5所示，accelerated-DTMB探针（A）在0.5 U/ml的DNase I酶中反应60分钟条带未发生明显变化，而单纯的发卡探针HP（B）在40分钟时已经被降解，表明accelerated-DTMB探针在复杂的生物环境中具有相当好的稳定性。

实施例5 基于accelerated-DTMB探针的miRNA-21的细胞成像分析

以上实验结果的基础上，我们应用accelerated-DTMB探针于活细胞成像。具体步骤为：

将100μL accelerated-DTMB探针（浓度500nM）混匀于900μL opti-MEM中，5min后将混合液加入细胞中，37 ℃培养2h后，用PBS进行洗涤，然后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像，通过荧光来对细胞内miRNA成像。

图6共聚焦显微镜图像显示，当HeLa细胞与accelerated-DTMB孵育后，在细胞中能同时观察到明显的绿色通道荧光，绿色荧光通道代表FAM荧光信号。这说明accelerated-DTMB探针上的HP与MB原位杂交生成双链，FAM与Dabcyl的相对距离变大，荧光恢复，从而以miRNA-21分子为模型实现了hella活细胞内miRNA的原位成像。为了进一步证明accelerated-DTMB探针对不同细胞内miRNA-21的成像能力，我们选择了L02，Hella，MCF-7三种细胞来进行试验。已有的研究表明L02细胞内的miRNA-21低表达，而Hella，MCF-7细胞中的miRNA-21高表达。图7共聚焦显微镜图像显示，三种细胞与accelerated-DTMB探针孵育后，L02细胞没有明显的绿色荧光，而Hella，MCF-7细胞能观察到明显的绿色荧光。表明accelerated-DTMB探针可以对不同细胞中miRNA-21进行成像。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 闽江学院

<120> 加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用

<130> 9

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgacgtagc tgtgtttttt ttttttagtc tgaattcctg gagatacatg gcatttgcta 60

cacgccctat tagaaggtcc gatttaagct agagcatcca atgtagctta tcagactgca 120

ttggatgctc cgaagagccg tagca 145

<210> 2

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcagttgacg cgacagtcgt tcaagccttt cggaccttct aatagggcgt gtagcattat 60

gcgagggtcc aatactctgt tccgg 85

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcttgaacg actgtcgcgt caactgctta cgacactacg taacggtcga ggactgttgc 60

tacggctctt cg 72

<210> 4

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgccatgtat ctccaggaat tcagactttc agtcctcgac cgttacgtag tgtcgtttcc 60

ggaacagagt attggaccct cgcat 85

<210> 5

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacagctacg tcggtttcaa catcagtctg ataagctaca ttggatgctc tagcttatca 60

gactg 65

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

uaauacuguc ugguaaaacc gu 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

uaauacugcc ugguaaugau ga 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

agagguagua gguugcauag uu 22

Claims

1.加速的DNA四面体分子探针，其特征在于，所述加速的DNA四面体分子探针accelerated-DTMB包含：一个DNA发卡结构HP和一个荧光染料修饰的分子探针MB嵌入的DNA四面体，即DNA四面体分子探针DTMB；所述DNA四面体分子探针DTMB由四条DNA单链S1、S2、S3和S4自组装而成；所述DNA发卡结构HP序列如SEQ ID NO.5所示；所述S1、S2、S3和S4序列如SEQ ID NO.1-4所示；荧光染料FAM和Dabcyl分别修饰在分子探针MB的颈部两侧对应位置，所述分子探针MB位于DTMB的一条棱S1的延伸部分，DNA发卡结构HP通过碱基互补连接在靠近MB的顶点；

所述的加速的DNA四面体分子探针的制备方法的制备步骤如下：

（1）将DNA发卡结构HP预先溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲液，其HP终浓度为2μM，95℃加热5分钟后，迅速放入冰浴中，维持半小时，使其形成稳定的发卡结构HP；

（2）将探针S1、S2、S3和S4等比例溶于1×TAE/Mg²⁺缓冲液中，使得各探针浓度为2μM，95℃加热8分钟，迅速放入冰浴中，维持半小时，使其完全杂交形成DNA四面体分子探针DTMB；

（3）等体积比例混合HP和DTMB于1×TAE/Mg²⁺缓冲液中，在37℃下反应3小时，组装形成加速的DNA四面体分子探针。

2.一种如权利要求1所述的加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用。