CN111321171A - 一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法 - Google Patents
一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种应用CRISPR/Cas9系统基因打靶的方法，通过选择具有DNA单链切割能力的Cas9的突变体，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA，Cas9的突变体识别打靶位点附近的保守的间隔相邻基序，产生DNA单链切口，而不产生DNA双链断裂，诱导单链切口同源重组修复。本发明还提供了利用所述方法介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法。本发明降低了基因打靶过程中HMEJ修复带来的插入缺失突变，获得高效打靶阳性克隆。本发明可作为平台技术广泛用于基因打靶动物模型的制备。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法。
研究背景
动物模型是研究人类医药和健康必不可缺的工具，它们在生命活动中的生理和病理过程，与人类都有很多相似之处，可以作为人类研究的参照物。通过不同的基因编辑方法，可以获得基因修饰的动物模型，从而研究相关疾病的发生与治疗等。
基因编辑是通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或者是插入外源的DNA序列，使之产生可遗传的改变。与射线或化学诱变剂导致的DNA随机突变不同的是，基因编辑技术是定向改变基因的组成和结构，具有高效、可控和定向操作的特点。因此，基因编辑技术被麻省理工科技评论评为2014年十大突破性科学技术，其中CRISPR获得了2015年度生命科学突破奖。
在细胞内DNA分子单链断裂或缺失后容易被细胞内的各种修复机制所修复而不产生任何改变，但DNA双链断裂的结果则有很大的不同。细胞内DNA双链断裂的修复主要有两种方式，即同源重组修复(Homology directed repair,HDR)和非同源末端链接修复(Non-Homologous End Join,NHEJ)。当DNA发生双链断裂后，如果细胞内存在与裂口两端同源的序列，则进行同源重组修复，外源DNA片段可借此插入断裂序列中对原来的基因进行敲除或将外源基因插入基因组DNA而形成所谓的基因敲入；若细胞内无同源序列存在，双链断裂的DNA分子则通过NHEJ连接，由于无模板可以利用，这种“硬”连接容易导致碱基的缺失、增加或改变而引起突变。DNA双链断裂对基因组而言是严重的伤害，但这种变化正是研究基因功能所需要的。
传统ES细胞(胚胎干细胞)打靶，是借助同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。尽管同源重组介导的基因打靶可高度精确的改变同源序列，但目的基因的重组效率却非常低下，给大规模应用基因打靶实验带来了巨大的挑战。
近年来，对于CRISPR/Cas9技术的研究与应用，为优化基因打靶技术提供了新的思路。 CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点切断双链DNA。在基因组编辑过程中，tracrRNA和crRNA可以融合成为1条单导向核苷酸(single guide RNA，sg RNA)表达同样可以起到靶向剪切的作用，细胞通过对断裂的双链进行修复，从而实现基因组的精确编辑。但双链的断裂会在相关位点引入不容忽视的脱靶突变，给临床应用带来风险。Cas9是通过两个核酸酶结构域RuvC和HNH来产生双链断裂，将这两个关键结构与中的一个残基转换成丙氨酸(D10A或H840A)，就形成了产生单链切口的核酸酶Cas9nickase(Cas9n)。Cas9n需要通过一对sgRNA引导来实现靶向双链切割，降低脱靶效应。
然而在利用Cas9蛋白介导ES打靶技术进行基因改造时，不论是WT Cas9还是Cas9n蛋白，由于引入双链断裂，会造成基因组的HMEJ修复，导致鉴定基因型时出现非目的条带，干扰阳性条带判断，不利于挑选阳性克隆用于注射遗传。
此外，同源重组是否能够高效发生受多因素影响，Thomas等(Thomas KR,CapecchiMR. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stemcells.Cell,1987,51(3): 503-12)发现当同源序列的长度由4kb增加到9kb时，其同源重组效率可以增加10倍。但同源序列过长会增加PCR方法鉴定的难度，权衡打靶效率和PCR鉴定难度，目前过长的同源序列，尚无很好的方法解决PCR鉴定的难题。
发明内容
本发明针对现有技术不足，利用Cas9突变体产生DNA单链断裂的特性，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条gRNA产生DNA单链切口，而不产生DNA双链断裂，诱导单链切口同源重组修复，降低HMEJ修复带来的插入缺失突变。进一步的，本发明将CRISPR/Cas9基因编辑技术与传统ES打靶结合，先用ES细胞(胚胎干细胞)进行sgRNA切割效率的测试，筛选出高效率的sgRNA。然后在ES打靶过程中添加 Cas9突变体蛋白和筛选出的靶向重组位点的高效sgRNA，可明显提高中靶效率。
本发明具体技术方案如下：
一种应用CRISPR/Cas9系统基因打靶的方法，基于CRISPR/Cas9系统，选择具有DNA单链切割能力的Cas9的突变体，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA，Cas9的突变体识别打靶位点附近的保守的间隔相邻基序，产生DNA单链切口，而不产生DNA双链断裂，诱导单链切口同源重组修复。
本发明所述方法中基因打靶的类型包括基因敲除、基因敲入。
本发明所述方法中Cas9的突变体优选为Cas9n D10A和/或H840A。
进一步的，本发明所述方法可以针对每个靶基因设计至少2个打靶位点以提高打靶效率或同时进行多个基因打靶，每个打靶位点的间隔不小于100bp，保证相邻的DNA单链切口间隔足够的距离而不产生双链断裂。
本发明的另一目的在于提供一种应用CRISPR/Cas9系统制备基因打靶ES细胞的方法，包括如下步骤：
(1)根据基因打靶的类型和靶基因选择合适的打靶位点，设计同源DNA供体和鉴定方案；
(2)采用本发明所述应用CRISPR/Cas9系统基因打靶的方法，制备Cas9的突变体或其表达载体，根据靶基因和打靶位点设计并制备sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体或各自的表达载体；
或者，制备Cas9的突变体、sgRNA或者crRNA和tracrRNA的共表达载体；
(3)将步骤(1)制备得到的Cas9的突变体、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体转染入ES细胞，可根据基因打靶的类型选择无同源DNA模板使打靶位点发生碱基插入或删除，或者同时转染同源供体DNA将外源DNA插入到基因组；
(4)提取ES细胞DNA进行PCR鉴定和/或Southern Blot检测与核型鉴定，鉴定通过的克隆即为基因打靶阳性ES细胞。
本发明可以直接制备Cas9的突变体、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体转染入 ES细胞，也可制备各自的表达载体或共表达载体染入ES细胞，优选直接制备Cas9的突变体、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体转染入ES细胞，可以避免表达载体或共表达载体染入ES细胞后的表达效率问题。
上述方法，优选的，所述步骤(2)还包括进一步检测制得的sgRNA或者crRNA和tracrRNA二元复合体的切割效率和脱靶效应。所述检测包括核酸内切酶检测法、SSA报告载体检测法、Sanger测序法、Digenome-Seq技术。优选核酸内切酶检测法，所述核酸内切酶选自SURVEYOR酶、T7EN1酶。
本发明一个具体的实施方式，将野生型Cas9、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体转染ES细胞，提取细胞基因组并用特异引物扩增目标切割区域，对获得的PCR产物进行进行T7EN1酶切，酶切后进行电泳检测，检测结果显示比对照组多出一条或多条条带的视为有效切割；或者，对获得的PCR产物进行Sanger测序，测序结果比对显示，sgRNA区域出现双峰视为有效切割；筛选出高效sgRNA或crRNA 和tracrRNA。
本发明所述方法，转染ES细胞的方法包括病毒转染、脂质体转染、电转染。
本发明的另一目的在于提供一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法，将本发明所述应用CRISPR/Cas9系统制备基因打靶ES细胞的方法制备得到的基因打靶阳性ES细胞注射到动物囊胚中，将囊胚分别移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为F0代基因打靶动物模型。优选的，本发明所述基因打靶动物模型为哺乳动物，优选小鼠或大鼠。优选的，本发明所述基因打靶动物模型为KO、cKO、KI、KO first、TM小鼠模型。
本发明所述方法适用于所有基因的敲入或敲除。本发明中具体列举的打靶动物模型为 PRKAA1-KI、CD27-KI、ANXA8-CKO小鼠模型。
本发明的另一目的在于提供一种提高基于CRISPR/Cas9系统介导ES打靶阳性克隆筛选效率的方法，利用CRISPR/Cas9系统，选择具有DNA单链切割能力的Cas9的突变体，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA，Cas9的突变体识别打靶位点附近的保守的间隔相邻基序，产生DNA单链切口，而不产生双链断裂，诱导单链切口同源重组修复。
本发明所述的野生型Cas9和突变体Cas9n或其表达载体可参考现有技术制备而成(Cong,Le,et al."Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems."Science(2013): 1231143.)也可委托商业公司制备得到。sgRNA或者tracrRNA/crRNA设计并制备针对改造位点的sgRNA可使用Cas9sgRNA设计网站，根据打靶基因和打靶位点设计sgRNA，例如使用网站https://crispr.mit.edu/分析sgRNA特异性。选择得分60分以上的sgRNA，评分越高，说明sgRNA特异性越高，相应的脱靶效应越小。
可参考现有技术构建sgRNA转录载体或委托商业公司制备。
具体的操作如下：
1)sgRNA引物设计；
将sgRNA序列作为正向引物订购，sgRNA序列反向互补序列作为反向引物订购。
2)构建sgRNA转录载体；
将正反向引物退火形成双链，在与BsaI单酶切的pUC57-T7载体连接，构建得到含有 sgRNA序列的转录载体。
3)通过PCR扩增制备体外转录模板；
以PrimerStar Max体系，sgRNA-F、sgRNA-R为引物，序列正确的pUC57-sgRNA质粒为模板进行PCR，95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 40s，72℃ 5min，30个循环。程序结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切目的条带进行胶回收，回收获得的终产物为转录模板。
4)使用转录模板进行体外转录并纯化。
试剂I：HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB#E2050S)；
试剂II：Ambion MEGAclear kit(Ambion AM1908)；
按HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB#E2050S)的操作手册进行 RNA体外转录，按Ambion MEGAclear kit(Ambion AM1908)的操作手册进行RNA纯化。回收获得的RNA通过紫外分光光度计测浓度，并取1μl RNA样品加入9μl 1×Loadingbuffer，进行琼脂糖凝胶电泳。其余RNA样品-80℃保存。
本发明优点：
(1)本发明利用Cas9突变体产生DNA单链断裂的特性，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA产生DNA单链切口，而不产生DNA双链断裂，诱导单链切口同源重组修复，降低HMEJ修复带来的插入缺失突变。
(2)本发明将CRISPR/Cas9基因编辑技术与传统ES打靶结合，先用ES细胞(胚胎干细胞)进行sgRNA切割效率的测试，筛选出高效率的sgRNA。然后在ES打靶过程中添加 Cas9突变体蛋白和筛选出的靶向重组位点的高效sgRNA，可明显提高中靶效率。
(3)本发明利用CRIPSR/Cas9n介导ES打靶的基因编辑技术，以体外表达获得的蛋白和通过ES细胞筛选获得的高效sgRNA组合，实现基因组多位点打靶，对靶基因上的多个位点实行剪切，在不增加同源臂长度的同时，提高打靶效率，实现基因组改造的目的，可作为平台技术广泛用于基因打靶动物模型的制备。
附图说明
图1.实施例1sgRNA切割T7EN1酶切比对图。
图2.实施例1WT Cas9介导ES打靶PCR检测中靶克隆图。
图3.实施例1Cas9n D10A介导ES打靶PCR检测中靶克隆图。
图4.实施例1WT或D10A Cas9介导ES打靶Southern检测中靶克隆图。
图5.实施例2sgRNA切割测序比对图。
图6.实施例2PCR检测中靶克隆图。
图7.实施例2Southern检测中靶克隆图。
图8.实施例2小鼠基因型检测图。
图9.实施例3sgRNA切割测序比对图。
图10.实施例3PCR检测中靶克隆图。
图11.实施例3Southern检测中靶克隆图。
图12.实施例3小鼠基因型检测图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1Prkaa1-KI ES细胞的制备
本发明使用的WT Cas9和Cas9n D10A，购自于苏州强耀生物科技有限公司，检测其核酸酶活性，用于后续实验。
一、sgRNA的设计、制备及切割活性检测
1.设计并制备针对目的位点的sgRNA
1)使用Cas9sgRNA设计网站设计针对目的位点的sgRNA
使用网站https://crispr.mit.edu/分析sgRNA特异性。选择得分60分以上的sgRNA，评分越高，说明sgRNA特异性越高，相应的脱靶效应越小。
由于同源DNA供体片段两端各有约5kb大小的同源臂，整体偏度较长，本发明在2个同源臂100bp以内各设计并筛选获得1条可切割的sgRNA。
sgRNA序列如下：
| sgRNA名称 | 序列 | PAM |
| Prkaa1-5S1 | gaacacuagugcacuuaucc(SEQ ID NO:1) | CGG |
| Prkaa1-3S2 | uccugaaaugacuucuggug(SEQ ID NO:2) | CGG |
2)sgRNA引物设计；
将sgRNA序列作为正向引物订购，sgRNA序列反向互补序列作为反向引物订购。
3)构建sgRNA转录载体；
将正反向引物退火形成双链，再与BsaI单酶切的pUC57-T7载体连接，构建得到含有 sgRNA序列的转录载体。
4)通过PCR扩增制备体外转录模板；
以PrimerStar Max体系，sgRNA-F、sgRNA-R为引物，序列正确的pUC57-sgRNA质粒为模板进行PCR，95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 40s，72℃ 5min，30个循环。
程序结束后进行琼脂糖凝胶电泳，切目的条带进行胶回收，回收获得的终产物为转录模板。
2.使用转录模板进行体外转录并纯化
试剂I：HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB#E2050S)
试剂II：Ambion MEGAclear kit(Ambion AM1908)
按HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB#E2050S)的操作手册进行 RNA体外转录，按Ambion MEGAclear kit(Ambion AM1908)的操作手册进行RNA纯化。
回收获得的RNA通过紫外分光光度计测浓度，并取1μl RNA样品加入9μl 1×Loading buffer，进行琼脂糖凝胶电泳。其余RNA样品-80℃保存。
3.将sgRNA与WT Cas9蛋白通过电转方式进入小鼠ES细胞中
1)准备ES细胞：复苏液氮中冻存的ES细胞，通过传代进行扩增，电转前一天计数传代，每个10cm dish接种5×106细胞量。
2)电转样品准备：在电转当天下午14:00，在无RNA条件下，根据电转要求，将Cas9与 sgRNA混合，作为电转样品。
3)细胞电转：前一天接种的细胞消化终止后，取1×106细胞，离心1000rpm 5min，负压吸去上清。用100μl电转buffer重悬后，加入混好的电转样品，混匀后转入电激杯中。电转后，向电激杯中加入500μlES-DMEM，转入铺有明胶的6孔板中。
4)48h后，收细胞，提DNA鉴定切割效果。
4.基因鉴定获得高切割效率sgRNA。
PCR体系按表1进行加样，PCR引物见表2，PCR程序见表3。PCR产物通过T7EN1酶切，酶切结果如图1所示。图1中左图为5端同源臂内测sgRNA切割比对图，右图为3端同源臂内测sgRNA切割比对图，图中显示T7EN1酶切后出现2条带，说明5端同源臂内测 sgRNA和3端同源臂内测sgRNA可切割目的基因组。
表1：
表2：
注：1和2引物分别为包含5端sgRNA和3端sgRNA位置的扩增引物。
表3：
二、利用Cas9 D10A介导ES打靶技术，筛选获得阳性ES克隆(同时使用WT Cas9介导ES打靶作为对照)
i.电转前一天铺制feeder细胞于6cm dish中。
ii.实验当天提前将所需的ES-DMEM、ES-0、胰酶放入37度水浴锅中预热。打开电转仪，根据细胞系设置好参数。
iii.用胰酶将细胞消化下来，ES-0中和后收细胞离心，1000rpm5min，用电吸引器软管部分连接已高压灭菌的吸管(吸管事先放入超净台内)，负压吸去上清。
iv.用Ca2+/Mg2+free PBS 20ml重悬，计数。取2×106细胞，离心1000rpm 5min，负压吸去上清。
v.用100μl电转buffer重悬后，加入混好的Cas9D10A蛋白与sgRNA以及同源DNA供体 (序列如SEQ ID NO:7所示，同源DNA供体包含敲入位点同源臂、替换区CDS、抗性筛选原件(G418)，混匀后转入电激杯中。
vi.电转后，向电激杯中加入500μlES-DMEM，转入铺有feeder细胞的6cm dish中。
vii.48h后，更换为含200ug/ml G418的新鲜ES-M+G418。放入二氧化碳培养箱，37℃， 5％CO2培养筛选7天。
viii.7天后，挑取单克隆至铺有feeder的96孔板中，ES细胞长至80％融合时，以1：3传代，其中一盘用于提DNA，另两盘用于冻存至-80度的冰箱中。
ix.96孔板DNA进行PCR鉴定。
x.96孔板细胞扩增：PCR阳性的克隆确认后，从-80度的冰箱中将96孔板中取出，酒精喷表面，擦干净酒精，放置到培养箱中，大约30min,期间变动96孔板放置的位置(变动2-3次，未完全融化的96孔板放置一个位置10分钟后，底部温度会变低，这时移动位置可使 96孔板底部重新处于37℃以便其快速融化)，待冰晶全部化掉后，将细胞全部吸取到24孔板中，每个阳性克隆复苏到一个24孔内，标记清楚。每个克隆经过换液，传代等，扩增至 2个10cm dish上，一皿用于冻存，一皿用于提DNA。
xi.Southern鉴定与核型检测：扩增后的细胞DNA用于southern检测，鉴定通过的克隆即为打靶阳性克隆。
PCR检测体系及结果：
PCR体系如表4，PCR引物如表5，PCR程序如表6。
表4：
表5：
注：5’LR-PCR引物为跨越5端同源序列扩增引物，3’LR-PCR引物为跨越3端同源序列扩增引物。
表6:
WT Cas9介导ES打靶PCR检测中靶克隆结果如图2所示，其中：B6为阴性对照，是 B6基因组DNA；N为空白对照，无模板的对照；P为阳性对照；TRANS 2K条带： 8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp；A1-H6为不同克隆编号的样品。5’LR-PCR扩增阳性克隆与3’LR-PCR扩增阳性克隆编号吻合即为正确重组的阳性克隆。从A1-H6编号的48个克隆中得到阳性克隆：E1，H2，E3，H3，H4，E6；阳性率： 6/48＝12.5％其余为野生型或阴性。
Cas9n D10A介导ES打靶PCR检测中靶克隆结果如图3所示，其中：B6为阴性对照，是B6基因组DNA；N为空白对照，无模板的对照；P为阳性对照；TRANS 2K条带： 8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp；A1-G4为不同克隆编号的样品。5’LR-PCR扩增阳性克隆与3’LR-PCR扩增阳性克隆编号吻合即为正确重组的阳性克隆。从A1-G6编号的40个克隆中得到阳性克隆：A1，A3，A5，A6，B1，B3，B4，B5， B6，C3，C5，C6，E1，E3，F2，F4，F5，F6，G1，G2，G3；阳性率：21/40＝52.5％其余为野生型或阴性。
结论：对比图2与图3的PCR鉴定结果显示，CIRSPR/D10A介导PRKAA1基因重组的效率高于WT蛋白。
Southern检测及结果：
酶切方案如表7所示，探针引物明细如表8所示，模板使用小鼠BAC：RP23-240A23。表7：
注：通过酶切产生不同片段的的方式区分中靶基因型与野生型的差异。
表8：
注：引物1和2分别为5端和3端探针的扩增引物，放在各自同源臂外侧，检测中靶条带，排除随机插入干扰。
WT或D10A Cas9介导ES打靶Southern检测中靶克隆结果如图4.所示，其中：B6N为阴性对照，是B6基因组DNA；Marker条带：15000bp\10000bp\7500bp\5000bp\2500bp\1000bp\250bp； ：非目的条带。结果显示：使用Cas9n D10A蛋白，基因组不会出现断裂，检测条带只有Target条带和WT条带；使用Cas9WT蛋白，基因组出现DSB，除了Target条带和WT条带，还有非目的带。
实施例2Cas9n D10A介导ES打靶技术制备CD27-KI小鼠模型
一、sgRNA的设计、制备及切割活性检测
参照实施例2的方法，设计、制备sgRNA，并检测切割活性。
sgRNA序列如下：
| sgRNA名称 | 序列 | PAM |
| CD27-5S1 | uggcauggccaccucccuac(SEQ ID NO:16) | TGG |
| CD27-3S2 | acgggcaagagcacaccg(SEQ ID NO:17) | AGG |
PCR体系按表9进行加样，PCR引物见表10，PCR程序见表11。
表9：
表10：
注：1和2引物分别为包含5端sgRNA和3端sgRNA位置的扩增引物。
表11：
sgRNA切割测序比对结果如图5所示，其中：左图为3端同源臂内测sgRNA切割比对图，右图为5端同源臂内测sgRNA切割比对图，标黑区为sgRNA序列。测序比对图显示， sgRNA位置出现双峰，说明该位置出现了切割，导致碱基插入与缺失，证明sgRNA可切割目的基因组。
一、利用Cas9n D10A介导ES打靶技术，筛选获得阳性ES克隆
参照实施例2中的方法，采用Cas9n D10A介导ES打靶技术，筛选获得阳性ES克隆。同源DNA供体序列如SEQ ID NO:22所示。
PCR检测体系及结果：PCR体系如表12，PCR引物如表13，PCR程序如表14。
表12：
表13：
注：5’LR-PCR引物为跨越5端同源序列扩增引物，3’LR-PCR引物为跨越3端同源序列扩增引物。
表14：
PCR检测中靶克隆结果如图6所示，其中：129及B6为阴性对照，是129及B6基因组DNA；N为空白对照，无模板的对照；P为阳性对照；TRANS 2K条带：8000bp\5000bp\ 3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp；A1-G12为不同克隆编号的样品；5’LR- PCR扩增阳性克隆与3’LR-PCR扩增阳性克隆编号吻合即为正确重组的阳性克隆。从A1-P6 编号的96个克隆中得到阳性克隆：A3,F3,G3,E5,C6,E6,F10,G11，阳性率：8/96＝8.3％，其余为野生型或阴性。
Southern检测及结果：
酶切方案如表15，探针引物明细如表16，模板使用小鼠BAC：RP23-394N13。
表15：
注：通过酶切产生不同片段的的方式区分中靶基因型与野生型的差异。
表16：
注：引物1和2分别为5端和3端探针的扩增引物，放在各自同源臂外侧，检测中靶条带，排除随机插入干扰，3为内部引物，验证中靶区域的完整性。
Southern检测中靶克隆结果如图7所示，其中，：B6N为阴性对照，是B6基因组 DNA；Marker条带：15000bp\10000bp\7500bp\5000bp\2500bp\1000bp\250bp；LR-PCR阳性克隆的DNA使用上表的酶切方案及相应的探针，检测出的条带，通过与阴性对照及Marker 的条带参照，判断两端重组中靶及完整性通过的阳性克隆。
Southern鉴定结果显示：A3,C6,E6,F3,G3,G11：为中靶及完整性通过的阳性克隆，但 E5存在随机插入，A3中靶条带较弱，不推荐注射。
三、进行阳性ES克隆注射及移植
i.准备2.5天受体鼠：挑选周龄体重合格的ICR雌鼠，下午3:30将结扎雄鼠与雌鼠1:2合笼，第二天上午8:00开始对受体进行检栓，见栓鼠标记为0.5天，取见栓2.5天小鼠，作为当天胚胎移植实验的受体。
ii.准备3.5天胚胎：挑选合适周龄雌鼠进行超级排卵操作(注射PMSG、HCG)，下午3:30 将结扎雄鼠与雌鼠1:2合笼，第二天上午8:00开始对受体进行检栓，见栓鼠标记为0.5天，脱颈椎处死见栓2.5天供体雌鼠，剪出子宫及输卵管，用吸有D-PBS的注射针从输卵管伞口处冲洗输卵管及子宫，将8细胞期的胚胎挑选出来，清洗干净后转移到提前1小时制备好的 M16液滴的培养皿内，放入37℃、5％CO2培养箱培养过夜。
iii.注射细胞准备:在注射当天早上10:00，根据注射要求，提供阳性ES细胞给注射人员。
iv.注射：制备合适的固定管、注射针、操作皿，用注射针挑选一些小而亮且边缘比较光滑的ES细胞10-15个，用固定管将胚胎固定，轻轻地用注射针转动胚胎，寻找细胞间隙处进针，注射针进入囊腔后轻轻将ES细胞吹入囊腔。将注射ES细胞的囊胚移入ES-mediun中培养，恢复3-4小时。
v.胚胎移植：囊胚完全恢复后，将胚胎移植到E2.5天受体子宫内。将做完移植手术的小鼠放在干净鼠笼内，37℃热台上保温直到小鼠苏醒。将苏醒后的小鼠转移入相应的动物饲养房，等待生仔。
小鼠繁育：移植受体生出的小鼠标记为嵌合鼠，对毛色嵌合率超过50％的雄鼠进行配繁，后代小鼠标记为F1。按照繁育目标，制定繁育计划，将3-5只基因型符合要求的F1按照计划进行繁育，建系。
鉴定：在F1小鼠出生后1周内进行剪尾，鉴定基因型，并检测突变检测；建系过程中产生的所有小鼠进行基因型鉴定，以保证小鼠基因的遗传稳定性。
PCR体系及程序如表17，PCR引物如表18，使用小鼠的鼠尾DNA作为鉴定模板。
表17：
表18：
注：KI及KIN为中靶基因型鉴定；WT为野生型鉴定。
小鼠基因型检测结果如图8所示，其中：数字为鼠尾号，P为阳性对照，WT为C57BL/6J 野生型，N为negative空白对照，M为DNA Marker Marker条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。107#，108#，110#，112#小鼠为KI阳性F1代小鼠。
实施例3Cas9n D10A介导ES打靶技术制备Anxa8-CKO小鼠模型
一、sgRNA的设计、制备及切割活性检测
参照实施例2的方法，设计、制备sgRNA，并检测切割活性。
sgRNA序列如下：
| sgRNA名称 | 序列 | PAM |
| Anxa8-5S1 | caaguguguaagacga(SEQ ID NO:39) | GGG |
| Anxa8-3S1 | ucuggucagucagcgug(SEQ ID NO:40) | GGG |
PCR体系按表19进行加样，PCR引物见表20，PCR程序见表21。
表19：
| 试剂 | 体积(μl) | 规格 |
| 10X Buffer | 2.5 | |
| ddH<sub>2</sub>O | 17.75 | |
| primer | 0.5 | 10uM |
| primer | 0.5 | 10uM |
| Mg<sup>2+</sup> | 2 | 25mM |
| dNTPs | 0.5 | 10mM each |
| Taq | 0.25 | 5U/μl |
| Template | 1 |
表20：
注：1和2引物分别为包含5端sgRNA和3端sgRNA位置的扩增引物。
表21：
sgRNA切割测序比对结果如图9所示，其中：左图为3端同源臂内测sgRNA切割比对图，右图为5端同源臂内测sgRNA切割比对图，标黑区为sgRNA序列。测序比对图显示， sgRNA位置出现双峰，说明该位置出现了切割，导致碱基插入与缺失，证明sgRNA可切割目的基因组。
二、利用Cas9D10A介导ES打靶技术，筛选获得阳性ES克隆
参照实施例2中的方法，采用Cas9n D10A介导ES打靶技术，筛选获得阳性ES克隆。
同源DNA供体序列如SEQ ID NO:45所示。
PCR检测体系及结果：
PCR体系如表22，PCR引物如表23，PCR程序如表24。
表22：
表23：
表24：
注：5’LR-PCR引物为跨越5端同源序列扩增引物，3’PCR引物为跨越3端同源序列扩增引物。
PCR检测中靶克隆结果如图10所示，其中，B6为阴性对照，是B6基因组DNA；N为空白对照，无模板的对照；TRANS 2K条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp；A1-H12为不同克隆编号的样品；5’LR-PCR扩增阳性克隆与3’LR-PCR扩增阳性克隆编号吻合即为正确重组的阳性克隆。PCR阳性克隆(3端同源臂内测短引物)：B 1，C3，F3，D4，A5，E5，F9，B10，D10，E10，E11，C12，阳性率：12/96＝12.5％，其余为野生型或阴性。
Southern检测及结果：
酶切方案如表25，探针引物明细如表26，模板使用小鼠BAC：RP23-20D5。
表25：
注：通过酶切产生不同片段的的方式区分中靶基因型与野生型的差异。
表26：
注：引物1和2分别为3端和5端探针的扩增引物，放在各自同源臂外侧，排除随机插入干扰，4为内部引物，验证中靶区域的完整性。
Southern检测中靶克隆结果如图11所示，其中：B6N为阴性对照，是B6基因组 DNA；Marker条带：15000bp\10000bp\7500bp\5000bp\2500bp\1000bp\250bp；LR-PCR阳性克隆的DNA使用上表的酶切方案及相应的探针，检测出的条带，通过与阴性对照及Marker 的条带参照，判断两端重组中靶及完整性通过的阳性克隆。
Southern鉴定结果显示：A5，B10，C12，D10，E5，E10，E11：为中靶及完整性通过的阳性克隆。
三、阳性ES克隆注射及移植；
参照实施例2的方法，进行阳性ES克隆注射及移植、小鼠繁育及鉴定。
PCR体系及程序如表27所示，PCR引物如表28所示。
表27：
表28：
注：Fln及Fl为中靶基因型鉴定；WT为野生型鉴定。
小鼠基因型检测结果如图12所示，其中：数字为鼠尾号，P为阳性对照，WT为C57BL/6J野生型，N为negative空白对照，M为DNAMarker Marker条带：8000bp\5000bp\3000 bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp。56#，59#，62#，65#，66#，72#，73#，77#， 80#，84#，85#，87#，89#，91#，92#，97#，98#，102#，109#，119#，120#，122#，128 #，134#：小鼠为阳性F1代小鼠。
序列表
<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司
<120> 一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法
<160> 61
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacacuagu gcacuuaucc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uccugaaaug acuucuggug 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acttttacct gctgagccta 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgtatgtgc taagctagtg gt 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaactcttga ctggtcactt tttg 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggccaatgtg ttacttttat gtc 23
<210> 7
<211> 18829
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcctggctt gttttgctct taccttacca taagtgtgcc aagcaggctc ccaactgggc 60
cctggccctg gctgttcctt ccccctgccc acttcacctt cctcctggcc aaggtagtct 120
gctcctccct tccttggggc tctgctctgg tgtactctgt gaccttcctg gcatgctctg 180
cctcttactt aattactgtc tgtgtcctgg cccctgcatc aagaacataa caaacttgct 240
tactgtctgt ctcctggcac ctgcatcagg accataacaa aaacaggaga ttggctttgc 300
tcccccacag acttctagca gctagcacag tacctggtat cttataggtg cttagtaaat 360
ctttactgaa tggatgaata cacgtgtttt aatattagta gataatgttt tctctcacca 420
ggtaccaggt catcagtaca ccatctgata ttttcatggt gatggaatat gtctctggag 480
gagagctatt tgattatatc tgtaaaaatg gaagggtaag cagttctcat ttaattctgt 540
acacagtttg gtaactctct gtccccctta ttgcattata gtgtcagcaa gcaattttca 600
gaggtctgtt tagtaataag tccccttagc atgaatttgt gtagcatcat aggctaatga 660
gaaggaaagg acctcaaaag tgatccctga tcccatttaa ttgacatgga tataaagact 720
acttgttgag tatttgttca aggtcacgtg atttactagt gatttacaga gttcacgtaa 780
gtccctaaaa tttattatcc tcagatttaa ggtttttagc aaaacaaact tttatttatt 840
tttttggaga cagggtcaca ctatgccact gtgactgcca tgtagatcag gctggcctcc 900
agtgcatagc catgcccctg tctctgtctc ccaagtgctg ggattgaagg tgtgcctggt 960
ctgtgctcac ccttaatgtg cttcctaaac tttcctaaca cgctttccta tgtgggcctc 1020
ccaaaatacg tcagtaagta cttaaacgat gtaggccttg ttcttcaacc ctggccacat 1080
ttcagttgtg ctcgtgtgtt ggtttctgat gtgcctgcag tagaaaggaa tagggatttt 1140
gaaggagcta ggaagtagac ttacagggct tagtgtttga aggaaccttg aagacgttta 1200
gttctaagca caaattctga gcaccgtccc ctgcccatac gcactctcac gttatctgac 1260
tggcacagcg ccctgctgaa aggccccaca cctaggagag aagagagcct ggctcccctt 1320
cagtcggaag ctatttgcat tcttcattct ttcatgttac gcactgtctc tctttaatca 1380
ggatcagact cattaagcac gctagtctgt tttttctcaa tgtggttaat ttctacctaa 1440
agttttccct ttctcatcct tcaaggccct attcctgtcc actggaggaa ttcttccaaa 1500
ttgatcaatg cctgcatttc tcatctctct ctttttttcc tcccatttgt catttctagt 1560
cattttgcta tacattgtgg ggacgtcttt agtgttacct tttgaatgcc aaccttccag 1620
ctgtcacatg tttgtatttc agatttctgc cttattttct gaaattccct ttggatagct 1680
gcctgtttgg ccttacctgt ttgagaatga cattttggtt ttaaatgtct tttggccact 1740
gcaccgctcc gttttccgtg ctttccgctc gcctcctctt ttttttcccc ccttctgttc 1800
attttgtctc cccccccccc aaccctccca tactcttagt cagatatctg gccattctta 1860
gctgtccact taaatttcag aacaaagtca caccacatgc caagccagtg gatgtgtgct 1920
gtttatggtt ttccctcagg ttgcattgtt ggagacatta attttggtag ggtaaattct 1980
ttgctcacaa gcacaagtgt ttttcttcgt ttgatttggt atctgctttt tcctattttc 2040
ttgaaggtat tggtttagct gttggaactg agtcgggaga tggggtcagg tctttcctgt 2100
tagtatgcac ataatctaca tcttccttaa cggcctggcc aacccgagga gctacaggtc 2160
ttactccccc ttggtggtac ctacagcttt ctgcacaggc ctgctgtctt gtttccgtcc 2220
gcccctcatt gcttcagaaa gtcatggtgc acccactgct cagcgttccc agggttccgc 2280
tgtgcacttg cgttcatttt ctcctctagg atttggtttt gcttttctct cttttgctga 2340
gttttcatct gctgtccata cattcctctt gatggccgct gtctctccat ctttttgttt 2400
tatgggcctt gtgtgttgct gacagcaccc tggggcgaca caacagggag tgacacaaaa 2460
gactcagtgt gggatgttta tcagcttgga gtgttctttt acatggctca tcttccttta 2520
gtcgctgcca ttctttgtac tgtattttta taaataaaat tcttttcacc tttgcagcct 2580
ttctgttact tatcatttgt taagttttct cttcctcttg cataattttt ttttaaataa 2640
acatctactt gaacaaaggt gtgagattgc aaaagtatta atgtcttttt cttaagggag 2700
aggaccttac atttcagggt aagggtatgc tacacttcag tagcattttt aattttgtat 2760
tcaaagcaat ggctggtttc tctttgtccc acgttatcca tgcggtgaag gtgtggggtt 2820
ctggatttag aatgctcact cctgacctgc caaggacctc atgtgagcat ccttgcctgg 2880
gccagtagct cacttatcga atcccctgtc ctggaacccg ggcaaagcag tgctgcttcc 2940
cctgctgagc aaacgccaga aaatgcagag actggaagat gatttttaaa agattgtact 3000
taaaaattgt aattgtagtg taagtgtttt ccttcaggaa agatgcaaag ggtaaatgtg 3060
ctaaggattt tcttttggtg aagtgaaaac atcttagacc tgaagagatg gcacccatgt 3120
caggtggctc tcgattgtaa ctccgggtcc agaggaccca acattcttag cattcttgtc 3180
tctgtaggca cctgcaggca gatgcacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 3240
cacacacaca tatacacaca cacacacata tacacacaca cacacacaca cacatacaca 3300
cacacacata cacacacata cacacacata cacacacaca cacacataca cacacacaca 3360
cacacacaca cacacacaca cacacacact taaaaatagc ttaaatttca gagtacaggc 3420
tatctttgcg ttgtggctca attccaatac ttacctgtca cttctttgtg gtctgtaatc 3480
gtcccccatg caagcatcac ttggtatatt ctctttttct ttcccttttc tccgattaga 3540
tttgctcttt gacagttgcg tccatgtgtt ctgcgccctc tgtgtacgct cccaccctga 3600
cccccttctc ttccttcccc tcctccctgc aggtccctgg tttacactca tgactttgtt 3660
ctgttctggg aaccactgag tttgactaga agcatctgtt tccccctggg tttggatctg 3720
ctcattggaa cgctttctgt atcactctgt gacccttttt tcccactgtt acgctcatgt 3780
ttggtttggt tttggcctta ttttgtctac tagagtaggg ccttcctctc actcatctct 3840
gtgctatgga tatctaacca gtacagcata ttgaatatct aatactatgg atatctaacc 3900
agtacagcat attgaatgtg ctcagtaaat atttgttgaa ggagggaagg attaaacacc 3960
actaattgga aaacattccc agtttcaggt agaagttgaa agtactagaa atagcccatg 4020
agctccagaa gaagatgtgt ttttaagtgt agtttatata tgtgataggg tcaaagagtt 4080
gagttgctga tttggtcccc gtaagccctt gcttggcatt tcagtgtagg gctgcaggcc 4140
ttacttgccc atttcaaagt acctcatggg tgaagttcgc ctggaagctt tcaggcgttg 4200
acagtccaca ggctggagaa ttataagaat gttttcattg agagacacag cttaaaatgc 4260
ctttcttctt ttcctagttg gacgaaaagg aaagccgccg tctgttccag cagatccttt 4320
ccggtgtgga ttattgtcac aggcatatgg tggtccacag agatttgaaa cctgagaacg 4380
tcctgcttga tgcacacatg aatgcaaaga tagccgactt tggtaaggat ggttgtgatg 4440
tttaatgagc ataagtatca tcttctggta gtgtttatgg ggtgcactag aaccccactc 4500
tgcaagtgaa cattcagaag ggaaaacagt aaggtacgcg cgcgcgcgcg cgcgcacaca 4560
cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cgccacagga tagctttggg 4620
ggatgtttct attcttccag cacgtgggtc ttagagggtg gatttaggtt gtcaggcatg 4680
gtggtaagca cttttacctg ctgagcctac ctgccagccc tgaaattcag ttttgtgatc 4740
ttaaatattt caacttctta acattagaga gatcatttga aaagaaaaga ctattatttg 4800
tcaagaaggt agcaacttga tttctaatat ttctttttgg tggagtatgg agaaaatgga 4860
aagtgggatg gaattattga cataacattg gaatctagaa agatgaatta tatgaggaaa 4920
ctttttttat aaaattaata tttaaatgct gtaaagttgg ttttcagatg tagtggtagg 4980
tgccttcagt ctaagaattc cagagatgga ggccgataac ttcgtatagc atacattata 5040
cgaagttatg tagagatctt tctgttcagc tgggtctatt ttgcctagca gtatccatat 5100
taaaaggtag acatttcaag gatcttctag tattcaaaac caccactagc ttagcacata 5160
cacattaaac tctagatgtt gaaattcatt gtacattttg tgtataaggt cagaatattt 5220
aagaaataaa gactataatc aagttaaaag tttttgtttt tttgtttttt ttttctgttt 5280
ttattttatt ttattttatt acatattttc ctcaattaca tttccaatgc tatcctaaaa 5340
gtcccccata ccctcccccc ccacttccct acccactcat tcccattttt tttggccctg 5400
gcgttcccct gtactggggc atataaagtt tgtgtgtcca atgggcctct ctttccagtg 5460
atggccgact agaccatcgt ttgatacata tgcagctaga gtcaagagct ccaggatact 5520
ggttagttca taatgttgtt ccacctatag ggttgcagac ccctttagct ccttgggtac 5580
tttctctagc tcctccattg ggagtttttt tttctgtttt acttgctttt tgtccttaag 5640
aactcttgac tggtcacttt ttgtcatttc aggtctttca aacatgatgt cagatggtga 5700
atttttaaga acaagctgtg gctcacccaa ttatgcagct ccagaagtca tttcaggaag 5760
attgtacgca ggccccgagg tggacatctg gagcagcggg gtcattctct atgctttgct 5820
gtgtggaacc ctcccttttg atgatgacca tgtgccaact ctttttaaga agatatgtga 5880
tgggatcttt tatacccctc agtacttaaa cccttcagta atcagccttt tgaaacatat 5940
gctgcaggtg gatcccatga agagggccgc aataaaagat atcagggaac acgagtggtt 6000
taaacaggac cttccgaagt atctctttcc tgaggaccca tcttatagtt caaccatgat 6060
cgatgacgaa gccttgaaag aagtgtgtga gaagttcgag tgttcggagg aggaggtcct 6120
cagctgcctg tacaacagaa accaccagga cccactagcc gtcgcctacc acctcatcat 6180
agacaacagg agaataatga atgaagccaa agatttctac ctagcaacca gcccacctga 6240
ctctttcctg gacgaccacc atttaactcg gcctcaccct gaaagagtac cgttcttggt 6300
tgccgaaaca ccacgggccc ggcacaccct ggatgaatta aacccacaga aatccaaaca 6360
ccaaggtgta cggaaggcaa aatggcattt gggaattcga agtcaaagcc gacccaatga 6420
tatcatggca gaagtttgta gagcaatcaa gcagttggat tatgaatgga aggttgtaaa 6480
cccctattat ttgcgtgtac gaaggaagaa tcctgtgaca agcacatttt ccaaaatgag 6540
tctacagcta taccaagtgg atagtaggac ttacttgttg gatttccgta gtattgatga 6600
tgagattaca gaagccaaat cagggactgc tactccacag agatcgggat ccatcagcaa 6660
ctatcgatct tgccaaagga gtgactctga tgccgaagct caaggaaagc cctcagacgt 6720
ctcccttacc tcatctgtca cctccctcga ctcctcccct gtcgacgtag ctccaagacc 6780
aggaagtcat acaatagaat tttttgaaat gtgtgcaaat ctaattaaaa ttcttgcaca 6840
gtaactgtaa gtctgcagaa attgatgatc tattaaacaa taaagatgtc cactaaaatg 6900
gaagtttttc ctgtcatact ttgttaagaa gggtgagaac agagtaccta cattttgaat 6960
ggaaggattg gagctacggg ggtgggggtg gggtgggatt agataaatgc ctgctcttta 7020
ctgaaggctc tttactattg ctttatgata atgtttcata gttggatatc ataatttaaa 7080
caagcaaaac caaattaagg gccagctcat tcctcccact catgatctat agatctatag 7140
atctctcgtg ggatcattgt ttttctcttg attcccactt tgtggttcta agtactgtgg 7200
tttccaaatg tgtcagtttc atagcctgaa gaacgagatc agcagcctct gttccacata 7260
cacttcattc tcagtattgt tttgccaagt tctaattcca tcagaagctt gcagatctgc 7320
gactctagag gatcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 7380
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 7440
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 7500
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 7560
gctgcgactc tagaggatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt 7620
aaaaaacgtt taaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt 7680
gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 7740
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 7800
aatgtatctt atcatgtctg gatctgcgac tctagaggat cataatcagc cataccacat 7860
ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata 7920
aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 7980
gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 8040
tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatctg cgactctaga ggatcataat 8100
cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct 8160
gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa 8220
tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 8280
ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tccccatcaa 8340
gctgataaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc 8400
tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac atttctctaa ggcgcataac gataccacga 8460
tatcaacaag tttgtacaaa aaagcaggct ggcgccggaa cgcatgcaga tctacgcgtg 8520
attaacttta aataattggc attatttaaa gttattaatt aaccccccca aaaaaaaggt 8580
gcctatcacc cttctgccta cctgtgtatc ctcaggacat ggtgggcctc tctggttggc 8640
agaaagcaca acaaagcctc ttcatcctat actacttctc ttgaccagat gccaagtcta 8700
atatgaactg caatcctcta tacaccaaaa gttcatgggg gcaccgtgag gtcccactcc 8760
acctcagcca attccttgtt gctgccccac tcacctcctg agcctccctc tgtttcctgt 8820
ccacctttca gcttccctct caggctggga gcaggggcca gtagcagcac ccacgtccac 8880
cttctgtcta gtaatgtcca acacctccct cagtccaaac actgctctgc atccatgtgg 8940
ctcccattta tacctgaagc acttgatggg gcctcaatgt tttactagag cccacccccc 9000
tgcaactctg agaccctctg gatttgtctg tcagtgcctc actggggcgt tggataattt 9060
cttaaaaggt caagttccct cagcagcatt ctctgagcag tctgaagatg tgtgcttttc 9120
acagttcaaa tccatgtggc tgtttcaccc acctgcctgg ccttgggtta tctatcagga 9180
cctagcctag aagcaggtgt gtggcactta acacctaagc tgagtgacta actgaacact 9240
caagtggatg ccatctttgt cacttcttga ctgtgacaca agcaactcct gatgccaaag 9300
ccctgcccac ccctctcatg cccatatttg gacatggtac aggtcctcac tggccatggt 9360
ctgtgaggtc ctggtcctct ttgacttcat aattcctagg ggccactagt atctataaga 9420
ggaagagggt gctggctccc aggccacagc ccacaaaatt ccacctgctc acaggttggc 9480
tggctcgacc caggtggtgt cccctgctct gagccagctc ccggccaagc cagcggcgcg 9540
ccgccaccat gggtgctagc gagctgatca tctctggctc ctctggagga ttcctgagga 9600
acatcggcaa ggagtaccag gaggctgctg agaacttcat gagattcatg aatgaccagg 9660
gagcctacgc ccctaacacc ctgagagacc tgaggctggt gttccactcc tgggctagat 9720
ggtgccacgc tagacagctg gcctggttcc ctatctctcc tgagatggct agggagtact 9780
tccttcagct gcacgatgct gacctggcct ctaccaccat cgacaagcac tacgccatgc 9840
tgaacatgct gctgtcccac tgtggcctgc ctcctctgtc tgatgacaag tctgtgagcc 9900
tggccatgag gagaatccgg agagaggctg ccaccgagaa gggagagaga accggccagg 9960
ccatccctct gagatgggat gacctgaagc tgctggatgt gctgctgtct agatctgaga 10020
gactggtgga cctgaggaat agggccttcc tgtttgtggc ctacaacacc ctgatgagga 10080
tgtctgagat ctctaggatc agagtgggag acctggacca gaccggagac accgtgaccc 10140
tgcacatctc ccacaccaag accatcacca ccgctgctgg cctggacaaa gtgctgtcta 10200
ggaggaccac cgctgtgctg aatgactggc tggatgtgtc tggcctgaga gagcaccctg 10260
acgctgtgct gttccctcct atccaccgga gcaacaaggc taggatcacc accacccctc 10320
tgaccgcccc tgccatggag aagattttta gcgatgcctg ggtgctgctg aacaagaggg 10380
atgccacccc taacaagggc cgctaccgga cctggaccgg ccactctgct agagtgggag 10440
ctgccatcga catggctgag aagcaagtgt ccatggtgga gatcatgcag gagggcacct 10500
ggaaaaagcc tgagacactg atgagatacc tgaggagggg aggagtgtct gtgggagcca 10560
actctaggct gatggactcc gctagcggcg ccggtcctaa gaagaagagg aaagtgtgag 10620
gccacgtagg cccgcgatga ataaatgaaa gcttgcagat ctgcgactct agaggatctg 10680
cgactctaga ggatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 10740
aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac 10800
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 10860
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 10920
catgtctgga tctgcgactc tagaggatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt 10980
tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa 11040
ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 11100
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 11160
tcaatgtatc ttatcatgtc tggatctgcg actctagagg atcataatca gccataccac 11220
atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca 11280
taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 11340
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 11400
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctggatc cccatcaagc tgatccggaa 11460
ccgcttggct gcaggtcgtc gaaattctac cgggtagggg aggcgctttt cccaaggcag 11520
tctggagcat gcgctttagc agccccgctg ggcacttggc gctacacaag tggcctctgg 11580
cctcgcacac attccacatc caccggtagg cgccaaccgg ctccgttctt tggtggcccc 11640
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tcgtgcagga cgtgacaaat ggaagtagca cgtctcacta gtctcgtgca gatggacagc 11760
accgctgagc aatggaagcg ggtaggcctt tggggcagcg gccaatagca gctttgctcc 11820
ttcgctttct gggctcagag gctgggaagg ggtgggtccg ggggcgggct caggggcggg 11880
ctcaggggcg gggcgggcgc ccgaaggtcc tccggaggcc cggcattctg cacgcttcaa 11940
aagcgcacgt ctgccgcgct gttctcctct tcctcatctc cgggcctttc gacctgcagc 12000
ctgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga 12060
actaaaccat gggatcggcc attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 12120
gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 12180
ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 12240
gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 12300
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gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 12420
tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 12480
accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 12540
aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 12600
aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 12660
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cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 12780
aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 12840
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catgctggag ttcttcgccc accccccgga tctaagctct agataagtaa tgatcataat 13080
cagccatatc acatctgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct 13140
gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa 13200
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cgctaacttt aaataattgg cattatttaa agttacaccc agctttcttg tacaaagtgg 13380
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ttatacgaag ttatgtagag atctttctgt tcagctgggt ctattttgcc tagcagtatc 13500
catattaaaa ggtagacatt tcaaggatct tctagtattc aaaaccacca ctagcttagc 13560
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tatttaagaa ataaagacta taatcaagtt aaaagttttt gtttttttgt tttttttttc 13680
tgtttttatt ttattttatt ttattacata ttttcctcaa ttacatttcc aatgctatcc 13740
taaaagtccc ccataccctc cccccccact tccctaccca ctcattccca ttttttttgg 13800
ccctggcgtt cccctgtact ggggcatata aagtttgtgt gtccaatggg cctctctttc 13860
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caagctgtct ctgtacatct gtcctggtac agtggcctcc tctccctgca ctgaccctca 14700
agtacttcct ctctcttccc gtgagaggtt gggcatatcc tattctgtca ggtctttttc 14760
tgatttgtca tttgtctgcc actcaattag aagttacttt caaacatggg tgctttcttc 14820
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tgatttttaa accaatgtat ttttctacct tttcgagtct ctagatacc 18829
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtcttcata ccgccactgc tt 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcctgcgta caatcttcct g 21
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcacagctgc cactatcagt catgc 25
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccttcggtgt taccttgtag gct 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tctggaggaa gagatggagt g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccttcttcc accattgctg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccattttgcc ttccgtacac c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uggcauggcc accucccuac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgggcaaga gcacaccg 18
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
catgtctgtg aagctcagca ga 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaatgtacct gagagcagag g 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tctgtagccc tcacattcag ag 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctgtgcaaa cacaatcggt cag 23
<210> 22
<211> 21864
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agcatgttca acgcagtgag ccacctctgc tgcctccatc caccgatgca atgcatcggt 60
ccagcgccca ggtaaactgc tgccccttca tctccactcc ttgcgacttg cagactcaag 120
taccagtgaa ggggaaaagg cacaagtatc ctctgagccc ctcaacaaag tattttagtt 180
agggttttac tgctgtgaaa agtcaccatg accccagcaa ctcgtttttg gttggttggt 240
tggtttggtt ggttggttgg ttggtttggt tggttggttg gttggtttgg ttggttggtt 300
ggttggttgg tttggttggt tggttggctg gttggtttgg ttggttggtt ggttggttgg 360
tttggttggt tggttgtttg gtcggttggt tggttggtta gtttggttgg ttggttagtt 420
tggttggttg gtttggttgg ttgtttggtt ggttggtttg gttggttgat ttggttggtt 480
ggttggttgg tttggttggt tggttggttg gtttggttgg ttgattggtt ggttggtttg 540
gttggttggt tggttggttg gttgtttatt gctttcccag acaatggtcc cctccctggc 600
atctttgagg atttgcttta ctaggctgat cttcccagac caaaaccctc aggacgcagc 660
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acaaaaacag agagagaaag gaaaccacaa aggaggcacc cggaacctgt gacctcagct 840
cccacaacaa acacctgaaa cactgcacca cgctttcaca ttagggttca gctcaccaga 900
aagaaatggg caaaagggtg gacatgtggc tcacttagta gattgttctc tcaaatagac 960
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tctgccttcc aaatgctggg attaaaggtg tgagccacct ctgcctgact gatgttaggt 1140
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atatatacat acacacacat acacacacat atatatatga catatatatt atgtatatat 1260
catatatatg ataaagatga gggacatata tatatatgta tgtatatgaa tgataagaat 1320
gtatatgtgt gtgtgtgtgt atcactaaca tcagaaagga atgtcaagta ccatggctgg 1380
ggacagcact gaatccagag gcagctgcca aggcgctgtc agcaagcact gtccagagct 1440
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ctgcctccag gttctgtaag tcagaagtct aaaggaggcc tcagccaggg atgcagctca 1860
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cagggcagga gaataaaaac attcaaacac ataaaataaa caaacccttt gaaattattt 2280
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ggttcaatgg cccgtgcttc tccagtgtag caactccagc atcctcaaat cagaattccc 4140
agaggagcat gaggcttaag atgatggccc acgtaggtgc ccaccttcaa tcccatgtgc 4200
ccagggccat gaagagagat ggctcaggta cctgaagata ctagtgacca agccagccag 4260
aagcaggaag gataaaaatg ggattaggtc aagaaggaag tttggcaaaa gttcccccag 4320
gcagtgggtc acatctgtgt cacaggctgg cattaagaag aaataaaacc aggctggagt 4380
ggtagctcag tcaggaaagt acaagggcct gagtctgatc gccaaaaccc agtttttgag 4440
ttcatttctt tgtttgtttg ttttgctaaa ggatcccagg gtttgatggt catccagcct 4500
cctctactag gcaagttgca ggccagtgag aaataataat ctccatcttc tttatcatca 4560
ccaccaccat catcatcatc atcgatgtcc ctgaggaatg aaaccaaggt tgtcccctga 4620
cctccatacg catgaacacc tacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 4680
cacacacaca catgtgcaca caaggattaa agggacttga tatcacagaa cagaaaaaga 4740
cacagggaac acagggctaa ctcttgccct caattgtatg caatgttcaa gagcttgtat 4800
agccagaaac tcaaacctca gttatataag gctggttgtc atgactcctc ccctttatac 4860
atgcaatagc tttgctgcgt gtgctgtgtc caagctggga atatagctca gacagcagtg 4920
tttgcctagg atgcaaaaag ccctgggttt catccccagt accacataaa cgggatgcgg 4980
cagcacagcg ctatggcacc agcagcagtg gcttggtagc aaaccctgca acaccaggaa 5040
cactcaggag agggaggcag aaagatcaga agtcccaagt catcctcagc taccaagcaa 5100
ccttgaggct accttggcat atataagacc gtcttccaaa ctgttgtgct tagccgtgtc 5160
accccacctc taatggggtg ttttgtggta ctagttttag gcaaaatctg aaaatgtcat 5220
gattttaaaa ctaacctgcc cctaggagct tcagaaataa tctgtaatct gctcctatct 5280
ggtcacctct ggaagggctg ggctatgaga gaggacactt gccagggaca gatgagggca 5340
cccagcgtcc atccctatca acaggtccgg cggctgtggg tattcattac tgagagaggt 5400
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ctccggagtg cggaaaagag aagggggtgg aggctgctga gagagagaca aagaaaacca 5520
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ctggtggggc tctcagctac tccagccccc aagagctgcc cagagaggca ctactgggct 5760
cagggaaagc tgtgctgcca gatgtgtgag ccaggtaaga gggggccttg gtaagggcca 5820
ggtgagtggc gaaagagaga ggactggggt taatacagta aataggcgca gggtgagact 5880
gagctcaagc aaggagggaa atcctgcagc tgtggggagg caccaccttg aagagggcag 5940
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aaggactgtg accagcatag aaaggctgct cagtgtgatc cttgcatacc gggggtctcc 6060
ttctctcctg accaccacac ccggccccac tgtgagagct gtcggcactg taactctggt 6120
gaggtgggca agggtgtgta ggtggggacg atggacaagc atctggggga gcaaggctgg 6180
tgacgggttt gggggtgcaa ggaggatgac ggggccaaag ctttggcctt cttcaaggct 6240
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gggcagacat ctagtattcc aggaaaggga taaatagaat ttgagggatt ggtgagaacg 6360
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gccattggga atttggaata catctttcta aggaaataac aaagcaaccc aataggtaac 6540
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attttatagt tccaaaaaaa aaggtttttt ttaaactaag aagtataata tctgcagttg 6660
tgcttatgaa tgctgttatt atttctccat cttcgctaca atttcagaaa ctacggccag 6720
tatacactag aatagcaggc tttaaagtgg cccctttgaa caaatgttct ctagcaagac 6780
actttttaga accaggtaac tgtaactatt aaactaccta cttgcaaaac gtgtttggtg 6840
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gtcacccagg ctggagtgca gtggtgcaat catagctccc cacagccttg aactcctggg 6960
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tgcctggtcc cgtaaaaaca aaaacaaaaa ccaacaccag atgtggtggc tcatgcctat 7080
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cccaggagct tgagaccagc tgggcaacat agtgagacct tgtctctaaa aaaattggct 7200
ggtcatggta gtgcacctgc agtcccagct acttgggagg ctgagatggg aagatcactt 7260
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agtttaagaa caccctgggc aacatggcaa aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaagt 7500
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cttgggagac agagtgagca gagtgagacc ctgtttccaa aaaaaaaaag aaaacaaaag 7680
cttttccatt gcaaatcaac caaaaaggaa cgtctttaat acacaagaaa tattcttcag 7740
tctacttaac ttaaaaatgt aactgtaata gatgcttttc tcttgacagc ggccccggca 7800
gggttggaac ttttcctagt caaaaccccc ctactcactc tgcagaccct tcctgaaggt 7860
cttcgcccca tactgagccc atcttcagtc ccttcacttg ttccaaacta gcccaatcca 7920
tgacccttct ctgggagctc agccaataga tcccaaagta ccacagcagc acctggctgc 7980
agaaggaccc ccgggaaatg cagtcagggg tgagaagatg ggtgggctga atgagctcgg 8040
ccctctctgg gccttagtgc tggcatctat gagatgagga catgcctgaa gtcagcctgg 8100
aattttgagc ccaggttaaa ggcgcataac gataccacga tatcaacaag tttgtacaaa 8160
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attatttaaa gttattaatt aaccccccca aaaaaaaggt gcctatcacc cttctgccta 8280
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caggctggga gcaggggcca gtagcagcac ccacgtccac cttctgtcta gtaatgtcca 8580
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tgtggcctgc ctcctctgtc tgatgacaag tctgtgagcc tggccatgag gagaatccgg 9600
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gacctgaagc tgctggatgt gctgctgtct agatctgaga gactggtgga cctgaggaat 9720
agggccttcc tgtttgtggc ctacaacacc ctgatgagga tgtctgagat ctctaggatc 9780
agagtgggag acctggacca gaccggagac accgtgaccc tgcacatctc ccacaccaag 9840
accatcacca ccgctgctgg cctggacaaa gtgctgtcta ggaggaccac cgctgtgctg 9900
aatgactggc tggatgtgtc tggcctgaga gagcaccctg acgctgtgct gttccctcct 9960
atccaccgga gcaacaaggc taggatcacc accacccctc tgaccgcccc tgccatggag 10020
aagattttta gcgatgcctg ggtgctgctg aacaagaggg atgccacccc taacaagggc 10080
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gctagcggcg ccggtcctaa gaagaagagg aaagtgtgag gccacgtagg cccgcgatga 10320
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cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct 10440
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tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 10560
ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga tctgcgactc 10620
tagaggatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc 10680
ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt 10740
attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 10800
tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 10860
tggatctgcg actctagagg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg 10920
ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg 10980
ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 11040
tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 11100
tatcttatca tgtctggatc cccatcaagc tgatccggaa ccgcttggct gcaggtcgtc 11160
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gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat gggatcggcc 11760
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gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 12960
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cacaccccac gacaggcccc agtgtgtgat gttccccttc ctgtgtccaa gtgttctcat 13380
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aaattccaat cctagaacta ggccacaccc catctcgtct gttcgatcac agatctgaac 18180
agggagttgt caccagggca gacccaaagg atttaacatg gactgaaagg aagaagggtc 18240
cagagtaccg gggaatctat cttctggctc caccccctct ccagccctct catagttggg 18300
gctgatggga aagctgatgt ggtgatacca ggttttgaaa tcacctgggg atttcttggg 18360
tgcggggtgg accttaggga gaacagaaag cagagctggc tgcagccatt actggcctcg 18420
ggcgggcggc cacagaggca gttgaagtga aagtgaaaga gaaacgataa gagaacggag 18480
accacaggtg ctaagtgagg gtgctcacag aaccccctct tcagccagag atcactagca 18540
ggggaactgt ggagaaggca gccagcaagg aagagcctga gagtagcctc catgggcttg 18600
gagcccagct ggtatctgct gctctgtttg gctgtctctg gggcagcagg gactggtgag 18660
tgcggagacc aggctggggc ctgggggact gggggggagg aagcgccaag ctaaaggagc 18720
cccaggaagc caccttctca gaacagcacc agcttgtctg ctaagcccag caaatgagtg 18780
cggcactcac aacatgcgga accagtttgg agaggggtac ggcagagaac tcacagaaaa 18840
ggggggcttc ctcgatggga aggcagggtg ttagcattct gtgggacagc tcactgccct 18900
gagttgaatc cttagaagag gaaggggctc cccaggctaa gaaatcattg ggttggtgac 18960
tcctggtggg cgtggctatg gcagaaagca gaggcctctg ggaaagttgg gtgatgagaa 19020
aaaggttgtc aatgtcccta ggaacagcag tgtcttggct cctctcccct gtggcagtat 19080
ttcttattcc tttttttttt tttttttttt aacctgagaa ttcctttcca gaaattccct 19140
tgcatcccac agctgagact cagaaataca aagcataaac ccctctggct ttgatcagga 19200
cagatctagg acttgaaata actcacagag ccgctgcctg agtagcaggt gcctcagcag 19260
aagctgggtt tatagatgac accaggacag cggggctcag aaggcacctt tacctgctgc 19320
tcagcccggg gcttggtgaa ggggtgggaa gagtgtggag gacgagggtg cttgttccac 19380
tttccctgca gaccctccca cagcgcccac cacagcagaa agacagcggc agcccacgga 19440
catcatctta gactgcttct tggtgacaga agacaggcac cgcggggctt ttgccagcag 19500
tggggacagg gagagggcct tgcttgtgct gaagcaggta ccagtgctgg atgatggctc 19560
cctggaaggc atcacagatt tccaggggag cactgagacc aaacaggatt cacctgttat 19620
ctttgaggcc tcaggtaaaa tctccccatc ctaggcttcc tccacaggaa cagccccgtt 19680
cccagttcta tctacccacg cctgcccccc cccccccccg gtctggcgtt gtccatccaa 19740
cattacttct gtatgctgcc cttctcccca gtggacttgg tacagattcc ccaggcagag 19800
gcgttgctcc atgctgactg cagcgggaag gcagtgacct gcgagatctc caagtatttc 19860
ctccaggcca gacaagaggc cacttttgag aaagcacatt ggttcatcag caacatgcag 19920
gtttctagag gtggccccag tgtctccatg gtgatgaaga ctctaagaga tgctgaagtt 19980
ggagctgtcc ggcaccctac actgaaccta cctctgagtg cccagggcac agtgaagact 20040
caaggtgaga aaacaaaatg cagtggcaca ggaacatttt gtattattgt gtgtgtgtgt 20100
gtgtgtgcgc gtccatgcgc acatacgtgt gcacatgcca cagcacatag gtagagatca 20160
gaggacagct tatagaacct accatgtggt ttccagggat tgaactagtt cactatgctt 20220
ggcagcaagc actttatgca ctatgccatc tcaatagccc caagatagtt ttttggtttt 20280
ttggttttgg tttttttttt tttttggggg gggggttgtt gtttttttaa tttgtttttt 20340
gtttgtttgg ttggtttgtt ggttggtatt ttgttttctt ttgtggttag agatgggata 20400
gaaggaagaa aacaaatatc ccacaggtcc tcctgaggta cccatagagc ttcatctttt 20460
ctttctaaaa tatcctgagt caagaagagg ggatgctagg agatccttat tcgagcaagc 20520
atcaaaacat aataatcatc aggtattttc tccaaagtgg ggaagcaaca catgaggaca 20580
ctgtagctac acatgtcact acactcttat ttagccaaac tcatgtttcc tcccagggag 20640
agggagtctg gtctggtgct tcatggcaat tacagcagag cacagggaga aagaagtgct 20700
cagtagctct tactagtgag cccattcctc attctctccc acttagtacc tcctaccagg 20760
ttcaaaacca agaggaaaca tattgacagg cacctggaga gtccagttca ttattttgcc 20820
tccaaaaagg agaaaatcaa gtccacagaa gatgacgatg agggggcccc tctcctatcc 20880
ctgcaaaccc ctaaaacatt agcctttagt attatgttgt cccatactga ggatagaacc 20940
tagagccttg tgctaaacac gagctctact actaaactac agcttcaatt cctttttcag 21000
ttttattgtg aaacaggggt ctcacccaga tgccctggca ggcctggaaa cttgtgattc 21060
tgtcatgcct ccttagtagc tgatggtaca ggcatatact accacaccct ccggctctac 21120
agtcctttct gaatgtgcct tgccacatca gaaaagatgt tcagcatctc ctatccttgg 21180
ccatgggtag tttagtgctt ctcccttttt gaacttattc agatctacaa ataaatgaaa 21240
caacataccc ccacccagcc gtgacttatt tctgacctat ttcgtcagct gtcatagttc 21300
ctctctaccc gactaacata gatatcctcc cctggactga ctaggctgta gggaccacaa 21360
cacttcaccc ccaaatgctc ccatgtgcag ttagggctga tagctgaaag tcaaggccac 21420
tctgcttcac aataaccaag gatcccaaaa gcctatcaag gctggggagt gctctactca 21480
cagtaacaag ggtccagtgc acacaggact taacagtatt tcattcatgg aaagacgtga 21540
ctattgaagc tggacgtact gtccacatct gcagtccttg cacttggagg gactgaacca 21600
cgaagattgt gggtttaggc tctcatgtgt gccttgctgc accattaatt tatggctcca 21660
ctggacagga aatgaactca gtaccactgt ccagggaagg gagccggagc tgtctgtcca 21720
tggctcagag gccaggtgac cttaaggaag aaacagtctg taagtcaccc tttctttctc 21780
tctacagtgg agttccaggt gacatcagag acccaaaccc tgaaccacct gctggggtcc 21840
tctgtctccc tgcactgcag tttc 21864
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcagactcaa gtaccagtga aggg 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tagtgcctct ctgggcagct ctt 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cctattacag cccaaagatc cct 23
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agcactcccc agccttgata g 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
catgaggtag ctggtaggac ct 22
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctttgttgag gggctcagag gat 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccaaatgctc ccatgtgcag t 21
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acctggaact ccactgtaga gag 23
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tcttatcatg tctggatccg gg 22
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgtcaaagag agaatgtcaa aggtc 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cagtgactcg gtacaagcag ttg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gtcacagtcc ttcacgagga atg 23
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaagatgggt gggctgaatg ag 22
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gggacaaatt ccttcttggc atc 23
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aactgcacag tcactgccaa tg 22
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaaacagaca gagcgagtca caag 24
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caagugugua agacga 16
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ucuggucagu cagcgug 17
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggacacagaa agatgccttg tt 22
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
actaaggact tcccctgggc t 21
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
caggaggttc ccctaccttt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cttggttccc catctccaac 20
<210> 45
<211> 15858
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gtgaggaccc tatccatgtg tgtaatatct caagttctgt gtgtctccat tgctcagtga 60
aggaagaatg tgggcacacg tccggtagat aagggggtgc tgtatcatgc caggggcaca 120
tggtaacatg aagcttacct gaagctacat ggatgggatg gtttagccca gaatccctgc 180
agaggctggc ccttttcctg ggctatccaa gggccctcaa cattgctgct ccttcagggg 240
acccatctca gtcacctgta ctgcctgact tgggctagac ccttccggtt ccagaatcac 300
tggctctaga gactcacatg catgtccctg tacggacatc tcgatataaa caagcatggg 360
tgtccaccaa cctaaaaatg taggggaatc caagcttccg aaggcctgga atgtgtccgc 420
catcactttg tgctgaggca gctgggaccg tcttcctttc gctgcattgc actgcactgt 480
tgctcaatgg atctccaggt tccctgcagc tctgctcagt agctgccttc ccagggcatg 540
gctaccttcc tcctctctgc ttgccagccc agatccatcc ctacccatcc ctgcccacgc 600
cacaagaaag agatgacaac tctgtttgta gaacaaagaa cactggagtc aggggtggga 660
actttgaaca tttcacatca cgggaccatt cataaaaggc tgttctgcaa cctcggtggc 720
cccacaatgg ggtctgagct ggatcatgag atgcttgact cctctgcagg gcatatgaga 780
cagctttctc tcctggttct gaaatggact cctggcatca tgcagagtga catggaccgg 840
gaaactgcct atggcttctt catgctgggt agcctgtaca taatgtaggg tcgagcctcg 900
tgtgtagact gctggggacc caggcaactg tggcttgcag gtcctgctgc tggtatgagg 960
gcagtgttgg cttccagctt gttctgggct tgtgctatag gcctctacat ggaccagtta 1020
aaactggact ggacatggaa ttggtgcctg aggcagccag tacagaaggc cctaatgaag 1080
caaggctgtc aggactggct ggggctgaag actgggacat taaaacctga cccttcagaa 1140
agaaaaagaa acattctgca aggtttcctt ggatttaaaa gtcatcatga gggctgagag 1200
ctttaggagc cttcctggaa ctgggtgatg ctcccagagg cagcagcctc acactgaaag 1260
gtagctagct aggagctagc ttagttaagg gatcctataa gaagagttgt gctgagggag 1320
agttgaagaa aagtaggaaa ttcccaaaat tgagcttctt ggaagctagt tgggaatagt 1380
actcctgccc cttggcaact agcatctcct accccgcccc tccccatggg aggcagcagc 1440
ctctcacccc atgagagttg gtacacagtc actctgttgt cacaacaact gtcatttaag 1500
caaataatct aggtgcttgc gaatggttcc ctctagcaca ggaactcata cctgcttcct 1560
aagactgtga tcatgaccca aggatccgtc gttacaagat ggttaaagag gaatttagac 1620
acagtgcacc ccagggaata ggggtggctg tttctgtgtc ctttgctgaa ctcattgtgc 1680
tgctaagtat gcaaagatgg cagtaagcag aagggctgcg cgctgccggt cccttctctc 1740
tgtgattgag gtctagccaa cctcaagaag ctatagccat gtttactttc aaacgctacc 1800
tcagagtttc caagctatgt gacagccaca gcccaaacat tctcagggca ggcccgggca 1860
gtgtctgggt ggggtctggg agtcacagga ggggcccaga gccaagcgga gcctgaggtg 1920
gagggaggga gggctgggtg gggctggacc tgtgtacaca accacaccta ctatcgggga 1980
gtagctgtgt ccagtcactg agcagaggcc aactagtgtt tcttcatctc cctgggaaaa 2040
gcagcagaca ggatggcctg gtggaaagcc tgggtaagtt gaaatggtct ggggagatgg 2100
gtccctagtc cttgttggga gtgtggagga cacaaaaagt aaagctgaac ctgcgaggcc 2160
aagtcccggt gaggaaactg ggagaaaaac cctgtccacg cttagaaaag ttaaggtttg 2220
aaaggtaaga cagttaaaaa taaaacaaga acattttttt ttttaatttt taactgcaaa 2280
gagaaagcta aaggattcga gtgtccagag ggagacttct gtaggggaaa agctacttta 2340
gtgcctctgt ggatatgtgc aatgtgtgag tttgtgcttg gagagactct agcaggctgc 2400
tccttgcaga agtagcagtg tgtgaaaggc gctagggggc ccaggaagtt gactttggaa 2460
aacattgccc tgtttgagca tttgaatgtt cagatgggtt ggatctaggt ctggagagga 2520
tcccggatgg aaggaacatc gagggacttg aatgacaggc taaggggttg gagctcgact 2580
tccaaacagt acggagccac ctctacccac atgtacagcc gaaacacctc atgggcaggc 2640
acacggctac atgtgctatg caccttcctc gtcccagctg gggcactcaa agagggaaaa 2700
gctgaggttc tgggacacca ggtagcttgc tcaggtccct cggacagctt agactagaga 2760
aagcccaaag tctctgcaca gtctccgggc tccttatagg cagaagatcc aagttggccc 2820
agcttcagga aaatctttgt tgctgtgcca ccacccagag agaagctgta ggtgtagatg 2880
ccccgggaag gggggggggg cgtctctgga cagataggac agactagaag gcaggaagag 2940
atgagctatc atcctgaccc tcaggagaaa gcagcccgag cagtggctgt gcatagcttc 3000
acagcagctg ctggcaatac gccttgtgca ggtgcacaca gcagggctct gagtgttggg 3060
cagttcctgc agtcagatgc tggccaaaat agcctgattc taggccctgc actccatagg 3120
gcaggggcag gggccatcct cttggggacc tgattggatt ggttggtact ctcagaacct 3180
tctgtatgga tggggacact cctgtcggca tctctcacca ctgtcactgg aacctcacag 3240
caagtctgta ggatgggtgg ctttacacac aagggtggaa atggagactc cagtaccaca 3300
gctgccacac tagtaagggt ttaggtctgg gcagcctggg tccggatgca ctcagtcatc 3360
cagcatctct gacccttggg agagcagact cagggcagca aggcttctgt atctgtccag 3420
gctgccagtg aggaccaaat gtcccctgag tacaaagttg gattaaatac aggactggag 3480
aggtcaaaag agtgacagag agtgcctgtc ttcaaaacag gttccccctt tgtggtgaag 3540
agatcagaca aaagtatgcc agatcctgca tgcccatgac agacggtgtt ctagacatag 3600
catccaaaat tgcctgaatt gcctttttcc tgggtgtgtg atggtctgga atcactggcc 3660
tcagggtagc tccatcagaa gcctgaggct gacatggaag ctgggataga tgcctcctaa 3720
tctccactct aggcagtgtc ccatccttgg cacccagaac gctgatctct ttctatagaa 3780
ccttagcaag ggaagagaga caggcttctc aatgtggtga tatctgagcc acccctggag 3840
ctgctgacaa atacaggtcc cagaatggta tgggggacac tcctcaatga ctaagtttct 3900
gacacttctt tgggtcaggc agagaaacta ggaagtgaga acttaaatgc tgcccacccc 3960
acacccctca gaaaacccac atgtctatgg gtgaggctct ctgcagtgaa acattccaat 4020
aaaacccagt gtctggaaaa gtgtgaatca tctgaagagt gggggaggta gacagagctc 4080
aggttgtgaa ccaggctgtg ggtgaagtgc cagcttacta gccaagccac caagcccagg 4140
ctcctaatac gactgctgga gaaggtggca ggctgagcaa catgcttaac gcactttaca 4200
gagaatgctc aagtagactt ctagtagtag cagtgtgtga cctcagaagc aaggagtgtg 4260
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tggcagcatt tggctcactg gagaaacttt 4320
ccctaggaat tatttctaac agttcctgtt ataaagcatg gtgcaataaa tgggaaggga 4380
aactctattt ttggacacgt gaaaatcaac caaaggacac agaaagatgc cttgttcctt 4440
tctcagaagc aggaccctta tggaggtggg gacctgttgt gtatttccag ggtctagcct 4500
gaggcttgag gggacagaca atgagtgtag ggagaaaagg aaagataggt ggagggtgct 4560
tgagaagaaa ctaagagaaa aggaggcaaa cgggggagga gaggagacgg aaagaaggaa 4620
gccggacgaa ggggaagggc aggcaggtgg gtgtaaggac cctgcagcct gggtagagaa 4680
ttggtgaatg gttgggcgaa cgtgtgaggt ggaaagcagg tgggtggatg gggaacaaca 4740
gaagagctgt gtgagcaggt gggtgaacga ccagaggggt tcgactaaac tctccatctg 4800
aaggaaccag gtctcccctc aaccctaccc ctagttcccc ccactcttca ccacccctcc 4860
ccctaaaaca cacagggtcc tgcatcctaa gcatctgata aattatgcgg agcacacaga 4920
taagtggcct ttacactggc cccgcctact gcgactatag agatatcaac cactttgtac 4980
aagaaagctg ggtgtcgaca agcttgatat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt 5040
attaacttta aataatgcca attatttaaa gttactcgac gcggtacccc cggatccaga 5100
catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg 5160
ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa 5220
acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga 5280
ggttttttaa agcaagtaaa acctctacag atgtgatatg gctgattatg atcattactt 5340
atctagagct tagatccggg gggtgggcga agaactccag catgagatcc ccgcgctgga 5400
ggatcatcca gccggcgtcc cggaaaacga ttccgaagcc caacctttca tagaaggcgg 5460
cggtggaatc gaaatctcgt gatggcaggt tgggcgtcgc ttggtcggtc atttcgaacc 5520
ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 5580
gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 5640
agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5700
acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5760
gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag 5820
ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5880
ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5940
agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 6000
aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 6060
ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag 6120
ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt 6180
gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc 6240
gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc 6300
tgcgtgcaat ccatcttgtt caatggccga tcccatggtt tagttcctca ccttgtcgta 6360
ttatactatg ccgatatact atgccgatga ttaattgtca acaggctgca ggtcgaaagg 6420
cccggagatg aggaagagga gaacagcgcg gcagacgtgc gcttttgaag cgtgcagaat 6480
gccgggcctc cggaggacct tcgggcgccc gccccgcccc tgagcccgcc cctgagcccg 6540
cccccggacc caccccttcc cagcctctga gcccagaaag cgaaggagca aagctgctat 6600
tggccgctgc cccaaaggcc tacccgcttc cattgctcag cggtgctgtc catctgcacg 6660
agactagtga gacgtgctac ttccatttgt cacgtcctgc acgacgcgag ctgcggggcg 6720
ggggggaact tcctgactag gggaggagta gaaggtggcg cgaaggggcc accaaagaac 6780
ggagccggtt ggcgcctacc ggtggatgtg gaatgtgtgc gaggccagag gccacttgtg 6840
tagcgccaag tgcccagcgg ggctgctaaa gcgcatgctc cagactgcct tgggaaaagc 6900
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aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 7140
ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta tggctgatta 7200
tgatcctcta gagtcgcaga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 7260
acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 7320
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tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt 7440
ggtatggctg attatgatcc tctagagtcg cagatccaga catgataaga tacattgatg 7500
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acctctacaa atgtggtatg gctgattatg atcctctaga gtcgcagatc ctctagagtc 7740
gcagatctgc aagctttcat ttattcatcg cgggcctacg tggcctcaca ctttcctctt 7800
cttcttagga ccggcgccgc tagcggagtc catcagccta gagttggctc ccacagacac 7860
tcctcccctc ctcaggtatc tcatcagtgt ctcaggcttt ttccaggtgc cctcctgcat 7920
gatctccacc atggacactt gcttctcagc catgtcgatg gcagctccca ctctagcaga 7980
gtggccggtc caggtccggt agcggccctt gttaggggtg gcatccctct tgttcagcag 8040
cacccaggca tcgctaaaaa tcttctccat ggcaggggcg gtcagagggg tggtggtgat 8100
cctagccttg ttgctccggt ggataggagg gaacagcaca gcgtcagggt gctctctcag 8160
gccagacaca tccagccagt cattcagcac agcggtggtc ctcctagaca gcactttgtc 8220
caggccagca gcggtggtga tggtcttggt gtgggagatg tgcagggtca cggtgtctcc 8280
ggtctggtcc aggtctccca ctctgatcct agagatctca gacatcctca tcagggtgtt 8340
gtaggccaca aacaggaagg ccctattcct caggtccacc agtctctcag atctagacag 8400
cagcacatcc agcagcttca ggtcatccca tctcagaggg atggcctggc cggttctctc 8460
tcccttctcg gtggcagcct ctctccggat tctcctcatg gccaggctca cagacttgtc 8520
atcagacaga ggaggcaggc cacagtggga cagcagcatg ttcagcatgg cgtagtgctt 8580
gtcgatggtg gtagaggcca ggtcagcatc gtgcagctga aggaagtact ccctagccat 8640
ctcaggagag atagggaacc aggccagctg tctagcgtgg caccatctag cccaggagtg 8700
gaacaccagc ctcaggtctc tcagggtgtt aggggcgtag gctccctggt cattcatgaa 8760
tctcatgaag ttctcagcag cctcctggta ctccttgccg atgttcctca ggaatcctcc 8820
agaggagcca gagatgatca gctcgctagc acccatggtg gcggcgcgcc gctggcttgg 8880
ccgggagctg gctcagagca ggggacacca cctgggtcga gccagccaac ctgtgagcag 8940
gtggaatttt gtgggctgtg gcctgggagc cagcaccctc ttcctcttat agatactagt 9000
ggcccctagg aattatgaag tcaaagagga ccaggacctc acagaccatg gccagtgagg 9060
acctgtacca tgtccaaata tgggcatgag aggggtgggc agggctttgg catcaggagt 9120
tgcttgtgtc acagtcaaga agtgacaaag atggcatcca cttgagtgtt cagttagtca 9180
ctcagcttag gtgttaagtg ccacacacct gcttctaggc taggtcctga tagataaccc 9240
aaggccaggc aggtgggtga aacagccaca tggatttgaa ctgtgaaaag cacacatctt 9300
cagactgctc agagaatgct gctgagggaa cttgaccttt taagaaatta tccaacgccc 9360
cagtgaggca ctgacagaca aatccagagg gtctcagagt tgcagggggg tgggctctag 9420
taaaacattg aggccccatc aagtgcttca ggtataaatg ggagccacat ggatgcagag 9480
cagtgtttgg actgagggag gtgttggaca ttactagaca gaaggtggac gtgggtgctg 9540
ctactggccc ctgctcccag cctgagaggg aagctgaaag gtggacagga aacagaggga 9600
ggctcaggag gtgagtgggg cagcaacaag gaattggctg aggtggagtg ggacctcacg 9660
gtgcccccat gaacttttgg tgtatagagg attgcagttc atattagact tggcatctgg 9720
tcaagagaag tagtatagga tgaagaggct ttgttgtgct ttctgccaac cagagaggcc 9780
caccatgtcc tgaggataca caggtaggca gaagggtgat aggcaccttt tttttggggg 9840
ggttaattaa taactttaaa taatgccaat tatttaaagt taatcacgcg tagatctgca 9900
tgcgttccgg cgccagcctg cttttttgta caaacttgtt gatatcgtgg tatcgttatg 9960
cgccttaata ttctggattg caagtgtgta agacgagggt ctgggtactt tggttatcaa 10020
gtttattcca taatccatag aatatccatc ctacagttct ctctaaactt aaccctctgc 10080
ccaatacgat cccatggtct tgcaaaccac ctgagctttg gggatgctca gcgtgtctcc 10140
tggccctctg aaatagccac acctcaccac aggaaagacc agaataggct tagaaccttc 10200
ctcacaagaa aaaaaaaatg tccagatgcc acatccagac acaaagccac tccttgtgag 10260
tttatttcca cccattctgc tgtacacggt gcggatgaga actgtgtgtg accagtccgc 10320
tatctgccct cagccaacag gtaatttctt tttataagct ctggtcccag ctgcaccagt 10380
ctattagttg gagcacccag tcacaccctg caaggctcca tctggtctca gagcccaggg 10440
gaagtcctta gtttaacaaa gtagactaca tggtaagcca ggaggttccc ctacctttcc 10500
tgtattttcc atcatgagca gacctgtttg tcttgcaggt tgaacaggag ggcgtcagcg 10560
tgaagggtag ttctcatttc aacccagacc ctgatgcaga gaccctctac aaagccatga 10620
aggggattgg tgagttacca cccatggcct ggccgctggg gcctcacatc ccacatcctc 10680
agaaagtgga tgccagggac agtcaggcat agacggggcc cccattttac taagtgactt 10740
agttacttac agcatcacac cggctctgag ttgagtggct gttccttccc aagtgacaat 10800
gacagggaag gccatcatta atctgaagtt tctcacttgt aaaacggctg ccaggactct 10860
ggactcgata gttctcttct gcttcataaa cacacacttc ccaatccatc aggggaagat 10920
ggattggcac caggcccact gtgggcatgg gatgggagtt taggtgtggc actgaggcca 10980
gggcgatcag ccacatggat cctgcagctt gtcctctacc ccacgctgac tgaccagaca 11040
gtcagctgct tcccgctcta gaactagtgg atcccctcga gggacctaat aacttcgtat 11100
agcatacatt atacgaagtt atattaaggg ttattgaata tgatcggaat tgggctgccc 11160
atacctcaca tgagcgtgag tgggaaggga ccggtttacc ctaggatttg gtctcgctcc 11220
aggtaggagt catctctcag ctggctctgc ccagtgagtc aggacactaa agagaactgc 11280
cgtgcccaaa ggggcctaga ctgcatcctc atacccactg tttccatgaa aactttactg 11340
ttatccccac ttctaatata agcaaatgca ggctccagga aatgagcctt ctcgtccatg 11400
acatacaagg cagactctca gacccaatgg tctagaattc gctgtgatat tcctctaatg 11460
tgaccaacac aagggaaaga cttaaaatat ctcccttggg catgcttcaa aggtccacag 11520
ttgttgtcca aagctccctg cccttggttg ctatgctatg aagtcaagcc tgagccatac 11580
ccaacactat gtaagttgga gatggggaac caagaggtgc actacctgga tgccttgttt 11640
acaccatgga aattggacgt ttgcagctcg ccccccttca gtcttttctg atgccccccc 11700
ccagaggtag aagggattct catactgtac actcctacag gaaccaatga gcaggccatc 11760
atagacgtgc tcaccaagag gagcaatgtg cagaggcagc agattgccaa gtccttcaag 11820
gctcaatttg gaaaggtaag caggttgggt gccaaagacc aggcagttcc tcccagaatg 11880
gaaatgtgta catagggcat attgcattaa aacaatactt ccattcatct gtggtcaagt 11940
ttctctggct gttctggttt tttgtttgtt tgtttgtttg tttgcttttt tggttttttg 12000
gttttttggt ttttttttgt ttttttgttt ttttttctgc aagagccatt tatagctccc 12060
aagccccagc atgacattag ccttgcatgg tctagcccca tttcttccct gttctctctc 12120
cagctttgct gtcccactac ctgaactgac cttccatatc cctgctccct ggcaacacct 12180
ggctcccttc tgtttcacag cacaggcaca tgcttctcac aggggagtta cttgtgtgtt 12240
cctctcctgc ctgtggatac tctaggggca ctttggctgc tcccagccct tagcacagaa 12300
ccagaggcgc acagtgaatg ccagaggttt gtgcataggc atgtgggtgc ctagagtctc 12360
cccatttgct cacagattta acacaaaagc atcagtgatg aagtttagtg aagccatatg 12420
taactccttt cccctccaag ctacacatta tcctccgagt tcaacatcag aaaggttgag 12480
taatttccta aggctccaga gctcttaagt gacagtctga cagccctgta caaatcagct 12540
gggtgtgacc tagtggcttc ttgtagttgt gtgtgccctc aggaagagtc aggttgagac 12600
agaatcttgg aatctctttc tttctttccc ttcctcctct ctctccaacc ccctctttcc 12660
ctctcctcac tgaatcatgt aataagttaa gcatggagct gccaccctcc gatcttgcag 12720
tcccgaaagc aatggcaatc ctattttcct gagtttagaa tgtgcccagt actggactgt 12780
gtgctgagct gtcacatgtc tgtgtcatca caccaacagg acagagtcca tgtgggaagg 12840
aagaaagagt ccccaggcca gccttaacca cctgcctgca ctgcagtggg cttagaagat 12900
aagtcatctc gacctttctt tctgcctgtc ttaggacctc actgagacct taaagtcaga 12960
gctgagtggc aaatttgaga gactcatcgt ggccctcatg tacccgccat acagctacga 13020
ggccaaggag ctgcacgatg ccatgaaggt actccacttt gccataaatc agagtggcca 13080
cctgggcctg actgacctaa tgagcttgca acctgctcca acagccgccc agcagtgggg 13140
ctgaccagtc acaataaagg tctagatcag tacttcttag aatagggttg gaccagcagg 13200
agtgcagggg aatcggaaat ccatctctgc agtctgagca ctgccccttg gccatccttt 13260
gcttcatcat tcctgttact ctcacagatt aggtggtact ggagacccag aagccacaac 13320
atccccacta aaaggatact cagtacagtc tatgccaggc attttacagc tgtgacctct 13380
aaggccacct tcagggtagg cttgcctcat tatcctcact aacagatggc agtgcttaag 13440
ggtgggaagg tggagccacc taggtgagac cacccagcta aggaaagaga gctgaggtag 13500
cttacagcat tagctgtcct aagaaacaat ggtggggatt caatatcacc ctccaacaga 13560
agagggcaga agaggcagtg gccatagctt cttagaagat agggcaggcg gagcaggaga 13620
ccaagggcag agcactccag aacacagagg tctctgtccc cagggcttag gaaccaaaga 13680
aggagtcatc attgagatcc tagcttctcg gaccaagaac cagctgagag agataatgaa 13740
ggcatatgag gaaggtaagg ggttgcaaag atggtggggt ggaaacctag acatggccta 13800
cgttttggca acctgatagg gaaaaggagt caggcagttc ccaagggaac tcaaccagag 13860
tggaaaggag cctttggaag gtcttctgag ataaagtcca actagtgccc acgggtgcca 13920
aatcctgtac ccaacagtaa ttgagcatgg ctcagacatg gggagagtga tgtgtgccca 13980
gatgagctca tgtcccttaa tgctgtggca gtgctgggga cgggggcagc agtgggcaag 14040
agtacttgtt ggctgcacat gggttgaccc agaacactag agagggtcat ctgccagggc 14100
cccattatgc taggggagcc ccactggctt actctcctat atagtgccta gccttccagg 14160
caagcaaagg ccagccagtc ctccatgttg tgcttctggc caagggagtc taaaggctct 14220
ggctttgctc aacttggcaa tgaaatagtc tcagtctgca ggctctggtc tggctctctg 14280
gcctgatcta tttctctctc tagcttggtt gcacatttat gtcaacatct gaatgattac 14340
ctagctagat gtctgccaat ttggacatct aaatggggtg tacaccttct gtaccaagaa 14400
cttgtccgcc cgttgggaga agtgtgggaa gcaggtctgg aggaaggaag tggaccctga 14460
caggccctgg gtcactcact gtccattacc tctggttctg tttttctgca gactatggat 14520
ctaccctgga agaagacatc caaggagaca cgagtggcta tctggagcgg attctggtgt 14580
gtctcctgca ggtaacacaa tccagattcc agaactctgt ggcttaaaga tccaaagaga 14640
gccatcccag cacagccctt gagtcatgac tcccagtgag ggctgggcta tggggaaacc 14700
cagcgatctg gaagcaccat ctgtgtgtca gcacaaaagg agggtcctcc ctgagagcct 14760
catgcctctc tttccttatc ctagtgggct ctgctcacta gtgtggctca ctgaatccac 14820
cattccaatg aagtagctca tctactttcg tggtacaaat gccaacagtg aggcatggtg 14880
aggatggctg ctggcttgca ggtctcatgg atcagaagca atagtctttt cctacctgcc 14940
ctctgtaccc cactgtcccc tcagcccagt gttctgagtc ctgacctgcc ttacagagtg 15000
attttctctg atcctagggc agcagagatg atgtgagcgg ctttgtggat ccaggactgg 15060
tcctccaaga tgcacaggta aaacggtacc ttgaccttac cacctgaact ctgagcttta 15120
tgatcccctt tgccaaggag agctttcttt aatatagacc cgtctctgca gcctccacca 15180
tgtgttgact aaggaggaaa gcaggatatc tgggaaactc aatggaagaa aaggaaaaat 15240
ggagaagctg ggaagggagg agctaaggct gtcaggcaga gcgagcctcc ctgagcccag 15300
agcttgctca tgtgcacatc tctgtgtatc tattggtaga gtgcttgtta ctcagtgctc 15360
ccagagacaa tgggggaagg agaattttct aaagaagctg atggcccagg acagaggaga 15420
gccaacacta ttagaggaac aggagttcag gacagtgagc caccatgtta ggctcactga 15480
tggtgagcta gaattctctc tcacctccac ctcctcctgt cccaattcta ggccctgcat 15540
gaagcgggtg agaagattat gggaaccgat gagatgaagt tcatcactat cctgtgcaca 15600
cgcagtgcca ctcacctgat gagaggtaca gggcagaagt gggacacgca ggggtgtgtg 15660
gctgccctag ccacgtggcc tctgcctttg tgtggaaggt ctgatgtgta gtcttaagca 15720
gcttagactt ggggagagag ccatggagac cttgactctt ccccatgtgc caagatggag 15780
gcagaaatgt gctcatactg cactcaggtg cagcgcgtaa tctacgtatc ccttacgtgg 15840
atgcttctct ccatagtg 15858
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cctaagtaaa cttctgccag cctc 24
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cacccagctt tcttgtacaa agtg 24
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atgggatggg agtttaggtg tg 22
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aaacagtggg tatgaggatg cag 23
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gagtgttacc tcagtgactc caggc 25
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
catagggata gagggaggag gt 22
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtgggttcat tgacatcact tg 22
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtgtgtgatg atgggtcagg 20
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ccatgtccat agcacatctt gg 22
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gagggtgact gaggctttaa g 21
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acacacactt cccaatccat cag 23
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gtgggtatga ggatgcagtc tagg 24
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tctccatctg aaggaaccag gtc 23
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
tcttatcatg tctggatccg gg 22
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tctccatctg aaggaaccag gtc 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
atcgtattgg gcagagggtt aag 23
Claims (16)
1.一种应用CRISPR/Cas9系统基因打靶的方法，其特征在于基于CRISPR/Cas9系统，选择具有DNA单链切割能力的Cas9的突变体，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA，Cas9的突变体识别打靶位点附近的保守的间隔相邻基序，产生DNA单链切口，而不产生DNA双链断裂，诱导单链切口同源重组修复。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述基因打靶包括基因敲除、基因敲入。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述Cas9的突变体选自Cas9n D10A和/或H840A。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于针对每个靶基因设计至少2个打靶位点，每个打靶位点的间隔不小于100bp。
5.一种应用CRISPR/Cas9系统制备基因打靶ES细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)根据基因打靶的类型和靶基因选择合适的打靶位点，设计同源DNA供体和鉴定方案；
(2)采用权利要求1-4任一项所述的方法，制备Cas9的突变体或其表达载体，根据靶基因和打靶位点设计并制备sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体或各自的表达载体；
或者，制备Cas9的突变体、sgRNA或者crRNA和tracrRNA的共表达载体；
(3)将步骤(1)制备得到的Cas9的突变体、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体转染入ES细胞，根据基因打靶的类型选择同时转染同源DNA模板使打靶位点发生碱基删除或将外源DNA插入到基因组；
(4)提取ES细胞DNA进行PCR鉴定和/或Southern Blot检测与核型鉴定，鉴定通过的克隆即为基因打靶阳性ES细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤(2)还包括进一步检测制得的sgRNA或者crRNA和tracrRNA二元复合体的切割效率。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述检测包括核酸内切酶检测法、SSA报告载体检测法、Sanger测序法、Digenome-Seq技术。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述核酸内切酶选自SURVEYOR酶、T7EN1酶。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于将野生型Cas9蛋白、sgRNA或者tracrRNA/crRNA二元复合体，或者各自的表达载体或共表达载体转染ES细胞，提取细胞基因组并用特异引物扩增目标切割区域，对获得的PCR产物进行T7EN1酶切，酶切后进行电泳检测，检测结果显示比对照组多出一条或多条条带的视为有效切割，或者对获得的PCR产物进行Sanger测序，测序结果比对显示，sgRNA区域出现双峰视为有效切割；筛选出高效sgRNA或crRNA和tracrRNA。
10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于所述转染ES细胞的方法包括病毒转染、脂质体转染、电转染。
11.一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法，其特征在于采用权利要求5-10任一项所述的方法制备得到基因打靶阳性ES细胞注射到动物囊胚中，将囊胚分别移植到代孕母体中，进行饲养，生产出的后代即为F0代嵌合体动物，F0代性成熟后与同背景野生型动物配繁获得F1代，通过基因鉴定的阳性F1代动物即为基因打靶动物模型。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于基因打靶动物模型为哺乳动物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于基因打靶动物模型选自小鼠或大鼠。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于基因打靶动物模型为KO、CKO、KI、KOfirst、TM小鼠模型。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于基因打靶动物模型为PRKAA1-KI、CD27-KI、ANXA8-CKO动物模型。
16.一种提高基于CRISPR/Cas9系统介导ES打靶阳性克隆筛选效率的方法，其特征在于利用CRISPR/Cas9系统，选择具有DNA单链切割能力的Cas9的突变体，针对每个打靶位点使用一条tracrRNA/crRNA二元复合体或者一条sgRNA，Cas9的突变体识别打靶位点附近的保守的间隔相邻基序，产生DNA单链切口，而不产生双链断裂，诱导单链切口同源重组修复。
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