CN110951742A - 一种不产生dna双链断裂的实现植物基因替换的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种不产生DNA双链断裂的实现基因替换的方法。所述方法包括如下步骤：将sgRNA、Cas9切刻酶、供体DNA导入目的植物中；sgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；供体DNA依次包括DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和DNA片段甲靶点序列；DNA片段乙为将DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；在sgRNA引导下，Cas9切刻酶在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列处和所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列处均产生单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的DNA片段甲替换为DNA片段乙，实现植物基因替换。

Description

一种不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法。

背景技术

长链DNA模板介导的基因精确替换在细胞中的概率非常低，但是在待替换位点附近引入DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)能够明显的增加替换的概率。CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，通过切割使DNA产生DSB，从而增加长链DNA模板介导的基因精确替换效率。在产生DSB后，生物体会本能的启动DNA修复机制。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，此种修复所占的比例占大多数，修复DNA后一般会产生随机的indels(insertions ordeletions)。另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)，使用姐妹染色单体或外源DNA供体(donor)作为修复模板，实现基因的精确修复。在动物细胞中，修复的具体原理是：CtIP酶在DSB处起始末端切割，产生突出的3’端单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)尾巴，ssDNA会被重组酶Rad51识别，结合成复合物，侵入供体DNA模板，并与其同源的片段退火结合，以供体DNA作为模板，合成新的DNA链，完成修复。当供体DNA同源臂之间的序列带有外源突变时，此突变会在修复的过程中引入到DNA链中，从而实现精确定点替换。此种HDR修复起始于DSB的产生，由于NHEJ的修复概率远大于HDR，在发生了精确替换的样品中，会有较多的副产物，比如引入indels，造成DNA大片段缺失、移位等。

为了提高产物中精确HDR:非精确HDR的比例，人们尝试使用Cas9的一种失活突变体D10A，对DNA造成单链切刻(Nick)。在动物中，相比于DSB而言，单链切刻起始的HDR的副产物较少，但同时在一定程度上降低了HDR的效率。在植物中，DSB诱发的HDR在不同的基因上能够实现精确替换，但是Cas9 D10A引发的切刻能否实现HDR精确替换，其效率是否比DSB诱导的HDR低，副产物是否减少，均无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法。

本发明提供的不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法包括如下步骤：将sgRNA、Cas9切刻酶(Cas9n)或其变体、供体DNA导入目的植物中；

所述sgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；

所述供体DNA依次包括所述DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和所述DNA片段甲靶点序列；

所述DNA片段乙为将所述DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；

在所述sgRNA引导下，所述Cas9切刻酶或其变体在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列处和所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列处均产生单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的所述DNA片段甲替换为所述DNA片段乙，实现植物基因替换。

上述方法中，所述DNA片段甲可为目的植物基因组上的任意片段，将DNA片段甲上的某一个或某几个碱基突变后获得DNA片段乙，所述DNA片段乙为供体DNA上的片段。所述碱基突变可为碱基替换和/或碱基插入和/或碱基缺失。

在实际应用中，将sgRNA/Cas9n系统和两端添加有靶点对应的靶点序列的DNA片段乙即供体DNA导入目的植物后，可实现将目的植物基因组中的DNA片段甲替换为DNA片段乙，进而实现基因替换。此处基因替换可实现将基因突变位点引入目的植物基因组中，进而实现目的植物基因组上的基因突变(如碱基替换、碱基插入或碱基缺失)，从而使目的植物中表达的相应蛋白质的氨基酸功能位点和/或种类和/或活性和/或含量等发生改变，获得具有某一功能或性状的植物突变体。在本发明的具体实施例中，所述碱基突变具体可为碱基替换。

进一步的，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均可为200-2000bp或200-1500bp或200-1000bp。

更进一步的，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均为694bp。

所述DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的DNA分子。

所述DNA片段乙为序列1第10695-11388位所示的DNA分子。

在本发明的具体实施例中，所述DNA片段甲依次由大小为636bp的ALS基因片段和其下游大小为58bp的片段组成。所述DNA片段乙为将DNA片段甲第344位由碱基G突变为碱基T，且将第581位由碱基G突变为碱基T，且将第336位由碱基G突变为碱基C，且将第339位由碱基G突变为碱基C，且将第342位由碱基A突变为碱基G，且将第396位由碱基G突变为碱基C后得到的DNA分子。将水稻基因组中的DNA片段甲替换为DNA片段乙后，由于水稻基因组中的DNA片段甲第344位由碱基G突变为碱基T，且第581位由碱基G突变为碱基T，水稻中表达的ALS蛋白氨基酸序列第548位的氨基酸由酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu)，第627位的氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile)，从而产生具有除草剂抗性的精确编辑植株。

上述方法中，所述sgRNA结构如下：tRNA-所述DNA片段甲靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架；

所述tRNA为a1)或a2)或a3)：

a1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；

a2)将a1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；

所述sgRNA骨架为b1)或b2)或b3)：

b1)将序列1第571-646位中的T替换为U得到的RNA分子；

b2)将b1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述方法中，所述供体DNA依次由所述DNA片段甲靶点序列、PAM序列、DNA片段乙和所述DNA片段甲靶点序列和PAM序列组成。所述DNA片段甲靶点序列具体为ST215靶点序列；所述ST215靶点序列为序列1第551-570位。所述供体DNA具体为序列1第10672-11411位。

上述方法中，所述Cas9切刻酶可为Cas9 D10A切刻酶或Cas9 H840A切刻酶；

所述Cas9切刻酶变体包括来源于细菌的Cas9(如SaCas9、SaCas9-KKH等)，识别不同PAM的Cas9变体(如xCas9、Cas9-NG、Cas9-VQR、Cas9-VRER等)，Cas9高保真酶变体(如HypaCas9、eSpCas9(1.1)、Cas9-HF1等)等。

进一步的，所述Cas9 D10A切刻酶为SpCas9n蛋白质；

所述SpCas9n蛋白质为C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

更进一步的，所述SpCas9n蛋白质的编码基因为c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列1第2877-6977位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子。

上述方法中，所述Cas9切刻酶或其变体带有核定位信号。所述核定位信号可为BPNLS、VirD2 NLS或SV40 NLS。所述核定位信号的个数可为1个或2个或多个。

进一步的，所述核定位信号为SV40 NLS。所述SV40 NLS的氨基酸序列为序列2。所述核定位信号的个数为8个。

更进一步的，所述SV40 NLS的编码序列为序列1第2742-2762位。所述Cas9切刻酶或其变体两端分别带有4个SV40 NLS。

上述方法中，所述将sgRNA、Cas9切刻酶或其变体、供体DNA导入目的植物中的方法包括如下步骤：将转录sgRNA的DNA分子、Cas9切刻酶或其变体的编码基因和供体DNA导入目的植物中。

上述方法中，所述sgRNA为tRNA-sgRNA，转录所述tRNA-sgRNA的DNA分子转录后得到的所述tRNA-sgRNA为不成熟的RNA前体，该RNA前体中的tRNA会被两种酶(RNase P和RNaseZ)切割掉后得到成熟的RNA。一个重组表达载体中有多少个靶点，就会得到多少个独立的成熟的RNA，每个成熟的RNA依次由所述靶点序列转录的RNA和所述sgRNA骨架组成，或依次由所述靶点序列转录的RNA、所述sgRNA骨架和所述tRNA残留的个别碱基组成。在本发明的具体实施例中，所述重组表达载体中含有一个靶点。

进一步的，所述转录sgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和所述供体DNA通过重组表达载体导入目的植物中。所述转录sgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和所述供体DNA可通过同一个重组表达载体导入目的植物中，也可通过两个或者多个重组表达载体共同导入目的植物中。

在本发明的具体实施例中，所述转录sgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和所述供体DNA通过同一个重组表达载体导入目的植物中。所述重组表达载体包括依次由启动子、所述转录sgRNA的DNA分子和终止子组成的表达盒和依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和终止子组成的表达盒。

更进一步的，所述重组表达载体的核苷酸序列如序列1所示。

上述方法在植物基因编辑或制备植物突变体或提高植物基因替换效率或减少植物基因替换产生的副产物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明最后还提供了方法一或方法二或方法三或方法四：

所述方法一为一种植物基因编辑的方法；所述植物基因编辑的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，从而实现植物基因编辑。所述编辑具体可为碱基替换。

所述方法二为一种制备植物突变体的方法；所述制备植物突变体的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，获得植物突变体。所述植物突变体具体可为抗除草剂突变体。

所述方法三为一种提高植物基因替换效率的方法；所述提高植物基因替换效率的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换。所述替换效率具体可为HDR替换效率。

所述方法四为一种减少植物基因替换产生的副产物的方法；所述减少植物基因替换产生的副产物的方法包括如下步骤：按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换。所述减少植物基因替换产生的副产物具体体现在按照上述方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换得到的产物没有额外的Indels产生。

上述方法或应用中，所述植物为如下d1)-d3)中的任一种：

d1)单子叶植物或双子叶植物；

d2)禾本科植物；

d3)水稻(如日本晴)。

本发明提供的不产生DNA双链断裂的实现基因替换的方法的原理如下：Cas9 D10A切刻酶在sgRNA的引导下，在基因组ALS靶位点引发单链DNA切刻；载体上的供体DNA含有具有除草剂抗性的突变位点，同时供体DNA的5’端和3’端各含有1个靶点对应的靶点序列，在Cas9 D10A/sgRNA复合体的引导下，各产生一个切刻位点；在植物体内的修复机制下，实现供体DNA与基因组片段的精确替换，从而产生具有除草剂抗性的精确编辑植株。

本发明具有以下优点：

1、效率高：单链切刻(Nick)引发的HDR精确替换效率是DSB引发的HDR精确替换效率的2-3倍。

2、副产物少：单链切刻(Nick)引发的HDR精确替换植株中不含有随机的Indels，而DSB引发的HDR精确替换含有大量的indels。

3、成本低：本发明提供的不产生DNA双链断裂的实现基因替换的方法仅需要载体中含有Cas9n相关元件，以及对应的供体DNA，通过农杆菌侵染的方法即可实现精确替换。

本发明提供了一种不产生DNA双链断裂的实现基因替换的方法。通过实验证明：本发明提供的不产生DNA双链断裂的实现基因替换的方法在水稻中实现了对内源的乙酰乳酸合酶ALS基因的精确替换，获得具有除草剂抗性的精确编辑植株。

附图说明

图1为精确替换载体构建示意图。

图2为Nick引发的ALS精确替换工作原理示意图。

图3为DSB引发的ALS精确替换工作原理示意图。

图4为Nick引发的ALS精确替换产生的植株，特异引物扩增检测结果。

图5为DSB引发的ALS精确替换产生的植株，特异引物扩增检测结果。

图6为Nick和DSB对应的精确替换具体形式。

图7为精确替换载体构建示意图。

图8为sgRNA/Cas9n常规载体转基因植株，特异引物扩增检测结果。

图9为esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt优化载体转基因植株，特异引物扩增检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

引物对P1由引物HDR-F：5’-gcgcccgattctctatgtc-3’和引物HDR-R：5’-acctatcctccaactggacg-3’组成，用于检测植株是否发生精确替换。

引物对P2由引物gALS-F：5’-atcccagttacaaccactctg-3’和引物gALS-R：5’-cacttaactcagagctattgcatag-3’组成，用于扩增基因组ALS序列并测序。

HDR苗是指在获得的T₀苗中，含有donor带入的对应突变位点的植株。

基于T₀苗的HDR替换效率＝T₀苗中发生了精确替换的苗数/获得的T₀苗总数。

基于愈伤数量的HDR替换效率＝T₀苗中发生了精确替换的苗数/起始侵染的愈伤总数。

HDR中的indels效率＝精确替换的T₀苗中发生了indels的苗数/精确替换的T₀苗总数。

日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。

恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。

筛选培养基1：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。

筛选培养基2：含有0.4uM/L双草醚的N6固体培养基。

分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸、0.28uM/L双草醚的N6固体培养基。

下述实施例中ALS蛋白的氨基酸序列如序列表中序列6所示，其编码基因序列如序列表中序列5第1-1935位所示。

实施例1、不产生DNA双链断裂实现基因替换的载体的构建及其在水稻基因替换中的应用

一、重组表达载体的构建及替换原理说明

1、重组表达载体的构建

人工合成如下重组表达载体，各载体均为环状质粒：sgRNA/Cas9重组表达载体、sgRNA/Cas9n重组表达载体。sgRNA/Cas9重组表达载体、sgRNA/Cas9n重组表达载体的结构示意图均如图1所示。具体结构描述分别如下：

sgRNA/Cas9n重组表达载体的序列为序列表中的序列1。序列1的第131-467位为OsU3启动子序列，第474-550位为tRNA序列，第551-570位为ST215靶点序列，第571-646位为sgRNA骨架序列，第647-937位为OsU3终止子序列。序列1的第944-2657位为OsUbq3启动子序列，第2742-2762位、第2772-2792位、第2802-2822位、第2832-2852位、第6996-7016位、第7026-7046位、第7056-7076位、第7086-7106位均为核定位信号SV40的编码序列(编码序列2所示的核定位信号SV40)，第2877-6977位为SpCas9n蛋白质的编码序列(编码序列3所示的SpCas9n蛋白质)；序列1的第7122-7376位为Nos终止子序列；序列1的第7405-9397位为ZmUbi1启动子序列，第9404-10429位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，第10456-10671位为CaMV35S终止子序列。第10672-10694位、第11389-11411位均为ST215靶点靶序列(由ST215靶点序列和PAM序列组成)；第10695-11388位为ALS供体DNA序列。

sgRNA/Cas9重组表达载体的序列为将序列1中的第2877-6977位替换为序列4所示的SpCas9蛋白质的编码序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

2、重组表达载体的精确替换原理

1)sgRNA/Cas9n重组表达载体的精确替换原理

sgRNA/Cas9n重组表达载体是基于单链切刻(Nick)引导的精确替换，原理示意图如图2所示。

sgRNA/Cas9n重组表达载体包括如下元件：sgRNA、Cas9n、供体DNA。

sgRNA靶向ST215靶点靶序列。

供体DNA(donor DNA)：供体DNA依次由ST215靶点靶序列、ALS供体DNA序列和ST215靶点靶序列组成。

ALS供体DNA序列(序列1第10695-11388位)是将DNA片段甲(DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的大小为694bp的片段，其依次由大小为636bp的ALS基因片段和其下游大小为58bp的片段组成。DNA片段甲为水稻基因组上的片段。)进行突变后得到的DNA分子。突变包括功能位点突变和同义位点突变。

功能位点突变：将DNA片段甲第344位由碱基G突变为碱基T(此处碱基突变可使水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第548位的酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu))，且将第581位由碱基G突变为碱基T(此处碱基突变可使水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第627位的丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile))。水稻中的ALS蛋白氨基酸序列第548位的酪氨酸(Try)突变为亮氨酸(Leu)，且第627位的丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile)后能够抗双草醚除草剂，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第548位记作W548L功能突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第627位记作S627I功能突变位点。

同义位点突变：为了方便后期设计特异检测引物检测精确替换突变体，将DNA片段甲第336位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第545位)，且将第339位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第546位)，且将第342位由碱基A突变为碱基G(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第547位)，且将第396位由碱基G突变为碱基C(此处碱基突变对应水稻ALS蛋白氨基酸序列第565位)。此处同义位点突变不改变水稻ALS蛋白氨基酸序列上的相应氨基酸位点所对应的氨基酸，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第545位记作545同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第546位记作546同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第547位记作547同义突变位点，将水稻ALS蛋白氨基酸序列第565位记作P565同义突变位点。

Cas9n/sgRNA复合物在ST215靶点的引导下，在载体中供体donor上的靶点序列产生两个单链切刻位点，同时在水稻基因组DNA片段甲上的靶点序列产生一个单链切刻位点，将此方案记作triNicks(三个Nick)。在水稻体内的修复机制下，供体DNA在水稻基因组上的切刻位点处发生精确替换(水稻基因组上的DNA片段甲替换为ALS供体DNA)，使ALS供体DNA上的突变位点引入到水稻基因组中，获得基因替换后的植株，该基因替换后的植株具有除草剂抗性。

2)sgRNA/Cas9重组表达载体的精确替换原理

sgRNA/Cas9重组表达载体是基于DSB引导的精确替换，原理示意图如图3所示。

sgRNA/Cas9重组表达载体包括如下元件：sgRNA、Cas9、供体DNA。

sgRNA靶向ST215靶点靶序列。

供体DNA(donor DNA)：供体DNA依次由ST215靶点靶序列、ALS供体DNA序列和ST215靶点靶序列。

Cas9/sgRNA复合物在ST215靶点的引导下，在载体中供体donor上的靶点序列产生两个DSB位点，同时在水稻基因组上的靶点序列产生一个DSB位点，将此方案记作triDSBs(三个DSB)。在水稻体内的修复机制下，供体DNA在水稻基因组上的DSB位点处发生精确替换(水稻基因组上的DNA片段甲替换为ALS供体DNA)，使ALS供体DNA上的突变位点引入到水稻基因组中，获得基因替换后的植株，该基因替换后的植株具有除草剂抗性。

二、水稻阳性抗性愈伤的获得

将步骤一获得的sgRNA/Cas9n、sgRNA/Cas9重组表达载体分别按照如下步骤1-7进行操作：

1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。

2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD₆₀₀为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD₆₀₀为0.2，得到农杆菌侵染液。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。

4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。

5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。

6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基1上，28℃暗培养2周。

7、取步骤6得到的水稻愈伤，转移至筛选培养基2上，28℃暗培养4周，得到水稻抗性愈伤。

三、水稻T0苗的获得

1、取步骤1得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右。

2、将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取抗除草剂的水稻T0苗。

四、精确替换植株鉴定

1、经过含有除草剂的生根培养基筛选后，存活下来的水稻T0苗，分别提取基因组DNA并以其作为模板，采用引物HDR-F(5’-gcgcccgattctctatgtc-3’)和引物HDR-R(5’-acctatcctccaactggacg-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约833bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为发生了精确替换的阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约833bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为未发生精确替换的T0苗。

2、使用引物gALS-F(5’-atcccagttacaaccactctg-3’)和引物gALS-R(5’-cacttaactcagagctattgcatag-3’)组成的引物对，对上述步骤1筛选出的精确替换的阳性T0苗的基因组ALS基因序列进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行一代测序，分析对应位点是否确实发生了精确替换。

五、结果分析

1、水稻T0苗中引物初筛获得的精确替换植株

triNicks方案共获得32棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，32棵苗全部存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，其中有5棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图4所示。

triDSBs方案共获得23棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，仅9棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有2棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图5所示。

2、水稻T0苗中测序确认的精确替换植株及对应效率

一代测序结果显示：PCR检测结果为阳性的植株均在对应位点上发生了精确替换。因此，triNicks和triDSBs方案在T0苗中发生精确替换的概率分别是15.6％(5/32)、8.7％(2/23)。若从整体转化效率来看，以起始侵染的840块抗性愈伤为分母计算，triNicks和triDSBs方案发生精确替换的概率分别是0.6％(5/840)、0.2％(2/840)。

综上所述，triNicks方案在T0苗中的精确替换效率是triDSBs的1.8倍，若以起始侵染的愈伤为基础，triNicks方案的精确替换效率是triDSBs的3倍。说明Nick诱导的triNicks方案的精确替换效率明显高于DSB诱导的triDSBs方案。

另外，将发生了精确替换的样品的PCR扩增产物连接pEASY-B(北京全式金生物)，每个样品挑选4-6个阳性克隆测序，确认替换的具体形式，具体测序结果见图6所示。triNicks方案中的5棵T0苗在基因组中均为杂合替换突变体，在基因组中未引发额外的Indels产生，而triDSBs方案中的2棵T0苗均在基因组ST215靶点处均产生了一个碱基G的插入。说明Nick诱导的triNicks方案在基因组上产生的副产物少于DSB诱导的triDSBs方案。

对triNicks方案中发生精确替换的样品进行进一步的分析，发现不同的样品在W548、P565、S627处的替换形式不相同，有的是三个位点同时发生替换(突变形式1)，有的是在W548、P565处发生替换(突变形式2)，有的在W548、S627处发生替换(突变形式3)，有的仅在W548处发生替换(突变形式4)。各突变形式对应的效率如表1所示。

表1

实施例2、sgRNA/Cas9n重组表达载体的优化及其在水稻基因替换中的应用

一、重组表达载体的构建及替换原理说明

1、重组表达载体的构建

人工合成如下重组表达载体，各载体均为环状质粒：sgRNA/Cas9n重组表达载体、esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt重组表达载体。sgRNA/Cas9n重组表达载体、esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt重组表达载体结构示意图如图7所示。具体结构描述分别如下：

sgRNA/Cas9n重组表达载体的序列为序列表中的序列1。

esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt重组表达载体的序列为将序列1中的第571-646位替换为序列7所示的esgRNA骨架序列，且将序列1的第7107-10671位替换为序列8所示的P2A-Hpt-tNos序列，且保持其他序列不变后得到的序列。序列8第22-78位为自切割寡肽P2A的编码序列(编码序列9所示的自切割寡肽P2A)，第79-1104位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列(编码序列10所示的潮霉素磷酸转移酶)，第1111-1365位为Nos终止子序列。

2、重组表达载体的精确替换原理说明

1)sgRNA/Cas9n重组表达载体的精确替换原理

同实施例1中的sgRNA/Cas9n重组表达载体的精确替换原理。

2)esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt重组表达载体的精确替换原理

esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt重组表达载体的精确替换原理与sgRNA/Cas9n重组表达载体的精确替换原理相同，仅是将sgRNA/Cas9n重组表达载体中的sgRNA骨架替换为esgRNA骨架序列，且将sgRNA/Cas9n重组表达载体中独立的Cas9n编码基因表达盒和独立的潮霉素磷酸转移酶基因表达盒替换为由自切割寡肽P2A连接的Cas9n和潮霉素磷酸转移酶共表达的表达盒。

二、水稻阳性抗性愈伤的获得

将步骤一获得的sgRNA/Cas9n、esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt载体分别按照实施例1步骤二中的方法进行操作。

三、水稻T0苗的获得

同实施例1的步骤三。

四、精确替换植株鉴定

同实施例1的步骤四。

五、结果分析

1、水稻T0苗中引物初筛获得的精确替换植株

sgRNA/Cas9n普通载体，共获得32棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，32棵苗均存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有5棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图8所示。

esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt优化载体，共获得55棵转基因阳性苗(独立转化事件)，经过含有除草剂的生根培养基筛选后，24棵苗存活。经过HDR-F和HDR-R引物筛选后，有12棵转基因苗为精确替换植株，PCR检测结果如图9所示。

2、水稻T0苗中测序确认的精确替换植株及对应效率

一代测序结果显示：PCR检测结果为阳性的植株均在对应位点上发生了精确替换，且无额外的Indels碱基发生。因此，sgRNA/Cas9n普通载体、esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt优化载体在T0苗中发生精确替换的概率分别是15.6％(5/32)、21.8％(12/55)。若从整体转化效率来看，以起始侵染的840块抗性愈伤为分母计算，sgRNA/Cas9n普通载体、esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt优化载体发生精确替换的概率分别是0.6％(5/840)、1.4％(12/840)。

综上所述，esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt优化载体在T0苗中的精确替换效率是sgRNA/Cas9n普通载体的1.4倍，若以起始侵染的愈伤为基础，esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt优化载体的精确替换效率是sgRNA/Cas9n普通载体的2.3倍。说明esgRNA/Cas9n-P2A-Hpt优化载体比sgRNA/Cas9n普通载体的精确替换效率高。

表2

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>一种不产生DNA双链断裂的实现基因替换的方法

<160>10

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>11586

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60

ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120

ttaaggtacc gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 180

tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 240

gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt 300

aggagaaaag catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg 360

ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc 420

acatagatca aagctgattt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcgga tccaacaaag 480

caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 540

ggctggtgca atttgggtat ggtggtgcaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 600

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttttttcgtt 660

ttgcattgag ttttctccgt cgcatgtttg cagttttatt ttccgttttg cattgaaatt 720

tctccgtctc atgtttgcag cgtgttcaaa aagtacgcag ctgtatttca cttatttacg 780

gcgccacatt ttcatgccgt ttgtgccaac tatcccgagc tagtgaatac agcttggctt 840

cacacaacac tggtgacccg ctgacctgct cgtacctcgt accgtcgtac ggcacagcat 900

ttggaattaa agggtgtgat cgatactgct tgctgctaag cttacaaatt cgggtcaagg 960

cggaagccag cgcgccaccc cacgtcagca aatacggagg cgcggggttg acggcgtcac 1020

ccggtcctaa cggcgaccaa caaaccagcc agaagaaatt acagtaaaaa aaaagtaaat 1080

tgcactttga tccacctttt attacctaag tctcaatttg gatcaccctt aaacctatct 1140

tttcaatttg ggccgggttg tggtttggac taccatgaac aacttttcgt catgtctaac 1200

ttccctttca gcaaacatat gaaccatata tagaggagat cggccgtata ctagagctga 1260

tgtgtttaag gtcgttgatt gcacgagaaa aaaaaatcca aatcgcaaca atagcaaatt 1320

tatctggttc aaagtgaaaa gatatgttta aaggtagtcc aaagtaaaac ttatagataa 1380

taaaatgtgg tccaaagcgt aattcactca aaaaaaatca acgagacgtg taccaaacgg 1440

agacaaacgg catcttctcg aaatttccca accgctcgct cgcccgcctc gtcttcccgg 1500

aaaccgcggt ggtttcagcg tggcggattc tccaagcaga cggagacgtc acggcacggg 1560

actcctccca ccacccaacc gccataaata ccagccccct catctcctct cctcgcatca 1620

gctccacccc cgaaaaattt ctccccaatc tcgcgaggct ctcgtcgtcg aatcgaatcc 1680

tctcgcgtcc tcaaggtacg ctgcttctcc tctcctcgct tcgtttcgat tcgatttcgg 1740

acgggtgagg ttgttttgtt gctagatccg attggtggtt agggttgtcg atgtgattat 1800

cgtgagatgt ttaggggttg tagatctgat ggttgtgatt tgggcacggt tggttcgata 1860

ggtggaatcg tggttaggtt ttgggattgg atgttggttc tgatgattgg ggggaatttt 1920

tacggttaga tgaattgttg gatgattcga ttggggaaat cggtgtagat ctgttgggga 1980

attgtggaac tagtcatgcc tgagtgattg gtgcgatttg tagcgtgttc catcttgtag 2040

gccttgttgc gagcatgttc agatctactg ttccgctctt gattgagtta ttggtgccat 2100

gggttggtgc aaacacaggc tttaatatgt tatatctgtt ttgtgtttga tgtagatctg 2160

tagggtagtt cttcttagac atggttcaat tatgtagctt gtgcgtttcg atttgatttc 2220

atatgttcac agattagata atgatgaact cttttaatta attgtcaatg gtaaatagga 2280

agtcttgtcg ctatatctgt cataatgatc tcatgttact atctgccagt aatttatgct 2340

aagaactata ttagaatatc atgttacaat ctgtagtaat atcatgttac aatctgtagt 2400

tcatctatat aatctattgt ggtaatttct ttttactatc tgtgtgaaga ttattgccac 2460

tagttcattc tacttatttc tgaagttcag gatacgtgtg ctgttactac ctatctgaat 2520

acatgtgtga tgtgcctgtt actatctttt tgaatacatg tatgttctgt tggaatatgt 2580

ttgctgtttg atccgttgtt gtgtccttaa tcttgtgcta gttcttaccc tatctgtttg 2640

gtgattattt cttgcagtac gtaagcatgg actacaagga ccacgacggg gattacaaag 2700

accacgacat agactacaag gatgacgatg acaaaatggc accgaagaaa aaaaggaagg 2760

tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg 2820

tcggcggctc cccgaagaaa aaaaggaagg tcggaatcca tggcgttcca gctgccgaca 2880

agaagtactc catcggcctc gccatcggca ccaacagcgt cggctgggcg gtgatcaccg 2940

acgagtacaa ggtcccgtcc aagaagttca aggtcctggg caacaccgac cgccactcca 3000

tcaagaagaa cctcatcggc gccctcctct tcgactccgg cgagacggcg gaggcgaccc 3060

gcctcaagcg caccgcccgc cgccgctaca cccgccgcaa gaaccgcatc tgctacctcc 3120

aggagatctt ctccaacgag atggcgaagg tcgacgactc cttcttccac cgcctcgagg 3180

agtccttcct cgtggaggag gacaagaagc acgagcgcca ccccatcttc ggcaacatcg 3240

tcgacgaggt cgcctaccac gagaagtacc ccactatcta ccaccttcgt aagaagcttg 3300

ttgactctac tgataaggct gatcttcgtc tcatctacct tgctctcgct cacatgatca 3360

agttccgtgg tcacttcctt atcgagggtg accttaaccc tgataactcc gacgtggaca 3420

agctcttcat ccagctcgtc cagacctaca accagctctt cgaggagaac cctatcaacg 3480

cttccggtgt cgacgctaag gcgatccttt ccgctaggct ctccaagtcc aggcgtctcg 3540

agaacctcat cgcccagctc cctggtgaga agaagaacgg tcttttcggt aacctcatcg 3600

ctctctccct cggtctgacc cctaacttca agtccaactt cgacctcgct gaggacgcta 3660

agcttcagct ctccaaggat acctacgacg atgatctcga caacctcctc gctcagattg 3720

gagatcagta cgctgatctc ttccttgctg ctaagaacct ctccgatgct atcctccttt 3780

cggatatcct tagggttaac actgagatca ctaaggctcc tctttctgct tccatgatca 3840

agcgctacga cgagcaccac caggacctca ccctcctcaa ggctcttgtt cgtcagcagc 3900

tccccgagaa gtacaaggag atcttcttcg accagtccaa gaacggctac gccggttaca 3960

ttgacggtgg agctagccag gaggagttct acaagttcat caagccaatc cttgagaaga 4020

tggatggtac tgaggagctt ctcgttaagc ttaaccgtga ggacctcctt aggaagcaga 4080

ggactttcga taacggctct atccctcacc agatccacct tggtgagctt cacgccatcc 4140

ttcgtaggca ggaggacttc taccctttcc tcaaggacaa ccgtgagaag atcgagaaga 4200

tccttacttt ccgtattcct tactacgttg gtcctcttgc tcgtggtaac tcccgtttcg 4260

cttggatgac taggaagtcc gaggagacta tcaccccttg gaacttcgag gaggttgttg 4320

acaagggtgc ttccgcccag tccttcatcg agcgcatgac caacttcgac aagaacctcc 4380

ccaacgagaa ggtcctcccc aagcactccc tcctctacga gtacttcacg gtctacaacg 4440

agctcaccaa ggtcaagtac gtcaccgagg gtatgcgcaa gcctgccttc ctctccggcg 4500

agcagaagaa ggctatcgtt gacctcctct tcaagaccaa ccgcaaggtc accgtcaagc 4560

agctcaagga ggactacttc aagaagatcg agtgcttcga ctccgtcgag atcagcggcg 4620

ttgaggaccg tttcaacgct tctctcggta cctaccacga tctcctcaag atcatcaagg 4680

acaaggactt cctcgacaac gaggagaacg aggacatcct cgaggacatc gtcctcactc 4740

ttactctctt cgaggatagg gagatgatcg aggagaggct caagacttac gctcatctct 4800

tcgatgacaa ggttatgaag cagctcaagc gtcgccgtta caccggttgg ggtaggctct 4860

cccgcaagct catcaacggt atcagggata agcagagcgg caagactatc ctcgacttcc 4920

tcaagtctga tggtttcgct aacaggaact tcatgcagct catccacgat gactctctta 4980

ccttcaagga ggatattcag aaggctcagg tgtccggtca gggcgactct ctccacgagc 5040

acattgctaa ccttgctggt tcccctgcta tcaagaaggg catccttcag actgttaagg 5100

ttgtcgatga gcttgtcaag gttatgggtc gtcacaagcc tgagaacatc gtcatcgaga 5160

tggctcgtga gaaccagact acccagaagg gtcagaagaa ctcgagggag cgcatgaaga 5220

ggattgagga gggtatcaag gagcttggtt ctcagatcct taaggagcac cctgtcgaga 5280

acacccagct ccagaacgag aagctctacc tctactacct ccagaacggt agggatatgt 5340

acgttgacca ggagctcgac atcaacaggc tttctgacta cgacgtcgac cacattgttc 5400

ctcagtcttt ccttaaggat gactccatcg acaacaaggt cctcacgagg tccgacaaga 5460

acaggggtaa gtcggacaac gtcccttccg aggaggttgt caagaagatg aagaactact 5520

ggaggcagct tctcaacgct aagctcatta cccagaggaa gttcgacaac ctcacgaagg 5580

ctgagagggg tggcctttcc gagcttgaca aggctggttt catcaagagg cagcttgttg 5640

agacgaggca gattaccaag cacgttgctc agatcctcga ttctaggatg aacaccaagt 5700

acgacgagaa cgacaagctc atccgcgagg tcaaggtgat caccctcaag tccaagctcg 5760

tctccgactt ccgcaaggac ttccagttct acaaggtccg cgagatcaac aactaccacc 5820

acgctcacga tgcttacctt aacgctgtcg ttggtaccgc tcttatcaag aagtacccta 5880

agcttgagtc cgagttcgtc tacggtgact acaaggtcta cgacgttcgt aagatgatcg 5940

ccaagtccga gcaggagatc ggcaaggcca ccgccaagta cttcttctac tccaacatca 6000

tgaacttctt caagaccgag atcaccctcg ccaacggcga gatccgcaag cgccctctta 6060

tcgagacgaa cggtgagact ggtgagatcg tttgggacaa gggtcgcgac ttcgctactg 6120

ttcgcaaggt cctttctatg cctcaggtta acatcgtcaa gaagaccgag gtccagaccg 6180

gtggcttctc caaggagtct atccttccaa agagaaactc ggacaagctc atcgctagga 6240

agaaggattg ggaccctaag aagtacggtg gtttcgactc ccctactgtc gcctactccg 6300

tcctcgtggt cgccaaggtg gagaagggta agtcgaagaa gctcaagtcc gtcaaggagc 6360

tcctcggcat caccatcatg gagcgctcct ccttcgagaa gaacccgatc gacttcctcg 6420

aggccaaggg ctacaaggag gtcaagaagg acctcatcat caagctcccc aagtactctc 6480

ttttcgagct cgagaacggt cgtaagagga tgctggcttc cgctggtgag ctccagaagg 6540

gtaacgagct tgctcttcct tccaagtacg tgaacttcct ctacctcgcc tcccactacg 6600

agaagctcaa gggttcccct gaggataacg agcagaagca gctcttcgtg gagcagcaca 6660

agcactacct cgacgagatc atcgagcaga tctccgagtt ctccaagcgc gtcatcctcg 6720

ctgacgctaa cctcgacaag gtcctctccg cctacaacaa gcaccgcgac aagcccatcc 6780

gcgagcaggc cgagaacatc atccacctct tcacgctcac gaacctcggc gcccctgctg 6840

ctttcaagta cttcgacacc accatcgaca ggaagcgtta cacgtccacc aaggaggttc 6900

tcgacgctac tctcatccac cagtccatca ccggtcttta cgagactcgt atcgaccttt 6960

cccagcttgg tggtgatgac gatgacaaaa tggcaccgaa gaaaaaaagg aaggtcggcg 7020

gctccccgaa gaaaaaaagg aaggtcggcg gctccccgaa gaaaaaaagg aaggtcggcg 7080

gctccccgaa gaaaaaaagg aaggtcggaa tccatggcta gtcccgatcg ttcaaacatt 7140

tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 7200

tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 7260

aggtgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 7320

atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagaggcg 7380

cgcctggtgg atcgtccgcc taggctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta 7440

gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca 7500

cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata 7560

atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt 7620

agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt 7680

tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc 7740

attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt 7800

agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag 7860

tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac 7920

aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa 7980

tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg 8040

tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc 8100

tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc 8160

ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca 8220

gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa 8280

atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac 8340

acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt 8400

cctccccccc cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc 8460

cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg 8520

ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca 8580

gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc 8640

atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata 8700

tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga 8760

tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt 8820

ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa 8880

gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat 8940

gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc 9000

gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat 9060

tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa 9120

tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg 9180

catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat aataaacaag 9240

tatgttttat aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata 9300

tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg 9360

tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggag ctcatgaaaa agcctgaact 9420

caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctgat 9480

gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata 9540

tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca 9600

ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggagt ttagcgagag 9660

cctgacctat tgcatctccc gccgttcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac 9720

cgaactgccc gctgttctac aaccggtcgc ggaggctatg gatgcgatcg ctgcggccga 9780

tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac 9840

atggcgtgat ttcatatgcg cgattgctga tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat 9900

ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc tttgggccga 9960

ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca atgtcctgac 10020

ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca 10080

atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac 10140

gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg ccacgactcc gggcgtatat 10200

gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc 10260

agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg 10320

tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc 10380

cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg tccgagggca aagaaataga gtagatgccg 10440

accgggatct gtcgatcgac aagctcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca 10500

gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct 10560

tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca 10620

aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cgttaattca gatttgggta 10680

tggtggtgca acgggaagag atcccaccgc aatatgccat tcaggtgctg gatgagctga 10740

cgaaaggtga ggcaatcatc gctactggtg ttgggcagca ccagatgtgg gcggcacaat 10800

attacaccta caagcggcca cggcagtggc tgtcttcggc tggtctgggc gcaatgggat 10860

ttgggctgcc tgctgcagct ggtgcttctg tggctaaccc aggtgtcaca gttgttgata 10920

ttgatgggga tggtagcttc ctcatgaaca ttcaggagct ggcattgatc cgcattgaga 10980

acctccctgt gaaggtgatg gtgttgaaca accaacattt gggtatggtc gtccagttgg 11040

aggataggtt ttacaaggcg aatagggcgc atacatactt gggcaacccc gaatgtgaga 11100

gcgagatata tccagatttt gtgactattg ctaaggggtt caatattcct gcagtccgtg 11160

taacaaagaa gagtgaagtc cgtgccgcca tcaagaagat gctcgagact ccagggccat 11220

acttgttgga tatcatcgtc ccgcaccagg agcatgtgct gcctatgatc ccaattgggg 11280

gcgcattcaa ggacatgatc ctggatggtg atggcaggac tgtgtattaa tctataatct 11340

gtatgttggc aaagcaccag cccggcctat gtttgacctg aatgacccat ttgggtatgg 11400

tggtgcaacg gcctgcagga cgcgtttaat taagtgcacg cggccgccta cttagtcaag 11460

agcctcgcac gcgactgtca cgcggccagg atcgcctcgt gagcctcgca atctgtacct 11520

agtgtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag 11580

cgttta 11586

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>2

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210>3

<211>1367

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>3

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

305 310 315 320

Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

325 330 335

Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

595 600 605

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

610 615 620

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu

770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

785 790 795 800

Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

945 950 955 960

Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

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Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr

1025 1030 1035

Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn

1040 1045 1050

Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr

1055 1060 1065

Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg

1070 1075 1080

Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu

1085 1090 1095

Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

1100 1105 1110

Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

1115 1120 1125

Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu

1130 1135 1140

Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

1145 1150 1155

Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

1160 1165 1170

Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu

1175 1180 1185

Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

1190 1195 1200

Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

1205 1210 1215

Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn

1220 1225 1230

Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro

1235 1240 1245

Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg

1265 1270 1275

Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

1280 1285 1290

Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

1295 1300 1305

Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

1310 1315 1320

Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

1325 1330 1335

Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

1340 1345 1350

Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210>4

<211>4101

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

gacaagaagt actccatcgg cctcgacatc ggcaccaaca gcgtcggctg ggcggtgatc 60

accgacgagt acaaggtccc gtccaagaag ttcaaggtcc tgggcaacac cgaccgccac 120

tccatcaaga agaacctcat cggcgccctc ctcttcgact ccggcgagac ggcggaggcg 180

acccgcctca agcgcaccgc ccgccgccgc tacacccgcc gcaagaaccg catctgctac 240

ctccaggaga tcttctccaa cgagatggcg aaggtcgacg actccttctt ccaccgcctc 300

gaggagtcct tcctcgtgga ggaggacaag aagcacgagc gccaccccat cttcggcaac 360

atcgtcgacg aggtcgccta ccacgagaag taccccacta tctaccacct tcgtaagaag 420

cttgttgact ctactgataa ggctgatctt cgtctcatct accttgctct cgctcacatg 480

atcaagttcc gtggtcactt ccttatcgag ggtgacctta accctgataa ctccgacgtg 540

gacaagctct tcatccagct cgtccagacc tacaaccagc tcttcgagga gaaccctatc 600

aacgcttccg gtgtcgacgc taaggcgatc ctttccgcta ggctctccaa gtccaggcgt 660

ctcgagaacc tcatcgccca gctccctggt gagaagaaga acggtctttt cggtaacctc 720

atcgctctct ccctcggtct gacccctaac ttcaagtcca acttcgacct cgctgaggac 780

gctaagcttc agctctccaa ggatacctac gacgatgatc tcgacaacct cctcgctcag 840

attggagatc agtacgctga tctcttcctt gctgctaaga acctctccga tgctatcctc 900

ctttcggata tccttagggt taacactgag atcactaagg ctcctctttc tgcttccatg 960

atcaagcgct acgacgagca ccaccaggac ctcaccctcc tcaaggctct tgttcgtcag 1020

cagctccccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccagt ccaagaacgg ctacgccggt 1080

tacattgacg gtggagctag ccaggaggag ttctacaagt tcatcaagcc aatccttgag 1140

aagatggatg gtactgagga gcttctcgtt aagcttaacc gtgaggacct ccttaggaag 1200

cagaggactt tcgataacgg ctctatccct caccagatcc accttggtga gcttcacgcc 1260

atccttcgta ggcaggagga cttctaccct ttcctcaagg acaaccgtga gaagatcgag 1320

aagatcctta ctttccgtat tccttactac gttggtcctc ttgctcgtgg taactcccgt 1380

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gttgacaagg gtgcttccgc ccagtccttc atcgagcgca tgaccaactt cgacaagaac 1500

ctccccaacg agaaggtcct ccccaagcac tccctcctct acgagtactt cacggtctac 1560

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ggcgagcaga agaaggctat cgttgacctc ctcttcaaga ccaaccgcaa ggtcaccgtc 1680

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ggcgttgagg accgtttcaa cgcttctctc ggtacctacc acgatctcct caagatcatc 1800

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ctcttcgatg acaaggttat gaagcagctc aagcgtcgcc gttacaccgg ttggggtagg 1980

ctctcccgca agctcatcaa cggtatcagg gataagcaga gcggcaagac tatcctcgac 2040

ttcctcaagt ctgatggttt cgctaacagg aacttcatgc agctcatcca cgatgactct 2100

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aagaggattg aggagggtat caaggagctt ggttctcaga tccttaagga gcaccctgtc 2400

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atgtacgttg accaggagct cgacatcaac aggctttctg actacgacgt cgaccacatt 2520

gttcctcagt ctttccttaa ggatgactcc atcgacaaca aggtcctcac gaggtccgac 2580

aagaacaggg gtaagtcgga caacgtccct tccgaggagg ttgtcaagaa gatgaagaac 2640

tactggaggc agcttctcaa cgctaagctc attacccaga ggaagttcga caacctcacg 2700

aaggctgaga ggggtggcct ttccgagctt gacaaggctg gtttcatcaa gaggcagctt 2760

gttgagacga ggcagattac caagcacgtt gctcagatcc tcgattctag gatgaacacc 2820

aagtacgacg agaacgacaa gctcatccgc gaggtcaagg tgatcaccct caagtccaag 2880

ctcgtctccg acttccgcaa ggacttccag ttctacaagg tccgcgagat caacaactac 2940

caccacgctc acgatgctta ccttaacgct gtcgttggta ccgctcttat caagaagtac 3000

cctaagcttg agtccgagtt cgtctacggt gactacaagg tctacgacgt tcgtaagatg 3060

atcgccaagt ccgagcagga gatcggcaag gccaccgcca agtacttctt ctactccaac 3120

atcatgaact tcttcaagac cgagatcacc ctcgccaacg gcgagatccg caagcgccct 3180

cttatcgaga cgaacggtga gactggtgag atcgtttggg acaagggtcg cgacttcgct 3240

actgttcgca aggtcctttc tatgcctcag gttaacatcg tcaagaagac cgaggtccag 3300

accggtggct tctccaagga gtctatcctt ccaaagagaa actcggacaa gctcatcgct 3360

aggaagaagg attgggaccc taagaagtac ggtggtttcg actcccctac tgtcgcctac 3420

tccgtcctcg tggtcgccaa ggtggagaag ggtaagtcga agaagctcaa gtccgtcaag 3480

gagctcctcg gcatcaccat catggagcgc tcctccttcg agaagaaccc gatcgacttc 3540

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tctcttttcg agctcgagaa cggtcgtaag aggatgctgg cttccgctgg tgagctccag 3660

aagggtaacg agcttgctct tccttccaag tacgtgaact tcctctacct cgcctcccac 3720

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cacaagcact acctcgacga gatcatcgag cagatctccg agttctccaa gcgcgtcatc 3840

ctcgctgacg ctaacctcga caaggtcctc tccgcctaca acaagcaccg cgacaagccc 3900

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gttctcgacg ctactctcat ccaccagtcc atcaccggtc tttacgagac tcgtatcgac 4080

ctttcccagc ttggtggtga t 4101

<210>5

<211>2936

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60

ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120

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ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccgg gcggcgcgtc catggagatc 300

caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360

gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420

acctccggcc ccggggcaac caacctcgtg tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480

gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca tgatcggcac cgacgccttc 540

caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca agcacaatta ccttgtcctt 600

gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct tcctcgcgtc ctcgggccgt 660

cctggcccgg tgctggtcga catccccaag gacatccagc agcagatggc cgtgccggtc 720

tgggacacct cgatgaatct accagggtac atcgcacgcc tgcccaagcc acccgcgaca 780

gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac ggcgcccgat tctctatgtc 840

ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt ttgttgagct gactggtatc 900

ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca gtgacgaccc gttgtccctg 960

cgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg ccgtggataa ggctgacctg 1020

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ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag cttgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200

caacagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat ggcacaatga gttggaccag 1260

cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaa acttttggtg aagagatccc accgcaatat 1320

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tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgctg cagctggtgc ttctgtggct 1500

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gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620

catttgggta tggtggtgca atgggaggat aggttttaca aggcgaatag ggcgcataca 1680

tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac tattgctaag 1740

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gtgctgccta tgatcccaag tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga tggtgatggc 1920

aggactgtgt attaatctat aatctgtatg ttggcaaagc accagcccgg cctatgtttg 1980

acctgaatga cccataaaga gtggtatgcc tatgatgttt gtatgtgctc tatcaataac 2040

taaggtgtca actatgaacc atatgctctt ctgttttact tgtttgatgt gcttggcatg 2100

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gcatcacaag atatcatgta agtttcttgt cctacatatc aataataaga gaataaagta 2220

cttctatgca atagctctga gttaagtgtt tcaacaattt ctgaacttct gaacttatgt 2280

ttgctcaact gtcatcacac gaagtactct ccttgtaact acattttccc caagacttta 2340

aatcccctca gttacagcaa aaaataaact ttgcatctac tgttttccct ctcttcggtc 2400

gatcttattg ggtactacta tagagagagg ctgcatgaag tatttccttt ttctgtttag 2460

ttatgccgtg taaattagca tccatgcaaa atagatgaaa aatcaagcta ttcctgactg 2520

ctaaggatta tttttggcat aatgtattct tatatactcc ctccgtccca tattataagg 2580

gattttgagt ttttgtttat actgtttgac cactcgtctt attcaaaaaa ttttagaatt 2640

attatttatt ttttttgtga cttactttat tatctaaagt actttaagca caattttcgt 2700

attttatatt tgcacaaatt ttttgaataa gacgaatggt caaacaatac aaataaaaat 2760

tcaaaatccc ttataatatg ggacggaggt atgatagttg gtgaactgct acgtattgcc 2820

atttgacatt ttttggatta tgcaattttg ctgtctatag tgctctaatc aattcgcaat 2880

cccgaccttg gagtattggt ctcatggaac ccctcatctg agtaatctcc atattt 2936

<210>6

<211>644

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>6

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala

85 90 95

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

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His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

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Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Ser Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly

625 630 635 640

Arg Thr Val Tyr

<210>7

<211>86

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac 60

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 86

<210>8

<211>1373

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>8

ggaatccatg gcggatcagg agccaccaac ttctccctcc tcaagcaggc cggcgacgtg 60

gaggagaacc cgggcccaat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt 120

ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct 180

cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc 240

gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt 300

ccggaagtgc ttgacattgg ggagtttagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt 360

tcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctacaaccg 420

gtcgcggagg ctatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc 480

ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt 540

gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc 600

gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc 660

gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc 720

attgactgga gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc 780

tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg 840

gagcttgcag gatcgccacg actccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc 900

tatcagagct tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac 960

gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg 1020

gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc 1080

actcgtccga gggcaaagaa atagactagt tcccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 1140

tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa 1200

ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga ggtgggtttt 1260

tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 1320

aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagaggcgc gcc 1373

<210>9

<211>19

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>9

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210>10

<211>341

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>10

Met Lys Lys Pro Glu Leu Thr Ala Thr Ser Val Glu Lys Phe Leu Ile

1 5 10 15

Glu Lys Phe Asp Ser Val Ser Asp Leu Met Gln Leu Ser Glu Gly Glu

20 25 30

Glu Ser Arg Ala Phe Ser Phe Asp Val Gly Gly Arg Gly Tyr Val Leu

35 40 45

Arg Val Asn Ser Cys Ala Asp Gly Phe Tyr Lys Asp Arg Tyr Val Tyr

50 55 60

Arg His Phe Ala Ser Ala Ala Leu Pro Ile Pro Glu Val Leu Asp Ile

65 70 75 80

Gly Glu Phe Ser Glu Ser Leu Thr Tyr Cys Ile Ser Arg Arg Ser Gln

85 90 95

Gly Val Thr Leu Gln Asp Leu Pro Glu Thr Glu Leu Pro Ala Val Leu

100 105 110

Gln Pro Val Ala Glu Ala Met Asp Ala Ile Ala Ala Ala Asp Leu Ser

115 120 125

Gln Thr Ser Gly Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gln Gly Ile Gly Gln Tyr

130 135 140

Thr Thr Trp Arg Asp Phe Ile Cys Ala Ile Ala Asp Pro His Val Tyr

145 150 155 160

His Trp Gln Thr Val Met Asp Asp Thr Val Ser Ala Ser Val Ala Gln

165 170 175

Ala Leu Asp Glu Leu Met Leu Trp Ala Glu Asp Cys Pro Glu Val Arg

180 185 190

His Leu Val His Ala Asp Phe Gly Ser Asn Asn Val Leu Thr Asp Asn

195 200 205

Gly Arg Ile Thr Ala Val Ile Asp Trp Ser Glu Ala Met Phe Gly Asp

210 215 220

Ser Gln Tyr Glu Val Ala Asn Ile Phe Phe Trp Arg Pro Trp Leu Ala

225 230 235 240

Cys Met Glu Gln Gln Thr Arg Tyr Phe Glu Arg Arg His Pro Glu Leu

245 250 255

Ala Gly Ser Pro Arg Leu Arg Ala Tyr Met Leu Arg Ile Gly Leu Asp

260 265 270

Gln Leu Tyr Gln Ser Leu Val Asp Gly Asn Phe Asp Asp Ala Ala Trp

275 280 285

Ala Gln Gly Arg Cys Asp Ala Ile Val Arg Ser Gly Ala Gly Thr Val

290 295 300

Gly Arg Thr Gln Ile Ala Arg Arg Ser Ala Ala Val Trp Thr Asp Gly

305 310 315 320

Cys Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Gly Asn Arg Arg Pro Ser Thr Arg

325 330 335

Pro Arg Ala Lys Lys

340

Claims (10)

1.一种不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法，包括如下步骤：将sgRNA、Cas9切刻酶或其变体、供体DNA导入目的植物中；

所述sgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；

所述供体DNA依次包括所述DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙、所述DNA片段甲靶点序列；

所述DNA片段乙为将所述DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；

在所述sgRNA引导下，所述Cas9切刻酶或其变体在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列处和所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列处均产生单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的所述DNA片段甲替换为所述DNA片段乙，实现植物基因替换。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均为200-2000bp；

和/或，所述DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的DNA分子；

和/或，所述DNA片段乙为序列1第10695-11388位所示的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA结构如下：tRNA-所述DNA片段甲靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架；

和/或，所述tRNA为a1)或a2)或a3)：

a1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；

a2)将a1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；

和/或，所述sgRNA骨架为b1)或b2)或b3)：

b1)将序列1第571-646位中的T替换为U得到的RNA分子；

b2)将b1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：

所述Cas9切刻酶为Cas9 D10A切刻酶或Cas9 H840A切刻酶；

和/或，所述Cas9 D10A切刻酶为SpCas9n蛋白质；

和/或，所述SpCas9n蛋白质为C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

和/或，所述SpCas9n蛋白质的编码基因为c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列1第2877-6977位所示的cDNA分子或DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：

所述Cas9切刻酶或其变体带有核定位信号；

和/或，所述核定位信号为BP NLS、VirD2 NLS或SV40 NLS；

和/或，所述核定位信号为SV40 NLS；

和/或，所述SV40 NLS的氨基酸序列为序列2。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述DNA片段甲靶点序列为序列1第551-570位；

和/或，所述供体DNA的序列为序列1第10672-11411位。

7.根据权利要求1-6所述的方法，其特征在于：所述将sgRNA、Cas9切刻酶或其变体、供体DNA导入目的植物中的方法包括如下步骤：将转录sgRNA的DNA分子、Cas9切刻酶或其变体的编码基因和供体DNA导入目的植物中；

和/或，所述转录sgRNA的DNA分子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和所述供体DNA通过重组表达载体导入目的植物中；

和/或，所述重组表达载体包括依次由启动子、所述转录sgRNA的DNA分子和终止子组成的表达盒和依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和终止子组成的表达盒；

和/或，所述重组表达载体的核苷酸序列如序列1所示。

8.权利要求1-7任一所述的方法在植物基因编辑中的应用；

或，权利要求1-7任一所述的方法在制备植物突变体中的应用；

或，权利要求1-7任一所述的方法在提高植物基因替换效率中的应用；

或，权利要求1-7任一所述的方法在减少植物基因替换产生的副产物中的应用。

9.一种植物基因编辑的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，从而实现植物基因编辑；

或，一种制备植物突变体的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换，获得植物突变体；

或，一种提高植物基因替换效率的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换；

或，一种减少植物基因替换产生的副产物的方法，包括如下步骤：按照权利要求1-7任一所述的方法对植物基因组中的目的基因片段进行替换。

10.根据权利要求1-7任一所述的方法或权利要求8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为如下d1)-d3)中的任一种：

d1)单子叶植物或双子叶植物；

d2)禾本科植物；

d3)水稻。

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