CN102732483A - 造血祖细胞的制备方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种造血祖细胞的制备方法及其专用培养基。本发明提供了由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化制备造血祖细胞的培养基，由细胞培养液I、细胞培养液II、细胞培养液III和细胞培养液IV组成。本发明的实验证明，建立了一个成分明确的，新的逐级诱导人胚胎干细胞分化产生造血祖细胞的体系，这不仅为进一步研究造血干/祖细胞分化产生提供了良好的研究平台，同时由于此分化体系是在无血清，无鼠源的基质细胞等，为获得造血祖细胞应用于临床血液疾病的治疗提供了分化方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种造血祖细胞的制备方法及其专用培养基。
背景技术
人多能干细胞(人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞能)具有在体外无限增殖的能力，并能分化产生各种细胞类型比如血液细胞，这将为治疗血液疾病提供了新的细胞来源。已有的研究报道了人多能干细胞在体外分化产生造血祖细胞的方法，他们主要采用与基质细胞共培养，拟胚体(embryonic body)分化的方式，这些分化方法有诸多的缺点，比如分化方向不定向，分化效率较低，并且分化条件中含有血清和鼠源基质细胞等，这将严重限制此类分化方法产生的造血细胞应用于血液疾病的治疗。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化制备如下造血祖细胞的培养基。
本发明提供的培养基，由细胞培养液I、细胞培养液II、细胞培养液III和细胞培养液IV组成，
所述细胞培养液I按照如下方法制备：将Activin A、骨形成蛋白-4、碱性成纤维生长因子和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述Activin A在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-25ng/ml，所述骨形成蛋白-4在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液I中的浓度为10ng/ml-100ng/ml；
所述细胞培养液II按照如下方法制备：将成血管生长因子、碱性成纤维生长因子、B27添加剂和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述成血管生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为0.8％-1.2％(体积百分含量)；
所述细胞培养液III按照如下方法制备：将成血管生长因子、碱性成纤维生长因子、B27添加剂、TGF β信号抑制剂和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述成血管生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述TGF β信号抑制剂在所述细胞培养液III中的浓度为2uM-20uM，所述B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为0.8％-1.2％(体积百分含量)；
所述细胞培养液IV按照如下方法制备：将干细胞因子、血小板生成素、Flt3-ligand、白介素-3、B27添加剂和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述干细胞因子在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述血小板生成素在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述Flt3-ligand在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述白介素-3在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液IV中的浓度为0.8％-1.2％(体积百分含量)。
所述细胞培养液I中，所述Activin A在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-10ng/ml，所述骨形成蛋白-4在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-25ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液I中的浓度为25ng/ml-50ng/ml；
所述细胞培养液II中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为1％(体积百分含量)；
所述细胞培养液III中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述TGF β信号抑制剂在所述细胞培养液III中的浓度为10uM-20uM，所述B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为1％(体积百分含量)；
所述细胞培养液IV中，所述干细胞因子在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述血小板生成素在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述Flt3-ligand在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述白介素-3在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液IV中的浓度为1％(体积百分含量)。
所述细胞培养液I中，所述Activin A在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml、10ng/ml或25ng/ml，所述骨形成蛋白-4在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml、25或50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液I中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml；
所述细胞培养液II中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为1％(体积百分含量)；
所述细胞培养液III中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述TGF β信号抑制剂在所述细胞培养液III中的浓度为2uM、10uM或20uM，所述B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为1％(体积百分含量)；
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所述细胞培养液I、细胞培养液II和细胞培养液III中的培养哺乳动物细胞的基础培养基为RPMI 1640；
所述细胞培养液IV中的培养哺乳动物细胞的基础培养基为IMDM；
所述TGFβ信号抑制剂为SB 431542。
本发明的另一个目的是提供一种用上述培养基制备所述造血祖细胞的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将离体的人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在所述培养基中的细胞培养液I上培养；
2)步骤1)获得的细胞在所述培养基中的细胞培养液II上培养；
3)步骤2)获得的细胞在所述培养基中的细胞培养液III上培养；
4)步骤3)获得的细胞在所述培养基中的细胞培养液IV上培养，得到造血祖细胞。
步骤1)中，所述培养时间为1.5天-2.5天，所述培养时间具体为2天；
步骤2)中，所述培养时间为1.5天-2.5天，所述培养时间具体为2天；
步骤3)中，所述培养时间为1.5天-2.5天，所述培养时间具体为2天；
步骤4)中，所述培养时间为6天-12天，所述培养时间具体为6天、10天或12天。
所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系。
所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。
本发明的第三个目的是提供一种造血祖细胞。
本发明提供的造血祖细胞，是由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化获得造血祖细胞。
所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系。
所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。
本发明的实验证明，本发明提供了一个成分明确的、新的逐级诱导人胚胎干细胞分化产生造血祖细胞的体系和用于分化的培养基这不仅为进一步研究造血干/祖细胞分化产生提供了良好的研究平台，同时由于此分化体系是在无血清，无鼠源的基质细胞等，为获得造血祖细胞应用于临床血液疾病的治疗提供了分化方法，重要的是，培养基中的SB 431542结合VEGF和bFGF，能促进新生造血祖细胞的高效产生，比以前已有的报道提高了两倍以上。因此，建立的分化体系以及专用培养基将为临床上应用干细胞分化的造血祖细胞提供大量细胞来源，具有潜在的，重要的临床应用价值。
附图说明
图1为人胚胎干细胞向造血细胞分化过程经历生血内皮细胞阶段
图2为建立逐级诱导分化体系
图3为VEGF能诱导早期中胚层细胞分化产生生血内皮细胞
图4为信号分子诱导生血内皮细胞向新生造血祖细胞的分化
图5为第四天添加SB 431542促进造血细胞的分化
图6为SB 431542协同VEGF和bFGF诱导产生的新生造血祖细胞具有更强的造血集落形成能力
图7为SB431542降低了分化细胞的凋亡比例
图8为人胚胎干细胞向造血祖细胞逐级分化
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、人胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化系统条件的摸索
1、分化系统的建立
通过追踪体内造血干细胞发生，证明了生血内皮细胞能直接产生出造血干细胞。
根据这个发现，利用人胚胎干细胞体外分化体系，发现在人胚胎干细胞分化的中胚层细胞(KDR+)会进一步分化产生具有内皮细胞性质和产生造血细胞的一群细胞，将这群细胞命名为生血内皮细胞。生血内皮细胞主要富集在CD31+的细胞群中，这群生血内皮细胞能直接产生CD45+的造血细胞，同时表达CD34+，KDR+，Tie-2，Ac-LDL和PDGFa-等表面标志(图1为人胚胎干细胞向造血细胞分化过程经历生血内皮细胞阶段，生血内皮细胞富集在CD31+细胞群中，这些细胞能产生造血CD45+细胞并表现内皮细胞的性质。)。
2、追踪分化过程
在鉴定了人胚胎干细胞向造血祖细胞分化过程需要经历生血内皮细胞以及新生造血祖细胞后，追踪了整个分化过程。
结果图2A所示，为追踪人胚胎干细胞向造血细胞分化过程，发现BRACHYURY，KDR，CD31，CD43，CD45逐步出现，具体如下：
人胚胎干细胞经过2天的分化，会产生BRACHYURY+的原条细胞以及KDR+的早期中胚层细胞；经过的分化，从早期中胚层细胞中会逐渐产生生血内皮细胞，生血内皮细胞主要富集在CD31+的细胞中；经过的分化，CD31+的生血内皮细胞会逐渐产生CD43+的新生造血祖细胞；经过进一步分化，这些CD43+的新生造血祖细胞能逐渐产生CD45+的造血祖细胞。
根据这个分化过程，建立了一个新的逐级分化的策略(见图2B，为根据2A中的变化，将人胚胎干细胞向造血细胞分化过程分为四个步骤。)：第一步：人胚胎干细胞分化产生原条/早期中胚层细胞；第二步：早期中胚层细胞分化产生生血内皮细胞；第三步，生血内皮细胞分化产生新生造血祖细胞；第四步：新生造血细胞进一步产生造血祖细胞。这个逐级分化的过程为寻找新的促进造血祖细胞产生的诱导信号提供了良好的研究平台。
3、早期中胚层细胞产生生血内皮细胞的信号
首先研究了调控早期中胚层细胞向生血内皮细胞分化的信号。
将各种调控早期造血发育的信号分化添加到分化第二天的细胞。
结果如图3所示，其中，可以看出，经过不同细胞因子的处理后，只有VEGF信号分子可以诱导早期中胚层细胞(KDR+)产生出CD31+富含生血内皮的细胞(图3A)。同时也发现bFGF有显著的协同作用，促进VEGF诱导CD31+细胞的产生(图3B，图3C)。
4、SB 431542促进生血内皮细胞产生造血祖细胞
在确定了诱导生血内皮产生的信号后，进一步研究生血内皮是如何产生新生造血祖细胞的。
待人胚胎干细胞分化到第四天时，也就是生血内皮产生之后，将调控造血细胞的信号分子添加到分化培养基中，培养2天。
结果如图4所示，经过两天的继续分化，发现在这些测试的信号分子中，包括VEGF，bFGF，RA和SB 431542都能促进新生造血祖细胞CD43+的产生。
待人胚胎干细胞四天时，将SB 431542添加到分化培养基中，培养2天。
结果如下：
进一步，发现SB 431542在第四天添加比其他天添加对促进造血基因的表达是最有效的。
发现SB 431542促进了CD43+CD235a-新生造血祖细胞的产生。同时发现经过SB43152协同VFGF和bFGF，能提高CD43+细胞的产量超过两倍，而不影响CD31+细胞的产生(图5为第四天添加SB 431542促进造血细胞的分化)。
同时，发现经过SB 431542诱导的新生造血祖细胞能进一步产生造血祖细胞并且具备更强的造血集落形成能力(图6为SB 431542协同VEGF和bFGF诱导产生的新生造血祖细胞具有更强的造血集落形成能力。)
5、SB 431542是通过抑制凋亡信号促进造血祖细胞的产生
进一步研究SB 431542是如何促进生血内皮细胞向造血细胞的分化。
结果如图7所示，发现SB431542不影响CD31+，CD43+细胞的增殖，但是能降低分化细胞的凋亡效率。
实施例2、人胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化及鉴定
人胚胎干细胞系H1购自美国Wicell公司。
(一)人胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化(细胞培养基pH值都在7.0-7.2间)
1、方法一：
在研究生血内皮细胞的产生信号以及调控生血内皮细胞向新生造血祖细胞分化的信号后，根据上述新的逐级分化方法，完成人胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化，具体如下：
1)将生长密度达(1X10e4)的人胚胎干细胞H1接种到Matrigel(BD，产品目录号为356230)处理过的12孔板(BD Falcon)上，然后加入人胚胎干细胞培养基(含有4ng/ml bFGF(PeproTech，产品目录号为AF-100-18B)和20％KnockOut SR(Invitrogen，产品目录号为10828-028)的DMEM/F12培养基(Invitrogen，产品目录号为11330-032)，在37℃、5％二氧化碳培养条件下培养1天；
2)将步骤1)得到的细胞换为第一步分化培养液(细胞培养液I)，在温度为37℃、5％二氧化碳细胞培养条件下培养两天；
第一步分化培养液按照如下方法配制得到：将Activin A(PeproTech，产品目录号为120-14)、BMP4(骨形成蛋白-4购自R&D，产品目录号为314-BP-050)、bFGF(碱性成纤维生长因子，PeproTech，产品目录号AF-100-18B)和RPMI 1640(Invitrogen，产品目录号为31800-022)混合，得到第一步分化培养液，Activin A在所述第一步分化培养液中的浓度为25ng/ml，BMP4在所述第一步分化培养液中的浓度为25ng/ml，bFGF在所述第一步分化培养液中的浓度为25ng/ml。
3)将步骤2)得到的细胞换用第二步分化培养液(细胞培养液II)，在温度为37℃、5％二氧化碳培养条件下培养两天，
所述第二步分化培养液按照如下方法配制得到：将VEGF(成血管生长因子，PeproTech，产品目录号为100-20A)、bFGF(碱性成纤维生长因子，PeproTech，产品目录号为AF-100-188)、B27添加剂(Invitrogen，产品目录号为17504044)和RPMI 1640(Invitrogen，产品目录号为31800-022)混合，得到第二步分化培养液，VEGF在第二步分化培养液中的浓度为50ng/ml，bFGF在第二步分化培养液中的浓度为50ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为1％(体积百分含量)。
4)将步骤3)得到的细胞换用第三步分化培养液(细胞培养液III)，在温度为37℃、5％二氧化碳培养条件下培养2天；
所述第三步分化培养液按照如下方法配制得到：将VEGF(成血管生长因子，PeproTech，产品目录号为100-20A)、bFGF(碱性成纤维生长因子，PeproTech，产品目录号为AF-100-188)、B27添加剂、SB 431542(Tocris，产品目录号为1614)和RPMI 1640(Invitrogen，产品目录号为31800-022)混合，得到第三步分化培养液，VEGF在第三步分化培养液中的浓度为50ng/ml，bFGF在第三步分化培养液中的浓度为50ng/ml，SB 431542在第三步分化培养液中的浓度为20uM，B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为1％(体积百分含量)。
5)将步骤4)得到的细胞换用第四步分化培养液(细胞培养液IV)，在温度为37℃、5％二氧化碳条件下，培养12天；得到细胞。
所述第四步分化培养液按照如下方法配制得到：将SCF(干细胞因子，Perotech，产品目录号为AF-300-07))、TPO(血小板生成素，Peprotech，产品目录号为AF-300-18)、Flt3-Ligand(Perotech，产品目录号为AF-300-19)、IL3(白介素-3，Peprotech，产品目录号为200-13)、B27添加剂和IMDM(Invitrogen，产品目录号为31800-022)培养基混合，得到第四步分化培养液，SCF在第四步分化培养液中的浓度为50ng/ml，TP0在第四步分化培养液中的浓度为50ng/ml，Flt3-Ligand在第四步分化培养液中的浓度为50ng/ml，IL3在第四步分化培养液中的浓度为50ng/ml，B27添加剂在第四步分化培养液中的浓度为1％(体积百分含量)。
2、方法二：
1)与方法一相同；
2)与方法一基本相同，不同的是将第一步分化培养液替换为细胞培养液I-1；
第一步分化培养液按照如下方法配制得到：将Activin A、BMP4、bFGF和RPMI 1640混合，得到第一步分化培养液，Activin A在所述第一步分化培养液中的浓度为1ng/ml，BMP4在所述第一步分化培养液中的浓度为25ng/ml，bFGF在所述第一步分化培养液中的浓度为10ng/ml。
3)与方法一基本相同，不同的是将第二步分化培养液替换为细胞培养液II-1；
所述第二步分化培养液按照如下方法配制得到：将VEGF、bFGF、B27添加剂和RPMI1640混合，得到第二步分化培养液，VEGF在第二步分化培养液中的浓度为10ng/ml，bFGF在第二步分化培养液中的浓度为10ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为0.8％(体积百分含量)。
4)与方法一基本相同，不同的是将第三步分化培养液替换为细胞培养液III-1；
所述第三步分化培养液按照如下方法配制得到：将VEGF、bFGF、B27添加剂、SB431542和RPMI 1640混合，得到第三步分化培养液，VEGF在第三步分化培养液中的浓度为10ng/ml，bFGF在第三步分化培养液中的浓度为10ng/ml，SB 431542在第三步分化培养液中的浓度为2uM，B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为0.8％(体积百分含量)。
5)与方法一基本相同，不同的是将第四步分化培养液替换为细胞培养液IV-1；得到细胞；
所述第四步分化培养液按照如下方法配制得到：将SCF、TPO、Flt3-Ligand、IL3、B27添加剂和IMDM培养基混合，得到第四步分化培养液，SCF在第四步分化培养液中的浓度为100ng/ml，TPO在第四步分化培养液中的浓度为100ng/ml，Flt3-Ligand在第四步分化培养液中的浓度为100ng/ml，IL3在第四步分化培养液中的浓度为100ng/ml，B27添加剂在第四步分化培养液中的浓度为0.8％(体积百分含量)。
3、方法三：
1)与方法一相同；
2)与方法一基本相同，不同的是将第一步分化培养液替换为细胞培养液I-2；
第一步分化培养液按照如下方法配制得到：将Activin A、BMP4、bFGF和RPMI 1640混合，得到第一步分化培养液，Activin A在所述第一步分化培养液中的浓度为10ng/ml，BMP4在所述第一步分化培养液中的浓度为50ng/ml，bFGF在所述第一步分化培养液中的浓度为100ng/ml。
3)与方法一基本相同，不同的是将第二步分化培养液替换为细胞培养液II-2；
所述第二步分化培养液按照如下方法配制得到：将VEGF、bFGF、B27添加剂和RPMI1640混合，得到第二步分化培养液，VEGF在第二步分化培养液中的浓度为100ng/ml，bFGF在第二步分化培养液中的浓度为100ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为1.2％(体积百分含量)。
4)与方法一基本相同，不同的是将第三步分化培养液替换为细胞培养液III-2；
所述第三步分化培养液按照如下方法配制得到：将VEGF、bFGF、B27添加剂、SB431542和RPMI 1640混合，得到第三步分化培养液，VEGF在第三步分化培养液中的浓度为100ng/ml，bFGF在第三步分化培养液中的浓度为100ng/ml，SB 431542在第三步分化培养液中的浓度为10uM，B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为1.2％(体积百分含量)。
5)与方法一基本相同，不同的是将第四步分化培养液替换为细胞培养液IV-2；得到细胞；
所述第四步分化培养液按照如下方法配制得到：将SCF、TPO、Flt3-Ligand、IL3、B27添加剂和IMDM培养基混合，得到第四步分化培养液，SCF在第四步分化培养液中的浓度为200ng/ml，TPO在第四步分化培养液中的浓度为200ng/ml，Flt3-Ligand在第四步分化培养液中的浓度为200ng/ml，IL3在第四步分化培养液中的浓度为200ng/ml，B27添加剂在第四步分化培养液中的浓度为1.2％(体积百分含量)。
(二)鉴定
采用流式分析的方法，分别在分化第2天、第5天、第6天、第12天以及第18天对方法一获得的分化细胞进行了鉴定，第二天采用的抗体是PE-BRACHYURY(R&D，产品目录号为IC2085P)，第5天采用的抗体是APC-KDR(R&D，产品目录号为FAB357A)，PE-CD31(BD，产品目录号为555446)，第6天采用的抗体是PE-CD31(BD，产品目录号为555446)，FITC-CD43(Biolegend，产品目录号为315204)，第12天采用的是PE-CD31(BD，产品目录号为555446)，FITC-CD43(Biolegend，产品目录号为315204)，第18天采用的是PE-CD45(BD，产品目录号为555483)，FITC-CD43(Biolegend，产品目录号为315204)。结果如图8所示，其中A为建立的新的逐级诱导人胚胎干细胞向造血祖细胞定向分化示意图、B为人胚胎干细胞向造血祖细胞分化鉴定过程；从图中看出，在分化第2天产生93％的BRACHYURY+细胞，在分化第5天产生85％KDR+细胞，在分化第6天产生74％CD31+的细胞，而同时有约40％CD31+CD43+的新生造血祖细胞。经过进一步的培养，大约在分化第18天能产生60％的CD45+造血祖细胞。这些造血祖细胞能形成造血集落，为进一步分化产生各造血世系细胞提供了大量的造血祖细胞。
采用已经报道的分化体系EB分化或者与基质细胞共培养(Pick M，et al.，StemCells 2007；Vodyanik MA，et al.，Blood 2005)的方法诱导人胚胎干细胞定向分化产生造血祖细胞，这些分化方法分化效率较低，大约只能产生10-20％的CD34+细胞和约25％CD45+造血祖细胞。
因此，经过对比，可以看出，本发明方法一采用的分化培养基和建立的分化方法，能够产生大约90％的CD43+造血细胞和约60％的CD45+造血祖细胞，这为造血细胞应用于临床提供了一个新的，有效的方法。
采用相同的方法检测上述方法二、三不同分化时间的细胞，结果与方法一无显著差异。
Claims (10)
1.由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化制备如下权利要求9或10中任一所述造血祖细胞的培养基，由细胞培养液I、细胞培养液II、细胞培养液III和细胞培养液IV组成，
所述细胞培养液I按照如下方法制备：将Activin A、骨形成蛋白-4、碱性成纤维生长因子和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述Activin A在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-25ng/ml，所述骨形成蛋白-4在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液I中的浓度为10ng/ml-100ng/ml；
所述细胞培养液II按照如下方法制备：将成血管生长因子、碱性成纤维生长因子、B27添加剂和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述成血管生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为0.8％-1.2％(体积百分含量)；
所述细胞培养液III按照如下方法制备：将成血管生长因子、碱性成纤维生长因子、B27添加剂、TGFβ信号抑制剂和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述成血管生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml-100ng/ml，所述TGFβ信号抑制剂在所述细胞培养液III中的浓度为2-ng/ml 20uM，所述B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为0.8％-1.2％(体积百分含量)；
所述细胞培养液IV按照如下方法制备：将干细胞因子、血小板生成素、Flt3-ligand、白介素-3、B27添加剂和培养哺乳动物细胞的基础培养基混合，得到培养液，所述干细胞因子在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述血小板生成素在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述Flt3-ligand在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述白介素-3在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-200ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液IV中的浓度为0.8％-1.2％(体积百分含量)。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：
所述细胞培养液I中，所述Activin A在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-10ng/ml，所述骨形成蛋白-4在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml-25ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液I中的浓度为25ng/ml-50ng/ml；
所述细胞培养液II中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为1％(体积百分含量)；
所述细胞培养液III中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为25ng/ml-50ng/ml，所述TGFβ信号抑制剂在所述细胞培养液III中的浓度为10uM-20uM，所述B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为1％(体积百分含量)；
所述细胞培养液IV中，所述干细胞因子在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述血小板生成素在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述Flt3-ligand在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述白介素-3在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml-100ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液IV中的浓度为1％(体积百分含量)。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：
所述细胞培养液I中，所述Activin A在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml、10ng/ml或25ng/ml，所述骨形成蛋白-4在所述细胞培养液I中的浓度为1ng/ml、25ng/ml或50ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液I中的浓度为10、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml；
所述细胞培养液II中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液II中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液II中的浓度为1％(体积百分含量)；
所述细胞培养液III中，所述成血管生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述碱性成纤维生长因子在所述细胞培养液III中的浓度为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或100ng/ml，所述TGFβ信号抑制剂在所述细胞培养液III中的浓度为2uM、10uM或20uM，所述B27添加剂在所述细胞培养液III中的浓度为1％(体积百分含量)；
所述细胞培养液IV中，所述干细胞因子在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml，所述血小板生成素在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml，所述Flt3-ligand在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml，所述白介素-3在所述细胞培养液IV中的浓度为50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml，所述B27添加剂在所述细胞培养液IV中的浓度为1％(体积百分含量)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的培养基，其特征在于：
所述细胞培养液I、细胞培养液II和细胞培养液III中的培养哺乳动物细胞的基础培养基为RPMI 1640；
所述细胞培养液IV中的培养哺乳动物细胞的基础培养基为IMDM；
所述TGFβ信号抑制剂为SB 431542。
5.一种用权利要求1-4中任一所述培养基制备所述造血祖细胞的方法，包括如下步骤：
1)将离体的人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞在权利要求1-4中任一所述培养基中的细胞培养液I上培养；
2)步骤1)获得的细胞在权利要求1-4中任一所述培养基中的细胞培养液II上培养；
3)步骤2)获得的细胞在权利要求1-4中任一所述培养基中的细胞培养液III上培养；
4)步骤3)获得的细胞在权利要求1-4中任一所述培养基中的细胞培养液IV上培养；得到造血祖细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中，所述培养时间为1.5天-2.5天，所述培养时间具体为2天；
步骤2)中，所述培养时间为1.5天-2.5天，所述培养时间具体为2天；
步骤3)中，所述培养时间为1.5天-2.5天，所述培养时间具体为2天；
步骤4)中，所述培养时间为6天-12天，所述培养时间具体为6天、10天或12天。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：
所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系.
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。
9.造血祖细胞，是由人胚胎干细胞或诱导的多潜能干细胞分化获得CD45+造血祖细胞。
10.根据权利要求9所述的造血祖细胞，其特征在于：所述人胚胎干细胞为可从商业途径获得的人胚胎干细胞系；
所述可从商业途径获得的人胚胎干细胞系为下述任一种细胞系：BG01，BG02，BG03，BG04，SA01，SA02，SA03，ES01，ES02，ES03，ES04，ES05，ES06，TE03，TE32，TE33，TE04，TE06，TE62，TE07，TE72，UC01，UC06，WA01，WA07，WA09，WA13和WA14；所述编号为NIH的编号。
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