CN102112110A - 用于RNAi试剂体内递送的新型组合物 - Google Patents

Abstract

本专利申请描述了含有用于在活体内递送RNAi、抗miRNA或核酸适体试剂的中性磷脂的乳剂。本专利申请还涉及制备所述制剂的方法以及将所述制剂作为递送试剂的使用。

Description

用于RNAi试剂体内递送的新型组合物

目前，人们正对将多种类型的核酸用作可能的疗法进行研究，诸如RNA干扰试剂、核酸适体、抗miRNA或基因替代疗法。RNA干扰(RNAi)通常涉及主要在转录后水平上调节基因表达的细胞途径。科学家使用多种RNAi试剂和工具来进行功能基因组筛查、药物开发研究和体内靶标确认，并且RNAi试剂能够在体外和体内检测中下调基因的表达。RNAi试剂的例子包括但不限于短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶和反义化合物。多种RNAi试剂通过共同的途径起作用，并且通常导致一个或多个靶标mRNA分子裂解、翻译减少或其它表达干扰(图1)。

微RNA(miRNA)是一种内源性非编码小分子RNA，其通过结合至靶标mRNA转录本和(1)引发转录本降解或(2)更改来自转录本的蛋白翻译来调节基因表达。miRNA经常在癌组织和其它病变组织中有区别地表达，并且当解除调节时会导致各种人类疾病(包括癌症)的发生。抗miRNA是通过杂交来干扰靶标miRNA活性的短核酸。抗miRNA的使用致使受靶标miRNA调节的mRNA的活性增加，而不是减少靶标mRNA的表达或活性。

RNAi试剂能够从细胞内开始进入RNAi途径，或能够被递送至细胞内。尽管RNAi试剂是作为基因特效药而进行研发的，但是该技术未来的成功是与递送化学物质、方法和制剂的发展密切联系在一起的，所述化学物质、方法和制剂将RNAi试剂递送至植物和动物活体内的细胞和器官，无毒且高效。

核酸适体是特异地结合至诸如蛋白质的分子靶标的小核酸分子。与通过杂交至另一核酸靶标进行作用的核酸治疗剂不同，核酸适体形成三维形状从而使得其可特异结合至酶、生长因子、受体、病毒蛋白和免疫球蛋白。

对于基于寡核苷酸的试剂来说，有效的递送至靶标器官和与该等递送相关的高成本是治疗剂应用面临的主要限制条件之一。例如，目前在平均大小的小鼠中每次注射所用的siRNA量的范围是单位剂量从0.03mg至2.4mg(1-50mg/kg)。人平均体重约80kg且按比例将需要约0.08g至4.0g的siRNA。目前，0.08g的研究级siRNA的价格超过3000美元。在将药物监管批准和药物检测要求的成本考虑进去后，用于制药的核酸成本将大幅增加。其它反义化合物和基于寡核苷酸的药物也面临着同样的问题。因此，例如，增加摄取进靶标细胞的效率或提高RNAi制剂的稳定性将降低治疗所需的RNAi试剂的量，同时也降低了成本并减小了有害副作用的可能。人们需要改善的RNAi试剂组合物以治疗疾病并且还需要制备该等组合物的方法。

由阳离子磷脂制成的脂质体和乳状液已在之前用于小分子和核酸的递送和转染。在这些制剂中，阳离子脂质和带负电的核酸通过静电相互作用形成复合物。然而，这些制剂常常具有毒性特征使其不适合体内应用。(请参阅，如Campbell PI.，Cytobios，37(145)：21-6(1983)；Senior JH等人，Biochim Biophys Acta，1070(1)：173-9(1991)；Filion MC等人，Biochim Biophys Acta，1329(2)：345-56(1997)。)

本发明涉及RNAi试剂、抗miRNA或核酸适体的亲脂性制剂。该制剂可被称为磷脂-油脂-RNAi乳状液(PORE)，其含有中性磷脂、油脂和RNAi试剂(图2)。在一些实施例中，该制剂包括用于RNAi试剂、抗miRNA或核酸适体递送的非离子表面活性剂、脂质组分和含水组分。本文还描述了制备该等制剂和使用该制剂用于治疗之目的的方法。这些方法具有促进RNAi试剂的治疗应用和提高RNAi试剂体内递送(图3)能力的功用。

在一些实施例中，乳剂包含中性磷脂、油脂和非离子表面活性剂。在其它实施例中，在制剂中使用不止一种中性磷脂。在其它实施例中，在制剂中使用不止一种油脂。在某些实施例中，中性磷脂为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)。在一些实施例中，油脂为角鲨烯。在其它实施例中，聚山梨醇酯20(Tween20)或聚山梨醇酯80(Tween 80)是非离子表面活性剂。在某些实施例中，RNAi试剂为miRNA或siRNA。乳剂可以包括其它组分，诸如抗氧化剂、蜡、清洁剂或它们的组合。某些实施例包括制备乳剂的方法。在一些实施例中，制备脂质组分而后与含水组分混合以形成乳状液。

乳剂可以用于将至少一种RNAi试剂、抗miRNA试剂或核酸适体递送至活体动物的组织。在某些实施例中，乳剂保护RNAi试剂在循环系统中免于降解。此外，乳剂能够促进RNAi试剂穿过诸如细胞膜的生理屏障的传递。

在一个实施例中，治疗哺乳动物疾病或调节细胞中靶标核酸表达的方法包括：以缓解疾病的某些症状或改变细胞中靶标核酸水平的有效剂量，给哺乳动物受试者施用含有RNAi试剂、抗miRNA或核酸适体的制剂。在一些实施例中，组合物和方法可以用于治疗以一个或一组基因的表达或过表达为特征的疾病和病症，诸如癌症、代谢性疾病、传染性疾病和免疫失调等等，除了别的以外。

本发明的其它实施例在整个本专利申请中进行讨论。本发明的其它目的、特征和优点通过下文的具体实施方式将变得显而易见。就本发明的一个方面所讨论的任何实施例也适用于本发明的其它方面，反之亦然。在实例部分的实施例应理解为适用于本发明所有方面的本发明实施例。

然而，应当理解，表示本发明的特定实施例的具体实施方式和特定实例，仅以示例的方式给出，原因是根据本具体实施方式，在本发明的精神和范围内的各种变更和修改对那些本领域的技术人员而言将是显而易见的。

本发明的其它方面在以下的描述中进行阐明。

附图简述

图1示出在转录后水平上用于形成RNAi的细胞途径以及用于沉默基因表达的RNAi介导的机理。

图2示出微观层次的磷脂-油脂-RNAi乳状液(PORE)。

图3示出用于制备PORE的方法及其在活体内的使用。

图4示出注射含有GAPDH siRNA的PORE的小鼠器官内的相对GAPDH蛋白水平。将GAPDH的相对水平与使用阴性对照siRNA治疗的小鼠作比较。

图5示出注射含有GAPDH siRNA的PORE的大鼠器官内的相对GAPDH蛋白水平。将GAPDH的相对水平与使用阴性对照siRNA治疗的大鼠作比较。

图6示出在小鼠已注射含有GAPDH siRNA的PORE之后，通过免疫组织化学和ELISA所估测的小鼠心脏内的相对GAPDH蛋白水平。将GAPDH的相对水平与使用阴性对照siRNA治疗的小鼠作比较。

图7A示出未感染的小鼠或用PORE-配制的RSV siRNA治疗的、无任何制剂(裸siRNA)治疗的、或无任何siRNA治疗的呼吸道合胞病毒(RSV)感染的小鼠的呼吸频率。图7B示出用PORE-配制的RSV siRNA治疗的、无任何制剂(裸siRNA)治疗的、或无任何siRNA治疗的小鼠的病理评分。图7C是示出测试4天后用PORE-配制的

或无制剂(裸siRNA)治疗的小鼠的RSV滴定度的图。

图8是示出通过向含有中性脂质的制剂添加角鲨烯而获得基因减少改善的图。

图9示出将PORE-配制的荧光素酶特异的siRNA系统递送至小鼠内原位肺癌移植瘤的结果。携带人H460非小细胞肺癌移植瘤(其稳定地表示肺内的荧光素酶及生长情况)的小鼠，以1毫克每千克小鼠体重(1mg/kg)的最终浓度接受PORE-配制的荧光素酶siRNA(si-luc)(图9B，动物#3和#4)或PORE-配制的阴性对照(NC)寡核苷酸(图9A，动物#1和#2)的静脉注射。示出活性荧光素酶的荧光信号的

图像取自临制剂注射之前(0时)和注射后48时。

图10示出用PORE-配制的荧光素酶siRNA治疗的原位肺肿瘤内的荧光素酶活性。示出了采自图9中动物的

数据的定量。在0时的总通量设定为100％的荧光素酶活性。注射后48时的荧光素酶的活性百分比示出在图中。

图11示出PORE-配制的治疗miRNA的瘤内递送。携带可触摸的皮下H460非小细胞肺癌移植瘤的小鼠用含有hsa-miR-34a(图11A，白色方格)、hsa-miR-124a(图11B，白色菱形)的PORE或阴性对照miRNA(图11A和11B，miR-NC，黑色圆圈)进行治疗。单独一组荷瘤动物仅使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷脂-油脂乳状液(在图11A和11B中分别为黑色菱形和黑色方格)进行治疗。在移植瘤移植后的第12、15和18天(箭头)瘤内注射(i.t.)制剂。图中示出了7只动物(miR-34a、miR-124、miR-NC)或4只动物(仅PBS、磷脂-油脂)的平均和标准偏差。

图12示出PORE-配制的治疗miRNA的系统递送的结果。携带可触摸的皮下H460非小细胞肺癌移植瘤的小鼠用含有hsa-miR-34a(图12A，白色方格)、hsa-miR-124a(图12B，白色菱形)的PORE或阴性对照miRNA(图12A和12B，miR-NC，黑色圆圈)进行系统地治疗。单独一组荷瘤动物仅用磷脂-油脂乳状液(图12A和12B，黑色方格)进行治疗。在移植瘤移植后的第12、15和18天(箭头)将制剂通过尾静脉注射(i.v.)进行给药。图中示出了每组中4只动物的平均和标准偏差。

图13示出PORE-配制的治疗miRNA各种剂量的系统递送的结果。确诊有皮下人H460非小细胞肺癌移植瘤的小鼠用PORE-配制的hsa-miR-34a寡核苷酸进行静脉注射。图中示出使用的剂量和治疗的天数。作为对照，给单独一组荷瘤动物注射磷酸缓冲盐水。图中示出了每组中3只动物的平均和标准偏差。将数据绘成总肿瘤体积(图13A)或是相对于第一次治疗天数的肿瘤生长百分比(图13B，第12天，100％)。

图14示出PORE-配制的治疗miRNA向小鼠内原位生长肺肿瘤的系统递送。携带原位肺癌移植瘤的小鼠通过在第39天至第52天之间每2天一次的系统给药来接受PORE-配制的hsa-miR-124a。作为正常肿瘤生长的参考，还使用了未经治疗的小鼠。

数据如整个小鼠的图像(图14A)或以总通量单位表示的定量(图14B)所示。

具体实施方式

在某些方面，乳剂含有用于将RNAi试剂递送至细胞的中性磷脂和油脂。在某些方面，乳剂含有用于将RNAi试剂递送至细胞的聚山梨醇酯和中性磷脂。在一些方面，使用RNAi制剂来治疗动物或人类的疾病。还包括制备和使用该RNAi制剂的方法。

为帮助理解本发明，首先对某些术语进行了定义。在整个专利申请中还提供了其它定义。

术语“RNAi试剂”包括短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、与Piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶和反义化合物。RNAi试剂包括含有RNA、DNA或两者的核酸。在一些实施例中，RNAi试剂的长度不到200个核苷酸。在其它实施例中，RNAi试剂的长度不到50个核苷酸。在某些实施例中，RNAi试剂的长度约15至约25个核苷酸。在一些实施例中，RNAi试剂是双链的，而其它实施例包括单链的RNAi试剂。RNAi试剂可进行化学改性。

如本文所用，术语“siRNA”是指长度约15至约25个核苷酸的双链RNA。siRNA可以具有平端，或可以在一端或两端具有单链悬突。此外，siRNA可以包括化学改性，诸如主链、糖、碱基或末端(3′或5′端)改性。siRNA可含有完全或部分与一个或多个靶标mRNA互补的序列。

如本文所用，术语“微RNA”(miRNA)包括可以是天然存在的或合成产生的人miRNA、成熟单链miRNA、前体miRNA以及它们的变体。在某些情况下，术语“miRNA”还包括初级miRNA转录本和复式miRNA。当修饰miRNA或诸如miR-13的特定miRNA时，术语“成熟”是指从存在于生物样本内的对应的前体miRNA序列加工的一个或多个成熟序列。当与特定miRNA一起使用时(如，hsa-miR-34a)，前缀“hsa”是指人miRNA序列。包括人成熟序列和前体序列的某些miRNA序列报告在miRBase::Sequences Database中(https://microrna.sanger.ac.uk；Griffiths-Jones等人，Nucleic Acids Research，2008，36，Database Issue，D154-D158；Griffiths-Jones等人，Nucleic Acids Research，2006，34，Database Issue，D140-D144；Griffiths-Jones，Nucleic Acids Research，2004，32，Database Issue，D109-D111)。熟练的技术人员将会知道，有关对于给定miRNA、尤其是对于成熟形式的miRNA的精确核酸序列的科学共识，可随着时间的变化而变化。

如本文所用“乳状液”是指悬浮于水溶液中不溶解的小脂滴。该脂滴可含有油脂、磷脂、表面活性剂或它们的混合物。

在权利要求书和/或说明书中所用词“一个”、“一种”或“所述”，当与术语“含有”一起使用时，可以是指“一个”，但也可以是指“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”。

I.乳剂

在某些实施例中，包括脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液可用来将RNAi试剂递送至活体动物的组织。在一些实施例中，乳状液中脂滴的平均直径在50nm至2,000nm之间。在其它实施例中，平均直径在50nm至100nm、100nm至150nm、150nm至200nm、200nm至300nm、300nm至400nm、400nm至500nm、500nm至600nm、100nm至500nm、100nm至1000nm、500nm至1000nm或1000nm至2000nm之间。本领域的技术人员将会理解，乳状液制剂包含具有一定大小范围的脂质微粒。在一些实施例中，乳状液制剂包含与平均粒径相差10％、15％、20％或25％的脂质微粒。在一些实施例中，脂滴以较大的脂质球的形式而存在。在某些实施例中，脂质球具有从约10μm至约1000μm的直径。本领域的技术人员应认识到，不同的组织可能需要不同的递送粒径。例如，不同组织或肿瘤中脉管系统的特性会影响最佳的递送粒径。

A.脂质组分

制剂的脂质组分包含中性磷脂。在一些实施例中，脂质组分还包含油脂或蜡。脂质组分可包含20重量％至100重量％的中性磷脂和0至80重量％的油脂或蜡。在含有油脂或蜡的制剂中，在该制剂中中性磷脂与油脂或蜡的重量比可以从1∶2至1∶6。在一些实施例中，磷脂与油脂的比为约1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或1∶6。

1.磷脂

磷脂最常见地是由结合至两个脂肪酸的甘油分子和磷酸基团所构成的双极性分子。在一些磷脂中，磷酸基团结合至另一化学基团，被称为头部基团。如果磷脂的净电荷为零，则其为中性磷脂。带有净正电荷的磷脂为阳离子磷脂，而带有净负电荷的那些为阴离子磷脂。

在一些实施例中，磷脂是中性磷脂。中性磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、卵磷脂、磷酸酰乙醇胺(PE)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺(Iysophosphatidylethanolamine)、鞘磷脂(sphinogomyelin)(SM)、心磷脂、磷脂酸(phosphosphatidic acid)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)、1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二棕榈油酰(dipalmitoloeoyl)-PE、二植烷醇(diphytanoyl)-PE、DSPE、二反油酸-PE、二亚油酰-SM和二亚油酰-PE。在一些实施例中，中性磷脂DOPC和/或中性磷脂DOPE使用于乳剂中。

2.油脂和蜡

如本文所使用的“油脂”是指一组异质性的中性、可燃物质，其在室温下为液体，并且特有地可溶于相对非极性溶剂但仅微溶于含水溶剂。主要有三种类型：(1)动物和植物油脂，其主要包括三酰基甘油，但也可包括不同量的其它醇的脂肪酸酯；(2)衍生自石油、煤、页岩的矿物油，其包括烃；和(3)精油。

油脂的实例包括但不限于植物油、棉籽油、油菜籽油、橄榄油、矿物油、甜杏仁油、蓖麻油、椰子油、棕榈油、大麻籽油、亚麻油、鱼油、鲸脂衍生油、鲨鱼肝油、角鲨烯或角鲨烯蜡。在其它实施例中，油脂可以包括油性脂肪醇、山梨醇酯和脂肪酸酯、中链甘油三酯、油性蔗糖酯或衍生自任何植物或动物源的油脂。在一些实施例中，油脂可以是离子或非离子嵌段共聚物、苯乙烯、二乙烯基苯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸月桂酯、丙烯酸十二碳烯醇酯、丙烯酸十四烷基酯、丙烯酸十六烷基酯、丙烯酸十六碳烯醇酯、丙烯酸十八烷基酯、丙烯酸十八碳烯醇酯、丙烯酸二十二烷基酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸月桂酯、甲基丙烯酸十二碳烯醇酯、甲基丙烯酸十四烷基酯、甲基丙烯酸十六烷基酯、甲基丙烯酸十六碳烯醇酯、甲基丙烯酸十八烷基酯(straryl methacrylate)、甲基丙烯酸十八碳烯醇酯(actadecenyl methacrylate)或甲基丙烯酸二十二烷基酯。在一些实施例中，角鲨烯可以用于形成乳剂。

在某些实施例中，所述制剂含有蜡，所述蜡替代油脂或加成至油脂。本文所用的“蜡”是指活体有机体或原油的任何脂质部分或长链一羟基醇的任何脂肪酸酯，所述脂质部分是可塑性物质，冷却时变硬，加热时易于模制，且不溶于水。

蜡的实例包括但不限于蜂蜡、Stedmans蜡、白蜡、紫胶蜡、鲸蜡、羊毛脂蜡、耳蜡、蜡果杨梅蜡、小烛树蜡、蓖麻蜡、eapatro蜡、日本蜡、霍霍巴蜡、小冠巴西棕榈蜡、米糠蜡、纯地蜡、褐煤蜡、纯地蜡、泥煤蜡、石蜡、微晶蜡、聚乙烯蜡、费-托蜡(fisher-tropsch wax)、化学改性蜡、酰胺替代蜡或聚α烯烃或它们的组合。

B.含水组分

乳剂的含水组分包含存在于水性介质中的RNAi试剂、抗miRNA试剂或核酸适体。含水组分可以是任何药用的溶液或缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水、林格氏溶液或水。缓冲含水组分可包括已知的缓冲剂和缓冲系统。在某些实施例中，RNAi或抗miRNA试剂以约0.1mg/ml至约0.2mg/ml的浓度存在于水溶液中。

RNAi试剂包括但不限于短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、与Piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶和反义化合物。在一些实施例中，RNAi试剂为siRNA或miRNA。在一些实施例中，RNAi试剂通过质粒或其它表达载体进行表达。在其它情况下，RNAi试剂制备为PCR产物。RNAi试剂可以是单链的或双链的，并且一些RNAi试剂包括发夹或其它次生结构。一些RNAi试剂包括化学改性的RNA或DNA，诸如主链、糖、碱基、末端(3′或5′端)改性。RNAi试剂可包括抗癌剂、抗病毒剂、抗菌剂、免疫调节剂、抗寄生虫剂以及调节炎症、代谢或可与疾病或感染有关的其它途径的试剂。

在一些实施例中，脂质组分与RNAi试剂的重量比为约10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1或100∶1。在其它实施例中，脂质组分与含水组分的重量比为在1∶1和1∶1000之间。在某些实施例中，脂质与含水的重量比为约1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶500或1∶1000。

C.非离子表面活性剂

在一些实施例中，乳剂含有非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的例子包括但不限于聚山梨醇酯20(Tween20)、聚山梨醇酯80(Tween80)、诺乃洗涤剂P-40(NP-40)、CHAPS或它们的组合。非离子表面活性剂的其它的例子包括TritonX100、TritonX114、NP40、Brij-35、Brij-58、辛基葡糖苷和辛硫基葡糖苷。在一些实施例中，表面活性剂Tween20可用于形成乳剂。

在某些实施例中，非离子表面活性剂占总制剂的0.01重量％至50重量％之间。在一些实施例中，表面活性剂占总乳剂按重量计约0.01％、0.1％、1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％。在某些实施例中，表面活性剂占总乳剂按重量计约0.1％至5％、1％至10％、2％至20％、10％至33％、20％至40％、20％至33％、30％至50％、30％至40％或40％至50％。在其它实施例中，表面活性剂与脂质组分的比在1∶10,000和1∶3,000、1∶3,000和1∶1,000、1∶1,000和1∶300、1∶300和1∶100、1∶100和1∶10、1∶30和1∶10、1∶30和1∶1、1∶1和3∶1、1∶1和10∶1、1∶1和15∶1、15∶1和30∶1或15∶1和50∶1之间。

D.其它组分

在一些实施例中，乳剂含有抗氧化剂。抗氧化剂的例子包括但不限于抗坏血酸、生育酚、白藜芦醇、类黄酮、番茄红素、胡萝卜素L-半胱氨酸和鼠尾草酚。在一些实施例中，抗坏血酸可用于乳剂。在某些实施例中，抗氧化剂以约0.01mg/ml至10mg/ml的浓度存在于乳状液中。在一些实施例中，乳状液含有约0.1-1mg/ml、1-2mg/ml、1-5mg/ml、1-10mg/ml或5-10mg/ml浓度的抗氧化剂。

在另一实施例中，磷脂共轭至抗体或其它靶向剂，从而能够将RNAi试剂定向递送至特异靶标器官。抗体识别组织特异的靶标，从而集中递送至那些组织。其它靶向剂包括蛋白质、碳水化合物或用于组织或细胞特异的受体、病毒载体以及本领域已知的其它靶向部分的小分子配体。

II.制备方法

在一些实施例中，脂质组分通过将中性磷脂和油脂与有机溶剂(如，氯仿、己烷)混合进行制备。使用本领域已知的标准干燥或蒸发法，将有机溶剂从所得的混合物中移除。在一些实施例中，在干燥或蒸发步骤之前脂质组分在-80℃下进行冷冻。在干燥或蒸发步骤之前混合物可以冷冻至少10分钟、20分钟或30分钟。在某些实施例中，干燥或蒸发包括冻干法或旋转蒸发。所得的物质也可以通过在其上穿过惰性气流(如，氮气)进行干燥。

在一些实施例中，将非离子表面活性剂添加至脂质混合物并与脂质一起干燥。在形成乳状液之前，也可将表面活性剂添加至含水组分，或可将其添加至脂质含水混合物。在一些实施例中，含水组分包含约0.1mg/ml至20mg/ml之间的RNAi、抗miRNA或核酸适体试剂。在某些实施例中，至少使用5μl的脂质组分来配制100μg的RNAi、抗miRNA或核酸适体试剂。在其它实施例中，脂质含水乳状液的体积在约1μl和1ml之间。

在某些实施例中，脂质组分与RNAi、抗miRNA或核酸适体试剂在水溶液中结合并混合以形成乳状液。该乳状液可以通过在水溶液中高能量混合脂质、油脂、表面活性剂和核酸来制备。合适的高能混合方法包括声波降解法、挤压、均化、加压、加热、冷冻、破碎、激光照射、搅拌，用其它高能运动或其它本领域的技术人员已知的方法进行处理。在一些实施例中，声波降解法至少进行5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟或30分钟。在其它采用挤压法的实施例中，挤压膜的孔径可以小于50nm、100nm、150nm、200nm或400nm。可以通过依据粒径，例如，依据粒径、密度或场流分级法或色谱法析出微粒对乳状液进行进一步加工。

乳剂可以包括脂质体以及其它脂质载体微粒，所述脂质体为含有具有脂双层的囊泡的脂质，所述脂质载体微粒能够捕集核酸试剂。脂质体能够由中性磷脂制成。合适的磷脂包括DOPC、DOPE和本文列出的其它磷脂。脂质体可以是单层、多层或具有不定的层状结构。在一些方面，脂质体捕集、封装和/或结合核酸试剂，从而使得所述试剂装入脂质体的一些部分或与其结合。在一些实施例中，脂质微粒形成胶束。胶束可以具有由中性磷脂包围的油脂核。在其它实施例中，脂质微粒可以反胶束的形式存在。核酸可包含在脂质微粒内、表面上和/或水相乳状液中。

在某些实施例中，脂质组分和含水组分以约1∶1至约1∶1000的重量比进行结合。脂质组分和含水组分的比可以是约1∶1、1∶5、1∶50、1∶100、1∶500或1∶1000。比例的范围也包括在本范围内，诸如具有包括所列出值及其之间的比例的各个子范围。乳剂中核酸的总浓度可以为从约0.1μg/ml至约10mg/ml。在一些实施例中，核酸的浓度为约0.1-1mg/ml、0.1-2mg/ml、0.5-1mg/ml、1-2mg/ml、1-5mg/ml或1-10mg/ml。

在一些实施例中，至少50％、60％、70％、80％或90％的核酸与脂质微粒结合。所述制剂可以使用本领域已知的方法进行描述。

III.乳剂的使用

乳剂用于多种应用，其包括治疗和研究之目的。该制剂适用于脊椎动物，诸如母牛、马、猪、猴、兔、大鼠、小鼠和人类。在其它实施例中，该制剂可用于将RNAi、抗miRNA或核酸适体试剂递送至其它动物，诸如鱼、青蛙、虾、用作食物或用作饲料的动物和植物、虫子(包括但不限于蚂蚁、蜜蜂、苍蝇、蚊子、蚋、爬虫、飞虫、蠕虫或穴居虫)。在其它实施例中，可将制剂施用于草、农作物、野生花草树木。

疾病和病理状态包括但不限于增生性疾病、炎症性疾病、免疫性疾病、代谢疾病、传染性疾病和缺血性疾病。疾病还包括神经系统、免疫系统、肌肉、生殖、胃肠道、肺、心血管、肾、增生和/或癌症疾病、失调和病症。本领域的技术人员将会理解，沉默或减少与疾病或病症相关的基因表达能够与其它常规疗法相结合。

示例性的癌症包括恶性血液病、白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病，包括原粒细胞、早幼粒细胞、粒单核细胞、单核细胞的急性髓细胞白血病和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)、骨髓增生异常综合征真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、腺体癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、甲状腺癌或肉瘤、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、皮肤癌(包括，如上皮癌、肉瘤和黑素瘤)、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤；和/或癌转移，包括在骨、肝脏和肺内的转移。

根据本领域的技术人员已知的任何药物施用的方法，可递送并使用最终物质，所述药物施用包括但不限于循环系统、皮肤、眼睛、耳朵、鼻子、咽喉、肛门、阴道和尿道。可能的给药方法包括静脉注射(IV)、皮下注射(sub-Q)、低压尾静脉注射(LPTV)、高压尾静脉注射(HPTV)、吞服、腹腔注射(IP)、吸入、滴鼻、鞘内注射、瘤内注射、经皮给药、肌内注射、眼球内注射或耳蜗内灌注或它们的组合。例如，PORE制剂能够系统地或局部地递送至特异的组织或瘤。本领域的技术人员应认识到，哪种给药方法是适当的要取决于正在治疗的疾病或正施用的试剂类型。

在一个实施例中，用作乳剂的组合物可包装在试剂盒内。例如，含有中性磷脂、油脂和非离子表面活性剂的组合物可包装在小瓶内。在一些实施例中，组合物包含在第一小瓶中的中性磷脂和油脂以及在第二小瓶中的非离子表面活性剂。试剂盒可包括干燥形式的RNAi、抗miRNA或核酸适体试剂，其中所述试剂可适于注射并不含RNase。在替代实施例中，表面活性剂可与核酸试剂混合。试剂盒还可包括能够重新构成干燥形式的RNAi试剂的缓冲液组合物。试剂盒还可包括用于在与组合物混合后递送治疗剂的递送装置(如，注射器)。

IV.实例

以下实例示出了本发明的各个实施例，但并非旨在限制本发明的范围。

实例1.磷脂-油脂RNAi乳状液(PORE)的制备和显微镜检查

siRNA和miRNA试剂购自Qiagen、Sigma、IDT或Applied Biosystems。磷脂购自Sigma Chemical或Avanti Lipids。角鲨烯购自Sigma。

100μg抗坏血酸、3μl角鲨烯(油脂)、1mg 2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)(中性磷脂)、49μl Tween20和1ml氯仿的组合物在含有耐溶剂螺旋瓶盖的10ml玻璃小瓶中通过涡旋30秒进行混合。角鲨烯与DOPC的摩尔比率约为200∶1。混合物在-80℃下培养至少10分钟。使用旋转蒸发器将氯仿在40℃下冻干，并且将混合物恢复至-80℃保持至少20分钟。冻干的组合物进一步通过在其上通过氮气流(使用稳定气流采用直接吹氮法)进行干燥。所得的组合物非常粘稠，类似于重油，并使用TJ-6离心机(Beckman；Fullerton，CA，USA)以5,000rpm的速度旋转离心，从而使得试剂积聚在小瓶的底部。

将溶解在150μl PBS中的100μg miRNA样本直接添加至冻干的磷脂-油脂混合物，并使用G112SP1超声清洗器(Laboratory Supplies Company，New York，USA)以80KHz和80瓦特在室温下进行声波处理10分钟。角鲨烯与miRNA的摩尔比率约为1∶1。控制超声清洗器的水温。如果温度上升超过40℃，则向水中加冰来降低温度。所得的物质是磷脂-油脂RNAi乳状液(PORE)。

PORE用显微镜放大100倍进行分析。在多种情况下，发现溶液中存在较大的结构。这些较大的脂质/油脂结构内部包含脂质体。在一些情况下，该结构表现为围绕着许多较小脂质体(0.1μm至10μm)的大油滴(100μm至1000μm)的混合物。RNAi试剂很可能通过不止一个囊泡(囊泡内的囊泡)捕集和封装。这种独特的试剂混合物可以保护RNAi试剂免受体内核酸酶的影响，并且赋予其更长的循环寿命。

实例2.使用以中性磷脂配制的siRNA的小鼠体内GAPDH的减少

将100μg GAPDH siRNA在200μl PBS中的溶液添加至根据实例1方法制备的100μg抗坏血酸、3μl角鲨烯、1mg DOPC和49μl Tween20的冻干磷脂-油脂混合物。该混合物使用112SP1特殊超声清洗器(Laboratory Supplies Company，New York)以80KHz和80瓦特进行声波处理5分钟以制备PORE。将该PORE注射至小鼠的尾静脉。注射后72时，处死动物，移除器官，使用GAPDH ELISA试剂盒(Bioo Scientific，产品编号3401)中提供的蛋白质提取缓冲液提取蛋白质，并采用Bradford测定法(Bioo Scientific，产品编号：3440-01)对蛋白质进行归一化。使用GAPDH ELISA(Bioo Scientific，产品编号3401)测定GAPDH的浓度。蛋白质减少相对于阴性对照RNAi试剂治疗的动物(Qiagen阴性对照siRNA，产品编号S104381048)来表示。GAPDH的活性在心脏和肺内减少一倍(图4)。

实例3.使用以中性和阳离子磷脂配制的siRNA的大鼠心脏内的GAPDH的减少

含有角鲨烯、DOTAP(阳离子磷脂)、0.8DOPE(中性磷脂)的制剂与GAPDH siRNA(Qiagen GAPDH阳性对照，产品编号GS14433)混合。12.5μl角鲨烯、3.2mg DOTAP、0.8mg DOPE的混合物溶解于1ml氯仿中。混合物在-80℃下培养至少10分钟。使用旋转蒸发器将氯仿在40℃下冻干，并且将混合物恢复至-80℃保持至少20分钟，然后使用干燥氮气流进行干燥。将400μg GAPDH siRNA(Qiagen，产品编号GS14433)在200μl PBS中的溶液直接添加至磷脂-油脂混合物，并使用112SP1超声清洗器(The Laboratory Supplies Company，New York)以80KHz和80瓦特进行声波处理5分钟。每只远系繁殖的大鼠(Jackson Labs；Bar Harbor，Maine，USA)在尾静脉注射400μg配制的siRNA。注射后72时，使用二氧化碳气体处死动物，移出心脏并切成8等份。还移出单叶肝脏和脾。使用GAPDH ELISA试剂盒蛋白质提取缓冲液(Bioo Scientific，产品编号3401)从组织中提取蛋白质。使用Bradford测定法(Bioo Scientific，产品编号3440-01)对蛋白质进行归一化。使用GAPDH ELISA(Bioo Scientific，产品编号3401)测定GAPDH的浓度。试验动物中每一份的GAPDH的浓度降低了50％至60％(图5)。注射进大鼠尾静脉的物质总体积不得超过0.5ml溶液。

实例4.小鼠心脏内的GAPDH蛋白质减少

1ml体积的氯仿与100μg抗坏血酸、3μl角鲨烯、1mg DOPC和49μlTween20混合。混合物在-80℃下培养至少10分钟。使用旋转蒸发器将氯仿在40℃下冻干，并且将混合物恢复至-80℃保持至少20分钟，然后使用干燥氮气流进行干燥。将100μg GAPDH siRNA(Qiagen，产品编号GS14433)在100μl PBS中的溶液直接添加至冻干的物质，并进行声波处理5分钟。将GAPDH PORE注射进balb/c小鼠的尾静脉，每只小鼠100μg。注射后72时，处死动物。移出心脏，并将其嵌入石蜡中以用于通过免疫组织化学(服务提供商为在德州休斯顿的贝勒医学院的Lester and Sue Smith Breast Center)进行GAPDH蛋白质分析或使用GAPDH ELISA试剂盒蛋白质提取缓冲液从组织中提取蛋白质。提取的蛋白质使用Bradford测定法(Bioo Scientific，产品编号3440-01)进行归一化。然后使用Bioo GAPDH ELISA试剂盒(Bioo Scientific，产品编号3401)对GAPDH蛋白质水平进行定量。试验动物的GAPDH水平在试验动物中减少了50％(图6)。免疫组织化学结果证实了ELISA结果并表明基于GAPDH蛋白质(褐色)强度等级试验动物GAPDH蛋白质减少。

实例5.PORE-配制的RSV siRNA对病毒测试的功效

1ml体积的氯仿与100μg抗坏血酸、3μl角鲨烯、1mg DOPC和49μlTween20混合。该混合物在-80℃下培养至少10分钟。使用旋转蒸发器将氯仿在40℃下冻干，并将混合物恢复至-80℃保持至少20分钟，然后使用干燥氮气流进行干燥。将呼吸道合胞病毒(RSV)在100μl PBS中的100μg溶液直接添加至冻干的物质，并进行声波处理5分钟。RSV siRNA也使用所述

转染试剂(Mirus Bio Corporation，Madison，W1)和

(Forest Pharmaceuticals，Inc)(Bitko等人，2005)进行配制。

将PBS中三种不同的RSV siRNA制剂和未配制的siRNA以不同剂量的siRNA重复三次地鼻内施用给小鼠来评估每种制剂的效果。siRNA给药4时后，小鼠被感染所述1x107RSV(Bitko等人，2005)。在测试后的第0天、2天、4天和6天通过三种不同标准(呼吸频率、H&E染色肺病理评分和RSV滴定度(图7))对RSV感染效果进行监测。

用5μgRSV PORE治疗的小鼠具有类似于未感染小鼠的呼吸频率，然而与未经任何治疗的感染小鼠(图7A)相比，用5μg未配制的RSV siRNA治疗的小鼠具有高很多的呼吸频率(图7A)。将呼吸频率降至未感染小鼠的呼吸频率水平需要约70μg未配制的siRNA。因此，RSV PORE比未配制的RSVsiRNA或TranslT-TKO配制的RSV siRNA(数据未示出)的有效性高出约14倍。

用5μg RSV PORE治疗的小鼠具有类似于未感染(正常)小鼠的病理评分，然而用5μg未配制的RSV siRNA治疗的感染小鼠具有类似于未经治疗的感染小鼠的病理评分(图7B)。

在测试4天后(病毒浓度预计达到峰值)，RSV感染的小鼠用RSV PORE治疗，在所有的siRNA浓度下，小鼠肺内的RSV滴定度比未经治疗的感染小鼠低约100倍(图7C)。与未经治疗的感染小鼠相比，其它三种RNA siRNA制剂，即使用量达40μg滴定度的降低也不会超过10倍。

实例6.PORE和DOPC制剂的比较

1ml体积的氯仿与100μg抗坏血酸、3μl角鲨烯、1mg DOPC和49μlTween20(PORE制剂)混合，或与1mg DOPC和49μl Tween20(DOPC)混合。该混合物在-80℃下培养至少10分钟。使用旋转蒸发器将氯仿在40℃下冻干，并且将混合物恢复至-80℃保持至少20分钟，然后使用干燥氮气流进行干燥。将100μg GAPDH siRNA(Qiagen，产品编号GS14433)在100μl PBS中的溶液直接添加至冻干的物质，并进行声波处理5分钟。将GAPDH PORE或DOPC制剂注射进balb/c小鼠的尾静脉，每只小鼠100μg。注射后72时，处死动物。然后，使用GAPDH ELISA试剂盒蛋白质提取缓冲液(Bioo Scientific，产品编号3401)从组织中提取蛋白质。使用Bradford测定法(Bioo Scientific，产品编号3440-01)对蛋白质进行归一化。使用GAPDH ELISA(Bioo Scientific，产品编号3401)测定GAPDH的浓度。使用PORE-配制的siRNA而非DOPC-配制的siRNA治疗的小鼠，其肝脏内GAPDH的浓度减少了50％至60％(图8)。

实例7.将siRNA递送至正常组织的各种油脂/蜡和中性脂质的作用

为评估各种油脂/蜡和中性脂质在静脉注射后将siRNA递送至各组织的能力，表1所列出的PORE制剂用靶向GAPDH的siRNA或使用标准方法(见实例1)所获得的阴性对照siRNA进行制备。各种制剂+siRNA以5mg/kg的速率通过尾静脉注射输入BalbC小鼠。注射后2天，处死小鼠并移出脑、肝、心、脾、左肾、右肾、左肺和右肺。将从各组织制备的蛋白质样本进行Bradford分析，并随后对相同质量的蛋白质样本进行ELISA测定来定量GAPDH蛋白。

表1：使用各种油脂和蜡的基于DOPC的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加。

实例8：将siRNA递送至小鼠内原位肺癌移植瘤

先前的实例表明小干扰RNA至各正常组织(包括肺)的成功递送和及其活性。在本实例中，发明者证实了在原位肺肿瘤小鼠模型中用作寡核苷酸递送载体的基于中性磷脂的乳状液的功用。稳定地表达萤火虫荧光素酶基因的人H460非小细胞肺癌移植瘤在小鼠的肺内(原位肺肿瘤小鼠模型)生长，并使用荧光素酶定向的siRNA(si-luc)来显示通过PORE至肿瘤细胞的系统递送。在本测定系统中，荧光素酶活性的减少将表明(i)荧光素酶定向的siRNA成功递送至肺，(ii)siRNA成功递送至肺内生长的肿瘤细胞，(iii)肿瘤细胞对siRNA的成功细胞内摄取，和(iv)siRNA成功进入RNAi途径以及下调其预期靶标。因此，以荧光素酶表达肿瘤细胞和荧光素酶定向siRNA的使用为寡核苷酸的递送和活性提供精确且灵敏的评估。本模型系统描述了在寡核苷酸显示治疗活性之前系统递送的寡核苷酸必须穿过的所有物理屏障。

将20μg合成荧光素酶特异的siRNA(si-luc；Ambion，Austin，TX，USA)或20μg阴性对照寡核苷酸(NC；Dharmacon，Lafayette，CO)在200μl PBS中的溶液添加至冻干的磷脂-油脂混合物，所述混合物由20μg抗坏血酸、0.6μl角鲨烯、0.2mg DOPC和9.8μl Tween20根据实例1的方法制备。寡核苷酸在PORE中的最终浓度为100ng/ul。

通过气管插管将3x10⁶H460肺癌细胞移植至4只免疫失能的NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories；Bar Harbor，ME，USA)的肺内。通过

成像系统(Xenogen，Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA)对小鼠进行定期监测，该系统在荧光素酶基质荧光素的腹膜内注射后测量发光(荧光素酶活性)。由于H460细胞稳定表达荧光素酶，所以发光信号直接地与活肿瘤细胞相关。一旦小鼠形成易于检测的肺肿瘤，则记录下总发光数据(总通量，0时)。测量发光后，立即对两只小鼠进行尾静脉注射含有20μg si-luc的200μlPORE。假定小鼠平均体重为20g，则该剂量为1mg/kg的小鼠体重。作为阴性对照，对两只小鼠进行尾静脉注射含有20μg NC的200μl PORE制剂。注射配制的寡核苷酸后48时，再次测量发光并表示为相对于每只小鼠在0时(100％)总通量的变化百分比。

如图9A所示，含有NC的PORE的系统递送对H460肿瘤细胞(动物#1和#2)的荧光素酶活性不具有抑制效应。相反，PORE-配制的si-luc的系统给药导致注射后48时荧光素酶活性的显著降低(图9B，动物#3和#4)。相对于0时，使用荧光素酶siRNA治疗的动物的其余荧光素酶活性为0.84％和0.41％，表明荧光素酶siRNA被成功地递送至肿瘤细胞(图10)。

所述数据表明PORE促进荧光素酶siRNA有效递送至肿瘤细胞。

实例9.PORE制剂中的治疗miRNA的瘤内递送抑制小鼠内肿瘤的生长

当在基于中性磷脂的油脂乳状液中复合时，hsa-miR-34a和hsa-miR-124a的疗效显示了基于中性磷脂的油脂乳状液的成功递送治疗剂的能力。

发明者此前已证实，hsa-miR-34a和hsa-miR-124a参与多数细胞活性的调节，所述细胞活性表示癌症治疗和其它疾病和病症(参见，如美国专利申请No.11/141,707、No.11/273,640、No.12/134,932和No.12/325,917)治疗的介入点。例如，合成hsa-miR-34a或hsa-miR-124a的过表达或施用降低了某些正常或癌细胞系的增殖和/或生存力并且干扰了动物内肿瘤的生长。

将100μg合成hsa-miR-34a、hsa-miR-124a或阴性对照miRNA寡核苷酸(miR-NC)(Dharmacon，Lafayette，CO)在200μl PBS的溶液添加至冻干的磷脂-油脂混合物来达到在PORE中寡核苷酸的最终浓度500ng/μl，所述冻干的磷脂-油脂混合物由100μg抗坏血酸、3μl角鲨烯、1mg DOPC和49μl Tween20根据实例1的方法制备。

每3x10⁶人H460非小肺癌细胞与BD Matrigel^TM(BD Biosciences；San Jose，CA，USA；产品编号356237)以1∶1的比例混合，并皮下注射至28NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories；Bar Harbor，ME，USA)的后背。一旦动物形成可触摸的肿瘤(异种移植后12天)，则在第12、15和18天对多组动物(7只一组)进行瘤内注射100μg用PORE配制的hsa-miR-34a或hsa-miR-124a(Dharmacon，Lafayette，CO)(注射量为200μl的寡核苷酸，其在PORE中的浓度为500ng/μl)。依据用于hsa-miR-34a和hsa-miR-124a的相同注射时间表，对对照组的7只动物中的每一只进行瘤内注射100μg阴性对照miRNA(miR-NC；Dharmacon，Lafayette，CO)。此外，对一组4只H460荷瘤小鼠进行瘤内注射无miRNA的磷脂-油脂乳状液，并对一组4只动物进行瘤内注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。每1至2天进行卡钳测量，并用下式计算肿瘤的体积∶体积＝长x宽x宽/2，其中长大于宽。

如图11所示，3剂量配制的hsa-miR-34a(图11A，白色方格)或3剂量PORE-配制的hsa-miR-124a(图11B，白色菱形)显著地抑制确诊的H460肺肿瘤的生长。相反，用PORE-配制的阴性对照miRNA(miR-NC，黑色圆圈)治疗的肿瘤以稳定的速度生长，并且生成的肿瘤具有类似于仅用PBS或磷脂-油脂乳状液(黑色菱形和黑色方格)治疗的动物肿瘤的平均大小。在第20天，用配制的hsa-miR-34a治疗的肿瘤平均体积为用配制的miR-NC治疗的肿瘤平均体积的22.2％，其p值在第13天至第20天小于0.01。同样，在第20天，用配制的hsa-miR-124a治疗的肿瘤平均体积为用配制的miR-NC治疗的肿瘤平均体积的26.9％，示出p值在第14天至第20天小于0.01。

所述数据表明PORE促进治疗miRNA hsa-miR-34a和hsa-miR-124a成功递送至肿瘤细胞内，从而显著并特异地抑制肿瘤的生长。

实例10：PORE制剂中的治疗miRNA的系统递送抑制小鼠内肿瘤的生长

发明者评估了基于中性磷脂的油脂乳状液通过系统施用向活体内肿瘤细胞成功地递送治疗寡核苷酸的能力。

将100μg合成hsa-miR-34a、hsa-miR-124a或阴性对照miRNA寡核苷酸(miR-NC)(Dharmacon，Lafayette，CO)在200μl PBS中的溶液添加至冻干的磷脂-油脂混合物来达到在PORE中寡核苷酸的最终浓度500ng/μl，所述冻干的磷脂-油脂混合物由100μg抗坏血酸、3μl角鲨烯、1mg DOPC和49μl Tween20根据实例1的方法制备。

每3x10⁶人H460非小肺癌细胞与BD Matrigel^TM(BD Biosciences；San Jose，CA，USA；产品编号356237)以1∶1的比例混合，并皮下注射至16NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories；Bar Harbor，ME，USA)的后背。动物形成可触摸的肿瘤之后(异种移植后12天)，则在第12、15和18天对多组动物(4只一组)中的每一只进行静脉注射100μg PORE-配制的hsa-miR-34a或hsa-miR-124a(Dharmacon，Lafayette，CO)(注射量为200μl的寡核苷酸，其在PORE中的浓度为500ng/μl)。依据用于hsa-miR-34a和hsa-miR-124a的相同注射时间表，对对照组的4只动物中的每一只进行静脉注射100μgPORE-配制的阴性对照miRNA(miR-NC；Dharmacon，Lafayette，CO)。此外，对一组4只H460荷瘤小鼠进行静脉注射无miRNA的磷脂-油脂乳状液。每1至2天进行卡钳测量，并用下式计算肿瘤的体积∶体积＝长x宽x宽/2，其中长大于宽。

如图12所示，3剂量配制的hsa-miR-34a(图12A，白色方格)或3剂量配制的hsa-miR-124a(图12B，白色菱形)显著地抑制确诊的H460肺肿瘤的生长。相反，用配制的阴性对照miRNA(miR-NC，黑色圆圈)治疗的肿瘤以稳定的速度生长，并且生成的肿瘤具有类似于仅用磷脂-油脂乳状液(黑色方格)治疗的动物肿瘤的平均大小。在第20天，用配制的hsa-miR-34a治疗的肿瘤平均体积为用配制的miR-NC治疗的肿瘤平均体积的30.1％，其p值在第14天至第20天小于0.01。同样，在第20天，用配制的hsa-miR-124a治疗的肿瘤平均体积为用配制的miR-NC治疗的肿瘤平均体积的30.8％，示出p值在第15天至第20天小于0.01。

所述数据显示显著和特异肿瘤生长的抑制。

实例11：PORE制剂中不同剂量的治疗miRNA的系统递送

发明者评估了使用中性磷脂油脂乳剂进行系统递送治疗寡核苷酸的活体内剂量响应。

合成hsa-miR-34a(Dharmacon，Lafayette，CO)用PORE依据实例1所述的实验步骤进行配制。通过调整PORE与寡核苷酸总量的比例和用磷酸盐缓冲盐水(PBS)调整所需的浓度来制备各种hsa-miR-34a制剂，该制剂在PORE中的浓度为500ng/μl、100ng/μl、10ng/μl和1ng/μl。假定注射量为200μl，则采用以下miRNA剂量：100μl、20μl、2μl和200ng。假定小鼠平均体重为20g，则这些剂量表示5mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg和0.01mg/kg。

每3x10⁶人H460非小肺癌细胞与BD Matrigel^TM(BO Biosciences；San Jose，CA，USA；产品编号356237)以1∶1的比例混合，并皮下注射至15NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories；Bar Harbor，ME，USA)的后背。一旦动物形成可触摸的肿瘤(异种移植后12天)，则对多组动物(3只一组)中的各只以500ng/μl、100ng/μl、10ng/μl和1ng/μl的浓度进行静脉注射200μgPORE-配制的hsa-miR-34a。作为阴性对照，单独一组的3只荷瘤动物中的各只接受200μl PBS。在第15天和第19天进行重复治疗。每1至2天进行卡钳测量，并用下式计算肿瘤的体积∶体积＝长x宽x宽/2，其中长大于宽。

如图13A所示，相对于PBS，在使用的所有剂量下hsa-miR-34a均抑制肿瘤的生长。在最高剂量(5mg/kg)时实现对肿瘤生长最大的抑制，并且0.01mg/kg的hsa-miR-34a具有最差的疗效。相对于PBS数据，hsa-miR-34a数据的p值范围小于0.05(5mg/kg，第14、15和20天；1mg/kg，第15至21天；0.1mg/kg，第19至21天；0.01mg/kg，第20天)和小于0.01(5mg/kg，第16至19天和第21天)，从而表明统计显著性。为直接比较各种剂量hsa-miR-34a的效果，肿瘤体积以相对于其各自肿瘤体积在第12天的变化百分比进行绘制(开始治疗，100％；图13B)。hsa-miR-34a的剂量依存性的效果与治疗剂的一般动力学相一致，并表明肿瘤生长的抑制是对治疗剂的特异响应。

实例12：将治疗miRNA递送至小鼠内的原位肺癌移植瘤

在实例8中，发明者表明了基于中性磷脂的油脂使用荧光素酶定向的siRNA将小寡核苷酸递送至小鼠内的原位生长的肺肿瘤的能力。在本实例中，使用PORE-配制的治疗miRNA寡核苷酸抑制小鼠内的肺肿瘤的原位生长。

如实例1所述，合成hsa-miR-124a(Dharmacon，Lafayette，CO)用PORE制备，其最终浓度为100ng/μl寡核苷酸。

通过气管插管将各3x10⁶H460肺癌细胞移植至免疫失能的NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories；Bar Harbor，ME，USA)的肺内。通过

成像系统(Xenogen，Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA)对小鼠进行定期监测，该系统在荧光素酶基质荧光素的腹膜内注射后测量发光(荧光素酶活性)。由于H460细胞稳定表达荧光素酶，所以发光信号直接地与活肿瘤细胞相关。一旦小鼠形成易于检测的肺肿瘤(接种后39天)，则对每只小鼠进行尾静脉注射含有20μg PORE-配制的hsa-miR-124a的200μl溶液。假定小鼠平均体重为20g，则该剂量为1mg/kg的小鼠体重。作为对照，使用具有相似肺肿瘤大小的小鼠，并且其在整个实验过程中未进行治疗。在随后的13天中，每隔一天重复静脉注射PORE-配制的hsa-miR-124a。频繁地记录下发光，并且在第52天处死两只小鼠。

正如预料的那样，未经治疗的小鼠显示出发光随着时间的延长稳定地增加，表明H460肿瘤继续在肺内生长(未经治疗，图14)。相反，第一次注射治疗miRNA后不久，用PORE-配制的hsa-miR-124a系统地治疗的小鼠显示肺肿瘤的消失。根据发光数据，用has-miR-124a治疗的小鼠的肿瘤体积为未经治疗小鼠的肿瘤体积的0.22％。所述数据表明PORE促进治疗hsa-miR-124a成功递送至肿瘤细胞，所递送的量足以诱发自然存在部位生长的肺肿瘤内的治疗响应。

实例13：活体内siRNA系统递送中的PORE乳状液

包含油脂/蜡和中性脂质的制剂影响向动物肿瘤细胞的系统递送。DOPC、DOPE和DPPE在制剂中用作中性脂质，并且角鲨烯、椰子油、steedman蜡、棕榈油、蜂蜡、大麻子油、亚麻油、Ω-3-鱼油、植物油和橄榄油用作油脂和蜡。一直不变的组分为抗坏血酸和Tween20。脂质组分与在200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的100μgRNAi试剂混合。组分的详情在表2-4中进行描述。该制剂按照实例1所述的试验方法进行制备。

表2：使用各种油脂和蜡的基于DOPC的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

表3：使用各种油脂和蜡的基于DOPE的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

表4：使用各种油脂和蜡的基于DPPE的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

稳定地表达荧光素酶的每3x10⁶人H460非小肺癌细胞与BD Matrigel^TM(BO Biosciences；San Jose，CA，USA；产品编号356237)以1∶1的比例混合，并皮下注射至NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories；Bar Harbor，ME，USA)的后背。通过IVIS成像系统(Xenogen，Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA)对小鼠进行定期监测，该系统在荧光素酶基质荧光素的腹膜内注射后测量发光(荧光素酶活性)。小鼠形成易于检测的肺肿瘤之后，则记录下总发光数据(总通量，0时)。测量发光后，立即对小鼠进行尾静脉注射含有100μg荧光素酶定向的siRNA(si-luc)的200μl PORE，该PORE采用表2-4所述的组合物。作为阴性对照，一组小鼠接受PBS静脉注射。注射配制的寡核苷酸后48时，再次测量发光并表示为相对于每只小鼠在0时(100％)总通量的变化百分比。因此，可以测量荧光素酶沉默的程度。

实例14：PORE中的Tween20

siRNA系统递送中各种Tween20浓度，包括油脂与Tween20的比例范围从3∶0至3∶100，均在表5中进行描述。使用这些不同Tween20浓度的PORE制剂按照实例1所述进行制备。以定量进行添加的组分为抗坏血酸、角鲨烯和DOPC。如上所述，脂质组分与在200μlPBS中的100μgRNAi试剂混合。

表5：使用各种Tween20浓度的基于DOPC的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

如实例13所述，表5所述制剂递送RNAi试剂的能力使用稳定地表达荧光素酶的H460肿瘤模型和作为RNAi试剂的荧光素酶定向siRNA进行测试。仅在配制siRNA的i.v注射之前(0时)和注射后48时对荧光进行记录。荧光值(总通量)被表达为相对于每鼠在0时总通量(100％)的变化百分比。

实例15：油脂/蜡和中性脂质乳状液

将表6-8列出的各种油脂/蜡和中性脂质PORE制剂进行制备、与合成miRNA相复合、在原生质中进行培养并测试完整的miRNA。表6-8示出的各种混合物如实例1所述进行混合、凝固并干燥。脂质组分与在200μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的100μgRNAi试剂混合。

表6：使用各种油脂和蜡的基于DOPC的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

表7：使用各种油脂和蜡的基于DOPE的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

表8：使用各种油脂和蜡的基于DPPE的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

将miRNA/脂质/油脂乳状液添加至10％的血浆溶液，并在室温下培养从0至24时之间的各种时间段。使用miRVana RNA提取试剂盒(Ambion)，采用制造商推荐的血浆RNA提取步骤，对样本的RNA进行回收。使用用于靶标miRNA的

测定法和用于miR-24的第二

测定法对所得的RNA样本进行qRT-PCR分析。每份样本中完整靶标miRNA的相对丰度通过从同一样本的miR-24的Ct值中减去其Ct值进行计算。将每份样本产生的dCt值与靶标miRNA在无油脂/水乳状液的血浆中培养的样本进行对比，从而来判断各种制剂的相对稳定活性。

实例16：PORE中的Tween20

Tween20是稳定在油脂、脂质和RNAi试剂之间形成的微粒的乳化剂。在复合溶液中范围从0至50％的Tween20最终浓度在表9中进行描述。使用这些不同Tween20浓度的PORE制剂如实例1所述进行制备。以定量添加的组分为抗坏血酸、角鲨烯和DOPC。如上所述，脂质组分与200μl PBS中的100μg RNAi试剂混合。

表9：使用各种浓度Tween 20的基于DOPC的油脂乳状液组合物。缩写：N/A，未添加

对表9所述制剂在血浆中稳定合成miRNA的能力，如以上实例所述进行测定。为评估随着时间的延长活性微粒的保持情况，将各种复合物在添加血浆之前在室温下培养0至24小时。对超过1周、1个月、3个月、6个月和1年的稳定性进行评估。

实例17：RNAi试剂与PORE的结合

含有1mg DOPC、3ul角鲨烯、49ul Tween20和100ug siRNA的PORE采用实例1所述的方法进行制备。将该PORE添加至30,000标称分子量极限过滤器装置(Millipore corp.，Billerica，Ma)，并在室温下以10,000X g进行离心10分钟。在单独的试管中回收流过和截留的物质，并与已用TE(pH7.5)稀释100,000倍的SYBR Gold(Invitrogen)混合。将该溶液在室温下培养5分钟，并且随后通过使用波长为470nm和示值(readout)550nm的光激活染料以评估荧光性。PORE制剂中80％的siRNA通过过滤器被保留，而在没有使用PORE时保留的siRNA不到10％。这表明RNAi试剂与在制剂中由脂质和油脂形成的微粒结合。

实例18：RNAi试剂与含有不同量Tween20的PORE的结合

含有不同量Tween20(表9，实例16)的PORE制剂根据实例1进行制备。与各PORE制剂结合的RNAi试剂的量采用实例17所述的凝胶柱过滤法和SYBR Gold定量法进行测定。

参照本文所公开的本发明的说明书和操作，本发明的其它实施例对本领域的技术人员而言将是显而易见的。说明书和实例仅被视为旨在示例性的，而本发明的真实范围和精神由以下权利要求书进行规定。

本文所引用的所有参考文献的全文均以引用的方式并入本文。如果以引用的方式并入的公开和专利或专利申请与说明书所含的本发明内容相矛盾，则本说明书将取代任何相矛盾的内容。

Claims (25)

1.一种组合物，其包含脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液，其中

所述脂质组分包含20重量％至100重量％的中性磷脂和0至80重量％的油脂或蜡；

所述含水组分包含水性介质中的RNAi试剂；以及

所述表面活性剂包含0.1重量％至50重量％的所述总乳状液。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述中性磷脂为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述油脂为角鲨烯。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20。

5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述RNAi试剂为miRNA。

6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述RNAi试剂为siRNA。

7.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含抗氧化剂。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脂质组分包含20重量％至40重量％的磷脂和60重量％至80重量％的油脂或蜡；并且所述表面活性剂包含40重量％至50重量％的所述总乳状液。

9.一种制备乳状液的方法，包括以下步骤：

a.在有机溶剂中混合中性磷脂、油脂和非离子表面活性剂；

b.蒸发所述有机溶剂以形成干燥的脂质组分；以及

c.将所述脂质组分与水性介质中的RNAi试剂混合；其中

所述脂质组分包含20重量％至100重量％的中性磷脂和0至80重量％的油脂或蜡；

所述RNAi组分包含水性介质中的RNAi试剂；以及

所述表面活性剂包含0.1重量％至50重量％的所述总乳状液。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述中性磷脂为1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述油脂为角鲨烯。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯20。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述RNAi试剂为miRNA。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述RNAi试剂为siRNA。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述脂质组分包含20重量％至40重量％的磷脂和60重量％至80重量％的油脂或蜡；并且所述表面活性剂包含40重量％至50重量％的所述总乳状液。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述蒸发采用冻干法来完成。

17.根据权利要求9所述的方法，其中所述步骤c中的混合采用声波降解法来完成。

18.根据权利要求9所述的方法，进一步包括挤压所述步骤c中形成的混合物。

19.根据权利要求9所述的方法，进一步包括将抗氧化剂添加至所述步骤a中的混合物。

20.一种将RNAi试剂递送至动物的方法，包括将权利要求1所述的组合物施用给所述动物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组合物通过注射给药。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物系统地施药。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述RNAi试剂为miRNA。

24.一种组合物，其包含脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液；其中

所述脂质组分包含20重量％至100重量％的中性磷脂和0至80重量％的油脂或蜡；

所述含水组分包含水性介质中的抗miRNA试剂；以及

所述表面活性剂包含0.1重量％至50重量％的所述总乳状液。

25.一种组合物，其包含脂质组分、含水组分和非离子表面活性剂的乳状液；其中

所述脂质组分包含20重量％至100重量％的中性磷脂和0至80重量％的油脂或蜡；

所述含水组分包含水性介质中的核酸适体；以及

所述表面活性剂包含0.1重量％至50重量％的所述总乳状液。

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