CN101646769A - 无脊椎动物微rna - Google Patents

无脊椎动物微rna Download PDF

Info

Publication number
CN101646769A
CN101646769A CN200880010470A CN200880010470A CN101646769A CN 101646769 A CN101646769 A CN 101646769A CN 200880010470 A CN200880010470 A CN 200880010470A CN 200880010470 A CN200880010470 A CN 200880010470A CN 101646769 A CN101646769 A CN 101646769A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
plant
invertebrates
natural
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200880010470A
Other languages
English (en)
Inventor
E·艾伦
W·P·多诺万
G·R·赫克
J·K·罗伯特
V·厄辛
张远记
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Co
Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Co filed Critical Monsanto Co
Publication of CN101646769A publication Critical patent/CN101646769A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供对无脊椎动物害虫有抗性的植物。更具体地，本发明公开原位表达至少一种无脊椎动物miRNA以抑制无脊椎动物害虫的或与其相关的共生体的目标基因的非天然转基因植物。本发明还提供用于原位表达至少一种无脊椎动物miRNA的重组DNA构建体、包含本发明非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物、由本发明非天然转基因植物细胞生长的非天然转基因植物和由该非天然转基因植物产生的种子，以及由本发明的非天然转基因植物细胞、植物或种子产生的商品。本发明还提供抑制植物无脊椎动物害虫的或与其相关的共生体的至少一种目标基因的方法，包括提供含本发明非天然转基因植物细胞的植物，其中所述无脊椎动物是无脊椎动物害虫，重组DNA在非天然转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体，且当无脊椎动物害虫摄取重组miRNA前体时，该至少一种目标基因被抑制。

Description

无脊椎动物微RNA
相关申请的交叉引用和序列表的引入
本申请要求2007年2月20日提交的美国临时专利申请60/890705的优先权利益，该申请通过引用全文并入本申请。包含在名称为“38-21_54478_A.txt”的文件(其在操作系统MS-Windows中测量为35kb，且在2007年2月15日创建和在2007年8月20日与美国临时专利申请60/890705一起提交)中的序列表通过引用并入本申请。
序列表的引入
包含在2007年2月12日创建的名称为“38-21_54478_B.txt”的文件(其在操作系统MS-Windows中测量为35kb)中的序列表在此一起提交并通过引用并入本申请。
发明领域
本发明涉及从无脊椎动物鉴别的新型微RNA(microRNA)和微RNA前体，以及包括这些新型miRNA、miRNA前体和对应于该miRNA的miRNA识别位点的重组DNA构建体。本发明还公开了基因组中包含本发明的重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞、植物和种子。本发明进一步提供使用本发明的重组DNA构建体抑制基因的方法。
背景技术
微RNA(miRNA)是非蛋白质编码性RNA，一般在大约19至大约25核苷酸之间(在植物中通常为大约20-24核苷酸)，其引导目标转录物的反式(in trans)切割，从而负调节涉及各种调节和发育途径的基因的表达(Bartel(2004)Cell，116：281-297)。在某些情况中，miRNA起到引导siRNA原始转录物的同步(in-phase)加工的作用(参见Allen等(2005)Cell，121：207-221)。
许多微RNA基因(MIR基因)已经得到确认并在数据库(“miRBase”，在microrna.sanger.ac.uk/sequences上在线提供；另外参见Griffiths-Jones等(2003)Nucleic Acids Res.，31：439-441)中向公众提供。微RNA首先在线虫类中报道并由那时起在其它无脊椎动物中得到鉴别，参见例如Lee和Ambros(2001)Science，294：862-864；Lim等(2003)Genes Dev.，17：991-1008；Stark等(2007)Genome Res.，17：1865-1879。MIR基因已报道存在于基因间区域，在基因组中孤立地或成簇存在，但也可以全部或部分位于其它基因(蛋白质编码基因和非蛋白质编码基因)的内含子中。miRNA生物发生的最近综述参见Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385。MIR基因的转录至少在某些情况中可以处于MIR基因本身的启动子的起动控制之下。称为“pri-miRNA”的原始转录物可以相当大(几个千碱基对)并可以是多顺反子性的，从而包含一个或多个pre-miRNA(含有加工成成熟miRNA的茎-环(stem-loop)排列的折回(fold-back)结构)以及常见的mRNA的5’“帽”和多腺苷酸尾。参见，例如Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385中的图1。
成熟miRNA从其相应的前体(pri-miRNA和pre-miRNA)达到成熟在动物和植物之间具有显著差异。例如，在植物细胞中，微RNA前体分子被认为完全在核中大部加工成成熟miRNA，而在动物细胞中，pri-miRNA转录物在核中通过动物特异性的酶Drosha加工，随后输出pre-miRNA到胞质中，在此它进一步加工成成熟miRNA。植物中的成熟miRNA长度通常为21个核苷酸，而在动物中最常发现的是22个核苷酸长的miRNA。植物和动物中miRNA生物发生的最近综述参见Kim(2005)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，6：376-385。另外的关于miRNA生物发生和功能的综述见例如Bartel(2004)Cell，116：281-297；Murchison和Hannon(2004)Curr.Opin.Cell Biol.，16：223-229及Dugas和Bartel(2004)Curr.Opin.Plant Biol.，7：512-520。此外，虽然一份最近的报告描述了来自拟南芥(Arabidopsis)的miRNA(miR854)，其也在动物中发现(Arteaga-Vazquez等(2006)Plant Cell，18：3355-3369)，但是miRNA保守性一般表现为界特异性的。动物miRNA前体具有许多与植物对应部分不同的特性，包括倾向于在茎的碱基中发现的具有成熟miRNA序列的较短miRNA前体折回(在动物中的约90个核苷酸对植物中的约180个核苷酸)、折回中较高数目的失配和来自多顺反子信息的衍生(deriviation)。而动物miRNA一般不完全退火结合到它们的目标mRNA的3’未翻译区域(UTR)，大多数植物miRNA特征在于具有完全的或接近完全的与它们的目标序列(其通常在编码区域中)的互补性，仅有一些在目标mRNA的UTR中具有结合位点的miRNA的例子，参见Rhoades等(2002)Cell，110：513-520；Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant Biol.，57：19-53。这些植物和动物miRNA之间的显著差异使得miRNA跨界加工和发挥功能一般来说不太可能。
miRNA(不论是天然产生的序列还是人工序列)的转基因表达可用于调节该miRNA的一个目标基因或多个目标基因的表达。在转基因表达的转录物中包含miRNA识别位点也可用于调节该转录物的表达，参见例如，Parizotto等(2004)Genes Dev.，18：2237-2242。miRNA的识别位点已在mRNA的所有区域中得到证实，包括5’未翻译区域、编码区域和3’未翻译区域，从而表明与编码序列相关的miRNA目标位点的位置可能不必然影响抑制(参见，例如Jones-Rhoades和Bartel(2004).Mol.Cell，14：787-799，Rhoades等(2002)Cell，110：513-520，Allen等(2004)Nat.Genet.，36：1282-1290，Sunkar和Zhu(2004)PlantCell，16：2001-2019)。因为miRNA是真核细胞中重要的调节元件，miRNA的转基因抑制可用于操控生物途径和反应。最终，MIR基因的启动子可具有非常特异性的表达模式(例如，细胞特异性的、组织特异性的、时间特异性的或可诱导的)，并因此可用于重组构建体中以诱导它们可操作地连接的DNA序列的这种特异性转录。miRNA、它们的前体、它们的识别位点和它们的启动子的各种用途在美国专利申请公开2006/0200878A1中详细地进行了描述，该文献通过引用并入本申请中。这些用途的非限制性的例子包括：(1)原始miRNA或miRNA前体序列的表达以抑制目标基因；(2)工程化(非原始)miRNA或miRNA前体序列的表达以抑制目标基因；(3)具有miRNA识别位点的转基因的表达，其中当成熟miRNA表达时所述转基因被抑制；(4)miRNA启动子驱动的转基因表达。
动物miRNA已用作在动物细胞中表达特定miRNA的前体；例如，人miR-30前体在培养细胞中表达为原始序列和表达为修饰的(人工的或工程化的)miRNA(Zeng等(2002)Mol.Cell，9：1327-1333和Zeng等(2005)J.Biol.Chem.，280：27595-27603)。单个成熟miRNA从给定的前体进行精确加工，并因此这类“人工的”或工程化的miRNA提供优于双链RNA(dsRNA)的优势在于仅特定miRNA序列被表达，从而限制了潜在的偏离目标(off-target)效应。虽然动物miRNA通常与3’UTR中的不完全目标序列(imperfect target sequence)相互反应，但具有完全目标互补性的合成miRNA也能引导目标切割(参见Zeng等(2003)RNA，9：112-123和Zeng等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100：9779-9784)。
称作短干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)的小RNA已表明在植物和动物中调节基因表达(Valencia-Sanchez等(2006)Genes Dev.，20：515-524；Nelson等(2003)Trends Biochem.Sci.，28：534-540)。siRNA水平的实验性改变导致线虫的表型效应(Timmons和Fire(1998)Nature，395：8543)。转基因表达与根结线虫16D10基因互补的siRNA的植物表明具有对四种根结线虫的抗性(Huang等(2006)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，103：14302-14306)。本发明公开了原位(in planta)表达的重组无脊椎动物miRNA类似地调节摄取该miRNA的无脊椎动物中的表达的用途。
本发明公开了编码无脊椎动物成熟miRNA及它们的miRNA前体的重组DNA构建体，所述成熟miRNA及它们的miRNA前体设计为原位表达。在一些实施方式中，无脊椎动物miRNA前体被工程化以表达设计为抑制特定无脊椎动物基因或使其静默的人工miRNA，从而使得植物表达对抗(resistence)无脊椎动物的miRNA，该无脊椎动物摄取所述miRNA。在许多情况中，意图抑制无脊椎动物目标的RNAi(siRNA或miRNA)转录物优选以较大的转录物(即大于通常由原位加工产生的21-24核苷酸片段)被无脊椎动物摄取。因此，意在用于摄取的RNAi转录物优选设计为对原位加工有抗性。本发明的重组无脊椎动物miRNA优选对植物特异性的内源miRNA加工有抗性(与植物来源的miRNA相比)，但优选很容易被无脊椎动物细胞识别，它们在所述无脊椎动物细胞中被加工。
发明内容
在一个方面中，本发明提供对从植物摄取RNA的无脊椎动物害虫具有抗性的非天然植物，其中该植物包含其基因组中含有在转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体的重组DNA构建体的植物细胞，且该重组miRNA前体包括RNA的单链，该RNA的单链折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构并包含加工成成熟miRNA的至少一个茎环；并且该成熟miRNA抑制无脊椎动物害虫(或与该无脊椎动物害虫相关的共生体)的至少一个目标基因的表达，从而赋予该非天然植物对该无脊椎动物害虫的抗性。
本发明的另一方面提供在非天然转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体的重组DNA构建体。在许多实施方式中，该重组DNA构建体进一步包含一个或多个选自以下的元件：(a)在植物细胞中发挥功能的启动子；(b)转基因转录单元；(c)基因抑制元件和(d)转录调节/转录物稳定元件。
在进一步的方面中，本发明提供其基因组中含有在非天然转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体的重组DNA的非天然转基因植物细胞，其中该重组miRNA前体包含RNA的单链，该RNA的单链折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构且包含加工成成熟miRNA的至少一个茎环，并且其中该成熟miRNA抑制无脊椎动物(或与该无脊椎动物害虫相关的共生体)的至少一个目标基因的表达。本发明还提供包含本发明的转基因植物细胞的非天然转基因植物、从本发明的转基因植物细胞生长的非天然转基因植物和由该转基因植物产生的非天然转基因种子，以及由本发明的非天然转基因植物细胞、植物或种子产生的商品。
本发明的其它特定实施方式在下面的详细说明中公开。
附图简述
图1显示了如实施例1中描述的多种无脊椎动物miRNA前体的非限制性的例子，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)“8-miR”序列(SEQ IDNO.1)。各miRNA前体通过加下划线的粗体文字表示。
图2显示了实施例1和表1中描述的黑腹果蝇“8-miR”序列的8miRNA前体各自的折回结构(即，包括加工成成熟miRNA的茎环的miRNA前体二级结构)。成熟miRNA以粗体大写字体表示在折回结构中。折回结构的茎区域一般通过表明折叠链的第一和第二片段之间的碱基配对的垂直细线表示；环区域在各种情况中表示在茎区域的右侧。这图示了错配的非限制性实施方式(参见0024段)，其中第一片段的至少一个核苷酸未在通过茎区域包含的第一和第二片段的杂交形成的部分双链RNA中配对。错配的一个实例是处于dme-mir-5(SEQ ID NO.15)中与第一片段中所说的核苷酸对应的位置处的该至少一个额外的或至少一个缺失的核苷酸。错配的另一个实例由me-mir-309(SEQ ID NO.11)中的多个非碱基配对核苷酸表示。
图3显示了如表2中所列的和实施例1中所描述的原始miRNA前体及各原始miRNA前体的对应工程化miRNA前体。工程化miRNA前体中的二级结构(即，折回结构)优选保持与对应的原始miRNA前体的二级结构相似。请注意，环区域可以包括一个以上的单链片段(参见SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.38的结构)。
图4显示了用于原位测试如实施例1中所描述的工程化miRNA前体的稳定性的RNA印迹分析。“+”表示来自用pMON97878转化的植物的RNA；“-”表示阴性对照。“8mirvATPase-16”(SEQ ID NO.46)RNA作为全长“8mirvATPase-16”转录物和作为降解的RNA存在于烟草植物中，表明“8mirvATPase-16”RNA在植物中比由反向重复序列(即，与同一目标基因的反义序列相邻的正义序列)产生的相应双链RNA更稳定，反向重复序列被发现完全原位切割成小的RNA(数据未显示)。
图5显示了如实施例2中所描述的折回结构(即，表4中所列的无脊椎动物miRNA前体的二级结构，各包括至少一个加工成成熟miRNA的茎环，其中该茎环包括茎区域和环区域)的非限制性例子。
图6A显示了如实施例4中所描述的原始“SCN15”pre-miRNA序列(SEQ ID NO.57)，其折回的互补区域经改变以保持原始的配对和未配对碱基，从而产生对应的工程化pre-miRNA序列“SCN15-MIRMSP1”(SEQID NO.92)。图6B显示了如实施例5中所描述的原始“SCN25”pre-miRNA序列(SEQ ID NO.58)，其折回的互补区域经改变以保持原始的配对和未配对碱基，从而产生对应的工程化pre-miRNA序列“SCN25-MIRcgh1”(SEQ ID NO.96)。
图7示意性地显示了如实施例6中所描述的非限制性重组DNA构建体。为用于植物细胞的土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化，在各构建体中一般包含至少一个T-DNA边界(未显示)。这些构建体包含启动子元件(“pro”)、在一侧或两侧与非蛋白质编码DNA相接的内含子、任选的终止子元件(“ter”)、用于抑制至少一个第一目标基因的至少一个第一基因抑制元件(“GSE”或“GE1”)，且可以任选包含用于抑制至少一个第二目标基因的至少一个第二基因抑制元件(“GSE2”)、用于表达至少一个所关注的基因的至少一个基因表达元件(“GEE”)或者包含这两者。在包含基因表达元件的实施方式中，该基因表达元件可位于内含子邻近(内含子之外)。在这一实施方式的一种变型(未显示)中，基因抑制元件(嵌入在一侧或两侧与非蛋白质编码DNA相接的内含子中)位于终止子的3’侧。在本发明的其它构建体(未显示)中，基因抑制元件(非内含子嵌入的)位于终止子的3’侧。
图8显示了如实施例6中所描述的基因抑制元件的各种非限制性的例子。在画作单链时(图6A至图6E)，按照惯例沿5’至3’(左至右)的转录方向描绘，其中箭头表示反义序列(箭头指向左侧)或正义序列(箭头指向右侧)。在画作双链(反平行)转录物时(图6F和6G)，5’和3’转录方向性如图所示。实线、虚线和点线表示以不同目标基因作为目标的序列。
具体实施方式
除非另外定义，所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。一般，所使用的命名和下面所描述的制备或实验过程是公知的且为现有技术中普遍采用。常规方法用于这些过程，例如在现有技术中和各种通用参考资料中提供的常规方法。除非另外说明，在本发明说明书文字中的核酸序列在从左向右阅读时以5’至3’的方向给出。核酸序列可以按照说明以DNA或RNA提供，如本领域技术人员已知的，公开了DNA和RNA中的一个则必然确定另一个。在一个项目以单数形式提供的情况下，本发明还包括以该项目的复数形式描述的本发明的方面。所使用的命名和下面所描述的实验过程是本领域中公知的和普遍采用的。在通过引用并入的参考文献中所使用的术语和定义存在差异的情况下，本申请中所使用的术语应具有所给出的定义。所使用的其它技术术语具有它们所使用的领域中的普通含义，如多种技术词典中举例说明的。本发明人不意图限制于某种作用机理或模式。提供的对作用机理或模式的引用仅用于举例说明的目的。
对无脊椎动物害虫具有抗性的植物
在一个方面中，本发明提供对从植物摄取RNA的无脊椎动物害虫具有抗性的非天然植物，其中该植物包括基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物细胞，所述重组DNA构建体在转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体，且该重组miRNA前体包括RNA的单链，该RNA的单链折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构并包括至少一个加工成成熟miRNA的茎环；并且该成熟miRNA抑制无脊椎动物害虫(或与该无脊椎动物害虫相关的共生体)的至少一个目标基因的表达，从而赋予该非天然植物对该无脊椎动物害虫的抗性。
在另一个方面中，本发明还特别公开和要求在转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体的重组DNA构建体。重组DNA构建体通过本领域已知的技术制备，例如在标题为“制备和使用重组DNA构建体”的部分中描述的和在工作实施例中说明的技术。重组DNA构建体特别用于制备如下面“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”部分所讨论的转基因植物细胞、转基因植物和转基因种子。重组miRNA前体一般转录为单链RNA。该单链RNA包括至少一个可被认为等同于天然发生的pre-miRNA的茎环，原因在于它被加工成成熟miRNA。当该单链本身折回且发生足够的碱基配对以稳定所产生的折叠结构时形成茎环。该茎环包括茎区域和环区域，其全部位于同一单链RNA内。茎区域包括通过环区域接合的第一片段和第二片段。请注意，环区域可以包括比简单的单链环更复杂的结构，其非限制性的例子由图3中的mir286(SEQ ID NO.13)及其工程化对应体(SEQ ID NO.38)说明。第一片段包括用于使编码目标基因的信使RNA静默的至少19个连续核苷酸。第二片段包含至少19个连续核苷酸。第一片段和第二片段一般具有相似的长度(就构成各片段的连续核苷酸数目而言)，但不是必须具有相同的长度。环区域位于第一和第二片段之间的单链上。第一和第二片段杂交以形成部分双链RNA，其中第一片段的至少一个核苷酸未配对；也就是说，在所述的部分双链RNA中，存在至少一个与第二片段上的相应位置错配的第一片段的核苷酸。该错配导致在其它地方基本双链的茎区域中形成凸起或环或结。错配可能是由于例如第二片段的至少一个核苷酸未与第一片段中的所述核苷酸碱基配对，或者在第二片段与第一片段中所述核苷酸对应的位置上存在至少一个额外的或至少一个缺失的核苷酸。图2显示了错配的非限制性的例子。
茎区域的第一片段包括用于使编码目标基因的信使RNA(“目标mRNA”)静默的至少19个连续核苷酸；从茎环加工的成熟miRNA包括该至少19个连续核苷酸。该至少19个连续核苷酸与目标mRNA中的等长片段具有至少大约70％的互补性(也就是说，与具有大约相同数目的连续核苷酸的片段的至少大约70％的互补性)。例如，在茎区域的第一片段由使目标mRNA静默的恰好19个连续核苷酸组成的情况中，该19个连续核苷酸可以包括与目标mRNA中的19-核苷酸片段互补的13个核苷酸(13/19＝68％的互补性)、14个核苷酸(14/19＝74％的互补性)、15个核苷酸(15/19＝79％的互补性)、16个核苷酸(16/19＝84％的互补性)、17个核苷酸(17/19＝89％的互补性)、18个核苷酸(18/19＝95％的互补性)或甚至19个核苷酸(19/19＝100％的互补性)。
在优选的实施方式中，该至少19个连续核苷酸与目标mRNA中的等长度的片段具有至少大约75％、或至少大约80％、或至少大约85％或至少大约90％的互补性。在一个特别优选的实施方式中，该至少19个连续核苷酸与目标mRNA中的等长度的片段具有至少大约95％的互补性。在另一个特别优选的实施方式中，该至少19个连续核苷酸与目标mRNA中的等长度的片段具有100％的互补性。
茎区域第一片段的至少19个连续核苷酸与目标mRNA中的等长度的片段之间的互补性程度很容易由本领域技术人员选择。已经报道，朝向成熟miRNA的5’末端定位的核苷酸与目标mRNA之间的碱基配对在成熟miRNA使目标mRNA的表达静默的能力中相对重要(参见，例如Doensch和Sharp(2004)Genes Dev.，18：504-511)，且预期成熟miRNA的5’末端与靶标之间的高互补性可以允许更接近于成熟miRNA的3’末端的核苷酸与靶标(反之亦然)相对高的失配程度。因此，在优选的实施方式中，选择茎区域第一片段的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，从而从茎环加工的成熟miRNA在该成熟miRNA5’端的最多8个核苷酸与目标mRNA完全互补。在另一个优选的实施方式中，选择茎区域第一片段的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，从而从茎环加工的成熟miRNA在该成熟miRNA的2、3、4、5、6和7位置(从5’末端算)的核苷酸与目标mRNA完全互补。在另一个优选的实施方式中，设计茎区域第一片段的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列，从而从茎环加工的成熟miRNA具有很少或没有G:U摆动碱基对(wobble base pair)。
茎环的环区域通常包括大约4至大约40个核苷酸。在一些优选的实施方式中，环区域包括无脊椎动物miRNA前体的原始环序列的连续核苷酸。在一些实施方式中，环区域与无脊椎动物miRNA前体的原始环序列相同。
在一些实施方式中，茎环在转基因植物细胞中加工成成熟miRNA，成熟miRNA通常具有21、22、23、24、25或26个核苷酸的长度。在其它的实施方式中，茎环优选在转基因植物细胞中保持相对完整(即，基本上未切割成较小的多核苷酸)，但在从包括转基因植物细胞的植物摄取RNA的无脊椎动物的消化道中或者在其细胞中或细胞上加工成成熟miRNA(通常具有21、22、23、24、25或26个核苷酸的长度)。
在一个实施方式中，单链RNA包括加工成成熟miRNA的单个茎环。在另外的实施方式中，单链RNA包括加工成成熟miRNA的多个茎环。在存在多个茎环的情况下，它们可以由多个相同的茎环或多个不同的茎环组成。在一个优选的实施方式中，单链RNA包括对应于以多顺反子转录单元原始转录的一组无脊椎动物miRNA的多个茎环。一个非限制性的例子是包括与黑腹果蝇染色体2R上发现的8miRNA多顺反子组对应的多个茎环的单链RNA(SEQ ID NO.1，参见实施例1)。
受到成熟miRNA抑制的无脊椎动物害虫(或与该无脊椎动物害虫相关的共生体)的目标基因可以是单个目标基因或可以是多个目标基因(例如，给定目标基因的多个等位基因或多个不相关的目标基因)。受关注的目标基因在“目标基因和有害无脊椎动物”的章节中进行了详细描述。
在一些实施方式中，所述至少一个目标基因是由无脊椎动物miRNA前体原始表达的无脊椎动物miRNA的内源或原始靶标。在这些实施方式中，从茎环加工的成熟miRNA与从天然产生的无脊椎动物miRNA前体原始加工的成熟miRNA相同(或几乎相同)。因此，一般地，重组miRNA前体基本上与无脊椎动物miRNA前体相似，虽然重组miRNA前体被设计成一般在非原始条件下表达成熟miRNA。在非限制性的实施例中，重组DNA编码原始无脊椎动物miRNA前体，在与无脊椎动物miRNA前体的原始启动子不同的启动子控制下表达。
在其它的实施方式中，该至少一个目标基因是由无脊椎动物miRNA前体原始表达的无脊椎动物miRNA的内源靶标以外的基因。在这些实施方式中，从茎环加工的成熟miRNA是“工程化的miRNA”，即具有设计为抑制所选择的目标基因的人工序列的成熟miRNA。在这种工程化miRNA序列的设计中考虑的因素在“目标基因和有害无脊椎动物”的章节中、在工作实施例中和在本说明书的其它部分进行了详细描述。
无脊椎动物害虫是至少一种或多种选自昆虫、蛛形纲动物(例如，螨类)、线虫、软件动物(例如，蛞蝓和蜗牛)和环节动物的无脊椎动物，且可以包括与无脊椎动物害虫具有共生关系的无脊椎动物(例如，某些蚂蚁与蚜虫类之间的互惠共生关系)。本文中使用的术语“共生”关系涵盖其中两种或多种相关的物种中的至少一种受益的兼性(非专性)和专性共生，且进一步包括互惠共生、共栖和寄生关系。共生体还包括非无脊椎动物共生体，例如原核生物和真核原生生物。无脊椎动物害虫可以通过以与无脊椎动物害虫内部或外部相关的共生体为靶标间接地控制。例如，已知在许多无脊椎动物(包括受到关注的无脊椎动物害虫)的消化道或其它组织中存在原核共生体。与无脊椎动物害虫相关的作为靶标的共生体的非限制性的例子包括蚜虫内共生细菌巴克纳氏菌(Buchnera)、感染许多昆虫的细菌沃尔巴克氏体(Wolbachia)、玻璃翅神射手(琉璃叶蝉Homalodisca coagulata)的共同共生细菌Baumannia cicadellinicola和Sulcia muelleri，琉璃叶蝉传播皮尔斯病(Pierce’s disease)的病原体苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)、及白蚁中的真核原生生物(鞭毛虫)内共生体。另外参见，例如Wu等(2006)PLoSBiol.，4(6)：e188doi：10.1371/journal.pbio.0040188；Moran和Telang(1998)BioScience，48：295-304及Moran和Baumann(2000)Curr.Opin.Microbiol.，3：270-275。在替代的途径中，无脊椎动物害虫的内源目标基因的表达可以通过控制该无脊椎动物的共生体的方式进行改变，进而影响宿主无脊椎动物。例如，已经报道，使用以果蝇同源框基因Caudal(其抑制核因子κB依赖性抗菌肽基因)为靶标的构建体(包括内含间隔区的目标基因头尾反向重复序列)进行的RNAi介导基因抑制导致抗菌肽的过表达，因此改变了果蝇消化道中的共栖细菌群落并最终导致消化道细胞凋亡和宿主死亡，参见Ryu等(2008)Science，319：777-782。
受关注的害虫在“目标基因和有害无脊椎动物”章节中进行了详细描述。特别受到关注的是吸树汁的昆虫，例如蚜虫、草盲蝽(Lygus)、叶蝉、粉虱、蓟马、介壳虫和粉蚧，以及摄取植物组织和细胞的昆虫，例如磷翅类昆虫的幼虫。非限制性实施方式包括其中(a)所述植物是玉米且所述无脊椎动物害虫是叶甲虫(Diabrotica)类；(b)所述植物是大豆且所述无脊椎动物害虫是大豆异皮线虫(囊线虫病(Heteroderaglycines))；(c)所述植物是葡萄且所述无脊椎动物害虫是葡萄根瘤蚜或玻璃翅神射手(琉璃叶蝉)；和(d)所述植物是苹果树且所述无脊椎动物害虫是苹果绵蚜的实施方式。
在许多实施方式中，重组DNA构建体进一步包括一个或多个选自以下的元件：(a)在植物细胞中发挥功能的启动子；(b)转基因转录单元；(c)基因抑制元件；和(d)转录调节/转录物稳定元件。可用于本发明中的启动子在植物细胞中具有启动子活性。合适的启动子包括在标题“启动子”的部分中详细描述的那些启动子。启动子的非限制性的例子包括组成型启动子、在很可能被有害无脊椎动物接触的组织中具有表达分布的启动子(例如，韧皮部特异性启动子、维管特异性启动子或根特异性启动子)和诱导型启动子，如通过应激(非生物应激或生物应激，如来自有害无脊椎动物侵袭的应激)诱导的启动子。
转基因转录单元包括编码受关注的基因的DNA序列。受关注的基因可以包括来自任何物种(包括，但不限于非真核生物，如细菌和病毒；真菌；原生生物，包括原生动物；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如农作物、观赏植物和非驯化的或野生植物；无脊椎动物，如节肢动物、环节动物、线虫类和软体动物；脊椎动物，如两栖动物、鱼、鸟和哺乳动物)的编码或非编码序列。由转基因转录单元表达的非编码序列的非限制性的例子包括，但不限于5’非翻译区、启动子、增强子或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子、内含子、微RNA、微RNA前体DNA序列、小的干扰RNA、核糖体或核酶的RNA成分、核仁小RNA、能够与配体结合的RNA适体和其它非编码RNA。受关注的基因的非限制性例子进一步包括，但不限于可翻译(编码)序列，如编码转录因子的基因和编码参与受关注的分子(如氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物、及次级代谢产物包括生物碱、萜类、聚酮化合物、非核糖体肽和混合生物合成来源的次级代谢产物)的生物合成或分解代谢的酶的基因。受关注的基因可以是本发明的重组DNA构建体在其中转录的细胞(例如，植物细胞)原始的基因，或者可以是非原始基因。受关注的基因可以是标志基因，例如编码对抗生素、抗真菌剂或除草剂的抗性的可选择标志基因，或者编码易检测的性状的标志基因(例如在植物细胞中，八氢番茄红素合酶或其它给予植物特殊色素的基因)，或者编码可检测的分子(例如荧光蛋白质、萤光素酶或者可分别通过蛋白质或核酸检测方法检测的独特多肽或核酸“标签”)的基因。可选择的标志是在确认本发明构建体的成功操作中具有特别效用的受关注基因。受关注的基因包括在标题“目标基因”部分也如上描述为目标基因的那些基因。转基因转录单元可以按照转基因转录的需要进一步包括5’或3’序列或者包括两者。
基因抑制元件包括设计为具体地抑制受关注的一个或多个基因的任何DNA序列(或其中编码的RNA序列)。在“基因抑制元件”的语境中，“目标基因”一般指被本发明的成熟miRNA静默的无脊椎动物害虫目标基因以外的基因，这可以是转基因植物细胞内生的基因或植物外生的基因。在“基因抑制元件”的语境中，合适的目标基因的非限制性例子还包括氨基酸分解代谢基因(例如，但不限于编码赖氨酸酮戊二酸还原酶(LKR)和酵母氨酸脱氢酶的玉米LKR/SDH基因及其同源物)、玉米蛋白基因、参与脂肪酸合成(如植物微粒体脂肪酸去饱和酶和植物酰基-ACP硫酯酶，例如，但不限于在美国专利6426448和6872872号中公开的那些)的基因、参与多步骤生物合成途径的基因，其中它可以具有调节一种或多种中间体的水平的作用，例如编码多羟基链烷酸酯生物合成的酶的基因(参见，例如美国专利5750848号)以及编码细胞周期控制蛋白质(例如具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂样活性的蛋白质)的基因(参见，例如在国际专利申请公开WO05007829A2中公开的基因)。目标基因可以包括编码不希望的蛋白质(例如，变应原或毒素)或用于生物合成不希望的化合物(例如，不希望的风味或香气成分)的酶的基因。因此，本发明的一个实施方式是转基因植物或进一步通过抑制变应原蛋白质或毒素改良的这种植物的组织(例如具有降低的变应原性的花生、大豆或麦粒)。目标基因可以包括参与果实成熟的基因，例如多聚半乳糖醛酸酶基因。目标基因可以包括其表达优选限制于特定细胞或组织或发育阶段的基因或者其表达优选是瞬时表达的基因，也就是说，并不是必然希望得到组成型的或总体的抑制或者扩散到许多组织的抑制。因此，合适的目标基因的其它例子包括编码蛋白质的基因，当该蛋白质在转基因植物中表达时使得该转基因植物对害虫或病原体有抗性(参见，例如如美国专利5763245号中公开的胆固醇氧化酶基因，还包括其表达为害虫-或病原体-诱导的表达的基因和可以诱导或恢复生育力的基因(参见，例如在美国专利6759575号中描述的barstar/barnase基因)，所有这些在本段落中提及的专利通过引用全文并入本申请中。
合适的基因抑制元件在美国专利申请公开2006/0200878(其通过引用并入本申请)中有详细描述，且包括以下的一种或多种：
(a)包括与目标基因的至少一个片段反义的至少一个反义DNA片段的DNA；
(b)包括与目标基因的至少一个片段反义的至少一个反义DNA片段的多个拷贝的DNA；
(c)包括本身为目标基因的至少一个片段的至少一个正义DNA片段的DNA；
(d)包括本身为目标基因的至少一个片段的至少一个正义DNA片段的多个拷贝的DNA；
(e)转录为通过形成双链RNA抑制目标基因的RNA并包括对至少一个目标基因的片段反义的至少一个反义DNA片段和作为至少一个目标基因的片段的至少一个正义DNA片段的DNA；
(f)转录为通过形成单个双链RNA抑制目标基因的RNA并包括对至少一个目标基因的片段反义的多个串联反义DNA片段和作为至少一个目标基因的片段的多个串联正义DNA片段的DNA；
(g)转录为通过形成多个双链RNA抑制目标基因的RNA并包括对至少一个目标基因的片段反义的多个反义DNA片段和作为至少一个目标基因的片段的多个正义DNA片段的DNA，且其中该多个反义DNA片段和多个正义DNA片段以一系列的反向重复序列排列；
(h)包括源自植物miRNA的核苷酸的DNA；
(i)包括siRNA的核苷酸的DNA；
(j)转录为能够与配体结合的RNA适体的DNA；和
(k)转录为能够与配体结合的RNA适体的DNA，和转录为能够调节目标基因的表达的调节性RNA的DNA，其中所述调节依赖于调节性RNA的构型，且调节性RNA的构型受到RNA适体的结合状态的变构(allosterically)影响。
用于抑制表达的DNA元件在实施例6中进一步描述并在图7和8中描绘。
转录调节元件包括调节本发明的重组DNA构建体的表达水平的元件(相对于其在没有这种调节元件时的表达)。合适的转录调节元件的非限制性例子包括核开关(riboswitch)(顺式-或反式-作用)和miRNA识别位点，如美国专利申请公开2006/0200878中所详细描述的，该文献通过引用并入本申请中。转录调节元件的其它例子包括转录物稳定元件，例如呈现出赋予转录物更高的稳定性或更长的体内半衰期的二级结构或三维构型(例如，环、茎环、假结)的RNA，赋予转录物更高的细胞或组织特异性的RNA适体，及如在美国专利申请公开2007/0011761中所详细描述的SAUR去稳定序列的转录物去稳定元件，该文献通过引用并入本申请中。
在本发明的一些实施方式中，非天然植物是非天然的转基因植物，如通过下面标题为“制备和使用转基因细胞和转基因植物”的部分中描述的技术提供的非天然转基因植物。在这些实施方式中，非天然植物的所有细胞(可能除单倍体细胞以外)和组织包含本发明的重组DNA构建体。
在其它实施方式中，非天然植物不是完全转基因的，而是包括天然的非转基因组织(例如，嫁接到天然非转基因组织上的非天然转基因组织)。在非限制性的实施方式中，非天然植物包括天然的非转基因接穗和含有转基因植物细胞的非天然转基因砧木，其中非转基因接穗和转基因砧木嫁接在一起。这类实施方式在植物是通常作为嫁接到砧木上的接穗而无性繁殖生长的植物(其中接穗和砧木可以是相同的物种或品种或者是不同的物种或品种)的情况中特别有用，非限制性的例子包括葡萄(例如，酿酒葡萄和鲜食葡萄)、苹果、梨、榅桲(quince)、鳄梨、柑橘、核果(例如，桃、李子、油桃、杏、樱桃)、猕猴桃、玫瑰及其它具有农业或装饰意义的植物。特别要求的实施方式包括其中(a)非天然植物包括天然的非转基因葡萄接穗和非天然转基因葡萄砧木且无脊椎动物害虫为葡萄根瘤蚜，和(b)非天然植物包括天然的非转基因果树(例如，梨树)接穗和非天然转基因果树(例如，榅桲)砧木的实施方式。
目标基因和有害无脊椎动物
在一个方面，本发明提供在转基因植物细胞中转录为重组miRNA前体的重组DNA构建体，其中该重组miRNA前体包括RNA的单链，该RNA的单链折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构且包括加工成成熟miRNA的至少一个茎环；且该成熟miRNA抑制无脊椎动物害虫的至少一个目标基因的表达，从而赋予该植物对该无脊椎动物害虫的抗性。无脊椎动物害虫的目标基因可以是无脊椎动物害虫的任何一个或多个目标基因。目标基因可以是与该无脊椎动物害虫相关的共生体的目标基因，这种共生体基因的抑制赋予该植物对该无脊椎动物害虫的抗性。目标基因可以包括单一基因或以抑制为目标的单一基因的部分，或者可以包括，例如目标基因的多个连续片段、目标基因的多个非连续片段、目标基因的多个等位基因或来自一个或多个物种的多个目标基因。
目标基因包括任何无脊椎动物害虫物种(或与该无脊椎动物害虫相关的共生体)的内源序列。特别受到关注的是节肢动物(昆虫和蛛形纲动物)、线虫类、软体动物(如蛞蝓或蜗牛)、环节动物和无脊椎动物害虫的专性共生体。目标基因可以是可翻译(编码)序列，或者可以是非编码序列(如非编码调节序列)，或者是两者。目标基因的非限制性例子包括非可翻译的(非编码的)序列，例如，但不限于5’非翻译区、启动子、增强子、或其它非编码转录区、3’非翻译区、终止子和内含子。目标基因包括编码微RNA(即编码内源性微RNA的原始转录物或由这一原始转录物加工的RNA中间体)、小的干扰RNA、核糖体或核酶的RNA成分、核仁小RNA和其它非编码RNA的基因(参见，例如在rfam.wustl.edu上向公众提供的非编码RNA序列；Erdmann等(2001)Nucleic Acids Res.，29：189-193；Gottesman(2005)Trends Genet.，21：399-404；Griffiths-Jones等(2005)Nucleic Acids Res.，33：121-124)。目标基因还可以包括编码转录因子的基因和编码参与受关注的分子(例如，但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物、生物聚合物及次级代谢产物，包括生物碱、萜类、聚酮化合物、非核糖体肽及混合的生物合成源的次级代谢产物)的生物合成或分解代谢的酶的基因的可翻译(编码)序列。
在许多优选实施方式中，目标基因是无脊椎动物害虫(或与该无脊椎动物害虫相关的共生体)的关键基因。关键基因包括无脊椎动物害虫发育成具繁殖能力的成虫所需要的基因。关键基因包括在被静默或抑制时导致无脊椎动物害虫(作为成虫或处于任何发育阶段，包括配子)死亡的基因或导致无脊椎动物害虫丧失成功繁殖的能力(例如，雄性或雌性母体不育或者合子、胚胎或幼虫死亡)的基因。已经有对线虫关键基因的描述，例如在www.wormbook.org上在线提供的Kemphues，K.“Essential Genes”(December 24，2005)，WormBook编辑，The C.elegans Research Community，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.57.1。大豆异皮线虫关键基因在2006年2月23日提交的美国专利申请11/360355中公开，该文献通过引用并入本申请中。无脊椎动物关键基因的非限制性例子包括主要的精子蛋白质、α微管蛋白、β微管蛋白、液泡ATP酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、RNA聚合酶II、几丁质合成酶、细胞色素、miRNA、miRNA前体分子、miRNA启动子以及其它基因如在美国专利申请公开2006/0021087A1、PCT专利申请PCT/US05/11816中和在美国专利申请公开2004/0098761A1的表II中公开的那些基因，这些文献通过引用引入本申请。昆虫基因的描述在果蝇基因组数据库(在flybase.bio.indiana.edu/上在线提供)中向公众提供。预测的果蝇基因的大多数已经通过基于细胞培养的RNA干扰筛选进行了功能分析，结果确认了438个关键基因，参见Boutros等(2004)Science，303：832-835和www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1上在线提供的支持材料。关键昆虫基因的其它例子包括肠细胞蛋白质、膜蛋白质、蜕皮激素受体、ATP酶如γ-ATP酶、氨基酸转运体、转录因子、肽酰甘氨酸α-酰化单加氧酶；半胱氨酸蛋白酶、氨基肽酶、二肽酶、蔗糖酶/转葡糖苷酶、翻译延伸因子、真核翻译起始因子1A、剪接因子、细胞凋亡抑制物；微管蛋白、肌动蛋白、α-肌动蛋白、组蛋白、组蛋白脱乙酰基酶、细胞周期调节蛋白、细胞呼吸蛋白(cellularrespiratory protein)；昆虫特异性激素信号的受体、保幼激素受体、昆虫肽激素受体、调节细胞内离子平衡的蛋白质、质子泵、Na/K泵、肠蛋白酶；参与蔗糖代谢的酶、消化酶、胰蛋白酶样蛋白酶和组织蛋白酶B样蛋白酶。关键基因包括影响其它基因的基因，其中总体效应是无脊椎动物害虫的死亡或无脊椎动物害虫丧失成功繁殖的能力。在非限制性的实施例中，果蝇同源框基因Caudal的抑制最终导致由间接效应(即，昆虫的共生肠细菌群的失衡)引起的宿主死亡(Ryu等(2008)Science，319：777-782)并因此Caudal及被Caudal直接控制的抗菌肽基因都认为是关键基因。
植物有害无脊椎动物包括，但不限于线虫类、软体动物(蛞蝓和蜗牛)及昆虫和蛛形纲动物。还参见G.N.Agrios，“Plant Pathology”(第四版)，Academic Press，San Diego，1997，635pp.关于线虫类和鞭毛原生动物的描述，其都是受关注的无脊椎动物害虫。还参见Committee onStandardization of Common Names for Plant Diseases of The AmericanPhytopathological Society，1978-2005汇编的有关AmericanPhytopathological Society’s“Common Names of Plant Diseases”的连续更新有关植物害虫和由该植物害虫引起的疾病的汇编，其在www.apsnet.org/online/common/top.asp上在线提供。
无脊椎动物害虫的非限制性例子包括胞囊线虫异皮线虫(Heterodera)的种，特别是大豆异皮线虫Heterodera glycines、根结线虫Meloidogyne的种、纽带线虫Hoplolaimus的种、矮化线虫Tylenchorhynchus的种、螺旋线虫Helicotylenchus的种、短体线虫Pratylenchus的种、环线虫Criconema的种、叶芽线虫Aphelenchus的种或Aphelenchoides的种、玉米根虫、草盲蝽(Lygus)的种、蚜虫和类似的吸食汁液的昆虫如根瘤蚜(葡萄根瘤蚜(Daktulosphairavitifoliae))、玉米螟、地老虎(cutworm)、粘虫、叶蝉、日本金龟子、蝗虫和其它有害的鞘翅目昆虫、双翅目昆虫和鳞翅目昆虫。无脊椎动物害虫的特别例子包括能够侵扰农作物的根系的害虫，例如北方玉米根虫(Diabrotica barberi)、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)、西方玉米根虫(Diabrotica virgifera)、玉米根蚜虫(Anuraphismaidiradicis)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、透翅切根夜蛾(Crymodesdevastator)、番茄褐夜蛾(Feltia ducens)、泥背地蚕(Agrotis gladiaria)、金针虫(Melanotus种，Aeolus mellillus)、麦金针虫(Aeolus mancus)、砂栖蠕虫(Horistonotus uhlerii)、玉米象虫(Sphenophorus maidis)、梯牧草象甲(Sphenophorus zeae)、早熟禾象甲(Sphenophorus parvulus)、坚皮谷象(Sphenophorus callosus)、蛴螬(Phyllophaga种)、种蝇(seedcornmaggot)(Delia platura)、葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea)、种甲虫(seedcorn beetle)(Stenolophus lecontei)和玉米籽步甲(Cliviniaimpressifrons)以及在美国专利6194636的表6中所列的寄生性线虫，该文献通过引用全文并入本申请中。
特别在(但不限于)南半球区域(包括南美洲和中美洲)受到特别关注的无脊椎动物害虫包括蚜虫、玉米根虫、夜蛾、夜蛾科(noctuideae)、薯虫、草盲蝽种、任何的半翅类、同翅类或异翅类昆虫、任何的鳞翅类昆虫、任何的鞘翅类昆虫、线虫、切根虫、铃虫(earworms)、粘虫、蛀虫、卷叶虫及其它。本发明特别包含的节肢动物类害虫包括：各种切根虫的种，包括切根虫(Agrotis repleta)、小地老虎(Agrotis ipsilon)、切根虫(Anicla ignicans)、斑点夜蛾(Feltia subterranea)、“gusano áspero”(Agrotis malefida)；地中海粉螟(Anagasta kuehniella)，方颈谷粒甲虫(Cathartus quadricollis)、跳甲(Chaetocnema种)、稻蛾(Corcyracephalonica)、玉米根虫或“vaquita de San Antonio”(Diabotica speciosa)、甘蔗蛀虫(Diatraea saccharalis)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、褐臭蝽(brown stink bug)(Euschistus spp.)、棉铃虫(Helicoverpa zea)、扁谷盗(Laemophloeus minutus)、草地环蛾(Mocislatipes)、锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)、谷螟(Pyralis farinalis)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、玉米叶蚜虫(Rhopalosiphum maidis)、棕色穿皮虫或“chinche subterránea”(Scaptocoris castanea)、麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、谷物象鼻虫(Sitophilus zeamais)、麦蛾(Sitotrogacerealella)、草地粘虫(Spodoptera frugiperda)、大谷盗(Tenebroidesmauritanicus)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)、赤拟谷盗(Triboleumcastaneum)、棉叶虫(Alabama argillacea)、棉铃象鼻虫(Anthonomusgrandis)、棉蚜(Aphis gossypii)、蕃薯粉虱(Bemisia tabaci)、各种牧草虫种(Frankliniella种)、棉铃虫(Helicoverpa zea)、“oruga bolillera”(例如Helicoverpa geletopoeon)、烟草夜蛾幼虫(Heliothis virescens)、臭蝽(Nezaraviridula)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)、甜菜粘虫(Spodopteraexigua)、蛛螨(Tetranychus种)、洋葱牧草虫(Thrips tabaci)、温室粉虱(Trialeurodes vaporarium)、藜豆毛虫(Anticarsia gemmatalis)、斑点玉米甲虫或“astilo moteado”(Astylus atromaculatus)、“oruga de la alfalfa”(Colias lesbia)、“chinche marrón”或“chinche de los cuernos”(Dichelopsfurcatus)、“alquiche chico”(Edessa miditabunda)、斑蝥(Epicauta种)、“barrenador del brote”(Epinotia aporema)、“oruga verde del yuyocolorado”(Loxostege bifidalis)、根结线虫(Meloidogyne种)、“orugacuarteadora”(Mocis repanda)、南方绿椿象(Nezara viridula)、“chinche dela alfalfa”(Piezodorus guildinii)、苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、尺蠖“isoca medidora del girasol”(Rachiplusianu)、黄色灯蛾虫(Spilosoma virginica)、黄带粘虫(Spodopteraornithogalli)、各种根象鼻虫(象虫科)、各种金针虫(叩甲科)，以及各种蛴螬(金龟子科)。本发明特别包含的线虫类害虫包括玉米(Belonolaimus的种、Trichodorus的种、Longidorus的种、Dolichodorus的种、Anguina的种、Pratylenchus的种、Meloidogyne的种、Heterodera的种)、大豆(Heterodera glycines、Meloidogyne的种、Belonolaimus的种)、香蕉(Radopholus similis、Meloidogyne的种、Helicotylenchus的种)、甘蔗(Heterodera sacchari、Pratylenchus的种、Meloidogyne的种)、柑橘(Tylenchulus的种、Radopholus的种、Belonolaimus的种、Pratylenchus的种、Xiphinema的种)、咖啡(Meloidogyne的种、Pratylenchus的种)、椰树(Bursaphelenchus的种)、番茄(Meloidogyne的种、Belonolaimus的种、Nacobbus的种)、葡萄(Meloidogyne的种、Xiphinema的种、Tylenchulus的种、Criconemella的种)、柠檬和酸柚(Tylenchulus的种、Radopholus的种、Belonolaimus的种、Pratylenchus的种、Xiphinema的种)、可可(Meloidogyne的种、Rotylenchulus reniformis)、菠萝(Meloidogyne的种、Pratylenchus的种、Rotylenchulus reniformis)、木瓜(Meloidogyne的种、Rotylenchulus reniformis)、葡萄柚(Tylenchulus的种、Radopholus的种、Belonolaimus的种、Pratylenchus的种、Xiphinema的种)和蚕豆(Meloidogyne的种)的线虫类害虫。
可以设计重组DNA构建体以更具体地抑制目标基因，例如，通过设计该重组DNA构建体来编码被加工成成熟miRNA(其包含对于非目标基因序列基本上非互补的区域)的重组miRNA前体。非目标基因可以包含不意图被静默或被抑制的任何基因，该基因或者在包含重组DNA构建体的植物中或者在可以与重组DNA构建体形成接触的有机体中。非目标基因序列可以包含来自任何种(包括但不限于：非真核生物，例如细菌和病毒；真菌；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如农作物植物、观赏植物和非家养的或野生的植物；无脊椎动物，例如节肢动物、环节动物、线虫和软体动物；以及脊椎动物，例如两栖动物、鱼、鸟、家养的或野生的哺乳动物，以及甚至人)的任何序列。
在一个实施方式中，所述目标基因是对于感兴趣的特定无脊椎动物害虫物种为内源性的基因，而所述非目标基因是一种或多种非目标物种的一个或多个基因(例如，植物物种的一个或多个基因或者病毒、真菌、细菌、非目标无脊椎动物或脊椎动物、甚至人的基因)。一个非限制性的实例为：设计重组DNA构建体以被加工为用于抑制目标基因(其是对于单一物种(例如西方玉米根虫，Diabrotica virgifera virgiferaLeConte)内源性的基因)的成熟miRNA，但是不抑制非目标基因(例如来自相关的、甚至密切相关的物种(例如，北方玉米根虫、Diabroticabarberi Smith and Lawrence，或南方玉米根虫，Diabroticaundecimpunctata)的基因)的成熟miRNA。
在其他的实施方式(例如，期望抑制在多个物种之间交叉的目标基因的情况)中，可能期望将该重组DNA构建体设计被加工为用于抑制目标基因需要被静默的多个物种共有的目标基因序列的成熟miRNA。因此，从所述重组DNA构建体加工的miRNA可以设计为对于一个分类单位(taxon)特异的(例如，对于属、科或者甚至更大的分类单位例如门，举个例子，节足动物门是特异的)，但是对于其他分类单位(例如，植物或脊椎动物或哺乳动物)不是特异的。在该实施方式的一个非限制性实例中，可以将所述重组DNA构建体设计为被加工成用于抑制蚜虫(Aphidoidea)共有的目标基因序列而不靶向来自其他昆虫或无脊椎动物的任何基因序列的成熟miRNA。
在该实施方式的另一非限制性实例中，设计用于使玉米根虫中基因静默的重组DNA构建体以被加工成用于抑制Diabrotica属的所有成员共有的目标基因序列的成熟miRNA。在该实施方式的进一步的实例中，可以选择这种靶向于Diabrotica的重组DNA构建体，从而不靶向于来自有益的鞘翅类昆虫(例如，捕食性的瓢虫类甲虫，通常称为瓢虫或花姑娘)或其他的有益昆虫物种的任何序列。
用于静默目标基因的本发明的重组DNA构建体需要的特异性程度取决于多种因素。这些因素可以包括所述重组DNA构建体编码的成熟微RNA的尺寸和核酸序列，以及降低该成熟miRNA的能力与抑制非目标基因的相对重要性。在非限制性的实例中，在期望这种成熟miRNA为22个碱基对大小的情况下，一个特别优选的实施方式包括编码用于静默目标基因的成熟miRNA的DNA，其中所述成熟miRNA包含与非目标基因序列基本上不相同的序列，例如非目标基因序列的22个连续核苷酸中少于19个，或少于18个，或少于17个，或少于16个，或少于15个匹配。
在某些实施方式中，可能期望设计重组DNA构建体以包含预计不产生不期望的多肽的区域，例如通过筛选可以编码已知的不期望的多肽或其密切同源物的序列而对重组DNA构建体进行筛选。不期望的多肽包括(但不限于)与已知的变应原多肽同源的多肽和与已知的多肽毒素同源的多肽。公众可获得的编码这些可能不期望的变应原多肽的序列是可得的，例如，食物过敏研究和资源程序(FARRP)变应原数据库(可在allergenonline.com获得)或用于食品安全数据库的生物技术性息(可在www.iit.edu/～sgendel/fa.htm获得)(同时参见，例如Gendel(1998)Adv.Food Nutr.Res.，42：63-92)。不期望的序列也可以包括，例如，被解释为已知的毒素或潜在的或已知的变应原且包含在例如GenBank、EMBL、SwissProt以及其它(它们可以通过Entrez系统(www.ncbi.nih.gov/Entrez)检索)的公众可以获得的数据库中的那些多肽序列。不期望的、潜在变应原肽序列的非限制性实例包括来自大豆的大豆球蛋白、来自花生的油质蛋白和凝集素、来自小麦的麦谷蛋白、来自牛乳的酪蛋白、乳清蛋白和乳球蛋白、以及来自不同的贝壳类动物的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不期望的、潜在毒性肽的非限制性实例包括来自破伤风杆菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素tetA、来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的痢疾毒素、以及毒液，例如来自芋螺(Conus)种的芋螺毒素和来自节肢动物和爬行类动物的神经毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)。
在一个非限制性的实例中，筛选所述重组DNA构建体以除去那些编码与已知的变应原或毒素超过8个连续氨基酸完全同源或在至少80个氨基酸中具有至少35％的同一性的多肽的可转录的序列；该筛选可以在任何和所有的可能的阅读框中以两个方向，在以AUG(在相应的DNA中的ATG)开始的可能的开放阅读框上，或者在所有可能的读码框上(不管它们是否以AUG(或ATG)开始)进行。当“击中”或匹配时，即当编码与已知的变应原或毒素超过8个连续的氨基酸完全同源(或在至少80个氨基酸上具有至少35％的同一性)的潜在多肽的序列被确认时，可以在选择用于静默目标基因的RNA中使用的序列时回避、消除或改变对应于该击中的核酸序列。在一个实施方式中，设计所述重组DNA构建体使其不包含以AUG(相应的DNA中的ATG)开始的潜在开放阅读框。可以通过本领域技术人员已知的多种方法中的任何一种完成回避、消除或改变不期望的序列。在某些情况下，结果可能是被认为非天然存在的新型的序列。例如，可以通过将“干净”的序列结合在一起以形成重组DNA构建体中使用的新型的嵌合序列而实现回避特定的序列。
申请人认识到：在某些微RNA介导的基因静默中，不完全匹配的miRNA序列在基因静默中有效是可能的。例如，已经显示：靠近miRNA互补位点中心的失配比位于更远位置处的失配对于miRNA的基因静默具有更大的影响。参见，例如Mallory等(2004)EMBO J.，23：3356-3364中的图4。在另一个实例中，已经报道：失配碱基对的位置和形成失配的核苷酸的身份都影响给定的siRNA静默目标基因的能力，且除了G:U摆动碱基对之外，腺嘌呤-胞嘧啶失配得到很好的忍受(见Du等(2005)Nucleic Acids Res.，33：1671-1677)。因此，所述重组DNA构建体的给定链不总是需要具有与期望的目标基因100％的序列同一性，但是通常优选具有与期望的目标基因实质上的序列同一性，例如与期望的目标基因约95％、约90％、约85％或约80％的序列同一性。说到互补性，优选设计所述重组DNA构建体的一个链具有与期望的目标(例如，目标信使RNA或目标非编码RNA)基本的互补性，例如与期望的目标约95％、约90％、约85％或约80％的互补性。在非限制性的实例中，在重组DNA构建体编码22个核苷酸的成熟miRNA的情况下，被编码的成熟miRNA设计为与目标RNA的22个连续核苷酸基本上而不是完全互补；优选地，位置22的核苷酸与目标RNA中相应位置不配对以避免转移性。
相对于赋予其他标准的重要性，例如(但不限于)与预期的目标基因的百分序列同一性或给定序列的预计基因静默效力，本领域普通技术人员能够判断筛选预计对目标基因具有更高的特异性或预计不产生不期望的多肽的区域的重要性。例如，设计本发明的重组DNA构建体以被加工为对于几个目标无脊椎动物害虫物种具有活性的成熟miRNA，由此本领域的技术人员能够确定：重组DNA构建体中包含编码对所关注的几个无脊椎动物害虫物种特异的成熟miRNA的DNA更重要，而筛选预计具有更高基因静默效力的区域或预计产生不期望的多肽的区域的重要性较低。
启动子
通常，本发明的重组DNA构建体包含启动子，该启动子在植物细胞中是有功能的，并且可操作连接到编码重组miRNA前体的DNA上。在各种实施方式中，所述启动子选自由组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子和诱导型启动子组成的组中。
适合与本发明的重组DNA构建体一起使用的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可以包括细胞器-、细胞-、组织-或器官-特异性启动子(例如，分别在质体、根、花粉或种子中用于抑制第一目标RNA表达的质体特异性的、根特异性的、花粉特异性的或种子特异性的启动子)。在许多情况下，种子特异性的、胚特异性的、糊粉特异性的或胚乳特异性的启动子是特别有用的。时间特异性启动子可以包括倾向于在植物生长周期的特定发育阶段中，或者在白天或黑夜的不同时间内，或者在一年中的不同季节启动表达的启动子。诱导型启动子包括通过化学物质或通过环境条件(例如，但不限于，生物的或非生物的应激(例如，水分亏缺或干旱、热、冷、高或低的养分水平或盐水平、高或低的光强度，或者害虫或病原体感染))诱导的启动子。特别受到关注的是微RNA启动子，尤其是具有时间特异性的、空间特异性的或具有可诱导的表达模式的那些启动子。表达特异性启动子也可以包括通常组成性地表达，但是表达的程度或“强度”不同的启动子，包括通常称作“强启动子”或“弱启动子”的启动子。
特别受到关注的启动子包括以下非限制性的例子：从土壤杆菌(Agrobacterium)的T-DNA分离的胭脂碱合酶(opaline synthase)启动子；花椰菜花叶病毒35S启动子；增强启动子元件或嵌合的启动子元件，例如连接到增强子元件(来自玉米(zea mays)的热休克蛋白70的内含子)上的增强花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子；根特异性启动子，例如美国专利5837848、6437217和6426446中描述的根特异性启动子；美国专利6433252公开的玉米L3油质蛋白启动子；美国专利申请公开2004/0216189中描述的编码质体定位醛缩酶的植物核基因的启动子；美国专利6084089公开的冷诱导的启动子；美国专利6140078公开的盐诱导的增强子；美国专利6294714公开的光诱导的启动子；美国专利6252138公开的病原体诱导的启动子；以及美国专利申请公开2004/0123347A1公开的缺水诱导的启动子。所有上述公开了启动子及其作用(尤其在植物中起作用的重组DNA构建中的启动子)的专利和专利公开以引用的方式并入到本申请中。
所关注的植物脉管-或韧皮部-特异性的启动子包括发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的rolC或rolA启动子、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA基因5的启动子、水稻蔗糖合酶RSs1基因启动子、鸭跖草(Commelina)黄化斑驳杆状DNA病毒启动子、椰子叶腐烂病毒启动子、水稻东格鲁杆状病毒启动子、豌豆谷氨酰胺合成酶GS3A基因的启动子、土豆转化酶基因的invCD111和invCD141启动子、Kertbundit等(1991)证明在烟草中具有韧皮部特异表达的从拟南芥分离的启动子、VAHOX1启动子区域、豌豆细胞壁转化酶基因启动子、来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子、硫酸盐运载体基因Sultr1；3的启动子、植物蔗糖合酶基因的启动子和植物蔗糖运载体基因的启动子。
启动子元件可以包括本身为非天然存在的启动子或启动子元件或其同源物但可以调节基因表达的核酸序列。这种“基因独立”的调节序列的例子包括含有配体结合区或适体和调节区域(其可能是顺式作用的)的天然存在的或人工设计的RNA序列。参见，例如，Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.，22：841-847；Bayer和Smolke(2005)Nature Biotechnol.，23：337-343；Mandal和Breaker(2004)Nature Rev.Mol.Cell Biol.，5：451-463；Davidson和Ellington(2005)Trends Biotechnol.，23：109-112；Winkler等(2002)Nature，419：952-956；Sudarsan等(2003)RNA，9：644-647以及Mandal和Breaker(2004)Nature Struct.Mol.Biol.，11：29-35。例如，这种“核糖核酸调节子(riboregulator)”可以对特定的空间或时间特异性进行选择或设计以仅在给定浓度的合适配体存在(或不存在)的情况下调节编码重组miRNA前体的DNA的翻译。一个非限制性的例子是响应在应激下(例如，非生物应激，如水、温度、或养分胁迫；或者生物应激，如被害虫或病原体袭击)植物产生的内源性配体(例如茉莉酸或水杨酸)的核糖核酸调节子；在应激下，内源性配体的水平增加到足以使核糖核酸调节子开始编码重组miRNA前体的DNA的转录的水平。
制备和使用重组DNA构建体
本发明的重组DNA构建体可以通过适合预期的应用的任何方法制备，其中考虑到例如期望表达的类型和在所述构建体被转录的植物中使用的方便性。制备和使用DNA构建体和载体的一般方法在本领域是公知的，且详细地描述在例如包括Sambrook和Russell，“分子克隆：实验室指南”(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，2001的手册和实验室指南中。建立用于转化的DNA构建体和载体的有用的技术的实例描述在美国专利申请公开2004/0115642A1中，其以引用的方式并入本申请。DNA构建体也可以通过使用GATEWAyTM克隆技术(可从Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA获得)建立，该技术使用来自λ噬菌体载体构建的整合酶/att系统的位点特异性重组酶LR克隆反应，而不是限制性内切酶和连接酶。LR克隆反应描述于美国专利5888732和6277608中，以及美国专利申请公开2001/283529、2001/282319和2002/0007051中，其全部以引用的方式并入本申请中。GATEWAYTM克隆技术指导手册(其也由Invitrogen提供)提供了将任何期望的DNA常规克隆到包含可操作的植物表达元件的载体中的简要说明。另一个可选的载体制作方法使用不依赖于连接(ligation)的克隆技术，其描述于Aslandis等(1990)Nucleic Acids Res.，18：6069-6074和Rashtchian等(1992)Biochem.，206：91-97中，其中具有单链5’和3’末端的DNA片段被连接到随后在体内扩增的所需载体中。
在某些实施方式中，重组DNA构建体的DNA序列包含对于该重组DNA构建体将在其中表达的植物进行密码子优化的序列。例如，将在植物中表达的重组DNA构建体使用本领域公知的方法使其序列的全部或部分(例如，第一个基因抑制单元或基因表达单元)对于在植物中的表达进行密码子优化。对于植物的密码子优化方法学的描述参见例如，美国专利5500365，其以引用的方式并入；同时参见De Amicis和Marchetti(2000)Nucleic Acid Res.，28：3339-3346。
转基因植物细胞和植物
本发明的另一方面提供了一种其基因组中包含重组DNA的非天然转基因植物细胞，该重组DNA在非天然转基因植物细胞中转录为重组miRNA前体，其中该重组miRNA前体包括折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构且包含被加工为成熟miRNA的至少一个茎-环的RNA的单链，并且其中成熟miRNA抑制无脊椎动物的或与该无脊椎动物有关的共生体的至少一个目标基因的表达。本发明还提供了包含本发明的非天然转基因植物细胞的非天然转基因植物，由本发明的非天然转基因植物细胞生长的非天然转基因植物，以及由非天然转基因植物产生的非天然转基因种子。可采用在下面“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”标题下所述的技术制备该非天然转基因植物细胞、植物和种子。本发明进一步提供了一种抑制植物的无脊椎动物害虫或与该无脊椎动物有关的共生体的至少一个目标基因的方法，包括：提供含有本发明的非天然转基因植物细胞的植物，其中该无脊椎动物是无脊椎动物害虫，重组DNA在非天然转基因植物细胞中转录为重组miRNA前体，并且当无脊椎动物害虫摄入该重组miRNA前体时，该至少一个目标基因受到抑制。
本发明的非天然转基因植物包括任何发育阶段的植物，且包括由此处公开的非天然转基因植物细胞制备的非天然再生植物，或该再生植物的非天然子代植物(其可以是同系繁殖或杂交的子代植物)，或这样的非天然转基因植物的种子。本发明还提供和要求在其基因组中含有本发明的重组DNA构建体的非天然转基因种子。本发明的非天然转基因植物细胞、转基因植物和转基因种子可以通过本领域公知的方法制备，如下面标题为“制备和使用转基因植物细胞和转基因植物”的部分所描述的。
非天然转基因植物细胞可以包括分离的植物细胞(例如，单独的植物细胞或者在人工培养基中或人工培养基上生长的细胞)，或者可以包括未分化组织(例如，愈伤组织或植物细胞的任何聚集体)中的植物细胞。非天然转基因植物细胞可以包括选自叶(例如叶柄和叶片)、根、茎(例如块茎、根茎、匍匐茎、鳞茎和球茎)、杆(例如木质部、韧皮部)、木质、种子、果实(例如坚果、谷粒、肉质果)和花(例如雄蕊、花丝、花药、花粉、心皮、雌蕊、子房、胚珠)中的至少一种分化组织中的植物细胞。
本发明的非天然转基因植物细胞或非天然转基因植物可以是所关注的任何适合的植物细胞或植物。瞬时转化的和稳定转化的植物细胞都包括在本发明内。特别优选的是稳定转化的转基因植物。在许多优选的实施方式中，非天然转基因植物是来自可以收获种子的有繁殖力的转基因植物，且本发明进一步要求保护这种转基因植物的非天然转基因种子，其中非天然的种子优选也包含本发明的重组构建体。
制备和使用转基因植物细胞和转基因植物
当使用本发明的重组DNA构建体制备本发明的非天然转基因植物细胞、转基因植物或转基因种子时，转化可以包括任何公知并证明的方法和组合物。适于植物转化的方法实际上包括可将DNA引入到细胞中的任何方法，例如DNA的直接投送(例如，通过PEG介导的原生质体转化、通过电穿孔、通过碳化硅纤维的刺激和通过DNA涂布颗粒的促进)、土壤杆菌介导的转化、通过病毒或其他载体等。植物转化的一个优选的方法是微粒轰击(microprojectile bombardment)，例如美国专利5015580(大豆)、5550318(玉米)、5538880(玉米)、6153812(小麦)、6160208(玉米)、6288312(水稻)和6399861(玉米)以及6403865(玉米)所说明的，其全部以引用的方式并入。
植物转化的另一个优选的方法是土壤杆菌介导的转化。在一个优选的实施方式中，本发明的转基因植物细胞是通过借助于含有二元Ti质粒系统的土壤杆菌的转化获得的，其中该土壤杆菌携带第一Ti质粒和第二嵌合性的含有野生型Ti质粒的至少一个T-DNA边界质粒，在转化的植物细胞中起作用并可操作地与本发明的基因抑制构建体连接的启动子。参见，例如，美国专利5159135描述的二元系统，其以引用的方式并入。同时参见De Framond(1983)Biotechnology，1：262-269；以及Hoekema等(1983)Nature，303：179。在这样的二元系统中，包含T-DNA边界或多个边界的较小质粒可以方便地构建和在适合的可选择的宿主(例如E.coli)内操作，然后转移到土壤杆菌中。
用于土壤杆菌介导的植物(尤其是农作物)转化的详细过程包括例如美国专利5004863、5159135和5518908(棉花)；5416011、5569834、5824877和6384301(大豆)；5591616和5981840(玉米)；5463174(芸苔)及美国专利申请公开2004/0244075(玉米)中所描述的过程，其全部以引用的方式并入。已经报道用于许多植物物种(双子叶植物和单子叶植物)的类似方法，这些植物物种特别包括花生(Cheng等(1996)Plant Cell Rep.，15：653)、芦笋(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：5345)、大麦(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.，104：37)、水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology，6：10；Zhang等(1988)Plant Cell Rep.，7：379)、小麦(Vasil等(1992)Bio/Technology，10：667；Becker等(1994)Plant J.，5：299)、苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.，5：313)及番茄(Sun等(2006)Plant Cell Physiol.，47：426-431)。同时参见美国专利申请公开2003/0167537A1(以引用的方式并入)中有关载体、转化方法和转化的拟南芥植物的产生的描述，其中转录因子通过CaMV35S启动子组成型地表达。转基因植物细胞和转基因植物也可以在使用合适的转化方案时，例如细菌感染(例如使用上述的土壤杆菌)、二元细菌人工染色体构建体、DNA的直接投送(例如通过PEG介导的转化、脱水/抑制作用介导的DNA摄取、电穿孔、碳化硅纤维刺激和微粒轰击)，由其他载体转化获得，例如(但不限于)病毒载体(例如，烟草蚀刻病毒(TEV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、和Edwardson和Christie的“马铃薯Y病毒群：专著No.16，1991，Agric.Exp.Station，Univ.of Florida的病毒”中涉及的病毒、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或任何其他适合的克隆载体。本领域的普通技术人员很清楚，为了从任何数目的感兴趣的植物物种制备稳定的转基因植物，可以使用和改进各种转化方法。
提供包含稳定整合的重组DNA的转基因植物细胞和转基因植物的转化方法优选在培养基上和受控环境中的组织培养中进行。“培养基”指的是用于在体外(即，完整的活生物体的外部)培养细胞的多种营养成分混合物。受体细胞目标包括(但不限于)分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚或胚的部分和配子细胞(例如小孢子、花粉、精子和卵细胞)。可以再生成可繁殖的植物的任何细胞都认为是可用于实施本发明的受体细胞。愈伤组织可由各种组织来源开始，包括(但不限于)未成熟胚或胚的部分、幼苗的顶端分生组织、小孢子等。如愈伤组织一样能够增殖的那些细胞可以用作基因转化的受体细胞。用于制备本发明的转基因植物的实用的转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化和后续的可繁殖转基因植物的再生)描述于例如美国专利6194636和6232526以及美国专利申请公开2004/0216189中，其以引用的方式并入。
在通常的转化实践中，DNA在任何一种转化实验中仅被引入到很小百分比的靶细胞中。标志基因通常用来提供鉴定那些通过将转基因DNA构建体接收或整合到它们的基因组中而稳定转化的细胞的有效体系。优选地标志基因提供赋予对选择性物质(例如抗生素或除草剂)的抗性的选择性标志物。植物细胞可能具有抗性的任何抗生素或除草剂可以是用于选择的物质。将潜在转化的细胞暴露于选择剂。存活细胞的种群中通常是赋予抗性的基因以足够的水平被整合和表达以允许细胞存活的那些细胞。进一步测试细胞以确定重组DNA的稳定的整合。常用的选择标志基因包括赋予对抗生素(例如卡那霉素或巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac3和aacC4))的抗性，或者对除草剂(例如草铵磷(glufosinate)(bar或pat)和草甘膦(EPSPS))的抗性的那些基因。有用的选择性标志基因和选择剂的实例描述于美国专利5550318、5633435、5780708和6118047中，其全部以引入的方式并入。也可以使用可筛选的标志物或报道体，例如提供可视化地鉴别转化体的能力的标志物。有用的可筛选的标志物的非限制性实例包括，例如，表达通过作用于显色底物而产生可探测的色彩的蛋白质(例如，β葡萄糖苷酸酶(GUS)(uidA)或萤光素酶(luc))可，或者本身可探测的蛋白质(例如绿色荧光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子)的基因。本领域的技术人员将认识到，许多其他有用的标志物或报道体因是可以使用的。
可以通过任何适合的方法实现本发明的转基因植物细胞中重组DNA构建体的转录的检测和测量，包括蛋白质检测方法(例如，蛋白质印迹法、ELISA和其他的免疫化学方法)、酶活性的测量或者核酸检测方法(例如，DNA印迹法、RNA印迹法、PCR、RT-PCR、荧光原位杂交)。如通过许多可获得的手册所证明的，这些方法对于本领域的普通技术人员是公知的；参见，例如，Joseph Sambrook和David W.Russell，“MolecularCloning：A Laboratory Manual”(第三版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，2001；Frederick M.Ausubel等(编辑)“Short Protocols inMolecular Biology”(第五版)，John Wiley and Sons，2002；John M.Walker(编辑)“Protein Protocols Handbook”(第二版)，Humana Press，2002；和Leandro (编辑)“Transgenic Plants：Methods and Protocols”，HumanaPress，2004。
用于检测或测量本发明的转基因植物细胞中重组DNA构建体的转录的其他适合的方法包括：测量任何作为重组DNA构建体被转录的转基因植物细胞中相对于重组DNA没有被转录的细胞目标基因受到抑制的直接或代表的指标的其他性状，例如，大的或微观的形态性状、生长速率、产率、繁殖或补充率、对害虫或病原体的抗性、或对生物的或非生物的应激的抗性(例如，缺水应激、盐应激、养分胁迫、热或冷应激)。这些方法可以利用表型性状的直接测量或替代的分析(例如，在植物中，这些分析包括植物部分的分析，例如叶或根的分析，以测定非生物应激的耐受)。非限制性的方法包括对无脊椎动物害虫抗性的直接测量(例如，对植物组织的损害)或替代分析(例如，植物产率分析，或生物测定，例如描述于国际专利申请公开WO2005/110068A2和美国专利申请公开US 2006/0021087A1中(其以引用的方式并入)的西方玉米根虫(Diabrotica virgfera virgifera LeCote)幼虫的生物测定，或者描述于Steeved等(2006)Funct.Plant Biol.，33：991-999中的大豆异皮线虫的生物测定，其中测量每一植物的包囊、每克根的包囊、每一植物的卵、每克根的卵和每包囊的卵。
本发明的重组DNA构建体可以叠加其它的重组DNA以例如，通过表达或抑制其他基因赋予附加的性状(例如，在转化植物的情况下，性状包括除草剂抗性、抗虫性、冷萌芽耐受性、缺水耐受性等)，。用于协同降低或增加基因表达的构建体描述于美国专利申请公开2004/0126845A1中，通过引入的方式并入。
可以收获转基因的、可繁殖植物的种子并用于培植基因组中包含重组DNA构建体的本发明的转基因植物的后代，包括杂种世代。由此，除了用本发明的重组DNA构建体直接转化植物之外，本发明的转基因植物可以通过将具有重组DNA的第一植物与缺少该构建体的第二植物杂交而制备。例如，所述重组DNA可以引入到易于转化的植物家系中以制备转基因植物，其可以与第二植物家系杂交以将重组DNA基因渗入(introgress)到所产生的后代中。本发明的转基因植物可以与具有赋予一个或多个附加性状(例如，但不限于，除草剂抗性、害虫或疾病抗性、环境应激耐受性、改变的营养含量和产率改善)的其他重组DNA的植物家系杂交来制备具有赋予期望的目标序列表达性能和附加的性状的重组DNA的后代植物。
典型地，在这种组合性状的育种中，赋予附加性状的转基因植物是雄性系，而具有基本特性的转基因植物是雌性系。这一杂交的后代隔离，从而一些植物将携带两个亲本性状的DNA，而一些将携带一个亲本性状的DNA；这些植物可以通过与亲本重组DNA相关的标志物确认。携带两个亲本性状的DNA的后代植物可以回交到母系中多次，例如，通常为6～8个世代，以制备除其他转基因亲本系的重组DNA外具有基本上与一个原始的转基因亲本系基本相同的基因型的后代植物。
本发明的再另一方面是由本发明的转基因种子生长的转基因植物。本发明包括从包含重组DNA的转基因种子直接生长的转基因植物以及通过将从转基因种子直接生长的转基因植物与不是从相同的转基因种子生长的第二植物杂交产生的植物后代，包括近交的或杂种的植物家系。
杂交可以包括例如下述步骤：
(a)种植第一亲本植物(例如，非转基因的或转基因的植物)和按照本发明转基因的第二亲本植物的种子；
(b)使第一和第二亲本植物的种子培养成开花的植物；
(c)用来自第二亲本的花粉给第一亲本的花授粉；以及
(d)收获在携带所述受精的花的亲本植物上产生的种子。
通常期望将重组DNA渗入(例如通过回交)到优良的品种中以将特别期望的性状从一个来源转移到缺少该性状的近交植物或其他植物中。例如，这可以通过首先将优势近交亲本(“A”)(回交亲本)与携带用于所讨论的性状的适当基因(例如，根据本发明制备的构建体)的供体近交亲本(“B”)(非回交亲本)杂交。在得到的后代中首先选择具有从非回交亲本“B”转移的期望性状的这一杂交的后代，然后将该选择的后代回配优势回交亲本“A”。在具有选择的期望性状的五个或更多个回交世代后，后代对于控制被转移的特征的基因座是半合子的，但是大部分或几乎全部其它基因与优势亲本一样。最后的回交后代将自交以得到对于被转移的基因为纯系繁育的后代，即，一个或多个转化事件。
通过一系列的繁育处理，所选择的DNA构建体可以从一个家系移动到完全不同的家系中而不需要进一步的重组体处理。由此可以制备作为一个或多个DNA构建体的不分离系的纯系植物。通过杂交不同的纯系植物，可以制备具有DNA构建体的不同组合的大量的不同杂种。以此方式，可以制备具有经常与杂种相关的期望的农学性质(“杂种优势”)以及由一个或多个DNA构建体赋予的期望性质的植物。
可以使用遗传标志物帮助本发明的一个或多个DNA构建体从一个遗传背景渐渗到另一个遗传背景中。有助于选择的标记提供的相对于常规育种的优点在于可以避免表型变异引起的错误。进一步的，遗传标志物可以提供关于特殊杂交的单个后代中优良种质的相关程度的数据。例如，当具有期望性状的但另外具有非农学期望的遗传背景的植物与优良亲本杂交时，遗传标志物可以用于选择不仅具有感兴趣的性状，而且具有相对大比例的期望种质的后代。以此方式，可以使将一个或多个性状渗入到特定遗传背景中所需要的世代数最小化。帮助选择的标志物在繁育本发明的转基因植物中有用途，以及可用的分子标志物的类型(例如但不限于SSR和SNP)在PCT申请公开WO 02/062129和美国专利申请公开号2002/0133852、2003/0049612和2003/0005491中进行了讨论，各文献的全部内容以引用的方式并入。
在本发明的特定转基因植物细胞和转基因植物中，可能期望在调节目标基因的表达的同时表达(或抑制)感兴趣的基因。因此，在一些实施方式中，转基因植物包含进一步含有用于表达至少一个感兴趣的基因的基因表达(或抑制)元件的重组DNA，且重组miRNA前体的转录优选通过基因表达(或抑制)元件的同时转录实现。
因此，如此处所描述的，可以通过使用本领域已知或当前披露的任何适当的瞬时的或稳定的、综合的或非综合的转化方法获得本发明的非天然转基因植物细胞或转基因植物。可以在任何植物细胞或组织中或者在任何发育阶段的整体植物中转录重组DNA构建体。转基因植物可以源自任何的单子叶或双子叶植物，例如但不限于具有商业或农业价值的植物，如农作物类植物(尤其是用于人类食物或动物饲料的农作物)、制备木材或纸浆的树、蔬菜植物、果树和观赏植物。感兴趣的植物的非限制性实例包括谷类作物(例如，小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、黍、高粱、昆诺阿藜、苋和荞麦)；饲料作物类植物(例如，饲用牧草和饲料双子叶植物，包括苜蓿、巢菜、三叶草等)；油料作物类植物(例如，棉花、红花、向日葵、大豆、芥籽(canola)、油菜、亚麻、花生和油椰)；树坚果(例如，胡桃、腰果、榛子、山核桃、杏等)；甘蔗椰子、海枣、橄榄、甜菜、茶和咖啡；制备木材或纸浆的树；蔬菜作物类植物，例如豆类(如，菜豆、豌豆、扁豆、紫花苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、朝鲜蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜，芸苔类(例如，甘蓝、羽衣甘蓝、芥菜和其他多叶的芸苔，花茎甘蓝、花椰菜、芽甘蓝、芜菁、球茎甘蓝)，可食用葫芦类(例如，黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜)，可食用葱类(例如，洋葱、大蒜、韭葱、青葱、细香葱)，可食用茄科成员(例如，番茄、茄子、马铃薯、辣椒、酸浆(ground cherry))，以及可食用藜科的成员(例如，甜菜、牛皮菜、菠菜、昆诺阿藜、苋菜)；果类作物植物，例如苹果、梨、柑桔类水果(例如，桔子、酸橙、柠檬、葡萄柚及其他)，核果(例如，杏、桃、李子、蜜桃)，香蕉，菠萝、葡萄、猕猴桃、木瓜、鳄梨和草莓；和观赏植物，包括观赏的有花植物，观赏树木和灌木，观赏的地被植物和观赏的草类植物。优选的双子叶植物包括，但不限于，芥籽、花茎甘蓝、甘蓝、胡萝卜、花椰菜、大白菜、黄瓜、干豆(dry bean)、茄子、茴香、四季豆、葫芦、莴苣、甜瓜、秋葵、豌豆、辣椒、南瓜、萝卜、菠菜、南瓜(squash)、西瓜、棉花、马铃薯、昆诺阿藜、苋菜、荞麦、红花、大豆、糖用甜菜和向日葵。优选的单子叶植物包括，但不限于，小麦、燕麦、大麦、玉米(包括甜玉米和其他品种)、黑麦、黑小麦、水稻、观赏的和饲用草类、高粱、黍、洋葱、韭葱和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。
植物转化的最终目标是产生对人类有用的植物。在此方面，本发明的非天然转基因植物可以用于认为对种植者或对消费者有价值的实际上任何目的。例如，一个人可能期望收获转基因植物本身，或者收获用于种植目的的转基因植物的转基因种子，或者可以从转基因植物或它的种子制备产品，例如油、淀粉、乙醇或其它的发酵产品，动物饲料或人的食物，药物和各种工业产品。例如，玉米广泛用于食物和饲料工业中，以及工业化应用中。玉米用途的进一步讨论可以在例如美国专利号6194636、6207879、6232526、6426446、6429357、6433252、6437217和6583338(以并入的方式引入)，以及PCT公开WO 95/06128和WO02/057471中找到。因此，本发明也提供由本发明的非天然的转基因植物细胞、植物或种子制备的商品，包括但不限于收获的叶、根、嫩枝、块茎、茎、果实、种子、或植物的其他部分、粗粉、油、提取物、发酵或消化产物、碾碎的或整个的植物谷粒或种子，或者包括由本发明的转基因植物细胞、植物或种子制备的这些商品的任何食物或非食物产品。在本发明包含的一种或多种商品或商品产物中检测到本发明的重组DNA构建体的一个或多个核算序列是该商品或商品产物包含或源自本发明的非天然的转基因植物细胞、植物或种子的事实证据。
在优选的实施方式中，相对于缺少重组DNA构建体的植物，由本发明的非天然的转基因植物细胞制备的非天然转基因植物，即在它的基因组中含有本发明的重组DNA构建体的非天然转基因植物，具有选自下述性状的至少一个另外的改变性状：
(a)改善的非生物应激耐受性；
(b)改善的生物应激耐受性；
(c)改变的初级代谢物组成；
(d)改变的次级代谢物组成；
(e)改变的微量元素、类胡萝卜素或维生素组成；
(f)改善的产率；
(g)改善的利用氮或其他营养物的能力；
(h)改变的农学特性；
(i)改变的生长和繁殖特性；以及
(j)改善的收获、贮存或加工质量。
在特别优选的实施方式中，所述非天然的转基因植物的特征在于：改善的非生物应激(例如，对缺水或干旱、热、冷、非最佳的营养物或盐水平，非最佳的光水平)或生物应激(例如，拥挤、异种克生或创伤)的耐受性；改变的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)组成；改变的次级代谢物(例如，生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体的肽，以及混合的生物合成源的次级代谢物)组成；改变的微量元素(例如，铁、锌)、类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、番茄红素、黄体素、玉米黄素或其它的类葫萝卜素和叶黄素)或维生素(例如，生育酚)组成；改善的产率(例如，非应激条件下改善的产率或者生物或非生物应激下改善的产率)；改善的利用氮或其他营养物的能力；改变的农学特性(例如，延迟成熟；延迟衰老；更早或更晚成熟；改善的耐荫性；改善的抵抗根或茎倒伏的能力；改善的抵抗茎的“青折(green snap)”的能力；改变的光周期响应)；改变的生长或繁殖特性(例如，有意的矮化；可用于例如改善的杂交程序的有意的雄性不育；改善的营养生长率；改善的发芽；改善的雄性或雌性生育力)；改善的收获、贮存或加工质量(例如，改善的贮存过程中对害虫的抗性，改善的对于断裂的抗性，改善的对于用户的吸引力)；或者这些性状的任意组合。
在一个优选的实施方式中，非天然的转基因种子，或通过非天然的转基因植物产生的种子，具有改变的初级代谢物(例如，脂肪酸、油、氨基酸、蛋白质、糖或碳水化合物)的组成，改变的次级代谢物(例如，生物碱、萜类化合物、聚酮化合物、非核糖体的肽，以及混合的生物合成源的次级代谢物)的组成，改变的微量元素(例如，铁、锌)、类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素、番茄红素、黄体素、玉米黄素或其它的类葫萝卜素和叶黄素)或维生素(例如，生育酚)的组成；改善的收获、贮存或加工质量；或它们的组合。例如，可能期望改变农作物(例如，芥籽、棉花、红花、大豆、甜菜、向日葵、小麦、玉米或水稻)种子的氨基酸(例如，赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸或总蛋白质)、油(例如，脂肪酸组成或总油)、碳水化合物(例如，单糖或淀粉)、微量元素、类胡萝卜素或维生素的含量，优选与改善的种子收获、贮存或加工质量组合，因此提供用于动物饲料或人类食物中的改良种子。在另一情况中，可能期望改变转基因植物或转基因植物种子的原始组分的水平，例如，降低具有低水平的赖氨酸、蛋氨酸或色氨酸的蛋白质的水平，或者增加期望的氨基酸或脂肪酸的水平，或者降低变应原性蛋白或糖蛋白(例如，包含arah1的花生变应原，包含麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的小麦变应原，包含P34变应原、球蛋白、大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的大豆变应原)或者毒性代谢产物(例如，木薯中的氰糖苷，茄科成员中的茄属生物碱)的水平。
实施例
实施例1
该实施例描述可用于制备本发明的非天然的转基因植物细胞、植物和种子的重组DNA构建体的非限制性的实施方式。更具体地，该实施例描述在植物细胞可转录为重组miRNA前体的重组DNA构建体，其中所述重组miRNA前体包含RNA的单链，该RNA的单链折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构且包含加工成成熟miRNA的至少一个茎-环；且其中所述的成熟miRNA设计为抑制无脊椎动物或与该无脊椎动物相关的共生体的至少一个目标基因。该构建体转录为原位相对稳定的重组miRNA前体，使得相对完整的重组miRNA前体能够被无脊椎动物摄取。
在本发明的一个非限制性的实施方式中，所述重组DNA构建体包含源自多个miRNA前体的序列，例如，如Biemar等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，102：15907-15911报道的，在黑腹果蝇的染色体2R上确认的8miRNA(“8-mir”)的多顺反子簇。使用多个miRNA前体(多个不同的前体，或相同前体的多个复本，或其组合)导致从单个重组DNA构建体加工多个成熟miRNA，这有利于靶向于多个目标基因(例如，不同的等位基因、单个目标基因中的不同区域，或不同的目标基因)或增加用于静默的成熟miRNA的数量。
图1中描述了所述“8-mir”簇(SEQ ID NO.1)，并通过粗体带下划线的文字表明单个miRNA前体。在SEQ ID NO.2中也提供了包括所有8miRNA前体的较短的序列。这一簇包括编码8miRNA前体的DNA序列，其以以下顺序排列：dme-mir-309(SEQ ID NO.3)、dme-mir-3(SEQID NO.4)、dme-mir-286(SEQ ID NO.5)、dme-mir-4(SEQ ID NO.6)、dme-mir-5(SEQ ID NO.7)、dme-mir-6-1(SEQ ID NO.8)、dme-mir-6-2(SEQ ID NO.9)和dme-mir-6-3(SEQ ID NO.10)。表1确认各个miRNA前体的DNA序列和相应的RNA序列。图2中描述了所述各8miRNA前体的折-回结构(即，包含加工成成熟miRNA的茎-环的miRNA前体二级结构)，其中所述成熟miRNA以粗体的大些字母标明在折-回结构中。
表1
Figure A20088001047000461
在一个实施方式中，在与原始的黑腹果蝇“8-miR”簇前体启动子不同的启动子的控制下，在转基因植物细胞中表达包含与所述“8-miR”序列(SEQ ID NO.1)相同(或基本上相似)的序列的重组DNA构建体。目标基因是由“8-miR”簇原始加工的成熟miRNA的内源性靶标，或者是包含与内源性靶标相似的序列(例如，内源性靶标的同源体或直系同源体(orthologue))的基因。预测给定的动物miRNA的靶标的技术是本领域已知的，且包括Lewis等(2005)Cell，120：15-16，Lewis等(2003)Cell，115：787-798和Rehmsmeier等(2004)RNA，10：1507-1517描述的那些技术。公众可获得的靶标预测器，TargetScanS(www.targetscan.org)，通过搜索与各个miRNA的种子区域(seed region)(成熟miRNA的2-7位置)匹配的保守8mer和7mer位点的存在来预测miRNA的生物学靶标。另一个公众可获得的在线靶标预测器是RNAhybrid(bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid；见Krüger和Rehmsmeier(2006)Nucleic Acids Res.，34：W451-W454，以及Rehmsmeier等(2004)RNA，10：1507-1517)。此外，公众还可获得综合数据库miRGen(www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen；见Megraw等(2007)Nucleic AcidsRes.，35：D149-D155)，其提供(i)动物miRNA和基因组注释集(genomicannotation sets)之间的位置关系和(ii)根据广泛使用的靶标预测程序的组合的动物miRNA靶标。此外，公众还可获得TarBase(www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase；见Sethupathy等(2006)RNA，12：192-197)，在人/小鼠、果蝇、蠕虫和斑马鱼中实验测试miRNA靶标的人工管理的数据库，其区别已经过验证(测试阳性)的miRNA靶标和测试为阴性的靶标。
在另一实施方式中，所述“8-miR”序列(SEQ ID NO.1)充当得到“工程化8-miR”序列的模板，其中修饰起动序列以得到衍生的工程化miRNA前体，其被加工成设计为使由“8-miR”簇原始加工的成熟miRNA的内源性靶标之外的特定的一个或多个目标基因静默的工程化成熟miRNA。如Zeng等(2002)Mol.Cell，9：1327-1333所证明的，设计人工或工程化miRNA序列可以和替代与miRNA前体的miRNA茎区域中核苷酸的预期目标互补的序列一样简单。确定原始miRNA序列中核苷酸的变化以产生工程化miRNA前体的一般方法的一个非限制性的实例包括以下步骤：
(a)例如，通过使用序列比对工具(例如BLAST)从例如玉米cDNA和基因组DNA数据库选择对于目标基因特异的至少18个核苷酸的唯一的目标序列(参见，例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.，25：3389-3402)，以确认目标转录物直系同源物和任何潜在的与不相关基因的匹配，由此避免无意间使得非目标序列静默。
(b)分析不期望序列的目标基因(例如，与来自非目标物种的序列匹配)，并且对各潜在的19-mer片段的GC含量、Reynolds评分(参见Reynolds等(2004)Nature Biotechnol.，22：326-330)以及特征在于自由能(“ΔΔG”)负差的功能不对称(见Khvorova等(2003)Cell，115：209-216)进行评分。优选地，选择具有全部或大部分下述特征的19-mer：(1)Reynolds评分＞4；(2)GC含量为约40％～约60％；(3)负的ΔΔG；(4)末端腺苷；(5)缺少4个或更多个相同核苷酸的连续延伸(consecutive run)；(6)位置接近所述目标基因的3’末端；(7)与miRNA前体转录物的最小差异。优选地，选择多个(3个或以上)19-mer进行测试。已经报道siRNA中每隔一个(every third)核苷酸的位置对于影响RNAi效力特别重要，且算法“siExplorer”在rna.chem.t.u-tokyo.ac.jp/siexplorer.htm(参见Katoh和Suzuki(2007)Nucleic Acids Res.，10.1093/nar/gkl1120)上可公开获得。
(c)确定在制备修饰的成熟miRNA中使用的所选择19-mer的反向互补体。优选地，将20位的附加的核苷酸与所选择的目标序列匹配，并且优选地选择21位的核苷酸为不配对以阻止目标转录物上静默的扩散，或者为与目标序列配对以促进目标转录物上静默的扩散。
(d)测试工程化miRNA前体的期望的特征，例如原位稳定性，或者控制无脊椎动物害虫的效力。例如，在组成型(例如，CaMV 35S)或组织特异性的(例如，根)启动子作用下，在植物中表达包含工程化miRNA前体的重组DNA构建体，并且测量所述前体的原位稳定性。在另一实例中，可以在作为目标基因静默效力的替代测量的幼虫死亡率生物测定中测试工程化miRNA前体；参见，例如，在国际专利申请公开WO2005/110068A2和美国专利申请公开US 2006/0021087A1(其以引入的方式引入)中详细描述的西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)幼虫的生物测定。在又一实施例中，工程化miRNA前体可以在大豆异皮线虫生物测定中测试，例如Steeves等(2006)Funct.Plant Biol.，33：991-999详细描述的，其中测量每植物的包囊、每克根的包囊、每植物的卵、每克根的卵和每包囊的卵。
以及(e)将最有效的工程化miRNA前体克隆到用于植物(例如玉米)稳定转化的构建体中(参见标题“制备和使用重组DNA构建体”和“制备和使用转基因细胞和转基因植物”下的章节)。
在工程化miRNA途径的非限制性实例中，“8-miR”序列(SEQ IDNO.1)经工程化以加工成被设计为使西方玉米根虫空泡的ATPase(vATPase，SEQ ID NO.19)静默的新型成熟miRNA。成熟miRNA序列的设计考虑到目前已知的有关动物miRNA加工的内容，参见，例如Schwarz等(2003)Cell，115：199-208，Khvorova等(2003)Cell，115：209-216和Reynolds等(2004).Nature Biotechnol.，22：326-330。为了最小的偏离目标的效应和最大的预定效力，选择与目标序列完全或接近完全的匹配。各个工程化的成熟miRNA序列设计为取代相应的内源性成熟miRNA，而保留前体和“8-miR”簇的预定的二级结构。表2列出了8个选择的目标序列中的每一个、其在SEQ ID NO.19中的位置、各个目标序列的相关性质以及设计为静默目标序列的工程化miRNA序列。在相应的工程化miRNA中保持了各原始miRNA前体的二级结构(即，折-回结构)，其描述在图3中。
将8个工程化miRNA序列代入支架(原始)的“8-miR”簇以产生单一的工程化“8mirvATPase”序列(SEQ ID NO.44)。由于构建的方法，得到了5个变异8mirvATPase序列(各与SEQ ID NO.44具有微小差异)，包括变体“8mirvATPase-11”(SEQ ID NO.45)和“8mirvATPase-16”(SEQID NO.46)。5个版本的8mirvATPase中的每一个的RNA由其相应的质粒表达，并且在西方玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera)幼虫食物生物测定(在美国专利申请公开US 2006/0021087A1中描述，其以引入的方式并入)中测试。全部的5个RNA都显示对WCR幼虫的部分致死性和生长迟缓。来自构建体pMON97871(包含SEQ ID NO.45)和pMON97872(包含SEQ ID NO.46)的RNA分别引起64％和77％的显著的WCR幼虫致死率，且经工程化以在玉米植物中转录。
为了测试工程化miRNA前体转录物的原位稳定性，制备了质粒pMON97878(包括在CaMv35S启动子的控制下的SEQ ID NO.46)并渗透到烟草(Nicotiana benthamiana)植物中。三天后，从三个单独的渗透植物中提取总RNA并使用与“8mirvATPase-16”互补的地高辛标记的RNA探针通过RNA印迹法进行分析。RNA印迹分析(Figure 4)显示：烟草植物中存在作为全长“8mirvATPase-16”转录物和作为降解RNA的“8mirvATPase-16”(SEQ ID NO.46)RNA，表明：“8mirvATPase-16”RNA在植物中比由反向重复序列(即，与相同的目标基因的反义序列相邻的正义序列)产生的相应的双链RNA更加稳定，双链RNA被发现完全原位切割成小的RNA(数据未给出)。
为了评介赋予植物抵抗无脊椎动物害虫的抗性的效力，质粒pMON97875(包含“8mirvATPase-11”(SEQ ID NO.45))和pMON97876(包含“8mirvATPase-16”(SEQ ID NO.46))使用玉米二元质粒进行克隆。这些质粒被转化到玉米中。得到的植物预期显示抵抗西方玉米根虫损害的抗性。
Figure A20088001047000511
实施例2
该实施例描述包含新型无脊椎动物miRNA前体的非限制性实施方式。更具体地，该实施例描述从大豆异皮线虫(SCN，Heterodera glycines)中确认的新型的成熟miRNA序列和它们相应的miRNA前体序列和折回结构。所述线虫miRNA前体用于制备重组DNA构建体(其用于制备本发明的非天然的转基因植物细胞、植物和种子)，特别是具有抵抗SCN和其他的线虫或无脊椎动物害虫的抗性的非天然转基因大豆植物。可以预见，通过线虫(例如，SCN)摄取线虫特异性的miRNA(不论作为外源性表达的原始序列或作为工程化miRNA)是控制线虫和其他无脊椎动物害虫的方法。
通过与Aravin和Tuschl(2005)FEBS Letts.，579：5830-5840以及Ambros和Lee(2004)Methods Mol.Biol.，265：131-158中描述的方法相似的标准程序来构建来自大豆异皮线虫(Heterodera glycine，SCN)的小RNA的文库。简言之，通过Trizol(Invitrogen)方法从SCN中分离总RNA。在聚丙烯酰胺凝胶上对SCN RNA进行分级并从凝胶上洗脱小RNA(约18个～约26个核苷酸)。将接头连接到小RNA的5’和3’末端，并通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到的连接混合物。将所述PCR产品连接到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)中。连接混合物转化到E.coli.中。使192个得到的转化集落生长并从各个集落制备质粒DNA。测定各个质粒的部分DNA序列以确定插入到载体中的小RNA的性质。
使用常规方法对两个文库进行测序并且得到192个原始序列。取得长度约18～26个核苷酸的89个独特的小RNA并进行新的miRNA的分析。使用如Hofacker等(1994)Monatsh.f.Chemie，125：167-188描述的Vienna包中的RNAfold程序，通过首先折叠二级结构来预测新的miRNA。如此预测的结构基于由Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant.Biol.，57：19-53衍生的那些进行修饰的经过验证的miRNA前体的特性进行过滤。最后人工检查预测结果。确认了4个公开的miRNA家族的SCN同源体并列于表3中。此外，从52个SCN基因组基因座预测了4个新型SCN miRNA并给出小标示符“SCN15”(GUCAGCCGAUCCUAAGGCACC，SEQ ID NO.53)、“SCN25”(UGGUGCGUGGACUAGUGGUGAG，SEQ ID NO.54)、“SCN30”(UGAAAGACAUGGGUAGUAUGAGACG，SEQ ID NO.55)和“SCN31”(CACCUAUACUCCACCGUCAUUGG，SEQ ID NO.56)。所述成熟SCNmiRNA和它们相应的miRNA前体列于表4中。在图5中描述了折-回结构(即，无脊椎动物miRNA前体的二级结构，各包含至少一个将被加工为成熟miRNA的茎-环，其中所述茎-环包括茎区域和环区域)的非限制性的实例
表3
  miRNA家族   SCN序列   SEQ ID NO.
  miR-8   UAAUACUGUCAGGUAAAGAUGUC   47
  miR-71   UGAAAGACAUGGGUAGUAUGAGACG   48
  miR_86   UAAGUGAAUUCUUUGCCACAGUCU   49
  miR-100   AACCCGUAGAUCCGAACUAGUC   50
  miR-100   AACCCGUAGAUCCGAACUAGUCU   51
  miR-100   AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG   52
表4
                                              基因组基因
                     pre-miRNA
           成熟                    Pre-miR    座中
SCN成                中成熟
           miRNA                   NA         pre-miRNA
熟                   miRNA的                                SCN基因组基因座
           SEQ ID                  SEQ ID     的核苷酸位
miRNA                核苷酸位置
           NO.                     NO         置
            起点  终点        起点  终点
15    53    59    79    57    181    270    HG3_LIB5513-477-A1-M1-H4
25    54    43    64    58    197    271    HG3_34113.C1
25    54    43    64    58    197    271    HG3_29652.C1
25    54    43    64    58    197    271    HG3_28454.C1
25    54    43    64    59    197    271    HG3_18268.C1
25    54    43    64    58    197    271    HG3_34533.C1
25    54    43    64    58    172    246    HG3_19260.C1
25    54    43    64    58    103    177    HG3_25275.C1
25    54    43    64    60    103    177    HG3_12307.C1
25    54    43    64    58    197    271    HG3_25338.C1
25    54    43    64    58    197    271    HG3_10253.C1
25    54    43    64    58    154    228    HG3_29286.C1
25    54    43    64    58    197    271    HG3_254.C1
25    54    43    64    58    156    230    HG3_8212.C1
25    54    43    64    59    197    271    HG3_18844.C1
25    54    43    64    61    63     137    HG3_1908.C2
25    54    43    64    58    197    271    HG3_33191.C1
25    54    43    64    59    197    271    HG3_LIB5513-515-A1-P1-C7
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5519-246-A1-M1-A2
25    54    43    64    59    35     109    HG3_L_IB5520-450-A1-P1-D6
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5519-364-A1-M1-C2
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5513-505-A2-M1-E11
25    54    43    64    62    197    271    HG3_LIB5513-708-A1-M1-E9
25    54    43    64    59    197    271    HG3_LIB5513-353-A1-P1-B11
25    54    43    64    59    197    271    HG3_LIB5513-678-A1-M1-E6
25    54    43    64    63    76     150    HG3_LIB5513-103-A1-M1-G4
25    54    43    64    59    197    271    HG3_LIB5519-495-A1-M1-G5
25    54    43    64    59    48     122    HG3_LIB5514-043-A1-P1-D11
25    54    43    64    62    197    271    HG3_LIB5513-373-A1-M1-H2
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5513-801-A1-P1-D5
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5519-564-A1-P1-C9
25    54    43    64    59    35     109    HG3_LIB5519-028-A1-P1-B10
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5519-120-A1-P1-F12
25    54    43    64    64    197    271    HG3_LIB5519-507-A1-M1-F3
25    54    43    64    59    197    271    HG3_LIB5519-231-A1-M1-G2
25    54    43    64    59    197    271    HG3_LIB5519-518-A1-M1-B2
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5513-224-A1-P1-E3
25    54    43    64    58    164    238    HG3_LIB5513-691-A1-M1-G5
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5519-295-A1-M1-G11
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5513-052-A1-M1-F7
25    54    43    64    58    197    271    HG3_LIB5519-450-A1-P1-F10
30    55    10    34    65    228    319    HG3_1898.C5
31    56    65    87    66    696    793    HG3_25240.C1
31    56    65    87    67    696    793    HG3_23769.C1
31    56    65    87    66    690    787    HG3_13335.C1
31    56    65    87    66    699    796    HG3_21499.C1
31    56    64    86    68    151    247    HG3_LIB5513-288-A1-M1-G12
31    56    64    86    68    49     145    HG3_LIB5513-004-A1-M1-C6
31    56    10    32    69    133    230    HG3_LIB5520-318-A1-P1-D7
31    56    64    86    68    140    236    HG3_LIB5519-222-A1-P1-D9
31    56    64    86    68    174    270    HG3_LIB5520-295-A1-M1-E8
31    56    64    86    68    138    234    HG3_LIB5519-532-A1-M1-E2
实施例3
该实施例描述可以在植物细胞中转录为重组miRNA前体的重组DNA构建体的另一个非限制性实施方式，优选赋予植物抵抗无脊椎动物害虫的抗性。更具体地，该实施方式描述包含源自多个miRNA前体的序列的重组DNA构建体，在本实施例中为与西方玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera)miRNA前体具有同源性的9个无脊椎miRNA前体。
从来自西方玉米根虫的小RNA文库得到与已知miRNA具有同源性的9个克隆；这些推定的WCR miRNA示于表5中。
表5
  小  miRNA家族  SEQ   克隆的WCR miRNA   大
  RNAID  IDNO.   小(nt)
  2997059  bta-miR-7  70   TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTT   24
  1167198  dme-miR-9a  71   TCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA   21
  2999692  dme-miR-14  72   TCAGTCTTTTTCTCTCTCCTA   22
  3000551  dme-miR-31a  73   GGCAAGATGTCGGCATAGCTG   22
  3000395  sme-miR-71c  74   TGAAAGACATGGGTAGTGAGAT   22
  3000406  aga-miR-92b  75   AATTGCACTTGTCCCGGCCTGC   22
  2998018  dme-miR-275  76   TCAGGTACCTGAAGTAGCGCGC   22
  2833118  dme-miR-279  77   TGACTAGATCCACACTCATTAA   23
  3007470  dme-miR-305  78   ATTGTACTTCATCAGGTGCTCT   21
对于9个微RNA中的每一个，无脊椎动物pre-miRNA的同源体从MiRbase确认(8个来自黑腹果蝇而1个来自线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabdites elegans))。选择的同源的pre-miRNA序列(各包含pre-miRNA的上游和下游的另外10个核苷酸，如在序列名称中以“+10”表示)为：“dme-mir-7+10”(GTCCTCCTGGGAGTGCATTCCGTATGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTTGGTCTTTGGTAATAACAATAAATCCCTTGTCTTCTTACGGCGTGCATTTGTGCTCTTCA，SEQ ID NO.79)、“dme-mir-9a+10”(TATACAGGGTGCTATGTTGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATGAGTGATAAATAACGTCATAAAGCTAGCTTACCGAAGTTAATATTAGCGTCTGCCCAG，SEQ ID NO.80)、“dme-mir-14+10”(CTGCAACCTATGTGGGAGCGAGACGGGGACTCACTGTGCTTATTAAATAGTCAGTCTTTTTCTCTCTCCTATACAAATTGCGG，SEQ IDNO.81)、“dme-mir-31a+10”(CGCTGACTGTTCCATTGAACAACTGACTAGATGCAGCATAGCGCTCTTCAAAATCGCTTTTCAACGTCAGCTATGCCGACATCTTGCCAATTTACCAACGGAGTTGATATAC，SEQ ID NO.82)、“Cel-miR-71+10”(CACAGAGGTTGTCTGCTCTGAACGATGAAAGACATGGGTAGTGAGACGTCGGAGCCTCGTCGTATCACTATTCTGTTTTTCGCCGTCGGGATCGTGACCTGGAAGCTGTAAACT，SEQ ID NO.83)、“dme-mir92a+10”(GCCGAATATAAATATGAATTTCCCGTAGGACGGGAAGGTGTCAACGTTTTGCATTTCGAATAAACATTGCACTTGTCCCGGCCTATGGGCGGTTTGTAATAAACAACTAAAATCT，SEQ ID NO.84)、“dme-miR275+10”(TTCCCCCGACTGTAAAGTCTCCTACCTTGCGCGCTAATCAGTGACCGGGGCTGGTTTTTTATATACAGTCAGGTACCTGAAGTAGCGCGCGTGGTGGCAGACATATATCTCCATCTTC，SEQ ID NO.85)、“dme-miR279+10”(AGCTGGAATTGGAATTCATACTACTGTTTTTAGTGGGTGGGGGTCCAGTGTTTCACATTGATTTTCTTAGTATTTGTGACTAGATCCACACTCATTAATAACGGTAGTTCAATCATCAAG，SEQ ID NO.86)和“dme-miR305+10”(AACTGTCTCCCATGTCTATTGTACTTCATCAGGTGCTCTGGTGTGTCTCGTAACCCGGCACATGTTGAAGTACACTCAATATGAGGCGATTTG，SEQ ID NO.87)。
所述的9个pre-miRNAs(包含额外的“+10”个核苷酸)头尾连接得到951个核苷酸的序列，“miR-7+9+14+31+71+92+275+279+305”(GTCCTCCTGGGAGTGCATTCCGTATGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTTGGTCTTTGGTAATAACAATAAATCCCTTGTCTTCTTACGGCGTGCATTTGTGCTCTTCATATACAGGGTGCTATGTTGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATGAGTGATAAATAACGTCATAAAGCTAGCTTACCGAAGTTAATATTAGCGTCTGCCCAGCTGCAACCTATGTGGGAGCGAGACGGGGACTCACTGTGCTTATTAAATAGTCAGTCTTTTTCTCTCTCCTATACAAATTGCGGCGCTGACTGTTCCATTGAACAACTGACTAGATGCAGCATAGCGCTCTTCAAAATCGCTTTTCAACGTCAGCTATGCCGACATCTTGCCAATTTACCAACGGAGTTGATATACCACAGAGGTTGTCTGCTCTGAACGATGAAAGACATGGGTAGTGAGACGTCGGAGCCTCGTCGTATCACTATTCTGTTTTTCGCCGTCGGGATCGTGACCTGGAAGCTGTAAACTGCCGAATATAAATATGAATTTCCCGTAGGACGGGAAGGTGTCAACGTTTTGCATTTCGAATAAACATTGCACTTGTCCCGGCCTATGGGCGGTTTGTAATAAACAACTAAAATCTTTCCCCCGACTGTAAAGTCTCCTACCTTGCGCGCTAATCAGTGACCGGGGCTGGTTTTTTATATACAGTCAGGTACCTGAAGTAGCGCGCGTGGTGGCAGACATATATCTCCATCTTCAGCTGGAATTGGAATTCATACTACTGTTTTTAGTGGGTGGGGGTCCAGTGTTTCACATTGATTTTCTTAGTATTTGTGACTAGATCCACACTCATTAATAACGGTAGTTCAATCATCAAGAACTGTCTCCCATGTCTATTGTACTTCATCAGGTGCTCTGGTGTGTCTCGTAACCCGGCACATGTTGAAGTACACTCAATATG，SEQ ID NO.88)。这是使用重叠的50-mer寡核苷酸通过PCR合成的。将该序列克隆到pCR4-TOPO载体(Invitrogen)中，得到质粒pMON97886，T7聚合酶用于从该质粒生成RNA。
在西方玉米根虫(WCR，Diabrotica virgifera)幼虫饮食生物测定(在美国专利申请公开US 2006/0021087A1中描述，以引入的方式并入)中测试所获得的对应于SEQ ID NO.88的RNA，并测量对于WCR幼虫的致死率和生长迟缓率。
实施例4
该实施例描述可以在植物细胞中转录为重组miRNA前体的重组DNA构建体的另一个非限制性实施方式，优选赋予植物抵抗无脊椎动物害虫的抗性。更具体而言，该实施方式描述包含设计为抑制无脊椎动物目标基因的源自大豆异皮线虫(Heterodera glycine，SCN)miRNA序列的人工miRNA前体序列的重组DNA构建体。
当在大豆中表达为dsRNA时，已报道精子主要蛋白1(MSP1)引起大豆异皮线虫严重死亡；参见Steeves等(2006)Funct.Plant Biol.，33：991-999。基于Reynolds等(2004)Nature Biotechnol.，22：326-330和Khvorova等(2003)Cell，115：209-216描述的功能不对称和效力预测器，来自大豆异皮线虫MSP1(SEQ ID NO.90)的21个核苷酸的序列TCTTGAGACTGTCCTGTATTA(SEQ ID NO.89)选择作为目标序列。通过用工程化的成熟miRNA“SCN15-miRMSP1”(SEQ ID NO.91)替换“SCN15”成熟miRNA的核苷酸对产生“SCN15”成熟miRNA(SEQ IDNO.53)(参见实施例2)的“SCN15”pre-miRNA序列(SEQ ID NO.57)进行修饰，并且改变折回的互补区域以保持原始配对的和不配对的碱基，从而得到工程化的pre-miRNA序列“SCN15-MIRMSP1”(SEQ ID NO.92)；参见图6A。将合成的pre-miRNA“SCN15-MIRMSP1”(SEQ ID NO.92)克隆到具有组成型的或根特异性的启动子的二元表达载体中，转化到大豆中，并测定其对抗SCN的效力，例如，使用Steeves等(2006)Funct.Plant Biol.，33：991-999描述的生物分析方法。
实施例5
该实施例描述可以在植物细胞中转录为重组miRNA前体的重组DNA构建体的另一个非限制性实施方式，优选赋予植物抵抗无脊椎动物害虫的抗性。更具体而言，该实施方式描述了包含经工程化以抑制无脊椎动物目标基因的源自大豆异皮线虫(Heterodera glycine，SCN)miRNA序列的人工miRNA前体序列的重组DNA构建体。
基于Reynolds等(2004)Nature Biotechnol.，22：326-330和Khvorova等(2003)Cell，115：209-216描述的功能不对称和效力预测器，选择来自大豆异皮线虫cgh-1(SEQ ID NO.94)的22个核苷酸的序列TGGTGCGTGGACTAGTGGTGAG(SEQ ID NO.93)作为目标序列。通过用工程化成熟miRNA“SCN25-miRcgh1”(SEQ ID NO.95)替换“SCN25”成熟miRNA的核苷酸对产生“SCN25”成熟miRNA(SEQ IDNO.53)(参见实施例2)的“SCN25”pre-miRNA序列(SEQ ID NO.58)进行修饰，并且改变折回的互补区域以保持原始的配对的和不配对的碱基，从而得到工程化的pre-miRNA序列“SCN25-MIRcgh1”(SEQ ID NO.96)；参见图6B。将合成的pre-miRNA“SCN25-MIRcgh1”(SEQ ID NO.96)克隆到具有组成型或根特异性的启动子的二元表达载体中，转化到大豆中，并例如，使用Steeves等(2006)Funct.Plant Biol.，33：991-999)描述的生物分析方法分析对抗SCN的效力。
实施例6
在本发明的许多实施方式中，所述重组DNA构建体进一步包含一个或多个选自下述的元件：(a)在植物细胞中发挥功能的启动子；(b)转基因转录单元；(c)基因抑制元件；以及(d)转录调节/转录物稳定元件。该实施例进一步说明了基因抑制元件的非限制性实施方式。基因抑制元件可以包括但不限于作为本发明方面的无脊椎动物成熟miRNA和miRNA前体。
图7A示意性地描述说明该构建体成分的排列的重组DNA构建体的非限制性实施例。在这些非限制性的实施例中，所述构建体包含至少一个第一基因抑制元件(“GSE”or“GSE1”)，其用于抑制至少一个第一目标基因，其中所述第一基因抑制元件嵌入到一侧或两侧与非蛋白质编码的DNA相邻的内含子中。这些构建体利用内含子(在许多实施方式中，优选源自5’未翻译区域的内含子或增强表达的内含子)传递基因抑制元件而不需要任何蛋白质编码的外显子(编码序列)的存在。所述构建体可以任选地包含至少一个用于抑制至少一个第二目标基因的第二基因抑制元件(“GSE2”)、至少一个用于表达至少一个感兴趣的基因(其可以是编码的或非编码的序列或者两者均是)的基因表达元件(“GEE”)或者包括两者。在包含任选的基因表达元件的实施方式中，所述基因表达元件可以位于内含子外(例如，邻近内含子)。在某些实施方式中，包含第一基因抑制元件的内含子是在终止子的3’侧。
为了更加清楚将本发明的重组DNA构建体(包含至少一个嵌入到一侧或两侧与非蛋白质编码的DNA相邻的单一内含子中的基因抑制元件)与现有技术区分开，图7B示意性地描述了现有技术的重组DNA构建体的实例。这些构建体可以包含位置靠近与蛋白质编码的序列侧邻的内含子或者位置在两个不连续的内含子(其中，所述基因抑制元件没有嵌入两个不连续的内含子中的任一个内)之间的基因抑制元件，或者可以包含基因抑制单元，包括嵌入与多个外显子(例如，包括蛋白质的编码序列的外显子)侧邻的内含子内的基因抑制元件。
图8描绘了可用于本发明的重组DNA构建体的基因抑制元件的各种非限制性的实施例。当描绘为单链(图8A到8E)时，它们常规地沿5’到3’(从左到右)的转录方向描绘；箭头表明反义序列(箭头指向左)或正义序列(箭头指向右)。这些基因抑制元件可以包括：包含至少一个反义DNA片段(其对至少一个第一目标基因的至少一个片段是反义的)的DNA，或者包含至少一个反义DNA片段(其对至少一个第一目标基因的至少一个片段是反义的)的多个复本的DNA(图8A)；包含至少一个正义DNA片段(其为至少一个第一目标基因的至少一个片段)的DNA，或者包含至少一个正义DNA片段(其为至少一个第一目标基因的至少一个片段)的多个复本的DNA(图8B)；转录为通过形成双链的RNA而抑制至少一个第一目标基因的RNA，且包含至少一个反义DNA片段(其对至少一个第一目标基因的至少一个片段是反义的)和至少一个正义DNA片段(其是至少一个第一目标基因的至少一个片段)的DNA(图8C)；转录为通过形成单个双链RNA而抑制至少一个第一目标基因的RNA，且包含多个串联的反义DNA片段(其对至少一个第一目标基因的至少一个片段是反义的)和多个串联正义DNA片段(其是至少一个第一目标基因的至少一个片段)的DNA(图8D)；转录为通过形成多个双链RNA而抑制至少一个第一目标基因的RNA，且包含多个反义DNA片段(其对至少一个第一目标基因的至少一个片段是反义的)和多个正义DNA片段(其是至少一个第一目标基因的至少一个片段)的DNA，且其中所述多个反义DNA片段和多个正义DNA片段以一系列的反向重复序列进行排列(图8E)；以及包含源自miRNA的核苷酸(包括但不限于，源自本发明的无脊椎动物成熟miRNA和miRNA前体的核苷酸)的DNA，或者包含siRNA的核苷酸的DNA(图8F)。
图8F描绘了可由用于本发明的重组DNA构建体的基因抑制元件的实施方式转录的双链RNA的各种非限制性的排列。当形成这种双链RNA时，它可以抑制一种或多种目标基因，且可以形成单个双链RNA或多个双链RNA或者单个双链RNA“茎”或多个“茎”。在形成多个双链RNA“茎”的情况下，它们可以排列成“锤头”或“苜蓿叶”形式。在一些实施方式中，双链茎可以形成“假结(pseudoknot)”形式(例如，在一个双链茎的间隔区或环状RNA形成第二双链茎的部分的情况中)，参见，例如Staple和Butcher(2005)PLoS Biol.，3(6)：e213中对假结结构的描述。间隔区DNA(位于dsRNA区域之间或与dsRNA区域相邻)是任选的，但通常包括其中，且间隔区DNA一般包括不与目标基因对应的DNA(虽然在一些实施方式中可能包括目标基因的正义或反义DNA)。间隔区DNA可以包括转录成单链RNA或至少部分双链RNA(例如在“亲吻茎-环(kissing stem-loop)”形式中)或者转录成呈现二级结构或三维构型(例如，目标基因反义序列的大环或适体)(该二级结构或三维构型赋予转录物额外的特性，如更高的稳定性、更长的体内半衰期或者细胞或组织特异性)的RNA的序列。
本发明公开和要求的所有物质和方法可以按照以上公开内容的指示制备和使用而不需要过度的试验。虽然本发明的物质和方法参照优选的实施方式的示例性的实施例进行了说明，但本领域技术人员很清楚，可以对本文中所描述的物质和方法进行改变而不脱离本发明的原理、精神和范围。对于本领域技术人员显而易见的所有这些替换和改进都认为在所附的权利要求所定义的本发明的精神、范围和原理内。
<110>Allen，Edwards
Donovan，William P.
Heck，Gregory R.
Roberts，James K.
Ursin，Virginia
Zhang，Yuanji
<120>无脊椎动物微RNA
<130>38-21(54478)B
<150>US 60/890,705
<151>2007-02-20
<160>96
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1502
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>1
aaaattttca ctaaggtcgt cgcgatccgg gacgcgaatt cgcggaacag ccccgaccct  60
ttcaggtaac aacgcccgcc acccacaggt aggtgtttat aggacaagaa agtgggtata  120
aaagatctag ccgctggcaa ggaagtcatc agttaccaac gcatcttcaa agtgtaagga  180
tcccgcagtg agaagcgaag tcttaaagtt tggaatagca attatacgac aaaccttgtt  240
cggttttgcc aatttccaag ccagcactgg gtaaagtttg tcctataatc ccgaaacgac  300
gaccagctaa ttgtgagcca cctaaggtcc cgatcctggg atgcatcttg tgcagttatg  360
tttcaatctc acatcactgg gcaaagtgtg tctcaagatc ctggccacat cgtcgcaact  420
tcaaatcaat taaatcaaaa aatcaagagt aagtgatatt gggcactcca gttttaaaat  480
tgaatggcga atgtcggtat ggtctctttt tcaaagaaag gtttcgatta agcgaagtga  540
ctagaccgaa cactcgtgct ataattttaa aatattcaac atgctcagta aagttgcgag  600
tgaaaattaa aatattatgg agcggttgca attagtttct ttggtcgtcc agccttaggt  660
gatttttccg gtcataaagc tagacaacca ttgaagttcg ttgtggcatt agcagcacca  720
cgagtcaaga aattatgtta agtgatcccc aaattcatcg ggccattcgc taaaaggaac  780
gatcgttgtg atatgagttg tttcctaaca tatcacagtg attttccttt ataacgcatg  840
tttaaagtcc acaactcatc aaggaaaatg aaagtcaaag ttggcagctt acttaaactt  900
aatcacagcc tttaatgtag agggaatagt tgctgtgctg taagttaata taccatatct  960
atatcacagt ggctgttctt tttgtaccta aagtgcctaa catcattatt taattttttt  1020
tttttttggc acacgaataa ccatgccgtt tttaacccaa gggaacttct gctgctgata  1080
tattattgaa aaactactat atcacagtgg ctgttctttt tggttgcacg gccaattcca  1140
acgatttgtc atttgtggca cgcatttgtg tcacctcagt gcgaaaattg aaaattgtac  1200
aaaaagaagg gaacggttgc tgatgatgta gtttgaaact ctcacaattt atatcacagt  1260
ggctgttctt ttttgtttgg caatcgatct acgttcagtg gtttgccagg acatgaaaca  1320
gaaatatttt ccgtcaacag acttctgatt gcacaaattc ctcaagcttt gaacatttgg  1380
gaaaaactga tgagacgttg gttttctagc ttgtgcatca attcgtcatt tgtctgcagt  1440
tttgtcaatc tttaattgca ctttacaatt cattgctttt tgttcaatca tttttgggtg  1500
gt                                                                 1502
<210>2
<211>1059
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>2
attatacgac aaaccttgtt cggttttgcc aatttccaag ccagcactgg gtaaagtttg  60
tcctataatc ccgaaacgac gaccagctaa ttgtgagcca cctaaggtcc cgatcctggg  120
atgcatcttg tgcagttatg tttcaatctc acatcactgg gcaaagtgtg tctcaagatc  180
ctggccacat cgtcgcaact tcaaatcaat taaatcaaaa aatcaagagt aagtgatatt  240
gggcactcca gttttaaaat tgaatggcga atgtcggtat ggtctctttt tcaaagaaag  300
gtttcgatta agcgaagtga ctagaccgaa cactcgtgct ataattttaa aatattcaac  360
atgctcagta aagttgcgag tgaaaattaa aatattatgg agcggttgca attagtttct  420
ttggtcgtcc agccttaggt gatttttccg gtcataaagc tagacaacca ttgaagttcg  480
ttgtggcatt agcagcacca cgagtcaaga aattatgtta agtgatcccc aaattcatcg  540
ggccattcgc taaaaggaac gatcgttgtg atatgagttg tttcctaaca tatcacagtg  600
attttccttt ataacgcatg tttaaagtcc acaactcatc aaggaaaatg aaagtcaaag  660
ttggcagctt acttaaactt aatcacagcc tttaatgtag agggaatagt tgctgtgctg  720
taagttaata taccatatct atatcacagt ggctgttctt tttgtaccta aagtgcctaa  780
catcattatt taattttttt tttttttggc acacgaataa ccatgccgtt tttaacccaa  840
gggaacttct gctgctgata tattattgaa aaactactat atcacagtgg ctgttctttt  900
tggttgcacg gccaattcca acgatttgtc atttgtggca cgcatttgtg tcacctcagt  960
gcgaaaattg aaaattgtac aaaaagaagg gaacggttgc tgatgatgta gtttgaaact  1020
ctcacaattt atatcacagt ggctgttctt ttttgtttg                         1059
<210>3
<211>69
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>3
attatacgac aaaccttgtt cggttttgcc aatttccaag ccagcactgg gtaaagtttg    60
tcctataat                                                            69
<210>4
<211>69
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>4
gatcctggga tgcatcttgt gcagttatgt ttcaatctca catcactggg caaagtgtgt    60
ctcaagatc                                                            69
<210>5
<211>100
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>5
ttaaaattga atggcgaatg tcggtatggt ctctttttca aagaaaggtt tcgattaagc    60
gaagtgacta gaccgaacac tcgtgctata attttaaaat                          100
<210>6
<211>81
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>6
ttgcaattag tttctttggt cgtccagcct taggtgattt ttccggtcat aaagctagac    60
aaccattgaa gttcgttgtg g                                              81
<210>7
<211>69
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>7
gctaaaagga acgatcgttg tgatatgagt tgtttcctaa catatcacag tgattttcct    60
ttataacgc                                                            69
<210>8
<211>82
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>8
tttaatgtag agggaatagt tgctgtgctg taagttaata taccatatct atatcacagt    60
ggctgttctt tttgtaccta aa                                             82
<210>9
<211>74
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>9
taacccaagg gaacttctgc tgctgatata ttattgaaaa actactatat cacagtggct    60
gttctttttg gttg                                                      74
<210>10
<211>80
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>10
caaaaagaag ggaacggttg ctgatgatgt agtttgaaac tctcacaatt tatatcacag    60
tggctgttct tttttgtttg                                                80
<210>11
<211>69
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>11
auuauacgac aaaccuuguu cgguuuugcc aauuuccaag ccagcacugg guaaaguuug    60
uccuauaau                                                            69
<210>12
<211>69
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>12
gauccuggga ugcaucuugu gcaguuaugu uucaaucuca caucacuggg caaagugugu    60
cucaagauc                                                            69
<210>13
<211>100
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>13
uuaaaauuga auggcgaaug ucgguauggu cucuuuuuca aagaaagguu ucgauuaagc    60
gaagugacua gaccgaacac ucgugcuaua auuuuaaaau                          100
<210>14
<211>81
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>14
uugcaauuag uuucuuuggu cguccagccu uaggugauuu uuccggucau aaagcuagac    60
aaccauugaa guucguugug g                                              81
<210>15
<211>69
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>15
gcuaaaagga acgaucguug ugauaugagu uguuuccuaa cauaucacag ugauuuuccu    60
uuauaacgc                                                            69
<210>16
<211>82
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>16
uuuaauguag agggaauagu ugcugugcug uaaguuaaua uaccauaucu auaucacagu    60
ggcuguucuu uuuguaccua aa                                             82
<210>17
<211>74
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>17
uaacccaagg gaacuucugc ugcugauaua uuauugaaaa acuacuauau cacaguggcu    60
guucuuuuug guug                                                      74
<210>18
<211>80
<212>RNA
<213>黑腹果蝇
<400>18
caaaaagaag ggaacgguug cugaugaugu aguuugaaac ucucacaauu uauaucacag    60
uggcuguucu uuuuuguuug                                                80
<210>19
<211>2891
<213>西方玉米根虫
<400>19
cgcacgcctg caccgtaccg gaaactcgtc cataatcgcg atagttgagt gggtgaggtt  60
ccaagagaaa cataacatcc atccacaaat atgtcgaaag taaggatcgg agatgaagag  120
aaggaagggc agtatggtta tgtccatgct gtctcaggtc cagtcgttac tgctgagaaa  180
atgtctggtt ctgctatgta cgaactggta cgtgtcggat actatgagct ggtaggagaa  240
atcattagat tggaaggtga catggctact attcaggtat acgaagaaac atcaggtgta  300
actgttggtg atccagtatt aagaactggt aaaccacttt cagtagaact tggacctggt  360
attatgggtt ccatttttga tggtatccaa cgtccattga aagacatttg tgacgctact  420
gatagtattt acatccccaa gggtattaac gtaccttctt tatcgagaac agcaaaatgg  480
gacttcaacc caatcaacat caagttggga tctcacttaa ctggaggtga tatatatggt  540
ctagttcatg aaaacaccct tgtcaaacac aaaatgattc tgcctcctag agctaagggt  600
actgtaacct acattgcaga accaggaaac tacactgttg atgaagtagt attggaaact  660
gaatttgatg gtgatcgtac caaatatact atgttgcaag tatggcctgt acgtcaagca  720
aggccagtca gtgaaaaatt acctgccaac catcctctgc ttacaggaca gcgtgtactt  780
gatgctcttt tcccatgtgt acagggtggt actactgcca ttcccggagc tttcggttgt  840
ggaaaaactg taatttcaca atctctttcc aaatattcca actctgatgt cattatctac  900
gtcggttgcg gagaaagagg taacgaaatg tctgaagtat tgagagattt ccctgaattg  960
actgttgaaa ttgacgggca cactgaatct attatgaaac gtaccgcatt ggtcgccaac  1020
acatctaaca tgcctgtagc tgctcgtgaa gcttctatct atactggtat tactctttct  1080
gaatacttcc gtgatatggg ttacaacgta tctatgatgg ctgactcgac atcacgttgg  1140
gccgaagctt tgagagaaat ttcaggtcgt ttggctgaaa tgcctgccga ttccggttat  1200
ccggcttact taggtgcccg tttggcttcc ttctacgaac gtgctggtcg cgttaaatgt  1260
ttaggtaatc cagacagaga aggatccgtt tcaattgtag gagccgtatc acctcctggt  1320
ggtgatttct cagatcctgt taccactgct actcttggta ttgtacaggt gttctggggt  1380
ttggacaaga aacttgccca acgtaagcac ttcccttcag tagactggct tggatcatat  1440
tccaaatatt taagagcatt ggacgacttt tatgacaaaa acttccaaga gtttattcct  1500
cttagaacca aagttaagga aattcttcag gaagaagatg atctagccga aattgtgcag  1560
ctggtaggta aagcatctct ggcagaaacg gacaaaatca ccttggaaat tgccaggctt  1620
cttaaagaag atttcttgca acaaaactca tactcttctt atgacagatt ctgtccattc  1680
tataaaactg tcggtatgtt gagaaacatg atcggtttgt acgacatggc gagacacgct  1740
gtagaatcaa ccgcacaatc agaaaataag atcacttgga acgtaataag agattcaatg  1800
agtggaattt tatatcaact tagcagtatg aaatttaagg atcccgtaaa agatggtgaa  1860
gctaaaatca aggcagattt tgatcaatta tatgaagata ttcagcaggc cttcagaaac  1920
ttagaagatt aaatcttttt aaggaaattt tcctattttg ttcatcagtg taagtttaaa  1980
aatatagcga tatttatcaa aaagaataat aaggcctcta tccctcactt ctgtgaatat  2040
taatatggcc gtactaaaga tagtaactaa agataggttt tctctttttt gatattatcc  2100
tgtacaaaat aaattatgta aattgttgaa tatgtgtata gtttttttgg gtgagggtac  2160
agtgcttatt aaatactttt taaacatttt tcccgccatt ccaattacta ttaagttttt  2220
tcgttttaat acttttttaa atatacaggt gcttaatatc gtttatattt tcagtattac  2280
ttggttttct tcatgtaaat tgttttaaat ttttctttta cccttttaat cttgtatatt  2340
acattaccca attaaagtta attgtacaga ttaagataaa cgagtatctt ataacatcta  2400
ttagattgtt agaatcaata aatgtagtgt aattgttctg ttttgaacaa ataaatgcat  2460
cattattgtt gaaaaaaaaa aaaaaagggc ggccgctcgc gatctagaac tagttttttt  2520
ttttttacca taaaaattta atattttaaa tactccatca cataaacatc ataaaaacat  2580
aaaatcactc attaagacga tgagacaagc tgaacttcct ttccagtttt tttgataatc  2640
tccaagacat cattagcagg caaagttgat ttcactttaa cactctgact ttccagactt  2700
atagaaactt cttccacacc ttttccaacg tgtttattta gagctctttc cacagcacca  2760
ctgcatcctc cacaggtcat ttttacgttg aattcgtgta tttgggacat ctttgatttg  2820
ttgttgatcg aataagtgat gttttagaca gcacggacgc agatgggtcg gaccccgggg  2880
aattcccggg a                                                       2891
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>20
gactggcttg gatcatatt    19
<210>21
<211>19
<212>DNA
<213>两方玉米根虫
<400>21
gagcattgga cgactttta    19
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>22
tgtgcagctg gtaggtaaa    19
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>23
tggcagaaac ggacaaaat    19
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>24
tgccaggctt cttaaagaa    19
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>25
gcaggccttc agaaactta    19
<210>26
<211>19
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>26
tggccgtact aaagatagt    19
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>两方玉米根虫
<400>27
gagggtacag tgcttatta    19
<210>28
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>28
attagtcgac tggcctggat cataattgcc aatttccaag ccaaatatga tccaagccag    60
tctactaat                                                            69
<210>29
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>29
gatcctaaga gcattcgacg tctttcatgt ttcaatctca cataaaagtc gtccaatgct    60
cttaagatc                                                            69
<210>30
<211>97
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>30
ttaaaattga acgtgtggag cggtaagtaa atctttttca aagaaaggtt tcgattaagc    60
gaagttttac ctaccagctg cacaattata attttaa                             97
<210>31
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>31
ttgcaattag ttctacggca caaaaggact cttatgattt ttccggtcat tttgtccgtt    60
tctgccagag agttcgttgt gg                                             82
<210>32
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>32
gctattcttt aagaagcctg gcaattagtt gtttcctata attgccaggc ttctaaagaa    60
ataacgc                                                              67
<210>33
<211>82
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>33
tttaatgttc agcaggcctt tagaaaccta taagttaata taccatatct ataagtttct    60
gaaggcctgc tgagtaccta aa                                             82
<210>34
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>34
taacccatat ggcctcacta aagatagtta ttattgaaaa actactaact atctttagta    60
cggccatatt ggttg                                                     75
<210>35
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>35
caaaaaggtg agggtacagt gctatattat agtttgaaac tctcacaatt tataataagc    60
actgtaccct cacctgtttg                                               80
<210>36
<211>69
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>36
auuagucgac uggccuggau cauaauugcc aauuuccaag ccaaauauga uccaagccag    60
ucuacuaau                                                            69
<210>37
<211>69
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>37
gauccuaaga gcauucgacg ucuuucaugu uucaaucuca cauaaaaguc guccaaugcu    60
cuuaagauc                                                            69
<210>38
<211>97
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>38
uuaaaauuga acguguggag cgguaaguaa aucuuuuuca aagaaagguu ucgauuaagc    60
gaaguuuuac cuaccagcug cacaauuaua auuuuaa                             97
<210>39
<211>82
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>39
uugcaauuag uucuacggca caaaaggacu cuuaugauuu uuccggucau uuuguccguu    60
ucugccagag aguucguugu gg                                             82
<210>40
<211>67
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>40
gcuauucuuu aagaagccug gcaauuaguu guuuccuaua auugccaggc uucuaaagaa    60
auaacgc                                                              67
<210>41
<211>82
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>41
uuuaauguuc agcaggccuu uagaaaccua uaaguuaaua uaccauaucu auaaguuucu    60
gaaggccugc ugaguaccua aa                                             82
<210>42
<211>75
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>42
uaacccauau ggccucacua aagauaguua uuauugaaaa acuacuaacu aucuuuagua    60
cggccauauu gguug                                                     75
<210>43
<211>80
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>43
caaaaaggug aggguacagu gcuauauuau aguuugaaac ucucacaauu uauaauaagc    60
acuguacccu caccuguuug                                                80
<210>44
<211>1056
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>44
attagtcgac tggcctggat cataattgcc aatttccaag ccaaatatga tccaagccag  60
tctactaatc ccgaaacgac gaccagctaa ttgtgagcca cctaaggtcc cgatcctaag  120
agcattcgac gtctttcatg tttcaatctc acataaaagt cgtccaatgc tcttaagatc  180
ctggccacat cgtcgcaact tcaaatcaat taaatcaaaa aatcaagagt aagtgatatt  240
gggcactcca gttttaaaat tgaacgtgtg gagcggtaag taaatctttt tcaaagaaag  300
gtttcgatta agcgaagttt tacctaccag ctgcacaatt ataattttaa attcaacatg  360
ctcagtaaag ttgcgagtga aaattaaaat attatggagc ggttgcaatt agttctacgg  420
cacaaaagga ctcttatgat ttttccggtc attttgtccg tttctgccag agagttcgtt  480
gtggcattag cagcaccacg agtcaagaaa ttatgttaag tgatccccaa attcatcggg  540
ccattcgcta ttctttaaga agcctggcaa ttagttgttt cctataattg ccaggcttct  600
aaagaaataa cgcatgttta aagtccacaa ctcatcaagg aaaatgaaag tcaaagttgg  660
cagcttactt aaacttaatc acagccttta atgttcagca ggcctttaga aacctataag  720
ttaatatacc atatctataa gtttctgaag gcctgctgag tacctaaagt gcctaacatc  780
attatttaat tttttttttt tttggcacac gaataaccat gccgttttta acccatatgg  840
cctcactaaa gatagttatt attgaaaaac tactaactat ctttagtacg gccatattgg  900
ttgcacggcc aattccaacg atttgtcatt tgtggcacgc atttgtgtca cctcagtgcg  960
aaaattgaaa attgtacaaa aaggtgaggg tacagtgcta tattatagtt tgaaactctc  1020
acaatttata ataagcactg taccctcacc tgtttg                            1056
<210>45
<211>1025
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>45
attagtcgac tggcctggat cataattgcc aatttccaag ccaaatatga tccaagccag    60
tctactaatc ccgaaacgac gaccagctaa ttgtgagcca cctaaggtcc cgatcctaag    120
agcattcgac gtctttcatg tttcaatctc acataaaagt cgtccaatgc tcttaagatc    180
ctggccacat cgtcgcaact tcaaatcaat taaatcaaaa aatcaagagt aagtgatatt    240
gggcactcca gttttaaaat tgaacgtgtg gagcggtaag taaatctttt tcaaagaaag    300
gtttcgatta agcgaagttt tacctaccag ctgcacaatt ataattttaa attcaacatg    360
ctcagtaaag ttgcgagtga aaattaaaat attatggagc ggttgcaatt agttctacgg    420
cacaaaagga ctcttatgat ttttccggtc attttgtccg tttctgccag agagttcgtt    480
gtggcattag cagcaccacg agtcaagaaa ttatgttaag tgatccccaa attcatcggg    540
ccattcgcta ttctttaaga agcctggcaa ttagttgttt cctataattg ccaggcttct    600
aaagaaataa cgcatgttta aagtccacaa ctcatcaagg aaaatgaaag tcaaagttgg    660
cagcttactt aaacttaatc acagccttta atgttcagca ggcctttaga aacctataag    720
ttaatatacc atatctataa gtttctgaag gcctgctgag tacctaaagt gcctaacatc    780
attatttaat tttttttttt ttggcacacg aataaccatg ccgtttttaa cccatatggc    840
ctcactaaag atagttatta ttgaaaaact actaactatc tttagtacgg ccatattggt    900
tgcacggcca attccaacga tttgtcattt gtggcacgca tttgtgtcac ctcagtgcga    960
aaattgaaaa ttgtacaaac aggtgagggt acagtgctta ttataaattg tgagagtttc    1020
aaact                                                                1025
<210>46
<211>1021
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>synthetic construct
<400>46
attagtcgac tggcctggat ctaattgcca attccaagcc aaatatgatc caagccagtc    60
tactaatccc gaaacgacga ccagctaatt gtgagccacc taaggtcccg atcctaagag    120
cattcgacgt ctttcatgtt tcaatctcac ataaaagtcg tccaatgctc ttaagatcct    180
ggccacatcg tcgcaacttc aaatcaatta aatcaaaaaa tcaagagtaa gtgatattgg    240
gcactccagt tttaaaattg aacgtgtgga gcggtaagta aatctttttc aaagaaaggt    300
ttcgattaag cgaagtttta cctaccagct gcacaattat aattttaaat tcaacatgct    360
cagtaaagtt gcgagtgaaa attaaaatat tatggagcgg ttgcaattag ttctacggca    420
caaaaggact cttatgattt ttccggtcat tttgtccgtt tctgccagag agttcgttgt    480
ggcattagca gcaccacgag tcaagaaatt atgttaagtg atccccaaat tcatcgggcc    540
attcgctatt ctttaagaag cctggcaatt agttgtttcc tataattcca ggcttctaaa    600
gaaataacgc atgtttaaag tccacaactc atcaaggaaa atgaaagtca aagttggcag    660
cttacttaaa cttaatcaca gcctttaatg ttcagcaggc ctttagaaac ctataagtta    720
atataccata tctataagtt tctgaaggcc tgctgagtac ctaaagtgcc taacatcatt    780
atttaatttt tttttttttt ggcacacgaa taaccatgcc gtttttaacc catatggcct    840
cactaaagat agttattatt gaaaaactac taactatctt tagtacgacc atattggttg    900
cacggccaat tccaacgatt tgtcatttgt ggcacgcatt tgtgtcacct cagtgcgaaa    960
attgaaaatt gtacaaaaag gtgagggtac agtgctatat tatagtttga aactctcaaa    1020
t                                                                    1021
<210>47
<211>23
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>47
uaauacuguc agguaaagau guc                                            23
<210>48
<211>25
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>48
ugaaagacau ggguaguaug agacg                                          25
<210>49
<211>24
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>49
uaagugaauu cuuugccaca gucu                                           24
<210>50
<211>22
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>50
aacccguaga uccgaacuag uc                                             22
<210>51
<211>23
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>51
aacccguaga uccgaacuag ucu                                            23
<210>52
<211>22
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>52
aacccguaga uccgaacuug ug                                             22
<210>53
<211>21
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>53
gucagccgau ccuaaggcac  c                                             21
<210>54
<211>22
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>54
uggugcgugg acuaguggug ag                                             22
<210>55
<211>25
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>55
ugaaagacau ggguaguaug agacg                                          25
<210>56
<211>23
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>56
caccuauacu ccaccgucau ugg                                            23
<210>57
<211>90
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>57
ucuuggaguc ggguuguuug ggaucgcagc ccaaaucagg ugguaaacuu ugaauguggg    60
ucagccgauc cuaaggcacc ggcuaacgcc                                     90
<210>58
<211>75
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>58
acaggcggcu uuugcccgug gcugcgugcu guucuuucgg ggauggugcg uggacuagug    60
gugagagcug cuugu                                                     75
<210>59
<211>75
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>59
acaggcggcu uuugcccgug gcugugugcu guucuuucgg ggauggugcg uggacuagug    60
gugagagcug cuugu                                                     75
<210>60
<211>75
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>60
acaggcggcu uuugcccgug gcugcgugcu guucuuucgg ggauggugcg uggacuagug    60
gugagagcuc ccucc                                                     75
<210>61
<211>75
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>61
acagacggcu uuugcccgug gcugcgugcu guucuuucgg ggauggugcg uggacuagug    60
gugagagcug cuugu                                                     75
<210>62
<211>75
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>62
acaggcggcu uuugcccgug gcugcuugcu guuccuucgg ggauggugcg uggacuagug    60
gugagagcug cuugu                                                     75
<210>63
<211>75
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>63
acaggcggcu uuucuccgug gcugcuugcu guuccuucgg ggauggugcg uggacuagug    60
gugagagcug cuugu                                                     75
<210>64
<211>75
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>64
acaggcggcu uuugcccgug gcugcuugcu guuccuucgg ggauggugcg uggacuagug    60
gugagagcug cucaa                                                     75
<210>65
<211>92
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>65
gaccagaugc ugaaagacau ggguaguaug agacguucgu guguguaaau gccaaaaguc    60
gugucaucua cucuguuuuu cggcauuugc cu                                  92
<210>66
<211>98
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>66
ucaacgcaac caccacgacc cuccuacacg ucauggccag acuacgcgac aagcacgugu    60
acaagccaau gacgguggag uauagguggc ccgcucca                            98
<210>67
<211>98
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>67
ucaacgcaac cacuacgacc cuccuacacg ucauggccag acuacgcgac aagcacgugu    60
acaagccaau gacgguggag uauagguggc ccgcucca                            98
<210>68
<211>97
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>68
caacgcaacc accacgaccc uccuacacgu cauggccaga cuacgcgaca agcacgugua    60
caagccaaug acgguggagu auagguggcc cgcucca                             97
<210>69
<211>98
<212>RNA
<213>大豆异皮线虫
<400>69
uggagcgggc caccuauacu ccaccgucau uggcuuguac acgugcuugu cgcguagucu    60
ggccaugacg uguaugaggg ucgugguggu ugcguuga                            98
<210>70
<211>24
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>70
tggaagacta gtgattttgt tgtt                                           24
<210>71
<211>23
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>71
tctttggtta tctagctgta tga                                            23
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>72
tcagtctttt tctctctcct a                                              21
<210>73
<211>21
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>73
ggcaagatgt cggcatagct g                                              21
<210>74
<211>22
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>74
tgaaagacat gggtagtgag at                                             22
<210>75
<211>22
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>75
aattgcactt gtcccggcct gc                                             22
<210>76
<211>22
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>76
tcaggtacct gaagtagcgc gc                                             22
<210>77
<211>22
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>77
tgactagatc cacactcatt aa                                             22
<210>78
<211>22
<212>DNA
<213>西方玉米根虫
<400>78
attgtacttc atcaggtgct ct                                             22
<210>79
<211>108
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>79
gtcctcctgg gagtgcattc cgtatggaag actagtgatt ttgttgtttg gtctttggta    60
ataacaataa atcccttgtc ttcttacggc gtgcatttgt gctcttca                 108
<210>80
<211>98
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>80
tatacagggt gctatgttgt ctttggttat ctagctgtat gagtgataaa taacgtcata    60
aagctagctt accgaagtta atattagcgt ctgcccag                            98
<210>81
<211>83
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>81
ctgcaaccta tgtgggagcg agacggggac tcactgtgct tattaaatag tcagtctttt    60
tctctctcct atacaaattg cgg                                            83
<210>82
<211>112
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>82
cgctgactgt tccattgaac aactgactag atgcagcata gcgctcttca aaatcgcttt    60
tcaacgtcag ctatgccgac atcttgccaa tttaccaacg gagttgatat ac            112
<210>83
<211>114
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>83
cacagaggtt gtctgctctg aacgatgaaa gacatgggta gtgagacgtc ggagcctcgt    60
cgtatcacta ttctgttttt cgccgtcggg atcgtgacct ggaagctgta aact          114
<210>84
<211>115
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>84
gccgaatata aatatgaatt tcccgtagga cgggaaggtg tcaacgtttt gcatttcgaa    60
taaacattgc acttgtcccg gcctatgggc ggtttgtaat aaacaactaa aatct         115
<210>85
<211>118
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>85
ttcccccgac tgtaaagtct cctaccttgc gcgctaatca gtgaccgggg ctggtttttt    60
atatacagtc aggtacctga agtagcgcgc gtggtggcag acatatatct ccatcttc      118
<210>86
<211>120
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>86
agctggaatt ggaattcata ctactgtttt tagtgggtgg gggtccagtg tttcacattg    60
attttcttag tatttgtgac tagatccaca ctcattaata acggtagttc aatcatcaag    120
<210>87
<211>93
<212>DNA
<213>黑腹果蝇
<400>87
aactgtctcc catgtctatt gtacttcatc aggtgctctg gtgtgtctcg taacccggca    60
catgttgaag tacactcaat atgaggcgat ttg                                 93
<210>88
<211>951
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>88
gtcctcctgg gagtgcattc cgtatggaag actagtgatt ttgttgtttg gtctttggta    60
ataacaataa atcccttgtc ttcttacggc gtgcatttgt gctcttcata tacagggtgc    120
tatgttgtct ttggttatct agctgtatga gtgataaata acgtcataaa gctagcttac    180
cgaagttaat attagcgtct gcccagctgc aacctatgtg ggagcgagac ggggactcac    240
tgtgcttatt aaatagtcag tctttttctc tctcctatac aaattgcggc gctgactgtt    300
ccattgaaca actgactaga tgcagcatag cgctcttcaa aatcgctttt caacgtcagc    360
tatgccgaca tcttgccaat ttaccaacgg agttgatata ccacagaggt tgtctgctct    420
gaacgatgaa agacatgggt agtgagacgt cggagcctcg tcgtatcact attctgtttt    480
tcgccgtcgg gatcgtgacc tggaagctgt aaactgccga atataaatat gaatttcccg    540
taggacggga aggtgtcaac gttttgcatt tcgaataaac attgcacttg tcccggccta    600
tgggcggttt gtaataaaca actaaaatct ttcccccgac tgtaaagtct cctaccttgc    660
gcgctaatca gtgaccgggg ctggtttttt atatacagtc aggtacctga agtagcgcgc    720
gtggtggcag acatatatct ccatcttcag ctggaattgg aattcatact actgttttta    780
gtgggtgggg gtccagtgtt tcacattgat tttcttagta tttgtgacta gatccacact    840
cattaataac ggtagttcaa tcatcaagaa ctgtctccca tgtctattgt acttcatcag    900
gtgctctggt gtgtctcgta acccggcaca tgttgaagta cactcaatat g             951
<210>89
<211>21
<212>DNA
<213>大豆异皮线虫
<400>89
tcttgagact gtcctgtatt a                                              21
<210>90
<211>515
<212>DNA
<213>大豆异皮线虫
<400>90
ccaccccgtg agattcacct caactcgcca ttcaacatcc ggaccatcta caacttccgc    60
ctgatcaaca cgggctcaaa gcgcattggg ttcgccttca agacgacgaa gccgaagcgc    120
atcttcctga acccgccgtg cggcaccgtg ggcgtcggcg acaccgtgaa cgtgatcatc    180
accgtggcac ccttcgaccc gaacaacgag gacatcaaga acgatcgcgt gatcgtggaa    240
tggtgcaacg cgcccggccc gtctgacgcc gtgttcaact tggactggtt caccgaaaat    300
gcggttcgaa atgtgcgcct caacgtcgtc tacaacttgt agcggatgca atatgatgat    360
ctgtatcgat ccatttcatg aaatgtattt caatgatcac tgttatcttg agactgtcct    420
gtattatgtg ttccgttttt tcatcatcat gaaatgtatt tcaatgatca cggaacgata    480
aatcggcgct agtgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                               515
<210>91
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>91
uaauacagga cagucucaag a                                              21
<210>92
<211>90
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>92
ucuuggaguc ucugugggau uguccgucua ccaaaucagg ugguaaacuu ugaauguggu    60
aauacaggac agucucaaga ggcuaacgcc                                     90
<210>93
<211>22
<212>DNA
<213>大豆异皮线虫
<400>93
tggtgcgtgg actagtggtg ag                                             22
<210>94
<211>1807
<212>DNA
<213>大豆异皮线虫
<400>94
gcacgaggtc tatttgtttt ttattcaatt tcgacctgaa tgtcagctgc ggtttcttct  60
tcgcgtccga tggaagattg gaaatctgag ttagctatgc cagacaagga ccttcgatac  120
aaaacatctg atgtgactgc gactaagggc gttgaatttg aggaatttgg gctcactcgc  180
gaccttctta aaggcatttt tgagaagggt tgggagcatc caagtccggt tcaggaagcg  240
tcgattggaa ttgcacttac aggccaagac attctcgctc gcgccaaaaa tggaactggc  300
aaaactggcg catattgcat tccctgcatt gagaaaattg acccatcaaa agaatacatc  360
caagcaatga taatcgttcc aactcgggag cttgccttac aaacatctca gatttgcgta  420
gaactcagca aacacttgaa gattaagatt atggtgacga ctggcggaac agatcttcgt  480
gacgatattt tgcgtctcaa tggtattgta catcttgttg tggcaactcc tggccgaatt  540
ttggatctta tggagaaggg agttgcgaat gttgcgtatt gcaagacgat cgttctcgat  600
gaagcggaca aactcctttc ccaggacttc caaggtgtgc ttgaccgtct tgttcagttt  660
ctacccaaag accgtcaaat tatgctgtac tccgcaacat ttccgcgcac tgtcgcgact  720
tttatggaaa agcacatgag caagccgtat gaaatcaatc tgatggagga actgacgctg  780
cttggcatta cacagtttta tgcttatgtc caagaaaaac agaaagtgca ctgtctgaac  840
acgcttttcc gcaagctcca aataaaccaa tccatcatct tttgtaattc gacacaacgg  900
gtggagttac ttgccaagaa aatcacagaa ttgggctact cctgttacta cattcattcc  960
aaaatggctc aacaccacag gaacagagtg ttccatgaat ttcgtcaggg tcattgtagg  1020
aacttggtct gttccgatct gcttactcgt ggtattgaca tccaagccgt caacgtggtc  1080
attaactttg acttcccgcg caattccgag acatatttgc acagaattgg acgttctggc  1140
cgttttggcc ccttggtatt gctatcaatc tgatcacctt tgaagaccgt tacaacctgc  1200
gacgcatcga aaaggagctc aagacacaca ttgacccaat tccaaaggaa gtcgatccga  1260
aactctatgt tgctgaattt caaatggatc acaccaaatt cgactgtggg aatgtcgtcg  1320
atggtgcggt gctgaacaac ggagtcgacc aacaacagca gcctcgggct tcgtcgtagt  1380
tgcggtggga gcacggagcg aaaactccca cagaatttat cagctcgtcc atccacagta  1440
aattgaccct aataaaaatg ctgcgctgct ctccgatctc tcatttgttg ttaattttcg  1500
gattttgtta tttaaattct ctcatccgca cacgtccgtc acaccattca aatttatcgt  1560
ccattcattg tgcgaatttg gtatttctct gcgaacacat tgtgtggatt tctatctttg  1620
tgacctttta ataaatgtga gagggttttg tctttgttcg ttctcatcat tcacctcttt  1680
ctctccctca cctaaccaat aatcctccaa tttactgctt gtctattaac tttgttacgg  1740
gtaaattcca actatgcctc aaaaaaaaaa aaacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  1800
aaaaaaa                                                            1807
<210>95
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>95
uaaaagguca caaagauaga aa                                           22
<210>96
<211>85
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>96
acaggcggcu uuuuuacguu uuggccuuuu guucuuucgg ggauaaaagg ucacaaagau    60
agaaaagcug cuuguagcug cuugu                                          85

Claims (20)

1.一种非天然植物，具有对从所述植物摄取RNA的无脊椎动物害虫的抗性，其中
所述非天然植物包含其基因组中具有重组DNA构建体的转基因植物细胞，该重组DNA构建体在所述转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体；且
所述重组miRNA前体包含RNA的单链，该RNA的单链折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构并包含至少一个加工成成熟miRNA的茎环；且
所述成熟miRNA抑制所述无脊椎动物害虫的或与所述无脊椎动物害虫相关的共生体的至少一个目标基因的表达，从而赋予所述非天然植物对所述无脊椎动物害虫的抗性。
2.根据权利要求1的非天然植物，其中所述至少一个加工成成熟miRNA的茎环包含茎区域和环区域，其中
所述茎区域包含第一片段和第二片段，
所述第一片段包含用于使编码所述目标基因的信使RNA静默的至少19个连续核苷酸，
所述第二片段包含至少19个连续核苷酸，
所述环区域位于所述第一和第二片段之间，且
所述第一和第二片段杂交以形成部分双链RNA，
其中所述第一片段的至少一个核苷酸是未配对的。
3.根据权利要求3的非天然植物，其中所述使信使RNA静默的至少19个连续核苷酸与所述信使RNA中的一个等长度片段具有至少70％的互补性。
4.根据权利要求3的非天然植物，其中所述环区域包括所述无脊椎动物miRNA前体的原始环序列。
5.根据权利要求1的非天然植物，其中所述RNA的单链包含加工成成熟miRNA的单个茎环。
6.根据权利要求1的非天然植物，其中所述RNA的单链包含加工成成熟miRNA的多个茎环。
7.根据权利要求1的非天然植物，其中所述无脊椎动物害虫是选自昆虫、蛛形纲动物、线虫类、软体动物和环节动物的至少一种。
8.根据权利要求1的非天然植物，其中所述至少一个目标基因是(a)单目标基因或(b)多个目标基因。
9.根据权利要求1的非天然植物，其中所述至少一个目标基因是从所述无脊椎动物miRNA前体天然表达的无脊椎动物miRNA的内源靶标。
10.根据权利要求1的非天然植物，其中所述至少一个目标基因不是从所述无脊椎动物miRNA前体天然表达的无脊椎动物miRNA的内源靶标。
11.根据权利要求1的非天然植物，其中所述至少一个目标基因是与所述无脊椎动物害虫相关的共生体的目标基因。
12.根据权利要求1的非天然植物，其中
(a)所述非天然植物是玉米且所述无脊椎动物害虫是叶甲虫类；
(b)所述非天然植物是大豆且所述无脊椎动物害虫是大豆异皮线虫；
(c)所述非天然植物是葡萄且所述无脊椎动物害虫是葡萄根瘤蚜或玻璃翅神射手(琉璃叶蝉)；或
(d)所述非天然植物是苹果且所述无脊椎动物害虫是苹果绵蚜。
13.根据权利要求1的非天然植物，其中所述重组DNA构建体进一步包含一个或多个选自以下的元件：
(a)在植物细胞中发挥功能的启动子；
(b)转基因转录单元；
(c)基因抑制元件；和
(d)转录调节/转录物稳定元件。
14.根据权利要求1的非天然植物，其中所述非天然植物是转基因植物。
15.根据权利要求1的非天然植物，其中所述非天然植物进一步包含非转基因组织。
16.根据权利要求15的非天然植物，其中所述植物包含非转基因接穗和含有所述转基因植物细胞的砧木。
17.基因组中具有重组DNA构建体的非天然转基因植物细胞，该重组DNA构建体在所述非天然转基因植物细胞中转录成重组miRNA前体，其中所述重组miRNA前体包含RNA的单链，该RNA的单链折叠成无脊椎动物miRNA前体的二级结构并包含至少一个加工成成熟miRNA的茎环；且其中所述成熟miRNA抑制无脊椎动物的或与所述无脊椎动物相关的共生体的至少一个目标基因的表达。
18.从权利要求17的非天然转基因植物细胞生长的非天然转基因植物。
19.由权利要求18的非天然转基因植物产生的非天然转基因种子。
20.抑制植物无脊椎动物害虫的至少一个目标基因的方法，包括提供包含权利要求17的非天然转基因植物细胞的植物，其中
所述无脊椎动物是所述的无脊椎动物害虫，
所述重组DNA构建体在所述非天然转基因植物细胞中转录成所述重组miRNA前体，和
当所述无脊椎动物害虫摄取所述重组miRNA前体时，所述至少一个目标基因被抑制。
CN200880010470A 2007-02-20 2008-02-19 无脊椎动物微rna Pending CN101646769A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89070507P 2007-02-20 2007-02-20
US60/890,705 2007-02-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101646769A true CN101646769A (zh) 2010-02-10

Family

ID=39707792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200880010470A Pending CN101646769A (zh) 2007-02-20 2008-02-19 无脊椎动物微rna

Country Status (6)

Country Link
US (3) US8410334B2 (zh)
EP (1) EP2115141A4 (zh)
CN (1) CN101646769A (zh)
AR (1) AR065400A1 (zh)
AU (1) AU2008218813B2 (zh)
WO (1) WO2008103643A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088021A (zh) * 2011-10-31 2013-05-08 中国科学院动物研究所 miR-45调控线虫寿命的应用和方法
CN103937887A (zh) * 2014-04-02 2014-07-23 西北农林科技大学 一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法
CN107119052A (zh) * 2017-04-25 2017-09-01 中国农业科学院植物保护研究所 人工设计合成的miRNA分子及其对蚜虫的控害作用
CN107164372A (zh) * 2017-04-25 2017-09-15 中国农业科学院植物保护研究所 人工设计合成的对蚜虫具有控害作用的miRNA分子
CN113564174A (zh) * 2021-07-16 2021-10-29 山西大学 苹果黄蚜Cat-B基因及其核酸干扰剂制备方法与应用
CN113881679A (zh) * 2021-11-03 2022-01-04 河南农业大学 一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101646769A (zh) * 2007-02-20 2010-02-10 孟山都技术公司 无脊椎动物微rna
IT1393648B1 (it) * 2008-07-17 2012-05-08 Arterra Bioscience S R L Metodo per l'ottenimento di piante transgeniche resistenti all'attacco di fitopatogeni basato sull'interferenza dell'rna (rnai)
EP2403527A4 (en) 2009-03-06 2012-11-14 Sinai School Medicine LIVELY WEAKED INFLUENZA VIRUS VACCINES WITH MICRORNA REACTION ELEMENTS
BR112012033544A2 (pt) * 2010-06-30 2015-09-08 Basf Plant Science Co Gmbh molécula de ácido nucleíco isolada, constructo, vetor, planta, célula vegetal ou semente de planta, métodos, uso e processo
US9222100B2 (en) 2010-08-24 2015-12-29 Monsanto Technology Llc Methods and DNA constructs for autoregulating transgene silencing
AU2011319989B2 (en) * 2010-10-29 2014-09-18 Syngenta Participations Ag Overexpression of plant miRNAs for parasite control
EP2510781A1 (en) * 2011-04-15 2012-10-17 Institut National De La Recherche Agronomique Novel methods of modifying plant phenotype
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
US20170327834A1 (en) * 2014-12-15 2017-11-16 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
CA3051585A1 (en) 2017-01-28 2018-08-02 Inari Agriculture, Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
US11603536B2 (en) 2017-09-29 2023-03-14 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient maize genome editing
US11802288B1 (en) 2018-01-29 2023-10-31 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient soybean genome editing
US11220694B1 (en) 2018-01-29 2022-01-11 Inari Agriculture, Inc. Rice cells and rice plants
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
CA3091625A1 (en) * 2018-02-22 2019-08-29 Dow Agrosciences Llc Short/small hairpin rna molecules
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
WO2022204460A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
US20240181079A1 (en) 2021-03-26 2024-06-06 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Production of circular polyribonucleotides in a eukaryotic system
EP4314289A1 (en) 2021-03-26 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Production of circular polyribonucleotides in a prokaryotic system
KR20240110818A (ko) 2021-11-01 2024-07-16 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 유기체를 변형하기 위한 폴리뉴클레오티드
MX2024009021A (es) 2022-01-20 2024-08-06 Flagship Pioneering Innovations Vii Llc Polinucleotidos para modificar organismos.
CN114921477B (zh) * 2022-06-14 2023-05-16 西南大学 褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA

Family Cites Families (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
ATE206462T1 (de) 1989-02-24 2001-10-15 Monsanto Technology Llc Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
JP3209744B2 (ja) 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
DE69232132T3 (de) 1991-05-15 2008-08-14 Monsanto Technology Llc. Verfahren zur schöpfung einer transformierten reispflanze
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
US5763245A (en) 1991-09-23 1998-06-09 Monsanto Company Method of controlling insects
EP1983056A1 (en) 1992-07-07 2008-10-22 Japan Tobacco Inc. Method for transforming monocotyledons
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US5631152A (en) 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
GB9505907D0 (en) * 1995-03-23 1995-05-10 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
JP4020429B2 (ja) 1995-06-07 2007-12-12 インヴィトロジェン コーポレーション 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング
ATE298368T1 (de) 1995-12-27 2005-07-15 Japan Tobacco Inc Kälteindusierbare promotorsequenzen
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
CA2234119C (en) 1996-09-03 2010-01-05 Plant Genetic Systems, N.V. Improved barstar gene
US6140078A (en) 1996-09-05 2000-10-31 Unilever Patent Holdings Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
JP2001508661A (ja) 1997-01-20 2001-07-03 プラント ジエネテイツク システムズ エヌ．ブイ 病原体誘導植物プロモーター
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
NZ504214A (en) 1997-10-24 2003-06-30 Invitrogen Corp Recombination cloning using nucleic acids having recombination sites
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6426448B1 (en) 1998-05-11 2002-07-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Gene combinations that alter the quality and functionality of soybean oil
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
GB9827152D0 (en) * 1998-07-03 1999-02-03 Devgen Nv Characterisation of gene function using double stranded rna inhibition
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
US6717034B2 (en) 2001-03-30 2004-04-06 Mendel Biotechnology, Inc. Method for modifying plant biomass
WO2000042207A2 (en) 1999-01-14 2000-07-20 Monsanto Technology Llc Soybean transformation method
US6733965B2 (en) 1999-01-15 2004-05-11 International Paper Company Microsatellite DNA markers and uses thereof
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6207879B1 (en) 1999-05-14 2001-03-27 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
WO2001037654A2 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Dna Plant Technology Corporation METHOD OF EXPRESSING dsRNA IN PLANTS TO INHIBIT INSECT PESTS
NZ530816A (en) 1999-12-10 2005-10-28 Invitrogen Corp Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
AU2771901A (en) 2000-01-07 2001-07-24 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules and other molecules associated with soybean cyst nematoderesistance
US20020133852A1 (en) 2000-01-07 2002-09-19 Hauge Brian M. Soybean SSRs and methods of genotyping
CZ308053B6 (cs) * 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
MXPA03006986A (es) 2001-02-06 2004-07-08 Dow Agrosciences Llc Plantas de maiz con alto contenido de aceite y metodos para obtener las mismas.
ES2609014T3 (es) * 2001-07-12 2017-04-18 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN de interferencia pequeños que median el silenciamiento génico
US7001739B2 (en) 2001-08-24 2006-02-21 The Texas A&M University System Isolation of proteins involved in posttranscriptional gene silencing and methods of use
WO2003029459A2 (en) * 2001-09-28 2003-04-10 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Micro-rna molecules
US7166771B2 (en) 2002-06-21 2007-01-23 Monsanto Technology Llc Coordinated decrease and increase of gene expression of more than one gene using transgenic constructs
US20040053876A1 (en) * 2002-03-26 2004-03-18 The Regents Of The University Of Michigan siRNAs and uses therof
CA2524569C (en) * 2002-05-03 2013-10-22 Duke University A method of regulating gene expression
BR0312580A (pt) 2002-07-10 2006-10-10 Univ Kansas State composições e métodos para controlar nematódeos parasitas
CA2492917C (en) * 2002-07-19 2011-10-18 University Of South Carolina Compositions and methods for the modulation of gene expression in plants
US20040115642A1 (en) 2002-12-12 2004-06-17 Changlin Fu Single-step methods for gene cloning
US20040123347A1 (en) 2002-12-20 2004-06-24 Hinchey Brendan S. Water-deficit-inducible plant promoters
US7682829B2 (en) 2003-05-30 2010-03-23 Monsanto Technology Llc Methods for corn transformation
US20050144669A1 (en) * 2003-07-01 2005-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research MicroRNAs in plants
EP1644502A4 (en) 2003-07-14 2006-08-30 Monsanto Technology Llc MATERIALS AND METHOD FOR MODULATING CYCLINE-DEPENDENT KINASE-INHIBITOR-LIKE POLYPEPTIDES IN MAIZE
US20060272049A1 (en) * 2003-11-17 2006-11-30 Waterhouse Peter M Insect resistance using inhibition of gene expression
AR048685A1 (es) * 2004-04-09 2006-05-17 Monsanto Technology Llc Metodos para el control de infestaciones de insectos en plantas.
AU2005243410B2 (en) * 2004-05-14 2010-04-22 Rosetta Genomics Ltd. Micronas and uses thereof
AU2005295948A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-27 The Rockefeller University MicroRNAs
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
US8314290B2 (en) 2004-12-21 2012-11-20 Monsanto Technology Llc Temporal regulation of gene expression by MicroRNAs
US8404927B2 (en) 2004-12-21 2013-03-26 Monsanto Technology Llc Double-stranded RNA stabilized in planta
EP2765189A1 (en) * 2004-12-21 2014-08-13 Monsanto Technology LLC Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP1838144B1 (en) * 2005-01-07 2016-08-31 Oregon State University Method to trigger rna interference
US8088976B2 (en) * 2005-02-24 2012-01-03 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of plant pest infestation and compositions thereof
WO2007035650A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 Monsanto Technology Llc Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof
CN101195821A (zh) * 2006-12-04 2008-06-11 中国科学院上海生命科学研究院 利用RNAi技术改良植物抗虫性的方法
CN101646769A (zh) * 2007-02-20 2010-02-10 孟山都技术公司 无脊椎动物微rna
US20100180352A1 (en) * 2007-06-15 2010-07-15 Basf Plant Science Gmbh Compositions and Methods of Using RNA Interference for Control of Nematodes

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088021A (zh) * 2011-10-31 2013-05-08 中国科学院动物研究所 miR-45调控线虫寿命的应用和方法
CN103088021B (zh) * 2011-10-31 2015-08-05 中国科学院动物研究所 miR-45调控线虫寿命的应用和方法
CN103937887A (zh) * 2014-04-02 2014-07-23 西北农林科技大学 一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法
CN103937887B (zh) * 2014-04-02 2015-12-09 西北农林科技大学 一种用于葡萄根瘤蚜抗性的快速鉴定方法
CN107119052A (zh) * 2017-04-25 2017-09-01 中国农业科学院植物保护研究所 人工设计合成的miRNA分子及其对蚜虫的控害作用
CN107164372A (zh) * 2017-04-25 2017-09-15 中国农业科学院植物保护研究所 人工设计合成的对蚜虫具有控害作用的miRNA分子
CN107119052B (zh) * 2017-04-25 2019-08-20 中国农业科学院植物保护研究所 人工设计合成的miRNA分子及其对蚜虫的控害作用
CN107164372B (zh) * 2017-04-25 2020-02-14 中国农业科学院植物保护研究所 含miRNA分子的试剂盒在制备控害蚜虫产品中的应用
CN113564174A (zh) * 2021-07-16 2021-10-29 山西大学 苹果黄蚜Cat-B基因及其核酸干扰剂制备方法与应用
CN113881679A (zh) * 2021-11-03 2022-01-04 河南农业大学 一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物
CN113881679B (zh) * 2021-11-03 2023-07-18 河南农业大学 一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的miR-71-5模拟物

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008103643A1 (en) 2008-08-28
US20170067076A1 (en) 2017-03-09
EP2115141A1 (en) 2009-11-11
AU2008218813B2 (en) 2014-04-17
AR065400A1 (es) 2009-06-03
AU2008218813A1 (en) 2008-08-28
US20080201801A1 (en) 2008-08-21
US9528121B2 (en) 2016-12-27
US8410334B2 (en) 2013-04-02
US10570414B2 (en) 2020-02-25
US20130165498A1 (en) 2013-06-27
EP2115141A4 (en) 2010-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101646769A (zh) 无脊椎动物微rna
US11008580B2 (en) Regulation of gene expression by temporal or leaf specific promoters
EP2559767B1 (en) Plant microRNAs and methods of use thereof
CN101600798A (zh) 相位型小rna
CN101466837A (zh) 生产杂种种子的方法
JP2024133533A (ja) 非標準塩基対を含むｒｎａ分子
JP2023164536A (ja) Ｒｎａ分子
US20170327834A1 (en) Pesticidal microrna carriers and use thereof
US9315819B2 (en) Temporal regulation of gene expression by microRNAs
WO2012112512A2 (en) Small interfering rnas with target-specific seed sequences
BR102015001527B1 (pt) Cassete de expressão do gene e métodos para a expressão de uma sequência de codificação em uma planta transgênica e para a fabricação de uma sequência de polinucleotídeo sintética
CN112204141A (zh) 短/小发夹rna分子
AU2014201710A1 (en) Invertebrate microRNAs
CN116802305A (zh) 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的抗性基因
US20140047582A1 (en) INTERFERING RNAs THAT PROMOTE ROOT GROWTH

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20100210