CN100439400C - 治疗性多肽,其同源物、其片段及其在调节血小板介导的聚集方面的应用 - Google Patents

治疗性多肽,其同源物、其片段及其在调节血小板介导的聚集方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗需要对血小板介导的聚集进行调节的疾病并克服现有技术问题的多肽、所述多肽的同源物和/或所述多肽的功能部分，该多肽包括针对vWF、vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWF A3结构域、gpIb和/或胶原蛋白的至少一个单结构域抗体。本发明另一方面是产生所述多肽的方法，用所述多肽包被用于医学程序(如PCTA，放置斯坦特印模)的装置的方法，筛选调节血小板介导的聚集的试剂的方法和试剂盒，以及诊断与血小板介导的聚集相关疾病的试剂盒。

Description

治疗性多肽，其同源物、其片段及其在调节血小板介导的聚集方面的应用
发明背景
血管受损时，内皮下结构裸露，其通过与冯德勒布兰德因子(vWF)相互作用介导血小板粘附。VWF在受损血管壁内的胶原蛋白与血小板受体糖蛋白Ib(gpIb)间形成桥，该相互作用在高切应力(shear)状态下尤其重要，导致形成止血栓，因而防止流血过多(Bennett S，Thromb Haemost(2001)Mar；85(3)：395-400)。正常止血过程中，这些过程导致受损血管壁的伤口愈合。而在病理情况下，过分的血小板功能可导致形成血栓。vWF亚基由几个同源结构域组成，每个具有不同功能。vWF通过其A3结构域与纤维状胶原蛋白纤维相互作用，通过其A1结构域与血小板受体gpIb作用。正常情况下，血小板和vWF不相互作用。然而，当vWF在高切应力速率下与胶原蛋白结合时，认为其经历构象改变，允许其与血小板受体gpIb结合。该可逆的粘附使血小板翻越受损区，然后通过血小板上的胶原蛋白受体(gpIa/IIa，gpVI，gpIV，p65，TIIICBP)形成稳定粘附，导致血小板活化。这导致gpIIb/IIIa受体活化，纤维蛋白原结合，最终产生血小板聚集。
已经从吸血生物体如水蛭中分离出血小板聚集抑制剂。源自药用医学属水蛭的乳清酸在WO 02/15919A2和Cruz CP等人文献中描述。乳清酸作为冯德勒布兰德因子依赖的血小板粘附抑制剂，减少大鼠颈动脉内膜切除模型中的血小板聚集和内膜增生。Journal of Vascular Surgery，2001，34：724-729和Smith TP等人文献，乳清酸，胶原蛋白-血小板相互作用抑制剂，在犬透析通路模型中减少静脉吻合内膜增生，Vasc Endovascular Surg，2003 Jul-Aug；37(4)：259-69。
基于抗体的治疗已得到发展，其中有些已用于当前治疗。
阿昔单抗(嵌合7E3Fab；ReoPro；US 6,071,514，EP 0 882 453)，抑制配体结合血小板gpIIb/IIIa受体的小鼠人嵌合抗体7E3的Fab片段，于1994年12月获准作为辅助治疗应用于人类，以防止经皮冠脉介入的局部缺血并发症。gpIIb/IIIa抑制剂的主要安全问题是流血风险，因为这些药物强烈的抗血小板效应可能不利于影响止血。
开发了抗vWF A1结构域(US 2002/0028204 A1；US 6,280,731和WO00/10601)和抗其活性构象(US 6,251,393)的鼠源单克隆抗体。体内效应见Kageyama S等人所述：“Effect of a humanized monoclonal antibody to冯维勒布兰德因子in a canine model of coronary arterial thrombosis”，Eur J Pharmacol.2002 May 17；443(1-3)：143-9，和“Anti-human vWF monoclonal antibody，AjvW-2 Fab，Inhibits repretitive coronary artery thrombosis without bleeding timeprolongation in dogs”，Thromb Res，2001 Mar 1；101(5)：395-404及“Anti-human冯维勒布兰德因子monoclonal antibody AJvW-2 prevents thrombus deposition andneointima formation after balloon injury in guinea pigs”，Arterioscler Thromb VascBiol，2000 Oct；20(10)：2303-8。AJvW-2抑制高切应力诱导的人血小板聚集，对低切应力诱导的血小板聚集没有作用。
抗人vWF A3结构域的鼠源抗体82D6A3在狒狒内的效应公开于WO02/051351及Dongmei Wu等人，“Inhibition of the von Willebrand(VWF)-collagen interaction by an antihuman VWF monoclonal antibody results inabolition ofin vivo arterial platelet thrombus formation in baboons”，Hemostasis.thrombosis and vascular biology，2002，99：3623-3628。
抗体6B4是抗纯化的人gpIb的单克隆抗体(MoAb)。MoAb 6B4能够抑制利托菌素和美洲矛头蝮毒蛋白诱导的依赖vWF的人血小板凝集。MoAb 6B4还能阻止切应力诱导的人血小板与胶原蛋白I的粘附。注射入狒狒体内时，完整IgG和其F(ab’)(2)片段几乎立即导致血小板减少，原因是二价F(ab’)(2)介导血小板交联，或Fc：Fc受体相互作用介导血小板聚集活化(WO 0110911；Cauwenberghs N.等人，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular biology，2000，20：1347，及见如Cadroy Y等人，Blood，1994，83：3218-3224，Becker BH等人，Blood，1989，74：690-694，Ravanat C.等人，Thromb.Haemost.1999，82：528a摘要)。在血栓产生前将Fab片段注射入狒狒体内，能够抑制血小板在胶原蛋白富集的牛心包上沉积。但当在允许血栓形成后注射Fab片段，看不到进一步的血栓抑制。所述Fab分子表达产量很低，产生方法耗费巨大人力。
发明目的
本发明目标是提供多肽、所述多肽同源物和/或所述多肽功能部分，该多肽包括针对vWF、vWF A1结构域、活化vWF的A1结构域、vWF A3结构域、gpIb和/或胶原蛋白的一个或多个单结构域抗体，用于治疗需要对血小板介导的聚集进行调节的疾病并克服现有技术问题。本发明另一目标是提供产生所述多肽的方法、用多肽包被用于医学程序(如PCTA，放置斯坦特印模)的的装置的方法、筛选调节血小板介导的聚集的试剂的方法和试剂盒，以及诊断与血小板介导的聚集相关的疾病的试剂盒。
发明概述
已经制备出特异性识别参与血小板聚集的第一步及随后步骤的靶分子的单结构域抗体。这使得抗血栓形成试剂更有效、更安全。
本发明一个实施方案是多肽构建体，包括：至少一种针对vWF、vWF A1结构域、活化的vWF A1结构域、vWF A3结构域、gpIb或胶原蛋白的任一种的单结构域抗体。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中针对活化vWF A1结构域的单结构域抗体特异性识别血栓形成部位活化的vWF构象，而不结合循环的非活化形式的vWF。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，还包括至少一种针对一种或多种血清蛋白的单结构域抗体。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中所述至少一种血清蛋白是任一血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、转铁蛋白(transferring)或纤维蛋白原或其片段。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中针对一种或多种血清蛋白的至少一种单结构域抗体对应SEQ ID NO：16到19和49到61任一个所示序列。
本发明另一实施方案是对应SEQ ID NO：13到15和42到45任一个所示序列的上述多肽构建体。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是人源化的序列。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体对应SEQ ID NO：38到41和42到45任一个所示序列。
本发明另一实施方案是对应SEQ ID NO：8到12、20到22、32到34和42到47任一个所示序列的上述多肽构建体。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是骆驼科VHH抗体。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体对应SEQ ID NO：1到7、23到31、35到37和62到65任一个所示序列。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中所述单结构域抗体是全长单结构域抗体的同源序列、功能部分或同源序列的功能部分。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，其中所述多肽构建体是所述多肽构建体同源序列、其功能部分或其功能部分的同源序列。
本发明另一实施方案是编码上述多肽构建体的核酸。
本发明另一实施方案是组合物，其包括上述多肽构建体和至少一种溶解血栓试剂，用于同时、分别或顺序向受试者给药。
本发明另一实施方案是组合物，其中所述溶解血栓试剂是葡萄球菌激酶、组织纤溶酶原激活物、链激酶、单链链激酶、尿激酶和酰基纤溶酶原链激酶复合物的任何一种。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，或上述核酸或上述组合物，用于治疗、预防和/或缓解与血小板介导的聚集或其功能失调相关的疾病。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体，或上述核酸或上述组合物的用途，用于制备治疗、预防和/或缓解与血小板介导聚集或其功能失调相关的疾病的药物。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或上述多肽构建体、核酸或组合物的用途，其中所述疾病是短暂脑局部缺血性发作、不稳定或稳定型心绞痛、心绞痛、脑梗塞、心肌梗塞、周围动脉闭塞性疾病、再狭窄、冠脉旁路移植，或冠状动脉瓣膜换置和冠脉介入如血管成形术、放置斯坦特印模、颈动脉内膜切除术或粥样斑切除术(atherectomy)的任何一种。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或上述多肽构建体、核酸或组合物的用途，其中所述疾病是非闭塞性血栓形成、闭塞性血栓形成、动脉血栓形成、急性冠脉闭塞、再狭窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狭窄、狭窄的动脉内血栓形成、血管成形术、粥样斑切除术或动脉斯坦特印模后的增生、血管系统的闭塞综合征或患病动脉的开放缺陷中的任何一种。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或上述多肽构建体、核酸或组合物的用途，其中所述疾病是高切应力环境中斑块或血栓形成。
本发明另一实施方案是上述多肽构建体、核酸或组合物，或上述多肽构建体的用途，其中所述多肽构建体是静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻内、阴道内、直肠内或吸入给药。
本发明另一实施方案是一种组合物，其包括上述多肽构建体或编码所述多肽构建体的核酸，或上述组合物和药用载体。
本发明另一实施方案是生产上述多肽的方法，包括：
(a)在允许所述多肽表达的条件下，培养包括能编码上述多肽的核酸的宿主细胞，和
(b)从培养物中回收所产生的多肽。
本发明另一实施方案是上述方法，其中所述宿主细胞为细菌或酵母。
本发明另一实施方案是处理侵入性医疗装置的方法，以防止在侵入部位周围形成血小板介导的积聚，包括用上述多肽构建体包被所述装置。
本发明另一实施方案是防止在侵入部位周围形成血小板介导的积聚的侵入性医疗装置，其中所述装置包被有上述多肽构建体。
本发明另一实施方案是鉴定调节血小板介导的聚集的试剂的方法，包括：
(a)在允许所述多肽间结合的条件下，在存在和不存在候选调节剂的条件下，使上述多肽构建体与对应其靶目标的多肽接触，和
(b)测量(a)步骤的多肽间的结合，相对于不存在所述候选调节剂，存在所述候选调节剂时结合的降低将所述候选调节剂鉴定为调节血小板介导的聚集的试剂。
本发明另一实施方案是试剂盒，其用于根据上述方法筛选调节血小板介导的聚集的试剂。
本发明另一实施方案是根据上述方法鉴定的未知试剂，其调节血小板介导的聚集。
本发明另一实施方案是诊断疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征在于血小板介导的聚集的机能障碍，所述方法包含步骤：
(a)使样品与上述多肽构建体接触，和
(b)检测所述多肽构建体与所述样品的结合，和
(c)将步骤(b)中检测的结合与标准进行比较，其中相对于所述样品而言结合的差异诊断为以血小板介导的聚集的机能障碍为特征的疾病或病症。
本发明另一实施方案是筛选试剂盒，其用于根据上述方法，对以血小板介导的聚集的机能障碍为特征的疾病或疾患进行诊断。
本发明另一实施方案是包括上述多肽构建体的上述试剂盒。
详述
本发明涉及包括一个或多个单结构域抗体的多肽构建体，每个单结构域抗体针对靶目标，涉及所述构建体对血小板介导的聚集具有调节作用的发现。
靶目标
根据本发明，靶目标是任一vWF、vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWF A3结构域、gpIb或胶原蛋白。所述靶目标是哺乳动物的，源自物种如兔、山羊、小鼠、大鼠、奶牛、小牛、骆驼、美洲驼、猴子、驴、豚鼠、猪、鸡、绵羊、狗、猫、马，和优选地人。人vWF序列见表30，SEQ IDNO：48。
靶目标也是能够引发免疫反应的vWF、vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWFA3结构域、gpIb或胶原蛋白的片段。靶目标也是能够与抗“亲本”全长靶目标的产生的单结构域抗体结合的vWF、vWF A1结构域、活化的vWF A1结构域、vWF A3结构域、gpIb或胶原蛋白的片段。
此处应用的片段指少于100％序列(如99％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％等)。但包括5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多氨基酸。片段应足够长。使得感兴趣的相互作用维持在亲和力1×10-6M或更高水平。
此处应用的片段还指任选插入、缺失和替换一个或多个氨基酸，其不实质上改变该靶目标与针对野生型靶目标产生的单结构域抗体的结合能力。插入、缺失和替换的氨基酸数目优选为高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。
针对靶目标的单结构域抗体是指与其靶目标结合的亲和力超过10-6M的单结构域抗体。
单结构域抗体
单结构域抗体是指其互补决定区为部分单结构域多肽的抗体。实施例包括但不限于，重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、源自常规四链抗体的单结构域抗体、工程抗体和不同于那些源自抗体的单结构域支架。单结构域抗体可以是现有技术的任何抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可以来自任何物种，包括但不限于，小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。根据本发明一个方面，此处所应用的单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，已知为无轻链的重链抗体。此类单结构域抗体公开于如WO 9404678。为清楚起见，源自天然无轻链的重链抗体的可变结构域在此称为VHH或nanobody，以便与四链免疫球蛋白的常规VH区别开。此类VHH分子可源自在骆驼科物种中产生的抗体，例如，在骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和驼马中。除骆驼科外其他物种可产生天然无轻链的重链抗体；此类VHHs也属于本发明范围。
VHHs，根据本发明，正如技术人员所知，是源自天然无轻链的免疫球蛋白的重链可变结构域，如WO 9404678所述的源自骆驼科的那些(下文称为VHH结构域或nanobody)。VHH分子比IgG分子约小10倍。其为单一多肽，非常稳定，耐受极端pH和温度条件。另外，它们抗蛋白酶的作用，常规抗体没有这个能力。此外，VHHs体外表达产生高产量、正确折叠的功能VHHs。另外，Camelids产生的抗体识别的表位与体外通过使用抗体文库或通过免疫非Camelids的哺乳动物产生的抗体所识别表位不同(WO 9749805)。同样，抗清蛋白VHHs可以更有效的方式与已知作为载体蛋白的血清清蛋白相互作用。作为载体蛋白，血清清蛋白的一些表位难以被结合的蛋白、多肽和小的化合物接近。由于已知VHHs结合“不寻常”或非常规表位如腔(WO 9749805)，此类VHHs与循环清蛋白的结合亲和力得以提高。
VHH的类别
本发明还涉及多肽构建体，其中单结构域抗体是针对此处所提靶目标的VHH，其中VHH属于具有类似人的序列的类别。按照Kabat编号，其类别特征在于VHHs在第45位携带的氨基酸选自由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺组成的组，例如L45群体。结合vWF的SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3所示VHH序列属于这种类似人的类别的VHH多肽。同样，属于此类的肽与人VH框架区氨基酸序列高度同源，所述肽可以向人类直接给药而不预期由此产生不需要的免疫反应，而且无需进一步人源化的负担。
因此，本发明一方面允许直接向所需受试者给予多肽构建体，所述多肽构建体包括一个或多个对应SEQ ID NO：1和3任一个所示序列的单结构域抗体。
SEQ ID NO：16和18所示另一类类似人的骆驼科单结构域抗体已描述于WO 03/035694，包含人源或其他物种来源的常规抗体中典型发现的疏水FR2残基，但通过在103位以一些残基如带电荷的精氨酸残基、丝氨酸或不带电残基如甘氨酸替换双链抗体VH上的保守色氨酸残基，弥补了其亲水性损失。同样，属于这两类的肽与人VH框架区氨基酸序列高度同源，将所述肽向人类直接给药无预期的不需要的免疫反应，并且无进一步人源化的负担。
本发明应用的任一VHHs可以是传统类别或类似人的骆驼科抗体类别。所述抗体可以针对整个靶目标或其片段。这些多肽包括全长骆驼科抗体，即Fc和VHH结构域，骆驼科抗体重链与人Fc结构域的嵌合形式。
针对靶目标的多肽构建体的一个或多个单结构域抗体可以是相同序列。备选地，它们不都具有相同序列。多肽构建体包括不都具有相同序列、但针对相同靶目标的抗靶目标单结构域抗体，或其片段、其一个或多个抗原，这也隶属本发明范围。
本发明另一方面是包括两个或多个单结构域抗体的多肽构建体，其中任何两个单结构域抗体针对不同靶目标，即针对vWF、vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域、vWF A3结构域、gpIb和胶原蛋白任何一种。
本发明另一方面是双特异性多肽构建体，包括抗vWF A1结构域、活化的vWF的A1结构域的单结构域抗体，及抗vWF A3结构域的另一单结构域抗体。该双特异性多肽构建体抑制vWF与胶原蛋白之间及vWF与血小板之间的相互作用。
依照本发明另一方面，可包括两个或多个已连接的单结构域抗体的多肽构建体。该单结构域抗体可以具有相同序列，针对相同靶目标或抗原。根据连接的VHHs数量，多价VHHs可以是二价(2VHHs)、三价(3VHHs)、四价(4VHHs)或具有更高效价的分子。
本发明也涉及一种发现，即此处公开的还包括一个或多个单结构域抗体，每个针对受试者的血清蛋白的多肽构建体，与非所述构建体部分的抗靶目标单结构域抗体的半衰期相比，在所述受试者循环中的半衰期令人惊讶地显著延长。此外，发现所述构建体显示相同的VHHs优良性质，如在小鼠内保持完整的高稳定性，耐受极端pH、高温稳定性和高的靶目标亲和力。
此类构建体的实例由SEQ ID NO.13到15所示，其包括抗vWF VHH和抗小鼠血清清蛋白VHH。
因此，本发明另一实施方案是对应SEQ ID NO.13到15任一个所示序列的多肽构建体。
此类构建体的其他实例由SEQ ID NO.42到45所示，其包括人源化抗vWF VHH和抗小鼠血清清蛋白VHH。
因此，本发明另一实施方案是对应SEQ ID NO.42到45任一个所示序列的多肽构建体。
血清蛋白可以是受试者血清内发现的任一合适蛋白，或其片段。在本发明一个方面，该血清清蛋白是血清清蛋白、血清免疫球蛋白、甲状腺素结合蛋白、转铁蛋白或纤维蛋白原。按照意向用途例如进行有效治疗所需的半衰期和/或靶抗原的区分，VHH配偶体可以针对上述血清蛋白中的一种。
针对血清清蛋白的单结构域抗体的实例是由对应于SEQ ID NOs：16到19和SEQ ID NOs：49到61任一个的序列所示的序列。
因此，本发明另一方面是还包括一个或多个抗血清单结构域抗体的多肽构建体，其中抗血清单结构域抗体的序列对应于SEQ ID NOs：16到19和49到61任一个所示序列。
此类构建体可以在受试者血清内循环数日，减少治疗频率和给受试者带来的不便，使得降低治疗成本。此外，本发明一个方面是，此处公开的多肽构建体的半衰期可以通过构建体中抗血清蛋白单结构域抗体的数目来控制。在几种情况下可控的半衰期是理想的，如采用定时给药治疗性多肽构建体的情况。
本发明另一实施方案是此处提及的多肽构建体，还包括溶解血栓试剂。
该溶解血栓试剂可以通过共价或非共价方式而非共价或共价结合到单结构域抗体上。此类共价方式见下述。非共价方式包括通过蛋白相互作用如生物素/链亲和素，或通过免疫缀合物。
备选地，溶解血栓试剂可以与本发明多肽构建体同时、分别或顺序给药。
本发明另一方面是组合物，其包括至少一种此处公开的多肽构建体和至少一种溶解血栓试剂，用于同时、分别或顺序向受试者给药。
本发明一个方面是治疗自身免疫疾病的方法，包括向个体同时、分别或顺序给予有效剂量的至少一种本发明多肽构建体和至少一种溶解血栓试剂。
本发明另一方面是试剂盒，其包含至少一种本发明的多肽构建体和至少一种溶解血栓试剂，用于同时、分别或顺序向受试者给药。本发明一个方面是该试剂盒可按照本发明来使用。本发明一个方面是该试剂盒可用于治疗此处所提及的疾病。
同时给药意味着将多肽和溶解血栓试剂在相同时间给予受试者。例如，作为混合物或包括该成分的组合物。实例包括，但不限于，静脉给药的溶液、片剂、液体、外用霜剂等，其中每一制剂包括目的组分。
分别给药意味着将多肽和溶解血栓试剂同时或实质上同时给药。组分在试剂盒中作为分开的、未混合的制剂存在。例如，多肽和溶解血栓试剂作为单独的片剂存在于试剂盒内。可通过同时吞咽片剂或一个片剂接着另一个片剂吞咽对受试者给药。
顺序给药意味着将多肽和溶解血栓试剂依次给予受试者。多肽和溶解血栓试剂在试剂盒中作为分开的、未混合的制剂存在。剂量之间有时间间隔。例如，一种组分可在另一组分给药后高达336、312、288、264、240、216、192、168、144、120、96、72、48、24、20、16、12、8、4、2、1或0.5小时给药。
顺序给药时，在给予另一组分之前和/或之后，可以一次或多次以不同剂量给药一种组分。顺序给药可以与同时或顺序给药联合应用。
下述多肽构建体的医学用途，也适用于包括此处公开的多肽构建体和至少一种多肽溶解血栓试剂的组合物，用于如上所述同时、分别或顺序向受试者给药。
根据本发明溶解血栓试剂可包括，例如葡萄球菌激酶、组织纤溶酶原激活物、链激酶、单链链激酶、尿激酶和酰基纤溶酶原链激酶复合物。
采用本领域已知方法或任何未来方法，可以将单结构域抗体连接起来形成此处公开的包括多于一个单结构域抗体的任一多肽构建体。例如，可以通过氨基酸残基与有机衍生剂反应通过化学交联使之融合，如Blatter等人，Biochemistry，24，1517-1524；EP294703所述。备选地，利用遗传方法在DNA水平使单结构域抗体发生融合，即形成多核苷酸构建体，其编码包括一个或多个抗靶目标单结构域抗体和一个或多个抗血清蛋白单结构域抗体的完整多肽构建体。产生二价或多价VHH多肽构建体的方法公开于PCT专利申请WO 96/34103。连接多个单结构域抗体的一个方法是通过遗传途径直接或利用肽连接物连接单结构域抗体编码序列。例如，第一单结构域抗体C末端可以连接至下一个单结构域抗体的N末端。如要连接额外的单结构域抗体来构建和生产三联、四联等功能性构建体，也可扩展该连接模式。
可按照本领域已知方法或任一未来方法，由技术人员制备此处公开的多肽构建体。例如，VHHs可利用本领域已知方法获得，比如通过免疫骆驼然后从其获得杂交瘤，或通过利用本领域已知的分子生物学技术克隆单结构域抗体文库然后利用噬菌体展示进行筛选。
本发明一个方面涉及一种发现，即表30中SEQ ID NOs：1到7所示源自骆驼科VHHs的多肽结合vWF并抑制其与胶原蛋白相互作用。
因此，本发明一个实施方案是多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体对应于SEQ ID NOs：1到7任一个所示序列。
本发明另一实施方案是对应于SEQ ID NOs：8到12任一个所示序列的多肽构建体。该序列对应于针对vWF的单特异性多肽构建体(如SEQ ID NO：8和11)或包括不同序列VHHs的异种特异性多肽构建体(如SEQ ID NO：9，10和12)。
本发明另一实施方案是包括针对vWF的一个或多个单结构域抗体的多肽构建体。
血小板聚集是非常复杂的现象，体内环境下，vWF和胶原蛋白的相互作用只在小动脉内高切应力状态下观察得到。为评估高切应力状态下血小板聚集情况，发明者进行了灌注试验。实施例16代表利用特异性vWF-A3结合物SEQ ID NO：1到12获得的切应力数据。该实验代表了小动脉内血管壁受损时(如血管成形术过程中)发生的相互作用。
令人惊讶的是，在高切应力下单价VHHs在血小板聚集实验中表现良好：在0.08至0.3μg/ml之间的浓度对血小板聚集的抑制率达50％。相比而言，抑制与胶原蛋白的相互作用的IgG vWF特异性抗体，82D6A3，对血小板聚集抑制50％则需要约20倍更高的浓度(Vanhoorelbeke K.等人，Journal of BiologicalChemistty，2003，278：37815-37821)。在ELISA中单价VHHs的IC50比82D6A3IgG的IC50差高达7倍的条件下，这些结果出人意料。
这清楚证明，该大分子量抗体不适合与启动聚集或在其过程中的大分子发生相互作用，比如那些参与血小板介导的聚集的大分子。vWF形成多达60个单体的多聚体(最终多聚体分子量高达两千万道尔顿)。事实上，已发现不是所有的A3结构域都易于接近82D6A3(Dongmei WU，Blood，2002，99，3623-3628)。另外，大分子量常规抗体的限制组织渗透，例如在受损血管壁部位发生血小板介导的聚集过程中。
Nanobody具有独特结构，由单可变结构域组成。源自骆驼科抗体的VHH分子是已知最小的完整抗原结合结构域之一(约15kDa，或比常规IgG小10倍)，因此非常适于运送至致密组织，及进入到参与或启动血小板介导的聚集过程的大分子之间的有限空间内。
据我们所知，这是首次实验表明，小分子nanobody对此类大分子之间相互作用的抑制优于大分子完整抗体。
尽管Nanobody分子量小、因而有利于渗透，还令人惊讶地是，这种小分子能够抑制大的多聚体例如vWF(高达60个单体)与胶原蛋白之间的相互作用，并具有很高效率。已描述了只有大的多聚体形式的vWF具有止血活性(Furlan，M，.1996，Ann.Hematol.72：341-348)。与单聚体vWF片段相比，多聚体vWF与胶原蛋白结合的亲和力高～100倍。
高切应力实验结果表明，可以给患者更低剂量。因此，期待副作用更低(例如免疫原性或出血问题)。
本发明还涉及一种发现，即来自美洲驼单结构域抗体的对应SEQ ID NOs23到31任一个所示序列的多肽，与vWF A1结构域结合。
因此，本发明另一实施方案是包括一个或多个单结构域抗体的多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体对应SEQ ID NOs 23到31任一个所示序列。
本发明另一实施方案是对应SEQ ID NOs：32到34任一个所示序列的多肽构建体。该序列对应包括同样序列的VHHs的二价多肽构建体，二者都抗vWFA1结构域。
发明者进行了在流腔中的灌注实验，研究高切应力条件下，包括SEQ IDNOs：23到31所示序列的多肽构建体对血小板聚集的效应。实施例25提供了利用特异性vWF-A1结合物SEQ ID NOs 23到31获得的切应力数据。
本发明还涉及一种发现，即来自美洲驼单结构域抗体的对应SEQ ID NOs62到65任一个所示序列的多肽，选择性结合vWF活性构象(比如与胶原蛋白结合后)的A1结构域，而不是自由循环的非活性vWF。这使得抗血栓形成试剂更安全有效。此处应用的“选择性结合”vWF A1结构域是指美洲驼抗体对vWF活性构象的亲和力比非活性构象高至少10倍，优选100倍。
因此，本发明另一实施方案是包括一个或多个单结构域抗体的多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体对应SEQ ID NOs：62到65任一个所示序列。
本发明另一实施方案中，多肽构建体包括针对相同靶目标的一个或多个单域抗体，还包括针对相同靶目标但是相同结构域的不同表位的一个或多个单结构域抗体。
例如，SEQ ID NOs：9、10和12所示序列是异种特异性多肽构建体，包括针对vWF A3结构域不同表位的VHHs。因此，本发明另一实施方案是对应SEQID NOs：9、10和12任一个所示序列的多肽构建体。
本发明另一实施方案是多肽构建体，其中针对相同靶目标的单结构域抗体数是两个或更多。
SEQ ID NOs：8和11所示序列是包括针对vWF A3结构域中相同表位的VHHs的多肽构建体，其中VHH均具有相同序列。因此，本发明另一实施方案是对应SEQ ID NOs：8和11任一个所示序列的多肽构建体。
本发明另一实施方案中，多肽构建体包括针对相同靶目标的一个结构域的一个或多个单结构域抗体，及针对相同靶目标但是相同靶目标的另一个结构域的一个或多个单结构域抗体。不同结构域的实例可以是vWF的A1和A3结构域。
另一实施例中，SEQ ID NOs：20、21和22所示序列是异种特异性多肽构建体，包括针对vWF不同结构域，即vWF的A1和A3结构域上表位的VHHs。因此，本发明另一实施方案是对应SEQ ID NOs：20、21和22任一个所示序列的多肽构建体。
本发明一个方面是，异种特异性多肽构建体中至少一种抗A1结构域的VHH识别vWF活性构象。该VHH对应SEQ ID NOs：62到65任一个所示序列。
与单聚VHHs相比，该多肽构建体可具有优越的抗血栓形成效应。在流腔中进行灌注实验，研究高切应力下血小板聚集状况，来研究这些多肽构建体的效应。实施例30表示利用包括抗vWF-A1 VHH和抗vWF-A3 VHH的异种特异性多肽构建体获得的切应力数据。
本发明还涉及一种发现，即来自美洲驼单结构域抗体的对应SEQ ID NOs35到37所示序列的多肽，与I型和/或III型胶原蛋白结合。
因此，本发明另一实施方案是多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体对应SEQ ID NOs：35到37任一个所示序列。
本发明另一实施方案中，多肽构建体包括针对I型和/或III型胶原蛋白的一个或多个单结构域抗体，及针对相同靶目标但是相同结构域中不同表位的一个或多个单结构域抗体。3P1-31 3P2-31和3L-41 3P2-31所示序列是异种特异性多肽构建体，包括针对I型胶原蛋白中不同表位的VHHs。因此，本发明另一实施方案是对应SEQ ID NOs：46和47任一个所示序列的多肽构建体。
本发明另一方面是包括针对血小板糖蛋白Ib的一个或多个单结构域抗体的多肽构建体。
开发了鼠抗人vWF单抗，AJvW-2(IgG)，其抑制利托菌素或美洲矛头蝮毒蛋白诱导的人血小板聚集过程中血小板糖蛋白Ib(gpIb)和冯维勒布兰德因子(vWF)之间的相互作用(PCT申请号WO 00/10601)。AJvW-2Fab，抑制狗冠状动脉反复性血栓形成而不延长流血时间(Kageyama S等人，Thromb Res.，2001 Mar 1；101(5)：395-404)，防止豚鼠泡沫化损伤后血栓沉积和neointima形成(Kageyama S.等，Arterioscler Thromb Vasc Biol)2000 Oct；20(10)：2303-8)。
6B4抗体是抗纯化的人gpIb的单克隆抗体(MoAb)(PCT申请号WO01/10911 A2)。注射入狒狒体内时，完整IgG和其F(ab’)(2)片段几乎立即导致血小板减少，原因是二价F(ab’)(2)介导血小板交联，或Fc：Fc受体相互作用介导血小板聚集的活化(Cauwenberghs N等人，Arteriosclerosis，Thrombosis andVascular biology)2000，20：1347，及见如Cadroy Y等人，Blood，1994，83：3218-3224，Becker BH等人，Blood，1989，74：690-694，Ravanat C.等人，Thromb.Haemost.1999，82：528a摘要)。在血栓产生前，将Fab片段注射入狒狒体内，抑制血小板在胶原蛋白富集的牛心包上沉积。但在血栓形成后注射Fab片段，看不到进一步的血栓形成抑制。
发现Fab片段对血小板上gpIb受体的亲和力比完整IgG或F(ab’)2弱10倍(KD分别是49.2nM，4.7nM和6.4nM)。同样，对利托菌素诱导的血小板聚集IC50值，对于Fab而言比IgG或F(ab’)2差高达10倍(IC50分别是40nM，4.5nM和7.7nM)。
可以预料的是，当利用完整IgG或F(ab’)2进行体内治疗所观察到的Fc：Fc受体介导的血小板聚集的活化和/或F(ab’)2介导的血小板交联所致的意外的血小板减少，可通过应用VHH加以避免，因为VHH不含Fc，也不是二价。如用6B4的Fab片段所观察的一样，不会损失亲和力和活性，因为nanobody已经是单结构域分子。
人源化抗体
在美洲驼、单峰骆驼和骆驼体内发现的天然存在的单结构域抗体展示了一类新型治疗用分子，它们既具有单克隆抗体的优点如特异性、低毒性，又具备小分子的优点如组织渗透和稳定性。不幸的是，基于这些蛋白开发合适的治疗用产品时遇到了麻烦，因为这些产品源自骆驼科而非人类。非人类蛋白质所含的氨基酸残基注射入人患者体内时具有免疫原性。虽然研究已表明，源自骆驼科的VHH注射入小鼠体内没有免疫原性，但优选用人类残基替代骆驼科残基。这些人源化多肽在人体内应实质上没有免疫原性，但仍保持野生多肽的亲和力与活性。
人源化是指突变，这样向人类患者给药时免疫原性达最小或消失。根据本发明，将多肽人源化包括将一个或多个骆驼科氨基酸由人类共有序列中发现的人类相对应物所置换的步骤，多肽不会丧失其典型特性，即人源化不会显著影响所产生多肽的抗原结合能力。
发明者已确定可修饰的抗体可变区(VHH)的氨基酸残基，而不减小结构域与抗原的天然亲和力但降低其对异源种系的免疫原性；在确定残基发生修饰的VHH的应用，其用于对异源种系给药；如此修饰的VHH。更具体而言，本发明涉及经过修饰用于人类给药的VHHs的制备，所产生的VHH自身，及此类“人源化”VHHs在治疗人类疾病中的用途。
发明者还发现VHH多肽的人源化需在单个多肽链中插入或诱变仅有限数量的氨基酸，而不显著丧失结合和/或抑制活性。这与scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化相反，后者需要在双链，轻链和重链中导入氨基酸变化，并保留二条链的组装。
人源化技术可通过一种方法实施，包括单独或联合置换以下任一残基：FR1的1、5、28和30位、FR2中37、44、45和47位标志氨基酸、FR3的残基74、75、76、83、84、93和94及FR4中103、104、108和111位；按照Kabat编号法进行编号。此类人源化序列的实例见表30，SEQ ID NO.2、38到41。
实例63和64所示多肽与人种系VH DP-47高度同源。进一步的人源化需要在单个多肽链中导入和诱变有限数量的氨基酸。这不同于scFv、Fab、(Fab)2和IgG的人源化，后者需要在双链，轻链和重链中导入氨基酸变化，并保留二条链的组装。
该多肽在FR2中包含与人类似的残基。人源化需要对FR1的1和5位残基进行诱变，该诱变通过利用所有组成成分克隆的引物插入，天然美洲驼序列不存在该突变。那些残基突变不导致丧失结合和/或抑制活性。FR1人源化也需要28和30位发生诱变。那些残基的突变同样不导致丧失结合和/或抑制活性。
人源化也需要FR3中的74、75、76、83、84、93、94位残基发生突变。那些残基的突变不导致丧失结合和/或抑制活性。
人源化也需要FR4中104、108和111位残基发生突变。Q108L突变导致在大肠杆菌中更低的生产水平。Camelid VHH 108位是暴露于溶剂的，而在人抗体中该位置隐藏于VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分离的VH中，108位是暴露于溶剂的。插入非极性疏水Leu而不是极性不带电Gln对分子固有的可折叠性/稳定性有重大影响。
本发明一个实施方案是人源化VHH的方法，包括步骤：
(a)单独或联合置换以下任一残基：
FR1的1、5、28和30位，
FR2中37、44、45和47位标志氨基酸，
FR3的参见74、75、76、83、84、93和94，
及FR4中103、104、108和111位；
按照Kabat编号法进行编号。
该人源化序列的实例见表30，SEQ ID NO 2，38到41。
应用源自如小鼠、绵羊、山羊、兔等来源的抗体及其人源化衍生物来治疗需对血小板相关聚集进行调节的疾病时，因几个原因而存在问题。传统抗体室温下不稳定，对于制备和储存、储存和运输必须冷藏，需要必需的冷冻实验设备、这导致费时费钱。有时在发展中国家冷冻不是切实可行的。该Fab分子表达产量很低，生产方法耗费大量人力。而且，制造或小规模生产所述抗体非常昂贵，因为表达完整和活性抗体所需的哺乳细胞系统需要时间和设备的高水平支撑，且产量很低。另外，传统抗体结合活性依赖于pH，因此不适用于一般生理pH范围以外的环境应用，例如，在治疗胃出血、胃外科手术的情况下。此外，传统抗体在低或高pH下不稳定，因此不适于口服。然而已证实，Camelid抗体耐受苛刻条件，如极端pH、变性剂和高温(Ewert S等人，Biochemistry，2002，Mar 19；41(11)：3628-36)，因此使得它们适于口服递送。另外，传统抗体结合活性依赖于温度，因此不适用于在生物活性温度范围外的温度下(如37±20℃)用于分析或试剂盒。
SEQ ID NOs：1到47和49到65所示多肽构建体及其衍生物不仅具有传统抗体的优良特性，如低毒性和高选择性，而且它们还显示其他特性。它们的可溶性更佳，意味着与传统抗体相比，它们可以以更高的浓度储存和/或给药。它们在室温下稳定，意味着它们无需使用冷冻设备而制备、储存和/或运输，节省成本、时间，也环保(如实施例61所述)。与常规抗体相比，其他优越的特性包括循环半衰期短，这一点可以按照本发明进行调节，例如通过清蛋白偶联，一种双特异性nanobody，其具有针对清蛋白的一个特异性，另一个针对靶目标、Fc偶联、VHH偶联(二价VHHs)或通过pegylation(如实施例41到54所述)。对于外科手术程序需要短且能够控制的半衰期，例如，需要在有限时间内抑制血小板介导的聚集。同样，出现出血问题或其他并发症时，可立即降低剂量。本发明多肽在通常生理范围之外的pH和温度下仍保持结合活性，这意味着其可在调节血小板介导的聚集需要的极端pH和温度条件下进行应用，如胃外科手术、胃出血控制，室温进行的分析等。本发明多肽还在极端pH下显示延长的稳定性，意味着其适于口服递送。本发明多肽可通过在方便的重组宿主生物体如大肠杆菌和酵母这发酵来成本有效的生产，可获得高的表达水平，不像常规抗体还需要昂贵的哺乳细胞培养装置。本发明多肽产量的实例是1到10mg/ml(大肠杆菌)和高达1g/l(酵母)。本发明多肽与广谱的不同抗原类型具有高结合亲和力，结合常规抗体无法识别的表位的能力；例如，它们具有基于长CDR的环形结构，具有渗透到腔中的潜能，显示酶抑制功能。另外，由于结合常常仅通过CDR3环路发生，可以设想源自CDR3的肽可用于治疗(Desmyter等人，J Biol Chem，2001，276：26285-90)。该肽制备方法见实施例65所述。本发明多肽还保持与酶或毒素作为融合蛋白的完全的结合能力。另外，可以预料的是，当利用完整IgG或F(ab’)2进行体内治疗时所观察到的，Fc：Fc受体介导的血小板聚集的活化和/或F(ab’)2介导的血小板交联所致的意外的血小板减少(见Cauwenberghs N等人，Arteriosclerosis，Thrombosis and Vascular biology，2000，20：1347)，可通过应用VHH加以避免，因为VHH不含Fc，也不是二价。因此，SEQ ID NOs：1到15、20到47、62到65所示多肽、其同源物或功能部分提供了治疗和诊断与血小板介导的聚集相关疾病时相当可观的节省成本和时间，并且需要该多肽的患者会较少遇到与常规试剂有关的问题。
在血小板介导的聚集过程中，结合有vWF的胶原蛋白粘附到血小板和/或血小板受体(二者的实例是gpIa/IIa、gpIb或胶原蛋白)上，最后导致血小板活化。血小板活化导致纤维蛋白原结合，最后血小板聚集。本发明范围涵盖提供多肽，其调节包括血小板介导的聚集的过程，比如vWF-胶原蛋白结合、vWF-血小板受体粘附、胶原蛋白-血小板受体粘附、血小板活化、纤维蛋白原结合和/或血小板聚集。该多肽源自骆驼科抗体，针对vWF、vWF A1、活化vWF A1结构域或A3结构域、gpIb或胶原蛋白，并如上所述具备与SEQ IDNOs：1到15、20到47和62到65所示多肽相同的优点。
根据本发明一个方面，多肽构建体可以是全长多肽构建体的同源序列。根据本发明另一方面，多肽构建体可以是全长多肽构建体的功能部分。根据本发明另一方面，多肽构建体可以是全长多肽构建体的同源序列。根据本发明另一方面，多肽构建体可以是全长多肽构建体的同源序列的功能部分。根据本发明一个方面，多肽构建体可包括多肽构建体序列。
根据本发明一个方面，用于形成多肽构建体的单结构域抗体可以是完整的单结构域抗体(如VHH)或其同源序列。根据本发明另一方面，用于形成多肽构建体的单结构域抗体可以是完整单结构域抗体的功能部分。根据本发明另一方面，用于形成多肽构建体的单结构域抗体可以是完整单结构域抗体的同源序列。根据本发明另一方面，用于形成多肽构建体的单结构域抗体可以是完整单结构域抗体的同源序列的功能部分。
本发明另一方面是对应SEQ ID NOs：1到7、16到19、23到31、35到41和49到65任一个的单结构域抗体、其同源序列、和/或其功能部分。
根据本发明另一方面，多肽构建体可以是亲本序列的同源序列。根据本发明另一方面，多肽构建体可以是亲本序列的功能部分。根据本发明另一方面，多肽构建体可以是亲本序列的同源序列的功能部分。
正如此处应用的，同源序列可包括添加、缺失或替换一个或多个氨基酸，而实质上不改变该多肽的功能特性。缺失和替换的氨基酸数目优选为高达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。
根据本发明的同源序列包括通过添加氨基酸以形成人重链抗体和人单个结构域重链抗体而扩展的多肽，其不实质上改变未修饰多肽的功能特性。
本发明的同源序列可包括SEQ ID NOs：1到47和49到65任一个所示已被人源化的多肽(如实施例63和64所述)。
本发明的同源序列可包括对应SEQ ID NOs：1到47和49到65任一个所示序列的序列，其存在于其他骆驼科物种比如骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼、驼马等。
同源序列表示序列的一致性，表示与亲本序列具有高度序列一致性(超过70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％序列一致)的序列，优选特征在于与亲本序列的类似特性，即亲和力，所述一致性利用已知方法计算。
备选地，同源序列还可以是根据下式在亲本序列的任何数目位置进行允许的替换所产生的任一氨基酸序列：
丝氨酸由丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和天冬酰胺取代；
精氨酸由精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和谷氨酸之一取代；
亮氨酸由亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和缬氨酸之一取代；
脯氨酸由脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸之一取代；
苏氨酸由苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸和谷氨酰胺之一取代；
丙氨酸由丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸和脯氨酸之一取代；
缬氨酸由缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸之一取代；
甘氨酸由甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸和丝氨酸之一取代；
异亮氨酸由异亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸之一取代；
苯丙氨酸由苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸之一取代；
酪氨酸由酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸之一取代；
组氨酸由组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸和精氨酸之一取代；
谷氨酰胺由谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、组氨酸、苏氨酸和精氨酸之一取代；
天冬酰胺由天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸之一取代；
赖氨酸由赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和精氨酸之一取代；
天冬氨酸由天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺之一取代；
谷氨酸由谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和精氨酸之一取代；
蛋氨酸由蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和酪氨酸之一取代。
根据本发明，同源物可指超过50、100、200、300、400、500、600、800或1000个核苷酸、在严格杂交条件下(比如SAMBROOK等人所述，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验出版社，纽约)能与编码多肽的核苷酸序列的反向互补链杂交的核苷酸序列。
正如此处应用的，功能部分指足够长度的单结构域抗体使得感兴趣的相互作用的亲和力保持在1×10-6M或更高。
备选地，本发明单结构域抗体的功能部分包括完整氨基酸序列的部分缺失，但仍保持结合靶目标并与之相互作用所需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，SEQ ID NO：1到7任一个的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持抑制vWF与胶原蛋白结合所需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，SEQ ID NOs：23到31和62到65任一个的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持结合vWF A1结构域并与之相互作用所需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，SEQ ID NOs：35到37任一个的功能部分是多肽，包括完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持结合胶原蛋白并与之相互作用所需的结合位点和蛋白结构域。
备选地，功能部分包括多肽的完整氨基酸序列的部分缺失，仍保持结合其所针对的抗原并与之相互作用所需的结合位点和蛋白结构域。其包括但不限于VHH结构域。
正如此处应用的，表示多肽序列的功能部分是指少于100％序列(如99％、90％、80％、70％、60％、50％等)，但包括5个或更多个氨基酸。
如同其表示编码多肽序列的核苷酸序列的部分是指少于100％序列(如99％、90％、80％、70％、60％、50％等)，但包括15个或更多个核苷酸。
本发明一个方面是根据本发明多肽构建体的给药可避免注射。基于常规抗体进行的治疗具有作为药物的显著效力，因为它们对其靶目标有精确的特异性且很低固有毒性，但它们有一个重要的缺点：相对不稳定，对蛋白酶降解敏感。这意味着常规抗体药物不能通过口服、舌下、局部、经鼻、阴道、直肠或通过吸入给药，因为它们无法耐受这些部位的低pH及这些部位和血液内蛋白酶的作用，和/或者它们分子量太大。必须通过注射给药(静脉内、皮下等)才能克服部分这些问题。注射给药需要专业训练以便正确并安全使用皮下注射器或针。还需要无菌设备、治疗性多肽的液体制剂、该多肽的无菌且稳定形式的安剖包装及，对受试者而言，合适的入针部位。另外，受试者在注射前和接受注射时一般会有生理和心理压力。
本发明一个方面通过提供本发明多肽构建体，克服了这些现有技术中的问题。该构建体足够小、耐受力强并稳定，可以口服、舌下、局部、经鼻、阴道、直肠或吸入给药而实质上不丧失活性。本发明多肽构建体避免了注射，不仅省钱省时，而且更方便和使受试者更舒适。
本发明一个实施方案是此处公开的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病的症状，所述疾病的症状易受一种物质调节，所述物质控制血小板介导的聚集，其可通过胃环境而该物质不被灭活。
正如本领域的技术人员所知，一旦拥有该多肽构建体，可应用制剂技术以在合适部位(如胃、结肠等)释放最大量多肽。这种递送方法对治疗、预防和/或缓解靶目标位于肠道系统的疾病的症状非常重要。
本发明一个方面是通过给受伤者口服此处公开的多肽构建体来治疗、预防和/或缓解疾病症状的方法，该疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质可通过胃环境而不被灭活。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体的用途，用以制备治疗、预防和/或缓解疾病的症状的药物，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质可通过胃环境而不被灭活。
本发明一个方面是，通过给受试者口服在此公开的多肽构建体来递送物质到肠道系统而不被灭活的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
本发明一个方面是，通过给受试者口服在此公开的多肽构建体来递送物质到受试者的血液而不被灭活的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体，用来治疗、预防和/或缓解疾病的症状，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质被递送到阴道和/或直肠道。
一个非限制性实施例是，根据本发明的制剂，其包含在此公开的多肽构建体，所述制剂是凝胶、霜剂、栓剂、薄膜的形式，或海绵状的形式，或作为阴道环，其随着时间缓慢释放活性成分(此类制剂见EP 707473，EP 684814，US 5629001所述)。
本发明一个方面是，通过向受试者阴道和/或直肠给予在此公开的多肽构建体来治疗、预防和/或缓解疾病的症状的方法，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质的调节，所述该物质被递送到阴道和/或直肠道。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体的用途，用于制备治疗、预防和/或缓解疾病的症状的药物的方法，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质的调节，所述该物质被递送到阴道和/或直肠道。
本发明一个方面是，通过向受试者阴道和/或直肠道给予在此公开的多肽构建体将物质递送到阴道和/或直肠道而所述物质不被灭活的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
本发明一个方面是，通过向受试者阴道和/或直肠道给予在此公开的多肽构建体将物质递送到受试者的血液而所述物质不被灭活的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病的症状，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，所述物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺。
在非限制性实施例中，根据本发明的制剂，其包含在此公开的多肽构建体，所述制剂是鼻喷雾剂(如气溶胶)或吸入剂的形式。由于该多肽构建体很小，它可以比治疗性IgG分子更有效地到达其靶目标。
本发明一个方面是通过经口或鼻吸入向受试者给予在此公开的多肽构建体来治疗、预防和/或缓解疾病症状的方法，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，所述物质被递送到上呼吸道和肺。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体的用途，用于制备治疗、预防和/或缓解疾病的症状的药物，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，所述物质被递送到鼻、上呼吸道和/或肺而所述多肽不被灭活。
本发明一个方面是通过向受试者鼻、上呼吸道和/或肺给予在此公开的多肽将物质递送到鼻、上呼吸道和肺而不灭活的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
本发明一个方面是通过向受试者鼻、上呼吸道和/或肺给予在此公开的多肽将物质递送到受试者的血液而不灭活的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
本发明一个实施方案是在此公开的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病的症状，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，所述物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加了肠粘膜通透性。由于它们分子量小，在此公开的多肽构建体可更有效地通过受试者肠粘膜，到达血液，这些受试者患有导致肠粘膜通透性增加的疾患。
本发明一个方面是通过给受试者口服在此公开的多肽构建体来治疗、预防和/或缓解疾病的症状的方法，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，所述物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加了肠粘膜通透性。
还可通过本发明另一方面-应用活性转运载体促进该过程。在本发明该方面，VHH与载体融合，后者可促进从肠壁到血液的转移过程。在非限制性实施例中，该“载体”是融合到治疗性VHH上的第二个VHH。应用本领域已知方法制备该融合构建体。该“载体”VHH与肠壁上的受体特异性结合，后者诱导经肠壁的活性转移。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体的用途，用于制备治疗、预防和/或缓解疾病的症状的药物，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，所述物质被递送到肠粘膜，其中所述疾病增加了肠粘膜通透性。
本发明一个方面是通过受试者口服本发明的多肽构建体，将控制血小板介导的聚集的物质递送到肠粘膜而不使之失活的方法。
本发明一个方面是通过受试者口服本发明多肽构建体，将控制血小板介导聚集的物质运送到受试者的血液而不使之失活的方法。
还可通过本发明另一方面-应用活性转运载体进一步促进该过程。在本发明该方面，此处描述的多肽构建体与载体融合，后者可促进从肠壁到血液的转移过程。在非限制性实施例中，该“载体”是融合到该多肽上的VHH。应用本领域已知方法制备该融合构建体。该“载体”VHH与肠壁上的受体特异性结合，后者诱导经肠壁的活性转移。
本发明一个实施方案是此处描述的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病的症状，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质能有效通过舌下组织。将在此公开的该多肽构建体制剂，例如片剂、喷雾剂、滴剂置于舌下，经粘膜吸收到舌下毛细血管网。
本发明一个方面是，通过舌下给予受试者在此公开的多肽构建体来治疗、预防和/或缓解疾病的症状的方法，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质能有效通过舌下组织。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体的用途，用于制备治疗、预防和/或缓解疾病的症状的药物，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质能通过舌下组织。
本发明一个方面是通过舌下给予受试者在此公开的多肽构建体，递送控制血小板介导的聚集的物质到舌下组织而不使之失活的方法。
本发明一个方面是通过给受试者口服在此公开的多肽构建体，递送控制血小板介导的聚集的物质到受试者血液而不使之失活的方法。
本发明一个实施方案是在此公开的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病的症状，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质能有效通过皮肤。
将所述多肽构建体的制剂例如，霜剂、薄膜、喷雾剂、滴剂、贴片剂置于皮肤，经皮吸收。
本发明一个方面是通过局部给予受试者此处公开的多肽构建体来治疗、预防和/或缓解疾病的症状的方法，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质的控制，所述物质能有效通过皮肤。
本发明另一实施方案是在此公开的多肽构建体的用途，用于制备治疗、预防和/或缓解疾病的症状的药物，所述疾病的症状易受控制血小板介导的聚集的物质调节，该物质能有效通过皮肤。
本发明一个方面是通过对受试者局部给予在此公开的多肽构建体，将物质递送到皮肤而不被灭活的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
本发明一个方面是通过对受试者具有给予在此公开的多肽构建体，将物质递送到受试者的血液的方法，所述物质控制血小板介导的聚集。
在本发明另一实施方案中，在此公开的多肽构建体还包括载体单结构域抗体(如VHH)，其作为活性转运载体转运该多肽构建体经肺腔至血液。
多肽构建体还包括特异性结合粘膜表面(支气管上皮细胞)上存在的受体的载体，导致该多肽从肺腔到血液活性转移。该载体单结构域抗体可与该多肽构建体融合。应用本领域已知及本文描述的方法制备该融合构建体。“载体”单结构域抗体与粘膜表面上的受体特异性结合，后者诱导经表面的活性转移。
本发明另一方面是确定哪种单结构域抗体(如VHHs)经鼻给药活性转运到血液内的方法。类似地，将首次用于实验或免疫VHH噬菌体文库经鼻给药，并于给药后不同的时间点，分离血液或器官，拯救(rescue)已被活性转移到血液中的噬菌体。用于从肺腔到血液活性转移的受体的非限制性实例是Fc受体N(FcRn)。本发明一个方面包括根据该方法鉴别的VHH分子。随后该VHH可用作载体VHH，用于经鼻给药将治疗性VHH转运到血液内相应靶目标。
本发明一个实施方案是在此公开的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病的症状，所述疾病的症状涉及血小板介导的聚集或其机能障碍。所述疾病包括血栓形成血小板减少性紫癜(TTP)，短暂脑局部缺血性发作、不稳定或稳定型心绞痛、脑梗塞、心肌梗塞、周围动脉闭塞性疾病、再狭窄。该疾患还包括冠脉旁路移植、或冠状动脉瓣膜换置和冠脉介入治疗如血管成形术、放置斯坦特印模、或动脉粥样斑块旋切引发的症状。
其他疾病为非闭塞性血栓形成、闭塞性血栓形成、动脉血栓形成、急性冠脉闭塞、再狭窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狭窄、狭窄的动脉内血栓形成、血管成形术、动脉粥样斑块旋切或动脉斯坦特印模后的增生、血管系统的闭塞综合征或患病的动脉开放缺陷中的任何一种。
本发明一个方面是在此公开的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病或病症，所述疾病或病症与血小板介导的聚集或其机能障碍相关，其中该多肽构建体被静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻内、阴道内、直肠内或吸入给药。
本发明另一方面是在此公开的多肽构建体用途，用于制备治疗、预防和/或缓解疾病或病症的药物，所述疾病或病症与血小板介导的聚集或其机能障碍相关，其中该多肽构建体被静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻内、阴道内、直肠内或吸入给药。
本发明另一方面是治疗、预防和/或缓解疾病或病症的方法，所述疾病或病症与血小板介导的聚集或其机能障碍相关，包括将在此公开的多肽构建体给予受试者，其中该异种特异性多肽构建体被静脉内、皮下、口服、舌下、局部、鼻内、阴道内、直肠内或吸入给药。
本发明另一方面是在此公开的多肽构建体，用于治疗、预防和/或缓解疾病或病症，所述疾病或病症与血小板介导的聚集或其机能障碍相关。
本发明另一方面是在此公开的多肽的用途，用于制备治疗、预防和/或缓解与血小板介导的聚集或其机能障碍相关的疾病或病症。
利用本发明多肽构建体筛选调节多肽与vWF(或gpIb或胶原蛋白)结合的试剂。在测量结合力或该多肽单独置换的分析中一旦确定试剂，对试剂进行功能测试，以确定其是否为血小板介导的聚集的调节剂。
在一个置换实验的实施例中，表达vWF或其片段的噬菌体或细胞在结合缓冲液中与例如，已被标记的SEQ ID NO：1所示多肽温育，加上或不加浓度升高的候选调节剂。为了验证和校准测试，可利用浓度升高的未标记的该多肽进行对照竞争反应。温育后，充分洗涤细胞，根据标记物用恰当方法测量结合的标记多肽(如闪烁计数、荧光等)。有候选调节剂的情况下结合的标记多肽量减少至少10％，说明候选调节剂置换了结合。若候选调节剂在1μM或更低浓度置换50％标记多肽(亚饱和多肽剂量)，则认为其在本文描述的该测试和其它测试中结合是特异性的。当然，可轻松利用上述方法筛选候选调节剂，所述候选调节剂改变SEQ ID NOs：2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间的结合。
备选地，结合或结合置换可通过表面胞质团共振(SPR)监测。表面胞质团共振分析可作为定量方法测量两种分子之间的结合，所述测量是通过固定的传感器附近质量的变化进行，所述质量的变化是由来自液相的例如SEQ IDNO：1所示多肽与固定于传感器膜上的vWF或其片段之间的结合或结合损失所致。该质量变化被测量为在注射或去除所述多肽或候选调节剂后相对于时间的共振单位，用Biacore生物传感器测量(Biocore AB)。根据Salamon等人(Salamon等人，1996，Biophys J.71：283-294；Salamon等人，2001，BiophysJ.80：1557-1567；Ssalamon等人，1999，Trends Biochem.Sci.24：213-219，每一篇都在此引用以供参考)所述方法，可将如vWF或其片段固定在薄膜脂质膜中的传感器芯片上(例如，研究级CM5芯片；Biocore AB)。Sarrio等人证明SPR可用于检测结合固定到芯片上脂质层内的GPCR A(1)腺苷受体的配体(Sarrio等人，2000，Mol.Cell.Biol.20：5164-5174，在此引用以供参考)。本发明多肽构建体在SPR分析中的结合条件可由本领域技术人员利用Sarrio等人报道的条件作为起点进行精调。当然，可轻松利用上述方法筛选候选调节剂，其改变在此公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间的结合。
SPR至少有两种方式分析结合的调节剂。首先，例如，可将SEQ ID NO：1所示多肽与固定的vWF或其片段预结合，然后注射候选调节剂，浓度范围是0.1nM到1μM。可以定量所结合多肽的置换，允许检测调节剂结合。备选地，膜结合的vWF或其片段可与候选调节剂预温育，并被例如SEQ ID NO：1所示多肽竞争。与不加调节剂的所述多肽和vWF或其片段之间的结合亲和力相比，所述多肽和预温育了调节剂的vWF或其片段的结合亲和力的差别证明，有调节剂情况下所述多肽的结合或置换。另一个分析中，与不加候选调节剂所结合的所述多肽量相比，加上候选调节剂所结合的该多肽量减少10％或更多，说明候选调节剂抑制vWF或其片段与该多肽之间的相互作用。当然，可轻松利用上述方法筛选候选调节剂，其改变SEQ ID NOs：2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间结合。
另一种检测抑制如SEQ ID NOs：1到15、20到34、38到45或62到65所示多肽与vWF或其片段结合的方法采用荧光共振能量转移法(FRET)。FRET是一种量子力学现象，其发生在彼此紧密接近(一般＜100
Figure C20048000209000351
)的荧光供体(D)和荧光受体(A)之间，条件是D发射光谱和A的激发光谱重叠。待测分子如SEQ ID NO：1所示多肽和vWF或其片段用供体和受体的互补荧光团对进行标记。当通过vWF：多肽相互作用一起紧密结合时，供体荧光团受激发而发射的荧光波长与当所述多肽未与vWF或其片段结合时激发波长发射的波长不同，准备通过测量每一波长的发射强度可以对结合与未结合的分子进行定量。标记vWF或其片段的供体荧光团为本领域熟知。特别引起人们兴趣的是A的变异体。维多利亚GFP已知为青色FP(CFP，供体(D))和黄色FP(YFP，受体(A))。作为一个实例，YFP变体可与vWF或其片段形成融合蛋白。GFP变体作为融合物的表达载体(Clontech)以及荧光团标记试剂(Molecular Probes)为本领域熟知。将候选调节剂加入到荧光标记的多肽与YFP-vWF混合物中可抑制能量转移，这通过如，相对没有候选调节剂的样品，YFP荧光减弱得到证明。在用FRET检测vWF：多肽相互作用的分析中，相对不含候选调节剂的样品而言，含有该候选调节剂的样品中在受体波长发射的荧光强度减弱10％或更多，说明该候选调节剂抑制vWF：多肽相互作用。当然，可轻松利用上述方法筛选候选调节剂，其改变SEQ ID NOs：2到15、20到47和62到65所示多肽或在此公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间的结合。
FRET的变体利用荧光淬灭来监测分子相互作用。相互作用对中的一个分子用荧光团标记，另一个用当紧密靠近时能淬灭荧光团荧光的分子标记。激发时荧光的变化提示标记有荧光团：淬灭剂对的分子联系的变化。一般而言，标记vWF或其片段荧光增强说明携带淬灭剂的多肽分子(如本发明多肽构建体)已被置换。对于淬灭分析，相对于没有候选调节剂的样品而言，含有该候选调节剂的样品荧光发射强度增加10％或更多，说明该候选调节剂抑制vWF：多肽相互作用。当然，可轻松利用上述方法筛选候选调节剂，其改变在此公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间的结合。
除表面胞质团共振和FRET方法外，荧光偏振测量可用于定量结合。荧光标记分子的荧光偏振值有赖于转动相关时间(rotational correlation time)或翻转率(tumbling rate)。复合体，比如那些通过vWF或其片段与荧光标记的多肽(如荧光标记的SEQ ID NOs：1到15、20到34、38到45和62到65任一个所示多肽)所形成的复合体，偏振值要高于未复合的标记多肽。若候选抑制剂破坏或抑制vWF或其片段与所述多肽之间的相互作用，那么相对于无候选抑制剂的混合物而言，vWF：多肽相互作用的包含候选抑制剂导致荧光偏振值降低。荧光偏振充分适合于鉴定破坏vWF：多肽复合体形成的小分子。与没有候选调节剂的样品的荧光偏振相比，含有该候选调节剂的样品的荧光偏振下降10％或更多，说明该候选调节剂抑制vWF：多肽相互作用。当然，可轻松利用上述方法筛选候选调节剂，其改变在此公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间的结合。
另一种监测vWF：多肽相互作用的备选方案采用生物传感器分析。ICS生物传感器已在本领域有述(澳大利亚膜生物技术研究所；Comell B，Braach-Maksvytis V，King L，Osman P，Raguse B，Wieczorek L，和Pace R.“Abiosensor that uses ion-channel switches”Nature，1997，387，580)。在该技术中，将vWF或其片段与多肽(如SEQ ID NOs：1到15、20到34、38到45和62到65任一个所示多肽)的联系，与悬浮的双层膜内gramacidin促进的离子通道闭合偶联一起，并从而与生物传感器的导纳(admittance)(类似于impedence)的可测量的变化偶联。该方法在导纳变化的6个数量级内是线性的并且非常适于小分子组合文库的大规模、高通量筛选。相对于没有候选调节剂的样品的导纳，含有候选调节剂的样品中导纳的10％或更大的变化(增加或减小)表明候选调节剂抑制vWF或其片段与所述多肽的相互作用。重要的是注意到在检测vWF或其片段与多肽(比如，SEQ ID NOs：1到15、20到34、38到45和62到65任一个所示多肽)的相互作用的测定中，可能相互作用的调节剂不必一定直接与在生理上与所述多肽相互作用的蛋白质的结构域相互作用。还可能调节剂在从相互作用部位除去的位置相互作用并导致，例如，vWF中的构象变化。以该方式作用的调节剂(抑制剂或激动剂)仍然可以作为调节血小板介导的聚集。当然，可轻松利用上述方法筛选候选调节剂，其改变于在此公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间结合。
所描述的任一种结合测定法都可用于确定样品(例如，组织样品)中试剂的存在，该试剂结合vWF或其片段，或者影响例如SEQ ID NO：1到15、20到34、38到45或62到65任一个所示多肽与vWF结合。为此，在样品的存在或缺乏时，将vWF或其片段与所述多肽反应，并且用对所使用的结合测定适宜的方法测量多肽结合。所述多肽的结合减小10％或者更多表明该样品含有调节所述多肽与vWF或其片段结合的试剂。当然，上面的一般化方法可容易地应用于筛选候选调节剂，该候选调节剂改变此处公开的多肽构建体与参与血小板介导的聚集的大分子比如vWF、gpIb或胶原蛋白或其片段之间结合。细胞
根据本发明有用的细胞优选选自细菌细胞例如大肠杆菌、酵母细胞例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤巴斯德酵母(P.pastors)、昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
根据本发明使用的细胞可以是任一细胞，依照本发明编码含有SEQ IDNOs：1到47和49到65任一个的多肽，或根据本发明的多肽构建体的核酸序列可被导入该细胞，从而该多肽可以以如文中定义的天然水平或者高于天然水平表达。优选地，在细胞中表达的本发明的多肽显示出如文中定义的正常的或者接近正常的药理学。最优选地，在细胞中表达的本发明的多肽包括核苷酸序列，该核苷酸序列能够编码表30中给出的氨基酸序列或者能够编码与表30中给出的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列。
根据本发明的优选实施方案，细胞选自COS7-细胞、CHO细胞、LM(TK-)细胞、NIH-3T3细胞、HEK-293细胞、K-562细胞或者1321N1星形细胞瘤细胞(astrocytoma cell)以及其他可被转染的细胞系。
通常，“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”指实现所希望的一个或多个结果(治疗或预防血小板聚集)所需的量。本领域技术人员将认识到潜能和因此“有效量”将随着用于本发明中抑制血小板聚集的多种化合物而变。本领域技术人员将容易评估该化合物的潜能。
如文中所用的，术语“化合物”指此处公开的多肽构建体、或能够编码所述多肽的核酸、或者依照此处描述的筛选方法鉴定的试剂或包含一个或多个衍生化的氨基酸的所述多肽。
“药学上可接受的”指不是生物学上的材料或者不是不希望的材料，即，该材料可以与该化合物一起施用于个体而不导致任何不希望的生物学效应或不与药物组合物中所含有的其他组分的任一种以有害的方式相互作用。
在此公开的发明对受试者有助于治疗或预防血小板介导的聚集的疾病，包括给予药物有效量的化合物或组合物，抑制BTK及抑制血小板介导的聚集。
在此公开的发明对受试者有助于治疗或预防血栓形成的第一步，包括给予药物有效量的根据本发明的化合物或组合物。
在此公开的发明对受试者有助于治疗或预防再狭窄，包括给予药物有效量的根据本发明的化合物或组合物。
本发明一个方面是本发明化合物的用途，用于治疗或预防受试者血小板介导的聚集的疾病，包括联合另一种例如阿司匹林给予药物有效量的化合物。
本发明一个方面是本发明化合物的用途，用于治疗或预防受试者血小板介导的聚集的疾病，包括联合另一种例如溶解血栓试剂给予药物有效量的化合物。
本发明另一方面是本发明化合物的用途，用于治疗或预防个体斑块或血栓。所述斑块或血栓可在高切应力条件下形成。在血栓形成和再闭塞中，血小板在高切应力速率下发生可逆的粘附或栓缚，然后通过血小板上的胶原蛋白受体形成牢固粘附，导致血小板活化；血小板通过vWF栓缚到受损血管壁内裸露的胶原蛋白上，这在高切应力条件下尤为重要。本发明者已发现本发明的多肽构建体在高切应力条件下出人意料的表现良好(例如，实施例16)。
本发明并不限于给药包括本发明单一化合物的制剂。本发明范围还包括联合治疗，其中将包括超过一种本发明化合物的制剂给予所需患者。
血小板介导的聚集的疾病包括，但不限于，不稳定型心绞痛、稳定型心绞痛、心绞痛、栓子形成、深静脉血栓形成、溶血性尿毒症综合征、溶血性贫血、急性肾衰竭、溶解血栓并发症、血栓形成血小板减少性紫癜、弥散性血管内comgelopathy、血栓症、冠心病、血栓栓塞并发症、心肌梗塞、再狭窄和心房纤维性颤动中的血栓形成、慢性不稳定型心绞痛、短暂局部缺血性发作和中风、周围血管疾病、动脉血栓形成、子痫前期、栓塞、再狭窄和/或血管成形术、颈动脉内膜切除术、血管移植物的接合及慢性接触心血管装置后的血栓形成。该疾病也可产生自溶栓治疗过程中和治疗后、血管成形术后及冠脉旁路(术)后的血栓栓塞和再闭合。
如何应用本文所述标准测试或应用其他类似测试方法确定血小板介导的聚集的抑制，为本领域熟知。优选地，该方法导致血小板介导的聚集减少至少10％，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或任何中间数值，最优选90％。
类似地，该方法导致细胞内钙动员下降至少10％，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。类似地，该方法导致磷酸化PLCg2水平下降至少10％，包括，例如，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％。
例如可通过比较时序血小板凝集计(chronology platelet aggregometer)中的光阻(optical impedence)来测量这种减少。也可使用任何其他已知测量方法。例如，(1)胶原蛋白刺激时，胶原蛋白诱导的细胞内钙动员的水平随时间增加，因此测量可包括测量胶原蛋白诱导的细胞内钙水平，或(2)胶原蛋白刺激时，磷酸化PLCg2水平随时间增加，因此测量可包括测量磷酸化PLCg2水平。
可体外接触细胞，例如通过将本发明化合物加到培养基中(通过持续输注、通过丸剂运送或通过将培养基更换为含有化合物的培养基)，或将化合物加到体内细胞外流体(通过局部运送、全身运送、吸入、静脉内注射、丸剂运送或持续输注)进行。根据化合物在浸泡细胞或细胞群的培养基或胞外流体中以有效生理水平或推断的有效生理水平存在的时间，来确定与细胞或细胞群“接触”的持续时间。优选地，接触的持续时间是1-96小时，更优选地，是24小时，但该时间会随化合物的半衰期而变，本领域技术人员可应用常规实验对其进行优化。
可将用于本发明的化合物配制成药用组合物，并通过适于选择的给药途径的各种形式施用于哺乳动物宿主，如人类患者或家畜，所述给药途径即口服或胃肠外，通过鼻内或吸入、静脉内、肌肉内、局部或皮下路径。
本发明化合物也可应用运送的基因治疗方法给药。见如美国专利号No5,399,346，在此全文引用以供参考。应用运送的基因治疗方法，转染有本发明化合物的基因的原代细胞还可另外转染组织特异性启动子以定位特异性器官、组织、移植物、肿瘤或细胞。
因此，本发明化合物可联合药用载体如惰性稀释液或可同化的食用载体全身给药，如口服。它们可封入硬或软壳明胶胶囊内，可压缩成片剂或直接掺入到患者食物内。口服给药治疗的话，活性化合物可联合一种或多种赋形剂，以可吸收的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、糯米纸囊剂等等形式使用。此类组合物和制剂应包含至少0.1％活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可发生变化，可便利地介于所给单位剂量形式的约2％到约60％重量之间。该治疗有用组合物中活性化合物的数量应获得有效剂量水平。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等等还可以含有下面的：结合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等等；润滑剂如硬脂酸镁；和甜味剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦或者增香剂如欧薄荷、冬青油，或者樱桃香料。当单位剂型是胶囊剂时，其除了上面类型的物质，还可以含有液态载体，如植物油或者聚乙二醇。可以存在多种其他材料作为包衣或者另外改变固态单位剂型的物理形式。例如，用明胶、蜡、虫胶或者糖等等可以将片剂、丸剂或者胶囊剂包衣。糖浆剂或者酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖或者果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和香料如樱桃或者桔子香料。当然，用制备任一单位剂型中的任一材料都应该是药学上可接受的并且在用量内实质上无毒。此外，活性化合物可被掺入缓释制剂和装置。
活性化合物也可通过输注或注射而静脉内或腹腔内给药。活性化合物溶液或其盐可在水中制备，并随意与无毒表面活性剂混和。分散相也可在甘油、液体聚乙二醇、醋酸甘油和其混合物以及油中制备。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂，防止细菌滋生。
还可以通过灌注或注射，静脉内或者腹膜内地施用活性化合物。可以在水中制备活性化合物或者其盐的溶液，其任选与无毒表面活性剂混合。还可以在甘油、液态聚乙二醇、三醋精，和它们的混合物和油中制备分散剂。在保存和使用的通常条件下，这些制剂含有用于防止微生物生长的防腐剂。
适于注射或灌注的药学剂型可包括含有活性成分的无菌水性溶液或者分散剂或者无菌粉剂，其适于临时制备无菌注射液或者灌注液或分散剂，任选封装在脂质体中。在所有情况中，最终剂型在生产和保存条件下必须是无菌的、液态和稳定的。
液态载体或赋形剂可以是溶剂或者液态分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液态聚乙二醇，等等)、植物油、无毒甘油酯，和它们的适宜的混合物。通过例如，形成脂质体，对于分散剂的情况，通过保持所需要的颗粒大小或者通过使用表面活性剂可以保持适当流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞，等等可以防止微生物的作用。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如，糖、缓冲剂或者氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶可以延长可注射组合物的吸收。
将适当溶剂中的所需要的量的活性化合物与上面列举的多种其他成分(如果需要)合并，然后过滤除菌可以制备无菌注射液。对于用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况，优选制备方法是真空干燥和冰冻干燥技术，这些技术产生前面无菌过滤溶液中存在的活性成分加上额外的所希望的成分的粉末。
对于局部施用，本化合物可以以纯的形式应用(即，当它们是液体时)。然而，通常希望将它们作为组合物或者制剂，联合皮肤病学上可接受的载体施用于皮肤，这些载体可以是固体或者液体。
可用的固态载体包括细分的固体，如滑石、粘土、微晶纤维素、硅土、矾土，等等。可用的液态载体包括水、羟烷基或二元醇或者水-乙醇/二元醇掺合物，其中本化合物可以任选通过无毒表面活性剂的帮助以有效水平溶解或者分散。可以加入佐剂诸如芳香剂或者抗微生物剂以优化给定用途的性质。所得液态组合物可以从吸收垫应用，用于浸渍绷带或者其他包扎用品，或者使用泵型或者气溶胶喷雾器喷到受侵袭的区域。
增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或者改性矿物材料可以与液态载体一起使用以形成可涂抹的膏剂、凝胶剂、软膏剂、皂剂，等等，以直接应用于使用者的皮肤。
可用于将该化合物递送到皮肤的有用的皮肤病学组合物的实例是本领域中公知的；例如，见Jacquet等人(美国专利号4,608,392)、Geria(美国专利号4,992,478)、Smith等人(美国专利号4,559,157)和Wortzman(美国专利号4,820,508)。
通过比较化合物的体外活性和动物模型中的体内活性可以确定该化合物的有用剂量。将小鼠，和其他动物中的有效剂量外推到人的方法是本领域中公知的；例如，见美国专利号4,938,949。
通常，液态组合物如洗剂中化合物的浓度将为约0.1-25wt-％，优选约0.5-10wt-％。半固态或者固态组合物如凝胶剂或者粉剂中的浓度将为约0.1-5wt-％，优选约0.5-2.5wt-％。
用于治疗所需的化合物，或者其活性盐或者衍生物的量将不仅随着所选的具体盐而且随着施用途径、被治疗的病症的性质和患者的年龄和状况而变，并且将最终由主治医生或者临床医生的判断决定。而且该化合物的剂量将根据靶细胞、肿瘤、组织、移植物，或者器官而变。
所希望的剂量可便利地作为单剂给出或者作为分开的剂量给出，该分开的剂量以适宜的间隔施用，例如，作为每天2、3、4或多个亚剂量。该亚剂量本身还可以被分成例如，许多离散的松散隔开的施用；诸如吹入器的多次吸入或者通过应用于眼睛的多次滴剂。
施用方案可以包括长期的、每日治疗。“长期”指至少两周，优选数周、数月或者数年持续时间。本领域普通技术人员仅使用此处教导中的常规实验法就可以确定该剂量范围中必要的修饰。见Remington′s Pharmaceutical Sciences(Martin，E.W，第四版)，Mack Publishing Co.，Easton，PA。如果发生任何并发症，个别医生还可以调节剂量。
本发明提供血小板介导的聚集的调节剂。
候选试剂可以是合成试剂，或者试剂的混合物，或者可以是天然产物(例如，植物提取物或者培养上清液)。根据本发明的候选试剂包括可以合成的小分子、天然提取物、肽、蛋白质、糖类、脂质等。
可以从合成的或天然试剂的大文库中筛选候选调节剂。当前利用多种方法随机和定向合成糖、肽、和基于核酸的试剂。可以通过商业途径从许多公司得到合成试剂文库，这些公司包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)、和Microsource(New Milford，CT)。从Aldrich(Milwaukee，WI)可以得到稀有化学品文库。可以得到并且可以制备组合文库。备选地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然试剂的文库可以从例如，Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)得到，或者通过本领域中熟知的方法容易地制备。此外，通过常规化学、物理和生物化学方法容易修饰天然的和合成产生的文库和试剂。
在多种化学品类别中可以发现有用的试剂。有用的试剂可以是有机试剂，或者小有机试剂。小有机试剂的分子量大于50但是小于约2,500道尔顿，优选小于约750，更优选小于约350道尔顿。代表性类别包括杂环类、肽、糖、类固醇，等等。可以修饰这些试剂以增强效能、稳定性、药物相容性，等等。试剂的结构鉴定可用于鉴定、产生或者筛选额外试剂。例如，当鉴定了肽试剂时，可将它们以各种方法修饰以增强它们的稳定性，诸如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸，尤其D-丙氨酸，通过功能化氨基或者羧基末端，例如，对于氨基，酰化或者烷基化，对于羧基，酯化或者酰胺化，等等。
对于初步筛选，根据本发明的候选试剂的有用浓度为约10mM到约100μM或以上(即，1mM、10mM、100mM、1M等)。初步筛选浓度将用作上限，以及9种额外的浓度，其中通过将初步筛选浓度以半对数间隔(例如，对于9种额外的浓度)减小用于二次筛选或者用于产生浓度曲线来确定额外的浓度。
高通量筛选试剂盒
根据本发明的高通量筛选试剂盒含有实施试剂的检测所有必要的方法和介质，该试剂通过在存在多肽(例如，SEQ ID NOs：1到15、20到34、38到45、62到65所示多肽或多肽构建体)，优选浓度范围为1μM到1mM，与本发明靶目标例如vWF或其片段发生相互作用来调节血小板介导的聚集。该试剂盒包括下列组分。本发明的重组细胞，包括和表达编码vWF或其片段的核苷酸序列，根据本领域的技术人员熟知的方法，特别如WO 00/02045所述，根据试剂盒在固体载体上，例如微量滴定板，更优选96孔微量滴定板上生长细胞。备选地，以纯化形式提供vWF或其片段，由本领域技术人员将其固定于例如96孔微量滴定板上。备选地，提供试剂盒内预固定于，例如96孔微量滴定板上的vWF或其片段。备选地，在进行针对gpIb、gpIa/IIa或胶原蛋白的大分子筛选时，上述实施方案可分别用gpIb、gpIa/IIa或胶原蛋白多肽或多聚核酸来取代vWF。试剂盒中可含有一个以上的大分子(例如vWF、gpIb或胶原蛋白大分子和/或多聚核酸)。将浓度约为1μM-1mM或更高的本发明调节剂加入到存在适宜浓度多肽构建体的特定孔中，所述多肽的所述浓度优选范围是1μM到1mM。试剂盒可含有一个以上的多肽。
根据在此已公开的方法进行结合分析，将此结果与例如没有加入调节剂时vWF或其片段与多肽的结合的基线水平进行比较，该多肽是例如，SEQ ID No：2到15、20到34、38到45或62到65任一个所示多肽。选择与不存在调节剂的活性水平相比，vWF-多肽结合能力(例如)升高或降低至少2倍、优选5倍、更优选10倍、最优选100倍或更高的培养孔进行进一步的分析。
根据本发明使用的其它试剂盒
本发明提供用于筛选血小板介导的聚集的调节剂的试剂盒，以及用于诊断以血小板介导的聚集失调为特征的疾病或疾患的试剂盒。本发明采用的试剂盒可包括分离的vWF或其片段。备选地，或另外，试剂盒可包括表达vWF或其片段的转化细胞。在另一实施方案中，本发明试剂盒可包括编码vWF或其片段的多聚核苷酸。在更进一步实施方案中，本发明试剂盒可包括用于扩增vWF或其片段的特异引物。备选地，在进行针对gpIb或胶原蛋白的大分子筛选时，上述实施方案可分别采用gpIb、gpIa/IIa或胶原蛋白多肽或多聚核酸或其片段来取代vWF。试剂盒可含有一个以上的大分子(例如，vWF、gpIb或胶原蛋白大分子或多聚核酸或其片段)。本发明所采用的试剂盒可包括SEQID NOs：1到15、20到47或62到65任一个所示分离的多肽，其同源物，或其功能部分，或本发明的多肽构建体。本发明试剂盒可包括表达所述多肽的转化细胞。试剂盒可包含一种以上的多肽。在进一步实施方案中，本发明试剂盒可包括编码大分子，例如vWF、gpIb或胶原蛋白，或其片段的多聚核苷酸。在更进一步实施方案中，本发明试剂盒可包括用于扩增大分子，例如vWF、gpIb或胶原蛋白、或其片段的特异引物。根据本发明的所有试剂盒将含有所陈述的物品或者物品的组合和包装材料。试剂盒将还包括使用说明书。
医学装置
本发明还提供由本发明多肽构建体或根据本发明筛选方法所得试剂包被的侵入性医学装置，所述多肽构建体或试剂用于需要其的装置。非限制性装置实例包括外科导管、闭塞装置、假体装置(prosthetic devices)。上述装置的应用包括需要在侵入部位周围调节血小板介导的聚集的外科手术程序。
本发明一个实施方案是处理侵入性医学装置的方法，以防止在侵入部位周围的血小板介导的聚集，所述方法包括用本发明多肽构建体或试剂包被该装置的步骤。
本发明另一实施方案是防止侵入部位周围发生血小板介导的聚集的侵入性医学装置，其中所述装置包被有本发明多肽构建体或试剂。
实施例
通过下列非限制性实施例对本发明进行说明。
实施例图例
实施例1.免疫美洲驼002
实施例2.所有组成成分的克隆
实施例3.文库拯救，噬菌体制备
抑制与胶原蛋白相互作用的vWF结合物的筛选：
实施例4.抑制与胶原蛋白相互作用的vWF结合物的筛选，第一轮和第二轮淘洗
实施例5.vWF结合物通过VHH抑制vWF与胶原蛋白结合的功能特征
实施例6.VHH的表达及纯化
实施例7.vWF结合性ELISA
实施例8.VHHs的特异性
实施例9.纯化的VHH抑制ELISA
实施例10.克隆的测序
实施例11.表位作图
实施例12.二价和双特异性VHHs的表达及纯化
实施例13.在ELISA中结合vWF
实施例14.纯化的VHH抑制ELISA
实施例15.人类血浆中二价或双特异性构建体的稳定性
实施例16.在高切应力下评估VHH的抑制作用
抑制与血小板相互作用的vWF结合物的选择：
实施例17.抑制与血小板相互作用的vWF结合物的选择淘洗
实施例18.与vWF的A1结构域结合的筛选
实施例19.抑制与血小板相互作用的vWF结合物的选择：MATCHM
实施例20.纯化的VHH与vWF结合性ELISA
实施例21.纯化的VHH的抑制性ELISA
实施例22.克隆的测序
实施例23.评估高切应力条件下VHH的抑制作用
实施例24.二价VHH的表达和纯化
实施例25.评估高切应力条件下VHH的抑制作用
制备vWF-特异性VHH的双特异性构建体：
实施例26.双特异性构建体的构建及序列
实施例27.双特异性构建体的表达及纯化
实施例28.vWF结合试验
实施例29.通过双特异性构建体抑制vWF与胶原蛋白的结合，并与单价VHH的作用进行比较
实施例30.评估高切应力下VHH的抑制作用
筛选I型和III型胶原蛋白的结合物：
实施例31.I型胶原蛋白结合物的选择
实施例32.应用ELISA方法检测VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
实施例33.克隆的测序
实施例34.纯化VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
实施例35.抑制与vWF相互作用的I型胶原蛋白结合物的选择
实施例36.应用ELISA方法检测VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
实施例37.克隆的测序
实施例38.纯化的VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
实施例39.应用ELISA方法检测胶原蛋白-特异性VHH抑制vWF与胶原蛋白的结合
实施例40.检测低和高切应力下胶原蛋白-特异性VHH抑制血小板聚集
改良的VHH半衰期：
实施例41.免疫美洲驼(llamas)
实施例42.所有组成成分的克隆
实施例43.文库拯救，噬菌体制备
实施例44.噬菌体ELISA
实施例45.第一和第二轮生物淘洗的选择
实施例46.筛选生物淘洗后的单个克隆
实施例47.HinfI图谱及测序
实施例48.检测不同物种清蛋白的交叉反应性
实施例49.表达及纯化
实施例50.纯化的nanobodies在MSA上的ELISA
实施例51.双特异性构建体的构建及序列
实施例52.双特异性构建体的表达及纯化
实施例53.双特异性构建体中两种VHH的功能作用
实施例54.比较单价VHH及双特异性构建体抑制vWF与胶原蛋白的结合
抑制与vWF相互作用的gpIb结合物的选择：
实施例55.rgpIb结合物的选择
实施例56.应用ELISA筛选结合物
实施例57.纯化的VHH与rgpIb的结合
实施例58.克隆的测序
实施例59.检测gpIb特异性的VHH的抑制性能
实施例60.评估高切应力下VHH的抑制作用
应用VHH包被斯坦特印模、套管、气囊、导管和移植材料：
实施例61.VHH的稳定性
实施例62.VHH固定于聚合物上
C37的人源化：
实施例63.进行C37与DP-47的比对
实施例64.C37的诱变
抗VWF VHHs的片段
实施例65.vWF-C37的VHH-CDR3片段的表达
实施例66.通过第一和第二轮生物淘洗进行重组体A1(rA1)的选择
实施例67.生物淘洗后进行单个克隆的筛选
实施例68.HinfI图谱及测序
实施例69.抑制性ELISA
实施例
实施例1：免疫美洲驼002
应用vWF和I型和III型胶原蛋白混合物对一只美洲驼进行免疫。那些抗原均参与了第一次相互作用，导致血小板聚集(图1)。在表1中对免疫方案进行了简要介绍。
实施例2：所有组成成分的克隆
通过密度梯度离心方法(FicoII-Paque Plus Amersham Biosciences)分离外周血淋巴细胞(PBLs)。将PBLs用于提取总RNA(Chomczynski and Sacchi1987)。用100μg总RNA及MMLV逆转录酶(Gibco BRL)和寡聚d(T)寡核苷酸制备cDNA。应用苯酚/氯仿进行cDNA纯化，然后进行乙醇沉淀，随后用作扩增VHH所有组成成分的模板。
在首轮PCR反应中，用特异性先导引物(5’-GGCTGAGCTCGGTGGTCCTGGCT-3’)(SEQ ID NO：66)及寡聚d(T)引物(5’-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)(SEQ ID NO：67)扩增保守(1.6kb)及重链(1.3kb)抗体基因片段的所有组成成分。应用琼脂糖胶电泳分离所产生的DNA片段，从琼脂糖凝胶中纯化编码重链抗体片段的1.3kb片段。应用FRI反向引物及相同寡聚d(T)正向引物的混合物进行第二轮PCR反应。应用SfiI(加入FR1引物内)和BstEII(FR4中天然存在)消化PCR产物。进行凝胶电泳后，从凝胶中纯化长度约为400个碱基对的DNA片段，并连接到噬菌粒pAX004相应限制性酶切位点，电穿孔大肠杆菌TG1后获得VHHs克隆文库。文库大小为1.4×107cfu，且所有克隆均含有正确大小的插入片段。
实施例3：文库拯救，噬菌体制备
该文库在37℃、含有2％葡萄糖及100μg/ml氨苄青霉素的10ml 2×TY培养基中进行生长，直到OD600nm值达到0.5。加入M13KO7噬菌体(1012)，37℃条件下温育混合物2×30分钟，开始时不进行振荡，然后以100rpm振荡。室温下4500rpm离心细胞10分钟。将细菌沉淀重悬于含有100μg/ml氨苄青霉素及25μg/ml卡那霉素的50ml 2×TY培养基，37℃、250rpm剧烈振荡条件下温育过夜。过夜培养物在4℃下10000rpm离心15分钟。PEG(20％聚乙二醇和1.5M NaCl)沉淀噬菌体，10000rpm离心30分钟。用20ml PBS重悬沉淀物。再次进行噬菌体PEG沉淀，4℃，20000rpm离心30分钟。用5ml PBS-1％酪蛋白溶解沉淀物。通过感染OD600nm＝0.5的TG1细胞，将其接种于含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LB琼脂平板上，进行噬菌体滴定。转化体的数目表示噬菌体的数目(＝pfu)。用15％甘油-80℃保存噬菌体。
抑制与胶原蛋白相互作用的vWF结合物的选择(图2)
实施例4：抑制与胶原蛋白相互作用的vWF结合物选择：第一轮及第二轮淘洗
用2μg/ml vWF或含有1％酪蛋白的PBS包被微量滴定板上的孔。4℃温育过夜后，在室温条件下应用含有1％酪蛋白的PBS对孔封闭3小时。将200μl噬菌体加入孔中。室温温育2小时后，用PBS-吐温及PBS分别冲洗10次培养孔。用100μl浓度为100μg/ml的III型胶原蛋白进行噬菌体的特异性洗脱。在室温过夜条件下进行洗脱。将洗脱的噬菌体感染指数生长的TG1细胞，然后将其接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LB琼脂平皿上。如上在上述相同条件下，重复进行此实验进行第二轮淘洗。淘洗结果见表2。
实施例5：vWF结合物的功能表征：通过VHH抑制vWF与胶原蛋白的结合
用含25μg/ml III型胶原蛋白的PBS 4℃下包被微量滴定板过夜。应用PBS-吐温冲洗培养板5次，用含有1％酪蛋白的PBS室温下封闭2小时。PBS-吐温漂洗平板5次。将100μl浓度为2μg/ml的vWF(vWF于37℃预温育15分钟)与20μl含有VHH抗体(如实施例6所述)的胞质提取物混合，在微量滴定板培养孔中室温下温育90分钟。用PBS-吐温冲洗平板5次。用PBS将抗-vWF-HRP单克隆抗体(DAKO)稀释3,000-倍并温育1小时。用PBS-吐温冲洗平板5次，用ABTS/H2O2进行vWF-结合的检测。30分钟后405nm波长下进行信号的测定。结果见表3，显示经过第一轮和第二轮淘洗后获得的抑制剂。
实施例6：VHH的表达及纯化
制备抑制与III型胶原蛋白相互作用的vWF的结合物的质粒，转化到WK6电穿孔细胞。选取单个集落，用于起始在含有2％葡萄糖及100μg/ml氨苄青霉素的LB中培养过夜。过夜培养物用含有100μg/ml氨苄青霉素的300ml TB培养液稀释100倍，并在37℃条件下进行温育直到OD 600nm＝0.5。加入1mMIPTG，37℃温育培养物3个多小时或28℃过夜。
培养物于10000rpm 4℃离心20分钟。在-20℃条件下冰冻沉淀过夜或1小时。然后，室温下解冻沉淀40分钟，用20ml PBS再悬沉淀，冰上振荡1小时。通过4℃，20000rpm离心20分钟分离胞质级分。将含VHH的上清液上样到Ni-NTA进行纯化至同质。根据消光系数计算VHH产量。结果归纳于表4。
实施例7：ELISA：vWF结合试验
用2μg/ml vWF包被微量滴定板，4℃过夜。用300μl含有1％酪蛋白的PBS室温下封闭微量滴定板2小时。用PBS-吐温冲洗滴定板3次。所有纯化样品的系列稀释物在室温下温育2小时。用PBS-吐温冲洗滴定板6次，然后检测VHH结合，方法是与用PBS 1/2000稀释的小鼠抗-myc mAB室温温育1小时，再用PBS 1/1000稀释的抗小鼠-HRP结合物室温下再温育1小时。用底物ABTS/H2O2进行染色，30分钟后在405nm波长检测信号。作为纯化的VHH浓度的函数的结合力见图3所示。
实施例8：VHHs的特异性
用2μg/ml vWF和其它3种不参与血小板聚集但还在美洲驼002中免疫的抗原包被微量滴定板。根据实施例7所述方法采用670，67及6.7nM VHH进行ELISA试验。结果简要总结于表5。该结果显示VHH具有特异性抑制vWF的作用。
实施例9：应用纯化的VHH的抑制ELISA试验
根据实施例5所述方法进行抑制性ELISA试验，不同点是VHH浓度递减并采用1/60稀释的人类血浆替代纯化vWF或人类非稀释血浆。结果见图4。抑制50％(IC50)的VHH浓度见表6。
实施例10：克隆的测序
应用M13通用反向引物进行克隆测序。氨基酸序列见表30(SEQ ID号1、3、4、5、6和7)。
实施例11：表位作图
在pBAD-OprI-ss中克隆vWF的A3结构域
将pBAD-OprI-strep-spec载体用于在UT5600大肠杆菌细胞表面上展示作为与OprI的融合物的vWF A3结构域(F-ara-14 IeuB6 azi-6 lacY1 proC14tsx-67 entA403 trpE38 rfbD1 rpsL109 xyl-5 mtl-1 thil DompT fepC266)(Cote-Sierra等人，1998，Gene，221：25-34)。应用A3for及A3back PCR引物通过PCR反应扩增编码vWF A3结构域(201个氨基酸)的基因。
A3for：CTG GTG CTG CAG AGG TGA AGC TTC GGA GAG GGG CTGCAG ATC(SEQ ID NO：68)
A3back：ATC CAT GCA AAT CCT CTA GAA TCC AGA GCA CAG TTTGTG GAG(SEQ ID NO：69)
应用HindIII及Xbal消化片段及载体，将其连接并转化UT5600(＝pBAD-vWFA1/pBAD-vWFA3)。将转化细胞接种于含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB琼脂板上。
在UT5600F-细胞中转化pBAD-vWFA3质粒并接种含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板中。将单个集落接种于含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB培养基中。细胞在37℃200rpm条件下生长过夜。次日，应用0.2％阿拉伯糖进行细胞诱导，并在37℃150rpm条件下温育1个多小时。总细胞裂解液在还原性样品缓冲液中煮沸，上样于12％SDS-PAGE胶中，硝基纤维膜转膜进行Western印迹。转移的蛋白质应用抗-OprI单克隆抗体(SH2.2)(CoteSierra等人，1998，Gene，221：25-34)检测。采用缀合碱性磷酸酶的抗小鼠IgG(Sigma)，印迹采用BCIP/NBT进行显影(图5)。
将pBAD-vWFA3质粒转化UT5600F-细胞并接种于含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板中。将单个集落接种于含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB培养基中。细胞在37℃200rpm条件下生长过夜。次日，应用0.2％阿拉伯糖进行细胞诱导，并在37℃150rpm条件下温育1个多小时。应用PBS 1/1000稀释的抗-OprI单克隆抗体(SH2.2)4℃包被微量滴定板过夜，并在室温下用含有1％酪蛋白的PBS封闭2小时。诱导后，室温下使所有细胞与该滴定板结合1小时。用PBS-吐温冲洗滴定板5次。室温下使单个集落的噬菌体制品结合2小时。用PBS-吐温冲洗滴定板5次。抗M13-HRP缀合物用于检测结合表达A3结构域的大肠杆菌细胞或它们表面上无关抗原的噬菌体。应用PBS-吐温冲洗滴定板5次。采用ABTS/H2O2进行染色，30分钟后在405nm检测信号。结果归纳于表7。
实施例12：二价和双特异性VHH：表达及纯化
设计了大肠杆菌生成载体pAX11(图6)，其可以两步克隆二价或双特异性VHH。
应用PstI和BstEII首先克隆VHH羧基端，第二步通过SfiI和NotI插入其它VHH，其在第一基因片段中不切割。该程序避免了通过扩增所致新位点的产生，因此避免了插入性PCR错误的风险。序列见表30(SEQ ID号8、9、10、11和12)。
根据实施例6所述方法进行蛋白的表达和纯化。需要在superdex 75上进行额外的纯化步骤以去除某些单价降解产物(5-10％)。每升大肠杆菌中表达和纯化的二价蛋白的产量归纳于表8。
实施例13：vWF结合的ELISA检测
应用实施例7所述的方法在ELISA中进行vWF结合的检测，并与单价VHH的结合进行比较。结果见图7。结果明显显示二价和双特异性VHH与单价VHH相比显示对vWF的结合能力更强。
实施例14：纯化VHH的抑制性ELISA
根据实施例5中所述的方法，与二价VHHs相比，检测单价VHH对vWF与胶原蛋白结合的抑制。应用1/60稀释的人、狒狒和猪血浆替代纯化的vWF进行平行试验。IC50值归纳于表9。
实施例15：二价或双特异性构建体在人血浆中的稳定性
通过37℃条件下在人类血浆中温育来检测二价构建体的稳定性。将浓度为38μg/ml的AM-4-15-3/AM2-75在人类血浆中于37℃温育。温育后1、2、3、6和24小时移除样品。将样品稀释10倍，进行Western blot分析。结果归纳于图8，显示二价构建体在人类血浆中37℃下至少保持24小时的稳定性。
实施例16：评估高切应力条件下VHH的抑制作用
应用chromosulfuric acid(2％三氧化铬)溶液清洗玻璃盖玻片(18×18mm，Menzel)过夜，在喷洒前用蒸馏水冲洗。III型胶原蛋白单体溶于50mmol/L乙酸中，用retouching airbrush(Badger model 100，Badger Brush Go)以30μg/cm2的密度向玻璃盖玻片上进行喷洒。喷洒程序后，用含有1％人清蛋白的PBS(10mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4，和0.15mol/L NaCl)封闭该胶原蛋白表面1小时，以防止在后续灌注过程中结合非特异性蛋白质。在特殊设计的小型平行板灌注腔内进行III型胶原蛋白的灌注研究，该灌注腔具有很好设计的流变学特征，能容纳一张玻璃盖玻片。通过静脉穿刺方法获取志愿者全血。在Harvard输注泵(泵22，型号2400-004；哈佛大学，Natick，MA)的作用下血液流经灌注腔。灌注时间为5分钟。将三重盖玻片插入灌注腔内。5ml全血37℃预热5分钟，加入或不加VHH，然后在5分钟内使血液重新流过灌注腔，壁面切变率(wall shear rate)为300s-1或1600s-1。去除并冲洗盖玻片，0.05％戊二醛固定，甲醇脱水，May-Grünwald/Giemsa染色。通过连接到计算机图像分析仪(AMS 40-10，Saffron Walden，UK)的光学显未镜(放大倍数，1,000×)进行血小板粘附的定量分析。血小板粘附用表面血小板覆盖百分比表示。结果归纳于表10和表11。
抑制与血小板相互作用的vWF结合物的选择(图9)。
实施例17：抑制与血小板相互作用的vWF结合物的选择：淘洗
用2μg/ml vWF或含有1％酪蛋白的PBS包被免疫管。4℃温育过夜后，用含有1％酪蛋白的PBS室温封闭管3小时。将200μl噬菌体加入免疫管中，在PBS中终体积为2ml。室温温育2小时后，用PBS-吐温和PBS冲洗免疫管各10次。用2ml 0.2M pH＝2.4的甘氨酸缓冲液洗脱结合的噬菌体。在室温下洗脱20分钟。用洗脱噬菌体感染指数生长的TG1细胞，然后将细胞铺到含有100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LB琼脂平板中。淘洗结果见表12。
实施例18：与vWF的A1结构域结合的筛选
将pBAD-OprI-strep-spec载体用于在UT5600大肠杆菌细胞表面上展示作为与OprI融合物的vWF A1结构域(F-ara-14 IeuB6 azi-6 lacY1 proC14 tsx-67entA403 trpE38 rfbD1 rpsL109 xyl-5 mtl-1 thil DompT fepC266)(Cote-Sierra等人，1998，Gene，221：25-34)。应用A1for和A1back PCR引物通过PCR进行vWF A1结构域(219个氨基酸)编码基因的扩增。
A1for：CCG GTG AGC CCC ACC ACT CTA AGC TTG GAG GAC ATCTCG GAA CCG(SEQ ID NO：70)
A1back：CCC CAG GGT CGA AAC CCT CTA GAG CCC CGG GCC CACAGT GAG(SEQ ID NO：71)
应用HindIII和Xbal消化片段和载体，连接并转化UT5600(＝pBAD-vWFA1/pBAD-vWFA3)。将转化细胞铺到含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板中。
将pBAD-vWFA1质粒转化UT5600F-细胞，将其铺于含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB琼脂平板中。挑选单集落接种于含有20μg/ml链霉素、50μg/ml壮观霉素的LB培养基中。细胞在37℃、200rpm条件下生长过夜。次日，应用0.2％阿拉伯糖诱导细胞，37℃、150rpm温育1个多小时。将总细胞裂解物在还原性样品缓冲液中煮沸，上样于12％SDS-PAGE胶中，转移到硝基纤维膜，进行Western印迹。转移蛋白用抗-OprI单克隆抗体(SH2.2)(Cote-Sierra等人，1998，Gene，221：25-34)检测。施用缀合碱性磷酸酶的抗小鼠IgG(Sigma)，印迹用BCIP/NBTas显影，结果见图10。
根据实施例11所述方法进行ELISA试验。结果归纳于表13。
结果表明得到了vWF-A1结构域特异性VHH。
实施例19：抑制与血小板相互作用的vWF结合物的选择：MATCHM
表达vWF A1结构域的大肠杆菌细胞(实施例18)用于MATCHM试验：培养转化有pBAD-OprI-A1的UT5600细胞，并用0.2％阿拉伯糖进行诱导。冲洗细胞，在常温下将细胞与噬菌体一起温育1小时。用PBS-吐温冲洗混合物7次，用指数生长的TG1细胞洗脱噬菌体。我们进行了第一轮和第二轮筛选。结果归纳于表14。
实施例20：ELISA：纯化的VHH与vWF的结合
采用实施例6所述方法进行vWF A1结构域特异性VHH的表达和纯化。采用实施例7所述方法进行ELISA中与vWF的结合的检测。结果见图11。
实施例21：纯化的VHH的抑制ELISA
4℃条件下用在PBS中的5μg/ml血小板受体gpIb的特异抗体包被微量滴定板过夜。PBS-吐温冲洗滴定板5次，用300μl PBS-1％酪蛋白室温下封闭2小时。PBS-吐温冲洗滴定板3次。将浓度为1μg/ml的血小板受体gpIb(gpIb)施加到微量滴定板的孔中，室温结合2小时。PBS-吐温冲洗滴定板5次。加入递减浓度的VHH(A38(阴性对照)及A50(vWF A1结合物))。在37℃条件下预温1/128稀释的含vWF的血浆5分钟。加入终浓度为760μg/ml的利托菌素(Risto)并加至VHH。室温下将此混合物温育30分钟。然后将100μl该混合物加到微量滴定板孔中，并在室温下温育90分钟。PBS-吐温冲洗滴定板5次。在PBS中将抗vWF-HRP单克隆抗体稀释3000倍，温育1小时。用PBS-吐温冲洗滴定板5次，并用ABTS/H2O2检测vWF-结合。30分钟后在405nm波长检测信号。结果归纳于图12。
实施例22：克隆的测序
应用M13通用反向引物进行克隆测序。氨基酸序列见表30(SEQ ID号码：23、24、25、26、27、28、29、30和31)。
实施例23：评估高切应力条件下VHH的抑制作用
按照实施例16所述方法进行切应力实验。血小板粘附被表示为血小板覆盖表面的百分比。结果归纳于表15和表16。
实施例24：二价VHHs：表达及纯化
根据实施例12所述的方法构建二价分子。序列见表30(SEQ ID号码32、33和34)。
根据实施例6所述方法进行蛋白质的表达和纯化。需要在superdex 75上进行额外的纯化步骤以去除一些单价降解产物(5-10％)。
实施例25：评估高切应力条件下VHH的抑制作用
根据实施例16所述方法进行切应力实验。将血小板粘附表示为血小板覆盖的表面百分比。结果归纳于表17和表18。
制备vWF特异性VHH的双特异性构建体(图13)
实施例26：双特异性构建体的构建和序列
根据实施例12所述方法制备构建体，其中一个vWF特异性的VHH，抑制与胶原蛋白的相互作用，另一个VHH同样对vWF特异性但抑制与血小板受体gpIb相互作用：序列见表30(SEQ ID号码：20、21和22)。
实施例27：双特异性构建体的表达及纯化
根据实施例6所述方法表达和纯化蛋白质。需要在superdex 75上进行额外的纯化步骤以去除一些单价降解产物(5-10％)。每升大肠杆菌中双特异性蛋白质的表达及纯化产量归纳于表19。
实施例28：与vWF结合
根据实施例7所述方法在ELISA中检测与vWF的结合。结果见图14。
实施例29：与单价VHHs相比，双特异性构建体对vWF与胶原蛋白结合的抑制
根据实施例5所述方法，与双特异性构建体相比，检测单价构建体对vWF与胶原蛋白结合的抑制。IC50值归纳于表20。
实施例30：评估高切应力条件下VHH的抑制
根据实施例16所述方法进行切应力实验。将血小板粘附表示为覆盖血小板的表面积百分比。结果归纳于表21和22。
I型和III型胶原蛋白结合物的筛选(图15)
实施例31：I型胶原蛋白结合物的选择
应用25μg/ml I型胶原蛋白包被微量滴定板。根据实施例3所述方法制备噬菌体，使其与封闭的微量滴定板孔结合2小时。经过冲洗后，用pH＝4.5的0.1M甘氨酸缓冲液洗脱噬菌体。结果归纳于表23。
实施例32：在ELISA中检测VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
根据实施例7所述方法，但在用溶解于PBS中的25μg/ml的I型或III型胶原蛋白包被的孔中检测在ELISA中的结合克隆。结果归纳于表24。
实施例33：克隆的测序
应用M13通用反向引物进行克隆测序。氨基酸序列见表30(SEQ ID号码35、36和37)。
实施例34：纯化的VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
根据实施例6所述方法，表达和纯化VHH。用25μg/ml I型或III型胶原蛋白包被微量滴定板并将其封闭。2倍稀释结合物，根据实施例7所述方法检测结合。结果归纳于图16。
实施例35：抑制与vWF相互作用的I型胶原蛋白结合物的选择
用25μg/ml I型胶原蛋白包被微量滴定板。根据实施例3所述的方法制备噬菌体，使其与封闭的微量滴定板上的孔结合2小时。经过冲洗后，应用300μg/ml vWF洗脱噬菌体。采用同样方法进行第2轮和第3轮筛选。
实施例36：在ELISA中检测VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
根据实施例34所述方法在ELISA中检测克隆与I型和III型胶原蛋白的结合。
实施例37：克隆的测序
应用M13通用反向引物进行克隆的测序。
实施例38：纯化的VHH与I型和III型胶原蛋白的结合
根据实施例6所述方法表达和纯化VHH。用25μg/ml I型或III型胶原蛋白包被微量滴定板并进行封闭。2倍稀释结合物，根据实施例34所述方法进行结合的检测。
实施例39：在ELISA中检测胶原蛋白特异性VHH对vWF与胶原蛋白结合的抑制
根据实施例5所述方法检测抑制作用。
实施例40：检测低切应力及高切应力条件下胶原蛋白特异性VHH对血小板聚集的抑制
根据实施例16所述方法进行切应力实验。将血小板粘附表示为覆盖血小板的表面百分比。
改良的VHH半衰期
实施例41：免疫美洲驼
用人血清清蛋白(HSA)对一只美洲驼进行免疫。免疫方案归纳于表25。
实施例42：所有组成成分的克隆
根据实施例2所述方法制备文库。文库大小为2×107cfu，所有克隆均含有正确大小的插入片段。
实施例43：文库拯救，噬菌体制备
根据实施例3所述方法制备噬菌体。
实施例44：噬菌体ELISA
在4℃条件下，应用PBS-1％酪蛋白或5μg/ml HSA(人血清清蛋白)包被微量滴定板(Maxisorp)过夜。用PBS-吐温(0.05％吐温20)冲洗滴定板3次，并在室温条件下，用200μl PBS-1％酪蛋白封闭2小时。PBS-吐温冲洗滴定板5次。根据上述方法制备噬菌体，以连续2倍稀释浓度加到孔中。PBS-吐温冲洗滴定板5次。采用1/2000 PBS稀释的缀合辣根过氧化物酶(HRP)的小鼠抗M13单克隆抗体检测结合的噬菌体。PBS-吐温冲洗滴定板5次。用ABTS/H2O2进行染色，30分钟后在405nm波长检测信号。结果见图17，表明文库中存在HSA-特异性nanobody。
实施例45：筛选：第1轮和第2轮生物淘洗
应用10μg/ml小鼠血清清蛋白(MSA)或含有1％酪蛋白的PBS包被微量滴定板孔。4℃温育过夜后，用含1％酪蛋白的PBS室温封闭孔3小时。向孔中加入200μl噬菌体。室温下温育2小时后，将孔用PBS-吐温和PBS冲洗10次。用100μl 0.2M pH2.4的甘氨酸缓冲液洗脱已结合的噬菌体。室温条件下洗脱20分钟。将洗脱得到的噬菌体感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，然后将其铺于含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LB琼脂平板中。在上述相同条件下进行第2轮。结果归纳于表26。
实施例46：生物淘洗后单个克隆的筛选
ELISA：与人血清清蛋白(HSA)及小鼠血清清蛋白(MSA)的结合
根据实施例6所述的方法制备周质提取物。
用5μg/ml HSA、5μg/ml小鼠血清清蛋白(MSA)或PBS-1％酪蛋白包被微量滴定板4℃过夜。室温下用300μl PBS-1％酪蛋白封闭滴定板2小时。用PBS-吐温冲洗滴定板3次。经过第1轮和第2轮筛选后从23个单个克隆中制备周质级分，使其与滴定板孔结合。用PBS-吐温冲洗滴定板6次，然后检测nanobody的结合，方法是通过室温下与PBS稀释的小鼠抗组氨酸单克隆抗体Serotec MCA 1396(1/1000稀释)温育1小时后，再与PBS稀释的抗小鼠碱性磷酸酶缀合物(1/2000稀释)同样室温温育1小时。用底物PNPP(2mg/mlp-硝苯基磷酸盐溶于1M二乙醇胺、1mM Mg2SO4，pH9.8)进行染色，30分钟后在405nm波长检测信号。结果归纳于表27。
实施例47：HinfI图谱及测序
第2轮淘洗后，采用与载体序列结合的一套引物进行阳性克隆PCR反应。应用限制性酶HinfI酶切PCR产物，并上样于琼脂糖凝胶上。筛选4个具有不同HinfI图谱的克隆进行进一步评估。对那些克隆进行了测序，结果归纳于表30(SEQ ID号：16、17、18和19)。
实施例48：检测不同物种中与清蛋白的交叉反应性
对不同物种(狒狒、猪、仓鼠、人、大鼠、小鼠和兔)的血浆(1/10稀释)进行SDS-PAGE电泳，并印迹于硝基纤维膜上。如实施例3所述制备MSA21、MSA24、MSA210、MSA212克隆和非相关nanobody的噬菌体。使噬菌体与印迹有血清清蛋白的硝基纤维素膜结合，洗脱未结合噬菌体。应用偶联HRP的抗M13多克隆抗体检测结合。DAP用作检测底物。结果见图18。
由这些结果我们可以得出结论，所有4种结合物在猪、人、小鼠(对MSA212交叉反应较小)和仓鼠血清清蛋白间均具有交叉反应。MSA 21也与兔血清清蛋白具有交叉反应。非相关nanobody未发现结合(未显示)。
作为对照实验，对用PBS进行1/100稀释的不同血浆样品进行SDS-PAGE电泳。应用考马斯蓝染色凝胶。由图19我们可以得出结论：除兔血浆清蛋白的水平较低外，其它所有血浆样品中清蛋白水平均较高。
实施例49：表达及纯化
根据实施例6所述方法表达和纯化蛋白质。
实施例50：纯化的nanobodies在MSA上的ELISA
用5μg/ml MSA包被微量滴定板4℃过夜。冲洗后，用PBS-1％酪蛋白室温封闭滴定板2小时。成对加入样品，起始浓度为2500nM，以1/3稀释，使样品室温结合2小时。加入1/1000稀释的多克隆兔抗nanobody血清(K208)室温下1小时。用1/1000稀释的抗兔碱性磷酸酶缀合物进行检测，用PNPP染色。结果见图20。
实施例51：双特异性构建体的构建与序列
用对清蛋白特异性的第一VHH(MSA21)和对vWF特异性的第二VHH制备双特异性构建体(图21)。如实施例12所述方法制备构建体。序列见表30所示(SEQ ID号13、14和15)。
实施例52：双特异性构建体的表达与纯化
根据实施例6所述方法表达和纯化蛋白质。需要在superdex75上进行额外的纯化步骤以去除一些单价降解产物(5-10％)。
实施例53：双特异性构建体中两种VHH的功能性
用5μg/ml小鼠血清清蛋白4℃包被微量滴定板过夜。冲洗滴定板后，用PBS-1％酪蛋白封闭滴定板孔2小时。使双特异性蛋白与滴定板孔在室温下结合2小时。冲洗后，加入不同稀释度的人、狗和猪血浆，使其在室温下结合2小时。用1/3000稀释的来自DAKO的抗vWF-HRP检测vWF的结合。用ABTS/H2O2染色。结果如图22所示，表明双特异性构建体保留了两种VHH的功能性。
实施例54：与单价VHHs相比，双特异性构建体对vWF与胶原蛋白结合的抑制
根据实施例5所述方法，与双特异性构建体相比，检测单价VHH对vWF与胶原蛋白结合的抑制。IC50值归纳于表28。结果表明双特异性构建体保留了VHH的抑制特性。
抑制与vWF相互作用的gpIb结合物的选择(图23)
根据实施例1、2和3所述方法进行免疫、所有组成成分的克隆和噬菌体制备。
实施例55：rgpIb结合物的选择
用抗rgpIb的小鼠mAb包被微滴定板。封闭该板，使5μg/ml rgpIb室温下结合2小时。冲洗该板。如上所述制备噬菌体并使其与微滴定板孔结合。冲洗后，用0.1M pH4.5甘氨酸缓冲液洗脱噬菌体。同样方式进行第二轮淘洗。
实施例56：在ELISA中筛选结合物
根据实施例6所述方法制备胞质提取物。
如实施例55所述，将上清加到包被有mAb和随后的gpIb的滴定板孔内。系列稀释的所有纯化样品在室温下温育2小时。用PBS-吐温冲洗6次滴定板，然后检测VHH的结合，方法是与在PBS中1/2000稀释的小鼠抗His-HRP mAB室温温育1小时后用底物ABTS/H2O2染色。30分钟后在405nm检测信号。
实施例57：纯化的VHH与rgpIb的结合
如实施例6所述方法制备胞质级分。将含VHH的上清加到Ni-NTA上以纯化成均质。VHH产量根据消光系数计算。根据实施例55所述方法进行ELISA。
实施例58：克隆的测序
应用M13通用反向引物进行克隆测序。
实施例59：检测gpIb特异性VHH的抑制性能
如实施例21所述方法，在ELISA中检测VHHs的抑制功能。
实施例60：评估高切应力下VHH的抑制作用
根据实施例16所述方法进行切应力实验。将血小板粘附表示为覆盖血小板的表面的百分比。
应用VHH包被斯坦特印模、套管、气囊、导管和移植材料：
实施例61：VHH的稳定性
VHH C37在37℃温育，如实施例7所述通过ELISA测量不同时间点其对vWF与胶原蛋白结合的抑制作用。结果与储存于-20℃的VHH进行比较，见图24。进行比较的是抗B3抗原的scFv的活性(Reiter等人，Protein Engineering，1994，7：697-704)，该scFv发生了修饰，在框架残基44和105之间插入了一个二硫键以增加其稳定性(dsFv)。37℃温育60小时后dsFv损失了其40％活性。37℃温育1年后，分析C37抑制性能并与储存于冷藏机中的C37进行比较。根据实施例5所述方法，用1/200最终稀释的人血浆进行ELISA。结果见图25所示，表明该功能性得以完全保留(储存在37℃和-20℃的C37的IC50值分别是0.085和0.1μg/ml)。因此预计VHH具有长的半衰期。
实施例62：VHH固定于聚合物上
制备0.5ml 30％丙烯酰胺；1ml 1M Tris pH＝7.5；3.5ml H2O；35μl 10％APS；3.5μl TEMED的混合物。在一些孔中，加入VHH C37，终浓度为10μg/ml。使混合物在96孔板内室温聚合3小时。加入不同稀释度的人血浆，起始浓度为未稀释的血浆。室温温育1小时，冲洗该板，加入1/2000稀释的抗vWF-HRP(DAKO)，室温温育1小时。冲洗该板后，加入底物(ABTS/H2O2)并在OD405nm处检测。结果见图26所示。结果表明固定在聚合物上的VHH保留功能性。
C37人源化：
实施例63：进行C37与DP-47的比对
比较C37nanobody(SEQ ID 1号)和人VH3种系(DP-47)发现二者高度同源：
οFR1中1、5、28和30位4个氨基酸改变
οFR3中74、75、84和94位4个氨基酸改变
οFR4中104、108和111位3个氨基酸改变
见图27所示。
实施例64：C37的诱变
根据Chen和Ruffner所述(Chen和Ruffner，Amplification of closed circularDNA in vitro，Nucleic Acids Research，1998，1126-1127)和由Stratagene所商业化的(Quickchange site-directed mutagenesis)，应用不是以PCR为基础的定点诱变方法对C37进行突变。
用质粒DNA作为模板，用两个突变引物(表29)引入所需突变。两引物每个与模板质粒DNA的相反链互补。在应用pfu DNA多聚酶进行的聚合酶反应中，每一链在循环过程中通过有限数量的循环从引物序列延伸。产生野生链和突变链的混合物。用DpnI酶切来筛选体外合成的突变DNA。沉淀DNA，使之转化大肠杆菌，通过序列分析来分析所需突变。将正确序列的克隆命名为C37-hum，氨基酸序列见表30SEQ ID2号。
根据实施例6所述方法表达和纯化C37-hum。如实施例5所述，比较C37和C37-hum对vWF和胶原蛋白结合的抑制作用。结果见图28。其清晰表明人源化的C37完全保留功能。
需要人源化的位点是：Q1、Q5、D104、Q108和I 111。我们可以对1和5位进行人源化而无损其抑制功能，因为这些氨基酸通过FR1引物引入，而不存在于天然美洲驼序列中。我们也可人源化111位，因为我们分离出了除1111V外与C37等同的VHH(AM-2-75 SEQ ID 3号)，仍具有同样的功能(实施例9和表6)。
108位在Camelid VHH中是溶剂暴露的，但在人类抗体中该位点隐藏于VH-VL界面(Spinelli，1996；Nieba，1997)。在分离的VH中，108位是溶剂暴露的。引入非极性疏水Leu而不是极性不带电Gln对分子固有的可折叠性/稳定性有重大影响。
抗VWF VHHs的片段
实施例65：vWF-C37的VHH-CDR3片段的表达
通过使用位于框架4区中的正义引物(正向：CCCCTGGTCCCAGTTCCCTC)(SEQ ID NO：72)和位于框架3区中的反义引物(反向：TGTGCTCGCGGGGCCGGTAC)(SEQ ID NO：73)对C37的CDR3区进行扩增。
为了将CDR3片段克隆到pAX10中，用以下引入所需限制位点的引物进行第二轮PCR扩增：
反向引物Sfi1：
GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCTGTGCTCGCGGGGCCGGTAC(SEQ ID NO：74)
正向引物Not1：
GTCCTCGCAACTGCGCGGCCGCCCCCTGGTCCCAGTTCCCTC(SEQID NO：75)
用50pmol每种引物在50ml反应体积中进行PCR反应。初级PCR反应条件为94℃11分钟，然后是在94/55/72℃30/60/120秒，循环30次，最后是72℃5分钟。所有反应体系含2.5mM MgCl2，200mM dNTP和1.25U AmpliTaqGod DNA多聚酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)。
用Sfi1和Not1切开后将PCR产物克隆到pAX10中。
构象特异性抗vWF VHHs的分离
实施例66：通过第一和第二轮生物淘洗进行重组体A1(rA1)的选择
用5μg/ml重组vWF A1结构域(rA1)或含1％酪蛋白的PBS包被微量滴定板的孔。4℃温育过夜后，用含1％酪蛋白的PBS室温封闭滴定板孔3小时。将200μl噬菌体加到滴定板孔内。室温温育2小时后，滴定板孔用PBS-吐温和PBS各冲洗10次。用100μl 0.2M pH2.4甘氨酸缓冲液洗脱已结合的噬菌体。室温条件下洗脱20分钟。将洗脱得到的噬菌体感染指数生长的大肠杆菌TG1细胞，然后将其铺于含100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的LB琼脂平板中。如上所述在相同条件下进行第2轮，但将噬菌体重悬于10μg/mlvWF。用10μg/ml vWF冲洗滴定板孔7次，时间30分钟。结果归纳于表31。
实施例67：生物淘洗后进行单个克隆的筛选
ELISA：与rA1和vWF结合
将单个集落用于起始在含2％葡萄糖和100μg/ml氨卞青霉素的LB中培养过夜。过夜培养物用含100μg/ml氨卞青霉素的TB培养基稀释100倍，在37℃条件下进行温育直到OD 600nm＝0.5。加入1mM IPTG，培养物37℃温育3个多小时或28℃过夜。将培养物于10,000rpm 4℃离心20分钟。沉淀冰冻过夜或在-20℃条件下放置1小时。然后，室温下解冻沉淀40分钟，用PBS再悬沉淀，冰上振荡1小时。通过在4℃20,000rpm离心20分钟分离胞质级分。用含VHH的上清液作进一步分析。
用2μg/ml rA1或1μg/ml vWF包被微量滴定板，4℃过夜。用300μl含有1％酪蛋白的PBS室温下封闭微量滴定板2小时。PBS-吐温冲洗滴定板3次。经过第二轮筛选后，对于192个独立克隆制备胞质级分，使之与滴定板孔结合。用PBS-吐温冲洗滴定板6次，然后检测nanobody的结合，方法是与PBS中的兔多克隆抗-nanobody抗体(1/2000稀释)室温温育1小时，再用PBS中1/2000稀释的山羊抗兔-HRP缀合物室温下温育1小时。用底物ABTS/H2O2进行染色，30分钟后在405nm检测信号。结果归纳于表32。我们得出结论：50个克隆与rA1而非vWF结合。
实施例68：HinfI图谱及测序
第二轮淘洗后，用一套结合载体序列的引物对rA1阳性克隆和vWF阴性克隆进行PCR。PCR产物用限制性酶HinfI酶切，上样于琼脂糖凝胶。选择30个具有不同HinfI图谱的克隆作进一步评估。那些克隆用实施例67所述ELISA进行更细致的检测。30个克隆中有4个显示明显对于rA1比对于vWF更高的亲和力。该数据见图29(结合rA1)和30(结合vWF)所示。对这些克隆进行测序，结果归纳于表30(SEQ ID 62到65号)。
实施例69：抑制性ELISA
通过ELISA确定nanobody对vWF与gpIb结合的抑制作用。用5μg/ml在PBS中的对血小板受体gpIb特异性抗体4℃过夜包被滴定板。PBS-吐温冲洗滴定板5次，用300μl PBS-1％酪蛋白室温下封闭2小时。PBS-吐温冲洗滴定板3次。将1/2稀释的血浆加到滴定板孔内，使之在37℃结合1.5小时。PBS-吐温冲洗滴定板5次。加入递减浓度的VHH。含vWF的血浆以1/50稀释，在37℃预温5分钟。将终浓度为1mg/ml的利托菌素加到VHH中。在37℃温育该混合物1小时。然后将50μl该混合物加到滴定板孔内，37℃温育90分钟。PBS-吐温冲洗滴定板5次。将抗vWF-HRP单克隆抗体用PBS稀释3000倍，温育1小时。PBS-吐温冲洗滴定板5次，用ABTS/H2O2检测vWF的结合。30分钟后在405nm测量信号。
图
图1.参与血小板聚集的第一步骤的相互作用。
图2.参与血小板聚集的第一步骤的相互作用。VHH被表示抑制vWF与胶原蛋白之间的相互作用。
图3.如实施例7所述用纯化的VHH，通过ELISA确定与vWF的结合。
图4.如实施例9所述用ELISA检测VHH对vWF与胶原蛋白结合的抑制作用。
图5.如实施例11所述，Western印迹显示vWF A3结构域作为与OprI的融合物表达于大肠杆菌表面。
图6.用于构建二价或双特异性nanobody的PAX011多克隆位点的限制性图谱。
图7.如实施例13所述，ELISA中单价相对二价和双特异性VHH与纯化vWF的结合状况。
图8.如实施例15所述，双特异性VHH在人血浆中37℃温育高达24小的稳定性。
图9.参与血小板聚集的第一步骤的相互作用。VHH被表示抑制vWF与血小板之间的相互作用。
图10.如实施例18所述，Western印迹显示vWF A1结构域与OprI作为融合物表达于大肠杆菌表面。
图11.如实施例20所述，用纯化的VHH，通过ELISA确定与vWF的结合状况。
图12.实施例21所述，A50和A38(阴性对照)对gpIb与vWF结合的抑制作用。
图13.参与血小板聚集的第一步骤的相互作用。双特异性构建体中的一个VHH为vWF特异性并抑制vWF与胶原蛋白之间的相互作用，另一个VHH为vWF特异性但抑制vWF与血小板之间的相互。
图14.如实施例28所述，在ELISA中对vWF的结合。
图15.参与血小板聚集的第一步骤的相互作用。VHH被表示为胶原蛋白特异性，抑制vWF与胶原蛋白之间的相互作用。
图16.如实施例34所述，在ELISA中纯化的VHH与I型和III型胶原蛋白结合状况。
图17.如实施例44所述，表明文库中存在HSA特异性nanobody的噬菌体ELISA。
图18.如实施例48所述，表达清蛋白结合物的噬菌体与印迹到硝酸纤维素膜上的血浆的结合状况。
图19.如实施例48所述，SDS-PAGE上血浆样品的考马斯染色。
图20.如实施例50所述，通过ELISA确定纯化的nanobody与小鼠清蛋白结合状况。
图21.如实施例51所述，用于改善半衰期的双特异性构建体，所述双特异抗体的一个VHH结合清蛋白，第二个VHH结合vWF。
图22.如实施例53所述，三明治ELISA表明双特异性构建体中两种VHH的功能性。
图23.参与血小板聚集的第一步骤的相互作用。将VHH表示为gpIb特异性并抑制vWF与血小板之间的相互作用。
图24.储存于-20℃的C37与37℃温育高达194小时的C37残留活性的比较。如实施例61所述，C37稳定性与B3抗原特异性scFv的稳定性和稳定形式dsFv(通过2个二硫键稳定)的稳定性比较。
图25.如实施例61所述，储存于-20℃的C37与在37℃温育一年的C37抑制活性比较。
图26.如实施例62所述，人血浆vWF与固定于丙烯酰胺上的C37结合状况。
图27.如实施例63所述，C37与人种系序列DP-47氨基酸比对。
图28.如实施例64所述，通过ELISA确定C37和C37-hum对vWF与胶原蛋白结合的抑制作用。
图29.ELISA测量的A11、A12、A13、A14、A15和A16克隆与rA1结合状况。
图30.ELISA测量的A11、A12、A13、A14、A15和A16克隆与vWF结合状况。
表
表1.根据实施例1免疫美洲驼002的方案。
表2.如实施例4所述，与PBS-酪蛋白相比，一或两轮淘洗后vWF蚀斑形成单位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特异性结合)＝丰度。
表3.如实施例5所述，一或两轮淘洗后抑制剂数目与检测克隆数目比值。
表4.如实施例6所述，生长于WK6大肠杆菌细胞的VHH表达和纯化后的产量(mg/升培养物)。
表5.依照实施例8，ELISA中VHH与vWF和美洲驼002免疫的3种抗原结合的OD405nm值。
表6.如实施例9所述，抑制vWF与胶原蛋白结合达50％(IC50)所需的VHH的浓度(nM)。
表7.如实施例11所述，结合vWF并抑制其与胶原蛋白相互作用的VHH表位作图。
表8.如实施例12所述，每升培养物中二价和双特异性VHHs纯化蛋白产量(mg)。
表9.单价与二价和双特异性VHHs的IC50值比较。如实施例14所述，用人、猪和狒狒血浆检测抑制状况。
表10.如实施例16所述，高切应力状态下(1600s-1)血小板聚集的抑制状况。
表11.如实施例16所述，低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况。
表12.如实施例17所述，经过一轮淘洗后vWF蚀斑形成单位(pfu)。PfuvWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特异性结合)＝丰度。
表13.如实施例18所述，结合vWF和vWF A1结构域的单个克隆的ELISA筛选结果。
表14.如实施例19所述，一轮MATCHM后pBAD-OprI-A1细胞上的结果。
表15.如实施例23所述，高切应力状态下(1600s-1)血小板聚集的抑制状况。
表16.如实施例23所述，低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况。
表17.如实施例25所述，高切应力状态下(1600s-1)血小板聚集的抑制状况。
表18.如实施例25所述，低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况。
表19.如实施例27所述，双特异性构建体表达和纯化后的产量。
表20.如实施例29所述，vWF A1和A3结构域的双特异性nanobody的IC50值。
表21.如实施例30所述，高切应力状态下(1600s-1)血小板聚集的抑制状况。
表22.如实施例30所述，低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况。
表23.如实施例31所述，经过一轮淘洗后I型胶原蛋白蚀斑形成单位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特异性结合)＝丰度。
表24.如实施例32所述，经过一轮选择后结合I型和III型胶原蛋白的克隆数。
表25.根据实施例41人血清清蛋白免疫方案。
表26.如实施例45所述，经过一轮和二轮淘洗后小鼠血清清蛋白的结果。
表27.经过一轮和二轮筛选后选择克隆并制备周质提取物。如实施例46所述，在ELISA中分析这些克隆与人和小鼠清蛋白结合状况。
表28.如实施例54所述，抗清蛋白和抗vWF的双特异性nanobody的IC50值。
表29.如实施例64所述用于C37人源化的引物序列。
表30.本发明肽和人冯维勒布兰德因子(vWF)的氨基酸序列表。人vWF序列分别用粗体字母表示A1和A3结构域。
表31.如实施例66所述，经过两轮淘洗后对vWF rA1结构域的结果。
表32.如实施例67所述，所选克隆与rA1和vWF结合的ELISA分析。
表1：依照实施例1美洲驼002免疫接种方案
 美洲驼002免疫天数   vWF   I型胶原蛋白  III型胶原蛋白
  0   100μg   100μg   100μg
  7   100μg   100μg   100μg
  14   50μg   50μg   50μg
  21   50μg   50μg   50μg
  28   50μg   50μg   50μg
  35   50μg   50μg   50μg
表2：如实施例4所述，与PBS-酪蛋白相比，一或两轮淘洗后vWF蚀斑形成单位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特异性结合)＝丰度。
 轮   Pfu vWF   Pfu酪蛋白   丰度
 第1轮   1×10<sup>7</sup>   2.5×10<sup>5</sup>   40
 第2轮   5×10<sup>8</sup>   2.5×10<sup>6</sup>   200
表3：如实施例5所述，经过第1轮和第2轮淘洗后，抑制剂数目与检测克隆数目比值。
 轮   抑制剂数目/检测克隆数目
 第1轮   4/800
 第2轮   4/96
表4：如实施例6所述，生长于WK6大肠杆菌细胞的VHH表达和纯化后的产量(mg/升培养物)。
  VHH名称   产量(mg/升培养液)
  22-2L-34   1.4
  T76   2.9
  AM-4-15-3   2.2
  22-4L-16   2.8
  C37   3.8
  AM-2-75   3.6
表5：依照实施例8，ELISA中VHH与vWF和美洲驼002免疫的3种抗原结合的OD405nm值。
Figure C20048000209000771
表6：如实施例9所述，抑制vWF与胶原蛋白结合达50％(IC50)所需的VHH的浓度(nM)。
  VHH名称   IC50(nM)人血浆1/60   IC50(nM)未稀释的人血浆
  22-2L-34   10   -
  T76   30   -
  AM-4-15-3   7   200
  22-4L-16   4   1000
  C37 3   -
  AM-2-75   2   100
表7：如实施例11所述，结合vWF并抑制其与胶原蛋白相互作用的VHH表位作图
  VHH名称   与vWF A3结构域结合
  22-2L-34   是
  T76   否
  22-4L-16 否
  C37 是
  AM-2-75 是
表8：如实施例12所述，每升培养物中二价和双特异性VHHs纯化蛋白的产量(mg)
  VHH NH2端   VHH COOH端   产量mg/升培养物
  AM-2-75   AM-4-15-3   3.2
  AM-4-15-3   AM-4-15-3   2.3
  AM-4-15-3   AM-2-75   4.0
  AM-2-75   AM-2-75   1.0
  AM-2-75   22-4L-16   3.0
表9：与二价和双特异性VHHs相比，单价VHH的IC50值。如实施例14所述，用人、猪和狒狒血浆检测抑制状况。
  第一个VHH   第二个VHH   IC50(ng/ml)人血浆   IC50(ng/ml)狒狒血浆   IC50(ng/ml)猪血浆
  AM-2-75   150   400   50
  AM-4-15-3   50   200   40
  22-4L-16   15   70   7
  AM-2-75   AM-4-15-3 3   5   6
  AM-4-15-3   AM-2-75   2   8 3
  AM-4-15-3   AM-4-15-3   5   10   7
  AM-2-75   22-4L-16   8   20   10
  AM-2-75   AM-2-75 5
表10如实施例16所述，高切应力状态下(1600s-1)下血小板聚集的抑制状况
浓度[μg/ml]   ％抑制率
  AM-2-75   0.2   0
  AM-2-75   0.3   12
  AM-2-75   0.4   56
  AM-2-75   0.6   97
  AM-2-75   0.8   96
  AM-4-15-3   0.05   0
  AM-4-15-3   0.1   75
  AM-4-15-3   0.25   74
  AM-4-15-3   0.5   86
  AM-4-15-3   1   91
  22-4L-16   0.1   32
  22-4L-16   0.5   54
  22-4L-16   0.75   86
  22-4L-16   2   97
  22-4L-16   10   99
  AM-4-15-3/AM-4-15-3   0.05   0
  AM-4-15-3/AM-4-15-3   0.075   23
  AM-4-15-3/AM-4-15-3   0.1   37
  AM-4-15-3/AM-4-15-3   0.15   56
  AM-4-15-3/AM-4-15-3   0.2   98
  AM-4-15-3/AM-4-15-3   1.9   100
  AM-4-15-3/AM-2-75   1.9   100
  AM-2-75/AM-4-15-3   0.05   2
  AM-2-75/AM-4-15-3   0.1   36
  AM-2-75/AM-4-15-3   0.2   96
  AM-2-75/AM-4-15-3   0.35   91
  AM-2-75/AM-4-15-3   0.4   98
  AM-2-75/AM-2-75   0.04   5
  AM-2-75/AM-2-75   0.1   26
  AM-2-75/AM-2-75   0.2   52
  AM-2-75/AM-2-75   0.3   80
  AM-2-75/AM-2-75   0.4   99
  AM-2-75/AM-2-75   0.83   100
  AM-2-75/22-4L-16   1.17   99
表11：如实施例16所述，在低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况
  浓度[μg/ml]   ％抑制
  AM-2-75   10   20
  AM-4-15-3   10   17
  22-4L-16   10   22
  AM-4-15-3/AM-4-15-3   10   23
  AM-4-15-3/AM-2-75   10   21
  AM-2-75/AM-4-15-3   10   18
  AM-2-75/AM-2-75   2   32
  AM-2-75/22-4L-16   10   13
表12：如实施例17所述，经过一轮淘洗vWF的蚀斑形成单位(pfu)。Pfu vWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特异性结合)＝丰度
  Pfu vWF   Pfu酪蛋白   丰度
  1.5×10<sup>7</sup>   1×10<sup>4</sup>   1.500
表13：如实施例18所述，在ELISA中筛选个体克隆结合vWF和vWF A1结构域的结果。
  No.克隆+ve for vWF/检测克隆数   No.克隆+ve for A1/检测克隆数
  344/380   5/570
表14：如实施例19所述，一轮MATCHM后pBAD-OprI-A1细胞的结果
  轮   No.克隆+ve for vWF/检测克隆数   No.克隆+ve for A1/检测克隆数
  第一轮   1/96
  第二轮   45/348   12/348
表15：如实施例23所述，在高切应力状态下(1600s-1)血小板聚集的抑制状况
  浓度[μg/ml]   ％抑制
  2A1-4L-129   13.5   26
  2A1-4L-129   20   50
  2L-A1-15   9.7   30
  2L-A1-15   25   45
  A50   10.2   20
  2A1-4L-79   11.1   20
  2A1-4L-34   11.1   3
  Z29   10.6   0
  I53   9.7   0
  M53   10.6   0
表16：如实施例23所述，在低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况
  浓度[μg/ml]   ％抑制率
  2A1-4L-129   10   0
  2L-A1-15   10 3
  A50   25   0
  2A1-4L-79   25   15
表17：如实施例25所述，在高切应力状态下(1600s-1)血小板聚集的抑制状况
  浓度[μg/ml]   ％抑制
  2A1-4L-79/2A1-4L-79   25   54
  2LA1-15/2LA1-15   25   45
表18：如实施例25所述，在低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况
  浓度[μg/ml]   ％抑制
  2A1-4L-79/2A1-4L-79   25   0
  2LA1-15/2LA1-15   25   23
表19：如实施例27所述，双特异性构建体表达和纯化后的产量
  VHH NH2端   VHH COOH端   产量mg/升培养物
  2A1-4L-79   AM-4-15-3   7.5
  2A1-4L-79   AM-2-75   2
  2A1-4L-79   22-4L-16   2.5
表20：如实施例29所述，vWF A1和A3结构域的双特异性nanobody的IC50值
  VHH NH2端   VHH COOH端   IC50(ng/ml)
  2A1-4L-79   AM-4-15-3   10
  AM-4-15-3   -   45
  2A1-4L-79   AM-2-75   12
  AM-2-75   -   40
  2A1-4L-79   22-4L-16   10
  22-4L-16   -   10
  2A1-4L-79   -   ＞10000
表21：如实施例30所述，在高切应力状态下(1600s-1)血小板聚集的抑制状况
  浓度[μg/ml]   ％抑制
  2A1-4L-79/AM-4-15-3   12   100
  2A1-4L-79/AM-2-75   0.02   0
  2A1-4L-79/AM-2-75   0.1   28
  2A1-4L-79/AM-2-75   0.5   79
  2A1-4L-79/AM-2-75   1   95
  2A1-4L-79/22-4L-16   12   96
表22：如实施例30所述，在低切应力状态下(300s-1)血小板聚集的抑制状况
  浓度[μg/ml]   ％抑制
  2A1-4L-79/AM-4-15-3   10   15
  2A1-4L-79/AM-2-75   10   25
  2A1-4L-79/22-4L-16   10   27
表23：如实施例31所述，经一轮淘洗I型胶原蛋白的蚀斑形成单位(pfu)。PfuvWF(抗原)除以pfu酪蛋白(特异性结合)＝丰度
 从I型胶原蛋白洗脱的噬菌体   5×10<sup>6</sup>
 从酪蛋白洗脱的噬菌体   4×10<sup>4</sup>
 丰度   100
表24：如实施例32所述，经过一轮选择结合I型和III型胶原蛋白的克隆数
  I型胶原蛋白   15/32
  III型胶原蛋白   7/32
  酪蛋白   0/32
表25：根据实施例41人血清清蛋白的免疫方案
  免疫天数  HSA美洲驼006
  0  100μg
  7  100μg
  14  50μg
  21  50μg
  28  50μg
  35  50μg
表26：如实施例45所述，经过一轮和二轮淘洗后小鼠血清清蛋白上的结果
  第一轮   第二轮
 pfu小鼠血清清蛋白   2.5×10<sup>7</sup>   2.5×10<sup>7</sup>
 pfu酪蛋白   5×10<sup>3</sup>   2.5×10<sup>3</sup>
 丰度   5.000   10.000
表27：经过一轮和二轮筛选后选择克隆并制备周质提取物。如实施例46所述，在ELISA中分析这些克隆与人和小鼠清蛋白结合状况
  第一轮   第二轮
  ELISA小鼠血清清蛋白   1/16   15/16
  ELISA小鼠血清清蛋白   1/16   15/16
  ELISA酪蛋白   0/16   0/16
表28：如实施例54所述针对清蛋白和针对vWF的双特异nanobides的IC50值
  IC50(ng/ml)
  AM-2-75   100
  MSA21/AM-2-75   60
  AM-4-15-3   155
  MSA21/AM-4-15-3   245
  22-4L-16   100
  MSA21/22-4L-16   140
表29：如实施例64所述，用于人源化C37的引物序列
  突变   模板   引物序列
  A74S+N75K+P84A   Wildtype   5′-AGA GAC AAC TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAAATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG-3′(SEQ ID No 76)Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr(SEQ ID No 77)
  A74S+N75K+P84A+R94K   A74S+N75K+P84A   5′-AT TAC TGT GCT AAA GGG GCC GGT ACT AGT T-3′(SEQ ID No 78)Tyr Cys Ala Lys Gly Ala Gly Thr Ser(SEQ ID No 79)
  N28T+N30SA74S+N75K+P84A+R94K   A74S+N75K+P84A+R94K   5′-TCC TGT GCA GCC TCC GGA TTC ACT TTC AGT TGGTA-3′(SEQ ID No 80)Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp(SEQ ID No 81)
表30：本发明的肽和人冯维勒布兰德因子(vWF)的氨基酸序列表。
人vWF的序列    分别以黑体字母表示A1和A3结构域
Figure C20048000209000891
Figure C20048000209000911
Figure C20048000209000931
Figure C20048000209000941
Figure C20048000209000961
表31：如实施例66所述经过两轮淘洗vWF rA1上的结果。
  第一文库   第二文库   第三文库
  Pfu rA1   1×10<sup>8</sup>   2×10<sup>7</sup>   4×10<sup>9</sup>
  Pfu酪蛋白   2×10<sup>4</sup>   2×10<sup>4</sup>   2×10<sup>4</sup>
  丰度   5.000   1.000   200.000
表32：如实施例67所述所选克隆与rA1和vWF结合的ELISA分析。
  第一文库   第二文库   第三文库
  ELISA rA1   54/64   51/64   49/64
  ELISA vWF   36/64   35/64   33/64
序列表
<110>埃博灵克斯股份有限公司
<120>治疗性多肽，其同源物，其片段和其用于调节血小板介导的聚集
<130>ABL-005-PCT3
<140>PCT/BE2004/000002
<141>2004-01-09
<150>EP 03447005.4
<151>2003-01-10
<150>PCT/EP03/06581
<151>2003-06-23
<150>PCT/EP03/07313
<151>2003-07-08
<150>PCT/BE03/00193
<151>2003-11-07
<150>PCT/BE03/00189
<151>2003-11-07
<150>PCT/BE03/00190
<151>2003-11-07
<150>PCT/BE03/00192
<151>2003-11-07
<150>PCT/BE03/00194
<151>2003-11-07
<150>PCT/BE03/00206
<151>2003-12-01
<150>PCT/BE03/00191
<151>2003-12-02
<160>85
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
        115                 120
<210>2
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Lys Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
        115                 120
<210>3
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>4
<211>126
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>4
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser ValArg Ile Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Asn Arg Ser Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
    50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Asp Tyr Ser Gly Ser Tyr Thr Ser Leu Trp Ser Arg Pro Glu
            100                 105                 110
Arg Leu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Phe Ser
        115                 120                 125
<210>5
<211>124
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Ala Asp Thr Gly Gly Ile Ser Trp Ile Arg Thr Gln Gly Tyr Asn
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>6
<211>117
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
            20                  25                  30
Thr Met Gly Trp Tyr Gly Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Thr Phe Gly Gly Val Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Asn Asp Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Ile Cys Asn
                85                  90                  95
Ala Val Thr Trp Gly Gly Leu Thr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>7
<211>117
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>7
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
            20                  25                  30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala His Ala Leu Ala Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
                85                  90                  95
Thr Val Pro Ser Ser Val Thr Lys Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>8
<211>246
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>8
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
            20                  25                  30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala His Ala Leu Ala Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
                85                  90                  95
Thr Val Pro Ser Ser Val Thr Lys Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala
        115                  120                  125
Ala Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
    130                 135                 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile
145                 150                 155                 160
Asn Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu
                165                 170                 175
Val Ala His Ala Leu Ala Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Arg Asp Ser Val
            180                 185                 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
        195                 200                 205
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Asn Thr Val Pro Ser Ser Val Thr Lys Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>9
<211>249
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>9
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
            20                  25                  30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala His Ala Leu Ala Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
                85                  90                  95
Thr Val Pro Ser Ser Val Thr Lys Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala
        115                 120                 125
Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
    130                 135                 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
                165                 170                 175
Val Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val
            180                 185                 190
Lys Ala Asp Ser Pro Ser Ser Glu Thr Thr Pro Thr Thr Arg Cys Ile
        195                 200                 205
Cys Asn Glu Gln Pro Glu Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
    210                 215                 220
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
225                 230                 235                 240
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>10
<211>250
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro
        115                 120                 125
Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu
    130                 135                 140
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Ser
145                 150                 155                 160
Ile Phe Ser Ile Asn Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys
                165                 170                 175
Gln Arg Glu Leu Val Ala His Ala Leu Ala Asp Gly Ser Ala Ser Tyr
            180                 185                 190
Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
        195                 200                 205
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
    210                 215                 220
Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Val Pro Ser Ser Val Thr Lys Gly Tyr Trp
225                 230                 235                 240
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245                 250
<210>11
<211>242
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
    130                 135                 140
Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr Pro Met Ser Trp Val Arg Gln
145                 150                 155                 160
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly
                165                 170                 175
Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
            180                 185                 190
Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro
        195                 200                 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser
    210                 215                 220
Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
225                 230                 235                 240
Ser Ser
<210>12
<211>257
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro
        115                 120                 125
Gln Pro Ala Ala Ala Gln ValGln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
    130                 135                 140
Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
145                 150                 155                 160
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
                165                 170                 175
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
            180                 185                 190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
        195                 200                 205
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
    210                 215                 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala Asp Thr Gly Gly Ile Ser Trp Ile Arg
225                 230                 235                 240
Thr Gln Gly Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
                245                 250                 255
Ser
<210>13
<211>246
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
            20                  25                  30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
    130                 135                 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr Pro Met
145                 150                 155                 160
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Asp
            180                 185                 190
Ser Pro Ser Ser Glu Thr Thr Pro Thr Thr Arg Cys Ile Cys Asn Glu
        195                 200                 205
Gln Pro Glu Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala
    210                 215                 220
Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>14
<211>243
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
            20                  25                  30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
    130                 135                 140
Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ser Met
145                 150                 155                 160
Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala His
                165                 170                 175
Ala Leu Ala Asp Gly Ser Ala Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg
            180                 185                 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Val
    210                 215                 220
Pro Ser Ser Val Thr Lys Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
225                 230                 235                 240
Val Ser Ser
<210>15
<211>250
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
            20                  25                  30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val
        115                  120                  125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
    130                  135                  140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
                165                 170                 175
lle Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
        195                 200                 205
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala
    210                 215                 220
Asp Thr Gly Gly Ile Ser Trp Ile Arg Thr Gln Gly Tyr Asn Tyr Trp
225                 230                 235                 240
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245                 250
<210>16
<211>115
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
            20                  25                  30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>17
<211>115
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe
             20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser
        115
<210>18
<211>114
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ser Asp Ser Gly Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>19
<211>114
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>19
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ala Asp Gly Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Lys Met Leu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Asp Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser
<210>20
<211>255
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>20
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Val Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln ValThr Val Ser Ser Glu Pro
        115                 120                 125
Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Asp
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ser Met Gly Trp Tyr Arg
                165                 170                 175
Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala His Ala Leu Ala Asp
            180                 185                 190
Gly Ser Ala Ser Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
    210                 215                 220
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Thr Val Pro Ser Ser Val
225                 230                 235                 240
Thr Lys Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245                 250                 255
<210>21
<211>258
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>21
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Val Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
        115                 120                 125
Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr Pro Met Ser Trp Val Arg
                165                 170                 175
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Thr Tyr
            180                 185                 190
Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Ala Asp Ser Pro Ser Ser
        195                 200                 205
Glu Thr Thr Pro Thr Thr Arg Cys Ile Cys Asn Glu Gln Pro Glu Thr
    210                 215                 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser
225                 230                 235                 240
Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
                245                 250                 255
Ser Ser
<210>22
<211>262
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>22
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser ValArg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
        115                 120                 125
Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Val Glu
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg
                165                 170                 175
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser
            180                 185                 190
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
        195                 200                 205
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
    210                 215                 220
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala Asp Thr Gly Gly
225                 230                 235                 240
Ile Ser Trp Ile Arg Thr Gln Gly Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
                245                 250                 255
Gln Val Thr Val Ser Ser
            260
<210>23
<211>125
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Arg Gly Asp Asn Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala His Val Thr Val Ser Ala Ile Thr Leu Ser Thr Ser Thr Tyr
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>24
<211>122
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>24
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Lys Asp Met Ala
            20                  25                  30
Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Val Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ser Asp Gly Ser Thr Leu Val Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg
    50                  55                  60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
65                  70                  75                  80
Thr Ser Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser
                85                  90                  95
Arg Gly Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Arg Tyr Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Thr Gly Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>25
<211>123
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Met His
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Pro Ser Ala Phe Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Leu ValTrp Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Gly Ala Phe Thr Ala Thr Thr Ala Pro Leu Tyr Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>26
<211>122
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>26
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Thr Ser Gly Arg Thr Phe Gly Arg Arg
            20                  25                  30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe Val
        35                  40                  45
Ala Trp Ile Ala Arg Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Asn Lys Asn Thr Met Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Met Asn Asn Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Gly Pro Arg Gly Leu Tyr Tyr Glu Ser Arg Tyr Glu Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>27
<211>126
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>27
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Val Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>28
<211>126
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Val Phe Ile Gly Ser Asp His Ser Thr Leu Tyr Ser Thr Ser Val Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Asn Ser Ala Trp Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Thr Ser
            100                 105                 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>29
<211>124
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>29
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Gly Phe Ile Gly Ser Asp Gly Ser Thr Leu Tyr Ser Ser Ser ValArg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ala Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Arg Tyr Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Thr Asp Tyr Pro
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>30
<211>124
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Ser Phe Gly Gly Phe
            20                  25                  30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ser Gly Leu Thr Arg Ser Leu Phe Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Thr Asp Asn Thr Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Pro Asp Leu Tyr Ala Tyr Ser Arg Asp Pro Asn Glu Tyr Asp
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>31
<211>111
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>31
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Val Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
    50                  55                  60
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Lys Arg Thr Gly Ile Phe Thr Thr Ala Arg
                85                  90                  95
Met Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210>32
<211>264
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>32
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Val Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro
        115                 120                 125
Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Asp
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala Ser Leu Arg Leu Ser Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu Pro Met Ala Trp Phe Arg
                165                 170                 175
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Phe Ile Gly Ser Asp
            180                 185                 190
Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Met Asn Leu Lys
    210                 215                 220
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Ser Ser Ala Phe
225                 230                 235                 240
Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln
                245                 250                 255
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
            260
<210>33
<211>234
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>33
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Val Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
    50                  55                  60
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr Lys Arg Thr Gly Ile Phe Thr Thr Ala Arg
                85                  90                  95
Met Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu
            100                 105                 110
Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln
        115                 120                 125
Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala
    130                 135                 140
Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ile Val Ser Thr Tyr Ala Met Gly Trp Phe
145                 150                 155                 160
Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Val Lys Gly
                165                 170                 175
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
            180                 185                 190
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
        195                 200                 205
Thr Lys Arg Thr Gly Ile Phe Thr Thr Ala Arg Met Val Asp Tyr Trp
    210                 215                 220
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
225                 230
<210>34
<211>262
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Arg Arg Gly Asp Asn Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala His Val Thr Val Ser Ala Ile Thr Leu Ser Thr Ser Thr Tyr
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys
        115                 120                 125
Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln
                165                 170                 175
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Arg Gly
            180                 185                 190
Asp Asn Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser
        195                 200                 205
Arg Asp Asn Ala Glu Ser Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
    210                 215                 220
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala His Val Thr Val Ser
225                 230                 235                 240
Ala Ile Thr Leu Ser Thr Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
                245                 250                 255
Gln Val Thr Val Ser Ser
            260
<210>35
<211>122
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Arg Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Val Ala Asp Thr Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Asn Ser Thr Thr Asn Tyr Tyr Asn Gln Ser Pro Ser Ser Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>36
<211>122
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>36
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Arg Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Val Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Thr Ser Asn Gly Arg Pro Ser Val Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Asn Thr Ser Ala Asp Tyr Tyr Asn Gln Ser Pro Ser Ser Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Leu Ser
        115                 120
<210>37
<211>120
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Thr Met Gly
            20                  25                  30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Phe Val Ala Ala Leu
        35                  40                  45
Thr Trp Thr Gly Gly Ser Pro Val Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
    50                  55                  60
Phe Thr Thr Trp Arg Val Leu Asp Asn Asn Thr Val Tyr Leu His Met
65                  70                  75                  80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Arg Thr Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser Glu Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
       115                 120
<210>38
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
        115                 120
<210>39
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Lys Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
        115                 120
<210>40
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Lys Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln ValThr Ile Ser Ser
        115                120
<210>41
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>41
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Lys Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>42
<211>248
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe
            20                  25                  30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Val Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Ser Leu Gly Asp Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys
                85                  90                 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Asn Pro Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln
        115                 120                 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
    130                 135                 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
                165                 170                 175
Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser ValLys Gly
            180                 185                 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
        195                 200                 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
    210                 215                 220
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp Gln
225                 230                 235                 240
Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
                245
<210>43
<211>248
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp ValArg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ValTyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln
        115                 120                 125
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
    130                 135                 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
                165                 170                 175
Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
            180                 185                 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
        195                 200                 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
    210                 215                 220
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp Gln
225                 230                 235                 240
Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
                245
<210>44
<211>247
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ser Asp Ser Gly Thr LysAsn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
                100                 105                 110
Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
    130                 135                 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Pro Met
145                 150                 155                 160
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
            180                 185                 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
                245
<210>45
<211>247
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>45
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
            20                  25                  30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Ala Asp Gly Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Lys Met Leu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Asp Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
            100                 105                 110
Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val
        115                 120                 125
Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
    130                 135                 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr Pro Met
145                 150                 155                 160
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
            180                 185                 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
                245
<210>46
<211>254
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Arg Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Ser Val Ala Asp Thr Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Asn Ser Thr Thr Asn Tyr Tyr Asn Gln Ser Pro Ser Ser Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys
        115                 120                 125
Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145                 150                 155                 160
Arg Thr Phe Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
                165                 170                 175
Gln Phe Val Ala Ala Leu Thr Trp Thr Gly Gly Ser Pro Val Tyr Ala
            180                 185                 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Trp Arg Val Leu Asp Asn Asn
        195                 200                 205
Thr Val Tyr Leu His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
    210                 215                 220
Tyr His Cys Ala Ala Ala Arg Thr Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser Glu Tyr
225                 230                 235                 240
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245                 250
<210>47
<211>254
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>47
Gln Val Gln Leu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Arg Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Val Leu Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Thr Ser Asn Gly Arg Pro Ser Val Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Asn Thr Ser Ala Asp Tyr Tyr Asn Gln Ser Pro Ser Ser Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Leu Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys
        115                 120                 125
Pro Gln Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Leu Val Gln Ala Gly Asp Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145                 150                 155                 160
Arg Thr Phe Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
                165                 170                 175
Gln Phe Val Ala Ala Leu Thr Trp Thr Gly Gly Ser Pro Val Tyr Ala
            180                 185                 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Thr Trp Arg Val Leu Asp Asn Asn
        195                 200                 205
Thr Val Tyr Leu His Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
    210                 215                 220
Tyr His Cys Ala Ala Ala Arg Thr Tyr Tyr Gly Asn Ile Ser Glu Tyr
225                 230                 235                 240
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
                245                 250
<210>48
<211>2804
<212>PRT
<213>人
<400>48
Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile
1               5                   10                  15
Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr
            20                  25                  30
Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly
        35                  40                  45
Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly
    50                  55                  60
Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys
65                  70                  75                  80
Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu
                85                  90                  95
Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro
            100                 105                 110
Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys
        115                 120                 125
Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly
145                 150                 155                 160
Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln
                165                 170                 175
Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala
            180                 185                 190
Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser
        195                 200                 205
Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln
    210                 215                 220
Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu
225                 230                 235                 240
Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu
                245                 250                 255
Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala
            260                 265                 270
Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His
        275                 280                 285
Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys
    290                 295                 300
Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met
305                 310                 315                 320
Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu
                325                 330                 335
Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His
            340                 345                 350
Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn
        355                 360                 365
Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys
    370                 375                 380
Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp
385                 390                 395                 400
Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg
                405                 410                 415
Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys
            420                 425                 430
Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu
        435                 440                 445
Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val
    450                 455                 460
Ala Met Asp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu
465                 470                 475                 480
Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu
                485                 490                 495
Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu
            500                 505                 510
Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn
        515                 520                 525
Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro
    530                 535                 540
Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln
545                 550                 555                 560
Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met
                565                 570                 575
Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala Val Leu Thr Ser Pro Thr Phe
            580                 585                 590
Glu Ala Cys His Arg Ala Val Ser Pro Leu Pro Tyr Leu Arg Asn Cys
        595                 600                 605
Arg Tyr Asp Val Cys Ser Cys Ser Asp Gly Arg Glu Cys Leu Cys Gly
    610                 615                 620
Ala Leu Ala Ser Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Arg Gly Val Arg Val
625                 630                 635                 640
Ala Trp Arg Glu Pro Gly Arg Cys Glu Leu Asn Cys Pro Lys Gly Gln
                645                 650                 655
Val Tyr Leu Gln Cys Gly Thr Pro Cys Asn Leu Thr Cys Arg Ser Leu
            660                 665                 670
Ser Tyr Pro Asp Glu Glu Cys Asn Glu Ala Cys Leu Glu Gly Cys Phe
        675                 680                 685
Cys Pro Pro Gly Leu Tyr Met Asp Glu Arg Gly Asp Cys Val Pro Lys
    690                 695                 700
Ala Gln Cys Pro Cys Tyr Tyr Asp Gly Glu Ile Phe Gln Pro Glu Asp
705                 710                 715                 720
Ile Phe Ser Asp His His Thr Met Cys Tyr Cys Glu Asp Gly Phe Met
                725                 730                 735
His Cys Thr Met Ser Gly Val Pro Gly Ser Leu Leu Pro Asp Ala Val
            740                 745                 750
Leu Ser Ser Pro Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu Ser Cys Arg
        755                 760                 765
Pro Pro Met Val Lys Leu Val Cys Pro Ala Asp Asn Leu Arg Ala Glu
    770                 775                 780
Gly Leu Glu Cys Thr Lys Thr Cys Gln Asn Tyr Asp Leu Glu Cys Met
785                 790                 795                 800
Ser Met Gly Cys Val Ser Gly Cys Leu Cys Pro Pro Gly Met Val Arg
                805                 810                 815
His Glu Asn Arg Cys Val Ala Leu Glu Arg Cys Pro Cys Phe His Gln
            820                 825                 830
Gly Lys Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Gly Cys Asn Thr
        835                 840                 845
Cys Val Cys Arg Asp Arg Lys Trp Asn Cys Thr Asp His Val Cys Asp
    850                 855                 860
Ala Thr Cys Ser Thr Ile Gly Met Ala His Tyr Leu Thr Phe Asp Gly
865                 870                 875                 880
Leu Lys Tyr Leu Phe Pro Gly Glu Cys Gln Tyr Val Leu Val Gln Asp
                885                 890                 895
Tyr Cys Gly Ser Asn Pro Gly Thr Phe Arg Ile Leu Val Gly Asn Lys
            900                 905                 910
Gly Cys Ser His Pro Ser Val Lys Cys Lys Lys Arg Val Thr Ile Leu
        915                 920                 925
Val Glu Gly Gly Glu Ile Glu Leu Phe Asp Gly Glu Val Asn Val Lys
    930                 935                 940
Arg Pro Met Lys Asp Glu Thr His Phe Glu Val Val Glu Ser Gly Arg
945                 950                 955                 960
Tyr Ile Ile Leu Leu Leu Gly Lys Ala Leu Ser Val Val Trp Asp Arg
                965                 970                 975
His Leu Ser Ile Ser Val Val Leu Lys Gln Thr Tyr Gln Glu Lys Val
            980                 985                 990
Cys Gly Leu Cys Gly Asn Phe Asp Gly Ile Gln Asn Asn Asp Leu Thr
        995                 1000                1005
Ser Ser Asn Leu Gln Val Glu Glu Asp Pro Val Asp Phe Gly Asn
    1010                1015                1020
Ser Trp Lys Val Ser Ser Gln Cys Ala Asp Thr Arg Lys Val Pro
    1025                1030                1035
Leu Asp Ser Ser Pro Ala Thr Cys His Asn Asn Ile Met Lys Gln
    1040                1045                1050
Thr Met Val Asp Ser Ser Cys Arg Ile Leu Thr Ser Asp Val Phe
    1055                1060                1065
Gln Asp Cys Asn Lys Leu Val Asp Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Val
    1070                1075                1080
Cys Ile Tyr Asp Thr Cys Ser Cys Glu Ser Ile Gly Asp Cys Ala
    1085                1090                1095
Cys Phe Cys Asp Thr Ile Ala Ala Tyr Ala His Val Cys Ala Gln
    1100                1105                1110
His Gly Lys Val Val Thr Trp Arg Thr Ala Thr Leu Cys Pro Gln
    1115                1120                1125
Ser Cys Glu Glu Arg Asn Leu Arg Glu Asn Gly Tyr Glu Cys Glu
    1130                1135                1140
Trp Arg Tyr Asn Ser Cys Ala Pro Ala Cys Gln Val Thr Cys Gln
    1145                1150                1155
His Pro Glu Pro Leu Ala Cys Pro Val Gln Cys Val Glu Gly Cys
    1160                1165                1170
His Ala His Cys Pro Pro Gly Lys Ile Leu Asp Glu Leu Leu Gln
    1175                1180                1185
Thr Cys Val Asp Pro Glu Asp Cys Pro Val Cys Glu Val Ala Gly
    1190                1195                1200
Arg Arg Phe Ala Ser Gly Lys Lys Val Thr Leu Asn Pro Ser Asp
    1205                1210                1215
Pro Glu His Cys Gln Ile Cys His Cys Asp Val Val Asn Leu Thr
    1220                1225                1230
Cys Glu Ala Cys Gln Glu Pro Gly Gly Leu Val Val Pro Pro Thr
    1235                1240                1245
Asp Ala Pro Val Ser Pro Thr Thr Leu Tyr Val Glu Asp Ile Ser
    1250                1255                1260
Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu
    1265                1270                1275
Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe
    1280                1285                1290
Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg
    1295                1300                1305
Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp
    1310                1315                1320
Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser
    1325                1330                1335
Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln
    1340                1345                1350
Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile
    1355                1360                1365
Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu
    1370                1375                1380
Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val
    1385                1390                1395
Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro
    1400                1405                1410
Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile
    1415                1420                1425
Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val
    1430                1435                1440
Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys
    1445                1450                1455
Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro His Met
    1460                1465                1470
Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Arg Asn Ser Met Val Leu
    1475                1480                1485
Asp Val Ala Phe Val Leu Glu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Glu Ala
    1490                1495                1500
Asp Phe Asn Arg Ser Lys Glu Phe Met Glu Glu Val Ile Gln Arg
    1505                1510                1515
Met Asp Val Gly Gln Asp Ser Ile His Val Thr Val Leu Gln Tyr
    1520                1525                1530
Ser Tyr Met Val Thr Val Glu Tyr Pro Phe Ser Glu Ala Gln Ser
    1535                1540                1545
Lys Gly Asp Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Ile Arg Tyr Gln Gly
    1550                1555                1560
Gly Asn Arg Thr Asn Thr Gly Leu Ala Leu Arg Tyr Leu Ser Asp
    1565                1570                1575
His Ser Phe Leu Val Ser Gln Gly Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn
    1580                1585                1590
Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys
    1595                1600                1605
Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro
    1610                1615                1620
Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala
    1625                1630                1635
Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro
    1640                1645                1650
Asp Leu Val Leu Gln Arg Cys Cys Ser Gly Glu Gly Leu Gln Ile
    1655                1660                1665
Pro Thr Leu Ser Pro Ala Pro Asp Cys Ser Gln Pro Leu Asp Val
    1670                1675                1680
Ile Leu Leu Leu Asp Gly Ser Ser Ser Phe Pro Ala Ser Tyr Phe
    1685                1690                1695
Asp Glu Met Lys Ser Phe Ala Lys Ala Phe Ile Ser Lys Ala Asn
    1700                1705                1710
Ile Gly Pro Arg Leu Thr Gln Val Ser Val Leu Gln Tyr Gly Ser
    1715                1720                1725
Ile Thr Thr Ile Asp Val Pro Trp Asn Val Val Pro Glu Lys Ala
    1730                1735                1740
His Leu Leu Ser Leu Val Asp Val Met Gln Arg Glu Gly Gly Pro
    1745                1750                1755
Ser Gln Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr
    1760                1765                1770
Ser Glu Met His Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val
    1775                1780                1785
Ile Leu Val Thr Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala
    1790                1795                1800
Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile
    1805                1810                1815
Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro
    1820                1825                1830
Ala Gly Asp Ser Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu
    1835                1840                1845
Pro Thr Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys
    1850                1855                1860
Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys
    1865                1870                1875
Arg Pro Gly Asp Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val
    1880                1885                1890
Thr Cys Gln Pro Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val
    1895                1900                1905
Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser
    1910                1915                1920
Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro
    1925                1930                1935
Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp
    1940                1945                1950
Gly Gln Asn Phe Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe
    1955                1960                1965
Gln Asn Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala
    1970                1975                1980
Cys Ser Pro Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val
    1985                1990                1995
Lys His Ser Ala Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val
    2000                2005                2010
Thr Val Asn Gly Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn
    2015                2020                2025
Met Glu Val Asn Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe
    2030                2035                2040
Asn His Leu Gly His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu
    2045                2050                2055
Phe Gln Leu Gln Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr
    2060                2065                2070
Gly Leu Cys Gly Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met
    2075                2080                2085
Leu Arg Asp Gly Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln
    2090                2095                2100
Glu Trp Thr Val Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu
    2105                2110                2115
Glu Glu Gln Cys Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu
    2120                2125                2130
Leu Leu Pro Leu Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala
    2135                2140                2145
Thr Phe Tyr Ala Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln
    2150                2155                2160
Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn
    2165                2170                2175
Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser
    2180                2185                2190
Cys Pro Pro Ser Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro
    2195                2200                2205
Arg His Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser
    2210                2215                2220
Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser
    2225                2230                2235
Cys Val Pro Glu Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly
    2240                2245                2250
Val Gln His Gln Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro
    2255                2260                2265
Cys Gln Ile Cys Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr
    2270                2275                2280
Thr Gln Pro Cys Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys
    2285                2290                2295
Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu
    2300                2305                2310
Tyr Glu Cys Val Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val
    2315                2320                2325
Pro His Cys Glu Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly
    2330                2335                2340
Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys
    2345                2350                2355
Lys Arg Val Ser Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr
    2360                2365                2370
Leu Arg Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn
    2375                2380                2385
Cys Val Asn Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser
    2390                2395                2400
Thr Ala Thr Asn Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro
    2405                2410                2415
Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln
    2420                2425                2430
Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu
    2435                2440                2445
Asp Ala Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro
    2450                2455                2460
Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu
    2465                2470                2475
Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val
    2480                2485                2490
Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val
    2495                2500                2505
Gly Ser Gln Trp Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu
    2510                2515                2520
Cys Val Arg Val Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val
    2525                2530                2535
Ser Cys Pro Gln Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln
    2540                2545                2550
Leu Ser Cys Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu
    2555                2560                2565
Arg Met Glu Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly
    2570                2575                2580
Lys Thr Val Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val
    2585                2590                2595
Gln Val Gly Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr
    2600                2605                2610
Thr Cys Asn Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr
    2615                2620                2625
Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln
    2630                2635                2640
Leu Arg Gly Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu
    2645                2650                2655
Gln Asp Gly Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly
    2660                2665                2670
Glu Tyr Phe Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp
    2675                2680                2685
Glu His Lys Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro
    2690                2695                2700
Gly Thr Cys Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile
    2705                2710                2715
Thr Ala Arg Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu
    2720                2725                2730
Val Glu Val Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys
    2735                2740                2745
Ala Met Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser
    2750                2755                2760
Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His
    2765                2770                2775
Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met
    2780                2785                2790
Glu Cys Lys Cys Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys
    2795                2800
<210>49
<211>128
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>49
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Thr Thr Phe Ser Ser Ala
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Lys Trp Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Thr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Asp Arg Asp Arg Tyr Arg Asp Arg Met Gly Pro Met Thr Thr
            100                 105                 110
Thr Asp Phe Arg Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>50
<211>124
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>50
Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Gly Ser Ser Gly Ile Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Leu Cys Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Val Asn Arg Tyr Gly Ile Pro Tyr Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Gln
            100                 105                 110
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>51
<211>120
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>51
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Asn Asp Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Met Val
        35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Ile Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val
                85                  90                  95
Ala His Arg Gln Thr Val Val Arg Gly Pro Tyr Leu Leu Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>52
<211>123
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>52
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Gly Ser Gly Arg Ser Asn Ser Tyr Asn Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ser Thr Asn Leu Trp Pro Arg Asp Arg Asn Leu Tyr Ala Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>53
<211>125
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Gly Ile Tyr
            20                  25                  30
Arg Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Arg Tyr Leu Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Lys Asn Ala Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Leu Tyr Trp Thr Leu Ser Thr Ser Tyr
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>54
<211>125
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>54
Gln Val Gln Leu Val Glu Phe Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Gly Ile Tyr
            20                  25                  30
Lys Met Ala Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Arg Tyr Ile Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Leu Tyr Trp Thr Leu Ser Thr Ser Tyr
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>55
<211>124
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Pro Tyr
            20                  25                  30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu
        35                  40                  45
Ala Gly Val Thr Trp Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Gly Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Thr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Gly Leu Tyr Arg Asp Pro Arg Ser Tyr Asp
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>56
<211>131
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>56
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Ala Trp
            20                  25                  30
Pro Ile Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
        35                  40                  45
Ser Cys Ile Arg Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
    50                  55                  60
Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Asn Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65                  70                  75                  80
Thr Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
                85                  90                  95
Pro Ser Gly Pro Ala Thr Gly Ser Ser His Thr Phe Gly Ile Tyr Trp
            100                 105                 110
Asn Leu Arg Asp Asp Tyr Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser
    130
<210>57
<211>126
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>57
Glu ValGln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1              5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp His Tyr
            20                  25                  30
Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
        35                  40                  45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Glu Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Gly Gly Leu Leu Leu Arg Val Glu Glu Leu Gln Ala Ser Asp
            100                 105                 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>58
<211>128
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>58
Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
        35                  40                  45
Ala Cys Ile Ser Asn Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Thr Ala Asp Arg His Tyr Ser Ala Ser His His Pro Phe Ala Asp
            100                 105                 110
Phe Ala Phe Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>59
<211>120
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Tyr Gly Leu Thr Phe Trp Arg Ala
            20                  25                  30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
        35                  40                  45
Val Ala Arg Asn Trp Gly Asp Gly Ser Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Val Arg Thr Tyr Gly Ser Ala Thr Tyr Asp Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>60
<211>123
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Phe Ser Gly Arg Thr Phe Ala Asn Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Ala Ile Asn Arg Asn Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ala Leu
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Arg Glu Trp Pro Phe Ser Thr Ile Pro Ser Gly Trp Arg Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>61
<211>125
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>61
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Ala Ser Ser His
            20                  25                  30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Val Gly Ile Asn Arg Gly Gly Val Thr Arg Asp Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Ile Cys
                85                  90                  95
Ala Ala Arg Pro Glu Tyr Ser Phe Thr Ala Met Ser Lys Gly Asp Met
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>62
<211>126
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Lys Ala Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Leu
            20                  25                  30
Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
        35                  40                  45
Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu Tyr Thr Ser Ser Val Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Met Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser
            100                 105                 110
Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>63
<211>125
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>63
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Ile
        35                  40                  45
Ala Val Ile Tyr Trp Arg Asp Gly Ser Ser Leu Tyr Ser Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Asn Arg His Asp Ser Arg Gly Thr Tyr Tyr Ser Ser Arg Gly Tyr
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>64
<211>122
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>64
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Lys Asp Met Ala
            20                  25                  30
Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe ValAla Val Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ser Asp Gly Ser Thr Leu ValAla Ala Ser Val Lys Gly Arg
    50                  55                  60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
65                  70                  75                  80
Thr Ser Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser
                85                  90                  95
Arg Gly Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Arg Tyr Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>65
<211>122
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>65
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Lys Asp Met Ala
            20                  25                  30
Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Val Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ser Asp Gly Ser Thr Leu Val Ala Ala Ser Val Thr Gly Arg
    50                  55                  60
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met
65                  70                  75                  80
Thr Ser Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Ser
                85                  90                  95
Arg Gly Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Thr Ser Arg Tyr Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>66
<211>23
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>66
ggctgagctc ggtggtcctg gct                            23
<210>67
<211>45
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>67
aactggaaga attcgcggcc gcaggaattt tttttttttt ttttt    45
<210>68
<211>42
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>68
ctggtgctgc agaggtgaag cttcggagag gggctgcaga tc       42
<210>69
<211>42
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>69
atccatgcaa atcctctagaat ccagagca cagtttgtgg ag       42
<210>70
<211>45
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>70
ccggtgagcc ccaccactct aagcttggag gacatctcgg aaccg    45
<210>71
<211>42
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>71
ccccagggtc gaaaccctct agagccccgg gcccacagtg ac       42
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>72
cccctggtcc cagttccctc                                20
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>73
tgtgctcgcg gggccggtac                                20
<210>74
<211>47
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>74
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggcctgt gctcgcgggg ccggtac                   47
<210>75
<211>42
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>75
gtcctcgcaa ctgcgcggcc gccccctggt cccagttccc tc                        42
<210>76
<211>60
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>76
agagacaact ccaagaacac gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg     60
<210>77
<211>20
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>77
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
1               5                   10                  15
Ala Glu Asp Thr
            20
<210>78
<211>30
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>78
attactgtgc taaaggggcc ggtactagtt                               30
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>79
Tyr Cys Ala Lys Gly Ala Gly Thr 5er
1               5
<210>80
<211>35
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>80
tcctgtgcag cctccggatt cactttcagt tggta                  35
<210>81
<211>11
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>81
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp
1               5                   10
<210>82
<211>253
<212>DNA
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>82
aagcttgcat gcaaattcta tttcaaggag acagtcataa tgaaatacct attgcctacg    60
gcagccgctg gattgttatt actcgcggcc cagccggcca tggggcctaa taggcggccg   120
cacaggtgca gctgcaggag tcataatgag ggacccaggt caccgtctcc tcagaacaaa   180
aactcatctc agaagaggat ctgaatgggg ccgcacatca tcatcatcat cattaatgag   240
aattcactgg ccg                                                      253
<210>83
<211>61
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>83
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Gly Pro Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu
            20                  25                  30
Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
        35                  40                  45
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
    50                  55                  60
<210>84
<211>98
<212>PRT
<213>人
<400>84
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys
<210>85
<211>121
<212>PRT
<213>美洲驼(Lama glama)
<400>85
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Trp Tyr
            20                  25                  30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ala Gly Thr Ser Ser Tyr Leu Pro Gln Arg Gly Asn Trp Asp
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Ile Ser Ser
        115                 120

Claims (22)

1.一种多肽或多肽构建体，其包含至少一种针对冯德勒布兰德因子(vWF)的单结构域抗体，其中至少一种单结构域抗体对应SEQ ID NO：1到7任一个代表的序列，或对应SEQ ID NO：1到7任一个序列的同源序列，其与亲本序列具有多于70％的序列同一性。
2.根据权利要求1的多肽或多肽构建体，其中所述单结构域抗体能够在高切应力1600s-1和1μg/ml以下的浓度条件下抑制至少50％的血小板凝集。
3.根据权利要求1-2的多肽或多肽构建体，其中所述单结构域抗体对应由SEQ ID NO：3表示的序列，或对应SEQ ID NO：3的同源序列，其与亲本序列具有多于70％的序列同一性。
4.根据权利要求1-3的多肽或多肽构建体，其中所述单结构域抗体对应由SEQ ID NO：5表示的序列，或对应SEQ ID NO：5的同源序列，其与亲本序列具有多于70％的序列同一性。
5.根据权利要求1-4的多肽或多肽构建体，其中所述单结构域抗体对应由SEQ ID NO：7表示的序列，或对应SEQ ID NO：7的同源序列，其与亲本序列具有多于70％的序列同一性。
6.根据权利要求1-5的多肽或多肽构建体，其包含两个针对冯德勒布兰德因子的单结构域抗体，和
i.其中所述两个单结构域抗体的至少一个对应SEQ ID NO：3表示的序列，或对应具有多于70％序列同一性的SEQ ID NO：3的同源序列，或
ii.其中所述两个单结构域抗体的至少一个对应SEQ ID NO：5表示的序列，或对应具有多于70％序列同一性的SEQ ID NO：5的同源序列，或
iii.其中所述两个单结构域抗体的至少一个对应SEQ ID NO：7表示的序列，或对应具有多于70％序列同一性的SEQ ID NO：7的同源序列。
7.根据权利要求1-6的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是VHH结构域。
8.根据权利要求1-7的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是VHH结构域，按照Kabat编号其在位置45携带的氨基酸选自由甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，丝氨酸，苏氨酸，天冬氨酸和谷氨酰胺组成的组。
9.根据权利要求1-8的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是VHH结构域，按照Kabat编号其在位置103携带的氨基酸选自由精氨酸，丝氨酸或未带电荷的残基任选甘氨酸组成的组。
10.根据权利要求1-9的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是VHH结构域，所述VHH结构域是如下获得的：免疫骆驼并从其获得杂交瘤，或克隆单结构域抗体的文库，随后通过利用噬菌体展示筛选VHH。
11.根据权利要求1-10的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是人源化的。
12.根据权利要求1-11的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是人源化的VHH结构域。
13.根据权利要求1-12的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是通过用在人共有序列中发现的骆驼科氨基酸的人对应物来置换一种或多种骆驼科氨基酸而被人源化。
14.根据权利要求1-13的多肽或多肽构建体，其中至少一种单结构域抗体是通过单独或联合置换以下任一残基而被人源化：按照Kabat编号法的FR1的1、5、28和30位残基、FR2位置中37、44、45和47位标志氨基酸、FR3位置74、75、76、83、84、93和94位残基及FR4位置103、104、108和111位残基。
15.根据权利要求1-14的多肽或多肽构建体，其包含一种或多种针对vWF A1结构域或活化的vWF的A1结构域的单结构域抗体，和一种或多种针对vWF的A3结构域的单结构域抗体。
16.根据权利要求1-15的多肽或多肽构建体，其中两种或多种单结构域抗体是相同序列的。
17.根据权利要求1-16的多肽或多肽构建体，其中第一种单结构域抗体的C-末端连接到下一个单结构域抗体的N-末端。
18.按照权利要求1-17的多肽或多肽构建体，其中所述同源序列在低切应力300s-1和10μg/ml以下的浓度条件下不能抑制50％的血小板凝集。
19.组合物，其包括权利要求1-17的多肽或多肽构建体，和药用赋形剂。
20.包括权利要求1-17的多肽或多肽构建体和药用赋形剂的组合物，其适于所选择的给药途径，其中所述给药途径是通过口服或胃肠外，通过鼻内、吸入、静脉内、肌肉内、局部或皮下途径来给药。
21.核酸，其编码根据权利要求1-17的多肽或多肽构建体。
22.根据权利要求1-17的多肽或多肽构建体在制备治疗、预防和/或缓解血小板介导的聚集的疾病的药物中应用，其中所述疾病是非闭塞性血栓形成、闭塞性血栓形成、动脉血栓形成、急性冠脉闭塞、再狭窄、PCTA或放置斯坦特印模后再狭窄、狭窄的动脉内血栓形成、血管成形术、粥样斑切除术或动脉斯坦特印模后的增生、血管系统的闭塞综合征或患病动脉的开放缺陷中的任何一种。
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