BR112019017853A2 - Meios e métodos para liberação oral de proteína - Google Patents

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Abstract

"meios e métodos para liberação oral de proteína". a presente invenção refere-se ao campo da produção de proteína recombinante em uma célula hospedeira. mais especificamente, a invenção refere-se ao campo da liberação oral de proteína. especificamente, a invenção fornece formulações farmacêuticas orais compreendendo o meio de cultura de um hospedeiro recombinante que secreta uma proteína recombinante. as formulações farmacêuticas orais resultantes são úteis para o tratamento de distúrbios gastrointestinais e/ou bucais. adicionalmente, as formulações farmacêuticas orais são úteis para propósitos profiláticos e de vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO SECA, SEUS USOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA ORAL QUE A COMPREENDE, E PRODUTO ALIMENTÍCIO OU PARA ALIMENTAÇÃO ANIMAL". Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se ao campo de produção de proteína recombinante em uma célula hospedeira tal como células de levedura. Mais especificamente, a invenção refere-se ao campo da liberação oral de proteínas. Especificamente, a invenção fornece formulações farmacêuticas orais que compreendem o meio de cultura de um hospedeiro recombinante que secreta um polipeptídeo recombinante. Introdução da Invenção
[0002] Peptídeos ou proteínas, que incluem hormônios, enzimas, ligantes ou inibidores, incluindo anticorpos, regulam várias funções celulares. Portanto, são úteis na clínica para tratar ou prevenir distúrbios humanos através da modulação de processos fisiológicos ou patológicos. Em contraste aos fármacos de pequenas moléculas, a elevada seletividade de peptídeos ou proteínas para seus alvos pode reduzir os efeitos colaterais e a toxicidade da célula hospedeira. Espera-se que o uso de proteínas ou peptídeos para propósitos terapêuticos continuará a aumentar no tratamento de câncer, distúrbios metabólicos, doenças gastrointestinais, doenças bucais, doenças neurodegenerativas e infecciosas. Atualmente, os fármacos de proteína são amplamente fabricados utilizando sistemas de cultura celular de mamífero, vegetal, levedura ou bacteriana. Estas proteínas expressas devem ser extraídas e purificadas, o que requer processos caros e complexos e armazenagem e transporte a frio. Produtos biológicos são geralmente liberados por injeção intravenosa ou subcutânea, que é eficaz, mas não desejável para os pacientes, particularmente para condições crônicas.
Formas injetáveis de fármacos de proteína frequentemente requerem pessoal de saúde para administração, resultando em visitas hospitalares frequentes e cooperação diminuída do paciente.
Outras vias de liberação tais como as administrações transdérmica, intranasal, inalação e oral estão sob investigação, mas a liberação oral é geralmente considerada como a via mais desejada.
A despeito de décadas de esforço, a liberação oral de peptídeos, proteínas e fármacos de anticorpos permanece um maior desafio farmacêutico, com apenas um número limitado de tais proteínas no mercado.
Isto é particularmente decepcionante, visto que os produtos biológicos são o segmento que mais cresce do mercado farmacêutico, triplicando em valor de 36 bilhões de dólares a 163 bilhões de dólares nos últimos 10 anos.
Assim, embora conveniente para os pacientes, existem várias barreiras técnicas que fazem essa via de administração desafiadora para fármacos de grandes moléculas.
Certamente o desafio mais importante é a degradação enzimática e dependente do pH dos fármacos no estômago e intestinos.
Além disso, existe a baixa permeabilidade de células epiteliais que alinham o trato gastrointestinal (Gl) e a instabilidade intrínseca destes compostos.
Diversas tecnologias foram desenvolvidas para facilitar a liberação oral de grandes moléculas.
A ligação de moléculas como polietileno glicol, um domínio Fc de anticorpo ou albumina de soro humano aumenta a estabilidade do peptídeo no soro durante a circulação.
Além disso, os fármacos peptídicos podem ser modificados para proteger de proteases e peptidases do soro.
Tais modificações incluem a acetilação N-terminal, a amidação C-terminal, o uso de aminoácidos não naturais e a ciclização através de ligações de dissulfeto.
Além disso, algumas melhoras foram efetuadas no desenvolvimento de inibidores de enzima, no uso de intensificadores de absorção ou permeação, na formulação de polipeptídeos em cápsulas, na aplicação de polímeros adesivos que se aderem ao revestimento do intestino e na incorporação de moléculas carreadoras na formulação. A despeito destas tecnologias, proteínas e peptídeos tipicamente possuem biodisponibilidade extremamente baixa de menos do que 2% quando tomados pela boca. Recentemente mostramos que os anticorpos produzidos por semente vegetal sobreviveram ao canal gástrico e eram biologicamente ativos no intestino (ver o WO2014033313 e Virdi V. et al. (2013) PNAS, 110, 29, 11809-11814). Os sistemas de produção de plantas embora capazes de produzir altas quantidades de proteínas recombinantes, eles não seriam a melhor escolha para a produção de vacinas comestíveis devido aos procedimentos reguladores prolongados e caros. Os organismos eucarióticos inferiores são mais desejáveis e capazes de produzir maiores quantidades de proteínas recombinantes. Seria uma vantagem utilizar hospedeiros eucarióticos inferiores tais como leveduras para a produção de proteínas terapêuticas que podem ser liberadas por via oral. As células eucarióticas inferiores foram descritas para a liberação de proteínas terapêuticas, mas apenas como células recombinantes completas que são capazes de produzir uma proteína terapêutica (ver, por exemplo, Zhang et al. (2012) BMC Biotechnology 12:97 e WO2007039586). Seria desejável poder utilizar somente o meio de cultura compreendendo o polipeptídeo secretado em vez da própria levedura recombinante. Ainda mais desejável, seria importante não ter que purificar o polipeptídeo terapêutico do meio de cultura e utilizar o meio de cultura como tal. Sumário da Invenção
[0003] Na presente invenção de modo surpreendente mostramos que uma formulação seca compreendendo o meio de cultura de levedura recombinante, cujo meio compreende um polipeptídeo terapêutico e cujo meio foi tratado por um processo de separação por membrana para reduzir a concentração de compostos permeados, pode ser utilizada como uma formulação de liberação oral. É mostrado que o meio de cultura seco em pó (obtido por meio da liofilização ou por meio da secagem por pulverização) compreendendo o polipeptídeo terapêutico é surpreendentemente protegido da degradação no intestino. Além disso, é também mostrado que a formulação seca em pó também mantém sua atividade biológica no intestino.
[0004] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma formulação seca que compreende a mistura de uma matriz oralmente admissível e o meio de cultura de um hospedeiro recombinante, em cujo meio de cultura a concentração de compostos permeados solúveis foi reduzida em um processo de separação por membrana, o dito hospedeiro produzindo um polipeptídeo exógeno que é secretado no dito meio de cultura.
[0005] Em mais outro aspecto específico, a invenção fornece uma formulação que compreende o meio de cultura de uma levedura recombinante, dita levedura produzindo um polipeptídeo exógeno que é secretado em dito meio de cultura.
[0006] Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma formulação de acordo com o aspecto 1, em que o teor de água da referida formulação e as moléculas solúveis com um peso molecular mais baixo do que 5 kDa são reduzidos pela concentração de dito meio de cultura em um processo de separação por membrana antes da preparação da referida formulação.
[0007] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece uma formulação de acordo com o aspecto 1, em que o teor de água e as moléculas solúveis com um peso molecular mais baixo do que 5 kDa são reduzidos através da secagem de dito meio de cultura antes da preparação da referida formulação.
[0008] Em um quarto aspecto, a invenção fornece uma formulação de acordo com o aspecto 1, em que o teor de água da referida formulação e as moléculas solúveis com um peso molecular mais baixo do que 5 kDa são reduzidos através da secagem da referida formulação.
[0009] Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma formulação seca que compreende o meio de cultura de um hospedeiro recombinante, dito hospedeiro produzindo um polipeptídeo exógeno que é secretado em dito meio de cultura.
[0010] Em um sexto aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com o aspecto cinco, em que dito hospedeiro recombinante é uma levedura.
[0011] Em um sétimo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com os aspectos 5 e 6, em que o polipeptídeo exógeno é fundido a um domínio Fc.
[0012] Em um oitavo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com o aspecto 7, em que dito domínio Fc é um domínio Fc de IgA.
[0013] Em um nono aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 8, em que dito peptídeo exógeno é um peptídeo profilático ou terapêutico ou em que o dito peptídeo exógeno é uma vacina ou faz parte de uma vacina.
[0014] Em um décimo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca que compreende um polipeptídeo que é exógeno a um hospedeiro recombinante obtido pela secreção de dito polipeptídeo no meio de cultura de um hospedeiro recombinante seguido por secagem de dito meio de cultura.
[0015] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção fornece uma formulação seca que compreende um polipeptídeo de fusão com um domínio Fc obtido pela produção de dito polipeptídeo de fusão no meio de cultura de um hospedeiro recombinante seguido pela secagem de dito meio de cultura.
[0016] Em um décimo segundo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com os aspectos 10 ou 11, em que dito hospedeiro recombinante é um hospedeiro procariótico, uma célula vegetal ou uma célula fúngica, particularmente um fungo filamentoso.
[0017] Em um décimo terceiro aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com aspectos 10 ou 11, em que dito hospedeiro recombinante é uma célula de levedura.
[0018] Em um décimo quarto aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 13, em que dita secagem é realizada através da secagem por pulverização.
[0019] Em um décimo quinto aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 13, em que dita secagem é realizada por liofilização.
[0020] Em um décimo sexto aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 13, que ainda compreende células de levedura.
[0021] Em um décimo sétimo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 13, que ainda compreende uma refeição rica em proteínas.
[0022] Em um décimo oitavo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para uso como um medicamento.
[0023] Em um décimo nono aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para tratar doenças gastrointestinais.
[0024] Em um vigésimo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para uso para tratar doenças bucais.
[0025] Em um vigésimo primeiro aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para uso como um produto profilático.
[0026] Em um vigésimo segundo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para uso como uma vacina.
[0027] Em um vigésimo terceiro aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para uso como um produto alimentar funcional.
[0028] Em um vigésimo terceiro aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para uso como um produto alimentar medicinal.
[0029] Em um vigésimo quarto aspecto, a invenção fornece um produto alimentar que compreende uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17.
[0030] Em um vigésimo quinto aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17, em que o polipeptídeo é uma fusão IL22 IgAFc.
[0031] Em um vigésimo sétimo aspecto, a invenção fornece uma formulação farmacêutica oral que compreende uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 e um excipiente farmacêutico.
[0032] Em um vigésimo oitavo aspecto, a invenção fornece uma formulação seca de acordo com qualquer um dos aspectos de 5 a 17 para uso como um medicamento.
[0033] Em um vigésimo nono aspecto, a invenção fornece uma formulação farmacêutica oral de acordo com o aspecto vinte e sete para uso como um medicamento. Figuras
[0034] Figura 1: Triagem e seleção dos clones de Pichia de alta expressão (A) e sementes de soja (B) por meio da configuração de ELISA imobilizado por FaeG. Os painéis 'C' e 'D' mostram uma imunomarcação representativa de sobrenadante contendo Pichia VHH-lgAFc e extratos de sementes de soja de expressão de VHH- lgAFc, respectivamente.
[0035] Figura 2: Um exemplo típico de titulação com base em ELISA para comparar a equivalência funcional de anticorpos produzidos por Pichia e sementes. Nesta figura representativa, a curva do anticorpo V2A produzido por Pichia (Pichia-V2A), nas linhas pontilhadas, está sendo comparada a diferentes concentrações de V2A produzido por Arabidopsis (At-V2A), linhas sólidas.
[0036] Figura 3: VHH-lgA produzido por Pichia e soja impede a infecção de ETEC em leitões. Representação esquemática do experimento (A); Eliminação de F4-ETEC após estímulo (B); Soroconversão que mostra títulos de IgM (C), IgG (D) e IgA (E) no soro anti-F4-ETEC.
[0037] Figura 4: Painel A. Preparação experimental do exemplo 3, Painel B. A eliminação de bactérias F4+ ETEC por grama de fezes para os 4 grupos diferentes até o dia 6, C. Títulos de soro de IgG anti- ETEC Para leitões individuais pertencentes aos 4 grupos diferentes, D. Títulos de soro de IgA anti-ETEC para leitões individuais pertencentes aos 4 grupos diferentes.
[0038] Figura 5: Redução da análise SDS-PAGE da expressão de fusão de V2IgAFc impulsionada pelo promotor GAP produzida em Komagataella phaffi (anteriormente conhecida como Pichia pastoris). Painel A) V2lgAFc marcado com his C-terminal foi purificada por Ni- IMAC e 1 μg de proteína recombinante foi tratado (pista direita) ou não tratado (pista esquerda) com PNGase F; Painel B) o sobrenadante bruto de Komagaatella phaffi que produz V2lgAFc foi tratado (raia direita) ou não tratado (raia esquerda) com PNGase F. Após o tratamento com PNGase F, o peso molecular é fortemente reduzido para aproximadamente 38 kDa, que corresponde ao peso molecular teórico da molécula não glicosilada. Estruturas de hipermanosil, presentes em um único sítio de N-glicosilação, adicionam mais do que 30 kDa ao peso molecular da proteína.
[0039] Figura 6: O nível de glicosilação é aumentado quando a molécula de V2lgAFc é produzida em Komagataella phaffi a partir do promotor GAP constitutivo (cultura em glicose) ao invés do promotor AOXI induzível por metanol (cultura em metanol). O MW médio da proteína produzida por promotor GAP é ao redor de 70 kDa, enquanto que o MW esperado para a proteína de V2lgAFc não glicosilada seria de 38,4 kDa. Descrição Detalhada da Invenção
[0040] A presente invenção será descrita com relação às modalidades particulares e com referência a certos desenhos, mas a invenção não é limitada a isso, mas somente pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser interpretados como limitativos do escopo. Naturalmente, deve ficar entendido que não necessariamente todos os aspectos ou vantagens podem ser alcançados em conformidade com qualquer modalidade particular da invenção. Assim, por exemplo, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser concretizada ou realizada de uma maneira que alcance ou otimize uma vantagem ou grupo de vantagens conforme aqui ensinado sem necessariamente alcançar outros aspectos ou vantagens como pode ser ensinado ou sugerido nesta invenção.
[0041] A invenção, tanto como organização quanto como método de operação, juntamente com as suas características e vantagens, pode ser de melhor modo compreendida por referência à seguinte descrição detalhada quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Os aspectos e vantagens da invenção serão evidentes e elucidados com referência às modalidades descritas a seguir. Referência ao longo deste relatório descritivo a "alguma modalidade" ou "uma modalidade" significa que um aspecto, estrutura ou característica particular descrita em conexão com a modalidade é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, o aparecimento das frases "em alguma modalidade" ou "em uma modalidade" em vários lugares por todo este relatório descritivo não são necessariamente todas referindo-se à mesma modalidade, mas pode. De forma semelhante, deve ser observado que na descrição das modalidades exemplares da invenção, vários aspectos da invenção são às vezes agrupados entre si em uma única modalidade, figura, ou sua descrição, para o propósito de simplificar a descrição e auxiliar na compreensão de um ou mais dos vários aspectos inventivos. Este método de divulgação, no entanto, não deve ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada requer mais características do que as expressamente citadas em cada reivindicação. De preferência, conforme as seguintes reivindicações refletem, os aspectos inventivos situam-se em menos de todas as características de uma única modalidade divulgada anteriormente.
[0042] Onde um artigo indefinido ou definido é utilizado quando se refere a um substantivo singular, por exemplo, "um" ou "uma", "o" ou "a", isto inclui um plural deste substantivo a menos que algo diferente seja especificamente mencionado. Onde o termo "compreendendo" é usado na presente descrição e reivindicações, ele não exclui outros elementos ou etapas. Além disso, os termos primeiro, segundo,
terceiro e assim por diante na descrição e nas reivindicações, são utilizados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem sequencial ou cronológica. Deve ficar entendido que os termos assim utilizados são trocáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção aqui descritas são capazes de operação em outras sequências do que as descritas ou ilustradas nesta invenção. Os seguintes termos ou definições são fornecidos unicamente para ajudar no entendimento da invenção. A menos que especificamente aqui definido, todos os termos aqui utilizados têm o mesmo significado que teriam para uma pessoa versada na técnica da presente invenção. Os profissionais são particularmente direcionados para Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016), para definições e termos da técnica. As definições aqui fornecidas não devem ser interpretadas como tendo um escopo menor do que o entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica.
[0043] "Cerca de" como aqui utilizado quando se refere a um valor mensurável tal como uma quantidade, uma duração temporal, e semelhantes, significa abranger variações de ± 20% ou ± 10%, mais preferivelmente ± 5%, ainda mais preferivelmente ± 1%, e ainda mais preferivelmente ± 0,1% do valor especificado, já que tais variações são apropriadas para executar os métodos divulgados.
[0044] "Sequência de nucleotídeo", "sequência de DNA", "elementos de DNA" ou "moléculas de ácido nucleico" conforme aqui utilizados, referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim,
este termo inclui DNA e RNA de fita dupla e simples. Também inclui tipos conhecidos de modificações, por exemplo, substituição de "caps" de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo. "Sequência de codificação" é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita em mRNA e/ou transladada em um polipeptídeo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códon de início da translação no terminal 5' e um códon de parada da translação no terminal 3'. Uma "sequência de codificação" pode incluir, mas não é limitada a estas, mRNA, cDNA, sequências de nucleotídeo recombinante ou DNA genômico, enquanto que íntrons também podem estar presentes sob certas circunstâncias. "Ortólogos" são genes de organismos diferentes que se originaram através de especiação, e também são derivados de um gene ancestral comum.
[0045] Os termos "elemento regulador", "sequência de controle" e "promotor" ou "região promotora de um gene" são todos utilizados de modo trocável nesta invenção e devem ser tomados em um contexto amplo para se referir às sequências reguladoras de ácido nucleico que são uma unidade de sequência de DNA funcional capaz de efetuar a expressão das sequências às quais elas são ligadas. O termo "promotor" refere-se tipicamente a uma sequência de controle de ácido nucleico localizada a montante do início transcricional de um gene, ou está ligado de maneira operável a uma sequência de codificação, e quando possivelmente colocado nas condições de indução apropriadas, é suficiente para promover a transcrição da dita sequência de codificação através do reconhecimento de sua sequência e ligação de RNA polimerase e outras proteínas. Incluídos pelos termos anteriormente mencionados estão as sequências reguladoras transcricionais derivadas de um gene genômico eucariótico clássico (incluindo a caixa TATA que é necessária para o início preciso da transcrição, com ou sem uma sequência de caixa CCAAT) e elementos reguladores adicionais (isto é, sequências de ativação a montante, intensificadores e silenciadores) que alteram a expressão gênica em resposta a estímulos de desenvolvimento e/ou externos, ou de uma maneira específica do tecido.
Também incluída dentro do termo é uma sequência reguladora transcricional de um gene procariótico clássico, em cujo caso pode incluir uma sequência caixa -35 ou sequências reguladoras transcricionais caixa -10. O termo "elemento regulador" também abrange uma molécula de fusão sintética ou derivada que confere, ativa ou intensifica a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, tecido ou órgão.
Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "peptídeo" são utilizados de modo trocável aqui mais adiante para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido e às variantes e análogos sintéticos dos mesmos.
Assim, estes termos se aplicam aos polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um aminoácido sintético não natural, tal como um análogo químico de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como aos polímeros de aminoácido de ocorrência natural.
Este termo também inclui modificações pós- translacionais do polipeptídeo, tal como glicosilação, fosforilação e acetilação.
Por "polipeptídeo recombinante" entenda-se um polipeptídeo produzido utilizando técnicas recombinantes, isto é, através da expressão de um polinucleotídeo recombinante ou sintético.
O termo "expressão" ou "expressão gênica" significa a transcrição de um gene específico ou genes específicos ou construção genética específica.
O termo "expressão" ou "expressão gênica", em particular, significa a transcrição de um gene ou genes ou construção genética em RNA (rRNA, tRNA) ou mRNA estrutural com ou sem translação subsequente do último em uma proteína.
O processo inclui a transcrição de DNA e processamento do produto de mRNA resultante.
O termo "célula hospedeira recombinante", "célula planejada", "célula hospedeira de expressão", "sistema hospedeiro de expressão", "sistema de expressão" ou simplesmente "célula hospedeira", conforme aqui utilizado, é proposto para se referir a uma célula na qual um vetor recombinante e/ou construção de gene quimérico foi introduzido. Deve ficar entendido que tais termos pretendem referir-se não somente à célula objeto particular, mas à progênie de uma tal célula. Visto que certas modificações podem ocorrer nas gerações sucessivas devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie pode, de fato, não ser idêntica à célula de origem, mas está ainda incluída dentro do escopo do termo "célula hospedeira" conforme aqui utilizado. Uma célula hospedeira recombinante pode ser uma célula isolada ou linhagem celular desenvolvida em cultura, as células podem ser células procarióticas, células eucarióticas tais como células animais, células vegetais, células fúngicas tais como fungos filamentosos, preferivelmente uma célula é uma célula de levedura recombinante.
[0046] O termo "endógeno", conforme aqui utilizado, refere-se às substâncias (por exemplo, genes) originárias de dentro de um organismo, tecido ou célula. Analogamente, "exógeno" conforme aqui utilizado, é qualquer material originado fora de um organismo, tecido ou célula, mas que está presente (e tipicamente pode se tornar ativo) naquele organismo, tecido ou célula.
[0047] O trato gastrintestinal (Gl) é um ambiente hostil para polipeptídeos porque é evolucionariamente otimizado para destruir nutrientes e desativar patógenos. O pH altamente acídico no estômago resulta na protonação de proteínas e seu desdobramento, que expõe mais motivos que são reconhecidos por enzimas de degradação de proteínas. As enzimas no estômago (pepsina), intestino delgado (por exemplo, quimotripsina, amino- e carboxipeptidases) e as enzimas produzidas pelo pâncreas e suco biliar dividem as proteínas em fragmentos menores e unidades individuais.
Visto que os polipeptídeos terapeuticamente ativos (por exemplo, componentes profiláticos, terapêuticos e de vacina) também são afetados por estes processos, a fração que sobrevive a estes processos de degradação é geralmente baixa e variável, especialmente na presença de alimento.
Além disso, os fármacos de polipeptídeo necessitam superar múltiplas barreiras projetadas para impedir a entrada de antígenos dietéticos e bacterianos a fim de atingir o compartimento sistêmico.
Para acessar a camada de células epiteliais, o polipeptídeo em primeiro lugar precisa difundir através da camada de muco que cobre o epitélio intestinal.
Este epitélio é outra barreira importante, pois as junções bem apertadas que vedam as células epiteliais restringem o transporte paracelular (isto é , a passagem entre as células) para pequenas moléculas e íons menores do que 600 Da.
Além disso, a passagem através da célula é mediada por receptores endocitóticos expressos de forma luminal (por exemplo, receptor de vitamina B12, receptor de transferrina) e, portanto, necessita de conjugação com os respectivos ligantes de modo a ser explorado na liberação de fármaco.
Ainda outro ponto de acesso ao compartimento sistêmico é as células M fagocitóticas de placas de Peyer que experimentam antígenos luminais e podem absorver substratos particulares na faixa de baixo micrômetro.
No entanto, a proporção de células M no epitélio intestinal é pequena e varia grandemente entre espécies, que complica as previsões de absorção em seres humanos com base nos dados do animal.
Dada as dificuldades delineadas acima, não é surpreendentemente que apenas seis biomacromoléculas tenham sido aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para liberação oral: dois localmente e dois peptídeos sistemicamente liberados, um macrociclo não peptídico localmente liberado, e uma mistura de proteínas localmente liberada (Moroz E. et al (2016) Advanced Drug Delivery Reviews 101, 108-121). Entretanto, várias formulações oralmente aplicadas de proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos estão atualmente sob avaliação clínica. Muitas vezes, estas formulações contêm pelo menos um dos seguintes excipientes: um revestimento entérico e/ou inibidores de protease para prevenir a degradação do fármaco e intensificadores de permeação para permitir o transporte paracelular de macromoléculas. Segundo as leis da mecânica, o aumento da absorção pode ser alcançado pela interrupção mecânica das junções herméticas ou da membrana plasmática, diminuindo a viscosidade do muco e modulando as vias de sinalização de regulação da junção bem apertada. Estratégias adicionais para a liberação oral de biomacromoléculas sob desenvolvimento clínico incluem a liberação bucal, utilizando transcitose mediada por portador, e liberação local em alvos Gl. A maioria esmagadora de fármacos orais atualmente aprovados e candidatos clínicos apresenta um peso molecular de < 1000 Da. Acima desse limite, preocupações com a baixa biodisponibilidade, a variabilidade inter- e intraindividual, os efeitos alimentares e a segurança a longo prazo dos excipientes de aumento da biodisponibilidade permanecem importantes desafios da liberação oral a despeito dos avanços claros no conhecimento após quase 90 anos de tentativa e erro.
[0048] A presente invenção fornece soluções transparentes para as deficiências da distribuição oral atual de proteínas terapêuticas. Na presente invenção, de modo surpreendente observamos que uma formulação seca obtida através da secagem do meio de cultura compreendendo uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 5 kDa de leveduras recombinantes que secretam uma proteína terapêutica no meio de cultura, pode ser utilizada para a liberação oral da formulação seca. Surpreendentemente esta formulação não é apenas protegida por proteólise e degradação no trato gastrintestinal, mas a proteína terapêutica presente na formulação seca é também de forma surpreendente biologicamente ativa. Sem ter que limitar a invenção a um mecanismo ou ação particular, acreditamos que pelo menos um mecanismo é aquele em que o meio extracelular de levedura atua como uma película protegida em torno da proteína terapêutica que impede (ou retarda) a proteólise da proteína terapêutica no intestino. Isto é diferente da situação em que as proteínas terapêuticas são expressas em sementes de planta, em que a matriz de semente seca protege a proteína terapêutica da degradação (ver a WO2014033313). Ainda outro mecanismo possível é aquele em que a proteína terapêutica glicosilada consiste apenas de estruturas de açúcar manose (elevada) (por natureza de expressão em um hospedeiro de levedura recombinante). Estas estruturas volumosas de alta manose também podem proteger o peptídeo terapêutico contra a degradação proteolítica no intestino. A Figura 5 ilustra a glicosilação volumosa de alta manose presente na fusão V2A- lgAFc produzida em Pichia pastoris cuja proteína recombinante é utilizada nos presentes exemplos. A principal vantagem de nossa descoberta é que não existe nenhuma necessidade de purificação da proteína terapêutica, o que significa que uma formulação compreendendo o meio como tal ou uma formulação seca compreendendo múltiplas macromoléculas maiores do que 5 kDa presentes no meio de cultura (incluindo leveduras produzidas por suas próprias proteínas) e a proteína terapêutica presente no meio de cultura podem ser utilizadas como um produto farmacêutico oral. Estas vantagens são resumidas nas seguintes modalidades.
[0049] Em uma modalidade específica, a invenção fornece uma formulação seca compreendendo o meio de cultura de uma célula hospedeira recombinante, dita célula hospedeira que produz uma proteína exógena que é secretada no meio de crescimento (ou meio de cultivo) da referida célula hospedeira recombinante. As células hospedeiras recombinantes podem ser hospedeiros procarióticos (por exemplo, Lactococcus, Bacillus e outros hospedeiros bacterianos), hospedeiros eucarióticos tais como células vegetais, células animais, células fúngicas em particular células fúngicas filamentosas e células de leveduras. Um polipeptídeo pode ser um peptídeo terapêutico, um peptídeo profilático ou um peptídeo que pode ser utilizado em uma composição de vacina.
[0050] Em outra modalidade específica, a invenção fornece uma formulação seca compreendendo o meio de cultivo de uma levedura recombinante, dita levedura produzindo uma proteína exógena que é secretada no meio de cultivo. O "meio de cultivo" significa o caldo de fermentação (tipicamente de um caldo de fermentação de levedura de alta densidade) sem as células de levedura. O "meio de cultivo" é também conhecido como o "meio de crescimento" na técnica. Várias opções existem no processamento a jusante para separar as células de leveduras do caldo de fermentação (também conhecido como técnicas de clarificação do caldo de fermentação) tal como, por exemplo, centrifugação seguida por filtração de profundidade, centrifugação seguida por filtração de profundidade intensificada com o auxílio de filtro e também técnicas de microfiltração. Fica claro que o caldo de fermentação é uma sopa ou solução muito complexa. Fundamentalmente, o caldo de fermentação é o mar de nutrientes em que as leveduras crescem, reproduzem e também secretam o polipeptídeo terapeuticamente relevante. O caldo de fermentação tipicamente contém ingredientes nutrientes de fermentação tais como peptonas de levedura (incluindo extratos de levedura), autolisados de leveduras e leveduras inativas. O teor destes produtos varia em vitaminas B, nucleotídeos, minerais, teor de alfa-amino nitrogênio e outros compostos bioativos.
[0051] Vários processos de separação de membrana (com tamanhos de poro de membrana variáveis) são conhecidos da pessoa versada que podem ser utilizados para reduzir a concentração de componentes permeados solúveis e aumentar ainda mais a concentração de compostos retidos (aqui o polipeptídeo recombinante de interesse). A osmose inversa ou a hiperfiltração é um processo de separação por membrana, acionado por um gradiente de pressão, no qual a membrana separa o solvente de outros componentes de uma solução. A configuração de membrana é geralmente de fluxo cruzado. Com a osmose inversa, o tamanho de poro da membrana é muito pequeno, permitindo que apenas quantidades muito pequenas de solutos de peso molecular muito baixo (por exemplo, corte de 100 MW) passem através das membranas. A ultrafiltração é outro processo de separação por membrana, acionada por um gradiente de pressão, em que a membrana fraciona os componentes dissolvidos e dispersos de um líquido como uma função do seu tamanho e estrutura solvatizadas. A configuração de membrana é geralmente de fluxo cruzado. Na ultrafiltração, o tamanho de poro da membrana é maior do que no processo de osmose inversa, permitindo assim que alguns componentes passem através dos poros com a água. Trata-se de um processo de separação/fracionamento utilizando um corte de 10.000 MW. A diafiltração é outro tipo de ultrafiltração que envolve a remoção ou separação de componentes (moléculas permeáveis como sais, pequenas proteínas, solventes, etc.,) de uma solução com base em seu tamanho molecular mediante o uso de filtros permeáveis à micromolécula. Ainda outro processo que é comumente utilizado no curso da purificação e fracionamento de proteína é adicionar uma concentração de sal elevado ao meio de crescimento. As proteínas diferem notadamente em suas solubilidades em alta resistência iônica,
portanto "colocação de uma camada de sal" é um procedimento muito útil para auxiliar na purificação e concentração de proteínas presentes no meio de crescimento. Sulfato de amônio é um sal inorgânico com elevada solubilidade que se dissocia em amônio e sulfato nas soluções aquosas. Sulfato de amônio é especialmente útil como precipitante porque é altamente solúvel, estabiliza a estrutura da proteína, possui uma densidade relativamente baixa e é relativamente barato.
[0052] Portanto, em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 5 kDa presentes no meio de cultura de um fungo recombinante, dito fungo produzindo um polipeptídeo exógeno fundido a um domínio Fc que é secretado no referido meio de cultura.
[0053] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 10 kDa presentes no meio de cultura de um fungo recombinante, dito fungo produzindo um polipeptídeo exógeno fundido a um domínio Fc que é secretado no referido meio de cultura.
[0054] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 15 kDa presentes no meio de cultura de um fungo recombinante, dito fungo produzindo um polipeptídeo exógeno fundido a um domínio Fc que é secretado no referido meio de cultura.
[0055] Nas modalidades específicas, o domínio Fc nas formulações secas é um domínio Fc de IGA.
[0056] Nas modalidades específicas, o peptídeo exógeno na formulação seca é um peptídeo profilático ou terapêutico ou em que o dito peptídeo exógeno é uma vacina ou faz parte de uma vacina.
[0057] Visto que é difícil definir as formulações secas da invenção em termos de suas características técnicas e estruturais, acreditamos que estas formulações são mais adequadamente definidas nas reivindicações como "obteníveis por" formulações.
Portanto, em outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma proteína que é exógena para a levedura obtida pela secreção de dita proteína no meio de cultura de uma levedura recombinante seguida por secagem do dito meio de cultura.
Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma proteína terapêutica que é exógena para a levedura obtida através da secreção da referida proteína terapêutica no meio de cultura de uma levedura recombinante seguida pela secagem de dito meio de cultura.
Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma proteína profilática que é exógena à levedura obtida pela secreção da referida proteína profilática no meio de cultura de uma levedura recombinante seguida pela secagem de dito meio de cultura.
Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma proteína que forma parte de uma vacina que é exógena para a levedura obtida pela secreção de dita proteína no meio de cultura de uma levedura recombinante seguida por secagem do referido meio de cultura.
Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca obtida pela adição de uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 5 kDa presentes no meio de cultura de um hospedeiro fúngico recombinante, tal como um fungo filamentoso ou uma célula de levedura, a uma matriz admissível por via oral, seguido por secagem da mistura obtida, dito meio de cultura compreendendo um polipeptídeo secretado que é exógeno a dito hospedeiro recombinante.
Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende a mistura de um meio de cultura de um hospedeiro recombinante e uma matriz oralmente admissível, dito hospedeiro produzindo um polipeptídeo exógeno que é secretado no referido meio de cultura.
[0058] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende a mistura de um meio de cultura de um hospedeiro recombinante e uma matriz oralmente admissível, dito hospedeiro produzindo um polipeptídeo exógeno que é secretado no referido meio de cultura e em que o teor de água de dita formulação é reduzido através da concentração de dito meio de cultura antes da preparação da referida formulação.
[0059] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende a mistura de um meio de cultura de um hospedeiro recombinante e uma matriz oralmente admissível, dito hospedeiro produzindo um polipeptídeo exógeno que é secretado no referido meio de cultura e em que o teor de água de dita formulação é reduzido através da secagem do dito meio de cultura antes da preparação da referida formulação.
[0060] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende a mistura de um meio de cultura de um hospedeiro recombinante e uma matriz oralmente admissível, dito hospedeiro produzindo um polipeptídeo exógeno que é secretado no referido meio de cultura e em que o teor de água de dita formulação é reduzido através da secagem da referida formulação.
[0061] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca obtida pela adição de uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 5 kDa presentes no meio de cultura de um hospedeiro recombinante que compreende um polipeptídeo secretado que é exógeno ao dito hospedeiro recombinante a uma matriz oralmente admissível, seguido pela secagem da mistura obtida.
[0062] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca obtida pela adição de uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 5 kDa presentes no meio de cultura de uma célula fúngica recombinante tal como um hospedeiro filamentoso recombinante ou uma célula de levedura recombinante em que dito meio de cultura compreende um polipeptídeo secretado que é exógeno à dita célula fúngica recombinante, a uma matriz oralmente admissível, seguido por secagem da mistura obtida.
[0063] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca obtida pela adição de uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 5 kDa presentes no meio de cultura de uma célula fúngica recombinante tal como um hospedeiro filamentoso recombinante ou uma célula de levedura recombinante em que dito meio de cultura compreende um polipeptídeo secretado que é exógeno à dita célula fúngica recombinante, a uma matriz admissível oral, seguido por secagem da mistura obtida em que dita secagem é realizada através da secagem por pulverização.
[0064] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca obtida pela adição de uma pluralidade de macromoléculas maiores do que 5 kDa presentes no meio de cultura de uma célula fúngica recombinante tal como um hospedeiro filamentoso recombinante ou uma célula de levedura recombinante em que dito meio de cultura compreende um polipeptídeo secretado que é exógeno à dita célula fúngica recombinante, e uma matriz admissível oral, seguido da secagem da mistura obtida em que dita secagem é realizada através da liofilização.
[0065] Uma "matriz oralmente admissível" como definida nesta invenção é um produto que é utilizado na indústria alimentícia como um veículo, tal como, por exemplo, amido, maltodextrina, proteínas de leite de soja, celulose, pectina e goma guar. Em uma modalidade particular, a matriz oralmente admissível é uma matriz comestível. Em outra modalidade particular, a matriz oralmente admissível é um nutriente solúvel de qualidade alimentar ou uma matriz solúvel de qualidade alimentar ou uma substância solúvel de qualidade alimentar. Formulações secas
[0066] Em muitos casos, é vantajoso ter a proteína seca em um formato de pó, que facilita a sua conversão em cápsulas, comprimidos e películas finas. Vários métodos de secagem estão disponíveis na técnica para converter soluções de proteína em forma de pó seco. A maioria dos métodos de secagem envolve a remoção de solvente por sublimação tal como secagem por congelamento ou evaporação tal como secagem por pulverização e secagem ou precipitação de leito fluidizado tal como tecnologia de fluido supercrítico. Entre estes métodos, a secagem por pulverização e a secagem por congelamento são de longe os métodos industriais mais comumente utilizados de secagem de soluções de proteína. A liofilização (um termo equivalente é a secagem por congelamento) é um método de processamento para a remoção de umidade de produtos biofarmacêuticos e pode aumentar a estabilidade, a tolerância à temperatura e a vida de prateleira destes produtos. Embora a liofilização seja bem estabelecida na indústria, ela requer equipamento caro que ocupa uma grande quantidade de espaço dentro de uma instalação de produção. A liofilização também pode levar dias para completar, e os fabricantes que necessitam de um produto em pó devem incorporar uma etapa de granulação ao processo. Assim, a liofilização pode ser utilizada para obter uma formulação seca por liofilização do caldo de fermentação de levedura após as leveduras recombinantes terem sido removidas.
[0067] Assim, em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o meio de cultura de levedura recombinante em que uma proteína está presente em dito meio de cultura compreendendo a secagem de dito meio de cultura através da liofilização.
[0068] A secagem por pulverização é uma técnica alternativa para a conservação de produtos biofarmacêuticos e é um processo por meio do qual uma formulação líquida é convertida em um pó seco em uma única etapa. O processo é tipicamente executado por primeiro atomizar a solução em gotículas finas que são depois secadas rapidamente em uma grande câmara pelo uso de gás quente. As partículas secas resultantes são coletadas com um separador centrífugo. A secagem por pulverização expõe os produtos biofarmacêuticos à tensão de cisalhamento durante a etapa de atomização, que pode desestabilizar os compostos biofarmacêuticos instáveis tais como proteínas. As moléculas biológicas complexas são mais difíceis de secar por pulverização porque elas são sensíveis à alta tensão de cisalhamento. A quantidade de tensão de cisalhamento encontrada depende do tipo de atomizador e da pressão de atomização utilizada. Um bocal sônico que pode operar a uma pressão relativamente baixa de menos do que 20 psig, que minimiza a tensão de cisalhamento e permite processar produtos biofarmacêuticos complexos, é convenientemente utilizado. A secagem por pulverização foi conduzida para uma ampla variedade de produtos biofarmacêuticos tais como proteínas, enzimas, anticorpos, vírus e bactérias. O processo remove a água e restringe a mobilidade do produto biofarmacêutico, o que resulta em uma taxa de degradação significativamente reduzida. Desse modo, a secagem por pulverização pode ser utilizada para obter uma formulação seca através da secagem por pulverização do caldo de fermentação de levedura após as leveduras recombinantes terem sido removidas.
[0069] Assim, em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o meio de cultura de levedura recombinante, em que uma proteína está presente no referido meio de cultura compreendendo a secagem de dito meio de cultura através da secagem por pulverização.
[0070] Nas modalidades particulares dissacarídeos ou tensoativos são adicionados ao meio de cultura antes da secagem por pulverização ser conduzida. Os dissacarídeos e tensoativos são descritos para evitar a agregação (Broadhead J. et al. (1993) J. Pharm. Pharmacol. 46 (6) 458-467) e adicionalmente melhorar a capacidade de armazenamento da energia carregada com proteína (Adler M and Lee G (1999) J. Pharm. Sci. 88, 199-208).
[0071] Em mais outra modalidade, trealose e/ou sorbitol pode ser adicionado ao meio de cultura antes da secagem por pulverização ser realizada. É descrito que a presença de 30% em peso de sorbitol reduz substancialmente a agregação de uma proteína farmacêutica durante a secagem por pulverização e também a estabilidade à armazenagem a seco é melhorada (Maury M. et al. (2005) Eur. J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 59, 251-261), efeitos semelhantes são descritos para a trealose.
[0072] Assim, em uma modalidade particular, uma redução de viscosidade ultrassônica é aplicada antes de conduzir o processo de secagem por pulverização. A redução de viscosidade ultrassônica leva em conta uma maior carga de partículas da solução, que leva a um volume reduzido de líquido que deve ser evaporado. A redução da viscosidade ultrassônica resulta no consumo reduzido de energia e rendimento mais elevado.
[0073] A secagem por pulverização é mais escalonável em custos mais baixos com relação a equipamentos, instalações e utilidades. Além disso, o tempo de ciclo para secagem por pulverização é em horas em vez de dias, e assim os custos operacionais podem ser mais baixos do que aqueles para liofilização. Produtos alimentares
[0074] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um produto alimentar que compreende uma formulação seca como aqui previamente descrito.
[0075] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um produto alimentar que compreende uma formulação seca conforme aqui previamente descrito, em que o produto alimentar é um produto alimentar funcional.
[0076] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um produto alimentar que compreende uma formulação seca conforme aqui previamente descrito, em que o produto alimentar é um produto alimentar medicinal.
[0077] Vários produtos alimentares podem ser preparados de acordo com a invenção. Uma lista não limitativa de produtos alimentares compreende substitutos de refeição, sopas, macarrões, sorvete, molhos, temperos, pastas, petiscos, cereais, bebidas, pão, biscoitos, outros produtos de padaria, doces, barras, chocolate, goma de mascar, produtos de laticínios e produtos dietéticos. Uma argumentação dos últimos produtos e como eles podem ser preparados é apresentada na US8105592 (página 20, iniciando na linha 62 até a página 23, linha 35).
[0078] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica oral que compreende uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos em que a proteína fundida com a proteína IgAFc é uma proteína profilática ou terapêutica ou componente de vacina.
[0079] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica oral que compreende uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos em que a proteína fundida com o IgAFc é um domínio variável único de imunoglobulinas.
[0080] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica oral que compreende uma proteína de fusão
IgAFc produzida por fungos, em que a proteína fundida com o IgAFc é um domínio VHH.
[0081] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica oral que compreende uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos em que a proteína fundida com o IgAFc é um domínio VHH e em que o domínio VHH contém um sítio de N- glicosilação introduzido de forma artificial.
[0082] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica oral que compreende uma proteína produzida por fungos modificada com N-glicanos e/ou O-glicanos dos quais pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou mais do peso molecular de glicoproteína é contribuído pelos referidos N- ou O-glicanos.
[0083] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica oral que compreende uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos modificada com N-glicanos e/ou O- glicanos dos quais pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou mais do peso molecular de glicoproteína é contribuído pelos referidos N- ou O- glicanos.
[0084] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica oral que compreende uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos modificada com N-glicanos e/ou O- glicanos dos quais pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou mais do peso molecular de glicoproteína é contribuído pelos ditos N- ou O-glicanos e em que a proteína fundida com IgAFc é um domínio variável único de imunoglobulina.
[0085] Notavelmente, a estrutura de N-glicosilação que consiste principalmente de estruturas de hipermanosila adiciona mais do que 50% do peso molecular à proteína de fusão IgAFc que é produzida de forma recombinante nas leveduras. Isto é presenciado na figura 5 (veja a diferença entre a fusão V2A-IgAFc glicosilada e a proteína de fusão V2A-lgAFc desglicosilada). Também é notável que quando a proteína de fusão IgAFc é produzida sob o controle do promotor GAP constitutivo em levedura, a hiperglicosilação é ainda mais abundante do que quando a proteína de fusão IgAFc é produzida sob o controle do promotor induzível por metanol oxidase (promotor AOX) (ver a Figura 6).
[0086] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos para uso de administração oral.
[0087] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos em que a proteína fundida com IgAFc é um domínio variável único de imunoglobulina para uso de administração oral.
[0088] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos em que a proteína fundida com o IgAFc é um domínio VHH para o uso de administração oral.
[0089] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma proteína de fusão IgAFc produzida por fungos em que a proteína fundida com o IgAFc é um domínio VHH e em que o domínio VHH contém um sítio de N-glicosilação artificialmente introduzido para uso de administração.
[0090] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma proteína produzida por fungos modificada com N-glicanos e/ou O-
glicanos dos quais pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou mais do peso molecular de glicoproteína é contribuído por ditos N- ou O-glicanos para uso de administração oral.
[0091] Sem limitar a invenção a um mecanismo particular, acreditamos que as estruturas de glicano hipermanosiladas como produzidas por células fúngicas na proteína recombinante (fusão) protegem a proteína recombinante no intestino de modo que estas proteínas recombinantes hipermanosiladas sejam adequadas para a liberação oral.
[0092] O termo "domínio variável único de imunoglobulina" (abreviado como "ISVD"), equivalente ao termo "domínio variável único", define moléculas em que o sítio de ligação ao antígeno está presente e formado por um único domínio de imunoglobulina. Isto estabelece domínios variáveis únicos de imunoglobulina separados das imunoglobulinas "convencionais" ou seus fragmentos, em que dois domínios de imunoglobulina, em particular dois domínios variáveis, interagem para formar um sítio de ligação ao antígeno. Tipicamente, nas imunoglobulinas convencionais, um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) interagem para formar um sítio de ligação ao antígeno. Neste caso, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) tanto de VH quanto de VL irão contribuir com o sítio de ligação ao antígeno, isto é, um total de 6 CDRs estará envolvido na formação de sítio de ligação ao antígeno.
[0093] Em vista da definição acima, o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo convencional de 4 cadeias (tal como um IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE; conhecido na técnica) ou de um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv tal como um fragmento Fv ou scFv ligado por dissulfeto, ou um diacorpo (todos conhecidos na técnica) derivado de tal anticorpo convencional de 4 cadeias, normalmente não seria considerado como um domínio variável único de imunoglobulina, como, nestes casos, a ligação ao respectivo epítopo de um antígeno normalmente não ocorreria por um domínio de imunoglobulina (único), mas por um par de domínios de imunoglobulina (associados) tais como domínios variáveis de cadeia leve e pesada, isto é, por um par de VH-VL de domínios de imunoglobulina, que se ligam conjuntamente a um epítopo do respectivo antígeno.
[0094] Ao contrário, domínios variáveis únicos de imunoglobulina são capazes de se ligar especificamente a um epítopo do antígeno sem emparelhamento com um domínio variável de imunoglobulina adicional. O sítio de ligação de um domínio variável único de imunoglobulina é formado por um único domínio VH/VHH ou VL. Portanto, o sítio de ligação de antígeno de um domínio variável único de imunoglobulina é formado por não mais do que três CDRs.
[0095] Como tal, o domínio variável único pode ser uma sequência de domínio variável de cadeia leve (por exemplo, uma sequência de VL) ou um fragmento adequado desta; ou uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência de VH ou uma sequência de VHH) ou um fragmento apropriado desta; contanto que seja capaz de formar uma unidade de ligação ao antígeno isolada (isto é, uma unidade de ligação ao antígeno funcional que consiste essencialmente do domínio variável único, de tal modo que o domínio de ligação ao antígeno único não precisa interagir com outro domínio variável para formar uma unidade de ligação ao antígeno funcional).
[0096] Em uma modalidade da invenção, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina são sequências de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência de VH); mais especificamente, os domínios variáveis únicos de imunoglobulina podem ser sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de anticorpo convencional de quatro cadeias ou sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo de cadeia pesada.
[0097] Por exemplo, o domínio variável único de imunoglobulina pode ser um anticorpo de domínio (único) (ou uma sequência de aminoácido que é adequada para utilização como um anticorpo de domínio (único)), um "dAb" ou dAb (ou uma sequência de aminoácido que é adequada para uso como um dAb) ou um Nanobody (conforme definido aqui, e incluindo, mas não limitado a um VHH); outros domínios variáveis únicos, ou qualquer fragmento adequado de qualquer um destes.
[0098] Em particular, o domínio variável único de imunoglobulina pode ser um Nanobody® (como aqui definido) ou um fragmento adequado deste. [Nota: Nanobody®, Nanobodies® e Nanoclone® são marcas registradas da Ablynx N.V.] Para uma descrição geral de Nanobodies, referência é feita à descrição adicional abaixo, assim como à técnica anterior citada nesta invenção, tal como, por exemplo, descrita no WO 08/020079 (página 16).
[0099] "Domínios VHH", também conhecidos como VHHs, domínios VHH, fragmentos de anticorpos de VHH e anticorpos de VHH, foram originalmente descritos como o domínio de imunoglobulina de ligação ao antígeno (variável) de "anticorpos de cadeia pesada" (isto é, de "anticorpos desprovidos de cadeias leves"; Hamers-Casterman et al (1993) Nature 363: 446-448). O termo "domínio VHH" foi escolhido para distinguir estes domínios variáveis dos domínios variáveis de cadeia pesada que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 cadeias (que são referidos aqui como "domínios VH" ou "domínios VH") e dos domínios variáveis de cadeia leve que estão presentes em anticorpos convencionais de 4 de cadeias (que são referidos aqui como "domínios VL" ou "domínios VL"). Para uma descrição adicional de VHH e Nanobodies, referência é feita ao artigo de Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001), assim como aos seguintes pedidos de patente, que são mencionados como técnica antecedente geral: WO 94/04678, WO 95/04079 e WO 96/34103 da Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193 da Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 e WO 03/055527 da Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 da Algonomics N.V. and Ablynx N.V.; WO 01/90190 pela National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1433793) pelo Institute of Antibodies; assim como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/079372, WO 06/122786, WO 06/122787 e WO 06/122825, da Ablynx N.V. e os outros pedidos de patentes publicados por Ablynx N.V.
Referência também é feita para à outra técnica anterior mencionada nestes pedidos, e em particular à lista de referências mencionadas nas páginas 41 a 43 do Pedido Internacional WO 06/040153, cuja lista e referências são aqui incorporadas por referência.
Conforme descrito nestas referências, os Nanobodies (em particular sequências de VHH e Nanobodies parcialmente humanizados) podem, em particular, ser caracterizados pela presença de um ou mais "resíduos de Hallmark" em uma ou mais das sequências estruturais.
Uma descrição adicional dos Nanobodies, incluindo humanização e/ou camelização de Nanobodies, assim como outras modificações, partes ou fragmentos, derivados ou "fusões de Nanobodies", construções multivalentes (incluindo alguns exemplos não limitativos de sequências conectoras) e diferentes modificações para aumentar a meia-vida dos Nanobodies e suas preparações podem ser encontradas, por exemplo, nas WO
08/101985 e WO 08/142164. Para uma descrição geral adicional de Nanobodies, referência é feita à técnica anterior aqui citada, tal como, por exemplo, descrita no WO 08/020079 (página 16).
[00100] "Anticorpos de domínio", também conhecidos como "Dabs", "Anticorpos de Domínio" e "dAbs" (os termos "Anticorpos de Domínio" e "dAbs" sendo utilizados como marcas registradas pelo grupo GlaxoSmithKline de companhias) foram descritos em, por exemplo, EP 0368684, Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989), Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003) e WO 03/002609, assim como, por exemplo, WO 04/068820, WO 06/030220, WO 06/003388 e outros pedidos de patente publicados da Domantis Ltd. Os anticorpos de domínio essencialmente correspondem aos domínios VH ou VL de mamíferos não camelídeos, em particular anticorpos humanos de 4 cadeias. A fim de ligar um epítopo como um domínio de ligação ao antígeno único, isto é, sem ser correlacionado com um domínio VL ou VH, respectivamente, uma seleção específica para tais propriedades de ligação ao antígeno é necessária, por exemplo, através do uso de bibliotecas de sequências de domínio VH ou VL único humano. Os anticorpos de domínio possuem, como VHHs, um peso molecular de aproximadamente 13 a aproximadamente 16 kDa e, se derivados de sequências completamente humanas, não requerem humanização para, por exemplo, uso terapêutico em seres humanos.
[00101] Deve-se observar também que os domínios variáveis únicos podem ser derivados de certas espécies de tubarão (por exemplo, os assim chamados "domínios IgNAR", ver, por exemplo, a WO 05/18629).
[00102] Assim, no significado da presente invenção, o termo "domínio variável único de imunoglobulina" ou "domínio variável único" compreende polipeptídeos que são derivados de uma fonte não humana, de preferência um camelídeo, preferivelmente um anticorpo de cadeia pesada de camelídeo. Eles podem ser humanizados, conforme descrito anteriormente. Além do mais, o termo compreende polipeptídeos derivados de fontes não camelídeos, por exemplo, camundongo ou ser humano, que foram "camelizados", como, por exemplo, descrito em Davies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994; Biotechnol. 13: 475-479, 1995; Prot. Eng. 9: 531-537, 1996) e Riechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999).
[00103] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o meio de cultura de levedura recombinante em que uma proteína está presente no referido meio de cultura compreendendo: i) cultivar uma levedura recombinante que compreende uma proteína e que permite secretar dita proteína no meio de cultura, ii) separar as células de leveduras recombinantes a partir do meio de cultura, iii) concentrar o dito meio de cultura num processo de separação por membrana, e iv) secar o dito meio de cultura concentrado.
[00104] Métodos para gerar leveduras recombinantes são bem conhecidos na técnica. Resumidamente, os vetores de expressão que compreendem genes quiméricos que codificam as proteínas recombinantes estão presentes na levedura recombinante. O vetor de expressão pode ser integrado no genoma ou pode ser de replicação autônoma na levedura recombinante. Vetores que se integram no cromossoma hospedeiro são mais amplamente utilizados por causa da sua estabilidade mitótica na ausência de uma seleção. No entanto, os vetores de expressão epissomal existem para alguns sistemas de leveduras. Os vetores de expressão tipicamente contêm um promotor/terminador de levedura forte e um cassete marcador selecionável de levedura. A maioria dos vetores de levedura pode ser propagada e amplificada em E. coli para facilitar a clonagem e como tal, também contém uma origem de replicação de E. coli e marcador selecionável de ampicilina. Finalmente, muitos vetores de expressão de levedura incluem a capacidade de clonar opcionalmente um gene a jusante de um líder de secreção eficiente (por exemplo, aquele do fator de acasalamento ou da sequência de Ost1 (Fitzgerald I & Glick BS (2014) Microbial cell factories 13, 1)) que eficientemente direciona uma proteína heteróloga a tornar-se secretada a partir da célula. Um gene quimérico compreende um promotor acoplado de maneira operável a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de sinal que é acoplada de maneira operável a um gene recombinante que codifica um polipeptídeo útil. Um promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível.
[00105] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o caldo de fermentação de uma levedura recombinante em que uma proteína está presente no referido meio de cultura compreendendo: i) cultivar uma levedura recombinante que compreende uma proteína e que permite secretar dita proteína terapêutica no meio de cultura, ii) secar o dito caldo de fermentação (compreendendo a levedura recombinante e o meio de cultura).
[00106] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca da invenção que ainda compreende células de levedura.
[00107] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca da invenção que ainda compreende células de levedura não recombinantes.
[00108] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o meio de cultura de levedura recombinante em que uma proteína exógena está presente em dito meio de cultura e as células de levedura não recombinantes compreendendo: i) cultivar uma levedura recombinante que compreende uma proteína exógena e que permite secretar dita proteína no meio de cultura, ii) separar as células de levedura recombinantes do meio de cultura, iii) concentrar o dito meio de cultura num processo de separação por membrana, iv) adicionar células de levedura não recombinantes ao meio de cultura v) secar o dito meio de cultura.
[00109] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o meio de cultura de uma levedura recombinante em que uma proteína exógena está presente no referido meio de cultura e as células de levedura não recombinantes compreendendo: i) cultivar uma levedura recombinante que compreende uma proteína exógena e que permite secretar dita proteína exógena no meio de cultura, ii) separar as células de levedura recombinantes do meio de cultura, iii) secar o dito meio de cultura, iv) adicionar uma formulação seca de células de levedura não recombinantes ao meio de cultura seco obtido na etapa iii).
[00110] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca da invenção que ainda compreende uma formulação rica em proteína que é diferente das proteínas presentes no caldo de fermentação de levedura.
[00111] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o meio de cultura de uma levedura recombinante em que uma proteína exógena está presente em dito meio de cultura e uma formulação rica em proteína que é diferente das proteínas presentes no caldo de fermentação de levedura compreendendo: i) cultivar uma levedura recombinante que compreende uma proteína exógena e que permite secretar dita proteína no meio de cultura, ii) separar as células de levedura recombinantes do meio de cultura, iii) adicionar uma formulação rica em proteína ao meio de cultura, iv) secar o dito meio de cultura.
[00112] Em mais outra modalidade, a invenção fornece um método para produzir uma formulação seca que compreende o meio de cultura de levedura recombinante em que uma proteína terapêutica está presente em dito meio de cultura e células de levedura não recombinantes compreendendo: i) cultivar uma levedura recombinante que compreende uma proteína exógena e que permite secretar dita proteína no meio de cultura, ii) separar as células de levedura recombinantes do meio de cultura, iii) secar o dito meio de cultura, iv) adicionar uma formulação seca de uma formulação rica em proteína ao meio de cultura seco obtido na etapa iii).
[00113] Em mais outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende o meio de cultura de uma levedura recombinante, dita levedura produzindo uma proteína de fusão Fc exógena que é secretada no meio de cultura.
[00114] Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende o meio de cultura de uma levedura recombinante, dita levedura produzindo uma proteína de fusão Fc exógena que é secretada no meio de cultura e em que dito domínio Fc é um domínio Fc de IgA.
[00115] Devido às dificuldades para descrever estruturalmente as formulações secas da invenção em termos de suas características técnicas, é mais apropriado definir as formulações secas no formato de reivindicação "obtenível por". Portanto, em outra modalidade, a invenção fornece uma formulação seca que compreende uma proteína de fusão exógena entre um domínio Fc e um polipeptídeo obtido pela secreção de dita proteína exógena no meio de cultura de uma levedura recombinante seguida pela secagem de dito meio de cultura. Proteínas de fusão Fc
[00116] Uma região Fc (região cristalizável em fragmento) é a região residual de uma imunoglobulina que interage com receptores da superfície celular denominados receptores Fc e algumas proteínas do sistema complementar. De acordo com as modalidades particularmente consideradas, a região Fc na proteína de fusão Fc é uma região Fc de um isótipo de imunoglobulina G (IgG). Isto pode ser qualquer uma das subclasses de IgG (lgG1, 2, 3, 4 em seres humanos). Para IgG, como isótipos de IgA e IgD, a região Fc é composta de dois fragmentos de proteína idênticos, derivados dos segundo e terceiro domínios constantes das duas cadeias pesadas do anticorpo. Em outra modalidade, a parte Fc na proteína de fusão é derivada de um anticorpo de IgA. As "proteínas de fusão Fc" como aqui utilizadas são proteínas de fusão, em que uma região Fc é fundida a uma proteína ou peptídeo. Uma classe particular de proteínas contendo Fc são proteínas contendo Fc que podem se ligar a um antígeno. Exemplos são anticorpos, ou proteínas de fusão em que uma região Fc está ligada a um componente de ligação (por exemplo, um nanocorpo, uma região Fab, uma região F(ab')2). Além disso, a invenção não é limitada às sequências humanas. Por exemplo, é possível que a região Fc seja aquela de um camundongo, ou de uma camelídeo, um macaco reso, um cachorro, uma vaca, um porquinho da índia, uma ovelha, um porco, uma cabra, um cavalo, um rato, um coelho, um gato, ou qualquer outro mamífero. É mesmo possível que a região Fc seja de animais não mamíferos (por exemplo, uma galinha). Em exemplos específicos, um componente de ligação pode ser um arcabouço de não anticorpo. Os arcabouços de não anticorpos de um modo geral caem dentro de duas classes estruturais, a saber, compostos com tamanho de domínio (em peso molecular de 6 a 20 kDa) e peptídeos limitados (2 a 4 kDa). Os scaffolds de tamanho de domínio incluem Affibodies, Affilins, Anticalins, Atrimers, DARPins, FN3 scaffolds (por exemplo, Adnectins e Centyrins), Funomers, domínios Kunitz, Pronectins e OBodies, enquanto que Avimers, peptídeos bicíclicos e Cys-knots são relacionados com peptídeos (ver Vazquez-Lombardi R et al (2015) Drug Discovery Today 20, 10, 1271 para uma revisão compreensiva). Formulação farmacêutica
[00117] Em uma modalidade específica, as formulações secas da invenção podem ser encapsuladas com qualquer tecnologia de cápsula macia ou sólida disponível para resultar em uma forma de dosagem farmacêutica oral sólida que pode ainda compreender revestimentos de liberação entérica ou retardada.
[00118] Em ainda outro aspecto, a formulação seca pode ser dissolvida em um líquido para obter uma emulsão (ver Moreira TC et al (2016) Colloids Surf B. Biointerface 143: 399-405). Assim, em um aspecto particular, a formulação farmacêutica é um líquido. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 10% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 9% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 8% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 7% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 6% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 5% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 4% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 3% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 2% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 1% (p/p) de água. Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a presente invenção é um líquido e compreende menos do que 0% (p/p) de água.
[00119] Em certos aspectos da presente invenção, a formulação farmacêutica pode compreender excipientes adicionais comumente encontrados em formulações farmacêuticas, exemplos de tais excipientes incluem, mas não são limitados a estes, antioxidantes, agentes antimicrobianos, inibidores de enzima, estabilizantes, conservantes, aromatizantes, adoçantes e outros componentes como descrito no Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe et al., Eds., 7th Edition, Pharmaceutical Press (2012), que é aqui incorporado por referência.
[00120] Estes excipientes adicionais podem estar em uma quantidade de cerca de 0,05 a 5% em peso da formulação farmacêutica total. Antioxidantes, agentes antimicrobianos, inibidores de enzima, estabilizantes ou conservantes tipicamente fornecem até cerca de 0,05 a 1% em peso da formulação farmacêutica total. Agentes adoçantes ou aromatizantes tipicamente fornecem até cerca de 2,5% ou 5% em peso da formulação farmacêutica total.
[00121] As formulações farmacêuticas orais de acordo com esta invenção podem ser formuladas como formas de dosagem sólidas.
[00122] As formulações farmacêuticas orais de acordo com esta invenção podem ser formuladas como formas de dosagem sólidas e podem ser selecionadas do grupo que consiste em cápsulas, comprimidos, drágeas, pílulas, pastilhas, pós e grânulos.
[00123] As formulações farmacêuticas orais de acordo com esta invenção podem ser formuladas como formas de dosagem multiparticuladas.
[00124] As formulações farmacêuticas orais de acordo com esta invenção podem ser formuladas como formas de dosagem multiparticuladas e podem ser selecionadas do grupo que consiste em grânulos, micropartículas, nanopartículas, formulações de carga líquida ou semi-sólida em cápsulas macias ou sólidas, cápsulas macias-sólidas revestidas entéricas.
[00125] Em um aspecto, as formulações farmacêuticas orais podem ser preparadas com um ou mais revestimentos tais como revestimentos entéricos ou ser formuladas como formulações de liberação retardada de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica.
[00126] Em um aspecto, a formulação farmacêutica de acordo com a invenção é utilizada para a preparação de um medicamento.
[00127] O termo "tensoativo" como aqui utilizado refere-se a qualquer substância, em particular um detergente, que pode adsorver em superfícies e interfaces, tal como, mas não limitado a líquido a ar, líquido a líquido, líquido a recipiente ou líquido a qualquer sólido.
[00128] O termo "fármaco", "produto terapêutico", "medicamento" ou "remédio", quando aqui utilizado, refere-se a um ingrediente ativo utilizado em uma formulação farmacêutica, que pode ser utilizada para aplicações profiláticas, terapêuticas ou de vacina e, dessa maneira, também se referem ao que foi definido como "produto terapêutico macromolecular" ou "macromolécula terapêutica" ou "macromolécula profilática" ou "macromolécula de vacina" no presente pedido de patente. Profilático/Tratamento/vacinas
[00129] As formulações secas da invenção compreendendo um polipeptídeo podem ser utilizadas para uma variedade de doenças, obviamente dependendo da natureza do peptídeo. Por exemplo, quando o peptídeo for um peptídeo terapêutico, então diversas doenças incluem – mas não são limitadas a estas – distúrbios neurodegenerativos, câncer, distúrbios hematológicos, distúrbios imunológicos, distúrbios cardíacos, distúrbios hepáticos, distúrbios respiratórios, distúrbios de má absorção, diabetes, infecções virais, infecções fúngicas, infecções bacterianas, doenças oculares, distúrbios metabólicos raros e hipertensão.
[00130] Em uma modalidade específica, a invenção fornece formulações secas da invenção para o uso no tratamento de distúrbios gastrointestinais. Exemplos não limitativos de distúrbios gastrointestinais compreendem síndrome do intestino irritável, constipação, hemorróidas (por exemplo, hemorroidas internas), fissura anal, doença diverticular, pólipos de cólon, câncer de cólon, colite infecciosa, colite ulcerativa, doença de Crohn, colite isquêmica, colite por radiação e mucosite intestinal.
[00131] Em mais outra modalidade específica, a invenção fornece formulações secas da invenção para uso no tratamento de distúrbios bucais (ou da boca), tais como chagas do frio, feridas de câncer, aftas, leucoplasia, boca seca, gengiva, mau hálito, cáries dentais, doenças periodontais (por exemplo, gengivite), Candidíase oral, infecções pelo vírus da Herpex Simplex, infecções orais por papilomavírus humano, úlceras aftosas recorrentes, cancros orais e faríngeas e mucosite oral.
[00132] As proteínas terapêuticas presentes nas formulações secas da invenção compreendem anticorpos monoclonais, fatores de crescimento, interleucinas e semelhantes. Em outro aspecto, os polipeptídeos exógenos podem ser utilizados para propósitos de vacina. Em particular, os polipeptídeos exógenos podem ser utilizados isoladamente como uma vacina ou podem formar parte de uma composição de vacina. Leveduras recombinantes
[00133] Em uma modalidade específica, as leveduras recombinantes utilizadas para preparar as formulações secas da invenção são espécies de levedura que adquiriram a condição de GRAS. GRAS significa Generally Regarded as Safe (geralmente considerado como seguro). A levedura que possui a condição de GRAS inclui leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica e Kluyveromyces lactis. A produção de proteínas terapêuticas em leveduras recombinantes é bem conhecida da pessoa versada na técnica. Para a levedura Pichia pastoris existe, por exemplo, a revisão de Julien C (2006) BioProcess International, January, p. 22-31, para Saccharomyces cerevisiae existe, por exemplo, a revisão de Nielsen J
(2013) Bioengineered 4:4, 207-211, para Hansenula polymorpha existe a revisão de Cox H. et al (2000) Yeast, Volume 16, 13, pp. 1191-1203, para Kluyveromyces lactis existe a revisão de van Ooyen AJJ et al (2006) FEM Yeast Res 6, 381-392 e para Yarrowia lipolytica existe a revisão de Madzak C et al (2004) J. Biotechnol. 109(1-2):63-81.
[00134] Deve ficar entendido que embora as modalidades específicas, configurações específicas, assim como materiais e/ou moléculas tenham sido debatidas aqui com relação às células de levedura recombinantes planejadas e métodos de acordo com a presente invenção, várias alterações ou modificações na forma e detalhes podem ser feitas sem se afastar do escopo e espírito desta invenção. Os seguintes exemplos são providos para melhor ilustrar as modalidades particulares, e eles não devem ser considerados como limitativos do pedido. O pedido é limitado somente pelas reivindicações. Exemplos
1. Fusões VHH-lgAFc monoméricas produzidas por Pichia liberadas por via oral são eficazes na prevenção de infecção F4-ETEC em leitões
[00135] As fusões VHH-lgAFc monoméricas, designadas como V2A e V3A, que foram previamente geradas e avaliadas em sementes de Arabidopsis (ver Virdi et al (2013) 110, 29, 11809-11814), foram agora também produzidas na levedura Pichia pastoris e em sementes de soja. Resumidamente, anticorpos isolados de cadeia pesada de lhama (VHHs) foram gerados contra fímbrias F4+ ETEC. Os VHHs de F4+ ETEC selecionados foram enxertados na parte otimizada do códon da lgAb suína. As Fusões VHH-lgAFc resultantes são designadas como V2A e V3A. Os níveis de expressão das fusões VHH-lgAFc funcionais foram avaliados utilizando ELISA com os reservatórios revestidos com antígeno – FaeG de aderência de ponta de F4-ETEC, e detectados com IgA anti-porco conjugado à peroxidase de rábano silvestre. A Figura 1 mostra um exemplo típico de triagem de um clone de Pichia (ver a Fig. 1A) ou estoques de semente de soja (ver a Fig. B). Vinte colônias individuais foram submetidas à triagem para cada um dos anticorpos de V2A e V3A produzidos por Pichia. Similarmente, de 10 a 12 sementes foram submetidas à triagem de cada um dos eventos de soja transformados. 5 tais eventos foram selecionados para V2A e V3A cada um. Os estoques de semente de alta expressão foram retidos, e uma parte dos quais também foi utilizada para a elevação de estoques de sementes homozigotas T3. O nível de expressão de V2A e V3A produzidas por soja foi calculado como sendo ao redor de 0,2% de peso de semente, que foi similar ao nível de expressão nas sementes de Arabidopsis. O nível de expressão das V2A e V3A secretada por Pichia foi tão alto quanto 100 mg/l (analisado em géis de SDS-PAGE corados com azul de Coomassie). No entanto, a análise funcional baseada em ELISA mostrou que 1 ml de sobrenadante de Pichia era equivalente a 1 ml de soja ou extrato de sementes de Arabidopsis (5 mg de semente) (ver a Figura 2). E provável que a quantificação da VHH-lgAFc produzida por Pichia tenhqa sido obstruída devido à proteção por meio dos glicanos de Pichia, nesta configuração de ELISA. De fato, a análise de immunoblot do sobrenadante de Pichia (ver a Fig. 2C) e extratos de sementes de soja (ver a Fig. 1D) mostra marcações claras de glicosilação diferencial. A VHH-lgAFc de Pichia migra mais do que 50 k Da (~52 k Da) enquanto que a VHH-lgAFc produzida por soja é menor do que 50 kDa (~48 kDa) (ver a Fig. 1, C-D). Fusões de VHH-lgAFc produzidas por Pichia e soja impedem a infecção de ETEC em leitões
[00136] A eficácia in vivo do coquetel de anticorpos de VHH-lgAFc produzido por Pichia e semente de V2A e V3A (dose 5 mg/porco/dia),
foi avaliada no experimento de desafio de ração de leitão.
As VHH- lgAFc monomérica produzidas por Arabidopsis anteriormente gerada (Ver Virdi et al., 2013) (PNAS 110, 29, 11809-11814) serviram como uma referência (grupo de Arabidopsis), enquanto que a alimentação não contento nenhum anticorpo (Ração de linhaça, Fig. 3A) serviu como controle negativo.
Os seis leitões soro negativos de F4-ETEC e positivos do genótipo do receptor F4 (F4R) presentes em cada um dos grupos receberam a alimentação experimental durante um período de 10 dias.
No terceiro dia, todos os leitões foram estimulados com bactéria F4-ETEC 1010 durante dois dias consecutivos (dia 0 e dia 1) e o efeito resultante da infecção foi monitorado através da análise de eliminação diária da cepa de estímulo até o dia 14 (Fig. 3B). Os leitões foram submetidos à eutanásia no dia 14, em cujo ponto as bactérias F4-ETEC nos conteúdos do jejuno, íleo e ceco também foram determinadas (Tabela 1).
Tabela 1: Eliminação das F4-ETEC nas fezes (Log10) por grama de fezes para cada leitão
48/76 Legenda: dia – soja – Pichia – controle – porco – jejuno – íleo – ceco - sem fezes.
Nota: a observação após a morte revelou que o leitão 18 do grupo de Arabidopsis teve hérnia umbilical com extremo estrangulamento do intestino delgado, resultando em passagem obstrutiva. Portanto, os dados para o leitão 18 não estão incluídos no gráfico de eliminação (Fig. 3B) ou na análise estatística (os dados estão relatados na tabela 1).
[00137] Também após a eutanásia, o ensaio de aderência de F4- ETEC executado utilizando os enterócitos vilosos intestinais mostrou de 41 a 85 bactérias ligadas por 250 μm da superfície celular, confirmando de forma dual da expressão fenotípica de um alto número de receptores de F4 (F4R). Portanto, exceto o leitão 18, os dados de todos os leitões foram utilizados para avaliar a eficácia da VHH-lgAFc monomérica.
[00138] Os dados de eliminação revelaram que a dose de 5 mg/ porco por dia de coquetel de VHH-lgAFc V2A e V3A monomêrico, produzido em Pichia, as sementes de Arabidopsis ou sementes de soja impediram com sucesso a infecção de ETEC. Os grupos receptores de VHH-lgAFc tinham uma eliminação significativamente mais baixa (ver a Fig. 3B, Tabela 1). A eliminação média mais elevada nesses três grupos foi registrada no dia 2 com 4,5 (log10), 3,7 (log10) e 4 (log10) bactérias por grama de fezes para os grupos de feijão de soja, Pichia e Arabidopsis, respectivamente. A eliminação declinou nestes três grupos no dia subsequente por um log. Alcançando a eliminação média no dia 5 a 2,6 (log10), 2 (log10) e 2,7 (log10) bactérias por grama de fezes nos grupos de feijão de soja, Pichia e Arabidopsis, respectivamente. A eliminação nestes grupos permaneceu baixa depois disso, frequentemente abaixo de níveis detectáveis (2 (log10) bactérias por grama de fezes) para alguns dos leitões destes três grupos (ver a Tabela 1). Em contraste, os leitões do grupo que não recebem anticorpos (grupo de controle) na alimentação tiveram uma eliminação prolongada de altos títulos das bactérias de estímulo, em uma média mais elevada do que 6,3 (Log10) bactérias por grama de fezes a partir do dia 3 até o dia 6; e declinaram desde então no dia 7 (5,3 (log10) bactérias por grama de fezes e dia 8 (3,3 (log10) bactérias por grama de fezes) para abaixo dos níveis de detecção pelo dia 9. A elevada e prolongada eliminação indica que a cepa de estímulo pode estabelecer eficazmente a infecção e colonizar de forma bem-sucedida o intestino delgado no grupo de controle. Enquanto o anticorpo de VHH-lgAFc na alimentação que recebe leitões no grupo de Arabidopsis, no grupo de Pichia e no grupo de soja, todos apresentaram um rápido declínio na F4-ETEC imediatamente após o estímulo. Isto mostra que a VHH-lgAFc monomérica nestas alimentações impediu a F4-ETEC de se ligar aos enterócitos, colonizando e estabelecendo uma infecção. Isto é ainda corroborado pela soroconversão anti-F4-ETEC (Ver a Fig. 3C). A maioria dos leitões dos grupos de Pichia, soja e Arabidopsis montou uma resposta imune mais baixa devido à exposição limitada do patógeno de F4- ETEC ao sistema imunológico, embora o título médio dos níveis de IgG, IgM e IgA no soro anti-F4-ETEC do grupo de controle aumentaram constantemente pelo dia 7 e continuam a subir pelo dia
14.
[00139] Os resultados de eliminação e soroconversão demonstram claramente que a liberação na alimentação de 5 mg de dose de formulação de VHH-lgAFc monomérica contra a F4-ETEC, composta de proporções iguais de anticorpos de VHH-lgAFc - V2A e V3A produzidos em Arabidopsis, soja ou Pichia, é eficaz. Além disso, no caso de anticorpos produzidos por Pichia, os resultados de eficácia in vivo no devido tempo confirmam que o processamento e a formulação do meio que carrega VHH-lgAFcs secretadas são adequados para incorporar estavelmente e liberar por via oral as moléculas produzidas por Pichia com base na alimentação para indicações gástricas. Materiais e métodos para o exemplo 1 Expressão de VHH-lgAFc
[00140] Arabidopsis: Linhagens de Arabidopsis publicadas anteriormente que expressam fusões V2A-lgAFc e V3A-lgAFc monoméricas (Virdi et al. (2013) PNAS 110, 29, 11809-11814) foram escalonadas na estufa, para elevar ~100 gramas de sementes produtoras de V2A-lgAFc e V3A-lgAFc, para formular a ração contendo anticorpo para o grupo de Arabidopsis no experimento de estímulo.
[00141] Soja: Os plasmídeos pEV2A e pEV3A (Virdi et al. (2013) PNAS 110, 29, 11809-11814) que carrega o gene de fusão VHH-lgAFc para o anticorpo de V2A e V3A, respectivamente, foram recombinados no cassete de entrada de múltiplos sítios pGW43 (Karimi et al. (2002) Trends Plant Sci 7, 193-195) que carrega o gene que confere resistência a fosfinotricina para a seleção de transformante utilizando o herbicida Basta®, de acordo com o manual de instrução de clonagem de Gateway® (Invitrogen). Os vetores de expressão resultantes foram nomeados pMXV2A e pMXV3A, foram depois introduzidos na cepa de Agrobacterium EHA101 para transformação das plantas de soja (cultivar Williams 82) utilizando cotiledôneas como explantes de acordo com o método descrito por Paz MM et al. (2006) Plant Cell Rep. 25, 206-213) através da Plant Transformation Facility of Iowa State University. A expressão de anticorpos de VHH-lgAFc foi avaliada nas sementes T2 dos eventos transformados, através de ELISA com reservatórios revestidos com antígeno- FaeGac (a aderência de ponta de F4-ETEC) (Virdi et al (2013) PNAS 110, 29, 11809-11814), e detectada com IgA antiporco policlonal conjugado a peroxidase de rábano silvestre (AbD Serotech; AA140P). Dez a vinte sementes de eventos que expressam grandes quantidades de anticorpos foram retidas para crescimento de plantas T2 enquanto que as sementes remanescentes foram utilizadas para formular a dieta que carrega VHH-lgAFc produzida por soja para a avaliação do estímulo de alimentação de porcos.
[00142] Pichia: o gene de fusão VHH-lgAFc para VHH-lgAFc V2A e V3A foi amplificado por PCR utilizando o iniciador estabelecido Alfa-V2 (CTCTCTCGAGAAGAGAGAGGCCGAAGCTCAGGTGCAGCTGC) e IgA-NotI (CCTCTTGAGCGGCCGCCCTTTAGTAGCATATGCCTTCTG), como anteriormente descrito para VHH-IgG por De Meyer T. et al. (2015) Plant Biotechnol J 13, 938-947) estes iniciadores carregam o sítio de restrição Aval e Notl, por meio do qual o gene de anticorpo foi clonado na estrutura com o fator alfa-conjugado dentro do vetor de expressão pPpT4_Alpha_S (Naatsaari L. et al., (2012) PLoS ONE 7, e39720). Os respectivos vetores de expressão foram linearizados utilizando a enzima Pmel e introduzidos em Pichia pastoris por meio de eletroporação (Jacobs PP et al. (2009) Nat Protoc. 4, 58-70). As colônias de Pichia positivas foram selecionadas em ágar YPD plaqueado com 100 μg/ml de Zeocin® e 300 μg/ml de blasticidina. A expressão de 20 colônias individuais foi analisada no sistema de 24 reservatórios, em 2 ml de cultura líquida BMGY (extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato de potássio 100 mM, YNB 1,34%, glicerol 1%, pH 6,0). Em que após 48 horas de desenvolvimento, o meio líquido foi substituído com BMMY (extrato de levedura 1%, peptona 2%, fosfato de potássio 100 mM, YNB 1,34%, pH 5,7) e reforçado com metanol a 1% a cada 12 horas. O meio contendo os anticorpos de VHH-lgAFc secretados foi tipicamente colhido após 48 horas de indução em meio BMMY. O nível de expressão foi avaliado através de ELISA com reservatórios revestidos com FaeG. Clones com alta expressão foram identificados e a matéria-prima de glicerol foi gerada. Experimento de estímulo de porcos
[00143] Os experimentos de estímulo de leitão foram executados de acordo com as legislações belgas com relação ao bem-estar animal, após a sob a aprovação do Animal Care and Etics Committee of the Faculty of Veterinary Medicine at Ghent University, Belgium (número do dossiê ético EC2015/47). Para o experimento com IGA monomérica produzida por Pichia e soja os leitões (raça belga X raça inglesa) vieram de fazendas do Institute for Agricultural and Fisheries Research (ILVO), Melle, Belgium, de porcas não vacinadas.
Amostras de sangue foram coletadas de leitões com 2 a 3 semanas de idade para monitorar os níveis de anticorpos anti-ETEC no soro (aprovado pelo conselho de ética institucional de ILVO, número do dossiê 2016/267). Os leitões soronegativos para F4-ETEC, e positivos para o gene MUC-13 (homozigoto e heterozigoto dominantes), determinado por meio da PCR de MUC-13 (Goetstouwers et al (2014) PLoS One 9, e105013), que se correlaciona com a presença de receptores de F4-ETEC (F4R), foram selecionados.
Cada grupo experimental consistiu de seis leitões.
Após o desmame os leitões foram levados para os estábulos da faculdade e apropriadamente randomizados sobre os grupos de alimentação com base em suas excreções, genótipo e peso.
O peso inicial médio de cada grupo foi 7,2 kg.
O estímulo foi executados conforme descrito anteriormente (Virdi et al (2013) Proc Nat Acad Sci USA. 110, 29, 11809-11814). Resumidamente, os leitões foram estimulados em dias consecutivos com bactéria F4-ETEC 1010 (cepa - GIS26Rstrep), por meio de intubação intragástrica sob sedação, após a neutralização do pH gástrico com tampão de bicarbonato durante 30 minutos.
O primeiro dia de estímulo é considerado como dia 0 na linha de tempo.
A alimentação contendo anticorpos foi administrada durante um período de 10 dias, iniciando três dias antes do estímulo (Fig. 3, A). As amostras fecais foram colhidas a partir do dia de estímulo até o dia 12 e no dia da eutanásia, para monitorar a eliminação da cepa estimulada com F4-ETEC GIS26Rstrep, em placas de ágar sanguíneo com seleção de estreptomicina (1 mg/ml). As amostras de sangue foram tiradas para monitorar os títulos de IgG, IgA e IgM específicos da F4-ETEC no dia -1, dia 7 e dia 14. Modificação específica, coleta de amostras e manipulações com os animais são esquematicamente representadas na Fig. 3A. Preparação da ração
[00144] Para os anticorpos produzidos em sementes, as respectivas sementes precisamente pesadas (soja ou Arabidopsis) foram trituradas e depois misturadas com ração básica de porco em duas etapas para garantir homogeneidade completa; primeiro em um pequeno volume resultando em uma pré-mistura concentrada que foi subsequentemente diluída com mais ração de porco para preparar a ração experimental (Tabela 2). As sementes foram trituradas usando o moinho de facas (Retsch Graminyx GM200) antes da qual as sementes e a câmara de trituração foram resfriadas utilizando gelo seco. Para manter a nutrição proporcional em todos os grupos através de cada experimento, sementes de linho foram utilizadas para substituir as sementes de Arabidopsis (Tabela 2). Similarmente, para explicar as proteínas de soja adicionais, sementes de soja do tipo silvestre foram adicionadas ao grupo diferente do grupo de soja-lgA em proporção igual às sementes de soja produtoras de IgA (Tabela 2).
Tabela 2: Formulação de ração.
Asterisco (*) se refere ao peso total de mistura de Pichia seca agrupada, de quatro bateladas de pasta fluida de secagem por congelamento, (produzida a partir do meio de Pichia de tampão trocado e filtrado e ração de leitão) de cada batelada de produção.
A porcentagem de inclusão dentro da ração total é indicada entre parêntesis.
Etapa de mistura I Etapa de mistura II Composição de pré-mistura Ração experimental Sementes que carregam Sementes Sementes tipo Ração para Pré-mistura Matriz de Ração anticorpos/material de linhaça soja silvestre porcos total alimentação total Kg Kg Kg Kg Kg Kg Kg Arabidopsis-IgA 0,15 (0,83%) 0 0,15 (0,83%) 1,7 2 16 18
Soja-IgA 0 0,15 (0,83%) 0,15 (0,83%) 1,7 2 16 18
55/76 Pichia-IgA 5,368 * 0,15 (0,83%) 0,15 (0,83%) 0,337 6 12 18
Ração de linhaça-soja 0 2,49 (0,83%) 2,49 (0,83%) 1,02 6 294 300
Pichia:
[00145] Conforme o teste de equivalência baseado em ELISA (Fig. 2), 1 ml de extrato de Pichia foi equivalente a 5 mg de pó de semente de Arabidopsis produtora de VHH-lgAFc solubilizado em um ml de tampão de extração. Com base nesta proporção, para a dose de 5 mg de Pichia produziram VHH-lgAFcs por 6 leitões, durante 10 dias, a quantidade necessária de 30 L de meio de Pichia foi produzida. Os 30 L de cultura de Pichia foram produzidos em 4 bateladas de 7,5 semanalmente, como pelo protocolo de expressão padrão conforme acima (48 horas de cultivo em meio BMGY seguido por indução durante 48 h em meio BMMY). No final de cada operação, o meio de cultura foi coletado por centrifugação, o sobrenadante livre de células foi concentrado através de diafiltração em 2 a 1,5 L e subsequentemente o tampão trocado com tampão de fosfato de sódio (pH 6) com NaCl 18,75 mM, utilizando o sistema de filtração de fluxo tangencial Centramate™ 500 S (Pall Life Science) equipado com cassete de filtro centramate Omega™ 5 kDa. À solução de proteína de ~2 a 1,5 L resultante contendo Pichia produziu VHH-lgAFc, obtida no final de cada uma das quatro bateladas, um peso igual da ração de porco comercial foi adicionado e misturado com uma pá de mão para evitar qualquer formação de espuma, e a pasta fluida foi liofilizada utilizando secagem por congelamento (Epsilon 2-10 D LSC- Martin- Christ, Germany) durante 47 horas. O pó seco resultante, denominado pré-mistura de Pichia, das 4 bateladas no total foi de 5,368 Kg, que foi então misturado com a ração de porco para resultar em 18 Kg de ração que carrega VHH-lgAFc produzido por Pichia final (Tabela 2). Análise estatística:
[00146] Um modelo misturado linear foi utilizado para modelar as contagens bacterianas transformadas de Iog10 medidas diariamente do dia 1 até o dia 10, utilizando o procedimento misturado de SAS
(Versão 9.4 do sistema SAS para window 7 64bit. Copyright © 2002- 2012 SAS Institute Inc. Cary, NC, USA, www.sas.com). Visto que o limite de detecção para determinar a eliminação bacteriana foi 2 (Log10) por grama de fezes, os dados perdidos foram imputados com um valor de 1,9 (Log10) quando nenhuma bactéria foi detectada. Diversas estruturas para a matriz de variância-covariância dos resíduos foram testadas com base em um modelo médio saturado (isto é, considerando todas as variáveis independentes como variáveis categóricas e incluindo todos os efeitos de interação). Diversas estruturas foram testadas: não estruturada, de simetria composta, autorregressiva e matriz de Toeplitz combinada. A melhor estrutura foi escolhida com base nos valores AIC. A parte de efeitos fixos do modelo continha o efeito principal do grupo de alimentação e do dia e seu termo de interação. A aproximação Kenward-Roger para computar os graus denominadores de liberdade para os testes de efeitos fixos foi aplicada como implementada em SAS. O Teste F parcial foi calculado em cada dia utilizando o procedimento plm. Nesses dias onde o teste F parcial foi significativo no nível de significância de 5%, foram feitas comparações em pares. As significâncias estatísticas foram calculadas com testes de Wald e ajustadas para múltiplas comparações utilizando o método de Tukey em cada dia. Os diagnósticos residuais foram cuidadosamente examinados.
2. Avaliação de fusões IgAFc com IL-22 humana produzida em Pichia pastoris Materiais:
[00147] TNF de Murino recombinante (mTNF) foi produzido internamente em E. coli e tinha uma atividade específica de 9,46 x 107 lU/mg). Animais:
[00148] Camundongos neutralizados condicionais A20 (A20IEC-KO)
foram obtidos da Prof Geert van Loo. Os camundongos A20IEC-KO são deficientes para A20 em células epiteliais intestinais (lECs) (Vereecke, L. et al. (2010) J. of Experimental Medicine 207, 1513–1523). Para experimentação, apenas os camundongos fêmeas de 8 a 12 semanas de idade foram utilizados. Os camundongos foram alojados em gaiolas individualmente ventiladas no VIB Inflammation Research Center (IRC) em uma instalação específica livre de patógenos. Todos os experimentos em camundongos foram conduzidos de acordo com os regulamentos para animais institucionais, nacionais e europeus. Os protocolos de animais foram aprovados pelo comitê de ética da Ghent University. Ração:
[00149] Uma ração de camundongo em pó padrão (ssniff®R/M-H Complete feed – Maintenance) foi adquirida da Bio-Service (The Netherlands). Para preparar a ração contendo IL-22, o sobrenadante de cultura contendo cada formato de IL-22 respectivo foi concentrado através da diafiltração e subsequentemente o tampão trocado com tampão de fosfato de sódio (pH 6) com NaCI 18,75 mM, utilizando o sistema de filtração de fluxo tangencial Centramate™ 500 S (Pall Life Science) equipado com cassete de filtro centramate Omega™ de 5 kDa. Para cada formato, a bioatividade foi determinada no concentrado e o volume de cada formato foi ajustado para obter uma quantidade igual de bioatividade por ml de concentrado. Para misturar com a ração, um peso igual da ração de roedor em pó padrão foi adicionado ao concentrado contendo IL-22 e misturado. Subsequentemente, a pasta fluida foi liofilizada através da secagem por congelamento (Epsilon 2-10 D LSC- Martin-Christ, Germany) durante 47 horas. O pó seco resultante é então referido como pré- mistura de roedor Pichia. Teste in vitro:
[00150] Para testar a bioatividade dos diferentes formatos de IL-22 no meio de produção, o meio foi experimentado e o meio foi diluído em PBS estéril antes de executar o bioensaio. Para testar a retenção da bioatividade dos diferentes formatos de IL-22 na ração seca, a ração foi dissolvida 1:1 (v/v) em PBS. A pasta fluida foi então centrifugada em 13,000 g. A fase aquosa superior foi transferida para um tubo novo e esterilizada por filtração utilizando filtros de seringa de 0,22 μm de baixa ligação a proteína (Millipore). O filtrado foi então diluído em PBS estéril antes de executar o bioensaio.
[00151] As células de carcinoma do cólon Human Colo-205 foram ordenadas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas de acordo com as diretrizes fornecidas na folha de dados. Resumidamente, a linhagem celular foi cultivada como células semiaderentes em RPMI1640 (Gibco) suplementado com Soro Bovino Fetal a 10% (FBS) a 37°C. 5% de CO2. Para a passagem, as células que crescem em suspensão foram coletadas e as células aderentes foram tripsinizadas seguindo os procedimentos padrão de cultura de tecido.
[00152] Para determinar a bioatividade de IL-22 utilizando o ensaio Colo-205, as células foram semeadas em placas de fundo em U de 96 reservatórios em 3,0 x 105 células/ml (100 μl/reservatório). As células foram deixadas se adaptar durante 24 horas antes de estimular as células com uma série de diluições da fração contendo IL-22. Todas as estimulações foram deixadas prosseguir durante a noite. Como controle, uma série de diluições de hlL-22 recombinante comercialmente disponível (livre de veículos) produzida por E. coli (BioLegend) foi utilizada. No dia seguinte, as placas foram centrifugadas em 400 g, 10 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi analisado com relação à IL-10 utilizando hIL-10 DuoSet ELISA (R&D systems). Os dados foram analisados em
GraphPad Prism 6. A atividade específica foi determinada com base na curva de dose-resposta que foi utilizada para determinar a EC50. Modelo Experimental:
[00153] Para testar o efeito protetor de IL-22, camundongos C57BL/6 A20IEC-KO (n = 8 por grupo) foram submetidos à alimentação por sonda com 10 ml/kg de dieta líquida (equivalente a 200 μl) contendo um equivalente de 20, 10, 5, 1 μg de cada formato de IL-22 ou a alimentação equivalente sem IL-22 como controle.
[00154] Para induzir a colite experimental, 1 hora após a alimentação por sonda, os camundongos foram administrados com uma dose subletal de 250 μg/kg de mTNF por via intraperitoneal (i.p.). Os camundongos de controle (Simulados) foram injetados com um volume equivalente de NaCI a 0,9% i.p. A temperatura corporal e a sobrevivência foram monitoradas a cada hora. Em um experimento paralelo, os camundongos foram submetidos à eutanásia após 4 horas para análise histológica e ensaios de atividade de caspase. Histologia:
[00155] Depois da morte, o cólon inteiro foi removido do ceco até o ânus, e o comprimento do cólon foi medido como um marcador para inflamação. Após a medição, partes do intestino foram removidas e fixadas em Paraformaldeído a 4% (PFA). Após a incorporação de parafina e divisão em pedaços, o tecido foi tingido com hematoxilina/eosina para exame histológico. A apoptose foi analisada por microscopia de fluorescência utilizando um kit de detecção de morte celular in situ (Roche) para a coloração de TUNEL. Análise de soro:
[00156] As citocinas pró-inflamatórias no soro IL-6 e MCP-1 foram determinadas no soro utilizando o kit de ELISA Mouse IL-6 DuoSet (R&D Systems) e o kit de ELISA Mouse CCL2/JE/MCP-1 DuoSet (R&D Systems) respectivamente. A atividade de alanina aminotransferase (ALT) e a atividade de aspartato aminotransferase (AST) foram analisadas por teste fotométrico de rotina em um analisador Hitachi 747 (Diagnostica, Boehringer Mannheim). Resultados:
[00157] Os camundongos A20IEC-KO tratados simulados não apresentam quaisquer sinais fenotípicos de sofrimento. Ao contrário, os camundongos que recebem a injeção de TNF apresentam sintomas claros de toxicidade de TNF, incluindo hipotermia e diarréia severa tão logo 2 horas após a injeção. Além disso, entre 5 e 9 horas após a injeção de TNF, os camundongos começam a morrer. Os camundongos que recebem o tratamento intragástrico com a ração contendo IL-22 (IL-22 IgAFc ou IL-22) apenas apresentam uma diminuição suave na temperatura corporal e não desenvolvem diarréia. Além do mais, nenhum dos camundongos que são tratados com qualquer um dos formatos de IL-22 sucumbem após o estímulo de TNF.
[00158] Histologicamente, camundongos que são apenas tratados com TNF, mas não recebem IL-22, possuem um grave dano ao íleo e jejuno, caracterizado por danos epiteliais extensivos e a perda quase completa da estrutura de folículos-vilosidades. Em contrapartida, os camundongos que recebem qualquer um dos formatos de IL-22 não apresentam quaisquer sinais de dano, mantendo claramente a integridade da barreira. No nível celular, a coloração de TUNEL está ausente após o tratamento com IL-22, enquanto que nos camundongos tratados apenas com TNF, as células apoptóticas são altamente abundantes no revestimento epitelial das vilosidades além das células que já se desprendem e são encontradas no lúmen intestinal.
[00159] Nós avaliou-se ainda os efeitos sistêmicos através da medição das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e MCP-1. Os níveis de ambas são comparáveis para camundongos de controle e camundongos que recebem os formatos de IL-22, enquanto que os camundongos tratados apenas com TNF, mas que não receberam IL- 22, possuem níveis aumentados de IL-6 e MCP-1. Além disso, também avaliou-se os níveis de transaminase no fígado (AST e ALT) visto que foi relatado que o TNF também afeta a fisiologia do fígado. De fato, os camundongos tratados com TNF possuem níveis aumentados de AST e ALT no soro ao passo que os camundongos tratados com IL-22 não apresentam isto. Materiais e métodos para o exemplo 2 Cepas, meios e reagentes
[00160] Escherichia coli (E. coli) MC1061 ou DH5α foi utilizada para manipulações de biologia molecular padrão. Para a propagação do plasmídeo, a E. coli foi cultivada em caldo LB (extrato de levedura 0,5%, triptona 1% e NaCI 0,5%) suplementado com os antibióticos apropriados: 50 μg/ml de carbenicilina (Duchefa Biochemie), 50 μg/ml de canamicina (Sigma Aldrich), 50 μg/ml de higromicina B (Duchefa Biochemie) ou 50 μg/ml de Zeocin® (Life Technologies). Todas as reações de PCR foram executadas utilizando polimerase de alta fidelidade Phusion (NEB). Reagentes de PCR tais como dNTPs e iniciadores foram ordenados da Promega e IDT respectivamente.
[00161] A cepa de Pichia pastoris NRRL-Y 11430 (syn. Komagataella phaffi) foi fornecida pela A. Glieder (Technische Universität Graz, Austria). Esta cepa é referida como tipo silvestre. Culturas de levedura foram cultivadas em YPD líquido (extrato de levedura a 1%, peptona a 2%, D-glicose a 1%) ou em YPD-ágar sólido (extrato de levedura a 1%, peptona a 2%, D-glicose a 1%, ágar a 2%) e selecionadas pelo uso dos antibióticos apropriados: 100 μg/ml de Zeocin®, 500 μg/ml de geneticina/G418 (Life Technologies) ou 300 μg/ml de higromicina B. Extrato de levedura Bacto, triptona Bacto,
peptona Bacto, ágar Bacto e base de nitrogênio de levedura (YNB) foram adquiridos da Difco (Beckton Dickinson).
[00162] Para a expressão de proteína, as culturas foram cultivadas em uma incubadora de agitação (28 °C, 225 rpm) em BMGY (extrato de levedura a 1%, peptona a 2%, KH2PO4/K2HPO4 100 mM, YNB a 1,34%, glicerol a 1%, pH 5,5). Para a indução de expressão de proteína, as células foram comutadas para BMMY (extrato de levedura a 1%, peptona a 2%, KH2PO4/K2HPO4 100 mM, YNB a 1,34%, pH 5,5) contendo MeOH a 1%. Para manter a indução e compensar a evaporação, as culturas foram reforçadas com MeOH a 1% a cada 8 a 12 horas. No final da indução, as culturas foram colhidas por centrifugação (1,500 g, 4 °C durante 10 minutos). As amostras foram analisadas imediatamente ou congeladas por pressão em nitrogênio líquido antes do armazenamento a -20 °C. Construção de vetores de expressão de hIL-22
[00163] A estrutura de leitura aberta de interleucina-22 humana madura (hlL-22, Acesso UniProtKB Q9GZX6, resíduo 34-179) foi otimizada por códon para a expressão em P. pastoris utilizando algoritmo proprietário de Genscript e ordenada sinteticamente. A sequência de codificação de hlL-22 foi clonada na estrutura com o fator de conjugação α de S. cerevisiae no vetor de expressão de pKai61EA-yEGFP, mas sem incluir as repetições de EA (Schoonooghe S et al (2009) BMC Biotechnology 9, 70). O vetor de expressão final pKai-hlL22 contém o transgene de hlL-22 sob o controle do promotor AOX1 induzível a metanol forte e possui um marcador de resistência Zeocin® para a seleção tanto em bactérias quanto em leveduras. Como um sinal de secreção alternativo, a sequência de S. cerevisiae Ost1 (Fitzgerald I and Glick BS (2014) Microbial cell factories 13, 1) foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico de S. cerevisiae utilizando iniciadores Ost1SaccharopAOX1Fw e Ost1SaccharoRv.
Construção de vetores de expressão hlL-22-hlgA Fc-6xHis
[00164] Todos os construtos foram clonados utilizando uma estratégia de clonagem modular (MoCIo) que foi empregada. Este sistema foi desenvolvido para S. cerevisiae (Lee ME et al (2015) ACS Synth Biol 4, 975-986), mas foi adaptado internamente para uso em Pichia. Em resumo, o sistema MoCIo faz uso de vetores de entrada padronizados para subclonar as respectivas 'partes' de uma construção desejada. Cada parte dentro destes vetores é flanqueada por sítios de enzima de restrição distintos tipo Il. Através do agrupamento dos vetores de entrada em uma única reação e da execução da digestão de enzima de restrição consecutiva e reações de ligação T4, partes que têm extremidades compatíveis são deixadas agrupar e ligar em um plasmídio circular para produzir o vetor de expressão final. Todos os vetores de entrada foram gerados através do agrupamento de quantidades equimolares (~20 femtomoles) tanto do fragmento amplificado quanto do vetor de entrada MoCIo pYTK001 ou do vetor sintético, mas idêntico pPTK081. Os protocolos de clonagem modular padrão ("MoCIo") foram utilizados e caracterizam a adição da enzima de restrição Tipo II BsmBI (1U;NEB), da ligase T4 (1U;NEB) e de um tampão de ligase T4 10X (NEB) nas sequências agrupadas. Vinte e quatro ciclos de 42°C durante 2 min e 16°C durante 5 min foram executados em um ciclador de PCR, seguido por uma etapa final de digestão a 50°C durante 10 min e uma etapa de desnaturação térmica a 80°C durante outros 10 min, antes de manter a 12°C indefinidamente. Os vetores resultantes foram introduzidos em células competentes MC1061 de E. coli que foram então plaqueadas em meio de cloranfenicol LB. Visto que o vetor de entrada receptor pYTK001/pPTK081 representa um cassete de queda de GFP, a triagem verde-branca permitiu distinguir as colônias que contêm o plasmídio (correto) dos clones falsos positivos verdes. Os plasmídeos foram isolados e as sequências de interesse foram verificadas através do sequenciamento Sanger, utilizando iniciadores PP001 e PP002.
[00165] Para planejar uma fusão de hlL-22 com os domínios invariáveis de IgA (PAOX1-hlL-22-hlgA_Fc-6xHis), as sequências α- MF/Ost1/ pré-hlL-22 foram amplificadas por PCR com iniciadores que são compatíveis com o sistema MoCIo. Para fazer uma fusão N- terminal da sequência de hlL-22 com a sequência hlgA, o CDS de α- MF-hlL-22 completo, o CDS de Ost1-hlL-22 e o CDS pré-hIL-22 foram considerados como uma marca N-terminal ou parte 3a dentro do sistema MoCIo. Analogamente, os domínios invariáveis de IgA (ser humano, camundongo e porco) foram considerados um Gene de Interesse ou parte 3b.
[00166] Os vetores de entrada MoCIo que carregam o α-MF-hlL-22, Ost1-hlL-22 ou pré-hlL-22 foram todos gerados por uma amplificação de PCR inicial, utilizando os vetores de expressão pPpT4_Alpha_S acima mencionados como modelo. Ambas as sequências α-MF-hlL-22 e pré-hlL-22 foram amplificadas com iniciadores IL-22forentryfw e IL- 22forentryrv, enquanto que a sequência Ost1-hlL-22 foi amplificada com iniciadores IL-22ost1forentryfw e IL-22forentryrv. Os fragmentos de PCR foram então introduzidos através da digestão de restrição BsmBI e ligação T4 no pYTK001/pPTK081.
[00167] A sequência da região Fc de IgA humana (Homo sapiens, UniproKB: P01877) e IgA de camundongo (Mus musculus, UniprotKB: P01878) era o códon otimizado para a expressão em P. pastoris e ordenada sinteticamente como gBlocks em IDT. As IgA gBlocks de ser humano e camundongo foram então amplificadas com os iniciadores IgAforentryfw e IgAforentryrv ou IgAmouseforentryfw e IgAmouseforentryrv, para permitir a clonagem modular. A região Fc da IgA de porco (Sus scrofa, UniprotKB: K7ZRK0) foi amplificada a partir do vetor EV2A que foi previamente gerado (Virdi V et al (2013) PNAS
110, 11809) com iniciadores IgApigforentryfwcorrect e IgApigforentryrvnew. Todas as sequências de IgA foram clonadas no vetor pYTK001/ pPTK081 como uma 'parte 3b' no sistema MoCIo.
[00168] Os vetores de entrada foram então utilizados para gerar vetores de expressão utilizando o sistema MoCIo. Cada vetor de expressão foi gerado através do agrupamento de quantidades equimolares (~20 femtomoles) das seguintes partes (disponível ou estará disponível em Addgene): Parte 1 Conector de montagem: CONLS Parte 2 Promotor: PAOX1/PCAT1 Parte 3a marca N-terminal: α-MF-prepro/α-MF-pre/Ost1 – hIL-22 Parte 3b Gene de Interesse: hIgA/mIgA/pIgA Parte 4a marca C-terminal: 6xHis/6xHis-HDEL Parte 4b Terminador: AOX1TT Parte 5 Conector de Montagem CONRE Parte 6 marcador de levedura Stuffer (como a resistência à zeocina funciona tanto em bactérias quanto em fungos) Parte 7 Disposições gerais Stuffer Parte 8 marcador de E. coli + ORI ZeoR + ColE1 Iniciadores utilizados no exemplo 2: Nome Sequência
GCATCGTCTCATCGGTCTCATATGAGATTCC pYTK_IL22Fw CATCTATTT TCACCGCT
ATGCCGTCTCAGGTCTCAAGAACCAATACAA pYTK_IL22Rv GCGTTACG CAGAGACA
GCATCGTCTCATCGGTCTCATTCTGTGCCGT pYTK_hIgAFw
GCCCGGTG CCG
ATGCCGTCTCAGGTCTCAGGATCCATAGCA pYTK_hIgARv GGTGCCATC CACTTCCGCCA
ATGCGGCCGCTTATCACAACTCGTCGTGAAT IL-22rvHDELnew
ACAAGCGT TACGCAGAGACAT Ost1SaccharopAOX ACAACTAATTATTGAAAGAATTCCGAAACGAT 1Fw GAGGCAG GTTTGGTTCTC
ATCCAGACGACAATGAGAAGAAATTGGAGCA Ost1SaccharoRv
GCAGAAGA CACGTTGAAAAAAC
Nome Sequência pPpT4ASpAOX1Rv CGTTTCGGAATTCTTTCAATAATTAGT pPpT4ASIL22noprof Phos-GCTCCAATTTCTTCTCATTGTCGT w pPpT4ASIL22nopror Phos-AGCCAATGCAGAGGAGGC v GCATCGTCTCATCGGTCTCATTCTgtgccgtgcc IgAforentryfw cggtgccg ATGCCGTCTCAGGTCTCAGGATCCatagcaggt IgAforentryrv gccatccacttc cgcca
GCATCGTCTCATCGGTCTCATATGAGATTCC IL-22forentryfw
CATCTATTT TCACCGCT
ATGCCGTCTCAGGTCTCAAGAACCAATACAA IL-22forentryrv
GCGTTACG CAGAGACA
GCATCGTCTCATCGGTCTCATATGAGGCAG IL-22ost1forentryfw
GTTTGGTTC TCTTGG
GCATCGTCTCATCGGTCTCATTCTTGTTCTG IgAmouseforentryfw
GTCCAACAC CACCACCACC
ATGCCGTCTCAGGTCTCAGGATCCATAGCAA IgAmouseforentryrv
ATACCGTC GCCCTCACTCATAATCACAGA IgApigfw CTCAGATCCATGTCCTCAGTGCT IgApigrvnew GAGGCAGAAGGCATATGCTAC
ATGCCGTCTCAGGTCTCAGGATCCGTAGCAT IgApigforentryrvnew ATGCCTTC TGCCTC IgApigforentryfwcorr GCATCGTCTCATCGGTCTCATTCTGATCCAT ect GTCCTCAGT GCTGC
3. Comparação da eficácia in vivo de formulações comestíveis a partir de diferentes processos de secagem da fusão VHH-lgA-Fc produzida por Pichia
[00169] A estabilidade oral e gástrica é preeminente para os produtos bioterapêuticos como VHH-lgAFcs para ser eficaz no trato gastrintestinal. A matriz que circunda os anticorpos (no nível molecular) e o processo de secagem muito provavelmente desempenham um papel importante na proteção de anticorpos VHH- lgAFc de serem digeridos e tornando-se ineficazes no intestino. Aqui resolve-se avaliar o efeito sobre a eficácia in vivo de VHH-IgAFcs produzidas por Pichia diferencialmente seca na liberação da infecção por F4-ETEC, que foram secadas por congelamento juntamente com a matriz de alimentação (ver o exemplo 1) ou secadas por congelamento sem matriz de alimentação.
Além disso, também avaliou-se o processo de secagem por pulverização, que se baseia em um princípio alternativo que envolve calor; em que a maltodextrina foi utilizada como uma matriz/veículo.
As três formulações de ração processada de modo diferencial de Pichia produziram VHH-lgAFc anti-F4-ETEC (V2A E V3A) composta da mesma dose; equivalente de 0,5 L do fermentado por grama por leitão por dia ou 5 mg de VHH-lgAFcs/dia/leitão.
O quarto grupo não recebeu nenhum anticorpo de VHH-lgAFc na ração e serviu como controle negativo.
Vinte e quatro leitões soronegativos a F4-ETEC e positivos ao teste de gene muc-13, que se correlacionam com a suscetibilidade à infecção por F4-ETEC, foram selecionados, desmamados e alojados em 4 grupos de 6 leitões cada.
Estes leitões foram deixados adaptar-se a alimento sólido, após o que foram introduzidos na ração experimental específica do grupo (ver a Figura 4A). A ração experimental foi fornecida durante 10 dias, no terceiro dia do qual todos os leitões foram estimulados com 1010 bactérias F4-ETEC durante dois dias consecutivos (dia 0 e dia 1). O efeito resultante da infecção, em resposta às formulações de ração, foi monitorado por meio da análise das unidades formadoras de colônias (CFU) da cepa de estímulo lançada diariamente até o dia 12 (ver a figura 4B e Tabela 3) nas fezes.
Tabela 3: A eliminação diária da F4-ETEC (Log10) CFU por grama de fezes para cada leitão
Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day 7 Day 8 Day 9 Day 10 Day 11 Day 12 Piglet 1 — — — — 2,48 2,30 — — — — — — — Piglet 2 Dead — — — — — — Piglet 3 — — 6,76 — — — — — — — — — — Piglet 4 — — 2,60 — — — — — — — — — 2,60 Piglet 5 — — 3,48 3,00 2,00 — — — — 2,00 — — —
Petição 870200114072, de 09/09/2020, pág. 73/87 Spray dried Piglet 6 — — — — — — — — — — — — — Piglet 7 — — 6,68 5,07 — — — — — — — — — Piglet 8 — 3,95 5,90 — — — — — — — — — — Piglet 9 — 2,48 dead — — — — — — Piglet 10 — 5,68 5,00 — — — — — — — — — — Piglet 11 — 3,48 5,16 3,00 2,48 — — — — — — — —
Control Piglet 12 — 4,28 3,78 2,48 — — — — — — — — — Piglet 13 — 3,30 4,16 — — — — — — — — — — Piglet 14 — — — 3,07 — — — — — — — — — Piglet 15 — — — — — — — — — — — — — Piglet 16 — 3,48 — — — — — — — — — — — Piglet 17 — 5,47 3,18 — — — — — — — — — —
Freeze dry without matrix Piglet 18 — 4,00 7,04 4,99 3,85 3,43 2,48 2 — — — — — Piglet 19 — — 3,48 — — — — — — — — — — Piglet 20 — — — — — — — — — — — — — Piglet 21 — 3,06 4,04 — — — — — — — — — — 69/76
Piglet 22 — 3,43 4,53 — — — — — — — — — — Piglet 23 — 2,78 — — — — — — — — — — —
freze dry with feed matrix Piglet 24 — — — — — — — — — — — — —
congelamento sem matriz – secagem por congelamento com matriz de Legenda: dia – secado por pulverização – controle – secagem por alimentação – leitão – morto. Nota: O limite de detecção de log (10) CFU é 2, o traço (-) indica que nenhuma bactéria foi detectada Nota: O leitão 2 e o leitão 9 morreram no dia 5 e dia 2, respectivamente; devido a grandes úlceras gástricas descobertas durante a investigação depois da morte.
[00170] Todos os leitões do grupo de controle negativo eliminaram altas CFUs da F4-ETEC, no dia 1 e no dia 2, e a eliminação foi mantida pelo menos em metade dos leitões até o dia 3. A eliminação global nos grupos receptores de anticorpos foi baixa. A Figura 4B mostra a eliminação média em cada grupo e o erro padrão da média (SEM) até o dia 6, que reflete a tendência eficaz das três fusões VHH- lgA-Fc produzidas por Pichia e diferencialmente processadas contendo dietas na prevenção da infecção por F4-ETEC. Estes dados mostram que a matriz, como ração para porco no processo de secagem por congelamento ou maltodextrina na secagem por pulverização, se atribui a uma maior eficácia in vivo. Os níveis de IgG anti-ETEC (ver a Figura 4C) e IgA (ver Figura 4D) no soro foram mais baixos no grupo que recebeu secagem por congelamento na formulação de matriz da ração, o que confirma os resultados de eliminação. No geral, foi observada variação nos leitões individuais dentro dos grupos que mostram soroconversão (barras de erro nas Figuras 4C e 4D representam erro padrão da média). Material e Métodos para o exemplo 3 Formulação de ração baseada em VHH-lgA-Fc produzida por Pichia
[00171] A dose eficaz da VHH-lgAFc anti-ETEC conforme aplicada no Exemplo 1, experimento de estímulo, foi ao redor de 5 mg de VHH- lgAFc ou mais apropriadamente, produto seco que carrega a formulação de ração de 0,5 L da cultura cultivada em frasco de agitação por leitão por dia. Esta dose foi composta de partes iguais das duas VHH-lgAFcs anti-F4-ETEC, a saber, V2A e V3A (ver Virdi et al (2013) 110, 29, 11809-11814). Para preparar dose similar para 18 leitões, (seis animais em cada um dos três grupos) que recebem as VHH-lgAFcs produzidas por Pichia; 45 L de cada V2A e V3A (total de 90 L) que expressam a cultura de Pichia foram cultivadas em frascos de agitação.
Esta foi produzida em seis bateladas (em um processo longo de cinco dias, como no Exemplo 1, 48 horas de cultivo em meio BMGY seguido por indução durante 48 horas em meio BMMY) conforme resumido na Tabela 5 abaixo.
Assim uma batelada de cultura semanal de 15 L foi produzida.
No final de cada operação, o meio de cultura foi colhido por centrifugação, o sobrenadante livre de células foi concentrado através de diafiltração em 1 L e subsequentemente o tampão foi trocado com tampão de fosfato de sódio (Na2HPO4 20 mM, NaCI 18,75 mM, pH 6), utilizando o sistema de filtração de fluxo tangencial Centramate™ 500 S (Pall Life Science) equipado com cassete de filtro centramate Omega™ de 5 kDa.
A solução de proteína do retentado de 1 L resultante contendo o retentado denominado VHH-lgAFc produzido por Pichia, obtido no final de cada uma das seis bateladas (Tabela 4), foi secada de três maneiras específicas conforme abaixo.
Tabela 4: O processo de secagem de cada batelada de VHH-lgA-Fc produzida por Pichia, para formular a respectiva ração experimental Número da Anticorpo de VHH- Processo de secagem Formulação de ração BAtelada IgAFc anti-ETEC 1 V2A secagem por congelamento da pasta fluida de 1 L do retentado e 1 Aglomerado de pó seco ~2 Kg + 16 Kg de Kg de ração de porco ração de leitão comercial 2 V3A secagem por congelamento da pasta fluida de 1 L do retentado e 1 Kg de ração de porco 3 V2A secagem por congelamento de 1 L do retentado (Sem qualquer Aglomerado de pó seco de V2A e V3A ~ 60 g matriz sólida) + 17,94 Kg de ração de leitão comercial 4 V3A secagem por congelamento de 1 L do retentado (Sem qualquer matriz sólida) 5 V3A 1 L do retentado que carrega V3A (batelada 5) misturado com 1 L Aglomerado que carrega pó secado por 6 V2A do retentado que carrega V2A (batelada 6) juntamente com pulverização de V2A e V3A ~2,3 Kg + 15,7
72/76 maltodextrina a 10% foi secado por pulverização Kg de ração
[00172] Modo 1: Secagem por congelamento com matriz (similar ao Exemplo 1): um litro do retentado, que carrega VHH-lgAFc V2A (batelada 1, Tabela 5) ou V3A (batelada 2, Tabela 4) foi misturado com um quilograma de ração de leitão comercial (fornecedor: Van Huffel, 9850 Poesele (Nevele) Belgium) com uma pá manual para evitar qualquer formação de espuma, e a pasta fluida foi liofilizada utilizando um secador por congelamento (Epsilon 2- 10 D LSC- Martin-Christ, Germany) durante 47 horas. O pó seco resultante, das 2 bateladas de secagem por congelamento (aproximadamente 1 Kg cada), contendo VHH-lgA-Fc V2A e V3A, respectivamente, foi então misturado com a ração de porco para resultar em 18 Kg de ração final que carrega VHH-lgAFc com matriz secada por congelamento produzida por Pichia (Tabela 4).
[00173] Modo 2: Secagem por congelamento sem matriz: um litro do retentado, que carrega VHH-lgAFc V2A (batelada 3) ou V3A (batelada 4), foi liofilizado utilizando um secador por congelamento (Epsilon 2- 10 D LSC- Martin-Christ, Germany) durante 47 horas. O pó seco resultante, das 2 bateladas de secagem por congelamento (~30 gramas cada), contendo VHH-lgA-Fc V2A e V3A, respectivamente, foi então misturado juntamente com a ração de porco para resultar em 18 Kg de ração final que carrega VHH-lgAFc sem matriz secada por congelamento produzida por Pichia (Tabela 4).
[00174] Modo 3: Secagem por pulverização: um litro de retentado que carrega VHH-lgAFc V3A (batelada 5, Tabela 4) e outro litro de retentado que carrega VHH-lgAFc V2A (batelada 6, Tabela 5), foram misturados juntas com 23 L de tampão de fosfato de sódio (Na2HPO4 20 mM, NaCI 18,75 mM, pH 6) contendo 2,5 Kg de maltodextrina. O líquido total de 25 L foi misturado completamente utilizando um misturador industrial durante 5 a 7 minutos e depois alimentado no secador por pulverização, com parâmetros ajustados para o preaquecimento a 45 °C do líquido de alimentação, e temperatura do ar de entrada de 170 °C. Durante o processo de secagem, a temperatura média do ar de saída foi ao redor de 80° C, e uma velocidade de bombeamento de líquido constante foi mantida. Aproximadamente 2,3 kg de pó seco que carrega V2A e V3A foram recuperados, os quais foram misturados juntamente com a ração de porco para resultar em 18 Kg de ração final que carrega VHH-lgAFc secada por pulverização produzida por Pichia (Tabela 4).
[00175] As VHH-IgAFcs secas de cada um dos processos de secagem diferencial executados (ver a Tabela 5), sendo secadas por congelamento na ração (V2A batelada 1, V3A batelada 2), secadas por congelamento sem matriz (V2A batelada 3, V3A batelada 4) e secadas por pulverização com maltodextrina (V3A + V2A, batelada 5 e batelada 6 combinadas) quando solubilizadas em solução salina tamponada com fosfato e avaliadas em ELISA, foram observadas de serem funcionalmente ativas como ligação ao antígeno F4-FaeG imobilizado.
[00176] A ração de controle incluiu 18 kg de ração básica sem qualquer anticorpo. Cada uma das formulações de ração de 18 kg foi dividida em 10 sacos de 1,8 kg cada, como quota de alimentação diária por grupo, que foi fornecida na cuba de alimentação para os leitões do dia 3 até o dia 7 (Fig. 4A). Experimento de estímulo de leitão:
[00177] Experimentos de estímulo de leitão foram executados de acordo com as legislações belgas com relação ao bem-estar animal, após a aprovação do Animal Care and Ethics Committee of the Faculty of Veterinary Medicine at Ghent University, Belgium (número do dossiê ético EC2017/122). Os leitões (raça: híbridos) foram adquiridos das fazendas do Institute for Agricultural and Fisheries Research (ILVO), Melle, Belgium (no. do dossiê ético 2017/306). Cinco porcas primíparas foram privadas da vacina reforçadora contra F4-ETEC para garantir uma baixa imunidade lactogênica.
Os leitões nascidos destas porcas foram administrados com antibiótico (Duphamox 0,1 ml/porco) três vezes, a cada dois dias após o nascimento, para proteger da Infecção por F4-ETEC.
Além disso, amostra de sangue foi tirada destes leitões no 15° dia de nascimento, para avaliar os títulos de soro anti-F4-ETEC e o ensaio de genotipagem MUC13 (Goetstouwers et al (2014) PLoS One 9, e105013) que se correlacionam com a presença de receptores de F4-ETEC.
Vinte quatro soronegativos e homozigotos para o genótipo suscetível a F4-ETEC por MUC13 foram selecionados, desmamados e transportados para os estábulos da faculdade veterinária da Gent University para o experimento de estímulo.
Os leitões foram apropriadamente randomizados sobre os grupos de alimentação com base nas suas excreções, genótipos e peso.
O peso inicial médio de cada grupo foi de 8,5 Kg.
Os leitões foram administrados com antibiótico intramuscular Duphamox (0,6 ml/porco) no dia 12 e dia 11; enquanto que Baytril (0,25 ml/porco) foi administrado no dia 8, dia 7 e dia 6 para evitar a contingência de infecções bacterianas após o transporte.
O estímulo foi executado conforme descrito anteriormente (Virdi et al (2013) Proc Nat Acad Sci USA. 110, 29, 11809-11814). Resumidamente, os leitões foram estimulados em dias consecutivos com 1010 bactérias F4-ETEC (cepa GIS26Rstrep), através de intubação intragástrica sob sedação (1 ml de azaperona, Stressnill® Janssen Animal Health), após a neutralização do pH gástrico com 60 ml de tampão de bicarbonato (NaHCO3 1,4% p/v em água destilada). O primeiro dia do estímulo é considerado como o dia 0 na linha do tempo (Fig. 4A). A ração contendo anticorpos foi administrada durante um período de 10 dias, iniciando três dias antes do estímulo (Fig. 4A). Amostras fecais foram coletadas a partir do dia do estímulo até o dia 12 para monitorizar a eliminação da cepa estimulada com F4-ETEC GIS26Rstrep, em placas de ágar sanguíneo com seleção de estreptomicina (1 mg/ml). Amostras de sangue foram tiradas para monitorar a IgG específica de F4-ETEC e títulos de IgA no dia 15 (dia do desmame), dia 4, dia 7. Coleta de amostra específica e manipulações com os animais são representadas esquematicamente na Figura 4A.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para obter uma formulação seca, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) submeter o meio de cultura de uma cultura de células hospedeiras fúngicas recombinantes a um processo de separação por membrana ou a um processo de filtração de 14 profundidades, o referido meio de cultura compreendendo um polipeptídeo recombinante secretado pela referida célula hospedeira fúngica, cujo polipeptídeo é exógeno à referida célula hospedeira fúngica, seguido por (ii) secagem do meio de cultura obtido na etapa (i).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que após a etapa (i) é adicionada uma matriz oral admissível.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo está fundido com um domínio Fc, particularmente um domínio Fc de IgA.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo é um peptídeo profilático ou terapêutico ou em que o referido polipeptídeo é uma vacina ou faz parte de uma vacina.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo é um domínio variável único de imunoglobulina.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a secagem é realizada por secagem por pulverização ou por liofilização.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é IL22.
8. Uso de uma formulação seca obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento.
9. Composição farmacêutica oral, caracterizada pelo fato de que compreende uma formulação seca obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um excipiente farmacêutico.
10. Uso de uma formulação seca obtida pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma composição farmacêutica ou medicamento para prevenir ou tratar doenças gastrointestinais.
11. Uso de uma formulação seca obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição farmacêutica ou medicamento para tratamento de doenças bucais.
12. Uso de uma formulação seca obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma vacina.
13. Produto alimentício ou para alimentação animal, caracterizado pelo fato de que compreende uma formulação seca obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
14. Produto alimentício ou para alimentação animal, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é um produto alimentício funcional ou medicinal.
15. Formulação seca, caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
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