BRPI0113110B1

BRPI0113110B1 - Anticorpo anti-tnf e composição que o compreende

Info

Publication number: BRPI0113110B1
Application number: BRPI0113110-9A
Authority: BR
Inventors: Giles-Komar Jill; M. Knight David; Heavner George; Scallon Bernard; Shealy David
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2018-03-20
Also published as: EP3118318A1; IL154327A0; NO333378B1; WO2002012502A9; PL360438A1; JP2018046817A; IL154327A; CY2010008I1; LT2330129T; PL206833B1; FR10C0014I2; NO20030620D0; US7250165B2; AU7922701A; ME00314B; JP2011188862A; EP3118318B1; JP2004523209A; SI2330129T1; HK1052948A1

Abstract

"anticorpos anti-tnf, composições, métodos e usos". a presente invenção refere-se a pelo menos um novo anticorpo anti-tnf, incluindo ácidos nucléicos isolados que codificam pelo menos um anticorpo anti-tnf, tnf, vetores, células hospedeiras, animais ou plantas transgênicos, e métodos de preparar e empregá-los.

Description

(54) Título: ANTICORPO ANTI-TNF E COMPOSIÇÃO QUE O COMPREENDE (51) Int.CI.: C12N 15/13; C07K 16/24; C12N 15/79; C12N 5/10; A61K 39/395; C07K 16/42; G01N 33/50; G01N 33/577; A61P 37/00 (30) Prioridade Unionista: 01/08/2001 US 09/920,137, 07/08/2000 US 60/223,360, 29/09/2000 US 60/236,826 (73) Titular(es): JOHNSON & JOHNSON (72) Inventor(es): JILL GILES-KOMAR; DAVID M. KNIGHT; GEORGE HEAVNER; BERNARD SCALLON; DAVID SHEALY

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO ANTI-TNF E COMPOSIÇÃO QUE O COMPREENDE.

Fundamento da invenção

Campo da invenção

Este pedido é baseado em parte no, e reivindica prioridade para, Provisório dos Estados Unidos 60/223.360 depositado em 7 de agosto de 2000 e 60/236.826 depositada em 29 de setembro de 2000, cada da qual é totalmente incorporada aqui por referência.

A presente invenção refere-se a anticorpos, incluindo variantes ou porções específicas para pelo menos uma proteína de fator alfa de necrose de tumor ou fragmento deste, bem como ácido nucléicos codificando tais anticorpos anti-TNF, ácido nucléicos complementares, vetores, células hospedeiras, e métodos de preparação e uso destes, incluindo formulações terapêuticas, administrações e dispositivos.

Técnica relacionada

TNF alfa é um homotrímero solúvel de subunidades de proteína de 17 kD (Smith e outro, J. Biol. Chem. 262: 6951 - 6954 (1987)). Uma forma de precursor de 26 kD ligada por membrana de TNF também existe (Kriegler e outro, Cell 53: 45 - 53 (1988)). Para revisões de TNF, veja Beutler e outro, Nature 320: 584 (1986); Old, Science 230: 630 (1986); e Le e outro, Lab. Invest. 56: 234 (1987).

Células exceto monócitos ou macrófagos também produzem TNF alfa. Por exemplo linhagens de célula de tumor não monocítico humano produzem TNF alfa (Rubin e outro, J. Exp. Med. 164:1350 (1986); Spriggs e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6563 (1987)). Linfócitos T de sangue periferal CD4+ e CD8+ e algumas linhagens de célula T e B cultivadas (Cuturi e outro, J. Exp. Med. 165: 1581 (1987); Sung e outro, J. Exp. Med. 168: 1539 (1988); Turner e outro, Eur. J. Immunol. 17: 1807 - 1814 (1987)) também produz TNF alfa.

TNF alfa causa ações pró-inflamatórias que resultam em dano ao tecido, tal como degradação da cartilagem e osso (Saklatvala, Nature 322:547-549 (1986); Bertolini, Nature 319:516-518 (1986)), indução de mo-

léculas de adesão, induzindo atividade pró-coagulante em células endoteliais vasculares (Pober e outro, J. Immunol. 136:1680 (1986)), aumentando a aderência de neutrófilos e linfócitos (Pober e outro, J. Immunol, 138:3319 (1987)), e estimulando a liberação de fator de ativação de plaqueta de macrófagos, neutrófilos e células endoteliais vasculares (Camussi e outro, J. Exp. Med. 166: 1390 (1987)).

Evidência recente associa TNF alfa com infecções (Cerami e outro, Immunol. Today 9:28 (1988)), distúrbios imunes, patologias neoplásticas (Oliff e outro, Cell 50:555 (1987)), patologias auto-imune e patologias enxerto-versus-hospedeiro (Piguet e outro, J. Exp. Med. 166:1280 (1987)). A associação de TNF alfa com câncer e patologias infecciosas está frequentemente relacionada ao estado catabólico de hospedeiro. Pacientes com câncer sofrem de perda de peso, usualmente associada com anorexia.

A perda extensiva que está associada com câncer, e outras doenças, é conhecida como caquexia (Kern e outro, J. Parent. Enter. Nutr. 12:286-298 (1988)). A caquexia inclui perda progressiva de peso, anorexia, erosão persistente de massa corporal magra em resposta a um desenvolvimento maligno. O estado caquético causa mais mortalidade e morbidez ao câncer. Existe evidência que TNF alfa está envolvida em caquexia em câncer, patologia infecciosa, e outros estados metabólicos (observe, por exemplo, Beutler e Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7: 625 - 655 (1989)).

O TNF alfa acredita-se desempenhar um papel central em sepse gram-positiva e choque endotóxico (Michie e outro, Br. J. Surg. 76:670-671 (1989); Debets e outro, Second Vienna Shock Forum, p. 463 - 466 (1989); Simpson e outro, Crit. Care Clin. 5: 27 - 47 (1989)), incluindo febre, malestar, anorexia, e caquexia. A endotoxina fortemente ativa a segregação e produção de monócito/macrófago de TNF alfa e outras citocinas (Kornbluth e outro, J. Immunol. 137: 2585 - 2591 (1986)). TNF alfa e outras citocinas derivadas de monócito mediam as respostas neuro-hormonais e metabólicas para endotoxina (Michie e outro, New Engl. J. Med. 318: 1481 - 1486 (1988)). Administração de endotoxina em voluntários humanos produz doença aguda com sintomas tipo resfriado incluindo febre, taquicardia, taxa metabólica aumentada e liberação de hormônio de tensão (Revhaug e outro, Arch. Surg. 123: 162 - 170 (1988)). A circulação de TNF alfa aumenta em pacientes sofrendo de sepse Gram-negativa (Waage e outro, Lancet 1: 355 - 357 (1987); Hammerle e outro, Second Vienna Shock Forum, p. 715718 (1989); Debets e outro, Crit. Care Med. 17: 489 - 497 (1989); Calandra e outro, J. Infect. Dis. 161: 982 - 987 (1990)) .

Desse modo, TNF alfa foi envolvida em doenças inflamatórias, doenças auto-imunes, infecções virais, bacterianas e parasíticas, malignidades, e/ou doenças neurodegenerativas e é um alvo útil para terapia biológica específica em doenças, tal como artrite reumatóide e doença de Crohn. Efeitos benéficos em experiências de rótulo aberto com um anticorpo monoclonal quimérico em TNF alfa (cA2) foram reportados com a supressão de inflamação e com retratamento bem-sucedido após recaída em artrite reumatóide (Elliott e outro, Arthritis Rheum. 36: 1681 - 1690 (1993); e Elliot e outro, Lancet 344: 1125 - 1127 (1994)) e em doença de Crohn (Van Dullemen e outro, Gastroenterology 109:129 - 135 (1995)). Resultados benéficos em uma experiência de controlada por placebo, duplo cego, aleatorizada com cA2 foram reportados em artrite reumatóide com a supressão de inflamação (Elliott e outro, Lancet 344: 1105 - 1110 (1994)). Anticorpos em um material modulador que foi caracterizado como caquectina (mais tarde constatou ser idêntico ao TNF) foram descritos por Cerami e outro (Publicação de Patente EPO 0212489, 4 de Março de 1987). Tais anticorpos foram referidos ser úteis em imunoensaios diagnósticos e em terapia de choque em infecções bacterianas. Rubin e outro (Publicação de Patente EPO 0218868, 22 de abril de 1987) descreveu anticorpos monoclonaís em TNF humano, os híbridomas segregando tais anticorpos, métodos de produção de tais anticorpos, e o uso de tais anticorpos em imunoensaio de TNF. Yone e outro (Publicação de Patente EPO 0288088, 26 de outubro de 1988) descreveu anticorpos anti-TNF, incluindo mAbs, e sua utilidade em diagnóstico de imunoensaio de patologias, em particular patologia de Kawasaki e infecção bacteriana. Os fluidos do corpo de pacientes com patologia de Kawasaki (síndrome de nodo de linfa mucocutânea febril aguda infantil; Kawa-

saki, T., Ailergy 16:178 (1967); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26:935 (1995)) foram ditos conter níveis de TNF elevados que foram relacionados ao progresso da patologia (Yone e outro, supra) .

Outros inventigadores tem descrito mAbs específicos para TNF humano recombinante que tiveram atividade neutralizante in vitro (Liang, CM. e outro (Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, A. e outro, Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly e outro, Hybridoma 6:359-369 (1987); Bringman, T.S. e outro, Hybridoma 6:489-507 (1987); Hirai, M e outro, J. Immunol. Meth. 96:57-62 (1987); Moller, A. e outro (Cytokine 2:162169 (1990)). Alguns destes mAbs foram empregados para cartografar epitopos de TNF humano e desenvolver imunoensaios de enzima (Fendly e outro, supra; Hirai e outro, supra; Moller e outro, supra) e assistir na purificação de TNF recombinante (Bringman e outro, supra). Entretanto, estes estudos não fornecem uma base para produção de anticorpos neutralizantes de TNF que podem ser empregados para usos terapêuticos ou diagnósticos in vivo em seres humanos, devido à imunogenecidade, falta de especificidade e/ou adequabilidade farmacêutica.

A neutralização de anti-soros ou mAbs para TNF foi mostrada em mamíferos exceto o homem para ab-rogar alterações fisiológicas adversas e impedir a morte após o desafio letal em bacteremia e endotoxemia experimental. Este efeito foi demonstrado, por exemplo, em ensaios de letalidade de roedores em sistemas de modelo de patologia primata (Mathison, J.C. e outro, J. Clin. Invest. 81: 1925 - 1937 (1988); Beutler, B e outro, Science 229: 869 - 871 (1985). Tracey, K.J. e outro, Nature 330: 662 - 664 (1987); Shimamoto, Y. e outro, Y. e outro, Immunol. Lett. 17:311 - 318 (1988); Silva, A.T. e outro, J. Infect. Dis. 162: 421 - 427 (1990). Opal, S.M. e outro, J. Infect. Dis. 161: 1148 - 1152 (1990); Hinshaw, L.B. e outro, Circ. Shock 30: 279-292(1990)).

Locais de ligação de receptor putativo de hTNF foram descritos por Eck e Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), 17595 - 17605 (1989), os quais identificaram os locais de ligação de receptor de TNF-α quando consistindo de aminoácidos 11-13, 37-42, 49-57 e 155-157. Pedido PCT WO n°

91/02078 (data de prioridade de 7 de agosto de 1989) descreve ligantes de TNF que podem se ligar em anticorpos monoclonais tendo os seguintes epítopos: pelo menos um de 1-20, 56-77, e 108-127; pelo menos dois de 120, 56-77, 108-127 e 138-149; todos de 1-18, 58-65, 115-125, e 138-149; todos de 1-18, e 108-128; todos de 56-79, 110-127 e 135- ou 136-155; todos de 1-30, 117-128 e 141-153; todos de 1-26, 117-128 e 141-153; todos de 22-40; 49-96 ou -97, 110-127 e 136-153; todos de 12-22, 36-45, 96-105 e 132-157, todos de ambos de 1-20 e 76-90; todos de 22-40, 69-97, 105128 e 135-155; todos de 22-31 e 146-157; todos de 22-40 e 49-98; pelo menos um de 22-40, 49-98 e 69-97, ambos de 22-40 e 70-87.

Anticorpos monoclonais (Mabs) e/ou policlonais (por exemplo, anti-soros), quiméricos, mamíferos não humanos e fragmentos (por exemplo, digestão proteolítica ou produtos de proteína de fusão destes) são agentes terapêuticos potenciais que estão sendo investigados em alguns casos para tentar tratar certas doenças. Entretanto, tais anticorpos ou fragmentos podem extrair uma resposta imune quando administrados em seres humanos. Uma tal resposta imune pode resultar em uma liberação mediada por complexo imune dos anticorpos ou fragmentos da circulação, e tornar a administração repetida inadequada para terapia, desse modo reduzindo o benefício terapêutico ao paciente e limitando a re-administração do anticorpo ou fragmento. Por exemplo, administração repetida de anticorpos ou fragmentos compreendendo porções não-humanas podem induzir a doença de soro e/ou anafalaxia. A fim de evitar estes e outros problemas, vários métodos foram escolhidos para reduzir a imunogenicidade de tais anticorpos e porções destes, incluindo a quimerização e humanização, bemconhecidas na técnica. Estes e outros métodos, entretanto, ainda podem resultar em anticorpos ou fragmentos tendo alguma imunogenicidade, baixa afinidade, baixa avidez, ou com problemas em cultura de célula, escala elevada, produção, e/ou baixos rendimentos. Desse modo, tais anticorpos ou fragmentos podem ser menos do que idealmente adaptados para a fabricação ou uso como proteínas terapêuticas.

Consequentemente, existe uma necessidade de fornecer anti6 corpos anti-TNF ou fragmentos que superam mais um destes problemas, bem como melhoras em anticorpos corpos conhecidos ou fragmentos destes.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece anticorpos anti-TNF humanizados e/ou enxertados por CDR, quiméricos, de mamíferos, roedores, primatas, humanos isolados, imunoglobulinas, produtos de divagem e outras porções especificadas e variantes destes, bem como composições de anticorpo antiTNF, plantas transgênicas, animais trangênicos, dispositivos, formulações, composições, células hospedeiras, vetores, ácidos nucléicos complementares ou de codificação, e métodos de preparação e uso destes, como descrito e permitido aqui, em combinação com o que é conhecido na técnica.

A presente invenção também fornece pelo menos um anticorpo anti-TNF isolado como aqui descrito. Um anticorpo de acordo com a presente invenção inclui qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como porém não limitada a pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de uma cadeia leve ou pesada ou uma proteína de ligação de ligante deste, uma região variável de cadeia leve ou cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve ou cadeia pesada, uma região de estrutura, ou qualquer porção desta, que pode ser incorporada em um anticorpo da presente invenção. Um anticorpo da invenção pode incluir ou ser derivado de qualquer mamífero, tal como porém não limitado a um ser humano, um camundongo, um coelho, um rato, um roedor, um primata, ou qualquer combinação deste, e outros.

A presente invenção fornece, em um aspecto, moléculas de ácido nucléico isoladas compreendendo, complementar, ou hibridizando a, um polinucleotídeo codificando anticorpos anti-TNF específicos, compreendendo pelo menos uma seqüência especificada, domínio, porção ou variante deste. A presente invenção também fornece vetores recombinantes compreendendo as referidas moléculas de ácido nucléico de anticorpo anti-TNF, células hospedeiras contendo tais ácidos nucléicos e/ou vetores recombi-

nantes, bem como métodos de preparação e/ou uso de tais ácidos nucléicos, vetores e/ou células hospedeiras.

Pelo menos um anticorpo da invenção liga pelo menos um epitópo especificdo específico a pelo menos uma proteína de TNF, subunidade, fragmento, porção ou qualquer combinação deste. Pelo menos um epitópo pode compreender pelo menos uma região de ligação de anticorpo que compreende pelo menos uma porção da referida proteína, cujo epitópo é preferivelmente compreendido de pelo menos 1-5 aminoácidos de pelo menos uma porção deste, tal como porém não limitado a, pelo menos um domínio citoplasmático, externo, hidrofílico, solúvel, extracelular ou funcional da referida proteína, ou qualquer porção deste.

Pelo menos um anticorpo pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção especificada de pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) (por exemplo, CDR1, CDR2 ou CDR3 da região variável de cadeia leve ou pesada) e/ou pelo menos uma região de estrutura variável ou constante ou qualquer porção deste. Pelo menos uma seqüência de aminoácido de anticorpo pode também opcionalmente compreender pelo menos uma substituição, inserção ou anulação especificada como aqui descrito ou como conhecido na técnica.

A presente invenção também fornece pelo menos um anticorpo anti-TNF especificado como aqui descrito, onde o anticorpo tem pelo menos uma atividade, tal como, porém não limitada a inibição de moléculas de adesão de célula induzidas por TNF, inibição de ligação de TNF ao receptor, melhora no índice artrítico em modelo de camundongo, (observe, por exemplo, Exemplos 3 - 7). Um anticorpo anti-TNF pode desse modo ser avaliado quanto a uma atividade correspondente de acordo com métodos conhecidos, tal como porém não limitado a, pelo menos uma atividade biológica voltada para uma proteína de TNF.

A presente invenção também fornece pelo menos um anticorpo anti-idiotipo de TNF para pelo menos um anticorpo de TNF da presente invenção. O anticorpo anti-idiotipo inclui qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que compreende pelo menos uma porção de uma molécula

de imunoglobulina, tal como porém não limitada a pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de uma cadeia leve ou pesada ou uma porção de ligação de ligante deste, uma região variável de cadeia leve ou pesada, uma região constante de cadeia leve ou pesada, uma região de estrutura, ou qualquer porção destas, que podem ser incorporadas em um anticorpo da presente invenção. Um anticorpo da invenção pode incluir ou ser derivado de qualquer mamífero, tal como porém não limitado a um ser humano, um camundongo, um coelho, um rato, um roedor, um primata, e outros.

A presente invenção fornece, em um aspecto, moléculas de ácido nucléico isoladas compreendendo, complementar, ou hibridizando a, um polinucleotídeo codificando pelo menos um anticorpo anti-idiotipo de TNF, compreendendo pelo menos uma sequência especificada, domínio, porção ou variante deste. A presente invenção também fornece vetores recombinantes compreendendo as referidas moléculas de ácido nucléico de codificação de anticorpo anti-idiotipo de TNF, células hospedeiras contendo tais ácidos nucléicos e/ou vetores recombinantes, bem como métodos de preparação e/ou uso de tais ácidos nucléicos de anticorpo anti-idiotipo, vetores e/ou células hospedeiras.

A presente invenção também fornece pelo menos um método para expressar pelo menos um anti-corpo anti-TNF, ou anticorpo antiidiotipo de TNF, em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar uma célula hospedeira como descrita aqui sob condições onde pelo menos um anticorpo anti-TNF é expressa em quantidades detectáveis e/ou recuperáveis.

A presente invenção também fornece pelo menos uma composição compreendendo um anticorpo anti-TNF isolado codificando ácido nucléico e/ou anticorpo como descrito aqui; e (b) um diluente ou veículo adequado. O veículo ou diluente pode opcionalmente ser farmaceuticamente aceitável, de acordo com veículos ou diluentes conhecidos. A composição pode opcionalmente também compreender pelo menos um outro composto, proteína ou composição.

A presente invenção também fornece pelo menos um método de anticorpo anti-TNF ou composição, para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz para modular ou tratar pelo menos uma condição relacionada com TNF em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou, antes de, subseqüente a, ou durante uma condição relacionada, como conhecida na técnica e/ou como descrita aqui.

A presente invenção também fornece pelo menos uma composição, dispositivo e/ou método de liberação de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-TNF, de acordo com a presente invenção.

A presente invenção também fornece pelo menos um método de anticorpo anti-TNF ou composição, para diagnosticar pelo menos uma condição relacionada a TNF em um tecido de células, órgão, animal ou paciente e/ou, antes de, subseqüente a, ou durante uma condição relacionada, como conhecida na técnica e/ou como descrita aqui.

A presente invenção também fornece pelo menos uma composição, dispositivo e/ou método de liberação para diagnosticar pelo menos um anticorpo anti-TNF, de acordo com a presente invenção.

Descrição das Figuras

Figura 1 mostra uma representação gráfica exibindo um ensaio quanto à capacidade de mAbs de TNV em sobrenadantes de célula de hibridoma para inibir a ligação de TNFV em receptor de TNF recombinante. Quantidades variantes de sobrenadantes de célula de hibridoma contendo quantidades conhecidas de mAb de TNV foram pré-incubadas com uma concentração fixa (5 ng/ml) de ¹²⁵l-rotulado de TNFV. A mistura foi transferida para Optiplacas de 96 cavidades que foram previamente revestidas com p55-sf2, um receptor de TNF recombinante/proteína de fusão de IgG. A quantidade de TNFV que ligou ao receptor p55 na presença de mAbs foi determinada após a lavagem longe do material não-ligado e contagem empregando um contador gama. Embora oito amostras de mAb de TNV tenham sido testadas nestas experiências, para simplicidade três de mAbs que se mostraram por análises de sequência de DNA serem idênticas a um dos outros mAbs de TNV (observe Seção 5.2.2) não são mostradas aqui. Cada amostra foi testada em duplicidade. Os resultados mostrados são representativos de duas experiências independentes.

Figura 2 mostra seqüências de DNA das regiões variáveis de cadeia pesada de mAb de TNV. O gene de linha germinativa mostrado é o gene DP-46. ‘TNVs’ indica que a sequência mostrada é a sequência TNV14, TNV15, TNV148, e TNV196. Os primeiros três nucleotídeos na sequência TNV definem o códon Met de iniciação de tradução. Pontos nas seqüências de gene mAb de TNV indicam que o nucleotídeo é o mesmo como na sequência de linha germinativa. Os primeiros 19 nucleotídeos (sublinhados) das seqüências TNV correspondem ao oligonucleotídeo empregado para amplificar por PCR a região variável. Uma tradução de aminoácido (abreviações de letra única) começando com mAb maduro é mostrada apenas para o gene de linha germinativa. Os três domínios de CDR na tradução de aminoácido de linha germinativa são marcados em negrito e sublinhados. TNV148(B) rotulada por cepas indicam que a seqüência mostrada pertence a ambas TNV148 e TNV148B. Lacunas na seqüência de DNA de linha germinativa (CDR3) são devido à seqüência não ser conhecida ou não existir no gene de linha germinativa. As cadeias pesadas de mAb de TNV usam a região de união J6.

Figura 3 mostra seqüências de DNA das regiões variáveis de cadeia leve de mAb de TNV. O gene de linha germinativa mostrado é um membro representativo da família Vg/38K de genes humanos de região variável de linha germinativa Kappa. Pontos nas seqüência de gene de mAb de TNV indicam que o nucleotídeo é o mesmo como na seqüência de linha germinativa. Os primeiros 16 nucleotídeos (sublinhados) das seqüências TNV correspondem ao oligonucleotídeo empregado para amplificar por PCR a região variável. Uma tradução de aminoácido de mAb maduro (abreviações de letra única) é mostrada apenas para o gene de linha germinativa. Os três domínios de CDR na tradução de aminoácido de linha germinativa são marcados em negrito e sublinhados. TNV148(B) rotulada por cepas indicam que a seqüência mostrada pertence a ambas TNV148 e TNV148B.

Lacunas na sequência de DNA de linha germinativa (CDR3) são devido à sequência não ser conhecida ou não existir no gene de linha germinativa. As cadeias leves de mAb de TNV usam a região de união J3.

Figura 4 mostra sequências de aminoácido deduzidas das regiões 5 variáveis de cadeia pesada de mAb de TNV. As sequências de aminoácido mostradas (abreviações de letra única) foram deduzidas da sequência de DNA determinada de ambos os produtos de PCR não clonados e produtos de PCR clonados. As sequências de amino são mostradas divididas na sequência de sinal secretória (sinal), estrutura (FW), e domínios de região de determinação de com10 plementaridade (CDR). As sequências de aminoácidos para o gene de linha germinativa DP-46 é mostrada no topo da linha para cada domínio. Os pontos indicam que o aminoácido no mAb de TNV é idêntico ao gene de linha germinativa. TNV148(B) indica que a sequência mostrada pertence a ambas TNV148 e TNV148B. ‘TNVs’ indicam que a sequência mostrada pertence a todos mAbs de

TNV a menos que uma sequência diferente seja mostrada. Traços na sequência de linha germinativa (CDR3) indicam que as sequências não são conhecidas ou não existem no gene de linha germinativa. A SEQ ID NO:16 representa a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de TNV148(B).

Figura 5 mostra sequências de aminoácidos deduzidos das regiões variáveis de cadeia leve de mAb de TNV. As sequências de aminoácido mostradas (abreviações de letra única) foram deduzidas da sequência de DNA determinada de ambos os produtos de PCR não-clonados e produtos de PCR clonados. As sequências de amino são mostradas divididas na sequência de sinal secretória (sinal), estrutura (FW), e domínios de região de determinação de complemen25 taridade (CDR). A sequência de aminoácido para o gene de linha germinativa de cadeia leve tipo Vg/38K é mostrada no topo da linha para cada domínio. Os pontos indicam que o aminoácido no mAb de TNV é idêntico ao gene de linha germinativa. TNV148(B) indica que a sequência mostrada pertence a ambas TNV148 e TNV148B. ‘Todos’ indicam que a sequência mostrada pertence am30 bas TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B e TNV186. A SEQ ID NO:17 representa a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de TNV148(B).

Figura 6 mostra ilustrações esquemáticas dos plasmídeos de

Petição 870180005359, de 22/01/2018, pág. 8/12 expressão de cadeia leve e pesada empregadas para criar células C466 expressando rTNV148B. p1783 é o plasmídeo de cadeia pesada e p1776 é o plasmídeo de cadeia leve. A rTNV148B variável e domínios de codificação de região constante são mostrados como caixas pretas. Os realçadores de imunoglobulina nos íntrons J-C são mostrados como caixas cinzas. Sítios de restrição pertinentes são mostrados. Os plasmídeos são mostrados orientados tal que a transcrição dos genes Ab procede em uma direção horária. Plasmídeo p1783 é de 19,53 kb em comprimento e plasmídeo p1776 é de 15,06 kb em comprimento. As seqüências de nucleotídeo completas de ambos os plasmídeos são conhecidas. A sequência de codificação de região variável em p1783 pode ser facilmente substituída com outra seqüência região variável de cadeia pesada substituindo-se o fragmento de restrição BsiWI/BstBI. A seqüência de codificação de região variável em p1776 pode ser substituída com outra seqüência de região variável substituindo-se o fragmento de restrição Sall/Aflll .

Figura 7 mostra a representação gráfica de análise de curva de desenvolvimento de cinco linhagens de célula de produção de rTNV148B. As culturas foram iniciadas no dia 0 semeando-se células em frascos T75 em veículos I5Q+MHX para ter uma densidade de célula viável de 1,0 X 10⁵células/ml em um volume de 30 ml. As culturas de células empregadas para estes estudos tiveram em cultura contínua uma vez que as transfecções e subclonagens foram realizadas. Em dias subseqüentes, as células nos frascos T foram cuidadosamente ressuspensas e uma alíquota de 0,3 ml da cultura foi removida. Os estudos de curva de desenvolvimento foram terminados quando as contagens de célula caíram abaixo de 1,5 X 10⁵ células/ml. O número de células vivas na alíquota foi determinado por exclusão azul tripano e o resíduo da alíquota armazenada para determinação de concentração de mAb mais tarde. Um ELISA para IgG humano foi realizado em todas as amostras de alíquota no mesmo momento.

Figura 8 mostra uma representação gráfica de comparação de taxas de desenvolvimento de célula na presença de concentrações variantes de seleção de MHX. Subclones de célula C466A e C466B foram des-

congelados em veículos sem MHX (IMDM. 5% de FBS, 2 mM de glutamina) e cultivados durante dois dias adicionais. Ambas as culturas de células foram em seguida divididas em três culturas que continham ou nenhum MHX, 0,2X de MHX, ou 1X de MHX. Um dia mais tarde, frascos T75 frescos foram semeados com as culturas em uma densidade de partida de 1 X 10⁵ células/ml e células contadas em intervalos de 24 horas durante uma semana. Vezes dobradas durante os primeiros 5 dias foram calculadas empregando a fórmula SOP PD32.025 e são mostradas acima das barras.

Figura 9 mostra representações gráficas da estabilidade da produção de mAb em duração de duas linhagens de célula de produção de rTNV148B. Subclones de célula que estiveram em cultura contínua uma vez que realizando as transfecções e subclonagens foram empregados para começar as culturas seriais de longa duração em pratos de cultura de 24 cavidades. As células foram cultivadas em veículos I5Q com e sem seleção de MHX. As culturas foram continuamente passadas dividindo-se as culturas a cada 4 a 6 dias para manter novas culturas viáveis ao mesmo tempo que as culturas prévias foram permitidas funcionar despendidas. As alíquotas do sobrenadante de célula despendida foram coletadas concisamente logo que as culturas forem despendidas e armazenadas até as concentrações de mAb serem determinadas. Um ELISA para IgG humano foi realizado em todas as amostras de alíquota no mesmo momento.

Figura 10 mostra alterações em peso de modelo de camundongos Tg 197 de camundongo com artrite em resposta aos anticorpos antiTNF da presente invenção quando comparado aos controles no Exemplo 4. Em aproximadamente 4 semanas de idade os camundongos do estudo Tg197 foram nomeados, com base no sexo e peso corporal, em um dos 9 grupos de tratamento e tratados com uma dose de bólus intraperitoneal única de PBS de Dulbecco (D-PBS) ou um anticorpo anti-TNF da presente invenção (TNV14, TNV148 ou TNV196) em ou 1 mg/kg ou 10 mg/kg. Quando os pesos foram analisados como uma alteração da pré-dose, os animais tratados com 10 mg/kg de cA2 mostrou consistentemente ganho de peso mais alto do que os animais tratados com D-PBS em todo o estudo. Este ganho de peso foi significante em 3-7 semanas. Os animais tratados com 10 mg/kg de TNV148 também obtiveram ganho de peso significante em 7 semanas do estudo.

Figuras 11A-C representa a progressão da severidade da doença com base no índice artrítico como apresentado no Exemplo 4. O índice artrítico do grupo tratado por cA2 de 10 mg/kg foi mais baixo do que o grupo de controle de D-PBS começando na semana 3 e continuando durante todo o resto do estudo (semana 7). Os animais tratados com 1 mg/kg de TNV14 e os animais tratados com 1 mg/kg de cA2 não tiveram êxito para mostrar uma redução significante em Al após 3 semanas quando comparados ao Grupo tratado por D-PBS. Não existiu diferença significante entre os grupos de tratamento de 10 mg/kg quando cada foi comparado a outras doses similares (10 mg/kg de cA2 comparados a 10 mg/kg de TNV14, 148 e 196). Quando os grupos de tratamento de 1 mg/kg foram comparados, a TNV148 de 1 mg/kg mostrou um Al significantemente menor do que 1 mg/kg de cA2 3m 3, 4 e 7 semanas. A TNV148 de 1 mg/kg foi também significantemente menor do que o Grupo tratado por TNV14 de 1 mg/kg em 3 e 4 semanas. Embora TNV196 tenha mostrado redução significante em Al até 6 semanas de estudo (quando comparada ao Grupo tratado por D-PBS), a TNV148 foi o único tratamento de 1 mg/kg que permaneceu significante na conclusão do estudo.

Figura 12 mostra alterações em peso de modelo de camundongos Tg 197 de camundongo com artrite em resposta aos anticorpos antiTNF da presente invenção quando comparado aos controles no Exemplo 5. Em aproximadamente 4 semanas de idade os camundongos do estudo Tg197 foram nomeados, com base no sexo e peso corporal, em um dos 8 grupos de tratamento e tratados com uma dose de bólus intraperitoneal de artigo de controle (D-PBS) ou anticorpo (TNV14, TNV148) em 3 mg/kg (semana 0). As injeções foram repetidas em todos os animais nas semanas 1, 2, 3 e 4. As grupos 1-6 foram avaliados para testar a eficácia do artigo. As amostras de soro, obtidas de animais nos Grupos 7 e 8 foram avaliadas quanto a indução de resposta imune e liberação farmacocinética de TNV14 ou TNV148 em semanas 2, 3 e 4.

Figura 13A-C são gráficos representando a progressão da severidade da doença no Exemplo 5 com base no índice artrítico. O índice artrítico do grupo tratado por cA2 de 10 mg/kg foi significantemente mais baixo do que o grupo de controle de D-PBS começando na semana 2 e continuando durante todo o resto do estudo (semana 5). Os animais tratados com 1 mg/kg ou 3 mg/kg de cA2 e os animais tratados com 3 mg/kg de TNV148 não tiveram êxito para obter qualquer redução significante em Al no mesmo momento durante todo o estudo quando comparados ao grupo de controle com d-PBS. Os animais tratados com 3 mg/kg de TNV14 mostraram uma redução significante quando comparados ao grupo tratado por d-PBS começando na semana 3 e continuando por meio da semana 5. Os animais tratados por cA2 de 10 mg/kg mostraram uma redução significante em Al quando comparados a ambas as doses inferiores (1 mg/kg e 3 mg/kg) de cA2 nas semanas 4 e 5 do estudo e foi também foi também significantemente menor do que os animais tratados por TNV14 nas semanas 3 - 5. Embora não mostrem ter diferenças significantes entre quaisquer dos grupos de tratamento de 3 mg/kg, o Al para os animais tratados com 3 mg/kg de TNV14 foram significantemente mais elevados nos mesmos pontos de tempo do que os 10 mg/kg visto que os animais tratados com TNV148 não foram significantemente diferentes dos animais tratados com 10 mg/kg de cA2.

Figura 14 mostra alterações em peso de modelo de camundongos Tg 197 de camundongo com artrite em resposta aos anticorpos antiTNF da presente invenção quando comparadas aos controles no Exemplo 6. Em aproximadamente 4 semanas de idade os camundongos do estudo Tg197 foram nomeados, com base no sexo e peso corporal, em um dos 6 grupos de tratamento e tratados com uma dose de bólus intraperitoneal única de anticorpo (cA2, ou INV148) em ou 3 mg/kg ou 5 mg/kg. Este estudo utilizou o D-PBS e Grupos de controle de cA2 de 10 mg/kg.

Figura 15 representa a progressão de severidade da doença com base no índice artrítico como apresentado no Exemplo 6. Todos os grupos de tratamento mostraram alguma proteção nos pontos de tempo

mais precoce, com cA2 de 5 mg/kg e TNV148 de 5 mg/kg mostrando reduções significantes em Al nas semanas 1-3 e todos os grupos de tratamento mostrando uma redução significante na semana 2. Mais tarde no estudo os animais tratados com cA2 de 5 mg/kg mostrou alguma proteção, com reduções significantes nas semanas 4, 6 e 7. A dose baixa (3 mg/kg) de ambos cA2 e a TNV148 mostrou reduções significantes em 6 e todos os grupos de tratamento mostraram reduções significantes na semana 7. Nenhum dos grupos de tratamento foram capazes de manter uma redução significante na conclusão do estudo (semana 8). Não existiram diferenças significantes entre quaisquer dos grupos de tratamento (excluindo o grupo de controle de solução salina) em qualquer ponto de tempo.

Figura 16 mostra alterações em peso de modelo de camundongos Tg 197 de camundongo com artrite em resposta aos anticorpos antiTNF da presente invenção quando comparadas aos controles no Exemplo 7. Para comparar a eficácia de uma dose intraperitoneal única de TNV148 (derivada das células de hibridoma) e rTNV148B (derivada de células transfectadas). Em aproximadamente 4 semanas de idade, os camundongos do estudo Tg197 foram nomeados, com base no sexo e peso corporal, em um dos 9 grupos de tratamento e tratados com uma dose de bólus intraperitoneal única de PBS de Dulbecco (D-PBS) ou anticorpo (TNV148, rTNV148B) em 1 mg/kg .

Figura 17 representa progressão de severidade da doença com base no índice artrítico como apresentada no Exemplo 7. O índice artrítico do grupo tratado por cA2 de 10 mg/kg foi mais baixo do que o grupo de controle de D-PBS começando na semana 4 e continuando durante todo o resto do estudo (semana 8). Ambos os grupos tratados com TNV148 e grupos tratados com cA2 1 mg/kg mostraram uma redução significante em Al na semana 4. Embora um estudo prévio (P-099-017) mostrou que TNV148 foi ligeiramente mais eficaz na redução do índice Artrítico seguindo um bólus intraperitoneal de 1 mg/kg único, este estudo mostrou que o AI de ambas as versões dos grupos tratados por anticorpo de TNV foi ligeiramente mais alto. Embora (com a exceção da semana 6) o Grupo tratado por cA2 de mg/kg não foi significantemente aumentado quando comparado ao grupo cA2 de 10 mg/kg e os Grupos tratados por TNV148 foram significantemente mais elevados nas semanas 7 e 8, não existiram diferenças significantes em Al entre o cA2 de 1 mg/kg, TNV148 de 1 mg/kg e TNV148B de 1 mg/kg em qualquer ponto no estudo.

Descrição da Invenção

A presente invenção fornece anticorpos isolado, recombinante e/ou humano anti-TNF sintético, primata, roedor, mamífero, quimérico, humanizado ou enxertado por CDR, e anticorpos anti-idiotipo de TNF também, bem como composições e moléculas de ácido nucléico de codificação compreendendo pelo menos um polinucleotídeo codificando pelo menos um anticorpo anti-TNF ou anticorpo anti-idiotipo. A presente invenção também inclui, porém não está limitada a, métodos de preparação e uso de tais ácidos nucléicos e anticorpos e anticorpos anti-idiotipo, incluindo diagnóstico e composições terapêuticas, métodos e dispositivos.

Como empregado aqui, um anticorpo de fator alfa de necrose de antitumor, anticorpo anti-TNF, porção de anticorpo anti-TNF, ou fragmento de anticorpo anti-TNF e/ou variante de anticorpo anti-TNF e outros incluem qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que compreenda pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como porém não limitada a pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de uma cadeia leve ou pesada ou uma porção de ligação de ligante deste, uma região variável de cadeia leve ou cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve ou cadeia pesada, uma região de estrutura, ou qualquer porção deste, ou pelo menos uma porção de um receptor de TNF ou proteína de ligação, que pode ser incorporada em um anticorpo da presente invenção. Tal anticorpo opcionalmente também afeta um ligante específico tal como porém não limitado a, onde tal anticorpo modula, diminui, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloqueia, inibe, anula e/ou interfere com pelo menos uma atividade de TNF ou ligação, ou com ligação ou atividade de receptor de TNF, in vitro, in situ e/ou in vivo. Como um exemplo não-limitante, um anticorpo anti-TNF adequado, porção

especificada ou variante da presente invenção pode ligar pelo menos uma TNF, ou porções especificadas, variantes ou domínios destes. Um anticorpo anti-TNF adequado, porção especificada, ou variante pode também opcionalmente afetar pelo menos uma função ou atividade de TNF, tal como porém não limitado a, RNA, DNA ou síntese de proteína, liberação de TNF, sinalização de receptor de TNF, divagem de TNF de membrana, atividade de TNF, produção de TNF e/ou síntese. O termo anticorpo é também destinado a abranger anticorpos, fragmentos de digestão, variantes e porções especificadas destes, incluindo miméticos de anticorpo ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou função de um anticorpo ou fragmento especificado ou porção deste, incluindo anticorpos de cadeia única e fragmentos destes. Fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação de antígeno que ligam em uma TNF de mamífero. Por exemplo, fragmentos de anticorpo capazes de ligar em TNF ou porções destes, incluindo, porém não limitados a fragmentos Fab (por exemplo, por digestão de papaína), Fab’ (por exemplo, por digestão de pepsina e redução parcial) e F(ab’)₂ (por exemplo, por digestão de pepsina), facb (por exemplo, por digestão de plasmina), pFc’ (por exemplo, por digestão de pepsina ou plasmina), Fd (por exemplo, por digestão de pepsina, redução parcial e reagregação), Fv ou scFv (por exemplo, por técnicas de biologia molecular), são abrangidos pela invenção (observe, por exemplo, Colligan, Immunology, supra).

Tais fragmentos podem ser produzidos por divagem enzimática técnicas sintéticas ou recombinantes, como conhecidas na técnica e/ou descritas aqui. Os anticorpos podem também ser produzidos em uma variedade de formas truncadas empregando genes de anticorpo em que um ou mais códons de interrupção foram introduzidos a montante do sítio de interrupção natural. Por exemplo, um gene de combinação codificando uma porção de cadeia pesada de F(ab’)₂ pode ser designado para incluir sequências de DNA codificando o domínio CFh e/ou região de articulação de cadeia pesada. As várias porções de anticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua empregando técnicas de construção genética .

Como aqui empregado, o termo anticorpo humano refere-se a um anticorpo em que substancialmente cada parte da proteína (por exemplo, CDR, estrutura, domínios C_L, C_H (por exemplo, C_H1, C_H2, C_H3), articulação, (V_L, V_H)) é substancialmente não-imunogênica em seres-humanos, com somente variações ou alterações de seqüências menores. Similarmente, anticorpos designados primatas (macaco, babuíno, chimpanzé, etc.), roedor (camundongo, rato, coelho, cobaia, hamster, e outros) e outros mamíferos designam tais espécies, subgênero, gênero, subfamília, anticorpos específicos de família. Além disso, anticorpos quiméricos incluem qualquer combinação dos acima. Tais alterações ou variações opcional mente e preferivelmente retém ou reduzem a imunogenícidade em seres humanos ou outras espécies relativas a anticorpos não-modificados. Desse modo, um anticorpo humano é distinto de um anticorpo quimérico ou humanizada. É mostrado que um anticorpo humano pode ser produzido por um animal não-humano ou célula procariótÈca ou eucariótica que é capaz de expressar genes de imunoglobulina de ser humano funcionalmente reorganizados (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeia leve). Além disso, quando um anticorpo humano é um anticorpo de cadeia única, ele pode compreender um peptídeo ligante que não é encontrado em anticorpos humanos nativos. Por exemplo, um Fv pode compreender um peptídeo ligante, tal como dois a cerca de oito glicinas ou outros resíduos de aminoácidos, que fazem conexão com a região variável da cadeia pesada e com a região variável da cadeia leve. Tais peptídeos ligantes são considerados ser de uma origem humana .

Anticorpos biespecíficos, heteroespecíficos, heteroconjugados ou similares podem também ser empregados os quais são monoclonais, preferivelmente anticorpos humanos ou humanizados que tem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para pelo menos uma proteína de TNF, a outra é para qualquer outro antígeno. Métodos de construir anticorpos específicos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é com base na co-expressão ί

fl de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas tem especificades diferentes (Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)). Por causa da classificação aleatória de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é usualmente realizada por etapas de cromatografia de afinidade, é de preferência incômoda, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos, por exemplo, em WO 93/08829, Patente U.S. n°^s, 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, EP 03089, Traunecker e outro, EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh e outro, Methods in Enzymology 121:210 (1986), cada totalmente incorporada aqui por referência .

Anticorpos anti-TNF (também chamados anticorpos de TNF) úteis nos métodos e composições da presente invenção podem opcionalmente ser caracterizados por ligação de alta afinidade a TNF e opcionalmente e preferivelmente tendo baixa toxicidade. Em particular, um anticorpo, fragmento especificado ou variante da invenção, onde os componentes individuais, tal como a região variável, região constante e estrutura, individualmente e/ou coletivamente, opcionalmente e preferivelmente possui baixa imunogenicidade, é útil na presente invenção. Os anticorpos que podem ser empregados na invenção são opcionalmente caracterizados por sua capacidade de tratar pacientes durante períodos prolongados com alívio mensurável de sintomas e baixa e/ou toxicidade aceitável. Imunogenicidade baixa ou aceitável e/ou alta afinidade, bem como outras propriedades adequadas podem contribuir para os resultados terapêuticos obtidos. Baixa imunogenicidade é definida aqui como respostas HAHA, HACA ou HAMA significantes incitantes em menos do que cerca de 75%, ou preferivelmente menos do que cerca de 50% dos pacientes tratados e/ou baixos títulos incitantes no paciente tratado (menos do que cerca de 300, preferivelmente menos do que cerca de 100 avaliados com um imunoensaio de enzima de antígeno duplo) (Elliot e outro, Lancet 344:1125-1127 (1994), totalmente incorporados aqui por referência).

Utilidade

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser empregados para produção de pelo menos um anticorpo anti-TNF ou variante especificada deste, que pode ser empregados para avaliar ou realizar em uma célula, tecido, órgão ou animal (incluindo mamíferos e seres humanos), para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a impedir a incidência de, ou reduzir os sintomas de, pelo menos uma condição de TNF, selecionada de porém não limitada a, pelo menos uma de uma doença ou distúrbio imune, uma doença ou distúrbio cardiovascular, uma doença ou distúrbio infeccioso, maligno e/ou neurológico.

Um tal método pode compreender administrar uma quantidade eficaz de uma composição ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TNF em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção, ou redução em sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreender uma quantidade de cerca de 0,001 a 500 mg/kg por administração única (por exemplo, bólus), múltipla ou contínua, ou para obter uma concentração de soro de 0,01-5000 pg/ml de concentração de soro por administração única, múltipla, ou contínua, ou qualquer faixa eficaz ou valor neste, como realizada e determinada empregando métodos conhecidos, como descrito aqui ou conhecidos nas técnicas pertinentes.

Citações

Todas as publicações ou patentes aqui citadas são totalmente incorporadas aqui por referência quando eles mostram o estado da técnica no momento da presente invenção e/ou para fornecer a descrição e permissão da presente invenção. As publicações referem-se a quaisquer publicações científicas ou de patente, ou qualquer outra informação disponível em qualquer formato de veículos, incluindo todos os formatos registrados, eletrônicos ou impressos. As referências seguintes são totalmente incorpora22 das aqui por referência: Ausubel, e outro, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NV, NY (1987 - 2001); Sambrook, e outro, Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, 2^a Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, e outro, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, inc., NY (1994 - 2001); Colligan e outro, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997 - 2001). Anticorpos da Presente Invenção

Pelo menos um anticorpo anti-TNF da presente invenção pode ser opcionaímente produzido por uma linhagem de célula, uma linhagem de célula misturada, uma célula imortalizada ou população clonal de células imortalizadas, bem-conhecidas na técnica. Observe, por exemplo, Ausubel, e outro, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons., Inc, NY, NY (1987 - 2001); Sambrook, e outro, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a Edição, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, e outro, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994 - 2001); Colligan e outro, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997 - 2001), cada totalmente incorporado aqui por referência .

Anticorpos humanos que são específicos para proteínas de TNF humanas ou fragmentos destes podem ser aumentados contra um antígeno imunogênico apropriado, tal como proteína de TNF e/ou isolada ou uma porção desta (incluindo moléculas sintéticas, tal como peptídeos sintéticos). Outros anticorpos de mamíferos gerais ou específicos podem ser similarmente aumentados. A preparação de antígenos imunogênicos, e produção de anticorpo monoclonal pode ser realizada empregando qualquer técnica adequada .

Em um método, um hibridoma é produzido fundindo-se uma linhagem de célula imortal adequada (por exemplo, uma linhagem de célula de mielomatal como, porém não limitada a, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2

SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, ou similar, ou heteromilomas, produtos de fusão destes, ou qualquer célula ou célula de fusão derivada disso, ou qualquer outra linhagem de célula adequada como conhecida na técnica. Observe, por exemplo, www.atcc.org, www.lifetech.com., e similares, com células de produção de anticorpo, tal como, porém não limitada a, baço isolado ou clonado, sangue periférico, linfa, amígdala, ou outras células contendo célula B ou imune, ou quaisquer outras células expressando sequências de CDR ou estrutura ou variável ou constante de cadeia leve ou pesada, ou como ácido nucléico endógeno ou heterólogo, como recombinante ou endógeno, viral, bacteriano, algal, procariótico, anfibiano, inseto, reptiliano, peixe, mamífero, roedor, eqüino, ovino, bode, carneiro, primata, eucariótico, DNA genômico, cDNA, rDNA, RNA ou DNA mitocondrial, RNA ou DNA de cloroplasto, hnRNA, mRNA, tRNA, filamento único, duplo ou triplo, hibridizado, e outro ou qualquer combinação deste. Observe, por exemplo, Ausubel, supra, e Colligan, Immunology, supra, chapter 2, totalmente incorporado aqui por referência .

Células de produção de anticorpo podem também ser obtidas do sangue periférico ou, preferivelmente os nodos de linfa ou baço, de seres humanos ou outros animais adequados que foram imunizados com o antígeno de interesse. Qualquer outra célula hospedeira adequada pode também ser empregada para expressar ácido nucléico heterólogo ou endógeno codificando um anticorpo, fragmento específico ou variante desta, da presente invenção. As células fundidas (hibridomas) ou células recombinantes podem ser isoladas empregando condições de cultura seletivas ou outros métodos conhecidos adequados, e clonadas por diluição limitante ou separação de célula, ou outros métodos conhecidos. As células que produzem anticorpos com a especificidade desejada podem ser selecionadas por um ensaio adequado (por exemplo, ELISA).

Outros métodos adequados de produção ou isolamento de anticorpos da especificidade requerida podem ser empregados, incluindo, porém não limitados a, métodos que selecionam anticorpo recombinante de

uma biblioteca de peptídeo ou proteína (por exemplo, porém não limitados a, bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, ou similar, biblioteca de exibição; por exemplo, como disponibilizados por Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Observe, por exemplo, EP 368.684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/ 002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC); WO 90/14443; WO 90/14424; WO 90/14430; PCT/US94/1234; WO 92/18619; WO96/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); WO 95/16027 (Biolnvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4.704.692 (Enzon);

PCT/US91/02989 (Affymax); WO89/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); ou proteínas ou peptídeos estocasticamente gerados - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590 689 (Ixsys, agora Applied Molecular Evolution (AME), cada totalmente incorporadas aqui por referência) ou que contam com a imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen e outro, Microbiol. Immunol. 41:901 - 907 (1997); Sandhu e outro, Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118 (1996); Eren e outro, Immunol. 93:154-161 (1998), cada totalmente incorporado por referência bem como as patentes e pedidos relacionados) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, como conhecidos na técnica e/ou como aqui descrito. Tais técnicas, incluem, porém não são limitadas a, exibição de ribossomo (Hanes e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:4937 - 4942 (Maio de 1997); Hanes e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:14130 - 14135 (Novembro de 1998)); tecnologias de produção de anticorpo de célula única (por exemplo, método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM¹¹) (Patente U.S. n° 5.627.052, Wen e outro, J. Immunol. 17:887 - 892 (1987); Babcook e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843 - 7848 (1996)); microgotícula de gel e citometria de fluxo (Powell e outro, Biotechnol. 8: 333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray e outro, J. Imm. Meth.

182:155 - 163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13: 787 - 790 (1995)); BCell selection (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19: 125 - 134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, ln Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Netherlands (1988)) .

Métodos para construir ou humanizar anticorpos humanos ou não-humanos podem ser empregados e são bem-conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado ou construído tem um ou mais resíduos de aminoácido de uma fonte que é não-humana, por exemplo, porém não limitada a camundongo, rato, coelho, primata não-humano ou outro mamífero. Estes resíduos de aminoácido humano são freqüentemente referidos como resíduos importantes, que são tipicamente tirados de uma constante, variável importante ou outro domínio de uma seqüência humana conhecida. Sequências de Ig humanas conhecidas são descritas, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;www.attc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/;www.abcam.com/;www.antibodyresource.conVonlinecomp.html; www.pubfic.iastate.edu/~pedro/reseatch_tools.html;www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT. html; www.whfreeman.com4mmunology/CH05Auby05.htm;www.libraty.thinkquest.otg/ 12429/lmmune/Antibody.html; www.hhmkoig^/grants4ectures^/1996Vlab/;www.path.cam. ac.uk/~mrc7/mikeimages.html; www.antibodyresouiOe.com/; mcb.harvard.edLvBtoLinks/ lmmunology.html. www.immunologylink.com/;pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html; www.biotech.ufi.edu/~hcl/; www.pebio.corrVpa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/ awic/pubVantibody/; www.rn.ehime-u.ac.jp/~yasuhitc/Elisa.html;www.biodesing.com/ table.asp; www.icnet.uk/axp/facVdavies/links.html;www.biotech.ufl.edu/~fccl/pratocol.html; www.isacnet.org/sites_geo.html;aximtl.imt.uni-marburg.de/~rek/AEPStart.html; baserv.uci.kun.nl/~jraatVlinks1.html; www.recab.unt-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrccpe.cam.ac.uk/imt-doVpubliVINTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mtce.html; imgtcnusc. fr81O4/; www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/abVinctex.html;antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm. tamu.edu/lafc/wwwabgen.html; www.unizh.ch/~honegger/AHOseminar/Slide01 .html; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcgO7V;www.nitmr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg.htm;www.path.cam.ac. uk/~mrc7/hurrianisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.mÍssouri.edu/smithgp/indexhtnl;www.cryst.bioc.cam.ac.uk/~fmolina/Web-

pages/Pept/spotíech.html; www.jerini.de/fr__products.htiTi;www.patentsjbm.COrrVibiTi.htm!. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), cada totalmente incorporada aqui por referência.

Tais sequências importadas podem ser empregadas para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, realçar ou modificar a ligação, afinidade, na taxa, fora da taxa, avidez, especificidade, meia-vida, ou qualquer outra característica adequada, como conhecida na técnica. Geralmente parte ou todas as seqüências de CDR não-humana ou humana são mantidas ao mesmo tempo que as seqüências não-humanas das regiões constantes e variáveis são substituídas com humanos ou outros aminoácidos. Os anticorpos podem também opcionalmente ser humanizados com a retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para obter este objetivo, os anticorpos humanizados podem ser opcionalmente preparados por um processo de análise das seqüência parentais e vários produtos humanizados conceptuais empregando modelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares àqueles versados na técnica. Programas de computadores estão disponíveis os quais ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permitem a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de ligar seu antígeno. Desta maneira, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados das seqüências importantes e de consenso para que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o antígeno(s) alvo seja obtida. Em geral, os resíduos de CDR são díretamente e mais substancialmente envolvidos em ligação de antígeno de influência. A humanização ou construção de anticorpos da presente invenção pode ser realizada empregando qualquer método conhecido, tal como porém não limitado àqueles descritos em, Winter (Jones e outro, Nature 321: 522 (1986); Riechmann e outro, Nature 332: 323 (1988) ; Verhoeyen e outro, Science 239:1534 (1988)), Sims e outro, J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 (1987), Carter e outro, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285 (1992); Presta e outro, J. Immunol. 151:2623 (1993), Patente U.S. n°^s : 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5.766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630,

US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO 90/14443, WO90/14424, WO 90/14430, EP 229246, cada totalmente incorporada aqui por referência, referências citadas incluídas nestas.

O anticorpo anti-TNF pode também ser opcinalmente gerado por imunização de um animal transgênico (por exemplo, camundongo, rato, hamster, primata não-humano, e outros) capaz de produzir um repertório de anticorpos humano, como descrito aqui e/ou como conhecidos na técnica. As células que produzem um anticorpo anti-TNF humano podem ser isoladas de tais animais e imortalizadas empregando métodos adequados, tal como métodos descritos aqui.

Camundongos transgênicos que podem produzir um repertório de anticorpos humanos que ligam em antígenos humanos podem ser produzidos por métodos conhecidos (por exemplo, porém não limitados a, Patente U.S. n°^s: 5.770.428, 5.569.825, 5.545.806, 5.625.126, 5.625.825, 5.633.425, 5.661.016 e 5.789.650 emitidas por Lonberg e outro; Jakobovits e outro WO 98/50433, Jakobovits e outro WO 98/24893, Lonberg e outro WO 98/24884, Lonberg e outro WO 97/13852, Lonberg 94/25585, Kucherlapate e outro WO 96/34096, Kucherlapate e outro EP 0463 151 B1, Kucherlapate e outro EP 0710 719 A1, Surani e outro Patente U.S. n° 5.545.807, Bruggemann e outro WO 90/04036, Bruggemann e outro, EP 0438 474 B1, Lonberg e outro EP 0814 259 A2, Lonberg e outro GB 2 272 440 A, Lonberg e outro Nature 368: 856 - 859 (1994), Taylor e outro, Int. Immunol. 6(4) 579 - 591 (1994), Green e outro, Nature Genetics 7:13-21 (1994), Mendez e outro, Nature Genetics 15:146 - 156 (1997), Tayior e outro, Nucleíc Acids Research 20(23): 6287 - 6295 (1992), Tuaillon e outro, Proc. Natl Acad Sci USA 90(8) 3720 3724 (1993), Lonberg e outro, Int Rev Immunol 13(1):65 - 93 (1995) e

Fishwald e outro, Nat Biotechnol 14(7): 845 - 851 (1996), que são cada totalmente incorporado aqui por referência). Geralmente, estes camundongos compreendem pelo menos um animal transgene compreendendo DNA de pelo menos uma localização de imunoglobulina humana que é funcionalmente reorganizada, ou que pode sofrer reorganização funcional. As localizações de imunoglobulina endógena em tais camundongos podem ser rompidas ou anuladas para eliminar a capacidade do animal produzir anticorpos codificados por genes endógenos.

A avaliação de anticorpos para ligação específica em proteínas similares ou fragmentos pode ser convenientemente obtida empregando bibliotecas de exibição de peptídeo. Este método envolve a avaliação de grandes coleções de peptídeos para membros individuais tendo a estrutura ou função desejada. A avaliação de anticorpo das livrarias de exibição de peptídeo é bem-conhecida na técnica. As seqüências de peptídeo exibidas podem ser de 3 a 5000 ou mais aminoácidos no comprimento, freqüentemente de 5 -100 aminoácidos longos, e freqüentemente de cerca de 8 a 25 aminoácidos longos. Em adição aos métodos sintéticos químicos para gerar bibliotecas de peptídeo, diversos métodos de DNA recombinante foram descritos. Um tipo envolve a exiibição de uma seqüência de peptídeo sobre a superfície de um bacteriofago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de peptídeo exibida particular. Tais métodos são descritos na Publicação de patente PCT N~ 91/17271, 91/18980, 91/19818, e 93/08278. Outros sistemas para gerar bibliotecas de peptídeos tem aspectos de ambos os métodos recombinantes e síntese química in vitro. Observe, Publicação de Patente PCT N~ 92/05258, 92/14843, e 96/19256. Observe também, Patente U.S. n° 5.658.754; e 5.643.768. Bibliotecas de exibição de peptídeo, vetor, e kits de avaliação são comercialmente disponíveis de tais fornecedores como Invitrogen (Carlsbad, CA), e Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Observe, por exemplo, Patente U.S. n°^s 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, designadas por Enzon; 5223409,5403484, 5571698, 5837500, designadas por Dyax, 5427908, 5580717, designadas por Affymax; 5885793, designada por Cambridge antibody Technologies; 5750373, designada por Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, designadas por Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; ou Sambrook, supra, cada uma das patentes e publicações acima totalmente incorporadas aqui por referência.

Os anticorpos da presente invenção podem ser também preparados empregando pelo menos um anticorpo anti-TNF codificando o ácido nucléíco para fornecer mamíferos ou animais transgênicos, tai como bodes, vacas, cavalos, carneiros, e outros, que produzem tais anticorpos em seu leite. Tais animais podem ser fornecidos empregando métodos conhecidos. Observe, por exemplo, porém não limitado a, Patente U.S. n°^s 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616, 5.565.362; 5.304.489, e outros, cada da qual é totalmente incorporada por referência.

Os anticorpos da presente invenção podem adicionalmente ser preparados empregando pelo menos um anticorpo anti-TNF codificando ácido nucléico para fornecer plantas transgênicas e células de planta cultivadas (por exemplo, porém não limitadas a tabaco e milho) que produzem tais anticorpos, porções especificadas ou variantes nas partes de planta ou em células cultivadas destas. Como um exemplo não limitante, folhas de tabaco transgênicas expressando proteínas recombinantes foram bemsucedidamente empregadas para fornecer grandes quantidades de proteínas recombinantes, por exemplo, empregando um promotor induzível. Observe, por exemplo, Cramer e outro, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240: 95 118 (1999) e referências citadas a esse respeito. Da mesma forma, milho transgênico tem sido empregado para expressar proteínas de mamíferos em níveis de produção comercial, com atividades biológicas equivalentes aquelas produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificados de fontes naturais. Observe, por exemplo, Hood e outro, Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127 - 147 (1999) e referências citadas aqui. Os anticorpos foram também produzidos em grandes quantidades de sementes de plantas transgênicas incluindo fragmentos de anticorpos, tal como anticorpos de cadeia única (scFv’s), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. Observe, por exemplo, Conrad e outro, Plant Mol. Biol. 38: 101 - 109 (1998) e referência citada aqui. Desse modo, os anticorpos da presente invenção podem também ser produzidos empregando plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos. Observe, por exemplo, Fischer e outro, Biotechnol. Appl. Biochem. 30 : 99 - 108 (Oct., 1999), Ma e outro, Trends Biotechnol. 13: 522-7 (1995); Ma e outro, Plant PhysioL 109: 341-6 (1995); Whitelam e outro, Biochem. Soc. Trans. 22: 940 - 944 (1994); e referências citadas aqui. Observe, também geralmente para expressão de planta de anticorpos, porém não limitada a, cada das referências acima é totalmente incorporada aqui por referência .

Os anticorpos da presente invenção podem ligar TNF humana com uma ampla faixa de afinidades (K_D). Em uma modalidade preferida, pelo menos um mAb humano da presente invenção pode opcionalmente ligar TNF humana com alta afinidade. Por exemplo, um mAb humano pode ligar TNF humana com K_D igual a ou menor do que cerca de 10'⁷ M, tal como porém não limitado a, 0,1 - 9,9 (ou qualquer faixa ou valor nesse ponto) X 10'⁷, 10'^θ, 10'⁹, 10¹⁰, 10'¹¹, 10'¹², 10'¹³ ou qualquer faixa ou valor nesse ponto.

A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente empregando qualquer método adequado. (Observe, por exemplo, Berzofsky, e outro, Antibody-Antigen Interactions,Em Fundamenta! Immunology, Paul, W, E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); e métodos aqui descritos). A afinidade avaliada de uma interação de anticorpo-antígeno particular para variar se avaliada sob condições diferentes (por exemplo, concentração de sal, pH). Desta maneira, as avaliações de afinidade e outros parâmetros de ligação de antígeno (por exemplo, K_D, K_a, K_d) são preferivelmente feitos com soluções padronizadas de anticorpo e antígeno, e um tampão padronizado, tal como o tampão aqui descrito.

Moléculas de Ácido Nucléico

Empregando-se a informação aqui fornecida, tal como as seqüências de nucleotídeo codificando em pelo menos 70 - 100% dos aminoácidos contínuos de pelo menos uma das SEQ ID NOS:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, fragmentos especificados, sequências de consenso ou variantes destes, ou um vetor depositado compreendendo pelo menos uma destas seqüências, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção codificando pelo menos um anticorpo anti-TNF pode ser obtida empregando-se métodos aqui descritos ou como conhecido na técnica .

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser na forma de RNA, tal como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma de DNA, incluindo, porém não limitado a, cDNA e DNA genômico obtidos por clonagem ou sinteticamente produzido, ou quaisquer combinações destes. O DNA pode ser de filamento triplo, filamento duplo, filamento único, ou qualquer combinação destes. Qualquer porção de pelo menos um filamento do DNA ou RNA pode ser o filamento de codificação, da mesma forma conhecido como o filamento de anti-sentido.

As moléculas de ácido nucléico isolado da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucléico compreendendo um quadro de leitura aberto (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, por exemplo, porém não limitado a, pelo menos uma porção especificada de pelo menos um CDR, como CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de pelo menos uma cadeia pesada (por exemplo, SEQ ID NOS: 1 - 3) ou cadeia leve (por exemplo, SEQ ID NOS: 4 - 6); moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência de codificação para um anticorpo anti-TNF ou região variável (por exemplo, SEQ ID NOS: 7,8); e moléculas de ácido nucléico que compreendem uma seqüência de nucleotídeo substancialmente diferentes daquelas descritas acima porém que, devido à degeneração do código genético, ainda codifica pelo menos um anticorpo anti-TNF como aqui descrito e /ou como mostrado na técnica. Claro, o código genético é bem-conhecido na técnica. Desta maneira, seria rotineiro para alguém versado na técnica gerar tais variantes de ácido nucléico degeneradas que codificam para os anticorpos anti-TNF

específicos da presente invenção. Observe, por exemplo, Ausubel, e outros, supra, e tais variantes de ácido nucléico estão incluídas na presente invenção. Os exemplos não-limitantes de moléculas de ácido nucléico isolado da presente invenção incluem SEQ ID NOS: 10, 11, 12, 13, 14, 15, correspondente s aos exemplos não-limitantes de uma codificação de ácido nucléico, respectivamente, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, região variável de HC e região variável de LC.

Em outro aspecto, a invenção fornece moléculas de ácido nucléico isolado codificando um anticorpo anti-TNF tendo uma sequência de aminoácido como codificado pelo ácido nucléico contido no plasmídeo depositado como nomes de clone designado_e Depósito

ATCC n~_, respectivamente, depositado em

Como aqui indicado, as moléculas de ácido nucléico da presente invenção que compreendem um ácido nucléico codificando um anticorpo anti-TNF podem incluir, porém não limitadas a, aquelas codificando a seqüência de aminoácido de um fragmento de anticorpo, por si mesmo; a seqüência de codificação para o anticorpo inteiro ou uma porção deste; a seqüência de codificação para um anticorpo, fragmento ou porção, bem como seqüências adicionais, tal como a seqüência de codificação de pelo menos um peptídeo de fusão ou condutora de sinal, com ou sem as seqüências de codificação acima mencionadas, tal como pelo menos um íntron, juntamente com seqüências de não-codificação, adicionais, incluindo, porém não limitado a, seqüências 3’ e 5 de não-codificação, tais como seqüências não-traduzidas, transcritas que desempenham um papel na transcrição, processamento de mRNA, incluindo sinais de poliadenilação e união (por exemplo - estabilidade e ligação de ribossoma de mRNA); uma seqüência de codificação adicional que codifica para os aminoácidos adicionais, tais como aqueles que fornecem funcionalidades adicionais. Desta maneira, a seqüência codificando um anticorpo pode ser fundida a uma seqüência marcadora, tal como uma seqüência codificando um peptídeo que facilita a purificação do anticorpo fundido compreendendo uma porção ou

fragmento de anticorpo.

Polinucleotídeos que Seletivamente Hibridizam para um Polinucleotídeo como Aqui Descrito

A presente invenção fornece ácidos nucléicos isolados que hibridizam sob condições de hibridização seletiva para um polinucleotídeo aqui descrito. Desta maneira, os polinucleotídeos desta modalidade podem ser usados para isolar detectar, e /ou quantificar os aminoácidos compreendendo tais polinucleotídeos. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar, isolar, ou amplificar clones de tamanho natural ou parcial em uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são seqüências de cDNA ou genômicas, ou de outro modo complementar a, um cDNA de uma biblioteca de ácido nucléico de mamífero ou ser humano.

Preferivelmente, a biblioteca de cDNA compreende pelo menos 80% de seqüências de tamanho natural, preferivelmente pelo menos 85% ou 90% de seqüências de tamanho natural, e mais preferivelmente pelo menos 95% de seqüências de tamanho natural. As bibliotecas de cDNA podem ser normalizadas para aumentar a representação de seqüências raras. As condições de hibridização de rigorosidade moderada ou baixa são tipicamente, porém não exclusivamente, empregadas com seqüências tendo uma identidade de seqüência reduzida relativa às seqüências complementares. As condições de rigorosidade elevada e moderada podem opcionalmente ser empregadas para seqüências de maior identidade. As condições de rigorosidade baixa permitem a hibridização seletiva de seqüências tendo cerca de 70% de identidade de seqüência e podem ser empregadas para identificar seqüências ortólogas ou parálogas.

Opcionalmente, os polinucleotídeos desta invenção codificarão pelo menos uma porção de um anticorpo codificado pelos polinucleotídeos aqui descritos. Os polinucleotídeos desta invenção abrangem as seqüências de ácido nucléico que podem ser empregadas para hibridização seletiva para um polinucleotídeo codificando um anticorpo da presente invenção. Observe, por exemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, cada qual total-

mente incorporado aqui por referência .

Construção de Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser feitos empregando-se (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificação, ou combinações destes, também conhecidas na técnica.

Os ácidos nucléicos podem convenientemente compreender sequências em adição a um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de multiclonagem compreendendo um ou mais sítios de restrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucléico para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo. Da mesma forma, as seqüências traduzíveis podem ser inseridas para auxiliar o isolamento do polinucleotídeo traduzido da presente invenção. Por exemplo, uma sequência marcadora de hexa-histidina fornece um meio suficiente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido nucléico da presente invenção excluindo a seqüência de codificação é opcionalmente um vetor, adaptador, ou ligantes para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção.

As seqüências adicionais podem ser adicionadas a tais seqüências de clonagem e /ou expressão para otimizar sua função na clonagem e /ou expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo, ou para melhorar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e ligantes é bem-conhecido na técnica. (Observe, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra) Métodos Recombinantes para Construção de Ácidos Nucléicos

As composições de ácido nucléico isolado desta invenção, tal como RNA, cDNA, DNA genômico, ou qualquer combinação destes, pode ser obtida de fontes biológicas usando qualquer número de metodologias de clonagem conhecido por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeo que seletivamente hibridizam, sob condições rigorosas, para os polinucleotídeos da presente invenção são usadas para identificar a sequência desejada em uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA. O isolamento de RNA, e construção de bibliotecas ge-

nômicas e cDNA, são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. (Observe, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra)

Métodos de Isolamento e Avaliação de Ácido Nucléico

A biblioteca genômica ou cDNA pode ser avaliada empregandose uma sonda baseada na seqüência de um polinucleotídeo da presente invenção, tal como aqueles aqui descritos. As sondas podem ser empregadas para hibridizar com seqüências de cDNA ou DNA genômico para isolar os genes homólogos do mesmo ou diferentes organismos. Aqueles versados na técnica apreciarão que vários graus de rigorosidade de hibridização podem ser empregados no ensaio; e ou a hibridização ou o veículo de lavagem pode ser rigoroso. Quando as condições para a hibridização tornam-se mais rigorosas, deve existir um maior grau de complementariedade entre a sonda e o alvo para a formação dúplex ocorrer. O grau de rigorosidade pode ser controlado por um ou mais dentre temperatura, resistência iônica, pH e a presença de um solvente de desnaturação parcial tal como formamida. Por exemplo, a rigorosidade de hibridização é convenientemente variada alterando-se a polaridade da solução reagente através , por exemplo, de manipulação da concentração de formamida dentro da faixa de 0% a 50%. O grau de complementariedade (identidade de seqüência) requerido para ligação detectável variará de acordo com a rigorosidade do veículo de hibridização e /ou veículo de lavagem. O grau de complementariedade de forma ótima será 100%, ou 70 - 100%, ou qualquer faixa ou valor a esse respeito. Entretanto, deveria ser entendido que menores variações de seqüência nas sondas e iniciadores podem ser compensadas reduzindo-se a rigorosidade da hibridização e/ou veículo de lavagem.

Métodos para amplificação de RNA ou DNA são bemconhecidos na técnica e podem ser empregados de acordo com a presente invenção sem experimentação indevida, com base no ensino e orientação aqui apresentados.

Os métodos conhecidos de amplificação de RNA ou DNA incluem, porém não limitados a, reação de cadeia de polimerase (PCR) e os processos de amplificação relatados (observe, por exemplo, patente U.S. de N~

4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, para Muliis, e outros; 4.795.699 e 4.921.794 para Tabor, e outros; 5.142.033 para Innis; 5.122.464 para Wilson, e outros; 5.091.310 para Innis; 5.066.584 para Gyilensten, e outros 4.889.818 para Gelfand, θ outros; 4.994.370 para Silver, e outros; 4.766.067 para Biswas; 4.656.134 para Ringold) e amplificação mediada por RNA que usa RNA de anti-sentido para a sequência alvo como um padrão para a síntese de DNA de filamento duplo (patente U.S. de N^e. 5.130.238 para Malek, e outros, com o nome comercial NASBA), os conteúdos inteiros dos quais as referências são incorporadas aqui por referência. (Observe, por exemplo, Ausubel, supra; ou Sambrook, supra) .

Por exemplo, a tecnologia de reação de cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as seqüências de polinucleotídeos da presente invenção e os genes relatados diretamente de bibliotecas de cDNA ou DNA. PCR e outros métodos de amplificação in vitro podem da mesma forma ser úteis, por exemplo, para clonar seqüências de ácido nucléico que codificam para as proteínas serem expressas, para preparar os ácidos nucléicos para usar como sondas para detectar a presença do mRNA em amostras, para sequenciamento de ácido nucléico, ou para outros propósitos. Os exemplos de técnicas suficientes para orientar pessoas de experiência através de métodos de amplificação in vitro são constatados em Berger, supra, Sambrook, supra, e Ausubel, supra, bem como Muliis, e outros, patente U.S. de N². 4.683.202 (1987); e Innis, e outros, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Os kits comercialmente disponíveis para amplificação de PCR genômico são conhecidos na técnica. Observe, por exemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Adicionalmente, por exemplo a proteína 32 do gene T4 (Boehringer Mannheim) pode ser usada para melhorar o rendimento de produtos de PCR longo.

Métodos Sintéticos para Construção de Ácidos Nucléicos

Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem da mesma forma ser preparados por síntese química direta por métodos conhecidos (observe, por exemplo, Ausubel, e outros, supra). A síntese quími-

ca geralmente produz um oligonucleotídeo de filamento único, que pode ser convertido em DNA de filamento duplo por hibridização com uma seqüência complementar, ou por polimerização com uma polimerase de DNA empregando-se o filamento único como um padrão. Alguém versado na técnica reconhecerá que ao mesmo tempo que a síntese química de DNA pode ser limitada às seqüências de cerca de 100 ou mais bases, as seqüências mais longas podem ser obtidas pela ligação de seqüências mais curtas.

Cassetes de Expressão Recombinate

A presente invenção também fornece cassetes de expressão recombinante compreendendo um ácido nucléico da presente invenção. Uma seqüência de ácido nucléico da presente invenção, por exemplo um cDNA ou uma seqüência genômica codificando um anticorpo da presente invenção, pode ser usada para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introduzido em pelo menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante tipicamente compreenderá um polinucleotídeo da presente invenção de forma operável ligado às seqüências reguladoras de iniciação transcricional que direcionará a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Ambos os promotores heterólogo e não-heterólogo (isto é endógeno) podem ser empregados para direcionar a expressão dos ácidos nucléicos da presente invenção.

Em algumas modalidades, os ácidos nucléicos isolados que servem como promotor, realçador, ou outros elementos podem ser introduzidos na posição apropriada (a montante, a jusante ou em íntron) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção a fim de super ou sub-regular a expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo ou in vitro por mutação, anulação e /ou substituição.

Vetores e Células Hospedeiras

A presente invenção da mesma forma refere-se aos vetores que incluem moléculas de ácido nucléico isolado da presente invenção, células hospedeiras que são geneticamente construídas com os vetores recombinantes, e a produção de pelo menos um anticorpo anti-TNF por técnicas recombinantes, como é bem-conhecido na técnica. Observe, por exemplo, Sambrook, e outros, supra; Ausubel. e outros, supra, cada qual totalmente incorporado aqui por referência.

Os polinucleotídeos podem opcionalmente ser unidos a um vetor contendo um marcador selecionável para a propagação em um hospedeiro. Geralmente, um vetor de plasmídeo é introduzido em um precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio ou em um complexo com um lipídeo carregado. Se o vetor for um vírus, ele pode ser empacotado in vitro empregando uma linhagem de célula de empacotamento apropriado e então traduzido para dentro de células hospedeiras.

A inserção de DNA deveria ser operativamente ligada a um promotor apropriado. Os constructos de expressão também conterão sítios para a iniciação de transcrição, terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação de ríbossoma para tradução. A porção de codificação da transcrição madura expressa pelos constructos preferivelmente incluirá uma iniciação de tradução no começo e um códon de terminação (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado no fim do DNA a ser transladado, com UAA e UAG preferido para expressão de célula eucariótica ou de mamífero.

Os vetores de expressão preferivelmente porém opcionalmente incluirão pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem, por exemplo, porém não limitado a, metotrexato (MTX), reductase de diidrofolato Reductase (DHFR, patente U.S. de N~ 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico, ou resistência de glutamina sintetase (GS, patente U.S. de N-s. 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) para cultura de célula eucariótica, e genes de resistência a ampicilina ou tetraciclina para cultivar em E. coli e outras bactérias ou procarióticos (as patentes acima são total mente incorporado aqui por referência). As condições e veículos de cultura apropriados para as células hospedeiras acima descritas são conhecidos na técnica. Os vetores adequados serão facilmente aparentes para o versado na técnica. A introdução de um constructo de vetor em uma célula hospedeira pode ser executada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipideo catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, tal como Sambrook, supra, Chapters 1 - 4 e 16 - 18; Ausubel, supra, Chapters 1,9, 13, 15, 16.

Pelo menos um anticorpo da presente invenção pode ser expresso de uma forma modificada, tal como uma proteína de fusão, e pode incluir não apenas sinais de secreção, porém da mesma forma regiões funcionais heterólogas. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao terminal N de um anticorpo para melhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira, durante a purificação, ou durante armazenagem e tratamento subseqüente. Da mesma forma, as porções de peptídeo podem ser adicionadas a um anticorpo da presente invenção para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser removidas antes da preparação final de um anticorpo ou pelo menos um fragmento deste. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tal como Sambrook, supra, Chapters 17,29 17.42 e 18.1 -18.74; Ausubel, supra, Chapters 16, 17 e 18.

Aqueles versados na técnica são instruídos nos numerosos sistemas de expressão disponíveis para a expressão de um ácido nucléico codificando uma proteína da presente invenção.

Alternativamente, os ácidos nucléicos da presente invenção podem ser expressos em uma célula hospedeira por ligação (por manipulação) em uma célula hospedeira que contém DNA endógeno codificando um anticorpo da presente invenção. Tais métodos são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na patente U.S. de N⁹s. 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 e 5.733.761, totalmente incorporada aqui por referência.

Ilustrativo de culturas de célula úteis para a produção dos anticorpos, variantes ou porções especificadas destes, são células de mamífero. Os sistemas de célula de mamífero frequentemente estarão na forma de monocamadas de células embora suspensões de célula de mamífero possam da mesma forma ser usadas. Várias linhagens de célula hospedeira

adequadas capazes de expressar as proteínas glicosadas intactas foram desenvolvidos na técnica, e incluem COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e linhagens de célula BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células 293, células HeLa e outras, que estão facilmente disponíveis de, por exemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). As células hospedeiras preferidas incluem células de origem linfóide tal como células de linfoma e mieloma. As células hospedeiras particularmente preferidas são células P3X63Ag8.653 (ATCC Número de acesso CRL-1580) e células SP2/0-Ag14 (ATCC Número de acesso CRL-1851). Em uma modalidade particularmente preferida, a célula recombinante é uma célula P3X63Ab8.653 ou uma SP2/0-Ag14.

Os vetores de expressão para estas células podem incluir uma ou mais das seguintes seqüências de controle de expressão, tal como, porém não limitado a uma origem de réplica; um promotor (por exemplo, promotores de SV40 precoce ou tardio, o promotor de CMV (patente U.S. de N^es. 5.168.062; 5.385.839), um promotor de HSV tk, um promotor de pgk (cinase de fosfoglicerato), um promotor de EF-1 alfa (patente U.S. de N-. 5.266.491), pelo menos um promotor de imunoglobulina humana; um realçador, e /ou sítios de informação de processamento, tais como sítios de ligação de ribossoma, sítios de união de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, sítio de adição T Ag poli A grande de SV40), e seqüências terminadoras transcricionais. Observe, por exemplo, Ausubel e outros, supra; Sambrook, e outros, supra. Outras células úteis para a produção de ácidos nucléicos ou proteínas da presente invenção são conhecidas e /ou disponíveis, por exemplo, de American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ou outras fontes comerciais ou conhecidas.

Quando as células hospedeiras eucarióticas são empregadas, seqüências terminadoras de transcrição ou poliadenilação são tipicamente

incorporadas no vetor. Um exemplo de uma sequência terminadora é a sequência de poliadenilação do gene de hormônio de crescimento bovino. As seqüências para união acurada da transcrição podem da mesma forma ser incluídas. Um exemplo de sequência de união é o íntron de VP1 de SV40 (Sprague, e outros, J. Virol. 45:773 a 781 (1983)). Adicionalmente, as seqüências de gene para controlar a réplica na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, como conhecido na técnica.

Purificação de um Anticorpo

Um anticorpo anti-TNF pode ser recuperado e purificado de culturas de célula recombinante por métodos bem-conhecidos incluindo, porém não limitado a, purificação de proteína A, precipitação de etanol ou sulfato de amônio, extração de ácido, cromatografia de permuta de cátion ou ânion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode da mesma forma ser empregada para purificação. Observe, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997 a 2001), por exemplo, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10, cada qual totalmente incorporado aqui por referência.

Os anticorpos da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos sintéticos químicos, e produtos produzidos por técnicas recombinantes de um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, células de mamífero, inseto, planta alta, levedura. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o anticorpo da presente invenção pode ser glicosilado ou pode ser não glicosilado, com glicosilado preferido. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tal como Sambrook, supra, Sections 17.37 - 17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 e 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12 - 14, todos totalmente incorporados aqui por referência.

Anticorpos Anti-TTVF

Os anticorpos isolados da presente invenção compreendem seqüências de aminoácido de anticorpo aqui descritas codificadas por qualquer polinucleotídeo adequado, ou qualquer anticorpo preparado ou isolado. Preferivelmente, o fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo humano liga o TNF humano e, deste modo parcialmente ou substancialmente neutraliza pelo menos uma atividade biológica da proteína. Um anticorpo, ou variante ou porção especificada destes, que parcialmente ou preferivelmente substancialmente neutraliza pelo menos uma atividade biológica de pelo menos um fragmento ou proteína de TNF pode ligar o fragmento ou proteína e deste modo inibir as atividades mediadas através da ligação de TNF ao receptor de TNF ou através de outros mecanismos mediados ou dependentes de TNF. Como aqui empregado, o termo anticorpo neutralizante refere-se a um anticorpo que pode inibir uma atividade dependente de TNF por cerca de 20 - 120%, preferivelmente por pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% ou mais dependendo do ensaio. A capacidade de um anticorpo anti-TNF para inibir uma atividade dependente de TNF é preferivelmente taxada por pelo menos um ensaio de receptor ou proteína de TNF adequado, como aqui descrito e /ou como conhecido na técnica. Um anticorpo humano da presente invenção pode ser de qualquer classe (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, etc.) ou isótopo e pode compreender uma cadeia leve Kappa ou lambda. Em uma modalidade, o anticorpo humano compreende um fragmento definido ou cadeia pesada de IgG, por exemplo, pelo menos um dos isótopos, lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4. Os anticorpos deste tipo podem ser preparados empregando-se um camundongo transgênico ou outro mamífero não humano transgênico compreendendo pelo menos um transgene de cadeia leve de ser humano (por exemplo, IgG, IgA e IgM (por exemplo, γ1, γ2, γ3, γ4) como aqui descrito e /ou como conhecido na técnica. Em outra modalidade, o anticorpo humano de TNF anti-humano compreende uma cadeia pesada de IgG 1 e uma cadeia leve de IgG 1.

Pelo menos um anticorpo da invenção liga pelo menos um epi-

topo especificado específico para pelo menos uma porção, fragmento, subunidade, proteína de DNA ou qualquer combinação destes. Pelo menos um epitópo pode compreender pelo menos uma região de ligação de anticorpo que compreende pelo menos uma porção da referida proteína, cujo epitópo é preferivelmente compreendido de pelo menos uma porção citoplásmica ou externa, hidrofílica, solúvel, extracelular da referida proteína. Pelo menos um epitópo especificado pode compreender qualquer combinação de pelo menos uma seqüência de aminoácido de pelo menos 1 a 3 aminoácidos para a porção especificada inteira de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 9.

Geralmente, o fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo humano da presente invenção compreenderá uma região de ligação de antígeno que compreende pelo menos uma variante ou região de determinação de forma complementar humana (CDR1, CDR2 e CDR3) de pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma variante ou região de determinação de forma complementar humana (CDR1, CDR2 e CDR3) de pelo menos uma região variável de cadeia leve. Como um exemplo não limitante, a variante ou região de ligação de antígeno ou anticorpo pode compreender pelo menos uma das CDR3 de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:3, e /ou uma CDR3 de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:6. Em uma modalidade particular, o fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo pode ter uma região de ligação de antígeno que compreende pelo menos uma porção de pelo menos uma CDR de cadeia pesada (isto é, CDR1, CDR2 e /ou CDR3) tendo a seqüência de aminoácido das CDRs 1, 2 e /ou 3 correspondentes (por exemplo, SEQ ID NOS:1, 2, e /ou 3). Em outra modalidade particular, a variante ou porção de ligação de antígeno ou anticorpo pode ter uma região de ligação de antígeno que compreende pelo menos uma porção de pelo menos uma CDR de cadeia leve (isto é, CDR1, CDR2 e /ou CDR3) tendo a seqüência de aminoácido das CDRs 1, 2 e /ou 3 correspondentes (por exemplo, SEQ ID NOS:4, 5, e /ou 6). Em uma modalidade preferida as três CDRs de cadeia pesada e as três CDRs de cadeia leve do fragmento de

ligação de antígeno ou anticorpo tem a seqüência de aminoácido da CDR correspondente de pelo menos uma das TNV148, TNV14, TNV15, TNV196, TNV15, TNV118, TNV32, TNV86 de mAB, como aqui descrito. Tais anticorpos podem ser preparados quimicamente unindo-se conjuntamente as várias porções (por exemplo, CDRs, estrutura) do anticorpo empregando-se técnicas convencionais , preparando-se e expressando-se uma (isto é, uma ou mais) molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo empregandose técnicas convencionais de tecnologia de DNA recombinante ou empregando-se qualquer outro método adequado.

O anticorpo anti-TNF pode compreender pelo menos uma de uma região variável de cadeia leve ou pesada tendo uma seqüência de aminoácido definida. Por exemplo, em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-TNF compreende pelo menos uma de pelo menos uma região variável de cadeia pesada, opcionalmente tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:7 e /ou pelo menos uma região variável de cadeia leve, opcionalmente tendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:8. Os anticorpos que ligam-se ao TNF humano e que compreendem uma região variável de cadeia leve ou pesada definida podem ser preparados empregando-se métodos adequados, tais como exibição de fago (Katsube, Y, e outros, ínt J Mol. Med, 1(5): 863 - 868 (1998)) ou métodos que empregam animais transgênicos, como conhecido na técnica e /ou como aqui descrito. Por exemplo, um camundongo transgênico, compreendendo um transgene de cadeia pesada de imunoglobulina de ser humano funcionalmente reorganizado e um transgene compreendendo DNA de local de cadeia leve de imunoglobulina de humano que pode sofrer redisposição funcional, pode ser imunizado com TNF humano ou um fragmento deste para extrair a produção de anticorpos. Se desejado, as células de produção de anticorpos podem ser isoladas e hibridomas ou outras células de produção de anticorpos imortalizadas podem ser preparadas como descrito aqui e /ou conhecido na técnica. Alternativamente, o anticorpo, variante ou porção especificada podem ser expressados empregando-se o ácido nucléico de codificação ou porção deste em uma célula hospedeira adequada.

A invenção da mesma forma refere-se aos anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno, CDRs e cadeias de imunogíobulina compreendendo aminoácidos em uma seqüência que é substancialmente a mesma como uma seqüência de aminoácido aqui descrita. Preferivelmente, tais fragmentos de ligação de antígeno ou anticorpos compreendendo tais CDRs ou cadeias podem ligar o TNF humano com afinidade elevada (por exemplo, K_o menos do que ou igual a cerca de 10'⁹ M). As seqüências de aminoácido que são substancialmente as mesmas como as seqüências aqui descritas incluem as seqüências compreendendo substituições de aminoácido conservadoras, bem como inserções e /ou anulações de aminoácido. Uma substituição de aminoácido conservadora refere-se à substituição de um primeiro aminoácido por um segundo aminoácido que tem propriedades químicas e /ou físicas (por exemplo, carga, estrutura, polaridade, hidrofobicidade / hidrofilicidade) que são similares àquelas do primeiro aminoácido. As substituições conservadoras incluem a substituição de um aminoácido por outro com os seguintes grupos: lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) e glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D e E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptofan (W), metionina, (M), cisteina (C) e glicina (G); F, WeY; C, SeT.

Códigos de Aminoácido

Os aminoácidos que preparam anticorpos anti-TNF da presente invenção são frequentemente abreviados. As designações de aminoácido podem ser indicadas designando-se o aminoácido por seu código de letra única, seu código de três letras, nome, ou códon(s) de três nucleotídeos como é bem entendido na técnica (observe Alberts, B, e outros, Molecular

Biology of The Cell, Third Ed, '	Garland Publishing, Inc., New York, 1994):
Código de letra única	Código de três letras	Nome	Códon(s) de três nucleotídeos
A	Ala	Alanina	GCA, GCC, GCG, GCU
C	Cys	Cisteína	UGC, UGU
D	Asp	Ácido aspártico	GAC, GAU

Continuação...

Código de letra única	Código de três letras	Nome	Códon(s) de três nucleotídeos
E	Glu	Ácido glutâmico	GAA, GAG
F	Phe	Fenilanina	UUC, UUU
G	Gly	Glicina	GGA, GGC, GGG, GGU
H	His	Histidina	CAC, CAU
I	lie	Isoleucina	AUA, AUC, AUU
K	Lys	Lisina	AAA, AAG
L	Leu	Leucina	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M	Met	Metionina	AUG
N	Asn	Asparigina	AAC, AAU
P	Pro	Prolina	CGA, CCC, CCG, CCU
Q	Gin	Glutamina	CAA, CAG
R	Arg	Arginina	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S	Ser	Se ri na	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T	Thr	Treonina	ACA, ACC, ACG, ACU
V	Vai	Valina	GUA, GUC, GUG, GUU
w	Trp	Triptofano	UGG
Y	Tyr	Tirosina	UAC, UAU

Um anticorpos anti-TNF da presente invenção pode incluir uma ou mais adições, anulações ou substituições de aminoácido, ou de mutações naturais ou manipulação humana, como aqui especificado.

Claro, o número de substituições de aminoácido que um técnico experiente prepararia depende de vários fatores, incluindo aqueles aqui descritos. Geralmente falando, o número de anulações, inserções ou substituições de aminoácido para qualquer dado variante, fragmento ou anticorpo anti-TNF não será mais do que 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12,

11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, tal como 1 - 30 ou qualquer faixa ou valor nis-

so, como aqui especificado.

Os aminoácidos em um anticorpo anti-TNF da presente invenção que são essenciais para a função podem ser identificados pelos métodos conhecidos na técnica, tal como mutagênese direcionada por sítio ou mutagênese de varredura de alanina (por exemplo, Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham e Wells, Science 244:1081 a 1085 (1989)). O procedimento mais recente introduz mutações de alanina simples em cada resíduo na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadas com respeito à atividade biológica, tal como, porém não limitado a, pelo menos uma atividade neutralizante de TNF. Os sítios que são críticos para a ligação de anticorpo podem ser identificados por análise estrutural tal como cristalização, ressonância magnética nuclear ou rotulagem de fotoafinidade (Smith, e outros, J. Mol. Biol. 224: 899 a 904 (1992) and de Vos, e outros, Science 255:306 a 312 (1992)).

Os anticorpos anti-TNF da presente invenção podem incluir, porém não limitado a, pelo menos uma combinação, seqüência ou porção selecionada de 5 a todos dos aminoácidos contíguos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 5, 6.

Um anticorpo anti-TNF pode também opcionalmente compreender um polipeptídeo de pelo menos um dos 70 a 100% dos aminoácidos contíguos de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 7, 8.

Em uma modalidade, a seqüência de aminoácido de uma cadeia de imunoglobulina, ou porção disso (por exemplo, região variável, CDR) tem cerca de 70 - 100% de identidade (por exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor disso) para a seqüência de aminoácido da cadeia correspondente de pelo menos uma das SEQ ID NOS: 7, 8. Por exemplo, a seqüência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve pode ser comparada com a seqüência de SEQ ID NO: 8, ou a seqüência de aminoácido de uma CDR3 de cadeia pesada pode ser comparada com SEQ ID NO: 7. Preferivelmente, 70 a 100% de identidade de aminoácido (isto é, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nisso) é determinado empregando um algoritmo de computador adequado, como conhecido na técnica.

As seqüências de região variável de cadeia leve e cadeia pesada são fornecidas nas SEQ ID NOS: 7, 8. Os anticorpos da presente invenção, ou variantes especificadas destes, podem compreender qualquer número de resíduos de aminoácido contíguo de um anticorpo da presente invenção, onde esse número é selecionado do grupo de número inteiro consistindo em a partir de 10 - 100% do número de resíduos contíguos em um anticorpo anti-TNF. Opcionalmente, esta subseqüência de aminoácidos contíguos é pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou mais aminoácidos em comprimento, ou qualquer faixa ou valor nisso. Alam disso, o número de tais subseqüências pode ser qualquer número inteiro do grupo que consiste em 1 a 20, tal como pelo menos 2,3,4, ou 5.

Como aqueles versados na técnica apreciarão, a presente invenção inclui pelo menos um anticorpo biologicamente ativo da presente invenção. Anticorpos biologicamente ativos têm uma atividade específica pelo menos 20%, 30%, ou 40%, e preferivelmente pelo menos 50%, 60%, ou 70%, e mais preferivelmente pelo menos 80%, 90%, ou 95% a 1000% do que do anticorpo conhecido e relacionado ou endógeno, nativo (não sintético). Os métodos de avaliações de quantificação e ensaio de atividade enzimática e especificidade de substrato, são bem-conhecidos para aqueles versados na técnica .

Em outro aspecto, a invenção refere-se aos anticorpos humanos e fragmentos de ligação de antígeno, como aqui descrito, que são modificados pela ligação covalente de uma porção orgânica. Tal modificação pode produzir um fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo com propriedades farmacocinéticas melhoradas (por exemplo, meia vida de soro in vivo aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico ramificado ou linear, grupo de ácido graxo, ou grupo de éster de ácido graxo. Em modalidades particulares, o grupo polimérico hidrofílico pode ter um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 120.000 Daltons e pode ser um

polialcano glicol (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol (PPG), polímero de carboidrato, polímero de aminoácido ou polivinil pirrolidona, e o ácido graxo ou grupo de éster de ácido graxo pode compreender de cerca de oito a cerca de quarenta átomos de carbono.

Os fragmentos de ligação de antígeno e anticorpos modificados da invenção compreendem uma ou mais porções orgânicas que são covalentemente ligadas, diretamente ou indiretamente, ao anticorpo. Cada porção orgânica que é ligada a um fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo da invenção pode independentemente ser um grupo polimérico hidrofílico, grupo de ácido graxo ou grupo de éster de ácido graxo. Como aqui empregado, o termo ácido graxo abrange os ácidos monocarboxílicos e ácidos dicarboxílicos. Um “grupo polimérico hidrofílico, como o termo é aqui empregado, refere-se a um polimérico orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Por exemplo, polilisina é mais solúvel em água do que em octano. Desta maneira, um anticorpo modificado pela ligação covalente de polilisina é abrangido pela invenção. Os polímeros hidrofílicos adequados para modificar os anticorpos da invenção podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcano glicois (por exemplo, PEG, monometóxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e outros), carboidratos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e outros), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato e outros), óxidos de polialcano (por exemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno e outros) e polivinil pirrolidona. Preferivelmente, o polímero hidrofílico que modifica o anticorpo da invenção tem um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 150.000 Daltons como uma totalidade molecular separada. Por exemplo PEG₅₀oo θ PEG₂o,ooo, onde o subscrito é um peso molecular médio do polímero em Daltons, podem ser usados. O grupo de polímero hidrofílico pode ser substituído por um a cerca de seis grupos alquila, ácido graxo ou éster de ácido graxo. Os polímeros hidrofílicos que são substituídos por um ácido graxo ou grupos de éster de ácido graxo podem ser preparados empregando-se métodos adequados. Por exemplo, um polímero compreendendo um grupo de amina pode ser acoplado a um carboxi50 lato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com Ν,Ν-carbonil diimidazol) em um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo de hidroxila em um polímero.

Os ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para modificar os anticorpos da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Os ácidos graxos que são adequados para modificar os anticorpos da invenção incluem, por exemplo, ndodecanoato (Ci₂, laurato), n-tetradecanoato (C₁₄, miristato), noctadecanoato (Cw, estearato), n-eicosanoato (C_20l arachidato), ndocosanoato (Ο₂₂, beenato), n-triacontanoato (C₃₀), n-tetracontanoato (C₄₀), cis-AQ- octadecanoato (Cie, oleato), todos c/s-A5,8,11,14-eicosatetraenoato (C₂₀, arachidonato), ácido octanodióico, ácido tetradecanodióico, ácido octadecanodióico, ácido docosanodióico, e outros. Os ésteres de ácido graxo adequados incluem monoésteres de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo de alquila inferior linear ou ramificado. O grupo de alquila inferior pode compreender de um a cerca de doze, preferivelmente um a cerca de seis, átomos de carbono.

Os fragmentos de ligação de antígeno e anticorpos humanos modificados podem ser preparados empregando-se métodos adequados, tal como por reação com um ou mais agentes de modificação. Um agente de modificação como o termo é aqui empregado, refere-se a um grupo orgânico adequado (por exemplo, polímero hidrofílico, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreende um grupo de ativação. Um grupo de ativação é uma porção química ou grupo funcional que pode, sob condições apropriadas, reagir com um segundo grupo químico desse modo formando uma ligação covalente entre o agente de modificação e o segundo grupo químico. Por exemplo, os grupos de ativação reativos de amina incluem grupos eletrofílicos tal como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, iodo), ésteres de N-hidroxissucinimidila (NHS), e outros. Os grupos de ativação que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodoacetila, acriloíla, dissulfetos de piridila, tiol de ácido 5-tiol-2-nitrobenzóico (TNB-tiol), e outros. Um grupo funcional de aldeído pode ser acoplado a

moléculas contendo hidrazida ou amina, e um grupo de azida pode reagir com um grupo de fósforo trivalente para formar ligações de fosforimida ou fosforamidato. Os métodos adequados para introduzir grupos de ativação em moléculas são conhecidos na técnica (observe por exemplo, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques. Academic Press: SanDiego, CA (1996)). Um grupo de ativação pode ser ligado diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, ésteres de ácido graxo), ou através de uma porção ligadora, por exemplo um grupo de Ci - C₁₂ divalente onde um ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo tal como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. As porções ligadoras adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, -(CH₂)3-, -NH-(CH₂)₆“ NH-, -(CH₂)₂-NH- e -CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-. Os agentes de modificação que compreendem uma porção ligadora podem ser produzidos, por exemplo, reagindo-se uma mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, monoBoc-etilenodiamina, mono-Boc-diaminoexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para formar uma ligação de amina e o carboxilato de ácido graxo. O grupo de proteção Boc pode ser removido do produto por tratamento com ácido trifluoroacético (TFA) para expor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato como descrito, ou pode ser reagida com anidrido maléico e o produto resultante ciclizado para produzir um derivado de maleimido ativado do ácido graxo. (observe, por exemplo, Thompson, e outros, WO n° 92/16221 cujos ensinamentos totais são incorporados aqui por referência.). Os anticorpos modificados da invenção podem ser produzidos reagindo-se um fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo humano com um agente de modificação. Por exemplo, as porções orgânicas podem ser ligadas ao anticorpo de uma maneira específica de não sítio empregando-se um agente de modificação reativo de amina, por exemplo, um éster de NHS de PEG. Os fragmentos de ligação de antígeno ou anticorpos humanos modificados podem da mesma forma ser preparados reduzindo-se as ligações de dissulfeto (por exemplo, ligações de disulfeto de intracadeia) de um fragmento de ligação de antígeno ou anticorpo. O fragmento de ligação de antígeno ou anti52 corpo reduzido pode então ser reagido com um agente de modificação reativo de tiol para produzir o anticorpo modificado da invenção. Os fragmentos de ligação de antígeno e anticorpos humanos modificados compreendendo uma porção orgânica que é ligada aos sítios de um anticorpo da presente invenção podem ser preparados empregando-se métodos adequados, tal como proteólise reversa ( Fisch e outros, Bioconjugate Chem, 3:147 a 153 (1992); Werlen e outros, Bioconjugate Chem, 5:411 a 417 (1994); Kumaran e outros, Protein Sei. 6(10): 2233 a 2241 (1997); Itoh e outros, Bioorg. Chem, 24(1): 59 a 68 (1996); Capellas e outros, Biotechnof. Bioeng., 56(4):456 a 463 (1997)), e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996) .

Anticorpos Anti-ldiotipo para Composições de Anticorpo Anti-TNF.

Em adição aos anticorpos anti-TNF quiméricos ou monocionais, a presente invenção é da mesma forma direcionada a um anticorpo antiidiotipo (anti-iD) específico para tais anticorpos da invenção. Um anticorpo anti-ld que reconhece determinantes únicos geralmente associados com a região de ligação de antígeno de outro anticorpo. O anti-ld pode ser preparado imunizando-se um animal da mesma espécie e tipo genético (por exemplo cepa de camundongo) como a fonte do anticorpo anti-id com o anticorpo ou uma CDR contendo região desta. O animal imunizado reconhecerá e responderá aos determinantes idiotípicos do anticorpo de imunização e produzirá um anticorpo anti-ld. O anticorpo anti-ld pode da mesma forma ser usado como um imunogênio para induzir uma resposta imune em ainda outro animal, produzindo um anticorpo anti-ld assim chamado.

Composições de Anticorpo Anti-TNF

A presente invenção da mesma forma fornece pelo menos uma composição anticorpo anti-TNF compreendendo pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis ou mais anticorpos anti-TNF destes, como aqui descrito e /ou como conhecido na técnica que são fornecidos em uma forma, mistura ou composição de ocorrência não natural. Tais composições compreendem composições de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma ou duas variantes especificadas, fragmentos, domínios, variantes anuladas C e /ou N-terminalmente, de tamanho completo, da seqüência de aminoácido de anticorpo anti-TNF selecionada do grupo que consiste em 70 - 100% dos aminoácidos contíguos das SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou variantes, domínios ou fragmentos especificados destes. As composições de anticorpo anti-TNF preferidas incluem pelo menos uma ou duas variantes, domínios ou fragmentos de tamanho natural como pelo menos uma CDR ou LBR contendo porções da seqüência de anticorpo anti-TNF de 70 a 100% das SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou variantes, domínios ou fragmentos especificados destes. Além disso as composições preferidas compreendem 40 99% de pelo menos um dos 70 - 100% de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou variantes, domínios ou fragmentos especificados destes. Tais porcentagens de composição são em peso, volume, concentração, molaridade, molalidade como soluções secas ou líquidas, misturas, suspensão, emulsões ou colóides, como conhecido na técnica ou como aqui descrito.

As composições de anticorpo anti-TNF da presente invenção podem também compreender pelo menos uma de qualquer quantidade eficaz e adequada de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TNF para uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia, opcionalmente também compreendendo pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, porém não limitado a, um fragmento ou anticorpo de TNF, um fragmento ou receptor de TNF solúvel, proteínas de fusão destes, ou um antagonista de TNF de molécula pequena), um anti-reumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, etanercepto, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), um relaxante de músculo, um narcótico, uma droga não inflamatória de não esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobial (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, uma cefalosporina de carbapenem, uma fluorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraci54 clina, outro antimicrobial), um antipsoriático, um corticoesteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente tiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado ao cálcio, um antidiarréico, um antitussígeno, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropieitina (por exemplo, epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neurogen), um sargramostim (GM-CSF, Leucina), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor, (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio de crescimento, uma droga de substituição de hormônio, um modulador receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um anxiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, uma medicação para asma, um beta-agonista, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina ou antagonista de citocina. Os exemplos não limitantes de tais citocinas incluem, porém não limitados a, qualquer de IL-1 a IL-23. As dosagens adequadas são bem-conhecidas na técnica. Observe, por exemplo, Wells e outros, eds. Pharmacotherapy Handbook, 2^nd Edição, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada dessas referências são totalmente incorporadas aqui por referência.

Tal anticâncer ou antiinfectivos podem da mesma forma incluir moléculas de toxina que são associadas, ligadas, co-formuladas ou coadministradas com pelo menos um anticorpo da presente invenção. A toxina pode opcionalmente agir para seletivamente neutralizar o tecido ou célula patológica. A célula patológica pode ser um câncer ou outra célula. Tais toxinas podem ser, porém não limitadas a, toxina recombinante ou purificada ou fragmento de toxina compreendendo pelo menos um domínio citotóxico funcional de toxina, por exemplo, selecionado de pelo menos uma dentre toxina de difteria de ricina, uma toxina de veneno, ou uma toxina bacteriana.

O termo toxina da mesma forma inclui ambas as endotoxinas e exotoxinas produzidas por qualquer ocorrência natural, viroses ou bactérias recombinantes ou mutantes que podem causar qualquer condição patológica em seres humanos ou outros mamíferos, incluindo choque de toxina, que pode resultar em morte. Tais toxinas podem incluir, porém não limitadas a, enterotoxina lábil (LT) ao aquecimento de E. coli enterotoxigênica, enterotoxina estável (ST) ao aquecimento, citotoxina Shigella, enterotoxinas Aeromonas, toxina-1 de síndrome de choque tóxico (TSST-1), enterotoxina A Staphylococcal (SEA), B (SEB), ou C(SEC), enterotoxinas Streptococcal e outros. Tais bactérias incluem, porém não limitadas a, cepas de uma espécie de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroemorrágica (por exemplo, cepas de serotipo 0157:H7), espécie Staphylococcus ( por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), espécie Shigella (por exemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexnerí, Shigella boydii, e Shigella sonnei), espécie Salmonel/a (por exemplo, Salmonella iyphi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), espécie Clostridium (por exemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), espécie Camphlobacter (por exemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), espécie Heliobacter, (por exemplo, Heliobacter pylorí), espécie Aeromonas (por exemplo, Aeromonas sóbria, Aeromonas hidrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, espécie vibrios (por exemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), espécie Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, e Streptococci. Observe, por exemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3- ed., pp 1 a 13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans e outros, eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., pp 239 a 254, Plenum Medicai Book Co., New York (1991); Mandell e outros, Principies and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow e outros, eds., The Merck Manual, 16^thedition, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood e outros, FEMS Microbiology Immunology, 76:121 a 134 (1991); Marrack e outros, Science, 248:705 a 711 (1990), os conteúdos destas referências são incorporados aqui por referência.

As combinações, composições ou compostos anticorpo anti-TNF da presente invenção podem também compreender pelo menos um de qualquer auxiliar adequado, tal como, porém não limitado a, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservantes, adjuvantes ou outros. Os auxiliares farmaceuticamente aceitáveis são preferidos. Os exemplos não limitantes de, e métodos de preparar tais soluções estéreis são bem-conhecidos na técnica, tal como, porém limitado a, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser selecionados rotineiramente os quais são adequados para o modo de administração, solubilidade e /ou estabilidade da composição variante, fragmento ou anticorpo anti-TNF como bem-conhecido na técnica ou como aqui descrito.

Os aditivos e excipientes farmacêuticos úteis na presente composição incluem porém não são limitados às proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídeos, e carboidratos (por exemplo, açúcares, monossacarídeos, di-, tri-, tetra-, e oligossacarídeos; açucares derivatizados tais como alditóis, ácidos aldônicos, açucares esterificados e outros; e polímeros de açúcar ou polissacarídeos), que podem estar presentes simplesmente ou em combinação, compreendendo sozinho ou em combinação 1 - 99,99% em peso ou volume. Os excipientes de proteínas exemplares incluem albumina de soro tal como albumina de soro humano (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e outros. Os componentes de aminoácido / anticorpo representativos, que podem da mesma forma funcionar em uma capacidade de tamponamento, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteina, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame, e outros. Um aminoácido preferido é a glicina .

Os excipientes de carboidrato adequados para o uso na invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos tais como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose, e outros; dissacarídeos, tais como lactose, sacarose, trealose, celobiose, e outros; polissacarídeos, tais como rafinose, melezitose, matodextrinas, dextranos, amidos, e outros; e alditóis, tal como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, sorbitol de xilitol (glucitol), mioinositol e outros. Os excipientes de carboidrato preferidos para uso na presente invenção são manitol, trealose, e rafinose.

As composições de anticorpo anti-TNF podem da mesma forma incluir um tampão ou um agente de ajuste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado de uma base ou ácido orgânico. Os tampões representativos incluem sais de ácido orgânico tais como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido sucínico, ácido acético, ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfato. Os tampões preferidos para uso nas presentes composições são sais de ácido orgânico tal como citrato.

Adicionalmente, as composições de anticorpo anti-TNF da invenção podem incluir aditivos / excipientes poliméricos tais como polivinilpirrolidonas, ficóis (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, tal como 2-hidroxipropil-p-ciclodextrin), polietileno glicóis, agentes aromatizantes, agentes antimicrobiais, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensoativos (por exemplo, polisorbatos tais como TWEEN 20 e TWEEN 80), lipídeos (por exemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos), esteróides (por exemplo, colesterol), e agentes de quelação (por exemplo, EDTA).

Estes e aditivos e /ou excipientes farmacêuticos conhecidos adicionais adequados para uso nas composições variantes, porção ou de anticorpo anti-TNF de acordo com a invenção são conhecidos na técnica, por exemplo, como listado em Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19^th ed., Williams & Williams, (1995), e em Physician’s Desk Reference, 52^nd ed., Medicai Economics, Montvale, NJ (1998), as descrições das quais são totalmente incorporadas aqui por referência. Os materiais de excipiente ou veículo preferidos são carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos. Formulações

Como acima notado, a invenção fornece formulações estáveis, que é preferivelmente um tampão de fosfato com solução salina ou um sal

selecionado, bem como soluções conservadas e formulações contendo um conservante bem como formulações conservadas de multiuso adequadas para uso veterinário ou farmacêutico, compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TNF em uma composição farmaceuticamente aceitável. As formulações conservadas contêm pelo menos um conservante conhecido ou opcionalmente selecionados do grupo que consiste em pelo menos fenol, mcresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool de benziia, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexaidrato, alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e outros), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, deidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas destes em um diluente aquoso. Qualquer mistura ou concentração adequada pode ser usada como conhecido na técnica, tal como 0,001 5%, ou qualquer faixa ou valor a esse respeito, tal como, porém não limitado a, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8,

3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, ou qualquer faixa ou valor a esse respeito. Os exemplos não limitantes incluem, nenhum conservante, 0,1 a 2% de m-cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1 a 3% de álcool de benziia (por exemplo, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001 a 0,5% de trimerosal ( por exemplo, 0,005, 0,01), 0,001 - 2,0% de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005 - 1,0% de alquilparabeno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), e outros.

Como acima notado, a invenção fornece um artigo de fabricação, compreendendo material de empacotamento e pelo menos um frasco compreendendo uma solução de pelo menos um anticorpo anti-TNF com os conservantes e/ou tampões prescritos, opcionalmente em um diluente aquoso, onde o referido material de empacotamento compreende um rótulo que indica que tal solução pode ser conservada durante um período de 1,2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas ou maior. A invenção também compreende um artigo de fabricação, compreendendo um material de empacotamento, um primeiro frasco compreendendo liofilizado pelo menos um anticorpo anti-TNF, e um segundo frasco compreendendo um diluente aquoso de conservante ou tampão prescrito, onde o referido material de empacotamento compreende um rótulo que instrui um paciente a reconstituir pelo menos um anticorpo anti-TNF no diluente aquoso para formar uma solução que pode ser conservada durante um período de vinte e quatro horas ou maior.

O pelo menos um anticorpo anti-TNF empregado de acordo com a presente invenção pode ser produzido por meios recombinantes, incluindo de preparações transgênicas ou célula de mamífero, ou pode ser purificado de outras fontes biológicas, como aquii descrito ou como conhecido na técnica.

A faixa de pelo menos um anticorpo anti-TNF no produto da presente invenção inclui quantidades produzindo na reconstituição, se em um sistema úmido / seco, concentrações de cerca de 1,0 gg / ml a cerca de 1000 mg / ml, embora concentrações maiores ou inferiores sejam operáveis e sejam dependentes do veículo de liberação entendido, por exemplo, formulações de solução diferirão de emplastro transdérmico, pulmonar, transmucosal, ou métodos de microbomba ou osmótico.

Preferivelmente, o diluente aquoso opcionalmente também compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Os conservantes preferidos incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em fenol, mcresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool de benzila, alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e outros), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônío, deidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas destes. A concentração de conservante usado na formulação é uma concentração suficiente para produzir um efeito antimicrobial. Tais concentrações são dependentes do conservante selecionado e são facilmente determinadas pelo técnico experiente.

Outros excipientes, por exemplo agentes de isotonicidade, tampões, antioxidantes, realçadores de conservante, podem ser opcionalmente e preferivelmente adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, tal como glicerina, é comumente empregado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é preferivelmente adicionado para fornecer controle de pH melhorado. As formulações podem cobrir uma ampla faixa de pHs, tais como de cerca de pH 4 a cerca de pH 10, e faixas preferidas de cerca de pH 5 a cerca de pH 9, e uma faixa mais preferida de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. Preferivelmente as formulações da presente invenção têm pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,8. Os tampões preferidos incluem tampões de fosfato, mais preferivelmente fosfato de sódio, particularmente solução salina tamponada por fosfato (PBS).

Outros aditivos, tais como solubilizadores farmaceuticamente aceitáveis tipo Tween 20 (monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20)), Tween 40 (monopalmitato de sorbitano de polioxietileno (20)), Tween 80 (monooleato de sorbitano de polioxietileno (20)), Pluronic F68 (copolímeros de bloco de polioxipropileno de polioxietileno), e PEG (polietileno glicol) ou tensoativos não iônicos tal como polisorbato 20 ou 80 ou poloxâmero 184 ou 188, polióis Pluronic®, outros copolímeros de bloco, e quelantes tal como EDTA e EGTA podem opcionalmente ser adicionados a formulações ou composições para reduzir a agregação. Estes aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente plástico é empregado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável mitiga a propensão para a proteína agregar-se.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar pelo menos um anticorpo anti-TNF e um conservante do grupo consistindo de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool de benzila, alquilparabeno, (metila, etila, propila, butila e outros), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, deidroacetato de sódio e trimerosal ou misturas destes em um diluente aquoso. A mistura do pelo menos um anticorpo anti-TNF com o conservante em um diluente aquoso é realizada empregando-se procedimentos de dissolução e mistura convencionais. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo anti-TNF em solução tamponada é combinada com o conservante desejado em uma solução tampo-

nada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e conservante nas concentrações desejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por alguém versado na técnica. Por exemplo, a ordem em que os componentes são adicionados, se os aditivos adicionais são empregados, a temperatura e pH nos quais a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e métodos de administração empregados.

As formulações reivindicadas podem ser fornecidas a pacientes como soluções transparentes ou como frascos duais compreendendo um frasco de liofilizado pelo menos um anticorpo anti-TNF que é reconstituído com um segundo frasco contendo água, um conservante e/ou excipientes, preferivelmente um tampão de fosfato e/ou solução salina e um sal escolhido, em um diluente aquoso. Ou um frasco de solução simples ou frasco dual requerendo reconstituição pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou múltiplo de tratamento de paciente e desse modo pode fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que o correntemente disponível.

Os presentes artigos reivindicados de fabricação são úteis para a administração durante um período de imediatamente a vinte e quatro horas ou maior. Conseqüentemente, os artigos presentemente reivindicados de fabricação oferecem significantes vantagens ao paciente. Formulações da invenção podem opcionalmente ser seguramente estocadas em temperaturas de cerca de 2 a cerca de 40°C e retêm a atividade biológica da proteína durante períodos prolongados de tempo, desse modo, permitindo um rótulo de pacote indicando que a solução pode ser mantida e/ou empregada durante um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ou 96 horas ou maior. Se o diluente conservado é empregado, tal rótulo pode incluir usar até 1 a 12 meses, metade, um e meio e/ou dois anos.

As soluções de pelo menos um anticorpo anti-TNF na invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar pelo menos um anticorpo em um diluente aquoso. A mistura é realizada empregando-se procedimentos de dissolução e mistura convencionais. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo em água ou tampão é combinada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e opcionalmente um conservante ou tampão nas concentrações desejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por alguém versado na técnica. Por exemplo, a ordem em que os componentes são adicionados, se aditivos adicionais são empregados, a temperatura e pH nos quais a formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e métodos de administração empregados.

Os produtos reivindicados podem ser fornecidos aos pacientes como soluções transparentes ou como frascos duais compreendendo um frasco de liofilizado pelo menos um anticorpo anti-TNF que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. Ou um frasco de solução único ou frasco dual requerendo reconstituição pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou múltiplos ciclos de tratamento do paciente e desse modo fornecerem um regime de tratamento mais conveniente do que correntemente disponível.

Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente a pacientes por fornecimento para as farmácias, clínicas, ou outras tais instituições e facilidades, soluções transparentes ou frascos duais, compreendendo um frasco de liofilizado pelo menos um anticorpo anti-TNF que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. A solução transparente neste caso pode ser até um litro ou mesmo maior em tamanho, fornecendo um reservatório grande do qual porções menores da solução de pelo menos um anticorpo podem ser reavidas uma ou múltiplas vezes pàra transferir para frascos menores e fornecidas pela farmácia ou clínica para seus clientes e/ou pacientes.

Os dispositivos reconhecidos compreendendo estes sistemas de frasco simples incluem aqueles dispositivos de caneta injetora para liberação de uma solução tai como Canetas BD, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D® Pen, AutoPen®, e OptiPen®, GenotropinPen® , Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, iject®, J-tip Nee-

dle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por exemplo, como feito ou desenvolvido por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com: Bioject, Portland, Oregon (www.bioiect.com); National Medicai Products, Weston Medicai (Peterborough, UK, www.westonmedical.com). Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediiect.com). Dispositivos reconhecidos compreendendo um sistema de frasco dual incluem aqueles sistemas de caneta injetora para reconstituição de uma droga liofilizda em um cartucho para liberação da solução reconstituída tal como o HumatroPen®.

Os produtos presentemente reivindicados incluem material de empacotamento. O material de empacotamento fornece, em adição à informação requerida pelas agências reguladoras, as condições sob as quais o produto pode ser empregado. O material de empacotamento da presente invenção fornece instruções para o paciente para reconstituir o pelo menos um anticorpo anti-TNF no diluente aquoso para formar uma solução e para usar a solução durante um período de 2 a 24 horas ou maior para os dois frascos, produto úmico/seco. Para um produto de solução de frasco simples, o rótulo indica que tal solução pode ser empregada durante um período de 2 a 24 horas ou maior. Os produtos neste momento reivindicados são úteis para uso do produto farmacêutico humano.

As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar pelo menos um anticorpo anti-TNF e um tampão selecionado, preferivelmente um tampão de fosfato contendo solução salina ou um sal escolhido. A mistura de pelo menos um anticorpo e tampão em um diluente aquoso é realizada empregando-se procedimentos de dissolução e mistura convencionais. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um anticorpo em água ou tampão é combinada com o agente de tamponamento desejado em água em quantidades suficientes para fornecer a proteína e tampão nas concentrações desejadas. Variações deste processo seriam reconhecidas por alguém versado na técnica. Por exemplo, a ordem em que os compo9 nentes são adicionados, a temperatura e o pH nos quais formulação é preparada, são todos fatores que podem ser otimizados para a concentração e métodos de administrção empregados.

As formulações estáveis ou conservadas reivindicadas podem ser fornecidas a pacientes como soluções transparentes ou como frascos duais compreendendo um frasco de liofilizado pelo menos um anticorpo anti-TNF que é reconstituído com um segundo fransconete contendo um conservante ou tampão e excipientes em um diluente aquoso. Ou um frasco de solução simples ou frasco dual requerendo reconstituição pode ser reutilizado múltiplas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou múltiplos ciclos de tratamento de paciente e desse modo fornece um regime de tratamento mais conveniente do que correntemente disponível.

Pelo menos um anticorpo anti-TNF em ou formulações ou soluções estáveis ou conservadas aqui descritas, pode ser administrado a um paciente de acordo com a presente invenção por meio de uma variedade de métodos de liberação incluindo injeção SC ou IM; transdérmica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba, ou outros métodos apreciados pelo técnico experiente, com bem-conhecido na técnica.

Aplicações Terapêuticas

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos um doença relacionada com TNF, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente, como sabido na técnica ou como aqui descrito, empregando-se pelo menos um anticorpo de integrina dual da presente invenção.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença relacionada com TNF, em um célula, tecido, órgão, animal, ou paciente incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre obesidade, um doença relacionada imune, uma doença cardiovascular, uma doença infecciosa, uma doença maligna ou um doença neurológica.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença relacionada imune, em uma célula, tecido, órgão, animal, ou paciente incluindo, porém não limitado a, pelo menos uma dentre artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, artrite reumatóide juvenil de início sistêmico, artrite psoriática, espondilite ancilosante, úlcera gástrica, artropatia soronegativas, osteoartrite, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome antifosfolipídeo, neurite iridociclite/uveíte/ótica, fibrose pulmonar idiopática, vasculite sistêmica / granulomatose de wegener, sarcoidose, procedimentos reversos de orquite/vasectomia, doenças alérgicas/atópicas, asma, rinite alérgica, eczema, dermatite de contato alérgica, conjuntivite alérgica, pneumonite de hipersensibilidade, transplantes, rejeição de transplante de órgão, doença de enxerto-versus-hospedeiro, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, síndrome de sepse, sepse gram-positiva, sepse gram-negativa, sepse de cultura negativa, sepse fúngica, febre neutropênica, urosepse, meningococemia, trauma/hemorragia, queimaduras, exposição à radiação de ionização, pancreatite aguda, síndrome de dificuldade respiratória de adulto, artrite reumatóide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crônicas, sarcoidose, patologia de Crohn, anemia de célula foice, dibetes, nefrose, doenças atópicas, reações de hipersensibilidade, rinite alérgica, febre do feno, rinite perene, conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafilaxia sistêmica, dermatite, anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejeição de enxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição de transplante de rim, rejeição de transplante de coração, rejeição de transplante de fígado, rejeição de transplante de pâncreas, rejeição de transplante de pulmão, rejeição de transplante de medula óssea (BMT), rejeição de aloenxerto de pele, rejeição de transplante de cartilagem, rejeição de enxerto de osso, rejeição de transplante de intestino pequeno, rejeição de implante de timo fetal, rejeição de transplante de paratireóide, rejeição de xenoenxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição de aloenxerto, reações de hipersensibilidade de antireceptor, doença de Graves, doença de Raynoud, diabetes resistente à insulina tipo B, asma, miastenia grave, citotoxicidade mediada por anticorpo,

reações de hipersensibilidade do tipo III, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de POEMS (polineuroptia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, e síndrome de alterações de pele), polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, síndrome de alterações da pele, síndrome antifosfolipídeo, pênfigo, escleroderma, doença de tecido conectivo misto, doença de Addison idiopática, diabete melito, hepatite ativa crônica, cirrose biliar primária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia pós-MI, hipersensibilidade do tipo IV, dermatite de contato, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de aloenxerto, granulomas devido a organismos intracelulares, sensibilidade à droga, doença de Wilson, metabólica/idiopática, hemacromatose, deficiência de antitripsina alfa-1, retinopatia diabética, tiroidite de hashimoto, osteoporose, avaliação do eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal, cirrose biliar primária, tiroidite, encefalomielite, caquexia, fibrose cística, doença do pulmão crônico de neonatal, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), linfohistiocitose hematofagocítica familiar, condições dermatológicas, psoríase, alopecia, síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, falência renal aguda, hemodiálise, uremia, toxidade, préeclâmpsia, terapia de okt3, terapia anti-cd3, terapia de citocina, quimioterapia, terapia de radiação (por exemplo, incluindo porém não limitada a toastenia, anemia, caquexia, e outras), intoxicação de salicilato crônica, e outros. Veja, por exemplo, o Manual Merck, 12- a 17- Edições, Merck & Company, rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells e outro, eds., Segunda Edição, Appleton e Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), cada qual totalmente incorporado por referência .

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença cardiovascular em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre síndrome de atordoamento cardíaco, infarto miocardial, falência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, ataque isquêmico, hemorragia, arteriosclerose, aterosclerose, restenose, doença ateriosclerótica diabética, hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope, choque, sífilis do sistema cardiovascular, falência cardíaca, coração pulmonar, hipertensão pulmonar primária, arritmia cardíaca, batimentos ectópicos atriais, agitação atrial, fibrilação atrial (sustentada ou paroximal), síndrome pós-perfusão, resposta de inflamação de desvio cardiopulmonar, taquicardia atrial caótica ou multifocal, taquicardia QRS estreita regular, arritmia específica, fibrilação ventricular, arritmia de feixe de His, bloco atrioventricular, bloco de ramificação de feixe, distúrbios isquêmicos miocardiais, doença de artéria coronária, angina pectoris, infarto miocardial, cardiomiopatia, cardiomiopatia congestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva, doenças do coração valcular, endocardite, doença pericardial, tumores cardíacos, aneurismas aórticos e periféricos, dissecação aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, distúrbios vasculares periféricos, doenças arteriais oclusivas, doença aterosclerótica periférica, tromboangeíte obliterante, distúrbios arteriais periféricos funcionais, fenômeno e doença de Raynaud, acrocianose, eritromelalgia, doenças venosas, trombose venosa, veias de varicose, fístula arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina instável, dano de reperfusão, síndrome pós-bomba, dano de reperfusão de isquemia, e outros. Um tal método pode opcionalmente compreender administrar uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TNF para uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença infecciosa em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos um dentre: infecção bacteriana aguda ou crônica, processos parasíticos ou infecciosos agudos e crônicos, incluindo infecções bacterianas, virais e fúngicas, infecção de HIV / neuropatia de HIV, meningite, hepatite (A, B ou C, ou outro), artrite séptica, peritonite, pneumonia, epiglotite, e. coli 0157:h7, síndrome urêmica hemolítica / púrpura trombocitopênica trombolítica, malária, febre hemorrágica da dengue, leishmaniose, lepra, síndrome de choque tóxico, miosite estreptocócica, gangrena de gás, tuberculose micobacteriana, mico-

bactéria aviária intracelular, pneumonia de pneumocystis carínii, doença infiamatória pélvica, orquite / eprdidimite, legionetla, doença de lyme, influenza a, vírus epstein-barr, síndrome hemafagocítica associada vital, encefalite vital / meningite asséptica, e outras ;

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença maligna em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos uma dentre: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), célula B, célula T ou FAB ALL, leucemia mielóide aguda (AML), leucemia mielótica crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de célula pilosa, síndrome mielodiplástica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma de não hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colo-retal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaringeal, hitiocitose maligna, síndrome paraneoplástica / hipercalcemia de malignidade, tumores sólidos, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença metastática, reabsorção óssea relacionada com o câncer, dor óssea relacionada com o câncer e outras.

A presente invenção também fornece um método para modular ou tratar pelo menos uma doença neurológica em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente, incluindo, porém não limitado a, pelo menos uma dentre: doenças neurodegenerativas, esclerose múltipla, dor de cabeça de enxaqueca, demência da AIDS complexa, doenças de desmielinação, tal como esclerose múltipla e mielite transversa aguda; distúrbios cerebelares e extrapiramidais tais como lesões do sistema corticoespinhal; distúrbios dos gânglios basais ou distúrbios cerebelares; distúrbios do movimento hipercinético, tal como Corea de Huntington e corea senil; distúrbios do movimento induzidos por droga, tal como aqueles induzidos por drogas que bloqueiam os receptores de dopamina do CNS; distúrbios do movimento hipocinéticos, tal como doença de Parkinson; Paralisia supranúcleo progressiva; lesões estruturais do cerebelo; degenerações espinocerebelares, tal como ataxia espinhal, ataxia de Friedreich, degenerações corticais cerebelares, degenerações dos sistemas múltiplos (Mencel, Dejerine-Thomas, shi-Drager, e Ma-

chado-Joseph); distúrbios sistêmicos (doença de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia, e distúrbio do sistema múltiplo mitocondrial); distúrbios do núcleo de desmielinação, tal como esclerose múltipla, mielite transversa aguda; e distúrbios da unidade motora, tal como atrofias musculares neurogênicas (degeneração de célula do corno anterior, tal como esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscular espinhal juvenil); doença de Alzhetmer; Síndrome de Down em idade média; doença corporal Diffuse Lewy-, Demência Senil do tipo corporal Lewy; síndrome Wernicke-Korsakoff; alcoolismo crônico; doença CreutzfeldtJakob; panencefalite esclerosante subaguda, doença Hallerrorden-Spatz; e Demência pugilística, e outras. Um tal método pode opcionalmente compreender uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo de TNF ou porção especificada ou variante para uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Veja, por exemplo, o Merck Manual, 16- Edição, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).

Qualquer método da presente invenção pode compreender administrar uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TNF para uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Um tal método pode opcionalmente também compreender co-administração ou terapia de combinação para tratar tais doenças imunes, onde a administração do referido pelo menos um anticorpo anti-TNF, porção especificada ou variante destes, também compreende administrar, antes, coincidentemente, e/ou após, pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, porém não limitado a um anticorpo ou fragmento de TNF, um receptor ou fragmento de TNF solúvel, proteínas de fusão destes, ou um antagonista de TNF de molécula pequena), um antireumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, etanercept, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), um relaxante muscular, um narcótico, uma droga antiinflamatória não esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um

sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenema, cefalosporina, uma flurorquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobiano), um antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionado com a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente de tiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado com o cálcio, um antidiarréico, um antitussígeno, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropieitina (por exemplo, alfa epoetina), uma filgrastima (por exemplo, G-CSF, Neupogen), uma sargramostima (GM-CSF, Leucina), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio de crescimento, uma droga de substituição de hormônio, um modulador de receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente de alquilação, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressante, agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, uma medicação de asma, um agonista beta, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, alfa dornase (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonista da citocina. As dosagens adequadas são bem-conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Wells e outro, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2- Edição, Appleton e lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edição Deluxe, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada das quais referências são totalmente aqui incorporadas por referência.

Os antagonistas de TNF adequados para composições, terapia de combinação, co-administração, dispositivos e/ou métodos da presente invenção (também compreendendo pelo menos um anticorpo, porção especificada e variante deste, da presente invenção), incluem, porém não estão limitados a, anticorpos anti-TNF, fragmentos de ligação de antígeno destes, e moléculas receptoras que ligam-se especificamente a TNF; compostos que previnem e/ou inibem a síntese de TNF, liberam TNF ou sua ação sobre

as células alvo, tal como talidomida, tenidap, inibidores de fosfodiesterase (por exemplo, pentoxifilina e rolipram), agonistas receptores de adenosina A2b e realçadores de receptor de adenosina A2b; compostos que previnem e/ou inibem a sinalização de receptor de TNF, tal como inibidores de cinase de proteína ativada por mitógeno (MAP); compostos que bloqueiam e/ou inibem a divagem de TNF de membrana, tal como inibidores de metaloproteinase; compostos que bloqueiam e/ou inibem a atividade de TNF, tal como inibidores de enzima de conversão de angiotensina (ACE) (por exemplo, captopril); e compostos que bloqueiam e/ou inibem a produção e/ou síntese de TNF, tal como inibidores de cinase de MAP .

Como aqui empregado, um anticorpo de fator de necrose de tumor, anticorpo TNF, Anticorpo TNFa, ou fragmento e outros diminui, bloqueia, inibe, ab-roga, ou interfere com atividade de TNFa in vitro, in situ e/ou preferivelmente in vivo. Por exemplo, um anticorpo humano de TNF adequado da presente invenção pode ligar-se a TNFa e inclui anticorpos anti-TNF, fragmentos de ligação de antígeno destes, e mutantes ou domínios especificados destes que ligam-se especificamente ao TNFa . Um anticorpo ou fragmento de TNF adequado pode também diminuir, bloquear, abrogar, interferir, prevenir e/ou inibir síntese de proteína, DNA ou RNA de TNF, liberação de TNF, sinalização receptor de TNF, divagem do TNF de membrana, atividade de TNF, produção e/ou síntese de TNF .

O anticorpo quimérico cA2 consiste na região variável de ligação de antígeno do anticorpo lgG1 de TNFa anti-humano de camundongo de neutralização de afinidade elevada, designado A2, e as regiões constantes de uma imunoglobulina Kappa, lgG1 humana. A região Fc de lgG1 humana melhora a função efetora de anticorpo alogenéica, aumenta a meiavida do soro de circulação e diminui a imunogenicidade do anticorpo. A avidez e especificidade do epitópo do anticorpo quimérico cA2 é derivada da região variável do anticorpo de murino A2. Em uma modalidade particular, uma fonte preferida para ácidos nucléicos codificando a região variável do anticorpo A2 de murino é a linhagem de célula de hibridoma A2 .

Ο A2 quimérico (cA2) neutraliza o efeito citotóxico de ambos os

TNFa humanos natural e recombinante de uma maneira de dose dependente. Dos ensaios de ligação de anticorpo cA2 quimérico e TNFa humano recombinante, a constante de afinidade de anticorpo cA2 quimérico foi calculada ser de 1,04 x 10¹° M'¹. Os métodos preferidos para determinar a especi5 ficidade e afinidade de anticorpo monoclonal por inibição competitiva podem ser encontrados em Harlow, e outro, antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan e outro, eds., current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoe. e Wiley Interscience, New York, (1992 - 2000); Kozbor e outro, Immu10 nol. Today, 4: 72 - 79 (1983); Ausubel e outro, eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (1987 - 2000); e Muller, Meth. Enzymol., 92: 589 a 601 (1983), cujas referências são totalmente incorporadas aqui por referência.

Em uma modalidade particular, o anticorpo A2 monoclonal de murino é produzido por uma linhagem celular designada c134A. O anticorpo cA2 quimérico é produzido por uma linhagem celular designada c168A. Moléculas Receptoras de TNF

As moléculas receptoras de TNF preferidas úteis na presente invenção são aquelas que ligam TNFa com elevada afinidade (veja, por

Segue-se folha 73 exemplo, Feldmann e outro, International Publication n° WO 92/07076 (publicada em 30 de abril de 1992); Schall e outro, Cell 61: 361 a 370 (1990), e Loetscher e outro, Cell 61: 351 a 359 (1990), cujas referências são totalmente aqui incorporadas por referência) e opcionalmente possuem baixa imunogenicidade. Em particular, os receptores de superfície celular de TNF de 5,5 Kda (p55 TNF-R) e de 75 kDa (TNF-R de p75) são úteis na presente invenção. As formas truncadas destes receptores, compreendendo os domínios extracelulares dos receptores ou porções funcionais destes (veja, por exemplo, Corcoran e outro, Eur. J. Biochem. 223: 831 a 840 (1994)), são também úteis na presente invenção. As formas truncadas dos receptores de TNF, compreendendo o ECD, têm sido detectadas na urina e soro como proteínas de ligação inibidoras de TNFa de 30 kDa e 40 kDa (Engelmann, H. e outro, J. Biol. Chem. 265: 1531 - 1536 (1990)). As moléculas multiméricas receptoras de TNF e moléculas de fusão imunorreceptoras de TNF, e derivados e fragmentos ou porções destas, são exemplos adicionais de moléculas receptoras de TNF que são úteis nos métodos e composições da presente invenção. As moléculas receptoras de TNF que podem ser empregadas na invenção são caracterizadas por sua capacidade de tratar pacientes durante períodos prolongados com bom a excelente alívio dos sintomas e baixa toxidade. A baixa imunogenicidade e/ou elevada afinidade, bem como outras propriedades indefinidas, pode contribuir para os resultados terapêuticos obtidos.

As moléculas multiméricas receptoras de TNF úteis na presente invenção compreendem todo ou uma porção funcional do ECD de dois ou mais receptores de TNF ligados por meio de um ou mais ligadores de polipeptídeo ou outros ligadores de não peptídeo, tal como polietileno glicol (PEG). As moléculas multiméricas podem também compreender um peptídeo sinal de uma proteína segregada para expressão direta da molécula multimérica. Estas moléculas multiméricas e métodos para sua produção foram descritos no Pedido U. S. n° 08/437.533 (depositado em 9 de maio de 1995), o conteúdo do qual é totalmente aqui incorporado por referência .

As moléculas de fusão de imunorreceptor de TNF úteis nos métodos e composições da presente invenção compreendem pelo menos uma porção de uma ou mais moléculas de imunoglobulina e todos ou uma porção funcional de um ou mais receptores de TNF. Estas moléculas de fusão de imunorreceptor podem ser agrupadas como monômeros, ou heteroou homo-multímeros. As moléculas de fusão de imunorreceptor podem também ser monovalentes ou multivalentes. Um exemplo de uma tal molécula de fusão imunorreceptora de TNF é a proteína de fusão de IgG/receptor de TNF . As moléculas de fusão de imunorreceptor de TNF e métodos para sua produção foram descritas na técnica (Lessiauer e outro, Eur. J. Immunol. 21: 2883 a 2886 (1991); Ashkenazi e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535 a 10539 (1991); Peppei e outro, J. Exp. Med. 174: 1483 a 1489 (1991); Kolls e outro, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 215 a 219 (1994); Butler e outro, Cytokine 6(6): 616 a 623 (1994); Baker e outro, Eur. J. immunol. 24 : 2040 a 2048 (1994); Beutier e outro, Patente U.S. n° 5.447.851; e Pedido dos Estados Unidos n° 08/442.133 (depositado em 16 de maio de 1995), cada de cujas referências é totalmente incorporada aqui por referência). Os métodos para produzir moléculas de fusão de imunorreceptor podem também ser encontrados em Capon e outro, Patente U.S. n° 5.116.964; Capon e outro, Patente U.S. n° 5.225.538; e Capon e outro, Nature 337: 525 a 531 (1989), cujas referências são aqui totatmente incorporadas por referência .

Um equivalente funcionai, derivado, fragmento ou região da molécula de receptor de TNF refere-se à porção da molécula de receptor de TNF, ou a porção da sequência de molécula de receptor de TNF que codifica molécula de receptor de TNF, que é de tamanho suficiente e sequências para funcionalmente parecer-se com as moléculas receptoras de TNF que podem ser empregadas na presente invenção (por exemplo, ligam TNF com elevada afinidade e possuem baixa imunogenicidade). Um equivalente funcional da molécula de receptor de TNF que funcionalmente parece-se com as moléculas de receptor de TNF que pode ser empregado na presente invenção ( por exemplo, liga TNF com elevada afinidade e possui baixa imunogenicidade) . Por exemplo, um equivalente funcional de molécula de receptor de TNF pode conter um códon SILENT ou uma ou mais substitui75 ções, deleções ou adições de aminoácido (por exemplo, substituição de um aminoácido acídico por outro aminoácido acídico; ou substituição de um códon codificando o mesmo ou diferente aminoácido hidrofóbico por outro códon codificando um aminoácido hidrofóbico). Veja Ausubel e outro, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, e WileyInterscience, New York (1937 a 2000) .

As citocinas incluem qualquer citocina conhecida. Veja, por exemplo, CopewithCytokines.com. Os antagonistas de citocina incluem, porém não estão limitados a qualquer anticorpo, fragmento ou mimético, qualquer receptor, fragmento ou mimético solúvel qualquer antagonista de molécula pequena, ou qualquer combinação destes.

Tratamentos Terapêuticos

Qualquer método da presente invenção pode compreender um método para tratar um distúrbio mediado por TNF, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TNF para uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente em necessidade de tal modulação, tratamento ou terapia. Um tal método pode opcionalmente também compreender co-administração ou terapia de combinação para tratar tais doenças imunes, onde a administração do referido pelo menos um anticorpo anti-TNF, porção específica ou variante desta, também compreende administrar, antes, coincidentemente, e/ou após, pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, porém não limitado a um anticorpo ou fragmento de TNF, um receptor ou fragmento de TNF solúvel, proteínas de fusão destes, ou uma pequena molécula de agonista de TNF), um antirreumático (por exemplo, metotrexato, auronofina, aurotioglicose, azatioprina, etanercept, tiomalato de sódio de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), relaxante muscular, um narcótico, uma droga antiinflamatória não esteróide (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um antimicrobiano (por exemplo, aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenema, cefalosporina, uma flurorquinolona, um macrolídeo,

uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro antimicrobiano), um antipsoriático, um corticosteróide, um esteróide anabólico, um agente relacionado com a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente de tiróide, uma vitamina, um hormônio relacionado com o cálcio, um antidiarréico, um antitussígeno, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropieitina (por exemplo, alfa epoetina), uma filgrastima ( por exemplo, G-CSF, Neupogen), uma sargramostima (GM-GSF, Leucina), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), um hormônio de crescimento, uma droga de substituição de hormônio, um modulador de receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente de alquilação, um aníimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressante, agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, uma medicação de asma, um agonista beta, um esteróide inalado, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo, alfa dornase (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonista da citocina .

Tipicamente, tratamento de condições patológicas é realizado administrando-se uma quantidade ou dosagem eficaz de pelo menos uma composição de anticorpo anti-TNF que no total, em média, uma faixa de pelo menos cerca de 0,01 a 500 miligramas de pelo menos um anticorpo anti-TNF por quilograma do paciente por dose, e preferivelmente de pelo menos cerca de 0,1 a 100 miligramas de anticorpo/quiíograma do paciente por administração única ou múltipla, dependendo da atividade específica do contido na composição. Alternativamente, a concentração de soro efetiva pode compreender 0,1 a 5000 pg/ml de concentração de soro por administração simples ou múltipla. As dosagens adequadas são conhecidas pelos médicos e, evidentemente, dependerão do estado particular de doença, atividade específica da composição que está sendo administrada, e o paciente particular que está sofrendo o tratamento. Em alguns casos, para obter-se a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessário prover a subsistência de administração repetida, isto é, administrações individuais repetidas de

uma dose particular monitorada ou medida, onde as administrações individuais são repetidas até a dose diária ou efeito desejados serem obtidos.

As doses preferidas podem opcionalmente incluir, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,

37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,

57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,

78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,

98, 99 e/ou 100 a 500 mg/kg/administração, ou qualquer faixa, valor ou fração destas, ou para obter uma concentração de soro de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0,

1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0,

6.5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 11,9, 12,

12.5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0,

7.5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, e/ou 5000 pg/ml de concentração de soro por administração única ou múltipla, ou qualquer faixa, valor ou fração destas.

Alternativamente, a dosagem administrada pode variar dependendo de fatores conhecidos, tal como características farmacodinâmicas do agente particular, e seu modo e via de administração; idade, saúde e peso do recipiente; natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento coincidente, freqüência do tratamento, e o efeito desejado. Usualmente a dosagem do ingrediente ativo pode ser de cerca de 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Ordinariamente 0,1 a 50, e preferivelmente 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administração ou em forma de liberação prolongada é eficaz para obter-se os resultados desejados.

Um exemplo não limitante, tratamento de seres humanos ou animais pode ser fornecido como uma dosagem de uma única vez ou periódica de pelo menos um anticorpo da presente invenção 0,1 a 100 mg/kg, tal

como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um dia de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,

30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40, ou alternativamente ou adicionalmente, pelo menos de uma semana 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52, ou alternativamente ou adicionalmente, pelo menos um dentre 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 anos, ou qualquer combinação destas, empregando-se doses simples, de infusão ou repetidas.

As formas de dosagem (composição) adequadas para administração interna geralmente contêm de cerca de 0,1 miligramas a cerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nestas composições farmacêuticas o ingrediente ativo ordinariamente estará presente em uma quantidade de cerca de 0,5 a 99,999% em peso com base no peso total da composição.

Para administração parenteral, o anticorpo pode ser formulado como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação, ou separadamente fornecido, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, e 1 a 10% de albumina de soro humano. Lipossomas e veículos não aquosos tal como óleos fixos podem também ser empregados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas conhecidas ou adequadas.

Veículos farmacêuticos adequados são descritos na mais recente edição de Remington's Pharmaceutical Sciences, - Osol, um texto de referência padrão neste campo.

Administração Alternativa

Muitos modos conhecidos e desenvolvidos podem ser empregados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo menos um anticorpo anti-TNF de acordo com a presente invenção. Ao mesmo tempo que a administração pulmonar é empregada na seguinte descrição, outros modos de administração podem ser empregados de acordo com a presente invenção com resultados adequados.

Anticorpos de TNF da presente invenção podem ser liberados em um veículo, como uma solução, emulsão, colóide ou suspensão, ou como um pó seco, empregando-se qualquer de uma variedade de dispositivos e métodos adequados para a administração por inalação ou outros modos descritos aqui incluídos ou conhecidos na técnica .

Formulações Parenterais e Administração

As formulações para administração parenteral podem conter como excipientes comuns água estéril ou solução salina, polialquileno glicóis tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e outros. As suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser preparadas empregando-se um emulsificante ou umidificante apropriado e um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Agentes para injeção podem ser um agente de diluição administrável não oralmente tal como solução aquosa ou uma solução injetável estéril ou suspensão em um solvente. Como o veículo ou solvente usável, água, solução de Rtnger, solução salina isotônica, etc. são permitidos; como um solvente ordinário, ou solvente de suspensão, o óleo não volátil estéril pode ser empregado. Para estes propósitos, qualquer tipo de óleo involãtil e ácido graxo pode ser empregado, incluindo ácidos graxos ou óleos graxos naturais, sintéricos ou semi-sintéticos; mono- ou di- ou tri-glicerídeos naturais, sintéticos ou semisintéticos. A administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, porém não está limitada a, métodos convencionais de injeções, um dispositivo de injeção sem agulha pressionado a gás como descrito na Patente U.S. n° 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laiser como descrito na Patente

U.S. n° 5.839.446 totalmente incorporado aqui por referência .

Liberação Alternativa

A invenção também refere-se à administração de pelo menos um anticorpo anti-TNF por métodos parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilagenoso, intracavitário, intracelíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocardial, intra-osteal, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intra-retal, intra-renal, intra-retinal, intraespinhal, intra-sinovial, intratorácico, intra-urerino, intravesical, bólus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdérmico. Pelo menos uma composição de anticorpo anti-TNF pode ser preparada para uso parenteral (subcutâneo, intramuscular ou intravenoso) ou qualquer outra administração particularmente na forma de soluções líquidas ou suspensões; para uso em administração vaginal ou retal particularmente em formas semi-sólidas tal como, porém não limitadas a cremes e supositórios; para administração bucal ou sublingual tal como, porém não limitada à forma de tabletes ou cápsulas; ou intranasalmente tal como, porém não limitada à forma de pós, gotas nasais ou aerossóis ou certos agentes; ou transdermicamente tal como, porém não limitada a um gel, ungüento, loção, suspensão ou sistema de liberação de emplastro com realçadores químicos tal como sulfóxido de dimetila para ou modificar a estrutura da pele ou aumentar a concentração de droga no emplastro transdérmico (Junginger, e outro. Em Drug Permeation Enhancement; Hsieh, D. S., Eds., pp. 59 a 90 ( Marcei Dekker, Inc. New York 1994, totalmente incorporado aqui por referência), ou com agentes de oxidização que possibilitam a aplicação de formulações contendo proteínas e peptídeos sobre a pele (WO n° 98/53847), ou aplicações de campos elétricos para criar trilhas de transporte transitório ta! como eletroporação, ou para aumentar a mobilidade de drogas carregadas através da pele tal como iontoforese, ou aplicação de ultra-som tal como sonoforese (Patentes dos Estados Unidos n^os 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações e patentes acima sendo incorporadas aqui por referência) .

5¹

Administração Pulmonar / Nasal

Para administração pulmonar, preferivelmente pelo menos uma composição de anticorpo anti-TNF é liberada em um tamanho de partícula eficaz para alcançar as vias aéreas inferiores do pulmão ou seios. De acordo com invenção, pelo menos um anticorpo anti-TNF pode ser liberado por qualquer de uma variedade de dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para administração de um agente terapêutico por inalação. Estes dispositivos capazes de depositar formulações aerosolizadas na cavidade do seio ou alvéolos de um paciente inclui inaladores de dose controlada, nebulizadores, geradores de pó seco, vaporizadores, e outros. Outros dispositivos adequados para direcionar a administração pulmonar ou nasal de anticorpos são também conhecidos na técnica. Todos os tais dispositivos podem usar formulações adequadas para a administração para o dispensamento de anticorpo em um aerossol. Tais aerossóis podem ser compreendidos de qualquer das soluções (ambas aquosas ou não aquosas) ou partículas sólidas. Os inaladores de dose controlada como o inalador de dose controlada Ventolin®, tipicamente empregam um gás propelente e requerem ativação durante a inspiração (Veja, por exemplo, WO n° 94/16970, WO n° 98/35888). Os inaladores de pó seco como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros™ inalador (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, e o inalador de pó Spinhaler® (Fisons), empregam ativação pela respiração de um pó misturado (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, totalmente incorporados aqui por referência). Nebulizadores como AERx™ Aradigm, o nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), e o nebulizador Acorn II® (Marquest Medicai Products) (US 5404871 Aradigm, WO n° 97/22376), as referências acima totalmente incorporadas aqui por referência, produzem aerossóis de soluções, enquanto que os inaladores de dose controlada, inaladores de pó seco, etc. geram aerossóis de pequenas partículas. Estes exemplos específicos de dispositivos de inalação comercialmente disponíveis são destinados a serem uma representação de dispositivos específicos adequados para a prática desta

invenção, e não se destinam a limitar o escopo da invenção. Preferivelmente, uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo anti-TNF é liberado por um inalador ou um vaporizador de pó seco. Existem diversos aspectos desejáveis de um dispositivo de inalação para administrar pelo menos um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, a liberação pelo dispositivo de inalação é vantajosamente segura, reproduzível e precisa. O dispositivo de inalação pode opcionalmente liberar partículas secas pequenas, por exemplo, menores do que cerca de 10 gm, preferivelmente cerca de 1 a 5 gm, para boa respirabilidade.

Administração de Composições de anticorpo de TNF como um Spray

Um spray incluindo proteína de composição de anticorpo de

TNF pode ser produzida forçando uma suspensão ou solução de pelo menos um anticorpo anti-TNF através de uma agulha sob pressão. O tamanho e configuração do bico, a pressão aplicada, e a taxa de alimentação de líquido podem ser escolhidos para obter o rendimento e tamanho de partícula desejados. Uma eletrovaporização pode ser produzida, por exemplo, por um campo elétrico em conexão com uma alimentação de bico ou capilar. Vantajosamente, as partículas de pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-TNF liberada por um vaporizador têm um tamanho de partícula de menos do que cerca de 10 gm, preferivelmente na faixa de cerca de 1 gm a cerca de 5 gm, e o mais preferivelmente cerca de 2 gm a cerca de 3 gm.

Formulações de pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-TNF adequada para uso com um vaporizador tipicamente incluem proteína de composição de anticorpo em uma solução aquosa em uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-TNF por ml de solução ou mg/gm, ou qualquer faixa ou valor incluso, por exemplo, porém não limitado a, .1, .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70,

80, 90 ou 100 mg/ml ou mg/gm. A formulação pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um

tensoativo, e, preferivelmente, zinco. A formulação pode também incluir um excipiente ou agente para estabilização da proteína de composição de anticorpo, tal como um tampão, um agente de redução, uma proteína de carba, ou um carboidrato. As proteínas de carga úteis na formulação de proteínas de composição de anticorpo incluem albumina, protamina ou similares. Os carboidratos típicos úteis em formulação de proteínas de composição de anticorpo incluem sacarose, manitol, lactose, trehalose, glicose, ou similares. A formulação de proteína de composição de anticorpo pode também incluir um tensoativo, que pode reduzir ou prevenir agregação induzida na superfície da proteína de composição de anticorpo causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Vários tensoativos convencionais podem ser empregados, talcomo ésteres de ácido graxo de polioxietileno e álcoois, e ésteres de ácido graxo de sorbitol de polioxietileno. As quantidades geralmente variarão entre 0,001 e 14% em peso da formulação. Os tensoastivos especialmente preferidos para os propósitos desta invenção são monooleato de sorbitano de polioxietileno, polisorbato 80, polisorbato 20, ou similares. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína tal como anticorpos de TNF, ou porções ou variantes específicas, podem também ser incluídos na formulação.

Administração de composições de anticorpo de TNF por um Nebulizador.

A proteína de composição de anticorpo pode ser administrada por um nebulizador, tal como nebulizador a jato ou um nebulizador ultrassônico. Tipicamente, em um nebulizador a jato, uma fonte de ar comprimido é empregada para criar um jato de ar de alta velocidade por meio de um orifício. Quando o gás expande-se além do bico, uma região de baixa pressão é criada, que puxa uma solução de proteína de composição de anticorpo através de um tubo capilar conectado a um reservatório líquido. A corrente de líquido do tubo capilar é tosquiada em filamentos instáveis e gotículas quando ela sai do tubo, criando o aerossol. Uma faixa de configurações, taxas de fluxo, e tipos de placa defletora podem ser empregadas para obter as características de desempenho desejadas de um dado nebulizador a jato. Em um nebulizador ultrassônico, energia elétrica de elevada freqüência é ri empregada para criar energia mecânica, vibracionaf, tipicamente empregando um transdutor pioezelétrico. Esta energia é transmitida para a formulação de proteína de composição de anticorpo ou diretamente ou através de um fluído de acoplamento, criando um aerossol incluindo a proteína de composição de anticorpo. Vantajosamente, partículas de proteína de composição de anticorpo liberadas por um nebulizador têm um tamanho de partícula menor do que cerca de 10 pm, preferivelmente na faixa de cerca de 1 pm a cerca de 5 pm, e o mais preferivelmente cerca de 2 pm a cerca de 3 pm .

As formulações de pelo menos um anticorpo anti-TNF adequado para uso com um nebulizador, ou a jato ou ultrassônico, tipicamente incluem uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos uma proteína de anticorpo anti-TNF por ml de solução. A formulação pode incluir agentes tais como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo, e, preferivelmente, zinco. A formulação pode também incluir um excipiente ou agente para estabilização da pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-TNF, tal como um tampão, um agente de redução, uma proteínade carga, ou um carboidrato. As proteínas de carga úteis em formulação de pelo menos uma proteína de composição de anticorpo anti-TNF inclui albumina, ptotamina, ou similar. Os carboidratos típicos úteis na formulação de pelo menos um anticorpo anti-TNF inclui sacarose, manitol, lactose, trehalose, glicose, ou similar. A pelo menos uma formulação de anticorpo anti-TNF pode também incluir um tensoativo, que pode reduzir ou prevenir agregação induzida pela superfície do pelo menos um anticorpo anti-TNF causada por atomização da solução na formação de um aerossol. Os vários tensoativos convencionais podem ser empregados, tal como álcoois e ésteres de ácido graxo de polioxietileno, e ésteres de ácido graxo de sorbital de polioxietileno. Quantidades geralmente variarão entre 0,001 e 4% em peso da formulação. Os tensoativos especialmente preferidos para os propósitos desta invenção são o mono-oleato de sorbitan de polioxietileno, polisorbato 80, polísorbato 20, ou similar. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de

uma proteína tal como proteína de anticorpo podem também ser incluídos na formulação.

Administração de composições de anticorpo de TNF por um Inalador de

Dose Controlada.

Em um inalador de dose controlada (MDI), um propelente, pelo menos um anticorpo anti-TNF, e quaisquer excipientes ou outros aditivos são contidos em um canister como uma mistura incluindo um gás comprimido liquefeito. A ativação da válvula de medição libera a mistura como um aerossol, preferivelmente contendo partículas na faixa de tamanho de menos do que cerca de 10 pm, preferivelmente cerca de 1 pm a cerca de 5 pm, e o mais preferivelmente cerca de 2 pm a cerca de 3 pm. O tamanho de partícula de aerossol desejado pode ser obtido empregando-se uma formulação de proteína de composição de anticorpo produzida por vários métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo moagem a jato, secagem por atomização, condensação de ponto crítico, ou similares. Os inaladores de dose controlada preferidos inclui aqueles fabricados pela 3M ou Glaxo e empregando um propelente de hidrofluorocarbono.

Formulações de pelo menos um anticorpo anti-TNF para uso com um dispositivo de inalador de dose controlada geralmente incluirão um pó finamente dividido contendo pelo menos um anticorpo anti-TNF como uma suspensão em um veículo não-aquoso, por exemplo, suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para este propósito, tal como clorofluorocarbono, um hidroclorofluorocarbono, um hidrofluorocarbono, ou um hidrocarboneto, incluindo triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano134a), HFA-227 (hidrofluoroalcano-227), ou similar. Preferivelmente o propelente é um hidrofluorocarboneto. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar o pelo menos um anticorpo anti-TNF como uma suspensão no propelente, para proteger o agente ativo contra degradação química, e similar. Os tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitan, lecitina de soja, ácido oléico, ou similar. Em alguns casos os aerossóis de solução são preferidos empregando-se solventes tal como etanol. Agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína tal como proteína podem também ser incluídos na formulação.

Alguém versado na técnica reconhecerá que os métodos da presente invenção podem ser obtidos por administração pulmonar de pelo menos uma composição de anticorpo anti-TNF por meio de dispositivos não descritos aqui.

Formulações Orais e Administração

Formulações orais contam com a co-administração de adjuvantes (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não iônicos tal como éter de oleíla de polioxietileno e éter de n-hexadecilpolietileno) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como a coadministrção de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzimática. O composto de constituinte ativo da forma de dosagem tipo sólida para administração oral pode ser misturada com pelo menos um aditivo, incluindo sacarose, lactose, celulose, manitol, trehalose, rafinose, maltitol, dextrano, amidos, ágar, arginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma de tragacanto, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semi-sintético, e glicerídeo. As formas de dosagem podem também conter outros tipos de aditivos, por exemplo, agente de diluição inativo, lubrificante tal como estearato de magnésio, parabeno, agente de preservação tal como ácido sórbico, ácido ascórbico, alfa-tocoferol, antioxidante tal como cisteína, desintegrante, aglutinante, espessante, agente de tamponamento, agente adoçante, agente de aromatização, agente de perfume, etc.

Os tabletes e pílulas podem ser também processados em preparções revestidas por entérico. As preparções líquidas para administração oral incluem emulsão, xarope, elixir, suspensão e preparações de solução permitidas para uso médico. Estas preparações podem conter agentes de diluição inativos, ordinariamente empregados no referido campo, por exemplo, água. As lipossomas também têm sido descritas como sistemas de libe<2 ração de droga para insulina e heparina (Patente U.S. n° 4.239.754). Mais recentemente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos mistos (proteinóides) têm sido empregadas para liberar farmacêuticos (Patente U.S. n° 4.925.673). Além disso, os compostos veículos descritos na Patente U.S. n° 5.879.681 e Patente U.S. n° 5.871.753 são empregados para liberar agentes biologicamente ativos oralmente, são conhecidos na técnica . Formulações Mucosais e Administração

Para absorção através das superfícies mucosais, composições e métodos de administrar pelo menos um anticorpo anti-TNF incluem uma emulsão compreendendo uma pluralidade de partículas submícron, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo, e uma fase contínua aquosa, que promote a absorção por meio das superfícies mucosais obtendo-se mucoadesão das partículas de emulsão ( Patente U.S. n° 5.514.670). As superfícies mucosas adequadas para aplicação das emulsões da presente invenção podem incluir vias corneal, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomáquica, intestinal, e retal de administração. Formulações para administração vaginal ou retal, por exemplo, supositórios, podem conter como excipientes, por exemplo, polialquilenoglicóis, vaselina, manteiga de cacau, e outras. Formulações para administração intranasal podem ser sólidas e conter como excipientes, por exemplo, lactose ou podem ser soluções aquosas ou oleosas de gotas nasais. Para administração bucal os excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelinatinados, e outros (Patente U.S. n° 5.849.695) . Formulações Transdérmícas e Administração

Para administração transdérmica, o pelo menos um anticorpo anti-TNF é encapsulado em um dispositivo de liberação tal como uma lipossoma ou nanoparticulas poliméricas, micropartícula, microcápsula, ou microesferas (referidas coletivamente como micropartículas a menos que de outra maneira estabelecido). Diversos dispositivos adequados são conhecidos, incluindo micropartículas feitas de polímeros sintéticos tal como ácidos polihidróxi tal como ácido poliláctico, ácido poliglicólico e copolímeros destes, poliortoésteres, polianidridos, e polifosfazenos, e polímeros tal como

colágeno, ácido de poliamino, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos, e combinações destes ( Patente U.S. n° 5.814.599) . Administração Prolongada e Formulações

Pode-se desejar algumas vezes liberar os compostos da presente invenção para o indivíduo durante períodos prolongados de tempo, por exemplo, durante períodos de uma semana a um ano de uma administração única. Várias formas de dosgem de liberação lenta, depósito ou implante, podem ser utilizadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos que têm um baixo grau de solubilidade em fluídos corporais, por exemplo, (a) um sal de adição de ácido com um ácido polibásico tal como ácido fosfórico, ácido suifúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos mono- ou di-sulfônicos de naftaleno, ácido poligalacturônico, e outros; (b) um sal com um cátion de metal polivalente tal como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e outros, ou com um cátion orgânico formado de por exemplo, Ν,Ν'-dibenzil-etilenodiamina ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b) por exemplo um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, os compostos da presente invenção ou, preferivelmente, um sal relativamente insolúvel tal como aqueles exatamente descritos, podem ser formulados em um gel, por exemplo, um gel de monoestearato de alumínio com, por exemplo, óleo de sésamo, adequado para injeção. Os sais particularmente preferidos são sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato, e outros. Outro tipo de formulação de depósito de liberação lenta para injeção conferia o composto ou sal disperso para encapsulado em um polímero de degradação lenta, não-tóxico, não-antigênico, tal como um polímero de ácido poliglicólico/ácido polilático por exemplo como descrito na Patente U.S. n° 3.773.919. Os compostos ou, preferivelmente, relativamente sais insolúveis, tal como aqueles acima descrito podem também ser formulados em péfetes silásticas de matriz de colesterol, particularmente para uso em animais. As formulações adicionais de liberação lenta, depósito ou implante, por exemplo, lipossomas de gás ou líquidas são conhecidas na literatura (Patente

U.S. n° 5.770.222 e Sustained and Controíled Release Drug Delivesry Systems, J. R. Robinson ed., Marcei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978) .

Tendo geralmente descrito a invenção, o mesmo será mais facilmente entendido por referência para os seguintes exemplos, que são fornecidos a título de ilustração e não são destinados como limitantes.

Exemplo 1: Clonagem e Expressão de Anticorpo de TNF em Células Mamíferas.

Um vetor de expressão mamífero típico contém pelo menos um elemento promotor, que media o início de transcrição de mRNA, a seqüência de codificação de anticorpo, e sinais requeridos para o término de transcrição e poliadenilação da transcrição. Elementos adicionais incluem realçadores, sequências Kozak e seqüências intermediárias flanqueadas por doador e sítios aceptores para união de RNA. A transcrição altamente eficiente pode ser obtida com os promotores precoces e tardios de SV40, as repetições terminais longas (LTRS) de Retroviroses, por exemplo, RSV, HTLVI, HIVI e o promotor precoce do citomegalovírus (CMV). Entretanto, os elementos celulares podem também ser empregados (por exemplo, o promotor de actina humano). Os vetores de expressão adequados para uso na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vetores tais como plRESIneo, pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, ou pLNCX ( Clonetech Labs, Paio Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) ou pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL e PMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) e pBC12MI (ATCC 67109). As células hospedeiras mamárias que poderíam ser empregadas incluem Hela 293, H9 e células Jurkat, camundongo N1H3T3 e células C127, Cos 1, Cos 7 e CV 1, células QCI-3 de codorna, células L de camundongo e células de ovário de hamster chinês (CHO) .

Alternativamente, o gene pode ser expresso em linhagens de célula estável que contêm o gene integrado em um cromossoma. A cotransfecção com um marcador selecionável tal como dhfr, gpt, neomicina, ou higromicina permite a identificação e isolamento das células transfectadas.

O gene transfectado pode também ser amplificado para expres90 sar grandes quantidades do anticorpo codificado. O marcador DHFR (redutase de diidrofolato) é útil para desenvolver cepas celulares que transportam diversos centos ou ainda diversos milhares de cópias do gene de interesse. Outro marcador de seleção adequado é a sintase de glutamina de enzima (GS) (Murphy, e outro, Biochem. J. 227 : 277 a 279 (1991); Bebbington, e outro, Bio/Technology 10 : 169 a 175 (1992)). Empregando-se estes marcadores, as células mamárias são desenvolvidas em veículo seletivo e as células com a resistência mais elevada são selecionadas. Estas cepas celulares contêm os genes amplificados integrados em um cromossoma. O ovário de hamster chinês (CHO) e células NSO são frequentemente empregados para a produção de anticorpos.

Os vetores de expressão pC1 e pC4 contêm o promotor forte (LTR) do Vírus de Sarcoma de Rous (Cullen, e outro, Molec. Cell. Biol. 5: 438 a 447 (1985)) mais um fragmento do realçador de CMV (Boshart, e outros, Celi 41:521-530 (1985)). Sítios de clonagem múltipla, por exemplo, com os sítios de divagem de enzima de restrição BamHI, Xbal e Asp718, facilitam a clonagem do gene de interesse. Os vetores contêm além disso o íntron 3’, o sinal de poliadenilação e terminação dos gene de pré-proinsulina de rato.

Clonagem e Expressão em Células CHO

O vetor pC4 é empregado para expressão de anticorpo de TNF. O plasmídeo pC4 é um derivado do plasmídeo pSV2-dhfl (Acessão ATCC N° 37146). O plasmídeo contém o gene DHFR de camundongo sob controle do promotor precoce de SV40. Células de ovário de hamster chinês ou outras desprovidas de atividade de diidrofolato que são transfectadas com estes plasmídeos podem ser selecionadas pelo desenvolvimento das células em um veículo seletivo (por exemplo, alfa minus MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com o metotrexato de agente quimioterapêutico. A amplificação dos genes DHFR em células resistentes a metotrexato (MTX) tem sido bem documentada (veja, por exemplo, F. W. Alt, e outros, J. Biol. Chem. 253: 1357 a 1370 (1978); J. L. Hamlin e C. Ma, Biochem. et Biophys. Acta 1097: 107 a 143 (1990); e M. J. Page e Μ. A. Sydenham, Biote-

chnology 9: 64 a 68 (1991)). Células desenvolvidas em concentrações crescentes de MTX desenvolvem resistência à droga por superprodução da enzima alvo, DHFR, como um resultado da amplificação do gene DHFR. Se um segundo gene é ligado ao gene DHFR, ele é geralmente co-amplificado e super-expresso. Sabe-se na técnica que esta metodologia pode ser empregada para desenvolver linhagens de células transportando mais do que 1.000 cópias do(s) gene(s) amplificado(s). Subsequentemente, quando o metotrexato é retirado, linhagens de células são obtidas as quais contêm o gene amplificado integrado em um ou mais cromossomos da célula hospedeira.

O plasmídeo pC4 contém para expressão do gene de interesse o promotor forte da repetição de terminal longo (LTR) do Vírus de Sarcoma de Rous (Culien, e outros, Molec. Cell. Biol. 5: 438 a 447 (1985)) mais um fragmento isolado do realçador do gene precoce imediato de citomegalovírus humano (CMV) (Boshart, e outros, Cell 41: 521 a 530 (1985)). A jusante do promotor são BamHI, Xbal, e Asp718 sítios de divagem de enzima de restrição que permitem a integração dos genes. Atrás destes sítios de clonagem o plasmídeo contém o íntron 3’ e o sítio de poliadenilação do gene de pré-proinsulina de rato. Outros promotores de elevada eficiência podem também ser empregados para a expressão, por exemplo, o promotor de bactina humana, os promotores tardios ou precoces de SV40 ou as repetições de terminal longo de outras retro-viroses, por exemplo, HIV e HTLVI. Os sistemas de expressão Clontecíís Tet-Off e Tet-On e sistemas similares podem ser empregados para expressar o TNF de uma maneira regulada em células de mamíferos (M. Gossen, e H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5547 a 5551 (1992)). Para a poliadenilação do mRNA outros sinais, por exemplo, dos genes de globina ou hormônio de crescimento humano podem ser empregados também. Linhagens de células estáveis portando um gene de interesse integrado nos cromossomas podem também ser selecionados na co-transfecção com um marcador selecionável tal como gpt, G418 ou higromicina. É vantajoso empregar-se mais do que um marcador selecionável no início, por exemplo, G418 mais metotrexato. O plasmídeo pC4 é dige-

rido com enzimas de restrição e em seguida desfosforilado empregando-se fosfatase intestinai de bezerro através de procedimentos conhecidos na técnica. O vetor é em seguida isolado de um gel de agarose a 1% .

O DNA codificando região constante e variável isolado e o vetor desfosforilado são em seguida ligados com ligase T4 DNA. Células de E. coli HB101 ou XL-1 Azuis são em seguida transformadas e bactérias são identificadas as quais contêm o fragmento inserido no plasmídeo pC4 empregando-se, por exemplo, análise de enzima de restrição.

Células de ovário de hamster chinês (CHO) desprovidas de um gene DHFR ativo são empregadas para transfecção. 5 g do plasmídeo de expressão pC4 são co-transfectados com 0,5 g do plasmídeo pSV2-neo empregando-se lipofectina. O plasmídeo pSV2-neo contém um marcador selecionável dominante, o gene neo de Tn5 codificando um enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos incluindo G418. As células são semeadas em alfa menos MEM suplementado com 1 g/ml de G418 . Depois de 2 dias, as células são tripsinadas e semeadas em lâminas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em alfa menos MEM suplementado com 10, 25, ou 50 ng/ml de metotrexato mais 1 g/ml de G418. Depois de aproximadamente 10 a 14 dias clones simples são tripsinados e em seguida semeados em placas Petri de cavidade 6 ou frascos de 10 ml empregando-se diferentes concentrações de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Clones desenvolvendo-se nas concentrações mais elevadas de metotrexato são em seguida transferidos para novas lâminas de cavidade 6 contendo ainda concentrações elevadas de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). O mesmo procedimento é repetido até que clones sejam obtidos que cresçam a uma concentração de 100 a 200 mM. A expressão do desejado produto de gene é analisado, por exemplo, por SDS-PAGE e mancha do Oeste ou por análise de HPLC de fase reversa.

Exemplo 2: Geração de Anticorpos Monoclonaís IqG Humanos de Elevada

Afinidade Reativos com TNF Humano Empregando-se Camundongos

Transqênicos .

Sumário

Camundongos transgênicos têm sido empregados os quais contêm genes de imunoglobulina de cadeia leve e pesada humana para gerar anticorpos monoclonaís, completamente humanos, de elevada afinidade os quais podem ser empregados terapeuticamente para inibir a ação de TNF para o tratamento de uma ou mais doenças mediadas por TNF. Camundongos híbridos (CBA/J x C57/BL6/J) F₂ contendo transgenes de anticorpo de região constante e variável humano para ambas as cadeias leve e pesada são imunizados com TNF recombinante humano (Taylor e outros, Intl. Immunol. 6: 579-591 (1993); Lonberg e outros, Nature 368: 856 a 859 (1994); Neuberger, M., Nature Biotech. 14: 826 (1996); Fishwild, e outros, Nature Biotechnology 14: 845 a 851 (1996)). Diversas fusões produziram um ou mais painéis de anticorpos monoclonaís IgG reativos com TNF completamente humano. Os anticorpos anti-TNF completamente humanos são também caracterizados. Todos são lgG1. Nos anticorpos constata-se terem constantes de afinidade em algum lugar entre 1x10⁹ e 9x10¹². As afinidades inesperadamente elevadas destes anticorpos monoclonaís completamente humanos torna-os candidatos adequados para aplicações terapêuticas em doenças, patologias ou distúrbios relacionados com TNF.

Abreviações

BSA - albumina de soro bovino

CO₂ - dióxido de carbono

DMSO - sulfóxido de dimetila

EIA - imunoensaio de enzima

FBS - soro de feto bovino

H₂O₂ - peróxido de hidrogênio

HRP - peroxidase de rábano picante

ID - intradérmico

Ig - imunoglobulina

TNF - fator alfa de necrose de tecido

IP - intraperitoneal

IV - intravenosa

Mab - anticorpo monoclonal

OD - densidade óptica

OPD - cloridrato de o-fenilenodiamina

PEG - polietileno glicol

PSA-penicilina, estreptomicina, anfotericina

RT - temperatura ambiente

SQ - subcutâneo v/v - volume por volume w/v - peso por volume

Materiais e Métodos

Animais

Os camundongos transgênicos que podem expressar anticorpos humanos são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, por GenPharm International, San Jose, CA; Abgenix, Freemont, CA, e outros) os quais expressam imunoglobulinas humanas mas não IgM ou Ig de camundongo. Por exemplo, tais camundongos transgênicos contêm transgenes de seqüência humana que sofrem ligação V(D)J, permuta de classe de cadeia pesada, e mutação somática para gerar um repertório de imunoglobulinas de seqüência humana (Lonberg, e outros, Nature 368: 856 a 859 (1994)). O transgene de cadeia leve pode ser derivado, por exemplo, em parte de um clone de cromossomo artificial de levedura quase inclui aproximadamente metade da região V humana de linhagem de origem . Além disso, o transgene de cadeia pesada pode codificar igualmente as regiões constantes μ humana e 1 (Fishwild, e outros, Nature Biotechnology 14:845-851 (1996)) e/ou 3 humana. Camundongos derivados de cepas genotípicas apropriadas podem ser empregados nos processos de imunização e fusão para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para TNF.

imunização

Uma ou mais escalas de imunização podem ser empregadas para gerar os hibridomas humanos anti-TNF. As primeiras diversas fusões podem ser executadas depois do seguinte protocolo de imunização exemplar, porém outros protocolos conhecidos similares podem ser empregados. Diversos camundongos fêmeas de 14 a 20 semanas de idade e /ou machos transgênicos cirurgicamente castrados são IP e /ou ID imunizados com 1 a 1000 pg de TNF humano recombinante emulsificado com um volume igual de TITERMAX ou adjuvante de Freund completo em um volume final de 100 a 400 pl_ (por exemplo, 200). Cada camundongo pode também receber opcionalmente 1 a 10 pg em 100 pL de solução salina fisiológica em cada um dos 2 sítios SQ. Os camundongos podem em seguida ser imunizados 1 a 7, 5 a 12, 10 a 18, 17 a 25 e /ou 21 a 34 dias mais tarde IP (1 a 400 pg) e SQ (1 a 400 pg x 2) com TNF emulsificado com um volume igual de TITERMAX ou adjuvante de Freund incompleto. Camundongos podem ser sangrados 12 a 25 e 25 a 40 dias mais tarde por perfuração retro-orbital sem anticoagulante. O sangue é em seguida deixado coagular a temperatura ambiente durante uma hora e o soro é coletado e titulado empregando-se um ensaio de EIA de TNF de acordo com métodos conhecidos. Fusões são realizadas quando injeções repetidas não causam títulos para aumento. Neste momento, aos camundongos pode ser administrado uma injeção de reforço IV final de 1 a 400 pg de TNF diluído em 100 pL de solução salina fisiológica. Três dias depois, os camundongos podem ser eutanizados por deslocamento cervical e os baços removidos assepticamente e imersos em 10 mL de solução salina tamponada por fostato frio (PBS) contendo 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, e 0,25 pg/mL de anfotericina B (PSA). Os esplenócitos são colhidos por gotejamento estéril do baço com PSA-PBS. As células são lavadas uma vez em PSA-PBS frio, levado em conta o emprego de exclusão de corante azul de Tripano e ressuspensas em veículos RPMI 1640 contendo 25 mM de Hepes.

Fusão de Células

A fusão pode ser realizada em uma relação de 1:1 a 1:10 de células de mieloma de murino para células de baço viáveis de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, tais como conhecidos na técnica. Como um exemplo não limitante, células de baço e células de mieloma podem ser peletadas juntas. O pélete pode em seguida ser lentamente re-suspensa, durante 30 segundos, em 1 mL de 50% (peso/volume) de solução de PEG/PBS (peso molecular de PEG 1,450, Sigma) a 37°C. A fusão pode em seguida ser interrompida adicionando-se lentamente 10,5 mL de veículo RPMI 1640 contendo 25 mM de Hepes (37°C) durante 1 minutos. As células fundidas são centrifugadas durante 5 minutos a 500 a 1500 rpm. As células são em seguida re-suspensas em veículo HAT (veículo RPMI 1640 contendo 25 mM de Hepes, 10% de soro soro de Clone Fetal I (Hyclone), 1 mM de piruvato de sódio, 4 mM de L-glutamina, 10 pg/mL de gentamicina, 2,5% de suplemento de cultura Origen (Fisher), 10% de veículos RPMI 1640 condicionado 653 / Hepes, 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 100 μΜ de hipoxantina, 0,4 μΜ de aminopterina, e 16 μΜ de timidina) e em seguida plaqueados a 200 pL / cavidade em quinze placas de cultura de tecido de fundo plano de cavidade 96. As placas são em seguida colocadas em um incubador a 37°C umedecido contendo 5% de CO₂ θ 95% de ar durante 7 a 10 dias.

Detecção de Anticorpos Anti-TNF de IgG Humano em Soro de Camundongo.

EIA’s de fase sólida pode ser empregado para analisar soros de camundongos para anticorpos de IgG humana específicos para TNF humano. Sumariamente, placas podem ser revestidas com TNF a 2 pg / mL em PBS durante a noite. Após a lavagem em 0,15 M de solução salina contendo 0,02% (volume / volume) de Tween 20, as células podem ser bloqueadas com 1 % (peso / volume) de BSA em PBS, 200 pL / cavidade durante 1 hora a temperatura ambiente. As placas são empregadas imediatamente ou congeladas a -20°C para uso futuro. Diluições de soro de camundongo são incubadas nas placas revestidas de TNF a 50 pL / cavidade a temperatura ambiente durante 1 hora. As placas são lavadas e em seguida sondadas

com 50 pL / cavidade de IgG anti-humana de cabra rotulada por HRP, Fc específico diluído em 1:30.000 em 1% de BSA-PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. As placas podem novamente ser lavadas e 100 pl_ / cavidade da solução de substrato de citrato-fosfato (0,1 M de ácido cítrico e 0,2 M de fosfato de sódio, 0,01% de H₂O₂ e 1 mg / ml_ de OPD) é adicionada durante 15 minutos a temperatura ambiente. A solução final (4N de ácido sulfúrico) é em seguida adicionada a 25 pL / cavidade e as ODs são lidas em 490 nm por meio de um espectrofotômetro de placa automatizado. Detecção de Imunoglobulinas Completamente Humanas em Sobrenadantes de Hibridoma.

Imunoglobulinas completamente humanas de secreção de hibridomas positivos de crescimento podem ser detectadas empregando-se um EIA adequado. Sumariamente, placas de pop-out de cavidade 96 (VWR, 610744) podem ser revestidas com 10 pg / mL de Fc de IgG anti-humana de cabra em tampão de carbonato de sódio durante a noite a 4°C. As placas são lavadas e bloqueadas com 1% de BSA-PBS durante uma hora a 37°C e empregadas imediatamente ou congeladas a -20 °C. Sobrenadantes de hibridoma não diluídos são incubados nas placas durante uma hora a 37°C. As placas são lavadas e sondadas com Kappa anti-humana de cabra rotulada por HRP diluída em 1: 10.000 em 1% BSA-PBS durante uma hora a 37°C. As placas são em seguida incubadas com solução de substrato tal como descrito acima.

Determinação de Reatividade anti-TNF Completamente Humano.

Hibridomas, tal como acima descrito, podem ser simultaneamente testados com relação à reatividade ao TNF empregando-se um RIA adequado ou outro ensaio, por exemplo, sobrenadantes são incubados em placas de Fc de IgG anti-humana de cabra tais como acima referidas, lavados e em seguida sondados com TNF radio-rotulados com contagem apropriada por cavidade durante 1 hora a temperatura ambiente. As cavidades são lavadas duas vezes com PBS e o TNF radiorrotulado ligado é quantificado empregando-se um contador adequado.

Hibridomas de secreção anti-TNF de lgG1 humana podem ser

expandidos em cultura de células e consecutivamente subclonados por diluição limitante. As populações clonais resultantes podem ser expandidas e crio-conservadas em veículo de congelamento (95% de FBS, 5% de DMSO) e estocadas em nitrogênio líquido.

Isotipaqem

A determinação de isótipo dos anticorpos pode ser realizada empregando-se um EIA em um formato similar àquele empregado para analisar os soros imunes de camundongos quanto a títulos específicos. O TNF pode ser revestido em placas de cavidade 96 tal como descrito acima e anticorpo purificado a 2 pg/ mL pode ser incubado na placa durante uma hora a temperatura ambiente. A placa é lavada e sondada com IgGi anti-humana de cabra rotulado por HRP ou lgG3 anti-humana de cabra rotulado por HRP diluído a 1:4000 em 1% de BSA-PBS durante uma hora a temperatura ambiente. A placa é novamente lavada e incubada com solução de substrato tal como descrito acima.

Cinéticos de Ligação de Anticorpos de TNF Anti-Humano com TNF Humano.

Características de ligação com relação aos anticorpos podem ser adequadamente avaliadas empregando-se um EIA de captura de TNF e tecnologia BIAcore, por exemplo. Concentrações graduadas de anticorpos de TNF humano purificado podem ser avaliadas quanto a ligação às placas de EIA revestidas com 2 pg / mL de TNF em ensaios tais como descritos acima. As OD’s pode ser em seguida apresentadas como plotagens de semi-log apresentando eficiências de ligação relativas.

Constantes de ligação quantitativas podem ser obtidas, por exemplo, como segue, ou por qualquer outro método adequado conhecido. Um chip BIAcore CM-5 (carboximetila) é colocado em um BIAcore 2000 unidades. Tampão de HBS (0,01 M de HEPES, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% volume / volume de tensoativo P20, pH 7,4) é fluído sobre uma célula de fluxo do chip a 5 pL / minuto até que uma base estável seja obtida. Uma solução (100 pL) de 15 mg de EDC (cloridrato de N-etil-N’-(3dimetil-aminopropíl)-carbodiimida) em 200 pL de água é adicionada a 100

μΙ_ de uma solução de 2,3 mg de NHS (N-hidroxissucinimida) em 200 μΙ_ de água. Quarenta (40) μ!_ da solução resultante é injetado no chip. Seis μΙ_ de uma solução de TNF humano (15 pg / mL em 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8) é injetado no chip, resultando em um aumento de ca. 500 RU. O tampão é modificado para tampão de fluxo TBS/Ca/Mg/BSA (20 mM de Tris, 0,15 M de cloreto de sódio, 2 mM de cloreto de cálcio, 2 mM de acetato de magnésio, 0,5% de Triton X-100, 25 pg/mL de BSA, pH 7,4) e fluído sobre o chip durante a noite para equilibrá-lo e para hidrolisar ou tampar quaisquer ésteres de sucinimida não reagidos.

Os anticorpos são dissolvidos no tampão de fluxo a 33,33, 16,67, 8,33, e 4,17 nM. A taxa de fluxo é ajustada para 30 μΙ_ / min e a temperatura do instrumento para 25°C. Duas células de fluxo são empregadas para as séries cinéticas, uma na qual TNF tenha sido imobilizado (amostra ) e uma segunda, célula de fluxo não derivatizada (esboço). 120 pL de cada concentração de anticorpo é injetado nas células de fluxo a 30 pL / min (fase de associação) seguido por uns 360 segundos ininterruptos de fluxo de tampão (fase de dissociação). A superfície do chip é regenerada (fator alfa de necrose de tecido / complexo de anticorpo de dissociado) por meio de duas injeções sequenciais de 30 pL cada de 2 M de tiocianato de guanidina.

A análise dos dados é feita empregando-se avaliação BIA 3.0 ou CLAMP 2.0, tal como conhecido na técnica. Para cada concentação de anticorpo o sensograma do esboço é subtraído do sensograma da amostra. Um ajustamento global é feito igualmente para a dissociação (k_d, sec'¹) e a associação (ka, mol'¹ sec'¹) e a constante de dissociação (KD, mol) calculada (kd/ka). Quando a afinidade do anticorpo é elevada o bastante para que os RUs do anticorpo capturado seja > 100, diluições adicionais do anticorpo são feitas.

Resultados e Discussão

Geração de Anticorpos Monoclonais de TNF Anti-Humano

Diversas fusões são executadas e cada fusão é semeada em 15 placas (1440 cavidades / fusão) que produzem diversas dúzias de anticor-

100 pos específicos para TNF humano. Destes, alguns constata-se consistir em uma combinação de cadeias de Ig de camundongo e humana. Os hibridomas restantes segregam anticorpos anti-TNF consistindo somente em cadeias leve e pesada humanas. Dos hibridomas humanos todos espera-se serem lgG1.

Cinéticos de Ligação de Anticorpos de TNF Anti-Humano Humanos

A análise ELISA confirma que o anticorpo purificado da maioria ou a totalidade destes hibridomas ligam TNF de uma maneira dependente da concentração. As figuras 1 - 2 mostram os resultados da eficiência de ligação relativa destes anticorpos. Neste caso, a atividade do anticorpo com relação ao seu antígeno (epitópo) cognato é avaliada. Deve ser notado que a ligação de TNF diretamente à placa de EIA pode causar desnaturação da proteína e as afinidades de ligação aparentes não podem ser refletivas de ligação a proteína não desnaturada. Cinquenta por cento das ligações são encontradas sobre uma faixa de concentrações.

As constantes de ligação quantitativa são obtidas empregandose análise BIAcore dos anticorpos humanos e revela que diversos dos anticorpos monoclonais humanos têm afinidade muito elevada com K_D na faixa de 1 x 10’⁹ a 7 x 10‘¹².

Conclusões

Diversas fusões são realizadas utilizando-se esplenócitos de camundongos híbridos contendo transgenes de anticorpo de região constante e variável humanos que são imunizados com TNF humano. Um grupo de diversos anticorpos monoclonais de IgG reativos a TNF completamente humano do isótipo de lgG1 são gerados. Os anticorpos anti-TNF completamente humano são também caracterizados. Diversos dos anticorpos gerados têm constantes de afinidades entre 1 x 10⁹ e 9 x 10¹² . As afinidades inesperadamente elevadas destes anticorpos monoclonais completamente humanos tornam-os adequados para aplicações terapêuticas em doenças dependentes de TNF, patologias ou condições relacionadas.

101 ff

Exemplo 2: Geração de Anticorpos Monoclonais de IqG Humano Reativos ao TNFV Humano.

Sumário

Camundongos (1 a 4) híbridos (CBA/J x C57BL/6J) F₂ contendo transgenes de anticorpo de região constante e variável humano para ambas as cadeias leve e pesada foram imunizados com TNFV. Uma fusão, denominada GenTNV, produziu oito anticorpos monoclonais de IgGlK totalmente humana que ligam-se ao TNFa humano recombinante imobilizado. Imediatamente após a identificação, as oito linhagens de células foram transferidas para a Biologia Molecular para outra caracterização. Como estes Mabs são totalmente humanos em sequência, espera-se que eles sejam menos imunogênicos do que cA2 (Remicade) em seres humanos.

Abreviações

BSA - albumina de soro bovino

CO₂ - dióxido de carbono

DMSO - sulfóxido de dimetila

EIA - imunoensaio de enzima

FBS - soro de feto bovino

H₂O₂ - peróxido de hidrogênio

HC - cadeia pesada

HRP - peroxidase de rábano picante

Ig - imunoglobulina

IP - intraperitoneal

IV - intravenosa

Mab - anticorpo monoclonal

OD - densidade óptica

OPD - cloridrato de o-fenilenodiamina

PEG - polietileno glicol

PSA - penicilina, estreptomicina, anfotericina

RT - temperatura ambiente

SQ - subcutâneo

TNFV - fator alfa de necrose de tumor

102 v/v - volume por volume w/v - peso por volume

Introdução

Camundongos transgênicos que contêm genes de imunoglobulina de cadeia leve e pesada humana foram utilizados para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos os quais são específicos para TNFV humano recombinante. Espera-se que estes únicos anticorpos possam ser empregados, como cA2 (Remicade) é empregado para inibir terapeuticamente os processos inflamatórios envolvidos com doença mediada por TNFV com o benefício de meia-vida de soro aumentada e efeitos colaterais diminuídos referentes a imunogenicidade.

Materiais e Métodos

Animais

Camundongos transgênicos que expressam imunoglobulinas humanas, mas não IgM ou Igx de camundongos, têm sido desenvolvidos pela GenPharm International. Estes camundongos contêm transgenes de anticorpo humano funcionais que sofrem ligação V(D)J, permuta de classe de cadeia pesada e mutação somática para gerar um repertório de imunoglobulinas (1) humanas específicas de antígeno. Os transgenes de cadeia leve são derivados em parte de um clone de cromossomo artificial de levedura que inclui aproximadamente metade do local Vk humano da linhagem de origem . Além de diversos genes VH, o transgene de cadeia pesada (HC) codifica igualmente as regiões constantes μ humana e γ1 (2) e /ou γ3 humana. Um camundongo derivado da cepa genotípica HCo12/KCo5 foi empregado no processo de imunização e fusão para gerar os anticorpos monoclonais descritos aqui.

Purificação de TNFV Humano.

O TNFV humano foi purificado a partir do sobrenadante de cultura de tecido de células C237A por cromatografia de afinidade empregando-se uma coluna embalada com a proteína de fusão de (p55-sf2) (5) acoplada a Sepharose 4B (Pharmacia). O sobrenadante de células foi misturado com um nono do seu volume de 10x Duíbecco's PBS (D-PBS) e passado

103 através da coluna a 4°C em 4 ml/min. A coluna foi então lavada com PBS e o TNFV foi eluído com 0,1 M de citrato de sódio, pH 3,5 e neutralizado com 2 M deTris-HCI pH 8,5. O TNFV purificado foi permutado por tampão em 10 mM de Tris, 0,12 M de cloreto de sódio, pH 7,5 e filtrado por meio de um filtro de seringa de 0,2 pm .

Imunizações

Um camundongo GenPharm fêmea, aproximadamente com 16 semanas de idade, foi imunizado IP (200 pl) e ID (100 μΙ na base do rabo) com um total de 100 pg de TNFV (lote JG 102298 ou JG 102098) emulsificado com um volume igual de adjuvante Titermax nos dias 0, 12 e 28. O Camundongo foi sangrado nos dias 21 e 35 por punção retro-orbital sem anti-cogulante. O sangue foi deixado coagular em temperatura ambiente durante uma hora e o soro foi coletado e titulado empregando-se ensaio EIA de fase sólida de TNFV. A fusão, denominada GenTNV, foi executada após o camundongo ser deixado descansar durante sete semanas seguindo injeção no dia 28. O camundongo, com um título de IgG humano específico de 1:160 contra TNFV, foi então administrado uma injeção de reforço IV final de 50 pg de TNFV diluído em 100 pl de solução salina fisiológica. Três dias depois, o camundongo foi eutanizado por deslocamento cervical e o baço foi removido assepticamente e imerso em 10 ml de solução salina tamponada por fosfato fria (PBS) contendo 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, e 0,25 pg/ml de amfotericina B (P/as). Os esplenócitos foram colhidos esterilmente borrifando o baço com PSA-PBS. As células foram lavadas uma vez em PSA-PBS frio, contados empregando-se uma contadora Coulter e ressuspensos em veículo RPMI 1640 contendo 25 mM de Hepes.

Linhagens de células

O parceiro de fusão de mieloma de camundongo de não secreção, 653 foi recebido no grupo Cell Biology Services (CBS) em 14-5-97 do grupo Centocor's Product Development. A linhagem de célula foi expandida em veículo RPMI (JRH Biosciences) suplementado com 10% (v/v) de FBS (Cell Culture Labs), 1 mM de piruvato de sódio, 0,1 mM de NEAA, 2 mM de

104

L-glutamina (todos da JRH Biosciences) e criopreservada em 95% de FBS e 5% de DMSO (Sigma), em seguida estocada em um refrigerador de nitrogênio líquido de fase de vapor em CBS. O banco de célula foi estéril (Quality Control Centocor, Malvern) e sem micoplasma (Bionique Laboratories). As células foram mantidas em cultura de fase log até a fusão. Elas foram lavadas em PBS, contadas, e a viabilidade determinada (< 95%) por meio de exclusão de corante azul tripano antes da fusão.

As TNFV humanas foram produzidas por uma linhagem de célula recombinante, denominada C237A, gerada em Molecular biology no Centocor. A cepa celular foi expendida em veículo IMDM (JRH Biosciences) suplementada com 5% (v/v) de FBS (Cell Culture Labs), 2 mM de Lglutamina (todos da JRH Biosciences), e 0,5 :g/ml de ácido micofenóíico, e criopreservada em 95% de PBS e 5% de DMSO (Sigma), em seguida estocada em um congelador de nitrogênio líquido de fase de vapor em CBS (13). O banco de célula foi estéril (Quality Control Centocor, Malvern) e sem micoplasma (Bionique Laboratories).

Fusão de Célula

A fusão de célula foi realizada empregando-se uma relação de 1:1 de células de mieloma de murino 653 e células de baço de murino viáveis. Sumariamente, as células de baco e células de mieloma foram peletadas conjuntamente. A pélete foi lentamente ressuspensa durante um período de 30 segundos em 1 ml de 50% ( peso/volume) de solução de PEB/PBS (peso molecular de PEG de 1.450 g/mol, Sigma) a 37°C. A fusão foi interrompida lentamente adicionando-se 10,5 ml de veículos RPMI (nenhum aditivo) (JRH) (37°C) durante 1 minuto. As células fundidas foram centrifugadas durante 5 minutos a 750 rpm. as células foram então ressuspensas em veículo HAT (veículo RPMI/HEPES contendo 10% de Soro Bovino Fetal (JRH), 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina, 10 μg/ml de gentamicina, 2,5% de suplemento de cultura Origen (Fisher), 50 μΜ de 2-mercaptoetanol, 1% de veículo RPMI condicionado por 653, 100 μΜ de hipoxantina, 0,4 μΜ de aminopterina e 16 μΜ de timidina) e em seguida chapeadas em 200 pL/cavidade em cinco placas de cultura de tecido de base plana de cavida-

105 de 96. As placas foram então colocadas em um incubador a 37°C umidificado contendo 5% de CO₂ e 95% de ar durante 7 a 10 dias.

Detecção de Anticorpos Anti-TNFV de IgG Humano em 8oro de Camundongo.

As EIAs de fase sólida foram empregadas para analisar os soros de camundongos para anticorpos IgG humanos específicos para TNFV humano. Sumariamente, as placas foram revestidas com TNFV a 1 pg/ml em PBS durante a noite. Após lavagem em 0,15 M de solução salina contendo 0,02% 9v/v) de Tween 20, as cavidades foram bloqueadas com 1% de (peso/volume) de BSA em PBS, 200 pL/cavidade durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram ou empregadas imediatamente ou congeladas a -20°C para uso futuro. Os soros de camundongo foram incubados em diluições seriais de duas vezes sobre as placas revestidas por TNFV em 50 μl_/cavidade em temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas e em seguida sondadas com 50 pL/cavidade de IgG anti-humano de cabra rotulado por HRP, Fc específico (preciso) diluído 1:30.000 em 1% de BSA-PBS durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas e 100 pL/cavidade de solução de substrato de citrato-fosfato (0,1 M de ácido cítrico e 0,2 M de fosfato de sódio, 0,01% de H₂O₂ e 1 mg/mL de OPD) foi adicionado durante 15 minutos em temperatura ambiente. Solução de interrupção (4N de ácido sulfúrico) foi então adicionada a 25 pL/cavidade e as OD*s foram lidas a 490 nm empregando-se um espectrofotômetro de placa automatizsada.

Detecção de Imunoqlobulinas Totalmente Humanas em Sobrenadantes de

Hidridoma.

Porque o camundongo GenPharm é capaz de gerar igualmente cadeias de imunoglobulina de camundongo e humana, dois ensaios EIA separados foram empregados para testar os clones de hibridoma de crescimento positivo quanto a presença de ambas as cadeias leve humanas e cadeias pesadas humanas. As placas foram revestidas como acima descrito e os sobrenadantes de hibridoma não diluídos foram incubados sobre as placas durante uma hora a 37°C. As placas foram lavadas e sondadas com ou

106 anticorpo Kappa anti-humano de cabra conjugado com HRP (Southern Biotech) diluído 1:10.000 em 1% de BSA-HBSS ou anticorpo específico Fc de IgG anti-humano de cabra conjungado com HRP, durante uma hora a 37°C. As placas foram então incubadas com solução de substrato como acima definido. Os clones de hibridoma que não forneceram um sinal positivo em ambos os formatos de EIA de Fc de IgG anti-humano e Kappa anti-humano foram descartados.

Isotipaqem

A determinação de isótipo dos anticorpos foi executada empregando-se um EIA em um formato similar àquele empregado para analisar os soros imunes de camundongo quanto aos títulos específicos. As placas EIA foram revestidas com IgG anti-humano de cabra (H+L) a 10 :g/mL em tampão de carbonato de sódio durante a noite a 4EC e bloqueadas como acima descrito. Os sobrenadantes puros de culturas de cavidade 24 foram incubadas sobre a placa durante uma hora em temperatura ambiente. A placa foi lavada e sondada com IgG^ lgG₂, lgG₃ ou lgG₄ anti-humanos de cabra rotulado com HRP (Sítio de Ligação) diluído a 1:4000 em 1% de BSA-PBS durante uma hora em temperatura ambiente. A placa foi novamente lavada e incubada com solução de substrato como acima descrito.

Resultados e Discussão

Geração de Anticorpos Monoclonais de TNFV Anti-Humano Totalmente

Humanos.

Uma fusão, denominada GenTNV, foi executada de um camundongo GenPharm imunizado com proteína de TNFV humana recombinante. A partir desta fusão, 106 híbridos de crescimento positivo foram analisados. Oito linhagens de célula de hibridoma foram identificadas que segregam anticorpos IgG totalmente humano reativos com TNFV humano. Estas oito linhagens de célula segregaram imunoglubulinas do isótipo de IgGlK humano e todos foram subclondos duas vezes por limitação da diluição para obter linhagens de célula estável (>90% homogênea). Os nomes de cepa celular e respectivas designações de código C são listados na Tabela 1. Cada das cepas celulares foi congelada em 12 frascos de pesquisa de bancos de

107 célula estocados nitrogênio líquido.

As células mãe coletadas de cavidades de um prato de cultura de cavidade 24 para cada das oito linhagens de célula foram cedidas para o grupo Molecular Biology em 18-2-99 para transfecção e outra caracteriza5 ção.

Tabela 1: Designações de Linhagem de célula GenTNV.

Nome	Designação de Código C
GenTNVI 4,17,12	C414A
GenTNVI 5,28,11	C415A
GenTNV32,2,16	C416A
GenTNV86,14,34	C417A
GenTNV118,3,36	C418A
GenTNVI 22,23,2	C419A
GenTNV148,26,12	C420A
GenTNVI 96,9,1	C421A

Conclusão

A fusão de GenTNV foi realizada utilizando-se os esplenócitos de um camundongo híbrido contendo transgenes de anticorpo de região constante e variável humanos que foram imunizados com TNFV humano recombinante preparado em Centocor. Oito anticorpos monoclonaís de IgG reativo ao TNFV, totalmente humanos do isótipo IgGlK foram gerados. As linhagens de célula parenteral foram transferidas para o grupo de Molecular Biology para outra caracterização e desenvolvimento. Um destes novos an15 ticorpos humanos pode provar-se útil em antiinflamatório com o benefício potencial de imunogenicidade diminuída e complicações do tipo alérgica quando comparado com o Remicade.

Referências:

1. Taylor, e outro, International Immunology 6 : 579 - 591 (1993).

2. Lonberg, e outro, Nature 368 : 856 - 859 (1994) .

3. Neuberger, M. Nature Biotechnology 14 : 826 (1996).

4. Fishwild, e outro, Nature Biotechnology 14: 845 - 851 (1996) .

5. Scallon, e outro, Citocina 7 : 759 - 770 (1995) .

108

Exemplo 3: Clonagem e Preparação de Linhagens de célula Expressando

Anticorpo anti-TNFV Humano.

Sumário

Um grupo de oito anticorpos monoclonaís humanos (mAbs) com uma designação de TNV constatou-se inibir a TNFV humano imobilizado com avidez aparentemente elevada. Sete dos oito mAbs foram mostrados eficientemente bloquear a ligação de huTNFV a um receptor de TNF recombinante. A análise de sequência do DNA codificando os sete mAbs confirmou que todos os mAbs tiveram regiões V humanas. As seqüências de DNA também revelaram que três pares dos mAbs foram idênticos um ao outro, tal que o grupo original de oito mAbs contivesse apenas quatro mAbs distintos, representados por TNV14, TNV15, TNV148 e TNV196. Com base em análises das seqüências de aminoácido deduzidas dos mAbs e resultados de dados de neutralização de TNFV in vitro, TNV148 e TNV14 de mAb foram selecionados para outro estudo.

Porque o resíduo de prolína na posição 75 (estrutura 3) na cadeia pesada de TNV148 não foi encontrado naquela posição em outros anticorpos humanos do mesmo subgrupo durante uma pesquisa de base de dados, mutagênese de DNA direcionada ao sítio foi realizada para codificar um resíduo de serina naquela posição a fim de tê-lo adaptado às seqüências e estrutura de linha germinativa conhecidas. O mAb modificado por serina foi projetado TNV148B. O DNA amplificado por PCR codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de TNV148B e TNV14 foi clonado em vetores de expressão recentemente preparados que foram baseados nos genes de cadeia pesada e leve clonados recentemente de outro mAb humano (12B75), descrito no Pedido de Patente U.S. n°_, depositado em 7 de outrubro, 2000, entitulado IL-12 Antibodies, Compositions, Methods and Uses, que é totalmente incorporado aqui por referência.

As células P3X63Ag8.653 (653) ou células de mieloma de camundongo Sp2/0-Ag14 (Sp2/0) foram transfectadas com os respectivos plasmídeos de expressão de cadeia pesada e leve e analisadas por meio de dois ciclos de subclonagem para linhagens de célula produzindo níveis ele-

109 vados de mAbs de TNV148B e TNV14 (rTNV148B e rTNV14). As avaliações de curvas de crescimento e estabilidade de produção de mAb durante tempo prolongado indicou que os clones transfectados por 653 C466D e C466C estavelmente produziram aproximadamente 125 :g/ml de mAb de rTNV148B em culturas usadas ao passo que o transfectante Sp2/0 1.73-12-122 (C467A) estavelmente produziu aproximadamente 25 :g/ml de mAb de rTNV148B em culturas usadas. As análises similares indicaram que o clone C476A transfectante de Sp2/0 produziu 18 :g/mi de rTNV14 em culturas usadas.

Introdução

Um grupo de oito mAbs derivado de camundongos GenPharm/Medarex imunizados por TNFV (genótipo Hco12/Kco5) foi previamente demonstrado ligar-se ao TNFV humano e ter um lgG1 totalmente humano, isótipo Kappa. Um ensaio de ligação simples foi empregado para determinar se os mAbs exemplares da invenção eram prováveis de terem atividade de neutralização de TNFV por avaliação de sua capacidade de bloquear a ligação de TNFV ao receptor de TNF recombinante. Com base naqueles resultados, os resultados de sequência de DNA, e caracterizações in vitro de diversos dos mAbs, o TNV148 foi selecionado como o mAb a ser também caracterizado.

As sequências de DNA codificando o mAb de TNV148 foram clonadas, modificadas para adaptarem-se dentro dos vetores de expressão de gene que codificam regiões constantes adequadas, introduzidas dentro das céluls de mieloma de camundongo 653 e Sp2/0 bem caracterizados, e as linhagens de célula transfectada resultantes analisadas até os subclones serem identificados que produziram 40 vezes mais mAb do que a linhagem de célula de hibridoma original.

Materiais e Métodos

Reaqentes e Células

O reagente TRIZOL foi adquirido da Gibco BRL. A proteinase K foi obtida da Sigma Chemical Company. A transcriptase Reversa foi obtida de Life Sciences, Inc. Taq DNA Polymerase foi obtida ou de Perkin Elmer

110 i*

Cetus ou bibco BRL. As enzimas de restrição foram adquiridas de New England Biolabs. O Kit de Purificação de PCR QIAquick era da Qiagen. Um Kit de Mutagênese Direcionada ao Sitio QuikChange foi adquirido da Stratagene. Os kits miniprep de plasmídeo Wizard e RNasín eram da Promega. Op5 típlates foram obtidos da Packard. ¹²⁵lodine foi adquirido da Amersham. Os oligonucleotídeos de praxe foram adquiridos da Keystone/Biosource International. Os nomes, números de identificação, e seqüências dos oligonucleotídeos empregados neste trabalho são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Oligonucleotídeos empregados para clonar, construir ou seqüen10 ciar os genes mAb de TNV.

Os aminoácidos codificados pelos oligonucleotídeos 5'14s e HuH-J6 são mostrados acima na seqüência. O resíduo de aminoácido 'M' representa a tradução do códon de partida. As seqüências sublinhadas em oligonucleotídeos 5'14s e HuH-J6 marcam os sítios de restrição BsiWI e BstBI, respectivamente. O retalhamento em HuH-J6 corresponde à fronteira de éxon/íntron. Observe que os oligonucleotídeos cuja seqüência corresponde ao filamento negativo são escritos em uma orientação 3' - 5'. Nome I.D, Seqüência

HG1-4b	119
HG1-5B	354
HG1hg	360
HG1-6	35
HCK1-3E	117
HuK-3'Hd	208
HVKRNAseq	34

5'14s	366
5'46s	367
5'47s	368
5'63s	369
5‘73s	370

3'-TTGGTCCAGTCGGACTGG-5' ^CACCTGCACTCGGTGCTT-Õ' ^-CACTGTTTTGAGTGTGTACGGGCTTAAGTT-Õ¹

3-GCCGCACGTGTGGAAGGG-5¹

3-AGTCAAGGTCGGACTGGCTTAAGTT-5¹

3'-GTTGTCCCCTCTCACAATCTTCGAATTT-5'

S-GGCGGTAGACTACTCGTC-õ'

BsiWI M D W T W S I

5-TTTÇGTAÇGCCACCATGGACTGGACCTGGAGCATC-3¹5^,-TTTCGTACGCCACCATGGGGTTTGGGCTGAGCTG-3^,5’-TTTCGTACGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCATG-3' 5'-TTTCGTACGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTC-3^l5'-TTTCGTACGCCACCATGGGGTCAACCGCCATCCTC-3'

111

Continuação...

Nome I.D. Seqüência

Τ V Τ V S S~ BstBI

HuH-J6 388 S-GTCCCAGTGGCAGAGGAGTC/CATTCAAGCTTAAGTT-õ'

LK7s

LVgs

HuL-J3

V148-QCI

V148-QC2

Sail M D M R V

362 5'-TTTGTCGACACCATGGACATGAGGGTCC(TC)C-3^l

363 5'-TTTGTCGACACCATGGAAGCCCCAGCTC~3'

Τ K V D I K Afl2

380 3CTGGTTTCACCTATAGTTTG/CATTGAGAATTCGGCGCCTTT

399 Õ^ATCTCCAGAGACAATtCCAAGAACACGCTGTATC-S’

400 3'-GTAGAGGTCTCTGTTAaGGTTCTTGTGCGACATAG-5'

Um frasco congelado simples de células de mieloma de camundongo 653 foram obtidas. O frasco foi descongelado naquele dia e expandido em frascos T em IMDM, 5% de FBS, 2 mM de glutamina (veículo). Estas células foram mantidas em cultura contínua até elas serem transfectadas 2 a 3 semanas depois com o DNA anti-TNF aqui descrito. Algumas das culturas foram colhidas 5 dias após a data de descongelamento, peletadas por centrifugação, e ressuspensas em 95% de PBS, 5% de DMSO, aliquotadas em 30 frascos, congeladas e estocadas para uso futuro. Similarmente, um frasco congelado único de células de mieloma de camundongo Sp2/0 foi obtido. O frasco foi descongelado, um novo super congelamento preparado como descrito acima, e os frascos congelados estocados em caixas de congelador CBC AA e AB. Estas células foram descongeladas e empregadas para todas as transfecções de Sp2/0 aqui descritas.

Ensaio para Inibição de Ligação de TNF ao Receptor.

Os sobrenadantes de célula de hibridoma contendo os mAbs de

TNV foram empregados para ensaiar quanto à capacidade dos mAbs bloquearem a ligação de TNFV rotulados por ¹²⁵l à proteína de fusão de receptor de TNF recombinante, p55-sf2 (Scallon e outro (1995) Cytokine 7:

759 a 770). 50 :1 de p55-sf2 a 0,5 :g/ml em PBS foi adicionado às Optíplates para revestir as cavidades durante uma incubação de uma hora a 37°C. Diluições seriais dos oito sobrenadantes de célula TNV foram preparadas em

112 placas de base circular de cavidade 96 empregando-se o PBS/ 0,1% de BSA como diluente. O sobrenadante de célula contendo mAb anti-IL-18 foi incluído como um controle negativo e o mesmo sobrenadante anti-IL-18 trespassado com cA2 (anticorpo quimérico anti-TNF, Remicade, Patente U.S. 5.770.198, totalmente aqui incorporada por referência) foi incluído como um controle positivo. TNFV rotulado por ¹²⁵l (58 :Ci/:g, D. Shealy) foi adicionado 100 :1 de sobrenadantes de célula para ter um concentração de TNFV final de 5 ng/ml. A mistura foi pré-incubada durante uma hora em temperatura ambiente. Optiplates revestidas foram lavadas para remover p55-sf2 soltas e 50 :1 da mistura de ¹²⁵I-TNFV / sobrenadante celular foram transferidos para as Optiplates, Após 2 horas em temperatura ambiente, as Optiplates foram lavadas três vezes com PBS-Tween. 100 :1 de Microscint20 foram adicionados e a ligação de cpm determinada empregando-se a contadora gama TopCount.

Amplificação de Genes V e Análise de Seqüência de DNA.

As células de hibridoma foram lavadas uma vez em PBS antes da adição de reagente TRIZOL para preparação de RNA. Entre 7 x 10⁶ e 1,7 x 10⁷ células foram ressuspensas em 1 ml de TRIZOL. Os tubos foram agitados vigorosamente após a adição de 200 μΙ de clorofórmio. As amostras foram centrifugadas a 4°C durante 10 minutos. A fase aquosa foi transferida para um tubo microcentrífugo e um volume igual de isopropanol foi adicionado. Os tubos foram agitados vigorosamente e deixados incubar em temperatura ambiente durante 10 minutos. As amostras foram então centrifugadas a 4°C durante 10 minutos. Os péletes foram lavados uma vez com 1 ml de 70% de etanol e secadas ligeiramente em uma secadora a vácuo. Os péletes de RNA foram ressuspensos com 40 μΙ de água tratada por DEPC. A qualidade das preparações de RNA foi determinada por fracionamento de 0,5 μΙ em um gel de agarose a 1%. O RNA foi estocado em um congelador a -80°C até ser usado.

Para preparar os cDNAs de cadeia pesada e leve, misturas foram preparadas que incluiam 3 μΙ de RNA e 1 μρ de ou oligonucleotídeo 119 (cadeia pesada) ou oligonucleotídeo 117 (cadeia leve) (veja a Tabela 1) em

113 um volume de 11,5 μΙ. A mistura foi incubada a 70°C durante 10 minutos em um banho de água e em seguida resfriada sobre gelo durante 10 minutos. Uma mistura separada foi preparada a qual foi feita de 2,5 μΙ de 10Χ o tampão de transcriptase reversa, 10 μΙ de 2,5 mM de dNTPs, 1 μΙ de transcriptase reversa (20 unidades), e 0,4 μΙ de inibidor de ribonuclease RNasin (1 unidade). 13,5 μΙ desta mistura foram adicionados aos 11,5 μΙ da mistura de RNA/oligonucleotídeo resfriado e a reação incubada durante 40 minutos a 42°C. A reação de síntese de cDNA foi então estocada em um congelador a -20°C até ser usado.

Os cDNAs de cadeia pesada e leve não purificados foram empregados como padrão para amplificar por PCR as seqüências de codificação de região variável. Cinco pares de oligonucleotídeo (366/354, 367/354, 368/354,369/354 e 370/354, Tabela 1) foram simultaneamente testados quanto a sua capacidade de iniciar a amplificação do DNA de cadeia pesada. Dois pares de oligonucleotídeo (362/208 e 363/208) foram simultaneamente testados quanto a sua capacidade de iniciar a amplificação do DNA de cadeia leve. As reações PCR foram realizadas empregando-se 2 unidades de polimerase de DNA Taq de elevada fidelidade (HIFI) PLATINUM™ em um volume total de 50 μΙ: Cada reação incluiu 2 μΐ de uma reação de cDNA, 10 pmoíes de cada oligonucleotídeo, 0,2 mM de dNTPs, 5 μΙ de 10 X Tampão HIFI, e 2 mM de sulfato de magnésio. O programa ciclizador térmico foi de 95°C durante 5 minutos seguido por 30 ciclos de (94°C durante 30 segundos, 62°C durante 30 segundos, 68°C durante 1,5 minutos). Houve então uma incubação final a 68°C durante 10 minutos.

Para preparar os produtos de PCR para sequenciamento de DNA direto, eles foram purificados empregando-se o Kit de Purificação PCR OlAquick™ de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA foi eluído da coluna giratória empregando-se 50 μΙ de água estéril e em seguida secado para um volume de 10 μΙ empregando-se uma secadora a vácuo. As reações de sequenciamento de DNA foram então fixadas com 1 μΙ de produto de PCR purificado, 10 μΜ de iniciador de oligonucleotídeo, 4 μΙ de mistura de reação pronta BigDye Terminator™, e 14 μΙ de água estéril para um vo114 lume total de 20 μΙ. Os produtos de PCR de cadeia pesada preparados com o par de oligonucleotídeo 367/354 seqüenciado com iniciadores de oligonucleotídeo 159 e 360. Os produtos de PCR de cadeia leve preparados com o par de oligonucleotídeo 363/208 foram seqüenciados com os oligonucleotídeos 34 e 163. O programa ciclizador térmico para seqüenciamento foi de 25 ciclos de (96°C durante 30 segundos, 50°C durante 15 segundos, 60°C durante 4 minutos) seguido durante a noite a 4°C. Os produtos de reação foram fracionados por meio de um gel de poliacrilamida e detectados empregando-se um Seqüenciador de DNA ABI 377.

Mutagênese direcionada ao Sítio para Alterar um Aminoácido.

Um nucleotídeo simples na seqüência de DNA de região variável de cadeia pesada de TNV148 foi alterado a fim de substituir Pro⁷⁵ com um resíduo de Serina no mAb de TNV148. Os oligonucleotídeos complementares, 399 e 400 (Tabela 1), foram designados e ordenados para fazer esta alteração empregando-se o sítio de clonagem BsiWI único exatamente a montante do sítio de iniciação de tradução, seguindo o protocolo do fabricante. O plasmídeo resultante foi denominado p1747. Para introduzir um sítio BstBI na extremidade 3' da região variável, um iniciador de oligonucleotídeo 5' foi projetado com os sítios Sall e BstBI. Este iniciador foi empregado com o iniciador reverso PUC para amplificar um fragmento de 2,75 kb de p1747. Este fragmento foi então novamente clonado no sítio Sall de ocorrência natural na região variável 12B75 e um sítio Hindlll, desse modo introduzindo o sítio BstBI único, O vetor intermediário resultante, projetado p1750, poderia admitir fragmentos de região variável com extremidades BsiWI e BstBI. Para preparar uma versão de vetor de cadeia pesada no qual a região constante também derivou do gene 12B75, a inserção BamHIHindlll em p1750 foi transferido para pBR322 a fim de ter um sítio EcoRI a jusante do sítio Hindlll. O plasmídeo resultante, p1768,foi então digerido com Hindlll e EcoRI e ligado a um fragmento Hindlll-EcoRI de 5,7 kb de p1744, um subclone derivado por clonagem do fragmento BamHI-BamHI de p1560 em pBC. O plasmídeo resultante, p1784, foi então empregado como vetor para os fragmentos de cDNA ab de TNV com as extremidades de

115

BsiWI e BstBI. Trabalho adicional foi feito para preparar vetores de expressão, p1788 e p1798, que inclui a região constante lgG1 do gene 12B75 e difere um do outro por quão do íntron J-C de cadeia pesada 12B75 eles contêm.

Para modificar o gene de cadeia leve 12B75 em plasmídeo p1558, um fragmento de Sall/Aflll de 5,7 kb contendo o promotor 12B75 e região variável foi transferido de p1558 para dentro dos sítios Xhol/Aflll de plasmídeo L28. Este novo plasmídeo, p1745, forneceu um padrão menor para a etapa de mutagênese. Os oligonucleotídeos (C340sall e C340sal2) foi empregado para introduzir um sítio de restrição Sall na extremidade 5^l da região variável por mutagênese QuikChange™. O vetor intermediário resultante, p1746, tinha sítios de restrição Sall e Aflll únicos nos quais fragmentos de região variável poderiam ser clonados. Qualquer fragmento de região variável clonado dentro do p1746 preferivelmente seria ligado com a metade 3' do gene de cadeia leve. Para preparar um fragmento de restrição da metade 3' do gene de cadeia leve 12B75 que poderia ser empregado para este propósito, oligonucleotídeos BAHN-1 e BAHN-2 foram anelados um ao outro para formar um ligador de filamento duplo contendo os sítios de restrição BsiWI, Aflll, Hindll e Notl e que continham extremidades que poderiam ser ligadas nos sítios Kpnl e Saci. Este ligador foi clonado entre os sítios Kpnl e Saci de pBC para fornecer o plasmídeo p1757. Um fragmento de 7,1 kb contendo a região constante de cadeia leve 12B75, gerada digerindo p1558 com Aflll, em seguida parcialmente digerindo com Hindlll, foi clonado entre os sítios Aflll e Hindll de p1757 para produzir p1762. Este novo plasmídeo continha sítios únicos para BsiWI e Aflll nos quais o fragmento de BsiWI/AflIl contendo o promotor e regiões variáveis poderia ser transferido unindo-se as duas metades do gene.

Clonagem de cDNA e Montagem de Plasmídeos de Expressão.

Todas as reações de RT-PCR (veja acima) foram tratadas com enzima Klenow para também preencher as extremidades de DNA. Os fragmentos de PCR de cadeia pesada foram digeridos com as enzimas de restrição BsiWI e BstBI e em seguida clonados entre os sítiosBsiWI e BstBI de

116 plasmídeo L23 (L28 empregado por causa do vetor intermediário p1750 com base no 12B75 ainda não foi preparado). A análise de seqüência de DNA das inserções clonadas mostrou que os constructos resultantes foram corretas e que não houve nenhum erro introduzido durante as amplificações de PCR. Os números de identificação designados para estes constructos de plasmídeo L28 (para TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B e TNV196) são mostrados na Tabela 2.

As inserções BsiWI/BstBI para as cadeias pesadas de TNV14, TNV148 e TNV148B foram transferidas do vetor L28 para o vetor intermediário recentemente preparado, p1750. Os números de identificação designados para estes plasmídeos intermediários são mostrados na Tabela 2. Esta etapa de clonagem e etapas subseqüentes não foram feitas para TNV15 e TNV196. As regiões variáveis foram então transferidas em dois vetores de expressão de lgG1 humano diferentes. As enzimas de restrição EcoRI e Hindlll foram empregados para transferir as regiões variáveis para dentro do vetor lgG1 previamente empregado de Centocor, p104. Os plasmídeos de expressão resultantes, que codificam um lgG1 do alótipo Gm(f+), foram designados p1781 (TNV14, p1782 (TNV148) e p1783 (TNV148B) (veja a Tabela 2). As regiões variáveis foram também clonadas a montante da região constante de lgG1 derivada do gene 12B75 (GenPharm). Aqueles plasmídeos de expressão, que codificam um lgG1 doalótipo Glm(z), são também listados na Tabela 2.

Tabela 2. Números de Identificação de Plasmídeo para vários plasmídeos de cadeia pesada e leve.

O vetor L28 ou vetor pBO representa o clone de cDNA Ab inicial. As inserções naqueles plasmídeos foram transferidas para um vetor com base em 12B75 incompleto para preparar os plasmídeos intermediários. Uma etapa de transferência adicional resultou nos plasmídeos de expressão final que foram ou introduzidos em células após serem linearizados ou usados para purificar as inserções de gene mAb antes da transfecção de célula. (ND) = não feito.

ϋ

117

mAb	Plasmídeo ID Plasmídeo ID Plasmídeo ID Plasmídeo ID
de vetor L28	Intermediário	de Expressão de Expressão
Gm(f+)	G1m(z)
Cadeias Pesadas
TNV14	p1751	p1777	p1781	p1786
TNV15	p1752	(ND)	(ND)	(ND)
TNV148p1753	p1778	p1782	p1787
TNV148Bp1760	p1779	p1783	p1788
TNV196 p1754	(ND)	(ND)	(ND)	1
	Plasmídeo ID	Plasmídeo ID	Plasmídeo ID
	de vetor pBC	Intermediário	de Expressão
Cadeias feves
TNV14	p1748	p1755	p1775
TNV15	p1748	p1755	p1775
TNV148	p1749	p1756	p1776
TNV196	p1749	p1756	p1776

Os produtos de PCR de cadeia leve foram digeridos com enzimas de restrição Sall e Sacll e em seguida clonados entre os sítios Sall e Sacll do plasmídeo pBC. As duas diferentes versões de cadeia leve, que diferiram por um aminoácido, foram designadas p1748 e p1749 (Tabela 2). A análise de seqüência de DNA confirmou que estes constructos tinham as seqüências corretas. Os fragmentos de Sall / Aflll em p1748 e p1749 foram em seguida clonados entre os sítios Sall e Aflll do vetor intermediário p1746 para preparar p1755 e p1756, respectivamente. Estas metades 5' dos genes de cadeia leve foram então ligadas às metades 3' do gene transferindo-se os fragmentos BsiWI / Aflll de p1755 e p1756 para o constructo recentemente preparado p1762 para formar os plasmídeos de expressão final p1775 e p1776, respectivamente (Tabela 2).

118

Transfecções, Avaliações e Subclonaqem de Célula.

Um total de 15 transfecções de células de mieloma de camundongo foi realizado com os vários plasmídeos de expressão TNV (veja a Tabela 3 na seção Resultados e Discussão). Estas transfecções foram distinguidas por se (1) as células hospedeiras eram Sp2/0 ou 653; (2) a região constante de cadeia pesada foi codificada pelo vetor lgG1 anterior de Centocor ou a região constante de cadeia pesada 12B75; (3) o mAb foi TNV148B, TNV148, TNV14 ou uma nova combinação HC/LC; (4) se o DNA foi plasmídeo linearizado ou inserção de gene Ab purificado; e (5) a presença ou ausência da seqüência de íntron J-C completa no gene de cadeia pesada. Além disso, diversas transfecções foram repetidas para aumentar a probabilidade de que um grande número de clones pudesse ser analisado.

As células Sp2/0 e células 653 foram cada qual transfectada com uma mistura de DNA de cadeia pesada e leve (8-12 :g cada) por eletroporação sob condições padrão como previamente descrito (Knight DM e outro (1993) Molecular Im mu noiogy 30: 1443 - 1453). Para os números de transfecção 1,2, 3 e 16, os plasmídeos de expressão apropriados foram linearizados por digestão com uma enzima de restrição antes da transfecção. Por exemplo, as enzimas de restrição Sall e Notl foram empregadas para linearizar o plasmídeo p1783 de cadeia pesada TNV148B e o plasmídeo p1776 de cadeia leve, respectivamente. Para as transfecções restantes, as inserções de DNA que continham apenas o gene mAb foram separadas do vetor de plasmídeo por digestão dos plasmídeos de cadeia pesada com BamHI e plasmídeos de cadeia leve com BsiWI e Notl. As inserções de gene mAb foram então purificadas por eletroforese de gel de agarose e resinas de purificação Qiex. As células transfectadas com inserções de gene purificadas foram simultaneamente transfectadas com 3 a 5 :g de plasmídeo pSV2gpt linearizado por Pstl (p13) como uma fonte de marcador selecionável. Seguindo a eletroporação, as células foram semeadas em pratos de cultura de tecido de cavidade 96 em IMDM, 15% de FBS, 2 mM de glutamina e incubadas a 37°C em um incubador de CO₂ a 5%. Dois dias depois, um volume igual de IMDM, 5% de FBS, 2 mM de glutamina, 2 X de seleção de

119

ΜΗΧ (1Χ ΜΗΧ = 0,5 :g/ml de ácido micofenólico, 2,5 :g/ml de hipoxantina, 50 :g/ml de xantina) foi adicionado e as placas incubadas durante um adicional de 2 a 3 semanas enquanto as colônias formavam-se.

Os sobrenadantes celulares coletados de cavidades com colônias foram ensaiados quanto a IgG humana por ELISA como descrito. Em resumo, as diluições variantes dos sobrenadantes celulares foram incubadas em placas de EIA de cavidade 96 revestidas com fragmento de Fc de IgG anti-humano de cabra policlonal e em seguida o IgG humano solto foi detectado empregando-se IgG (H+L) anti-humano de cabra conjugado por Fosfatase Alcalina e os substratos de cor apropriados. As curvas padrão, que empregaram como padrão o mesmo mAb purificado que estava sendo avaliado nos sobrenadantes celulares, foram incluídas sobre cada placa de EIA para possibilitar a quantificação do IgG humano nos sobrenadantes. As células naquelas colônias que pareceram estar produzindo o IgG mais humano foram passadas em placas de cavidade 24 para determinações de produção adicional em culturas usadas e os clones origem de produção mais elevada foram subseqüentemente identificados.

Os clones origem de produção mais elevada foram subclonados para identificar os subclones de produção mais elevada e preparar uma linhagem de célula homogênea. As placas de cultura de tecido de cavidade 96 foram semeadas com uma célula por cavidade ou quatro células por cavidade em de IMDM, 5% de FBS, 2 mM de glutamina, 1 X MHX e incubadas a 37°C em um incubador de CO₂ a 5% durante 12 a 20 dias até as colônias ficarem aparentes. Os sobrenadantes celulares foram coletados de cavidades que continham uma colônia por cavidade e analizadas por ELISA como acima descrito. As colônias selecionadas foram passadas para placas de cavidade 24 e as culturas deixadas descansar antes de identificar os subclones de produção mais elevada por quantificação dos níveis de IgG humano em seus sobrenadantes. Este processo foi repetido quando subclones do primeiro ciclo selecionados foram submetidos a um segundo ciclo de subclonagem. Os melhores subclones do segundo cicio foram selecionados com as cepas celulares para desenvolvimento.

120

Caracterização de Subclones de Célula

Os melhores subclones do segundo ciclo foram escolhidos e as curvas de crescimento realizadas para avaliar os níveis de produção de mAb e as características de desenvolvimento. Os frascos T75 foram semeados com 1 X 10⁵ células / ml em 30 ml de IMDM, 5% de FBS, 2 mM de glutamina, e 1 X MHX (ou meio sem soro). Alíquotas de 300 ml foram tomadas em intervalos de 24 horas e a densidade de célula viva determinada. As análises continuaram até o número de células vivas ficar menor do que 1 X 10⁵ células/ml. As alíquotas coletadas de sobrenadantes celulares foram ensaiadas quanto à concentração de anticorpo presente. Os ensaios ELISA foram realizados empregando-se como padrão rTNV148B ou rTNV14 JG92399. As amostras foram incubadas durante 1 hora sobre placas ELISA revestidas com Fc de IgG anti-humano de cabra policlonal e mAb ligado detectado com IgG (H+L) anti-humano de cabra conjugado por fosfatase alcalina em uma diluição de 1:1000.

Uma análise de curva de crescimento diferente foi também feita para duas cepas celulares para o propósito de comparar as taxas de crescimento na presença de quantidades variantes de seleção de MHX. As cepas celulares C466A e 466B foram descongeladas em veículos sem MHX (IMDM, 5% de FBS, 2 mM de glutamina) e cultivadas durante dois dias adicionais. Ambas as culturas celulares foram então divididas em tres culturas que continham ou nenhum MHX, 0,2X MHX, ou 1X MHX (1X MHX = 0,5 :g/ml de ácido micofenólico, 2.5 :g/ml de hipoxantina, 50 :g/ml de xantina). Um dia depois, os frascos de T75 frescos foram semeados com as culturas em uma densidade de partida de 1 X 10⁵ células/ml e as células contadas em intervalos de 24 horas durante uma semana. Alíquotas para produção de mAb não foram coletadas. Os tempos duplicados foram calculados para estas amostras empregando-se a fórmula fornecida em SOP PD32.025.

Estudos adicionais foram realizados para avaliar a estabilidade de produção de mAb em tempo prolongado. As culturas foram desenvolvidas em placas de cavidade 24 em IMDM, 5% de FBS, 2 mM de glutamina, ou com ou sem seleção de MHX. As culturas foram divididas em culturas

121 frescas assim que elas tornaram-se confluentes e a cultura mais velha foi em seguida deixada despender. Neste momento, uma alíquota de sobrenadante foi tomada e estocada a 4°C. As alíquotas foram tomadas durante um período de 55 a 78 dias. No final deste período, os sobrenadantes foram testados quanto à quantidade de anticorpo presente pelo ELISA de Fc de IgG antihumano como abaixo resumido.

Resultados e Discussão

Inibição de Ligação de TNF a Receptor Recombinante.

Um ensaio de ligação simples foi realizado para determinar se os oito mAbs de TNV contidos em sobrenadante celular de hibridoma foram capazes de bloquear a ligação de TNFV ao receptor. As concentrações dos mAbs de TNV em seus sobrenadantes celulares respectivos foram primeiro determinadas por análise ELISA padrão para IgG humano. Uma proteína de fusão de IgG/receptor de TNF de p55 recombinante, p55-sf2, foi então re15 vestida sobre placas de EIA e o TNFV rotulado por ¹²⁵l deixado ligar-se ao receptor p55 na presença de quantidades variantes de mAbs de TNV. Como mostrado na Figura 1, todos os anticorpos, mas um (TNV122) dos oito mAbs de TNV bloqueou eficientemente a ligação de TNFV ao receptor p55. De fato, os mAbs de TNV pareceram ser mais eficazes na inibição da ligação de

TNFV do que o mAb de controle positivo de cA2 que foram trespassados em sobrenadante de hibridoma de controle negativo. Estes resultados foram interpretados como indicação de que era altamente provável que os mAbs de TNV bloqueassem a bioatividade de TNFV em ensaios com base em célula e in vivo e portanto as análises adicionais foram autorizadas.

Análise de Seqüência de DNA

Confirmação de que os RNAs Codificam mAbs Humanos

Como uma primeira etapa em caracterização dos sete mAbs de TNV (TNV14, TNV15.TNV32, TNV86, TNV118, TNV148 e TNV196) que exibiu atividade de bloqueio de TNFV no ensio de ligação de receptor, o RNA total foi isolado das sete linhagens de célula de hibridoma que produz estes mAbs. Cada amostra de RNA foi em seguida empregada para preparar cDNA de cadeia pesada ou leve de anticorpo humano que inclui a seqüên122 cia sinal completa, a seqüência de região variável completa, e parte da seqüência de região constante para cada mAb. Estes produtos de cDNA foram então amplificados em reações de POR e o DNA amplificado por PCR foi diretamente seqüenciado sem primeiro clonar os fragmentos. Os cDNAs de cadeia pesada seqüenciados foram >90% idênticos a um dos cinco genes de linha germinativa humana nos camundongos, DP-46 (Figura 2). Similarmente, os cDNAs de cadeia leve seqüenciados foram ou 100% ou 98% idênticas a um dos genes de linha germinativa humana nos camundongos (Figura 3). Estes resultados de seqüência confirmaram que as moléculas de RNA que foram transcritas no cDNA e seqüenciadas codificaram cadeias pesadas de anticorpo humano e cadeias leves de anticorpo humano. Devese observar que, porque as regiões variáveis foram amplificadas por PCR empregando-se os oligonucleotídeos que mapeiam para a extremidade 5^l da seqüência de codificação de seqüência sinal, alguns dos primeiros aminoácidos da seqüência sinal podem não ser a seqüência real dos produtos de tradução de TNV original porém eles representam as seqüências reais dos mAbs de TNV recombinantes.

mAbs de Neutralização Única

As análises das seqüências de cDNA para as regiões variáveis inteiras de ambas as cadeias pesada e leve para cada mAb revelaram que o TNV32 é idêntico ao TNV15, o TNV118 é idêntico ao TNV14, e TNV86 é idêntico ao TNV148. Os resultados do ensaio de ligação de receptor foram consistentes com as análises de seqüência de DNA, isto é, ambos TNV86 e TNV148 foram aproximadamente 4 vezes melhores do que ambos TNV118 e TNV14 no bloqueio da ligação de TNF. Trabalho subsequente foi portanto focalizado sobre apenas os quatro mAbs de TNV único, TNV14, TNV15, TNV148 e TNV196.

Relatividade dos Quatro mAbs

Os resultados da seqüência de DNA revelaram que os genes codificando as cadeias pesadas dos quatro mAbs de TNV foram todos altamente homólogos um ao outro e parecem ser todos derivados do mesmo gene de linha germinativa, DP-46 (Figura 2). Além disso, porque cada das

123 seqüências de CDR3 de cadeia pesada são desse modo similares e do mesmo comprimento, e porque elas todas empregam o éxon J6, elas aparentemente surgem de um evento de reorganização de gene VDJ simples que foi então seguido por mudanças somáticas que produziram cada mAb único. As análises de seqüência de DNA revelaram que existiram somente dois genes de cadeia leve distintos entre os quatro mAbs (Figura 3). As seqüências de codificação de região variável de cadeia leve em TNV14 e TNV15 são idênticas a cada outra e para uma seqüência de linhagem de origem representativa da família Vg/38K de cadeias kappa humanas. As seqüências de codificação de cadeia leve TNV196 e TNV148 são idênticas a cada outra mas diferenciam-se da seqüência de linhagem de origem nas duas posições de nucleotídeo (Figura 3) .

As seqüências de aminoácido deduzidas dos quatro mAbs revelaram a relação dos mAbs atuais. Os quatro mAbs contêm quatro cadeias pesadas distintas (Figura 4) mas somente duas cadeias leves distintas (Figura 5). As diferenças entre as seqüências de mAb TNV e as seqüências de linhagem de origem foram principalmente confirmadas para domínios de GDR nas três das cadeias pesadas de mAb também diferenciaram-se da seqüência de linhagem de origem nas regiões de estrutura (Figura 4). Comparado às regiões de estrutura DP-46 codificados por linhagem de origem Ab, TNV14 era idêntico, TNV15 diferenciava-se por um aminoácido, TNV148 diferenciava-se por dois aminoácidos, e TNV196 diferenciava-se por três aminoácidos.

Clonagem de cDNAs, Mutaqênese específica de sítio, e Montagem de

Plasmídeos de Expressão Final

Clonagem de cDNAs

Baseados na seqüência de DNA das regiões variáveis amplificadas de PCR, novos oligonucleotídeos foram ordenados a desempenhar outro ciclo de amplificação de PCR para o propósito de adaptação da seqüência de codificação a ser clonada nos vetores de expressão. No caso das cadeias pesadas, os produtos deste segundo ciclo de PCR foram digeridos com enzimas de restrição BsiWI e BstBI e clonados em vetor de pias-

124 mídeo L28 (números de identificação de plasmídeo apresentados na Tabela 2). No caso das cadeias leves, os produtos de PCR do segundo ciclo foram digeridos com Sa1l e Af1 II e clonados em vetor de plasmídeo pBC. Os clones individuais foram então seqüenciados para confirmar que suas seqüências eram idênticas à seqüência anterior obtida de seqüenciamento direto de produtos de PCR, que revelam o nucleotídeo mais abundante em cada posição em uma população de moléculas potencialmente heterogênea. Mutagênese específica de sítio para Mudar TNV148

Os mAbs TNV148 e TNV196 foram sendo consistentemente observados para serem quatro vezes mais potentes que o seguinte melhor mAb (TNV14) na neutralização de bioatividade de TNFV. Entretanto, como descrito acima, as seqüências de estrutura de cadeia pesada TNV148 e TNV196 diferenciam-se das seqüências de estrutura de linhagem de origem . Uma comparação da seqüência de cadeia pesada TNV148 a outros anticorpos humanos indicou que muitos outros mAbs humanos contêm um resíduo de lie na posição 28 na estrutura 1 (contando somente seqüência desenvolvida) enquanto o resíduo Pro na posição 75 na estrutura 3 foi um aminoácido fora do comum naquela posição.

Uma comparação similar da cadeia pesada TNV196 sugeriu que os três aminoácidos pelos quais diferem-se da seqüência de linhagem de origem na estrutura 3 podem ser raros em mAbs humanos. Havia uma possibilidade de que estas diferenças pudessem tornar TNV148 e TNV196 imunogênicos se administradas em humanos. Porque TNV148 tinha somente um resíduo aminoácido de concernimento e este resíduo acreditou-se não ser importante para ligação de TNFV, uma técnica de mutagênese específica de sítio foi usada para mudar um nucleotídeo único na seqüência de codificação de cadeia pesada TNV148 (no plasmídeo p1753) de forma que um resíduo Ser de linhagem de origem seria codificado em lugar do resíduo Pro na posição 75. O plasmídeo resultante foi chamado p1760 (ver Tabela 2). Os mAb e gene resultantes foram chamados TNV148B para distinguir do mAb e gene TNV148 originais (ver Figura 5).

125

Montagem de Plasmídeos de Expressão Final

Novos vetores de expressão de anticorpo foram preparados foram baseados nos genes de cadeia leve e cadeia pesada 12B75 previamente clonados como fragmentos genômicos. Ainda que plasmídeos de ex5 pressão TNV diferentes tenham sido preparados (ver Tabela 2), em cada caso as seqüências de flanqueamento 5', promotor, e realçador de íntron derivou dos genes 12B75 respectivos. Para os plasmídeos de expressão de cadeia leve, o íntron de J-C completo, seqüência de codificação de região constante e seqüência de flanqueamento 3' foram também derivados do ge10 ne de cadeia leve 12B75. Para os plasmídeos de expressão de cadeia pesada que resultaram nas linhagens de célula de produção final (p1781 e p1783, ver abaixo), as seqüências de codificação de região de constante IgG 1 humana derivadas de vetor de expressão usado previamente de Centocor (p104). Com importância, as linhagens de célula de produção final re15 latadas aqui expressam um diferente alótipo (Gm(f+)) de mAbs TNV do original, mAbs (G1m(z)) de TNV derivados de hibridoma. Isto é porque o gene de cadeia pesada 12B75 derivou de camundongos de GenPharm que codifica um resíduo Arg no fim do terminal C do domínio de CH1 enquanto que vetor p104 de expressão lgG1 de Centocor codifica um resíduo Lys naquela posição. Outros plasmídeos de expressão de cadeia pesada (por exemplo p1786 e p1788) foram preparados no qual o íntron J-G, seqüência de codificação de região de constante completa e seqüência de flanqueamento 3' foram derivados do gene de cadeia pesada 12B75, mas linhagens de células transfectadas com aqueles genes não foram selecionados como as li25 nhagens de célula de produção. Os vetores foram cuidadosamente projetados para permitirem clonagem de uma etapa de regiões V amplificadas de PCR futuras que resultariam nos plasmídeos de expressão final.

Os cDNAs de região variável amplificada de PCR foram transferidos de vetores L28 ou pBC para estágio intermediário, vetores baseados em 12B75 que fornecem a região de promotor e parte do íntron J-C (ver Tabela 2 para números de identificação de plasmídeo). Os fragmentos de restrição que contêm a metade 5' dos genes de anticorpo foram então transfe-

126 ridos destes vetores de estágio intermediário para os vetores de expressão final que fornecem a metade 3’ dos respectivos genes para formar os plasmídeos de expressão final (ver Tabela 2 para números de identificação de plasmídeo).

Subclonagem e Transfecções de Célula

Os plamídeos de expressão foram ou linearizados por digestão de restrição ou as inserções de gene de anticorpo em cada plasmídeo foram purificados fora das cadeias principais de plasmídeo. As células de mieloma de camundongo Sp2/0 e 653 foram transfectadas com o DNA de cadeia leve e pesada por eletroporação. Quinze diferentes transfecções foram feitas, maioria das quais foram únicas como definido pelas características específicas de Ab, dos genes de Ab, se os genes foram dos plasmídeos todos linearizados ou inserções de gene purificados, e a linhagem de célula hospedeira (sumariado na Tabela 3). Os sobrenadantes de célula de clones resistentes a ácido micofenólico foram analisados para a presença de IgG humano por ELISA e quantificados usando rTNV148B purificado como uma curva padrão referência.

Linhagens de célula rTNV148B de produção Elevada

Dez das cepas parentais 653 de melhor produção de transfecção 2 rTNV148B (produziu 5-10 :g/ml em culturas de cavidades 24 usadas) foram subclonados para avaliar quanto as linhagens de célula produziram a mais e para preparar uma população de célula mais homogênea. Dois dos subclones da cepa parental 2.320, 2.320-17 e 2.320-20, produziram aproximadamente 50 :g/ml em culturas de cavidades 24 usadas, que foram 5 vezes aumentados sobre sua cepa parental. Um segundo ciclo de subclonagem de cepas subclonadas 2.320-17 e 2.320-20 foi induzido .

Tabela 3. Sumário de Transfecções de Célula.

Os números de identificação dos plamídeos de cadeia leve e pesada que codificam cada mAb são mostrados. No caso de transfecções feitas com acréscimos de gene mAb purificado, plasmídeo p13 (pSV2gpt) foi incluído como uma fonte do marcador selecionável de gpt. As regiões constantes de cadeia pesada foram codificadas ou pelo mesmo vetor de

127 expressão lgG1 humano usado para codificar Remicade (‘antigo’) ou peias regiões constantes contidas dentro do gene (‘novo’) de cadeia pesada 12B75 (GenPharm/Medarex). H1/L2 refere-se a um novo mAb constituído da cadeia pesada TNV14 e da cadeia leve TNV148. Os plasmídeos p1783 e p1801 diferem-se somente por quanto do íntron J-C seus genes de cadeia pesada contêm. Os números de transfecção, que definem o primeiro número dos nomes genéricos para clones de célula, são mostrados na direita. As cepas C466 (A, B, C, D) e C467 de célula de produção de rTNV148B descritas aqui derivaram da transfecção número 2 e 1, respectivamente. A cepa

C476A de célula de produção de rTNV14 derivou da transfecção número 3.

mAb	Plasmídeos HC/LC/gpt	HC vetor	DNA formato	Transfecção N° Sp2/0 653
rTNV148B	1783/1776	antigo	linear	1 2
rTNV14	1781/1775	antigo	linear	3
rTNV14	3,27-1	C476 A	Sp2/0	19:g/mi

Caracterização de Linhagens de célula Subclonada

Para caracterizar mais cuidadosamente características de desenvolvimento de linhagem de célula e determinar níveis de produção de mAb em uma escala maior, análises de curvas de crescimento foram exe15 cutadas usando culturas de T75. Os resultados mostraram que cada uma das quatro série C466 de linhagens de célula alcançaram pico de densidade de célula entre 1,0 X 10⁶ e 1,25 X 10⁶ células/ml e níveis de acumulação de mAb máxima entre 110 e 140 :g/ml (Figura 7). Em contraste, a melhor produção de subclone Sp2/0, C467A, alcançou pico de densidade de célula de

2,0 X 10⁶ células/ml e níveis de acumulação de mAb máxima de 25 :g/ml (Figura 7). Uma análise da curva de crescimento não foi feita na linhagem de célula de produção de rTNV14, C476A.

Uma análise da curva de crescimento adicional foi feita para comparar as taxas de crescimento em concentrações diferentes de seleção de MHX. Essa comparação foi sugerida por observações recentes que células C466 cultivadas na ausência de MHX pareceram estar crescendo mais rápido que as mesmas células cultivadas na quantidade normal de MHX

128 (1Χ). Porque as concentrações citotóxicas de compostos tais como ácido micofenólico tendem a ser avaliadas por ordem de magnitude, foi considerado possível que o uso de uma menor concentração de MHX pode resultar em tempos de duplicação de células significativamente mais rápidos sem sacrificar a estabilidade de produção de mAb. As linhagem de célula C466A e C466B foram cultivadas ou em: sem MHX, 0,2X de MHX, ou 1X de MHX. Contagens de célula viva foram feitas em intervalos de 24 horas durante 7 dias. Os resultados revelaram uma taxa de concentração-dependente de MHX de crescimento de célula (Figura 8). Linhagem de célula C466A apresentou um tempo de duplicação de 25,0 horas em 1X de MHX mas somente 20,7 horas em sem MHX. Similarmente, linhagem de célula C466B apresentou um tempo de duplicação de 32,4 horas em 1X de MHX mas somente 22,9 horas em sem MHX. Com importância, os tempos de duplicação para ambas linhagens de célula em 0,2X de MHX foram mais similares ao qual foi observado em sem MHX do que em 1X de MHX (Figura 8). Essa observação eleva a possibilidade que performance de célula realçada em biorreatores, para qual tempos de duplicação são um importante parâmetro, pode ser realizada usando-se menos MHX. Entretanto, embora resultados de teste de estabilidade (ver abaixo) sugiram que linhagem de célula C466D seja capaz de produzir com estabilidade rTNV148B por pelo menos 60 dias mesmo com nenhum MHX presente, o teste de estabilidade também mostrou maiores níveis de produção de mAb quando as células foram cultivadas na presença de MHX comparado à ausência de MHX.

Para avaliar a produção de mAb das várias linhagens de célula durante um período de aproximadamente 60 dias, testes de estabilidade foram desempenhados nas culturas que ou continham, ou não continham, seleção de MHX. Nem todas as linhagens de célula mantiveram alta produção de mAb. Após exatamente duas semanas de cultivo, C466A clone foi produzindo aproximadamente 45% menos que no começo do estudo. A produção de C466B clone também pareceu cair significativamente. Entretanto, C466C e C466D clones mantiveram produção razoavelmente estável, com C466D mostrando os maiores níveis de produção absoluta (Figura 9).

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Conclusão

De uma lista inicial de oito mAbs humanos contra TNFV humano, TNV148B foi selecionado como preferido baseado em vários critérios que incluem seqüência de proteína e potência de neutralização de TNF, assim como TNV14. Linhagens de célula foram preparadas para que produzam mais que 100 :g/ml de rTNV148B e 19 :g/ml rTNV14.

Exemplo 4: Estudo de Camundonqos Artríticos usando Anticorpos Anti-TNF e Controles Usando Injeção de Bolo Única

Com aproximadamente 4 semanas de idade os camundongos de estudo Tg197 foram designados, com base no gênero e peso do corpo, para um dos 9 grupos de tratamento e tratados com uma dose de bolo intraperitoneal única de PBS (D-PBS) de Dulbecco ou um anticorpo anti-TNF da presente invenção (TNV14, TNV148 ou TNV196) a ou 1 mg/kg ou 10 mg/kg. Resultados

Ouando os pesos foram analisados como uma mudança de prédose, os animais tratados com 10 mg/kg de cA2 apresentaram ganho de peso consistentemente maior que os animais tratados com D-PBS durante o estudo. Este ganho de peso foi significante nas semanas 3-7. Os animais tratados com 10 mg/kg de TNV148 também obteve ganho de peso significante na semana 7 do estudo. (Ver Figura 10).

As figuras 11A-C representam a progressão de severidade de doença baseada no índice artrítico. O índice artrítico do grupo tratado com 10 mg/kg de cA2 foi menor então o grupo de controle de D-PBS começou na semana 3 e continuou por todo o restante do estudo (semana 7). Os animais tratados com 1 mg/kg de TNV14 e os animais tratados com 1 mg/kg de cA2 falharam para mostrar significante redução em Al após semana 3 quando comparados ao Grupo tratado com D-PBS. Não houve diferenças significantes entre os grupos de tratamento de 10 mg/kg quando cada um foi comparado aos outros de dose similar (10 mg/kg de cA2 comparado a 10 mg/kg de TNV14, 148 e 196). Guando os grupos de tratamento de 1 mg/kg foram comparados, o 1 mg/kg de TNV148 apresentou um Al significativamente menor que 1 rng/kg de cA2 nas semanas 3,4 e 7. O 1 mg/kg de

130

TNV148 foi também significativamente menor que o Grupo tratado com 1 mg/kg de TNV14 nas semanas 3 e 4. Ainda que TNV196 tenha apresentado significante redução em Al até a semana 6 do estudo (quando comparado ao Grupo tratado com D-PBS), TNV148 foi o único tratamento de 1 mg/kg que permaneceu importante na conclusão do estudo.

Exemplo 5: Estudo de Camundongos Artríticos usando Anticorpos Anti-TNF e Controles como Doses de Bolo Múltiplas

Com aproximadamente 4 semanas de idade os camundongos de estudo Tg197 foram designados, baseados no peso do corpo, para um dos 8 grupos de tratamento e tratados com uma dose de bolo intraperitoneal de artigo de controle (D-PBS) ou anticorpo (TNV14, TNV148) a 3 mg/kg (semana 0). As injeções foram repetidas em todos animais nas semanas 1, 2, 3, e 4. Os grupos 1 -6 foram avaliados para eficácia de artigo de teste. As amostras de soro, obtidas de animais nos Grupos 7 e 8 foram avaliadas para indução de resposta imune e remoção farmacocinética de TNV14 ou TNV148 nas semanas 2, 3 e 4.

Resultados: Nenhuma diferença significante foi observada quando os pesos foram analisados como uma mudança da pré-dose. Os animais tratados com 10 mg/kg de cA2 apresentaram ganho de peso consistentemente maior que os animais tratados com D-PBS durante todo o estudo. (Ver Figura 12).

As figuras 13A-C representam a progressão de severidade de doença baseada no índice artrítico. O índice artrítico de grupos tratados com 10 mg/kg de cA2 foi significativamente menor então o grupo de controle de DPBS começou na semana 2 e continuou durante todo o restante do estudo (semana 5). Os animais tratados com 1 mg/kg ou 3 mg/kg de cA2 e os animais tratados com 3 mg/kg de TNV14 falharam para alcançar qualquer redução significante em Al a qualquer época por todo o estudo quando comparado ao grupo de controle d-PBS. Os animais tratados com 3 mg/kg de TNV148 mostraram uma redução significante quando comparados ao grupo tratado com d-PBS começando na semana 3 e continuando até a semana 5. Os animais tratados com 10 mg/kg de cA2 mostraram uma redução significante em Al quando comparados com ambas doses menores (1 mg/kg

131 tf e 3 mg/kg) de cA2 nas semanas 4 e 5 do estudo e foi também significativamente menor que os animais tratados com TNV14 nas semanas 3-5. Embora pareça não existir diferenças significantes entre qualquer dos grupos de tratamento de 3 mg/kg, os Al para os animais tratados com 3 mg/kg de TNV14 foram significativamente maiores em alguns pontos de tempo que o 10 mg/kg enquanto que os animais tratados com TNV148 não foram significativamente diferentes dos animais tratados com 10 mg/kg de cA2.

Exemplo 6: Estudo de Camundongos Artríticos usando Anticorpos Anti-TNF e Controles como Dose de Bolo Intraperitoneal Única

A aproximadamente 4 semanas de idade os camundongos de estudo Tg197 foram designados, baseados no gênero e peso corporal, para um dos 6 grupos de tratamento e tratados com uma dose de boio intraperitoneal única de anticorpo (cA2, ou TNV148) a ou 3 mg/kg ou 5 mg/kg. Esse estudo utilizou os Grupos de controle de 10 mg/kg de cA2 e D-PBS.

Quando os pesos foram analisados como uma mudança de prédose, todos tratamentos alcançaram ganhos de peso similares. Os animais tratados com ou 3 ou 5 mg/kg de TNV148 ou 5 mg/kg de cA2 ganharam uma quantidade significante de peso anteriormente no estudo (nas semanas 2 e 3). Somente os animais tratados com TNV148 mantiveram ganho de peso significante nos últimos pontos de tempo. Ambos os animais tratados com 3 e 5 mg/kg de TNV148 apresentaram significação em 7 semanas e os animais de 3 mg/kg de TNV148 foram ainda significativamente elevados em 8 semanas pós-injeção. (Ver Figura 14) .

A Figura 15 representa a progressão de severidade de doença baseada no índice artrítico. Todos grupos de tratamento apresentaram alguma proteção nos pontos de tempo anteriores, com o 5 mg/kg de cA2 e o 5 mg/kg de TNV148 apresentando reduções significantes em Al nas semanas 1-3 e todos grupos de tratamento apresentando uma redução significante na semana 2. Mais tarde no estudo os animais tratados com 5 mg/kg de cA2 apresentaram alguma proteção, com reduções significantes nas semanas 4, 6 e 7. A dose fraca (3 mg/kg) de ambos os cA2 e os TNV148 apresentou reduções significantes em 6 e todos grupos de tratamento apresentaram

132 reduções significantes na semana 7. Nenhum dos grupos de tratamento foram capazes de manter uma redução significante na conclusão do estudo (semana 8). Não houve diferenças significantes entre qualquer um dos grupos de tratamento (excluindo o grupo de controle de solução salina) em qualquer ponto do tempo.

Exemplo 7: Estudo de Camundongos Artríticos usando Anticorpos Anti-TNF e Controles como Dose de Bolo Intraperitoneal Única Entre Anticorpo AntiTNF e Anticorpo Anti-TNF Modificado

Comparar a eficácia de uma dose intraperitoneal simples de TNV148 (derivada de células de hibridoma) e rTNV148B (derivada de células transfectadas). Com aproximadamente 4 semanas de idade os camundongos de estudo Tg197 foram designados, baseados no gênero e peso corporal, para um dos 9 grupos de tratamento e tratados com uma dose de bolo intraperitoneal única de Dulbecco S PBS (DPBS) ou anticorpo (TNV148, rTNV148B) a 1 mg/kg.

Quando os pesos foram analisados como uma mudança de prédose, os animais tratados com 10 mg/kg de cA2 apresentaram um ganho de peso consistentemente maior que os animais tratados com D-PBS por todo o estudo. Esse ganho de peso foi significante nas semanas 1 e semanas 38. Os animais tratados com 1 mg/kg de TNV148 também alcançaram ganho de peso significante nas semanas 5, 6 e 8 do estudo. (Ver Figura 16).

A Figura 17 representa a progressão de severidade de doença baseada no índice artrítico. O índice artrítico dos grupos tratados com 10 mg/kg de cA2 foi menor então o grupo de controle de D-PBS começou na semana 4 e continuou durante todo o estudo restante (semana 8). Ambos dos Grupos tratados com TNV148 e o Grupo tratado com 1 mg/kg de cA2 apresentaram uma redução significante em Al na semana 4. Ainda que um estudo prévio (p-099-017) tenha apresentado que TNV148 foi um pouco mais efetivo na redução do índice Artrítico seguindo um bolo intraperitoneal de 1 mg/kg único, esse estudo mostrou que o Al de ambas versões dos grupos tratados com anticorpo TNV foi um pouco maior. Ainda que (com a exceção da semana 6) o Grupo tratado com 1 mg/kg de cA2 não tenha sido

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significativamente aumentado quando comparado ao grupo de 10 mg/kg de cA2 e os Grupos tratados com TNV148 tenham sido significativamente maiores nas semanas 7 e 8, não houve diferenças significantes em Al entre o 1 mg/kg de cA2, 1 mg/kg de TNV148 e 1 mg/kg de TNV148B em qualquer ponto do estudo.

Está claro que a invenção pode ser praticada de outra forma do que como particularmente descrito nos exemplos e descrição antecedentes.

Numerosas modificações e variações da presente invenção são possíveis devido aos ensinamentos acima e, então, incluem-se no escopo das reivindicações anexadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO:16 e uma região variável de cadeia leve tendo se5 quência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO:17.
2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido na reivindicação 1, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

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Concentração de Mab (ng/ml) “Ο-TNV 14 TNV 15

-^-TNV122 -°-TNV148 —O-TNV196 -«-cA2 (trespassado) -X-Surp. de controle