BR112020001060A2 - variantes de trem2 resistentes a shedase - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a métodos e composições relacionados com mutantes de trem2 resistentes a clivagem por shedase, por exemplo, mutantes de trem2 humano resistentes a clivagem por shedase e ácidos nucleicos codificando tais mutantes de trem2 resistentes a clivagem por shedase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES DE TREM2 RESISTENTES A SHEDASE".
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada a título de referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada a 20 de julho de 2018, é denominada PATO57836-WO- PCT SL.txt e tem um tamanho de 60.538 bytes.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente invenção refere-se a métodos e composições relacionados com mutantes de TREM? resistentes a clivagem por shedase, por exemplo, mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase, e ácidos nucleicos codificando tais mutantes de TREM? resistentes a clivagem por shedase.
ANTECEDENTES
[003] Receptores “desencadeadores expressos em células mieloides ou "TREM" são um grupo de glicoproteínas transmembrana que são expressas em diferentes tipos de células mieloides, tais como mastócitos, monócitos, macrófagos, células dendríticas e neutrófilos. Os TREM têm um dobramento do tipo imunoglobulina (lg) em seu domínio extracelular e, assim, pertencem à superfamília de imunoglobulinas (I9SF). Os receptores TREM contêm um domínio intracelular curto, mas estão desprovidos de motivos de ancoragem para mediadores da sinalização e requerem proteínas adaptadoras, tais como DAP12 (proteína ativadora de DNAX de 12 kDa), para ativação celular. Foram relatados dois membros de TREM: TREM1 e TREM2, sendo que ambos desempenham um papel importante em respostas imunes e inflamatórias.
[004] O TREM? é expresso em macrófagos, células dendríticas, osteoclastos, microglia, células epiteliais do pulmão e células de hepatocarcinoma, mas está ausente de células mieloides no sangue. O TREM? se associa fisicamente a DAP12, que atua como proteína adaptadora de sinalização para TREM?2 e alguns outros receptores da superfície celular. O domínio citoplasmático de DAP12 contém um motivo de ativação baseado em tirosina do imunorreceptor (ITAM) (Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027—-33036, 2013). Após ativação do receptor de interação, DAP12 sofre fosforilação nos dois resíduos tirosina de ITAM conservados por Src cinases. Recrutamento e ativação subsequentes da proteína cinase Syk desencadeiam vias de sinalização a jusante, incluindo a ativação de proteína cinase ativada por mitógenos (MAPK) e fosfolipase Cy (PLCy).
[005] O TREM? pode ser ativado por lipopolissacarídeos (LPS), proteína de choque térmico 60, detritos neuríticos, bactérias e uma série ampla de lipídeos aniônicos e zwiteriônicos, por exemplo, ácido fosfatídico (PA), fosfatidilalicerol (PG), fosfatidilserina (PS), fosfatidilinosito! (PI), fosfatidilcolina (PC) e esfingomielina. A ativação do TREM?2 aumenta a capacidade fagocítica de microglia e macrófagos, reduz a liberação de citocinas pró-inflamatórias e limita a sinalização por TLR. O TREM? sustenta a sobrevivência microglial por sinergia com sinalização do receptor de CSF-1. Além disso, o TREM2 interage com Plexina-A1 regulando a adesão e motilidade celulares. A sinalização de TREM? facilita a degradação de presa ingerida e é crucial para o metabolismo de lipídeos, captação de mielina e degradação intracelular.
[006] O TREM? sofre processamento proteolítico sequencial por liberação do ectodomínio e proteólise intramembrana (Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027-33036, 2013). Durante a liberação do ectodomínio, o ectodomínio de TREM? é liberado por proteases tais como membros da família ADAM (uma proteína contendo domínios de desintegrina e metaloproteinase) ou BACE (enzima de clivagem do sítio b de APP) (Kleinberger, Sci Trans/ Med. 2014; 6(243):243ra86). Após remoção do ectodomínio, o fragmento remanescente retido na membrana é adicionalmente processado por proteólise intramembranosa mediada por y-secretase. Fragmentos solúveis de TREM2 (sSTREM2) produzidos por liberação do ectodomínio foram observados em sobrenadantes de culturas de células dendríticas bem como em amostras de plasma e CSF de pacientes com doenças neurológicas não inflamatórias e esclerose múltipla (Kleinberger, 2014). O ectodomínio liberado de TREM2 (sSTREM2) em CSF humano foi avaliado como potencial biomarcador de doença de Alzheimer (AD) e foi mostrado que está aumentado durante o envelhecimento em geral (Suarez-Calvet, EMBO Molecular Medicine 8, 466-476, 2016). Análise detalhada durante a progressão de AD revelou que STREM2 aumenta precocemente em AD antes do aparecimento de sintomas clínicos, atinge o pico em MCI-AD e permanece elevado mas a níveis menores em comparação com o estágio MCI-AD em demência por AD (Suarez- Calvet, 2016).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] São proporcionados aqui mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase (por exemplo, mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por ADAM1I7 ou ADAM1O), ácidos nucleicos codificando mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase e vetores e células contendo tais ácidos nucleicos. Também são proporcionados aqui métodos para aumentar a expressão de TREM2 em um indivíduo e métodos para tratar uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo por uso de ácidos nucleicos codificando mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase ou vetores e células contendo tais ácidos nucleicos.
[008] Em um aspecto, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase (por exemplo, mutante de TREMZ2 humano resistente a clivagem por DAM17 ou ADAM1O).
[009] Em algumas modalidades, o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades, o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades, o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades, o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades, o mutante de TREM2 humano compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades, o mutante de TREM2 humano compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48.
[0010] Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 67-74. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 67-69. Em algumas modalidades, — são proporcionados aqui ácidos —nucleicos compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 67, 70 ou 74. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO: 67.
[0011] Em algumas modalidades, tais ácidos nucleicos podem compreender um promotor, por exemplo, um promotor constitutivo, um promotor induzível, um promotor sintético ou um promotor específico para tipos de células. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para tipos de células. Por exemplo, o promotor pode guiar a expressão de ácidos nucleicos especificamente em microglias, macrófagos ou células dendríticas. Em algumas modalidades, tais ácidos nucleicos compreendem um promotor selecionado de um promotor de TREM2, promotor de TMEM119, promotor de Hexb, promotor de IBA1, promotor de CD45, promotor de CD11b, promotor de Cst7, promotor de Lpl, promotor de Csf1, promotor de Cs1R, promotor de Itgax, promotor de Clec7a, promotor de Lilrb4, promotor de Tyrobp, promotor de Ctsb, promotor de Ctsd, promotor de B2m, promotor de Lyz2, promotor de Cx3cr1i, promotor de Cst3, promotor de Ctss, promotor de P2ry12, promotor de Ciga ou promotor de C1iqb. Em algumas modalidades, tais ácidos nucleicos compreendem um promotor de TREM2. Em algumas modalidades, tais ácidos nucleicos podem compreender um sinal de poliadenilação.
[0012] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase podem compreender adicionalmente uma segunda sequência codificando uma proteína DAP12. Em algumas modalidades, tais ácidos nucleicos compreendem um sítio interno de entrada do ribossomo a montante da segunda sequência. Em algumas modalidades, tais ácidos nucleicos compreendem uma sequência 2A a montante da segunda sequência, por exemplo, uma sequência 2A selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 52-66. A proteína DAP12 pode compreender a SEQ ID NO: 49. Em algumas modalidades, a proteína DAP12 consiste na SEQ ID NO:
49.
[0013] Em outro aspecto são proporcionados aqui vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase. Tais vetores podem ser um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um cosmídeo ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral que é selecionado de um vetor baseado em qualquer um dos seguintes vírus: lentivírus, adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), Vírus Herpes Simplex (HSV), parvovírus, retrovírus, vírus vacínia, vírus Sinbis, vírus influenza, reovírus, vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus do sarampo, vírus da estomatite vesicular (VSV), poliovírus, poxvírus, vírus do Vale de Seneca, coxsackievírus, enterovírus, vírus Mixoma ou vírus Marabá. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de AAV. Em algumas modalidades, o vetor também compreende um marcador selecionável.
[0014] Em outro aspecto, são proporcionadas aqui células compreendendo um ácido nucleico ou um vetor que compreende uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase. Tais células podem ser um macrófago, uma célula dendrítica ou uma microglia. Em algumas modalidades, a célula pode expressar um marcador detectável.
[0015] Em um aspecto adicional são proporcionados aqui polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Também são proporcionados polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48.
[0016] Em um aspecto adicional são proporcionados aqui métodos para aumentar a expressão de TREM2 em um indivíduo (por exemplo, um humano) por administração ao indivíduo de qualquer um dos ácidos nucleicos, vetores ou células descritos aqui. O indivíduo pode ter uma doença ou distúrbio relacionado com TREM?2. Tais ácidos nucleicos, vetores ou células podem ser administrados ao indivíduo por uma via intravenosa, intracraniana, intratecal, subcutânea ou intranasal. Os métodos podem compreender adicionalmente administrar ao indivíduo um segundo agente.
[0017] Em um aspecto adicional são proporcionados aqui métodos para tratar uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo (por exemplo, um humano) em sua necessidade, o método compreendendo administrar ao indivíduo qualquer um dos ácidos nucleicos, vetores ou células descritos aqui. Tais ácidos nucleicos, vetores ou células podem ser administrados ao indivíduo por uma via intravenosa, intracraniana, intratecal, subcutânea ou intranasal. Os métodos podem compreender adicionalmente administrar ao indivíduo um segundo agente.
[0018] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM2 é uma doença neuroinflamatória ou neurodegenerativa selecionada de doença de Alzheimer, demência frontotemporal, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Nasu-Hakola, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica (ALS), encefalite antirreceptor de NMDA, autismo, lúpus cerebral (NP-SLE), neuropatia periférica induzida por quimioterapia (CIPN), neuralgia pós-terapêutica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, Síndrome de Guillain-Barré (GBS), miosite de corpos de inclusão, doenças de depósito lisossômico, lipidose de esfingomielina (Niemann- Pick C), mucopolissacaridose 11/ IIIB, leucodistrofia metacromática, neuropatia motora multifocal, Miastenia Gravis, Doença de Neuro- Behcet, neuromielite óptica (NMO), neurite óptica, polimiosite, dermatomiosite, encefalite de Rasmussen, Síndrome de Rett, derrame cerebral, mielite transversa, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, encefalite viral ou meningite bacteriana: Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM? é doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM?2 é demência frontotemporal.
[0019] Em algumas modalidades, os métodos descritos aqui podem compreender adicionalmente avaliar o nível de TREM2 humano da superfície celular em uma amostra (por exemplo, uma amostra de fluido cerebrospinal) obtida de um indivíduo. O nível de TREM2 humano da superfície celular em uma amostra pode ser determinado por um ensaio selecionado de citometria de fluxo, imuno-histoquímica, transferência Western, ensaio imunofluorescente, radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), fluorescência resolvida no tempo em formato homogêneo (HTRF) ou tomografia por emissão de pósitrons (PET).
[0020] Também estão incluídos usos dos ácidos nucleicos, vetores, células ou polipeptídeos descritos aqui para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo. Também são contemplados usos dos ácidos nucleicos, vetores, células ou polipeptídeos descritos aqui na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0021] A FIG. 1A mostra um alinhamento exemplificativo das sequências de aminoácidos da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 1), isoforma 1 de TREM2 Cyno (SEQ ID NO: 5) e isoforma 1 de TREM? de camundongo (SEQ ID NO: 6). A região de tronco de TREM2 inclui os resíduos sombreados a cinzento claro. O domínio transmembrana de TREM? inclui os resíduos sublinhados. A FIG. 1B mostra um alinhamento exemplificativo das sequências de aminoácidos da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 1), isoforma 2 (SEQ ID NO: 3) e isoforma 3 (SEQ ID NO: 4). A FIG. 1€ mostra um alinhamento exemplificativo das sequências de aminoácidos das regiões de tronco da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 89), isoforma 2 (SEQ ID NO: 8) e isoforma 3 (SEQ ID NO: 9). A FIG. 1D mostra um alinhamento exemplificativo das sequências de aminoácidos das regiões de tronco da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 7), isoforma 1 de TREM2 Cyno (SEQ ID NO: 10) e isoforma 1 de TREM2 de camundongo (SEQ ID NO: 11). A FIG. 1E ilustra a estrutura de TREM?2 e sua interação com a proteína adaptadora de sinalização DAP12. O TREM2 maduro inclui um único domínio de imunoglobulina (I9SF), uma região de tronco, um domínio transmembrana (TM), e um domínio citoplasmático.
[0022] As FIGs. 2A-2E mostram que ADAM 17 é a principal shedase para a clivagem do ectodomínio de TREM2 em células CHO-hDAP12- hTREM2 e macrófagos M2A humanos. As FIGs. 2A-2B mostram expressão na superfície celular de TREM2 em CHO-hDAP12-hTREM2 após tratamento com inibidores de ADAM DPC333 (círculo negro) ou GI254023 (triângulo ascendente); tratamento adicional com forbol- miristato-ácido (PMA) foi aplicado na FIG. 2B. As FIGs. 2C-2D mostram expressão na superfície celular de TREM2 em macrófagos M2A humanos após tratamento com inibidores de ADAM DPC333 (círculo negro) ou GI254023 (triângulo ascendente); tratamento adicional com PMA foi aplicado na FIG. 2D. A coloração na superfície celular de TREM? é representada graficamente como intensidades médias corrigidas quanto à coloração nuclear como média + E.P. (n=3). É mostrada uma experiência representativa de duas experiências. A FIG. 2E é um gráfico de linhas mostrando inibição de ADAM1O0 e ADAM17 recombinantes por DPC333 e GI254023 in vitro em tampão Hepes a pH 7,5.
[0023] As FIGs. 3A-3D são gráficos de barras mostrando que células THP1 TREM2 nocautes em ADAM17 mas não em ADAM1O exibem expressão acrescida de TREM?2 e redução de TREM? liberado (STREM2). A FIG. 3A mostra expressão na superfície celular de TREM2 em clones de células CRISPR THP1. A FIG. 3B mostra o nível de STREM?2 de sobrenadantes de clones de células CRISPR THP1 C. Os dados estão representados graficamente como média + E.P. (n=2). * p < 0,01, diferença estatística para grupo não tratado do clone gRNA Ctrl. t p < 0,01, diferença estatística para grupo tratado com PMA do clone gRNA Ctrl. RNA Ctrlg é clone transfectado com gRNA de controle; AD10 H4 é clone nocaute por CRISPR em ADAM1O; AD17 G12 é clone nocaute por CRISPR em ADAM17. A FIG. 3C mostra ausência de expressão de ADAM10 no clone CRISPR THP1 ADAM10O H4. Painel da esquerda clone de controle gRNA Ctrl; painel da direita clone AD10 H4. A FIG. 3D é uma análise de transferência Western representativa do clone de controle THP1 gRNA Ctrl (via 1) e células CRISPR ADAM1I7 AD17 G12 (via 2), mostrando ausência de expressão de ADAM17 no clone CISPR THP1 ADAM17 G12.
[0024] As FIGs. 4A-4D mostram que a extensão de aminoácidos na parte próxima da membrana da região de tronco de TREM?2 é importante para a liberação. A FIG. 4A mostra a sequência de aminoácidos da parte próxima da membrana da região de tronco de TREM2 humano de tipo selvagem ou mutante. Numeração de aminoácidos de acordo com iProt Q9NZC?2. TM: região transmembrana. Intervalos indicam aminoácidos deletados no respectivo mutante. Aminoácidos trocados a negrito. Aminoácidos sublinhados indicam o principal sítio de clivagem por shedase para a geração do terminal C do ectodomínio de TREM2. Como mostrado da Tabela 4, TS: SEQ ID NO: 12; TRUNC3 (deleção 159-174): SEQ ID NO: 13; TRUNC1: SEQ ID NO: 14; T2del 3-8: SEQ ID NO: 15; T2del 6-11: SEQ ID NO: 16; T2del 11-16: SEQ ID NO: 17; T2-YGG: SEQ ID NO: 18; T2-WFR: SEQ ID NO: 19; T2-duplo: SEQ ID NO: 20; T2-IPD: SEQ ID NO: 21; T2-IPP: SEQ ID NO: 22, T2-IDP: SEQ ID NO: 23. A FIG. 4B é um gráfico de barras mostrando análise por FACS de TREM?2 TS e mutantes transientemente expressos em células HEK293-FT. As células foram tratadas 48 horas após a transfecção com 50 ng/ml de PMA ou DMSO 0,05%. As células foram separadas,
etiquetadas com antissoro AF1828 e analisadas por citometria de fluxo. Os dados estão representados graficamente como a razão entre não tratadas e tratamento com PMA para cada mutante como média + E.P. (n=3). As diferenças estatísticas para TS foram calculadas por Anova com teste de múltiplas comparações de Dunnett. *P < 0,01. A FIG. 4C é um gráfico de barras mostrando ativação genética pelo mutante duplo em TREM2 como mostrado na FIG. 44. O mutante duplo em TREM? foi expresso de modo estável em células BWZ-lacZ-mDAP12. As células foram semeadas em um anticorpo monoclonal ativador ou controle de isótipo e a atividade do gene repórter foi avaliada passadas 16 h. Os dados estão representados graficamente como a razão de RGA para Ab ativador/de controle como média + E.P. (n=3). A FIG. 4D é um gráfico de barras mostrando que a substituição dos três aminoácidos no sítio de clivagem por shedase aumenta fortemente a expressão na superfície celular de TREM2. Análise por FACS de TREM2 TS e mutantes transientemente expressos em células HEK293-FT. As células foram tratadas 48 h após a transfecção com 50 ng/ml de PMA ou DMSO 0,05%. As células foram separadas, etiquetadas com antissoro AF1828 e analisadas por citometria de fluxo. Os dados estão representados graficamente como a razão entre não tratadas e tratamento com PMA para cada mutante como média + E.P. (n=3). As diferenças estatísticas foram calculadas por Anova com teste de múltiplas comparações de Dunnett. *P < 0,01.
[0025] As FIGs. 5A-5E mostram que ADAM17 procede à clivagem de peptídeos na região de tronco de TREM?2 in vitro em H157-S8158. À FIG. 5A mostra as sequências de aminoácidos dos peptídeos sintéticos derivados da região de tronco de TREM2 para ensaios de clivagem in vitro. Todos os peptídeos foram obtidos com uma cauda fluorescente de 7-metoxicumarina (Mca) N-terminal no terminal C. Aminoácidos sublinhados indicam o principal sítio de clivagem por shedase. AA112-
171: SEQ ID NO: 24; Peptídeo 1: SEQ ID NO: 25; Peptídeo 2: SEQ ID NO: 26; Peptídeo 3: SEQ ID NO: 27; Peptídeo 1a: SEQ ID NO: 28; Peptídeo 2a: SEQ ID NO: 29; Peptídeo 4: SEQ ID NO: 30; Peptídeo 5: SEQ ID NO: 31; Peptídeo 6: SEQ ID NO: 32. A FIG. 5B mostra análise por HPLC da clivagem do Peptídeo 3 (10 uM) por ADAM17 (31 nM) para 1, 5, ou 24 horas. A FIG. 5C mostra análise por HPLC da clivagem do Peptídeo 3 (10 UM) por ADAM17 (31 nM) para 48 horas, com identificação do produto maioritário e 2 produtos minoritários. A FIG. 5C divulga as SEQ ID NOS 83, 51 e 84, respectivamente, por ordem de aparecimento. A FIG. 5D mostra o decurso temporal da clivagem por ADAM17 do Peptídeo 1, Peptídeo 2, ou Peptídeo 3 (média de 2 experiências). A FIG. 5E mostra o decurso temporal da clivagem por ADAM17 do Peptídeo 4, Peptídeo 5, ou Peptídeo 6 (média de 2 experiências).
[0026] A FIG. 6A mostra a identificação do terminal C do ectodomínio de TREM?2 liberado de células HEK-FT transientemente transfectadas com TREM2 humano TS ou R47H (SEQ ID NO: 85) e DAP12. Extratos iônicos do íon peptídico 3 vezes carregado [D137- H157], m/2 791,94-792,06. O íon peptídico de interesse está claramente presente em todos os quatro digestos trípticos de TREM?2 liberado (extrato iônico dentro de caixa). * representa um peptídeo desconhecido presente como um íon 5 vezes carregado e ** é a forma desaminada do mesmo peptídeo. A FIG. 6B mostra o espectro de MSF desconvoluído do peptídeo D137-H157 (SEQ ID NO: 85). O painel de cima indica que os íons dos fragmentos b e y estão identificados. Este espectro de massa é do digesto tríptico de TREM2 R47H PMA.
[0027] A FIG. 7 mostra a identificação do ectodomínio de TREM2 liberado de células HEK-FT transientemente transfectadas com hTREM2 R47H TS ou mutante e hDAP12. Espectros de massa desconvoluídos de 4 espectros de massa: o hTREM?2 [19-157] liberado está claramente presente em todos os quatro extratos de sobrenadantes celulares. Os sobrenadantes celulares haviam sido tratados com PNGase-F e Sialidase A após purificação por afinidade, mas não reduzidos.
[0028] As FIGs. 8A-8C mostram a determinação de sítio(s) de O- glicosilação dentro da região de tronco de TREM2. TREM2-His foi primeiramente tratado com Sialidase A, então reduzido, alquilado, subsequentemente tratado com PNGase-F. A amostra resultante foi então digerida por tripsina ou por enzima Asp- e Glu-C. Os digestos foram analisados por LC-MSFE. FIG. 8A: Espectro de massa desconvoluído, varreduras combinadas: 1926:2097 (SEQ ID NO: 86). FIG. 8B: Espectro de massa desconvoluído, varreduras combinadas: 1566:1584 (SEQ ID NO: 87). FIG. 8C: Espectro de massa desconvoluído, varreduras combinadas: 1373:1477 (SEQ ID NO: 88).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0029] São proporcionados aqui mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase (por exemplo, mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por ADAM1I7 ou ADAM1O), ácidos nucleicos codificando mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase e vetores e células contendo tais ácidos nucleicos. Também são proporcionados aqui métodos para aumentar a expressão de TREM2 em um indivíduo e métodos para tratar uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo por uso de ácidos nucleicos codificando mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase ou vetores e células contendo tais ácidos nucleicos.
[0030] O TREM-2 media a fagocitose não flogística de bactérias e células moribundas e amortece respostas inflamatórias. A perda de função homozigótica de TREM-2 humano causa doença de Nasu- Hakola (osteodisplasia lipomembranosa policística com leucoencefalopatia esclerosante, "PLOSL"), ou síndrome do tipo demência fronto-temporal (FTD), doenças caracterizadas por cistos ósseos, neuroinflamação, neurodegenerescência progressiva e demência pré-senil. Uma mutação de perda de função heterozigótica R47H de TREM-2 também é um fator de risco importante para doença de Alzheimer (AD) com surgimento tardio, com uma dimensão do efeito que é similar à do alelo da apolipoproteína E e4. TREM-2 é expresso na microglia presente na substância branca, hipocampo e neocórtex, o que é parcialmente consistente com as características patológicas relatadas em cérebros com AD, suportando o possível envolvimento de TREM-2 na patogênese de AD. Rastreios genéticos também identificaram agora mutações heterozigóticas de sentido trocado em TREM2 como fatores de risco para doença de Parkinson (PD), esclerose lateral amiotrófica (ALS) e demência fronto-temporal (FTD), para além de AD (Kleinberger, Sci Transl Med. 2 de julho 2014;6(243):243ra86). Assim, TREM-2 funcional é requerido para proteção contra doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas relacionadas com a idade que causam enfraquecimento cognitivo grave e demência.
[0031] Devido a encadeamento alternativo, há três isoformas do TREM2 humano, sendo a isoforma 1 a isoforma mais longa. As sequências de aminoácidos da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 1), isoforma 2 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 3) e isoforma 3 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 4) foram alinhadas na FIG. 1B. O alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões de tronco da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 89), isoforma 2 (SEQ ID NO: 8) e isoforma 3 (SEQ ID NO: 9) revelou que a região de tronco da isoforma 1 de TREM2 humano partilha cerca de 79% de identidade de sequência com a região de tronco das isoformas 2 ou 3 de TREM2 humano (FIG.1C).
[0032] As sequências de aminoácidos da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 1), isoforma 1 de TREM2 Cyno (SEQ ID NO: 5) e isoforma 1 de TREM2 de camundongo (SEQ ID NO: 6) foram alinhadas na FIG.1A. O alinhamento das sequências de aminoácidos das regiões de tronco da isoforma 1 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 7), isoforma 1 de TREM2 Cyno (SEQ ID NO: 10) e isoforma 1 de TREM2 de camundongo (SEQ ID NO: 11) revelou que a região de tronco da isoforma 1 de TREM2 humano partilha 98% de identidade de sequência com a região de tronco da isoforma 1 de TREM2 Cyno e 69% de identidade de sequência com a região de tronco da isoforma 1 de TREM?2 de camundongo (FIG.1D). A FIG. 1E ilustra a estrutura de TREM? e sua interação com a proteína adaptadora de sinalização DAP12. Definições
[0033] Como usado no relatório descritivo e reivindicações, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referências plurais, a menos que o contexto claramente imponha de outro modo. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas.
[0034] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo intervalos, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 0,1. Deve ser entendido, apesar de nem sempre ser explicitamente afirmado, que todas as designações numéricas estão precedidas pelo termo "cerca de". Também deve ser entendido, apesar de nem sempre ser explicitamente afirmado, que os reagentes descritos aqui são meramente exemplos e que equivalentes dos mesmos são conhecidos na técnica.
[0035] Como usado aqui, "TREM2" (também conhecido como "receptor desencadeador expresso em células mieloides 2", TREM-2, TREM2a, TREM2b ou TREM?2c) se relaciona com uma glicoproteína codificada pelo gene TREM2. O TREM2 humano pertence à superfamília de imunoglobulinas (I9SF), e inclui um peptídeo sinal, um único domínio de imunoglobulina do tipo V (IgV), uma região de tronco, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática. O gene TREM?2 humano é mapeado na localização cromossômica 6p21.1, ea sequência genômica do gene TREM2 humano pode ser encontrada no GenBank em NC 000006.12. Devido a encadeamento alternativo há pelo menos três isoformas do TREM2 humano. O termo "TREM2 humano" é usado para se referir a qualquer isoforma de TREM2 humano. As sequências de proteína e mMRNA para a isoforma mais longa do TREM2 humano (isoforma 1) são: Precursor da isoforma 1 do precursor do receptor desencadeador expresso em células mieloides 2 [Homo sapiens] (NP 061838.1)
MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQOGVAGOSLQVSCPYDSMKHWGR RKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGT LTITLRNLAQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAG
DLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAA SALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT (SEQ ID NO: 1) Receptor desencadeador expresso em células mieloides 2 (TREM2) de Homo sapiens, variante de transcrito 1, MRNA (NM 018965.3) gggcagegec tgacatacct gatcctetet tttetacagt teaagggaaa gacgagatet tgcacaaggc actcetactte tacecttgge tagggaagag tagcatagag cceteteegge tgctcatcett actetttate acagagctgt ccggagecca caacaccaca gtgttecagg gcgtageagg ccagteccetg caggtatett geccctatga ctecatgaag cactagggga ggcgcaaggc ctggtgcegc cagctaggag agaagggcecc atgccagegt gtagtcagea cgcacaactt gtggctactg tecttectga ggagatagaa taggagcaca gcecatracag acgataccct gggtagcact ctcaccatta cgctgeggaa tetacaacec catgatgcgg gtctetacca gtgccagage ctecatggea gtgaggctga caccceteagg aaggtectgg tggaggtact ggcagacecce ctggatcace gagatgctgg agatctetag tteccegggg agtctgagag cttegaggat gccecatgtag agcacagcat ctccaggage ctettagaag gagaaatccc cttcccacee acttecatee tictectect ggcctgcatc tttctcatca agattctagc agccagegec ctetaggcta cagcectggca taggacagaag ccagggacac atccacccag tgaactagac tgtggccatg acccagggta tcagetecaa actetgccag ggctgagaga cacgtgaagg aagatgatag gaggaaaage ccaggagaag teccaccagg gaccagecea gectgcatac tigecactta gecaccagga ctecttatte tgctctggca agagactact ctgcctgaac actacttete ctagaccecta gaagcaggga ctagttaagg gagtgagagag gtggtaagaa cacctgacaa cttctgaata ttggacattt taaacactta caaataaatc caagactatc atatttagct ggataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa (SEQ ID NO: 2)
[0036] As sequências de aminoácidos da isoforma 2 de TREM2 humano (SEQ ID NO: 3) e isoforma 3 (SEQ ID NO: 4) são mostradas na FIG. 1B. Em algumas modalidades, a proteína TREM2 também abrange proteínas que têm, ao longo de todo o seu comprimento, pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com quaisquer das SEQ ID No: 1, 3, ou 4, em que tais proteínas ainda têm a ligação de ligantes, sinalização intracelular, facilitação da fagocitose e degradação de material fagocítico, e outras funções reguladoras de TREM2. As sequências de proteínas TREM2 murinas, cyno e de outros animais são conhecidas na técnica (por exemplo, NP 112544.1 e NP 001259007.1 para a proteina TREM2 murina).
[0037] O termo "domínio extracelular" se relaciona com a porção de uma proteína transmembrana que está exposta no lado extracelular de uma bicamada lipídica de uma célula. Métodos para a determinação do ectodomínio de uma proteína são conhecidos na técnica (Singer (1990); High et a/. (1993), e software McVetor, Oxford Molecular). Por exemplo, o domínio extracelular da proteína TREM2 humana pode incluir os resíduos de aminoácidos 14 até 174 de SEQ ID NO: 1 (isoforma 1), os resíduos de aminoácidos 14 até 168 de SEQ ID NO: 3 (isoforma 2) ou os resíduos de aminoácidos 14 até 171 de SEQ ID NO: 4 (isoforma 3).
[0038] O termo "ectodomínio" de TREM?2 se relaciona com uma porção do domínio extracelular de TREM?2 que é liberada após clivagem por shedase.
[0039] O termo "região de tronco" de TREM?2 se relaciona com uma porção do domínio extracelular de TREM2 que conecta o domínio de imunoglobulina do tipo V (IgV) e o domínio transmembrana.
[0040] O termo "domínio transmembrana" se relaciona com a porção de uma proteína transmembrana que abrange a bicamada lipídica de uma célula. Métodos para a determinação do domínio transmembrana de uma proteína são conhecidos na técnica (Elofsson et al. (2007) Annu. Rev. Biochem. 76:125-140; Bernsel et a/. (2005) Protein Science 14:1723-1728).
[0041] Os termos "domínio citoplasmático" e "cauda citoplasmática" são usados indistintamente e se relacionam à porção de uma proteína transmembrana que está no lado citoplasmático da bicamada lipídica de uma célula. Métodos para a determinação da cauda citoplasmática de uma proteína são conhecidos na técnica (Elofsson et al. (2007) e Bernsel et al. (2005)).
[0042] Os termos "mutante de TREM? resistente a clivagem" e "mutante de TREM? resistente a clivagem por shedase" são usados indistintamente aqui e se relacionam com um mutante de TREM2 que alberga uma ou mais mutações perto do sítio de clivagem de uma shedase que procede à clivagem de TREM?2 de tipo selvagem (por exemplo, ADAM17 ou ADAM1O) e, assim, tem clivagem reduzida pela shedase, por exemplo, cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% menos de clivagem pela shedase, em comparação com a proteína TREM2 de tipo selvagem sob as mesmas condições. Um
"mutante de TREM? resistente a clivagem" pode ter liberação reduzida do ectodomínio, por exemplo, cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% menos de liberação do que a proteína TREM2 de tipo selvagem sob as mesmas condições. Tais mutantes de TREM2 resistentes a clivagem podem ter liberação reduzida ao mesmo tempo que retêm funções-chave de TREM2, por exemplo, ainda podem ter a ligação de ligantes, sinalização intracelular, facilitação da fagocitose e degradação de material fagocítico, e outras funções reguladoras de TREM?2.
[0043] Como usado aqui, "DAP12" (também conhecido como TYROBP; KARAP; PLOSL) se relaciona com um polipeptídeo de sinalização transmembrana que contém um motivo de ativação baseado em tirosina do imunorreceptor (ITAM) em seu domínio citoplasmático. As sequências de proteína e MRNA para a isoforma mais longa do DAP12 humano (isoforma 1) são: Precursor da isoforma 1 da proteína de ligação a proteína tirosina cinase TYRO [Homo sapiens] (NP 003323.1)
[0044] MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPG
VLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETES PYQELQAGARSDVYSDLNTORPYYK (SEQ ID NO: 49) Proteína de ligação a proteína tirosina cinase TYRO de Homo sapiens (TYROBP), variante de transcrito 1, MRNA (NM 003332.3)
[0045] agacttccetec ctteacttgc ctggacgctg cgccacatce caceggeccet tacactatgg tgtccagcag catcceggctt cataggagga cttgaacect gcagcaggact cetactectg ccetetectage tagctataag tagtctecgat cctateccagg cccaggecea gagcgattgc agttgacteta cagtgagecc gagegtacta gcagggatcg taataggaga cctggtactg acagtactca tigccctage cgtatacttc ctaggcegge tggtcccteg gaggcgagag =. gctgcggagg cagcgaccocg gaaacagegt atcactgaga cegagtegoec ttateaggag ctecagggate agaggtegga tatcetacage gaccteaaca cacagaggcc gtattacaaa tgagcceegaa teatgacagt cagcaacatg atacctaggat ccagccattc ctgaagecca cectacacet cattceaact ccetacegega tacagaceca cagagtgcca tecctgagag accagacege tececaatac tetectaaaa taaacatgaa gcacaaaaac aaaaaaaaaa aaaaaaaa (SEQ ID NO: 50)
[0046] Os termos "tratar" e "tratamento" se relacionam com tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo consiste em prevenir ou abrandar uma alteração ou distúrbio fisiológico indesejado. Para os propósitos desta invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, atenuação de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, sem piorar), retardamento ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e remissão (parcial ou total), detectável ou não detectável. “Tratamento” também pode significar prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não receber tratamento.
[0047] O termo "indivíduo" se relaciona com um animal, humano ou não humano, ao qual é proporcionado tratamento de acordo com os métodos da presente invenção. São contempladas aplicações veterinárias e não veterinárias. O termo inclui, mas não está limitado a, mamíferos, por exemplo, humanos, outros primatas, porcos, roedores tais como camundongos e ratos, coelhos, porquinhos da índia, hamsters, vacas, cavalos, gatos, cães, ovelhas e cabras. Indivíduos típicos incluem humanos, animais de herdade e animais de estimação, tais como gatos e cães.
[0048] Uma "quantidade eficaz" se relaciona com uma quantidade suficiente para originar resultados benéficos ou desejados. Por exemplo, uma quantidade terapêutica é tal que alcança o efeito terapêutico desejado. Esta quantidade pode ser igual ou diferente de uma quantidade profilaticamente eficaz, que é uma quantidade necessária para prevenir o surgimento de doença ou sintomas de doença. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto terapêutico (isto é, uma dosagem eficaz) depende dos compostos terapêuticos selecionados. As composições podem ser administradas desde uma ou mais vezes ao dia até uma ou mais vezes por semana; incluindo uma vez em dias alternados. O perito na técnica apreciará que certos fatores podem influenciar a dosagem e calendarização requeridas para tratar eficazmente um indivíduo, incluindo mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos prévios, o estado geral de saúde e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos terapêuticos descritos aqui pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos.
[0049] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" se relaciona com ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e seus polímeros na forma de fita simples ou dupla. Salvo quando especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos que contêm análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de maneira semelhante em nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que indicado de outro modo, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente suas variantes conservativamente modificadas (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNP e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, podem ser obtidas substituições de códons degenerados gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) códons selecionados é substituída por resíduos de bases mistas e/ou desóxi- inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al.,
J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0050] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são utilizados alternadamente e se relacionam com um composto compreendido por resíduos de aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter, pelo menos, dois aminoácidos, e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que uma sequência de proteína ou peptídeo pode compreender. Polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Como aqui usado, o termo se relaciona com cadeias curtas, que também são vulgarmente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e com cadeias mais longas, que geralmente são referidas na técnica como proteínas, das quais há muitos tipos. "Polipeptídeos" incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, —polipeptídeos “modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante ou uma combinação destes.
[0051] O termo "modificações conservativas de sequências" se relaciona com modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. Podem ser introduzidas modificações em um anticorpo ou fragmento de anticorpo por técnicas comuns conhecidas na técnica, tais como mutagênese dirigida a sítios e mutagênese mediada por PCR. Substituições conservativas de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[0052] O termo “homólogo” ou “identidade” se relaciona com a identidade de sequências de subunidades entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, tais como duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas polipeptídicas. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, quando uma posição em cada uma de duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com dez subunidades de comprimento) das posições em duas sequências forem homólogas, as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10) forem correspondentes ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas. A percentagem de “identidade de sequência” pode ser determinada comparando duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que o fragmento da sequência de aminoácidos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (por exemplo, intervalos ou saliências) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições nem deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem pode ser calculada determinando o número de posições em que o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para gerar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para gerar a percentagem de identidade de sequência. O resultado é a identidade percentual da sequência em questão relativamente à sequência de consulta.
[0053] O termo “isolado” significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não está “isolado”, mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcialmente ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural está “isolado”. Um ácido nucleico ou proteína isolado pode existir em forma substancialmente purificada, ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo, uma célula hospedeira. Um anticorpo isolado está substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM2 está substancialmente desprovido de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes de TREMZ2). No entanto, um anticorpo isolado que se liga especificamente a uma molécula-alvo pode ter reatividade cruzada com os mesmos antígenos de outras espécies, por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a TREM2 pode se ligar a moléculas de TREM2 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode estar substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.
[0054] A não ser que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido pelo perito na técnica à qual pertence esta divulgação. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes a esses aqui descritos poderem ser usados para praticar a invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionados aqui são incorporados por referência na sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, que inclui definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitativos. Mutantes de TREM2 Resistentes a Clivagem por Shedase
[0055] O TREM? sofre processamento proteolítico sequencial por liberação do ectodomínio e proteólise intramembrana (Wunderlich, J. Biol. Chem. 288, 33027-33036, 2013). Durante a liberação do ectodomínio, o ectodomínio de TREM?2 é liberado por proteases tais como membros da família ADAM (uma proteína contendo domínios de desintegrina e metaloproteinase) ou BACE (enzima de clivagem do sítio b de APP) (Kleinberger, Sci Transl Med. 2 de julho 2014; 6(243):243ra86). Fragmentos solúveis de TREM2 (STREM2) produzidos por liberação do ectodomínio foram observados em sobrenadantes de culturas de células dendríticas bem como em amostras de plasma e CSF de pacientes com doenças neurológicas não inflamatórias e esclerose múltipla (Kleinberger, 2014). Análise detalhada durante a progressão de doença de Alzheimer (AD) revelou que STREM2 aumenta precocemente em AD antes do aparecimento de sintomas clínicos, atinge o pico em MCI-AD e permanece elevado mas a níveis menores em comparação com o estágio MCI-AD em demência por AD (Suarez- Calvet, EMBO Molecular Medicine 8, 466-476, 2016).
[0056] Os dados apresentados aqui identificaram ADAM17 como sendo a principal shedase responsável por liberação constitutiva
(Exemplo 2). A ablação de ADAM17 reduziu a liberação constitutiva de TREM?2 e aumentou TREM2 na superfície celular (Exemplo 3). Após tratamento com forbol-miristato-ácido (PMA), mecanismos de liberação adicionais entram em jogo, um dos quais poderá envolver ADAM1O (Exemplo 3). Foram identificadas duas áreas que são importantes para a liberação induzida por PMA de TREM2: uma membrana próxima nos aminoácidos 169-172 e uma membrana distal na região dos aminoácidos 156-164 (Exemplo 4). Análise por HPLC mostrou que a ligação H157-S8158 em TREM? é o principal sítio de clivagem para ADAM17 (Exemplo 5). O ectodomínio de TREM?2 liberado de células foi caracterizado e confirmou o principal sítio de clivagem entre H157 e S158 (Exemplo 6). Não foi identificada nenhuma O-glicosilação nas posições próximas do sítio de clivagem: S160 ou S168 (Exemplo 7). Mutantes de TREM2 com mutações no sítio de clivagem por shedase exibem expressão na superfície celular e resistência a clivagem por shedase aumentadas (Exemplo 8).
[0057] São proporcionados aqui mutantes de TREM? resistentes a clivagem por shedase (ou "mutantes de TREM2 resistentes a clivagem"), por exemplo, mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem por shedase (ou "mutantes de TREM2 humano resistentes a clivagem"). Em algumas modalidades, os mutantes de TREM2 resistentes a clivagem são resistentes a clivagem por ADAM17 ou ADAM 10. Em algumas modalidades, os mutantes de TREM2 resistentes a clivagem compreendem uma região de tronco mutante. Por exemplo, os mutantes de TREM? resistentes a clivagem podem albergar uma ou mais mutações perto do sítio de clivagem por shedase. Em algumas modalidades, os mutantes de TREM?2 resistentes a clivagem compreendem uma ou mais mutações perto do sítio de clivagem por ADAM17 entre H157 e S158.
[0058] Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos proporcionadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33, 36, 40. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33, 36, 40. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco compreendendo a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma região de tronco consistindo na SEQ ID NO: 33.
Tabela 1. Sequências de aminoácidos exemplificativas da região de tronco de mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase A sÓ T2-IPD 33 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE A eroRERBSRSLECERTES T2-IPP 34 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE T2-IDP 35 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE
AS SFEDNTEBRSRSLECERTTETS TRUNC3 /36 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE (deleção SFEDAHVEHS 159-174) T2del 11- | 37 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE Fr GroRENSEGEEREIS T2YGG [38 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE T2WFR [39 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE A ereoneNERLECENERITO T2-duplo [40 SLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESE O Jereouvroomeamercmentto
[0059] Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma sequência de aminoácidos — selecionada das sequências de aminoácidos proporcionadas na Tabela 2. Em algumas modalidades, um mutante de TREM?2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-43. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-43. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41, 44,48. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41, 44, 48. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase compreende a SEQ ID NO:
41. Em algumas modalidades, um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase consiste na SEQ ID NO: 41.
[0060] Também são proporcionados aqui polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades, o polipeptídeo — compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades, o polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-43. Em algumas modalidades, o polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ |D NOs: 41-43. Tabela 2. Sequências de aminoácidos exemplificativas de mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase a cerne T2-IPD 41 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFOQGVAGOSLQVSCPY
DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQOPHDAGLYQCAS LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF EDAHVEIPDSRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASAL WAAAWHGOKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRD
T T2-IPP 42 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGOSLQVSCPY
DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCAS LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF EDAHVEIPPSRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASAL WAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRD
T T2-IDP 43 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGOQSLQVSCPY
DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCAS LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF EDAHVEIDPSRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASAL WAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRD
T TRUNC3 | 44 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQOSLQVSCPY (deleção DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF 159-174) LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCAS
LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF EDAHVEHSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTH
PPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT Tadel 45 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQOGVAGOSLQVSCPY 11-16 DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF
LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLAQPHDAGLYQCOS LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF
EDAHVEHSEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAA ag PEER T2-YGG |46 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFOGVAGOSLQVSCPY
DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCAS LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF EDAHVYGGWGGWGPEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAA SALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPG
LRDT T2WFR | 47 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFOGVAGQOSLQVSCPY
DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLOPHDAGLYQCAS LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF EDAHVEHSISRSLLEGEIWFRWTSILLLLACIFLIKILAASA LWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLR
DT T2-duplo | 48 MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFOQGVAGOSLQVSCPY
DSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSF LRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCAS LHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESF EDAHVYGGWGGWGPEGEIWFRWTSILLLLACIFLIKILA ASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLOTLP
GLRDT Ácidos Nucleicos Codificando Mutantes de TREM2 Humanos, Vetores e Células
[0061] A presente divulgação também proporciona ácidos nucleicos codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase, vetores para expressão de um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase e células contendo tais vetores de expressão. Em outros aspectos, a divulgação proporciona uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase e vetores de expressão e células hospedeiras compreendendo tal polinucleotídeo.
[0062] Em algumas modalidades são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos proporcionadas na Tabela 1. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ |D NOs: 33-40. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades, — são proporcionados aqui ácidos —nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33, 36, 40. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33, 36, 40. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco compreendendo a SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma região de tronco consistindo na SEQ ID NO: 33.
[0063] Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada das sequências de aminoácidos proporcionadas na Tabela 2. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades, = são proporcionados aqui ácidos —nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-43. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-43. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41, 44, 48. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41, 44, 48. Em algumas modalidades, = são proporcionados aqui ácidos —nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que compreende a SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase que consiste na SEQ ID NO: 41.
[0064] Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM?2 humano resistente a clivagem por shedase, em que a sequência compreende qualquer uma das sequências proporcionadas na Tabela
3. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase, em que a sequência compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 67-74. Em algumas modalidades, — são proporcionados aqui ácidos —nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase, em que a sequência compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 67-69. Em algumas modalidades, — são proporcionados aqui ácidos —nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase, em que a sequência compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 67, 70 ou 74. Em algumas modalidades, — são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase, em que a sequência compreende a SEQ ID NO: 67.
[0065] Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 67-74. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 67-69. Em algumas modalidades, = são proporcionados aqui ácidos —nucleicos compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 67, 70 ou 74. Em algumas modalidades, são proporcionados aqui ácidos nucleicos compreendendo a SEQ ID NO: 67. Tabela 3. Sequências de ácidos nucleicos exemplificativas codificando a região de tronco de mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase Nome SEQ ID | Sequências
NO T2-IPD 67 AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA sequência AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC de DNA ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA
AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAAATTCCG GATAGCCGCAGCCTGCTGGAAGGCGAAATTCCGTTT
CCGCCGACCAGC T2-IPP 68 AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA sequência AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC de DNA ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA
AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAAATTCCG CCGAGCCGCAGCCTGCTGGAAGGCGAAATTCCGTT
TCCGCCGACCAGC T2-IDP AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA sequência AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC de DNA ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA
AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAAATTGAT CCGAGCCGCAGCCTEGCTGGAAGGCGAAATTCCGTT
[ ] [TCcGcoeGaCEAaGCE TRUNC3 70 AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA (deleção AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC 159-174) ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA sequência AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAACATAGC de DNA T2del 11-16 | 71 AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA sequência AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC de DNA ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA
AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAACATAGC
GAAGGCGAAATTCCGTTTCCGCCGACCAGC T2-YGG 72 AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA sequência AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC de DNA ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA
AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGTATGGCGGC TGGGGCEGCTEGEGCCCEGAAGGCGAAATTCCOGTT
TCCGCCGACCAGC T2-WFR 73 AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA sequência AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC de DNA ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA
AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGGAACATAGC ATTAGCCGCAGCCTGCTGGAAGGCGAAATTIGGTTT
CGCTGGACCAGC T2-duplo 74 AGCCTGCATGGCAGCGAAGCGGATACCCTGCGCAA sequência AGTGCTGGTGGAAGTGCTGGCGGATCCGCTGGATC de DNA ATCGCGATGCGGGCGATCTGTGGTTTCCGGGCGAA
AGCGAAAGCTTTGAAGATGCGCATGTGTATGGCGGC TGGGGCEGCTEGEGCCCGGAAGGCGAAATTTGGTT TCGCTGGACCAGC
[0066] São proporcionados aqui vetores (por exemplo, vetores de expressão) que podem ser empregues para expressar um mutante de TREM?2 humano resistente a clivagem por shedase. O termo "vetor de expressão" se relaciona com uma molécula de ácido nucleico transportadora na qual pode ser inserida uma sequência codificadora desejada para introdução em uma célula onde pode ser expressa. O vetor de expressão pode ser um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um cosmídeo ou um vetor viral, ou cromossomos artificiais (ver, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão de um polipeptídeo em células de mamífero (por exemplo, humanas) incluem pThioHis A, B & C, pcDNA3, 1/His, peEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA),
vetores de MPSV e numerosos outros vetores conhecidos na técnica para expressão de outras proteínas. Em algumas modalidades, o vetor de expressão pode ser capaz de replicação autônoma ou pode ser integrado em um DNA hospedeiro. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende adicionalmente um marcador selecionável.
[0067] Vetores virais úteis incluem, mas não estão limitados a, vetores baseados em qualquer um dos seguintes vírus: adenovírus, vírus adenoassociado, Vírus Herpes Simplex (HSV), parvovírus, retrovírus, lentivírus, vírus vacínia, vírus Sinbis, vírus influenza, reovírus, vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus do sarampo, vírus da estomatite vesicular (VSV), poliovírus, poxvírus, vírus do Vale de Seneca, coxsackievírus, enterovírus, vírus Mixoma ou vírus Marabá.
[0068] Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor lentiviral. Vetores derivados de retrovírus, como o lentivírus, são ferramentas adequadas para alcançar transferência genética de longa duração uma vez que permitem uma integração estável de longa duração de um transgene e a sua propagação em células filhas. Vetores lentivirais têm a vantagem adicional, relativamente a vetores derivados de oncorretrovírus, tais como vírus de leucemia murina, de poderem transduzir células não proliferantes, tais como hepatócitos. Também têm a vantagem adicional de baixa imunogenicidade. Um vetor retroviral pode também ser, por exemplo, um vetor gamarretroviral. Um vetor gamarretroviral pode incluir, por exemplo, um promotor, um sinal de empacotamento (w), um local de ligação de iniciador (PBS), uma ou mais (por exemplo, duas) repetições terminais longas (LTR) e um transgene de interesse, por exemplo, um gene codificando um CAR. Um vetor gamarretroviral pode não ter genes estruturas virais como gag, pol e env. Vetores gamarretrovirais exemplificativos incluem Vírus da Leucemia Murina (MLV), Vírus de Formação com Foco no Baço (SFFV) e Vírus do Sarcoma Mieloproliferativo (MPSV) e vetores daí derivados.
Outros vetores gamarretrovirais são descritos, por exemplo, em Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application" Viruses. Junho de 2011; 3(6): 677-713.
[0069] Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor de vírus adenoassociado (AAV), por exemplo, um vetor AAV recombinante (rAAV). "AAV" é uma abreviatura para vírus adenoassociado, e pode ser usado para se referir ao próprio vírus ou seus derivados. O termo abrange todos os subtipos e ambas as formas de ocorrência natural e recombinante, exceto quando requerido de outro modo. A abreviatura "rAAV" se relaciona com vírus adenoassociado recombinante, também referido como vetor AAV recombinante (ou "vetor rAAV"). O termo "AAV" inclui, por exemplo, AAV de tipo 1 (AAV1), AAV de tipo 2 (AAV2), AAV de tipo 3 (AAV3), AAV de tipo 4 (AAV4), AAV de tipo 5 (AAV5), AAV de tipo 6 (AAV6), AAV de tipo 7 (AAV7), AAV de tipo 8 (AAV8), AAV de tipo 9 (AAV9), AAV de tipo 10 (AAV10, incluindo AAVrh10), AAV de tipo 12 (AAV12), AAV aviário, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV de primata, AAV não de primata e AAV ovino. "AAV de primata" se relaciona com AAV que infecta primatas, "AAV não de primata" se relaciona com AAV que infecta mamíferos que não são primatas, "AAV bovino" se relaciona com AAV que infecta mamíferos bovinos e assim por diante.
[0070] As sequências genômicas de vários serótipos de AAV, bem como as sequências das repetições terminais invertidas (ITR) nativas, proteínas Rep e subunidades capsídicas são conhecidas na técnica. Tais sequências podem ser encontradas na literatura ou em bases de dados públicas tais como GenBank. Ver , por exemplo, Nos. De Acesso da GenBank NC-002077 (AAV1), AFO63497 (AAV1), NC-001401 (AAV2), AFO43303 (AAV2), NC-001729 (AAV3), NC-001829 (AAV4), U89790 (AAV4), NC-006152 (AAV5), AF513851 (AAV7), AF513852 (AAV8), e NC-006261 (AAV8), ou em publicações tais como
WOZ2005033321 (AAV1-9), cujas divulgações são incorporadas a título de referência aqui. Ver também, por exemplo, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71 :6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et a/. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et a/. (1996) Virology 221 :208; Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et a/. (2004) Virology 33:375-383; publicações de patentes internacionais WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244, e Pat. dos E.U.A. N.º 6,156,303.
[0071] Um "vetor rAAV", como usado aqui, se relaciona com um vetor AAV compreendendo uma sequência polinucleotídica não originária de AAV (isto é, um polinucleotídeo heterólogo a AAV), tipicamente uma sequência de interesse para a transformação genética de uma célula. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo heterólogo pode ser flanqueado por pelo menos uma, e por vezes por duas, sequências de repetições terminais invertidas (ITR) de AAV. O termo vetor rAAV abrange partículas de vetor rAAV e plasmídeos de vetor rAAV. Um vetor rAAV pode ser de fita simples (ssAAV) ou autocomplementar (scAAV). Um "vírus AAV" ou "partícula viral de AAV" ou "partícula de vetor rAAV" se relaciona com uma partícula viral composta por pelo menos uma proteína capsídica de AAV (tipicamente por todas as proteínas capsídicas de um AAV de tipo selvagem) e um vetor rAAV polinucleotídico encapsidado. Se a partícula compreender um polinucleotídeo heterólogo (isto é, um polinucleotídeo diferente de um genoma de AAV de tipo selvagem, tal como um transgene a ser distribuído em uma célula de mamífero), é tipicamente referida como "partícula de vetor rAAV" ou simplesmente um "vetor rAAV". Assim, a produção de partícula de rAAV inclui necessariamente a produção de vetor rAAV, pois tal vetor está contido dentro de uma partícula de rAAV.
[0072] Em algumas modalidades, o vetor de expressão pode ser uma molécula de DNA recombinante contendo um ácido nucleico codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase. "Recombinante", como usado aqui, significa que o vetor, polinucleotídeo, polipeptídeo ou célula é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição ou ligação (por exemplo, com referência a um polinucleotídeo ou polipeptídeo compreendido aí), e/ou outros procedimentos que resultam em um construto que é distinto de um produto presente na natureza. Um vírus ou vetor recombinante é uma partícula viral compreendendo um polinucleotídeo recombinante. Os termos incluem, respectivamente, repetições do construto polinucleotídico original e progênie do construto de vírus original.
[0073] O vetor de expressão recombinante inclui tipicamente uma ou mais sequências reguladoras operavelmente ligadas à sequência de ácido nucleico a ser expressa. O termo "sequência reguladora" inclui promotores, intensificadores e outros elementos de controle da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Sequências reguladoras incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos, bem como sequências reguladoras e/ou induzíveis específicas para tecidos. Vetores de expressão também podem incluir elementos planejados para otimizar a estabilidade e capacidade de tradução de RNA mensageiro em células hospedeiras, e/ou marcadores de seleção de fármacos para estabelecer clones de células estáveis e permanentes expressando um mutante de TREM2 humano. O planejamento do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado e similares. Métodos gerais para gerar tais vetores de expressão recombinantes podem ser encontrados em Sambrook e Russell editores (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3º edição; a série Ausubel et a/. editores (2007 com atualização até 2010) "Current Protocols in Molecular
Biology", entre outros conhecidos na técnica.
[0074] Um "promotor" é uma sequência de controle que é uma região de uma sequência de ácido nucleico na qual são controladas a iniciação e velocidade de transcrição. Pode conter elementos genéticos aos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, tais como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. As frases "operavelmente posicionado", "operavelmente ligado", "sob controle" e "sob controle de transcrição" significam que um promotor está em uma localização e/ou orientação funcionais corretas em relação a uma sequência de ácido nucleico para controlar a iniciação da transcrição e/ou expressão dessa sequência. Um promotor pode ou não ser usado em conjunção com um "intensificador", que se relaciona com uma sequência reguladora de atuação cis envolvida na ativação da transcrição de uma sequência de ácido nucleico.
[0075] Um promotor pode ser um promotor naturalmente associado a um gene ou sequência, pois pode ser obtido por isolamento das sequências não codificadoras 5' localizadas a montante do segmento e/ou éxon codificador. Tal promotor pode ser referido como "endógeno". De modo similar, um intensificador pode ser um intensificador naturalmente associado a uma sequência de ácido nucleico, localizado a jusante ou a montante dessa sequência. Alternativamente, certas vantagens serão ganhas por posicionamento do segmento de ácido nucleico codificador sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não está normalmente associado a uma sequência de ácido nucleico em seu ambiente natural. Um intensificador recombinante ou heterólogo se refere também a um intensificador que não está normalmente associado a uma sequência de ácido nucleico em seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes, e promotores ou intensificadores isolados de qualquer outra célula procariótica, viral ou eucariótica, e promotores ou intensificadores que não são "de ocorrência natural", isto é, contendo diferentes elementos de diferentes regiões reguladoras da transcrição e/ou mutações que alteram a expressão. Para além da produção sintética de sequências de ácidos nucleicos de promotores e intensificadores, sequências podem ser produzidas usando tecnologia de clonagem recombinante e/ou amplificação de ácidos nucleicos, incluindo PCR'Y, em conexão com as composições divulgadas aqui (ver US 4683202, US 5928906, cada uma incorporada aqui a título de referência). Adicionalmente, é contemplado que também podem ser empregues as sequências de controle que dirigem a transcrição e/ou expressão de sequências dentro de organelas não nucleares tais como mitocôndrias, cloroplastos e similares.
[0076] Os promotores empregues podem ser constitutivos, induzíveis, sintéticos, específicos para tecidos ou células e/ou úteis, sob as condições apropriadas, para dirigir a expressão em nível elevado do segmento de DNA introduzido, tal como é vantajoso na produção em larga escala de proteínas e/ou peptídeos recombinantes. Além disso, outros elementos reguladores também podem ser incorporados para melhorar a expressão de um ácido nucleico codificando uma proteína TREM2 mutante, por exemplo, intensificadores, sítio de ligação de ribossomos, sequências de terminação da transcrição e similares.
[0077] Em algumas modalidades é empregue um promotor constitutivo para proporcionar expressão constante de uma proteína TREM?2 mutante. Exemplos de um promotor constitutivo incluem, mas não estão limitados ao promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), ao promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetições terminais longas (LTR) do vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor inicial imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores de genes humanos tais como, mas não se limitando ao promotor da actina, ao promotor de miosina, ao promotor do fator de alongamento-1a, ao promotor de hemoglobina e ao promotor de creatina cinase.
[0078] Promotores induzíveis também são contemplados como parte da presente divulgação. O uso de um promotor induzível proporciona um interruptor molecular capaz de ligar a expressão da sequência polinucleotídica que está operavelmente ligada quando tal expressão é desejada, ou de desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não se limitam a, um promotor de metalotioneína, um promotor de glicocorticoides, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.
[0079] Em algumas modalidades é empregue um promotor específico para tecidos ou células para proporcionar expressão de uma proteína TREM2 mutante somente em tecidos ou células específicos. A identidade de promotores ou elementos específicos para tecidos ou células, bem como ensaios para caracterizar suas atividades, são bem conhecidos dos peritos na técnica. Exemplos incluem o gene LIMK2 humano (Nomoto et a/. 1999, Gene, 236(2):259-271), o gene do receptor da somatostatina 2 (Kraus et a/., 1998, FEBS Lett., 428(3): 165- 170), gene de ligação a ácido retinoico epididimal murino (Lareyre et al., 1999, Ju. Biol. Chem., 274(12):8282-8290), CD4 humano (Zhao-Emonet et al., 1998, Biochirn. Biophys. Acta, 1442(2-3): 109-119), colágeno alfa2 de camundongo (XI) (Tsumaki, et a/., 1998, J. Biol. Chem., 273(36):22861-22864), gene do receptor da dopamina D1A (Lee, et al., 1997, J. Auton. Nerv. Syst., 74(2-3):86-90), fator de crescimento do tipo insulina |l (Wu et al, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commurn., 233(1):221-226), molécula de adesão plaquetária de células endoteliais humanas-1 (Almendro et al., 1996, J. Immunol., 157(12):5411-5421), promotor da creatina cinase muscular (MCK) (Wang et al., Gene Ther. nov 2008;15(22):1489-99).
[0080] Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico para tipos de células. Por exemplo, um promotor pode ser empregue para conduzir a expressão de TREM2 especificamente em um macrófago, uma célula dendrítica ou uma microglia. Em algumas modalidades, um promotor específico é empregue para proporcionar expressão de proteína TREM2 em uma microglia. Os promotores que podem dirigir a expressão de proteína TREM2 em microglia incluem, mas não estão limitados a, um promotor de TREM2, promotor de TMEM119, promotor de Hexb, promotor de IBA1, promotor de CD45, promotor de CD11b, promotor de Cst7, promotor de Lpl, promotor de Csf1, promotor de Cs1R, promotor de ltgax, promotor de Clec7a, promotor de Lilrb4, promotor de Tyrobp, promotor de Ctsb, promotor de Ctsd, promotor de B2m, promotor de Lyz2, promotor de Cx3cr1, promotor de Cst3, promotor de Ctss, promotor de P2ry12, promotor de C1ga, promotor de C1qb, promotor de Axl, promotor de Timp2, promotor de Ctsl, promotor de Gnas, promotor de Cd9, promotor de Fth1, promotor de Tmsb4x. Em algumas modalidades, o vetor de expressão inclui um promotor selecionado de um promotor de TREM2, promotor de TMEM119, promotor de Hexb, promotor de IBA1, promotor de CD45, promotor de CD11b, promotor de Cst7, promotor de Lpl, promotor de Csf1, promotor de Cs1R, promotor de ltgax, promotor de Clec7a, promotor de Lilrb4, promotor de Tyrobp, promotor de Ctsb, promotor de Ctsd, promotor de B2m, promotor de Lyz2, promotor de Cx3cr1, promotor de Cst3, promotor de Ctss, promotor de P2ry12, promotor de C1iga ou promotor de C1iqb. Em algumas modalidades, o vetor de expressão inclui um promotor de TREM2.
[0081] Em algumas modalidades é empregue um promotor sintético para proporcionar expressão de uma proteína TREM2 mutante. Promotores sintéticos podem exceder grandemente as potências de transcrição de promotores naturais. Por exemplo, podem ser selecionados os promotores sintéticos que não são desligados ou cuja atividade não é reduzida pela maquinaria ou fatores celulares endógenos. Outros elementos, incluindo sítios de ligação de fatores de atuação trans e intensificadores, podem ser inseridos no promotor sintético para melhorar a eficiência da transcrição. Promotores sintéticos podem ser racionalmente planejados e sintetizados quimicamente para combinar as melhores características de promotores sintéticos e biológicos. Oligos sintéticos são emparelhados e ligados através de vários processos para gerar o promotor quimicamente sintetizado completo. Promotores sintéticos podem ser promotores induzíveis ou específicos para tipos de células. Por exemplo, um promotor sintético que possa conduzir a expressão de TREM2 especificamente em um macrófago, uma célula dendrítica ou uma microglia pode ser racionalmente planejado e sintetizado quimicamente.
[0082] Um sinal de iniciação específico também pode ser requerido para tradução eficiente de sequências codificadoras. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG ou sequências adjacentes. Pode ser necessário proporcionar sinais exógenos de controle da tradução, incluindo o códon de iniciação ATG. Alguém de habilidade comum na técnica será prontamente capaz de o determinar e de proporcionar os sinais necessários. É bem conhecido que o códon de iniciação deve estar "na estrutura" com o quadro de leitura da sequência codificadora desejada para assegurar a tradução de todo o inserto. Os sinais exógenos de controle da tradução e códons de iniciação podem ser naturais ou sintéticos. A eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão de elementos intensificadores da transcrição apropriados.
[0083] A expressão pode empregar quaisquer células hospedeiras apropriadas conhecidas na técnica, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de levedura, células hospedeiras de inseto, etc. Sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos estão amplamente disponíveis. Em algumas modalidades, o sistema de expressão é um sistema de expressão de células de mamífero, tal como um sistema de expressão de células CHO. Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode ser otimizado quanto a códons para facilitar a expressão em uma célula hospedeira desejada. Será importante empregar um promotor e/ou intensificador que dirijam eficazmente a expressão do segmento de DNA no tipo de células, organela e organismo escolhidos para expressão. Os peritos na técnica da biologia molecular conhecem genericamente o uso de combinações de promotores, intensificadores e tipos de células para expressão de proteínas, por exemplo, ver Sambrook et al. (2001), incorporado aqui a título de referência.
[0084] A maior parte das moléculas de RNA eucarióticas transcritas irá sofrer encadeamento de RNA para remover íntrons dos transcritos primários. Vetores contendo sequências genômicas eucarióticas podem requerer sítios de encadeamento doadores e/ou aceitadores para assegurar processamento apropriado do transcrito para expressão de proteínas (ver Chandler et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(8):3596-601).
[0085] Os vetores ou construtos da presente divulgação compreenderão geralmente pelo menos um sinal de terminação. Um "sinal de terminação" ou "terminador" é compreendido pelas sequências de DNA envolvidas na terminação específica de um transcrito de RNA por uma RNA polimerase. Assim, em certas modalidades, é contemplado um sinal de terminação que termina a produção de um transcrito de RNA. Um terminador pode ser necessário in vivo para alcançar níveis desejáveis de mensagens. Em sistemas eucarióticos, a região terminadora também pode compreender sequências de DNA específicas que permitem clivagem específica para sítios do novo transcrito de modo a expor um sítio de poliadenilação. Isto sinaliza uma polimerase endógena especializada para adicionar uma extensão de cerca de 200 resíduos A (poli A) à extremidade 3' do transcrito. Moléculas de RNA modificadas com esta cauda poliA aparentam ser mais estáveis e são traduzidas de modo mais eficiente. Assim, em outras modalidades envolvendo eucariotas, é preferencial que esse terminador compreenda um sinal para a clivagem do RNA, e é mais preferencial que o sinal do terminador promova a poliadenilação da mensagem. Os elementos do terminador e/ou sítio de poliadenilação podem atuar para intensificar níveis de mensagens e/ou para minimizar a continuação da leitura a partir do cassete para outras sequências. Terminadores contemplados para uso na divulgação incluem qualquer terminador da transcrição conhecido descrito aqui ou conhecido por alguém de habilidade comum na técnica, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, as sequências de terminação de genes, tais como, por exemplo, o terminador do hormônio de crescimento bovino, ou sequências de terminação virais, tais como, por exemplo, o terminador do SV40. Em certas modalidades, o sinal de terminação pode ser uma ausência de sequência apta a ser transcrita ou traduzida, tal como devido a um truncamento da sequência.
[0086] Na expressão, particularmente expressão eucariótica, tipicamente será incluído um sinal de poliadenilação para efetuar poliadenilação apropriada do transcrito. Não se crê que a natureza do sinal de poliadenilação seja crucial para a prática bem-sucedida da divulgação, e/ou quaisquer de tais sequências podem ser empregues. Modalidades preferenciais incluem o sinal de poliadenilação do SV40 e/ou o sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino, convenientes e/ou que são conhecidos por funcionarem bem em várias células-alvo. A poliadenilação pode aumentar a estabilidade do transcrito ou pode facilitar o transporte citoplasmático.
[0087] Para propagar um vetor em uma célula hospedeira, pode conter uma ou mais origens de sítios de replicação (muitas vezes denominadas "ori"), que é uma sequência de ácido nucleico específica onde é iniciada a replicação. Alternativamente, uma sequência de replicação autônoma (ARS) pode ser empregue se a célula hospedeira for levedura.
[0088] Em certas modalidades da divulgação, células contendo um construto de ácido nucleico da presente divulgação podem ser identificadas in vitro ou in vivo por inclusão de um marcador no vetor de expressão. Tais marcadores conferem uma alteração identificável à célula, permitindo identificação fácil de células contendo o vetor de expressão. Em geral, um marcador selecionável é tal que confere uma propriedade que permite seleção. Um marcador selecionável positivo é um onde a presença do marcador permite a sua seleção, ao passo que um marcador selecionável negativo é um onde a sua presença evita a sua seleção. Um exemplo de um marcador selecionável positivo é um marcador de resistência a fármacos.
[0089] Habitualmente, a inclusão de um marcador de seleção de fármacos auxilia a clonagem e identificação de transformantes, por exemplo, genes que conferem resistência a neomicina, puromíicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol são marcadores selecionáveis úteis. Para além de marcadores conferindo um fenótipo que permite a discriminação de transformantes com base na implementação de condições, também são contemplados outros tipos de marcadores, incluindo marcadores rastreáveis tais como GFP, cuja base é análise colorimétrica. Alternativamente, podem ser utilizadas enzimas rastreáveis, tais como timidina cinase (tk) do vírus herpes simplex ou cloranfenicol acetiltransferase (CAT). O perito na técnica também “saberá como empregar marcadores imunológicos, possivelmente em conjunção com análise FACS. Não se crê que seja importante qual é o marcador usado, desde que possa ser expresso simultaneamente com o ácido nucleico codificando um produto genético. Outros exemplos de marcadores selecionáveis e rastreáveis são bem conhecidos do perito na técnica.
[0090] Em algumas modalidades são proporcionados aqui vetores de expressão compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase, por exemplo, clivagem por ADAM17 ou ADAM1O. Em algumas modalidades são proporcionados aqui vetores de expressão compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano que compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades são proporcionados aqui vetores de expressão compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano que compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40. Em algumas modalidades são proporcionados aqui vetores de expressão compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano que compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades são proporcionados aqui vetores de expressão compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano que compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35. Em algumas modalidades são proporcionados aqui vetores de expressão compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48. Em algumas modalidades são proporcionados aqui vetores de expressão compreendendo uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48.
[0091] Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende um promotor que proporciona expressão da proteína TREM2 em um macrófago, uma célula dendrítica ou uma microglia. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende um promotor selecionado de um promotor de TREM2, promotor de TMEM119, promotor de Hexb, promotor de IBA1, promotor de CD45, promotor de CD11b, promotor de Cst7, promotor de Lpl, promotor de Csf1, promotor de Cs1R, promotor de ltgax, promotor de Clec7a, promotor de Lilrb4, promotor de Tyrobp, promotor de Ctsb, promotor de Ctsd, promotor de B2m, promotor de Lyz2, promotor de Cx3cr1i, promotor de Cst3, promotor de Ctss, promotor de P2ry12, promotor de C1ga ou promotor de C1qb. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende um promotor de TREM?2.
[0092] Em alumas modalidades, o vetor de expressão compreende um sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende um marcador selecionável.
[0093] Em algumas modalidades, o vetor de expressão também compreende uma segunda sequência codificando a proteína DAP12. Em algumas modalidades, a proteína DAP12 compreende a SEQ ID NO: 49. Em algumas modalidades, a proteína DAP12 consiste na SEQ ID NO: 49.
[0094] Em algumas modalidades, os vetores de expressão para expressar um polipeptídeo TREM2 e um polipeptídeo DAP12 podem compreender um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) a montante da sequência codificadora de DAP12. Elementos IRES conseguem contornar o modelo de varredura ribossômica de tradução dependente de Cap 5'-metilado e começar a tradução em sítios internos (Pelletier e Sonenberg, 1988, Nature, 334:320-325). Foram descritos elementos IRES de dois membros da família de picornavírus (polio e encefalomiocardite) (Pelletier e Sonenberg, 1988), bem como um IRES de uma mensagem de mamífero (Macejak e Sarnow, 1991, Nature, 353:90-94, 1991). Elementos IRES podem ser ligados a quadros de leitura abertos heterólogos. Múltiplos quadros de leitura abertos podem ser transcritos em conjunto, cada um separado por um IRES, criando mensagens policistrônicas. Em virtude do elemento IRES, cada quadro de leitura aberto está acessível a ribossomos para tradução eficiente. Múltiplos genes podem ser eficientemente expressos usando um único promotor/intensificador para transcrever uma única mensagem (ver Patentes dos E.U.A. 5925565 e 5935819, aqui incorporadas a título de referência).
[0095] Em algumas modalidades, os vetores de expressão para expressar um polipeptideco TREM2 e um polipeptídeo DAP12 compreendem uma sequência 2A a montante da sequência codificadora de DAP12. A sequência oligopeptídica 2A foi primeiramente caracterizada a partir do picornavírus de RNA de fita positiva Vírus da Doença do Pé-e-Boca (FMDV), e foi mostrado que FMDV 2A ou F2A medeia uma “clivagem' cotradução entre os domínios a montante (proteínas capsídicas) e a jusante (proteínas de replicação de RNA) da poliproteína FMDV (Ryan MD, EMBO J 1994;134: 928-933; Ryan MD, J Gen Virol 1991; 72: 2727-2732; Donnelly MLL, J Gen Virol 1997; 78:13—21; Donnelly MLL, J Gen Virol 2001; 82:1013—1025). Sequências 2A ativas foram caracterizadas nos genomas de vírus de outros gêneros de picornavírus, mais sequências “do tipo 2A' presentes nos genomas de uma gama de diferentes vírus de RNA e retrotransposons não LTR (Donnelly MLL, J Gen Virol 2001; 82:1027-1041; Heras SR, Cell Mol
Life Sci 2006; 63:1449-1460; Luke GA, J Gen Virol 2008; 89:1036- 1042; Odon V, Mol Biol Evol 2013; 30:1955-1965; Luke GA, Mob Gen Elements 2014; 3:027525). Foi mostrado que estas sequências oligopeptídicas 2A ou "do tipo 2A" medeiam um evento de “recodificação' de tradução referido como tradução “salto de ribossomo', “Stop-Carry on' ou “StopGo' (Atkins JF, RNA 2007; 13:1-—8).
[0096] Como usado aqui, uma "sequência 2A" se relaciona com qualquer sequência de ácido nucleico codificando um oligopeptídeo 2A ou "do tipo 2A" atuando como ligador entre duas proteínas, permitindo autoprocessamento intrarribossômico autônomo de poliproteínas (Ver por exemplo, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004); deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Estes oligopeptídeos permitem coexpressão de múltiplas proteínas a partir de um único vetor. Muitos elementos 2A são conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências 2A virais foram descritas nas Patentes dos EUA N.º* 9175311, 8865881, 7939059, 7947493, todas as quais são incorporadas a título de referência aqui. Por exemplo, uma sequência 2A viral pode ser uma sequência 2A picornaviral, tetraviral ou uma sua combinação. Uma sequência 2A picornaviral pode ser selecionada de qualquer uma das sequências 2A Enterovirais, sequências 2A Rinovirais, sequências 2A Cardiovirais, sequências 2A Aftovirais, sequências 2A Hepatovirais, sequências 2A Erbovirais, sequências 2A Cobuvirais, sequências 2A Tescovirais e sequências 2A Parecovirais. Uma sequência 2A tetraviral pode ser selecionada de quaisquer das sequências 2A Betatetravirais ou sequências 2A Omegatetravirais. Exemplos de sequências 2A que podem ser usadas nos métodos e sistema divulgados aqui, sem limitação, incluem sequências 2A do vírus da doença do pé-e-boca (F2A), vírus da rinite equina A (E2A), vírus Thosea asigna (T2A) e tescovírus porcino-1 (P2A). Em algumas modalidades, uma sequência 2A codifica um oligopeptídeo 2A viral selecionado de T2A
(EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 52) ou GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ I|D NO: 53), P2A (ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 54) ou GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 55), E2A (QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 56) ou GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 57)) ou F2A (VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP =(SEQ I|D NO 58) ou GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 59)).
[0097] Uma sequência 2A não viral foi descrita na Patente dos EUA N.º 8945876, que é incorporada a título de referência aqui. Por exemplo, uma sequência 2A não viral pode ser uma sequência 2A de ouriço do mar (Strongylocentrotus purpuratus) (DGFCILYLLLILLMRSGDVETNPGP) (SEQ ID NO: 60); uma sequência 2A de esponja (Amphimedon queenslandica) (LLCFMLLLLLSGDVELNPGP (SEQ ID NO: 61) ou HHFMFLLLLLAGDIELNPGP (SEQ ID NO: 62)); uma sequência 2A do verme da bolota (Saccoglossus kowalevskii) (WFLVLLSFILSGDIEVNPGP (SEQ ID NO: 63)) ou uma sequência 2A de anfioxo (Branchiostoma floridae) (KNCAMYMLLLSGDVETNPGP (SEQ ID NO: 64) ou MVISQLMLKLAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 65)). Em algumas modalidades, a sequência 2A é uma sequência de ocorrência natural ou sintética que inclui a sequência de consenso 2A D-X-E-X-NPGP (SEQ ID NO: 66), em que X é qualquer resíduo de aminoácido.
[0098] Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende uma sequência 2A codificando um oligopeptídeo 2A selecionado de qualquer uma de SEQ ID NOs: 52-66.
[0099] Em algumas modalidades, um ácido nucleico codificando um mutante de TREM2 humano também pode incluir uma sequência codificando uma sequência de sinal de secreção de modo que o polipeptídeo seja secretado a partir da célula hospedeira. Tal sequência pode ser proporcionada pelo vetor, ou como parte do ácido nucleico TREM? que está presente no vetor.
[00100] A geração de um vetor de expressão pode utilizar um vetor que inclui um sítio múltiplo de clonagem (MCS), que é uma região de ácido nucleico que contém múltiplos sítios de enzimas de restrição, qualquer um dos quais pode ser usado em conjunção com tecnologia recombinante comum para digerir o vetor. Ver Carbonelli et a/., 1999, Levenson et al., 1998, e Cocea, 1997, incorporados aqui a título de referência. "Digestão com enzima de restrição" se relaciona com clivagem catalítica de uma molécula de ácido nucleico com uma enzima que atua somente em localizações específicas em uma molécula de ácido nucleico. Muitas destas enzimas de restrição estão comercialmente disponíveis. O uso de tais enzimas é amplamente entendido pelos peritos na técnica. Frequentemente, um vetor é linearizado ou fragmentado usando uma enzima de restrição que corta dentro do MCS para permitir a ligação de sequências exógenas ao vetor. "Ligação" se relaciona com o processo de formação de ligações fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico, que podem ou não ser contíguos entre si. Técnicas envolvendo enzimas de restrição e reações de ligação são bem conhecidas dos peritos na técnica da tecnologia recombinante.
[00101] Os métodos para introduzir vetores de expressão contendo as sequências de polinucleotídeos de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção com cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, ao passo que tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares (ver genericamente Sambrook et al. supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossomos, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virossomos, imunolipossomos, conjugados policátion:ácido nucleico, DNA nu, vírions artificiais, fusão à proteína estrutural do vírus herpes VP22, captação de DNA intensificada por agente e transdução ex vivo. Para a produção de longa duração e alto rendimento de proteínas recombinantes será muitas vezes desejada expressão estável. Por exemplo, linhagens de células que expressam estavelmente polipeptídeos podem ser preparadas usando vetores de expressão que contêm origens de replicação virais ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável.
[00102] Também são proporcionadas aqui células que incluem qualquer um dos vetores de expressão descritos aqui. Em algumas modalidades, tais células compreendem um vetor de expressão para expressão de um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase. Em algumas modalidades, tais células compreendem um vetor de expressão para expressão de um mutante de TREM2 humano e uma proteína DAP12 humana. Em algumas modalidades, tais células compreendem um vetor de expressão para expressão de um mutante de TREM2 humano e um segundo vetor de expressão para expressão de uma proteína DAP12 humana. Tais células podem ser uma célula hospedeira ou uma célula terapêutica.
[00103] Em algumas modalidades, a divulgação apresenta uma célula hospedeira que inclui uma molécula de ácido nucleico descrita aqui. Uma célula hospedeira pode ser usada para produzir ou expressar um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase descrito aqui. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinante" são usados indistintamente aqui, que se referem não só à célula em questão particular mas também à progênie ou progênie potencial de tal célula. Uma vez que certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas, devido a mutação ou influências ambientais,
tal progênie pode, de fato, não ser idêntica à célula paterna, mas ainda está incluída no escopo do termo como usado aqui. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, uma proteína pode ser expressa em células bacterianas (tais como E. coli), células de inseto, células de levedura ou células de mamífero (tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS, por exemplo, células COS-7, células com origem CV-1 transformadas com SV40; Gluzman (1981) Cell 23:175-182). Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas dos peritos na técnica.
[00104] Uma célula hospedeira pode ser usada para produzir ou expressar um mutante de TREM2 humano descrito aqui Em conformidade, a divulgação também apresenta métodos para produzir um mutante de TREM2 humano usando uma célula hospedeira. Em uma modalidade, o método inclui cultivar a célula hospedeira (onde foi introduzido um vetor de expressão recombinante codificando uma proteína) em um meio adequado de modo a ser produzido um mutante de TREM2 humano. Em outra modalidade, o método também inclui isolar um mutante de TREM2 humano a partir do meio ou da célula hospedeira.
[00105] Em algumas modalidades, a divulgação apresenta uma célula terapêutica que inclui uma molécula de ácido nucleico descrita aqui. Como usado aqui, o termo "célula terapêutica" se relaciona com uma célula que foi geneticamente manipulada para expressar um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase. Tal célula terapêutica pode ser uma célula humana, por exemplo, um macrófago, uma célula dendrítica ou uma microglia.
[00106] Em algumas modalidades, tal célula terapêutica expressa um marcador detectável, por exemplo, uma molécula fluorescente (por exemplo, fluoresceína, vermelho Texas, rodamina, proteína verde fluorescente e similares), uma enzima (por exemplo, peroxidase de rábano picante, fosfatase alcalina), uma molécula luminescente (por exemplo, luciferase), uma molécula radioativa (por exemplo, ?H, 12º, 35S, 14C ou 3?P) ou etiquetas calorimétricas tais como ouro coloidal ou esférulas coloridas. Células expressando um marcador detectável podem ser seguidas ou visualizadas por métodos de detecção apropriados tais como microscopia, autorradiografia e/ou outros métodos de imagiologia conhecidos na técnica. Métodos de Tratamento e Uso Terapêutico
[00107] São proporcionados aqui métodos para aumentar a expressão de TREM2 em um indivíduo (por exemplo, um humano) por administração ao indivíduo de um ácido nucleico codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase como divulgado aqui, ou um vetor ou uma célula compreendendo tal ácido nucleico. O indivíduo pode ter uma doença ou distúrbio relacionado com TREM?2. Uma vez que TREM2 humano da superfície celular ausente ou liberação excessiva de TREM2 foi associado a patologias neuroinflamatórias e neurodegenerativas humanas, o aumento da expressão de um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem usando os métodos descritos aqui pode ser usado para tratar ou prevenir tal doença neuroinflamatória ou neurodegenerativa. Os ácidos nucleicos codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase, ou vetores ou células compreendendo tais ácidos nucleicos, também são adequados para tratar ou prevenir distúrbios autoimunes, inflamatórios ou malignos mediados por ou associados a clivagem proteolítica extensa de TREM2.
[00108] Ácidos nucleicos ou vetores que podem aumentar o nível de expressão de TREM2 podem ser identificados por rastreio de ácidos nucleicos ou vetores candidatos usando ensaios de células in vitro, ensaios desprovidos de células e/ou modelos animais in vivo. Por exemplo, células podem ser transfectadas ou infectadas com um ácido nucleico ou vetor candidato. O nível de TREM2, que pode ser o nível de um polipeptíideo TREM2 tendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1 ou um seu fragmento, na superfície celular pode ser monitorado para determinar se o nível de TREM? está aumentado em comparação com o nível do polipeptídeo TREM2 em células não tratadas ou células tratadas com um ácido nucleico ou vetor de controle. O nível de TREM2 humano na superfície celular na amostra pode ser determinado por um ensaio conhecido na técnica, por exemplo, por citometria de fluxo, imuno-histoquímica, transferência Western, ensaio imunofluorescente, radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), fluorescência resolvida no tempo em formato homogêneo (HTRF) ou tomografia por emissão de pósitrons (PET), ou qualquer outra detecção imune com um anticorpo ou fragmento de anticorpo contra a proteína TREM2 humana.
[00109] Ácidos nucleicos, vetores ou células que podem aumentar o nível de expressão de TREM também podem ser identificados por rastreio de ácidos nucleicos, vetores ou células candidatos em mamíferos não humanos (por exemplo, mamíferos não humanos transgênicos em TREM?2 ou nocautes em TREM2). Por exemplo, o nível de expressão de TREM2 pode ser avaliado em um grupo de mamíferos não humanos administrados com os ácidos nucleicos, vetores ou células e comparado com mamíferos de controle não tratados para determinar se a administração dos ácidos nucleicos, vetores ou células resulta ou não em um aumento do nível de TREM2. Mamíferos não humanos incluem, por exemplo, roedores, tais como ratos, porquinhos da índia e camundongos, e animais de herdade, tais como porcos, ovelhas, cabras, cavalos e gado. Mamíferos não humanos também podem ser planejados para ficarem desprovidos de ácido nucleico endógeno codificando um polipeptídeo TREM2 ou para conterem ácido nucleico de TREM2 endógeno truncado ou desfeito (por exemplo,
animais nocaute).
[00110] Também são proporcionados aqui métodos para tratar uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo (por exemplo, um humano) por administração ao indivíduo de um ácido nucleico codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase como divulgado aqui, ou um vetor ou uma célula compreendendo tal ácido nucleico.
[00111] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM? é uma doença neuroinflamatória ou neurodegenerativa tal como doença de Alzheimer, demência frontotemporal, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Nasu-Hakola, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica (ALS), encefalite antirreceptor de NMDA, autismo, lúpus cerebral (NP-SLE), neuropatia periférica induzida por quimioterapia (CIPN), neuralgia pós-terapêutica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, Síndrome de Guillain-Barré (GBS), miosite de corpos de inclusão, doenças de depósito lisossômico, por exemplo, lipidose de esfingomielina (Niemann-Pick C) e mucopolissacaridose |1/ IIIB, leucodistrofia metacromática, neuropatia motora multifocal, Miastenia Gravis, Doença de Neuro-Behcet, neuromielite óptica (NMO), neurite óptica, polimiosite, dermatomiosite, encefalite de Rasmussen, Síndrome de Rett, derrame cerebral, mielite transversa, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, encefalite viral ou meningite bacteriana.
[00112] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM?2 inclui doenças relacionadas com o SNC, doenças relacionadas com o SNP, inflamação sistêmica e outras doenças relacionadas com inflamação, dor e sintomas de privação causados por um abuso de substâncias químicas, doenças ou distúrbios relacionados com o SNC incluem distúrbios de ansiedade geral, distúrbios cognitivos, deficiências e disfunções de aprendizagem e memória, doença de
Alzheimer (ligeira, moderada e grave), distúrbio de deficiência de atenção e hiperatividade, doença de Parkinson, demência em doença de Parkinson, doença de Huntington, ALS, distúrbios neurodegenerativos priônicos tais como doença de Creutzfeld-Jacob e doença de Kuru, síndrome de Gilles de la Tourette, psicose, depressão e distúrbios depressivos, mania, depressão maníiaca, esquizofrenia, as deficiências cognitivas em esquizofrenia, distúrbios obsessivos compulsivos, distúrbios de pânico, distúrbios da nutrição, narcolepsia, nocicepção, demência relacionada com SIDA, demência senil, enfraquecimento cognitivo ligeiro relacionado com a idade (MCI), enfraquecimento da memória associado à idade, autismo, dislexia, discinesia tardia, epilepsia e distúrbios convulsivos, distúrbios de estresse pós-traumático, anoxia transiente, pseudodemência, síndrome pré-menstrual, síndrome de fase lútea tardia, síndrome de fadiga crônica e cansaço devido à diferença horária.
[00113] A doença ou distúrbio relacionado com TREM2 também inclui: distúrbios imunológicos, especialmente envolvendo distúrbios inflamatórios (por exemplo, infecção bacteriana, infecção fúngica, infecção viral, infecção por protozoários ou outros parasitas, psoríase, septicemia, malária cerebral, doença inflamatória do intestino, artrite, tal como artrite reumatoide, foliculite, impetigo, granulomas, pneumonias lipoides, vasculite, e osteoartrite), distúrbios autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide, tireoidite, tal como tireoidite de Hashimoto e doença de Graves, diabetes resistente a insulina, anemia perniciosa, doença de Addison, pênfigo, vitiligo, colite ulcerativa, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), síndrome de Sjogren, esclerose múltipla, dermatomiosite, doença do tecido conjuntivo misto, escleroderma, polimiosite, rejeição de enxerto (tal como rejeição de aloenxerto), distúrbios de células T (por exemplo, SIDA), distúrbios inflamatórios alérgicos (por exemplo, alergias da pele e/ou mucosa, tais como rinite alérgica, asma, psoríase),
distúrbios neurológicos, distúrbios oculares, distúrbios embrionários ou quaisquer outros distúrbios (por exemplo, tumores, cânceres, leucemia, doenças mieloides e traumatismos) que estão direta ou indiretamente associados a atividade e/ou expressão aberrantes de TREM2.
[00114] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM? é um distúrbio autoimune, inflamatório ou maligno mediado por ou associado a clivagem proteolítica extensa de TREM2 ou células expressando variantes aberrantes ou mutadas do receptor TREM2. Exemplos de doenças autoimunes incluem, sem limitação, artrite (por exemplo, artrite reumatoide, artrite crônica progressiva e artrite deformante) e doenças reumáticas, incluindo afecções inflamatórias e doenças reumáticas envolvendo perda óssea, dor inflamatória, espondiloartropatias incluindo espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, artrite reativa, artrite psoriática, e artrite enteropática, hipersensibilidade (incluindo hipersensibilidade das vias aéreas e hipersensibilidade dérmica) e alergias. Doenças autoimunes incluem distúrbios hematológicos autoimunes (incluindo, por exemplo, anemia hemolítica, anemia aplásicay anemia pura dos eritrócitos e trombocitopenia idiopática), lúpus eritematoso sistêmico, distúrbios musculares inflamatórios, policondrite, escleroderma, granulomatose de Wegener, dermatomiosite, hepatite ativa crônica, miastenia gravis, psoríase, síndrome de Steven-Johnson, psilose idiopática, oftalmopatia endócrina, doença de Graves, sarcoidose, esclerose múltipla, cirrose biliar primária, diabetes juvenil (diabetes mellitus de tipo |), uveiíte (anterior e posterior), queratoconjuntivite seca e queratoconjuntivite vernal, fibrose pulmonar intersticial, artrite psoriática e glomerulonefrite (com e sem síndrome nefrótica, por exemplo, incluindo gota, histiocitose de células de Langerhans, síndrome nefrótica idiopática ou nefropatia de alterações mínimas), tumores, doença inflamatória da pele e córnea, miosite, afrouxamento de implantes ósseos, distúrbios metabólicos, tais como aterosclerose, diabetes e dislipidemia.
[00115] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM2 é selecionado de asma, bronquite, pneumoconiose, enfisema pulmonar, outras doenças obstrutivas ou inflamatórias das vias aéreas incluindo fibrose pulmonar idiopática ou COPD.
[00116] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM? é um distúrbio maligno hematopoiético ou hepatopoético tal como leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, distúrbios mieloproliferativos, síndromes mielodisplásicas, mieloma múltiplo, hemoglobinúria paroxística noturna, anemia de Fanconi, talassemia major, síndrome de Wiskott-Aldrich, linfo-histiocitose hemofagocítica.
[00117] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM? é selecionado de asma, encefalite, doença inflamatória do intestino, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), distúrbios alérgicos, choque séptico, fibrose pulmonar, espondiloartropatia indiferenciada, artropatia indiferenciada, artrite, osteólise inflamatória, ou inflamação crônica resultante de infeções virais ou bacterianas crônicas.
[00118] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM? é selecionado de demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência mista, doença de Creutzfeldt-Jakob, hidrocéfalo de pressão normal, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, doença de Taupatia, doença de Nasu-Hakola, derrame cerebral, traumatismo agudo, traumatismo crônico, lúpus, colite aguda e crônica, cicatrização de feridas, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa, obesidade, Malária, tremor essencial, lúpus do sistema nervoso central, doença de Behcet, doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy, atrofia de múltiplos sistemas, síndrome de Shy-Drager, paralisia supranuclear progressiva, degenerescência ganglionar basal cortical, encefalomielite aguda disseminada, distúrbios granulomatosos, Sarcoidose, doenças do envelhecimento, crises convulsivas, lesão da medula espinhal, lesão cerebral traumática, degenerescência macular relacionada com a idade, glaucoma, retinite pigmentosa, degenerescência retiniana, infecção do trato respiratório, sepse, infecção ocular, infecção sistêmica, lúpus, artrite, esclerose múltipla, baixa densidade óssea, osteoporose, osteogênese, doença osteopetrótica, doença óssea de Paget e câncer.
[00119] Emalgumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM? é selecionado de demência, demência frontotemporal, doença de Alzheimer, doença de Nasu-Hakola e esclerose múltipla. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM2 é uma demência tal como demência frontotemporal, doença de Alzheimer, demência vascular, demência semântica ou demência com corpos de Lewy. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM2 é doença de Alzheimer. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio relacionado com TREM2 é demência frontotemporal.
[00120] Em algumas modalidades, o ácido nucleico, vetor ou célula é administrado ao indivíduo por uma via intravenosa, intracraniana, intratecal, subcutânea ou intranasal.
[00121] Em algumas modalidades, tais métodos também incluem avaliar o nível de TREM2 humano da superfície celular em uma amostra obtida de um indivíduo, por exemplo, uma amostra de fluido cerebrospinal. O nível de TREM2 humano na superfície celular na amostra pode ser determinado por um ensaio conhecido na técnica, por exemplo, por citometria de fluxo, imuno-histoquímica, transferência Western, ensaio imunofluorescente, radioimunoensaio (RIA), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), fluorescência resolvida no tempo em formato homogêneo (HTRF) ou tomografia por emissão de pósitrons (PET), ou qualquer outra detecção imune com um anticorpo ou fragmento de anticorpo contra a proteína TREM2 humana.
[00122] “Também são proporcionados aqui usos de um ácido nucleico codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase como divulgado aqui, ou um vetor ou uma célula compreendendo tal ácido nucleico, para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo. Também estão incluídos usos de um ácido nucleico codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase como divulgado aqui, ou um vetor ou uma célula compreendendo tal ácido nucleico, na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREM?2. Terapias de Combinação
[00123] Os vários tratamentos descritos acima podem ser combinados com outros parceiros de tratamento tais como os padrões de cuidados de saúde correntes para uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2, por exemplo, os padrões de cuidados de saúde correntes para doença de Alzheimer, demência frontotemporal, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica ou doença de Nasu- Hakola. Por exemplo, ácidos nucleicos codificando um mutante de TREM?2 humano resistente a clivagem por shedase como descrito aqui ou vetores ou células contendo tais ácidos nucleicos podem ser combinados com um ou mais de inibidores de BACE, anticorpos anti- Tau, anticorpos anti-beta amiloide, FTY720, BG12, interferon beta ou Tysabri. Em conformidade, os métodos para tratar uma doença ou distúrbio relacionado com TREM? descritos aqui também podem incluir administrar um segundo agente ao indivíduo necessitado de tratamento.
[00124] O termo "combinação" se relaciona com uma combinação fixa em uma forma unitária de dosagem ou uma administração combinada em que um composto da presente invenção e um parceiro de combinação (por exemplo, outro fármaco conforme explicado abaixo,
também denominado "agente terapêutico" ou "coagente") pode ser administrada independentemente ao mesmo tempo ou separadamente dentro de intervalos de tempo, especialmente quando estes intervalos de tempo permitem que os parceiros de combinação exibam um efeito cooperativo, por exemplo, sinérgico. Os componentes únicos podem ser embalados em um kit ou separadamente. Um ou ambos os componentes (por exemplo, pós ou líquidos) podem ser reconstituídos ou diluídos até uma dose desejada antes da administração. Os termos “coadministração” ou “administração combinada” ou similares, como usados aqui, pretendem abranger a administração do parceiro de combinação selecionado a um único indivíduo em sua necessidade (por exemplo, um paciente) e pretendem incluir os regimes de tratamento em que os agentes não são necessariamente administrados pela mesma via de administração ou ao mesmo tempo. O termo “combinação farmacêutica”, como usado aqui, significa um produto que resulta da mistura ou combinação de mais do que um agente terapêutico e inclui tanto combinações fixas como não fixas dos agentes terapêuticos. O termo "combinação fixa" significa que os agentes terapêuticos, por exemplo, um composto da presente invenção e um parceiro de combinação, são ambos administrados a um paciente simultaneamente na forma de uma entidade ou dosagem única. O termo "combinação não fixa" significa que os agentes terapêuticos, por exemplo, um composto da presente invenção e um parceiro de combinação, são ambos administrados a um paciente como entidades separadas simultânea, concomitante ou sequencialmente sem limites de tempo específicos, em que tal administração fornece níveis terapeuticamente eficazes dos dois compostos no corpo do paciente. O último também se aplica à terapia de coquetel, por exemplo, a administração de três ou mais agentes terapêuticos.
[00125] O termo "combinação farmacêutica", como usado aqui, se relaciona com uma combinação fixa em uma forma unitária de dosagem ou combinação não fixa ou um kit de partes para a administração combinada em que dois ou mais agentes terapêuticos podem ser administrados independentemente ao mesmo tempo ou separadamente dentro de intervalos de tempo, especialmente quando estes intervalos de tempo permitem que os parceiros de combinação exibam um efeito cooperativo, por exemplo, sinérgico.
[00126] O termo "terapia de combinação" se relaciona com a administração de dois ou mais agentes terapêuticos para tratar uma afecção ou distúrbio terapêutico descrito na presente divulgação. Tal administração engloba a coadministração destes agentes terapêuticos de um modo substancialmente simultâneo, tal como em uma única cápsula tendo uma razão fixa de ingredientes ativos. Alternativamente, tal administração engloba coadministração em recipientes múltiplos ou separados (por exemplo, comprimidos, cápsulas, pós e líquidos) para cada ingrediente ativo. Pós e/ou líquidos podem ser reconstituídos ou diluídos até uma dose desejada antes da administração. Além disso, tal administração engloba também uso de cada tipo de agente terapêutico de um modo sequencial, aproximadamente ao mesmo tempo ou em diferentes momentos. Em qualquer um dos casos, o regime de tratamento proporcionará efeitos benéficos da combinação de fármacos no tratamento das afecções ou distúrbios descritos aqui. Preparação de Amostras
[00127] Amostras usadas nos métodos descritos aqui podem ser obtidas de um indivíduo usando qualquer um dos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por biopsia ou cirurgia. Por exemplo, uma amostra compreendendo fluido cerebrospinal pode ser obtida por punção lombar, na qual uma agulha fina ligada a uma seringa é inserida no canal espinhal na área lombar e é criado um vácuo tal que fluido cerebrospinal possa ser sugado através da agulha e recolhido na seringa. Imagiologia TC, ultrassons ou um endoscópio podem ser usados para guiar este tipo de procedimento. A amostra pode ser instantaneamente congelada e armazenada a -80 “C para uso posterior. A amostra também pode ser fixada com um agente fixador, tal como formaldeído, paraformaldeído ou ácido acético/etanol. RNA ou proteína pode ser extraído de uma amostra fresca, congelada ou fixada para análise. Composições — Farmacêuticas, Dosagem e Métodos de Administração
[00128] Também são proporcionadas aqui composições, por exemplo, composições farmacêuticas, compreendendo um ou mais ácidos nucleicos codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase como descrito aqui, ou vetores ou células contendo tais ácidos nucleicos. Tais composições também podem incluir outro agente, por exemplo, um padrão de cuidado de saúde corrente para uma doença a ser tratada.
[00129] “Composições farmacêuticas incluem tipicamente um transportador farmaceuticamente aceitável. Como usada aqui, a linguagem "transportador farmaceuticamente aceitável" inclui solução salina, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e similares, compatíveis com administração farmacêutica. Composições farmacêuticas são tipicamente formuladas para serem compatíveis com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem administração parentérica (por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal), oral, intracraniana, intratecal ou intranasal (por exemplo, inalação), intradérmica, subcutânea ou transmucosa. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas para administrarem moléculas de ligação a TREM?2 para atravessarem a barreira hematoencefálica.
[00130] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, tais como albumina do soro humano, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglico! e lanolina.
[00131] Métodos de formulação de composições farmacêuticas adequadas são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy". 21.º edição, 2005, e os livros da série "Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs" (Dekker, NY). Por exemplo, soluções ou suspensões usadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente esterilizado como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicois, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetracético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses feitos de vidro ou plástico.
[00132] “Composições farmacêuticas adequadas para uso injetável podem incluir soluções (quando solúveis em água) ou dispersões aquosas esteriizadas e pós esteriizados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis esterilizadas. Para administração intravenosa, transportadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL'Y (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser esterilizada e deve ser fluida de modo a existir capacidade de manuseamento fácil com seringa. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e ser conservada contra a ação contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido e similares) e suas misturas adequadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos será preferencial incluir na composição agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conferida incluindo na composição um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
[00133] Soluções injetáveis esterilizadas podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização filtrada.
[00134] Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo esterilizado que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós esterilizados para a preparação de soluções injetáveis esteriizadas, os métodos de preparação preferenciais são secagem em vácuo e liofilização que originam um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração.
[00135] —Formulações parentéricas podem consistir em uma dose de bólus único, uma infusão ou uma dose de bólus de carga seguido de uma dose de manutenção. Estas composições podem ser administradas em intervalos específicos fixos ou variáveis, por exemplo, uma vez ao dia, ou em uma base "consoante o necessário".
[00136] Uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo, tampão de acetato, fosfato ou citrato), um tensoativo (por exemplo, polissorbato), opcionalmente um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana), etc. Preparações para administração periférica incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas esterilizadas. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. Transportadores aquosos incluem, por exemplo, água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo solução salina e meios tamponados. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende tampão de fosfato 0,01-0,1 M ou solução salina 0,8%. Outros veículos parentéricos comuns incluem soluções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem regeneradores de fluidos e nutrientes, regeneradores de eletrólitos, como os baseados em dextrose de Ringer, e afins. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo,
antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e afins.
[00137] “Composições orais incluem geralmente um diluente inerte ou um transportador comestível. Para o propósito de administração terapêutica oral, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, comprimidos para chupar, ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. Composições orais também podem ser preparadas usando um transportador fluido para uso como colutório. Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, comprimidos para chupar e similares podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de natureza similar: um aglutinante, tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente, tal como amido ou lactose, um agente desintegrante, tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante, tal como estearato magnésio ou Sterotes; um agente deslizante, tal como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante, tal como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante, tal como horteláã-pimenta, salicilato de metila ou aroma de laranja.
[00138] Para administração por inalação, os compostos podem ser administrados na forma de uma pulverização de aerossol a partir de um recipiente ou dispensador pressurizado que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono ou um nebulizador. Tais métodos incluem os descritos na Patente dos EUA N.º 6,468,798. A administração sistêmica de um composto terapêutico como descrito aqui também pode ser efetuada por meios transmucosos ou transdérmicos. Para administração transmucosa ou transdérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para administração transmucosa, detergentes, sais biliares e derivados do ácido fusídico. A administração transmucosa pode ser realizada usando pulverizações nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em pomadas, bálsamos, géis ou cremes, como é geralmente conhecido na técnica.
[00139] Em uma modalidade, os compostos terapêuticos são preparados com transportadores que protegerão os compostos terapêuticos contra eliminação rápida do corpo, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de administração microencapsulados.
[00140] As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, pacote ou dispensador juntamente com instruções para administração.
[00141] Em exemplos não limitadores, a composição farmacêutica contendo pelo menos um agente farmacêutico é formulada como um líquido (por exemplo, um líquido termofixo), como um componente de um sólido (por exemplo, um pó ou um polímero biocompatível biodegradável (por exemplo, um polímero biocompatível biodegradável catiônico)) ou como um componente de um gel (por exemplo, um polímero biocompatível biodegradável). Em algumas modalidades, a pelo menos composição contendo pelo menos um agente farmacêutico é formulada como um gel selecionado do grupo de um gel alginato (por exemplo, alginato de sódio), um gel à base de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose ou carboxietilcelulose) ou um gel à base de quitosana (por exemplo, glicerofosfato de quitosana). Exemplos não limitadores adicionais de polímeros de eluição de fármacos que podem ser usados para formular quaisquer das composições farmacêuticas descritas — aqui incluem carragenano, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, dextrana em combinação com álcool polivinílico,
dextrana em combinação com ácido poliacrílico, ácido poligalacturônico, polissacarídeo galacturônico, ácido polissaláctico, ácido poliglicólico, goma tamarindo, goma xantana, goma de celulose, goma guar (carboximetilguar), pectina, ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico, N- isopropilpoliacrilamida, polioxietileno, polioxipropileno, ácido plurônico, ácido poliláctico, ciclodextrina, cicloamilose, resilina, polibutadieno, copolímero de N-(2-Hidroxipropil)metacrilamida (HPMA), anidrato maleico - éter de alquilvinila, polidepsipeptídeo, poli-hidroxibutirato, policaprolactona, polidioxanona, polietilenoglicol, poliorganofosfazeno, poliortoéster, polivinilpirrolidona, ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA), polianidridos, polissilamina, poli-N-vinilcaprolactama e gelano.
[00142] Adosagem, toxicidade e eficácia terapêutica dos compostos terapêuticos podem ser determinadas mediante procedimentos farmacêuticos comuns em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar o valor LDso (a dose letal para 50% da população) e o valor EDso (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão na dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o Índice terapêutico e pode ser expresso na forma da razão LDso/EDso. Compostos que exibem elevados índices terapêuticos são preferenciais. Embora possam ser usados compostos que exibam efeitos secundários tóxicos, deve ter-se o cuidado de planejar um sistema de administração que dirija tais compostos para o sítio de tecido afetado com a finalidade de minimizar danos potenciais em células não infectadas e, desse modo, reduzir efeitos secundários.
[00143] Os dados obtidos de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagens para uso em humanos. A dosagem de tais compostos situa-se preferencialmente em uma gama de concentrações em circulação que incluem a EDso com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama, dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método divulgado aqui, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais de modo a alcançar um intervalo de concentrações no plasma em circulação que inclui o valor IC5o (isto é, a concentração do composto de teste que alcança uma inibição semimáxima de sintomas), conforme determinado em cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar mais rigorosamente doses úteis em humanos. Níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho. Kits
[00144] “Também são proporcionados aqui kits incluindo um ou mais ácidos nucleicos codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase como descrito aqui ou vetores ou células contendo tais ácidos nucleicos e instruções para uso. Instruções para uso podem incluir instruções para diagnóstico ou tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREMZ2. Kits proporcionados aqui podem ser usados de acordo com qualquer um dos métodos descritos aqui. Os peritos na técnica estarão cientes de outros usos adequados para kits proporcionados aqui e serão capazes de empregar os kits para tais usos. Os kits proporcionados aqui também podem incluir uma postagem (por exemplo, um envelope ou embalagem postal com porte pago) que pode ser usada para enviar de volta a amostra para análise, por exemplo, para um laboratório. O kit pode incluir um ou mais recipientes para a amostra, ou a amostra pode ficar contida em um frasco padronizado de recolha de sangue. O kit também pode incluir um ou mais de um formulário de consentimento informado, um formulário de requisição de teste e instruções sobre como usar o kit em um método descrito aqui. Métodos para uso de tais kits também estão incluídos aqui. Um ou mais dos formulários (por exemplo, o formulário de requisição de teste) e o recipiente contendo a amostra podem ser codificados, por exemplo, com um código de barras, para identificar o indivíduo que forneceu a amostra.
[00145] O perito na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui que podem ser usados na prática da presente invenção. De fato, a presente invenção não está de modo nenhum limitada aos métodos e materiais descritos.
EXEMPLOS
[00146] A invenção é adicionalmente descrita nos seguintes exemplos, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações. Exemplo 1: Materiais e Métodos Compostos.
[00147] Gl254023 ([[(18S)-2,2-dimetil-1-metilcarbamoil-1- propillamida) do ácido ((2R,3S)-3-(formil-hidroxiamino)-2-(3-fenil-1- propil)butanoico foi sintetizado como descrito em Hundhausen et al, Blood. 2003;102:1186-1195). DPC333 ((2R)-2-((3R)-3-amino-3(4-[2- metil-4-quinolinil)]metóxilfenil)-2-oxopirrolidinil)-N-hidróxi-4- metilpentanamida)) foi sintetizado como descrito em Qian et a/., "Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals" 35, 1916- 1925, 2007. Cultura de Células.
[00148] Células THP1 coexpressando de modo estável Cas9 e um gene de resistência a blasticidina fornecido por lentivírus foram cultivadas em meio RPMI contendo FBS 10%, L-glutamina 1%, pen/estrep 1% e 10 ug/mL de blasticidina (Thermo Fisher Scientific). As células foram cultivadas a 37 ºC em atmosfera de 5% de CO». Geração de Linhas Nocaute em ADAM17 e ADAM10.
[00149] Células THP1-Cas9 foram infectadas com lentivírus expressando o gene de resistência a puromicina e saRNA (quanto ao planejamento do vetor ver Hoffman, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 3128-3133, 2014) visando ADAM1O0 (GTAATGTGAGAGACTTTGGG, SEQ ID NO: 75) ou ADAM17 (CCGAAGCCCGGGTCATCCGG, SEQ ID NO: 76). O empacotamento lentiviral foi efetuado em células HEK293T como descrito previamente. Em resumo, 30 ul de sobrenadante de sa RNA lentiviral foram adicionados a 1x10º células THP1-Cas9 em 2 mL de meio contendo 5 pyg/mL de Polybrene (Sigma) e submetidos a rotação a 300 g durante 90 minutos em uma placa de 6 poços. Após 24 horas, as células foram submetidas a rotação e ressuspensas em meio de cultura fresco contendo 1,5 ug/mL de puromicina. Após 4 semanas de trocas semanais de meio, DNA genômico foi isolado usando um Kit Quick-gDNA miniprep (Zymo Research) para avaliar as inserções e deleções (indels) presentes na reunião por sequenciamento da geração seguinte (NGS). Para isolar clones contendo somente indels por deslocamento do quadro de leitura, células foram plaqueadas a diluição limitante para placas de 96 poços. Por expansão dos clones, foram avaliados por NGS e clones contendo somente alelos por deslocamento do quadro de leitura foram selecionados para ensaios a jusante. Análise de indels por NGS.
[00150] Para preparar células manipuladas para NGS, cada alvo foi amplificado usando iniciadores específicos para loci. Foram efetuadas duas rondas de PCR. A primeira ronda empregou iniciadores específicos para loci para amplificar a região editada. Os iniciadores para ADAM1O foram ATTAGACAATACTTACTGGGGATCC (SEQ ID NO: 77) e GGEAAGCTCTGGAGGAATATGTG (SEQ ID NO: 78) e os iniciadores para ADAM17 foram CCCCCAAACACCTGATAGAC (SEQ ID NO: 79) e CCAGAGAGGTGGAGTCGGTA (SEQ ID NO: 80). O produto formado durante a primeira ronda foi então usado como modelo para uma segunda ronda de PCR para adicionar índices duais compatíveis com o sistema Illumina. As sequências lIllumina Nextera Adapter para ambas as regiões-alvo foram TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ |D NO: 81) e GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG (SEQ ID NO: 82). Bibliotecas foram quantificadas por qRT-PCR e subsequentemente sequenciadas no sistema Illumina MiSeg. Para análise de sequências, leituras brutas foram alinhadas com uma sequência de referência, então personalizadas com base no genótipo. Por fim, genótipos personalizados foram agrupados em uma de três categorias: de tipo selvagem, no quadro, e com deslocamento do quadro. Expressão na superfície celular de TREM2 mutado em células HEK293.
[00151] Mutantes de TREM2 humano foram gerados usando o Kit de Mutagênese Dirigida a Sítios QuikChange (Stratagene) e confirmados por análise de sequências. Transfecções de construtos de DNA complementar (cCDNA) foram efetuadas em uma razão 1:1 de hDAP12 e TREM2 em células HEK-FT usando reagente Lipofectamina LTX (Thermofischer) de acordo com as recomendações do fabricante. 48 h após a transfecção, células foram tratadas durante 30 min com 50 ng/ml de PMA ou DMSO 0,05% e separadas com uma solução de separação de células Accutase (Sigma) e coradas com anticorpo anti- TREMZ2 humano de cabra AF1828 (R&D Systems) ou controle de isótipo seguido de incubação com o anticorpo secundário conjugado a Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). A aquisição foi efetuada usando um BD FACSCanto |! (BD Biosciences). Expressão de TREM2 em macrófagos e células CHO humanos
[00152] Células CHO foram transfectadas para coexpressarem hDAP12 e hNhTREM2 usando reagente Lipofectamina LTX (Thermofischer) de acordo com as recomendações do fabricante. Um clone positivo foi selecionado e denominado CHO-hDAP12-hTREM?2.
Macrófagos M2A humanos foram obtidos de creme leucocitário usando um kit de isolamento negativo para monócitos (Stem cell technologies) e diferenciados durante 5 dias em meio RPMII640 com Glutamax (Gibco) suplementado com FBS 10% (Gibco), PenStrep (Gibco), Piruvato de Sódio 1% (Gibco), Tampão HEPES 0,025 M (Gibco), B- mercaptoetanol 0,05 mM (Gibco), M-CSF (40 ng/mL) e IL-4 (50 ng/mL). TREM? da superfície celular foi detectado por FACS como descrito acima. Imagiologia de células vivas.
[00153] “Macrófagos M2A humanos ou CHO-hDAP12-hTREM?2 foram semeados em placas de 384 poços (Greiner) e tratados com inibidores de ADAM DPC333 ou GI254023 a concentrações indicadas nas figuras. 16 h mais tarde, células foram tratadas durante 30 minutos com PMA (50 ng/mL) ou DMSO 0,1% durante 30 minutos. Placas foram colocadas sobre gelo e coradas com anticorpo anti-TREM2 humano de cabra AF1828 (R&D Systems) ou controle de isótipo e corante Hoechst seguido de incubação com o anticorpo secundário anticabra conjugado a Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Foram adquiridas imagens usando um analisador InCell2000 (GE Healthcare). Para a quantificação de imagens, o software gratuito de fonte aberta CellProfiler foi aplicado. Ensaio de genes repórter em células BWVZ
[00154] Células repórter de timoma BWZ, que expressam lacZ sob o controle do promotor para o fator nuclear de células T ativadas (NFAT, Hsieh et al, Journal of Neurochemistry 109, 1144-1156, 2009) foram transfectadas para coexpressarem mDAP12 e hTREM2 TS ou TREM2 T2duplo. Células foram semeadas em RPMI sem vermelho de fenol suplementado com FBS 2% e aminoácidos não essenciais 1% em placas de microtitulação de elevada ligação (Greiner) pré-revestidas com mAb de rato anti-TREM2 de camundongo/humano (R&D, MAB 17291) ou controle de isótipo. A cultura de células foi continuada durante 16 h. A atividade de genes repórter foi avaliada com o sistema de ensaio Beta-glo (Promega) de acordo com as recomendações do fabricante usando um leitor de múltiplas etiquetas Envision 2104 (Perkin Elmer). Imunopurificação.
[00155] TREM? liberado foi purificado do sobrenadante de células através de imunopurificação em microescala. Tal foi efetuado na plataforma MEA (PhyNexus) e pontas revestidas com Estreptavidina (PTR 92-05-05, Phynexus) foram usadas. Em primeiro lugar, as pontas são equilibradas com PBS, então 200 uL de anticorpo anti-TREM2 biotinilado (0,55 pmol/uL, BAF1828 da R&D Systems) são carregados na pcoluna de estreptavidina (5 uL de volume do leito) a uma velocidade de 0,25 mL/min e 8 passagens. Após uma lavagem com PBS, o TREM2 liberado é capturado de um sobrenadante de células (200 uL) a uma velocidade de 25 mL/min e 12 passagens. É seguido de lavagem com PBS e eluição por Glicina 0,1 M pH 2,5 (2 x 4 passagens) para um volume final de 2x60 uL. A última solução é neutralizada com a adição de Tris-HCI 1 M pH 10 (5 uL), então foi seca (Speedvac) e re-hidratada com ureia 8 M (5 uL, Fluka) e NH.CO; 0,4 M (30 uL, Fluka). A amostra é então reduzida (2 ul de DTT 1 M, 30 min a 50 ºC), alquilada (6 uL de IAA 1 M (Sigma), 30 min à TA no escuro) e a reação foi terminada com a adição de DTT 1 M (2 ul) e NH.CO;3 0,4 M (30 uL). A amostra resultante é digerida por Tripsina ou enzima Asp-/Glu-C (+1 ul de Tripsina (Promega) ou Asp-/Glu C (Roche), 1 ug/uL, pH 8, e incubação durante a noite a 37 ºC). A amostra digerida é finalmente clarificada com HCOOH (1 uL, Fluka) e 25 uL do digesto resultante foram injetados na plataforma de LC-EM. Espectrometria de massa.
[00156] Identificação do sítio de clivagem por mapeamento de peptídeos: as análises de LC-MSE foram realizadas usando um espectrômetro de massa SYNAPT G2S QTOF (WATERS) acoplado a um UPLC (classe ACQUITY |, WATERS). Uma coluna de UPLC BEH C18 (1,7 um, 1xX100 mm, WATERS) foi usada para a separação de peptídeos. Um gradiente de eluição com fase móvel A (HCOOH 0,1% em água) e fase móvel B (HCOOH 0,1% em acetonitrila) foi gerado usando o seguinte programa: 1) isocrático a 2% de B durante 3 min; 2) gradiente linear desde 2 até 30% de B desde 3 até 90 min; 3) gradiente linear desde 30 até 100% de B desde 90 até 95 min; 4) isocrático a 100% de B desde 95 até 105 min; 5) gradiente linear desde 100 até 2% de B desde 105 até 105,5 min; e finalmente 6) isocrático a 2% de B desde 105,5 até 120 min. O espectrômetro de massa operou em modo de resolução positiva com correção automática de massas através de um sistema LockSpray (peptídeo P14R, m/z 767,433, infundido a 250 fmol a 5 uL/min, a frequência da troca foi a cada 20 s para 0,5 s por varredura, média de 3 varreduras). 2 traços de EM foram adquiridos, um EM e um para MSE. Foram ambos adquiridos no intervalo de massas m/z 50 — 2000, tempo de varredura 0,5 s, voltagem no capilar 3 kV, voltagem no cone 40 V. No modo MSE, a voltagem na armadilha foi aumentada em rampa em cada varredura desde 20 até 40 V. Adicionalmente, um traço de UV foi adquirido a um comprimento de onda de 214 nm.
Identificação do sítio de clivagem por medição de massas intatas.
[00157] As análises de LC-EM foram realizadas usando um espectrômetro de massa SYNAPT G1 QTOF (WATERS) acoplado a um UPLC (classe ACQUITY |, WATERS). Uma coluna de UPLC BEH C4 (1,7 um, 1x100 mm, WATERS) foi usada para a separação de proteínas. Um gradiente de eluição com fase móvel A (HCOOH 0,1% em água) e fase móvel B (HCOOH 0,1% em acetonitrila) foi gerado usando o seguinte programa: 1) isocrático a 5% de B durante 1,5 min; 2) gradiente linear desde 5 até 25% de B desde 1,5 até 2 min; 3)
gradiente linear desde 25 até 35% de B desde 2 até 12 min; 4) gradiente linear desde 35 até 95% de B desde 12 até 13 min; 5) isocrático a 95% de B desde 13 até 15 min; 5) gradiente linear desde 95 até 5% de B desde 15 até 15,5 min; e finalmente 6) isocrático a 5% de B desde 15,5 até 20 min. O espectrômetro de massa operou em modo de resolução positiva e foi calibrado com Nal 2 mg/mL. O traço de EM foi adquirido no intervalo de massas m/z 600 — 4500, tempo de varredura 0,5 s, voltagem no capilar 3 kV, voltagem no cone 40 V, temperatura de dessolvatação 200 ºC, fluxo de gás no cone 50 L/h. Adicionalmente, um traço de UV foi adquirido a um comprimento de onda de 214 nm. Identificação de glicosilação O-ligada.
[00158] As análises de LC-MSE foram realizadas usando um espectrômetro de massa QTOF Premier (WATERS) acoplado a um UPLC (classe ACQUITY H, WATERS). Uma coluna de UPLC BEH C18 (1,7 um, 1x100 mm, WATERS) foi usada para a separação de peptídeos. Um gradiente de eluição com fase móvel A (HCOOH 0,1% em 98% de água e 2% de acetonitrila) e fase móvel B (HCOOH 0,1% em acetonitrila) foi gerado usando o seguinte programa: 1) isocrático a 2% de B durante 3 min; 2) gradiente linear desde 2 até 30% de B desde 3 até 90 min; 3) gradiente linear desde 30 até 100% de B desde 90 até 95 min; 4) isocrático a 100% de B desde 95 até 105 min; 5) gradiente linear desde 100 até 2% de B desde 105 até 105,5 min; e finalmente 6) isocrático a 2% de B desde 105,5 até 120 min. O espectrômetro de massa operou em modo normal positivo com um sistema LockSpray (peptídeo P14R, infundido a 1 pmol a 10 uL/min, a frequência da troca foi a cada 20 s para 0,5 s por varredura, média de 3 varreduras). À correção de massas foi efetuada por aplicação de uma massa de calibração (2+, 767,433 Da) durante o processamento de dados com PLGS (WATERS). 2 traços de EM foram adquiridos, um EM e um para MSE. Foram ambos adquiridos no intervalo de massas m/z 50 — 2000,
tempo de varredura 0,5 s, voltagem no capilar 3 kV, voltagem no cone 40 V. No modo MSE, a voltagem na armadilha foi aumentada em rampa em cada varredura desde 20 até 40 V. Adicionalmente, um traço de UV foi adquirido a um comprimento de onda de 214 nm. Análise estatística.
[00159] A análise estatística foi efetuada usando software Prism (GraphPad, San Diego, CA) usando ANOVA e teste t de Student quando apropriado. Um valor p < 0,05 foi considerado significativo. Exemplo 2: Inibidores de ADAM17 estabilizam TREM2 na superfície celular
[00160] Receptor desencadeador expresso em células mieloides (TREM2) é um glicoproteína transmembrana de tipo | e um membro da superfamília de receptores de imunoglobulinas (lg) (Bouchon et al., The Journal of Experimental Medicine 194, 1111-1122, 2001). A expressão de TREM? foi mostrada em macrófagos, células dendríticas, microglia e osteoclastos, e a expressão aparenta ser temporal e espacialmente regulada (Lue et al., Neuroscience 302, 138-150, 2015; Schmid et al, Journal of Neurochemistry 83, 1309-1320, 2002; Sessa et al., The European Journal of Neuroscience 20, 2617-2628, 2004). Em macrófagos, a expressão de TREM2 é sobrerregulada durante inflamação, por exemplo, a expressão atinge o pico 2-3 dias após provocação com tioglicolato em um modelo murino de peritonite (Turnbull et al., Journal of Immunology 177, 3520-3524, 2006). TREM2 também está enriquecido naquelas regiões da superfície celular de microglia que contatam placas AB ou detritos neuronais (Yuan et al. Neuron 90, 724-739, 2016). Alguns dos ligantes que são apercebidos por TREM2 neste ambiente foram recentemente identificados, por exemplo, fosfolipídeos e lipídeos de mielina (Poliani et al., The Journal of Clinical Investigation 125, 2161-2170, 2015) bem como ApoE (Atagi et al., The Journal of Biological Chemistry 290, 26043-26050, 2015;
Bailey et al., The Journal of Biological Chemistry 290, 26033-26042, 2015). Outros ligantes podem ser detritos neuronais associados a AB e placas uma vez que TREM? contribui para a captação de AB para microglia (XKiang et al., EMBO Molecular Medicine 8, 992-1004, 2016).
[00161] Talestábem em linha com estudos anteriores de associação em todo o genoma mostrando que um SNP de TREM?2, rs75932628-T codificando a variante R47H, conferiu um risco significativamente aumentado de doença de Alzheimer com surgimento tardio (LOAD) com razões de probabilidade de 5,05 (Guerreiro et al., The New England Journal of Medicine 368, 117-127, 2013) e 2,92 (Jonsson et al., The New England Journal of Medicine 368, 107-116, 2013). Estas razões de probabilidade são comparáveis às do gene de risco de AD APOE4 bem estabelecido (Neumann & Daly, The New England Journal of Medicine 368, 182-184, 2013). De notar que TREM2 mutado R47H exibe quase a mesma expressão na superfície celular de TREM2 TS (Kleinberger, 2014) mas está funcionalmente enfraquecido: a mutação R47H em TREM? reduz a ligação de ligantes lipídicos (Wang et al., Cell 160, 1061-1071, 2015) e ApoE (Atagi, 2015; Bailey, 2015). A mutação também reduz a capacidade fagocítica (Kleinberger, 2014) e impede a reciclagem de TREM?2 via Vps35 dentro do complexo retromérico (Yin et al., Traffic 17, 1286-1296, 2016). Alguns portadores de R47H humano sem AD foram caracterizados, e estes indivíduos perdem volume cerebral mais rapidamente do que não portadores (Rajagopalan et al., The New England Journal of Medicine 369, 1565-1567, 2013), têm uma função cognitiva mais pobre do que controles de idade correspondente (Jonsson et al., The New England Journal of Medicine 368, 107-116, 2013) e exibem sobrerregulação de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, RANTES, INFy) e sub-regulação de marcadores protetores (por exemplo, IL-4, ApoA1; Ver Roussos et al., Alzheimer's & Dementia: the Journal of the Alzheimer's Association 11, 1163-1170, 2015).
[00162] Para determinar a contribuição de ADAM1O ou ADAM17 para a liberação do ectodomínio de TREM2, inibidores seletivos foram identificados: DPC333 (Qian et al., Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals 35, 1916-1925, 2007) e GI254023 (Hundhausen et a/., Blood. 2003;102:1186-1195). DPC333 e GI254023 foram caracterizados quanto à seletividade inibidora para ADAM1O0 e ADAM17. A FIG. 2E mostrou que DPC333 é um inibidor mais potente em ADAM17 (IC5o < 0,6 nM) do que em ADAM1O (IC5so= 5,3 NM), e GI254023 exibe seletividade para ADAM1O (IC50o 1,5 nM) relativamente a ADAM17 (ICso= 196 nM). Usando imagiologia de células vivas, a expressão na superfície celular de hTREM?2 foi avaliada em células CHO-hDAP12-hTREM?2 após tratamento durante a noite das células com os dois inibidores de ADAM sob condições de liberação condicionada (FIG. 2A) ou após tratamento das células com PMA (FIG. 2B). O inibidor seletivo de ADAM1I7 DPC333 aumenta de modo dependente da dose níveis na superfície celular de TREM2 sob ambas as condições.
Um efeito limitado em níveis na superfície celular de TREM2 também é observado a concentrações mais elevadas para GI254023, mas somente sob condições de estado estacionário.
Este efeito poderá ser atribuído a inibição verdadeira de ADAM1O0 ou poderá ser causado por inibição inespecífica de ADAM17 por GI254023 quando usado a concentrações elevadas.
Em células tratadas com PMA ocorre uma ausência completa de efeito de GI254023 na expressão na superfície celular de TREM2 (FIG. 2B). Para aproximar um sistema celular fisiológico, uma experiência similar foi conduzida em macrófagos M2A humanos diferenciados de monócitos humanos CD14* (FIGs. 2C- 2D). Estes resultados replicam muito bem as descobertas iniciais em células CHO-hDAP12-hTREM2; o inibidor de ADAM1I7 DPC333 aumenta a expressão na superfície celular de TREM2 de modo dependente da dose sob ambas as condições (FIGs. 2C-2D) e o inibidor seletivo de ADAM1O exibe um pequeno efeito na liberação no estado estacionário (FIG. 2C).
[00163] Em suma, estas experiências indicam que, em macrófagos humanos, ADAM17 desempenha um papel crítico para a liberação de TREM?2, mas uma contribuição marginal de ADAM1O sob condições de estado estacionário não pode ser excluída. Exemplo 3: Ablação de ADAM17 em células THP1 reduz a liberação constitutiva
[00164] Para confirmar os resultados do Exemplo 2, uma abordagem genética foi usada para pesquisar adicionalmente a contribuição de ADAM10/17 para a liberação de TREM2. Células THP1 monocíticas humanas foram escolhidas como sistema-modelo que expressa endogenamente TREM2. Empregando a tecnologia CRISPR/CAS9, foram gerados clones que estão desprovidos de expressão de ADAM1O (AD10 H4) ou ADAM17 (AD17 G12) bem como uma linhagem de células de controle (gRNA Ctrl). A ausência de produtos genéticos foi verificada por análise FACS ou transferência Western (FIGs. 3C-3D).
[00165] TREM?2 e sSTREM?2 expressos na superfície celular foram avaliados nas três linhagens de células na mesma experiência usando três condições diferentes: ausência de tratamento refletindo liberação constitutiva, tratamento com PMA que ativa maximamente a liberação, e finalmente tratamento com PMA e DPC333. A perda de ADAM17 aumenta a expressão na superfície celular de TREM2 e reduz fortemente TREM?2 solúvel sob condições de liberação condicionada, ao passo que a ausência de ADAM1O não tem efeitos significativos (ver barras negras nas FIGs. 3A-3B), desse modo indicando que ADAM17 é a principal shedase contribuindo para liberação constitutiva. A ativação máxima de shedases com PMA conduz a uma forte redução de TREM2 na superfície celular na linhagem de células de controle e no clone deficiente em ADAM10. Tal é refletido num forte aumento em STREM?2.
Na linhagem de células deficientes em ADAM17, o tratamento com PMA também conduz a uma redução de TREM?2 na superfície celular, mas em menor extensão do que no clone de CRISPR de controle. Além disso, o aumento em sSTREM?2 é menor em comparação com o clone de CRISPR de controle tratado com PMA e clone deficiente em ADAM1O. No entanto, a clivagem de TREM2 no clone AD17 G12 na presença de PMA deve ser causada por uma shedase diferente de ADAM1I7. Em conformidade, no clone de ADAM1O0 H4, o aumento da liberação induzida por PMA poderá ser causado por ativação adicional de ADAM17. O cotratamento com PMA e DPC333 restabeleceu níveis na superfície celular de TREM2 em gRNA Ctrl e células AD10 H4 mas teve efeitos menores no clone AD17 G12. No clone AD17 G12, níveis na superfície celular de TREM?2 não alcançam a extensão que é observada sob condições de liberação constitutiva. No entanto, STREM2 é fortemente reduzido no clone AD17 G12 sob estas condições em comparação com tratamento somente com PMA.
[00166] Em suma, em células THP1, ADAM17 aparenta ser a principal! shedase responsável por liberação constitutiva. Após tratamento com PMA, mecanismos de liberação adicionais entram em jogo, um dos quais pode envolver ADAM1O. Exemplo 4: A extensão de aminoácidos próxima do domínio transmembrana de TREM? é importante para a liberação
[00167] Nas experiências seguintes, mutagênese dirigida a sítios foi usada para identificar áreas dentro da região de tronco de TREM2 que albergam o sítio de clivagem ou são importantes para a ligação das shedases. A FIG. 4A mostra os diferentes mutantes de TREM2 que foram gerados e testados. A Tabela 4 lista as sequências de aminoácidos da parte próxima da membrana da região de tronco e domínio transmembrana de TREM2 humano de tipo selvagem ou mutante.
Tabela 4. Sequência de aminoácidos da parte próxima da membrana da região de tronco e domínio transmembrana de TREM? humano de tipo selvagem ou mutante
NA TRUNC3 13 | LWFPGESESFEDAHVEHSILLLLAC (deleção 159- E cerareen T2-YGG 18 | IWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIPFPPTSILLL OS jus SOS SS T2-WFR 19 LWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIWFRWTSILLLLA
IE T2-duplo 20 LWFPGESESFEDAHVYGGWGGWGPEGEIWFRWTSILL
NM
[00168] TREM? de tipo selvagem (TS) ou mutantes de TREM?2 foram transfectados em conjunto com hDAP12 em células HEK-FT. 48 h mais tarde, células foram tratadas durante 30 min com PMA para ativar ADAM na superfície celular (ver Sommer, Nature Communications 7, 11523, 2016). A expressão na superfície celular de TREM? foi avaliada por FACS, e os resultados são apresentados como razão de expressão de não tratadas relativamente a tratamento com PMA (FIG. 4B). À avaliação de cada construto na presença e ausência de tratamento com PMA derrota a possibilidade de alguns construtos poderem exibir diferentes propriedades de ligação para o antissoro e permite a comparação direta de alterações na expressão na superfície celular de TREM? após ativação de shedases. Uma razão de 1 indica inibição completa da liberação. A deleção dos primeiros 16 aminoácidos (AA) próximos do domínio transmembrana (TM) reduz maximamente a liberação de TREM2 (TRUNCI1I|-159-174). Tal sugere que esta região poderá implicar o sítio de clivagem e/ou de ligação para ADAM. Em seguida, quatro mutantes de deleção mais curtos foram gerados abrangendo esta área, cada um com 6 aminoácidos de comprimento (TRUNC1, T2del3-8, T2del6-11 e T2del11-16). Embora tenha existido um efeito nulo ou muito pequeno na liberação para os mutantes TRUNC1, T2del3-8 e T2del6-11, o mutante T2del11-16 exibiu liberação induzida por PMA reduzida (FIG. 46).
[00169] “Mutantes de substituição de aminoácidos foram planejados para ultrapassar o problema de os mutantes de deleção poderem deslocar o sítio de clivagem para mais próximo da região transmembrana, causando redução da clivagem devido a impedimento estérico. Os aminoácidos 156-164 e 169-172 foram substituídos por resíduos hidrofóbicos maiores que devem tornar a região de tronco resistente a clivagem por proteases (Stromstedt et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 53, 593-602, 2009). Embora o mutante T2- YGG tenha exibido uma tendência para redução da liberação de TREM2, o mutante T2-WFR com substituição de 4 aminoácidos próximos da membrana foi mais eficaz; e a combinação de ambas as mutações (mutante T2-duplo) teve um efeito similar ao do mutante de deleção TRUNCII|-159-174 (FIGs. 4A e 4B). Assim, estes mutantes de TREM? exibiram resistência a clivagem por shedase.
[00170] Em resumo, a abordagem de mutagênese revelou que duas áreas são importantes para a liberação induzida por PMA de TREM?2, uma membrana próxima nos aminoácidos 169-172 e uma membrana distal na região dos aminoácidos 156-164.
[00171] Seguidamente foi testado se o construto T2-duplo-TREM2 reteve a funcionalidade. Para este propósito, este mutante foi transfectado de modo estável em células BWZ que já expressavam DAP12 de camundongo e um repórter beta-Gal guiado por NFAT (Hsieh, Journal of Neurochemistry 109, 1144-1156, 2009). mDAP12 expresso sem TREM? nestas linhagens de células representa atividade do gene repórter (RGA) de fundo neste sistema. A comparação de RGA após ativação de TREM2 em células BWZ-T2-duplo e BWIVZ-TREM2-TS revelou atividade comparável, indicando que T2-duplo mutado ainda é capaz de sinalizar via DAP12 (FIG. 4C). Assim, o construto T2-duplo- TREM? reteve funções de TREM2. Exemplo 5: ADAM17 procede à clivagem de peptídeos na região de tronco de TREM2 na posição H157-S8158
[00172] Para identificar o sítio de clivagem de ADAM10/ADAM17 dentro da região de tronco de TREM2, padrões de clivagem in vitro de peptídeos derivados da região de tronco foram pesquisados e confirmaram o sítio de clivagem por determinação do terminal C de TREM? solúvel liberado de sobrenadantes de cultura de células. Uma série de peptídeos abrangendo a região de tronco foram planejados para pesquisa in vitro de clivagem por ADAM1IO0/ADAM17 (FIG. 5A). Todos os peptídeos foram obtidos com uma cauda fluorescente de 7- metoxicumarina (Mca) N-terminal. Os peptídeos 1-3, 1a e 2a foram incubados com ADAM17 em tampão neutro durante um período até 48 horas, e a reação foi seguida por análise por HPLC de alíquotas recolhidas em diferentes instantes. Foi observada clivagem significativa somente para o peptídeo 3, ao passo que os peptídeos 1, 2, 1a, e 2a exibiram uma redução apenas muito pequena ou nula do peptídeo paterno (FIG. 5D).
[00173] A análise por HPLC-EM da mistura reacional do peptídeo3/ADAM17 identificou um produto maioritário, SISRSLLEGEIPFP-NH>2 (SEQ ID NO: 51), juntamente com 2 produtos de clivagem minoritários (FIGs. 5B-5C). Tal sugere que a ligação H157- S158 em TREM? é o principal sítio de clivagem para ADAM17. A análise por HPLC da mistura de incubação em instantes > 24 horas revelou o aparecimento de mais do que um pico de produto, juntamente com um pico de produto principal reduzido. Nestes instantes não restou essencialmente nenhum substrato. Em consequência, pode concluir-se que os produtos de clivagem minoritários tiveram origem numa clivagem secundária por ADAM17 do produto principal. A mesma análise foi efetuada com ADAM10, e foi obtido um padrão de clivagem muito similar (dados não mostrados).
[00174] Literatura recente proporcionou maior conhecimento sobre preferências de ADAM1O0 e ADAM17 para a clivagem de peptídeos e proteínas (Caescu et al., Biochem J 424, 79-88, 2009; Tucher et al., J Proteome Res 13, 2205-2214, 2014). Surpreendentemente, muito raramente His foi encontrado em P1, e Ser foi encontrado na posição P1' em substratos clivados por ADAM1O e 17. Após pesquisa dos aminoácidos menos preferenciais em substratos de ADAM1O0 e 17, foi identificado que isoleucina nunca ocorreu em P1 de substratos de ADAM, e uma preferência muito baixa para aspartato ou prolina em P1' e em P2'. Para demonstrá-lo foram preparados os Peptídeos 4-6. Nestes peptídeos, o sítio de clivagem H-SI foi substituído por IPP, IPD, e IDP, respectivamente. Embora os 3 peptídeos tenham sido resistentes a clivagem in vitro por ADAM17 (FIG. 5E), os Peptídeos 5 e 6 foram lentamente clivados por ADAM1O (dados não mostrados). O Peptídeo 4, com o seu IPP substituindo o sítio de clivagem H-SI, aparentou ser resistente a clivagem in vitro. Exemplo 6. O ectodomínio de TREM? liberado de células é clivado entre H157 e S158
[00175] Para substanciar as descobertas in vitro da análise de peptídeos quanto ao sítio de clivagem por shedase de TREM2 em um sistema celular, células HEK-FT foram transientemente transfectadas com hTREM?2 ou hTREM2-R47H em combinação com hDAP12. Células transfectadas de ambas as condições foram tratadas com PMA ou solvente. STREM2 foi imunopurificado do sobrenadante celular e indivíduo a digestão com tripsina ou enzima Asp-/Glu-C, seguido de análise dos peptídeos por LC-EM. Nas quatro condições foi identificado o mesmo peptídeo N-terminal (D137-H157), indicando o principal sítio de clivagem entre H157 e S158 (FIG. 6A-6B). Estas experiências mostram que nem o tratamento com PMA nem a mutação R47H induzem um desvio do principal sítio de clivagem.
[00176] As experiências seguintes foram montadas para identificar a totalidade do ectodomínio de TREM? liberado do sobrenadante celular imunopurificado tratado com PNGase-F e sialidase-A seguido de análise por LC-EM. Uma espécie peptídica de 15 619 Dalton foi detectada no sobrenadante de células transfectadas com TREM2 TS, que corresponde a TREM219-157 desglicosilado (FIG. 7). Um peptídeo correspondente de 15 600 Daltons foi detectado no sobrenadante celular imunopurificado de células transfectadas com R47H-TREM?2. Devido à alteração de aminoácidos, este peptídeo é 19 Daltons mais leve do que o peptídeo TS e confirma o mesmo sítio de clivagem para R47H-TREM2 mutado. Exemplo 7. TREM2 não é Or-glicosilado em posições próximas do sítio de clivagem
[00177] Uma vez que modificações pós-tradução podem efetivar atividade de shedase (Goth et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112, 14623-14628, 2015; Schjoldager et al., Biochimica et Biophysica Acta 1820, 2079-2094, 2012), foi estudado o modo como a glicosilação poderá efetivar a liberação de TREM2. Existem dois sítios de O-glicosilação putativos próximos do sítio de clivagem H157 identificado do ectodomínio de TREMZ2: S160 e S168. Usando hTREM2 com cauda de his C-terminal e mapeamento de sítios de glicosilação por espectrometria de massa foi mostrado que hTREM?2 exibe O-glicosilação em T171 e/ou S172 (FIGs. 8A-8C), no entanto, nenhuma O-glicosilação em S160 ou S168 pode ser detectada. Exemplo 8. Mutantes de TREM2 com mutações no sítio de clivagem por shedase exibem expressão na superfície celular aumentada
[00178] O conjunto seguinte de experiências se destinou a substanciar em um sistema celular que os mutantes de TREM2 com mutação na posição 157-159 podem reduzir a clivagem da região de tronco de TREM2. Os aminoácidos do sítio de clivagem por ADAM17 HSI (posição 157-159) dentro da região de tronco de TREM2 humano foram substituídos pelos aminoácidos IPD via mutagênese dirigida a sítios. O construto mutante foi transientemente expresso em células HEK293-FT juntamente com hDAP12 e a expressão na superfície celular de TREM? foi avaliada como descrito na Figura 2. É muito interessante notar que o mutante de TREM2 com três substituições de aminoácidos no sítio de clivagem por shedase exibiu um aumento da expressão na superfície celular de TREM2 similar ao do mutante de TREM?2 com truncamento do sítio de clivagem (TRUNC3) ou do mutante de TREM2 com mutações T2-duplo (FIG. 4D), indicando resistência a clivagem por shedase em um contexto celular.
[00179] Os dados apresentados aqui pesquisaram primeiramente a contribuição de ADAM1O e ADAM17 para a liberação de TREM2. As abordagens farmacológica e genética usadas mostram de forma inequívoca que ADAM17 é a principal protease contribuindo para este processo. A seletividade enzimática dos inibidores de ADAM aplicados foi determinada em um ensaio de clivagem in vitro, e ambos os inibidores foram usados ao longo de uma gama ampla de concentrações para pesquisar efeitos na expressão na superfície celular de TREM2 em células CHO-hDAP12-hTREM2 e macrófagos M2A humanos. Para excluir que a abordagem farmacológica não foi confundida por inibição inespecífica de outras enzimas, estas descobertas foram corroboradas por nocaute por CRISPR/CAS9 de ADAM1O ou ADAM17 na linhagem de células monocíticas humanas THP-1. As experiências de nocaute confirmaram que a deficiência de ADAM1I7 aumentou TREM2 na superfície e reduziu STREM2. Os dados apresentados aqui sugerem que, sob condições de estado estacionário, TREM2 é clivado maioritariamente por ADAM17, mas após ativação de ADAM por PMA, mecanismos de liberação adicionais poderão entrar em cena. Dados da literatura recente indicaram que, sob condições de estado estacionário, ADAM1O medeia a geração de STREM?2 (Kleinberger, 2014). A principal diferença entre esse estudo e os resultados apresentados aqui é o uso de células HEK-FIlp-ln que estão desprovidas de coexpressão da proteína adaptadora de sinalização DAP12 juntamente com TREM?2. Poderá acontecer que TREM2, após expressão em um sistema recombinante na ausência de DAP12, tenha suscetibilidade aumentada a clivagem por ADAM1O. É interessante notar que DAP12 tem um domínio extracelular com 14 aminoácidos de comprimento (ver Lanier & Bakker, Immunol Today 21, 611-614, 2000). A proximidade estreita do domínio extracelular de DAP12 com o sítio de clivagem de TREM2 pode sugerir uma ação combinada entre as porções extracelulares de TREM2 e DAP12 que pode regular a ativação e liberação.
[00180] Para além da pesquisa de liberação constitutiva, PMA foi usado para intensificar a liberação de TREM2 da superfície celular. À liberação observada sob estas condições nas células THP1 deficientes em ADAM17 poderá ser atribuída a atividade de ADAM1O, mas também poderá envolver outros mecanismos. Por exemplo, o ectodomínio de
TREM2 poderá ser clivado de modo intracelular durante o seu transporte do ER para a membrana plasmática, permitindo secreção de TREM? para o meio.
[00181] Estudos recentes elucidaram como o tratamento com PMA e alterações na atividade de shedase estão conectados: Cascatas de sinalização desencadeadas por PMA ativam escramblases que intensificam a translocação de fosfatidilserina (PS) para a aba externa da membrana plasmática (Kodigepalli et al., Mol Cancer 12: 32, 2013). Aqui, PS se liga a um motivo catiônico no domínio próximo da membrana de ADAM17, permitindo que a protease execute a sua função de shedase (Sommer, Nature Communications 7, 11523, 2016). Estas experiências se centraram em ADAM17 e são requeridos estudos adicionais para elucidar se quaisquer destas descobertas se estendem a ADAM1O, o homólogo mais próximo de ADAM17 dentro da família ADAM.
[00182] De notar quePS também tem sido descrito como ligante de TREM2 (Wang et al. Cell 160, 1061-1071, 2015; Cannon et al, Immunogenetics 64, 39-47, 2012; Daws, Journal of Immunology 171, 594-599, 2003; Song et al., Alzheimer's & Dementia 13: 381-387, 2017). A fosfatidilserina pertence a uma gama de fosfolipídeos de membrana que são expostos por neurônios e células gliais danificados ou liberados por mielina danificada. Além disso, foi mostrado que fosfolipídeos com carga negativa como PS se associam a AB em membranas lipídicas (Ahyayauch et al., Biophys J 103, 453-463, 2012; Nagarathinam et al., J Neurosci 33, 19284-19294, 2013). Em todos estes processos, o PS atua como ligante para TREM2, e poderá ao mesmo tempo facilitar a sua liberação.
[00183] A análise mutacional identificou duas extensões de aminoácidos dentro da região de tronco de TREM2 que são importantes para a liberação de TREM2. A área distal à membrana compreende os aminoácidos do sítio de clivagem. É interessante notar que a troca de 5 aminoácidos próximos da membrana plasmática (T2-WFR mutante) também estabilizou TREM2 na superfície celular. Apesar de tal não ter sido pesquisado para TREM?2, foi descrito o coagrupamento de ADAM17 com o seu substrato L-selectina (Schaff et al., Journal of Leukocyte Biology 83, 99-105, 2008) e esta parte da região de tronco poderá contribuir para este processo, permitindo a ligação de ADAM1I7 ao seu substrato antes de a clivagem ser iniciada por ativação da atividade proteolítica de ADAM17 (por exemplo, por PS).
[00184] Experiências adicionais identificaram o sítio de clivagem preciso para o ectodomínio de TREM2. Foram aplicadas três abordagens complementares, e todas mostram o mesmo sítio de clivagem. Em primeiro lugar, peptídeos da região de tronco foram indivíduos a clivagem in vitro com ADAM1O e ADAM17 expressos de modo recombinante. Em segundo lugar, o terminal C de peptídeos trípticos do ectodomínio de TREM? foi purificado de sobrenadante de células HEK-FT expressando de modo recombinante hTREM2 e hDAP12 e determinado. Em terceiro lugar, o tamanho do ectodomínio completo de TREM?2 purificado de sobrenadante celular foi verificado. Embora a distância entre o sítio de clivagem e a membrana plasmática (17 aminoácidos) se encontre na extremidade superior em comparação com a maior parte dos substratos de ADAM17 conhecidos (12-16 aminoácidos, Ver Horiuchi, The Keio Journal of Medicine 62, 29-36, 2013; Overall & Blobel, Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 245- 257, 2007), a sequência (P2:V, P1:H, P1':S, P2':1) é bastante única em comparação com substratos de ADAM17 ou ADAM1O conhecidos (Caescu et al., Biochem J 424, 79-88; Liu et al., Mol Immunol 62, 122- 128, 2014; Tucher, 2014; Vahidi et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 450, 782-787, 2014). ADAM1O e 17 têm preferência por pequenos resíduos hidrofóbicos nas posições P2 até
P2', que guia a especificidade para substratos. No entanto, se sítios de clivagem para ADAM17 e ADAM1O0 forem compilados (Tucher, 2014), arginina em P1 é bastante comum. Histidina nesta posição em TREM2 também contém uma cadeia lateral básica com uma carga positiva. À troca de P1, P1' e P2' por aminoácidos que não são comuns ao motivo de clivagem de ADAM17/ADAM10 reduziu a clivagem. É de salientar que não ocorreu nenhum desvio da clivagem para outro lado dentro do peptídeo. Tal suporta a observação de que a liberação aparenta estar confinada a uma região próxima da membrana plasmática e não ocorre nenhum desvio da clivagem para um sítio secundário. Tal está em linha com descobertas anteriores sugerindo que a posição do sítio relativamente à região de transmembrana e à primeira parte globular da proteína é tão importante quanto a sequência de aminoácidos do sítio de clivagem (Horiuchi, The Keio Journal of Medicine 62, 29-36, 2013; Hinkle, The Journal of Biological Chemistry 279, 24179-24188, 2004; Wang et al., The Journal of Biological Chemistry 277, 50510-50519, 2002).
[00185] A variante R47H confere um risco significativamente aumentado de desenvolver LOAD (Guerreiro, 2013; Jonsson, 2013). Em contraste com alguns dos polimorfismos que conferem risco acrescido de FTD como T66M (Guerreiro, 2013; Kleinberger, 2014; Borroni et al, Neurobiology of Aging 35, 934 e937-910, 2014; Le Ber, Neurobiology of Aging 35, 2419 e2423-2415, 2017) e Y38C (Guerreiro, 2013), que reduzem a expressão na superfície celular de TREM2, a mutação R47H não afeta níveis de expressão mas, ao invés, enfraquece funcionalmente TREM?2 (Atagi, 2015; Bailey, 2015; Kleinberger, 2014; Wang, Cell 160, 1061-1071, 2015; Yin, 2016). Os dados apresentados aqui indicam que a mutação R47H não afeta o sítio de clivagem, isto é, o tamanho do ectodomínio de TREM?2 liberado solúvel. No entanto, estas experiências não permitem concluir se a extensão da liberação é alterada, isto é, a quantidade de STREM?2 é alterada.
[00186] Foi descrito que a liberação do ectodomínio é influenciada por O-glicosilação em resíduos serina ou treonina que se situam a + 4 resíduos do sítio de processamento (Goth, 2015; Schjoldager, 2012). A presença de O-glicosilação próximo do sítio de clivagem foi pesquisada. Os resultados indicam que, dentro da região de tronco, TREM2 é somente O-glicosilado em T171 e/ou S172, mas não em S168 ou S160. Muito provavelmente, este sítio de O-glicosilação é demasiado remoto do sítio de processamento para influenciar a clivagem. Estes resultados são limitados pelo fato de a proteína NTREM?2 usada para estes estudos não ter sido liberada da superfície celular mas secretada através da via secretora no sistema de expressão usado para a produção da proteína recombinante.
[00187] Nos últimos anos foi identificada uma profusão de variantes de TREM2 que influenciam a suscetibilidade a certas doenças neurodegenerativas (Ver Dardiotis, Neurobiol Aging. maio de 2017;53:194.e13-194.e022). É muito interessante notar que uma destas mutações H157Y (rs2234255, Ahyayauch, 2012; Cuyvers et al, Neurobiology of Aging 35, 726 e711-729, 2014; Jiang et al., Curr Neurovasc Res 13, 318-320, 2016; Ghani, Neurobiology of Aging 42, 217 e217-217 e213, 2016) está localizada precisamente no sítio de clivagem de TREM?2 identificado, e aumenta a propensão para desenvolver AD. Dados in vitro mostram que ADAM10/17 têm preferência aumentada por tirosina na posição P1' (Tucher, 2014). É portanto possível especular que esta mutação pode conduzir a liberação constitutiva acrescida de TREM?2 da superfície celular por ADAM10/17, e proporcionar uma ligação mecanística entre a liberação de TREM2 e desenvolvimento de AD, mas exatamente como esta mutação afeta a liberação de TREM? é presentemente desconhecido.
[00188] Uma questão fascinante que surge destes resultados é se
STREM2 desempenha um papel fisiológico. Em fases iniciais da defesa do hospedeiro ou inflamação estéril, uma inflamação robusta é vantajosa para a neutralização de patógenos ou remoção de tecido danificado seguido da resposta de resolução subsequente (Freire, Periodontology 2000, 63, 149-164). Por resolução da inflamação, a atividade de ADAM17 irá diminuir (Le Gall et al., Molecular Biology of the Cell 20, 1785-1794, 2009; Le Gall et al., Journal of Cell Science 123, 3913-3922, 2010) e o aumento resultante de TREM?2 irá promover a resolução e a fagocitose. Ao mesmo tempo, a produção de outras citocinas pró-inflamatórias como TNFa ficará reduzida.
[00189] A não ser que indicado de outro modo, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritos em detalhe podem ser realizados e foram realizados de uma maneira conhecida per se, como será claro para o perito na técnica. Se referem novamente, por exemplo, os manuais padrão e os antecedentes da técnica gerais mencionados aqui e as referências adicionais aí citadas. A não ser que indicado de outro modo, cada uma das referências citadas aqui é incorporada na sua totalidade a título de referência.
[00190] As reivindicações da invenção não são limitadoras e são fornecidas abaixo.
[00191] Apesar de aspectos e reivindicações particulares terem sido divulgados aqui em detalhe, tal foi feito a título exemplificativo apenas para propósitos ilustrativos e não se pretende que limitem o escopo das reivindicações adjuntas, ou o escopo do assunto das reivindicações de qualquer pedido futuro correspondente. Em particular, é contemplado pelos inventores que várias substituições, alterações e modificações podem ser feitas à divulgação sem se afastar do espírito e escopo da divulgação como definida pelas reivindicações. Se crê que a escolha do material de partida de ácido nucleico, clone de interesse ou tipo de biblioteca é uma questão de rotina para uma pessoa de habilidade comum na técnica com conhecimento dos aspectos descritos aqui.
Considera-se que outros aspectos, vantagens e modificações sejam abrangidos pelo escopo das reivindicações seguintes.
Os peritos na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes dos aspectos específicos da invenção descrita aqui.
Tais equivalentes se destinam a serem abrangidos pelas reivindicações seguintes.
A reformulação do escopo da reivindicação em pedidos correspondentes posteriormente depositados pode se dever às limitações pelas leis de patentes dos vários países e não deve ser interpretada como desistindo de matéria das reivindicações.

Claims (49)

U7 REIVINDICAÇÕES
1. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência codificando um mutante de TREM2 humano resistente a clivagem por shedase.
2. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a shedase é ADAM17 ou ADAM1O0.
3. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a shedase é ADAM17.
4, Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40.
5. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40.
6. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35.
7. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante de TREM2 humano compreende uma região de tronco consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-35.
8. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante de TREM2 humano compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48.
9. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mutante de TREM2 humano compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 41-48.
10. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 67-74.
11. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um promotor.
12. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor constitutivo.
13. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor induzível.
14. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor sintético.
15. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor específico para tipos de células.
16. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o promotor guia a expressão do ácido nucleico especificamente em microglias, macrófagos ou células dendríticas.
17. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado de um promotor de TREM2, promotor de TMEM119, promotor de Hexb, promotor de IBA1, promotor de CD45, promotor de CD11b, promotor de Cst7, promotor de Lpl, promotor de Csf1, promotor de Cs1R, promotor de Itgax, promotor de Clec7a, promotor de Lilrb4, promotor de Tyrobp, promotor de Ctsb, promotor de Ctsd, promotor de B2m, promotor de Lyz2, promotor de Cx3cr1i, promotor de Cst3, promotor de Ctss, promotor de P2ry12, promotor de C1ga ou promotor de C1qb.
18. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de TREM?2.
19. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um sinal de poliadenilação.
20. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma segunda sequência codificando uma proteína DAP12.
21. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a proteína DAP12 compreende a SEQ ID NO: 49.
22. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a proteína DAP12 consiste na SEQ ID NO: 49.
23. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende um sítio interno de entrada do ribossomo a montante da segunda sequência.
24. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência 2A a montante da segunda sequência, caracterizado pelo fato de que a sequência 2A é selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 52-66.
25. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
24.
26. Vetor, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o vetor é selecionado de um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um cosmídeo ou um vetor viral.
27. Vetor, de acordo com a reivindicação 26,
caracterizado pelo fato de que o vetor viral é selecionado de um vetor baseado em qualquer um dos seguintes vírus: lentivírus, adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), Vírus Herpes Simplex (HSV), parvovírus, retrovírus, vírus vacínia, vírus Sinbis, vírus influenza, reovírus, vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus do sarampo, vírus da estomatite vesicular (VSV), poliovírus, poxvírus, vírus do Vale de Seneca, coxsackievírus, enterovírus, vírus Mixoma ou vírus Marabá.
28. Vetor, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor lentiviral.
29. Vetor, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor de AAV.
30. Vetor, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um marcador selecionável.
31. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, ou o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a
30.
32. Célula, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada de um macrófago, uma célula dendrítica ou uma microglia.
33. Célula, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que a célula expressa um marcador detectável.
34. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 33-40.
35. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma de SEQ ID
NOs: 41-48.
36. Método para aumentar a expressão de TREM2 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 30, a célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 33.
37. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo em sua necessidade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo o ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, o vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 30, a célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 33.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio relacionado com TREM2 é uma doença neuroinflamatória ou neurodegenerativa selecionada de doença de Alzheimer, demência frontotemporal, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Nasu-Hakola, esclerose múltiplay esclerose lateral amiotrófica (ALS), encefalite antirreceptor de NMDA, autismo, lúpus cerebral (NP-SLE), neuropatia periférica induzida por quimioterapia (CIPN), neuralgia pós-terapêutica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), epilepsia, Síndrome de Guillain-Barré (GBS), miosite de corpos de inclusão, doenças de depósito lisossômico,
lipidose de esfingomielina (Niemann-Pick C), mucopolissacaridose |l/ IB, leucodistrofia metacromática, neuropatia motora multifocal, Miastenia Gravis, Doença de Neuro-Behcet, neuromielite óptica (NMO), neurite óptica, polimiosite, dermatomiosite, encefalite de Rasmussen, Síndrome de Rett, derrame cerebral, mielite transversa, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, encefalite viral ou meningite bacteriana.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio relacionado com TREM?2 é doença de Alzheimer.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio relacionado com TREM2 é demência frontotemporal.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 42, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico, vetor ou célula é administrado ao indivíduo por uma via intravenosa, intracraniana, intratecal, subcutânea ou intranasal.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 43, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente administrar um segundo agente ao indivíduo.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 44, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente: avaliar o nível de TREM2 humano da superfície celular em uma amostra obtida de um indivíduo.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende fluido cerebrospinal.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45,
caracterizado pelo fato de que o nível de TREM2 humano da superfície celular em uma amostra é determinado por um ensaio selecionado de citometria de fluxo, imuno-histoquímica, transferência Western, ensaio imunofluorescente, radioimunoensaio (RIA), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), fluorescência resolvida no tempo em formato homogêneo (HTRF) ou tomografia por emissão de pósitrons (PET).
48. Uso do ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, do vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 30, da célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 33, ou do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que é para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREM?2 em um indivíduo.
49. Uso do ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, do vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 30, da célula, como definida em qualquer uma das reivindicações 31 a 33, ou do polipeptídeo, como definido na reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado com TREM2 em um indivíduo.
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