DE69929444T2

DE69929444T2 - Cpg-zusammensetzungen, saponin-adjuvantien und verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE69929444T2
Application number: DE69929444T
Authority: DE
Inventors: A. Charlotte Milford KENSIL
Original assignee: Antigenics LLC
Current assignee: Agenus Inc
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2019-08-07
Also published as: ES2257068T3; AU5395399A; US7858589B2; JP4620251B2; ATE315405T1; US20060177458A1; JP2002522510A; DK1104306T3; EP1104306A1; EP1104306B1; WO2000009159A9; DE69929444D1; AU773204C; AU773204B2; CA2340174C; WO2000009159A1; US7049302B1; PT1104306E; CA2340174A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Immunadjuvantien und Impfstoffe. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stimulieren die Immunität, erhöhen Zell-vermittelte Immunität und verstärken die Antikörperproduktion.
Hintergrund der Erfindung
Adjuvante Saponine wurden identifiziert und aus einem wässrigen Extrakt der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja saponaria Molina gereinigt. Unter den 22 Saponin-Peaks, welche trennbar waren, wurden die stärker hervortretenden gereinigten Saponine als QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 identifiziert, welche auch als QA-7, QA-17, QA-18 bzw. QA-21 bekannt sind. Diese Saponine wurden im Wesentlichen durch verschiedene Verfahren einschließlich Hochdruckflüssigchromatographie („HPLC"), Niedrigdruck-Silica-Chromatographie, und hydrophile interaktive Chromatographie („HILIC") aufgereinigt. Die im Wesentlichen reinen Saponine erwiesen sich als nützlich als Immunadjuvantien zur Verstärkung von Immunantworten bei Individuen (Kensil et al., US-Patent 5,057,540; Kensil et al., J. Immunol. 148:2357 (1991); Maciani et al., Vaccine 9:89 (1991).) Kürzlich wurde gezeigt, dass Oligonukleotide, die das unmethylierte Cytosin-Guanin („CpG")-Dinukleotid in einem besonderem Sequenzkontext oder -motiv enthalten, in vitro wirksame Stimulatoren verschiedener Typen von Immunzellen sind. (Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94 :10833 (1997).) Ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, das ein unmethyliertes CpG-Motiv umfasst, ist ein Dinukleotid innerhalb des Oligonukleotids, das ständig eine immunstimulatorische Antwort und die Ausschüttung von Cytokinen auslöst. CpG-Motive können Monozyten, Makrophagen und dentritische Zellen stimulieren, die verschiedene Cytokine produzieren, einschließlich des T-Helfer 1 („Th 1")-Cytokins Interleukin („IL") 12. (Carson et al., J. Exp. Med. 186 :1621 (1997).) Diese Wirkung verursacht die Induktion der IFN-γ-Sezernierung durch natürliche Killerzellen, welches im Gegenzug Makrophagen aktiviert und den Immunglobulin-Isotyp-Wechsel bzw. -Switch zu IgG2a verstärkt, ein Kennzeichen für T-Helferzell-Immunität und -Differenzierung (Chu et al., J. Exp. Med. 186:1623 (1997).) Klinman et al. haben gezeigt, dass ein DNA-Motiv, das aus einem unmethylierten CpG-Dinukleotid, flankiert durch zwei 5'-Purine (GpA oder ApA) und zwei 3'-Pyrimidine (TpC oder TpT), B-Zellen optimal zur Herstellung von IL-6 und IL-12 stimuliert, und CD4+-T-Zellen zur Herstellung von IL-6 und IFN-γ stimuliert, und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. (Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:2879 (1996).) Davis et al., worauf hiermit expressis verbis Bezug genommen wird, haben entdeckt, dass Nukleinsäuren, die mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthalten, die Immunantwort eines Patienten beeinflussen können (Davis et al., WO 98/40100, PCT/US98/04703).
Die WO-A-9961056 offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Induzierung einer mucosalen Immunantwort unter Verwendung immunstimulatorischer Oligonukleotide, die CpG-Dinukleotide enthalten. In einigen Ausführungsformen stellt die WO-A-9961056 fest, dass ein nicht-mucosales Adjuvans zusätzlich zu den immunstimulatorischen Oligonukleotiden, die CpG-Dinukleotide enthalten, verabreicht werden kann, um die Immunantwort zu induzieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Da Immunität eine wichtige Rolle bei der Schutzreaktion gegenüber einer Infektion mit bestimmten mikrobiellen Agenzien spielt, besteht ein Bedarf, andere neue Adjuvantien zu charakterisieren, die auf eine sichere Weise Immunität induzieren. Solche Adjuvantien können möglicherweise in zukünftige humane Impfstoffe mit aufgenommen werden. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass eine Kombination eines Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid und ein Saponin-Adjuvans umfasst, ein wirkungsvoller Stimulator der Zell-vermittelten Immunität ist, verglichen mit einem der beiden Adjuvantien alleine. Antikörpertiter (antigenspezifisch) in Reaktion auf die Impfung waren signifikant höher bei Vakzinen, die ein CpG-enthaltendes Oligonukleotid/Saponin-Adjuvans in Kombination umfassten, verglichen mit entweder Saponin oder CpG alleine, und sie stellten einen positiven synergistischen Adjuvans-Effekt dar. Zusammen genommen begründen diese Ergebnisse, dass eine immun-adjuvante Zusammensetzung, die ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, welches mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, und ein Saponin-Adjuvans umfasst, ein Kandidat für eine adjuvante Zusammensetzung für Impfstoffe zur Induzierung von Immunität ist. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung neue Impfstoffzusammensetzungen bereit, welche ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, ein Saponin-Adjuvans und ein Antigen umfassen.
Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort gegenüber einem Antigen durch Verabreichen der erfinderischen Impfstoffzusammensetzungen und/oder immun-adjuvanten Zusammensetzungen sind andere Ausführungsformen, die hierin beschrieben sind.
Beschreibung der Figuren
1 stellt ein Diagramm dar, das die Verstärkung einer Zell-vermittelten Immunantwort durch QS-21 und eine Kombination aus CpG-Oligonukleotid/QS-21 zeigt, nachgewiesen durch die CTL-Induktion.
2 stellt ein Diagramm bereit, das die Verstärkung einer Zell-vermittelten Immunantwort durch QS-21 und eine CpG-Oligonukleotid/QS-21-Kombination, nachgewiesen durch die CTL-Induktion, zeigt.
3 zeigt ein Säulendiagramm der verstärkten Antikörperproduktion, insbesondere der Antikörper-Unterklassen wie IgG2a, die durch Th 1-Cytokine beeinflusst werden.
4 zeigt ein Säulendiagramm der IgG1-Titer, die für Typ 14-Pneumokokkenpolysaccharid spezifisch sind, und zwar bei den verschiedenen Formulierungen und für Kombinationen aus QS-21 und CpG-Oligonukleotid, in Mausseren, die 21 Tage nach einer ersten Immunisierung, die am Tag 0 gegeben wurde, eingesammelt wurden.
5 stellt ein Säulendiagramm mit IgG2a-Titern dar, die spezifisch für Typ 14-Pneumokokkenpolysaccharid sind, bei den verschiedenen Formulierungen und/oder Kombinationen aus QS-21 und CpG-Oligonukleotid, in Mausseren, die 21 Tage nach einer ersten Immunisierung, die am Tag 0 gegeben wurde, eingesammelt wurden.
6 stellt ein Säulendiagramm mit IgG3-Titern bereit, welche spezifisch für Typ 14-Pneumokokkenpolysaccharid sind, bei den verschiedenen Formulierungen und/oder Kombinationen aus QS-21 und CpG-Oligonukleotid, in Mausseren, die 21 Tage nach einer ersten Immunisierung, die am Tag 0 gegeben wurde, eingesammelt wurden.
7 stellt ein Säulendiagramm mit IgG1-Titern dar, die spezifisch für Typ 14-Pneumokokkenpolysaccharid sind, bei den verschiedenen Formulierungen und/oder Kombinationen aus QS-21 und CpG-Oligonukleotid, in Mausseren, die 14 Tage nach einer zweiten Immunisierung, welche 28 Tage nach der ersten Immunisierung gegeben wurde, eingesammelt wurden.
8 stellt ein Säulendiagramm mit IgG2a-Titern bereit, welche spezifisch für Typ 14-Pneumokokkenpolysaccharid sind, bei den verschiedenen Formu lierungen und/oder Kombinationen aus QS-21 und CpG-Oligonukleotid, in Mausseren, die 14 nach einer zweiten Immunisierung, welche 28 Tage nach der ersten Immunisierung gegeben wurde, eingesammelt wurden.
9 zeigt ein Säulendiagramm mit IgG3-Titern, welche spezifisch für Typ 14-Pneumokokkenpolysaccharid sind, bei den verschiedenen Formulierungen und/oder Kombinationen aus QS-21 und CpG-Oligonukleotid, in Mausseren, welche 14 Tage nach einer zweiten Immunisierung, welche 28 Tage nach der ersten Immunisierung gegeben wurde, gesammelt wurden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Der Ausdruck „Saponin", wie er hierin verwendet wird, umfasst glykosidische Triterpenoidverbindungen, welche in wässriger Lösung Schaum produzieren, hämolytische Aktivität in den meisten Fällen aufweisen, und immun-adjuvante Aktivität besitzen. Die Erfindung umfasst Saponin per se sowie natürliche und pharmazeutisch annehmbare Salze und pharmazeutisch annehmbare Derivate. Der Ausdruck „Saponin" umfasst auch biologisch aktive Fragmente von diesem.
Die erfindungsgemäßen Saponine können aus dem Baum Quillaja saponaria Molina erhalten werden. (Dalsgaard, Acta Veterinia Scandinavica, 69:1 (1978).) Ein teilweise aufgereinigter Saponin-angereichterter Extrakt, hergestellt wie von Dalsgaard beschrieben („Quil-A"), besitzt Adjuvans-Aktivität. Solch ein Extrakt kann weiter aufgetrennt werden. Unter den 22 Saponin-Peaks, welche unterscheidbar waren, wurden die stärker hervortretenden gereinigten Saponine als QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 identifiziert, die auch als QA-7, QA-17, QA-18 bzw. QA-21 bekannt sind. (Kensil et al., US-Patent 5,057,540.) Diese Saponine wurden im Wesentlichen mittels verschiedener Verfahren einschließlich HPLC, Niedrigdruck-Flüssig-Silica-Chromatographie und HILIC aufgereinigt.
Wie bei Kensil et al., US-Patent 5,057,540, auf welches hiermit expressis verbis Bezug genommen wird, beschrieben, kann die adjuvante Aktivität solcher Saponine mittels eines beliebigen aus einer ganzen Reihe von Verfahren bestimmt werden, welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Der Anstieg des Antikörpertiters eines Antikörpers gegen ein spezifisches Antigen nach Verabreichung eines Adjuvans kann als Kriterium für die adjuvante Aktivität verwendet werden. (Bomford, Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77:409 (1985).) In Kürze, ein solcher Test umfasst die Injektion eines Antigens (zum Beispiel Rinderserumalbumin („BSA")) in CD-1-Mäuse, und zwar gemischt mit unterschiedlichen Mengen des potentiellen Adjuvans. Seren werden von den Mäusen zwei Wochen später geerntet und mittels ELISA im Hinblick auf Anti-BSA-Antikörper getestet.
Ein weiterer solcher Test umfasst die Injektion eines Proteinantigens wie Ovalbumin („OVA") oder eines Polysaccharidantigens wie Pneumokokkenpolysaccharid in Inzuchtmäuse wie beispielsweise C57BL/6 oder Balb/c über den subkutanen Weg, und zwar gemischt mit dem potentiellen Adjuvans. Seren können von den Mäusen nach einer, zwei oder drei Immunisierungen geerntet werden und mittels ELISA im Hinblick auf Antigen-spezifische Antikörper (Gesamtimmunglobulin) oder im Hinblick auf spezifische Maus-IgG-Unterklassen wie IgG1 oder IgG2a hin getestet werden. Ein weiterer solcher Test umfasst die Injektion von OVA in C57BL/6-Mäuse, das Ernten der Milz nach einer, zwei oder drei Immunisierungen, die Stimulierung von Splenozyten mit Antigen, und dann die Untersuchung im Hinblick auf die zytolytische T-Lymphozyten-Aktivität („killing") von OVA-Peptid-exprimierenden Zielzellen. Alternativ dazu könnte eine proliferative Antwort in einem in vitro-Assay gemessen werden, in dem die Aufnahme von ³H-Thymidin durch Antigen-stimulierte Splenozyten, welche aus immunisierten Tieren erhalten werden, gemessen wird.
„QS-21" bezeichnet die Mischung der Komponenten QS-21-V1 und QS-21-V2, welche als einzelner Peak in der Umkehrphasen-HPLC auf Vydac C4 (5 μm Partikelgröße, 300 A Pore, 4,6 mm ID × 25 cm Länge) in 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42, Volumen/Volumen) erscheinen. Wenn Experimente beschrieben werden, die mit den weiter aufgereinigten Komponenten durchgeführt werden, wird auf die Komponentenfraktionen spezifisch mit QS-21-V1 und QS-21-V2 Bezug genommen.
Nach Kensil et al., US-Patent 5,583,112, worauf hiermit expressis verbis Bezug genommen wird, kann die Carboxylgruppe der Glukuronsäure von Quillaja saponaria Molina mit einem Protein, einem Peptid oder einem kleinen Molekül, das ein primäres Amin enthält, verknüpft werden. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein chemisch modifiziertes Saponin-Adjuvans oder eine Fraktion davon, die aus einem rohen Quillaja saponaria Molina-Extrakt erhältlich ist, wobei das chemisch modifizierte Saponin oder die Fraktion davon mindestens ein QS-17, QS-18, QS-21, QS-21-V1 und QS-21-V2 umfasst, und wobei das modifizierte Saponin seine Adjuvans-Aktivität beibehält.
Der Ausdruck „teilweise rein" bzw. „teilweise gereinigt" meint Saponine, die teilweise von Verbindungen abgetrennt sind, die normalerweise mit dem Saponin in seinem natürlichen Zustand assoziiert sind.
Der Ausdruck „im Wesentlichen rein" meint im Wesentlichen frei von Verbindungen, die normalerweise mit dem Saponin in seinem natürlichen Zustand assoziiert sind, wobei konstante und reproduzierbare chromatographische Reaktionen, Elutionsprofile und biologische Aktivität aufgewiesen werden. Der Ausdruck „im Wesentlichen rein" ist nicht so gemeint, dass artifizielle oder synthetische Gemische des Saponins mit anderen Verbindungen ausgeschlossen sind.
Die vorliegende Erfindung kann auch immunstimulatorische Saponine verwenden, die von anderen Pflanzenarten isoliert sind. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass ein Saponin aus Dolichos lablab als Adjuvans nützlich ist (Katayan et al., Vaccine 17:2733 (1999).)
Der Ausdruck „immunstimulatorisches Oligonukleotid umfassend mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid" meint ein Oligonukleotid, von dem gezeigt wurde, dass es das Immunsystem aktiviert. Das immunstimulatorische bzw. immunstimulante Oligonukleotid kann bevorzugt mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfassen. Ein „CpG-Motiv" ist ein DNA-Abschnitt, der mindestens eines oder mehrere CpG-Dinukleotide innerhalb einer spezifizierten Sequenz umfasst. Das Oligonukleotid, welches das CpG-Motiv umfasst, kann so kurz wie 5–40 Basenpaare lang sein. Das immunstimulatorische Oligonukleotid, welches das CpG-Motiv enthält, kann ein Monomer oder ein Teil eines Multimers sein. Alternativ dazu kann das CpG-Motiv ein Teil der Sequenz eines Vektors sein, der ebenfalls einen DNA-Impfstoff darstellt. Es kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Es kann synthetisch oder in großem Maßstab in Plasmiden hergestellt worden sein. Eine Ausführungsform der Erfindung deckt das immunstimulatorische Oligonukleotid ab, welches ein CpG-Motiv mit der Formel 5'X₁CGX₂3' enthält, ab, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinander folgende CpGs voneinander trennt, und wobei X₁ Adenin, Guanin oder Thymin, und X₂ Cytosin, Thymin oder Adenin ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das CpG-Motiv TCTCCCAGCGTGCGCCAT (auch bekannt als „1758") oder TCCATGACGTTCCTGACGTT (auch bekannt als „1826").
Man hat herausgefunden, dass DNA, die unmethylierte CpG-Dinukleotid-Motive im Kontext bestimmter flankierender Sequenzen enthält, in vitro ein wirkungsvoller Stimulator mehrer Arten von Immunzellen ist (Ballas et al., J. Immunol. 157:1840 (1996); Cowdrey et al., J. Immunol. 156:4570 (1996); Krieg et al., Nature 374:546 (1995).) Abhängig von den flankierenden Sequenzen können bestimmte CpG-Motive stärker immunstimulierend für B-Zell- oder T-Zell-Antworten sein, und bevorzugt bestimmte Species stimulieren. Wenn eine humorale Reaktion erwünscht ist, werden bevorzugte immunstimulatorische Oligonukleotide, die ein unmethyliertes CpG-Motiv umfassen, jene sein, die bevorzugt eine B-Zell-Reaktion stimulieren. Wenn Zell-vermittelte Immunität erwünscht ist, werden bevorzugte immunstimulatorische Oligonukleotide, die mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfassen, jene sein, die die Sezernierung von Cytokinen stimulieren, welche dafür bekannt sind, dass sie eine CD8+-T-Zell-Reaktion erleichtern.
Die erfindungsgemäßen immunstimulatorischen Oligonukleotide können auf eine Vielzahl von Wegen chemisch modifiziert werden, um das Oligonukleotid gegen endogene Endonukleasen zu stabilisieren. Zum Beispiel können die Oligonukleotide andere Verknüpfungen als Phosphodiesterverknüpfungen enthalten, wobei die Nukleotide am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende des Oligonukleotids durch eine beliebige Anzahl nicht-herkömmlicher Basen oder chemischer Gruppen ersetzt worden sind, wie beispielsweise Phosphorthioat-modifizierte Nukleotide. Die immunstimulatorischen Oligonukleotide, die mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfassen, können bevorzugt mit mindestens einem solchen Phosphorthioat-modifizierten Nukleotid modifiziert sein. Oligonukleotide mit Phosphorthioat-modifizierten Verknüpfungen können unter Verwendung von Verfahren präpariert werden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, wie beispielsweise Phosphoramidit (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7079 (1988)) oder H-Phosphonat (Froehler et al. Tetrahedron Lett. 27:5575 (1986)). Beispiele für andere modifizierende chemische Gruppen umfassen Alkylphosphonate, Phosphordithioate, Alkylphosphorthioate, Phosphoramidate, 2-O-Methyle, Carbamate, Acetamidate, Carboxymethylester, Carbonate und Phosphattriester. Oligonukleotide mit diesen Verknüpfungen können entsprechend bekannter Verfahren hergestellt werden (Goodchild, Chem. Rev. 90:543 (1990); Uhlmann et al., Chem. Rev. 90:534 (1990); und Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10:152 (1992)).
Der Ausdruck „immun-adjuvant" bezieht sich, wie er hier verwendet wird, auf Verbindungen, welche die Immunantwort gegen ein Antigen in dem Individuum oder dem Testsystem, in welches das Antigen eingebracht wird, erhöhen, wenn sie an ein Individuum verabreicht werden oder in vitro getestet werden. Bevorzugt sind solche Individuen Säuger, und bevorzugter sind die Säuger Menschen, die Erfindung soll insofern jedoch nicht begrenzt sein. Alle Tiere, welche die vorteilhaften Wirkungen der erfindungsgemäßen Impfstoffe erfahren können, liegen innerhalb des Bereichs der Tiere, welche entsprechend der vorliegenden Erfindung behandelt werden können. Einige Antigene sind schwach-immunogen, wenn sie alleine verabreicht werden, d.h. sie induzieren keine oder nur schwache Antikörpertiter oder Zell-vermittelte Immunantwort. Ein Immun-Adjuvans kann die Immunantwort des Individuums verstärken, indem Antikörpertiter oder Zellvermittelte Immunität erhöht werden. Die adjuvante Wirkung kann auch die Dosis des Antigens herabsetzen, die wirksam zum Erreichen einer Immunantwort in dem Individuum führt.
Gemäß eines ersten Aspekts der Erfindung ist eine immun-adjuvante Zusammensetzung, die ein Saponin-Adjuvans und ein immunstimulatorisches Oligonukleotid umfasst, zur Verabreichung vorgesehen. Bevorzugter kann eine solche immun-adjuvante Zusammensetzung die Immunantwort gegen ein Antigen in einem Individuum oder einem Testsystem, in welches das Antigen eingebracht wird, erhöhen. Bevorzugt ist das Saponin-Adjuvans ein Saponin von Quillaja saponaria Molina. Bevorzugter ist das Saponin-Adjuvans ein teilweise reines oder im Wesentlichen reines Saponin von Quillaja saponaria Molina. Bevorzugt kann das teilweise reine Saponin QS-7, QS-17, QS-18 und/oder QS-21 umfassen, und es kann andere Saponine umfassen. Bevorzugt ist das im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans QS-7, QS-17, QS-18 oder QS-21. Besonders bevorzugt ist das im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans QS-21. Alternativ dazu kann die immun-adjuvante Zusammensetzung mehr als ein im Wesentlichen reines Saponin-Adjuvans mit dem immunstimulatorischen Oligonukleotid umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Saponin ein chemisch-modifiziertes Saponin-Adjuvans oder eine Fraktion davon abdecken, welche bzw. welches von einem rohen Quillaja saponaria Molina-Extrakt erhältlich ist, wobei das chemisch-modifizierte Saponin oder dessen Fraktion mindestens ein QS-17, QS-18, QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2 umfasst, und wobei das chemisch-modifizierte Saponin die Adjuvans-Aktivität beibehält. Das immunstimulatorische Oligonukleotid umfasst bevorzugt mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid. Das CpG-Dinukleotid ist bevorzugt ein Monomer oder ein Multimer. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des CpG-Motivs ist eine Form als Teil der Sequenz eines Vektors, welcher ebenfalls einen DNA-Impfstoff darstellt. Noch eine weitere Ausführungsform der immun-adjuvanten Zusammensetzung ist auf das immunstimulatorische Oligonukleotid gerichtet, bei welchem das immunstimulatorische Oligonukleotid modifiziert ist. Die jeweilige Modifikation kann mindestens ein Phosphorthioat-modifiziertes Nukleotid umfassen. Außerdem kann das immunstimulatorische Oligonukleotid, welches mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid aufweist, ein CpG-Motiv mit der Formel 5'X₁CGX₂3' umfassen, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinander folgende CpGs voneinander trennt, und wobei X₁ Adenin, Guanin oder Thymin, und X₂ Cytosin, Thymin oder Adenin ist. Das CpG-Motiv kann bevorzugt TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT sein.
Gemäß eines zweiten Aspekts ist die Erfindung auf die Verwendung von (i) einem Antigen, (ii) einem Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität und (iii) einem immunstimulatorischen Oligonukleotid umfassend mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid, zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Verwendung beim Erhöhen der Immunantwort gegen das Antigen in einem Individuum oder Testsystem gerichtet. Bevorzugt ist das Saponin-Adjuvans ein Saponin aus Quillaja saponaria Molina. Bevorzugter ist das Saponin-Adjuvans teilweise rein oder ein im Wesentlichen reines Saponin von Quillaja saponaria Molina. Das Verfahren kann auch eine immun-adjuvante Zusammensetzung zum Gegenstand haben, die mehr als ein im Wesentlichen reines Saponin-Adjuvans und immunstimulatorisches Oligonukleotid umfasst. Das im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans ist bevorzugt QS-7, QS-17, QS-18 oder QS-21. Insbesondere bevorzugt ist das im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans QS-21. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Saponin-Adjuvans ein chemisch-modifiziertes Saponin-Adjuvans oder eine Fraktion davon, erhältlich aus einem rohen Quillaja saponaria Molina-Extrakt, wobei das chemisch-modifizierte Saponin oder die Fraktion davon mindestens ein QS-17, QS-18, QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2 umfasst, und wobei das chemisch modifizierte Saponin die Adjuvans-Aktivität beibehält, abdecken. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst das immunstimulatorische Oligonukleotid mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid. Das CpG-Motiv ist bevorzugt ein Monomer oder ein Multimer. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens umfasst das CpG-Motiv als Teil der Sequenz eines Vektors, der einen DNA-Impfstoff darstellt. Noch eine weitere Ausführungsform ist auf das Verfahren gerichtet, bei dem das immunstimulatorische Oligonukleotid mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, und wobei außerdem das immunstimulatorische Oligonukleotid chemisch-modifiziert sein kann, um das Oligonukleotid gegen endogene Endonukleasen zu stabilisieren. Die Modifikation kann mindestens ein Phosphorthioat-modifiziertes Nukleotid umfassen. Außerdem kann das Verfahren zum Teil auf das immunstimulatorische Oligonukleotid mit mindestens einem unmethylierten CpG-Dinukleotid gerichtet sein, welches ein CpG-Motiv mit der Formel 5'X₁CGX₂3' umfasst, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinander folgende CpGs voneinander trennt, und wobei X₁ Adenin, Guanin oder Thymin und X₂ Cytosin, Thymin oder Adenin ist. In einer anderen bevorzugten Methode ist das unmethylierte CpG-Motiv TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT.
Der Ausdruck „Vakzinzusammensetzung" bzw. „Impfstoffzusammensetzung" bezieht sich hierin auf eine Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Eine Impfstoffzusammensetzung entsprechend der vorliegenden Erfindung würde eine Immunität gegen eine Erkrankung in Individuen hervorrufen. Die Kombination aus Saponin und immunstimulatorischem Oligonukleotid entsprechend der vorliegenden Erfindung kann an ein Individuum verabreicht werden, um die Immunantwort gegen ein beliebiges Antigen zu verstärken. Bevorzugt stimuliert die Impfstoffzusammensetzung die Immunität. Besonders bevorzugt verstärkt die Impfstoffzusammensetzung die Antikörper produktion gegen ein Antigen und verstärkt eine Zell-vermittelte Immunantwort gegen ein Antigen.
Die erfindungsgemäße Vakzinzusammensetzung kann die Antikörperproduktion gegen ein Antigen auf positiv synergistische Weise verstärken. Die synergistische adjuvante Wirkung des immunstimulatorischen Oligonukleotids und des Saponin-Adjuvans, die hierin beschrieben ist, kann auf eine Reihe von Wegen gezeigt werden. Zum Beispiel kann ein synergistischer adjuvanter Effekt als Erhöhung der maximal erwarteten Immunreaktion gezeigt werden. Man könnte eine additive Wirkung erwarten, wenn zwei Adjuvantien kombiniert werden. Insbesondere wenn ein Adjuvans, das bei optimaler Dosis verwendet wird, „X" Antikörper hervorruft, und das andere Adjuvans, ebenfalls bei optimaler Dosis verwendet, „Y" Antikörper hervorruft, dann kann erwartet werden, dass die Kombination „X + Y" hervorruft, wenn das Ergebnis additiv und nicht synergistisch ist. Ein maximaler Reaktionsspiegel, der beachtlich höher ist als „X + Y", würde als synergistische Wirkung betrachtet und wäre unerwartet. Ein zweiter Hinweis auf Synergismus wäre das Auftauchen einer wesentlichen adjuvanten Wirkung bei Dosen, von denen man normalerweise nicht erwartet, dass sie eine adjuvante Wirkung hervorrufen. Ein drittes Anzeichen für Synergie wäre das Auftauchen einer Immunantwort mit einer früheren Kinetik, als für eines der beiden Adjuvantien alleine erwartet würde.
Des Weiteren umfassen typische Antigene, die für die erhöhte Immunantwort geeignet sind, Antigene, die sich von Folgendem ableiten: Viren, wie Influenza, Katzenleukämievirus, Katzenimmundefizienzvirus, HIV-1, HIV-2, Rabies, Masern, Hepatitis B oder Maul- und Klauen-Seuche; Bakterien, wie Anthrax, Diphtherie, Lyme-Krankheit, Pneumokokken oder Tuberkulose; oder Protozoen wie Babeosis bovis oder Plasmodium. Das Antigen kann bevorzugt ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein Glykolipid, ein Phospholipid oder eine Nukleinsäure, die für das interessierende antigene Protein oder Peptid kodiert, sein. Die Antigene können aus einer natürlichen Quelle aufgereinigt sein, mittels Festphasen-Synthese synthetisiert sein, oder sie können mittels Gentechnologie erhalten worden sein.
Entsprechend eines dritten Aspekts umfasst die Erfindung demnach auch eine Impfstoffzusammensetzung umfassend ein Saponin-Adjuvans, ein immunstimulatorisches Oligonukleotid und ein Antigen. Das Saponin-Adjuvans kann teilweise reines oder im Wesentlichen reines Saponin aus Quillaja saponaria Molina sein. Die Impfstoffzusammensetzungen können auch mehr als ein teilweise reines oder im Wesentlichen reines Saponin-Adjuvans, ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, welches außerdem mindestens ein unmethyliertes CpG-Motiv umfasst, und ein Antigen umfassen. Bevorzugt umfasst das im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans QS-7, QS-17, QS-18 und/oder QS-21 und es kann andere Saponine umfassen. Bevorzugt ist das im Wesentlichen reine Saponin QS-7, QS-17, QS-18 oder QS-21. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfasst Saponin-Adjuvantien, bei denen ein chemisch-modifiziertes Saponin-Adjuvans oder eine Fraktion davon, erhältlich aus einem rohen Quillaja saponaria Molina-Extrakt, vorliegt, wobei das chemisch-modifizierte Saponin oder die Fraktion davon mindestens eines aus QS-17, QS-18, QS-21, QS-21-V1 und QS-21-V2 umfasst, und wobei das chemisch-modifizierte Saponin seine Adjuvans-Aktivität beibehält. Insbesondere bevorzugt ist das teilweise reine oder im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans in der Impfstoffzusammensetzung QS-21. Das immunstimulatorische Oligonukleotid kann bevorzugt mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfassen. Das CpG-Motiv kann bevorzugt ein Monomer oder ein Multimer sein. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des CpG-Motivs ist das Vorliegen als Teil der Sequenz eines Vektors, welcher ebenfalls einen DNA-Impfstoff darstellt. Noch eine andere Ausführungsform der Impfstoffzusammensetzung, die hierin beschrieben ist, ist auf das immunstimulatorische Oligonukleotid gerichtet, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, welches eine chemische Modifikation enthält. Genauer kann das immunstimulatorische Oligonukleotid mit mindestens einem Phosphorthioatmodifizierten Nukleotid modifiziert sein. Weiterhin umfasst das immunstimulato rische Oligonukleotid mit mindestens einem unmethylierten CpG-Dinukleotid der Impfstoffzusammensetzung ein CpG-Motiv mit der Formel 5'X₁CGX₂3', wobei mindestens ein Nukleotid aufeinander folgende CpGs voneinander trennt, und wobei X₁ Adenin, Guanin oder Thymin, und X₂ Cytosin, Thymin oder Adenin ist. Das unmethylierte CpG-Motiv entsprechend dieses Aspekts der Erfindung kann bevorzugt TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT umfassen.
Die Erfindung hat auch die Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung zum Gegenstand, welche mehr als ein teilweise reines oder im Wesentlichen reines Saponin-Adjuvans, ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, und ein Antigen umfasst. Bevorzugt umfasst das teilweise reine Saponin-Adjuvans QS-7, QS-17, QS-18 und/oder QS-21, und kann andere Saponine umfassen. Bevorzugt umfasst das im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans QS-7, QS-17, QS-18 oder QS-21. Am meisten bevorzugt ist entsprechend der vorliegenden Erfindung das teilweise oder im Wesentlichen reine Saponin-Adjuvans QS-21. Das Saponin-Adjuvans kann bevorzugt ein chemisch-modifiziertes Saponin-Adjuvans oder eine Fraktion davon sein, erhältlich aus einem rohen Quillaja saponaria Molina-Extrakt, wobei das chemisch-modifizierte Saponin oder die Fraktion davon mindestens eines von QS-17, QS-18, QS-21, QS-21-V1 und QS-21-V2 umfasst, und wobei das chemisch-modifizierte Saponin seine Adjuvans-Aktivität beibehält. Bevorzugt umfasst die Erfindung die Verwendung von einem immunstimulatorischen Oligonukleotid, welches außerdem mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfasst. Das CpG-Dinukleotid darin ist ein Monomer oder ein Multimer. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Verwendung umfasst das CpG-Motiv als Teil der Sequenz eines Vektors, welcher ebenfalls einen DNA-Impfstoff darstellt. Noch eine andere Ausführungsform der Verwendungen, die hierin offenbart sind, ist auf das immunstimulatorische Oligonukleotid gerichtet, welches mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, wobei das immunstimulatorische Oligonukleotid chemisch-modifiziert sein kann, um seine Stabilität gegenüber endogenen Endonukleasen zu erhöhen. Solch eine Modifikation kann mindestens ein Phosphorthioat-modifiziertes Nukleotid umfassen. Weiterhin kann das immunstimulatorische Oligonukleotid mit mindestens einem unmethylierten CpG-Dinukleotid ein CpG-Motiv mit der Formel 5'X₁CGX₂3' umfassen, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinander folgende CpGs voneinander trennt, und wobei X₁ Adenin, Guanin oder Thymin, und X₂ Cytosin, Thymin oder Adenin ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das unmethylierte CpG-Motiv TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT.
Andere nützliche Indikationen für die Impfstoffzusammensetzung umfassen die Verstärkung der Antikörperproduktion gegen ein Antigen und die Verstärkung der Zell-vermittelten Immunität. Bevorzugter verstärkt der Impfstoff die Antikörperproduktion gegen ein Antigen und verstärkt eine Zell-vermittelte Immunität. Besonders bevorzugt verstärkt die Impfstoffzusammensetzung Antikörperproduktion gegen ein Antigen auf positiv synergistische Weise.
Die Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, internasal, oral, mucosal oder auf irgendeine andere geeignete Weise vorgenommen werden. Die verarbreichte Dosis kann vom Alter, Gewicht, der Art einer gleichzeitigen Behandlung, wenn eine vorliegt, und der Natur des verabreichten Antigens abhängen. Der Anfangsdosis kann eine Booster-Dosierung nach einer Zeitspanne von ungefähr vier Wochen folgen, um die immunogene Reaktion zu verstärken. Weitere Booster-Dosierungen können ebenfalls verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann als einzelne Injektion einer gemischten Formulierung aus Saponin, Oligonukleotid und Antigen, oder als getrennte Injektionen, verabreicht an derselben Stelle innerhalb einer kurzen Zeitspanne (d.h. 0–2 Tage), gegeben werden.
Die wirkungsvollen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Formen wie beispielsweise Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren zur oralen Verabreichung, oder sterilen Flüssigformen wie Lösungen oder Suspensionen verwendet werden. Irgendein inerter annehmbarer Trägerstoff kann bevorzugt verwendet werden, wie beispielsweise Kochsalzlösung oder PBS oder irgendein annehmbarer Trägerstoff, bei welchem die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignete Löslichkeitseigenschaften zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Beispiele
Ein gut etabliertes Tiermodell wurde verwendet, um zu untersuchen, ob Formulierungen aus CpG-Oligonukleotid und QS-21 zusammen als Immun-Adjuvans funktionieren. Kurz, es wurden Experimente durchgeführt, um QS-21 mit dem adjuvanten CpG-Motiv, von dem kürzlich berichtet wurde, zu vergleichen. Eine CpG-Sequenz (z.B. 1758), von der berichtet wurde, dass sie als Adjuvans für einen B-Zell-Lymphom-Idiotyp-KLH-Impfstoff in Mäusen dient, wurde ausgewählt. Ein Experiment sollte ermitteln, ob das CpG-Motiv, alleine oder in Kombination mit QS-21, als Adjuvans für einen Untereinheiten-Impfstoff, z.B. OVA, in Mäusen dienen kann, und zwar beim Induzieren von CTL-Reaktionen. Diese Arbeit umfasste ein Experiment betreffend einen Dosierungsbereich mit CpG, um die optimale Dosis zu bestimmen.
Zusätzlich dazu, CpG und QS-21 als Adjuvantien zu vergleichen, wurde ein zweites Experiment durchgeführt, das CpG-Oligonukleotid mit suboptimalen Dosen von QS-21 (z.B. 1,25 μg) kombinierte, um zu untersuchen, ob CpG-Oligonukleotid die adjuvante Wirkung von QS-21 beeinflussen kann.
Es wurde auch ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob die CpG und QS-21 Kombination die Antikörperproduktion, spezifisch das Isotypenprofil einer Antigen-spezifischen Antikörperreaktion, verbessern kann.
Schließlich wurde eine Serie von Experimenten durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine Kombination aus CpG-Oligonukleotid mit Saponin die Antikörperproduktion auf eine positiv synergistische Weise verstärken würde. Diese Arbeiten verwendeten Vakzinformulierungen aus Typ 14 Pneumokokkenpolysaccharid, QS-21 und CpG-Oligonukleotid, und untersuchten spezifische Antikörpertiter, die von Mäusen an den Tagen 21 und 42 nach der Immunisierung an Tagen 0 und 28 geerntet wurden. Eine andere CpG-Sequenz (z.B. 1826), von der berichtet wurde, dass sie als Adjuvans für Hühnerei-Lysozym in Mäusen dient, wurde ausgewählt.
Die Experimente wurden unter Verwendung von Materialien der folgenden Hersteller durchgeführt: OVA, Grad VI (Sigma); Typ 14 Pneumokokkenpolysaccharid (ATCC); QS-21 (Aquila); CpG-Oligonukleotide einschließlich der Phosphorthioat-modifizierten Sequenz 1758 TCTCCCAGCGTGCGCCA und der Phosphorthioat-modifizierten Sequenz 1826 TCCATGACGTTCCTGACGTT (Life Technologies (Gibco)).
Beispiel 1
CTL, induziert durch QS-21 und CpG/QS-21
C57BL/6-Mäuse (5 pro Gruppe, weiblich, 8 bis 10 Tage alt) wurden auf dem subkutanen Weg an Tagen 1, 15 und 29 immunisiert. Die Impfstoffe waren 25 μg OVA-Antigen plus die angegebenen Dosen Adjuvans in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Das in diesem Experiment verwendete CpG-Motiv war ein Phosphorthioat-modifiziertes Oligonukleotid 1758 mit der Sequenz TCTCCCAGCGTGCGCCA (Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:10833 (1997).) Splenozyten wurden an Tag 42 zur Verwendung als Effektorzellen im CTL-Assay entnommen. Sie wurden in vitro für 6 Tage mit Mitomycin C-behandelten E.G7-OVA-Zellen stimuliert und dann in einem standardisierten ⁵¹Cr-Ausschüttungs-CTL-Assay verwendet. E.G7-OVA-Zellen (mit ⁵¹Cr beladen) wurden als Zielzellen verwendet. Die Hintergrund-Lyse von EL4-Zellen (die nicht mit OVA transfiziert waren) wurde von der Lyse der E.G6- OVA-Zellen abgezogen, um eine prozentuale (%) Antigen-spezifische Lyse zu erhalten.
Die Ergebnisse, wie sie in 1 gezeigt sind, deuten darauf hin, dass in Abwesenheit eines Adjuvans keine Lysis beobachtet wurde, und zwar bei jeder CpG-Dosis, oder bei 1,25 μg QS-21 (suboptimale Dosis). Die suboptimale Dosis QS-21 in Kombination mit CpG induzierte jedoch eine signifikante CTL. Die Ergebnisse zeigen eine bedeutende adjuvante Wirkung bei Dosen, von denen man normalerweise nicht erwartet, dass sie eine solche adjuvante Wirkung hervorrufen. Dieser positive synergistische Effekt war am bemerkenswertesten bei der höheren Dosis CpG (50 μg). Die adjuvante Wirkung war mit der vergleichbar, die mit der optimalen 10 μg QS-21-Kontrolle erreicht wurde.
Beispiel 2
CTL, induziert durch QS-21 und CpG/QS-21
Splenozyten aus Mäusen, die wie in 1 beschrieben immunisiert waren, wurden in einem CTL-Assay verwendet. Die Splenozyten wurden in vitro mit denaturiertem OVA vor der Verwendung in dem CTL-Assay für 6 Tage stimuliert. Der Assay wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gegen E.G7-OVA-Zellen durchgeführt.
Wie aus den Ergebnissen in 2 ersichtlich, wurde in der Abwesenheit von Adjuvans keine Lysis beobachtet, und zwar bei jeder CpG-Dosis, oder mit 1,25 μg QS-21 (suboptimale Dosis). Die suboptimale Dosis QS-21 in Kombination mit CpG induzierte jedoch signifikante CTL (vergleichbar mit der optimalen 10 μg QS-21-Kontrolle). Die Ergebnisse veranschaulichen den positiven Synergismus zwischen CpG und QS-21, der bei einer suboptimalen Dosis unerwartet war.
Beispiel 3
Antigen-spezifisches Serum, IgG1 und IgG2a
Serumtiter gegenüber OVA wurden mittels EIA bei Seren bestimmt, die an Tag 42 von den Mäusen entnommen wurden, wie sie in Beispiel 1 beschrieben immunisiert wurden. Titer der IgG-Unterklasse IgG1 und IgG2a wurden für einzelne Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe) bestimmt und als geometrischer Durchschnittstiter aufgetragen. Die IgG1-Titer waren am höchsten in Gruppen, die nur QS-21 (bei 10 μg-Dosis) oder 10 μg QS-21 in Kombination mit entweder 10 oder 50 μg (ungefähr 10-fache Verstärkung gegenüber der nicht mit Adjuvans behandelten Gruppe) erhielten, wie in 3 zu sehen. Die IgG2a-Reaktion war bei keiner der Gruppen detektierbar, mit Ausnahme der Kombination von 10 μg QS-21 (optimale Dosis) mit 10 oder 50 μg CpG und der Kombination aus 1,25 μg QS-21 (suboptimale Dosis) mit 50 μg CpG. IgG2a wurde bei keiner alleinige CpG-Dosis, bei keiner alleinigen QS-21-Dosis, und in keiner nicht mit Adjuvans behandelten Gruppe detektiert.
Beispiel 4
Antikörper gegen Pneumokokken-Polysaccharid-Antigen, induziert durch QS-21 und OS-21/CpG
BALB/c-Mäuse (5 Mäuse pro Gruppe, weiblich, 8 bis 10 Wochen alt) wurden auf dem subkutanen Weg nur an Tag 0 oder an Tagen 0 und 28 immunisiert. Die Impfstoffe waren Typ 14-Pneumokokken-Polysaccharid plus angegebene Dosen Adjuvans, in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Das in diesem Experiment verwendete immunstimulatorische Motiv CpG war ein Phosphorthioat-modifiziertes Oligonukleotid 1826 mit der Sequenz TCCATGACGTTCCTGACGTT (Chu et al., J. Exp. Med. 186:1623–1631 (1997)). QS-21 wurde mit einer Dosis von 1,25 μg oder 10 μg verwendet. CpG ODN 1826 wurde mit einer Dosis von nur 10 μg verwendet.
Seren aus Mäusen, die nur eine einzelne Immunisierung erhielten, wurden an Tag 21 abgenommen. Seren von Mäusen, die zwei Immunisierungen erhielten, wurden an Tag 42 abgenommen. Antikörper-Titer, die für Typ 14-Polysaccharid spezifisch waren, wurden in den Seren bestimmt. IgG-Unterklassen IgG1, IgG2a und IgG3 wurden für einen Serenpool mit gleichem Volumen von den Mäusen in jeder Gruppe bestimmt. Nach einer einzelnen Immunisierung waren IgG1-Titer 66 mal höher bei der 10 μg QS-21/10 μg CpG-Kombination als bei QS-21 alleine, und sie waren 43 mal höher als bei CpG alleine (4). IgG2a-Titer waren 11 mal höher bei der 10 μg QS-21/CpG-Kombination als entweder bei QS-21 alleine oder bei CpG alleine (5). IgG3-Titer waren 85 mal höher bei der 10 μg QS-21/CpG-Kombination als bei QS-21 alleine, und sie waren 95 mal höher als bei CpG alleine (6).
Nach zwei Immunisierungen waren IgG1-Titer 46 mal höher bei der 10 μg QS-21/CpG-Kombination als bei QS-21 alleine, und sie waren 444 mal höher als CpG alleine (7). IgG2a-Titer waren 476 mal höher bei der 10 μg QS-21/CpG-Kombination als bei QS-21 alleine, und sie waren 127 mal höher als bei CpG alleine (5). IgG3-Titer waren 67 mal höher bei der 10 μg QS-21/CpG-Kombination als bei QS-21 alleine, und sie waren 243 mal höher als bei CpG alleine (9). Die Verstärkung dieser Titer zeigt, dass dies eine positiv synergistische Wirkung ist und nicht nur eine additive adjuvante Wirkung der Kombination dieser zwei Adjuvantien. Zusätzlich rief auch die Kombination niedriger Dosen von QS-21 (1,25 μg) mit 10 μg CpG ebenfalls IgG1- und IgG3-Titer nach zwei Immunisierungen hervor, die höher waren als jene, die entweder durch 1,25 μg QS-21 alleine, 10 μg QS-21 alleine, oder 10 μg CpG alleine hervorgerufen wurden.

Claims

Impfstoffzusammensetzung, welche umfasst: (a) ein Antigen; (b) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität; und (c) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Saponin abgeleitet ist von Quillaja saponaria.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das Saponin aus einem oder mehreren im Wesentlichen reinen Saponinen besteht.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das eine oder die mehreren im Wesentlichen reinen Saponine QS-7, QS-17, QS-18, QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2 oder mehr als eines der vorstehend genannten Saponine sind.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das im Wesentlichen reine Saponin QS-21 ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf das Antigen in einem Individuum, wobei das immunstimulante Oligonukleotid modifiziert ist, und wobei die Impfstoffzusammensetzung dem Individuum durch parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Mittel verabreicht wird.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das immunstimulante Oligonukleotid mit wenigstens einem Phosphorthioat-modifizierten Nukleotid modifiziert ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das immunstimulante Oligonukleotid ein CpG-Motiv umfasst, welches die Formel 5'X₁CGX₂3' aufweist, wobei wenigstens ein Nukleotid aufeinander folgende CpGs trennt, und wobei X₁ Adenin, Guanin oder Thymin und X₂ Cytosin, Thymin oder Adenin ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das CpG-Motiv TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiter die Immunantwort auf das Antigen erhöht.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiter die Antikörperproduktion auf das Antigen fördert.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiter die Antikörperproduktion auf das Antigen in einer positiven synergistischen Weise fördert.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung weiter die zelluläre Immunität fördert.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein Glycolipid, ein Phospholipid oder eine Nukleinsäure, welche für das Protein oder Peptid kodiert, umfasst.
Immun-adjuvante Zusammensetzung, welche umfasst: (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, wobei das immunstimulante Oligonukleotid kein Teil eines DNA-Impfstoffvektors ist, oder (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität, wobei das Saponin abgeleitet ist von Quillaja saponaria; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, wobei das Saponin aus einem oder mehreren der im Wesentlichen reinen Saponine QS-7, QS-17 oder QS-18 besteht, oder (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, wobei das immunstimulante Oligonukleotid TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT umfasst, oder (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität, wobei das Saponin ein chemisch modifiziertes Saponin ist; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die adjuvante Zusammensetzung umfasst: (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, wobei das immunstimulante Oligonukleotid kein Teil eines DNA-Impfstoffvektors ist.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die adjuvante Zusammensetzung umfasst: (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität, wobei das Saponin abgeleitet ist von Quillaja saponaria; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, wobei das Saponin aus einem oder mehreren der im Wesentlichen reinen Saponine QS-7, QS-17 oder QS-18 besteht.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die adjuvante Zusammensetzung umfasst: (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, wobei das immunstimulante Oligonukleotid TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT umfasst.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei die adjuvante Zusammensetzung umfasst: (a) ein Saponin mit immun-adjuvanter Aktivität, wobei das Saponin ein chemisch modifiziertes Saponin ist; und (b) ein immunstimulantes Oligonukleotid, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Saponin ein Saponin ist wie in den Ansprüchen 2, 3, 4 oder 5 definiert.
Immun-adjuvante Zusammensetzung wie in den Ansprüchen 16, 17, 18 oder 19 definiert zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum, welchem das Antigen verabreicht wird, wobei das immunstimulante Oligonukleotid modifiziert ist, und wobei die immun-adjuvante Zusammensetzung dem Individuum durch parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Mittel verabreicht wird.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das immunstimulante Oligonukleotid mit wenigstens einem Phosphorthioatmodifizierten Nukleotid modifiziert.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das immunstimulante Oligonukleotid ein Nukleotid ist wie in Anspruch 8 oder 9 definiert.
Impfstoffzusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 5, 8 bis 14 definiert zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf das Antigen in einem Individuum.
Verwendung eines (i) Antigens, (ii) eines Saponins mit immun-adjuvanter Aktivität, und (iii) eines immunstimulanten Oligonukleotids, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung für die Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf besagtes Antigen in einem Individuum.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Saponin ein Saponin ist wie in den Ansprüchen 2, 3, 4 oder 5 definiert.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das immunstimulante Oligonukleotid modifiziert ist, und wobei die Impfstoffzusammensetzung dem Individuum durch parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Mittel verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei das immunstimulante Oligonukleotid mit wenigstens einem Phosphorthioat-modifizierten Nukleotid modifiziert ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das immunstimulante Oligonukleotid ein Nukleotid ist wie in Anspruch 8 oder 9 definiert.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Verwendung weiter die Antikörperproduktion auf das Antigen fördert.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Verwendung weiter die Antikörperproduktion in einer positiven synergistischen Weise fördert.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Verwendung weiter die Zellimmunität fördert.
Immun-adjuvante Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 16, 20 und 23 definiert zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum, welchem das Antigen verabreicht wird.
Verwendung von (i) eines Saponins mit immun-adjuvanter Aktivität und (ii) eines immunstimulanten Oligonukleotids, welches wenigstens ein nicht-methyliertes CpG-Dinukleotid umfasst, bei der Herstellung einer immun-adjuvanten Zusammensetzung zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum, welchem das Antigen verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei das Saponin ein Saponin ist wie in den Ansprüchen 2, 3, 4 oder 5 definiert.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei das immunstimulante Oligonukleotid modifiziert ist, und wobei die immun-adjuvante Zusammensetzung dem Individuum durch parenterale, introvenöse, intramuskuläre oder subkutane Mittel verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei das immunstimulante Oligonukleotid mit wenigstens einem Phosphorthioat-modifizierten Nukleotid modifiziert ist.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei das immunstimulante Oligonukleotid ein CpG-Motiv umfasst, welches die Formel 5'X₁CGX₂3' aufweist, wobei wenigstens ein Nukleotid aufeinander folgende CpGs separiert, und wobei X₁ Adenin, Guanin oder Thymin und X₂ Cytosin, Thymin oder Adenin ist.
Verwendung nach Anspruch 38, wobei das CpG-Motiv TCTCCCAGCGTGCGCCAT oder TCCATGACGTTCCTGACGTT umfasst.
Verwendung nach Anspruch 34, wobei das Antigen ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein Glycolipid, ein Phospholipid oder eine Nukleinsäure, welche für das Protein oder Peptid kodiert, umfasst.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, wobei das Saponin ein Saponin ist wie in Anspruch 2, 3, 4 oder 5 definiert.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 oder 19, wobei das immunstimulante Oligonukleotid ein Nukleotid ist wie in Anspruch 8 oder 9 definiert.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 28 und 34 bis 38, oder immun-adjuvante Zusammensetzung nach den Ansprüchen 17, 18 oder 19, wobei das immunstimulante Oligonukleotid 5 bis 40 Basen in der Länge besitzt.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 28 und 34 bis 38, oder immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 16, 17 oder 18, wobei das Saponin ein chemisch modifiziertes Saponin ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 28 und 34 bis 38, wobei die Zusammensetzung, wenn sie einem Menschen verabreicht wird, die Immunantwort des Menschen auf das Antigen erhöht, oder, wobei die Zusammensetzung, wenn sie einem Tier verabreicht wird, die Immunantwort des Tieres auf das Antigen erhöht.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 16, 17, 18, 19 und 41, wobei die Zusammensetzung, wenn sie einem Menschen verabreicht wird, die Immunantwort des Menschen auf ein Antigen erhöht, welches dem Menschen verabreicht wird, oder, wobei die Zusammensetzung, wenn sie einem Tier verabreicht wird, die Immunantwort des Tieres auf ein Antigen erhöht, welches dem Tier verabreicht wird.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach Anspruch 46, wobei das Antigen ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein Glycolipid, ein Phospholipid oder eine Nukleinsäure, welche für das Protein oder das Peptid kodiert, umfasst.
Immun-adjuvante Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 17, 18, 19, 41 und 42 zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum, welchem das Antigen verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 34 oder 35, wobei das Antigen dem Individuum innerhalb von zwei Tagen nach der Verabreichung der immun-adjuvanten Zusammensetzung verabreicht wird, und wobei die immun-adjuvante Zusammensetzung dem Individuum durch parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Mittel verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 49, wobei das Antigen dem Individuum gleichzeitig mit der immun-adjuvanten Zusammensetzung verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 49 bis 50, wobei das Antigen ein Protein, ein Peptid, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein Glycolipid, ein Phospholipid oder eine Nukleinsäure, welche für das Protein oder für das Peptid kodiert, umfasst.