HAT 미디엄

인체 비장B세포와 결합된 플라스마시토마시미딘키나아제 돌연변이로 묘사된 HAT 선택.

HAT 매질(hymassantine-aminopterin-thymidine medium)은 포유류 세포 배양에 대한 선택 매개체로, 이수분포 환원효소를 억제하여 강력한 엽산 대사 억제제 역할을 하는 약물인 아미노프테린과 I를 매개하는 히산산산산틴(purine 파생물질)과 티미딘(dymidine)의 결합에 의존한다.n DNA 합성. 요령은 아미노프테린이 세포분열이 진행되기 위해 절대적으로 필요한 DNA de novo 합성을 차단하지만, 저산산틴과 티미딘은 세포에게 차단을 피할 수 있는 원재료('살바지 경로')를 제공하는데, 이는 세포들을 암호화하는 유전자의 기능 복사본을 갖는다는 것을 의미한다.

디하이드로폴리스의 감소로 테트라하이드로폴리스(THF)를 생성하는 효소 디하이드로폴리스 환원효소는 특히 아미노프테린에 의해 차단된다. THF는 특정 단백질과 연계하여 작용하며, 단일 탄소 단위를 수신하여 특정 표적에게 전달될 수 있다.

세포 생성을 위한 중요한 대상 중 하나는 티미딜산 싱타아제인데, 디옥시우리딘 모노인산염(dUMP)으로부터 티미딘 모노인산염(TMP)을 생성한다. 추가적인 인산화 반응에 의해 TMP는 DNA 중합체가 DNA를 생성하기 위해 사용하는 네 가지 뉴클레오티드 전구체 중 하나인 티미딘 삼인산(TTP)을 만드는 데 사용될 수 있다. dump 변환에 필요한 THF가 없으면 TTP가 있을 수 없고, 다른 소스에서 TMP를 생산할 수 없는 한 DNA 합성이 진행될 수 없다. 대체 선원은 HAT 매체에 존재하는 티미딘으로, 세포에 흡수되어 티미딘키나아제(TK)에 의해 TMP로 인산화된다.

IMM의 합성, (GMP와 GTP, AMP와 ATP에 대한 사전 커서) 또한 THF를 필요로 하며, 또한 우회할 수 있다. 이 경우 저산산산틴-과닌인산인산화효소(HGPRT)는 매질에서 흡수된 저산산산틴을 PRPP와 반응시켜 파이로인산염을 해방시켜 인양 경로를 통해 IMM을 생성한다.

따라서 세포 배양에 HAT 매체를 사용하는 것은 작동하는 TK와 HGPRT를 포함하는 세포에 대한 인위적인 선택이다. 이 계획의 많은 유용한 개선은 세포를 죽이는 독에 의해 가능하지만, 이 유전자들 중 하나가 부족하면 면역성이 있다. 따라서 TK가 부족한 세포는 브로모데옥시우리딘(BrdU)에 내성이 있고, HGPRT가 부족한 세포는 6-Thioguanine(6-TG)과 8-Azaguanine에 내성이 있다. 따라서, HAT 매체에 이어 후자의 두 가지 약물 중 하나로 선택하게 되면, 리턴트 군락을 산출하게 될 것이다.^[1]

적용들

HAT 매체는 단클론 항체를 준비하기 위해 사용된다. 이 과정을 하이브리드마 기술이라고 한다. 실험실 동물(예: 생쥐)은 항체를 분리하는 데 관심이 있는 항원에 처음 노출된다. 일단 스플렌세포가 포유류로부터 격리되면 B세포는 폴리에틸렌 글리콜이나 센다이 바이러스를 이용한 HGPRT 음성, 불멸의 골수종 세포와 융합된다. 융합된 세포는 HAT 매체에 배양된다. 중간중간에 있는 아미노프테린이 노보 길을 막는다. 따라서 미사용 골수종 세포는 데 노보나 인양 경로로 뉴클레오티드를 생산할 수 없기 때문에 죽는다. 사용되지 않은 B세포는 수명이 짧기 때문에 죽는다. 이렇게 해서 B세포 골수종 잡종만이 살아남는다. 이들 세포는 항체(B세포의 성질)를 생성하며 불멸(골수종 세포의 성질)이다. 배양된 매체는 각각의 웰이 1개의 셀만 포함할 정도로 멀티웰 플레이트로 희석된다. 그러면 각 우물에 있는 상등액을 검사하여 원하는 항체를 확인할 수 있다. 우물 안의 항체는 동일한 B세포에 의해 생성되기 때문에 동일한 비피형을 향해 향하게 되며, 단핵항체로 알려져 있다.

단핵 항체의 생산은 세사르 밀슈타인과 조르주 J. F. 쾰러에 의해 처음 발명되었는데, 이 회사는 닐스 카즈 제른과 공유한 1984년 노벨 생리의학상을 수상하였다.

참조