WO2018212247A1 - Method for predicting therapeutic efficacy of egfr tyrosine kinase inhibitor for egfr-mutant non-small cell lung cancer - Google Patents
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Definitions
- the step of determining that there is a successful treatment of the non-small cell lung cancer with the EGFR inhibitor The early prediction method according to any one of [1] to [8], further including: [10] The early prediction method according to any one of [1] to [9], wherein the EGFR inhibitor is afatinib.
- the present invention provides an early treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor by confirming whether or not there is a mutation in the EGFR gene in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor It becomes possible to predict the response, and it is possible to select a treatment method at an earlier stage than the conventional method.
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Abstract
Provided is a method for early predicting the therapeutic efficacy of an EGFR inhibitor drug for non-small cell lung cancer, said method comprising a step for confirming the presence or absence of mutation of EGFR gene in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after the administration of the EGFR inhibitor drug. Also provided is a kit for early predicting the therapeutic efficacy of an EGFR inhibitor drug for non-small cell lung cancer, said kit comprising a primer set for amplifying a DNA fragment containing mutation of EGFR gene.
Description
本発明は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法に関する。本発明はまた、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キットに関する。
The present invention includes a step of confirming whether or not an EGFR gene mutation is present in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after the administration of the EGFR inhibitor, the therapeutic efficacy of the non-small cell lung cancer with the EGFR inhibitor It relates to an early prediction method. The present invention also relates to a kit for early prediction of the efficacy of treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising a primer set for amplifying a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene.
非小細胞肺がんにおけるEGFR変異を検出するために従来は組織を用いての検査が行われてきたが、代替法として液性検体を用いた検出法が最近承認された（非特許文献１）。しかしながら、検査結果はEGFR阻害剤による治療の適応の可否を判断するためのみに用いられ、治療効果の予測や効果判定における診断意義については不明であった。さらには、血漿における分子遺伝学的寛解の早期評価が臨床的寛解および/またはより長期の有効性の評価の代替手段になりうるか否かについても不明であった。
In order to detect EGFR mutation in non-small cell lung cancer, examination using a tissue has been conventionally performed, but a detection method using a liquid sample has recently been approved as an alternative method (Non-patent Document 1). However, the test results were used only to determine whether the treatment with EGFR inhibitor is applicable, and the diagnostic significance in predicting the therapeutic effect and determining the effect was unknown. Furthermore, it was unclear whether early assessment of molecular genetic remission in plasma could be an alternative to clinical remission and / or longer-term efficacy assessment.
本発明の目的は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法を提供することである。本発明の別の目的は、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キットを提供することである。
An object of the present invention is to treat non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising the step of confirming whether or not an EGFR gene mutation is present in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor It is to provide an early prediction method of response. Another object of the present invention is to provide a kit for early prediction of the efficacy of treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising a primer set for amplifying a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene.
本発明者らは、血漿中のEGFR変異が陽性である非小細胞肺がん患者にアフィチニブを投与し、血漿DNAのEGFR変異について分子遺伝学的完全寛解(CMR)が確認された患者は、そうでない患者よりも長期の無憎悪期間を有することを見出した。
We administer afitinib to non-small cell lung cancer patients who are positive for EGFR mutations in plasma, and patients who have a complete molecular genetic response (CMR) for EGFR mutations in plasma DNA are not It has been found that it has a longer duration of hate than the patient.
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
即ち、本発明は下記のとおりである。
［１］非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法。
［２］EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含む、［１］に記載の早期予測方法。
［３］EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つを含む、［１］または［２］に記載の早期予測方法。
［４］確認する工程が、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅することを含む、［３］に記載の早期予測方法。
［５］確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を配列番号８で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、［４］に記載の早期予測方法。
［６］確認する工程が、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅することを含む、［３］～［５］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［７］確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を配列番号１０で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、［６］に記載の早期予測方法。
［８］確認する工程が、EGFR阻害薬投与後2週間以降に行われる、［１］～［７］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［９］EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む、［１］～［８］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［１０］EGFR阻害薬がアファチニブである、［１］～［９］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［１１］EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キット。
［１２］EGFR阻害薬投与前の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含んでいる非小細胞肺がん患者のための、［１１］に記載の早期予測用キット。
［１３］EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つである、［１１］または［１２］に記載の早期予測用キット。
［１４］EGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットである、［１３］に記載の早期予測用キット。
［１５］配列番号８で表される標識されたプローブをさらに含む、［１４］に記載の早期予測用キット。
［１６］EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットである、［１３］～［１５］のいずれか1つに記載の早期予測用キット。
［１７］配列番号１０で表される標識されたプローブをさらに含む、［１６］に記載の早期予測用キット。
［１８］EGFR阻害薬がアファチニブである、［１１］～［１７］のいずれか1つに記載の早期予測用キット。 Based on the above findings, the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
[1] Successful treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising the step of confirming whether or not an EGFR gene mutation is present in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor Early prediction method.
[2] The early prediction method according to [1], wherein DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient before administration of an EGFR inhibitor contains a mutation of the EGFR gene.
[3] The early prediction method according to [1] or [2], wherein the mutation of the EGFR gene includes at least one of c.2573T> G of the EGFR gene or deletion of the 19th exon of the EGFR gene.
[4] The step of confirming includes amplifying a DNA fragment containing c.2573T> G of the EGFR gene using a primer set consisting of the primer represented by SEQ ID NO: 1 and the primer represented by SEQ ID NO: 2. The early prediction method according to [3].
[5] The early step according to [4], wherein the step of confirming further comprises detecting a DNA fragment containing c.2573T> G of the amplified EGFR gene with a labeled probe represented by SEQ ID NO: 8 Prediction method.
[6] The step of confirming includes amplifying a DNA fragment from which the 19th exon of the EGFR gene is deleted using a primer set comprising the primer represented by SEQ ID NO: 3 and the primer represented by SEQ ID NO: 4. The early prediction method according to any one of [3] to [5].
[7] The early step according to [6], wherein the confirming step further includes detecting a DNA fragment from which the 19th exon of the amplified EGFR gene is deleted with a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10. Prediction method.
[8] The early prediction method according to any one of [1] to [7], wherein the step of confirming is performed after 2 weeks after administration of the EGFR inhibitor.
[9] When the presence of a mutation in the EGFR gene is not confirmed in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor, the step of determining that there is a successful treatment of the non-small cell lung cancer with the EGFR inhibitor The early prediction method according to any one of [1] to [8], further including:
[10] The early prediction method according to any one of [1] to [9], wherein the EGFR inhibitor is afatinib.
[11] A kit for early prediction of the efficacy of treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising a primer set for amplifying a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene.
[12] The kit for early prediction according to [11] for a non-small cell lung cancer patient in which DNA derived from a blood sample before administration of the EGFR inhibitor contains a mutation of the EGFR gene.
[13] The early prediction kit according to [11] or [12], wherein the mutation of the EGFR gene is at least one of c.2573T> G of the EGFR gene or deletion of the 19th exon of the EGFR gene.
[14] The primer set for amplifying a DNA fragment containing EGFR gene c.2573T> G is a primer set comprising the primer represented by SEQ ID NO: 1 and the primer represented by SEQ ID NO: 2, The kit for early prediction as described.
[15] The kit for early prediction according to [14], further comprising a labeled probe represented by SEQ ID NO: 8.
[16] The primer set for amplifying a DNA fragment from which the 19th exon of the EGFR gene is deleted is a primer set comprising the primer represented by SEQ ID NO: 3 and the primer represented by SEQ ID NO: 4. [13] to [13] [15] The kit for early prediction according to any one of [15].
[17] The kit for early prediction according to [16], further comprising a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10.
[18] The kit for early prediction according to any one of [11] to [17], wherein the EGFR inhibitor is afatinib.
即ち、本発明は下記のとおりである。
［１］非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法。
［２］EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含む、［１］に記載の早期予測方法。
［３］EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つを含む、［１］または［２］に記載の早期予測方法。
［４］確認する工程が、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅することを含む、［３］に記載の早期予測方法。
［５］確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を配列番号８で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、［４］に記載の早期予測方法。
［６］確認する工程が、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅することを含む、［３］～［５］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［７］確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を配列番号１０で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、［６］に記載の早期予測方法。
［８］確認する工程が、EGFR阻害薬投与後2週間以降に行われる、［１］～［７］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［９］EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む、［１］～［８］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［１０］EGFR阻害薬がアファチニブである、［１］～［９］のいずれか1つに記載の早期予測方法。
［１１］EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キット。
［１２］EGFR阻害薬投与前の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含んでいる非小細胞肺がん患者のための、［１１］に記載の早期予測用キット。
［１３］EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つである、［１１］または［１２］に記載の早期予測用キット。
［１４］EGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットである、［１３］に記載の早期予測用キット。
［１５］配列番号８で表される標識されたプローブをさらに含む、［１４］に記載の早期予測用キット。
［１６］EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットである、［１３］～［１５］のいずれか1つに記載の早期予測用キット。
［１７］配列番号１０で表される標識されたプローブをさらに含む、［１６］に記載の早期予測用キット。
［１８］EGFR阻害薬がアファチニブである、［１１］～［１７］のいずれか1つに記載の早期予測用キット。 Based on the above findings, the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
[1] Successful treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising the step of confirming whether or not an EGFR gene mutation is present in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor Early prediction method.
[2] The early prediction method according to [1], wherein DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient before administration of an EGFR inhibitor contains a mutation of the EGFR gene.
[3] The early prediction method according to [1] or [2], wherein the mutation of the EGFR gene includes at least one of c.2573T> G of the EGFR gene or deletion of the 19th exon of the EGFR gene.
[4] The step of confirming includes amplifying a DNA fragment containing c.2573T> G of the EGFR gene using a primer set consisting of the primer represented by SEQ ID NO: 1 and the primer represented by SEQ ID NO: 2. The early prediction method according to [3].
[5] The early step according to [4], wherein the step of confirming further comprises detecting a DNA fragment containing c.2573T> G of the amplified EGFR gene with a labeled probe represented by SEQ ID NO: 8 Prediction method.
[6] The step of confirming includes amplifying a DNA fragment from which the 19th exon of the EGFR gene is deleted using a primer set comprising the primer represented by SEQ ID NO: 3 and the primer represented by SEQ ID NO: 4. The early prediction method according to any one of [3] to [5].
[7] The early step according to [6], wherein the confirming step further includes detecting a DNA fragment from which the 19th exon of the amplified EGFR gene is deleted with a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10. Prediction method.
[8] The early prediction method according to any one of [1] to [7], wherein the step of confirming is performed after 2 weeks after administration of the EGFR inhibitor.
[9] When the presence of a mutation in the EGFR gene is not confirmed in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor, the step of determining that there is a successful treatment of the non-small cell lung cancer with the EGFR inhibitor The early prediction method according to any one of [1] to [8], further including:
[10] The early prediction method according to any one of [1] to [9], wherein the EGFR inhibitor is afatinib.
[11] A kit for early prediction of the efficacy of treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising a primer set for amplifying a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene.
[12] The kit for early prediction according to [11] for a non-small cell lung cancer patient in which DNA derived from a blood sample before administration of the EGFR inhibitor contains a mutation of the EGFR gene.
[13] The early prediction kit according to [11] or [12], wherein the mutation of the EGFR gene is at least one of c.2573T> G of the EGFR gene or deletion of the 19th exon of the EGFR gene.
[14] The primer set for amplifying a DNA fragment containing EGFR gene c.2573T> G is a primer set comprising the primer represented by SEQ ID NO: 1 and the primer represented by SEQ ID NO: 2, The kit for early prediction as described.
[15] The kit for early prediction according to [14], further comprising a labeled probe represented by SEQ ID NO: 8.
[16] The primer set for amplifying a DNA fragment from which the 19th exon of the EGFR gene is deleted is a primer set comprising the primer represented by SEQ ID NO: 3 and the primer represented by SEQ ID NO: 4. [13] to [13] [15] The kit for early prediction according to any one of [15].
[17] The kit for early prediction according to [16], further comprising a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10.
[18] The kit for early prediction according to any one of [11] to [17], wherein the EGFR inhibitor is afatinib.
本発明は、EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かを確認することによって、早期にEGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性を予測できるようになり、従来方法より早い段階で治療方法の選択を可能にする。
The present invention provides an early treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor by confirming whether or not there is a mutation in the EGFR gene in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor It becomes possible to predict the response, and it is possible to select a treatment method at an earlier stage than the conventional method.
本発明は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法を提供する（以下「本発明の方法」と省略する場合がある）。
The present invention includes a step of confirming whether or not an EGFR gene mutation is present in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after the administration of the EGFR inhibitor, the therapeutic efficacy of the non-small cell lung cancer with the EGFR inhibitor Is provided (hereinafter may be abbreviated as “method of the present invention”).
本発明の方法は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む（以下「本発明の確認工程」と省略する場合がある）。
The method of the present invention includes a step of confirming whether or not an EGFR gene mutation is present in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of an EGFR inhibitor (hereinafter abbreviated as “the confirmation step of the present invention”). May be).
本発明の方法における非小細胞肺がんは、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなどが含まれ、そのいずれであってもよい。
The non-small cell lung cancer in the method of the present invention includes adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma and the like, and any of them may be used.
本発明の方法における非小細胞肺がん患者は、非小細胞肺がんに罹患していると病理診断された患者であれば特に制限はない。非小細胞肺がんのステージは任意のステージであってよいが、ステージIII、ステージIVである場合に本発明の方法がより有効性を有する。本発明の方法における非小細胞肺がん患者は術後再発した患者であってもよい。また、本発明の方法における非小細胞肺がん患者は、EGFR阻害薬による治療を受けていない患者であることが好ましい。EGFR阻害薬としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アファチニブが挙げられるが、それらに制限されない。
The non-small cell lung cancer patient in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a patient pathologically diagnosed as suffering from non-small cell lung cancer. The stage of non-small cell lung cancer may be any stage, but the method of the present invention is more effective when it is stage III or stage IV. The non-small cell lung cancer patient in the method of the present invention may be a patient who has relapsed after surgery. In addition, the non-small cell lung cancer patient in the method of the present invention is preferably a patient who has not been treated with an EGFR inhibitor. EGFR inhibitors include, but are not limited to, gefitinib, erlotinib, osmeltinib, and afatinib.
本発明の方法における血液試料は、非小細胞肺がん患者から採取した、DNAを含有する血液試料であれば特に制限はなく、例えば、血液、血清または血漿などが挙げられる。血液または血清には白血球由来の断片化したゲノムDNAが混入している可能性があるため、血漿を利用することが好ましい。DNAは、血液、血清および血漿から公知の手段で単離することができ、例えば、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kitなどの市販品を用いて単離することができる。
The blood sample in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a blood sample containing DNA collected from a non-small cell lung cancer patient, and examples thereof include blood, serum, or plasma. Since blood or serum may be contaminated with fragmented genomic DNA derived from leukocytes, it is preferable to use plasma. DNA can be isolated from blood, serum and plasma by a known means, for example, using a commercially available product such as QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit.
本発明の方法における血液試料由来のDNAは、細胞から血中に遊離したDNAをいい、がん患者においては、腫瘍細胞から遊離される循環腫瘍DNA（ctDNA）を多く含む。循環DNAの濃度はがん患者で上昇していることが知られ、がん細胞のアポトーシス、壊死またはがん細胞からの分泌によって血中に流出すると考えられており、原発巣のコピー数多型、遺伝子変異、またはメチル化を反映していることが報告されている。従って、EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAは、EGFR遺伝子の変異を含んでいることが好ましい。
The DNA derived from a blood sample in the method of the present invention refers to DNA released from cells into the blood, and cancer patients contain a large amount of circulating tumor DNA (ctDNA) released from tumor cells. Circulating DNA levels are known to be elevated in cancer patients, and are thought to be released into the blood by cancer cell apoptosis, necrosis, or secretion from cancer cells. , Reported to reflect genetic mutation, or methylation. Therefore, it is preferable that the DNA derived from the blood sample of a non-small cell lung cancer patient before administration of the EGFR inhibitor contains a mutation of the EGFR gene.
本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異は、EGFRの機能が活性化される変異であればどのような変異であってもよく、その中でも、EGFR遺伝子の19番目エキソンの欠失（表１に記載されたアミノ酸の欠失）、EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子の変異を少なくとも１つ含む。19番目エキソンが欠失したEGFR遺伝子としては、表１に記載された塩基配列の欠失が挙げられる。EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子の変異としては、EGFR遺伝子のc.2573T＞Gが挙げられる。また、本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異は、上記以外のEGFR遺伝子の変異であってもよく、Lindeman NI et al., Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology., Journal of Thoracic Oncology, Volume 8, Number 7, page 823-859, July 2013にこれまでに報告されたEGFR遺伝子の変異が列挙されており、それらであってもよい。
The mutation of the EGFR gene in the method of the present invention may be any mutation as long as the function of EGFR is activated. Among them, deletion of the 19th exon of the EGFR gene (described in Table 1) At least one mutation in the EGFR gene that results in the replacement of Leu, the 858th amino acid of EGFR, with Arg. Examples of the EGFR gene from which the 19th exon has been deleted include deletion of the base sequences described in Table 1. The EGFR gene mutation c.2573T> G is exemplified as a result of replacing Leu, which is the 858th amino acid of EGFR, with Arg. Further, the mutation of the EGFR gene in the method of the present invention may be a mutation of an EGFR gene other than the above, and Lindeman NI et al., Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology., Journal of Thoracic Oncology, Volume 8, Number 7, Page 823-859, EGFRJuly Are listed, and may be those.
本発明の確認工程は、非小細胞肺がん患者にEGFR阻害薬投与後に行われる。EGFR阻害薬としては、EGFRの機能を阻害できればとくに制限はないが、ゲフィチニブ、エルロチニブ、オシメルチニブ、アファチニブなどがあげられる。その中でも、アファチニブが好ましい。
The confirmation step of the present invention is performed after EGFR inhibitor administration to non-small cell lung cancer patients. The EGFR inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the function of EGFR, and examples thereof include gefitinib, erlotinib, osimertinib, and afatinib. Of these, afatinib is preferred.
また、EGFR阻害薬の投与量は、EGFR阻害薬の種類、投与経路、患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、経口の場合には成人で１日あたり有効成分量として、数ｍｇ～２ｇ程度、好ましくは５ｍｇ～数十ｍｇ程度を、１日１～数回にわけて投与することができる。注射の場合には成人で有効成分量として約０．１ｍｇ～約５００ｍｇを投与すればよく、１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。特にアファチニブの場合、経口投与で１日１回４０ｍｇ投与することができる。
In addition, the dose of EGFR inhibitor varies depending on the type of EGFR inhibitor, administration route, patient age, weight, symptoms, etc., and cannot generally be specified. As a result, about several mg to 2 g, preferably about 5 mg to several tens mg can be administered once to several times a day. In the case of injection, it is sufficient to administer about 0.1 mg to about 500 mg as an active ingredient amount in an adult, and the daily dose can be administered once or divided into several times. In particular, in the case of afatinib, 40 mg can be administered once a day by oral administration.
本発明の確認工程は、非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異を検出することができる方法であれば特に制限されず、例えば、RFLP法、PCR-SSCP法、ASOハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RNaseA切断法、化学切断法、DOL法、TaqMan PCR法、インベーダー法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、UCAN法、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ECA法、デジタルPCR法などにより実施することができるが、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅する工程を含む方法が好ましい。EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅する工程を含む方法としてはPCRを利用した方法が挙げられ、PCRを利用した方法の中でもデジタルPCR法が好ましく挙げられる。
The confirmation step of the present invention is not particularly limited as long as it is a method capable of detecting a mutation in the EGFR gene in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient. For example, the RFLP method, PCR-SSCP method, ASO high level Hybridization, direct sequencing method, ARMS method, denaturing gradient gel electrophoresis method, RNaseA cleavage method, chemical cleavage method, DOL method, TaqMan PCR method, invader method, MALDI-TOF / MS method, TDI method, molecular beacon method , Dynamic allele specific hybridization method, padlock probe method, UCAN method, nucleic acid hybridization method using DNA chip or DNA microarray, ECA method, digital PCR method, etc. A method comprising a step of amplifying a DNA fragment comprising Examples of the method including the step of amplifying a DNA fragment containing a mutation of the EGFR gene include a method using PCR, and among the methods using PCR, a digital PCR method is preferable.
本発明の確認工程において、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅する工程を含む方法を用いる場合、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するためのプライマーセットが用いられる。プライマーセットは、本発明の確認工程において検出すべきEGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、該プライマーセットは、EGFR遺伝子の部分塩基配列であって、検出すべき変異部位より5’側の相補鎖配列の一部にハイブリダイズする、約15～約50塩基、好ましくは約15～約30塩基の塩基配列を含む核酸と、該変異部位の塩基より3’側の配列の一部にハイブリダイズする、約15～約50塩基、好ましくは約15～約30塩基の塩基配列を含む核酸との組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50～約1,000塩基、好ましくは約50～約500塩基、より好ましくは約50～約200塩基である、一対の核酸が挙げられる。
In the confirmation step of the present invention, when a method including a step of amplifying a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene is used, a primer set for amplifying the DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene is used. The primer set may be any as long as it is designed to amplify a DNA fragment containing a mutation of the EGFR gene to be detected in the confirmation step of the present invention. For example, the primer set is a partial base sequence of the EGFR gene, which hybridizes to a part of the complementary strand sequence 5 ′ to the mutation site to be detected, preferably about 15 to about 50 bases, preferably about 15 to A nucleic acid containing a base sequence of about 30 bases and a base sequence of about 15 to about 50 bases, preferably about 15 to about 30 bases, which hybridizes to a part of the sequence 3 'to the base of the mutation site A pair of nucleic acids which is a combination of nucleic acids and whose nucleic acid fragments amplified by them have a fragment length of about 50 to about 1,000 bases, preferably about 50 to about 500 bases, more preferably about 50 to about 200 bases. It is done.
本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞Gである場合、EGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片は、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅することができる。また、本発明の方法におけるEGFR遺伝子の変異が、EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失である場合、EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片は、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いて増幅することができる。
When the mutation of the EGFR gene in the method of the present invention is c.2573T> G of the EGFR gene, the DNA fragment containing c.2573T> G of the EGFR gene is represented by the primer represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Amplification can be performed using a primer set consisting of the primers to be prepared. In addition, when the mutation of the EGFR gene in the method of the present invention is the deletion of the 19th exon of the EGFR gene, the DNA fragment from which the 19th exon of the EGFR gene is deleted is the primer and sequence represented by SEQ ID NO: 3 Amplification can be performed using a primer set consisting of the primer represented by No. 4.
本発明の確認工程において増幅されたEGFR遺伝子の変異を含むDNA断片は、公知の手段で検出することができ、例えば、EGFR遺伝子の変異を含む塩基配列に相補的な塩基配列を含む標識されたプローブで検出することができる。該プローブは、その5’末端がFAMやTETなどの蛍光色素で、中央付近や3’末端がZENやIABkFなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されており、そのままの状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは野生型EGFRおよび変異型EGFRの双方のアレルについて調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色素（例えば、一方のアレルをFAM、他方をTET）で標識することが好ましい。また、プローブからのPCR伸長反応が起こらないように3’末端はリン酸化されている。プローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムDNAの部分配列を増幅するように設計されたプライマーおよびTaq DNAポリメラーゼとともにPCRを行うと、プローブが鋳型DNAとハイブリダイズし、同時にPCRプライマーからの伸長反応が起こるが、伸長反応が進むとTaq DNAポリメラーゼの5’ヌクレア－ゼ活性によりハイブリダイズしたプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大する。
The DNA fragment containing the mutation of the EGFR gene amplified in the confirmation step of the present invention can be detected by known means, for example, labeled with a base sequence complementary to the base sequence containing the mutation of the EGFR gene It can be detected with a probe. The probe is labeled with a fluorescent dye such as FAM or TET at the 5 'end, and with a quencher (quenching substance) such as ZEN or IABkF near the center or at the 3' end. Fluorescence is not detected because it absorbs fluorescence energy. It is preferable to prepare probes for both wild-type EGFR and mutant EGFR alleles and label them with fluorescent dyes having different fluorescence wavelengths (for example, one allele is FAM and the other is TET) for collective detection. Further, the 3 'end is phosphorylated so that PCR extension reaction from the probe does not occur. When PCR is performed with a primer designed to amplify a partial sequence of genomic DNA containing a region that hybridizes with the probe and Taq DNA polymerase, the probe hybridizes with the template DNA, and at the same time, an extension reaction from the PCR primer occurs. However, when the extension reaction proceeds, the hybridized probe is cleaved by the 5 ′ nuclease activity of Taq DNA polymerase, the fluorescent dye is released and is not affected by the quencher, and fluorescence is detected. The fluorescence intensity increases exponentially by amplification of the template.
本発明の確認工程において、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片は配列番号８で表される標識されたプローブで検出することができる。また、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片は配列番号１０で表される標識されたプローブで検出することができる。
In the confirmation step of the present invention, the amplified DNA fragment containing c.2573T> G of the EGFR gene can be detected with the labeled probe represented by SEQ ID NO: 8. Further, a DNA fragment from which the 19th exon of the amplified EGFR gene is deleted can be detected with a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10.
本発明の確認工程は、EGFR阻害薬の投与後であればどの時点で実施されてもよいが、EGFR阻害薬の投与後２週間目以降であることが好ましい。
The confirmation step of the present invention may be performed at any time point after the administration of the EGFR inhibitor, but is preferably after the second week after the administration of the EGFR inhibitor.
本発明の方法は、EGFR阻害薬の投与後、EGFR阻害薬投与前のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判断することができる。従って、本発明の方法は、EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む。ここで、EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいて検出される変異EGFR遺伝子の頻度が、健常人の血液試料由来のDNAにおいて疑陽性として検出される変異EGFR遺伝子の頻度（カットオフ値）未満になる場合、EGFR遺伝子の変異の存在が確認されない（または分子遺伝学的完全寛解(CMR)）と判定することができる。検出される変異EGFR遺伝子としては、19番目エキソンが欠失したEGFR遺伝子、EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子が挙げられる。19番目エキソンが欠失したEGFR遺伝子としては、表１に記載された塩基配列の欠失が挙げられる。EGFRの858番目のアミノ酸であるLeuがArgに置換される結果となるようなEGFR遺伝子の変異としては、EGFR遺伝子のc.2573T＞Gが挙げられる。カットオフ値としては、１９番目エキソンの欠失は4 events、c.2573T＞Gは2 eventsが挙げられるが、これらに制限されない。
In the method of the present invention, after the administration of the EGFR inhibitor, if the presence of a mutation in the EGFR gene is not confirmed in the DNA before the administration of the EGFR inhibitor, it is determined that the treatment of non-small cell lung cancer with the EGFR inhibitor is successful Can do. Therefore, the method of the present invention is effective in treating non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor when the presence of a mutation in the EGFR gene is not confirmed in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor. The process of determining is further included. Here, the frequency of the mutant EGFR gene detected in the DNA derived from the blood sample of the non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor is When the frequency is less than the cutoff value, it can be determined that the presence of a mutation in the EGFR gene is not confirmed (or complete molecular genetic remission (CMR)). Examples of the mutant EGFR gene to be detected include an EGFR gene in which the 19th exon is deleted, and an EGFR gene that results in the replacement of Leu, which is the 858th amino acid of EGFR, with Arg. Examples of the EGFR gene from which the 19th exon has been deleted include deletion of the base sequences described in Table 1. The EGFR gene mutation c.2573T> G is exemplified as a result of replacing Leu, which is the 858th amino acid of EGFR, with Arg. The cut-off values include, but are not limited to, 4 events for the 19th exon deletion and 2 events for c.2573T> G.
本発明はまた、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キットを提供する（以下「本発明のキット」と省略する場合がある）。
The present invention also provides a kit for early prediction of the efficacy of treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising a primer set for amplifying a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene (hereinafter referred to as “kit of the present invention”). May be omitted).
本発明のキットにおける、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットとしては、本発明の方法で用いられるプライマーセットであってよい。より具体的には、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセット、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットが挙げられる。
The primer set used in the method of the present invention may be a primer set for amplifying a DNA fragment containing an EGFR gene mutation in the kit of the present invention. More specifically, a primer set consisting of a primer represented by SEQ ID NO: 1 and a primer represented by SEQ ID NO: 2, a primer set comprising a primer represented by SEQ ID NO: 3 and a primer represented by SEQ ID NO: 4 Can be mentioned.
本発明のキットは、上記プライマーセットを用いて増幅されるEGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を、高感度で、定量的に検出することができる、該増幅断片内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、検出を容易かつ鋭敏にするための標識物質で標識された核酸プローブを、さらに含むことが好ましい。例えば、本発明のキットは、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を検出するためのプローブとして、配列番号８で表される標識されたプローブをさらに含むことができる。また、本発明のキットは、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を検出するためのプローブとして、配列番号１０で表される標識されたプローブをさらに含むことができる。
The kit of the present invention is a nucleotide complementary to the nucleotide sequence in the amplified fragment, capable of quantitatively detecting a DNA fragment containing a mutation of the EGFR gene amplified using the above primer set. It preferably further comprises a nucleic acid probe having a sequence and labeled with a labeling substance for easy and sensitive detection. For example, the kit of the present invention can further include a labeled probe represented by SEQ ID NO: 8 as a probe for detecting a DNA fragment containing the amplified EGFR gene c.2573T> G. Moreover, the kit of the present invention can further include a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10 as a probe for detecting a DNA fragment from which the 19th exon of the amplified EGFR gene is deleted.
本発明のキットに用いられるプライマーセットおよびプローブは、公知の塩基配列情報に基づいて、該塩基配列および／またはその相補鎖配列の一部もしくは全部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。該プライマーセットおよびプローブを含むキットは、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。
The primer set and probe used in the kit of the present invention can be obtained by using a commercially available DNA / RNA automatic synthesizer or the like, based on known base sequence information, by using a commercially available DNA / RNA automatic synthesizer or the like to partially or entirely include the base sequence and / or its complementary strand sequence It can be obtained by chemical synthesis. The kit including the primer set and the probe can be provided as a solid in a dry state or in an alcohol precipitate state, or provided in a state dissolved in water or a suitable buffer (eg, TE buffer). You can also
本発明のキットは、上記のプライマーセットおよびプローブに加えて、EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片の検出のための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、本発明のキットは、当該他の物質を、上記のプライマーセットおよびプローブを含む試薬とは別個の試薬として含む、試薬キットとして提供されてもよい。当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、dNTPs、耐熱性DNAポリメラーゼ等が挙げられる。
In addition to the primer set and probe described above, the kit of the present invention is another substance necessary for the reaction for detecting a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene, and adversely affects the reaction by storing it in the coexisting state. The substance which does not affect can be further contained. Alternatively, the kit of the present invention may be provided as a reagent kit containing the other substance as a reagent separate from the reagent containing the primer set and the probe. Examples of such other substances include reaction buffers, dNTPs, and heat-resistant DNA polymerase.
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the examples are merely illustrative of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
化学療法（EGFR-TKI）を受けていない、EGFR感受性変異を有する進行性NSCLC患者は、病勢増悪(PD)または毒性中止まで1日1回アファチニブ単剤治療(40 mg/body)を受けた（図１）。投与開始時（０日）、２週間、４週間、８週間、１２週間、２４週間、４８週間およびPD時における患者由来の血漿DNAを得た。3種の臨床的に相関のあるEGFR変異(exon 19 deletion、exon 20 T790Mおよびexon 21 L858R)がmultiplexed, pico-droplet digital PCRアッセイ(RainDrop(R) system, RainDance Technologies, Billerica, MA)を血漿DNAを用いて解析した(図２)。分子遺伝学的完全寛解(CMR)を「EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいて検出される変異EGFR遺伝子の頻度が、健常人の血液試料由来のDNAにおいて疑陽性として検出される変異EGFR遺伝子の頻度（カットオフ値）未満になる場合」と定義した。カットオフ値としては、exon 19 deletionは4 events, exon 21 L858Rは2 events, exon 20 T790は3 eventsを用いた。本実施例に記載の研究はUMIN (ID: 000015847)に登録されている。
Patients with advanced NSCLC with EGFR-sensitive mutations who have not received chemotherapy (EGFR-TKI) received afatinib monotherapy (40 mg / body) once daily until disease progression (PD) or cessation of toxicity ( FIG. 1). Plasma DNA from patients was obtained at the start of administration (Day 0), 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks, 12 weeks, 24 weeks, 48 weeks and PD. Three clinically correlated EGFR mutations (exon 19 deletion, exon 20 T790M and exon 21 L858R) were multiplexed, pico-droplet digital (PCR assay (RainDrop (R) system, RainDance Technologies, Billerica, MA) (FIG. 2). Molecular genetic complete remission (CMR): “The frequency of mutated EGFR gene detected in DNA from blood samples of non-small cell lung cancer patients after EGFR inhibitor administration is false positive in DNA from healthy human blood samples It is defined as “when the frequency (cutoff value) of the mutated EGFR gene detected is less than”. As cut-off values, 4 events were used for exon 19 deletion, 2 events were used for exon 21 L858R, and 3 events were used for exon 20 T790. The research described in this example is registered in UMIN (ID: 000015847).
試料および方法
試料回収
全被験者からBD BiosciencesのVacutainer EDTA採血管に全血を採取した。該血液を4℃で10分間、1500×gで遠心分離し、血漿上清（2～3.5 mL）を50mLコニカルチューブ(BD Falcon)に移し、使用まで-80℃で保存した。血漿DNAを製造元の指示に従い、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、単離した。血漿DNAをAVEバッファー(45 μL)に溶解した。血漿DNA約20μLをSpeedVac (Thermo Scientific)によって約10μLに濃縮した。 Samples and Methods Sample Collection Whole blood was collected from all subjects into BD Biosciences Vacutainer EDTA blood collection tubes. The blood was centrifuged at 1500 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the plasma supernatant (2-3.5 mL) was transferred to a 50 mL conical tube (BD Falcon) and stored at −80 ° C. until use. Plasma DNA was isolated using the QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. Plasma DNA was dissolved in AVE buffer (45 μL). About 20 μL of plasma DNA was concentrated to about 10 μL by SpeedVac (Thermo Scientific).
試料回収
全被験者からBD BiosciencesのVacutainer EDTA採血管に全血を採取した。該血液を4℃で10分間、1500×gで遠心分離し、血漿上清（2～3.5 mL）を50mLコニカルチューブ(BD Falcon)に移し、使用まで-80℃で保存した。血漿DNAを製造元の指示に従い、QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、単離した。血漿DNAをAVEバッファー(45 μL)に溶解した。血漿DNA約20μLをSpeedVac (Thermo Scientific)によって約10μLに濃縮した。 Samples and Methods Sample Collection Whole blood was collected from all subjects into BD Biosciences Vacutainer EDTA blood collection tubes. The blood was centrifuged at 1500 × g for 10 minutes at 4 ° C., and the plasma supernatant (2-3.5 mL) was transferred to a 50 mL conical tube (BD Falcon) and stored at −80 ° C. until use. Plasma DNA was isolated using the QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. Plasma DNA was dissolved in AVE buffer (45 μL). About 20 μL of plasma DNA was concentrated to about 10 μL by SpeedVac (Thermo Scientific).
マルチプレックス形式におけるEGFR変異検出
３つの共通EGFR変異および対応する各野生型配列を同定するためにマルチプレックスアッセイを開発した。簡潔には、TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies) 20.0μLを10μMのフォワードおよびリバースプライマー2.0μL、4μM FAMおよびTET標識プローブ2.0μL、Droplet Stabilizer (RainDance Technologies, Billerica, MA) 4.0μL、DNaseおよびRNase不含滅菌水4.0μLを含むアッセイ試薬と混合した。最終反応量は患者由来の血漿DNA試料8μLを含む40μLだった。プライマー、プローブおよびクエンチャーの配列を、その濃度とともに表２および表３に示す。 EGFR mutation detection in multiplex format A multiplex assay was developed to identify three common EGFR mutations and corresponding wild-type sequences. Briefly, TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies) 20.0 μL with 10 μM forward and reverse primers 2.0 μL, 4 μM FAM and TET labeled probe 2.0 μL, Droplet Stabilizer (RainDance Technologies, Billerica, MA) 4.0 μL, DNase and RNase free Mixed with assay reagent containing 4.0 μL of sterile water. The final reaction volume was 40 μL containing 8 μL of patient-derived plasma DNA sample. The primer, probe and quencher sequences are shown in Tables 2 and 3 along with their concentrations.
３つの共通EGFR変異および対応する各野生型配列を同定するためにマルチプレックスアッセイを開発した。簡潔には、TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies) 20.0μLを10μMのフォワードおよびリバースプライマー2.0μL、4μM FAMおよびTET標識プローブ2.0μL、Droplet Stabilizer (RainDance Technologies, Billerica, MA) 4.0μL、DNaseおよびRNase不含滅菌水4.0μLを含むアッセイ試薬と混合した。最終反応量は患者由来の血漿DNA試料8μLを含む40μLだった。プライマー、プローブおよびクエンチャーの配列を、その濃度とともに表２および表３に示す。 EGFR mutation detection in multiplex format A multiplex assay was developed to identify three common EGFR mutations and corresponding wild-type sequences. Briefly, TaqMan Genotyping Master Mix (Life Technologies) 20.0 μL with 10 μM forward and reverse primers 2.0 μL, 4 μM FAM and TET labeled probe 2.0 μL, Droplet Stabilizer (RainDance Technologies, Billerica, MA) 4.0 μL, DNase and RNase free Mixed with assay reagent containing 4.0 μL of sterile water. The final reaction volume was 40 μL containing 8 μL of patient-derived plasma DNA sample. The primer, probe and quencher sequences are shown in Tables 2 and 3 along with their concentrations.
製造元の指示に従い、液滴作製マイクロ流体チップ(Souse chip, RainDance Technologies)で流体力学的流動収束により、血漿DNA試料を含むアッセイ溶液から均一なサイズの水滴の集団（エマルジョン）を作製した。８つの0.2 mLコニカル底PCRチューブを含むPCRチューブストリップ(Axygen, Tewksbury, MA)にエマルジョンを集めた。エマルジョンおよびキャリアオイルを総量75μL含むPCRチューブストリップを8-Strip Dome Cap (Axygen)でしっかりと閉め、熱蓋を備えるサーマルサイクラ―(Proflex PCR system, Life Technologies)で設置した。エマルジョンを表４に記載した条件でサーマルサイクルした。
According to the manufacturer's instructions, a uniform population of water droplets (emulsion) was prepared from the assay solution containing the plasma DNA sample by hydrodynamic flow convergence with a droplet preparation microfluidic chip (Souse chip, RainDance Technologies). Emulsions were collected in PCR tube strips (Axygen, Tewksbury, MA) containing 8 0.2 mL conical bottom PCR tubes. PCR tube strips containing a total volume of 75 μL of emulsion and carrier oil were tightly closed with 8-Strip® Dome® Cap® (Axygen) and placed in a thermal cycler with a thermal lid (Proflex® PCR® system, Life Technologies Technologies). The emulsion was thermal cycled under the conditions listed in Table 4.
サーマルサイクルしたエマルジョンを第2マイクロ流体チップ(Souse chip, RainDance Technologies)に移し、製造元の指示に従い、エンドポイント蛍光シグナルを計測した。
The thermally cycled emulsion was transferred to a second microfluidic chip (Souse chip, RainDance Technologies), and the endpoint fluorescence signal was measured according to the manufacturer's instructions.
データ解析
液滴イベントデータを製造元の指示に従いRainDrop Analystソフトウェア(RainDance Technologies)で解析した。簡潔には、試料データを液滴サイズゲートテンプレート(RainDance Technologies)でロードした。ポジティブコントロール試料由来のデータを用いて、RainDrop Analystソフトウェア内に補正マトリクスを作成した。補正マトリクスを各試料由来のデータに適用し、TETおよびFAM蛍光分子からのクロストーク蛍光シグナルを除いた。ポジティブコントロールにおける野生型または変異型クラスターを含むエリアの手動選別によって野生型および変異型ゲートのサイズと位置を決定した。
各未知試料については、PCR陽性液滴イベントの数を各ゲート内でカウントした。各ゲート内のイベントの数を未処理液滴の総数を用いて、アッセイごとのイベントの数に変換した。臨床試料を解析する場合、組織試料におけるEGFR変異ステータスの結果を、血漿試料中のEGFR変異ステータスの結果が表れるまで隠した。 Data analysis Droplet event data was analyzed with RainDrop Analyst software (RainDance Technologies) according to the manufacturer's instructions. Briefly, sample data was loaded with a droplet size gate template (RainDance Technologies). A correction matrix was created in RainDrop Analyst software using data from positive control samples. A correction matrix was applied to the data from each sample to eliminate crosstalk fluorescence signals from TET and FAM fluorescent molecules. The size and location of wild type and mutant gates were determined by manual selection of areas containing wild type or mutant clusters in the positive control.
For each unknown sample, the number of PCR positive droplet events was counted within each gate. The number of events in each gate was converted to the number of events per assay using the total number of untreated droplets. When analyzing clinical samples, EGFR mutation status results in tissue samples were hidden until EGFR mutation status results in plasma samples appeared.
液滴イベントデータを製造元の指示に従いRainDrop Analystソフトウェア(RainDance Technologies)で解析した。簡潔には、試料データを液滴サイズゲートテンプレート(RainDance Technologies)でロードした。ポジティブコントロール試料由来のデータを用いて、RainDrop Analystソフトウェア内に補正マトリクスを作成した。補正マトリクスを各試料由来のデータに適用し、TETおよびFAM蛍光分子からのクロストーク蛍光シグナルを除いた。ポジティブコントロールにおける野生型または変異型クラスターを含むエリアの手動選別によって野生型および変異型ゲートのサイズと位置を決定した。
各未知試料については、PCR陽性液滴イベントの数を各ゲート内でカウントした。各ゲート内のイベントの数を未処理液滴の総数を用いて、アッセイごとのイベントの数に変換した。臨床試料を解析する場合、組織試料におけるEGFR変異ステータスの結果を、血漿試料中のEGFR変異ステータスの結果が表れるまで隠した。 Data analysis Droplet event data was analyzed with RainDrop Analyst software (RainDance Technologies) according to the manufacturer's instructions. Briefly, sample data was loaded with a droplet size gate template (RainDance Technologies). A correction matrix was created in RainDrop Analyst software using data from positive control samples. A correction matrix was applied to the data from each sample to eliminate crosstalk fluorescence signals from TET and FAM fluorescent molecules. The size and location of wild type and mutant gates were determined by manual selection of areas containing wild type or mutant clusters in the positive control.
For each unknown sample, the number of PCR positive droplet events was counted within each gate. The number of events in each gate was converted to the number of events per assay using the total number of untreated droplets. When analyzing clinical samples, EGFR mutation status results in tissue samples were hidden until EGFR mutation status results in plasma samples appeared.
結果
本実施例では55名の患者を検証した(図３)。アファチニブの有効性は以前の報告と同程度であった（全寛解率：78.6%、無増悪期間中央値(mPFS)：14.2ヶ月）。投与開始時において、患者の62.5%(35/56)において血漿中のEGFR変異が陽性であった。血漿中のEGFR変異陽性患者は、陰性患者よりもわずかに短いPFSを有したが、有意ではなかった(p = 0.24, log-rank)(図４)。投与開始時において血漿中のEGFR変異が陽性であった患者のうち、60.6%が2週間で、87.5%が4週間でそれぞれCMRに達した(図５)。2週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、2週間でCMRとなった患者は、2週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 7.5ヶ月, p = 0.0001)。4週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、4週間でCMRとなった患者もまた、4週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 5.1ヶ月, p < 0.0001)。4週間までにCMRとなった患者のうち、CMRに達するまでの時間はPFSに影響を与えなかった(p = 0.59)。 Results In this example, 55 patients were verified (FIG. 3). Afatinib was as effective as previously reported (total remission rate: 78.6%, median progression-free period (mPFS): 14.2 months). At the start of administration, plasma EGFR mutations were positive in 62.5% (35/56) of patients. EGFR mutation positive patients in plasma had slightly shorter PFS than negative patients, but were not significant (p = 0.24, log-rank) (FIG. 4). Of the patients who were positive for plasma EGFR mutation at the start of administration, 60.6% reached CMR in 2 weeks and 87.5% in 4 weeks, respectively (FIG. 5). Patients who discontinued afatinib by week 2 were excluded from the validation, and those who became CMR in 2 weeks had significantly longer PFS than those who did not become CMR in 2 weeks ( 13.6 versus 7.5 months, p = 0.0001). Patients who discontinued afatinib byweek 4 were excluded from the validation, and those who became CMR at 4 weeks also had significantly longer PFS than those who did not become CMR at 4 weeks (13.6 versus 5.1 months, p <0.0001). Among patients who became CMR by 4 weeks, the time to reach CMR did not affect PFS (p = 0.59).
本実施例では55名の患者を検証した(図３)。アファチニブの有効性は以前の報告と同程度であった（全寛解率：78.6%、無増悪期間中央値(mPFS)：14.2ヶ月）。投与開始時において、患者の62.5%(35/56)において血漿中のEGFR変異が陽性であった。血漿中のEGFR変異陽性患者は、陰性患者よりもわずかに短いPFSを有したが、有意ではなかった(p = 0.24, log-rank)(図４)。投与開始時において血漿中のEGFR変異が陽性であった患者のうち、60.6%が2週間で、87.5%が4週間でそれぞれCMRに達した(図５)。2週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、2週間でCMRとなった患者は、2週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 7.5ヶ月, p = 0.0001)。4週間目までにアファチニブ投与を中止した患者を検証の対象から除いた上で、4週間でCMRとなった患者もまた、4週間でCMRにならなかった患者と比べてPFSが有意に長かった(13.6 versus 5.1ヶ月, p < 0.0001)。4週間までにCMRとなった患者のうち、CMRに達するまでの時間はPFSに影響を与えなかった(p = 0.59)。 Results In this example, 55 patients were verified (FIG. 3). Afatinib was as effective as previously reported (total remission rate: 78.6%, median progression-free period (mPFS): 14.2 months). At the start of administration, plasma EGFR mutations were positive in 62.5% (35/56) of patients. EGFR mutation positive patients in plasma had slightly shorter PFS than negative patients, but were not significant (p = 0.24, log-rank) (FIG. 4). Of the patients who were positive for plasma EGFR mutation at the start of administration, 60.6% reached CMR in 2 weeks and 87.5% in 4 weeks, respectively (FIG. 5). Patients who discontinued afatinib by week 2 were excluded from the validation, and those who became CMR in 2 weeks had significantly longer PFS than those who did not become CMR in 2 weeks ( 13.6 versus 7.5 months, p = 0.0001). Patients who discontinued afatinib by
本発明は、EGFR阻害薬投与後の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かを確認することによって、早期にEGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性を予測できるようになり、従来方法より早い段階で治療方法の選択を可能にする。
本出願は、米国仮特許出願番号62/507,010を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。 The present invention provides an early treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor by confirming whether or not there is a mutation in the EGFR gene in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor It becomes possible to predict the response, and it is possible to select a treatment method at an earlier stage than the conventional method.
This application is based on US Provisional Patent Application No. 62 / 507,010, the entire contents of which are incorporated herein.
本出願は、米国仮特許出願番号62/507,010を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。 The present invention provides an early treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor by confirming whether or not there is a mutation in the EGFR gene in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor It becomes possible to predict the response, and it is possible to select a treatment method at an earlier stage than the conventional method.
This application is based on US Provisional Patent Application No. 62 / 507,010, the entire contents of which are incorporated herein.
Claims (18)
- 非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異が存在するか否かをEGFR阻害薬投与後に確認する工程を含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測方法。 A method for early prediction of the efficacy of treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor, comprising the step of confirming whether an EGFR gene mutation is present in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after the administration of the EGFR inhibitor .
- EGFR阻害薬投与前の非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含む、請求項１に記載の早期予測方法。 The early prediction method according to claim 1, wherein DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient before administration of an EGFR inhibitor contains a mutation of the EGFR gene.
- EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の早期予測方法。 The method for early prediction according to claim 1 or 2, wherein the mutation of the EGFR gene includes at least one of c.2573T> G of the EGFR gene or 19th exon deletion of the EGFR gene.
- 確認する工程が、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅することを含む、請求項３に記載の早期予測方法。 The step of confirming comprises amplifying a DNA fragment containing c.2573T> G of the EGFR gene using a primer set consisting of the primer represented by SEQ ID NO: 1 and the primer represented by SEQ ID NO: 2. 3. The early prediction method according to 3.
- 確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を配列番号８で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、請求項４に記載の早期予測方法。 The early prediction method according to claim 4, wherein the step of confirming further comprises detecting a DNA fragment containing the amplified EGFR gene c.2573T> G with the labeled probe represented by SEQ ID NO: 8.
- 確認する工程が、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットを用いてEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅することを含む、請求項３～５のいずれか1項に記載の早期予測方法。 The step of confirming comprises amplifying a DNA fragment from which the 19th exon of the EGFR gene is deleted using a primer set comprising the primer represented by SEQ ID NO: 3 and the primer represented by SEQ ID NO: 4. The early prediction method according to any one of 3 to 5.
- 確認する工程が、増幅されたEGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を配列番号１０で表される標識されたプローブで検出することをさらに含む、請求項６に記載の早期予測方法。 The early prediction method according to claim 6, wherein the step of confirming further comprises detecting a DNA fragment from which the 19th exon of the amplified EGFR gene is deleted with a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10.
- 確認する工程が、EGFR阻害薬投与後2週間以降に行われる、請求項１～７のいずれか1項に記載の早期予測方法。 The early prediction method according to any one of claims 1 to 7, wherein the step of confirming is performed after 2 weeks after administration of the EGFR inhibitor.
- EGFR阻害薬投与後に非小細胞肺がん患者の血液試料由来のDNAにおいてEGFR遺伝子の変異の存在が確認されない場合、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性があると判定する工程をさらに含む、請求項１～９のいずれか1項に記載の早期予測方法。 When the presence of a mutation in the EGFR gene is not confirmed in DNA derived from a blood sample of a non-small cell lung cancer patient after administration of the EGFR inhibitor, the method further comprises determining that the treatment of non-small cell lung cancer with an EGFR inhibitor is successful. The early prediction method according to any one of claims 1 to 9.
- EGFR阻害薬がアファチニブである、請求項１～９のいずれか1項に記載の早期予測方法。 The early prediction method according to any one of claims 1 to 9, wherein the EGFR inhibitor is afatinib.
- EGFR遺伝子の変異を含むDNA断片を増幅するプライマーセットを含む、EGFR阻害薬による非小細胞肺がんの治療奏功性の早期予測用キット。 A kit for early prediction of successful treatment of non-small cell lung cancer with EGFR inhibitors, including a primer set that amplifies a DNA fragment containing a mutation in the EGFR gene.
- EGFR阻害薬投与前の血液試料由来のDNAがEGFR遺伝子の変異を含んでいる非小細胞肺がん患者のための、請求項１１に記載の早期予測用キット。 The kit for early prediction according to claim 11, for a non-small cell lung cancer patient in which DNA derived from a blood sample before administration of an EGFR inhibitor contains a mutation of the EGFR gene.
- EGFR遺伝子の変異がEGFR遺伝子のc.2573T＞GまたはEGFR遺伝子の１９番目エキソンの欠失の少なくとも１つである、請求項１１または１２に記載の早期予測用キット。 The kit for early prediction according to claim 11 or 12, wherein the mutation of the EGFR gene is at least one of c.2573T> G of the EGFR gene or 19th exon deletion of the EGFR gene.
- EGFR遺伝子のc.2573T＞Gを含むDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号１で表されるプライマーおよび配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーセットである、請求項１３に記載の早期予測用キット。 The primer set which amplifies a DNA fragment containing c.2573T> G of EGFR gene is a primer set consisting of the primer represented by SEQ ID NO: 1 and the primer represented by SEQ ID NO: 2, Prediction kit.
- 配列番号８で表される標識されたプローブをさらに含む、請求項１４に記載の早期予測用キット。 The kit for early prediction according to claim 14, further comprising a labeled probe represented by SEQ ID NO: 8.
- EGFR遺伝子の１９番目エキソンが欠失したDNA断片を増幅するプライマーセットが、配列番号３で表されるプライマーおよび配列番号４で表されるプライマーからなるプライマーセットである、請求項１３～１５のいずれか1項に記載の早期予測用キット。 The primer set for amplifying a DNA fragment from which the 19th exon of the EGFR gene is deleted is a primer set consisting of the primer represented by SEQ ID NO: 3 and the primer represented by SEQ ID NO: 4. An early prediction kit according to claim 1.
- 配列番号１０で表される標識されたプローブをさらに含む、請求項１６に記載の早期予測用キット。 The kit for early prediction according to claim 16, further comprising a labeled probe represented by SEQ ID NO: 10.
- EGFR阻害薬がアファチニブである、請求項１１～１７のいずれか1項に記載の早期予測用キット。 The kit for early prediction according to any one of claims 11 to 17, wherein the EGFR inhibitor is afatinib.
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|---|---|---|---|
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