WO2017191093A1 - Procede d'enrobage de microorganismes, poudre desdits microorganismes enrobes et composition pharmaceutique, nutraceutique, cosmetique, alimentaire ou sanitaire la comprenant - Google Patents

Procede d'enrobage de microorganismes, poudre desdits microorganismes enrobes et composition pharmaceutique, nutraceutique, cosmetique, alimentaire ou sanitaire la comprenant Download PDF

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WO2017191093A1
WO2017191093A1 PCT/EP2017/060341 EP2017060341W WO2017191093A1 WO 2017191093 A1 WO2017191093 A1 WO 2017191093A1 EP 2017060341 W EP2017060341 W EP 2017060341W WO 2017191093 A1 WO2017191093 A1 WO 2017191093A1
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microorganisms
powder
encapsulated
bacillus
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PCT/EP2017/060341
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Shannon TIMMERMANS
Fabienne FONTEYN
Philippe Thonart
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Lacto Research Sprl
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    • A61K2035/115—Probiotics

Definitions

  • the present invention relates to a method of coating or encapsulation of cellular microorganisms, in particular bacteria and fungi including yeasts, the powder of said coated or encapsulated microorganisms, and a pharmaceutical, nutraceutical, cosmetic composition , food or sanitary comprising said coated microorganism powder and the applications of these compositions.
  • probiotics can be defined in several ways, depending on the understanding of the mechanisms of action of their effects on human health, it is generally accepted that These are living microorganisms, bacteria or yeasts used as living microbial food supplements that confer a specified and demonstrated beneficial effect on the health of the host that ingests them, for example by improving its intestinal microbial balance. Due to their beneficial effects on health, probiotic microorganisms were used in the field of pharmaceutical, cosmetic, nutraceutical and food processing, in particular for the preparation of so-called functional foods, that is to say having a beneficial effect on health or having prophylactic or therapeutic properties against certain disorders or certain diseases, affecting animals or humans.
  • This definition also encompasses the nutraceutical composition or dietary supplement intended for the animal or the human, said composition or said supplement being capable of generating a maintenance of the health of the animal or of the human, without having to prove the therapeutic virtues. of the active product administered to the animal or the human.
  • Coating or micro-encapsulation of probiotic microorganisms is a physico-chemical or mechanical process for trapping a substance in a polymeric material to produce microcapsules, microspheres or microbeads, with a diameter ranging from about 1 ym at around 1000 ym, which can free their content at controlled rates under the influence of specific conditions.
  • the encapsulation of probiotics is mainly used to protect the cells against an unfavorable environment, rather than for a controlled release.
  • Atomization is a well known drying process characterized by high production speeds and relatively low operational costs.
  • the probiotics subjected to atomization are heat sensitive and drying results in cell death due to dehydration and thermal inactivation of enzymes.
  • Lyophilization is traditionally used to dry and store fermentation initiation cultures of a food preparation process and probiotics.
  • Freeze-drying makes it possible to obtain a thorough dehydration of the microorganisms compatible with very long periods of storage of the products in the form of powder.
  • This method implements changes in product temperature quite aggressive for micro ⁇ organisms, because it requires freezing, which is not without consequences for the cells. In some cases, it causes cellular alterations (by peroxidation of fatty acids, but also genetic by a modification of proteins.
  • the level of cell viability after lyophilization varies according to many factors, including the strain of the microorganism and the effectiveness of the protective agent used during lyophilization (Morgan et al., 2006).
  • the powders obtained are however poorly resistant to air, moisture and / or temperature. They hardly retain a stable cell concentration during storage. In addition, when microorganisms such as lactic acid bacteria pass through the stomach after ingestion, a majority of cells are killed by gastric juice before reaching the intestine.
  • the conventional method of coating microorganisms, in particular lactic acid bacteria usually comprises the step of introducing a specific coating on the dried cells or on the concentrated culture of cells as shown in FIG.
  • Microorganisms in particular lactic acid bacteria are grown in an aerobic or anaerobic bioreactor using a fermentation medium containing assimilable sources of amino acids, peptides, sugars, vitamins and minerals. These nutrients contained in the medium are only used for the proliferation of cells.
  • Concentrated cultures are obtained by means of separation by centrifugation or ultrafiltration, whose purpose is only the separation and concentration of the cells contained in the culture medium.
  • a coating composition may be applied to the dry culture of microorganisms, in particular lactic bacteria thus obtained, followed by drying, most often by lyophilization.
  • the culture of micro ⁇ organisms in particular lactic acid bacteria concentrated and formulated, can be introduced into an aqueous solution of the coating composition, followed by drying, usually by freeze-drying.
  • This coating may be microspherical type, and applied to microorganisms, particularly lactic acid bacteria by an injection nozzle in a microencapsulation process.
  • the encapsulation process be carried out under relatively mild conditions to ensure high viability of the encapsulated cells.
  • the encapsulation of probiotic microorganisms in gel particles can be classified into 2 groups, depending on the process used to form the microcapsules: extrusion and emulsion techniques.
  • Extrusion is a physical technique that uses hydro-colloids as encapsulating materials.
  • the polymer solution is first mixed with the microbial cells. This mixture is then extruded through a high pressure nozzle in the form of droplets into a solution containing a solidifying agent.
  • Gelling occurs by contact of the polymeric source with the solidifying agent, by cooling or a combination of both.
  • the factors that influence the size of the microcapsules produced are: the diameter of the dispersion nozzle,
  • the main advantages of the extrusion method are the simplicity of its operation, at lower cost, and the operating conditions ensuring high cell viability.
  • the major disadvantage of this technique is that it is difficult to industrialize and automate due to microsphere formation.
  • an emulsion is a chemical technique for encapsulating probiotic cells, which also uses hydro-colloids as encapsulating materials.
  • This technique involves the dispersion of a "cell-polymer" suspension (discontinuous phase) in an oily / organic phase (continuous phase). The mixture is then homogenized to form a water-in-oil emulsion using a surfactant and stirring. The gelation of the dispersed phase is initiated by cooling or by the addition of a solidifying agent to the emulsion. Microcapsules produced are then collected by filtration or centrifugation.
  • This technique has the advantage of being easy to industrialize and gives a high survival rate of microorganisms.
  • the major disadvantage of this technique is that the microcapsules produced have a wide range of size and shape.
  • Spray drying is commonly used for the microencapsulation of probiotic microorganisms. It involves atomizing a solution containing the microbial cells and the polymer matrix into the hot drying air, followed by rapid evaporation of the water.
  • microencapsulated product is then separated, in the form of a dry powder, from the transport air in a cyclone.
  • Different spray drying parameters such as product feed rate, airflow, product temperature, inlet air temperature, and outlet air temperature need to be optimized to produce well-formed microcapsules.
  • This technique has the advantage of having high production speeds, but also disadvantages such as the costs of industrial installation and operation.
  • the main disadvantage is the use of high temperatures and osmotic stress due to dehydration which results in relatively high losses of viability and activity immediately after spraying, particularly the inactivation of essential enzymes which maintain the cell equilibrium. .
  • the probiotic cells During a spray coating, that is to say in the fluidized bed technique, the probiotic cells must be in solid form, but not necessarily completely dried. They are then suspended in the air and a coating material liquid is applied by spraying on the probiotic cells.
  • the main advantage of this technique is that it easily allows the addition of an additional layer of specific molecules for release into the intestine, for example.
  • a problem in the approach to the coating of probiotic cells is that these technologies stabilize the bacteria most often in liquid form. To improve storage, it is convenient to convert these microspheres to dry powder using techniques such as atomization, lyophilization or fluidized bed. Nevertheless, it is also known that lyophilization induces a significant mortality of bacterial cells because of the loss of membrane integrity and the denaturation of macromolecules. The components of the medium in which the bacteria are dried may have a greater effect on the stability of the probiotic cells than the microencapsulation itself.
  • microcapsules composed of a polymer material
  • the multiplication of probiotic microorganisms inside microcapsules composed of a polymer material is already known in the art. Indeed, it has been shown that the production of high populations of probiotic cells is possible inside alginate microcapsules.
  • probiotic microorganisms show a loss of cell viability at during the steps of the microencapsulation process itself and during their drying.
  • Champagne et al. (2000 & 2007) describe a production of probiotic microorganisms within a microsphere composed of a polymeric material, in particular alginate microcapsules.
  • this document neither describes nor suggests treating these microcapsules of alginate obtained by an additional drying step, in particular by freeze-drying.
  • WO2015 / 000972 discloses an improved method of lyophilization of encapsulated cells comprising successive steps of short incubations insufficient to ensure cell multiplication in a medium comprising protective molecules, followed by a step of drying these encapsulated and treated cells.
  • the present invention aims to provide a new process for coating or encapsulation of microorganisms, in particular probiotic microorganisms selected from the group consisting of bacteria, such as lactic acid bacteria and bifidobacteria, and as fungi, especially yeasts, and which does not have the disadvantages of the state of the art.
  • probiotic microorganisms selected from the group consisting of bacteria, such as lactic acid bacteria and bifidobacteria, and as fungi, especially yeasts, and which does not have the disadvantages of the state of the art.
  • a particular object of the invention is to obtain an industrializable process which generates powders of these microorganisms, in particular probiotics coated or encapsulated with low cell mortality.
  • a final object of the invention is to obtain such lyophilized microorganism powders which comprise a high concentration of living microorganisms coated or encapsulated capable of having a probiotic or non-probiotic efficacy in pharmaceutical, cosmetic, agri-food type compositions.
  • Nutraceutical or sanitary especially in sanitary compositions used in the purification of pipes or septic tanks, but also to obtain powders preferably having solid particle sizes consisting of these microcapsules are the most uniform possible; said powders being able to be stored, handled and stored for prolonged periods.
  • the present invention relates to a method of coating or encapsulation of microorganisms, preferably probiotic microorganisms, said process comprising the following steps, preferably consecutive: optionally a first step of cultivation and multiplication of said microorganisms, optionally followed a step of collecting said microorganisms,
  • a second step of culture and multiplication of the encapsulated microorganisms is carried out for a suitable duration to reach a maximum of encapsulated cells, preferably a duration of between about 2 hours and about 7 days, more particularly greater than 4 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours or 48 hours, preferably between about 6 hours and about 4 days or between about 12 hours and about 48 hours, or after an addition or "fed-batch" procedure of a second adequate nutrient solution or after replacement of the first nutrient solution by a second adequate nutrient solution and wherein said first and said second adequate nutrient solution are different or the same.
  • the total replacement of the first nutrient solution with a second nutrient solution is unexpectedly particularly effective to increase again the growth of encapsulated cells and further increase their concentration and retention within the polymeric capsules, probably following the elimination of the components or contaminants possibly present in the culture medium of said cells, possibly synthesized by said cells, and limiting growth and laminar conservation to generate a microcapsule powder essentially of substantially spherical shape, said nozzle vibrating having a vibration frequency between about 1 Hz and about 20,000 Hz and an amplitude greater than about 0.5 ⁇ m.
  • two liquids are extruded in laminar flow with one or more systems with several, preferably two nozzles, preferably vibrating, comprising at least one inner nozzle and one nozzle exterior.
  • the microorganisms are chosen from probiotic bacteria and fungi, in particular yeasts.
  • the probiotic bacteria are chosen from the group consisting of lactic acid bacteria or bifidobacteria, more particularly the lactic acid bacteria are chosen from the group consisting of Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, in particular Lactobacillus casei subsp. Casei or Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, in particular Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • Streptococcus thermophilus or their mixture.
  • the bifidobacteria are chosen from the group consisting of by Bifidobacterium adolescent, Bifidobacterium animalis including Bifidobacterium animalis subsp. animalis and Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Short Bifidobacterium, Bifidobacterium infantis, Bifidibacterium lactis,
  • the microorganisms may also be selected from the group consisting of Micrococcus varians, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus natto, Bacillus clausii, Bacillus cereus var.
  • toyoi Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli nissle strain, Paenibacillus alvei, Propionibacterium freudenreichii Escherichia coli nissle strain, Propionibacterium freudenreichii and yeasts, preferably Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Yarrowia lipolytica, Brettanomyces bruxellensis, Debaryomyces hansenii, Candida albicans and Kluyveromyces marxianus.
  • the polymeric material coating the microorganism (s) in polymer microcapsules is constituted by one or more hydro-colloid (s) chosen (s) from the group consisting by alginate, agar, carrageenans, preferably ⁇ -carrageenan, starch, chitosan, alginate, pectin, pullulan, gelatin, gums, in particular gellan gum or gum xanthan, cellulose acetate phthalate, milk proteins, in particular casein or a mixture thereof, as described by Burgain et al. (2011) as well as by Rathore & al.
  • hydro-colloid chosen (s) from the group consisting by alginate, agar, carrageenans, preferably ⁇ -carrageenan, starch, chitosan, alginate, pectin, pullulan, gelatin, gums, in particular gellan gum or gum xanthan, cellulose acetate phthalate, milk proteins, in particular casein or a mixture thereof, as
  • the preferred polymeric material is alginate, which does not need to be combined with another so-called "enteric” material to obtain resistance to the passage of the composition of the invention in the stomach and to the action of bile fluid, but a specific release of probiotic cells embedded in the intestine.
  • the polymer material can be combined with one or more materials, called “enteric” or be present in an “enteric” vehicle, that is to say a product offering micro capsules and thus coated cells resistance against the medium present in the stomach, duodenum and small intestine of a mammal, in particular the stomach, duodenum or small intestine of a man ; this product may take the form of a capsule or a tablet of ethylcellulose, hydroxypropylcellulose, caroxymethylcellulose or Eudragit ®.
  • the nutritive source optionally present in the form of a nutrient solution, encapsulated microorganisms essentially comprises amino acids, saccharides, vegetable oils, minerals, in particular a halogenated salt of an alkali or alkaline earth metal or a zinc salt, such as zinc acetate, zinc chloride or zinc lactate, antioxidants, acids, such as ascorbic acid or citric acid and possibly vitamins.
  • this nutritive source is present in an amount of between about 0.1% and about 10% by weight, more particularly between about 1% and about 5% by weight relative to the total weight of the dried powder equal to 100%.
  • the microorganism is either Lactobacillus rhamnosus and comprises a concentration of Lactobacillus rhamnosus greater than 1.5 x 10 11 (cfu / g), preferably greater than 2 x 10 11 (cfu / g) or the microorganism is selected from the group consisting of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus and Lactobacillus bulgaricus and comprises a concentration of microorganisms per capsule greater than 1 x 10 9 (cfu / g), preferably between 1 x 9 (cfu / g) and 2 x 10 11 (cfu / g).
  • Another aspect of the invention relates to either a pharmaceutical composition comprising a suitable pharmaceutical diluent or carrier, or a food composition comprising a diluent or a suitable food vehicle or a nutraceutical composition comprising a diluent or a suitable vehicle and the powder of the invention.
  • a final aspect of the invention relates to a sanitary composition, in particular for the purification of waste present in pipes or septic tanks and comprising the powder of the invention.
  • FIG. 1 represents the steps of a method of the state of the art for a coating or encapsulation of lactic acid bacteria.
  • FIG. 2 represents the main steps of the process for obtaining a freeze-dried powder of lactic acid bacteria coated or encapsulated according to the present invention.
  • FIG. 3 represents the evolution of the cell concentration of the strain (L. casei) in the alginate beads when fresh medium (called “fed-batch") in the form of a nutrient solution is added or when the medium is completely renewed by replacing the nutrient solution after overnight cultivation (approximately 18 hours) and a second time after 24 hours of culture.
  • FIG. 4 represents the effect of the renewal of the medium during the 42-hour culture of the strain (L. casei) on the cell concentration of the freeze-dried powder relative to the concentration of the powder obtained after lyophilization of the microcapsules used. in culture one night (about 18 hours).
  • Microcapsules are understood to mean microspheres or microbeads having substantially spherical structures and having a diameter of between about 1 and about 1000 microns, preferably between about 5 microns and about 800 microns, more particularly between about 10 microns. and about 500 microns, and consisting of a polymeric material capable of coating or encapsulating cells of one or more microorganisms, as well as other elements as a nutrient source for said cells.
  • a polymeric material capable of coating or encapsulating cells of one or more microorganisms, as well as other elements as a nutrient source for said cells.
  • the present invention relates to a method of coating or encapsulation, in particular microencapsulation of a microorganism, that is to say a cell living organism chosen from the group consisting of bacteria, in particular lactic acid bacteria or bifidobacteria and fungi, preferably an encapsulated probiotic microorganism comprising, as represented in FIG. 2, the following, preferably successive, steps:
  • a first culture 1 optionally a first culture 1, multiplication or prior propagation of said cellular microorganisms, preferably probiotics, in particular microorganisms, in particular lactic acid bacteria or yeasts, on a suitable microorganism growth medium, in particular an aqueous solution preferably comprising as nutrients, at least amino acids, saccharides, minerals and possibly vitamins;
  • probiotics in particular microorganisms, in particular lactic acid bacteria or yeasts
  • a suitable microorganism growth medium in particular an aqueous solution preferably comprising as nutrients, at least amino acids, saccharides, minerals and possibly vitamins
  • formulation step 2 optionally a multiplied microorganism collection step called formulation step 2 of said microorganisms to put them in conditions suitable for the subsequent coating step;
  • a coating or an encapsulation in particular a microencapsulation of said microorganisms or cells, preferably probiotics, multiplied in polymeric microcapsules;
  • a second culture 4 multiplication or propagation of said microorganisms in an adequate nutrient solution, preferably an aqueous solution comprising as nutrients at least saccharides, amino acids, minerals, and possibly vitamins and, during a phase of cell growth in (within) said polymeric microcapsules, in order to increase the concentration, preferably by a factor of 2, 4, 6, 10, 100 or 1000 or more of said microorganisms, probiotics, within the polymeric microcapsules, for a suitable duration for this culture, multiplication or propagation, preferably for a duration of more than 2 hours, preferably a duration of more than 4 hours or 6 hours, more than 12 hours, or even more than 24 hours or 48 hours, in particular for a period of between about 2 hours and about 7 days, preferably between about 6 hours and about 4 days, more particularly between about 12 hours and about 48 hours. ;
  • drying 6 preferably by lyophilization of the preferably probiotic microorganisms, encapsulated to form a powder of encapsulated probiotic microorganisms preferably.
  • the culture medium of the encapsulated microorganisms is a nutritive and preferably aqueous solution known for the growth of microorganisms, in particular bacteria and fungi, including yeasts, and preferably comprises amino acids. or source peptides of amino acids, saccharides, that is to say monosaccharides, such as glucose or polysaccharides, minerals in particular in the form of salts of halides and alkali or alkaline earth metals, optionally vitamins preferably having antioxidant activities and optionally acids, such as ascorbic acid or citric acid.
  • the nutrient solution comprises the following elements: casein peptone, yeast extract, meat extract, polyoxyethylene sorbitan monooleate (polysorbate 80 or tween 80®), glucose, minerals (preferably selected from the group consisting of potassium, sodium, ammonium, magnesium and manganese and possibly zinc, copper, iron, zinc, Boron, cobalt, sulphates, in particular calcium sulphate and / or magnesium sulphate, diammonium phosphate, phosphoric acid, optionally meat peptone, tryptone, glucose or other saccharides and vitamins.
  • the main material (a hydro ⁇ colloid) is selected from the group consisting of alginate, agar, carrageenans, preferably ⁇ -carrageenan, starch, chitosan, alginate pectin, pullulan, gelatin, gums, in particular gellan gum or xanthan gum, cellulose acetate phthalate, gelatin, milk proteins, in particular casein or a mixture of them, such as as described by Burgain & al. (2011) as well as by Rathore & al.
  • the polymeric capsules consist of a material selected from the group consisting of alginate or a mixture of alginate and maltodextrins.
  • microcapsules are almost exclusively produced using water-soluble polymers which provide a high degree of permeability to low molecular weight nutrients and metabolites, as well as optimal conditions necessary for the proper functioning of the cells, preferably probiotics, encapsulated.
  • the materials of the capsules, microspheres or beads are also selected to ensure enteric release of microorganisms, i.e., in the intestine of the mammal, including the man to whom they are administered.
  • the micro ⁇ organisms preferably probiotics, in particular lactic acid bacteria are multiplied a first time in a bioreactor under aerobic conditions or under anaerobic conditions using a fermentation medium containing adequate nutrients, in particular one or more assimilable source (s) of amino acids, peptides, saccharides, vitamins and minerals.
  • probiotics in particular lactic acid bacteria
  • a fermentation medium containing adequate nutrients, in particular one or more assimilable source (s) of amino acids, peptides, saccharides, vitamins and minerals.
  • This multiplied probiotic microorganism culture is then introduced into a coating composition, without prior concentration; the culture of microorganisms, in particular probiotics, being preferably mixed with a solution of between about 1% and about 10% sterile sodium alginate, preferably about 5 ⁇ 6 sterile sodium alginate.
  • Said mixture is added dropwise by extrusion into a sterile solution containing between about 3% and about 1% CaCl 2 , preferably about 2% Cacl 2 and between about 0.1% and about 5% glycerol, preferably about 1% glycerol, at room temperature while stirring continuously and these microcapsules obtained are then cured in this solution for a period of time. between about 30 minutes and about 2 hours, preferably for about 1 hour.
  • the cell viability of the coated probiotic cell powder thus obtained is surprisingly superior to that of a coated probiotic cell powder obtained from microcapsules containing a concentrated culture of these probiotic microorganisms.
  • the microorganisms are gram-positive bacteria, in particular species of lactic acid bacteria mainly used as probiotics and treated by the steps of the process of the invention are chosen from the group consisting of Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, in particular Lactobacillus casei subsp.
  • Casei or Lactobacillus casei Shirota Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, in particular Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis or Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • Lactobacillus farciminis Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus j ohnsonii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius, Lactococcus lactis, Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici , Pediococcus pentosaceus, Pediococcus halophilus, Streptococcus thermophilus, other bacteria described by Anal & Singh, 2007 or their mixtures.
  • Lactic acid bacteria which are among the most important probiotic microorganisms generally associated with the gastrointestinal tract, have numerous beneficial effects on the human intestinal flora, including for immune stimulation, for the reduction. cholesterol levels, inhibition of growth of pathogens, maintenance of a healthy gut microflora, cancer prevention, improvement of lactose utilization, prevention of diarrheal diseases or constipation, calcium absorption, vitamin synthesis and protein predigestion.
  • gram-positive, rod-shaped, non-sporulating, catalase-negative bacteria which are generally anaerobic but aerotolerant, are acid-tolerant and can be fermentative; lactic acid is the main end product of the fermentation of sugars.
  • bifidobacteria also treated by the process steps of the invention, preferably selected from the group consisting of Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, including Bifidobacterium animalis subsp. animalis and Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Short Bifidobacterium, Bifidobacterium infantis,
  • Bifidibacterium lactis Bididobacterium longum and Bifidobacterium pseudolongum.
  • the bifidobacteria are also Gram-positive and are rod-shaped, but ensure their anaerobic growth. These bacteria can grow at a pH in the 4.5-8.5 range. Bifidobacteria ferment carbohydrates, producing mainly acetic acid and lactic acid in a molar ratio of 3: 2 (v / v), but not carbon dioxide, butyric acid or acid propionic acid.
  • bacteria In addition to lactic acid bacteria, other bacteria such as Micrococcus varians, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus natto, Bacillus clausii, Bacillus cereus var.
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii, Yarrowia lipolytica, Brettanomyces bruxellensis, Debaryomyces hansenii, Candida albicans and Kluyveromyces marxianus.
  • the invention also relates to the pharmaceutical composition, preferably enteric that is to say, releasing microorganisms in the intestine of the mammal to which it is administered, nutraceutical, food or sanitary optionally comprising a diluent such as a suitable pharmaceutical, cosmetic and / or food solvent or vehicle as well as the powder of microorganisms, preferably probiotic, encapsulated and dried of the invention, as well as the applications, in particular therapeutic (including for the maintenance or restoration of health of a mammalian animal, including humans, but also for the treatment or prevention of inflammatory infectious diseases, such as gastro ⁇ enteritis, particularly newborn, or Crohn's disease) and cosmetics such compositions.
  • the present invention relates to the application of the composition sanitary device of the invention for the purification of pipes or septic tanks.
  • the food, nutraceutical or pharmaceutical compositions of the invention are preferably enteric compositions present in the form of a hard capsule or soft capsule, tablets, sachets or appropriate formulations containing materials such as starch or cellulose easily administered per os.
  • EXAMPLE 1 Preparation of Alginate Microcapsules with Cream of Lactobacillus (Lb.) Rhamnosus, Lactobacillus Acidophilus, Lactobacillus Helveticus or Lactobacillus Bulgaricus
  • Microcapsules of Lb. rhamnosus, Lb. acidophillus, Lb. helveticus or Lb. bugaricus in a matrix made of alginate were prepared according to the following protocol: 250 g or 50 g of a sterile solution of alginate at 5% by weight were added to equivalent amounts of 250 g of Lb cream. rhamnosus (7 x 10 9 cfu), at 50 g of Lb.
  • helveticus (8.73 x 109 cfu), 250 g of Lb. acidophilus (1.14 x 10 9 cfu), or 50 g of Lb. bulgaricus (8.03 x 10 8 cfu).
  • a drip casting with a drop rupture apparatus in a laminar flow regime was carried out to produce microcapsules by solidification in a solution composed of CaCl 2 at 2% by weight and glycerol at 1% by weight. with stirring. The separation of the microcapsules was then carried out using a sterile sieve.
  • microcapsules thus produced were cultured in a bioreactor in order to increase the Lb cell concentration.
  • a dry, fluid powder of microcapsules was obtained.
  • rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. helveticus or Lb. bulgaricus was performed in order to have a concentration in the microcapsules equivalent to the Lb concentration.
  • rhamnosus Lb. acidophilus, Lb. helveticus or Lb. bulgaricus obtained after the cell growth phase in the microcapsules.
  • the viable bacteria contents in the microcapsules were analyzed before and after the growth phase in the microcapsules, as well as after freeze-drying. These were compared with the levels of viable bacteria obtained in more concentrated microcapsules before and after lyophilization (control). Similar unexpected results have been obtained with other microorganisms strains of lactic acid bacteria, bifidobacteria or yeasts. Therefore, these different types of microorganisms can find at these higher and more viable concentrations advantageous applications in food, nutraceutical, cosmetic or pharmacy as well as in the sanitary field, in particular for the treatment of waste in pipelines and septic tanks.
  • Example 2 Culture of lactic acid bacteria in alginate microcapsules with fed-batch or medium renewal.
  • a "fed-batch” is a renewal of the culture of strains encapsulated or embedded in the microcapsules by fresh concentrated medium added after 18 hours and after 24 hours of culture and in both cases, the control is constituted by a conventional culture of bacteria coated or encapsulated in microcapsules.
  • Table 1 shows the effect of an extension of the culture time by addition of fresh medium or renewal of the culture medium on the cell concentration of a strain (L. casei) encapsulated or coated inside of microcapsules of alginate.
  • the renewal of the culture medium makes it possible to obtain a microcapsule powder comprising the stump coated or encapsulated lyophilized with a higher cell concentration (+ 42%). Similar results were obtained with the tested and claimed strains encapsulated or embedded in the microcapsules of alginate or other polymeric material of the invention.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d'enrobage de microorganismes, de préférence de microorganismes probiotiques et à une poudre desdits microorganismes enrobés obtenue par ce procédé, ainsi qu'aux compositions comprenant cette poudre.

Description

Procédé d' enrobage de microorganismes , poudre desdits microorganismes enrobés et composition pharmaceutique, nutraceutique, cosmétique, alimentaire ou sanitaire la comprenant
Domaine de l' invention
[0001] La présente invention concerne un procédé d'enrobage ou d' encapsulation de microorganismes cellulaires, en particulier de bactéries et de champignons y compris de levures, la poudre desdits microorganismes enrobés ou encapsulés, ainsi qu'une composition pharmaceutique, nutraceutique, cosmétique, alimentaire ou sanitaire comprenant ladite poudre de microorganismes enrobés et les applications de ces compositions.
Arrière-plan technologique à la base de l'invention [0002] Même si les probiotiques peuvent être définis de plusieurs façons, en fonction de la compréhension des mécanismes d'action de leurs effets sur la santé humaine, il est généralement admis qu'il s'agit de micro-organismes vivants, bactéries ou levures utilisés comme compléments alimentaires microbiens vivants qui confèrent un effet bénéfique spécifié et démontré pour la santé de l'hôte qui les ingère, par exemple en améliorant son équilibre microbien intestinal. En raison de leurs effets bénéfiques sur la santé, les microorganismes probiotiques ont été utilisés dans le domaine pharmaceutique, cosmétique, nutraceutique et dans la transformation des aliments, en particulier pour la préparation d'aliments dits fonctionnels, c'est-à-dire ayant un effet bénéfique sur la santé ou ayant des vertus prophylactiques ou thérapeutiques contre certains désordres ou certaines maladies, affectant les animaux ou l'humain. Cette définition englobe aussi la composition nutraceutique ou complément alimentaire destiné à l'animal ou l'humain, ladite composition ou ledit complément étant aptes à générer un maintien de la santé de l'animal ou de l'humain, sans devoir prouver les vertus thérapeutiques bénéfiques du produit actif administré à l'animal ou l'humain.
[0003] A titre indicatif, la norme que tout produit, vendu avec des allégations santé provenant de l'ajout de probiotiques doit contenir au moins 106 - 107 bactéries probiotiques viables par gramme (FAO/OMS, 2001).
[0004] Cependant, le nombre de bactéries probiotiques viables capables de fournir un effet bénéfique ciblé est souvent trop faible.
[0005] Différentes approches ont été utilisées pour améliorer la viabilité des probiotiques, y compris la sélection de souches résistantes à l'acidité et aux sels biliaires, l'adaptation au stress, l'utilisation de récipients imperméables à l'oxygène, une fermentation en continu-discontinu, l'incorporation d' oligo-éléments tels que les peptides et les acides aminés et la micro- encapsulation .
[0006] L'enrobage ou la micro-encapsulation des microorganismes probiotiques est un processus physico- chimique ou mécanique permettant de piéger une substance dans un matériau polymérique afin de produire des microcapsules, microsphères ou microbilles, d'un diamètre allant d'environ 1 ym à environ 1000 ym, qui peuvent libérer leur contenu à des taux contrôlés sous 1 ' influence de conditions spécifiques.
[0007] L ' encapsulation des probiotiques est principalement utilisée pour protéger les cellules contre un environnement défavorable, plutôt que pour une libération contrôlée .
[0008] L' atomisation est un procédé de séchage bien connu caractérisé par des vitesses de production élevées et des coûts opérationnels relativement faibles. Cependant, les probiotiques soumis à une atomisation sont sensibles à la chaleur et un séchage entraîne une mort cellulaire à cause de la déshydratation et de 1 ' inactivation thermique d' enzymes .
[0009] La lyophilisation est utilisée traditionnellement pour sécher et conserver les cultures d'initiation de la fermentation d'un procédé de préparation d'aliment et les probiotiques.
[0010] Il est connu un procédé d'obtention de bactéries lactiques, sous forme de poudre, comprenant les étapes consistant à cultiver les bactéries lactiques, à concentrer la culture et à lyophiliser celle-ci.
[0011] La lyophilisation permet d'obtenir une déshydratation poussée des microorganismes compatible avec des durées très longues de conservation des produits sous forme de poudre.
[0012] Cette méthode met en oeuvre des changements de température du produit assez agressifs pour les micro¬ organismes, car elle nécessite une congélation, ce qui n'est pas sans conséquence pour les cellules. Dans certains cas, elle occasionne des altérations cellulaires (par une peroxydation des acides gras, mais également génétiques par une modification des protéines.
[0013] Le niveau de la viabilité cellulaire après lyophilisation varie en fonction de nombreux facteurs, dont la souche du micro-organisme et l'efficacité de l'agent protecteur utilisé pendant la lyophilisation (Morgan & al., 2006) .
[0014] Les poudres obtenues sont cependant peu résistantes à l'air, à l'humidité et/ou à la température. Elles conservent difficilement une concentration cellulaire stable pendant un stockage. De plus, lorsque les microorganismes comme les bactéries lactiques passent par l'estomac après l'ingestion, une majorité des cellules sont tuées par le suc gastrique avant d'atteindre l'intestin.
[0015] Afin de surmonter ces problèmes, des procédés d'enrobage ou de micro-encapsulation des micro-organismes, en particulier des bactéries lactiques, utilisant des gélatines, des sucres, des gommes, etc. ont été proposés. Le procédé classique d'enrobage des micro-organismes, en particulier des bactéries lactiques, comprend habituellement l'étape consistant à introduire un enrobage spécifique sur les cellules séchées ou sur la culture concentrée de cellules comme indiqué à la Figure 1.
[0016] Les microorganismes, en particulier les bactéries lactiques sont cultivées dans un bioréacteur en aérobie ou anaérobie en utilisant un milieu de fermentation contenant des sources assimilables d'acides aminés, peptides, sucres, vitamines et minéraux. Ces nutriments contenus dans le milieu ne sont utilisés que pour la prolifération des cellules.
[0017] Les cultures concentrées sont obtenues au moyen d'une séparation par une centrifugation ou une ultrafiltration, dont le but est uniquement la séparation et la concentration des cellules contenues dans le milieu de culture .
[0018] Une composition d'enrobage peut être appliquée à la culture sèche de micro-organismes, en particulier des bactéries lactiques ainsi obtenues, suivie d'un séchage, le plus souvent par lyophilisation.
[0019] De façon alternative, la culture de micro¬ organismes, en particulier de bactéries lactiques concentrées et formulées, peut être introduite dans une solution aqueuse de la composition d'enrobage, suivie d'un séchage, le plus souvent par lyophilisation.
[0020] Cet enrobage peut être de type micro- sphérique, et appliqué aux micro-organismes, en particulier aux bactéries lactiques par une buse d'injection dans un procédé de micro-encapsulation.
[0021] Pour la micro-encapsulation de cellules microbiennes, il est essentiel que le procédé d ' encapsulation soit mis en oeuvre dans des conditions relativement douces pour assurer une viabilité élevée des cellules encapsulées.
[0022] Il existe de nombreuses techniques de micro- encapsulation. Cependant, les techniques appliquées aux probiotiques sont généralement limitées à 1 ' encapsulation dans des particules en gel, l'enrobage en lit fluidisé, et le séchage par atomisation.
[0023] Les techniques d ' encapsulation de microorganismes probiotiques dans des particules en gel peuvent être classées en 2 groupes, en fonction du procédé utilisé pour former les microcapsules: les techniques d'extrusion et d'émulsion.
[0024] L'extrusion est une technique physique qui utilise des hydro-colloïdes comme matériaux d ' encapsulation . La solution de polymère est d' abord mélangée avec les cellules microbiennes. Ce mélange est ensuite extrudé, à travers une buse à haute pression, sous forme de gouttelettes dans une solution contenant un agent de solidification.
[0025] La gélification se produit par contact de la source polymérique avec l'agent de solidification, par refroidissement ou par une combinaison des deux. Les facteurs qui influent la taille des microcapsules produites sont : le diamètre de la buse de dispersion,
la viscosité et le débit de la source polymérique, - la distance d'écoulement entre la buse et la solution de solidification,
la concentration et la température de la source polymérique .
[0026] De nouvelles techniques ont été développées pour la formation de gouttelettes et donc des microcapsules par extrusion : (a) la formation de gouttelettes par une force électrostatique, (b) la formation de gouttelettes par le dispositif de jet coupé, (c) la formation de gouttelettes par la fréquence des vibrations, (d) la formation de gouttelettes par co-extrusion (flux coaxial) .
[0027] Les principaux avantages de la méthode d' extrusion sont la simplicité de son fonctionnement, à moindre coût, et les conditions de fonctionnement assurant une viabilité cellulaire élevée. L'inconvénient majeur de cette technique est qu'elle est difficile à industrialiser et à automatiser en raison de la formation des microsphères.
[0028] La réalisation d'une émulsion est une technique chimique permettant d'encapsuler des cellules probiotiques , qui utilise également des hydro-colloïdes comme matériaux d ' encapsulation . Cette technique implique la dispersion d'une suspension « cellule-polymère » (phase discontinue) dans une phase huileuse/organique (phase continue) . Le mélange est ensuite homogénéisé pour former une émulsion eau-dans-huile à l'aide d'un agent tensioactif et d'une agitation. La gélification de la phase dispersée est déclenchée par refroidissement ou par l'addition d'un agent de solidification à 1 'émulsion. Les microcapsules produites sont ensuite recueillies par filtration ou par centrifugation .
[0029] Cette technique présente l'avantage d'être facile à industrialiser et donne un taux de survie élevé des micro-organismes. L'inconvénient majeur de cette technique est que les microcapsules produites présentent un large éventail de taille et de forme.
[0030] Le séchage par atomisation est couramment utilisé pour la micro-encapsulation de microorganismes probiotiques . Il implique 1 ' atomisation d'une solution contenant les cellules microbiennes et la matrice de polymère dans l'air chaud de séchage, suivie d'une évaporation rapide de l'eau.
[0031] Le produit micro-encapsulé est ensuite séparé, sous forme d'une poudre sèche, de l'air de transport dans un cyclone. Différents paramètres de séchage par pulvérisation tels que le taux d'alimentation en produits, le débit d'air, la température du produit, la température d'entrée d'air, et la température de sortie d'air doivent être optimisés afin de produire des microcapsules bien formées.
[0032] Cette technique présente l'avantage d'avoir des vitesses de production élevées, mais aussi des inconvénients comme les coûts de l'installation industrielle et de fonctionnement. L'inconvénient principal est l'utilisation de températures élevées et des stress osmotiques dus à la déshydratation qui entraînent des pertes de viabilité et d'activité relativement élevés immédiatement après pulvérisation, en particulier 1 ' inactivation d'enzymes essentielles qui maintiennent l'équilibre cellulaire.
[0033] Lors d'un enrobage par pulvérisation, c'est à dire dans la technique du lit fluidisé, les cellules probiotiques doivent être sous forme solide, mais pas nécessairement complètement séchées. Elles sont ensuite mises en suspension dans l'air et un matériau d'enrobage liquide est appliqué par pulvérisation sur les cellules probiotiques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet facilement l'ajout d'une couche supplémentaire de molécules spécifiques pour une libération dans l'intestin, par exemple.
[0034] Un problème dans l'approche de l'enrobage des cellules probiotiques est que ces technologies stabilisent les bactéries le plus souvent sous forme liquide. Pour améliorer le stockage, il est pratique de convertir ces microsphères en poudre sèche en utilisant des techniques telles que 1 ' atomisation, la lyophilisation ou le lit fluidisé. Néanmoins, il est également connu que la lyophilisation induit une mortalité significative des cellules bactériennes à cause de la perte d' intégrité membranaire et de la dénaturation des macromolécules. Les composants du milieu dans lequel les bactéries sont séchées peuvent avoir un effet plus important sur la stabilité des cellules probiotiques que la micro-encapsulation elle-même.
[0035] La multiplication des microorganismes probiotiques à l'intérieur de microcapsules composées d'un matériau polymère est déjà connue dans l'art. En effet, il a été démontré que la production de populations élevées de cellules probiotiques était possible à l'intérieur de microcapsules d'alginate.
[0036] Cependant de manière générale, de tels procédés classiques pour l'enrobage des bactéries lactiques qui comprennent les étapes d'introduction de la composition d'enrobage après concentration et éventuellement séchage des cultures, conduisent lors de l'étape de lyophilisation, à des rendements de survie cellulaire qui restent faibles pour de nombreux probiotiques.
[0037] En outre, il est connu que les microorganismes probiotiques montrent une perte de viabilité cellulaire au cours des étapes du procédé de la micro-encapsulation lui- même et lors de leur séchage.
Etat de la technique
[0038] Champagne et al. (2000 & 2007) décrivent une production de microorganismes probiotiques à l'intérieur d'une microsphère composée d'un matériau polymérique, en particulier de microcapsules d'alginate. Cependant ce document ne décrit ni ne suggère de traiter ces microcapsules d'alginate obtenues par une étape supplémentaire de séchage, en particulier par lyophilisation.
[0039] La demande internationale de brevet
WO2015/000972 divulgue une méthode améliorée de lyophilisation de cellules encapsulées comprenant des étapes successives de brèves incubations insuffisantes pour assurer une multiplication cellulaire dans un milieu comprenant des molécules protectrices, suivie d'une étape de séchage de ces cellules encapsulées et traitées.
Buts de l' invention
[0040] La présente invention a pour but de fournir un nouveau procédé d'enrobage ou d' encapsulation de micro- organismes, en particulier des microorganismes probiotiques choisis parmi le groupe constitué par les bactéries, telles que les bactéries lactiques et les bifidobactéries , ainsi que les champignons, en particulier les levures, et qui ne présente pas les inconvénients de l'état de la technique.
[0041] Un but particulier de l'invention est d'obtenir un procédé industrialisable et qui génère des poudres de ces micro-organismes, en particulier des probiotiques enrobés ou encapsulés avec une faible mortalité des cellules. [0042] Un dernier but de l'invention est d'obtenir de telles poudres de microorganismes lyophilisées qui comprennent une concentration élevée en microorganismes vivants enrobés ou encapsulés aptes à présenter une efficacité probiotique ou non probiotique dans des compositions de type pharmaceutiques, cosmétiques, agroalimentaires, nutraceutiques ou sanitaires, en particulier dans des compositions sanitaires utilisables dans l'épuration des canalisations ou des fosses septiques, mais aussi d'obtenir des poudres ayant de préférence des tailles de particules solides constituées de ces microcapsules qui soient les plus uniformes possibles ; les dites poudres étant aptes à être conservées, manipulées et stockées pendant des durées prolongées.
Eléments caractéristiques de l'invention
[0043] La présente invention concerne un procédé d'enrobage ou d' encapsulation de microorganismes de préférence des microorganismes probiotiques, le dit procédé comprenant les étapes, de préférence consécutives suivantes: éventuellement une première étape de culture et de multiplication desdits microorganismes, suivie éventuellement d'une étape de collecte desdits microorganismes,
une étape d'enrobage desdits microorganismes dans des capsules polymériques ,
une étape de culture et de multiplication des dits microorganismes encapsulés dans une première solution nutritive adéquate pendant une durée comprise entre environ 2 heures et environ 7 jours, de préférence pendant une durée supérieure à 24 heures ou 48 heures, une étape de collecte des microorganismes multipliés et encapsulés et
une étape de séchage par lyophilisation des microorganismes multipliés et encapsulés pour former une poudre de microorganismes encapsulés.
[0044] De préférence, dans le procédé de l'invention, on effectue une seconde étape de culture et de multiplication des microorganismes encapsulés pendant une durée adéquate pour atteindre un maximum de cellules encapsulées, de préférence une durée comprise entre environ 2 heures et environ 7 jours, plus particulièrement supérieure à 4 heures, à 6 heures, à 12 heures, à 24 heures ou à 48 heures, de préférence une durée comprise entre environ 6 heures et environ 4 jours ou entre environ 12 heures et environ 48 heures, soit après une adjonction ou procédure « fed-batch » d'une seconde solution nutritive adéquate ou soit après un remplacement de la première solution nutritive par une seconde solution nutritive adéquate et dans lequel ladite première et ladite seconde solution nutritive adéquate sont différentes ou identiques.
[0045] Selon l'invention, le remplacement total de la première solution nutritive par une seconde solution nutritive est de manière inattendue particulièrement efficace pour augmenter à nouveau la croissance des cellules encapsulées et augmenter encore leur concentration et la conservation au sein des capsules polymériques , probablement suite à l'élimination des composants ou contaminants éventuellement présents dans le milieu de culture desdites cellules, éventuellement synthétisés par les dites cellules, et limitant la croissance et la conservation laminaire pour générer une poudre de microcapsules essentiellement de forme essentiellement sphérique, la dite buse vibrante ayant une fréquence de vibration comprise entre environ 1 Hz et environ 20.000 Hz et une amplitude supérieure à environ 0,5 ym.
[0046] Avantageusement, dans le procédé et la poudre de l'invention, deux liquides sont extrudés en écoulement laminaire avec un ou plusieurs systèmes à plusieurs, de préférence à deux buses, de préférence vibrantes, comprenant au moins une buse intérieure et une buse extérieure.
[0047] De préférence, dans le procédé et la poudre de l'invention, les microorganismes, sont choisis parmi les bactéries probiotiques et les champignons, en particulier les levures.
[0048] Avantageusement, les bactéries probiotiques sont choisies parmi le groupe constitué par les bactéries lactiques ou les bifidobactéries , plus particulièrement les bactéries lactiques sont choisies parmi le groupe constitué par Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus amylovorus , lactobacillus alimentarius , Lactobacillus brevis , Lactobacillus casei, en particulier Lactobacillus casei subsp. Casei ou Lactobacillus casei Shirota , Lactobacillus crispatus , Lactobacillus curvatus , Lactobacillus delbrueckii , en particulier Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus , Lactobacillus farciminis , Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri , Lactobacillus helveticus , Lactobacillus j ohnsonii , Lactobacillus lactis, Lactobacillus paracasei , Lactobacillus pentosaceus , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius , Lactococcus lactis, Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici , Pediococcus pentosaceus , Pediococcus halophilus ,
Streptococcus thermophilus ou leur mélange.
[0049] Dans le procédé et la poudre de l'invention, les bifidobactéries sont choisies parmi le groupe constitué par Bifidobacterium adolescentes , Bifidobacterium animalis y compris Bifidobacterium animalis subsp. animalis et Bifidobacterium animalis subsp. lactis , Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brève, Bifidobacterium infantis , Bifidibacterium lactis,
Bididobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum ou leur mélange . Les microorganismes peuvent aussi être choisis parmi le groupe constitué par Micrococcus varians , Staphylococcus carnosus , Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis , Bacillus natto, Bacillus clausii , Bacillus cereus var . toyoi, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis , Escherichia coli souche nissle, Paenibacillus alvei, Propionibacterium freudenreichii Escherichia coli souche nissle, Propionibacterium freudenreichii et les levures, de préférence Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Yarrowia lipolytica , Brettanomyces bruxellensis , Debaryomyces hansenii , Candida albicans et Kluyveromyces marxianus .
[0050] Avantageusement dans le procédé et la poudre de l'invention, le matériau polymérique enrobant le ou les microorganisme ( s ) dans des microcapsules polymériques est constitué par un ou plusieurs hydro-colloïde ( s ) choisi (s) parmi le groupe constitué par l'alginate, l'agar, les carraghénanes , de préférence le κ-carraghénane, l'amidon, le chitosane, l'alginate, la pectine, le pullulane, la gélatine, les gommes, en particulier la gomme gellane ou la gomme xanthane, 1 ' acétophtalate de cellulose, les protéines du lait, en particulier la caséine ou un mélange d'entre eux, tels que décrits par Burgain & al. (2011) ainsi que par Rathore & al. (2013); lesdits matériaux pouvant être combinés à d'autres éléments connus pour améliorer cet enrobage, en particulier des maltodextrines , de la cellulose, de l' hemicellulose, de l' ethylcellulose, de la carboxycellulose et leur mélange. Avantageusement, le matériau polymerique préféré est de l'alginate, qui ne nécésite pas d'être combiné avec un autre matériau dit « entérique » pour obtenir une résistance au passage de la composition de l'invention dans l'estomac et à l'action du liquide biliaire, mais une libération spécifique des cellules probiotiques enrobées dans l'intestin.
[0051] Cependant, dans le procédé et les poudres de l'invention, le matériau polymerique peut être combiné avec un ou plusieurs matériaux, dits « enteriques » ou être présents dans un véhicule dit « entérique », c'est-à-dire un produit offrant aux micro capsules et donc aux cellules enrobées, une résistance contre le milieu présent dans l'estomac, le duodénum et l'intestin grêle d'un mammifère, en particulier l'estomac, le duodénum ou l'intestin grêle d'un homme ; ce produit pouvant prendre la forme d'une capsule ou d'une tablette d' éthylcellulose, d' hydroxypropylcellulose, de caroxymethylcellulose ou d' Eudragit®.
[0052] Dans le procédé et la poudre de l'invention, la source nutritive, présente éventuellement sous forme d'une solution nutritive, des microorganismes encapsulés comprend essentiellement des acides aminés, des saccharides, des huiles végétales, des minéraux, en particulier un sel halogéné d'un métal alcalin ou alcalino-terreux ou un sel de zinc, tel que de l'acétate de zinc, du chlorure de zinc ou du lactate de zinc, des anti-oxydants, des acides, tels que l'acide ascorbique ou l'acide citrique et éventuellement des vitamines. De préférence cette source nutritive est présente en une quantité comprise entre environ 0,1% et environ 10% en poids, plus particulièrement entre environ 1 % et environ 5% en poids par rapport au poids total de la poudre séchée égale à 100%. [0053] De préférence dans le procédé et la poudre de l'invention, le microorganisme est soit Lactobacillus rhamnosus et comprend une concentration en Lactobacillus rhamnosus supérieure à 1,5 x 1011 (cfu/g), de préférence supérieure à 2 x 1011 (cfu/g) ou soit le microorganisme est choisi parmi le groupe constitué par Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus helveticus et Lactobacillus bulgaricus et comprend une concentration en microorganismes par capsule supérieure à lx 109 (cfu/g), de préférence comprise entre 1 x 109 (cfu/g) et 2 x 1011 (cfu/g) .
[0054] Un autre aspect de l'invention concerne soit une composition pharmaceutique comprenant un diluant ou véhicule pharmaceutique adéquat, soit une composition alimentaire comprenant un diluant ou un véhicule alimentaire adéquat ou soit une composition nutraceutique comprenant un diluant ou un véhicule adéquat et la poudre de l'invention.
[0055] Un dernier aspect de l'invention concerne une composition sanitaire, en particulier destinée à l'épuration des déchets présents dans des canalisations ou fosses septiques et comprenant la poudre de l'invention.
[0056] La présente invention sera décrite en détails ci-dessous dans la description d'une forme d'exécution préférée de l'invention, en référence aux figures et à l'exemple présenté à titre d'illustration non limitative de la portée de l'invention.
Brève description des figures
[0057] La figure 1 représente les étapes d'un procédé de l'état de la technique pour un enrobage ou d' encapsulation de bactéries lactiques.
[0058] La figure 2 représente les étapes principales du procédé d'obtention d'une poudre lyophilisée des bactéries lactiques enrobées ou encapsulées selon la présente invention.
[0059] La figure 3 représente l'évolution de la concentration cellulaire de la souche (L. casei) dans les billes d' alginate lorsque du milieu frais (dit « fed- batch ») sous forme d'une solution nutritive est ajouté ou lorsque le milieu est complètement renouvelé par remplacement de la solution nutritive après une culture d'une nuit (environ 18 heures) et une seconde fois après 24 heures de culture.
[0060] La figure 4 représente l'effet du renouvellement du milieu pendant la culture de 42 heures de la souche (L. casei) sur la concentration cellulaire de la poudre lyophilisée par rapport à la concentration de la poudre obtenue après lyophilisation des microcapsules mises en culture une nuit (environ 18 heures) .
Définitions [0061] On entend par microcapsules, des microsphères ou des microbilles ayant des structures essentiellement sphériques et d'un diamètre compris entre environ 1 et environ 1000 ym, de préférence entre environ 5 ym et environ 800 ym, plus particulièrement entre environ 10 ym et environ 500 ym, et constituées d'un matériau polymérique apte à enrober ou encapsuler des cellules d'un ou plusieurs microorganismes, ainsi que d'autres éléments comme une source nutritive pour les dites cellules. Description détaillée de l'invention
[0062] La présente invention concerne un procédé d'enrobage ou d' encapsulation, en particulier de micro- encapsulation d'un microorganisme, c'est-à-dire une cellule vivante choisie parmi le groupe constitué par les bactéries, en particulier les bactéries lactiques ou les bifidobactéries et les champignons, de préférence un microorganisme probiotique encapsulé comprenant, tel que représenté à la figure 2, les étapes, de préférence successives, suivantes:
- éventuellement une première culture 1, multiplication ou propagation préalable desdits microorganismes cellulaires, de préférence probiotiques , en particulier des microorganismes, en particulier des bactéries lactiques ou des levures, sur un milieu de croissance des microorganismes adéquat, en particulier une solution aqueuse comprenant de préférence comme nutriments, au moins des acides aminés, des saccharides, des minéraux et éventuellement des vitamines ;
éventuellement une étape de collecte des microorganismes multipliés dénommée étape de formulation 2 desdits microorganismes pour les mettre en conditions aptes à l'étape ultérieure d'enrobage ;
- un enrobage ou une encapsulation, en particulier une micro-encapsulation 3 desdits microorganismes ou cellules, de préférence probiotiques, multipliés dans des microcapsules polymériques ;
- une seconde culture 4, multiplication ou propagation desdits microorganismes dans une solution nutritive adéquate, de préférence une solution aqueuse comprenant comme nutriments au moins des saccharides, des acides aminés, des minéraux, et éventuellement des vitamines et, pendant une phase de croissance cellulaire dans (à l'intérieur de) lesdites microcapsules polymériques, afin d'augmenter la concentration, de préférence d'un facteur 2, 4, 6, 10, 100 ou 1000 ou plus desdits micro-organismes, de préférence probiotiques , à l'intérieur des microcapsules polymériques , pendant une durée adéquate pour cette culture, multiplication ou propagation, de préférence pendant une durée de plus de 2 heures, de préférence une durée de plus de 4 heures ou 6 heures, de plus de 12 heures, voire de plus de 24 heures ou 48 heures, en particulier pendant une durée comprise entre environ 2 heures et environ 7 jours, de préférence comprise entre environ 6 heures et environ 4 jours, plus particulièrement entre environ 12 heures et environ 48 heures ;
- une récolte 5, de préférence sur un tamis de taille adéquate, desdits micro-organismes de préférence probiotiques, encapsulés et
- un séchage 6, de préférence par lyophilisation des micro-organismes de préférence probiotiques, encapsulés pour former une poudre de micro-organismes de préférence probiotiques encapsulés.
[0063] Selon l'invention, le milieu de culture des microorganismes encapsulés est une solution nutritive et de préférence aqueuse connue pour la croissance des microorganismes, en particulier les bactéries et les champignons, y compris les levures et comporte, de préférence des acides aminés ou des peptides source d'acides aminés, des saccharides, c'est-à-dire des monosaccharides , tels que le glucose ou des polysaccharides , des minéraux en particulier sous forme de sels d' halogénures et de métaux alcalins ou alcalinoterreux, éventuellement des vitamines ayant de préférence des activités anti-oxydantes et éventuellement des acides, tels que l'acide ascorbique ou l'acide citrique.
[0064] De préférence, la solution nutritive comporte les éléments suivants: peptone de caséine, extrait de levure, extrait de viande, du polyoxyethylene sorbitan monooleate (polysorbate 80 ou tween 80 ®) , glucose, des minéraux (de préférence choisis parmi le groupe constitué par du potassium, du sodium, de l'ammonium, du magnésium et du manganèse et éventuellement du Zinc, du Cuivre, du fer, du Bore, du Cobalt, des sulfates, en particulier du sulfate de calcium et/ou du sulfate de magnésium, du phosphate de diammonium, de l'acide phosphorique, éventuellement du peptone de viande, du tryptone, du glucose ou d'autres saccharides et des vitamines.
[0065] Dans les microcapsules le matériau (un hydro¬ colloïde) principal est choisi parmi le groupe constitué par l'alginate, l'agar, les carraghénanes , de préférence le κ- carraghénane, l'amidon, le chitosane, l'alginate, la pectine, le pullulane, la gélatine, les gommes, en particulier la gomme gellane ou la gomme xanthane, 1 ' acétophtalate de cellulose, la gélatine, les protéines du lait, en particulier la caséine ou un mélange d'entre eux, tels que décrits par Burgain & al. (2011) ainsi que par Rathore & al. (2013); lesdits matériaux pouvant être combinés à d'autres éléments connus pour améliorer cet enrobage ou encapsulation, en particulier des maltodextrines , de la cellulose, de l' hemicellulose, de l' ethylcelllulose, de la carboxycellulose et leur mélange. De préférence, les capsules polymériques sont constituées d'un matériau choisi parmi le groupe constitué par l'alginate ou un mélange d' alginate et de maltodextrines.
[0066] Les microcapsules sont presque exclusivement produites en utilisant des polymères solubles dans l'eau et qui fournissent un degré élevé de perméabilité aux nutriments de faible poids moléculaire et aux métabolites, ainsi que des conditions optimales nécessaires au bon fonctionnement des cellules, de préférence probiotiques , encapsulées. En outre, de préférence, les matériaux des capsules, microsphères ou billes sont aussi sélectionnés pour assurer une libération entérique des microorganismes, c'est-à-dire dans l'intestin du mammifère, y compris l'homme à qui elles sont administrées.
[0067] Aussi bien des polymères hydrosolubles naturels que des synthétiques ont été utilisés pour la micro- encapsulation de cellules microbiennes. Bien que les polymères synthétiques offrent une plus grande résistance mécanique et une meilleure stabilité chimique, les polymères naturels sont préférés à leurs homologues synthétiques, car ils sont moins nocifs pour l'intégrité et la viabilité cellulaire des microorganismes encapsulés.
[0068] Avantageusement, selon l'invention, les micro¬ organismes, de préférence probiotiques , en particulier des bactéries lactiques sont multipliées une première fois dans un bioréacteur en condition aérobie ou en condition anaérobie en utilisant un milieu de fermentation contenant des nutriments adéquats, en particulier une ou plusieurs source (s) assimilable ( s ) d'acides aminés, de peptides, de saccharides, de vitamines et de minéraux.
[0069] Cette culture de microorganismes probiotiques multipliés est ensuite introduite dans une composition d'enrobage, sans concentration préalable; la culture de micro-organismes, en particulier probiotiques, étant de préférence mélangée avec une solution comprise entre environ 1% et environ 10% d' alginate de sodium stérile, de préférence a environ 5~6 d'alginate de sodium stérile.
[0070] Ledit mélange est ajouté goutte à goutte par extrusion dans une solution stérile contenant entre environ 3% et environ 1% de CaCl2, de préférence environ 2% Cacl2 et entre environ 0.1 % et environ 5 % de glycérol, de préférence environ 1% de glycérol, à température ambiante tout en agitant continuellement et ces microcapsules obtenues sont ensuite durcies dans cette solution pendant une durée comprise entre environ 30 minutes et environ 2 heures, de préférence pendant environ 1 heure.
[0071] La viabilité cellulaire de la poudre de cellules probiotiques enrobées ainsi obtenue est étonnamment supérieure à celle d'une poudre de cellules probiotiques enrobées obtenue à partir de microcapsules contenant une culture concentrée de ces microorganismes probiotiques.
[0072] De préférence, les microorganismes sont des bactéries gram-positives , en particulier des espèces de bactéries lactiques principalement utilisées comme probiotiques et traitées par les étapes du procédé de l'invention sont choisies parmi le groupe constitué par Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus amylovorus , Lactobacillus alimentarius , Lactobacillus brevis , Lactobacillus casei, en particulier Lactobacillus casei subsp. Casei ou Lactobacillus casei Shirota , Lactobacillus crispatus , Lactobacillus curvatus , Lactobacillus delbrueckii , en particulier Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus , Lactobacillus farciminis , Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri , Lactobacillus helveticus , Lactobacillus j ohnsonii , Lactobacillus lactis, Lactobacillus paracasei , Lactobacillus pentosaceus , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius , Lactococcus lactis, Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici , Pediococcus pentosaceus , Pediococcus halophilus, Streptococcus thermophilus , d'autres bactéries décrites par Anal & Singh, 2007 ou leurs mélanges.
[0073] Les bactéries lactiques, qui sont parmi les microorganismes probiotiques les plus importants généralement associés au tractus gastro-intestinal, ont de nombreux effets bénéfiques sur la flore intestinale humaine, y compris pour la stimulation immunitaire, pour la réduction du taux de cholestérol, l'inhibition de la croissance des pathogènes, le maintien d'une microflore intestinale saine, la prévention du cancer, l'amélioration de l'utilisation du lactose, la prévention des maladies diarrhéiques ou de la constipation, l'absorption du calcium, la synthèse de vitamines et la prédigestion des protéines.
[0074] Ces bactéries Gram-positives , en forme de bâtonnet, non sporulées, catalase-négatives , généralement anaérobies, mais aérotolérantes, sont tolérantes à l'acidité et peuvent être fermentaires ; l'acide lactique est le principal produit final de la fermentation des sucres.
[0075] En outre, d'autres microorganismes communément utilisés comme probiotiques sont les bifidobactéries , également traitées par les étapes du procédé de l'invention, de préférence choisies parmi le groupe constitué par Bifidobacterium adolescentis , Bifidobacterium animalis , y compris Bifidobacterium animalis subsp . animalis et Bifidobacterium animalis subsp . lactis , Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brève, Bifidobacterium infantis ,
Bifidibacterium lactis, Bididobacterium longum et Bifidobacterium pseudolongum.
[0076] Les bifidobactéries sont également Gram- positives et sont en forme de bâtonnet, mais assurent leur croissance en anaérobie. Ces bactéries peuvent se développer à un pH appartenant à la gamme 4.5-8.5. Les bifidobactéries fermentent les hydrates de carbone, produisant principalement de l'acide acétique et de l'acide lactique dans un rapport molaire de 3:2 (v/v) , mais pas de dioxyde de carbone, d'acide butyrique ou d'acide propionique.
[0077] Outre les bactéries lactiques, d'autres bactéries telles que Micrococcus varians , Staphylococcus carnosus , Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis , Bacillus natto, Bacillus clausii , Bacillus cereus var . toyoi, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis , Escherichia coli souche nissle, Paenibacillus alvei, Propionibacterium freudenreichii Escherichia coli souche nissle, Propionibacterium freudenreichii ont également été identifiés comme ayant des effets probiotiques (Anal & Singh, 2007) et sont traités par les étapes de préférence successives du procédé de 1 ' invention .
[0078] Outre des bactéries, d'autres microorganismes tel que des champignons peuvent être aussi enrobés par le procédé de l'invention et présents dans les poudres de l'invention. Parmi les champignons préférées, on peut mentionnes les levures, telles que Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Yarrowia lipolytica , Brettanomyces bruxellensis , Debaryomyces hansenii , Candida albicans et Kluyveromyces marxianus .
[0079] L' invention concerne également la composition pharmaceutique, de préférence entérique c'est-à-dire libérant les microorganismes dans l'intestin du mammifère à qui elle est administrée, nutraceutique, alimentaire ou sanitaire comprenant éventuellement un diluant tel qu'un solvant ou véhicule pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire adéquat ainsi que la poudre de microorganismes, de préférence probiotiques, encapsulés et séchés de l'invention, ainsi que les applications, en particulier thérapeutiques (y compris pour le maintien ou le rétablissement de la santé d'un animal mammifère, y compris l'humain, mais aussi pour le traitement ou la prévention des pathologies infectieuses inflammatoires, comme la gastro¬ entérite, en particulier du nouveau-né, ou la maladie de Crohn) et cosmétiques de ces compositions. En particulier la présente invention concerne l'application de la composition sanitaire de l'invention pour l'épuration de canalisations ou de fosses septiques.
[0080] Les compositions alimentaires, nutraceutiques ou pharmaceutiques de l'invention sont de préférence des compositions entériques présentes sous la forme d'une gélule dure ou gélule souple, de tablettes, de sachets ou de formulations adéquates contenant des matériaux tels que de l'amidon ou de la cellulose facilement administrables per os .
Exemple 1 : Obtention de microcapsules d' alginate avec crème de Lactobacillus (Lb.) rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus ou Lactobacillus bulgaricus . [0081] Des microcapsules de Lb. rhamnosus , Lb . acidophillus , Lb . helveticus ou Lb. bugaricus dans une matrice faite d' alginate ont été préparées selon le protocole suivant : 250 g ou 50 g d'une solution stérile d' alginate à 5% en poids ont été ajoutés à des quantités équivalentes de 250g de crème de Lb. rhamnosus (7 x 109 cfu) , à 50 g de Lb. helveticus (8,73 x 109 cfu), à 250 g de Lb. acidophilus (1,14 x 109 cfu), ou à 50 g de Lb . bulgaricus (8,03 x 108 cfu) .
[0082] Une coulée goutte à goutte avec un appareil de rupture des gouttes en régime d'écoulement laminaire a été réalisée pour produire des microcapsules par solidification dans une solution composée de CaCl2 à 2% en poids et de glycérol à 1% en poids sous agitation. La séparation des microcapsules a ensuite été réalisée à l'aide d'un tamis stérile.
[0083] 250g ou 50g des microcapsules ainsi produites ont été mis en culture dans un bioréacteur afin d'augmenter la concentration cellulaire en Lb. rhamnosus , Lb . acidophilus, Lb . helveticus ou Lb. bulgaricus à l'intérieur des microcapsules avant lyophilisation. Une poudre fluide et sèche de microcapsules a été obtenue.
[0084] Dans les mêmes conditions, un témoin plus concentré en cellules de Lb. rhamnosus, Lb . acidophilus , Lb . helveticus ou Lb. bulgaricus a été réalisé afin d'avoir une concentration dans les microcapsules équivalente à la concentration en Lb. rhamnosus Lb . acidophilus , Lb . helveticus ou Lb . bulgaricus obtenue après la phase de croissance cellulaire dans les microcapsules.
[0085] Les teneurs en bactéries viables dans les microcapsules (cfu) ont été analysées avant et après la phase de croissance dans les microcapsules, ainsi qu'après la lyophilisation. Ces dernières ont été comparées aux teneurs en bactéries viables obtenues dans des microcapsules plus concentrées avant et après lyophilisation (témoin) . Des résultats similaires aussi inattendus ont été obtenus avec d'autres souches de microorganismes de bactéries lactiques, de bifidobactéries ou de levures. Par conséquent, ces différents types de microorganismes peuvent trouver à ces concentrations plus élevées et plus viables des applications avantageuses dans l'alimentation, la nutraceutique, la cosmétique ou la pharmacie ainsi que dans le domaine sanitaire, en particulier pour le traitement des déchets dans les canalisations et les fosses septiques.
[0086] Les résultats pour les 4 souches décrites ci- dessus sont présentés dans le tableau 1 suivant :
Cfu/
Cfu/g dans Cfu/g dans Cfu/g Rendement a
les les dans de dans
Test capsules capsules la lyophilisa la
fraîches fraîches poudre tion crèm
avant après sèche (%) e croissance croissance
cellulaire cellulaire
4,25
Lb. 2, 03 x
X 4,03 x 109 3,44 x 1010 43, 68 rhamnosus - 1011
109
test A -
7,00
Lb. 2, 45 x
X 7,89 x 109 4, 91 x 1010 42,74 rhamnosus - 1011
109
test B -
Lb. 3, 33
3,41 x Non 1,48 x
rhamnosus - X 26, 47
10io applicable 1011
Témoin - 10io
8,73
1,54 x
Lb. X 5,89 x 109 1,39 x 1010 8, 67
10io
helveticus 109
Lb. 1,81
1, 14 x Non 3, 94 x
helveticus X 0,017
10io applicable 107
-Témoin 10io
1, 14
1, 91 x
Lb. X 1,19 x 109 2, 14 x 109 5, 35
109
acidophilus 109
Lb. 2,20
Non 1,19 x
acidophilus X 2,44 x 109 0, 0024 applicable 106
-Témoin 109 8,03
1,33 x
Lb. X 7,26 x 108 5,70 x 109 1,39
109
bulgaricus 108
Lb. 8,58
Non
bulgaricus X 1,53 x 109 < 106 < 0,003 applicable
-Témoin 109
Exemple 2 : Culture de bactéries lactiques dans des microcapsules d' alginate avec fed-batch ou renouvellement de milieu .
[0087] Dans les figures 3 et 4 et les tableaux de l'exemple 2, on entend par :
Le renouvellement du milieu, le fait que dans les cultures de souches encapsulées ou enrobées dans les microcapsules, le milieu nutritionnel a été complètement renouvelé (c'est- à-dire remplacé et non ajouté au milieu présent pouvant comporter des contaminants ou présentant un pH apte (s) à retarder la croissance des souches présentes) après 18 heures et après 24 heures de culture,
Un « fed-batch » est un renouvellement de la culture de souches encapsulées ou enrobées dans les microcapsules par du milieu frais concentré ajouté après 18 heures et après 24 heures de culture et dans les deux cas, le témoin est constitué par une culture classique des bactéries enrobées ou encapsulées dans des microcapsules.
[0088] Le tableau 1 représente l'effet d'une prolongation du temps de culture par addition de milieu frais ou renouvellement du milieu de culture sur la concentration cellulaire d'une souche (L. casei) encapsulée ou enrobée à l'intérieur de microcapsules d' alginate. Tableau 1
Figure imgf000030_0001
[0089] On constate très nettement une augmentation de la concentration cellulaire présente dans les microcapsules d' alginate après le 1er ajout de milieu ou le 1er renouvellement de milieu après 18 heures de culture. Un second ajout ou renouvellement à 24 heures permet encore une amélioration, mais le gain est moins élevé. Le tableau 2 représente l'effet du renouvellement du milieu pendant la culture de 42 heures de la souche (L. casei) encapsulée ou enrobée sur la concentration cellulaire de la poudre lyophilisée par rapport à la concentration de la poudre obtenue après lyophilisation des microcapsules de cette souche et mises en culture une nuit (environ 18 heures) .
Tableau 2
Figure imgf000030_0002
[0090] Le renouvellement du milieu de culture permet d' obtenir une poudre de microcapsules comprenant la souche enrobée ou encapsulé lyophilisées avec une concentration cellulaire plus élevée (+ 42%) . Des résultats similaires ont été obtenus avec les souches testées et revendiquées encapsulées ou enrobées dans les microcapsules d' alginate ou dans un autre matériau polymérique de l'invention.
Bibliographie
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Burgain, J., & al . (2011) . Journal of Food Engineering 104, 467-483.
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Morgan & al. (2006) . Journal of Microbiological Methods
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Sweta Rathore, P. M. et al. (2013) . Journal of Food Engineering, Volume 116, Issue 2, May 2013, Pages 369- 381) .

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'enrobage de microorganismes comprenant les étapes suivantes :
éventuellement une première étape de culture (1) desdits microorganismes suivie éventuellement d'une étape de collecte (2) desdits microorganismes,
une étape d'enrobage (3) desdits microorganismes dans des capsules polymériques ,
une seconde étape de culture et de multiplication (4) desdits microorganismes encapsulés dans une solution nutritive pendant une durée comprise entre 2 heures et 7 jours,
une étape de collecte (5) des microorganismes multipliés et encapsulés et
- une étape de séchage (6) par lyophilisation des microorganismes multipliés et encapsulés pour former une poudre de microorganismes encapsulés.
2. Le procédé selon la revendication 1, dans lequel la seconde étape de culture et de multiplication (4) des microorganismes encapsulés s'effectue pendant une durée supérieure à 24 heures.
3. Le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel on effectue une seconde étape de culture et de multiplication des microorganismes encapsulés pendant une durée comprise entre 2 heures et 7 jour, soit après une adjonction d'une seconde solution nutritive ou soit après un remplacement de la première solution nutritive par une seconde solution nutritive.
4. Le procédé selon l'un quelconque des revendications précédentes 1 à 3, qui comprend une coulée goutte à goutte en écoulement laminaire.
5. Le procédé selon la revendication 4, comprenant une étape d'extrusion à une vitesse d'écoulement d'un liquide d'enrobage comprise entre 0,2 m/s et 5 m/s traversant une buse orientée dans une direction essentiellement axiale ou latérale par rapport à l'écoulement et générant des gouttelettes selon une coulée goutte à goutte en écoulement laminaire pour recueillir une poudre de microcapsules comprenant les microorganismes.
6. Le procédé selon la revendication 5, dans lequel deux liquides d'enrobage sont extrudés en écoulement laminaire avec un système à deux buses et comprenant une buse intérieure et une buse extérieure.
7. Le procédé selon la revendication 5 ou la revendication 6, dans lequel la buse est vibrante avec une fréquence de vibration comprise entre 1 Hz et 20.000Hz et une amplitude supérieure à 5,5 ym.
8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les microorganismes sont des microorganismes probiotiques .
9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les microorganismes sont choisis parmi les bactéries et les champignons, en particulier les levures.
10. Le procédé selon la revendication 9 dans lequel les bactéries sont choisies parmi le groupe constitué par les bactéries lactiques ou les bifidobactéries .
11. Le procédé selon la revendication 10, dans lequel les bactéries lactiques sont choisies parmi le groupe constitué par Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus amylovorus , lactobacillus alimentarius , Lactobacillus brevis , Lactobacillus casei, en particulier Lactobacillus casei subsp. Casei ou Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus crispatus , Lactobacillus curvatus , Lactobacillus delbrueckii , en particulier Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ou Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus , Lactobacillus farciminis , Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri , Lactobacillus helveticus , Lactobacillus j ohnsonii , Lactobacillus lactis ,
Lactobacillus paracasei , Lactobacillus pentosaceus , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri ,
Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus sakei, Lactobacillus salivarius , Lactococcus lactis , Oenococcus oeni, Pediococcus acidilactici , Pediococcus pentosaceus , Pediococcus halophilus , Streptococcus thermophilus ou leur mélange.
12. Le procédé selon la revendication 10 dans lequel les bifidobactéries sont choisies parmi le groupe constitué par Bifidobacterium adolescentes , Bifidobacterium animalis , Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brève,
Bifidobacterium infantis , Bifidibacterium lactis,
Bididobacterium longum, bifidobacterium pseudolongum ou leur mélange.
13. Le procédé selon la revendication 9, dans lequel le microorganisme est choisi parmi le groupe constitué par Micrococcus varians , Staphylococcus carnosus , Staphylococcus xylosus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans , Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis , Bacillus natto, Bacillus clausii , Bacillus cereus var. toyoi, Bacillus pumilus , Bacillus thuringiensis , Escherichia coli souche nissle, Paenibacillus alvei, Propionibacterium freudenreichii Escherichia coli souche nissle, Propionibacterium freudenreichii et les levures , de préférence Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii , Yarrowia lipolytica , Brettanomyces bruxellensis , Debaryomyces hansenii , Candida albicans et Kluyveromyces marxianus ou leur mélange .
14. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le matériau polymérique enrobant des capsules polymériques est un hydro-colloïde .
15. Le procédé selon la revendication 14, dans lequel 1 ' hydro-colloïde est choisi parmi le groupe constitué par l'alginate, l'agar, les carraghénanes , de préférence le κ-carraghénane, l'amidon, le chitosane, l'alginate, la pectine, le pullulane, la gélatine, les gommes, en particulier la gomme gellane ou la gomme xanthane, 1 ' acétophtalate de cellulose, la gélatine, les protéines du lait, en particulier la caséine ou un mélange d'entre eux, de préférence de l'alginate ou un mélange contenant de l'alginate et d'autres éléments connus pour améliorer cet enrobage, en particulier des maltodextrines , de la cellulose, de l' hemicellulose, de l' ethylcelllulose, de la carboxycellulose et leur mélange, de préférence des maltodextrines .
16. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution nutritive des microorganismes encapsulés comprend des acides aminés, des saccharides, des minéraux et éventuellement des acides et/ou des vitamines.
17. Poudre de microorganismes, de préférence probiotiques , incorporées dans des microcapsules polymériques et obtenue de préférence par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
18. La poudre selon la revendication 17, dans laquelle le microorganisme est Lactobacillus rhamonosus et comprenant une concentration en lactobacillus rhamnosus par microcapsule supérieure à 1,5 x 1011(cfu/g), de préférence supérieure à 2 x 1011 (cfu/g) .
19. La poudre selon la revendication 17, dans laquelle le microorganisme est choisi parmi le groupe constitué par Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus et Lactobacillus bulgaricus et comprenant une concentration en microorganismes par microcapsule supérieure à lx 109 (cfu/g), de préférence comprise entre 1 x 109 (cfu/g) et 2 x 1011 (cfu/g) .
20. Composition pharmaceutique comprenant un diluant ou véhicule pharmaceutique adéquat et la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 17 à 19.
21. Composition alimentaire comprenant un diluant ou un véhicule alimentaire adéquat et la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 17 à 19.
22. Composition nutraceutique comprenant un diluant ou un véhicule adéquat et la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 17 à 19.
23. Composition sanitaire, en particulier destinée à l'épuration des déchets présents dans des canalisations ou fosses septiques et comprenant la poudre selon l'une quelconque des revendications précédentes 17 à 19.
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