WO2016148253A1 - ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2016148253A1
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pluripotent stem
cells
naive
inhibitor
stem cell
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PCT/JP2016/058577
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岡野　栄之
誠司 塩澤
文彦 木佐
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小野薬品工業株式会社
学校法人慶應義塾
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing and / or maintaining a na ⁇ ve pluripotent stem cell (hereinafter sometimes abbreviated as the method of the present invention).
  • the present invention also relates to a naive pluripotent stem cell having an excellent differentiation pluripotency produced and / or maintained by the method of the present invention.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • iPS cell is a type of pluripotent stem cell.
  • iPS cells include embryonic stem cells (hereinafter sometimes abbreviated as ES cells), epiblast stem cells (Epiblast Stem cells). Is also included. These pluripotent stem cells have recently been found to have different basic properties depending on the animal species from which they are derived and the types of pluripotent stem cells. Specifically, mouse ES cells and mouse iPS cells are cells that are close to the initial stage of development, are easy to culture and genetically manipulate, have high proliferation ability, and can efficiently induce differentiation. is called.
  • Non-patent Document 3 a method in which two factors Nanog and Klf2 are introduced, and LIF (Leukemia Inhibitory Factor), PD0325901 (MEK inhibitor), CHIR99021 (GSK3 inhibitor), Go6983 (PKC inhibitor) is added to the medium (Non-patent Document 3) Reference) reports that the expression of KLF4 and TFCP2L1, which are known as na ⁇ ve gene markers, is increased, and thus human iPS cells in a state close to na ⁇ ve can be obtained.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • PD0325901 MEK inhibitor
  • CHIR99021 GSK3 inhibitor
  • Go6983 PLC inhibitor
  • An object of the present invention is to produce and / or maintain a pluripotent stem cell capable of highly expressing a gene important for maintaining na ⁇ ve undifferentiated ability.
  • the present inventors introduced six genes (Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog and Klf2) among so-called reprogramming factors.
  • reprogramming factors include LIF, MEK inhibitor, GSK3 inhibitor, cAMP production promoter, TGF- ⁇ inhibitor and PKC inhibitor.
  • the present inventors have found a method for producing pluripotent stem cells capable of maintaining the undifferentiated ability of the present invention and completed the present invention.
  • the present invention provides [1] the following two genes: Nanog and Klf2 to be temporarily expressed in primed pluripotent stem cells, and LIF, MEK inhibitor, GSK3 inhibitor, cAMP production promoter, TGF
  • a method for producing naive pluripotent stem cells comprising culturing in a medium containing a ⁇ inhibitor and a PKC inhibitor, [2] The production method according to the above [1], wherein the prime-type pluripotent stem cells are prime-type induced pluripotent stem cells or prime-type embryonic stem cells, [3] The method for producing a naive human pluripotent stem cell according to [1] or [2] above, wherein the prime type pluripotent stem cell is a prime type human induced pluripotent stem cell or a prime type human embryonic stem cell, [4] The method for producing a naive human induced pluripotent stem cell according to any one of the above [1] to [3], wherein the prime type pluripotent
  • the production method according to [16] The production method according to any one of [13] to [15], wherein the medium is an N2B27 medium, [17] Naive pluripotent stem cells comprising culturing naive pluripotent stem cells in a medium containing LIF, MEK inhibitor, GSK3 inhibitor, cAMP production promoter, TGF- ⁇ inhibitor and PKC inhibitor Stem cell maintenance methods, [18] The maintenance method according to [17] above, wherein the naive pluripotent stem cell is a naive induced pluripotent stem cell or a naive embryonic stem cell, [19] The method for maintaining a naive human pluripotent stem cell according to [17] or [18] above, wherein the naive pluripotent stem cell is a naive human induced pluripotent stem cell or a naive human embryonic stem cell, [20] The method for maintaining a naive human induced pluripotent stem cell according to any one
  • the maintenance method according to any one of the above, [22] The maintenance method according to any of [17] to [21], wherein the medium is an N2B27 medium, [23] A naive pluripotent stem cell produced according to the method of any one of [1] to [16], [24]
  • the present invention relates to a naive pluripotent stem cell and the like maintained according to the method described in any of [17] to [22].
  • pluripotent stem cells cultured under specific conditions of the present invention it is possible to stably produce pluripotent stem cells having naive characteristics and having differentiation pluripotency.
  • FIG. 1 shows a gene expression vector used for gene transfer.
  • FIG. 2A shows a picture of each cell colony.
  • FIG. 2B shows the gene expression level in each cell.
  • DOX indicates doxycycline.
  • P2 represents a page2 cell
  • P3 represents a page3 cell.
  • FIG. 3 shows the expression level of ESRRB gene in 201B7 cells (passage 1) cultured in each medium.
  • KSR 2iLFA and KSR 2iLFA + Go6983 indicate the media indicated in Table 1, and DOX indicates doxycycline.
  • FIG. 4A shows photographs of colonies of 201B7 cells (left: passage2, right: passage3) cultured in each medium.
  • FIG. 4B shows the expression level of the ESRRB gene in 201B7 cells (left: passage2, right: passage3) cultured in each medium.
  • 2iL + Go6983 and 2iLFA + Go6983 indicate the media shown in Table 1, and DOX indicates doxycycline.
  • FIG. 5 shows the expression level of ESRRB gene in each combination of reprogramming factors.
  • FIG. 6A shows the results of cell staining (green: MAP2, blue: nuclear staining with Hoechst) of each iPS cell induced to undergo neuronal differentiation for 10 days by the SDIA method.
  • FIG. 6B shows the proportion of colonies in which MAP2-positive cells on day 10 of differentiation induction exist in each iPS cell.
  • FIG. 7A shows the results of cell staining (green: ⁇ III-Tubulin, red: GFAP) of each iPS cell induced to differentiate into neurons by a method mediated by Neurosphere.
  • FIG. 7B shows the rate of differentiation of each iPS cell into astrocytes and neurons.
  • FIG. 8 shows each stage (P1 to P3) of na ⁇ ve. P1 represents a cell of page1, P2 represents a cell of page2, and P3 represents a cell of page3.
  • FIG. 9 shows the gene expression vector used for gene transfer in Example 5.
  • the method for maintaining a na ⁇ ve pluripotent stem cell is one in which the na ⁇ ve pluripotent stem cell is cultured and subcultured in a naive medium supplemented with various compounds.
  • the somatic cell is not particularly limited, but any somatic cell can be used.
  • tissue stem cells such as (1) sputum neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, dental pulp stem cells, (2) sputum tissue progenitor cells, (3) sputum fibroblasts (skin cells, etc.)
  • Epithelial cells hepatocytes, lymphocytes (T cells, B cells), endothelial cells, muscle cells, hair cells, gastric mucosa cells, intestinal cells, spleen cells (pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lungs
  • differentiated cells such as cells, kidney cells, and skin cells.
  • it is a human-derived somatic cell.
  • the pluripotent stem cell is not particularly limited.
  • an embryonic stem cell ES cell
  • an embryonic stem cell derived from a clone embryo obtained by nuclear transfer (ntES) cell a sperm stem cell (GS cell)
  • Examples include epiblast cells, embryonic germ cells (embryonic germ cells: EG cells), pluripotent germ stem cells (multipotent germline stem cells: mGS cells), and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ES cells, ntES cells, and iPS cells are preferable, ES cells and iPS cells are more preferable, and iPS cells are particularly preferable.
  • the living body from which these somatic cells or pluripotent stem cells are derived is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human animals (for example, monkeys, sheep, cows, horses, dogs, cats, rabbits, rats, Mouse). Preferably, it is a human.
  • the prime-type pluripotent stem cells are not particularly limited, but mean pluripotent stem cells, excluding mouse ES cells and mouse iPS cells recognized as naive types.
  • ES cells and iPS cells derived from humans, monkeys, pigs, sheep, dogs or cows, and epiblast stem cells derived from humans and non-human animal cells.
  • Human ES cells and human iPS cells are preferable, and human iPS cells are particularly preferable.
  • cell lines of human ES cells used as prime-type pluripotent stem cells are not particularly limited.
  • the cell line of human iPS cells used as prime-type pluripotent stem cells is not particularly limited.
  • WD39 derived from fibroblasts
  • aTKA4 derived from T cells
  • WD39 or 201B7 is preferable.
  • the gene to be introduced into somatic cells or prime-type pluripotent stem cells is not particularly limited as long as it is a factor known as a so-called reprogramming factor (reprogramming factor).
  • reprogramming factor for example, Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Klf2, L-Myc, N-Myc, Klf5, Lin28, Tert, Fbx15, Eras, ECAT15-1, ECAT15-2, Tcl1, ⁇ -catenin, ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, Fthl17, Sall4, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, Grb2, Prdm14, Nr5a1, Nr5a2, E-cadherin.
  • two or more genes can be selected from these gene groups and introduced in any combination.
  • combinations of Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, and Klf2 are preferable.
  • the cell into which the gene is introduced is a prime-type pluripotent stem cell, since any of the above reprogramming factors is expressed, reprogramming factors other than those may be introduced.
  • a combination of Nanog and Klf2 is preferable, and a combination of Oct3 / 4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog and Klf2 is also preferable. preferable.
  • the species of the gene to be introduced is preferably the same as the species of the cell to which the gene is introduced.
  • the gene introduced into a human-derived cell is a human gene.
  • a gene introduced into human-derived somatic cells human ES cells, or human iPS cells
  • a combination of human Nanog (NANOG) and human Klf2 (KLF2) is preferable, and human Oct3 / 4 (OCT3 / 4)
  • a combination of human Klf4 (KLF4), human c-Myc (c-MYC), human Sox2 (SOX2), human Nanog (NANOG) and human Klf2 (KLF2) is preferred.
  • the gene expression vector is not particularly limited, and examples thereof include viral vectors, plasmid vectors, artificial chromosome vectors, and transposon vectors.
  • virus vectors include retrovirus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, lentivirus vectors, and adeno-associated virus vectors.
  • somatic cells or primed pluripotent stem cells after gene introduction into somatic cells or primed pluripotent stem cells, they may be cultured with feeder cells.
  • feeder cells A mouse embryonic fibroblast (MEF cell) and a mouse embryonic fibroblast cell line (STO cell) are mentioned.
  • the prime medium is not particularly limited.
  • DMEM Dynamic Eagle medium
  • F12 a mixed medium of DMEM and F12
  • Knockout TM D-MEM Replacement serum (KSR; Knockout TM Serum Replacement (Invitrogen)
  • FBS fetal bovine serum
  • NEAA non-essential amino acids
  • 2-mercaptoethanol antibiotics (eg, streptomycin) , Penicillin, puromycin, mitomycin), bFGF (basic fibroblast growth factor), and other additive components, which are arbitrarily combined and added to any of the basal media.
  • cloning refers to a method of selecting a cell in which expression of the gene has been confirmed from somatic cells or prime-type pluripotent stem cells into which the reprogramming factor has been introduced.
  • a selection method for example, a fluorescent protein gene previously incorporated into a gene expression vector, for example, a green fluorescent protein (GFP) gene, a yellow fluorescent protein (YFP) gene (for example, Venus), a cyan fluorescent protein (A method of confirming fluorescence of a CFP) gene (for example, Cerulean), a red fluorescent protein (RFP) gene (for example, TOMATO) under a fluorescence microscope can be mentioned.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • TOMATO red fluorescent protein
  • various compounds in the step (iii) and the maintenance method include LIF (Leukemia Inhibitory Factor), MEK inhibitor, GSK3 inhibitor, cAMP production promoter, TGF- ⁇ inhibitor, or PKC inhibitor. . It is preferred to add all these compounds to the naive medium.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • MEK inhibitor MEK inhibitor
  • GSK3 inhibitor GSK3 inhibitor
  • cAMP production promoter TGF- ⁇ inhibitor
  • TGF- ⁇ inhibitor TGF- ⁇ inhibitor
  • PKC inhibitor PKC inhibitor
  • the MEK inhibitor is not particularly limited.
  • PD0325901 N-[(2R) -2,3-dihydroxypropoxy] -3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4- Iodophenyl) amino] -benzamide; CAS registry number: 391210-10-9), U0126 (1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis [2-aminophenylthio] butadiene; CAS registry number : 109511-58-2), PD98059 (2- (2-amino-3-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one; CAS Registry Number: 167869-21-8), PD184352 (2- (2 -Chloro-4-iodophenylamino) -N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluorobenzamide; CA Registration number:. 212631-79-3 and the like Among them,
  • the GSK3 inhibitor is not particularly limited.
  • CHIR99021 (6-[[2-[[4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (5-methyl-1H-imidazole-2- Yl) -2-pyrimidinyl] amino] ethyl] amino] -3-pyridinecarbonitrile; CAS Registry Number: 252917-06-9), BIO (6-bromoindirubin-3′-oxime; CAS Registry Number: 667463- 62-9), Kenpaulrone (9-bromo-7,12-dihydroindolo [3,2-d] [1] benzazepine-6 (5H) -one; CAS Registry Number: 142273-20-9), IM- 16 (3- (4-Fluorophenylethylamino) -1-methyl-4- (2-methyl-1H-indol-3-yl) -1H Pyrrole-2,5-dione; CAS Registry Number: 1129669
  • the cAMP production promoter is not particularly limited, and examples thereof include forskolin (CAS registration number: 66428-89-5).
  • the TGF- ⁇ inhibitor is not particularly limited.
  • A83-01 (3- (6-methyl-2-pyridinyl) -N-phenyl-4- (4-quinolinyl) -1H-pyrazole CAS No. 909910-43-6), SB431542 (4- [4- (1,3-benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1H-imidazole) -2-yl] -benzamide; CAS Registry Number: 301836-41-9). Of these, A83-01 is preferable.
  • the PKC inhibitor is not particularly limited.
  • Go6983 (3- [1- [3- (dimethylamino) propyl] -5-methoxy-1H-indol-3-yl] -4- ( 1H-Indol-3-yl) -1H-pyrrole-2,5-dione; CAS Registry Number: 133053-19-7), GF109203X (3- (1- (3-dimethylamino) propyl) -1H-indole- 3-yl) -4- (1H-indol-3-yl) -1H-pyrrole-2,5-dione; CAS Registry Number: 133052-90-1). Of these, Go6983 is preferable.
  • the naive medium is not particularly limited.
  • N2B27 medium N2 medium in which N2 supplement is added to DMEM / F12 medium and B27 medium in which B27 supplement is added to Neurobasal medium is 1 Medium mixed with 1
  • NEAA non-essential amino acids
  • L-glutamine L-glutamine
  • 2-mercaptoethanol 2-mercaptoethanol
  • antibiotics eg streptomycin, penicillin, puromycin, mitomycin
  • BSA bovine serum albumin
  • the concentration of various compounds added to the naive medium in the medium is not particularly limited.
  • LIF is 1 ng / mL to 100 ng / mL
  • MEK inhibitor is 50 nM to 100 ⁇ M
  • GSK3 inhibitor It is preferable to add 50 nM to 100 ⁇ M in the case of cAMP, 50 nM to 100 ⁇ M in the case of cAMP production promoter, 10 nM to 100 ⁇ M in the case of TGF- ⁇ inhibitor, and 50 nM to 100 ⁇ M in the case of PKC inhibitor.
  • the culture conditions using a naive medium are obvious to those skilled in the art, but it is preferable to culture under conditions of low oxygen (oxygen concentration: 5%).
  • “temporary” in the step (iii) is about 5 days or more, or about 10 days or more, preferably about 10 to 20 days, particularly preferably about 10 to 14 days.
  • “expressing the gene introduced in step (i)” in step (iii) is an act of inducing the expression of the transgene, for example, by adding doxycycline.
  • the expression level of the naive marker of the cell is determined by quantitative PCR.
  • the method of confirming is mentioned.
  • examples of the naive marker include DPPA3, ESRRB, TFCP2L1, KLF4, KLF5, and TBX3.
  • prime-type pluripotent stem cells mainly form monolayer flat colonies, whereas naive-type pluripotent stem cells mainly form stratified (dome-shaped) colonies, It can also be confirmed by its form.
  • the pluripotency marker of the cell is obtained by quantitative PCR.
  • examples of the pluripotency marker include OCT3 / 4, Nanog, Sox2, and SSEA4.
  • an embryoid body (EB) method and a teratoma (teratoma) formation method can be mentioned.
  • the expression of the transgene is not induced and cultured in a naive medium supplemented with various compounds.
  • the produced naive pluripotent stem cells maintain an undifferentiated state, that is, highly express ESRRB, which is one of naive markers, and have very high differentiation pluripotency. Therefore, (1) differentiation induction into various desired cells, (2) screening of drug candidate compounds using differentiation-induced cells, (3) preparation of tissue for regenerative medicine from differentiation-induced cells, (4) preparation It can be used for transplantation of the obtained tissue to a patient, and (5) organ regeneration by naive iPS cell transplantation to a blastocyst.
  • the cells capable of inducing differentiation of naive pluripotent stem cells are not particularly limited.
  • the method for inducing differentiation of naive pluripotent stem cells is not particularly limited.
  • the SDIA (Stromal cell-Derived Inducing Activity) method (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.99, No.3, 1580-1585, 2002).
  • cells induced to differentiate using naive pluripotent stem cells can be used for screening drug candidate compounds for treatment of various diseases. For example, by adding a drug candidate compound alone or in combination with other drugs to the differentiated cell, changes in the morphology or function of the cell, increase / decrease in various factors, gene expression profiling, etc. are detected. Therefore, evaluation can be performed.
  • the cell is preferably a cell having a phenotype similar to the disease to be treated, and more preferably induced to differentiate from a naive pluripotent stem cell produced from a somatic cell derived from a patient suffering from the disease. It is a cell.
  • a tissue can be prepared from cells induced to differentiate using naive pluripotent stem cells and used in the field of regenerative medicine.
  • damaged nerve tissue can be normalized by replacing the damaged nerve tissue with normal tissue derived from the present invention. Thereby, the disease derived from the damage of a nerve cell can be treated.
  • Such diseases include, for example, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, retinitis pigmentosa, amyotrophic lateral sclerosis, optic neuritis, optic neuritis, acute disseminated (disseminated) encephalomyelitis, allergic cerebrospinal cord Inflammation, spinal cord injury, transverse myelitis, spinocerebellar degeneration, chronic inflammatory demyelinating polyneuritis (CIDP), Guillain-Barre syndrome, multiple sclerosis, epilepsy, Parkinsonism, Down syndrome, Examples include schizophrenia, autonomic dysfunction, Huntington's disease, age-related macular degeneration, and inner ear hearing loss.
  • Parkinson's disease Alzheimer's disease, retinitis pigmentosa, amyotrophic lateral sclerosis, optic neuritis, optic neuritis, acute disseminated (disseminated) encephalomyelitis, allergic cerebrospinal cord Inflammation, spinal cord injury, transverse myelitis, spino
  • a method for transplanting the prepared tissue into a patient is obvious to those skilled in the art.
  • a method for transplanting nerve cells Nature Neuroscience, Vol. 2, No. 12, pp. 1137-1140, 1999.
  • Example 1 Naiveization of iPS cells 1.1 Culture of prime-type human iPS cells WD39 cells (Imaizumi et al. Molecular Brain 2012, 5:35) as human iPS cells and 201B7 cells widely used as control lines (RIKEN) BioResource Center) was used.
  • Human iPS cells were cultured using feeder medium with mitomycin C or radiation-treated mouse embryonic fibroblast cell line (STO cell) or mouse embryonic fibroblast (MEF cell) using the prime-type condition medium shown in Table 1. . The passage was performed once every 5-7 days. At the time of subculture, the colonies were peeled off using a dissociation solution (0.25% Trypsin, 1 mg / ml Collagenase IV, 20% KSR, 1 mM CaCl 2 / PBS), and seeded after finely breaking the colonies by pipetting. IPS cells seeded in 10 cm dishes were used for gene transfer tests.
  • STO cell radiation-treated mouse embryonic fibroblast cell line
  • MEF cell mouse embryonic fibroblast
  • the iPS cells were centrifuged at 200 g for 5 minutes to remove the supernatant, and 1 mL of TrypLE TM Select (Life Technologies) was added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. After adding 2 mL of Trypsin Inhibitor (Life Technologies), it was dissociated into single cells by pipetting 10-20 times with a P1000 pipetman. The volume was increased by adding 7 mL of medium and passed through a 70 ⁇ m cell strainer. IPS cells that became single cells were used for gene transfer.
  • Gene Juice registered trademark
  • Transfection Reagent Novagen
  • rtTA reverse tetracycline-regulated transactivator
  • rtTA RiggyBac Transposasetl expression vector
  • KLF2 and NANOG doxycycline dependent Yamanaka 4 factors
  • a vector that expresses fluorescent protein TOMATO OKSM, KLF2, NANOG and TOMATO
  • Doxycycline was added 5 to 10 days after gene introduction, and observed with a fluorescence microscope 8 to 12 hours later. A colony in which fluorescence of TOMATO was observed was judged to be a cell line in which the doxycycline-dependent expression induction system was functioning, and was cloned by colony pickup. Thereafter, doxycycline was not added, and the cells were cultured in the same manner as in “1.1 Culture of prime type human iPS cells”.
  • iPS cell naiveization Dissociate the iPS cells transfected and cloned in "1.2 Gene-transfected cell line" into single cells using dissociation solution and TrypLE TM Select, and feed MEF cells to the feeder.
  • the medium is a 2iLFA + Go6983 medium shown in Table 1 (hereinafter sometimes abbreviated as the medium of the present invention), and doxycycline (1 ⁇ g / mL) is added to induce the expression of the transgene.
  • the cells were cultured with oxygen (Passage 1; P1).
  • the cell death was suppressed by adding Y27632 (ROCK inhibitor) so that it might become 10 micromoles on the first day of the start of na ⁇ ve. Passaging was performed 5 to 7 days after the start of naiveization. After removing the medium, 350 ⁇ L of 0.25% Trypsin-EDTA was added to each well and allowed to react at 37 ° C. for 1 minute. The reaction was stopped with Trypsin Inhibitor and 5 mL of medium was added. By pipetting several times with a pipette aid, colonies of iPS cells were peeled from the feeder cell sheet, and the colonies were collected in a 15 mL tube.
  • Y27632 ROCK inhibitor
  • 201B7 cells were used as iPS cells.
  • the cells used for the analysis were 201B7 cells cultured in a medium under prime-type conditions (see “1.1 Cultivation of Prime-type Human iPS Cells”), Passage2 prepared in “1.3 Naiveization of iPS Cells” and It is 201B7 cell of Passage3.
  • RNA was collected from each cell using RNeasy mini kit (QIAGEN), reverse transcribed using RiverTra Ace (registered trademark), and then qPCR was performed using SYBR (registered trademark) Premix Ex TaqII (clontech). The primer set is shown in Table 2.
  • NANOG and OCT3 / 4 which are pluripotency markers, was also maintained by nailing.
  • genes such as KLF4, DPPA3, ESRRB, TFCP2L1, KLF5, and TBX3, which are highly expressed in mouse ES cells that are naive pluripotent stem cells have increased expression due to naiveization, and after the addition of doxycycline is stopped.
  • Passage3 also maintained high expression compared to the prime type.
  • the expression of Lefty which is a prime-type gene marker, was reduced by na ⁇ ve formation. From the above results, it became clear that iPS cells migrate to a naive type at least after passage 2 by using the method of the present invention. In addition, it was found that inducing the expression of the transgene is not necessary for the maintenance after the transition to the naive type, and only the medium of the present invention is sufficient.
  • Example 3 Effect on Na ⁇ ve by Go 6983 Addition Timing In this experiment, the effect on na ⁇ ve by Go 6983 addition timing was examined.
  • the passage 1 201B7 cell culture medium (2iLFA + Go6983 medium in Table 1) By changing the passage 1 201B7 cell culture medium (2iLFA + Go6983 medium in Table 1) to the KSR 2iLFA medium in Table 1 or the KSR 2iLFA + Go6983 medium in Table 1 in “1.3 Nabling of iPS cells” and adding doxycycline. After induction of transgene expression, the cells were cultured in hypoxia. Passage 1 cultured under each condition was collected 5 to 7 days after passage and subjected to analysis by qPCR. The result is shown in FIG. As is clear from FIG.
  • Example 4 Effect of forskolin and A83-01 addition on navalization
  • the ESRRB gene is an important gene that controls self-renewal in mouse ES cells (see Cell Stem Cell, 11,491-504 (2012)).
  • the expression of ESRRB is maintained in a high state regardless of the presence or absence of transgene expression induction.
  • the reset cells described in Non-Patent Document 3 the expression of ESRRB is hardly recognized (see Non-Patent Document 3).
  • One of the differences between the present invention and the conditions described in Non-Patent Document 3 is that forskolin and A83-01 are added to the medium conditions described in Non-Patent Document 3 in the present invention. Therefore, the effect of this difference on na ⁇ ve formation (ESRRB expression and colony morphology) was examined.
  • the medium of the present invention (the medium of 2iLFA + Go6983 in Table 1) and the medium of 2iL + Go6983 described in Table 1 were used as the medium for studying the naiveization. This was performed in the same manner as in “Naiveization of iPS cells”. Na ⁇ ve formation was evaluated using ESRRB gene expression and colony morphology in 201B7 cells of Passage 2 and Passage 3 cultured in each medium.
  • Non-Patent Document 3 Go6983 is added at the timing of removing doxycycline. However, in this test, since the focus is on the effect of forskolin and A83-01, Go6983 is added at the time of doxycycline addition. From. As is clear from Example 2, the expression of ESRRB is higher when Go6983 is added from the time of doxycycline addition. Therefore, the expression of ESRRB in reset cells in Non-Patent Document 3 is even lower than the results of this experiment, and its expression is hardly observed as described in Non-Patent Document 3, and the transcription factor network in reset cells is weak. (See Non-Patent Document 3).
  • naive iPS cells produced and maintained by the method of the present invention showed the same transcription factor expression as naive mouse ES cells, and formed the same transcription factor network as naive mouse ES cells. It is thought that. Therefore, it can be seen that the na ⁇ ve iPS cells produced and maintained by the method of the present invention are more na ⁇ ve than the reset cells described in Non-Patent Document 3.
  • Example 5 Comparison of Reprogramming Efficiency by Combination of Reprogramming Factors
  • the reprogramming factors (KLF2 and NANOG) described in Non-Patent Document 3 are used. It is the point which added 4 factors in Yamanaka. Therefore, the effect of this difference on na ⁇ ve (expression of ESRRB) was examined.
  • the WD39 cells cultured under the above-mentioned conditions “1.1 Cultivation of prime-type human iPS cells” were transfected using the same procedure as “1.2 Preparation of transgenic cell line”.
  • rtTA reverse tetracycline-regulated transactivator
  • rtTA reverse tetracycline-regulated transactivator
  • rtTA-Advanced sequence a reverse tetracycline-regulated transactivator (rtTA: using clontech's rtTA-Advanced sequence)
  • PiggyBac Transposon expression vector Proc Natl Acad Sci US A. 2011 Jan 25; 108 (4): 1531 -6
  • three types of vectors expressing a reprogramming factor and a fluorescent protein in a doxycycline-dependent manner were introduced (FIG. 9), and cultured in the same manner as in “1.1 Culture of prime type human iPS cells” above. .
  • KLF2, NANOG and Venus, (2) Yamanaka 4 factor and Cerulean, and (3) Yamanaka 4 factor, KLF2, NANOG and TOMATO were used as combinations of reprogramming factors and fluorescent proteins.
  • Doxycycline was added 4 days after the gene transfer, and drug selection was performed from the day after the doxycycline addition.
  • neomycin 100 ⁇ g / mL
  • puromycin 1 ⁇ g / mL
  • the naive pluripotent stem cells produced and maintained by the method of the present invention are in a state in which naiveization has progressed to several stages more than the reset cells described in Non-Patent Document 3, It functions well as a naive pluripotent stem cell.
  • Example 6 Induction of neural differentiation from na ⁇ ve iPS cells
  • the SDIA method is a method for inducing differentiation into nerves by culturing iPS / ES cells using mouse stromal cell lines (PA6 cells, RIKEN BioResource Center) as feeder cells (Kawasaki et al. Neuron. 2000 Oct; 28 ( 1): See 31-40).
  • PA6 cells mouse stromal cell lines
  • RIKEN BioResource Center mouse stromal cell lines
  • FBS 10% FBS
  • Y27632 a ROCK inhibitor, was added so that the concentration became 10 ⁇ M from 1 hour before the start of the experiment.
  • Y27632 was not added after seeding the cells on PA6 cells. The number of cells was seeded on a 12-well plate at 2 ⁇ 10 3 to 2 ⁇ 10 4 / well.
  • MAP2 antibody M4403, sigma. Each colony was observed with a fluorescence microscope to determine whether MAP2-positive nerves were induced. The result is shown in FIG.
  • Na ⁇ ve iPS cells had a significantly higher proportion of colonies with MAP2-positive cells than prime-type iPS cells. This result was observed in both 201B7 cells and WD39 cells used. From this result, it was found that iPS cells na ⁇ ve by the method of the present invention have excellent differentiation ability.
  • Example 7 Induction of astrocyte differentiation from na ⁇ ve iPS cells Prime differentiation and naive iPS cells were induced to undergo neuronal differentiation by a method mediated by Neurosphere (see Stem Cells. 2008 Dec; 26 (12): 3086-98).
  • a colony is peeled off in a lump state using a dissociation solution, and an embryoid body is formed by suspension culture in a medium of the prime type condition shown in Table 1 except for bFGF. I let you.
  • the colony was peeled off in a lump by repeating pipetting strongly, and an embryoid body was formed by culturing in N2B27 medium (basic medium of naive medium). Except for the method of peeling the colony during embryoid body formation and the culture medium, the same operation was performed for all primed and na ⁇ ve iPS cells.
  • LDN193189 was added to 100 nM in order to promote differentiation into the nervous system during embryoid body formation. Seven days after the formation of the embryoid body, the embryoid body was recovered, 1 mL of TrypLE TM Select was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the dissociated cells were adjusted to 2 ⁇ 10 5 cells / ml, and secondary Neurospheres were formed by suspension culture in MHM medium supplemented with 2% B27 and 20 ng / ml bFGF. Seven days after the formation of secondary Neurosphere, secondary Neurosphere was seeded on a cover glass coated with poly-L-ornithine and fibroctin to promote differentiation.
  • MHM medium supplemented with 2% B27, 2% FBS and 20 ng / ml hLIF was used.
  • ⁇ III-tubulin which is a neuronal marker
  • GFAP which is an astrocyte marker (antibody T8660, sigma and antibody 2. 2B10, Thermo Fisher Scientific).
  • the result is shown in FIG.
  • the proportion of cells that differentiate into astrocytes was significantly higher in naive iPS cells than in prime-type iPS cells. This result was observed in both 201B7 cells (B7 in the figure) and WD39 cells (WD in the figure) used. From this result, it was found that iPS cells na ⁇ ve by the method of the present invention have excellent differentiation ability.
  • pluripotent stem cells having naive characteristics and maintaining pluripotency can be stably produced, so that practical applications such as clinical use and drug evaluation are possible.
  • Sequence number 1 Primer sequence number 2: Primer sequence number 3: Primer sequence number 4: Primer sequence number 5: Primer sequence number 6: Primer sequence number 7: Primer sequence number 8: Primer

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Abstract

　公知の多能性幹細胞の製造方法では達成できなかった、未分化能維持に重要な遺伝子を高発現できるナイーブ型の多能性幹細胞を製造および／または維持することにある。　本発明によれば、いわゆる初期化因子のうち、６種の遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２）を導入して、一時的に発現させることを特徴とし、さらにＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することにより、未分化能を維持できるナイーブ型の多能性幹細胞を製造することができるため、本発明の課題を解決することができる。

Description

ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法
　本発明は、ナイーブ化された多能性幹細胞の製造および/または維持方法（以下、本発明の方法と略記することがある）に関する。また、本発明の方法によって製造および/または維持された優れた分化多能化能を有するナイーブ型多能性幹細胞に関する。
　近年、再生医療の分野では、誘導多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cells；以下、ｉＰＳ細胞と略記することがある）技術の出現により、ｉＰＳ細胞の実用化に向けた臨床研究が急速に進みつつある。例えば、ヒトｉＰＳ細胞から誘導された網膜色素上皮細胞を用いて、加齢黄斑変性患者を対象とした臨床試験は既に実施されていることに加え、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経細胞、軟骨細胞等を用いた臨床試験が計画されている（非特許文献１参照）。
　ｉＰＳ細胞とは、多能性幹細胞の一種であり、多能性幹細胞には、ｉＰＳ細胞の他に胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記することがある）、エピブラスト幹細胞（Epiblast Stem cells）も含まれる。これら多能性幹細胞は、最近ではその由来する動物種の違いや多能性幹細胞の種類によって、基本性質が異なることが分かってきている。具体的には、マウスＥＳ細胞およびマウスｉＰＳ細胞は、発生初期の状態に近く、培養や遺伝子操作が容易で、増殖能が高く、分化誘導を効率良く行うことが可能な細胞であり、ナイーブ型と呼ばれている。一方、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等は、より発生の段階が進んでいるエピブラストの性質を反映しているため、遺伝子操作が困難であり、３胚葉の内いずれか特定の胚葉への分化に偏った状態であり、プライム型と呼ばれている（非特許文献２参照）。したがって、再生医療等において、多能性幹細胞を実用化するためには、プライム型よりもナイーブ型の性質を有する多能性幹細胞を確実に取得できる製造方法が望まれていた。
　ヒトｉＰＳ細胞の製造方法としては、いわゆる山中４因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子）を体細胞に導入する方法（特許文献１参照）が知られていたが、プライム型のヒトｉＰＳ細胞しか取得できないという課題があった。そこで、これまでに、ナイーブ型のヒトｉＰＳ細胞を製造するために、様々な動物種由来のｉＰＳ細胞をナイーブ型に誘導する手法が開発されてきた。上記山中４因子にさらに他の遺伝子を導入する試みや、種々の化合物を加える培地条件の検討が行われている。例えば、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２の２因子を導入し、培地にＬＩＦ（Leukemia inhibitory factor）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、Ｇｏ６９８３（ＰＫＣ阻害剤）を添加する方法（非特許文献３参照）では、ナイーブ型の遺伝子マーカーとして知られているＫＬＦ４、ＴＦＣＰ２Ｌ１の発現が上昇していることから、ナイーブ型に近い状態のヒトｉＰＳ細胞が取得できたことが報告されている。
　しかしながら、上記の技術では、ナイーブ型の未分化能維持に重要な遺伝子と考えられているＥＳＲＲＢ（Estrogen-related receptor beta）（非特許文献３および４参照）の発現がほとんど認められない等の問題点があった。
特許第４１８３７４２号公報
バイオサイエンス・トレンズ（BioScience Trends）、第７巻、第３号、１５７－１５８ページ、２０１３年 セル・ステム・セル（Cell Stem Cell）、第４巻、４８７－４９２ページ、２００９年 セル（Cell）、第１５８巻、１２５４－１２６９ページ、２０１４年 ネイチャー・セル・バイオロジー（Nature Cell Biology）、第１１巻、第２号、１９７－２０３ページ、２００９年
　本発明の課題は、ナイーブ型の未分化能維持に重要な遺伝子を高発現できる多能性幹細胞を製造および／または維持することにある。
　本発明者らは、前記課題を解決するために、鋭意検討した結果、いわゆる初期化因子のうち、６種の遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２）を導入して、一時的に発現させることに加え、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することにより、驚くべきことにナイーブ型の未分化能を維持できる多能性幹細胞を製造する方法を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、［１］　下記の２種の遺伝子：ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２をプライム型多能性幹細胞に一時的に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、
［２］　プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、前記［１］に記載の製造方法、
［３］　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、前記［１］または前記［２］記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法、
［４］　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、前記［１］～［３］のいずれかに記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法、
［５］　さらに下記の４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に発現させる工程を含む、前記［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法、
［６］　ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、前記［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法、
［７］　培地がＮ２Ｂ２７培地である、前記［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法、
［８］　下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的にプライム型多能性幹細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、
［９］　プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、前記［８］に記載の製造方法、
［１０］　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、前記［８］または前記［９］記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法、
［１１］　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、前記［８］～［１０］のいずれかに記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法、
［１２］　下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に体細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型誘導多能性幹細胞の製造方法、
［１３］　下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２を一時的に体細胞に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、前記［１２］記載の製造方法、
［１４］　体細胞がヒト由来の体細胞である、前記［１２］または前記［１３］に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法、
［１５］　ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、前記［１３］または前記［１４］に記載の製造方法、
［１６］　培地がＮ２Ｂ２７培地である、前記［１３］～［１５］のいずれかに記載の製造方法、
［１７］　ナイーブ型多能性幹細胞を、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の維持方法、
［１８］　ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型誘導多能性幹細胞またはナイーブ型胚性幹細胞である、前記［１７］記載の維持方法、
［１９］　ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞またはナイーブ型ヒト胚性幹細胞である、前記［１７］または前記［１８］記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の維持方法、
［２０］　ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞である、前記［１７］～［１９］のいずれかに記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の維持方法、
［２１］　ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、前記［１７］～［２０］のいずれかに記載の維持方法、
［２２］　培地がＮ２Ｂ２７培地である、前記［１７］～［２１］のいずれかに記載の維持方法、
［２３］　前記［１］～［１６］のいずれかに記載の方法にしたがって製造された、ナイーブ型多能性幹細胞、
［２４］　前記［１７］～［２２］のいずれかに記載の方法にしたがって維持された、ナイーブ型多能性幹細胞等に関する。
　本発明の特定の条件下で培養した多能性幹細胞の製造方法によれば、ナイーブ型の特徴を維持し、かつ分化多能性を有する多能性幹細胞を安定的に製造できる。
図１は遺伝子導入に使用した遺伝子発現ベクターを表す。 図２Ａは、各細胞のコロニーの写真を示す。図２Ｂは、各細胞における遺伝子の発現量を示す。図中、ＤＯＸはドキシサイクリンを示す。Ｐ２はｐａｓｓａｇｅ２の細胞を、Ｐ３はｐａｓｓａｇｅ３の細胞を示す。 図３は、各培地で培養された２０１Ｂ７細胞（ｐａｓｓａｇｅ１）におけるＥＳＲＲＢ遺伝子の発現量を示す。図中、ＫＳＲ　２ｉＬＦＡおよびＫＳＲ　２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３は、表１に示した各表記の培地を示し、ＤＯＸはドキシサイクリンを示す。 図４Ａは、各培地で培養された２０１Ｂ７細胞（左：ｐａｓｓａｇｅ２、右：ｐａｓｓａｇｅ３）のコロニーの写真示す。図４Ｂは、各培地で培養された２０１Ｂ７細胞（左：ｐａｓｓａｇｅ２、右：ｐａｓｓａｇｅ３）におけるＥＳＲＲＢ遺伝子の発現量を示す。図中、２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３および２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３は、表１に示した各表記の培地を示し、ＤＯＸはドキシサイクリンを示す。 図５は、各リプログラミング因子の組み合わせにおけるＥＳＲＲＢ遺伝子の発現量を示す。図中、２ＦはＮＡＮＯＧ遺伝子およびＫＬＦ２遺伝子、４Ｆは山中４因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子）、６ＦはＮＡＮＯＧ遺伝子、ＫＬＦ２遺伝子および山中４因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ－Ｍｙｃ遺伝子）の組み合わせを示す。 図６Ａは、ＳＤＩＡ法により１０日間神経分化誘導された各ｉＰＳ細胞の細胞染色（緑：ＭＡＰ２、青：ヘキストによる核染色）の結果を示す。図６Ｂは、各ｉＰＳ細胞における分化誘導１０日目のＭＡＰ２陽性細胞が存在するコロニーの割合を示す。 図７Ａは、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを介する方法によって神経分化誘導された各ｉＰＳ細胞の細胞染色（緑：βIIIーＴｕｂｕｌｉｎ、赤：ＧＦＡＰ）の結果を示す。図７Ｂは、各ｉＰＳ細胞のアストロサイトおよび神経細胞への分化の割合を示す。 図８は、ナイーブ化の各ステージ（Ｐ１～Ｐ３）を示す。Ｐ１はｐａｓｓａｇｅ１の細胞を、Ｐ２はｐａｓｓａｇｅ２の細胞を、Ｐ３はｐａｓｓａｇｅ３の細胞を示す。 図９は実施例５において遺伝子導入に使用した遺伝子発現ベクターを表す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法とは、以下の工程にしたがって行われる。すなわち、工程（ｉ）：特定の遺伝子について、遺伝子発現ベクターを用いて体細胞またはプライム型多能性幹細胞に導入する工程；工程（ｉｉ）：工程（ｉ）において遺伝子導入された体細胞またはプライム型多能性幹細胞をプライム培地で培養し、ドキシサイクリンを添加後、遺伝子発現細胞株をクローン化する工程；工程（ｉｉｉ）：工程（ｉｉ）でクローン化された遺伝子発現細胞株に、一時的に工程（ｉ）で導入した遺伝子を発現させ、その期間、各種化合物を添加したナイーブ培地で培養する工程を通してナイーブ型多能性幹細胞を製造する。
　また、本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞の維持方法とは、ナイーブ型多能性幹細胞を、各種化合物を添加したナイーブ培地で培養、継代するものである。
　本発明において、体細胞としては、特に限定されないが、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。体細胞としては、例えば、(1) 神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、(2) 組織前駆細胞、(3) 線維芽細胞（皮膚細胞等）、上皮細胞、肝細胞、リンパ球（T細胞、B細胞）、内皮細胞、筋肉細胞、毛細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞が挙げられる。好ましくはヒト由来の体細胞である。
　本発明において、多能性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、エピブラスト細胞、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｇｅｒｍ　Ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　Ｇｅｒｍｌｉｎｅ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。なかでも、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞が好ましく、さらに好ましくは、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞であり、特に好ましくはｉＰＳ細胞である。
　ここで、これら体細胞または多能性幹細胞の由来となる生体としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス）が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
　本発明において、プライム型多能性幹細胞としては、特に限定されないが、多能性幹細胞のうち、ナイーブ型と認識されているマウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞を除いた細胞を意味する。例えば、ヒト、サル、ブタ、ヒツジ、イヌまたはウシに由来するＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞、ならびにヒトおよび前記非ヒト動物細胞に由来するエピブラスト幹細胞が挙げられる。好ましくは、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞であり、なかでも、ヒトｉＰＳ細胞が好ましい。
　本発明において、プライム型多能性幹細胞として用いるヒトＥＳ細胞の細胞株としては、特に限定されないが、例えば、Ｈ１、Ｈ９、Ｓｈｅｆ６、ｋｈＥＳ－１、ｋｈＥＳ－２、ｋｈＥＳ－３、ｋｈＥＳ－４、ｋｈＥＳ－５が挙げられる。
　本発明において、プライム型多能性幹細胞として用いるヒトｉＰＳ細胞の細胞株としては、特に限定されないが、例えば、ＷＤ３９（線維芽細胞由来）、ａＴＫＡ４（Ｔ細胞由来）、２０１Ｂ６、２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４が挙げられる。なかでも、ＷＤ３９、または２０１Ｂ７が好ましい。
　本発明において、体細胞またはプライム型多能性幹細胞に導入される遺伝子としては、いわゆる初期化因子（リプログラミング因子）として知られている因子であれば特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ５、Ｌｉｎ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－１、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎが挙げられる。ここで、これらの遺伝子群の中から２以上の遺伝子を選択して任意に組み合わせて導入することができる。なかでも、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＫｌｆ２の組合せが好ましい。ただし、遺伝子を導入する細胞が、プライム型多能性幹細胞である場合は、上記初期化因子のいずれかが発現しているため、それらを除いた初期化因子を導入してもよい。ヒトＥＳ細胞、またはヒトｉＰＳ細胞の場合、そのような初期化因子としては、例えば、Ｎａｎｏｇ、およびＫｌｆ２の組合せが好ましく、さらにＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２の組み合わせが好ましい。また、導入する遺伝子の種は、導入先の細胞の種と同一であることが好ましい。例えば、ヒト由来の細胞へ導入される遺伝子はヒト遺伝子であることが好ましい。例えば、ヒト由来の体細胞、ヒトＥＳ細胞、またはヒトｉＰＳ細胞へ導入される遺伝子としては、ヒトＮａｎｏｇ（ＮＡＮＯＧ）およびヒトＫｌｆ２（ＫＬＦ２）の組合せが好ましく、さらにヒトＯｃｔ３／４（ＯＣＴ３／４）、ヒトＫｌｆ４（ＫＬＦ４）、ヒトｃ－Ｍｙｃ（ｃ－ＭＹＣ）、ヒトＳｏｘ２（ＳＯＸ２）、ヒトＮａｎｏｇ（ＮＡＮＯＧ）およびヒトＫｌｆ２（ＫＬＦ２）の組み合わせが好ましい。
　本発明において、遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
　本発明において、体細胞またはプライム型多能性幹細胞に遺伝子導入を行った後、フィーダー細胞と共に培養してもよい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、マウス胚性線維芽細胞株（ＳＴＯ細胞）が挙げられる。
　本発明において、プライム培地としては、特に限定されないが、例えば、基礎培地として、ＤＭＥＭ（Dulbecco Modified Eagle medium）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、KnockoutTM D-MEM（Invitrogen社）挙げられ、代替血清（ＫＳＲ；KnockoutTM Serum Replacement（Invitrogen社））、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ－グルタミン、２－メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）、ｂＦＧＦ（basic Fibroblast Growth Factor）等の添加成分を任意に組み合わせて、当該いずれかの基礎培地に添加して調製したものが挙げられる。
　本発明において、クローン化とは、初期化因子を遺伝子導入された体細胞またはプライム型多能性幹細胞のうち、当該遺伝子の発現が確認できた細胞を選別する方法をいう。このような選別方法としては、例えば、予め遺伝子発現ベクターに組み込まれた蛍光タンパク質遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子（例えば、Ｖｅｎｕｓ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子（例えば、Ｃｅｒｕｌｅａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子（例えば、ＴＯＭＡＴＯ）等の蛍光を蛍光顕微鏡下で確認する方法が挙げられる。この方法によって選別された細胞を、本発明では遺伝子発現細胞株という。
　本発明において、工程（ｉｉｉ）および維持方法における各種化合物としては、ＬＩＦ（Leukemia inhibitory factor）、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤、またはＰＫＣ阻害剤が挙げられる。これらの化合物をすべてナイーブ培地に添加することが好ましい。
　本発明において、ＭＥＫ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：３９１２１０－１０－９）、Ｕ０１２６（１，４－ジアミノ－２，３－ジシアノ－１，４－ビス［２－アミノフェニルチオ］ブタジエン；ＣＡＳ登録番号：１０９５１１－５８－２）、ＰＤ９８０５９（２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン；ＣＡＳ登録番号：１６７８６９－２１－８）、ＰＤ１８４３５２（２－(２－クロロ－４－ヨードフェニルアミノ)－Ｎ－シクロプロピルメトキシ－３，４－ジフルオロベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：２１２６３１－７９－３が挙げられる。なかでも、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。
　本発明において、ＧＳＫ３阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル；ＣＡＳ登録番号：２５２９１７－０６－９）、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム；ＣＡＳ登録番号：６６７４６３－６２－９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロインドロ［３，２－ｄ］［１］ベンズアゼピン－６（５Ｈ）－オン；ＣＡＳ登録番号：１４２２７３－２０－９）、ＩＭ－１６（３-（４-フルオロフェニルエチルアミノ）－１－メチル－４－（２－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル)－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン；ＣＡＳ登録番号：１１２９６６９－０５－１）が挙げられる。なかでも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
　本発明において、ｃＡＭＰ産生促進剤としては、特に限定されないが、例えば、フォルスコリン（Forskolin；ＣＡＳ登録番号：６６４２８－８９－５）が挙げられる。
　本発明において、ＴＧＦ－β阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド；ＣＡＳ登録番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：３０１８３６－４１－９）が挙げられる。なかでも、Ａ８３－０１が好ましい。
　本発明において、ＰＫＣ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｇｏ６９８３（３－［１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－５－メトキシ－１Ｈ－インドール－３－イル］－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５３－１９－７）、ＧＦ１０９２０３Ｘ（３－（１－（３－ジメチルアミノ）プロピル）－１Ｈ－インドール－３－イル）－４－（１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５２－９０－１）が挙げられる。なかでも、Ｇｏ６９８３が好ましい。
　本発明において、ナイーブ培地としては、特に限定されないが、例えば、基礎培地として、Ｎ２Ｂ２７培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にＮ２サプリメントを添加したＮ２培地と、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地にＢ２７サプリメントを添加したＢ２７培地とを１：１に混合した培地）が好ましく、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ－グルタミン、２－メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の添加成分を任意に組み合わせて、当該基礎培地に添加して調製したものが挙げられる。
　本発明において、ナイーブ培地に添加する各種化合物の培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、ＬＩＦの場合は１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、ＭＥＫ阻害剤の場合は５０ｎＭ～１００μＭ、ＧＳＫ３阻害剤の場合は５０ｎＭ～１００μＭ、ｃＡＭＰ産生促進剤の場合は５０ｎＭ～１００μＭ、ＴＧＦ－β阻害剤の場合は１０ｎＭ～１００μＭ、ＰＫＣ阻害剤の場合は５０ｎＭ～１００μＭの範囲で添加されることが好ましい。
　本発明において、ナイーブ培地を用いる培養条件について、当業者であれば自明なことであるが、低酸素（酸素濃度：５％）の条件下で培養することが好ましい。
　本発明において、工程（ｉｉｉ）における「一時的」とは、約５日以上、または約１０日以上であり、好ましくは約１０～２０日間、特に好ましくは約１０日～１４日間である。
　本発明において、工程（ｉｉｉ）における「工程（ｉ）で導入した遺伝子を発現させる」とは、例えばドキシサイクリンの添加によって導入遺伝子の発現を誘導する行為である。
　本発明において、製造されたナイーブ型多能性幹細胞のナイーブ型の確認方法としては、当業者であれば自明なことであるが、例えば、定量的ＰＣＲにより、当該細胞のナイーブマーカーの発現量を確認する方法が挙げられる。ここで、ナイーブマーカーとしては、例えば、ＤＰＰＡ３、ＥＳＲＲＢ、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＴＢＸ３が挙げられる。あるいは、コロニー形態において、プライム型多能性幹細胞は主に単層の扁平なコロニーを形成するのに対して、ナイーブ型多能性幹細胞は主に重層（ドーム状）のコロニーを形成するため、その形態によって確認することもできる。
　本発明において、製造されたナイーブ型多能性幹細胞の分化多能性の確認方法としては、当業者であれば自明なことであるが、例えば、定量的ＰＣＲにより、当該細胞の多能性マーカーの発現量を確認する方法が挙げられる。ここで、多能性マーカーとしては、ＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ４が挙げられる。また、別の確認方法として、胚様体（ＥＢ；Embryoid Body）法、テラトーマ（奇形腫）形成法が挙げられる。
　本発明のナイーブ型多能性幹細胞の維持方法において、導入遺伝子の発現誘導は必須ではないため、行っても行わなくてもよい。好ましくは、導入遺伝子の発現誘導は行わずに、各種化合物を添加したナイーブ培地で培養することである。
　本発明において、製造されたナイーブ型多能性幹細胞は、未分化状態を維持し、すなわち、ナイーブマーカーの１種であるＥＳＲＲＢを高発現し、かつ非常に高い分化多能性を有しているため、（１）所望の各種細胞への分化誘導、（２）分化誘導した細胞を用いた医薬品候補化合物のスクリーニング、（３）分化誘導した細胞から再生医療用の組織の作製、（４）作製した組織の患者への移植、（５）胚盤胞へのナイーブ化iPS細胞移植による臓器再生法等に使用することができる。
　本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を分化誘導できる細胞としては、特に限定されないが、例えば、心筋細胞、神経細胞、インスリン産生細胞、糸球体内皮細胞、メサンギウム細胞、ボウマン嚢上皮細胞、血管内皮細胞が挙げられる。
　本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を分化誘導する方法としては、特に限定されないが、例えば、神経細胞に分化誘導する方法としては、ＳＤＩＡ（Stromal cell-Derived Inducing Activity）法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.99, No.3, 1580-1585, 2002）が挙げられる。
　本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を用いて分化誘導した細胞は、各種疾患の治療用医薬品候補化合物のスクリーニングに用いることができる。例えば、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、医薬品候補化合物を、当該分化誘導した細胞に添加することによって、当該細胞の形態または機能的な変化、各種因子の増減、遺伝子発現プロファイリング等を検出することにより、評価を行うことができる。ここで、当該細胞は、治療対象となる疾患と同様の表現型を有する細胞が好ましく、より好ましくは、疾患に罹患した患者に由来する体細胞から製造したナイーブ型多能性幹細胞から分化誘導した細胞である。
　本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を用いて分化誘導した細胞から組織を作製して、再生医療の分野で使用することができる。例えば、損傷した神経組織を本発明に由来する正常な組織と置き換えることによって、損傷した神経組織を正常化することができる。これにより、神経細胞の損傷に由来する疾患を治療することができる。そのような疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、網膜色素変性症、筋萎縮性側索硬化症、視神経脊髄炎、視神経炎、急性散在性（播種性）脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎、脊髄損傷、横断性脊髄炎、脊髄小脳変性症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ギラン・バレー（Guillain-Barre）症候群、多発性硬化症、てんかん、パーキンソン症候群、ダウン症、統合失調症、自律神経失調症、ハンチントン病、加齢黄斑変性症、内耳性難聴が挙げられる。
　本発明において、作製した組織の患者への移植方法としては、当業者であれば自明なことであるが、例えば、神経細胞を移植する場合は、ネイチャー・ニューロサイエンス（Nature Neuroscience）、第２巻、第１２号、１１３７－１１４０ページ、１９９９年に記載の方法に準じて行うことができる。
　以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　以下に生物学的実験例を示し、これらの実験方法に基づいて、本発明化合物の効果を確認した。
実施例１　ｉＰＳ細胞のナイーブ化
１．１　プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養
　ヒトｉＰＳ細胞としてＷＤ３９細胞（Imaizumi et al. Molecular Brain 2012, 5:35）およびコントロールラインとして広く使用されている２０１Ｂ７細胞（理研バイオリソースセンター）を用いた。
　ヒトｉＰＳ細胞は、表１のプライム型条件の培地を用いて、マイトマイシンＣや放射線処理したマウス胎児繊維芽細胞株（ＳＴＯ細胞）またはマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ細胞）をフィーダー細胞として培養された。５日～７日に１回のペースで継代を行った。継代の際には解離液（０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ、１ｍｇ／ｍｌＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ、２０％ＫＳＲ、１ｍＭＣａＣｌ２／ＰＢＳ）を用いてコロニーを剥がし、ピペッティングによってコロニーを細かく砕いたのちに播種した。１０ｃｍディッシュに播種したｉＰＳ細胞を遺伝子導入の試験に供した。
１．２　遺伝子導入細胞株の作製
　上記「１．１　プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」条件で培養されたｉＰＳ細胞（１０ｃｍディッシュ）の培地を除去し７ｍＬのＰＢＳで一回洗浄後、解離液を１ｍＬ添加した。１分～２分後に解離液を除去し、７ｍＬのＰＢＳを加えた。軽くディッシュを揺すってフィーダー細胞のみを剥がした後にＰＢＳを除去した。さらにＰＢＳで一度洗浄し、表１のプライム型条件の培地３ｍＬをディッシュに添加しスクレイパーによってｉＰＳ細胞のコロニーを剥がした後に１５ｍＬチューブに回収した。ｉＰＳ細胞を２００ｇで５分遠心して上清を除き、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１ｍＬ添加して３７℃にて５分反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２ｍＬを加えた後に、Ｐ１０００のピペットマンで１０回～２０回ピペッティングすることで単一細胞に解離した。７ｍＬの培地を足して容量を増やし７０μｍのセルストレイナーを通した。単一細胞となったｉＰＳ細胞を遺伝子導入に使用した。
　遺伝子導入ではＧｅｎｅ　ｊｕｉｃｅ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）発現ベクター（ｒｔＴＡ：ｃｌｏｎｔｅｃｈのｒｔＴＡ－Ａｄｖａｎｃｅｄ配列使用）、ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクター（Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 25;108(4):1531-6参照）、ドキシサイクリン依存的に山中４因子、ＫＬＦ２およびＮＡＮＯＧと蛍光タンパクであるＴＯＭＡＴＯを発現するベクター（ＯＫＳＭ，ＫＬＦ２，ＮＡＮＯＧおよびＴＯＭＡＴＯ）の３種類のベクターを導入し（図１）、上記「１．１プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」と同様に培養した。遺伝子導入の５日～１０日後にドキシサイクリンを添加し８時間～１２時間後に蛍光顕微鏡で観察した。ＴＯＭＡＴＯの蛍光が観察されるコロニーをドキシサイクリン依存性発現誘導システムが機能している細胞株であると判断し、コロニーピックアップによってクローン化した。以降はドキシサイクリンを添加せず、上記「１．１　プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」と同様に培養した。
１．３　ｉＰＳ細胞のナイーブ化
　「１．２　遺伝子導入細胞株の作製」で遺伝子導入およびクローン化されたｉＰＳ細胞を解離液およびＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて単一細胞に解離し、ＭＥＦ細胞をフィーダーとして播いた６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１×１０５／ｗｅｌｌにて播種した。その際、培地は表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地（以下、本発明の培地と略記することがある。）を使用し、さらにドキシサイクリン（1μｇ/ｍＬ）の添加によって導入遺伝子の発現を誘導したうえで低酸素にて培養した（Ｐａｓｓａｇｅ１；Ｐ１）。なお、ナイーブ化開始の初日は１０μＭとなるようＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を加え、細胞死を抑えた。ナイーブ化開始の５日～７日後に継代を行った。培地を除いたのち、各ウェルに０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを３５０μＬ加え１分間３７℃で反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒによって反応を止め、培地を５ｍＬ加えた。ピペットエイドで数回ピペッティングすることでフィーダー細胞のシートからｉＰＳ細胞のコロニーを剥がし、コロニーを１５ｍＬチューブに回収した。遠心後、上清を除いて２００μＬの培地を添加しＰ２００のピペットマンで４０回程度ピペッティングすることで単一細胞に解離した。ＭＥＦ細胞をフィーダー細胞として培養している新しい６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに細胞全量を播種した（Ｐａｓｓａｇｅ２）。継代後もＰ１と同様に、本発明の培地にドキシサイクリンを添加した条件で培養した。継代から５日～７日後に顕微鏡下でｉＰＳ細胞のコロニー形態を観察し２回目の継代を実施した。２回目の継代以降ドキシサイクリンは添加しなかった。２回目の継代から５日～７日後に顕微鏡下でｉＰＳ細胞のコロニー形態を観察し、３回目の継代を実施した。４回目以降も同様に継代した。なお、２回目および３回目の継代時に、それぞれＰａｓｓａｇｅ２およびＰａｓｓａｇｅ３の細胞の一部をｑＰＣＲによる解析用に回収した（図８参照）。
実施例２　ナイーブ化による遺伝子発現プロファイルの解析
　本実験では、ｉＰＳ細胞として２０１Ｂ７細胞を使用した。
　解析に使用する細胞は、プライム型条件の培地で培養された２０１Ｂ７細胞（「１．１　プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」参照）、「１．３　ｉＰＳ細胞のナイーブ化」で作製されたＰａｓｓａｇｅ２およびＰａｓｓａｇｅ３の２０１Ｂ７細胞である。各細胞からＲＮｅａｓｙ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを回収し、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（登録商標）を用いて逆転写した後にＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑII（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｑＰＣＲを行った。プライマーセットは表２に示した。
　その結果を図２に示す。多能性マーカーであるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４の発現はナイーブ化によっても維持されていた。また、ナイーブ型の多能性幹細胞であるマウスＥＳ細胞で発現の高いＫＬＦ４、ＤＰＰＡ３、ＥＳＲＲＢ、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＫＬＦ５およびＴＢＸ３といった遺伝子は、ナイーブ化によって発現が上昇しており、ドキシサイクリンの添加を止めた後（Ｐａｓｓｓａｇｅ３）もプライム型と比べて高い発現を維持していた。また、プライム型の遺伝子マーカーとされるＬｅｆｔｙの発現はナイーブ化によって低下していた。以上の結果から、本発明の方法を用いることで、少なくともｐａｓｓａｇｅ２以降、ｉＰＳ細胞がナイーブ型に移行することが明らかとなった。また、ナイーブ型に移行後その維持には導入遺伝子の発現誘導は必要なく、本発明の培地のみで十分であることが分かった。
実施例３　Ｇｏ６９８３添加タイミングによるナイーブ化への効果
　本実験では、Ｇｏ６９８３添加タイミングによるナイーブ化への効果を検討した。「１．３　ｉＰＳ細胞のナイーブ化」におけるｐａｓｓａｇｅ１の２０１Ｂ７細胞培養培地（表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地）を、表１のＫＳＲ　２ｉＬＦＡの培地または表１のＫＳＲ　２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地に変更し、ドキシサイクリンの添加によって導入遺伝子の発現を誘導したうえで低酸素にて培養した。それぞれの条件で培養したｐａｓｓａｇｅ１を継代から５日～７日後に回収し、ｑＰＣＲによる解析に供した。その結果を図３に示す。図３から明らかであるように、Ｇｏ６９８３を添加した培地で培養したｉＰＳ細胞のほうが、ＥＳＲＲＢの発現は高かった。本結果から、Ｇｏ６９８３をドキシサイクリンによる導入遺伝子の発現誘導と同時に添加することにより、ｉＰＳ細胞のナイーブ化は促進されることが分かった。
実施例４　フォルスコリンおよびＡ８３－０１の添加のナイーブ化に対する効果
　ＥＳＲＲＢ遺伝子はマウスＥＳ細胞において自己複製を制御する重要な遺伝子である（Cell Stem Cell, 11,491-504 (2012)参照）。本発明では、実施例１の結果から明らかであるように、導入遺伝子の発現誘導の有無にかかわらず、ＥＳＲＲＢの発現は高い状態で維持されている。それに対し、非特許文献３に記載のリセット細胞では、ＥＳＲＲＢの発現はほとんど認められていない（非特許文献３参照）。本発明と非特許文献３に記載の条件における相違点のひとつが、本発明では非特許文献３に記載の培地条件にフォルスコリンとＡ８３－０１を加えた点である。そこで、本相違点が、ナイーブ化（ＥＳＲＲＢの発現およびコロニー形態）に及ぼす影響について検討した。
　本実験では、ナイーブ化を検討する培地として、本発明の培地（表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地）および比較培地として表１に記載の２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３の培地を使用し、その他のナイーブ化方法は「１．３　ｉＰＳ細胞のナイーブ化」と同様に行った。各培地で培養したＰａｓｓａｇｅ２およびＰａｓｓａｇｅ３の２０１Ｂ７細胞におけるＥＳＲＲＢの遺伝子発現およびコロニー形態を指標に、ナイーブ化を評価した。
　その結果を図４に示す。両培地ともドキシサイクリン添加中は、ＥＳＲＲＢの発現が上昇しており、ナイーブ型のマウスＥＳ細胞と似たドーム状のコロニー形態をとっていた。しかしながら、２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３の培地で培養したｉＰＳ細胞ではドキシサイクリンの添加を止めてしまうと、ＥＳＲＲＢの発現が顕著に低下し（ドキシサイクリン添加時の発現の約１０％）、またプライム型の特徴である扁平なコロニーが増えていた。それに対し、本発明の培地（表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地）で培養したｉＰＳ細胞ではドキシサイクリンの添加を止めた後も、ＥＳＲＲＢの発現は低下するものの、その低下は２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３条件と比べて軽微（ドキシサイクリン添加時の発現の約５０％）であり、ドーム状のコロニー形態も維持されていた。
　本結果から、導入遺伝子の発現誘導を止めた後もｉＰＳ細胞のナイーブ化状態を維持するためにはフォルスコリンとＡ８３－０１の添加が必要であることが分かった。
　なお、非特許文献３では、Ｇｏ６９８３はドキシサイクリンを抜くタイミングで添加されているが、本試験ではフォルスコリンとＡ８３－０１による効果に焦点を当てるため、本発明の方法と同様にＧｏ６９８３はドキシサイクリン添加時から添加した。実施例２から明らかであるように、Ｇｏ６９８３はドキシサイクリン添加時から添加している方がＥＳＲＲＢの発現は高い。したがって、非特許文献３におけるリセット細胞におけるＥＳＲＲＢの発現は本実験結果よりもさらに低く、非特許文献３に記載されているようにその発現はほとんど認められず、リセット細胞における転写因子ネットワークは脆弱になっている（非特許文献３参照）。それに対し、本発明の方法によって製造され維持されたナイーブ型ｉＰＳ細胞では、ナイーブ型のマウスＥＳ細胞と同じ転写因子の発現が認められており、ナイーブ型のマウスＥＳ細胞と同じ転写因子ネットワークが形成されているものと考えられる。したがって、本発明方法によって製造され維持されたナイーブ型ｉＰＳ細胞は、非特許文献３に記載のリセット細胞よりもナイーブ化が進んだ状態であることがわかる。
実施例５　リプログラミング因子の組み合わせによるリプログラミング効率の比較
　本発明と非特許文献３に記載の条件における相違点のひとつが、本発明では非特許文献３に記載のリプログラミング因子（ＫＬＦ２及びＮＡＮＯＧ）に山中４因子を加えた点である。そこで、本相違点が、ナイーブ化（ＥＳＲＲＢの発現）に及ぼす影響について検討した。
　上記「１．１　プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」条件で培養されたＷＤ３９細胞に対し「１．２　遺伝子導入細胞株の作製」と同様の手技を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入ではリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）発現ベクター（ｒｔＴＡ：ｃｌｏｎｔｅｃｈのｒｔＴＡ－Ａｄｖａｎｃｅｄ配列使用）、ＰｉｇｇｙＢａｃ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ発現ベクター（Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 25;108(4):1531-6参照）、ドキシサイクリン依存的にリプログラミング因子及び蛍光タンパクを発現するベクターの３種類のベクターを導入し（図９）、上記「１．１プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」と同様に培養した。なお、リプログラミング因子及び蛍光タンパクの組み合わせは（１）ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＶｅｎｕｓ、（２）山中４因子及びＣｅｒｕｌｅａｎ、（３）山中４因子、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＴＯＭＡＴＯの三種類を用いた。遺伝子導入の翌日～４日後にドキシサイクリンを添加し、ドキシサイクリン添加の翌日から薬剤によるセレクションを行った。セレクションとして、ドキシサイクリン依存的に発現する耐性遺伝子の種類に従い、ネオマイシン（１００μｇ／ｍＬ）又はピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を添加した。ドキシサイクリン添加５日後に細胞を回収し、ｑＰＣＲによる遺伝子発現解析を実施したところ、（３）山中４因子、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＴＯＭＡＴＯの遺伝子を導入した細胞では、（１）ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＶｅｎｕｓや（２）山中４因子及びＣｅｒｕｌｅａｎを導入した細胞に比べてＥＳＲＲＢの発現が相乗的に高かった（図５）。したがって、山中４因子、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧの６遺伝子の導入によって製造されたナイーブ型ｉＰＳ細胞は、非特許文献３に記載のリセット細胞よりもナイーブ化が進んだ状態であることがわかる。
　以上実施例３～５の結果より、以下のことが明らかとなった。
（１）ＰＫＣ阻害剤（例えば、Ｇｏ６９８３）を導入遺伝子の発現誘導時に添加することにより、ナイーブ化は促進する。
（２）ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧの２遺伝子のみの導入より、山中４因子を加えた６遺伝子の導入によってナイーブ化はより促進する。
（３）ｃＡＭＰ産生促進剤（例えば、フォルスコリン）とＴＧＦ－β阻害剤（例えば、Ａ８３－０１）の添加により、細胞はナイーブ化状態を維持する。
　以上より、本発明方法によって製造され維持されたナイーブ型多能性幹細胞（例えば、ヒトiPS細胞）は、非特許文献３に記載のリセット細胞よりもナイーブ化が数段に進んだ状態であり、ナイーブ型多能性幹細胞として十分に機能する。
実施例６　ナイーブ化したｉＰＳ細胞からの神経分化誘導
　プライム型およびナイーブ化したｉＰＳ細胞をＳＤＩＡ法によって神経分化誘導した。ＳＤＩＡ法はマウスストローマ細胞株（ＰＡ６細胞、理研バイオリソースセンター）をフィーダー細胞としてｉＰＳ／ＥＳ細胞を培養することで神経への分化を誘導する方法である（Kawasaki et al. Neuron. 2000 Oct;28(1):31-40参照）。ＰＡ６細胞の通常の培養は、αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを使用した。ＳＤＩＡ法を行う際に、培地を表１のＳＤＩＡ　ｍｅｄｉｕｍに変更した。プライム型からＳＤＩＡ法を実施する際には上記「１．２　遺伝子導入細胞株の作製」と同様の方法でコロニーを単一細胞にしたが、細胞死を抑える目的で実験開始１時間前から１０μＭとなるようＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２を添加した。ＰＡ６細胞上に細胞を播種した後にはＹ２７６３２を添加しなかった。細胞数は１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２×１０３～２×１０４／ｗｅｌｌで播種した。ナイーブ型からＳＤＩＡ法を実施する際には上記「１．３　ｉＰＳ細胞のナイーブ化」で作製したＰａｓｓａｇｅ３またはＰａｓｓａｇｅ４の細胞をＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを用いた方法でコロニーを単一細胞にした。なお、細胞死を抑える目的で実験開始１時間前から１０μＭとなるようＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２を添加した。ＰＡ６細胞上に細胞を播種した後にはＹ２７６３２を添加しなかった。細胞数は１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２×１０３～２×１０４／ｗｅｌｌで播種した。ＳＤＩＡ法の１０日目に４％ＰＦＡによって細胞を固定し、ＭＡＰ２に対して免疫組織染色を実施した（抗体Ｍ４４０３、ｓｉｇｍａ）。１つ１つのコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、ＭＡＰ２陽性の神経が誘導されているか判別した。その結果を図６に示す。
　ナイーブ化したｉＰＳ細胞はプライム型のｉＰＳ細胞に比べてＭＡＰ２陽性の細胞が存在するコロニーの割合が顕著に高かった。この結果は、使用した２０１Ｂ７細胞およびＷＤ３９細胞の両方で認められた。本結果から、本発明の方法によってナイーブ化されたｉＰＳ細胞は、優れた分化能を有していることが分かった。
実施例７　ナイーブ化したｉＰＳ細胞からのアストロサイト分化誘導
　プライム型およびナイーブ化したｉＰＳ細胞をＮｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを介する方法によって神経分化誘導した（Stem Cells. 2008 Dec;26(12):3086-98参照）。プライム型からアストロサイト分化を実施する際には解離液を用いてコロニーを塊の状態で剥がし、表１のプライム型条件の培地からｂＦＧＦを除いた培地で浮遊培養することで胚様体を形成させた。ナイーブ型からアストロサイト分化を実施する際には強くピペッティングを繰り返すことでコロニーを塊の状態で剥がし、Ｎ２Ｂ２７培地（ナイーブ培地の基礎培地）で培養することで胚様体を形成した。なお、胚様体形成時のコロニーの剥がし方と培地以外はすべてプライム型とナイーブ化したｉＰＳ細胞で全く同じ操作をした。また、胚様体形成期間には神経系への分化を促進するため、１００ｎＭとなるようＬＤＮ１９３１８９を添加した。胚様体形成の７日後に胚様体を回収し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔを１ｍＬ添加して３７℃にて１０分反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２ｍＬを加えた後に、Ｐ１０００のピペットマンで２０回～３０回ピペッティングすることで単一細胞に解離した。解離した細胞は２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調整し、２％Ｂ２７及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加したＭＨＭ培地で浮遊培養することで一次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成した。一次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成の７日後にＮｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを回収し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔを１ｍＬ添加して３７℃にて１０分反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２ｍＬを加えた後に、Ｐ１０００のピペットマンで２０回～３０回ピペッティングすることで単一細胞に解離した。解離した細胞は２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調整し、２％Ｂ２７及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦを添加したＭＨＭ培地で浮遊培養することで二次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成した。二次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成の７日後にｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ及びｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎコートしたカバーガラス上に二次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを播種し分化を促した。分化用の培地には２％Ｂ２７，２％ＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌ　ｈＬＩＦを添加したＭＨＭ培地を用いた。カバーガラス上に播種した１０日後に４％ＰＦＡによって細胞を固定し、神経マーカーであるβIIIーＴｕｂｕｌｉｎ及びアストロサイトマーカーであるＧＦＡＰに対して免疫組織染色を実施した（抗体Ｔ８６６０、ｓｉｇｍａ及び抗体２．２Ｂ１０、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
　その結果を図７に示す。ナイーブ化したｉＰＳ細胞はプライム型のｉＰＳ細胞に比べてアストロサイトへ分化する細胞の割合が顕著に高かった。この結果は、使用した２０１Ｂ７細胞（図中、Ｂ７）およびＷＤ３９細胞（図中、ＷＤ）の両方で認められた。本結果から、本発明の方法によってナイーブ化されたｉＰＳ細胞は、優れた分化能を有していることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明によれば、ナイーブ型の特徴を維持し、かつ分化多能性を有する多能性幹細胞を安定的に製造できるため、臨床利用、薬物評価等の実用的な応用が可能である。
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー

Claims (24)

  1. 　下記の２種の遺伝子：ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２をプライム型多能性幹細胞に一時的に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
  2. 　プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、請求項１記載の製造方法。
  3. 　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、請求項１または請求項２記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法。
  4. 　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法。
  5. 　さらに下記の４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に発現させる工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　培地がＮ２Ｂ２７培地である、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的にプライム型多能性幹細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
  9. 　プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、請求項８記載の製造方法。
  10. 　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、請求項８または請求項９記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法。
  11. 　プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項８～１０のいずれか１項に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法。
  12. 　下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に体細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型誘導多能性幹細胞の製造方法。
  13. 　下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２を一時的に体細胞に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、請求項１２記載の製造方法。
  14. 　体細胞がヒト由来の体細胞である、請求項１２または請求項１３に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法。
  15. 　ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、請求項１３または請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　培地がＮ２Ｂ２７培地である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  17. 　ナイーブ型多能性幹細胞を、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ－β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の維持方法。
  18. 　ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型誘導多能性幹細胞またはナイーブ型胚性幹細胞である、請求項１７記載の維持方法。
  19. 　ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞またはナイーブ型ヒト胚性幹細胞である、請求項１７または請求項１８記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の維持方法。
  20. 　ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の維持方法。
  21. 　ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がＡ８３－０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の維持方法。
  22. 　培地がＮ２Ｂ２７培地である、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の維持方法。
  23. 　請求項１～１６いずれか一項に記載の方法にしたがって製造された、ナイーブ型多能性幹細胞。
  24. 　請求項１７～２２いずれか一項に記載の方法にしたがって維持された、ナイーブ型多能性幹細胞。
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