WO2014204023A1

WO2014204023A1 - 신규한 다베포에틴 알파의 정제 방법

Info

Publication number: WO2014204023A1
Application number: PCT/KR2013/005324
Authority: WO
Inventors: 안지원; 이윤정; 이동억; 김기완; 전창봉; 강길부; 김은영; 이원정
Original assignee: 씨제이헬스케어 주식회사
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2014-12-24

Abstract

본 발명은 당쇄 함량이 높은 다베포에틴 알파의 고순도 정제 방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 다베포에틴 알파를 포함하는 생물학적 유액을 블루 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계; (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계를 포함하는, 다베포에틴 알파의 정제 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 다베포에틴 알파의 정제 방법

다베포에틴 알파 (Darbepoetin Alfa, NESP)는 에리스로포이에틴 (EPO)의 분자 내 아미노산 5개를 치환하여 2개의 N-당쇄를 추가시킨 당단백질 (PCT 특허출원 US94/02957호 참조)로서 에리스포로이에틴과는 분자량, 등전점 등 생화학적 특성이 구별된다. 다베포에틴 알파는 EPO와 같은 적혈구 생성 촉진 단백질이다.

당쇄의 추가로 다베포에틴 알파는 에리스로포이에틴에 비해 마우스, 랫트, 개 및 인간 등에서 혈장 반감기가 약 3배 길며 (Pedrazzoli P, Cinieri S, Lorusso V, Gamucci T, Secondino S, Silvestris N 2007 Nov-Dec,27(6C),4419-24;Anticancer Res.), 다베포에틴 알파의 시알산 함량에 따른 구조적 아형 (isoform)은 최대 22개로 에리스포이에틴의 14개에 비해 많다. 다베포에틴 알파의 당쇄 및 시알산 함량이 높은 구조적 아형들은 낮은 등전점을 가지며, 이러한 구조적 아형은 생체 내 높은 생물학적 활성을 가진다고 알려져 있다 (미국특허 US09/48239호).

종래의 다베포에틴 알파의 정제는 음이온 교환 수지 단독 또는 음이온 교환 수지와 C4 수지로 진행하는 방법 (PCT 특허출원 US1994/09257호), 음이온 교환 수지와 양이온 교환수지, 다시 음이온 교환수지로 진행하는 방법 (PCT 특허출원 US09/48239호 참조)으로 진행되었다. 특히 미국특허 US09/48239호는 등전점 4.5 이하의 시알산 함량이 높은 다베포에틴 알파를 최소한 한 개 이상의 양이온 교환수지를 이용하여 다베포에틴 알파가 flow through로 나오도록 정제하는 방법을 제시하고 있다. 그러나 목적 단백질을 flow through로 얻고 농축하는 공정을 반복하여 여러 단계의 양이온 교환수지 및 농축 및 투석공정을 포함하여 정제하는 상기 미국특허 US09/48239호 방법은 공정시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이와 같이, 기존의 다베포에틴 알파의 정제 공정은 여러 단계의 수지를 이용한 크로마토그래피를 사용하는 복잡한 공정을 거쳐야 하며, 그로 인한 비용과 시간이 막대하게 들어가고 있는 바, 간단한 공정의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명자들은 간이한 단계의 정제 공정으로 다베포에틴 알파를 고순도 및 고수율로 정제하는 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 블루 수지, 하이드록시아파타이트 수지 및 이온교환수지의 조합공정을 통하여 다베포에틴 알파 세포배양액으로부터 95%이상 고순도의 당쇄 함량이 높은 다베포에틴 알파를 정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 당쇄와 시알산 함량이 높은 구조적 아형을 가진 고 순도의 다베포에틴 알파의 정제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법은 생산 적용이 편리하고 간편한 신규의 다베포에틴 알파를 분리하는 방법으로, 다베포에틴 알파 세포 배양액으로부터 당쇄와 시알산 함량이 높은 구조적 아형을 갖는 고순도의 다베포에틴 알파를 대량으로 정제할 수 있어서, 단백질 치료제의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 블루 수지 크로마토그래피를 이용하여 분리한 다베포에틴 알파의 욕출액 순도를 C4 HPLC 분석 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 2는 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 분리한 다베포에틴 알파의 용출액 순도를 C4 HPLC 분석 크로마토그래피로 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 3은 완충용액의 우레아 포함 여부에 따른 세척효과의 차이를 나타낸 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 다베포에틴 알파를 포함하는 생물학적 유액을 블루 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계; (b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계를 포함하는, 다베포에틴 알파의 정제 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "다베포에틴 알파 (Darbepoetin alfa)"는 당단백질인 에리스로포이에틴 (erythropoietin, EPO)의 재조합 형태로서, 에리스로포이에틴의 분자 내 아미노산 5개를 치환하여 2개의 N-당쇄를 추가시킨 당단백질로서, 에리스로포이에틴과는 분자량, 등전점 등 생화학적 특성이 구별된다. 다베포에틴 알파는 적혈구 생성을 유도하여, 신부전증 또는 암의 화학치료와 관련된 빈혈 치료제로 이용된다. 다베포에틴 알파는 당쇄의 추가로 인하여 에리스로포이에틴에 비해서 혈장 반감기가 약 3배 이상 길며, 시알산 함량에 따른 구조적 아형 (isodorm)이 다양하게 존재할 수 있다. 다베포에틴 알파의 당쇄 및 시알산 함량이 높은 구조적 아형들은 낮은 등전점을 가지며, 이러한 구조적 아형은 생체 내 높은 생물학적 활성을 가진다. 따라서, 당쇄 및 시알산 함량이 높은 구조적 아형들만을 선택적으로 고순도로 분리 정제하는 것은 상기 다베포에틴 알파를 이용하는 단백질 치료제에서 중요한 문제이나, 현재까지도 기존의 정제 공정은 여러 단계의 수지를 이용하여 비용과 시간이 막대하게 들어가는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 간이한 공정으로 원하는 당쇄화가 높은 다베포에틴 알파만을 단시간에 분리 정제하는 방법을 개발하였다.

본 발명의 정제 방법에 의해 분리 정제되는 다베포에틴 알파는 당쇄 함량 및 시알산 함량이 높은 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 시알산의 함량이 다베포에틴 알파 1몰 당 14 내지 22몰을 가지는 높은 당쇄 함량을 갖고 있으며, 등전점이 pH 2.0 내지 4.5로 낮은 등전점을 갖는 구조적 아형을 갖는 다베포에틴 알파일 수 있으며, 더 바람직하게는 등전점이 3.5 이하일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 등전점이 3.5 이하의 당쇄 함량이 높은 다베포에틴 알파를 정제하였다. 당쇄 함량 및 시알산 함량이 높을수록 다베포에틴 알파의 아형들은 등전점이 낮은 특징을 갖는다.

본 발명에서 용어, "생물학적 유액"은 세포, 세포 구성요소 또는 세포 산물을 함유하거나 그로부터 유래된 모든 배양액을 말하며, 이에 한정되는 것은 아니나 세포 배양물, 세포 배양 상등액, 세포 용해물, 세포 추출물, 조직 추출물, 혈액, 혈장, 혈청, 밀크, 뇨, 이들의 분획 등을 포함한다. 본 발명의 정제 방법에서는 상기와 같은 다양한 형태의 생물학적 유액을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 효모, 식물 세포 또는 동물 세포의 배양액일 수 있으며, 더 바람직하게는 다베포에틴 알파를 코딩하는 뉴클레오티드가 유전자 재조합 방식으로 형질 전환된 동물 세포 배양액을 사용하며, 더욱 바람직하게는 상기 동물세포가 CHO (중국햄스터 난소)인 동물 세포 배양액일 수 있다.

동물 세포 배양액 등을 이용하는 경우, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 배양액을 원심분리하여 그 상등액을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명자들은 다베포에틴 알파를 포함하는 벡터로 형질전환된 CHO 세포를 배양하여, 배양액의 상등 액에 50 mM 소듐 포스페이트 완충용액을 이용하여 한외 여과 시스템을 이용하여 정용여과 (diafiltration)하여 이용하였다.

본 발명의 각 단계를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(a) 단계는 다베포에틴 알파를 포함하는 생물학적 유액을 블루 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계로서, 바람직하게는 평형화된 블루 수지에 다베포에틴 알파를 포함하는 생물학적 유액, 또는 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 정용여과된 생물학적 유액을 가하여 흡착시킨 후, 0 내지 0.1M NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 세척한 후, 0.1 내지 1M NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계일 수 있다.

본 발명에서 용어, "블루 수지 크로마토그래피"는 "블루 컬럼"과 혼용될 수 있으며, 일반적으로 정제 대상물에서 혈청 알부민을 제거하기 위한 것으로서 수지 ㎖당 약 10㎎의 혈청 알부민을 흡착시킬 수 있는 것으로 알려져 있는 수지이다. 일반적으로 블루 수지를 사용하는 경우, 카탈로그 등에서 제시되는 방법은 완충용액의 pH를 7로 유지하는 것인데, 본 발명자들은 흡착시키는 대상을 혈청 알부민이 아닌 다베포에틴 알파로 달리하여 새로운 효과를 거두고자 노력하는 과정에서 완충용액의 pH를 6 내지 9로 유지시키면 상기한 바와 같은 효과를 달성할 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 완충용액에서 블루 수지 크로마토그래피는 다베포에틴 알파가 포함된 배양액 내의 염색약 (dye) 및 세척제 (detergent)를 제거할 수 있음을 확인하였다. 즉, 블루 수지 크로마토그래피는 pH가 높아짐에 따라 일반적으로 단백질의 흡착이 저해되지만 다베포에틴 알파는 흡착이 유지되는 성질을 이용하여 상기의 효과를 얻을 수 있다. 이러한 구성상의 변경은 본 발명에 따라 다베포에틴 알파를 정제함에 있어 커다란 잇점으로 작용하며, 또한 본 발명의 특징이 된다.

상기 블루 수지는 다베포에틴 알파를 특이적으로 흡착 및 용출시킬 수 있는 한 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 블루세파로즈 6 (Blue-sepharose 6, GE사), 어피-겔블루 (Affi-gel blue, Bio-Rad사) 또는 로요펄블루 (Toyopearl blue, Tosho사) 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 블루세파로즈 6를 사용하였다.

바람직하게 (a) 단계 이전에 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 상기 생물학적 유액을 희석하거나 농축 및 투석을 수행하는 단계를 추가로 포함하면 정제 수율을 높일 수 있다. 즉, 블루 수지에 생물학적 유액을 가하여 흡착시키기 전, 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 상기 생물학적 유액을 희석하거나 농축 및 투석을 수행하여 정제 수율을 높일 수 있다. 이는 한외여과법을 이용한 정용여과를 수행하여 수득할 수 있다. 본 한외여과법을 이용한 정용여과는 배양액 내의 10,000 M.W.C.O.(Molecuar weight cut off) 이하의 저분자 물질 (예를 들어, 계면활성제 (surfactant), 염색약, 저분자 펩타이드 (small peptide), 당성분 등)을 제거할 뿐만 아니라, 블루 수지 크로마토그래피 평형 완충용액으로 완충용액을 교환하여 컬럼 흡착 효율을 향상시키는 것이 가능하다.

또한, 한외여과법은 액체 중에 용해되거나 분산된 물질을 입자크기별로 분획할 수 있는 것으로서, 보통은 분자량 수천 내지 수십만 정도의 분자 또는 콜로이드 입자를 대상으로 분리, 농축, 정제가 가능하다. 한외여과막의 성능은 분획분자량 (M.W.C.O., Molecular weight of cut-off)으로 나타내는데, 그 막의 분획분자량 이상의 물질은 배제되는 것을 의미한다. 보통 M.W.C.O.는 90% 이상 배제될 수 있는 구형 단백질의 분자량으로 나타내고 있다. 이러한 한외여과막의 주요 기능은 정용여과, 정제 및 농축이다.

상기 각 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액으로는 바람직하게 소듐 포스페이트 (sodium phosphate) 완충용액, 칼륨 포스페이트 (potassium phosphate) 완충용액 또는 트리스 (Tris) 완충용액을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 CHO 세포로부터 다베포에틴 알파를 발현하여 얻은 배양액을 50 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)으로 한외 여과 시스템으로 정용여과한 후, 상기 시료를 50 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)으로 평형화시킨 블루세파로즈 6 수지가 충진된 XK-50 컬럼에 2.5 ㎖/min 유속으로 부하하여 결합시킨 후, 0.1 M NaCl이 포함된 50 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 2.5 ㎖/min 유속으로 3 컬럼 용량으로 불순 단백질을 제거하는 세척 후, 0.7 M NaCl이 포함된 50mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 2.5 ㎖/min 유속으로 3 컬럼 용량의 용출용매를 사용하여 다베포에틴 알파가 포함된 용액을 용출하였다. 그 결과, 순도는 약 88% 였다 (도 1).

(b) 단계는 상기 (a) 단계에서 생성된 용출액을 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계로서, 바람직하게는 평형화된 하이드록시아파타이트 수지에 순차적으로 상기 블루 수지 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용출액 또는 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 정용여과된 상기 용출액을 로딩한 후, pH 6 내지 8의 완충용액으로 세척한 후, 로딩과 세척에서 수지에 붙지 않고 빠져나온 액에서 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 수득하는 단계일 수 있다.

본 발명에서 용어, "하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피"는 "하이드록시아파타이트 컬럼"과 혼용될 수 있으며, 하이드록시아파타이트 수지가 충진된 것으로서, 이 수지는 통상 DNA 등 핵산의 제거용으로 많이 사용하고 있는 것이다. 특히, 수지를 평형화시킨 인산 완충용액의 농도가 5 내지 10 mM 이상 일때는 다베포에틴 알파 단백질이 수지에 흡착되지 않고 그대로 용출되며, 이종 단백질 및 핵산이 하이드록시아파타이트 수지에 흡착된다. 또한 이 과정에서 불완전한 다베포에틴 알파도 제거된다. 따라서, 본 발명에서는 블루 수지 크로마토그래피 및 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피 과정을 통하여 불완전한 다베포에틴 알파, 엔도톡신 및 핵산물질을 거의 완전히 제거하는 동시에 이종 단백질의 대부분을 제거하며 별다른 처리 없이 곧바로 다음의 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용함으로써 정제의 단순화, 자동화 등을 도입할 수 있으며, 공정 시간을 단축할 수 있는 장점이 있다. 즉, 본 발명의 하이드록시아파타이트 수지 단계는 다베포에틴 알파는 수지에 붙지 않고, 불순물은 수지에 붙는 방법을 이용하여 정제하는 방법을 특징으로 하고 있다.

상기 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피에 (a) 단계의 블루 수지로부터 수득한 다베포에틴 알파를 포함하는 용출액을 로딩하여 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 세척하면, 이때 로딩과 세척에서 수지에 붙지 않고 빠져나온 액에 당쇄가 많이 붙어있는 다베포에틴 알파가 포함되어 있다. 세척 후, pH 6 내지 8의 0.1 내지 0.7 M 칼륨 포스페이트 완충용액을 수지에 흘려 당쇄 함량이 낮은 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하여 수지에서 제거시킨다.

바람직하게 (b) 단계의 용출액을 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피에 적용하기 전에 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 정용여과하는 단계를 추가로 포함하면 정제 수율을 높일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 블루 수지 용출액을 pH 6 내지 8의 완충용액으로 정용여과한 후, 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)으로 평형화한 하이드록시아파타이트 수지가 충진된 XK-50컬럼에 적용한 후, 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)을 약 4 컬럼 용량으로 흘려서, 당쇄가 많이 붙어있는 다베포에틴 알파를 용출하였다.

(c) 단계는 상기 (b) 단계에서 생성된 용출액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계로서, 바람직하게는 음이온 교환 수지에 상기 하이르록시아파타이트 수지 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용출액을 가하여 흡착시킨 후, 0 내지 6 M의 우레아가 포함된 pH 4.0이하의 완충용액으로 1차 세척하고, pH 6 내지 8의 완충용액으로 2차 세척한 후, 0 내지 0.5 M NaCl을 포함하는 완충용액으로 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계일 수 있다.

상기 (c) 단계를 수행하여 등전점 3.5 이하의 98% 이상의 고순도 다베포에틴 알파를 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, "음이온 교환 수지 크로마토그래피"란 양으로 하전된 지지체에 음으로 하전된 (또는 산성) 분자를 결합시키는 것에 의해 분자들을 이들의 전하에 따라 분리할 수 있는 것으로서, 분자들의 동족체 (산성, 염기성 및 중성)는 이 기법에 의해 쉽게 분리할 수 있다. 본 발명의 음이온교환크로마토그래피에 사용될 수 있는 수지로는 강음이온 교환 수지와 약음이온 교환 수지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 세파덱스, 세파로즈, 소스, 모노, 미니 (상품명, GE healthcare) 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 수지의 작용기가 Q (Quaternary amine), DEAE (DiEthylAminoEthyl) 또는 QAE (Quaternary Amino Ethyl) 등인 수지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 수지의 작용기가 Q 또는 DEAE 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 강음이온 교환 수지인 Q-세파로즈를 사용할 수 있다.

음이온 교환 수지 크로마토그래피는 칼럼 크로마토그래피에 의해 수행하거나, 또는 배치 모드(batch mode)로 수행할 수 있다. 상업적 제조인 경우, 배치 모드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 음이온 교환 수지를 세척하고, 단계식 염 구배 (stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 용출시킨다. 적당한 단계식 또는 연속식 염 구배는 불순물로부터 지속형 인간 성장호르몬의 분리를 허용하는 것이라면 어느 것이든 무방하다.

또한, 본 발명의 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 사용되는 음이온 교환 수지는 배양액을 흡착시키기 전에 수성 완충용액으로 평형화시킬 수 있다.

바람직하게, (c) 단계에서 상기 1차 세척은 우레아가 포함된 완충용액으로 수행하여 목적하는 등전점을 가지는 구조적 아형 (isoform)인 다베포에틴 알파를 분리할 수 있다. 이는 음이온 교환 수지 크로마토그래피 단계에서 등점전이 다른 목적하지 않는 구조적 아형을 1차 세척 완충용액에 따라 분리 용출함으로써 제거가 가능하다. 단, 우레아가 없는 1차 세척 완충용액보다 우레아가 포함된 완충용액의 세척이 목적하지 않는 등전점을 가지는 구조적 아형 제거에 더 효과적일 수 있다 (도 3).

상기 각 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액으로는 바람직하게 소듐 아세테이트 (sodium phosphate) 완충용액, 사이트레이트 (citrate) 완충용액, 글라이신-HCl (glycin-HCl) 완충용액 또는 사이트릭 에시드-소듐 포스페이트 (citric acid-sodium phosphate) 완충용액을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 (b) 단계에서 얻은 다베포에틴 알파가 포함된 용출액을 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)으로 평형화된 Q 세파로즈 FF 수지가 충진된 XK-50컬럼 (GE Healthcare사)에 2.5 ㎖/min의 유속으로 컬럼에 흘린 후, 다시 10mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)을 약 3 컬럼 용량으로 흘려 컬럼을 세척하였다. 이후 순차적으로 6M 우레아가 포함된 pH 3.5 이하의 완충용액과 우레아가 포함되지 않은 pH 6~8의 완충용액으로 세척한 후, 0-0.5M NaCl을 포함하는 pH 6~8의 완충용액으로 다베포에틴 알파를 함유하는 분획을 용출하였다. 이때 6M 우레아가 포함된 pH 3.5 이하의 완충용액과 pH 6 내지 8의 완충용액으로 세척하는 과정에서 당쇄 함량이 적은 다베포에틴 알파가 제거되었다. 당쇄가 많이 붙고 등전점이 낮은 다베포에틴 알파만을 함유하는 용출액을 150 mM NaCl이 포함된 PBS (pH 7.45) 완충용액을 이용하여 한외 여과 시스템으로 정용여과 하였다. 회수한 용출액을 순도를 확인한 결과, 당쇄가 많이 붙고 등전점이 낮은 다베포에틴 알파의 순도는 약 98%임을 확인할 수 있었다.

음이온 교환 수지로부터 얻은 낮은 등전점의 다베포에틴 알파를 포함하는 용출액은 추가의 완충용액 교환공정을 수행할 수 있다. 완충용액 교환공정은 겔 여과 (gel-filtration)또는 농축 및 정용여과 (concentration and diafiltration)등으로 수행할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 정제 방법에 의해 정제된 다베포에틴 알파를 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 정제 방법에 의한 다베포에틴의 제조 방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 정제 방법에 의해 제조된 다베포에틴을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 블루세파로즈 컬럼에 의한 다베포에틴 알파 정제

다베포에틴 알파를 포함하는 벡터로 형질전환된 CHO세포로부터 다베포에틴 알파를 발현하여 얻은 배양액 약 2ℓ를 50 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)으로 한외 여과 시스템 (분자량 컷 오프 10,000)을 이용하여 정용여과 (diafiltration)하였다.

약 20 ㎖의 블루세파로즈 6 (Blue-sepharose 6, GE Healthcare사) 수지를 XK-50컬럼 (GE Healthcare사)에 충진하여 50 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 준비된 블루세파로즈 6 컬럼에 상기 정용여과액 약 0.1-0.2ℓ를 2.5 ㎖/min의 유속으로 흘린 후, 다시 50mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 약 3CV (column volume)흘려 컬럼을 세척하였다.

0.1M NaCl이 포함된 50mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 2.5 ㎖/min의 유속으로 약 3CV 흘려 불순 단백질들을 제거한 후, 0.7M NaCl이 포함된 50mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 8.0)을 2.5 ㎖/min의 유속으로 약 3CV 흘려 다베포에틴 알파가 포함된 용액을 회수하였다.

회수한 용출액의 순도를 C4 HPLC 분석 크로마토그래피를 통하여 측정한 결과를 도 1에 나타냈다.

실시예 2: 하이드록시아파타이트 컬럼에 의한 다베포에틴 알파 정제

상기 실시예 1에서 얻은 블루세파로즈 컬럼 용출액을 하이드록시아파타이트 수지에 흡착시키기 전, 한외여과 시스템을 (분자량 컷오프 10,000) 이용하여 pH 6~8의 10 mM 완충용액으로 정용여과 (diafiltraton)를 수행하였다.

약 20 ㎖의 하이드록시아파타이트 (GE Healthcare사)수지를 XK-50컬럼 (GE Healthcare사)에 충진하여 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 준비된 하이드록시아파타이트 컬럼에 상기 정용여과액 약 0.1 ℓ를 2.5 ㎖/min의 유속으로 흘린 후, 다시 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)을 약 4CV (column volume) 흘렸다.

이때 로딩과 세척에서 수지에 붙지 않고 빠져나온 액에 당쇄가 많이 붙어있는 다베포에틴 알파를 포함하며, 이 용액들을 모아 다음 공정을 진행한다. 세척 후, 0.1 내지 0.7M 칼륨 포스페이트 (potassium phosphate) pH 6~8의 완충용액을 수지에 흘려 당쇄가 적게 붙어있는 다베포에틴 알파를 함유하는 분획을 용출하여 수지에서 제거시켰다. 본 발명의 상기 하이드록시아파타이트 수지 단계는 다베포에틴 알파는 수지에 붙지 않고, 불순물은 수지에 붙는 방법을 이용하여 정제하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 하기 실시예 3의 음이온 교환 컬럼에 적용하는 용액은 로딩과 세척에서 용출된 액이다.

실시예 3: 음이온 교환 컬럼에 의한 다베포에틴 알파 정제

약 20 ㎖의 Q 세파로즈 FF (GE Healthcare사) 수지를 XK-50컬럼 (GE Healthcare사)에 충진하여 10 mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다.

상기 실시예 2에서 얻은 다베포에틴 알파가 포함된 용액 약 0.2 ℓ를 2.5 ㎖/min의 유속으로 컬럼에 흘린 후, 다시 10mM 소듐 포스페이트 완충용액 (pH 7.0)을 약 3CV (column volume)흘려 컬럼을 세척하였다. 이후 순차적으로 6M 우레아가 포함된 pH 3.5 이하의 완충용액과, 우레아가 포함되지 않은 pH 6~8의 완충용액으로 세척한 후, 0-0.5M NaCl을 포함하는 pH 6~8의 완충용액으로 다베포에틴 알파를 함유하는 분획을 용출하였다. 이때 6M 우레아가 포함된 pH 3.5 이하의 완충용액과 pH 6~8의 완충용액으로 세척하는 과정에서 당쇄 함량이 적은 다베포에틴 알파가 제거되었다.

당쇄가 많이 붙고 등전점이 낮은 다베포에틴 알파만을 함유하는 용출액은 150 mM NaCl이 포함된 PBS (pH 7.45) 완충용액을 이용하여 한외 여과 시스템(분자량 컷 오프 10,000)으로 정용여과 (diafiltration)하였다.

회수한 용출액의 순도를 C4 HPLC 분석 크로마토그래피를 통하여 측정한 결과는 도 2와 같으며, 당쇄가 많이 붙고 등전점이 낮은 다베포에틴 알파의 순도는 약 98%임을 확인할 수 있었다.

아울러, 상기 6M 우레아가 포함된 pH 3.5 이하의 완충용액으로 세척하는 단계에 있어서, 상기 완충용액 대신에 0M의 우레아가 포함된 (즉, 우레아가 포함되지 않은 완충용액) pH 4.0의 완충용액으로 세척을 수행한 군과 6M의 우레아가 포함된 pH 4.0의 완충용액으로 세척한 군으로부터 용출된 다베포에틴 알파를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 우레아가 없는 완충용액보다 우레아가 포함된 완충용액으로 세척한 군이 목적하지 않은 등전점을 가지는 구조적 아형 제거에 더 효과적인 것을 확인하였다 (도 3).

Claims

(a) 다베포에틴 알파를 포함하는 생물학적 유액을 블루 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 생성된 용출액을 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 생성된 용출액을 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하여 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계를 포함하는, 다베포에틴 알파의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 다베포에틴 알파는 시알산의 함량이 다베포에틴 알파 1 몰당 14 내지 22 몰로 당쇄 함량이 높고, 등전점이 pH 2.0 내지 4.0으로 낮은 등전점을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, (a) 단계 이전에 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 9의 완충용액으로 상기 생물학적 유액을 희석하거나 농축 및 투석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, (b) 단계의 용출액을 하이드록시아파타이트 수지 크로마토그래피에 적용하기 전에 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 정용여과하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 평형화된 블루 수지에 다베포에틴 알파를 포함하는 생물학적 유액, 또는 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 7 내지 9의 완충용액으로 정용여과된 생물학적 유액을 가하여 흡착시킨 후, 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 7 내지 9의 완충용액으로 세척한 후, 0.4 내지 1M NaCl이 포함된 pH 7 내지 9의 완충용액으로 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 평형화된 하이드록시아파타이트 수지에 순차적으로 상기 블루 수지 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용출액 또는 0 내지 100 mM NaCl이 포함된 pH 6 내지 8의 완충용액으로 정용여과된 상기 용출액을 로딩한 후, pH 6 내지 8의 완충용액으로 세척한 후, 로딩과 세척에서 수지에 붙지 않고 빠져나온 액에서 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 수득하는 단계인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 음이온 교환 수지에 상기 하이르록시아파타이트 수지 크로마토그래피 단계로부터 회수된 용출액을 가하여 흡착시킨 후, O 내지 6M의 우레아가 포함된 pH 4.0 이하의 완충용액으로 1차 세척하고, pH 6 내지 8의 완충용액으로 2차 세척한 후, 0 내지 0.5 M NaCl을 포함하는 완충용액으로 다베포에틴 알파를 포함하는 분획을 용출하는 단계인 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 1차 세척은 우레아가 포함된 완충용액으로 수행하여 목적하는 등전점을 가지는 구조적 아형 (isoform)인 다베포에틴 알파를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 및 (b) 단계에서 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액이 소듐 포스페이트 (sodium phosphate) 완충용액, 칼륨 포스페이트(potassium phosphate) 완충용액 또는 트리스(Tris) 완충용액이고, 상기 (c) 단계에서 세척 및 용출단계에서 사용되는 완충용액은 소듐 아세테이트 (sodium acetate) 완충용액, 사이트레이트 (citrate) 완충용액, 글리이신-HCl (glycin-HCl) 완충용액 또는 사이트릭 에시드-소듐 포스페이트 (citric acid-sodium phophate) 완충용액인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 유액은 효모, 식물세포 또는 동물세포 배양액인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 수지의 작용기가 Q (Quaternary amine), DEAE (DiEthylAminoEthyl) 및 QAE (Quaternary Amino Ethyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 방법.