WO2013031826A1 - 核初期化物質 - Google Patents

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WO2013031826A1
WO2013031826A1 PCT/JP2012/071829 JP2012071829W WO2013031826A1 WO 2013031826 A1 WO2013031826 A1 WO 2013031826A1 JP 2012071829 W JP2012071829 W JP 2012071829W WO 2013031826 A1 WO2013031826 A1 WO 2013031826A1
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WO
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cells
cell
ips
oct3
klf4
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/071829
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English (en)
French (fr)
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伸弥 山中
直樹 五島
崇裕 佐藤
Original Assignee
国立大学法人京都大学
独立行政法人産業技術総合研究所
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/602—Sox-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/603—Oct-3/4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/604—Klf-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel nuclear reprogramming substance and its use. More specifically, the present invention relates to a novel nuclear reprogramming substance that can replace c-Myc, and a method for establishing an induced pluripotent stem (hereinafter referred to as iPS) cell using the same.
  • iPS induced pluripotent stem
  • Irx family members Example: IRX6
  • Glis family members eg GLIS1
  • Ptx family eg PITX2
  • DMRT-like ⁇ familyDMB with proline-rich C-terminal, 1 gene (DMRTB1)
  • DMRTB1 DMRT-like ⁇ familyDMB with proline-rich C-terminal, 1 gene
  • iPS cells could be established efficiently when introduced into mouse and human skin-derived fibroblasts together with 3,4 Sox2 and c-Myc genes, these transcription factors could replace Klf4
  • Patent Document 7 a novel nuclear reprogramming factor
  • Glis family members eg GLIS1
  • Glis family members have a function to increase iPS cell establishment efficiency as a substitute factor for c-Myc as much as or higher
  • An object of the present invention is to identify a novel nuclear reprogramming substance, particularly a novel nuclear reprogramming substance that can replace c-Myc, and to provide a novel method for establishing iPS cells using the same.
  • the present inventors have widely used human gene libraries such as receptors or enzymes as a substitute for c-Myc in the same manner as described in WO ⁇ 2010/098419.
  • any of the 80 genes shown in Fig. 3 is introduced into mouse fetal fibroblasts (MEF) together with three genes Oct3 / 4, Sox2 and Klf4, iPS cells can be established efficiently I was able to.
  • Zinc finger and SCAN domain containing 4 Zscan4 compared c-Myc and Glis1 with iPS cell-inducing activity.
  • Zscan4 can induce iPS cells as well as Glis1 or better. It became. Based on these findings, the present inventors have identified Zscan4 as a novel nuclear reprogramming factor that can replace c-Myc, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • (b) A method for producing iPS cells, comprising a step of introducing a substance capable of inducing iPS cells from somatic cells by combining with c-Myc into the somatic cells.
  • the substance of (b) is selected from the group consisting of Oct family members, Sox family members, Klf family members, Glis family members, Nanog and Lin family members, and nucleic acids encoding them.
  • [3] The method according to [1] above, wherein the substance (b) is Oct3 / 4 or a nucleic acid encoding the same.
  • a method for producing a somatic cell comprising subjecting the iPS cell according to [11] above to differentiation induction treatment to differentiate it into a somatic cell.
  • a somatic cell-to-iPS cell inducer comprising Zscan4 or a nucleic acid encoding the same, together with a substance capable of inducing iPS cells from somatic cells in combination with c-Myc. An agent, characterized in that it is introduced.
  • Zscan4 or a nucleic acid encoding the same for the production of iPS cells, the substance being introduced into somatic cells together with a substance capable of inducing iPS cells from somatic cells in combination with c-Myc Characterized by being used.
  • Zscan4 or a nucleic acid that encodes Zscan4 as an inducer of iPS cells from somatic cells and is introduced into somatic cells together with a substance capable of inducing iPS cells from somatic cells in combination with c-Myc A substance characterized by that.
  • Zscan family members can replace c-Myc in nuclear reprogramming, enabling efficient establishment of iPS cells while avoiding the risk of tumor formation by c-Myc. It is useful for application.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing the steps from the human Gateway O entry clone (N. Goshima et al., Nature methods, 2008) to the selection of function-specific entry clones.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for preparing a transcription factor library for screening somatic cell reprogramming factors from entry clones of transcription factors.
  • FIG. 3 shows the names of 80 genes hit in the 2nd screening.
  • FIG. 4 is a graph showing the result of comparing the iPS cell inducing activity of ZSCAN4, c-MYC and GLIS1 on the 14th day (Day 14) after virus infection.
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKZ means OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and It means the introduction of ZSCAN4, OSKG means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and GLIS1.
  • shaft in a figure shows fluorescence intensity (Mean
  • FIG. 5 is a graph showing the results of comparing the iPS cell inducing activity of ZSCAN4, c-MYC and GLIS1 on the 15th day (Day 15) after virus infection.
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKZ means OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and It means the introduction of ZSCAN4,
  • OSKG means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and GLIS1.
  • shaft in a figure shows fluorescence intensity (Mean
  • FIG. 6 is a graph showing the results of comparing the iPS cell inducing activities of ZSCAN4, c-MYC and GLIS1 on the 16th day after virus infection (Day 16).
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKZ means OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and It means the introduction of ZSCAN4,
  • OSKG means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and GLIS1.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of comparing the iPS cell inducing activity of ZSCAN4, c-MYC and GLIS1 on the 17th day after virus infection (Day 17).
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKZ means OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and It means the introduction of ZSCAN4, OSKG means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and GLIS1.
  • shaft in a figure shows fluorescence intensity (Mean
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of comparing the iPS cell inducing activity of ZSCAN4, c-MYC, and GLIS1 on the 15th day after virus infection (Day 15).
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • shaft in a figure shows fluorescence intensity (Mean
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of comparing iPS cell inducing activities of ZSCAN4, c-MYC, and GLIS1 on the 17th day (Day 17) after virus infection.
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • shaft in a figure shows fluorescence intensity (Mean
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of comparing iPS cell inducing activities of ZSCAN4, c-MYC, and GLIS1 on the 8th day (Day 8) after virus infection.
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • shaft in a figure shows fluorescence intensity (Mean
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of comparing iPS cell inducing activities of ZSCAN4, c-MYC, and GLIS1 on the 10th day (Day 10) after virus infection.
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC
  • OSKG means OCT3 / 4
  • SOX2, KLF4 and OSKZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and ZSCAN4, and OSKGZ means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 and ZSCAN4.
  • shaft in a figure shows fluorescence intensity (Mean
  • FIG. 16 is a graph showing the results of comparing iPS cell inducing activities of ZSCAN4, c-MYC, and GLIS1 on the 29th day after virus infection.
  • the upper part shows an immunostained fluorescent image of SSEA-4
  • the lower part shows an ALP-stained image.
  • OSK means the introduction of OCT3 / 4, SOX2 and KLF4
  • OSKM means the introduction of OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC.
  • the number in parentheses means the number of colonies measured.
  • the present invention is a Zscan family member that is a nuclear reprogramming substance that can replace c-Myc, and a nuclear reprogramming capable of inducing iPS cells from somatic cells by combining the substance with c-Myc.
  • a method for producing iPS cells by introducing a substance into somatic cells is provided.
  • the “nuclear reprogramming substance” is a substance (group) capable of inducing iPS cells from somatic cells, and is a proteinous factor or a nucleic acid encoding the same (including forms incorporated in a vector) Alternatively, it may be composed of any substance such as a low molecular compound.
  • a nuclear reprogramming substance that can replace c-Myc identified by the present invention is any protein shown in FIG. 3 or a nucleic acid encoding it.
  • the Zscan family member has a structure including a SCAN box and about 4 C2H2 type Zinc finger regions, such as Zscan1, Zscan2, Zscan3, Zscan4, Zscan5 and Zscan6.
  • Zscan4 zinc finger and SCAN domain containing 4
  • Zscan4 is a gene that encodes a protein contained in telomeres and has been shown to be involved in maintaining the stability of telomeres and genomes in ES cells (Nature, 464, 858-863 (2010 ), WO2011 / 028880).
  • the amino acid sequence and cDNA sequence information of Zscan4 derived from human and mouse can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in Table 1, and those skilled in the art can easily obtain each protein based on the cDNA sequence information. Can be isolated and, if necessary, recombinant proteins can be produced.
  • Zscan4 has 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more identity with each of the above amino acid sequences, and wild-type Zscan4 as an alternative factor for c-Myc.
  • Natural or artificial mutant proteins having equivalent nuclear reprogramming ability and nucleic acids encoding the same can also be used as Zscan4 of the present invention.
  • Only one member of the Zscan family (including the nucleic acid encoding it) may be used, or two or more members may be used in combination.
  • a nuclear reprogramming substance that can induce iPS cells by combining with c-Myc a combination of substances excluding c-Myc from the combination of (1)-(12) above, that is, (i) Oct3 / 4, Klf4 (ii) Oct3 / 4, Klf4, Sox2 (Sox2 can be replaced with Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 or Sox18.
  • c-Myc can be replaced with T58A (active mutant), N-Myc, L-Myc.)
  • Oct3 / 4, Klf4, Sox2, TERT, SV40 Large T (v) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6 (vi) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7 (vii) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7 (viii) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil (ix) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, Nanog, Lin28 (x) Oct3 / 4, Klf4, Sox2, SV40 Large T (xi) Oct3 / 4, Klf4, Sox2,
  • Oct family members such as Oct1A and Oct6 can be used instead of Oct3 / 4.
  • Sox family members such as Sox7 can be used instead of Sox2 (or Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18).
  • Klf family members eg, Klf1, Klf2, Klf5 or known alternative factors thereof (eg, Esrr family members such as Esrrb, Esrrg, IRX1, IRX2, IRX3, IRX4, IRX5, Irx family members such as IRX6, Glis family members such as GLIS1, GLIS2, and GLIS3, Ptx family members such as PITX1, PITX2, and PITX3, and DMRTB1) can also be used.
  • Esrr family members such as Esrrb, Esrrg, IRX1, IRX2, IRX3, IRX4, IRX5, Irx family members such as IRX6, Glis family members such as GLIS1, GLIS2, and GLIS3, Ptx family members such as PITX1, PITX2, and PITX3, and DMRTB1
  • Esrr family members such as Esrrb, Esrrg, IRX1, IRX2, IRX3, IRX4, IR
  • nuclear reprogramming substances that can induce iPS cells by combining with c-Myc are preferably Oct family members (eg, Oct3 / 4, Oct1A, Oct6), Sox family members (eg: Sox2, Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18), Klf family members (eg, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5), Nanog and Lin family members (eg, Lin28, Lin28b).
  • a combination comprising at least Oct3 / 4 and optionally comprising Sox2 and / or Klf4 (ie (a) Oct3 / 4, (b) Oct3 / 4 + Sox2, (c) Oct3 / 4 + Klf4, (d) Oct3 / 4 + Sox2 + Klf4), and Nanog and / or Lin28 may be used in combination.
  • nuclear reprogramming substance in the present invention.
  • other substances such as members of the Myc family other than c-Myc (eg, L-Myc, N-Myc) or known substitutes thereof (eg, members of the Glis family such as GLIS1, GLIS2, GLIS3), etc. You may combine.
  • an alternative factor for c-Myc is, for example, compared to the iPS cell induction activity (including the case where there is no induction activity) obtained based on the combination of nuclear reprogramming substances (i) to (xii) above.
  • Any iPS cell obtained by adding the factor to each of the iPS cells can be used as long as the factor increases iPS cell-inducing activity, and is not necessarily limited to the combination of the above-mentioned nuclear reprogramming substances (1)-(12) containing c-Myc. It does not mean that it becomes stronger than the induction activity.
  • somatic cells subject to nuclear reprogramming may partially express any of the components in any of (i)-(x) above at a level sufficient for nuclear reprogramming.
  • the combination of only the remaining components excluding the component can also be included in the category of “nuclear reprogramming substance capable of inducing iPS cells by combining with c-Myc” in the present invention.
  • iPS cells when the obtained iPS cells are used for therapeutic purposes, a combination of two factors Oct3 / 4 and Sox2, or a combination of three factors Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 is preferable.
  • the four factors Oct3 / 4, Klf4, Sox2 and Lin28, or Nanog are preferred.
  • Mouse and human cDNA sequence information of each of the above proteinaceous factors can be obtained by referring to NCBI accession numbers described in WO 2007/069666 (Nanog is described as “ECAT4” in the publication)
  • mouse and human cDNA sequence information of Lin28, Lin28B, Esrrb, Esrrg, L-Myc, and Nr5a2 can be obtained by referring to the following NCBI accession numbers, respectively).
  • cDNA can be isolated.
  • the obtained cDNA is inserted into an appropriate expression vector, introduced into a host cell, and cultured from the resulting culture. Can be prepared by recovering.
  • the obtained cDNA is inserted into a viral vector, episomal vector or plasmid vector to construct an expression vector, which is then used for the nuclear reprogramming step.
  • Somatic cell source Somatic cells that can be used as a starting material for producing iPS cells in the present invention are any cells other than germ cells derived from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs, rats, etc.).
  • keratinized epithelial cells eg, keratinized epidermal cells
  • mucosal epithelial cells eg, epithelial cells of the tongue surface layer
  • exocrine glandular epithelial cells eg, mammary cells
  • hormone secreting cells Eg, adrenal medullary cells
  • cells for metabolism / storage eg, hepatocytes
  • luminal epithelial cells that make up the interface eg, type I alveolar cells
  • luminal epithelial cells in the inner chain eg, Vascular endothelial cells
  • cilia cells with transport ability eg, airway epithelial cells
  • cells for extracellular matrix secretion eg, fibroblasts
  • contractile cells e
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • final differentiated mature cells It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • dental pulp stem cells can be isolated and prepared from teeth extracted due to wisdom teeth, periodontal disease, etc., so they are readily available and are expected to be used as somatic cell sources for iPS cell banks in the future. .
  • blood cells peripheral mononuclear cells, peripheral blood lymphocytes, umbilical cord blood cells, etc.
  • peripheral blood lymphocytes peripheral blood lymphocytes
  • umbilical cord blood cells etc.
  • somatic cells there are no particular restrictions on the mammalian individual from which somatic cells are collected, but when the resulting iPS cells are used for human regenerative medicine, the patient or the type of HLA is used from the viewpoint that rejection does not occur. It is particularly preferred to collect somatic cells from others who are identical or substantially identical.
  • the type of HLA is “substantially the same” means that when the cells obtained by inducing differentiation from iPS cells derived from the somatic cells are transplanted into a patient by using an immunosuppressant or the like, the transplanted cells are This means that the HLA types match to the extent that they can be engrafted.
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR and 4 loci including HLA-Cw
  • the main HLA for example, 3 loci of HLA-A, HLA-B and HLA-DR and 4 loci including HLA-Cw
  • iPS cells when not being administered (transplanted) to humans, for example, when iPS cells are used as a source of screening cells for evaluating the patient's drug sensitivity and the presence or absence of side effects, It is desirable to collect somatic cells from others who have the same genetic polymorphism that correlates with side effects.
  • Somatic cells isolated from mammals can be pre-cultured in a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • a medium known per se suitable for culturing according to the type of cells prior to being subjected to the nuclear reprogramming step.
  • Examples of such a medium include a minimum essential medium (MEM), Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium, and F12 medium containing about 5 to 20% fetal calf serum. It is not limited to.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 RPMI1640 medium
  • 199 medium 199 medium
  • F12 medium containing about 5 to 20% fetal calf serum containing about 5 to 20% fetal calf serum.
  • a medium for mesenchymal stem cells such as Mesenchymal stem cells basal medium (Lonza).
  • Protein introduction reagents include cationic lipid-based BioPOTER Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systmes), Pro-Ject TM Protein Transfection Reagent (PIERCE) and ProVectin (IMGENEX), and lipid-based Profect-1 (Targeting Systems) ), Penetrain Peptide (Q biogene) and Chariot Kit (Active Motif) based on membrane-permeable peptides, GenomONE (Ishihara Sangyo) using HVJ envelope (inactivated Sendai virus), and the like are commercially available.
  • the introduction can be carried out according to the protocol attached to these reagents, but the general procedure is as follows.
  • Dilute the nuclear reprogramming substance in an appropriate solvent for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.
  • an appropriate solvent for example, buffer solution such as PBS, HEPES, etc.
  • CPP derived from PTD include polyarginine such as 11R (Cell Stem Cell, 4: 381-384 (2009)) and 9R (Cell Stem Cell, 4: 472-476 (2009)).
  • a fusion protein expression vector incorporating a nuclear reprogramming substance cDNA and a PTD sequence or CPP sequence is prepared and recombinantly expressed, and the fusion protein is recovered and used for introduction. Introduction can be performed in the same manner as described above except that no protein introduction reagent is added.
  • Microinjection is a method in which a protein solution is put into a glass needle having a tip diameter of about 1 ⁇ m and puncture is introduced into a cell, and the protein can be reliably introduced into the cell.
  • electroporation method in addition, electroporation method, semi-intact cell method (Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365 (2006)), introduction method using Wr-t peptide (Kondo, E. et al. Protein introduction methods such as Mol. Cancer Ther. 3 (12), 1623-1630 (2004)) can also be used.
  • the protein introduction operation can be performed any number of one or more times (for example, 1 to 10 times or 1 to 5 times), and preferably the introduction operation is performed 2 or more times (for example, 3 or 4 times). ) Can be done repeatedly. Examples of the interval when the introduction operation is repeated include 6 to 48 hours, preferably 12 to 24 hours.
  • the nuclear reprogramming substance in the form of a nucleic acid that encodes it rather than as a protein factor itself.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, or may be a DNA / RNA chimera, and the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded.
  • the nucleic acid is double stranded DNA, in particular cDNA.
  • the cDNA of the nuclear reprogramming substance is inserted into an appropriate expression vector containing a promoter that can function in somatic cells as a host.
  • expression vectors include retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpes viruses, Sendai virus and other viral vectors, animal cell expression plasmids (eg, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV). , PcDNAI / Neo) or the like.
  • Examples of the promoter used in the expression vector include EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Molone murine leukemia virus) LTR. HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase) promoter and the like are used. Of these, EF1 ⁇ promoter, CAG promoter, MoMuLV LTR, CMV promoter, SR ⁇ promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene, an SV40 replication origin, and the like as desired.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, and the like.
  • Nucleic acid that is a nuclear reprogramming substance may be incorporated on separate expression vectors, or two or more, preferably 2-3 types of genes may be incorporated into one expression vector. It is preferable to select the former when using a retrovirus or lentiviral vector with high gene transfer efficiency, and the latter when using a plasmid, adenovirus, episomal vector, or the like. Furthermore, an expression vector incorporating two or more types of genes and an expression vector incorporating only one gene can be used in combination.
  • sequences enabling polycistronic expression include 2A sequences of foot-and-mouth disease virus (PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES sequences (US Patent No. 4,937,190), preferably A 2A sequence can be used.
  • An expression vector containing a nucleic acid that is a nuclear reprogramming substance can be introduced into a cell by a method known per se according to the type of the vector.
  • a virus produced in the culture supernatant by introducing a plasmid containing the nucleic acid into an appropriate packaging cell (eg, Plat-E cell) or a complementary cell line (eg, 293 cell) The vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • an appropriate packaging cell eg, Plat-E cell
  • a complementary cell line eg, 293 cell
  • the vector is collected and cells are infected with the vector by an appropriate method according to each viral vector.
  • specific means of using a retroviral vector as a vector are disclosed in WO2007 / 69666, Cell, 126, 663-676 (2006) and Cell, 131, 861-872 (2007).
  • reprogramming genes may increase the risk of carcinogenesis in tissues regenerated from differentiated cells derived from iPS cells. It is preferable that the gene is transiently expressed without being integrated into the cell chromosome. From this point of view, it is preferable to use an adenovirus vector that rarely integrates into the chromosome. Specific means using an adenoviral vector is described in Science, 322, 945-949 (2008).
  • adeno-associated virus also has a low frequency of integration into chromosomes, and has lower cytotoxicity and inflammation-inducing action than adenovirus vectors, and thus can be mentioned as another preferred vector.
  • the Sendai virus vector can exist stably outside the chromosome, and can be preferably used in the same manner because it can be decomposed and removed by siRNA as necessary. Sendai virus vectors are described in J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007), Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85, 348-362 (2009), or Japanese Patent No. 3602058 Can be used.
  • a method of excising a nucleic acid encoding a nuclear reprogramming substance at a time point can be preferably used. That is, loxP sequences are arranged at both ends of the nucleic acid, and after iPS cells are induced, Cre recombinase is allowed to act on the cells using a plasmid vector or an adenovirus vector to cut out the region sandwiched between the loxP sequences. be able to.
  • the enhancer-promoter sequence in the LTR ⁇ U3 region may up-regulate nearby host genes by insertion mutation, so the 3′-self is deleted or replaced with a polyadenylation sequence such as SV40.
  • an inactivated (SIN) LTR is used to avoid expression control of the endogenous gene by an LTR outside the loxP sequence that is not excised and remains in the genome. Specific means using the Cre-loxP system and SIN LTR are disclosed in Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009).
  • plasmid vector which is a non-viral vector
  • the vector is transferred to cells using lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method, etc.
  • lipofection method liposome method
  • electroporation method calcium phosphate coprecipitation method
  • DEAE dextran method microinjection method
  • gene gun method etc.
  • Specific means using a plasmid as a vector are described in, for example, Science, 322, 949-953 (2008).
  • gene introduction can be carried out any number of one or more times (for example, 1 to 10 times or 1 to 5 times).
  • time for example, 1 to 10 times, or 1 to 5 times, etc.
  • the number of times can be performed, and preferably the introduction operation can be repeated 2 times or more (for example, 3 times or 4 times).
  • transgene may be integrated into the chromosome, it is necessary to finally confirm that there is no gene insertion into the chromosome by Southern blotting or PCR. Therefore, it may be advantageous to use a means for removing the gene after the transgene has been once integrated into the chromosome, as in the Cre-loxP system.
  • there is a method for completely removing a transgene from a chromosome by incorporating a transgene into a chromosome using a transposon and then allowing a transferase to act on the cell using a plasmid vector or an adenovirus vector. Can be used.
  • Preferred transposons include, for example, piggyBac, which is a transposon derived from a lepidopteran insect. Specific means using the piggyBac transposon are disclosed in Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009), Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009).
  • Another preferred non-integrated vector is an episomal vector capable of autonomous replication outside the chromosome.
  • episomal vectors Specific means using episomal vectors are disclosed in Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1 or Nature Methods, 8 (5), 409-412 (2011), etc. ing.
  • the episomal vector examples include a vector containing a sequence necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40 or the like as a vector element.
  • vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication.
  • the replication origin oriP And EBNA-1 gene SV40 includes the origin of replication ori and SV40 large T antigen gene.
  • S / MAR sequences derived from pEPI-based vectors and ⁇ -satellite DNA for human artificial chromosomes can also be used as vector elements necessary for autonomous replication (Mol Ther 16 (9), 1525-1538 (2008) ).
  • the episomal expression vector also contains a promoter that controls transcription of the reprogramming gene.
  • the promoter the same promoter as described above can be used.
  • the episomal expression vector may further contain an enhancer, a poly A addition signal, a selection marker gene in mammalian cells, and the like, if desired.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene and a neomycin resistance gene.
  • the selection marker gene include a dihydrofolate reductase gene and a neomycin resistance gene.
  • selectable marker genes eg, ampicillin resistance
  • Gene auxotrophic complementary gene
  • the loxP sequence used in the present invention includes a wild type loxP sequence derived from bacteriophage P1 and recombination when placed in the same direction at a position sandwiching a vector element required for replication of the reprogramming gene. And any mutated loxP sequence that can delete sequences between loxP sequences. Examples of the mutant loxP sequence include lox71 having a mutation in the 5 'repeat, lox66 having a mutation in the 3' repeat, lox2272 and lox511 having a mutation in the spacer portion, and the like.
  • the two loxP sequences arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element may be the same or different, but in the case of a mutant loxP sequence having a mutation in the spacer portion (for example, , Lox2272 and lox511) are used.
  • a mutant loxP sequence eg, lox71
  • a mutant loxP sequence eg, lox66
  • the loxP sequence remaining on the chromosome as a result of recombination has double mutations in the 5 'and 3' repeats, making it difficult to recognize by Cre recombinase, and chromosomal deletion mutations due to unnecessary recombination. The risk of causing this is reduced.
  • any of the mutant loxP sequences may be arranged on the 5 ′ side and 3 ′ side of the vector element, but the mutation site is mutated so that the mutation site is located at the outer end of the loxP sequence. It is necessary to insert the loxP sequence.
  • the two loxP sequences are the 5 'and 3' sides of the vector elements necessary for replication of the reprogramming gene (ie, the gene sequence encoding the replication origin or a protein that binds to the replication origin and controls replication). Are arranged in the same direction.
  • the vector element sandwiched by the loxP sequence may be either one of the replication origin, the gene sequence encoding the protein that binds to the replication origin and controls replication, or both.
  • Episomal vectors can be introduced into cells using, for example, lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method and the like. Specifically, for example, the methods described in Science, 324: 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1 or Nature Methods, 8 (5), 409-412 (2011) can be used.
  • Whether or not the vector element necessary for replication of the reprogramming gene has been removed from the iPS cell is determined by using a nucleic acid containing a base sequence in the vector element and / or in the vicinity of the loxP sequence as a probe or primer. It can be carried out by conducting Southern blot analysis or PCR analysis using the isolated episomal fraction as a template and examining the presence or absence of the band or the length of the detection band (WO 2011/016588 A1, Nature Methods, 8 (5) , See 409-412 (2011)). Episomal fractions may be prepared using methods well known in the art.For example, Science, 324: 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1, Nature Methods, 8 (5), 409-412 ( 2011) etc. can be used.
  • the nuclear reprogramming substance that can induce iPS cells by combining with c-Myc is a low molecular weight compound
  • introduction of the substance into somatic cells can be achieved by dissolving the substance in an aqueous or non-aqueous solvent at an appropriate concentration.
  • MEM minimal essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI1640 medium suitable for culturing somatic cells isolated from humans or mice
  • the concentration of the nuclear reprogramming substance varies depending on the type of the nuclear reprogramming substance used, but is appropriately selected within the range of about 0.1 nM to about 100 nM.
  • the contact period is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the nuclear reprogramming of the cells to be achieved, but it is usually sufficient that the contact period coexists in the medium until a positive colony appears.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • trichostatin Nucleic acid expression inhibitors such as A, sodium butyrate
  • small molecule inhibitors such as MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg, HDAC1 siRNA Smartpool O (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.) Etc.]
  • G9a histone methyltransferase inhibitors for example, small molecule inhibitors such as BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), siRNA and shRNA against G9a (eg, G9a siRNA (human) ( Nucleic acid expression inhibitors such as Santa Cruz Biotechnology)], L-calcium channel agonist (eg Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3,
  • the nucleic acid expression inhibitor may be in the form of an expression vector containing DNA encoding siRNA or shRNA.
  • SV40 large T is not an essential factor for somatic cell nuclear reprogramming, but is an auxiliary factor. It can also be included in a category.
  • auxiliary factors other than those essential for nuclear reprogramming are positioned as nuclear reprogramming substances or substances that improve the establishment efficiency of iPS cells. It may be convenient.
  • the nuclear reprogramming process of somatic cells is regarded as an overall event caused by the contact of somatic cells with the nuclear reprogramming substance and the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells. There will be no gender.
  • Contact of the iPS cell establishment efficiency improving substance with the somatic cell may be carried out when the substance is (a) a protein factor, (b) a nucleic acid encoding the protein factor, or (c) a low molecular weight compound.
  • the nuclear initialization material can be carried out by the same method as described above.
  • the iPS cell establishment efficiency improving substance may be brought into contact with the somatic cells simultaneously with the nuclear reprogramming substance. Alternatively, either one may be contacted first.
  • the nuclear reprogramming substance is a nucleic acid encoding a proteinous factor
  • the substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is a chemical inhibitor
  • the former removes the proteinous factor from the gene transfer treatment.
  • a substance that improves the establishment efficiency of iPS cells is added to the medium can do.
  • a nuclear reprogramming substance and an iPS cell establishment efficiency improving substance are used in the form of a viral vector, a plasmid vector, or an episomal vector, both are introduced into the cell simultaneously. Also good.
  • the iPS cell establishment efficiency can be further improved by culturing cells under hypoxic conditions in the somatic cell nuclear reprogramming step.
  • the “hypoxic condition” means that the oxygen concentration in the atmosphere when cells are cultured is significantly lower than that in the air. Specifically, the oxygen concentration condition is lower than the oxygen concentration in the atmosphere of 5-10% CO 2 / 95-90% air generally used in normal cell culture. For example, oxygen in the atmosphere Conditions with a concentration of 18% or less apply.
  • the oxygen concentration in the atmosphere is 15% or less (eg, 14% or less, 13% or less, 12% or less, 11% or less, etc.), 10% or less (eg, 9% or less, 8% or less, 7% or less) 6% or less), or 5% or less (eg, 4% or less, 3% or less, 2% or less, etc.).
  • the oxygen concentration in the atmosphere is preferably 0.1% or more (eg, 0.2% or more, 0.3% or more, 0.4% or more), 0.5% or more (eg, 0.6% or more, 0.7% or more, 0.8% or more, 0.95 Or 1% or more (eg, 1.1% or more, 1.2% or more, 1.3% or more, 1.4% or more, etc.).
  • a method for creating a hypoxic state in the cell environment is not particularly limited, but a method of culturing the cells in a CO 2 incubator in which the oxygen concentration can be adjusted is the easiest and is a preferable example.
  • CO 2 incubators with adjustable oxygen concentration are sold by various equipment manufacturers (for example, CO for low oxygen culture by manufacturers such as Thermo scientific, Ikemoto Rika Kogyo, Toji Field, and Waken Pharmaceutical Co., Ltd.) 2 incubators can be used).
  • the time when cell culture is started under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%).
  • the contact may be before the contact with the reprogramming substance, at the same time as the contact, or after the contact. For example, immediately after the somatic cell is contacted with the nuclear reprogramming substance, or the contact It is preferable to culture under hypoxic conditions after a certain period of time (for example, 1 to 10 (eg, 2,3,4,5,6,7,8 or 9) days).
  • the period for culturing cells under hypoxic conditions is not particularly limited as long as it does not prevent the establishment efficiency of iPS cells from being improved compared to the case of normal oxygen concentration (20%). Examples include, but are not limited to, a period of 7 days or more, 10 days or more, 50 days or less, 40 days or less, 35 days or less, or 30 days or less.
  • a preferable culture period under low oxygen conditions varies depending on the oxygen concentration in the atmosphere, and those skilled in the art can appropriately adjust the culture period according to the oxygen concentration used. In one embodiment, when selection of iPS cell candidate colonies is performed using drug resistance as an index, it is preferable to return from a low oxygen condition to a normal oxygen concentration before drug selection is started.
  • the preferred time and preferred culture period for starting cell culture under hypoxic conditions vary depending on the type of nuclear reprogramming substance used, iPS cell establishment efficiency under normoxic conditions, and the like.
  • the cells can be cultured under conditions suitable for culturing ES cells, for example.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • STO cell lines (ATCC CRL-1503) are usually used as MEFs.
  • SNL cells SNL76 / 7 STO cells
  • ECACC 07032801 McMahon, AP & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)
  • the co-culture with feeder cells may be started before the contact with the nuclear reprogramming substance, or may be started at the time of the contact or after the contact (for example, after 1-10 days).
  • the cells are cultured without any non-human animal-derived components (ie, under completely xeno-free conditions) ), It is possible to produce human iPS cells.
  • cells are derived from FBS or other non-human animals after contact with a nuclear reprogramming substance (and, if necessary, a substance that improves iPS cell establishment efficiency). Cultivated in medium without ingredients.
  • a human-derived purified protein preferably a recombinant protein
  • feeder cells any human-derived somatic cells can be used.
  • human dermal fibroblasts (HDF) and human dental pulp stem cells can be preferably used.
  • HDF human dermal fibroblasts
  • a commercially available xeno-free coating agent can be used instead of matrigel or gelatin as the coating agent for the cell container.
  • the selection of iPS cell candidate colonies includes a method using drug resistance and reporter activity as indicators and a method using visual morphological observation.
  • Examples of the former include a drug resistance gene and / or a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (for example, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4).
  • a recombinant cell targeted with a reporter gene is used to select colonies positive for drug resistance and / or reporter activity.
  • Such recombinant cells include, for example, MEF (Takahashi & naka Yamanaka, Cell, 126, 663) derived from a mouse in which a ⁇ geo (encoding a fusion protein of ⁇ -galactosidase and neomycin phosphotransferase) gene is knocked in at the Fbx15 locus. -676 (2006)), or MEFs derived from transgenic mice incorporating the green fluorescent protein (GFP) gene and puromycin resistance gene at the Nanog locus (Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) Etc.
  • MEF green fluorescent protein
  • examples of a method for selecting candidate colonies by visual morphological observation include the methods described in Takahashi et al., Cell, 131, 861-872-8 (2007).
  • a method using a reporter cell is simple and efficient, when iPS cells are produced for the purpose of human therapeutic use, visual colony selection is desirable from the viewpoint of safety.
  • a Zscan family member is introduced into a somatic cell in the form of a nucleic acid, and as a nuclear reprogramming substance capable of inducing iPS cells by combining with c-Myc, at least a Klf family member (eg, Klf4) is in a somatic cell in the form of a nucleic acid.
  • a Klf family member eg, Klf4
  • the iPS cells obtained are new cells that differ from conventionally known iPS cells in that they contain these exogenous nucleic acids.
  • the exogenous nucleic acid when introduced into a somatic cell using a retrovirus, a lentivirus or the like, the exogenous nucleic acid is usually incorporated into the genome of the resulting iPS cell, and therefore contains the exogenous nucleic acid. This trait is stably maintained.
  • the iPS cells thus established can be used for various purposes.
  • differentiation induction methods reported for pluripotent stem cells such as ES cells eg, differentiation induction methods for neural stem cells are disclosed in JP-A-2002-291469, and differentiation induction methods for pancreatic stem-like cells are Examples of methods for inducing differentiation into hematopoietic cells include the methods described in JP 2003-505006 and other methods for inducing differentiation by formation of embryoid bodies. The method described in 2003-523766 is exemplified.
  • To differentiate iPS cells into various cells eg, cardiomyocytes, blood cells, nerve cells, vascular endothelial cells, insulin secreting cells, etc.). Can be guided.
  • iPS cells are induced using somatic cells collected from the patient or another person who has the same or substantially the same type of HLA
  • the desired cells ie, the organ in which the patient is affected
  • Stem cell therapy based on autologous transplantation or allogeneic transplantation, such as differentiation into cells and cells that exhibit therapeutic effects on diseases, etc., and transplantation into the patient becomes possible.
  • functional cells differentiated from iPS cells eg, hepatocytes
  • drug candidates It can also be suitably used for in vitro screening of the efficacy and toxicity of compounds.
  • Example 1 Screening of novel reprogramming factor Human Gateway O entry clone prepared by Goshima et al. (Using the library described in N. Goshima et al., Nature methods, 2008. Y. Maruyama et al., Nucleic Acid Res. , 2009 database), about 20,000 clones of human comprehensive genes were aligned by the method shown in FIG. In other words, about 50,000 clones including full-length ORF in human Gateway O entry clones were subjected to blastp search based on NCBI RefSeq 37,900 sequences (24,200 genes) with a coverage of 80% or more and amino acid identity of 95% or more.
  • a sub-library consisting of approximately 20,000 entry clones with no sequence duplication was constructed in each type of N-type having a stop codon at the 3 ′ end and F-type not having a stop codon.
  • This aligned 20,000-entry clone is classified into protein kinases, protein phosphatases, transcription factors, GPCRs, and other clone groups using bioinformatics techniques, and a sub-library consisting of entry clones of transcription factors (all human transcription factors) (Over 50% of the cover) was constructed (Fig. 1).
  • the number of retroviruses used for initialization was 2.5 x 10 6 per 100 mm culture dish (Falcon) the day before and 2.5 x 10 4 per well for the 96-well plate (Falcon).
  • Each pMXs expression vector described above was individually introduced into seeded Plat-E cells (Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000)).
  • the culture solution was DMEM / 10% FBS (DMEM (Nacalai tesque) added with 10% fetal calf serum) and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • IPS cell induction experiment was performed using MEFs derived from Nanog-GFP mice (Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) and 96-well plate as the 1st screening.
  • MEFs derived from Nanog-GFP mice were seeded on a 96-well plate at 800 per well.
  • DMEM / 10% FBS was used and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • infection was made with retroviruses prepared from various expression vectors (Day 0).
  • 3 genes of human OCT3 / 4, SOX2 and KLF4 and 1 gene from the aforementioned human transcription factor expression library or kinase expression library were infected at a ratio of 1: 1: 1: 1.
  • As a negative control three genes OCT3 / 4, SOX2 and KLF4 were infected at a ratio of 1: 1: 1.
  • OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC 4 genes were infected at a ratio of 1: 1: 1: 1.
  • the day after virus infection (Day 1), the retrovirus solution was removed, replaced with DMEM / 10% FBS, and cultured on DMEM / 10% FBS until the third day of infection.
  • feeder cells were seeded on 96-well plate in which MEF was cultured. SNL cells (McMahon, cA. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) treated with mitomycin C to stop cell division were used as feeder cells.
  • ES cell medium (DMEM Na (Nacarai tesque) 15% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine (Invitrogen), 100 ⁇ M non-essential amino acid (Invitrogen), 100 ⁇ M 2-mercaptoethanol ( Invitrogen), 50 / mL penicillin (Invitrogen) and 50 ⁇ g / mL streptomycin (Invitrogen), Cell, 126, 663-676 (2006)) were used. Thereafter, the ES cell medium was changed every two days. Drug selection using puromycin was performed from Day 21, and the number of GFP positive colonies was counted on Day 28. As a result, about 430 genes out of about 1,700 genes screened, more GFP positive colonies were observed than the negative control.
  • 2nd screening was performed for about 430 genes.
  • the 2nd screening was performed in the same manner as the 1st screening by seeding MEFs derived from Nanog-GFP mice at 3,300 per 1 well using a 24-well plate. Criteria were determined that (1) the number of GFP-positive colonies was larger than that of the negative control, and (2) the colony morphology was dome-shaped and the outer edge was clear. As a result, the 80 genes shown in FIG. 3 were found to satisfy this criterion, and were found to be novel reprogramming factors that could replace c-Myc.
  • Example 2 Activity of promoting the efficiency of establishment of iPS cells by ZSCAN4 factor Regarding human ZSCAN4 (Zinc finger and SCAN domain containing 4), which is one of the factors obtained by the 2nd screening, human c-MYC and GLIS1 (Nature, 474, 225) -229 (2011) doi: 10.1038 / nature10106) and iPS cell establishment efficiency promoting activity were compared.
  • the combinations of human genes used for the introduction are shown below.
  • OCT3 / 4, SOX2, KLF4 (negative control) (OSK) OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC (positive control) (OSKM)
  • OCT3 / 4, SOX2, KLF4, ZSCAN4 (OSKZ) OCT3 / 4, SOX2, KLF4, GLIS1 (OSKG)
  • the iPS cell induction experiment was performed in the same manner as in Example 1 by seeding 1 ⁇ 10 3 or 1.5 ⁇ 10 3 Nanog-GFP mouse-derived MEF per well of a 96-well plate (Thermo Fisher Scientific). However, this time, selection with puromycin was not performed, and the number of GFP positive cells was measured with POWERSCAN4 (DS Pharma Biomedical) from day 14 to day 17 after infection (Day 0). The results are shown in FIGS. In combination with OCT3 / 4, SOX2 and KLF4, it was revealed that ZSCAN4 has iPS cell induction activity (iPS cell establishment efficiency promoting activity) equivalent to or higher than GLIS1.
  • Example 3 Activity of promoting iPS cell establishment efficiency by ZSCAN4 factor
  • the iPS cell establishment efficiency promoting activity of ZSCAN4 was compared under the same conditions as in Example 2.
  • the combinations of human genes used for the introduction are shown below.
  • Example 2 were seeded 96-well 1 well per 1.5 ⁇ 10 3 cells or 2.0x10 3 pieces of Nanog-GFP mice-derived MEF of plate, the iPS cell induction was carried out in the same manner as in Example 1. However, on the next day of infection, feeder cells are seeded on a 96-well plate in which MEF is cultured, and from the second day of infection (Day 2), the culture medium is switched to the mouse ES cell culture medium. The medium for ES cells was changed. The iPS cell induction efficiency was determined by measuring the number of GFP positive cells with POWERSCAN4 on the 14th to 17th days after infection (Day 0), as in Example 2. The results are shown in FIGS.
  • Example 4 Activity of promoting iPS cell establishment efficiency by inhibition of ZSCAN4 factor and p53
  • the activity of inducing iPS cells by the combination of ZSCAN4 and / or GLIS1 and inhibition of p53 was examined.
  • iPS cell induction was performed using a p53-deficient Nanog-GFP mouse-derived MEF (p53-null MEF).
  • p53-null MEF is a p53 gene having a Nanog reporter, obtained by producing a knockout mouse in which exon5 of the p53 gene is replaced with a neomycin resistance gene and mating with a Nanog reporter mouse according to the method described in International Publication WO2009 / 157593.
  • ZSCAN4 has a higher iPS cell-inducing activity (iPS cell) than OCT3 / 4, SOX2 and KLF4 alone when combined with OCT3 / 4, SOX2 and KLF4. Activity for promoting establishment efficiency). Furthermore, it has been clarified that the combination of ZSCAN4 and GLIS1 enhances iPS cell induction activity (iPS cell establishment efficiency promoting activity).
  • Example 5 iPS cell establishment efficiency promoting activity by ZSCAN4 factor (iPS cell establishment from keratinocytes) IPS cells were established using keratinocytes (epidermal keratinocytes) derived from human epidermis, and the iPS cell establishment efficiency promoting activity by ZSCAN4 was examined.
  • the combinations of human genes used for the introduction are shown below.
  • human epidermis-derived keratinocytes purchased from Cell Applications were seeded on a 6-well plate at a rate of 0.4 ⁇ 10 5 cells per well.
  • a keratinocyte medium (Cell Applications) was used as a culture solution, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • retroviruses prepared from various expression vectors were infected by spinfection (rotated at 1000 g for 30 minutes at 32 ° C.) (Day 0).
  • the day after virus infection (Day 1) SNL cells treated with mitomycin C to stop cell division were seeded as feeder cells, and cultured on days 3, 5 and 7 with the keratinocyte medium replaced. From day 9 of infection (Day 9), the culture medium was switched to a medium for human ES cells (ReproCell), and thereafter the medium for human ES cells was changed every day.

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Abstract

　本発明は、iPS細胞誘導剤としてのc-Mycの代替因子としての、Zscanファミリーのメンバー（例: ZSCAN4）またはそれをコードする核酸を提供する。本発明はまた、上記Zscanファミリーメンバーと、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とを、体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法を提供する。さらに、該方法により得られうる、ZscanファミリーメンバーおよびKlfファミリーメンバーをコードする外来性核酸を含むiPS細胞、該iPS細胞に分化を誘導することによる体細胞の製造方法も提供される。

Description

核初期化物質
　本発明は、新規核初期化物質およびその用途に関する。より詳細には、本発明は、c-Mycの代替となり得る新規核初期化物質、並びにそれを用いた人工多能性幹（以下、iPSという）細胞の樹立方法に関する。
発明の背景
　近年、マウスおよびヒトのiPS細胞が相次いで樹立された。Yamanakaらは、マウスおよびヒト由来の線維芽細胞に、Oct3/4, Sox2, Klf4およびc-Myc遺伝子を導入し強制発現させることによって、iPS細胞を誘導した（特許文献１、非特許文献１および２）。その後、iPS細胞から分化した組織や個体において腫瘍化が懸念されるc-Myc遺伝子を除いた3因子（Oct3/4, Sox2, Klf4）のみでもiPS細胞を作製できることが明らかとなった（特許文献１、非特許文献３）。しかし、c-Mycを除く3因子によってiPS細胞を作製した場合、その樹立効率が極めて低いという問題があった。そこで、c-Mycを用いることなくiPS細胞の樹立効率を高めるための様々な試みがなされてきた（例えば、特許文献２～６を参照）。
　本発明者らは、転写因子、受容体または酵素等のヒト遺伝子ライブラリーの中から、Klf4の代替因子としてiPS細胞を樹立することができる遺伝子を網羅的に探索した結果、Irxファミリーのメンバー（例：IRX6）、Glisファミリーに属する遺伝子(例：GLIS1)、Ptxファミリーに属する遺伝子(例：PITX2)、またはDMRT-like family B with proline-rich C-terminal, 1遺伝子（DMRTB1）を、Oct3/4, Sox2およびc-Mycの3遺伝子とともにマウスおよびヒトの皮膚由来線維芽細胞に導入した場合にiPS細胞を効率よく樹立することができたことから、これらの転写因子を、Klf4を代替し得る新規核初期化因子として同定したが（特許文献７）、これらのうちGlisファミリーメンバー(例：GLIS1)は、Klf4と併用することにより、マウスおよびヒト細胞のいずれに対してもiPS細胞樹立に関して劇的な相乗効果を示したことから、Glisファミリーメンバーは、むしろc-Mycの代替因子としてc-Mycと同等以上にiPS細胞樹立効率を高める機能があることが明らかとなった（特許文献８、非特許文献４）。
国際公開第2007/069666号 国際公開第2009/157593号 国際公開第2010/013845号 国際公開第2010/016588号 国際公開第2011/037270号 国際公開第2011/055851号 国際公開第2010/098419号 国際公開第2011/102531号
Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007) Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008) Maekawa, M. et al., Nature, 474: 225-229 (2011)
発明の要約
　本発明の目的は、新規核初期化物質、特にc-Mycの代替となり得る新規核初期化物質を同定し、それを用いた新規なiPS細胞の樹立方法を提供することである。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく、WO 2010/098419に記載される方法と同様にして、広く、受容体または酵素等のヒト遺伝子ライブラリーの中から、c-Mycの代替因子としてiPS細胞を樹立することができる遺伝子を網羅的に探索した。その結果、図3に示される80種の遺伝子のいずれかを、Oct3/4, Sox2およびKlf4の3遺伝子とともにマウス胎児線維芽細胞（MEF）に導入した場合に、iPS細胞を効率よく樹立することができた。これらのうち、Zinc finger and SCAN domain containing 4（Zscan4）について、c-MycおよびGlis1とiPS細胞誘導活性を比較したところ、特にZscan4はGlis1と同等もしくはそれ以上にiPS細胞を誘導し得ることが明らかとなった。本発明者らは、これらの知見に基づいて、Zscan4をc-Mycを代替し得る新規核初期化因子として同定し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
[1] 以下の(a)および(b):
(a) Zscan4またはそれをコードする核酸
(b) c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
を体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法。
[2]前記(b)の物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klfファミリーのメンバー、Glisファミリーのメンバー、NanogおよびLinファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、上記[1]記載の方法。
[3] 前記(b)の物質がOct3/4またはそれをコードする核酸である、上記[1]記載の方法。
[4] 前記(b)の物質がOct3/4およびSox2、またはそれらをコードする核酸を含む、上記[1]記載の方法。
[5] 前記(b)の物質がOct3/4およびKlf4、またはそれらをコードする核酸を含む、上記[1]記載の方法。
[6] 前記(b)の物質がOct3/4、Sox2およびKlf4、またはそれらをコードする核酸を含む、上記[1]記載の方法。
[7] 前記(b)の物質がOct3/4、Sox2、Klf4およびGlis1、またはそれらをコードする核酸を含む、上記[1]記載の方法。
[8] p53阻害剤を体細胞へ接触させる工程をさらに含む、上記[1]記載の方法。
[9] 前記体細胞がヒト細胞である、上記[1]記載の方法。
[10] 以下の(a)および(b):
(a) Zscan4またはそれをコードする核酸
(b) c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤。
[11] Zscan4をコードする外来性核酸を含む、iPS細胞。
[12] Klf4ファミリーのメンバーをコードする外来性核酸をさらに含む、上記[11]記載のiPS細胞。
[13] 前記外来性核酸がゲノムに組み込まれている、上記[11]記載のiPS細胞。
[14] 上記[11]記載のiPS細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させることを含む、体細胞の製造方法。
[15] Zscan4またはそれをコードする核酸を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤であって、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、剤。
[16] iPS細胞の製造のための、Zscan4またはそれをコードする核酸の使用であって、該物質が、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、使用。
[17] 体細胞からのiPS細胞の誘導剤としての、Zscan4またはそれをコードする核酸であって、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、物質。
[18] 体細胞の製造における、上記[11]記載のiPS細胞の使用。
[19] 体細胞の製造における細胞ソースとしての、上記[11]記載のiPS細胞。
　Zscanファミリーのメンバーは、核初期化においてc-Mycを代替し得るので、c-Mycによる腫瘍化リスクを回避しつつ効率よくiPS細胞を樹立することができ、例えば、自家移植によるヒト移植医療への応用に有用である。
図１は、ヒトGatewayOエントリークローン（N. Goshima et al., Nature methods, 2008）から機能別エントリークローンを絞り込むまでのステップを示した概念図である。 図２は、転写因子のエントリークローンから体細胞初期化因子スクリーニング用の転写因子ライブラリーを作製した手順を示す図である。 図３は、2ndスクリーニングでヒットした80遺伝子の名称である。 図４は、ウイルス感染から14日目（Day14）の、ZSCAN4、c-MYCおよびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図５は、ウイルス感染から15日目（Day15）の、ZSCAN4、c-MYCおよびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図６は、ウイルス感染から16日目（Day16）の、ZSCAN4、c-MYCおよびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図７は、ウイルス感染から17日目（Day17）の、ZSCAN4、c-MYCおよびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図８は、ウイルス感染から14日目（Day14）の、ZSCAN4、c-MYCおよびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図９は、ウイルス感染から15日目（Day15）の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図１０は、ウイルス感染から16日目（Day16）の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図１１は、ウイルス感染から17日目（Day17）の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図１２は、ウイルス感染から7日目（Day7）の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図１３は、ウイルス感染から8日目（Day8）の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図１４は、ウイルス感染から9日目（Day9）の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図１５は、ウイルス感染から10日目（Day10）の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味し、OSKGは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびGLIS1の導入を意味し、OSKZは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびZSCAN4の導入を意味し、OSKGZは、OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1およびZSCAN4の導入を意味する。なお、図中の縦軸は、蛍光強度（Mean Relative Fluorescence Units: RFU)を示す。値は8 well分のMean RFUの平均値である。 図１６は、ウイルス感染から29日目の、ZSCAN4、c-MYC、およびGLIS1のiPS細胞誘導活性を比較した結果を示すグラフである。図中、上段は、SSEA-4の免疫染色蛍光像を示し、下段はALP染色像を示す。OSKは、OCT3/4、SOX2およびKLF4の導入を意味し、OSKMは、OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの導入を意味する。また、括弧内の数字は計測されたコロニー数を意味する。
発明の詳細な説明
　本発明は、c-Mycの代替となり得る核初期化物質であるZscanファミリーメンバー、並びに該物質と、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる核初期化物質とを体細胞に導入することによる、iPS細胞の製造方法を提供する。
　(a) Zscanファミリーメンバー（c-Mycの代替因子）
　本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。本発明により同定されたc-Mycを代替し得る核初期化物質は、図3に示されるいずれかのタンパク質またはそれをコードする核酸である。
　Zscanファミリーメンバーとは、SCANボックスおよび約4個のC2H2型 Zincフィンガー領域を含む構造を有し、例えば、Zscan1、Zscan2、Zscan3、Zscan4、Zscan5およびZscan6などが例示される。
　Zscanファミリーのメンバーとしては、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）由来のタンパク質またはそれをコードする核酸を用いることができるが、ヒトまたはマウス由来のものが好ましい。本発明において、好ましいZscanファミリーメンバーとして、Zscan4（zinc finger and SCAN domain containing 4）が例示される。Zscan4は、テロメアに含まれるタンパク質をコードする遺伝子であり、ES細胞でのテロメアとゲノムの安定性維持にかかわっていることがこれまでに明らかにされている（Nature, 464, 858-863 (2010)、WO2011/028880）。ヒトおよびマウス由来のZscan4のアミノ酸配列およびcDNA配列情報は、表1に記載されるNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ、当業者は、該cDNA配列情報に基づいて容易に各タンパク質をコードする核酸を単離し、また必要に応じて、組換えタンパク質を製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　また、上記の各アミノ酸配列と90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有し、且つc-Mycの代替因子として野生型Zscan4と同等の核初期化能力を有する天然もしくは人工の変異タンパク質およびそれをコードする核酸も、本発明のZscan4として利用することができる。
　Zscanファミリーのメンバー（それをコードする核酸を含む）は、いずれか1種のみを用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
　(b) c-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質
　これまで、体細胞からiPS細胞を誘導し得る核初期化物質の組み合わせの中でc-Mycを含むものとしては、以下の組み合わせが知られている（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。）
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
（以上、WO 2007/069666を参照（但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 Large T」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照）
(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research(2008) 600-603を参照）
(10) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 Large T（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
(11) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Glis1（Nature, 474, 225-229 (2011)も参照）
(12) Nr5a2, Klf4, c-Myc, Sox2（Cell Stem Cell, 6, 167-174 (2010)も参照）
　したがって、c-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質としては、上記(1)-(12)の組み合わせからc-Mycを除いた物質の組み合わせ、即ち、
(i) Oct3/4, Klf4
(ii) Oct3/4, Klf4, Sox2（Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能。c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能。）
(iii) Oct3/4, Klf4, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(iv) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40 Large T
(v) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6
(vi) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7
(vii) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(viii) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil
(ix) Oct3/4, Klf4, Sox2, Nanog, Lin28
(x) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40 Large T
(xi) Oct3/4, Klf4, Sox2, Glis1、並びに
(xii) Nr5a2, Klf4, Sox2
が好ましく例示される。上記(i)-(xii)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。また、Klf4に代えて他のKlfファミリーのメンバー（例: Klf1、Klf2、Klf5）もしくは公知のその代替因子（例: Esrrb、EsrrgなどのEsrrファミリーのメンバー、IRX1、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、IRX6などのIrxファミリーのメンバー、GLIS1、GLIS2、GLIS3などのGlisファミリーのメンバー、PITX1、PITX2、PITX3などのPtxファミリーのメンバー、DMRTB1）などを用いることもできる。
　以上を総合すると、c-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質は、好ましくは、Octファミリーのメンバー（例: Oct3/4、Oct1A、Oct6）、Soxファミリーのメンバー（例: Sox2、Sox1、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18）、Klfファミリーのメンバー（例: Klf4、Klf1、Klf2、Klf5）、NanogおよびLinファミリーのメンバー（例: Lin28、Lin28b）から選択される。より好ましくは、少なくともOct3/4を含み、かつ任意でSox2および/またはKlf4を含んでいてもよい組み合わせ（即ち、(a) Oct3/4、(b) Oct3/4+Sox2、(c) Oct3/4+Klf4、(d) Oct3/4+Sox2+Klf4のいずれか）が挙げられ、これにさらにNanogおよび/またはLin28を組み合わせて用いてもよい。
　さらに、上記(i)-(xii)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。例えば、他の物質として、c-Myc以外のMycファミリーのメンバー（例: L-Myc、N-Myc）もしくは公知のその代替因子（例: GLIS1、GLIS2、GLIS3などのGlisファミリーのメンバー）等を組み合わせてもよい。ここで、「c-Mycの代替因子」とは、例えば上記(i)-(xii)の核初期化物質の組み合わせに基づき得られるiPS細胞誘導活性（誘導活性がない場合も含む）に比べて、それぞれにその因子を加えることでiPS細胞誘導活性が高くなる因子であればよく、必ずしもc-Mycを含有する上記(1)-(12)の核初期化物質の組み合わせに基づき得られるiPS細胞誘導活性よりも強くなることを意味しない。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(i)-(x)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「c-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
　これらの組み合わせの中で、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3/4およびSox2の2因子の組み合わせ、またはOct3/4、Sox2およびKlf4の3因子の組み合わせが好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など)は、Oct3/4, Klf4, Sox2およびLin28の4因子か、それにNanogを加えた5因子が好ましい。
　上記の各タンパク性因子のマウスおよびヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28B、Esrrb、Esrrg、L-Myc、Nr5a2のマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子名　　マウス　　　　　ヒト　　　
Lin28　　　 NM_145833　　　NM_024674
Lin28b　　　NM_001031772　 NM_001004317
Esrrb　　　 NM_011934　　　NM_004452
Esrrg　　　 NM_011935　　　NM_001438
L-Myc　　　 NM_008506　　　NM_001033081
Nr5a2　　　 NM_030676　　　NM_003822
　核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクター、エピソーマルベクターもしくはプラスミドベクターに挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
　尚、c-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質としては、c-Mycとともに体細胞に導入した場合に該体細胞をiPS細胞に変換し得る限り、上記した従来公知のタンパク性因子もしくはそれをコードする核酸の組み合わせのみならず、新たに見出されるタンパク性因子もしくはそれをコードする核酸の組み合わせをも包含し、さらには、低分子化合物等の非タンパク性因子を含む組み合わせも包含し得る。
　(c) 体細胞ソース
　本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。特に歯髄幹細胞は、智歯や歯周病等で抜いた歯から単離、調製することができるため、入手が容易であり、今後、iPS細胞バンクのための体細胞ソースとしての利用が期待される。また血液細胞（末梢単核細胞、末梢血リンパ球、臍帯血細胞など）も、入手が容易でありかつ侵襲を伴わないため、同様にiPS細胞バンクのための体細胞ソースとしての利用が期待される。
　体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体は特に制限されないが、得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。たとえば主たるHLA(例えばHLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、さらにHLA-Cwを含む4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。また、ヒトに投与（移植）しない場合、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとしてiPS細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取することが望ましい。
　哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、体細胞として歯髄幹細胞を用いる場合には、Mesenchymal stem cells basal medium (Lonza社) などの間葉系幹細胞用培地を用いることが好ましい。核初期化物質（さらに必要に応じて、後述するiPS細胞の樹立効率改善物質）との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
　(d) 核初期化物質の体細胞への導入方法
　前記(a)のZscanファミリーメンバーおよび前記(b)の「c-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質」の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）もしくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）およびProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide（Q biogene）およびChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコールに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で１ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
　PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT(Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynBl (Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R (Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)) や9R (Cell Stem Cell, 4:472-476(2009))等のポリアルギニンが挙げられる。
　核初期化物質のcDNAとPTD配列もしくはCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
　マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
　その他、エレクトロポレーション法、セミインタクトセル法（Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365(2006))、Wr-t ペプチドによる導入法（Kondo, E. et al., Mol. Cancer Ther. 3(12), 1623-1630(2004))などのタンパク質導入法も用いることができる。
　タンパク質導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下等）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回または4回）繰り返して行うことができる。導入操作を繰り返し行う場合の間隔としては、例えば6～48時間、好ましくは12～24時間が挙げられる。
　iPS細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化物質を、タンパク性因子自体としてではなく、それをコードする核酸の形態で用いることがむしろ好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
　核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）などが用いられ得る。
　発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばEF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
　発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　核初期化物質である核酸（初期化遺伝子）は、各々別個の発現ベクター上に組み込んでもよいし、1つの発現ベクターに2種類以上、好ましくは2～3種類の遺伝子を組み込んでもよい。遺伝子導入効率の高いレトロウイルスやレンチウイルスベクターを用いる場合は前者が、プラスミド、アデノウイルス、エピソーマルベクターなどを用いる場合は後者を選択することが好ましい。さらに、2種類以上の遺伝子を組み込んだ発現ベクターと、1遺伝子のみを組み込んだ発現ベクターとを併用することもできる。
　上記において複数の初期化遺伝子を1つの発現ベクターに組み込む場合、これら複数の遺伝子は、好ましくはポリシストロニック発現を可能にする配列を介して発現ベクターに組み込むことができる。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。
　核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat-E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が WO2007/69666、Cell, 126, 663-676 (2006) および Cell, 131, 861-872 (2007) に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917-1920 (2007) に開示がある。iPS細胞を再生医療のための細胞ソースとして利用する場合、初期化遺伝子の発現（再活性化）は、iPS細胞由来の分化細胞から再生された組織における発癌リスクを高める可能性があるので、初期化遺伝子は細胞の染色体に組み込まれず、一過的に発現することが好ましい。かかる観点からは、染色体への組込みが稀なアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段は、Science, 322, 945-949 (2008) に記載されている。また、アデノ随伴ウイルスも染色体への組込み頻度が低く、アデノウイルスベクターと比べて細胞毒性や炎症惹起作用が低いので、別の好ましいベクターとして挙げられる。センダイウイルスベクターは染色体外で安定に存在することができ、必要に応じてsiRNAにより分解除去することができるので、同様に好ましく利用され得る。センダイウイルスベクターについては、J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007) 、Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85, 348-362(2009)、または特許第3602058号に記載のものを用いることができる。
　レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre/loxPシステムを用いて、不要となった時点で核初期化物質をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後で、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー－プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、もしくはSV40などのポリアデニル化配列で置換した3’-自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre-loxPシステムおよびSIN LTRを用いる具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009) に開示されている。
　一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949-953 (2008) 等に記載されている。
　プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は１回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、または1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上(たとえば3回または4回)繰り返して行うことができる。
　尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre-loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)、Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009) に開示されている。
　別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピソーマルベクターが挙げられる。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)、WO 2011/016588 A1またはNature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等に開示されている。必要に応じて、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターに初期化遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、これを体細胞に導入することもできる。
　該エピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。あるいは、pEPI-based vectors由来のS/MAR配列やヒト人工染色体のためのα-satellite DNAを自律複製に必要なベクター要素として用いることもできる（Mol Ther 16(9), 1525-1538 (2008)）。
　また、エピソーマル発現ベクターは、初期化遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピソーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、哺乳動物細胞での選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。また、所望により、大腸菌などの細菌や酵母での大量増幅を可能にするために、細菌や酵母の複製起点（例えば、pUC ori、ColE1 ori、2μ ori等）と選択マーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子）などをさらに含有していてもよい。
　本発明で使用されるloxP配列としては、バクテリオファージP1由来の野生型loxP配列の他、初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素を挟む位置に同方向で配置された場合に、組換えを起こしてloxP配列間の配列を欠失させ得る任意の変異loxP配列が挙げられる。変異loxP配列としては、例えば、5’側反復配列に変異のあるlox71、3’側反復配列に変異のあるlox66、スペーサー部分に変異のあるlox2272やlox511などが挙げられる。該ベクター要素の5’側および3’側に配置される2つのloxP配列は、同一であっても異なっていてもよいが、スペーサー部分に変異のある変異loxP配列の場合は同一のもの（例、lox2272同士、lox511同士）が用いられる。好ましくは、5’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox71）と3’側反復配列に変異のある変異loxP配列（例、lox66）との組合せが挙げられる。この場合、組換えの結果染色体上に残るloxP配列は5’側および3’側の反復配列に二重変異を有するため、Creリコンビナーゼに認識されにくく、不必要な組換えにより染色体の欠失変異を起こすリスクが低減される。lox71とlox66とを用いる場合、前記ベクター要素の5’側および3’側にいずれの変異loxP配列を配置してもよいが、変異部位がloxP配列の外端に配置されるような向きで変異loxP配列を挿入する必要がある。
　2つのloxP配列は、初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素（即ち、複製開始点、または複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子配列）の5’側および3’側に、同方向に配置される。loxP配列が挟むベクター要素は、複製開始点、または複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子配列のいずれか一方だけであってもよいし、両方であってもよい。
　エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797-801 (2009)、WO 2011/016588 A1またはNature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等に記載される方法を用いることができる。
　iPS細胞から初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクター要素内部および／またはloxP配列近傍の塩基配列を含む核酸をプローブまたはプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析またはPCR分析を行い、バンドの有無または検出バンドの長さを調べることにより実施することができる（WO 2011/016588 A1、Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)参照）。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法と用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797-801 (2009)、WO 2011/016588 A1、Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等に記載される方法を用いることができる。
　c-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への導入は、該物質を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒトまたはマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5～20%の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1nM～約100nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
　(e) iPS細胞の樹立効率改善物質
　従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例、HDAC1 siRNA SmartpoolO (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNA及びshRNA（例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-calcium channel agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNA、shRNA、ドミナントネガティブ体など (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008); Nature 460, 1132-1135 (2009))）、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、細胞内シグナル伝達の修飾剤［例えば、Wnt Signaling活性化剤（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、TGF-βの阻害剤、MEK阻害剤、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signalling及びglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))］、他の天然もしくは合成低分子化合物（例、5’-azacytidine、thiazovivin、ビタミンC等）、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08、WO2009/075119)、miR-302 (RNA 14: 1-10 (2008))、miR-291-3p, miR-294及びmiR-295 (以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）等が挙げられるが、それらに限定されない。前記において核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
　尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質およびiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
　iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が(a) タンパク性因子である場合、(b) 該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは(c) 低分子化合物である場合に応じて、核初期化物質についてそれぞれ上記したと同様の方法により、実施することができる。
　iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクター、エピソーマルベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
　(f) 培養条件による樹立効率の改善
　体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下（例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など）、10%以下（例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など）、または5%以下（例、4%以下、3%以下、2%以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上（例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など）、0.5%以上（例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など）、または1%以上（例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など）である。
　細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
　低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への核初期化物質の接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2,3,4,5,6,7,8または9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
　低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上または10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下または30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
　さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期および好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
　(g) iPS細胞の選択および確認
　核初期化物質（およびiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および／または幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の初代線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞株（ATCC CRL-1503）等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、STO細胞にネオマイシン耐性遺伝子とLIF遺伝子を安定に組み込んだSNL細胞（SNL76/7 STO細胞; ECACC 07032801）（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等もよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1-10日後）から開始してもよい。
　細胞への核初期化物質の導入から、iPS細胞を樹立し、さらにiPS細胞として維持するまでの間、非ヒト動物由来成分を一切用いずに培養して（即ち、完全xeno-freeの条件下で）、ヒトiPS細胞を作製することが可能である。xeno-freeの条件下でヒトiPS細胞を誘導する場合、核初期化物質（さらに必要に応じてiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞は、FBSや他の非ヒト動物由来成分を含まない培地中で培養される。分化抑制因子として培地に添加される物質（例、bFGF、SCF等）としては、ヒト由来の精製されたタンパク質、好ましくは組換えタンパク質が使用される。フィーダー細胞としては、ヒト由来の任意の体細胞を用いることができるが、例えばヒト皮膚線維芽細胞（HDF）やヒト歯髄幹細胞などが好ましく用いられ得る。また、フィーダー細胞を用いることなくヒトiPS細胞を誘導することも可能であり、この場合、細胞容器のコーティング剤として、マトリゲルやゼラチンに代えて市販のxeno-freeのコーティング剤を用いることができる。
　iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanogまたはOct3/4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子および／またはレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性および／またはレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)）、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。
　選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（もしくはOct3/4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）および目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確を期すために、アルカリフォスファターゼ染色や、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
　Zscanファミリーメンバーが核酸の形態で体細胞に導入され、且つc-Mycと組み合わせることによりiPS細胞を誘導しうる核初期化物質として、少なくともKlfファミリーメンバー（例：Klf4）が核酸の形態で体細胞に導入された場合、得られるiPS細胞は、これらの外来性核酸を含む点で、従来公知のiPS細胞とは異なる新規細胞である。特に、当該外来性核酸がレトロウイルスやレンチウイルス等を用いて体細胞に導入された場合、当該外来性核酸は通常、得られるiPS細胞のゲノム中に組み込まれているので、外来性核酸を含むという形質は安定に保持される。
　(h) iPS細胞の用途
　このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞などの多能性幹細胞で報告されている分化誘導法（例えば、神経幹細胞への分化誘導法としては、特開2002-291469、膵幹様細胞への分化誘導法としては、特開2004-121165、造血細胞への分化誘導法としては、特表2003-505006に記載される方法などがそれぞれ例示される。この他にも、胚葉体の形成による分化誘導法としては、特表2003-523766に記載の方法などが例示される。）を利用して、iPS細胞から種々の細胞（例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等）への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞（即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など）に分化させて該患者に移植するという、自家移植もしくは同種異系移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞（例、肝細胞）は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
　実施例１: 新規初期化因子のスクリーニング
　Goshimaらが作製したヒトGatewayOエントリークローン（N. Goshima et al., Nature methods, 2008記載のライブラリーを用いる。Y. Maruyama et al., Nucleic Acid Res., 2009でデータベース公開）をもとに、図１に記載の方法で、ヒトの網羅的遺伝子約20,000クローンを整列化した。即ち、ヒトGatewayOエントリークローン中全長ORFを含む約50,000クローンを、NCBI RefSeqの37,900配列（24,200遺伝子）に対してcoverage 80%以上、アミノ酸同一性95%以上の基準でblastp検索をかけ、ORFの3’末端に終止コドンを持つN-typeと、終止コドンを持たないF-typeの各type内で配列に重複のない、約20,000エントリークローンからなるサブライブラリーを構築した。この整列化した約20,000エントリークローンを、バイオインフォマティクス手法によりタンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、転写因子、GPCR、およびその他のクローン群に分類し、転写因子のエントリークローンからなるサブライブラリー（ヒトの全転写因子の50%以上をカバー）を構築した(図１）。この転写因子のサブライブラリーから、エントリークローンごとに、図２に示すようにpMXs-GWデスティネーションベクター（エントリークローンF-typeを使用の場合は、pMXs-GW-Stopを使用（pMXs-GW-Stop はpMXs-GWのattR2配列の直下にインフレームでStopコドンを挿入したデスティネーションベクター))とのLR反応により発現クローンDNAを作製し、この反応液を大腸菌DH5αに導入し、クローン化して、1,440遺伝子からなる転写因子発現ライブラリーを構築した。また同様にして、288遺伝子からなるキナーゼ発現ライブラリーを構築した。これら転写因子発現ライブラリーおよびキナーゼ発現ライブラリーの約1,700遺伝子を以降のスクリーニングに用いた。
　また、ヒトOCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYCの各遺伝子もpMXs-GWに組み込み、各発現ベクターを構築した。
　初期化に使用するレトロウイルスは、前日に100 mm培養ディッシュ (Falcon) については１枚当り2.5 x 106個で、96-well plate (Falcon) については1 well当り2.5 x 104個で、それぞれ播種したPlat-E細胞 (Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066 (2000)) に、前述の各pMXs発現ベクターを個々に導入して作製した。培養液はDMEM/10% FBS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎仔血清を10%加えたもの)を使用し、37℃、5% CO2で培養した。
　pMXs発現ベクターの導入のために100 mm培養ディッシュ1枚当たり FuGENE6 transfection reagent (Roche) 27 μLをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 300 μLに入れ、室温で5分間静置した。その後、各pMXs発現ベクターを9 μg加え、さらに室温で15分静置してからPlat-Eの培養液に加えた。96-well plateについては1 well当たり上記100 mm培養ディッシュの1/100量となるように調製した。2日目にPlat-Eの上清を新しい培地に換え、3日目に培養上清を回収して0.45 μm sterile filter (Whatman) で濾過し、polybrene (Nacalai) を4 μg/mLとなるように加えてレトロウイルス液とした。
　iPS細胞誘導実験は、Nanog-GFPマウス（Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)）由来のMEFを用い、1stスクリーニングとして96-well plateを用いて行った。
　Nanog-GFPマウス由来のMEFを96-well plateに1 well当り800個で播種した。培養液はDMEM/10% FBSを使用し、37℃、5% CO2で培養した。翌日、各種発現ベクターから作製したレトロウイルスを感染させた (Day0)。具体的にはヒトOCT3/4、SOX2およびKLF4の3遺伝子と、前述のヒト転写因子発現ライブラリーまたはキナーゼ発現ライブラリーからの１遺伝子とを、1:1:1:1の割合で感染させた。ネガティブコントロールとしてOCT3/4、SOX2およびKLF4の3遺伝子を1:1:1の割合で感染させた。またポジティブコントロールとしてOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCの4遺伝子を1:1:1:1の割合で感染させた。
　ウイルス感染の翌日 (Day1)、レトロウイルス液を除去し、DMEM/10% FBSに交換して感染3日目までDMEM/10% FBSで培養した。感染から3日目 (Day3)にMEFを培養している96-well plateに対してフィーダー細胞を播いた。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）を用いた。感染4日目(Day4) からES細胞用培地（DMEM (Nacarai tesque) に15% ウシ胎仔血清、2 mM L-グルタミン (Invitrogen)、100 μM 非必須アミノ酸 (Invitrogen)、100 μM 2-メルカプトエタノール (Invitrogen)、50 U/mL ペニシリン (Invitrogen) と50 μg/mL ストレプトマイシン(Invitrogen) を加えたもの、Cell, 126, 663-676 (2006)）を用いた。以後2日ごとにES細胞用培地の交換を行った。Day21からピューロマイシンを用いた薬剤選択を行い、Day28にGFP陽性コロニー数をカウントした。その結果、スクリーニングを行った約1,700遺伝子のうち約430遺伝子において、ネガティブコントロールより多くのGFP陽性コロニーが認められた。
　次に、これら約430遺伝子について2ndスクリーニングを行った。2ndスクリーニングは24-well plateを用いて1 well当り3,300個でNanog-GFPマウス由来のMEFを播種し、1stスクリーニングと同様の手法で行った。(1)GFP陽性コロニーの数がネガティブコントロールより多いこと、および(2)コロニーの形態がドーム形で外縁が明確であること、をクライテリアとして判定を行った。その結果、図３に示す80遺伝子が、このクライテリアを満たすことが明らかとなり、c-Mycの代替えとなる新規初期化因子であることが明らかとなった。
　実施例２:ZSCAN4因子によるiPS細胞樹立効率促進活性
　2ndスクリーニングで得られた因子の1つであるヒトZSCAN4（Zinc finger and SCAN domain containing 4)について、ヒトc-MYCおよびGLIS1（Nature, 474, 225-229 (2011) doi: 10.1038/nature10106）とのiPS細胞樹立効率促進活性の比較を行った。導入に用いたヒト遺伝子の組み合わせを以下に示す。
(1) OCT3/4、SOX2、KLF4（ネガティブコントロール） (OSK)
(2) OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC（ポジティブコントロール） (OSKM)
(3) OCT3/4、SOX2、KLF4、ZSCAN4 (OSKZ)
(4) OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1 (OSKG)
　iPS細胞誘導実験は、96-well plate（Thermo Fisher Scientific）の1 well当り1x103個または1.5x103個のNanog-GFPマウス由来のMEFを播種し、実施例1と同様の手法で行った。ただし今回はピューロマイシンによる選択は行わず、感染（Day0）から14日目～17日目にGFP陽性細胞の数をPOWERSCAN4（DSファーマバイオメディカル）で測定することにより行った。結果を図４～図７に示す。OCT3/4、SOX2およびKLF4と組み合わせることにより、ZSCAN4はGLIS1と同等もしくはそれ以上のiPS細胞誘導活性（iPS細胞樹立効率促進活性）を有することが明らかとなった。
　実施例３:ZSCAN4因子によるiPS細胞樹立効率促進活性
　実施例２と条件を変更し、ZSCAN4のiPS細胞樹立効率促進活性の比較を行った。導入に用いたヒト遺伝子の組み合わせを以下に示す。
(1) OCT3/4、SOX2、KLF4（ネガティブコントロール） (OSK)
(2) OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC（ポジティブコントロール） (OSKM)
(3) OCT3/4、SOX2、KLF4、ZSCAN4 (OSKZ)
(4) OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1 (OSKG)
(5) OCT3/4、SOX2、KLF4、ZSCAN4、GLIS1 (OSKZG)
　本実施例は、96-well plateの1 well当り1.5x103個または2.0x103個のNanog-GFPマウス由来のMEFを播種し、実施例１と同様の手法でiPS細胞誘導を行った。ただし、感染翌日に、MEFを培養している96-well plateに対してフィーダー細胞を播き、感染2日目 (Day2) からはマウスES細胞用培地に培養液を切換え、以後2日ごとにマウスES細胞用培地の交換を行った。
　また、iPS細胞誘導効率は、実施例２と同様に、感染（Day0）から14日目～17日目にGFP陽性細胞の数をPOWERSCAN4で測定することにより行った。結果を図８～図１１に示す。
　ZSCAN4、OCT3/4、SOX2およびKLF4を組み合わせた場合、OCT3/4、SOX2およびKLF4の3因子のみを導入した場合と比較して高いiPS細胞誘導活性（iPS細胞樹立効率促進活性）を示し、さらにZSCAN4はGLIS1との組み合わせによりiPS細胞誘導活性（iPS細胞樹立効率促進活性）を高めることが明らかとなった。
　実施例４:ZSCAN4因子およびp53の阻害によるiPS細胞樹立効率促進活性
　ZSCAN4および/またはGLIS1とp53の阻害との組み合わせによるiPS細胞誘導活性について検討した。p53欠損させたNanog-GFPマウス由来のMEF（p53-null MEF）を用いてiPS細胞誘導を行った。p53-null MEFは、国際公報WO2009/157593に記載の方法に従って、p53遺伝子のexon5をneomycin耐性遺伝子に置換したノックアウトマウスを作製しNanogレポーターマウスと交配させることで得られた、Nanogレポーターを持つp53ホモ欠損マウスの胎仔（胎齢13.5日）から単離することで調整された。このように得られたp53-null MEFを96-well plateの1 well当り1.0x103個または2.0x103個播種し、実施例３と同様の手法で行った。ウイルス感染（Day0）から7日目～10日目にGFP陽性細胞の数をPOWERSCAN4で測定した結果を図１２～図１５に示す。
　p53の阻害条件においても、ZSCAN4は、OCT3/4、SOX2およびKLF4とを組み合わせることにより、OCT3/4、SOX2およびKLF4の3因子のみを導入した場合と比較して高いiPS細胞誘導活性（iPS細胞樹立効率促進活性）を示した。さらに、ZSCAN4とGLIS1とを組み合わせることでiPS細胞誘導活性（iPS細胞樹立効率促進活性）を高めることが明らかとなった。
　実施例５:ZSCAN4因子によるiPS細胞樹立効率促進活性（ケラチノサイトからのiPS細胞樹立）
　ヒト表皮由来のケラチノサイト（表皮角化細胞）を用いてiPS細胞の樹立を行い、ZSCAN4によるiPS細胞樹立効率促進活性の検討を行った。導入に用いたヒト遺伝子の組み合わせを以下に示す。
(1) OCT3/4、SOX2、KLF4、DsRed（ネガティブコントロール） (DsRed+OSK)
(2) OCT3/4、SOX2、KLF4、GLIS1 (OSK+GLIS1)
(3) OCT3/4、SOX2、KLF4、ZSCAN4 (OSK+ZSCAN4)
(4) OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC（ポジティブコントロール） (OSKM)
　iPS細胞誘導実験は、セルアプリケーションズ社から購入したヒト表皮由来ケラチノサイトを6-well plateに対して、1 well当り0.4x105個の割合で播種した。培養液にはケラチノサイト培地（Cell Applications）を使用し、37℃、5% CO2で培養した。翌日、各種発現ベクターから作製したレトロウイルスをスピンフェクション法（32℃条件下、1000gにて30分間回転）によって感染させた (Day0)。ウイルス感染の翌日 (Day1)、マイトマイシンCで処理して細胞分裂を止めたSNL細胞をフィーダー細胞として播き、感染3、5、7日にケラチノサイト培地を交換して培養を行った。感染9日目 (Day9) からは、培養液をヒトES細胞用培地（ReproCell) に切換え、以後1日ごとにヒトES細胞用培地の交換を行った。
　感染29日目に、SSEA-4免疫染色およびアルカリフォスタファーゼ（ALP）染色を行うことによってiPS細胞の樹立を確認した。その結果、DsRed+OSK、OSK+GLIS1、OSK+ZSCAN4およびOSKMの導入により得られたiPS細胞のコロニー数は、それぞれ、17個、65個、81個および126個であった。このときの初期化効率（得られたiPS細胞のコロニー数を当初ウェル上に播種した細胞数で割った値）は、それぞれ、0.0425%、0.1625%、0.2025%、0.315%であった。これらの結果から、ヒト細胞においてもZSCAN4は、iPS細胞誘導活性（iPS細胞樹立効率促進活性）を高めることが明らかとなった。
　本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　本出願は、米国仮特許出願第６１／５２８，５３４号（出願日：２０１１年８月２９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (19)

  1. 　以下の(a)および(b):
    (a) Zscan4またはそれをコードする核酸
    (b) c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
    を体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法。
  2. 　前記(b)の物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klfファミリーのメンバー、Glisファミリーのメンバー、NanogおよびLinファミリーのメンバー、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  3. 　前記(b)の物質がOct3/4またはそれをコードする核酸である、請求項1記載の方法。
  4. 　前記(b)の物質がOct3/4およびSox2、またはそれらをコードする核酸を含む、請求項1記載の方法。
  5. 　前記(b)の物質がOct3/4およびKlf4、またはそれらをコードする核酸を含む、請求項1記載の方法。
  6. 　前記(b)の物質がOct3/4、Sox2およびKlf4、またはそれらをコードする核酸を含む、請求項1記載の方法。
  7. 　前記(b)の物質がOct3/4、Sox2、Klf4およびGlis1、またはそれらをコードする核酸を含む、請求項1記載の方法。
  8. 　p53阻害剤を体細胞へ接触させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
  9. 　前記体細胞がヒト体細胞である、請求項1記載の方法。
  10. 　以下の(a)および(b):
    (a) Zscan4またはそれをコードする核酸
    (b) c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質
    を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤。
  11. 　Zscan4をコードする外来性核酸を含む、iPS細胞。
  12. 　Klf4ファミリーのメンバーをコードする外来性核酸をさらに含む、請求項11記載のiPS細胞。
  13. 　前記外来性核酸がゲノムに組み込まれている、請求項11記載のiPS細胞。
  14. 　請求項11記載のiPS細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させることを含む、体細胞の製造方法。
  15. 　Zscan4またはそれをコードする核酸を含有してなる、体細胞からiPS細胞への誘導剤であって、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、剤。
  16. 　iPS細胞の製造のための、Zscan4またはそれをコードする核酸の使用であって、該物質が、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、使用。
  17. 　体細胞からのiPS細胞の誘導剤としての、Zscan4またはそれをコードする核酸であって、c-Mycと組み合わせることにより体細胞からiPS細胞を誘導しうる物質とともに体細胞に導入されることを特徴とする、物質。
  18. 　体細胞の製造における、請求項11記載のiPS細胞の使用。
  19. 　体細胞の製造における細胞ソースとしての、請求項11記載のiPS細胞。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007069666A1 (ja) * 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2009057831A1 (ja) * 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009157593A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007069666A1 (ja) * 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2009057831A1 (ja) * 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009157593A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIRATA T. ET AL.: "Zscan4 transiently reactivates early embryonic genes during the generation of induced pluripotent stem cells", SCI REP., vol. 2, no. 208, January 2012 (2012-01-01), pages 1 - 11 *
HUANG J. ET AL.: "Association of telomere length with authentic pluripotency of ES/iPS cells", CELL RES., vol. 21, no. 5, May 2011 (2011-05-01), pages 779 - 792, XP055135693, DOI: doi:10.1038/cr.2011.16 *
MAEKAWA M. ET AL.: "Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1", NATURE, vol. 474, no. 7350, June 2011 (2011-06-01), pages 225 - 229, XP055034083, DOI: doi:10.1038/nature10106 *
STORM MP. ET AL.: "Characterization of the phosphoinositide 3-kinase-dependent transcriptome in murine embryonic stem cells: identification of novel regulators of pluripotency", STEM CELLS, vol. 27, no. 4, 2009, pages 764 - 775, XP055085919, DOI: doi:10.1002/stem.3 *
ZALZMAN M. ET AL.: "Zscan4 regulates telomere elongation and genomic stability in ES cells", NATURE, vol. 464, no. 7290, 2010, pages 858 - 863, XP008151227, DOI: doi:10.1038/nature08882 *

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