WO2007144943A1 - 免疫機能増強組成物 - Google Patents

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Shinji Murosaki
Yoshihiro Yamamoto
Norio Yamamoto
Yoshitaka Hirose
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Definitions

  • the present invention relates to an immune function-enhancing composition
  • an immune function-enhancing composition comprising, as an active ingredient, a saccharide containing zinc and 3_0_a_D_darcopyranosyl_D-glucose as structural units.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Compositions containing these saccharides as active ingredients include immunostimulants (see Patent Documents 1, 2 and 3), natural killer cell activators (see Patent Document 4), QOL improvers (see Patent Document 5), etc. It has been published.
  • Non-Patent Document 3 Synthesis of enzyme components and proteins, involvement in taste olfaction, participation in insulin production and function, reproductive function and It plays an important role in stimulating immunity. In particular, it is known to play a major role in overall immune function and regulate lymphocyte functions such as activation of T lymphocytes and natural killer cells (see Non-Patent Document 4).
  • Patent Document 1 JP-A-9-52834
  • Patent Document 2 JP 2001 _64174
  • Patent Document 3 JP 2002-80364
  • Patent Document 4 JP 2002-265366
  • Patent Document 5 JP 2002-265385
  • Non-patent literature l Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63: 373-378
  • Non-patent literature 2 Int. Immunopharmacol., 2002, 2: 151-159
  • Non-Patent Document 3 J. Leukoc. Biol., 2002, 71: 25-27
  • Non-Patent Document 4 ⁇ .2003, 133: 1452S-1456S Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a composition having a superior immune enhancing effect.
  • 3_0_a_D_Dalcopyranosyl-I-D a combination of saccharides containing zincolecose and zinc as compared with the case of taking each of them alone.
  • 3_0_a_D_Dalcopyranosyl-I-D a combination of saccharides containing zincolecose and zinc as compared with the case of taking each of them alone.
  • the present invention is as follows.
  • An immune function-enhancing composition comprising, as an active ingredient, a saccharide containing zinc and 3-0-D_darcobilanosyl mono-D-glucose as a structural unit.
  • the specific weight ratio of zinc and nigerooligosaccharide is 1: 200 to 2000,
  • the immune function enhancing composition according to any one of the above (1) to (8) which is a pharmaceutical or a food
  • a food comprising the immune function-enhancing composition according to (1) to (8) above or any one of the above.
  • a feed comprising the immune function enhancing composition according to any one of (1) to (8) above.
  • a cosmetic product comprising the immune function-enhancing composition described in (1) to (8) above.
  • the immune function-enhancing composition of the present invention has a significantly superior immunity compared to the case where a saccharide or zinc containing 3-O-a D darcoviranosyl D dalose as a structural unit is used alone. Demonstrate function enhancement. For this reason, it is possible to maintain and improve health more effectively.
  • the immune function-enhancing composition of the present invention comprises a saccharide containing zinc and 3 ____ a_D-darcopyranosyl_D_glucose as constituent units as an active ingredient.
  • the sugar containing 3_O_a_D-darcobilanosyl_D_glucose as a constituent unit is not particularly limited, and those known per se may be used.
  • an oligosaccharide having a glucose polymerization degree of about 2 or more and containing at least one or more -1,3 dalcoside bonds preferably an oligosaccharide having a glucose polymerization degree of 2 to 10 or more Preferred are nigerooligosaccharides which are oligosaccharides having a degree of polymerization of about 2-7.
  • the powerful Nigero-oligosaccharides include ⁇ -1, 3 dalcoside bonds and other bonds (eg ⁇ -1, 1, ⁇ -1, 2, ⁇ Oligosaccharides consisting of ⁇ 1,4, ⁇ -1,6darcoside bonds, etc.) are also included.
  • nigerose, nigerosyl glucose or nigerosyl maltose represented by the following formula. These may be used alone or in combination of two or more
  • 3-0-a_D-Gnorecopyranosinole_D-Gnolecose can be easily produced according to a method known per se.
  • a nigg mouth oligosaccharide can be prepared by the following known methods.
  • polysaccharides produced by microorganisms such as digeran or erucinan are used as substrates, enzymes or acids.
  • a method for producing a nigerooligosaccharide by hydrolysis using it is described.
  • ⁇ -darcosidase Is also known for preparing nigerose using a condensation reaction (Kenya Ken- et al.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-59559 discloses a glycosyltransferase (specifically, Acremonium) that produces a 1,3-glucoside bond to a substrate containing a polysaccharide or oligosaccharide linked to ⁇ -1,4 gnorecoside.
  • Glycosyltransferases prepared by culturing fungi such as Acremonium sp. S4G13 (FERM BP— 4373), which belong to the genus and produce glycosyltransferases that bring about 1, 3 linkages)
  • the nigg mouth oligosaccharide used in the present invention is not limited to the above-mentioned method, which may be prepared by any method. However, among the methods known so far, the most economical method is considered to be the glycosyltransferase (bigeroligosaccharide-forming enzyme) described in JP-A-7-59559. In the present invention, it is preferable to use a nigerooligosaccharide prepared according to this method.
  • zinc that is an active ingredient of the immune function enhancing composition of the present invention is usually supplied as a zinc salt (eg, zinc sulfate, zinc nitrate, zinc phosphate, etc.).
  • a zinc salt eg, zinc sulfate, zinc nitrate, zinc phosphate, etc.
  • the content ratio of the active ingredient zinc and saccharide containing 30 a D darcobilanosyl D-gnolecose as constituent units is not particularly limited, but zinc: saccharide (for example, The weight ratio of the nigerooligosaccharide and the like is, for example, about 1: 100 to 5,000, preferably about 1: 200 to 2000, more preferably about 1: 500 to 1500.
  • the immune function enhancing composition of the present invention can be produced by mixing zinc and saccharides by a method known per se (for example, stirring and mixing).
  • the immune function of mammals or fish can be enhanced.
  • the mammal is preferably a human, but is not limited to humans, but domestic animals such as rabbits, horses, pigs, hedges, goats, poultry such as chickens, pet animals such as dogs, cats, etc. Also good.
  • As the fish cultured fish such as yellowtail is preferred.
  • the composition for enhancing immune function of the present invention is used as a medicine, it can be administered orally or parenterally.
  • the dosage varies depending on the subject of administration, administration route, patient condition, etc.
  • the amount of saccharide, which is an active ingredient is about one day for an adult (body weight: about 60 kg).
  • the same amount can be administered in terms of body weight to mammals and fish other than humans.
  • the immune function-enhancing composition of the present invention is used as a medicine
  • its dosage form is an oral preparation (such as powder, granule, pill, tablet, hard capsule, soft capsule or syrup), or Alternatively, it may be a parenteral preparation such as a suppository or an injection. These preparations can be produced by a method known per se.
  • the immune function-enhancing composition of the present invention can be used as a food (particularly a functional food) per se or in a food or drink or feed.
  • the food and drink include sweeteners, confectionery, gum, candy, jelly, tea, juice, and the like.
  • the feed include feed for mammals other than humans and feed for fish.
  • the amount of the immune function-enhancing composition of the present invention added to a food or drink or feed is, for example, as follows: ) Degree is preferred.
  • the immune function-enhancing composition of the present invention can also be used in cosmetics.
  • cosmetics include external lotions, external emulsions, external creams or external jewels.
  • the amount of the immune function-enhancing composition of the present invention to be added to the cosmetic is preferably about:! To 20% (W / W), for example, as the amount of saccharide as an active ingredient with respect to the entire cosmetic.
  • the immune function enhancing action exhibited by the immune function enhancing composition of the present invention includes, for example, an effect of increasing the metabolic activity or proliferation ability of immunocompetent cells, or an effect of increasing the metabolic activity of T lymphocytes and proliferation ability. Examples thereof include an action or a cell death inhibitory action.
  • the immune function-enhancing composition of the present invention is an infectious disease caused by microorganisms such as viruses and bacteria. Influenza due to infection, cold syndrome and oral infection Stomatitis due to periodontal disease, etc. and various malignant tumors such as epithelial malignant tumors that occur in the organs of the digestive tract, respiratory mucosa, liver and kidney, non-epithelium that occurs in the motility organs and soft tissues, etc. It is effective in the prevention and treatment of sexual malignant tumors.
  • microorganisms such as viruses and bacteria. Influenza due to infection, cold syndrome and oral infection Stomatitis due to periodontal disease, etc.
  • various malignant tumors such as epithelial malignant tumors that occur in the organs of the digestive tract, respiratory mucosa, liver and kidney, non-epithelium that occurs in the motility organs and soft tissues, etc. It is effective in the prevention and treatment of sexual malignant tumors.
  • the numerical value in Table 1 is the absorbance (415 nm), and shows the average value ⁇ standard deviation of the number of the 3 holes.
  • mice (Balb / c, female, 10 weeks old) and crushed in RPMI1640 medium (GIBCO) supplemented with streptomycin and penicillin (manufactured by SIGMA)
  • a spleen cell suspension consisting of immunocompetent cells was obtained through # 200 mesh. After measuring the number of cells in the spleen cell suspension with an automated blood cell counter (Sysmetas: CDA-500), adjust the RPMI1640 medium to a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells ZmL, and culture in a 96-well culture. The plate was seeded with 50 ⁇ L per well. Containavalin A (manufactured by SIGMA), a cell growth stimulating factor dissolved in the above RPMI1640 medium, was added to the seeded cell solution at a final concentration of 0.4 ⁇ ⁇ / 111 with 50 ⁇ did.
  • the numerical value in Table 2 is the absorbance (415 nm), and shows the average value of 3 to 6 holes.
  • lymphocytes and monocytes present in the intermediate layer were carefully collected with a Pasteur pipette, and the collected cell suspension was washed twice with 10 times the amount of PBS.
  • an automated blood cell counter Sysmetas; CDA-500
  • 10% urinary fetal serum to a concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / mL, Prepared with RPMI1640 medium containing streptomycin and penicillin, and seeded 50 Ai L per well in a 96-well culture plate.
  • Concanaval in A (manufactured by SIGMA) dissolved in the above RPMI1640 medium was added to the seeded cell solution at a concentration of 50 ⁇ L per well to a final concentration of 2.0 ⁇ g / mL.
  • the thus prepared human peripheral blood mononuclear cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C for 48 hours.
  • the numerical value in Table 3 is the absorbance (415 nm), and shows the average soil standard deviation of 3 holes. *: Significantly different from the group without addition of zinc and nigerooligosaccharide (Dunnett's test). [0031] As is clear from Table 3, when nigerooligosaccharide or zinc alone does not substantially increase the metabolic activity of human immunocompetent cells, the combined use of zinc and nigerooligosaccharide at a ratio of 1: 1000 results in cellular metabolic activity. A significant increase was observed. That is, in an experiment using human peripheral blood mononuclear cells, the immune function-enhancing effect of a composition composed of a nigg mouth oligosaccharide and zinc was shown.
  • Zinc sulfate (as zinc) 0. 0 0 5
  • Soft candy was manufactured after mixing each raw material well so that the weight per one grain was 5 g in the blending amounts shown in Table 6 below.
  • Zinc sulfate (as zinc) 0. 0 0 8
  • the immune function-enhancing composition of the present invention has a significantly superior immune function-enhancing action compared to the case where a saccharide or zinc containing 3-0-a _D_darcopyranosyl and D_darcose as a constituent unit is used alone. To demonstrate.

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Abstract

　本発明は、亜鉛および３－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｄ－グルコースを構成単位として含有する糖類を有効成分とすることを特徴とする免疫機能増強組成物である。本発明の免疫機能増強組成物は、３－Ｏ－α－Ｄ－グルコピラノシル－Ｄ－グルコースを構成単位として含有する糖類または亜鉛をそれぞれ単独で使用する時よりも顕著に優れた免疫機能増強作用を発揮する。

Description

明 細 書
免疫機能増強組成物
技術分野
[0001] 本発明は、亜鉛および 3_0_ a _D_ダルコピラノシル _D—グルコースを構成 単位として含有する糖類を有効成分とすることを特徴とする免疫機能増強組成物に 関する。
背景技術
[0002] これまで 3— 0— a D ダルコビラノシルー D—グルコースを構成単位として含有 する糖類についてその免疫賦活効果が報告されている（非特許文献 1及び 2参照）。 これらの糖類を有効成分とする組成物は免疫賦活剤（特許文献 1、 2及び 3参照）、ナ チュラルキラー細胞活性化剤（特許文献 4参照）、 QOL向上剤（特許文献 5参照)等 として公開されている。
[0003] 一方、亜鉛はヒトの生体内に存在する微量元素の中では鉄に次いで多い元素であ る。亜鉛の生理作用については様々な報告がなされており（非特許文献 3参照）、酵 素の成分や蛋白質の合成、味覚'嗅覚への関与、インスリンの生成や機能への関与 、また生殖機能や免疫能の賦活に重要な役割を果たしている。特に、免疫機能全般 に大きな役割を果たし、 Tリンパ球やナチュラルキラー細胞の活性化といったリンパ球 の機能を調節することが知られてレ、る（非特許文献 4参照）。
特許文献 1:特開平 9一 52834
特許文献 2：特開 2001 _ 64174
特許文献 3:特開 2002— 80364
特許文献 4:特開 2002— 265366
特許文献 5:特開 2002— 265385
非特許文献 l:Biosci. Biotechnol. Biochem. , 1999, 63:373-378 非特許文献 2: Int. Immunopharmacol. , 2002, 2:151-159
非特許文献 3 :J. Leukoc. Biol. , 2002, 71:25-27
非特許文献 4:】. Ν .2003, 133:1452S-1456S 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、より優れた免疫増強作用を有する組成物を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、鋭意研究を行なった結果、 3_0_ a _D_ダルコピラノシル一 D —グノレコースを構成単位として含有する糖類と亜鉛を併用することで、それぞれを単 独で摂取する時よりも顕著に優れた免疫機能増強作用を発揮することを知見し、さら に検討を重ね、本発明を完成するに至った。
[0006] すなわち、本発明は次の通りである。
(1)亜鉛および 3— 0—ひ _D_ダルコビラノシル一D—グルコースを構成単位とし て含有する糖類を有効成分とすることを特徴とする免疫機能増強組成物。
(2)糖類が、ニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニグロシルマルトースのうち少 なくとも 1種を含有するニゲロオリゴ糖であることを特徴とする前記（1)に記載の免疫 機能増強組成物。
(3)亜鉛とニゲロオリゴ糖の重量比力 1： 200〜2000であることを特徴とする前記（2
)に記載の免疫機能増強組成物。
(4)免疫機能増強が、免疫担当細胞の代謝活性上昇作用であることを特徴とする前 記（1)〜（3)のレ、ずれかに記載の免疫機能増強組成物。
(5)免疫機能増強が、免疫担当細胞の増殖能上昇作用であることを特徴とする前記 (1)〜（3)のレ、ずれかに記載の免疫機能増強組成物。
(6)免疫機能増強が、 Tリンパ球の代謝活性上昇作用であることを特徴とする前記（1 )〜（3)のレ、ずれかに記載の免疫機能増強組成物。
(7)免疫機能増強が、 Tリンパ球の増殖能上昇作用であることを特徴とする前記（1) 〜（3)のレ、ずれかに記載の免疫機能増強組成物。
(8)免疫機能増強が、 Tリンパ球の細胞死抑制作用であることを特徴とする前記（1) 〜（3)のレ、ずれかに記載の免疫機能増強組成物。
(9)医薬または食品である前記（1)〜（8)のいずれかに記載の免疫機能増強組成物 (10)前記（1)〜（8)のレ、ずれかに記載の免疫機能増強組成物を配合してなることを 特徴とする食品。
(11)前記（1)〜（8)のいずれかに記載の免疫機能増強組成物を配合してなることを 特徴とする飼料。
(12)前記（1)〜（8)のレ、ずれかに記載の免疫機能増強組成物を配合してなることを 特徴とする化粧品。
発明の効果
[0007] 本発明の免疫機能増強組成物は、 3— O— a D ダルコビラノシルー D ダルコ ースを構成単位として含有する糖類または亜鉛をそれぞれ単独で使用する時よりも 顕著に優れた免疫機能増強作用を発揮する。このため、より効果的に健康を維持増 進すること力 Sできる。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明の免疫機能増強組成物は、亜鉛および 3 _〇_ a _ D—ダルコピラノシル _ D _グルコースを構成単位として含有する糖類を有効成分とすることを特徴とする 本発明で使用される 3 _〇_ a _ D—ダルコビラノシル _ D _グルコースを構成単 位として含有する糖類としては、特に限定されず、 自体公知のものを用いてよい。具 体的には、例えば、少なくとも 1つ以上のひ— 1 , 3ダルコシド結合を含むグルコース 重合度 2程度以上のオリゴ糖が挙げられ、好ましくはグルコース重合度 2〜： 10程度の オリゴ糖、より好ましくは重合度 2〜7程度のオリゴ糖であるニゲロオリゴ糖が挙げられ る。力かるニゲロオリゴ糖には、 α— 1 , 3グノレコシド結合のみからなるオリゴ糖の他に 、 α - 1 , 3ダルコシド結合とそれ以外の結合（例えば α— 1 , 1、 α— 1 , 2、 α ~ 1 , 4 、 α - 1 , 6ダルコシド結合など）とからなるオリゴ糖も包含される。中でも、本発明にお いては、下記式で表されるニゲロース、ニゲロシルグルコースまたはニゲロシルマルト ースを用いるのがより好ましい。これらは単独で用いても、 2種以上を併用してもよい
[0009] [化 1]
Figure imgf000005_0001
ニゲロース
a-D-Glc ?-(l→3)D-Glc
[0010] [化 2]
Figure imgf000005_0002
ニゲロシルグルコース -D'Glc -(1→3)- a -D-Glcj? -(l→4)-D-Glc
[化 3]
Figure imgf000005_0003
ニゲロシルマル] ス
-D-Glcp -(1→3)- -Ό-Glcp -(1→4)- -DGlcp -(l→4)-DGlc
[0012] 3-0- a _D—グノレコピラノシノレ _D—グノレコースを構成単位として含有する糖 類は、 自体公知の方法に従って容易に製造することができる。具体的には、例えば、 ニグ口オリゴ糖は、下記のような公知の方法によって調製することができる。例えば、 M. Stacey and J. M. Webber： Methods in Carbohydrate Chemistry, I , 339-341, AcademicPress(1962)には、微生物の生産する多糖類である、二 ゲランまたはエルシナン等を基質として、酵素または酸類などを用いて加水分解して ニゲロオリゴ糖を製造する方法が記載されている。また、公知の α—ダルコシダーゼ の糖転移 ·縮合反応を用いてニゲロースを調製する方法も知られている（金谷憲ー他
, 曰本農芸ィ匕学会誌， 53, 385— 390 (1979)、 H. Fujimoto et al. , Agric. Bi ol. Chem. , 52, 1345— 1351 (1988)など）。更【こ、特開平 3— 22958号公幸 【こ は、澱粉加水分解物に、サイクロデキストリン生成酵素を作用させてニグロースを製 造する方法が開示されている。更にまた、特開平 7— 59559号公報には、 α - 1 , 4 グノレコシド結合したポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む基質にひ一1 , 3グ ルコシド結合をもたらす糖転移酵素（具体的には、 Acremonium属に属し、 ひ— 1 , 3結合をもたらす糖転移酵素を生産する真菌、例えば Acremonium sp. S4G13 ( FERM BP— 4373)を常法に従レ、、培養することによって調製される糖転移酵素） を作用させてニグ口オリゴ糖を製造する方法が開示されている。本発明において用い るニグ口オリゴ糖は、いずれの方法で調製されたものでも良ぐ上記の方法に限定さ れない。ただし、現在までに知られている方法の中で最も経済的な面で優れていると 考えられるのは、上記特開平 7— 59559号公報に記載された糖転移酵素（二ゲロォ リゴ糖生成酵素）を用いた方法であり、本発明においてもこの方法に従って調製した ニゲロオリゴ糖を使用するのが好ましい。
[0013] 一方、本発明の免疫機能増強組成物の有効成分である亜鉛は、通常、亜鉛塩 (例 えば、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、リン酸亜鉛等）として供給される。
有効成分である亜鉛と 3 0 a D ダルコビラノシルー D グノレコースを構成 単位として含有する糖類 (以下、単に糖類ともいう。）の含有割合は、特に限定されな いが、亜鉛:糖類（例えば、ニゲロオリゴ糖等）の重量比として、例えば、約 1： 100〜5 000、好ましくは約 1 : 200〜2000、より好ましくは約 1 : 500〜： 1500である。本発明 の免疫機能増強組成物は、亜鉛と糖類を自体公知の方法で混合 (例えば、攪拌混 合等）することにより製造できる。
[0014] 本発明の免疫機能増強組成物を哺乳動物や魚類に投与することによって、哺乳動 物や魚類の免疫機能を増強することができる。該哺乳動物としては、ヒトが好ましいが 、ヒトに限られることはなぐゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ャギ等の家畜、ニヮトリ等の家禽 、ィヌ、ネコ等のペット動物であってもよい。該魚類としては、ハマチ等の養殖魚が好 ましい。 [0015] 本発明の免疫機能増強組成物を医薬として用いる場合、経口的にも非経口的にも 投与することができる。また、その投与量は、投与対象、投与ルート、患者の状態など により差異はあるが、例えば、有効成分である糖類の量が、成人一人（体重約 60kg) に対して、一日にっき、約 4mg〜40g程度、好ましくは約 10mg〜20g程度、さらに 好ましくは約 50mg〜10g程度であるのがよレ、。また、ヒト以外の哺乳動物や魚類に 対しても、体重換算して同様の量を投与することができる。
[0016] 本発明の免疫機能増強組成物を医薬として使用する場合、その剤形は、経口剤（ 散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤もしくはシロップ剤等）、ま たは坐剤もしくは注射剤等の非経口剤であってもよい。これらの製剤は、 自体公知の 方法によって製造することができる。
[0017] また、本発明の免疫機能増強組成物は、それ自体を食品（特に、機能性食品）とし て、あるいは飲食品または飼料に配合して使用することができる。飲食品としては、例 えば、甘味料、菓子、ガム、キャンディ、ゼリー、茶またはジュース等が挙げられ、また 飼料としては、ヒト以外の哺乳動物用飼料や魚類用飼料が挙げられる。
[0018] 本発明の免疫機能増強組成物の飲食品または飼料への配合量は、飲食品または 飼料全体に対し、有効成分である糖類の量として、例えば、：!〜 80% (W/W)程度 が好ましい。
[0019] また、本発明の免疫機能増強組成物は、化粧品に配合して使用することもできる。
化粧品としては、例えば、外用ローション、外用乳液、外用クリームまたは外用ジエル 等が挙げられる。
[0020] 本発明の免疫機能増強組成物の化粧品への配合量は、化粧品全体に対し、有効 成分である糖類の量として、例えば、：!〜 20% (W/W)程度が好ましい。
[0021] 本発明の免疫機能増強組成物が奏する免疫機能増強作用としては、例えば、免疫 担当細胞の代謝活性上昇作用もしくは増殖能上昇作用、または Tリンパ球の代謝活 性上昇作用、増殖能上昇作用もしくは細胞死抑制作用等が挙げられる。
[0022] 本発明の免疫機能増強組成物は、ウィルス、バクテリア等の微生物による感染症、 例えば、経口感染によるコレラ菌、毒素原性大腸菌、赤痢菌、サルモネラ、ウィルス 等の感染性腸炎や、気道感染によるインフルエンザ、かぜ症候群や、 口腔内感染に よる口内炎、歯周疾患等、また、各種悪性腫瘍、例えば、消化管や呼吸器粘膜、肝 · 腎等の実質臓器に発生する上皮性悪性腫瘍や、運動器ゃ軟部組織などに発生する 非上皮性悪性腫瘍の予防や治療に有効である。
実施例
以下に試験例および実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら に限定されるものではない。
[試験例 1 ]
3 - 0 - a—D—ダルコビラノシル D グノレコースを構成単位として含有する糖 類であるニゲロオリゴ糖と亜鉛を用いて、免疫担当細胞の代謝活性に対するニゲロ オリゴ糖と亜鉛の併用効果を検証した。亜鉛は、硫酸亜鉛を蒸留水に溶力 た形で 用いた。マウス（Balb/c、雌、 10週齢)から脾臓を無菌的に摘出し、ストレブトマイシ ン、ペニシリン（SIGMA社製）を添加した RPMI1640培地（GIBCO社製）中で押し つぶし、 # 200メッシュに通して免疫担当細胞からなる脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓 細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置（シスメッタス社製： CDA- 500)により測 定した後、 1 X 107細胞/ mLの濃度になるように上記の RPMI1640培地で調整し、 96穴培養プレートに一穴あたり 50 μ Lを播種した。播種した細胞液に上記の RPMI 1640培地に溶解した細胞増殖刺激因子である Concanavalin A (SIGMA社製） を最終濃度 2. 0 z g/mLとなるように 1穴あたり 50 z L添カロした。さらに上記の RPM 11640培地に溶解した亜鉛を最終濃度 0または Ing/mLになるように、さらに、ニグ 口オリゴ糖を最終濃度 0または 1000ng/mLとなるように各々 1穴あたり ずつ 添加した。このようにして調整した培養用の免疫担当細胞を 5%炭酸ガス培養器内に て 37°Cで 48時間培養した。培養終了後、 WST- K2- (4 インドフヱニル） _ 3 _ (4 ニトロフエ二ル）一 5— (2, 4 ジスルホフエ二ル）一 2H テトラゾリゥム，モノソジ ゥム塩；同仁化学研究所製）を 10mMの濃度になるように 0. 4mM 1 -metoxy P MS (同仁化学研究所製）に溶解した溶液を 1穴あたり 10 μ L添加し、炭酸ガス培養 器内にて 3時間培養して生細胞のミトコンドリアの脱水素酵素によりテトラゾリゥム塩で ある WST— 1から水溶性ホルマザンを形成させた。生成したホルマザン濃度を免疫 担当細胞の代謝活性の指標とした。ホルマザン濃度は、マイクロプレートリーダー（コ ロナ電気社製： MTP - 32)にて測定波長 415nmの吸光度により測定した（参照波 長 630nm)。その結果を表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000009_0001
表 1中の数値は、吸光度（415nm)であり、例数 3穴の平均値 ±標準偏差を示す。
*：亜鉛およびニグ口オリゴ糖非添加群に対して有意差あり（ダネットの検定)。
[0025] 表 1から明ら力、なように、免疫機能増強作用を有するニグ口オリゴ糖あるいは亜鉛単 独ではマウス免疫担当細胞の代謝活性をほとんど上昇させない条件下で両者を併 用すると、細胞代謝活性の有意な上昇が認められた。このような細胞代謝活性の上 昇は細胞増殖を大きく反映することが知られており、免疫担当細胞、特に Tリンパ球 や Bリンパ球などのリンパ球の機能発現には細胞増殖が必須であるので、ニゲロオリ ゴ糖と亜鉛の併用による明らかな免疫機能増強作用が示された。さらに、細胞代謝 活性の上昇は細胞死の抑制も反映しており、このような機序を介した当該組成物の 免疫増強作用も示された。
[0026] [試験例 2]
本試験例では、試験例 1と同様にニゲロオリゴ糖と亜鉛を用いて、免疫担当細胞の 長期間培養による代謝活性に対するニゲロオリゴ糖と亜鉛の併用効果を検証した。 マウス（Balb/c、雌、 10週齢)から脾臓を無菌的に摘出し、ストレプトマイシン、ぺニ シリン（SIGMA社製）を添加した RPMI1640培地（GIBCO社製）中で押しつぶし、
# 200メッシュに通して免疫担当細胞からなる脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮 遊液の細胞数を自動血球計測装置（シスメッタス社製： CDA- 500)により測定した 後、 1 X 107細胞 ZmLの濃度になるように上記の RPMI1640培地で調整し、 96穴 培養プレートに一穴あたり 50 μ Lを播種した。播種した細胞液に上記の RPMI1640 培地に溶解した細胞増殖刺激因子である Concanavalin A (SIGMA社製）を最終 濃度 0. 4 ^ §/111しとなるょぅに1穴ぁたり50 ^し添カロした。さらに上記の RPMI1640 培地に溶解した亜鉛を最終濃度 0または 1または 2ng/mLになるように、さらに、二 ゲロオリゴ糖を最終濃度 0または 1000ng/mLとなるように各々 1穴あたり 50 /iしず つ添加した。このようにして調整した培養用の免疫担当細胞を 5%炭酸ガス培養器内 にて 37°Cで 144時間培養した。培養終了後、 WST- K2- (4—インドフエニル）― 3- (4—ニトロフエ二ル）一 5— (2, 4—ジスルホフエニル）一2H—テトラゾリゥム，モノ ソジゥム塩；同仁化学研究所製）を 10mMの濃度になるように 0. 4mM 1 -metoxy PMS (同仁化学研究所製）に溶解した溶液を 1穴あたり 10 μ L添加し、炭酸ガス培 養器内にて 4. 5時間培養して生細胞のミトコンドリアの脱水素酵素によりテトラゾリゥ ム塩である WST— 1から水溶性ホルマザンを形成させた。生成したホルマザン濃度 を免疫担当細胞の代謝活性の指標とした。ホルマザン濃度は、マイクロプレートリー ダー（コロナ電気社製: ΜΤΡ— 32)にて測定波長 415nmの吸光度により測定した（ 参照波長 630nm)。その結果を表 2に示す。
[表 2]
Figure imgf000010_0001
表 2中の数値は、吸光度（415nm)であり、例数 3〜6穴の平均値を示す。
[0028] 表 2から明ら力なように、長期間の培養においてニゲロオリゴ糖あるいは亜鉛単独で はマウス免疫担当細胞の代謝活性をほとんど上昇させなレ、条件下で、亜鉛とニゲロ オリゴ糖を 1対 1000あるいは 1対 500の割合で併用すると亜鉛の濃度依存的に細胞 代謝活性の上昇が認められた。すなわち、長期培養におけるマウス免疫担当細胞に 対しても当該組成物による免疫増強作用が示された。
[0029] [試験例 3]
試験例 1と同様にニゲロオリゴ糖と亜鉛を用いて、ヒト末梢血単核球細胞の細胞代 謝活性に対するニゲロオリゴ糖と亜鉛の相乗効果を検証した。健常な成人男子より 採取した血液 20mLをカルシウム .マグネシウム不含リン酸緩衝食塩水（PBS)で 2倍 に希釈した後、 30mLの Ficoll— Paque PLUS (GEヘルスケア バイオサイエンス 社製）上に界面を乱さないように静かに重層し、 400 X g、 20°Cの条件で 40分間遠 心分離を行った。遠心後、中間層に存在するリンパ球と単球をパスツールピペットで 慎重に回収し、回収した細胞懸濁液を 10倍量の PBSで 2度洗浄した。得られた単核 球細胞の細胞数を自動血球計測装置（シスメッタス社製； CDA- 500)により測定し た後、 2 X 106細胞/ mLの濃度になるように 10%ゥシ胎児血清、ストレプトマイシン、 ペニシリンを含有する RPMI1640培地で調整し、 96穴培養プレートに一穴あたり 50 Ai Lを播種した。播種した細胞液に上記の RPMI1640培地に溶解した Concanaval in A (SIGMA社製）を最終濃度 2. 0 μ g/mLとなるように 1穴あたり 50 μ L添カロし た。さらに上記の RPMI1640培地に溶解した亜鉛を最終濃度 0および 10ng/mL になるように、さらに、ニグ口オリゴ糖を最終濃度 0および 10 x gZmLとなるように各 々 1穴あたり 50 μ Lずつ添加した。このようにして調整したヒト末梢血単核球細胞を 5 %炭酸ガス培養器内にて 37°Cで 48時間培養した。培養終了後、 WST—1 (同人化 学研究所製）を 10mMの濃度になるように 0· 4mM 1— metoxy PMS (同仁化学 研究所製）に溶解した溶液を 1穴あたり 10 添加し、炭酸ガス培養器内にて 1. 5時 間培養して生細胞のミトコンドリアの脱水素酵素によりテトラゾリゥム塩である WST— 1から水溶性ホルマザンを形成させた。生成したホルマザン濃度をヒト末梢血単核球 細胞の代謝活性の指標とした。ホルマザン濃度は、マイクロプレートリーダー（コロナ 電気社製： MTP - 32)にて測定波長 415nmの吸光度により測定した（参照波長 63 Onm)。その結果を表 3に示す。
[表 3]
Figure imgf000011_0001
表 3中の数値は、吸光度（415nm)であり、例数 3穴の平均値土標準偏差を示す。 *：亜鉛およびニゲロオリゴ糖非添加群に対して有意差あり（ダネットの検定)。 [0031] 表 3から明らかなように、ニゲロオリゴ糖あるいは亜鉛単独ではヒト免疫担当細胞の 代謝活性をほとんど上昇させないような条件下で、亜鉛とニゲロオリゴ糖を 1対 1000 の割合で併用すると細胞代謝活性の有意な上昇が認められた。すなわち、ヒト末梢 血単核球細胞を用いた実験においてもニグ口オリゴ糖と亜鉛からなる組成物の免疫 機能増強作用が示された。
[0032] [実施例 1]
下記表 4に記載の配合量にて、 1錠あたりの重量が 700mgとなるように、各原料を よく混合した後、打錠して錠剤を製造した。
[0033] [表 4]
Figure imgf000012_0001
[0034] [実施例 2]
下記表 5に記載の配合量にて各原料をよく混合し、粉末状の乳牛用濃厚飼料を製 造した。
[0035] [表 5]
成分 配合量 （重量％)
ニゲロオリゴ糖 1 0
硫酸亜鉛 （亜鉛として） 0 . 0 0 5
大麦圧ペン 2 0
ふすま 2 3
とうもろこし圧ペン 1 5
大豆粕 9
大豆皮 9
加熱大豆 7
綿実 7
[0036] [実施例 3]
下記表 6に記載の配合量にて、 1粒あたりの重量が 5gとなるように、各原料をよく混 合した後、ソフトキャンディーを製造した。
[0037] [表 6] 成分 配合量 （重量％)
ニゲロオリゴ糖 8
硫酸亜鉛 （亜鉛として） 0 . 0 0 8
グラニュー糖 9
水飴 2 0
牛乳 5 0
生クリーム 9
フォンダン卜クリーム 3 . 5
シユカ一エステル 0 . 5 産業上の利用可能性
本発明の免疫機能増強組成物は、 3-0- a _D_ダルコピラノシル一 D_ダルコ ースを構成単位として含有する糖類または亜鉛をそれぞれ単独で使用する時よりも 顕著に優れた免疫機能増強作用を発揮する。

Claims

請求の範囲
[I] 亜鉛および 3_0_ a _D_ダルコピラノシル _D—グルコースを構成単位として含 有する糖類を有効成分とすることを特徴とする免疫機能増強組成物。
[2] 糖類が、ニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニグロシルマルトースのうち少な くとも 1種を含有するニグ口オリゴ糖であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載 の免疫機能増強組成物。
[3] 亜鉛とニゲロオリゴ糖の重量比力 1 : 200〜2000であることを特徴とする請求の範 囲第 2項に記載の免疫機能増強組成物。
[4] 免疫機能増強が、免疫担当細胞の代謝活性上昇作用であることを特徴とする請求 の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物。
[5] 免疫機能増強が、免疫担当細胞の増殖能上昇作用であることを特徴とする請求の 範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物。
[6] 免疫機能増強が、 Tリンパ球の代謝活性上昇作用であることを特徴とする請求の範 囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物。
[7] 免疫機能増強が、 Tリンパ球の増殖能上昇作用であることを特徴とする請求の範囲 第 1項〜第 3項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物。
[8] 免疫機能増強が、 Tリンパ球の細胞死抑制作用であることを特徴とする請求の範囲 第 1項〜第 3項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物。
[9] 医薬または食品である請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の免疫機能増 強組成物。
[10] 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物を配合して なることを特徴とする食品。
[II] 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物を配合して なることを特徴とする飼料。
[12] 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の免疫機能増強組成物を配合して なることを特徴とする化粧品。
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