WO1999028459A1 - Examination method, examination reagent and remedy for diseases caused by variation in lkb1 gene - Google Patents

Examination method, examination reagent and remedy for diseases caused by variation in lkb1 gene Download PDF

Info

Publication number
WO1999028459A1
WO1999028459A1 PCT/JP1998/005357 JP9805357W WO9928459A1 WO 1999028459 A1 WO1999028459 A1 WO 1999028459A1 JP 9805357 W JP9805357 W JP 9805357W WO 9928459 A1 WO9928459 A1 WO 9928459A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lkb1
dna
gene
mutation
lkb1 gene
Prior art date
Application number
PCT/JP1998/005357
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter E. Jenne
Jun-Ichi Nezu
Original Assignee
Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. filed Critical Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc.
Priority to AU12620/99A priority Critical patent/AU750564B2/en
Priority to EP98955971A priority patent/EP1036844A4/en
Priority to US09/555,166 priority patent/US6800436B1/en
Priority to CA002311414A priority patent/CA2311414A1/en
Publication of WO1999028459A1 publication Critical patent/WO1999028459A1/ja
Priority to NO20002697A priority patent/NO20002697L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing a disease caused by a mutation in the LKB1 gene, and a test and therapeutic drug for the disease.
  • MIM 175200 is an autosomal dominant syndrome characterized by lip, peri-oral, and similar dark brown pigmentation, and benign, hamartomatic, and adenomatous multiple gastrointestinal polyps . Patients with this syndrome are also known to frequently develop benign and malignant tumors in the gastrointestinal tract, kidney, ovary, testis, breast, and uterus. In particular, small benign tumors frequently occur in the ovaries, and these small tumors develop as multifocal bilateral sex cord structures having an annular tubule. It can then progress to granulosa carcinoma, leading to precocious maturity in girls.
  • Multifocal sex cord cancer in boys has been found to cause gynecomastia and gynecology, albeit less frequently, as a result of excessive estrogen production. It is thought that deficiency of the causative gene of Koss syndrome (Boy-Jega gene) predisposes to a wide range of neoplastic diseases. It is known that 50% of carriers with one will develop cancer by age 60 (Giardiello, FM et al. Increasing risk oi cancer in the Peutz-Jeghers syndrome. N. Engl. J. Med. 316 , 1511-1514 (1987)., Spigelman, AD, Murday, V.
  • the present invention elucidates the causative gene of Peutz-Jeghers syndrome, and provides a method for testing a disease caused by mutation of the gene, and a test and therapeutic agent for the disease.
  • the present inventors In order to elucidate the causative gene of Peutz-Jeghers syndrome, the present inventors first constructed a continuous cosmid contig for 1.5 Mbp or more of the 19pl3.3 region of the chromosome where the Peutz-Jeger gene exists, and A map was made. Then Using the EST database, we searched for genes mapped in this region and determined the exact location of those genes. Next, through the evaluation of biological information and other factors, we identified some promising candidates for the Peutz-Jeger gene from among the many genes found.
  • LKB1 gene, primers and probes based on its base sequence, LKB1 protein, and antibodies that bind to LKB1 protein can be used to test and treat diseases caused by mutations in LKB1 gene. Has been found to be possible.
  • the present invention relates to a method for testing a disease caused by a mutation in the ⁇ LKB1 '' gene, which is a causative gene of Peutz-Jeghers syndrome, and a test and therapeutic agent for the disease, more specifically,
  • a primer comprising a nucleotide sequence comprising at least a part of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4, and used for testing a disease caused by a mutation in the LKB1 gene;
  • a probe DNA comprising a nucleotide sequence containing at least a part of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 4 and used for testing a disease caused by a mutation in LKB1 gene;
  • a therapeutic drug for a disease caused by a mutation in the LKB1 gene comprising an LKB1 protein as an active ingredient
  • a therapeutic agent for a disease caused by a mutation in the LKB1 gene comprising a compound that promotes the activity of the LKB1 protein as an active ingredient
  • test agent for a disease caused by mutation in the LKB1 gene comprising an antibody that binds to the LKB1 protein as an active ingredient
  • a method for examining a disease caused by a mutation in the LKB1 gene comprising detecting a mutation in the LKB1 gene.
  • the present invention is based on the findings by the present inventors that Peutz-Jeghers syndrome develops due to a mutation in a gene named “LKB1”.
  • the present invention relates to a nucleotide comprising at least a part of the nucleotide sequence of a genomic DNA region (including an intron region, a promoter region, and an enhancer region in addition to an exon region) encoding LKB1, and LKB1.
  • the present invention relates to the use of the nucleotide for testing a disease caused by a gene mutation.
  • the genomic DNA region of LKB1 is shown in SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • SEQ ID NO: 1 Is the gene sequence containing the 5 'upstream region of the LKB1 gene
  • SEQ ID NO: 2 is exon 1 and intron 1 (part) of the LKB1 gene
  • SEQ ID NO: 3 is exons 2 to 8 and Introns 1 (part) to 8 (part) and SEQ ID NO: 4 are intron 8 (part) and exon 9.
  • Nucleotides containing a part of these regions can be used as primers or probes for testing diseases caused by mutations in the LKB1 gene.
  • the nucleotide used as a primer is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp.
  • the primer may be any primer as long as it can amplify at least a part of the LKB1 gene or a region that regulates its expression.
  • Such regions include, for example, the exon region, intron region, promoter region, and enhancer region of the LKB1 gene.
  • a nucleotide as a probe usually has a chain length of at least 15 bp or more if it is a synthetic oligonucleotide.
  • the region used as a probe may be any region as long as it is at least a part of the LKB1 gene or a region that regulates its expression. Such regions include, for example, the exon region, intron region, promoter region, and enhancer region of the LKB1 gene.
  • the oligonucleotide or double-stranded DNA is appropriately labeled and used.
  • Labeling methods include, for example, labeling by phosphorylating the 5 'end of the oligonucleotide with ⁇ using T4 polynucleotide kinase, or random hexamer using DNA polymerase such as Klenow enzyme.
  • a method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin using a primer such as a lignonucleotide as a primer random prime method, etc.
  • PTEN and APC genes are hereditary cancers n disease (Cowden's disease) and familial adenomatous polyposis (FAP), but both genes are frequently found in non-hereditary general cancers. It is clear that the mutation has occurred.
  • the PTEN gene or the APC gene works to control cell growth in normal tissues, but when they mutate and lose their function, the cells lose their control and one of the major steps toward canceration is initiated. It is thought to proceed.
  • the LKB1 gene may be involved in the development of general cancer by mutating it.
  • test for a disease caused by a mutation in the LKB1 gene is characterized by detecting the mutation in the LKB1 gene.
  • the term "test for a disease caused by a mutation in the LKB1 gene” means not only a test for a patient who develops a specific symptom due to the mutation in the LKB1 gene, but also Testing for mutations in the LKB1 gene to determine whether a person is susceptible to a particular disease is also included. That is, a mutation in one of the LKB1 alleles greatly increases the risk of developing a specific disease caused by a mutation in the LKB1 gene even if the symptom has not yet appeared on the surface. it is conceivable that.
  • Such a test for identifying a patient (carrier) having a mutation in one of the LKB1 alleles is also included in the present invention.
  • the “detection of a mutation in the LKB1 gene” in the present invention includes detection in DNA, detection in RNA, and detection in protein.
  • test method of the present invention is a method for directly determining the nucleotide sequence of the LKB1 gene of a patient.
  • a part of the LKB1 gene of a patient is determined by PCR (Polymerase Chain Reaction) using DNA isolated from a patient suspected of having a disease caused by LKB1 mutation as a primer using the above nucleotide as a primer.
  • the whole is amplified and its base sequence is determined. By comparing this with the nucleotide sequence of the LKB1 gene of a healthy subject, a disease caused by a mutation in the LKB1 gene can be examined.
  • the direct determination of the nucleotide sequence of Various methods other than the method used can be used.
  • One embodiment is (a) a step of preparing a DNA sample from a patient, (b) a step of amplifying DNA derived from a patient using the primer DNA of the present invention, and (c) a step of converting the amplified DNA to a single-stranded DNA. (D) separating the dissociated single-stranded DNA on a non-denaturing gel, (e) comparing the mobility of the separated single-stranded DNA on the gel with a healthy control, including.
  • PCR-SSCP Single-strand conformation polymorphism, single-chain higher-order structural polymorphism
  • PCR-SSCP Single-strand conformation polymorphism, single-chain higher-order structural polymorphism
  • This method has advantages such as relatively simple operation and small sample size, and is particularly suitable for screening a large number of DNA samples.
  • the principle is as follows. When a double-stranded DNA fragment is dissociated into single strands, each strand forms a unique higher-order structure depending on its base sequence. When the dissociated DNA strand is electrophoresed in a polyacrylamide gel containing no denaturant, the single-stranded DNA of the same complementary length moves to a different position according to the difference in its higher-order structure. I do.
  • the single-stranded substitution also changes the higher-order structure of the single-stranded DNA, indicating different mobilities in polyacrylamide gel electrophoresis. Therefore, by detecting the change in mobility, it is possible to detect whether or not a mutation due to a point mutation, deletion, insertion or the like exists in the DNA fragment to be examined.
  • a part or all of the LKB1 gene is amplified by a PCR method or the like.
  • the amplification range is usually preferably about 200 to 400 bp.
  • the region to be amplified includes the exon, intron, and LKB1 gene of the LKB1 gene. Includes child promoters and enhancers.
  • PCR can be performed under normal conditions (for example, conditions for a reaction for amplifying each exon using the primer shown in Example 5).
  • the DNA fragment synthesized by the PCR reaction is labeled by adding a base
  • a Klenow enzyme is used to synthesize a substrate base labeled with an isotope such as 32 P, a fluorescent dye, or biotin.
  • the DNA fragment thus obtained can be labeled by adding the DNA fragment to the DNA fragment ..
  • the conditions for separation of DNA fragments can be improved by the addition of gel, and the electrophoresis conditions vary depending on the properties of each DNA fragment, but are usually performed at room temperature (20 to 25 ° C). If the desired separation cannot be obtained, it is preferable to study the temperature that gives the optimum mobility at a temperature of 4 to 30 ° C. After electrophoresis, the mobility of the DNA fragment is determined by autoradiography using an X-ray film.
  • this band is directly excised from the gel, re-amplified by PCR, and directly sequenced.
  • the gel after electrophoresis can be stained with ethidium gel or silver stain. By staining the like, it is possible to detect the band of the DNA fragment.
  • test method of the present invention include (a) a step of preparing a DNA sample from a patient, (b) a step of amplifying a patient-derived DNA using the primer DNA of the present invention, and (c) amplified DNA. (D) separating the MA fragment according to its size, (e) hybridizing the probe DNA of the present invention to the separated DNA fragment. (F) comparing the size of the detected DNA fragment with a control of a healthy subject. Examples of such a method include a method using restriction fragment length polymorphism (RFLP) and a PCR-RFLP method.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • these mutations can be detected as a difference in the mobility of the band after electrophoresis.
  • the presence or absence of the mutation can be detected by treating the patient-derived DNA with these restriction enzymes, electrophoresing, and performing Southern blotting using the probe DNA of the present invention.
  • the restriction enzymes to be used are appropriately selected according to the mutations in addition to those described above. In this method, genomic DNA prepared from a patient is treated with a restriction enzyme to detect mutations, and cDNA prepared by treating RNA prepared from a patient with reverse transcriptase is directly treated with a restriction enzyme, followed by Southern enzyme treatment. It can also be detected by blotting.
  • PCR is performed using this cDNA as type II, and the amplified product (part or all of the LKB1 gene) is cleaved with restriction enzymes, followed by electrophoresis to detect mutations as differences in the mobility of DNA fragments. You can also.
  • detection can be performed in the same manner by using A instead of DNA prepared from patients.
  • Such a method comprises: (a) a step of preparing an RNA sample from a patient; (b) a step of separating RNA prepared according to its size; and (c) a step of applying the probe DNA of the present invention to the separated RNA. And (d) comparing the size of the detected RNA with a control of a healthy subject.
  • An example of a specific method is that the patient The prepared RNA is subjected to electrophoresis, and Northern blotting is performed using the probe of the present invention to detect a difference in mobility.
  • test method of the present invention include (a) a step of preparing a DNA sample from a patient, (b) a step of amplifying patient-derived MA using the primer of the present invention, and (c) amplified DNA. (D) comparing the mobility of the separated DNA on the gel with a control of a healthy subject.
  • a method include denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE).
  • DGGE denaturant gradient gel electrophoresis
  • a part or all of the LKB1 gene is amplified by PCR or the like using the primer of the present invention or the like, and this is gradually increased as the concentration of a denaturant such as urea moves. Perform electrophoresis in the gel and compare with healthy subjects.
  • the DNA fragment becomes single-stranded at a lower concentration of the denaturing agent, and the migration speed is significantly reduced.
  • the presence or absence of the mutation can be determined by detecting the difference in mobility. Can be detected.
  • the Allele Specific Oligonucleotide / ASO hybridization method can be used for the purpose of detecting only a mutation at a specific position.
  • an oligonucleotide containing a base sequence that is considered to have a mutation is produced and hybridized with this and a sample MA. If mutations are present, the efficiency of hybridization is reduced.
  • These methods are based on Southern blotting, or a method that utilizes the property of quenching by the special fluorescent reagent being quenched in the gap of the hybrid every night. Detect by such as.
  • RNA mismatch cleavage method Detection by the ribonuclease A mismatch cleavage method is also possible.
  • part or all of the LKB1 gene is amplified by PCR or the like, and this is hybridized with labeled RNA prepared from LKB1 cDNA or the like incorporated in a plasmid vector or the like.
  • the hybrid has a single-stranded structure where the mutation exists This part is cleaved with ribonuclease A and autoradiography
  • the present invention also relates to an agent for testing a disease caused by a mutation in the LKB1 gene, comprising an antibody that binds to the LKB1 protein as an active ingredient.
  • Antibodies that bind to LKB1 protein can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • LKB1 protein naturally protein, LKB1 protein expressed in Escherichia coli as a fusion protein with GST, and other suitable host cells (E. coli, yeast, and mammalian cells) can be used.
  • the expressed recombinant LKB1 protein can be used, or a partial peptide thereof (eg, a peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 34) is immunized to a small animal such as a egret to obtain serum.
  • a partial peptide thereof eg, a peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 31 to SEQ ID NO: 34
  • This can be prepared, for example, by purifying it with ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G columns, DEAE ion exchange chromatography, affinity columns with LKB1 protein or synthetic peptides. is there.
  • a monoclonal antibody In the case of a monoclonal antibody, a small animal such as a mouse is immunized with the LKB1 protein or a partial peptide thereof, the spleen is excised from the mouse, the cells are crushed to separate cells, and mouse myeloma cells and polyethylene are used. Fused with a reagent such as glycol, and a clone that produces an antibody that binds to the LKB1 protein is selected from the resulting fused cells (hybridomas).
  • a reagent such as glycol
  • the obtained hybridoma is transplanted into the peritoneal cavity of a mouse, ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, and LKB1 protein. It can be prepared by purifying a synthetic peptide with an affinity column to which a capping is applied.
  • a tissue collected from a patient or The isolated cells are stained by an enzyme-labeled antibody method, a fluorescent-labeled antibody method, or the like, and examined for LKB1 protein deficiency, abnormal accumulation, or abnormal intracellular distribution.
  • a cell extract is prepared from tissues or isolated cells collected from patients such as Koz-Jieger, separated by SDS-PAGE or other method, and then transferred to a nitrocellulose membrane or PVDF membrane, etc.
  • detection can also be carried out by a method of staining proteins by the above-mentioned enzyme-antibody method (Western blotting, immnoblotting).
  • the distance on the chromosomal DNA between the gene LKB1 causing the Peutz-Jiega syndrome and the microsatellite marker D19S886 was about 190 kbp. It was revealed that both exist in close proximity. Therefore, as a test for various diseases based on the LKB1 gene mutation, a method of testing for loss of heterozygosity (LOH) using the D19S886 marker may be effective.
  • LH heterozygosity
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for a disease caused by a mutation in the LKB1 gene.
  • the LKB1 gene is used as an active ingredient.
  • a part or the entire length of LKB1 genomic DNA or LKB1 cDNA (SEQ ID NO: 5) can be converted into an appropriate vector, for example, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, or a retrovirus vector.
  • the drug is incorporated into plasmid DNA or the like, and administered to patients by, for example, oral administration, intravenous administration, local administration to the affected area, or the like.
  • an ex vivo method can be used in addition to an in vivo method.
  • tissue translocation and tissue absorption can also be enhanced by encapsulating the gene in ribosomes prepared by converting phospholipids into micelles.
  • tissue transferability and tissue absorbability it is possible to enhance tissue transferability and tissue absorbability. This makes it possible to replace the mutated LKB1 gene in the patient with a normal gene, or to additionally administer a normal gene to the patient, thereby treating a disease caused by the LKB1 gene mutation. Can do You.
  • the LKB1 protein is used as an active ingredient.
  • LKB1 protein can be prepared as a natural protein or as a recombinant protein using gene recombination technology.
  • the amino acid sequence of LKB1 protein is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the native protein can be expressed by a method known to those skilled in the art, for example, by performing affinity chromatography using an antibody against a partial peptide of the LKB1 protein described in Example 7 using an antibody against a partial peptide of the LKB1 protein. It can be isolated from testis, fetal liver, or cultured cells such as K562 cells.
  • a recombinant protein can be prepared, for example, by culturing cells transformed with DNA encoding the LKB1 protein (SEQ ID NO: 5).
  • cells used for producing a recombinant protein include mammalian cells such as COS cells, CH0 cells, and NIH3T3 cells, insect cells such as Sf9 cells, yeast cells, and E. coli.
  • the vector for expressing the recombinant protein in the cell varies depending on the host cell.For example, as a vector for a mammalian cell, pcDNA3 (Invitrogen) or pEF-BOS (Nucleic Acids.
  • Escherichia coli vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia) and QIAexpress systemj (Qiagen).
  • Vectors can be introduced into host cells by the calcium phosphate method, DEAE dextran method, Nick liposome D0TAP (Boehringer Mannheim), a method using SuperFect (Quiagen), an electroporation method, a calcium chloride method, and other known methods can be used. Refining of the recombinant protein from the body, a conventional method, for example, can be performed using the document "The Qiaexpressionist handbook, Q iagen, Hilden, a method of Ge Rmanyj described.
  • the LKB1 protein can be directly administered, or can be formulated and administered by a known pharmaceutical manufacturing method.
  • a carrier or medium generally used as a drug for example, sterile water, physiological saline, vegetable oil, surfactant, lipid, solubilizing agent, stabilizer, preservative, and the like.
  • the dose varies depending on various factors such as the patient's body weight, age, health degree, and administration method, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose. Usually, it is in the range of O. Olmg / -1 000 mg / kg.
  • Administration can be performed by, for example, oral administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration and the like.
  • a site-directed mutagenesis system using PCR (GIBCO-BRL, Gaithersburg, Maryland), a site-directed mutagenesis method using oligonucleotides (Kramer, W and Fritz, HJ (1987) Methods in Enzymol., 154: 350-367) and the Kunkel method (Methods Enzymol. 85, 763-Z766 (1988)).
  • Amino acid substitutions, deletions, additions, and / or insertions in the amino acid sequence of the LKB1 protein can be easily performed to enhance stability and the like.
  • Such a modified LKB1 protein can also be used for the drug of the present invention.
  • a compound that promotes the activity of the LKB1 protein is used as an active ingredient.
  • the LKB1 gene is a serine-threonine kinase with 82% high homology in amino acid sequence to the African megal serine-threonine kinase XEEK1. It is thought that the disruption of serine threonine kinase activity in the LKB1 protein is closely related to the onset of disease caused by mutations in the LKB1 gene. Therefore, by promoting the serine threonine kinase activity, it is conceivable to treat a disease caused by a mutation in the LKB1 gene.
  • LKB1 protein expressed in E. coli as a fusion protein with GST or LKB1 protein expressed in mammalian cells, insect cells, etc.
  • LKB1 protein expressed in mammalian cells, insect cells, etc. Using protein, the kinase activity of these proteins is measured in the presence of the test compound,
  • a compound that promotes the activity of LKB1 protein is selected.
  • the activity of phosphorylating the substrate protein of the LKB1 protein or the activity of autophosphorylation (autophosphorylation) by the LKB1 protein is determined using an appropriate reaction solution (for example, 50 mM Tris-HCl).
  • the amount of transfer of 32 P from [[P] ATP to the substrate in [pH 7.2, ImM dithiothreitol (DTT), 10 mM MgCL, 10 mM MnCL, etc.) is measured using a liquid scintillation counter or the like.
  • a compound that increases the amount a compound that promotes the activity of LKB1 protein can be isolated, and when the isolated compound is used as a therapeutic agent for a disease, the above LKB1 protein is treated.
  • it can be formulated and administered by a known pharmaceutical manufacturing method, and the dosage is usually in the range of O. Olmg / to 1000 mg / kg.
  • a method using a region that controls the expression of the LKB1 gene or a factor that binds to the region can be considered.
  • the structures of the LKB1 gene and its 5 ′ upstream region (SEQ ID NO: 1) have been clarified. It is considered that these regions contain a region that regulates the expression of the LKB1 gene (such as promoter promoter), but for those skilled in the art, the LKB1 gene can be obtained by appropriately combining existing methods. It is easy to identify the gene region that regulates the expression of E. coli.
  • a method of specifying a gene regulatory region for example,
  • the upstream region of the LKB1 gene is cleaved with various restriction enzymes to obtain fragments of an appropriate size, which are then used as the luciferase gene, secreted alkaline phosphatase gene, or the like.
  • Liposome such as chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene —Create an expression vector (such as PicaGeneTM Vector Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) that is integrated upstream of the Yuichi gene.
  • this is introduced into a suitable host cell such as COS cell, HEK293 cell, CH0 cell, etc., and after culturing for a certain period of time, the amount of the gene product inside and outside the cell is measured to determine the integrated gene.
  • the activity of the fragment can be measured overnight. If the gene fragment having the activity is identified in this way, the same operation is repeated with a smaller fragment, whereby the active site can be specified in a narrower region.
  • the activity can be measured after the nucleotide sequence of the specified region has been changed by site-directed mutagenesis or the like to confirm that it is an active site.
  • the region that regulates the expression of the LKB1 gene can be, for example, linked to the upstream of the normal LKB1 gene and administered to a patient with a mutated LKB1 gene, under the natural regulation of in vivo expression. Since the LKB1 gene can be expressed, it is particularly useful in the above-described gene therapy.
  • Such a screening method includes: (a) a step of constructing a vector in which a repo overnight gene is linked downstream of a portion of the promoter of the LKB1 gene; and (b) a step of: (C) contacting and / or introducing a test compound into the cells to detect the activity of the reporter gene.
  • Test compounds include, but are not limited to, for example, proteins, peptides, synthetic compounds, natural compounds, genes, gene products, and the like.
  • a compound that controls LKB1 gene expression can be screened by bringing a test sample into contact with a portion of the promoter and selecting a compound (such as a protein) that binds to the promoter site.
  • a compound such as a protein
  • a synthetic oligo DNA having a base sequence at a part of the promoter is prepared, and this is prepared using an appropriate primer such as Sepharose.
  • a transcription regulatory factor that binds to this promoter site and controls LKB1 gene expression can be purified by affinity purification or the like.
  • the present inventors have revealed that a mutation in the LKB1 gene causes a neoplasm such as a polyp in a Peutz'jega patient. For this reason, it can be said that by reducing the amount and activity of LKB1 protein, it is possible to impart temporary cell growth activity to normal cells. Therefore, by using antisense DNA against the LKB1 gene or cDNA, or a compound that inhibits the activity of the LKB1 protein, etc., the amount and activity of the LKB1 protein is artificially reduced, so that wound healing and tissue Treatment of diseases that require new cell proliferation, such as regeneration, may also be considered.
  • Figure 1 a is LKB1 chromosomal gene, and the structure of the vicinity region, restriction enzyme c R is EcoRI showing a map, B is BamHI, S is Sacl, K is Kpnl, BssH indicates it it sites of BssH 11 c
  • restriction enzyme c R is EcoRI showing a map
  • B is BamHI
  • S is Sacl
  • K is Kpnl
  • BssH indicates it it sites of BssH 11 c
  • Figure lb schematically shows the gene rearrangement seen in Peutz-Jeger patient A. The upper part shows the normal gene structure, and the lower part shows the structure of the mutant LKB1 gene of P. jaeger patient A. Arrows indicate the orientation and positional relationship of the primers used for PCR analysis.
  • Figure 2 shows a map of the Cosmidokun's contig and the EcoRI site in the vicinity of the microsatellite camera D19S886.
  • the positional relationship between the microsatellite marker D19S886 in the human chromosome 19pl3.3 region and the LKB1 gene is schematically shown.
  • tel indicates telomere
  • cen indicates the direction in which the centromere exists.
  • the aligned partially overlapping cosmid clones are shown.
  • Fig. 3a shows a family tree of Poijega-Patient A over three generations. The right half is filled The shaded symbol indicates the affected member.
  • b shows the results of long distance PCR analysis using the DJ666 primer and the DJ660 primer. Only the affected member has an abnormal amplification product of 2.5 kbp, indicated by a closed triangle.
  • c shows the results of PCR analysis using DJ666 and DJ684. An amplification product was observed only in the affected member, indicating that an inversion was present.
  • FIG. 4 shows an agarose electrophoresis image of each exon of LKB1 amplified by PCR. The number of the exon being amplified is shown above. MW represents a molecular weight marker.
  • FIG. 5 is an electrophoretic image showing the results of analysis by PCR-RFLP. Ahdl, BsrBI, R sal, and Seal represent samples treated with the respective restriction enzymes. WT indicates a healthy person, B indicates a boy Jager patient B, FA indicates a boy Jager patient FA, MA indicates a boy Jager patient MA, D indicates a DNA sample obtained from a Peutz Jager patient D . MW indicates a molecular weight marker.
  • FIG. 6 is a diagram showing the autophosphorylation ability of the immunoprecipitated LKB1 protein in the presence of various divalent cations. It can be seen that the autophosphorylation ability (kinase activity) of LKB1 is not activated very much by Mg 2+ but is strongly activated by Mn ".
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the autophosphorylation ability of the wild-type LKB1 protein and each mutant.
  • the upper panel is an autoradiography image showing autophosphorylation ability
  • the lower panel is the result of Western plotting stained with anti-c-Myc antibody. It can be seen that almost the same amount of each protein was produced.
  • FIG. 8 is an electrophoresis image showing the results of Western blot analysis of the GST-fused LKB1-myc protein expressed in E. coli.
  • M indicates a molecular weight marker
  • 1 indicates Escherichia coli lysate before induction with IPTG
  • 2 indicates Escherichia coli lysate after induction with IPTG
  • 3 indicates GST-fused LKB myc protein purified by glutathione sepharose.
  • the filter labeled “anti-Myc antibody” shows the results of staining with anti-myc antibody
  • the filter labeled “anti-LKB1 antibody” shows the results stained with affinity-purified anti-LKB1 peptide antibody.
  • FIG. 9 shows the results of Western blotting using each antibody.
  • Lane 1 is a lysate of C0S7 cells transfected with the pcDNA3 vector alone
  • lane 2 is a lysate of C0S7 cells transfected with pcDNA3 / LKBlmyc
  • lane 3 is a lysate of HeLa S3 cells. . Stained with the antibody shown on the left and anti-C-Myc antibody. The peptide used for the pre-incubation is shown at the top.
  • FIG. 10 is a diagram showing a tissue section of a human fetal colon stained with an anti-LKB1 P3 antibody.
  • the cytoplasm of epithelial cells is stained. Also, some cells considered to be endocrine cells are stained very strongly.
  • FIG. 11 is a diagram in which a tissue section of a human adult renal sulcus is stained with an anti-LKB1 P3 antibody. The islet cell group c is stained.
  • FIG. 12 shows a tissue section of a human fetal testis stained with an anti-LKB1 P3 antibody. C Undeveloped germ cells are strongly stained. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Cosmid clone contig in human chromosome 19pl3.3 region For the 19pl3.3 region of human chromosome, aiming at efficient identification of all genes in the region, a continuous clone consisting of cosmid clones etc. (Aligned clone. Contig) was constructed. First, from the group of cosmid clones mapped to this region by FISH mapping or the like, appropriate cosmids having short but different overlapping portions are selected, and the space between these clones is removed from the cosmid library, phosmi library. Screening BAC libraries and obtaining clones to fill them sequentially (cosmid walking, chromosome Ng).
  • a continuous clone contig consisting of L 5 bp in the 19pter region of the chromosome was constructed, and a high-resolution physical map was prepared.
  • the construction of the clone contig was performed as follows. Two chromosome 19-specific cosmid libraries cloned into the Lawrist5 vector and Lawristl6 vectors, a chromosome 19-specific fosmid library cloned into the pBeloBacll vector, a whole human genomic cosmid library (Stratagene), and all humans.
  • GZMM locus Pierat, D. et al. The human Met-ase gene (GZMM): structure, sequence and close physical linkage to the e ).
  • Cosmid walking was started from the ends of two contigs containing serine protease gene cluster on 19pl3.3. Genomics 24, 445-450 (1994). In other words, using the EcoRI fragment at the end of the contig as a probe, high-density cosmid filters and fosmid filters were screened with Cotl DNA (New England Biolabs) under reduced background conditions to obtain sequentially overlapping clones. Was.
  • the ends of the cosmid insert were sequenced directly using the Llawrist vector-specific primers DJ180 (SEQ ID NO: 35 / CGACTCACTATAGGGAGACCCA) and DJ181 (SEQ ID NO: 36 / CCTCGAGMTTACCCTCA CTAA).
  • the resulting sequence is used to (i) search a database to identify new genes that show significant homology to known genes, and (ii) to perform further chromosome tracking. It was used for preparing STS (Sequence Tagged Site).
  • STS Sequence Tagged Site
  • mapping was performed in this contig by the same method. Furthermore, by searching for sequences such as the LLNL database [http: ⁇ www-Mo.llnl.gov] using the sequence at the end of the cosmid, a newer gene can be added to this contig. Identified within.
  • genes that could be the causative gene of Peutz-Jeghers syndrome were selected in consideration of various biological information such as information on analysis of counterpart genes in other species. In each case, the presence or absence of mutations in the chromosomal DNA of patients was searched using DNA samples prepared from Koz-Jeger patients.
  • LKB1 gene was present in the R29114 clone and the R26552 clone adjacent to this clone, and it was confirmed that the LKB1 gene was present in this region.
  • primers for PCR and sequencing were designed based on the LKBlcDNA sequence (1302 bp) to determine the entire exon-intron structure of the LKB1 gene (see Tables 1 and 2 below). 2) The analysis was performed. Individual gene segments were amplified by PCR from cosmid DNA and sequenced by directly sequencing the PCR products. By comparing the sequence thus obtained with the LKBlcDNA sequence, the positions of exons and splice sites of all introns were identified.
  • the positions of all exons on the restriction map are determined by comparing restriction enzyme sites found in the genome sequence and by comparing the distance between each gene segment by long distance PCR (Long Distanse PCR). ( Figure la).
  • DJ666 5 '-GGTGATGGAGTACTGCGTGTG-3' (SEQ ID NO: 26 / exon 3) DJ684 5 '-ACATCGGGAAGGGGAGCTACG-3' (SEQ ID NO: 27 / exon 6) DJ660 5 '-CCGGGCACCGTGAAGTCCTG-3' (SEQ ID NO: 28 / exon 8) DJ650 5 '-TCACTGCTGCTTGCAGGCC-3' (SEQ ID 29 / exon 9) DJ717 5 '-GCAGGCGGCCAGCCTCA-3' (SEQ ID 30 / exon 9)
  • Mutation analysis was performed using DNA samples from five unrelated Peit's Jega patients (A, B, D, MA, FA,). First, gene deletion and rearrangement were screened by long-distance PCR using the primer sets DJ659 and DJ660 and DJ666 and DJ660.
  • PCR using primers DJ666 and DJ660 resulted in a 3.9 kbp amplification product in MA samples from all patients and control healthy subjects.
  • a single product of 2.5 gbp was simultaneously observed in a single patient, a patient of Poetry and Jega (Fig. 3b).
  • Fig. 3b After subcloning this DNA fragment, determine the base sequence, Comparison with the corresponding normal chromosomal DNA sequence revealed that there was a complex chromosomal rearrangement in the LKB1 gene in this patient ( Figure lb). That is, the 2.5 kbp PCR product had two mutations, a 1286 bp deletion between introns 3 and 5, and an 81 bp deletion within intron 7, respectively. Larger deletions include exons 4 and 5.
  • RNA isolated from peripheral blood cells of Patient A was isolated using the Blood RNA Isolation Kit (Qiagen) and reverse transcribed into cDNA using Superscript (GIBCO-BRL, Life Technologies). PCR using the primer set DJ660 and DJ666 yielded two products, 730 bp and 270 bp. The difference in length of about 460 bp between the two is well consistent with the transcript encoded by exons 4 to 7 being 456 bp, and the transcript in which exons 4 to 7 are spliced out due to this complex mutation. Was thought to have occurred.
  • DJ674 5'-AAGGAGACGGGAAGAGGAGCAG-3 '(SEQ ID NO: 10 / exon 2 antisense) DJ690 5'-GAGGAGGGGCAAGGTGGGT-3' (SEQ ID NO: 11 / exon 3 sense)
  • DJ693 5'-TCAGTCCTCTCAATGCCTGCTG-3 '(SEQ ID NO: 16 / exon 6 antisense) DJ696 5'-GCGGGGTCCCCCTTAGGAG-3' (SEQ ID NO: 17 / exon 7 sense)
  • DJ702 5 '-TGCTCCCGTGGGACATCCTG-3' (SEQ ID NO: 20 / exon 8 antisense) DJ676 5 '-GTAAGTGCGTCCCCGTGGTG-3' (SEQ ID NO: 21 / exon 9 sense)
  • exons 4 and 5 were simultaneously amplified in one PCR because of the short intron. Analysis revealed that mutations were present in one of the LKB1 alleles in all patients. Table 3 shows the results. The codon in the table is the last Indicates the number of the wild-type codon. Restriction enzyme sites were used to prove the presence or absence of mutations in PCR products from Peutz-Jeger patients and healthy subjects. Tens of restriction enzymes indicate the acquisition and elimination of restriction enzyme sites by mutation, respectively.
  • the base number of LKB1 in B, MA, and FA patients was in accordance with the base sequence number of LKB1 cDNA registered in Genbank accession number U63333.
  • the LKB1 base number of the D patient was in accordance with the base sequence number of the LKB1 gene registered in Genbank accession number AF032985.
  • the LKB1 gene structure was also examined in a Japanese polyposis patient (SK1) suspected to be a Peutz-Jegher patient. Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of this patient using the QIAamp Blood kit (Qiagen), and the LKB1 gene was amplified by PCR using the primers listed in Table 2 as type II. When this PCR product was directly sequenced and analyzed, there was a single base (C) deletion (the “GAC” “C” deletion corresponding to the 207th Asp) in the exon 5 coding region. I found that. It was thought that this mutation caused a frameshift after the Asp at position 207, resulting in a protein of incomplete length, probably without kinase activity.
  • C single base
  • the amplification of the LKB1 gene from the DNA sample by PCI was performed basically under the following conditions.
  • As a reaction solution use a total of 50/1 reaction solution containing chromosomal DNA ( ⁇ DNA) lOOng, primer 50 pmol, PCR buffer I J (Invitrogen), Ampl iTaq (Perkin Elmer) 2.5 Unit, and DMSO 2.5 / 1.
  • TaKaRa 0.4 ⁇ 1
  • TaqStart TM Antibody (CLON TECH) 0.4 / 1
  • a total of 50 1 reaction solution was used.
  • the reaction was performed for 2 to 4 minutes at 94 ° C, followed by 35 cycles of ⁇ 30 to 45 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 58 ° C or 62 ° C, and 45 seconds at 72 ° C '', Then, the reaction was performed at 72 ° C for 3 minutes.
  • the PCR product is purified from the gel after agarose electrophoresis using the QI Aquick Gel Extraction kit (Qiagen), or from the PCR reaction solution using the QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen). It was sequenced directly from both directions.
  • Sequencing was performed using a Drhoda mine terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems).
  • Applied Biosystems After amplifying the region containing the mutation from the DNA sample prepared from each patient by PCR under the above conditions, cut it with restriction enzymes corresponding to each mutation, and examine the length of the cut fragment. As a result, it was confirmed that these mutations were not PCR errors or sequencing errors (PCR-RFLP analysis). That is, PCR amplification product restriction enzymes (Ahd I, BsrB I, Rsal, Seal) A total of 201 reaction solutions containing 4 Unit s restriction enzyme buffer 2 ⁇ 1 were incubated at 37 ° C for 1.5 hours, and agarose The length of each DNA fragment was examined by electrophoresis.
  • LK E1 primer SEQ ID NO: 39 / 5'-gat g aa ttc ggg tec age atg gag gtg gtg gac-3 '
  • E2 primer SEQ ID NO: 40 / 5'-
  • a c-Myc epitope sequence at the C-terminus SEQ ID NO: 41 / Glu Gin
  • pcDNA3 / LKBlmyc was type I, and an in vitro mutagenesis using GeneEditor (Promega) was used to produce an expression plasmid DNA into which mutations including amino acid substitution mutations found in Peutz-Jieger patients were introduced. did. That is, the expression plasmid KDNA (pcDNA3 / LKBl D176Nmyc) having the D176N mutation (mutation in which Asp at position 176 replaces Asn; the same applies hereinafter) was used for the LK D176N primer (SEQ ID NO: 45 / 5'-at).
  • LK W308C primer SEQ ID NO: 46/5, -egg cag cac age tgc ttc egg aag aaa-3, for the W308C mutation (pcDNA3 / LKBl W308Cmyc)
  • LK L67P primer SEQ ID NO: 47/5, -gtg aag gag gtg ccg gac tcg gag acg-3 '
  • L67P mutation pcDNA3 / LKBl L67Pmyc
  • K78I mutation pcDNA3 / LKBl K78Imyc
  • Mutagenesis was carried out using KIl primer (SEQ ID NO: 48/5, -agg agg gcc gtc atcate etc aag aag-3,) as a primer for mutagenesis.
  • Both the primer for mutation introduction and the primer for selection (for bottom strand) attached to the kit were annealed with the single-stranded type I plasmid DNA to synthesize a new DNA strand. This was introduced into Escherichia coli, and a clone retaining the plasmid having the mutation was selected as a GeneEditor TM antibiotic-resistant clone. The mutation was confirmed by sequencing and used for expression experiments.
  • LK E4 primer (SEQ ID NO: 42 / 5'-gat ggg c cc tta cag gga ggc ata gtc agg cac ate ata tgg gta ctg ctg ctt gca ggc c ga-3 ') instead of LK E2 primer or LK Perform PCR using the E5 primer (SEQ ID NO: 43/5, -gat gaa ttc tta gtg atg gtg atg gtg atg ctg ctg gca ggc cga-3 '), and integrate the obtained fragments into various vectors.
  • Epito Ichipu that is recognized by anti-HA antibody (SEQ ID NO: 4 4 / NH 2 - YPYDVPDYASL- C00H) and histidine (H) is Six consecutive sequences (histidine hexamer) will be added to the C-terminal.
  • H histidine
  • NP40 kinase lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.8, 13 ⁇ 4 NP40, 0.15 M sodium chloride, ImM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 5 mM sodium pyrophosphate, 10 ⁇ g / ml aprotinin, ImM PMSF).
  • the protein was turbid and solubilized by mixing at 4 ° C for 30 minutes. Protein A / G plus agarose (Santa Cruz) was added to the cell lysate thus obtained, and the mixture was mixed for 30 minutes to remove non-specifically adsorbed proteins to the beads.
  • anti-c-Myc antibody A14 (Santa Cruz) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 1 hour. Then, protein A / G plus agarose was added, and the mixture was allowed to stand for 1 hour. The immunocomplex is precipitated by centrifugation, washed several times with NP40 Quina-Zelesis buffer, a buffer containing 1 M sodium chloride, and 50 mM Tris-HCl (pH 7.8). Was served.
  • the kinase assay was performed in a reaction system containing 50 mM Tris-HCl (pH 7.8), ImM DTT, lOmM divalent cation (Mn, etc.) and 10 ° Ci [ ⁇ - 32 P] ATP in a total amount of 50 ⁇ 1.
  • the immunoprecipitate was incubated at 37 ° C. for 30 minutes in this kinase assay solution to carry out the reaction, and then the reaction was stopped by adding an SDS-PAGE sample buffer and boiling, followed by SDS-PAGE.
  • the gel was fixed with a methanol / acetic acid solution, dried, and the image was analyzed using a BAS200 image analyzer (Fuji Film). LKB1 kinase activity is autophosphorus It was determined as oxidizing ability.
  • the expressed protein was detected after SDS-PAGE by Western plotting using anti-c-Myc antibody A14.
  • pGEX / LKBlmyc was introduced into E. coli DH5 strain to obtain a single colony. After this was cultured at 37 ° C- ⁇ ⁇ in 10 ml of 2xY ⁇ medium, a part thereof was diluted 100-fold with a new 2xYT medium, and the culture was continued at 37 ° C until the 0D at 600 nm became 0.6. Thereafter, IPTG (isopropyl-3-D (-)-thiogalactovyranoside) was added to a final concentration of O. lmM, and the culture was further continued for several hours.
  • IPTG isopropyl-3-D (-)-thiogalactovyranoside
  • Escherichia coli was collected by centrifugation, suspended in 1% TritonX-100, 1% Tween 20, PBS, and subjected to sonication to disrupt cells and solubilize the protein.
  • LKB1 protein expressed as a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) was purified from this solubilized sample by affinity purification using glutathione sepharose 4B (Pharmacia). did.
  • LKB1 protein expressed in Escherichia coli was also detected by Western blotting using anti-C-Myc antibody A14 (FIG. 8).
  • LKBl P6 (equivalent to 27-# 45) peptide NH 2 - CHMDSTEVIYQPRRK KL- C00H (SEQ ID NO: 3 4)
  • LKB1 P3 (corresponding to 400- 417 No.) peptide NH 2 -CLSTKSRAEGRAPNPARKA- C00H (SEQ ID NO: 3 1)
  • FIG. 9 shows the results of Western blotting using these antibodies (anti-LKB1 P6 antibody-recognizing the N-terminal side, anti-LKB1 P3 antibody-recognizing the C-terminal side). It was shown that both antibodies could detect a band (arrow) of about 55 kDa, which is considered to be LKBlmyc protein expressed in C0S7 cells. Since this reaction was blocked by pre-incubating the antibody with a large excess amount of the peptide used as the antigen in advance, it was considered that this reaction was specific to the epitope. In addition, no cross-reactivity was seen in HeLa S3 cell lysates, which are known not to express LKB1, indicating that these antibodies can detect LKB1 protein very specifically. Became clear. In addition, it was confirmed that LKB1 protein expressed as a GST fusion protein by E. coli was also detected by anti-LKB1 P3 antibody (Fig. 8).
  • FIG. 10 is a diagram showing a tissue section of a human fetal colon stained. The cytoplasm of epithelial cells is stained. In addition, it can be seen that some cells considered to be endocrine cells are stained very strongly.
  • FIG. 11 shows a tissue section of a human adult spleen stained. Islet cells are stained.
  • FIG. 12 shows a tissue section of a human fetal testis stained. Immature germ cells are strongly stained. All of these stains were obtained with anti-LKB1 P3 antibody, but similar results were obtained with anti-LKB1 P6 antibody. In addition, these reactions disappeared by pre-incubation with each antigen peptide, and are considered to be specific staining.
  • Industrial applicability was obtained with anti-LKB1 P3 antibody, but similar results were obtained with anti-LKB1 P6 antibody. In addition, these reactions disappeared by pre-incubation with each antigen peptide, and are considered to be specific staining.
  • the Boyt-Jega syndrome is caused by a mutation in the LKB1 gene.
  • This enables testing and treatment of diseases caused by mutations in the LKB1 gene, such as Koz-Jeghers syndrome, using the LKB1 gene, primers or probes based on its sequence, LKB1 protein, and its antibodies. It became possible.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

L K B 1遺伝子の変異に起因する疾患の検査方法、 検査薬、 および治療薬 技術分野
本発明は、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の検査方法、 並びに該疾患の検査 薬および治療薬に関する。 背景技術
ポイツ 'イエガー症候群 [MIM 175200]は、 唇、 口周囲、 および類の黒褐色色素 沈着、 ならびに良性 ·過誤腫性 ·腺腫性の多発性胃腸ポリープを特徴とする、 常 染色体優性遺伝を示す症候群である。 この症候群の患者は、 さらに、 胃腸管、 脬 臓、 卵巣、 精巣、 乳房、 および子宮に良性や悪性の腫瘍を高頻度で生じることが 知られている。 特に、 卵巣には小型の良性腫瘍が高頻度に発生し、 これらの小腫 瘍は、 環状管 （annular tubule) を有する多病巣性の左右相称の性索構造として 発達する。 そして、 顆粒層癌へと進行し、 少女に両性の早熟をもたらすことがあ る。 少年における多病巣性性索癌は、 頻度は低いが、 過剰にエストロゲンが産生 される結果として、 女性化乳房および女性化を引き起こすことが見出されている。 ポイツ ·イエガー症候群の原因遺伝子 （ボイヅ ·イエガ一遺伝子） が欠損するこ とにより、 広範囲の新生物疾患に対する素因が与えられると考えられており、 実 際に、 欠損ポイツ 'イエガー遺伝子を対立遺伝子の片方に持つキャリアーの 50% が 60才までに癌を発症することが知られている （Giardiello, F.M. et al . Incr eased risk oi cancer in the Peutz - Jeghers syndrome . N. Engl . J. Med. 316, 1511-1514 ( 1987) . 、 Spigelman, A.D. , Murday, V. & Phillips, R.K. Cancer and the Peutz-Jeghers syndrome. Gut 30, 1588-1590 ( 1989) . [MIM 17520 0] ) 。 ポイツ ·イエガー遺伝子産物が欠損するかまたは不活化されることにより、 潜在的に高増殖能を有する体細胞における基本的な増殖調節機構が損なわれ、 良 性の過誤腫ポリープの成長が開始され、 やがてその中から、 さらなる遺伝子変化 を経て悪性の腫瘍細胞が生じてくるものと考えられている。
近年、 ボイヅ ·イエガー症候群患者の 12家系の連鎖解析により、 ボイッ ·イエ ガー遺伝子とマイクロサテライ ト遺伝子マ一カー D19S886とのマルチボイントロッ ド値 (multipoint lod score) は 7.00を示し、 染色体 DNA上の 19pl3.3領域にマツ プされること力報告された (He腿 inki , A. et al . Localization of a suscepti bilty locus for Peutz - Jeghers syndrome to 19p using comparative genomic hybridization and targeted linkage analysis. Nature Genet. 15, 87-90 ( 19 97) . ) 。 さらに、 別の 5家族について調べられた第二の研究 （Amos， C. I . et al .
Fine mapping of a genetic locus for Peutz - Jeghers syndrome on chromosom e 19p. Cancer Res. 57, 3653-3656 ( 1997)) においても同様に、 ポィヅ 'イエガ 一遺伝子と遺伝子マーカー D19S886との連鎖 （マルチボイントロッド値は 7.52) が報告された。 元来、 ポイツ ·ィエガー遺伝子と組み換えを示す最も近傍の遺伝 子マーカ一として D19S565が知られていたが、 さらにその近傍に位置する遺伝子マ —カー D19S878も報告され、 これらのマーカ一の位置がポイツ ·イエガ一遺伝子の 候補領域の境界であると考えられた。 いずれの連鎖解析においても、 遺伝子マー 力一 D19S886とポィヅ ·イエガー遺伝子との間には組み換えが見られなかったこと から、 両者が近傍に存在していることが推測された。 発明の開示
本発明はポイツ ·イエガー症候群の原因遺伝子を解明し、 該遺伝子の変異に起 因する疾患の検査方法、 ならびに該疾患の検査薬および治療薬を提供する。
本発明者らは、 ポイツ ·イエガー症候群の原因遺伝子を解明すべく、 まず、 ポ イツ ·イエガー遺伝子が存在する染色体 19pl3.3領域の 1.5Mbp以上の範囲につき、 連続コスミ ドコンティグの構築、 および制限酵素地図の作製を行った。 次いで、 ESTデ一夕一ベースを利用してこの領域内にマップされる遺伝子を探索し、 さらに それら遺伝子の正確な位置を決定した。 次いで、 生物学的情報の評価などを通じ て、 見いだされた多くの遺伝子の中からポイツ ·イエガー遺伝子の有力な候補を いくつか特定した。 そして、 ポイツ ·イエガー症候群患者 DNAにおけるこれら遺伝 子の変異を順次解析した結果、 この中の一つの遺伝子 「LKB1」 がポィヅ ·ィェガ 一症候群患者に特異的に変異していることを見いだした。 即ち、 本発明者等は、 鋭意研究を行った結果、 ポイツ ·イエガー症候群の原因遺伝子を解明することに 初めて成功するに至った。 そして、 これにより LKB1遺伝子、 その塩基配列に基づ くプライマーやプローブ、 LKB1タンパク質、 および LKB1タンパク質に結合する抗 体などを利用して、 LKB1遺伝子の変異に由来する疾患の検査および治療を行うこ とが可能であることを見いだすに至った。
即ち、 本発明は、 ポイツ ·イエガー症候群の原因遺伝子である 「LKB1」 遺伝子 の変異に起因する疾患の検査方法、 並びに該疾患の検査薬および治療薬に関し、 より具体的には、
( 1 ) 配列番号： 1乃至 4のいずれかに記載の塩基配列の少なくとも一部を含 む塩基配列からなる、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の検査に用いるプライマ -DNA,
( 2 ) 配列番号： 7乃至 3 0のいずれかに記載の塩基配列からなる、 （ 1 ) に 記載のプライマー DNA、
( 3 ) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がポイツ ·イエガー症候群である、 ( 1 ) または （2 ) に記載のプライマー DNA、
( 4 ) 配列番号： 1乃至 4のいずれかに記載の塩基配列の少なくとも一部を含 む塩基配列からなる、 LKB 1遺伝子の変異に起因する疾患の検査に用いるプローブ DNA、
( 5 ) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がポイツ ·イエガー症候群である、 ( 4 ) に記載のプローブ DNA、 (6) LKBl遺伝子を有効成分とする、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療 薬、
(7) LKB1タンパク質を有効成分とする、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の 治療薬、
(8) LKB1タンパク質の活性を促進する化合物を有効成分とする、 LKB1遺伝子 の変異に起因する疾患の治療薬、
( 9 ) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がボイッ ·イエガー症候群である、 ( 6) 乃至 （8) のいずれかに記載の治療薬、
( 1 0) LKB1タンパク質に結合する抗体を有効成分とする、 LKB1遺伝子の変異 に起因する疾患の検査薬、
( 1 1) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がポィヅ 'イエガー症候群である、 ( 1 0) に記載の検査薬、
( 1 2) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、 LKB1遺伝 子の変異を検出することを特徴とする方法、
( 1 3) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から DNA試料を調製する工程、
(b) ( 1) に記載のプライマ一 DNAを用いて患者由来の DNAを増幅する工程、
(c) 増幅した DNAを切断する工程、
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程、
( e) 分離した DNA断片に対し、 （4) に記載のプローブ DNAをハイブリダィズさ せる工程、
(f ) 検出された DNA断片の大きさを、 健常者の対照と比較する工程、 を含む方法、
( 14) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から RNA試料を調製する工程、
(b) 大きさに応じて調製した RNAを分離する工程、 ( c) 分離した RNAに対し、 （4) に記載のプローブ DNAをハイブリダィズさせる 工程、
(d) 検出された RNAの大きさを、 健常者の対照と比較する工程、
を含む方法、
( 15) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から DNA試料を調製する工程、
(b) ( 1) に記載のプライマ一 DNAを用いて患者由来の DNAを増幅する工程、
(c) 増幅した MAを一本鎖 DNAに解離させる工程、
(d) 解離させた一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程、
(e) 分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、 を含む方法、
( 16) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から DNA試料を調製する工程、
(b) ( 1 ) に記載のプライマー DNAを用いて患者由来の DNAを増幅する工程、
(c) 増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
(d) 分離した DNAのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、 を含む方法、
( 17) LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がポイツ ·イエガ一症候群である、 ( 12) 乃至 （ 16) のいずれかに記載の検査する方法、
に関する。
本発明は、 ポイツ 'ィエガー症候群が 「LKB1」 と名付けられた遺伝子の変異に 起因して発症するという本発明者等による知見に基づく。 本発明は、 第一に、 LK B1をコードするゲノム DNA領域 （ェキソン領域の他、 イントロン領域、 プロモー夕 —領域、 ェンハンサ一領域を含む） の塩基配列の少なくとも一部を含むヌクレオ チド、 および LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の検査のための該ヌクレオチドの 利用に関する。 LKB1のゲノム DNA領域を配列番号： 1から 4に示す。 配列番号： 1 は LKB1遺伝子の 5'側上流領域を含む遺伝子配列であり、 配列番号： 2は LKB1遺伝 子のェキソン 1およびイントロン 1 (一部） であり、 配列番号： 3は LKB1遺伝子 のェキソン 2乃至 8およびイントロン 1 (一部） 乃至 8 (—部） であり、 配列番 号： 4はイントロン 8 (—部） およびェキソン 9である。
これら領域の一部を含むヌクレオチドは、 プライマ一またはプローブとして LK B 1遺伝子の変異に起因する疾患の検査に利用することができる。 プライマ一とし て用いるヌクレオチドは、 通常、 15bp〜100bpであり、 好ましくは 17bp〜30bpであ る。 プライマ一は、 LKB1遺伝子またはその発現を調節する領域の少なくとも一部 を増幅しうるものであればいかなるものでもよい。 このような領域としては、 例 えば、 LKB1遺伝子のェキソン領域、 イントロン領域、 プロモーター領域、 ェンハ ンサ一領域が含まれる。 一方、 プローブとしてのヌクレオチドは、 合成オリゴヌ クレオチドであれば、 通常、 少なくとも 15bp以上の鎖長を有する。 プラスミ ド DN Aなどのべクタ一に組み込んだクローンから得た二本鎖 DNAをプロ一ブとして用い ることも可能である。 プローブとして利用する領域としては、 LKB1遺伝子または その発現を調節する領域の少なくとも一部であればいかなるものでもよい。 この ような領域としては、 例えば、 LKB1遺伝子のェキソン領域、 イントロン領域、 プ ロモ一ター領域、 ェンハンサー領域が含まれる。 プローブとして用いる場合、 ォ リゴヌクレオチドあるいは二本鎖 DNAは適宜標識して用いられる。 標識する方法と しては、 例えば、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの 5' 端を^でリン酸化することにより標識する方法や、 クレノゥ酵素などの DNAポリメ ラーゼを用い、 ランダムへキサマーォリゴヌクレオチドなどをプライマーとして、 32Pなどのアイソトープ、 蛍光色素、 あるいはビォチンなどにより標識された基質塩 基を取り込ませる方法 （ランダムプライム法など） が挙げられる。
これらヌクレオチドを利用して検出する LKB1遺伝子の変異に起因する疾患とし ては、 ポイツ ·イエガ一症候群に限られない。 LKB1遺伝子の変異に起因するすべ ての疾患が含まれる。 PTEN遺伝子や APC遺伝子はそれそれ遺伝性の癌である Cowde n病（Cowden' s disease ), 及び家族性腺腫性ポリポ一シス（Famil ial Adenomatous polyposis/FAP)の原因遺伝子として発見されたが、 双方とも、 遺伝性ではない一 般の癌においても高頻度に変異が起こっていることが明らかになつている。 PTEN 遺伝子あるいは APC遺伝子は、 正常組織においては細胞の増殖を制御するために働 いているが、 それらが変異し機能を失うことにより、 細胞がその制御から外れ、 癌化への大きな一つのステップが進むものと考えられている。 これら PTEN遺伝子 や APC遺伝子のように、 LKB1遺伝子もそれが変異を起こすことにより一般の癌の発 生に関与している可能性が考えられる。
本発明における LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の検査は、 LKB1遺伝子の変異 を検出することを特徴とする。 本発明において 「LKB1遺伝子の変異に起因する疾 患の検査」 とは、 LKB1遺伝子の変異に起因して特定の症状を発現している患者の 検査のみならず、 被験者が LKB1遺伝子の変異に起因する特定の疾患にかかりやす いか否かを判断するために行う、 LKB1遺伝子の変異の検査も含まれる。 すなわち、 LKB1対立遺伝子の片方に変異が生じることにより、 表面上は未だ症状を発現して いない場合においても、 LKB1遺伝子の変異に起因する特定の疾患にかかる危険性 が非常に増大しているものと考えられる。 このような片方の LKB1対立遺伝子に変 異を持つ患者 （キャリアー） を特定するための検査も本発明に含まれる。 また、 本発明における 「LKB1遺伝子の変異の検出」 には、 DNAにおける検出、 RNAにおけ る検出の他、 タンパク質における検出が含まれる。
本発明の検査方法の一つの態様は、 患者の LKB1遺伝子の塩基配列を直接決定す る方法である。 例えば、 上記ヌクレオチドをプライマ一として、 LKB1の変異に起 因する疾患の疑いのある患者から単離した DNAを鍊型として、 PCR (Polymerase C hain Reaction) 法などにより、 患者の LKB1遺伝子の一部もしくは全部を増幅し、 その塩基配列の決定を行う。 これを健常者の LKB1遺伝子の塩基配列と比較するこ とにより、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査することができる。
本発明の検査方法としては、 このように直接患者由来の DNAの塩基配列の決定を 行う方法以外にも種々の方法を用いることができる。 その一つの態様は、 （a ) 患者から DNA試料を調製する工程、 （b ) 本発明のプライマー DNAを用いて患者由 来の DNAを増幅する工程、 （c ) 増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離する工程、 （d ) 解離した一本鎖 DNAを非変性ゲル上で分離する工程、 （e ) 分離した一本鎖 DNAの ゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、 を含む。
このような方法として、 PCR-SSCP (.single-strand conformation polymorphis m、 一本鎖高次構造多型) 法 (Cloning and polymerase chain reaction-single- strand conformation polymorphism analysis of anonymous Alu repeats on ch romosome 11. Genomics. 1992 Jan 1 ; 12( 1 ) : 139-146. Detection of p53 gen e mutations in human brain tumors by single-strand conformation polymorp hism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene. 1991 Aug 1 ; 6(8) : 1313 - 1318.ヽ Multiple fluorescence-based PCR-SSCP analysis with postlabeling. 、 PCR Methods Appl . 1995 Apr 1 ; (5) : 275-282. ) が挙げられ る。 この方法は操作が比較的簡便であり、 また試料の量も少なくてすむなどの利 点を有するため、 特に多数の DNAサンプルをスクリーニングするのに好適である。 その原理は以下の如くである。 二本鎖 DNA断片を一本鎖に解離すると、 各鎖はその 塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。 この解離した DNA鎖を変性剤を含 まないポリアクリルアミ ドゲル中で電気泳動すると、 それそれの高次構造の差に 応じて、 相補的な同じ鎖長の一本鎖 DNAが異なる位置に移動する。 一塩基の置換に よってもこの一本鎖 DNAの高次構造は変化し、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動に おいて異なる移動度を示す。 従って、 この移動度の変化を検出することにより検 査対象の DNA断片に点突然変異や欠失、 あるいは挿入などによる変異が存在するか 否かを検出することができる。
PCR- SSCP法においては、 まず、 LKB1遺伝子の一部あるいは全部を PCR法などによ つて増幅する。 増幅される範囲としては、 通常 200-400bp程度の長さが好ましい。 また、 増幅される領域としては、 LKB1遺伝子のェキソン、 イントロン、 LKB1遺伝 子のプロモータ一、 およびェンハンサ一が含まれる。 PCRは、 通常の条件 （例えば、 実施例 5に示したプライマ一による各ェキソンを増幅する反応の条件） で行うこ とができる。 PCRによる遺伝子断片増幅の際、 "Pなどのアイソトープ、 蛍光色素、 あるいはピオチンなどによって標識したプライマ一を用いるか、 または PCR反応液 に32 Pなどのアイソトープ、 蛍光色素、 あるいはビォチンなどによって標識した基質 塩基を加えることによって、 PCR反応により合成される DNA断片を標識する。 PCR反 応後にクレノウ酵素などを用いて32 Pなどのアイソトープ、 蛍光色素、 あるいはピオ チンなどによつて標識した基質塩基を合成された DNA断片に付加することによって、 該 DNA断片の標識を行うこともできる。 こうして得られた標識された MA断片を加 熱などにより変性し、 尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミ ドゲルによ つて電気泳動を行う。 この際、 ポリアクリルアミ ドゲルに適量 （5から 10%程度） のグリセロールを添加することにより、 DNA断片の分離の条件を改善することがで きる。 また、 泳動条件は各 DNA断片の性質により変動するが、 通常、 室温 (20から 25°C )で行い、 好ましい分離が得られないときには 4から 30°Cまでの温度で最適の 移動度を与える温度の検討を行うことが好ましい。 電気泳動後、 DNA断片の移動度 を X線フィルムを用いたオートラジオグラフィ一や、 蛍光を検出するスキャナ一等 で検出し、 解析する。 移動度に差があるバンドが検出された場合、 このバンドを 直接ゲルから切り出し、 PCRによって再度増幅し、 それを直接シークェンシングす ることにより、 変異の存在を確認することができる。 また、 PCRにより合成された MA断片を標識しない場合においても、 電気泳動後のゲルをェチジゥムブ口マイ ド や銀染色法などによって染色することにより、 該 DNA断片のバンドを検出すること ができる。
本発明の検査方法の他の態様は、 （a ) 患者から DNA試料を調製する工程、 ( b ) 本発明のプライマー DNAを用いて患者由来の DNAを増幅する工程、 （c ) 増 幅した DNAを切断する工程、 （d ) MA断片をその大きさに応じて分離する工程、 ( e ) 分離した DNA断片に対し、 本発明のプローブ DNAをハイブリダィズさせるェ 程、 （f ) 検出された DNA断片の大きさを、 健常者の対照と比較する工程、 を含む。 このような方法としては、 制限酵素断片長多型 （Restriction Fragment Lengt h Polymorphism/RFLP) を利用した方法、 PCR- RFLP法などが挙げられる。 これらの 方法は、 制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、 あるいは制限酵素処理によ つて生じる DNA断片内に塩基の挿入や塩基の欠失が存在する場合、 制限酵素処理後 に生じる断片の大きさが健常者と比較して変化するという原理を利用する。 実際、 ボイッ ·イエガ一症候群に関しては、 実施例に示した 4人のボイヅ ·イエガー症候 群患者!)、 B、 MA、 FAの LKB1遺伝子において、 それそれ Sealサイ トの獲得、 Ahdlサ ィ 卜の消失、 Rsalサイ 卜の消失、 BsrBIサイ トの消失が存在した （表 3 ) 。 従って、 これら変異を含む領域を PCI こよって増幅し、 上記制限酵素で処理し、 これを電気 泳動することによって、 これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として 検出することができる。 あるいは、 患者由来の DNAをこれらの制限酵素によって処 理し、 電気泳動した後、 本発明のプローブ DNAを用いてサザンブロッテイングを行 うことにより、 変異の有無を検出することができる。 用いられる制限酵素は上述 したものの他、 それそれの変異に応じて適宜選択される。 この方法では、 患者か ら調製したゲノム DNAを制限酵素処理して変異を検出する他、 患者から調製した R NAを逆転写酵素で処理することにより調製した cDNAをそのまま制限酵素処理して、 サザンブロッテイングにより検出することもできる。 また、 この cDNAを鍊型とし て PCRを行い、 その増幅産物 （LKB1遺伝子の一部あるいは全部） を制限酵素で切断 した後、 電気泳動を行い、 DNA断片の移動度の差として変異を検出することもでき る。
また、 患者から調製した DNAの代わりに Aを用いても同様に検出することが可 能である。 このような方法は、 （a ) 患者から RNA試料を調製する工程、 （b ) 大 きさに応じて調製した RNAを分離する工程、 （c ) 分離した RNAに対し、 本発明の プローブ DNAをハイブリダィズさせる工程、 （d ) 検出された RNAの大きさを、 健 常者の対照と比較する工程、 を含む。 具体的な方法の一例としては、 患者から調 製した RNAを電気泳動し、 本発明のプローブを用いてノーザンプロティングを行い、 移動度の差を検出する。
本発明の検査方法の他の態様は、 （a ) 患者から DNA試料を調製する工程、 ( b ) 本発明のプライマ一を用いて患者由来の MAを増幅する工程、 （c ) 増幅し た DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、 （d ) 分離し た DNAのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、 を含む方法である。 このような方法としては、 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（denaturant gradie nt gel electrophoresis : DGGE)が挙げられる。 この方法においては LKB1遺伝子の 一部あるいは全部を本発明のプライマ一などを用いた PCRなどによって増幅し、 こ れを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなつているポリアク リルアミ ドゲル中で電気泳動し、 健常者と比較する。 変異が存在する DNA断片の場 合、 より低い変性剤濃度位置で DNA断片が一本鎖になり、 顕著に移動速度が遅くな るため、 この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができ る。
これら方法以外にも、 特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的ォ リゴヌクレオチド （Allele Specific Oligonucleotide/ASO) ハイブリダィゼーシ ヨン法が利用できる。 この方法においては、 変異が存在すると考えられる塩基配 列を含むォリゴヌクレオチドを作製し、 これと試料 MAとでハイプリダイゼ一ショ ンを行わせる。 変異が存在する場合には、 ハイブリッド形成の効率が低下するた め、 それをサザンブロット法や、 特殊な蛍光試薬がハイプリッドのギャップにィ ン夕一カレーシヨンすることにより消光する性質を利用した方法などにより検出 する。
また、 リボヌクレア一ゼ Aミスマッチ切断法による検出も可能である。 この方法 においては、 LKB1遺伝子の一部あるいは全部を PCRなどによって増幅し、 これをプ ラスミ ドベクタ一等に組み込んだ LKB1 cDNA等から調製した標識 RNAとハイブリダ ィゼ一シヨンさせる。 変異が存在する部分においてはハイプリッドが一本鎖構造 となるため、 該部分をリボヌクレアーゼ Aによって切断し、 オートラジオグラフィ
—などで検出する。 これにより変異の存在を検出することができる。
本発明は、 また、 LKB1タンパク質に結合する抗体を有効成分とする、 LKB1遺伝 子の変異に起因する疾患の検査薬に関する。 LKB1夕ンパク質に結合する抗体は、 当業者に公知の方法により調製することが可能である。 ポリクローナル抗体であ れば、 例えば、 LKB1タンパク質 （天然のタンパク質の他、 GSTとの融合タンパク質 として大腸菌において発現させた LKB1タンパク質のような、 適当な宿主細胞 （大 腸菌、 酵母、 哺乳類細胞） によって発現させたリコンビナント LKB1タンパク質を 用いることもできる） 若しくはその部分ペプチド （例えば、 配列番号： 31乃至配列 番号： 34に記載のァミノ酸配列からなるペプチド）をゥサギなどの小動物に免疫し 血清を得て、 これを、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DE AEイオン交換クロマトグラフィ一、 LKB1タンパク質や合成べプチドをカツプリン グしたァフィ二ティ一カラムなどにより精製することで調製することが可能であ る。 また、 モノクローナル抗体であれば、 LKB1タンパク質若しくはその部分ぺプ チドをマウスなどの小動物に免疫を行い、 同マウスより脾臓を摘出し、 これをす りつぶして細胞を分離し、 マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなど の試薬により融合させ、 これによりできた融合細胞 （ハイプリ ドーマ） の中から、 LKB1タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。 次いで、 得られ たハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水を回収し、 得られ たモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 LKB1タンパク質や合成べプチドをカツプリ ングしたァフィ二ティーカラムなどにより精製することで調製することが可能で ある。
抗体を検査薬として用いる場合、 滅菌水、 生理食塩水、 植物油、 界面活性剤、 脂質、 溶解補助剤、 安定剤 （BSAやゼラチンなど） 、 保存剤等を必要に応じて混合 する。 該抗体を用いた検査としては、 例えば、 患者から採取した組織、 あるいは 単離した細胞を、 酵素標識抗体法、 蛍光標識抗体法などの方法で染色し、 LKB1夕 ンパク質の欠損、 あるいは異常蓄積、 または異常な細胞内分布の検査を行う。 ま た、 ポイツ ·ィエガー患者などから採取した組織あるいは単離した細胞から細胞 抽出液を調製し、 これを SDS- PAGEなどの方法により分離し、 ニトロセルロース膜 や PVDF膜等にタンパク質を転写した後、 タンパク質を上記酵素抗体法等により染 色する方法 （ウエスタンブロッテイング、 ィムノブロッテイング） によっても検 出を行うこともできる。
本発明者等による、 第 19番染色体 pl3. 3領域における詳細な物理地図作製により、 ポイツ ·イエガ一症候群の原因遺伝子 LKB1とマイクロサテライ トマ一カー D19S88 6との染色体 DNA上における距離は約 190kbpで両者が非常に近接して存在すること が明らかにされた。 このため、 LKB1遺伝子変異に基づく各種疾患の検査として、 D19S886マーカーを用いたヘテロ接合体消失（Loss of Heterozygosity /LOH)を試験 する方法も有効であると考えられる。
また、 本発明は、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療薬に関する。 その一 つの態様は、 LKB1遺伝子を有効成分とする。 LKB1遺伝子を治療薬として用いる場 合、 LKB1ゲノム DNAの一部もしくは全長、 または LKB1 cDNA (配列番号： 5 ) を適 当なベクタ一、 例えば、 アデノウイルスベクタ一、 アデノ随伴ウィルスベクター、 レトロウイルスベクタ一、 あるいはプラスミ ド DNAなどに組み込み、 例えば、 経口 投与、 静脈内投与、 患部への局所投与等の方法により患者に投与する。 投与方法 としては、 インビボ法の他、 ェクスビボ法を用いることも可能である。 投与にお いて、 リン脂質などをミセル化して作製したリボソームに遺伝子を封入すること により、 組織移行性、 組織吸収性を高めることもできる。 またカチオン性の脂質 を加え、 遺伝子 MAと複合体を形成させることにより、 組織移行性、 組織吸収性を 高めることも可能である。 これにより患者体内における変異した LKB1遺伝子を正 常な遺伝子に置換したり、 また、 正常な遺伝子を付加的に患者に投与することが 可能であり、 その結果 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療を行うことができ る。
LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療薬に関する他の態様は、 LKB1タンパク 質を有効成分とする。 LKB1タンパク質は、 天然のタンパク質として、 また遺伝子 組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。 LKB1夕 ンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 6に示す。 天然のタンパク質は、 当業者に 周知の方法、 例えば、 実施例 7に記載の LKB1タンパク質の部分ペプチドに対する の抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィ一を行うことにより、 LKB1タン パク質発現の高い、 例えば、 精巣、 胎児肝臓、 あるいは K562細胞などの培養細胞 から単離することが可能である。 一方、 組換えタンパク質は、 例えば、 LKB1タン パク質をコードする DNA (配列番号： 5 ) で形質転換した細胞を培養することによ り調製することが可能である。 組換えタンパク質の生産に用いる細胞としては、 例えば、 COS細胞、 CH0細胞、 NIH3T3細胞などの哺乳類細胞、 Sf9細胞などの昆虫細 胞、 酵母細胞、 大腸菌 （E. coli) が挙げられる。 また、 細胞内で組換えタンパク 質を発現させるためのベクターは、 宿主細胞に応じて変動するが、 例えば、 哺乳 類細胞のベクタ一としては pcDNA3 ( Invitrogen) や pEF- BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18( 17)5p5322) などが、 昆虫細胞のベクタ一としては 「BAC-to- BAC baculo virus expression systenij (GIBCO BRL) などが、 酵母細胞のベクタ一としては rpichia Expression Kitj ( Invitrogen) などが、 大腸菌のベクタ一としては p GEX-5X-1 (Pharmacia) 、 「QIAexpress systemj (Qiagen) などが挙げられる。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラ ン法、 カチォニックリポソ一ム D0TAP (ベーリンガーマンハイム）や SuperFect (Qu iagen) を用いた方法、 エレクロポレーシヨン法、 塩化カルシウム法など公知の方 法を用いて行うことができる。 得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精 製は、 常法、 例えば、 文献 「The Qiaexpressionist handbook, Q iagen, Hilden, Ge rmanyj 記載の方法を用いて行うことが可能である。
得られた LKB1タンパク質を LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療薬として用 いる場合には、 LKB1タンパク質を直接投与することもできるが、 公知の製剤学的 製造法により製剤化して投与することもできる。 例えば、 薬剤として一般的に用 いられる担体または媒体、 例えば、 滅菌水、 生理食塩水、 植物油、 界面活性剤、 脂質、 溶解補助剤、 安定剤、 保存剤等と適宜組み合わせて投与しうる。 投与量は、 患者の体重、 年齢、 健康度、 あるいは投与方法などの諸要因に応じて変動するが、 当業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。 通常、 O. Olmg / 〜 1 000mg/kgの範囲内である。 投与は、 例えば、 経口投与、 静脈投与、 筋肉内投与、 皮下投与などの方法で行うことができる。
また、 当業者であれば、 公知の方法、 例えば、 例えば、 PCRによる部位特異的変 異誘発システム （GIBCO-BRL，Gaithersburg, Maryland) 、 オリゴヌクレオチドによ る部位特異的変異誘発法 (Kramer, W. and Fritz, HJ ( 1987) Methods in Enzymol . , 154:350-367) 、 Kunkel法 (Methods Enzymol .85, 763-Z766( 1988)) などの方法を 利用して、 本発明の薬剤の活性や安定性などを高める等のため、 LKB1タンパク質 のアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換、 欠失、 付加、 および/または挿入を容 易に行うことができる。 このような改変 LKB1タンパク質も本発明の薬剤に用いる ことが可能である。
LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療薬に関する他の態様は、 LKB1タンパク 質の活性を促進する化合物を有効成分とする。 LKB1遺伝子は、 アフリカッメガエ ルのセリンスレオニンキナ一ゼ XEEK1とアミノ酸配列において 82%の高い相同性を 有するセリンスレオニンキナーゼである。 LKB1遺伝子の変異による疾患の発症に は、 LKB1タンパク質におけるセリントレオニンキナーゼ活性の崩壊が密接に関与 していると考えられる。 従って、 該セリントレオニンキナーゼ活性を促進するこ とにより、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療を行うことも考えられる。
LKB1タンパク質の活性を促進する化合物をスクリーニングする方法としては、 以下の方法が挙げられる。 例えば、 GSTとの融合タンパク質などとして大腸菌で発 現させた LKB1タンパク質、 あるいは哺乳細胞や昆虫細胞等で発現させた LKB1タン パク質を用い、 これらタンパク質のキナーゼ活性を被検化合物の存在下で測定し、
LKB1タンパク質の活性を促進する化合物を選択する。
より具体的には、 例えば、 LKB1タンパク質の基質タンパク質をリン酸化する活 性、 または LKB1タンパク質による自己リン酸化（オートホスフオリレ一シヨン）活 性を、 適当な反応液 （例えば、 50mMトリス-塩酸 pH7.2、 ImMジチオスレィ トール (DTT)、 10mM MgCL, lOmM MnCLなど） 中における [ァ- "P] ATPからの32 Pの基質への 転移量として液体シンチレーシヨンカウンタ一等で測定し、 この転移量を増加さ せる化合物を選択するこどにより、 LKB1タンパク質の活性を促進する化合物を単 離することができる。 単離した化合物を疾患の治療薬として用いる場合には、 上 記 LKB1タンパク質を治療薬として用いる場合と同様に、 公知の製剤学的製造法に より製剤化して投与することができる。 投与量は、 通常、 O . Olmg / 〜 1000mg/kg の範囲内である。
LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療には、 これ以外にも、 LKB1遺伝子の発 現を制御する領域もしくはこれに結合する因子を利用する方法が考えられる。 本 発明により、 LKB1遺伝子と、 その 5'上流領域 （配列番号： 1 ) の構造が明らかと なった。 これらの領域内に LKB1遺伝子の発現を調節する領域 （プロモー夕一ゃェ ンハンサ一等） が含まれていると考えられるが、 当業者にとっては、 既存の方法 を適宜組み合わせることにより、 この LKB1遺伝子の発現を調節する遺伝子領域を 特定することは容易である。 遺伝子調節領域を特定する方法としては、 例えば、
( a ) LKB1遺伝子の 5'上流領域 （配列番号： 1に記載の塩基配列若しくはその一 部からなる DNA) の下流にレポーター遺伝子が連結されたべクタ一を構築する工程、
( b ) 該ベクターを適当な細胞に導入する工程、 （c ) レポ一夕一遺伝子の活性 を検出する工程、 を含む方法が挙げられる。 具体的には、 例えば LKB1遺伝子の上 流域を様々な制限酵素で切断することなどにより適当な大きさの断片とし、 これ をホ夕ルルシフェラーゼ遺伝子や、 分泌型アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子、 あ るいはクロラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ（CAT)遺伝子などのリポ —夕一遺伝子の上流に組み込んだ発現ベクター （PicaGeneTM Vector 和光純薬ェ 業株式会社 など） を作製する。 次いで、 これを COS細胞、 HEK293細胞、 CH0細胞 などの適当な宿主細胞に導入し、 一定時間培養後、 細胞内外のそれそれのリボー 夕一遺伝子産物の量を測定することにより、 組み込まれた遺伝子断片のプロモー 夕一活性を測定することができる。 こうして、 活性を有する遺伝子断片が同定さ れれば、 これをさらに小さい断片にして同様な作業を繰り返すことにより、 より 狭い領域に活性部位を特定していくことができる。 最終的には特定された領域の 塩基配列を、 部位特異的変異導入法等により変化させた後に活性を測定し、 活性 部位であることを確認することができる。 LKB 1遺伝子の発現を制御する領域は、 例えば、 上記の正常な LKB1遺伝子の上流に結合させて、 LKB1遺伝子が変異してい る患者に投与することにより、 生体内における自然な発現制御下で、 LKB1遺伝子 を発現させることができるため上記の遺伝子治療において特に有用である。
また、 LKB1遺伝子の上流域からプロモーター部位が特定されれば、 この部位を 持つリポ一夕一遺伝子発現べクタ一を用い、 様々な化合物を用いてリポーター遺 伝子産物の産生に及ぼす影響を調べることにより、 簡便に LKB1遺伝子発現量を調 節する化合物をスクリーニングすることが可能である。 このようなスクリーニン グ方法としては、 （a ) LKB1遺伝子のプロモ一夕一部位の下流にレポ一夕一遺伝 子が連結されたべクタ一を構築する工程、 （b ) 該ベクターを適当な細胞に導入 する工程、 （c ) 該細胞に被検化合物を接触および/または導入してレポーター 遺伝子の活性を検出する工程、 を含む方法が挙げられる。 被検化合物としては、 例えば、 タンパク質、 ペプチド、 合成化合物、 天然化合物、 遺伝子、 遺伝子産物 などが挙げられるが、 これらに制限されない。
また、 プロモー夕一部位に被検試料を接触させて、 該プロモーター部位に結合 する化合物 （タンパク質など） を選択することにより、 LKB1遺伝子の発現を制御 する化合物をスクリーニングすることも可能である。 例えば、 プロモ一夕一部位 の塩基配列を持つ合成ォリゴ DNAなどを作製し、 これをセファロースなどの適当な 支持担体に結合させ、 これに細胞抽出液などを接触させることにより、 このプロ モーター部位に結合し、 LKB1遺伝子の発現を制御する転写調節因子を、 ァフィ二 ティ一精製などにより精製することもできる。
なお、 本発明者等により、 ポイツ 'イエガ一患者において、 LKB1遺伝子が変異 することが原因となり、 ポリ一プなどの新生物が生じることが明らかにされた。 このため、 LKB1タンパクの量や活性を減少させることにより、 正常な細胞に一時 的な細胞増殖活性を賦与することが可能であるといえる。 従って、 LKB1遺伝子も しくは cDNAに対するアンチセンス DN A、 または LKB 1タンパク質の活性を阻害する化 合物などを利用して、 LKB1タンパクの量や活性を人為的に減少させることにより 創傷治癒、 組織再生等の新たな細胞増殖を必要とする疾病の治療を行うことも考 えられる。 図面の簡単な説明
図 1 aは LKB1染色体遺伝子、 及びその近傍領域の構造と、 制限酵素地図を示す c Rは EcoRI、 Bは BamHI、 Sは Sacl、 Kは Kpnl、 BssHは BssH 11のサイ トをそれそれ示す c LKB1遺伝子の 9個のェキソンをボックスで示した。 黒く塗られたボックスは翻訳領 域を、 白抜きのボックスは非翻訳領域をそれそれ表す。 図 l bはポイツ ·イエガー 患者 Aに見られた遺伝子再編成を模式的に示した。 上部が正常な遺伝子構造、 下部 がポィヅ ·イエガー患者 Aの変異 LKB1遺伝子の構造である。 また、 PCR解析に用い たプライマーの向きと位置関係を矢印で示した。
図 2は、 マイクロサテライ トマ一力一 D19S886の近傍領域におけるコスミ ドク口 —ン 'コンティグと、 EcoRIサイ 卜のマップを示す。 下部に、 ヒト染色体 19pl3.3 領域におけるマイクロサテライ トマーカー D19S886と、 LKB1遺伝子との位置関係を 模式的に示した。 telはテロメァ、 cenはセントロメァの存在する方向を示す。 上 部に、 整列させた部分的に重複するコスミ ドクローンを示した。
図 3 aはポィヅ ·イエガ一患者 Aの 3世代に渡る家系図を表す。 右半分が塗りつ ぶされたシンボルは罹患しているメンバ一を示す。 bは D J666プライマ一と DJ660プ ライマーによる長距離 PCR解析の結果を示す。 罹患しているメンバーにのみ黒三角 で示した 2. 5kbpの異常な増幅産物が見られる。 cは DJ666ブラィマ一と DJ684ブラィ マーによる PCR解析の結果を示す。 罹患しているメンバ一にのみ増幅産物が見られ、 逆位が存在することがわかる。
図 4は、 PCRによって増幅された LKB 1の各ェキソンのァガロース電気泳動像を表 す。 上に増幅されているェキソンの番号を示した。 MWは分子量マーカーを表す。 図 5は、 PCR- RFLPによる解析の結果を示す電気泳動像である。 Ahdl、 BsrBI、 R sal、 Sealは、 それそれの制限酵素で処理されたサンプルであることを表す。 WTは 健常人、 Bはボイッ ·イエガ一患者 B、 FAはボイヅ ·イエガー患者 FA、 MAはボイヅ •イエガー患者 MA、 Dはポイツ ·イエガー患者 Dからそれそれ得た DNAサンプルであ ることを示す。 MWは分子量マーカーを示す。
図 6は、 免疫沈降した LKB1タンパク質の自己リン酸化能を各種二価カチオン存 在下で調べた図である。 LKB1の自己リン酸化能 （キナーゼ活性） は Mg2+によっては あまり活性化されず、 Mn"によって強く活性化されていることがわかる。
図 7は、 野生型 LKB1タンパク質と各変異体の自己リン酸化能を調べた図である。 上のパネルは自己リン酸化能を示すォ一トラジォグラフィ一像、 下のパネルは抗 c-Myc抗体によって染色したウエスタンプロッティングの結果である。 各タンパク 質はほぼ同量産生されていることがわかる。
図 8は、 大腸菌によって発現させた GST融合 LKBl-mycタンパクの、 ウエスタンブ ロッテイングによる解析結果を示す電気泳動像である。 M は分子量マーカ一、 1は IPTGによる誘導前の大腸菌ライゼート、 2は IPTGによる誘導後の大腸菌ライゼ一ト、 3はグル夕チオンセファロ一スにより精製した GST融合 LKB卜 myc夕ンパク質を示す。 「抗 Myc 抗体」 と示したフィルタ一は抗 myc抗体で染色した結果を、 また 「抗 L KB1 抗体」 と示したフィル夕一は、 ァフィ二ティ一精製した抗 LKB1ペプチド抗体 で染色した結果を表す。 図 9は、 各抗体を用いたウエスタンブロッテイングの結果である。 レーン 1は p cDNA3ベクターのみをトランスフヱクトした C0S7細胞のライゼ一ト、 レーン 2は pc DNA3/LKBlmycをトランスフエク卜した C0S7細胞のライゼート、 レーン 3は HeLa S3 細胞のライゼ一トをサンプルとしている。 左に示した抗体、 および、 抗 C- Myc抗体 によって染色されている。 上部にプレインキュベ一シヨンに用いたぺプチドを示 した。
図 1 0は、 抗 LKB1 P3抗体を用い、 ヒト胎児結腸の組織切片を染色した図である。 上皮性細胞の細胞質が染色されている。 また、 一部内分泌細胞と思われる細胞が 非常に強く染色されている。
図 1 1は、 抗 LKB1 P3抗体を用い、 ヒト成人臈臓の組織切片を染色した図である c 島細胞群が染色されている。
図 1 2は、 抗 LKB1 P3抗体を用い、 ヒト胎児精巣の組織切片を染色した図である c 未発達の生殖細胞が強く染色されている。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[実施例 1 ] ヒト染色体 19pl3.3領域におけるコスミ ドクローン ·コンティグの ヒト染色体の 19pl3. 3領域について、 領域内の全遺伝子の効率的な同定を目指し、 コスミ ドクローンなどからなる連続クロ一ン 'コンティグ （整列クローン .コン ティグ） の構築を行った。 まず、 F ISHマッピングなどによってこの領域にマップ されたコスミ ドクローン群から、 短いが異なる重複部分を有する適当なコスミ ド を選択し、 これらのクロ一ン間の空白を、 コスミ ドライブラリー、 フォスミ ドラ ィブラリー、 および BACライプラリ一をスクリーニングすることによりそれを埋め るクロ一ンを順次得て行くこと （コスミ ドウォーキング、 クロモゾ一ムゥォ一キ ング） により埋めていった。 こうして、 染色体 19pter領域における、 L 5 bpから なる連続したクローン ·コンティグを構築し、 その高分解物理地図を作製した。 具体的には、 クローン ·コンティグの構築は以下のように行った。 Lawrist5ベ クタ一および Lawristl6ベクターにクローニングされた 2つの 19番染色体特異的コ スミ ドライブラリー、 pBeloBacllベクターにクローニングされた 19番染色体特異 的フォスミ ドライブラリー、 全ヒトゲノムコスミ ドライブラリー （Stratagene) 、 および全ヒ卜ゲノム BACライプラリー （Research Genetics) を用い、 以前に FISH 法によりマップされ、 整列化されている染色体 19pl3.3由来の小さいコスミ ドク口 —ン -コンティグを伸長した (Ashworth, L.K. et al . An integrated metric p hysical map of human chromosome 19. Nature Genet. 11， 422-427 ( 1995 ) . ) 。 まず、 19pl3.3領域上の PRNT3遺伝子座 （Zi画 er, M. et al . . Three human elas tase - l ike genes coordinately expressed in the myelomonocyte lineage are organized as a single genetic locus on 19pter. P roc. Natl . Acad. Sci. U. S.A. 89， 8215-8219 ( 1992) . ) および GZMM遺伝子座 (Pilat, D. et al . The human M et-ase gene ( GZMM)： structure, sequence and close physical l inkage to th e serine protease gene cluster on 19pl3.3. Genomics 24, 445-450 ( 1994) . ) をそれそれ含む 2つのコンティグの末端からコスミ ドウォ一キングを開始した。 す なわち、 コンティグ末端の EcoRI断片をプローブとし、 高密度コスミ ドフィルター およびフォスミ ドフィルターを、 Cotl DNA (New England Bio labs) でバックグラ ゥンドを低減した条件で、 スクリーニングし、 順次重複するクローンを得た。 い くつかの場合においては、 Llawristベクタ一特異的プライマ一 DJ180 (配列番号： 35/CGACTCACTATAGGGAGACCCA) および DJ181 (配列番号： 36/CCTCGAGMTTACCCTCA CTAA) を用いて直接コスミ ドインサートの末端を配列決定した。 得られた配列は、 ( i )データ一ベースを検索し、 既知の遺伝子と有意な相同性を示す新規遺伝子を同 定するため、 および（ii )さらにクロモソ一ムゥォ一キングを行うために使用する STS( Sequence Tagged Site)を作製するため、 に用いた。 こうして 19番染色体テロ メァ領域において 1.5Mbpに渡って整列化されたコスミ ドクローン ·コンティグを 得た。 これらコスミ ドクローンにつき、 BamHI， BssHI I , EcoRI , Hindl l l, Kpnlそ して Sacl制限酵素サイ トをマッピングし、 制限酵素地図を作製した。 より具体的 には、 ラムダ夕一ミナ一ゼおよび部分的酵素分解により線状化したコスミ ド DNAの cos部位を標識した後に制限酵素で処理し、 得られた切断断片の大きさから決定し た (cosサイ 卜標識 ¾s。 Rackwitz, H.R. , et al . Analysis of cosmids using li near izat ion by phage lambda terminase. Gene 40， 259-266 ( 1985) ) 。
[実施例 2 ] 19p3.3 領域コスミ ドクローン · コンティグ内にマップされる遺伝 子の同定
19p3.3 領域において、 遺伝子マーカー D19S216よりテロメァ側に 91個の EST(Ex pressed Sequence Tag)が、 ラディエーシヨンハイブリッドマッピング法により既 にマッピングされていた。 これらの EST間における重複を、 UNIGENEプログラム（h Up：〃 www. ncbi. nlm.nih.gov/UniGene八 ndex.html )を用いて解析することにより 除き、 最終的に 60個の別々の遺伝子に由来すると考えられる ESTを得た。 それそれ の ESTを増幅するためのプライマ一セッ トを Research Geneticsから購入し、 先に 構築した 19p3.3 領域コスミ ドクローン ·コンティグ中のコスミ ドクローンをそれ それ重複しない 4つのプールに分けたものを PCIUこよりスクリーニングすることに より、 それそれの遺伝子がこれらのコンティグ内に存在するかどうかを検定した。 陽性シグナルを与えた ESTについては、 さらにデータ一ベースを検索することによ り、 その配列を伸長することができる重複した ESTを検索した。 次に、 それそれの 陽性 ESTに対応する cDNAクローンを Research Geneticsから購入し、 そのインサー ト cDNAをプローブとし、 EcoRI消化したコスミ ドクローンに対するサザンハイブリ ダイゼーシヨンを行うことにより、 それそれの遺伝子のこのコンティグ内におけ る正確な位置を決定した。
また、 遺伝子マーカー D19S886 (Genbank登録番号： Z52881) についても同様に、 このコスミ ドクローン ·コンティグ内における正確な位置を決定した。 すなわち、 このマーカ一の配列を持つ DNA断片をセンスプライマ一 （配列番号： 37/TGGATCTA CACTCCGGC) およびアンチセンスプライマ一 （配列番号： 38/ATTTTACTGGCTGGCACT TG) を用いた PCRにより全ヒト DNAから増幅し、 これをプローブとして、 コスミ ド クローン R32184を EcoRI、 Sad, BamHK および BssHI Iで消化した後にサザンプロ ッティングを行い、 このマ一力一の EcoRIマップ上の正確な位置を決定した。
また、 マウス 10番染色体上においてヒ卜の 19p領域に相当すると考えられている 領域に既にマップされている遺伝子についても、 同様な手法により、 このコンテ ィグ内におけるマッピングを行った。 さらに、 コスミ ド末端の配列を用いて LLNL デ一夕べ一ス [http：〃 www- Mo. l lnl . gov]などのデ一夕べ一スを検索することによ り、 さらに新しい遺伝子をこのコンティグ内に同定した。
[実施例 3 ] ポイツ ·ィエガー遺伝子の候補領域の決定
ポイツ ·イエガー遺伝子が存在する候補領域としては、 連鎖解析により、 マ一 力一 Dl 9S878および D19S565よりテロメァ側であることが報告されていたが、 テロ メァ側には全くマ一カーが報告されていないため、 これらのマーカ一よりテロメ ァ側に約 2Mb以上もの領域が候補領域として考えられた。 しかし、 D19S886マーカ 一とポイツ 'イエガー遺伝子座との強い連鎖を考慮すると、 変異遺伝子はこのマ 一力一の極近傍に位置する可能性が考えられた。 そこで、 まず D19S886マーカ一の コスミ ド ·コンティグにおける正確な位置を上述したように決定し、 この近傍に 存在すると考えられる遺伝子を探索した。 その結果、 D19S886マ一カー近傍 400kb P内には 21個の遺伝子が存在することが明らかとなった。 これらの遺伝子の中から、 他の生物種におけるカウンターパート遺伝子の解析の情報など様々な生物学的情 報を考慮し、 ポイツ ·イエガー症候群の原因遺伝子となりうる可能性ある遺伝子 を選抜した。 それそれについてポイツ ·イエガー患者より調製した DNA試料を用い て患者の染色体 DNA上の変異の有無を検索した。
[実施例 4 ] LKB1遺伝子の同定およびゲノム構造の解析
19p3.3 領域コスミ ドクローン 'コンティグに含まれるコスミ ドクローン R2911 4のテ口メァ側末端から得た配列で GenBankの配列相同性検索を行ったところ、 新 規なヒトセリンスレオニンプロテインキナーゼ （LKB1 ) をコードする cDNA (Genb ank登録番号 U63333) と 32bpの短い範囲で一致することが判明した。 LKB1 cDNA配 列の 5'末端および 3'末端に対応する 2つの配列決定用プライマ一 DJ649 (配列番号 : 24) および DJ650 (配列番号： 29) を作製し、 直接コスミ ドクローンのシ一クェン シングを行うことにより、 R29114クローン、 およびこのクローンに隣接する R265 52クローンに LKB1遺伝子が存在していることが判明し、 この領域に LKB1遺伝子が 存在することが確認された。 さらに詳細な解析を行うため、 LKB1遺伝子の全ェキ ソン-イントロン構造の決定を目的に、 LKBlcDNA配列 （1302bp) に基づき、 PCRお よび配列決定用のプライマーを設計し （下記、 表 1， 表 2 ) 解析を行った。 個々 の遺伝子セグメントは、 コスミ ド DNAから PCRにより増幅し、 PCR産物を直接シーク ェンシングすることにより配列を決定した。 こうして得た配列を LKBlcDNA配列と 比較することにより、 ェキソンの位置および全ィントロンのスプライス部位を同 定した。 全ェキソンの制限酵素地図上の位置は、 ゲノム配列中に見られる制限酵 素サイ トを比較すること、 及び長距離 PCR(Long distanse PCR)法により各遺伝子 セグメント間の距離を比較することによって決定した （図 l a) 。 特に長いイント ロンであるイントロン 1および 8を除くほとんどの領域についての塩基配列は、 両 方向からシークェンシングすることにより決定した。
その結果、 LKB1遺伝子は、 23kb以上の範囲において、 9個のコーディングェキソ ンと 1個のノンコ一ディングェキソンに分割されてコ一ドされていることが明ら かとなつた。 またこの遺伝子は、 テロメァ側からセントロメァ方向に向かって転 写されることが推測された （図 2 ) 。 興味深いことに、 イントロン 2のスプライス 連結部は、 通常のィントロン境界に見られる GT/ATルールに一致しないことが明ら かとなつた。 イントロン 2の 5'末端は、 「ATATCCCTT」 で開始し、 「CCCAC」 で終結 し、 そして 「TCCTTAAC」 モチーフがェキソン 3の 15bp上流から開始する。 これらの 3つの配列因子は、 最近報告された極めて稀な真核生物ィントロンの特徴に一致す る。 このパターンを持つイントロンは、 一般的でない U12 snRNA依存的なスプライ シングを受ける。
[実施例 5 ] ポイツ 'イエガー患者における変異解析
ポイツ ·イエガー患者における変異解析において利用したプライマ一の配列を 下記表 1に示す。 表 1
DJ705 5' -GGGAATTCGGAACACAAGGAAG-3' (配列番号 23/ェキソン 1 )
DJ649 5' -ATGGAGGTGGTGGACCCGC-3' (配列番号 24/ェキソン 1 )
DJ659 5' -GTTACGGCACAAAAATGTCATCCA-3' (配列番号 25/ェキソン 2)
DJ666 5' -GGTGATGGAGTACTGCGTGTG-3' (配列番号 26/ェキソン 3) DJ684 5' -ACATCGGGAAGGGGAGCTACG-3' (配列番号 27/ェキソン 6) DJ660 5' -CCGGGCACCGTGAAGTCCTG-3' (配列番号 28/ェキソン 8) DJ650 5' -TCACTGCTGCTTGCAGGCC-3' (配列番号 29/ェキソン 9) DJ717 5' -GCAGGCGGCCAGCCTCA-3' (配列番号 30/ェキソン 9)
5人の互いに無関係なポイツ 'イエガ一患者 （A、 B、 D、 MA、 FA、 ) 由来の DNA試 料を用いて、 変異解析を行った。 まず、 プライマーセット DJ659と DJ660、 および DJ666と DJ660を用いた長距離 PCRにより、 遺伝子の欠失および再構成についてスク リーニングを行った。
プライマ一 DJ666と DJ660を用いた PCRにより、 全ての患者、 及び対照である健常 者から得られた MA試料において、 3.9kbpの増幅産物が生じた。 しかし、 一人のポ イツ ·イエガ一患者 Aにおいては、 2.5kbpの産物も同時に観察されることが見いだ された （図 3 b) 。 この DNA断片をサブクロ一ニングした後、 塩基配列を決定して、 対応する正常な染色体 DNA配列と比較すると、 この患者の LKB1遺伝子においては複 雑な染色体再構成が存在していることが明らかになった （図 l b) 。 すなわち 2.5 kbpの PCR産物は、 それぞれイントロン 3および 5の間における 1286bpの欠失と、 ィ ントロン 7内における 81bpの欠失の二つの変異を有していた。 大きい方の欠失に は、 ェキソン 4および 5が含まれる。 さらに、 ェキソン 6および 7が含まれる中央部 は逆位を起こしていた。 この逆位が存在することを確認するため、 、 ェキソン 3お よびェキソン 6に特異的なセンス鎖プライマー DJ666と D J684を用いた PCR解析を行 つた。 これらのプライマーは、 両方ともがセンス鎖に対応するプライマーである ため、 逆位が起こっている場合のみ PCR産物が生じることになる。 その結果、 ボイ ッ 'イエガ一患者 Aの 2世代に渡る家系メンバ一のうち、 罹患している者全員にこ の逆位が存在することが明らかとなった。 一方、 同家系のメンバ一であっても罹 患していない者、 および対照の健常者にはこの変異は見られなかった （図 3 a、 c) 。
この複雑な LKB1遺伝子の変異を転写産物のレベルで解析するため、 患者 Aの末梢 血液細胞から単離した RNAを用いて RT- PCR解析を行った。 なお、 RNAは Blood RNA Isolation Kit (Qiagen) を用いて単離し、 Superscript (GIBCO-BRL, Life Tech nologies) を用いて cDNAへと逆転写した。 プライマ一セット DJ660と DJ666を用い た PCRにより 730bpおよび 270bpの 2種類の産物が生じた。 両者間の約 460bpの長さの 相違は、 ェキソン 4から 7によりコードされる転写産物が 456bpであることとよく一 致し、 この複雑な変異によりェキソン 4から 7がスプライスァゥトされている転 写産物が生じているものと考えられた。 ェキソン 3から 8への異常なスプライシン グはフレームシフトを引き起こさないが、 こうして生じる転写産物は、 触媒ドメ ィンの C末側半分を欠失するわずか 281アミノ酸残基からなる異常なタンパク質を コードしているものと考えられる。
患者 D、 MA、 および FAにおいては、 異常な長さを持つ PCR産物は観察されなか つた。 そこで LKB1遺伝子における点突然変異をスクリーニングするため、 8種類の プライマ一セット （表 2) を設計し、 それそれのェキソンを独立に増幅し、 直接シ
—クェンシングを行った （図 4 ) 。 表 2
DJ698 5' -GGTCCCCGAGGACGAAGTTGA-3' (配列番号 7/ェキソン 1 センス）
DJ673 5' -ACCATCAGCACCGTGACTGG-3' (配列番号 8/ェキソン 1 アンチセンス） DJ703 5' -TCGCCGGCCGATGACAGA-3' (配列番号 9/ェキソン 2 センス）
DJ674 5' -AAGGAGACGGGAAGAGGAGCAG-3' (配列番号 10/ェキソン 2 アンチセンス） DJ690 5' -GAGGAGGGGCAAGGTGGGT-3' (配列番号 11/ェキソン 3 センス）
DJ680 5' -GTGTGGCCTCACGGAAAGGAG-3' (配列番号 12/ェキソン 3 アンチセンス） DJ692 5' -AGCTGGGCCTGTGGTGTTTG-3' (配列番号 13/ェキソン 4- 5 センス） DJ694 5' -CAGAGGCCCCTCGGAGTGTG-3' (配列番号 14/ェキソン 4- 5アンチセンス） DJ695 5' -GCCTCTGTCCCTGGGGTAGA-3' (配列番号 15/ェキソン 6 センス）
DJ693 5' -TCAGTCCTCTCAATGCCTGCTG-3' (配列番号 16/ェキソン 6 アンチセンス） DJ696 5' -GCGGGGTCCCCCTTAGGAG-3' (配列番号 17/ェキソン 7 センス）
DJ697 5' -CTAGCGCCCGCTCAACCAG-3' (配列番号 18ノエキソン 7 アンチセンス） DJ675 5' -GGAGCTGGGTCGGAAAACTGGA-3' (配列番号 19/ェキソン 8 センス）
DJ702 5' -TGCTCCCGTGGGACATCCTG-3' (配列番号 20/ェキソン 8 アンチセンス） DJ676 5' -GTAAGTGCGTCCCCGTGGTG-3' (配列番号 21/ェキソン 9 センス）
DJ677 5' -GTGGCATCCAGGCGTTGTCC-3' (配列番号 22/ェキソン 9 アンチセンス）
ただし、 ェキソン 4及び 5は、 イントロンが短いため、 一回の PCRで同時に増幅し た。 解析の結果、 全ての患者において LKB1対立遺伝子の片方において変異が存在 することが明らかとなった。 表 3にその結果を示す。 なお、 表中のコドンは最後 の野生型コドンの番号を示す。 また、 制限酵素部位はポイツ ·イエガー患者と健 常者由来の PCR産物における変異の有無を証明するために用いた。 制限酵素の十と —はそれそれ変異による制限酵素部位の獲得および消失を示す。 また、 B、 MA、 F A患者の LKB1の塩基の番号は Genbank登録ナンバー U63333に登録されている LKB1 c DNAの塩基配列のナンバーに従った。 D患者の LKB1の塩基の番号は Genbank登録ナン バー AF032985に登録されている LKB1遺伝子の塩基配列のナンバーに従った。
表 3 患者 変異 コドン 部位解析 予想される影響
A 逆位/欠失 ェキソン 4- 7 155 コドン 156- 307欠失
D G2412A イントロン 3 156 +ScaI スプライスァクセプ夕 の欠失
ェキソン 4のスキップ； 読み枠シフト
コ ドン 242での終止
B 716欠失 ェキソン 5 240 -Ahdl 'コドン 285で終止；
G G T C 読み枠シフ ト
MA C 759A ェキソン 6 252 -Rsal · Tyr253( TAC )~>終止（TAA)
FA 843欠失 G ェキソン 6 280 -BsrBI '読み枠シフ ト；
コドン 286で終止
患者 MAにおいては、 759番目の塩基 （ェキソン 6) の Cが Aへと置換されており、 そのために 253番目のアミノ酸であるチロシンをコ一ドするコドン TACが終止コド ン TMへと変化していた。 患者 Bにおいては、 717番目から 720番目の塩基 （ェキソ ン 5) の 4塩基対が欠失しており、 これにより 239番目のアミノ酸であるトリプトフ アンをコードするコドンの 135bp下流で終始コドンが生じていることが判明した。 患者 Dにおいては、 厳密に保存されているィントロン 3の 3，末端のスプライスァク セプ夕一部位が AGから AAに変化していることが見いだされた。 ェキソン 3がェキソ ン 4をスキップしてェキソン 5と連結された場合には、 155番目のァミノ酸の後で読 み枠がシフトし、 241番目のアミノ酸の後でタンパク質のアミノ酸配列は終止して しまうと考えられる。 患者 FAは、 843番目の塩基 （ェキソン 6) である Gが欠失して おり、 これにより読み枠のシフトが起こり、 857番目の塩基から終止コドン TGAが 生じることが判明した。
これらの 5人のポイツ ·イエガー患者の LKB1遺伝子における変異は全て、 キナー ゼドメインの必須部分を消失する変異であり、 LKB1の高次構造を崩壊させるもの と考えられる。 さらに、 これらの患者のうち 4人は、 LKB1の調節ドメインであると 考えられる C末端部が消失していた。 LKB1遺伝子におけるこれらの変異により、 そ の遺伝子産物である変異 LKB1タンパク質はキナーゼ活性を失い、 LKB1が関与する シグナル伝達経路が遮断されることが推測された。
また、 ポイツ ·イエガー患者であることが疑われた日本人のポリポーシス患者 ( SK1 ) についても、 LKB1遺伝子の構造を調べた。 この患者の末梢血から QIAamp Blood kit (Qiagen) を用いゲノム DNAを抽出し、 これを錡型として表 2に記載した プライマ一を用いた PCRにより LKB1遺伝子を増幅した。 この PCR産物を直接シーク ェンシングし、 解析したところ、 ェキソン 5のコード領域に一塩基 ( C)の欠失 （20 7番目の Aspに対応する 「GAC」 の 「C」 の欠失） が存在することを見出した。 この 変異により 207番目の Asp以降がフレームシフトを起こし、 これにより不完全な長 さの、 おそらくキナーゼ活性を有しないタンパク質が生じると考えられた。
なお、 DNA試料からの LKB1遺伝子の PCI こよる増幅は、 基本的に次の条件に従つ て行った。 反応液としては、 染色体 DNA (錶型 DNA) lOOng, プライマー 50pmol、 P CRバッファ一 J ( Invitrogen), Ampl iTaq (Perkin Elmer ) 2.5Unit、 および DMSO 2.5 / 1を含む全量 50 / 1の反応液を用いるか、 あるいは染色体 DNA (錡型 DNA) 100η g、 プライマ一 20pmolヽ 10 X TaKaRa Taqバッファー （TaKaRa) 5〃1、 2.5mM dN TPs (TaKaRa) 4ju L TaKaRa Taq. ( TaKaRa) 0.4〃 1、 TaqStart™ Antibody ( CLON TECH) 0.4 / 1を含む全量 50 1の反応液を用いた。 反応は、 94°Cで 2から 4分、 次い で 「94°Cで 30秒から 45秒 、 58°Cあるいは 62°Cで 30秒、 及び 72°Cで 45秒」 を 35サ ィクル、 次いで 72°Cで 3分行った。 PCR産物は、 ァガロース電気泳動後ゲルから QI Aquick Gel Extraction kit (Qiagen) を用いて精製するか、 あるいは PCR反応液 から QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen) を用いて精製した後、 これを錡 型として、 直接、 両方向からシークェンシングした。 シ一クェンシングは Drhoda mine terminator cycle sequenc ing kit(Appl ied Biosystems )を用いて行った。 また、 各患者から調製した DNA試料から変異が存在する領域を上に示した条件な どの PCRで増幅した後、 それそれの変異に対応した制限酵素で切断し、 切断断片の 長さを調べることにより、 これらの変異が PCRエラー、 あるいはシークェンシング エラ一でないことを確認した （PCR- RFLP解析） 。 すなわち、 PCR増幅産物 制 限酵素（Ahd I , BsrB I , Rsal , Seal ) 4Units 制限酵素用バッファー 2〃 1を含む全 量 20 1の反応液を 37°Cで 1. 5時間保温し、 ァガロース電気泳動により各 DNA断片の 長さを調べた。
同様な解析を 50人の健常人から得た DNA試料についても調べたところ、 これらの 変異は全く観察されず、 このことから、 これらの変異はポィヅ ·イエガー患者に 特異的な変異であることが示された （図 5 ) 。
[実施例 6 ] 大腸菌、 哺乳動物細胞用発現プラスミ ド DNAの作製
LKB1 cDNAクローンを錶型とし、 LK E1プライマー （配列番号： 3 9 /5' -gat g aa ttc ggg tec age atg gag gtg gtg gac-3' ) と E2プライマー （配列番号： 4 0 /5' -gat gaa ttc tta gag gtc ttc ttc tga gat gag ctt ctg etc ctg ctg ctt gca ggc cga-3' ) を用いた PCRを行うことにより、 C末端に c- Myc ェピトープ 配列（配列番号： 4 1 /Glu Gin Lys Leu l ie Ser Glu Glu Asp Leu)が付加された 全 LKB 1アミノ酸配列をコードする DNA断片を増幅し、 これをプライマーに付加した EcoRIサイ 卜で切断した後、 哺乳動物細胞用発現べクタ一である pcDNA3ベクタ一 ( Invitrogen)の EcoRIサイ ト、 あるいは大腸菌用発現ベクターである pGEX- 5X-1ベ クタ一（Pharmacia)の EcoMサイ トに組み込んだ。 シ一クェンシングにより PCRエラ 一が無いことを確認したクローン （哺乳動物細胞用 - pcDNA3/LKBlmyc、 大腸菌用 - pGEX/LKBlmyc) を選抜し、 発現実験に用いた。
また、 pcDNA3/LKBlmycを銪型とし、 GeneEditor (Promega)を用いた in vitroミ ュ一夕ジヱネシスにより、 ポイツ ·ィエガー患者において発見されたアミノ酸置 換変異を含む変異を導入した発現プラスミ ド DNAを作製した。 すなわち、 D176N変 異 （176番目の Aspが Asnに置換する変異。 以下同様に示す。 ） を持つ発現プラスミ KDNA(pcDNA3/LKBl D176Nmyc )には LK D176Nプライマー (配列番号： 4 5 /5' -at t gtg cac aag aac ate aag ccg ggg-3' )、 W308C変異（pcDNA3/LKBl W308Cmyc )に は LK W308Cプライマー （配列番号： 4 6 /5， -egg cag cac age tgc ttc egg aag aaa- 3，）、 L67P変異（pcDNA3/LKBl L67Pmyc)には LK L67Pプライマー （配列番号： 4 7 /5，- gtg aag gag gtg ccg gac tcg gag acg-3' )ヽ そして K78I変異（pcDNA3/ LKBl K78Imyc)には LK KIlプライマ一 （配列番号： 4 8 /5，- agg agg gcc gtc at c ate etc aag aag- 3，）を変異導入用プライマ一として用い変異導入を行った。 変 異導入用プライマーとキッ卜に添付されている選択用プライマ一 （ボトムストラ ンド用） を共に一本鎖にした錶型プラスミ ド DNAとァニールさせ、 新たな DNA鎖を 合成した。 これを大腸菌に導入し、 変異を持つプラスミ ドを保持したクローンを GeneEditor™抗生物質耐性クローンとして選択した。 シークェンシングにより変異 が入っていることを確認し、 発現実験に用いた。
LK E2プライマ一の代わりに LK E4プライマー （配列番号： 4 2 /5' -gat ggg c cc tta cag gga ggc ata gtc agg cac ate ata tgg gta ctg ctg ctt gca ggc c ga-3' ) 、 あるいは LK E5プライマー（配列番号： 4 3 /5， -gat gaa ttc tta gtg atg gtg atg gtg atg ctg ctg ctt gca ggc cga-3' )を用いて PCRを行い、 得た断 片を様々なベクターに組み込むことにより、 それそれ、 抗 HA抗体により認識され るェピト一プ (配列番号： 4 4 /NH2- YPYDVPDYASL- C00H )および、 ヒスチジン（ H )が 6個連続した配列 （ヒスチジンへキサマー） が C末に添加されるようになる。 この ことにより、 抗 HA抗体ゃ抗ヒスチジンへキサマ一抗体を利用した方法により簡単 に LKB1タンパクを検出したり、 抗 HA抗体やニッケルカラムなどを用いたァフィ二 ティー精製によって精製することができる。
[実施例 7 ] 哺乳動物細胞における発現とキナーゼアツセィ
LKB1発現用プラスミ ド DNA(pcDNA3/LKBlmyc )などの約 10 gを、 SuperFect (Qia gen) を用いた方法により、 C0S7細胞に導入 （トランスフエクシヨン） した。 すな わち、 約 10s個の C0S7細胞を 10cmディッシュに蒔き、 ー晚培養した後、 10〃gのブラ スミ ド DNAと の SuperFectの混合物を添加し、 約 3時間培養を行った。 その後 培養液を新しいものに交換し、 さらに 1-2日間培養した後、 細胞をトリプシン- ED TA液ではがして回収した。 細胞を NP40 キナーゼライシスバッファ一（lOmM トリス 塩酸 pH7.8、 1¾ NP40、 0. 15M塩化ナトリウム、 ImM EDTA、 50mM フッ化ナトリウ ム、 5mM ピロリン酸ナトリウム、 10〃g/ml ァプロチニン、 ImM PMSF ) に懸濁し、 4°Cで 30分混合することによりタンパク質を可溶化した。 こうして得た細胞ライゼ —卜にプロティン A/Gプラスァガロース（ Santa Cruz )を加え 30分混合することによ り非特異的にビーズに吸着するタンパクを除いた。 次に抗 c-Myc抗体 A14( Santa C ruz )を加え 4°Cで 1時間放置した後、 プロテイン A/Gプラスァガロース を加えてさ らに 1時間放置した。 これを遠心する事により免疫複合体を沈殿させ、 NP40 キナ —ゼライシスバッファ一、 1Mの塩化ナトリウムを含んだバッファ一、 および 50mM トリス塩酸 (pH7.8)によって何回か洗浄し、 キナーゼアツセィに供した。
キナーゼアツセィは 50mM トリス塩酸（pH 7.8)、 ImM DTT、 lOmM二価カチオン (Mnなど）および 10〃Ciの [ァ- 32P]ATPを含む全量 50〃1の反応系で行った。 免疫沈降 物をこのキナーゼアツセィ溶液中で 37°C、 30分保温して反応を行った後、 SDS- PA GEサンプルバッファーを加え煮沸することにより反応を停止し SDS- PAGEを行った。 ゲルをメタノール/酢酸溶液で固定した後、 乾燥させ、 BAS200イメージアナライ ザ一 （Fuji Fi lm) によってイメージを解析した。 LKB1のキナーゼ活性は自己リン 酸化能として判定した。 また、 発現させたタンパク質は SDS- PAGE後抗 c- Myc抗体 A 14を用いたウエスタンプロッティングにより検出した。
まず、 LKB1タンパク質のキナーゼ活性に対する 2価カチオン要求性を検討したと ころ、 LKB1は Mg"によってはあまり活性化されず、 Mn"存在下に強い活性を示すこと が明らかとなった （図 6 ) 。 次にポイツ 'イエガー患者に見つかったアミノ酸置 換型変異を持つ変異体のキナーゼ活性を調べたところ、 全ての変異体がほとんど 活性を失っていることが明らかとなった （図 7 ) 。 このことから、 ポイツ 'イエ ガ一患者においては LKB1キナーゼは活性を失っており、 このことが原因となり発 症する事が強く示唆された。
[実施例 8 ] 大腸菌による LKB1タンパクの発現
pGEX/LKBlmycを大腸菌 DH5ひ株に導入し、 シングルコロニーを得た。 これを 2xY Τ培地 10ml中で 37°C—晚培養した後、 この一部を新たな 2xYT培地で 100倍に希釈し、 600nmにおける 0Dが 0.6になるまで 37°Cで培養を続けた。 その後 IPTG (イソプロピ ル- 3 -D ( -) -チォガラクトビラノシド） を終濃度 O. lmMになるように添加し、 さら に培養を数時間続けた。 大腸菌を遠心により集め、 1% TritonX-100, 1% Tween 20， PBSに懸濁し、 超音波処理を施すことにより、 細胞を破壊し、 タンパク質を可溶 化させた。 この可溶化サンプルよりグル夕チオンセファロ一ス 4B(Pharmacia)を用 いたァフィ二ティ一精製によって、 グル夕チオン- S-トランスフェラ一ゼ（GST )と の融合タンパクとして発現された LKB1タンパクを精製した。 大腸菌で発現させた LKB1タンパク質も、 抗 C- Myc抗体 A14を用いたウエスタンプロッティングにより検 出された （図 8 ) 。
[実施例 9 ] LKB1タンパクに対する抗体の作製とその利用
LKB1アミノ酸配列の N末側、 および C末側に対応する以下の 2種類のぺプチドを合 成した （サヮディテクノロジ一） 。
LKBl P6ペプチド （27- 45番に相当） NH2- CHMDSTEVIYQPRRK KL- C00H (配列番 号： 3 4 ) LKB1 P3ペプチド （400- 417番に相当） NH2-CLSTKSRAEGRAPNPARKA- C00H (配列番 号： 3 1 )
これらを、 m-マレイミ ドベンゾィル -N-ヒドロキシスクシニミ ドエステル（MBS ) を介した方法により、 ァミノ末端のシスティンでキーホールリンぺットへモシァ ニン（KLH )に結合させた （サヮディテクノロジー） 。 これを抗原としてゥサギに数 回免役し、 抗血清を得た。 この抗血清より、 ペプチドに特異的に反応する抗体を、 ペプチドをセル口ファイン （生化学工業） に結合して作製したァフィ二ティカラ ムを用いてァフィ二ティ精製した。
これらの抗体 （抗 LKB1 P6抗体 - N末側を認識、 抗 LKB1 P3抗体 - C末側を認 識） を用いウエスタンブロッテイングを行った結果を図 9に示す。 いずれの抗体 も、 C0S7細胞に発現させた LKBlmycタンパク質と考えられる約 55kDaのバンド （矢 印） を検出できることが示された。 この反応はそれそれ抗原としたペプチドの大 過剰量と抗体をあらかじめプレインキュベートしておくことでプロッキングされ ることから、 ェピト一プに特異的な反応であると考えられた。 また、 LKB1を発現 していないことがわかっている HeLa S3細胞ライゼ一ト中には全く交差反応は見ら れず、 このことから、 これらの抗体は非常に特異的に LKB1タンパク質を検出でき ることが明らかとなった。 また、 大腸菌によって GST融合タンパク質として発現さ せた LKB1タンパク質も抗 LKB1 P3抗体によって検出されることが確認された （図 8 ) o
これらの抗体を用いヒト組織切片を免疫染色した結果を図 1 0、 1 1、 1 2に 示す。 図 1 0はヒト胎児結腸の組織切片を染色した図である。 上皮性細胞の細胞 質が染色されている。 また、 一部内分泌細胞と思われる細胞が非常に強く染色さ れていることがわかる。 図 1 1はヒト成人脬臓の組織切片を染色した図である。 島細胞群が染色されている。 図 1 2はヒト胎児精巣の組織切片を染色した図であ る。 未発達の生殖細胞が強く染色されている。 これらの染色は全て抗 LKB1 P3抗体 によって得られたものであるが、 抗 LKB1 P6抗体によっても同様の結果が得られた。 また、 これらの反応はそれぞれの抗原べプチドとのプレインキュベーションによ つて消失したことから、 特異的な染色であると考えられる。 産業上の利用の可能性
本発明によりボイッ ·イエガ一症候群が LKB1遺伝子の変異により引き起こされ ることが解明された。 これにより LKB1遺伝子、 その配列に基づくプライマー若し くはプローブ、 LKB1タンパク質、 およびその抗体などを利用した、 ポイツ .イエ ガー症候群をはじめとする LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の検査や治療を行う ことが可能となった。

Claims

請求の範囲
I . 配列番号： 1乃至 4のいずれかに記載の塩基配列の少なくとも一部を含む 塩基配列からなる、 LK B 1遺伝子の変異に起因する疾患の検査に用いるプライマー DNA。
2 . 配列番号： 7乃至 3 0のいずれかに記載の塩基配列からなる、 請求項 1に 記載のプライマー DNA。
3 . LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がポイツ ·イエガー症候群である、 請求 項 1または 2に記載のプライマー DNA。
4 . 配列番号： 1乃至 4のいずれかに記載の塩基配列の少なくとも一部を含む 塩基配列からなる、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の検査に用いるプロ一ブ DN
5 . LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がボイッ ·イエガ一症候群である、 請求 項 4に記載のプローブ DNA。
6 . LKB1遺伝子を有効成分とする、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治療薬 c
7 . LKB1タンパク質を有効成分とする、 LKB1遺伝子の変異に起因する疾患の治 療薬。
8 . LKB1タンパク質の活性を促進する化合物を有効成分とする、 LKB1遺伝子の 変異に起因する疾患の治療薬。
9 . LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がボイッ ·ィエガー症候群である、 請求 項 6乃至 8のいずれかに記載の治療薬。
1 0 . LKB1夕ンパク質に結合する抗体を有効成分とする、 LKB1遺伝子の変異に 起因する疾患の検査薬。
I I . LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がポイツ ·イエガ一症候群である、 請 求項 1 0に記載の検査薬。
1 2 . LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、 LKB1遺伝子 の変異を検出することを特徴とする方法。
13. LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から DNA試料を調製する工程、
(b) 請求項 1に記載のプライマ一 DNAを用いて患者由来の DNAを増幅する工程、
(c) 増幅した DNAを切断する工程、
(d) DNA断片をその大きさに応じて分離する工程、
( e ) 分離した MA断片に対し、 請求項 4に記載のプローブ DNAをハイプリダイズ させる工程、
(f ) 検出された DNA断片の大きさを、 健常者の対照と比較する工程、 を含む方法。
14. LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から RNA試料を調製する工程、
(b) 大きさに応じて調製した RNAを分離する工程、
(c) 分離した RNAに対し、 請求項 4に記載のプローブ DNAをハイブリダィズさせ る工程、
(d) 検出された RNAの大きさを、 健常者の対照と比較する工程、
を含む方法。
15. LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から DNA試料を調製する工程、
(b) 請求項 1に記載のプライマー DNAを用いて患者由来の DNAを増幅する工程、
(c) 増幅した DNAを一本鎖 DNAに解離させる工程、
(d) 解離させた一本鎖 MAを非変性ゲル上で分離する工程、
( e ) 分離した一本鎖 DNAのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、 を含む方法。
16. LKB1遺伝子の変異に起因する疾患を検査する方法であって、
(a) 患者から DNA試料を調製する工程、 (b) 請求項 1に記載のプライマ一 DNAを用いて患者由来の DNAを増幅する工程、
(c) 増幅した DNAを、 DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程、
( d ) 分離した DNAのゲル上での移動度を健常者の対照と比較する工程、 を含む方法。
17. LKB1遺伝子の変異に起因する疾患がポイツ ·イエガー症候群である、 請 求項 12乃至 16のいずれかに記載の検査する方法。
PCT/JP1998/005357 1997-11-27 1998-11-27 Examination method, examination reagent and remedy for diseases caused by variation in lkb1 gene WO1999028459A1 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU12620/99A AU750564B2 (en) 1997-11-27 1998-11-27 Examination method, examination reagent and remedy for diseases caused by variation in LKB1 gene
EP98955971A EP1036844A4 (en) 1997-11-27 1998-11-27 Test methods, test reagent and remedies for diseases caused by changes in the LKB1 gene
US09/555,166 US6800436B1 (en) 1997-11-27 1998-11-27 Diagnostic method, diagnostic reagent and therapeutic preparation for diseases caused by variation in LKB1 gene
CA002311414A CA2311414A1 (en) 1997-11-27 1998-11-27 Diagnostic method, diagnostic reagent and therapeutic preparation for diseases caused by variation in lkb1 gene
NO20002697A NO20002697L (no) 1997-11-27 2000-05-26 Diagnostisk metode, diagnostisk reagens og terapeutisk preparat for sykdommer forÕrsaket av variasjon i LKB1-gen

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP9/344256 1997-11-27
JP34425697 1997-11-27
JP10/280357 1998-10-01
JP28035798 1998-10-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1999028459A1 true WO1999028459A1 (en) 1999-06-10

Family

ID=26553739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1998/005357 WO1999028459A1 (en) 1997-11-27 1998-11-27 Examination method, examination reagent and remedy for diseases caused by variation in lkb1 gene

Country Status (6)

Country Link
US (1) US6800436B1 (ja)
EP (1) EP1036844A4 (ja)
AU (1) AU750564B2 (ja)
CA (1) CA2311414A1 (ja)
NO (1) NO20002697L (ja)
WO (1) WO1999028459A1 (ja)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002006520A1 (fr) * 2000-07-19 2002-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode de criblage de compose regulant la transduction de signaux mek/erk et utilisation medicale dudit compose
US9155736B2 (en) 2012-10-18 2015-10-13 Signal Pharmaceuticals, Llc Inhibition of phosphorylation of PRAS40, GSK3-beta or P70S6K1 as a marker for TOR kinase inhibitory activity
US9359364B2 (en) 2013-04-17 2016-06-07 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical formulations, processes, solid forms and methods of use relating to 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b] pyrazin-2(1H)-one
US9358232B2 (en) 2013-04-17 2016-06-07 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using TOR kinase inhibitor combination therapy
US9416134B2 (en) 2014-04-16 2016-08-16 Signal Pharmaceuticals, Llc Solid forms of 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one, as TOR kinase inhibitors
US9474757B2 (en) 2013-04-17 2016-10-25 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using TOR kinase inhibitor combination therapy
US9505764B2 (en) 2013-04-17 2016-11-29 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
US9512129B2 (en) 2014-04-16 2016-12-06 Signal Pharmaceuticals, Llc Solid forms comprising 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one and a coformer
US9555033B2 (en) 2010-02-03 2017-01-31 Signal Pharmaceuticals, Llc Identification of LKB1 mutation as a predictive biomarker for sensitivity to TOR kinase inhibitors
US9604939B2 (en) 2013-05-29 2017-03-28 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical compositions of 7-(6-(2-hydroxypropan-2-YL)pyridin-3-YL)-1-((trans)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino [2,3-B]pyrazin-2(1H)-one, a solid form thereof and methods of their use
US9630966B2 (en) 2013-04-17 2017-04-25 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
US9782427B2 (en) 2013-04-17 2017-10-10 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using TOR kinase inhibitor combination therapy
US9937169B2 (en) 2013-04-17 2018-04-10 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using dihydropyrazino-pyrazine compound combination therapy
US11096940B2 (en) 2017-06-22 2021-08-24 Celgene Corporation Treatment of hepatocellular carcinoma characterized by hepatitis B virus infection

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1186232A4 (en) 1999-05-31 2004-11-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 'KNOCKOUT' ANIMALS LACKING THE LKB1 GENE
DK1633883T3 (da) * 2003-06-17 2009-01-26 Medical Res Council Fremgangsmåde til analyse af LKB1-phosphoryleringsaktivitet
WO2006062811A2 (en) * 2004-12-08 2006-06-15 Aventis Pharmaceuticals Inc. Method for measuring resistance or sensitivity to docetaxel
BRPI0614050A2 (pt) * 2005-06-30 2011-03-09 Syngenta Participations Ag métodos para peneiramento de polimorfismos de hibridização especìficos de gene (gshps) e seus usos no mapeamento genético e desenvolvimento de marcador

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08308586A (ja) * 1995-03-16 1996-11-26 Chugai Pharmaceut Co Ltd プロテインキナーゼをコードするｄｎａ

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5709999A (en) * 1994-08-12 1998-01-20 Myriad Genetics Inc. Linked breast and ovarian cancer susceptibility gene
CA2215260A1 (en) 1995-03-16 1996-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dna encoding protein kinase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08308586A (ja) * 1995-03-16 1996-11-26 Chugai Pharmaceut Co Ltd プロテインキナーゼをコードするｄｎａ

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AVIZIENYTE E., ET AL.: "SOMATIC MUTATIONS IN LKB1 ARE RARE IN SPORADIC COLORECTAL AND TESTICULAR TUMORS.", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 58., no. 10., 15 March 1998 (1998-03-15), US, pages 2087 - 2090., XP000938617, ISSN: 0008-5472 *
BIGNELL G. R., ET AL.: "LOW FREQUENCY OF SOMATIC MUTATIONS IN THE LKB1/PEUTZ-JEGHERS SYNDROME GENE IN SPORADIC BREAST CANCER.", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 58., no. 07., 1 April 1998 (1998-04-01), US, pages 1384 - 1386., XP000938618, ISSN: 0008-5472 *
DONG S. M., ET AL.: "FREQUENT SOMATIC MUTATIONS IN SERINE/THREONINE KINASE 11/PEUTZ-JEGHERS SYNDROME GENE IN LEFT-SIDED COLON CANCER.", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 58., no. 17., 1 September 1998 (1998-09-01), US, pages 3787 - 3790., XP000938616, ISSN: 0008-5472 *
HEMMINKI A., ET AL.: "SERINE/THREONINE KINASE GENE DEFECTIVE IN PEUTZ-JEGHERS SYNDROME.", NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, UNITED KINGDOM, vol. 391., no. 6663., 1 January 1998 (1998-01-01), United Kingdom, pages 184 - 187., XP000861923, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/34432 *
JENNE D. E., ET AL.: "PEUTZ-JEGHERS SYNDROME IS CAUSED BY MUTATIONS IN A NOVEL SERINE THREONINE KINASE.", NATURE GENETICS., NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, US, vol. 18., no. 01., 1 January 1998 (1998-01-01), NEW YORK, US, pages 38 - 43., XP000951587, ISSN: 1061-4036, DOI: 10.1038/ng0198-38 *
NAKAGAWA H., ET AL.: "NINE NOVEL GERMLINE MUTATIONS OF STK11 IN TEN FAMILIES WITH PEUTZ-JEGHERS SYNDROME.", HUMAN GENETICS, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 103., no. 02., 1 August 1998 (1998-08-01), BERLIN, DE, pages 168 - 172., XP000861892, ISSN: 0340-6717, DOI: 10.1007/s004390050801 *
STRATAKIS C. A., ET AL.: "CARNEY COMPLEX, PEUTZ-JEGHERS SYNDROME, COWDEN DISEASE, AND BANNAYAN-ZONANA SYNDROME SHARE CUTANEOUS AND ENDOCRINE MANIFESTATIONS, BUT NOT GENETIC LOCI.", JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, THE ENDOCRINE SOCIETY, US, vol. 83., no. 08., 1 August 1998 (1998-08-01), US, pages 2972 - 2977., XP000861842, ISSN: 0021-972X, DOI: 10.1210/jc.83.8.2972 *
WALSH J H: "GASTROENTEROLOGY NEWS PEUTZ-JEGHERS CULPRIT IS REVEALED", GASTROENTEROLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 114, no. 03, 1 March 1998 (1998-03-01), AMSTERDAM, NL, pages 429, XP002918382, ISSN: 0016-5085 *
WANG Z.-J., ET AL.: "GENETIC PATHWAYS OF COLORECTAL CARCINOGENESIS RARELY INVOLVE THE PTEN AND LKB1 GENES OUTSIDE THE INHERITED HAMARTOMA SYNDROMES.", JOURNAL OF PATHOLOGY, JOHN WILEY & SONS LTD, GB, vol. 153., no. 02., 1 August 1998 (1998-08-01), GB, pages 363 - 366., XP000911885, ISSN: 0022-3417 *

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002006520A1 (fr) * 2000-07-19 2002-01-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode de criblage de compose regulant la transduction de signaux mek/erk et utilisation medicale dudit compose
US9555033B2 (en) 2010-02-03 2017-01-31 Signal Pharmaceuticals, Llc Identification of LKB1 mutation as a predictive biomarker for sensitivity to TOR kinase inhibitors
US9155736B2 (en) 2012-10-18 2015-10-13 Signal Pharmaceuticals, Llc Inhibition of phosphorylation of PRAS40, GSK3-beta or P70S6K1 as a marker for TOR kinase inhibitory activity
US9557338B2 (en) 2012-10-18 2017-01-31 Signal Pharmaceuticals, Llc Inhibition of phosphorylation of PRAS40, GSK3-beta or P70S6K1 as a marker for tor kinase inhibitory activity
US9782427B2 (en) 2013-04-17 2017-10-10 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using TOR kinase inhibitor combination therapy
US10052322B2 (en) 2013-04-17 2018-08-21 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical formulations, processes, solid forms and methods of use relating to 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one
US9505764B2 (en) 2013-04-17 2016-11-29 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
US10391092B2 (en) 2013-04-17 2019-08-27 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using dihydropyrazino-pyrazine compound combination therapy
US10183019B2 (en) 2013-04-17 2019-01-22 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
US9358232B2 (en) 2013-04-17 2016-06-07 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using TOR kinase inhibitor combination therapy
US9474757B2 (en) 2013-04-17 2016-10-25 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using TOR kinase inhibitor combination therapy
US9630966B2 (en) 2013-04-17 2017-04-25 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
US9359364B2 (en) 2013-04-17 2016-06-07 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical formulations, processes, solid forms and methods of use relating to 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b] pyrazin-2(1H)-one
US9980963B2 (en) 2013-04-17 2018-05-29 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with dihydropyrazino-pyrazines
US9827243B2 (en) 2013-04-17 2017-11-28 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical formulations, processes, solid forms and methods of use relating to 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one
US9937169B2 (en) 2013-04-17 2018-04-10 Signal Pharmaceuticals, Llc Methods for treating cancer using dihydropyrazino-pyrazine compound combination therapy
US9974786B2 (en) 2013-05-29 2018-05-22 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical compositions of 7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((trans)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino[2,3- B]pyrazin-2(1H)-one, a solid form there of and methods of their use
US9795603B2 (en) 2013-05-29 2017-10-24 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical compositions of 7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((trans)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino [2,3-B]pyrazin-2(1H)-one, a solid form thereof and methods of their use
US9604939B2 (en) 2013-05-29 2017-03-28 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical compositions of 7-(6-(2-hydroxypropan-2-YL)pyridin-3-YL)-1-((trans)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino [2,3-B]pyrazin-2(1H)-one, a solid form thereof and methods of their use
US10052323B2 (en) 2013-05-29 2018-08-21 Signal Pharmaceuticals, Llc Pharmaceutical compositions of 7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-(trans)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino [2,3-b]pyrazin-2(1H)-one, a solid form thereof and methods of their use
US9975898B2 (en) 2014-04-16 2018-05-22 Signal Pharmaceuticals, Llc Solid forms of 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-YL)-3,4-dihydropyrazino [2,3-b]pyrazin-2(1H)-one as tor kinase inhibitors
US9981971B2 (en) 2014-04-16 2018-05-29 Signal Pharmaceuticals, Llc Solid forms of 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one as TOR kinase inhibitors
US9416134B2 (en) 2014-04-16 2016-08-16 Signal Pharmaceuticals, Llc Solid forms of 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one, as TOR kinase inhibitors
US9512129B2 (en) 2014-04-16 2016-12-06 Signal Pharmaceuticals, Llc Solid forms comprising 1-ethyl-7-(2-methyl-6-(1H-1,2,4-triazol-3-yl)pyridin-3-yl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one and a coformer
US11096940B2 (en) 2017-06-22 2021-08-24 Celgene Corporation Treatment of hepatocellular carcinoma characterized by hepatitis B virus infection

Also Published As

Publication number Publication date
AU1262099A (en) 1999-06-16
NO20002697D0 (no) 2000-05-26
NO20002697L (no) 2000-07-27
EP1036844A1 (en) 2000-09-20
EP1036844A4 (en) 2002-12-04
US6800436B1 (en) 2004-10-05
CA2311414A1 (en) 1999-06-10
AU750564B2 (en) 2002-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7510834B2 (en) Gene mapping method using microsatellite genetic polymorphism markers
EP2300041B1 (en) Method for determining risk of recurrence of prostate cancer
WO1999028459A1 (en) Examination method, examination reagent and remedy for diseases caused by variation in lkb1 gene
US20020098530A1 (en) Tumor suppressor gene
JP2010248210A (ja) 疾患のイメージング、診断、及び治療
JP2002501376A (ja) 新規のｌｄｌ−レセプター
US20090220967A1 (en) Systemic Carnitine Deficiency Gene and Uses Thereof
Yang et al. Genomic structure and mutational analysis of the human KIF1B gene which is homozygously deleted in neuroblastoma at chromosome 1p36. 2
JPH11504803A (ja) ヒト転移サプレッサー遺伝子ｋａｉ１に由来する試薬を使用する診断方法及び遺伝子療法
US20050130146A1 (en) Histone deacetylase 9
US7335475B2 (en) PR/SET-domain containing nucleic acids, polypeptides, antibodies and methods of use
US6361948B1 (en) Prognostic compositions for prostate cancer and methods of use thereof
JP2004533206A (ja) 化学療法のための標的としてのガン関連遺伝子
JP2002531066A (ja) イカロス（ｉｋａｒｏｓ）アイソフォームおよび突然変異体
US20110052593A1 (en) Breast cancer associated antigen
JP2001512969A (ja) 緑内障の診断および治療
US7112419B2 (en) Human hepatoma associated protein and the polynucleotide encoding said polypeptide
CN114846156A (zh) Hla-h、hla-j、hla-l、hla-v和hla-y作为治疗和诊断靶
JP2004505637A (ja) ガン関連ｓｉｍ２遺伝子
JP4617257B2 (ja) ヒト癌関連遺伝子、それがコードする産物および適用
US20030049623A1 (en) PR/SET-domain containing nucleic acids, polypeptides, antibodies and methods of use
US20030109027A1 (en) TSLL2 gene
JP2002521062A (ja) ヒトニューロキニン１レセプター遺伝子における遺伝子多形性および疾病の診断および処置におけるその使用
US6994996B1 (en) Polypeptide, human vacuolar H+ -ATPase C subunit 42 and polynucleotide encoding it
WO1999009164A9 (en) Coding sequence haplotypes of the human brca2 gene

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CU CZ DE DK EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MD MG MK MN MW MX NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT UA UG US UZ VN YU ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW SD SZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)

Free format text: (EXCEPT GD)

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2311414

Country of ref document: CA

Ref country code: CA

Ref document number: 2311414

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12620/99

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1998955971

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1998955971

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09555166

Country of ref document: US

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 12620/99

Country of ref document: AU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1998955971

Country of ref document: EP