UA111813C2

UA111813C2 - Спосіб одержання сквалену з застосуванням дріжджів

Info

Publication number: UA111813C2
Application number: UAA201207689A
Authority: UA
Inventors: Кейт А. Волкер; Марк Е. Нут; Ноель М. Фонг; Пітер Р. Бітем
Original assignee: Нукеліс, Інк.
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2010-11-22
Publication date: 2016-06-24
Also published as: ES2760911T3; KR101951051B1; JP2013511282A; EP3219815B1; DK2504421T3; PT2504421T; EP3219815A3; WO2011063350A3; US20170145429A1; JP6479711B2; CN102666837A; US20110124072A1; AU2010321722A1; PL2504421T3; KR20120086328A; ES2625154T3; AU2016204319A1; EP2504421A2; WO2011063350A2; US11952577B2

Abstract

Винахід належить до способу одержання сквалену, зазначений спосіб включає культивування генетично модифікованих або не модифікованих генетично дріжджівYeastem po l g із протигрибковим агентом.

Description

Винахід належить до способу одержання сквалену, зазначений спосіб включає культивування генетично модифікованих або не модифікованих генетично дріжджів Уатом/а /роуїса Уеавівт ро 1 4 із протигрибковим агентом.

СПОРІДНЕНІ ПАТЕНТНІ ЗАЯВКИ

ІО00О1) Дана заявка претендує на пріоритет на підставі попередньої заявки на патент США Мо 61/263775 під назвою "Способи та композиції для отримання сквалену із застосуванням дріжджів", поданої 23 листопада 2009 р. і включеної в дану заявку за допомогою посилання в усій повноті і для будь-яких цілей.

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ

0002) У винаході запропоновані способи і композиції для отримання ізопреноїдів, таких як сквален, із застосуванням дріжджів.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Ї0003| Наступний опис передумов створення винаходу наведений виключно для сприяння розумінню даного винаходу і не має за мету описати або включити в даний винахід відомий рівень техніки. 0004) Ізопреноїди, такі як сквален, являють собою ліпіди комерційного значення. Вони мають відмінні змащуючі властивості, стійкі до окислення, мають низькі температури застигання, низькі температури замерзання, високі температури спалаху і легко біорозкладаються. Сквален в даний час виробляється шляхом екстракції з оливкової олії або олії печінки холодноводної акули і має високу собівартість продукції. Через високу собівартість є економічно доцільним застосування сквалену і сквалану (повністю гідрогенізованого похідного сквалену) при виробництві продукції з невеликим ринком збуту, наприклад, мастила для годинників, фармацевтичних товарів/нутрицевтиків, косметики, парфумерії, і як проміжних хімічних продуктів при виробництві товарів з високою вартістю.

ЇО00О5| У той же час існує значний ринковий потенціал для біорозкладних мастильних матеріалів, присадок до мастил та гідравлічних рідин. Здатність до біологічного розкладання цих продуктів є особливо важливою при використанні в екологічно значущих областях, наприклад, у сільському господарстві або там, де значна кількість мастильних або гідравлічних рідин може потрапляти у навколишнє середовище. Об'єм потенційного ринку збуту біорозкладних мастильних матеріалів, присадок до мастил та гідравлічних рідин досить значний і ймовірно складає близько п'яти мільйонів тонн на рік.

І0006) Біорозкладні мастильні матеріали, присадки до мастил і гідравлічні рідини, одержані з

Зо рослинних і тваринних жирів та масел, існують, але мають недоліки. Як правило, вони тверднуть при відносно високих температурах (тобто тверднуть у холодну погоду) і мають температури спалаху занадто низькі для використання при високих температурах (тобто вони розкладаються або займаються в умовах, нормальних для гарячого двигуна).

Ї0007| Таким чином, існує необхідність в економічно ефективному способі отримання сквалену, який дозволив би здійснювати серійне виробництво і широке застосування сквалену та сквалану в біорозкладних мастильних матеріалах, присадках до мастил та гідравлічних рідин. (0008) Спапод і співавтори (Аррі. Місгобріої. Віотесппої., 2008, 78, 963-72) повідомляють про відкриття дріжджів дикого типу, Рзейдолута 5р. УСС207, які продукують "велику кількість сквалену і декількох поліненасичених жирних кислот", і описують виділення Рзейдогута 5р.

УСС207 з морської води, зібраної біля зцат, О5А; автори не впевнені, чи являє Рзхейдогута 5р.

УСС207 собою новий вид чи варіант Р. гедціоза або Р. арпіаїі5. У зазначеній статті "ефективність отримання сквалену |з Рзхейдо7ута 5р. УСС207| досліджували в різних умовах".

І0009| Компанія Юоум/ Адгозсіепсез (ІІ С) в джерелі О5іпд Уеавзі Регтепіайоп юю Ргодисе Сов51-

ЕпПесіїме апа Віодедгадабіє ІГибгісапі5, ("Застосування дріжджової ферментації для отримання економічно ефективних біорозкладних мастил") пЕр:https://«Тагзгерогів.аїр.пізї дом/герогів/ 95-01-0 148РОР.раї, повідомляє, що "Ізазначена| компанія планувала застосовувати генну інженерію з метою зміни метаболічних властивостей жирових (ліпідних) дріжджів для збільшення здатності зазначених дріжджів продукувати ізопрени шляхом біосинтезу". Зокрема, мішенями були чотири ферменти: АсСсСаза, гідроксиметилглутарил-КоА-редуктаза (ГМГР), скваленсинтетаза і скваленепоксидаза.

ІЇО010| У патенті США Мо 5460949 описаний "спосіб збільшення акумуляції сквалену і специфічних стеролів у дріжджах". Зокрема показано, що "акумуляція |с| квалену і стеролу підвищується у результаті підвищення рівня експресії гена, що кодує поліпептид з ГМГ-КоА- редуктазною активністю".

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

0011) У даному винаході запропоновані композиції і способи для отримання сквалену з дріжджів. 0012) Згідно з певними аспектами і варіантами реалізації отримання підвищених кількостей бо ізопреноїдів (наприклад, сквалену) за допомогою генетично перетворених або не перетворених генетично дріжджів може бути результатом мутацій, модифікацій та/або зміни активності одного або більше ферменту шляху біосинтезу ізопреноїдів. Наприклад, ацетил-КоА-карбоксилаза (або "АССаза"), ГМГ-КоА-редуктаза, скваленепоксидаза, скваленсинтаза, АТФ-цитратсинтаза, мевалонаткіназа (наприклад, мевалонаткіназа М. Іроїуйса (СепоІємоге5 ЖМАПІОВ160389)), гліцеринкіназа (наприклад, гліцеринкіназа У. Іроїміса (бепоЇїемиге5 МАГПІОРО04849)) та/або 5- амінолевулінатсинтаза (наприклад, кодована геном НЕМІ Засспаготусев сегемізіае) можуть бути модифіковані, містити мутації або проявляти змінену активність.

І0013) Згідно з деякими переважними варіантами реалізації генетично перетворені дріжджі, що експресують модифікований фермент, отримують введенням мутації у зазначений фермент за допомогою олігополімеру нуклеїнових основ для генної репарації згідно з наведеним тут описом. Згідно з деякими варіантами реалізації запропоновані способи включають вбудовування олігонуклеотиду для генної репарації, який містить специфічну мутацію гена- мішені, який представляє інтерес, у дріжджову клітину за допомогою будь-якого із загальновідомих у даній області техніки способів (наприклад, електропорації, ГіОАс, біолістики, сферопластів та/або Адгорасіегішт (див., наприклад, МеоСіеПапа, СМ, Спаподо, Жс, апа Кмоп-

Спипо, Ку. (2005) Рипда! Сепеїісв апа Віоіоду 42:904-913)) та ідентифікації клітин, що містять мутантний фермент. 0014) Згідно з одним із аспектів даного винаходу у винаході запропоновані ізопреноїди, виділені з перетворених генетично або не перетворених генетично дріжджів, описаних у даному документі. Згідно з відповідним аспектом у винаході запропонований сквален, виділений із генетично перетворених дріжджів згідно з наведеним тут описом. 00151 Згідно з іншим аспектом у винаході запропонований спосіб отримання ізопреноїдів, переважно сквалену. Згідно з певними варіантами реалізації зазначений спосіб включає отримання перетворених генетично або не перетворених генетично дріжджів згідно з описом у цьому документі і виділення сквалену із зазначених дріжджів. Згідно з деякими варіантами реалізації зазначений спосіб включає вплив на дріжджі (перетворені або не перетворені генетично) протигрибковим агентом (наприклад, аліламіновим протигрибковим агентом, таким як тербінафін) і виділення сквалену із зазначених дріжджів. Згідно з деякими варіантами реалізації зазначений спосіб включає вплив на генетично перетворені дріжджі, такі як описані в

Зо цьому документі, протигрибковим агентом (наприклад, аліламіновим протигрибковим агентом, таким як тербінафін) і виділення сквалену із зазначених дріжджів. Згідно з деякими варіантами реалізації зазначений спосіб включає вплив на не перетворені генетично дріжджі, такі як описані у цьому документі, протигрибковим агентом (наприклад, аліламіновим протигрибковим агентом, таким як тербінафін) і виділення сквалену із зазначених дріжджів.

ІЇ0016| Згідно з певними варіантами реалізації описаних у даному документі способів і композицій, що включають протигрибковий агент (наприклад, аліламіновий протигрибковий агент, такий як тербінафін), зазначений протигрибковий агент (наприклад, тербінафін або інший протигрибковий агент) може бути доданий або може бути присутнім у концентрації приблизно 1 мкг/мл чи вище або приблизно 5 мкг/мл; або приблизно 10 мкг/мл; або приблизно 11 мкг/мл; або приблизно 12 мкг/мл; або приблизно 12,5 мкг/мл; або приблизно 13 мкг/мл, або приблизно 15 мкг/мл; або приблизно 16 мкг/мл; або приблизно 20 мкг/мл; або приблизно 25 мкг/мл; або приблизно 30 мкг/мл; або приблизно 40 мкг/мл; або приблизно 50 мкг/мл чи вище. Згідно з певними варіантами реалізації способів і композицій, описаних в даному документі, які включають протигрибковий агент (наприклад, аліламіновий протигрибковий агент, такий як тербінафін), зазначений протигрибковий агент (наприклад, тербінафін або інший протигрибковий агент) може бути доданий або може бути присутнім у концентрації приблизно від 0,5 до 100 мкг/мл; або від 0,5 до 50 мкг/мл; або 1-50 мкг/мл; або 5-50 мкг/мл; або 8-50 мкг/мл; або 10-50 мкг/мл; або 12-50 мкг/мл; або 15-50 мкг/мл; або 15-50 мкг/мл; або 25-50 мкг/мл; або 1- 25 мкг/мл; або 5-25 мкг/мл; або 10-25 мкг/мл; або 10-20 мкг/мл; або 10-15 мкг/мл.

І0017| Згідно з одним аспектом у винаході запропоновані генетично перетворені дріжджі, які продукують ізопреноїди. Згідно з певними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі продукують сквален. 0018) Згідно з іншим аспектом, у винаході запропоновані генетично перетворені дріжджі, де зазначені дріжджі генетично перетворені таким чином, щоб продукувати підвищені рівні сквалену в порівнянні з відповідними нативними дріжджами. Згідно з певними варіантами реалізації вищенаведених аспектів даного винаходу, зазначені генетично перетворені дріжджі експресують один або більше модифікований фермент з однією або більше, ніж однією, мутацією. Згідно з певними варіантами реалізації вищенаведених аспектів рівень експресії вказаного одного або більше ферменту у зазначених генетично перетворених дріжджах 60 підвищений або знижений в порівнянні з відповідними нативними дріжджами. Згідно з відповідними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі експресують один або більше модифікований фермент з однією або більше, ніж однією, мутацією, і рівень експресії вказаного одного або більше ферменту у зазначених генетично перетворених дріжджах підвищений або знижений в порівнянні з відповідними нативними дріжджами. Згідно з певними переважними варіантами реалізації, запропонованими у даному винаході, генетично перетворені дріжджі генетично перетворені введенням мутації у фермент із застосуванням олігополімеру нуклеїнових основ для генної репарації. Згідно з деякими варіантами реалізації генетично перетворені дріжджі згідно з описом у цьому винаході генетично перетворені вбудовуванням однієї або більше мутацій у сайт початку трансляції або в область гена, що оточує його і що кодує фермент, який підвищує або знижує експресію зазначеного ферменту, наприклад, згідно з описами в заявках на патент США Мо 10/411969 і Мо 11/625586. Згідно з певними варіантами реалізації зазначений фермент, модифікований в генетично перетворених дріжджах згідно з даним винаходом, включає один або більше фермент, вибраний із групи, що складається З ацетил-КоА-карбоксилази (або "АсСсСази"), ГМГ-КоА-редуктази, скваленепоксидази, скваленсинтази, АТФ-цитрат-ліази, АТФ-цитратсинтази, мевалонаткінази (наприклад, мевалонаткінази М. Ііроїуїйса (Сепоіемиге5 МА ІОВ160389)), гліцеринкінази (наприклад, гліцеринкінази У. Іроїуйса (сепоїемиге5 МАГ ІОРО004849)) і 5-амінолевулінатсинтази. 0019) Нуклеїнова основа містить основу, яка являє собою пурин, піримідин або їхнє похідне, або аналог. Нуклеозиди являють собою нуклеїнові основи, що містять фрагмент пентозофуранозілу, наприклад, необов'язково заміщений рибозид або 2'-дезоксирибозид.

Нуклеозиди можуть бути з'єднані одним або кількома зв'язуючими фрагментами, які можуть містити або не містити фосфору. Нуклеозиди, з'єднані незаміщеними фосфодиефірними зв'язками, називають нуклеотидами. "Нуклеїнові основи" в контексті даного документа включають пептидні нуклеїнові основи, субодиниці пептидних нуклеїнових кислот, морфолінові нуклеїнові основи, а також нуклеозиди та нуклеотиди.

І0020| Олігополімер нуклеїнових основ являє собою полімер нуклеїнових основ, який здатний гібридизуватися шляхом спарювання основ за Уотсоном-Кріком з комплементарною послідовністю ДНК. Ланцюг олігополімеру нуклеїнових основ містить одиночні 5" і 3'-кінці, які являють собою кінцеві нуклеїнові основи полімеру. Конкретний ланцюг олігополімеру

Зо нуклеїнових основ може містити нуклеїнові основи всіх типів. З'єднання олігополімеру нуклеїнових основ являє собою з'єднання, яке містить один або більше ланцюг олігополімеру нуклеїнових основ, які комплементарні і гібридизовані шляхом спарювання за Уотсоном-Кріком.

Нуклеїнові основи відносяться до дезоксирибо-типу або рибо-типу. Нуклеїнові основи рибо-типу являють собою нуклеїнові основи, що містять пентозофуранозіл, де вуглець в положенні 2" являє собою метилен, заміщений гідроксилом, алкокси або галогеном. Нуклеїнові основи дезоксирибо-типу являють собою нуклеїнові основи, відмінні від нуклеїнових основ рибо-типу, і включають усі нуклеїнові основи, що не містять фрагментів пентозофуранозілу.

Ї0021| Нитка оолігополімеру нуклеїнових основ загалом включає обидва ланцюги олігополімеру нуклеїнових основ і сегменти або ділянки ланцюгів олігополімеру нуклеїнових основ. Нитка олігополімеру нуклеїнових основ має 3'-кінець і 5'-кінець. У тих випадках, коли протяжність нитки олігополімеру нуклеїнових основ збігається з протяжністю ланцюга, зазначені

З3'- і 5-кінці зазначеної нитки також є і 3", і 5 кінцями зазначеного ланцюга. (0022) Використовуваний у даній заявці термін "олігополімер нуклеїнових основ для генної репарації" означає олігонуклеотиди, в тому числі змішані дуплексні олігонуклеотиди; молекули, що не містять нуклеотидів; однониткові олігодезоксинуклеотиди та інші молекули для генної репарації згідно з наведеним нижче детальним описом.

І0023| Згідно з деякими варіантами реалізації, перетворені генетично дріжджі або не перетворені генетично дріжджі згідно з даним винаходом отримують з жирових дріжджів. Згідно з певними переважними варіантами реалізації, перетворені генетично дріжджі або не перетворені генетично дріжджі згідно з даним винаходом отримують із дріжджів, вибраних із групи, яка складається з Сгуріососси5 сигмайш5, Магоміа Іроїуїйса, КПподоїогиїа дішіпи, і

КПогозрогідішт огиЇоідеб5. Згідно з деякими переважними варіантами реалізації, зазначені перетворені генетично дріжджі або не перетворені генетично дріжджі отримують із дріжджів, вибраних з групи, яка складається з Стгуріососси5 сигмайи5, Матоу/ла Ііроїуйса і ЕПодоїогца дішіпи5. Згідно з відповідними варіантами реалізації, зазначені перетворені генетично дріжджі або не перетворені генетично дріжджі отримують із дріжджів, вибраних із групи, яка складається з Стуріососси5 сигмай5 і КПподоїогціа дішіпи5. Згідно з певними переважними варіантами реалізації, зазначені перетворені генетично дріжджі або не перетворені генетично дріжджі отримують не з Маїтом/а Ііроїуїїса. Згідно з певними варіантами реалізації, зазначені перетворені 60 генетично дріжджі або не перетворені генетично дріжджі являють собою штам МУаїтоу/а

Іроїуїіса, вибраний із групи, яка складається з АТСС 20688, АТСС 90811, АТСС 90904, АТОС 90812, АТОСС МУ А-2613 і Меазіегп ро!їд. (0024) Згідно з певними переважними варіантами реалізації, фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах згідно з даним винаходом, являє собою ацетил-Код- карбоксилазу (або "АССазу"). Згідно з деякими переважними варіантами реалізації ацетил-КоА- карбоксилазу в генетично перетворених дріжджах модифікують так, що її активність і/або експресія зменшуються відносно відповідних нативних дріжджів, або так, що вказана активність іМабо експресія усунені. Згідно з деякими варіантами реалізації зазначена ацетил-Код- карбоксилаза може бути модифікована так, що її субстратна селективність змінена. Згідно з деякими переважними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі модифікують так, що активність і/або експресія ацетил-КоА-карбоксилази знижена відносно відповідних нативних дріжджів, але зазначена активність не усунена. Згідно з деякими переважними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі модифікують так, що активність і/або експресія ацетил-КоА-карбоксилази в зазначених генетично перетворених дріжджах знижується приблизно до 90 95; або приблизно до 80 95; або приблизно до 70 905; або приблизно до 60 95; або приблизно до 50 95; або приблизно до 40 95; або приблизно 30 95, або приблизно до 20 95; або приблизно до 10 95; або приблизно до 5 95 від активності і/або експресії у відповідних нативних дріжджах. Згідно з відповідними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі модифікуються так, що активність і/або експресія ацетил-КоА- карбоксилази в зазначених генетично перетворених дріжджах становить приблизно 90-95 95; або приблизно 80-90 95; або приблизно 70-80 95; або приблизно 60-70 95; або приблизно 50- 60 95; або приблизно 40-50 95; або приблизно 30-40 95; або приблизно 20-30 95; або приблизно 10-20 95; або приблизно 5-10 95; або приблизно 2-5 95 від активності і/або експресії у відповідних нативних дріжджах. (0025) Згідно з певними переважними варіантами реалізації фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах згідно з даним винаходом, являє собою ГМГ-КоА-редуктазу.

Згідно з деякими переважними варіантами реалізації ГМГ-КоА-редуктаза в генетично перетворених дріжджах модифікується так, що її активність і/або експресія підвищуються відносно відповідних нативних дріжджів. Згідно з деякими варіантами реалізації зазначена ГМГ-

Зо КоА-редуктаза може бути модифікована так, що її субстратна селективність змінена. Згідно з певними переважними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі модифікують так, що активність і/або експресія ГМГ-КоА-редуктази в зазначених генетично перетворених дріжджах підвищуються щонайменше 1,2-кратно; або 1,5-кратно; або 2-кратно; або 3-кратно; або 4-кратно; або 5-кратно; або 10-кратно; або 15-кратно; або 20-кратно; або 50- кратно; або 100-кратно; або 1000-кратно; або 10000-кратно; або 100000-кратно; або 1000000- кратно в порівнянні з активністю і/або експресією у відповідних нативних дріжджах.

І0026| Згідно з певними переважними варіантам реалізації запропонований у даному винаході фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах, являє собою скваленепоксидазу. Згідно з деякими переважними варіантами реалізації, скваленепоксидаза в генетично перетворених дріжджах модифікується таким чином, що її активність і/або експресія зменшуються відносно відповідних нативних дріжджів; або таким чином, що зазначені активність і/або експресія усунені. Згідно з деякими варіантами реалізації зазначена скваленепоксидаза може бути модифікована таким чином, що її субстратна селективність змінена. Згідно з деякими переважними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі модифікуються таким чином, що активність і/або експресія скваленепоксидази знижені в порівнянні з відповідними нативними дріжджами, але зазначена активність не усунена. Згідно з певними варіантами реалізації, зазначена скваленепоксидаза модифікується включенням однієї або більше мутації (й) або гомолога (ів) однієї або більше мутації (й), пов'язаної (их) з підвищеною чутливістю до тербінафіну. Згідно з певними варіантами реалізації, зазначені дріжджі не являються Засспаготусез сегемізіає, а зазначена скваленепоксидаза модифікована таким чином, що містить гомологи однієї або більше наступних мутацій, асоційованих із підвищеною чутливістю до тербінафіну в гені ЕКОС1 Засспаготусе5 сегемізіае: 5305, 137Р і

К2695 (див., наприклад, Тигпожу5Ку, 2005, 2007 і 2008). Згідно з певними варіантами реалізації, зазначені дріжджі являють собою У. Іроїуїса, а зазначена скваленепоксидаза модифікована таким чином, що містить гомологи однієї або більше наступних мутацій, асоційованих із підвищеною чутливістю до тербінафіну в гені ЕКОС1 Засспаготусе5 сегемізіае: 5305, 137Р і

К2695 (див., наприклад, Тигпому5Ку, 2005, 2007 і 2008). Згідно з деякими варіантами реалізації, зазначений ген дріжджової скваленепоксидази модифікується згідно з описом у даному документі за допомогою синтезу і заміни гена дикого типу або введенням мутацій за допомогою бо КТО5. Згідно з деякими переважними варіантами реалізації, зазначені генетично перетворені дріжджі модифікуються таким чином, що активність і/або експресія скваленепоксидази в зазначених генетично перетворених дріжджах знижується приблизно до 90 95; або приблизно до 80 95; або приблизно до 70 95; або приблизно до 60 95; або приблизно до 50 95; або приблизно до 40 95; або приблизно до 3095; або приблизно до 20 95; або приблизно до 10 95; або приблизно до 5 95 від активності і/або експресії у відповідних нативних дріжджах. Згідно з відповідними варіантами реалізації, зазначені генетично перетворені дріжджі модифікуються таким чином, що активність і/або експресія скваленепоксидази в зазначених генетично перетворених дріжджах становить приблизно 90-95 95; або приблизно 80-90 95; або приблизно 70-80 95; або приблизно 60-70 95; або приблизно 50-60 95; або приблизно 40-50 95; або приблизно 30-40 95; або приблизно 20-30 95; або приблизно 10-20 95; або приблизно 5-10 95; або приблизно 2-5 95 від активності і/або експресії у відповідних нативних дріжджах.

І0027| Згідно з певними переважними варіантами реалізації, фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах згідно з даним винаходом, являє собою скваленсинтазу.

Згідно з деякими переважними варіантами реалізації, скваленсинтаза в генетично перетворених дріжджах модифікована так, що її активність і/або експресія підвищуються в порівнянні з відповідними нативними дріжджами. Згідно з деякими варіантами реалізації, зазначена скваленсинтаза може бути модифікована таким чином, що змінюється її субстратна селективність. Згідно з певними переважними варіантами реалізації, зазначені генетично перетворені дріжджі модифіковані таким чином, що активність і/або експресія скваленсинтази в зазначених генетично перетворених дріжджах підвищена(ї) щонайменше 1,2-кратно; або 1,5- кратно; або 2-кратно; або 3-кратно; або 4-кратно; або 5-кратно; або 10-кратно; або 15-кратно; або 20-кратно; або 50-кратно; або 100-кратно; або 1000-кратно; або 10000-кратно; або 100 000- кратно; або 1000000-кратно в порівнянні з активністю і/або експресією у відповідних нативних дріжджах. (0028) Згідно з певними переважними варіантами реалізації, фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах згідно з даним винаходом, являє собою АТФ-цитрат-ліазу.

Згідно з деякими варіантами реалізації, гени будь-якої або обох субодиниць АТФ-цитрат-ліази (наприклад, АТФ-цитрат-ліази Маїтом/іа Іроїуїйса; сСепоїемиге5 МАГ І00244319 і МАГІОЄ347939) модифіковані згідно з наведеним тут описом. Згідно з певними варіантами реалізації, активність

Зо АТФ-цитрат-ліази в модифікованих дріжджах підвищена в результаті вставки та/або гетерологічної експресії гена тваринної АТФ-ліази, яка включає холофермент з однієї субодиниці. Згідно з деякими переважними варіантами реалізації, АТФ-цитрат-ліаза в генетично перетворених дріжджах модифікована таким чином, що її активність і/або експресія підвищуєть(ють)ся в порівнянні з відповідними нативними дріжджами. Згідно з певними переважними варіантами реалізації, зазначені генетично перетворені дріжджі модифіковані таким чином, що активність і/або експресія АТФ-цитрат-ліаази в зазначених генетично перетворених дріжджах підвищуєть(ють)ся щонайменше 1,2-кратно; або 1,5-кратно; або 2- кратно; або 3-кратно; або 4-кратно; або 5-кратно; або 10-кратно; або 10-кратно; або 20-кратно; або 50-кратно; або 100-кратно; або 1000-кратно; або 10000-кратно; або 100000-кратно; або 1000000-кратно в порівнянні з активністю та/або експресією у відповідних нативних дріжджах.

І0029| Згідно з певними варіантами реалізації композицій і способів, запропонованих у даному винаході, фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах або не перетворених генетично дріжджах, являє собою АТФ-цітратсинтазу. Переважно, її активність і/або експресія підвищуєть(ють)ся в порівнянні з відповідними нативними дріжджами. 0030 Згідно з певними переважними варіантами реалізації, фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах згідно з даним винаходом, являє собою мевалонаткіназу (наприклад, мевалонаткіназу У. Ііроїуїйса (сСепоЇїемигез МАПІОВ160389)). Згідно з деякими переважними варіантами реалізації, мевалонаткіназа (наприклад, мевалонаткіназа У. Іроїуїса (СсепоЇемиге5 МАГІОВ160389)) в генетично перетворених дріжджах модифікується таким чином, що її активність і/або експресія підвищені в порівнянні з відповідними нативними дріжджами.

Згідно з певними переважними варіантами реалізації, зазначені генетично перетворені дріжджі модифікуються таким чином, що зазначені активність і/або експресія мевалонаткінази (наприклад, мевалонаткінази У. Ігроїуйса (сепоЇемиге5 МАГІОВ160389)) в зазначених генетично перетворених дріжджах підвищені щонайменше 1,2-кратно; або 1,5-кратно; або 2-кратно; або 3- кратно; або 4-кратно; або 5-кратно; або 10-кратно; або 15-кратно; або 20-кратно; або 50-кратно; або 100-кратно; або 1000-кратно; або 10000-кратно; або 100000-кратно; або 1000000-кратно в порівнянні з активністю і/або експресією у відповідних нативних дріжджах.

І0ОЗ31) Згідно з певними переважними варіантами реалізації фермент, що модифікується в генетично перетворених дріжджах згідно з даним винаходом являє собою гліцеринкіназу бо (наприклад, гліцеринкіназу М. Ііроїуйїса (СепоІемиге5 МАГОРО04849)). Згідно з деякими переважними варіантами реалізації гліцеринкіназа (наприклад, гліцеринкіназа У. Іроїуїса (сепоЇїемиге5 МАГОРО04849)) в генетично перетворених дріжджах модифікована таким чином, що її активність і/або експресія підвищуються в порівнянні з відповідними нативними дріжджами. Згідно з певними переважними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі модифіковані таким чином, що зазначені активність і/або експресія мевалонаткінази гліцеринкінази (наприклад, гліцеринкінази М. ІПроїуйса (сепоїемиге5

МАГІОРО0О4849)) в зазначених генетично перетворених дріжджах підвищуєть(ють)ся щонайменше 1,2-кратно; або 1,5-кратно; або 2-кратно; або 3-кратно; або 4-кратно; або 5-кратно; або 10-кратно; або 15-кратно; або 20-кратно; або 50-кратно; або 100-кратно; або 1000-кратно; або 10000-кратно; або 100000-кратно; або 1000000-кратно в порівнянні з активністю і/або експресією у відповідних нативних дріжджів.

І0032| Згідно з певними варіантами реалізації композицій і способів, запропонованих у даному винаході, зазначений фермент, який модифікується в генетично перетворених дріжджах або не перетворених генетично дріжджах, являє собою 5-амінолевулінатсинтазу (наприклад, таку, що кодується геном Засспаготусе5 сегемізіае НЕМІ1). Переважно, її активність і/або експресія підвищенайї) в порівнянні з відповідними нативними дріжджами.

ІЇ0О33| Згідно з певними переважними варіантами реалізації описаних вище аспектів, зазначені генетично перетворені дріжджі являють собою генетично перетворені дріжджі; згідно з іншими переважними варіантами реалізації зазначені генетично перетворені дріжджі являють собою трансгенні дріжджі. Інші варіанти реалізації представлені дріжджами, які містять і трансгенні, і генетичні перебудови.

Ї0034| Згідно з певними аспектами і варіантами реалізації, у винаході запропоновані композиції що включають дріжджі (наприклад, генетично перетворені дріжджі, наприклад, описані в даному документі, або не перетворені генетично дріжджі), такі, де щонайменше 10 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 20 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 25 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 28 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 30 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 32 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 35 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 37 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 38 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 40 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 42 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 45 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 47 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 50 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 52 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 55 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 57 95 від загального вмісту ліпідів представлені скваленом; або щонайменше 60 95 або більше від загального вмісту ліпідів представлені скваленом.

ІЇ0035| Згідно з подальшими варіантами реалізації різних описаних в даному документі аспектів, в даному винаході запропоновані ізопреноїди, такі як сквален, виділені з будь-яких вище- або нижчеописаних генетично перетворених, трансгенних генетично перетворених або не перетворених генетично дріжджів.

І0036| Вираз "генетично перетворені дріжджі" або "генетично модифіковані дріжджі" в контексті цього документа належить до дріжджів, що містять одну або більше генетичну модифікацію, наприклад, трансгени і/або модифіковані ферменти, які містять одну або більше спрямовану мутацію. Такі спрямовані мутації можуть призводити до того, що активність модифікованого ферменту буде відрізнятися від активності нативного ферменту. Такі відмінності можуть включати відмінності в субстратній специфічності або рівнях активності. У контексті цього документа термін "трансгенні дріжджі" означає один із типів "генетично перетворених дріжджів".

І0037| Термін "нативні дріжджі" в контексті цього документа належить до дріжджів, не перетворених генетично (тобто не трансгенних і не модифікованих генетично). Нативні дріжджі включають дріжджі дикого типу, а також дріжджі, що пройшли селекцію на певні властивості.

І00З8)| Вираз "трансгенні дріжджі" відноситься до дріжджів, що містять ген з інших дріжджів або з недріжджових видів. Такий ген може бути позначений як "трансген".

І0039| У контексті даного документа термін "ген-мішень" відноситься до гену, що кодує фермент, який модифікується. 00401) Вираз "жирові дріжджі" відноситься до дріжджів, які містять щонайменше приблизно бо 20 9о ліпідів у сухій клітинній масі (СКМ), яка екстрагується з організму. Здатність до акумуляції ліпідів у кількості щонайменше приблизно 20 95 від СКМ не є властивістю якогось певного роду; рівні ліпідів, що перевищують приблизно 20 95 СКМ, виявлені у І іротусез Ірогїег, Г. «агкеуї, Ї..

Івігазроги5, Сапаїйда Іроїуїїса, С. аідаепвзіає, С. рагаїїроїуїїса, С. сигмайа, Стуріососсив аїрідив,

Стуріососсив Іашйгепії, Сеойміспит сапаїдит, Аодоїогша дгатіпив, Тгіспозрогоп риїміапв,

КПподозрогідіит (огиоіде5, КПподоїогша дішіпи5, Кподоїогціа дгасіїй5 і Маггом/ліа Іроїуйса. Див, наприклад, патент США 4032405 Таїзиті, єї а. і Кацгау, Місгобіа! Ііріав, Мої. 1 (1998). 00411 Термін "приблизно" в контексті даного документа означає в кількісному вираженні плюс або мінус 10 95. Наприклад, "приблизно З 95" охоплює діапазон 2,7-3,3 95, а "приблизно 96" охоплює діапазон 9-11 95. 10 (00421 Якщо не вказано інше, будь-які зазначені в цьому документі процентні частки являють собою масові процентні частки. 0043) Інші особливості та переваги винаходу будуть очевидними з наведеного нижче опису переважних варіантів реалізації та з формули винаходу.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

(0044) Типи дріжджів 0045) Композиції та способи згідно з описами в даному документі можуть бути основані на будь-якому з численних видів або штамів дріжджів. Згідно з певними варіантами реалізації зазначені дріжджі являють собою жирові дріжджі. Наприклад, зазначені дріжджі можуть являти собою Стгуріососси5 сигмайш5 (наприклад, АТСС 20508), Маїтом/іа Ігроїуїса (наприклад, АТОС 20688 або АТСС 90811), КПподоїогиїа дішіпи5 (наприклад, АТСС 10788 або АТСС 204091) і

КПпогозрогідішт огиоіде5. Автори винаходу виявили, що, в порівнянні з деякими іншими дріжджами (наприклад, Маїгтом/іа Іроїуїйса), Стгуріососси5 сигмайш5 і Кподоїогиціа дішіпіб здатні формувати культури з дуже високою щільністю клітин на найрізноманітніших субстратах і виробляти значний загальний об'єм ліпідів у різних умовах культивування. Відповідно, згідно з певними варіантамии реалізації, застосування Стуріососси5 сигмайи5 і Кподоїогша дішіпів може бути особливо ефективним в композиціях і способах згідно з описаними в даному документі.

Існує безліч добре розроблених і специфічних для Маггом/а Ішроїуїса генетичних інструментів (наприклад, протоколи трансформації, селективні маркери); відповідно, згідно з деякими варіантами реалізації, застосування Маїгтгом/іа Іроїуйса може бути особливо ефективним у композиціях і способах згідно з описаними в даному документі. Згідно з певними варіантами реалізації композицій і способів, описаних у цьому документі, зазначені дріжджі (перетворені генетично або не перетворені генетично) можуть являти собою штам Маїгтом/а Іроїуїса, такий як

АТСС 20688, АТС 90811, АТОС 90904, АТОС 90812, АТОС МУА-2613 або Уеавзіет ро!/д.

І0046)| Олігополімери нуклеїнових основ для генної репарації

І0047| Даний винахід може бути здійснений із застосуванням "олігополімерів нуклеїнових основ для генної репарації", які мають конформації і хімічні властивості згідно з наведеним нижче докладним описом. Зазначені "олігополімери нуклеїнових основ для генної репарації", запропоновані у даному винаході, включають змішані дуплексні олігонуклеотиди; молекули, що не містять нуклеотиди; однониткові олігодезоксинуклеотиди і інші молекули для генної репарації, описані в згаданих нижче патентах і патентних публікаціях. Зазначені "олігополімери нуклеїнових основ для генної репарації", запропоновані у даному винаході, також описувалися в опублікованих наукових і патентних джерелах під іншими назвами, включаючи "рекомбіногенні олігонуклеотиди", "РНК/ДНК химерні олігонуклеотиди", "химерні олігонуклеотиди", "змішані дуплексні олігонуклеотиди (МООМ) "; "РНК-ДНК-олігонуклеотиди (КОО)"; "олігонуклеотиди з направленою дією на ген(и)"; "генопласти", "однониткові модифіковані олігонуклеотиди", "однониткові олігодезоксинуклеотидні мутаційні вектори", "дуплексні мутаційні вектори"; і "гетеродуплексні мутаційні вектори". 0048) Олігополімери нуклеїнових основ, які мають конформації і хімічні властивості, описані

Ктіес в патенті США 5565350 (Ктіес І) і патенті США 5731181 (Ктіес І), включених у цей документ за допомогою посилання, підходять для застосування як "олігополімери нуклеїнових основ для генної репарації" запропоновані в даному винаході. Зазначені олігополімери нуклеїнових основ для генної репарації за Ктіес І і/або Ктіес ІІ містять дві комплементарні нитки, одна з яких містить щонайменше один сегмент нуклеотидів РНК-типу ("РНК-сегмент"), спарений із нуклеотидами ДНК-типу іншої нитки. (0049) У Ктієс ІІ зазначено, що замість нуклеотидів можуть застосовуватися ненуклеотидні з'єднання, які містять пуринові і піримідинові основи. Додаткові молекули для генної репарації, які можуть бути використані в даному винаході, описані в патентах США 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 та 6010907; в міжнародному патенті

РСТ/О5О0/23457; і в міжнародних патентних публікаціях М/О 98/49350; УМО 99/07865;. МО 60 99/58723; УМО 99/58702 та УМО 99/40789, кожен із яких включений до даної заявки в усій повноті.

І0О50) Згідно одному з варіантів реалізації зазначений олігополімер нуклеїнових основ для генної репарації являє собою змішаний дуплексний олігонуклеотид, при цьому нуклеотиди РНК- типу зазначеного змішаного дуплексного олігонуклеотиду стійкі до РНКази в результаті проведеного заміщення функціональною групою, яка містить 2'-гідроксилу фтор-, хлор- чи бром, або введенням замісника з 2'-О. Відповідні замісники включають замісники, запропоновані в

Ктіес ІІ. Альтернативні замісники включають замісники, запропоновані в патенті США 5334711 (Зргоа)), та замісники, запропоновані в патентних публікаціях ЕР 629 387 і ЕР 679 657 (в сукупності, заявках Магпіп (Магпіп Арріїсайоп5)), які включені в даний документ за допомогою посилання. В контексті даного документа 2"-фтор, хлор- чи бром-похідне рибонуклеотиду або рибонуклеотид з заміщеними замісниками згідно з описами в Магпіп Арріїсайоп5 або Зргоаї 2'-

ОН називається "2'і-заміщеним рибонуклеотидом". У контексті даного документа термін "нуклеотид РНК-типу" означає 2'"-гідроксил- чи 2'-заміщений нуклеотид, який з'єднаний з іншими нуклеотидами змішаного дуплексного олігонуклеотиду незаміщеним фосфодиефіром або за допомогою будь-якого зі штучних зв'язків, запропонованих у Ктіес І або Ктіес ІІ. У контексті даного документа термін "нуклеотид дезоксирибо-типу" відноситься до нуклеотиду, що містить 2-Н, який може бути зв'язаний з іншими нуклеотидами олігополімеру нуклеїнових основ для генної репарації незаміщеним фосфодиефірним зв'язком або будь-яким зі штучних зв'язків, запропонованих у Ктієс І або Ктієс ІІ.

ІЇ0О51| Згідно окремому варіанту реалізації даного винаходу, зазначений олігополімер нуклеїнових основ для генної репарації являє собою змішаний дуплексний олігонуклеотид, який з'єднаний виключно незаміщеними фосфодиефірними зв'язками. Згідно з альтернативними варіантами реалізації зв'язування забезпечується заміщеними фосфодиефірами, похідними фосфодиефірів і не основаними на фосфорі зв'язками згідно з запропонованими в Ктіес ІІ.

Згідно зі ще одним варіантом реалізації кожен нуклеотид РНК-типу в змішаному дуплексному олігонуклеотиді являє собою 2'-заміщений нуклеотид. Конкретні переважні варіанти реалізації 2"-заміщених рибонуклеотидів представлені 2"-фтор, 2'-метокси, 2--пропілокси, 2'-алілокси, 2'- гідроксилетилокси, 2'--метоксиетилокси, 2'--фторпропілокси і 2'-трифторпропілокси-заміщеними рибонуклеотидами. Більш переважні варіанти реалізації 2'-заміщених рибонуклеотидів представлені 2"-фтор, 2'-метокси, 2'--метоксиетилокси і 2'-алілокси-заміщеними нуклеотидами.

Зо Згідно з іншим варіантом реалізації зазначений змішаний дуплексний олігонуклеотид з'єднаний незаміщеними фосфодіефірними зв'язками. 0052) Незважаючи на те, що змішані дуплексні олігонуклеотиди, що містять тільки один тип 2"-заміщеного нуклеотиду РНК-типу, зручніше синтезувати, способи, запропоновані у даному винаході, можуть здійснюватися із застосуванням змішаних дуплексних олігонуклеотидів, що містять два або більше типи нуклеотидів РНК-типу. На функціонування РНК-сегмента не обов'язково впливає переривання в результаті вставки дезоксинуклеотиду між двома тринуклеотидами РНК-типу відповідно, термін "РНК-сегмент" включає і "розщеплений РНК- сегмент". Нерозщеплений РНК-сегмент називається послідовним РНК-сегментом. Згідно з альтернативним варіантом реалізації РНК-сегмент може містити стійкі до РНКази і 2-ОН- незаміщені нуклеотиди, що чергуються. Зазначені змішані дуплексні олігонуклеотиди переважно складаються менше, ніж зі 100 нуклеотидів, і більш переважно менше, ніж з 85 нуклеотидів, але більше, ніж з 50 нуклеотидів. Зазначені перша і друга нитки спарені за Уотсоном-Кріком. Згідно з одним варіантом реалізації нитки зазначеного змішаного дуплексного олігонуклеотиду ковалентно пов'язані лінкером, таким як однонитковий гекса-, пента- або тетрануклеотид, таким чином, що зазначені перша і друга нитки являють собою сегменти одиночного олігонуклеотидного ланцюга, що має одиночний 3'- і одиночний 5'-кінці. 3"- і 5'-кінці можуть бути захищені додаванням "шпилькового ковпачка" в цьому випадку 3- і 5-кінцеві нуклеотиди спарені за Уотсоном-Кріком із сусідніми нуклеотидами. Другий шпильковий ковпачок може додатково бути розміщений на стику між зазначеними першою і другою нитками на відстані від 3- і 5-кінців таким чином, щоб стабілізувати спарювання за Уотсоном-Кріком між зазначеними першою і другою нитками. 0053) Зазначені перша і друга нитки містять дві ділянки, гомологічні двом фрагментам зазначеного гена-мішені, тобто мають ту ж послідовність, що і вказаний ген-мішень. Гомологічна ділянка містить нуклеотиди РНК-сегмента і може містити один або більше нуклеотид ДНК-типу з'єднувального ДНК-сегмента, а також може містити нуклеотиди ДНК-типу, що не входять до складу проміжного ДНК-сегмента. Дві ділянки, що мають гомологію, розділені ділянкою (і межують із нею), яка має відмінну від послідовності зазначеного гена-мішені послідовність і називається "гетерологічною областю". Зазначена гетерологічна область може містити один, два або три неспівпадаючих нуклеотиди. Зазначені неспівпадаючі нуклеотиди можуть бути 60 розташовані безперервно або ж можуть бути розділені одним або двома нуклеотидами,

гомологічними гену-мішені. Як варіант, зазначена гетерологічна область може також містити вставку з одного, двох, трьох або з п'яти чи менше нуклеотидів. Як варіант, послідовність зазначеного змішаного дуплексного олігонуклеотиду може відрізнятися від послідовності зазначеного гена-мішені тільки делецією одного, двох, трьох або п'яти чи менше нуклеотидів у змішаному дуплексному олігонуклеотиді. У цьому випадку вважається, що довжина і розташування гетерологічної області відповідає довжині делеції, незважаючи на те, що нуклеотиди зазначеного змішаного дуплексного олігонуклеотиду відсутні в гетерологічній області. Відстань між фрагментами зазначеного гена-мішені, які комплементарні двом гомологічним ділянкам, ідентична довжині гетерологічної області в тому випадку, коли має місце заміщення або заміщення. Якщо зазначена гетерологічна область містить вставку, зазначені гомологічні ділянки в результаті розташовані в змішаному дуплексному олігонуклеотиді на більшій відстані, ніж комплементарні їм гомологічні фрагменти зазначеного гена, а у випадку, коли зазначена гетерологічна область кодує делецію, вірним є обернене.

І0054| Кожен із РНК-сегментів зазначених змішаних дуплексних олігонуклеотидів являє собою частину гомологічної ділянки, тобто ділянку, що має послідовність, ідентичну фрагменту вказаного гена-мішені, чиї сегменти сумісно переважно містять щонайменше 13 нуклеотидів

РНК-типу, переважно - від 16 до 25 нуклеотидів РНК-типу, ще більш переважно - 18-22 нуклеотидів РЕНК-типу і найбільш переважно - 20 нуклеотидів. Згідно з одним варіантом реалізації РНК-сегменти, що мають гомологію ділянок, розділені проміжним ДНК-сегментом, і кожен із них межує з ним, тобто вони ним "з'єднані". Згідно одному з варіантів реалізації кожен нуклеотид зазначеної гетерологічної області являє собою нуклеотид проміжного ДНК-сегменту.

Проміжний сегмент ДНК, який містить вказану гетерологічну область змішаного дуплексного олігонуклеотиду, називається "мутаторним сегментом".

ІЇ0055| Згідно іншому варіанту реалізації даного винаходу, зазначений олігополімер нуклеїнових основ для генної репарації являє собою однонитковий олігодезоксинуклеотидний мутаційний вектор (З5БОМУМ), описаний у заявці на міжнародний патент РСТ/О500/23457, патентах США 6271360, 6479292 та 7060500, включених у дану заявку в усій повноті за допомогою посилання. Зазначена послідовність «5ОМУМ заснована на тих же принципах, що і мутаційні вектори, описані в патентах США 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972;

Зо 5780296; 5945339; 6004804 та 6010907 і в міжнародних публікаціях УМО 98/49350; УМО 99/07865;

МО 99/58723; УМО 99/58702 та УМО 99/40789. Зазначена послідовність 550ММ містить дві ділянки, які гомологічні цільовій послідовності, розділені ділянкою, яка містить необхідну генну модифікацію, називану мутаторною ділянкою. Послідовність зазначеної мутаторної ділянки може бути рівною за довжиною послідовності, яка розділяє гомологічні ділянки цільової послідовності, але відрізнятися від неї за складом. Така мутаторна ділянка може призводити до заміни. Як варіант, гомологічні ділянки З5ОММ можуть бути послідовно розташовані одна за одною, в той час як ділянки гена-мішені, які мають ту ж послідовність, розділені одним, двома або більше нуклеотидами. Такий 55ОММ призводить до видалення з гена-мішені нуклеотидів, відсутніх у зазначеному 55ОМУ. Нарешті, ділянки послідовності зазначеного гена-мішені, ідентичні гомологічним ділянкам, можуть межувати в гені-мішені, але бути розділені одним, двома або більше нуклеотидами в послідовності Х5ОМУ. Такий З5БОММ призводить до вставки в послідовність гена-мішені.

І0056| Нуклеотиди 55ОММ являють собою дезоксирибонуклеотиди, зв'язані за допомогою немодифікованих фосфодиефірних зв'язків, за винятком того, що 3'-кінцевий і/або 5'-кінцевий міжнуклеотидний лінкер або, як варіант, два 3'-кінцеві і/або 5'-кінцеві міжнуклеотидні лінкери можуть являти собою фосфотіоат або фосфоамідат. У контексті даного документа міжнуклеотидний лінкер являє собою лінкер, що зв'язує нуклеотиди 550ММ і не включає зв'язки між 3'-кінцневим нуклеотидом або 5'-кінцевим нуклеотидом і блокуючим замісником, див. вище.

Згідно з окремим варіантом реалізації довжина 55ОММ становить від 21 до 55 дезоксинуклеотидів, загальна довжина ділянок, що мають гомологію, складає, відповідно, щонайменше 20 дезоксинуклеотидів, і довжини щонайменше двох ділянок, що мають гомологію, повинні становити щонайменше 8 дезоксинуклеотидів.

Ї0057| 5ББОММ може бути сконструйований як комплементарний для нитки зазначеного гена- мішені, яка кодує або не кодує. Якщо бажана мутація являє собою заміну однієї основи, переважно, щоб обидва мутаторних нуклеотиди являли собою піримідин. Для досягнення достатньої виразності бажаного функціонального результату переважно, щоб і мутаторний нуклеотид, і цільової нуклеотид в комплементарній нитці являли собою піримідин. Зокрема, переважними є 55ОМУМ, що кодують трансверсії, тобто С або Т мутаторний нуклеотид помилково спарений, відповідно, з С або Т нуклеотидом в комплементарній нитці.

0058) На додаток до олігодезоксинуклеотиду 55ОММ може містити 5'-блокуючий замісник, приєднаний до 5'-кінцевих вуглецевих атомів за допомогою лінкера. Хімія вказаного лінкера не суттєва, важлива тільки його довжина, яка переважно має становити щонайменше 6 атомів і дозволяти лінкеру бути гнучким. Можуть застосовуватися різні нетоксичні замісники, такі як біотин, холестерин або інші стероїди або неінтеркалюючий катіонний флуоресцентний барвник.

Зокрема, переважними як реагенти для отримання 55ОММ є реагенти, що продаються під торговими найменуваннями СуЗ "м 'ї Суб "М від Сієп Кезеагсі, 5іегіїпуд Ма., які являють собою захищені фосфорамідити, при включенні в олігонуклеотиди дають 3,3,33'-тетраметил М,М'- ізопропіл заміщені індомонокарбоціанінові та індодикарбоціанінові барвники відповідно. СуЗ є найбільш переважним. Якщо зазначений індокарбоціанін є М-оксиалкіл-заміщеним, він може бути зручно пов'язаний із 5'-кінцем олігодезоксинуклеотиду через фосфодиефір із 5'-кінцевим фосфатом. Хімія лінкера барвника, який з'єднує барвник і олігодезоксинуклеотид, не суттєва і він вибирається, виходячи зі зручності синтезу. Якщо застосовується, згідно з вказівками, комерційно доступний СуЗ фосфорамідіт, 5'-модифікація, яка отримується в результаті, складається з блокуючого замісника та лінкера, які разом складають М-гідроксіпропіл-, М'- 3,3,3,3-тетраметиліндомонокарбоціанін. 0059) Згідно одному з переважних варіантів реалізації зазначений індокарбоціаніновий барвник є тетразаміщеним за З і 3" положеннями індольних кілець. Без обмеження теорією, при таких заміщеннях зазначений барвник не є інтеркалюючим барвником. Тип замісників у цих положеннях не є критично важливим. 5БОММ може додатково містити 3'-блокуючий замісник.

Хімія вказаного 3'-блокуючого замісника також не є критично важливою.

І0О60) Гетерологічна експресія

І00О61) Згідно з певними варіантами реалізації гетерологічна експресія застосовується для експресії чужорідних генів або додаткових копій ендогенних генів у дріжджах (наприклад,

Уагтоміа Іроїуїса). Гетерологічна експресія в дріжджах може здійснюватися із застосуванням способів, загальновідомих у даній області техніки. Експресія чужорідних генів або додаткових копій ендогенних генів у дріжджах із застосуванням гетерологічної експресії може включати застосування вектора, який включає (а) промоторні послідовності для ініціації транскрипції, (Б) термінаторні послідовності для термінації транскрипції і (с) маркер, що селектується.

Зо Гетерологічна експресія та експресійні вектори можуть відповідати описаним, наприклад, у оглядовій статті Мааак, С, Саїйагаіп, С, ВесКегісп, УМ., 2004 Неїегоіодоив Ргоїєїп Ехргезвіоп апа БЗесгейоп іп Ше Моп-Сопмепіпа! Меавзі Маггоула Іроїуїйса ("Гетерологічна експресія і секреція білків в неконвенційних дріжджах МУаїтоу/а Іроїуїса "у: доигпаї ої ВіоїесппоЇоду 109:63- 81. Згідно з певними варіантами реалізації описаних тут композицій і способів, вказаний вектор являє собою рм1ЕХІ (Жеавзіегп) Необмежений список відповідних генів-маркерів, що селектуються, включає пигаз, Іу55, Ігрі, Іец2, адеї, прі Е.соїї, що кодує стійкість до гігроміціну, і 5ИС2 з Засспаготусез сегемізіае. Необмежений список відповідних промоторів включає рі ЄО2, рРХРК2, рРОХ2, рРОТІ, рІСІЇ, рОзЗР, рМТР, ртТЕЕ і рКРБЗ7. Згідно з певними варіантами реалізації зазначений промотор є промотором пра, який являє собою сильний конститутивний гібридний промотор (патент США 6083717 від 4 липня 2000 р.). Необмежений список відповідних термінаторних послідовностей включає ХРКАЇ, ПРІ ї РНОБІ.

І0062| Згідно з певними варіантами реалізації один або більше, ніж один, ген Магтом/а

Іроїуїса ІМ51 (СепоІїемиге5 МАГІОВ154449), ТКРІ (Сепоїємигез МАГІОВО76679) і АОЕ1 (СсепоІїемигез МАГІОЕЗ330339) застосовують як маркери, що селектуються. Згідно з певними варіантами реалізації один або більше ген Маїтоу/ла Ійроїуїйса ОКАЗ (СепВапк: 0О40564.1) або

ГЕЦ2 (СепоЇІемиге5 МАГІОСО0407) застосовують як маркери, що селектуються. 0063) Згідно з певними варіантами реалізації інтеграційний експресійний вектор включає одну або більш промоторну і/або термінаторну послідовність, обрану з групи, що складається з генів гліколітичного шляху Матоу/ла Ііроїуїіса, генів утилізації алканів або гліцерину, ХРК2, АССІ1,

НМОЇ, ЕКС і ЕКО 9. (0064) Згідно з певними варіантами реалізації здійснюється надекспрессія однієї або обох субодиниць АТФ-цитрат-ліази Маггом/іа Іроїуйса (сепоЇемиге5 МАГІОЮ244319 ії МАГІОЕ347939). у

Уатоміа Іроїуїїса. (0065) Модифіковані ферменти

Ї0066| Модифікований або мутантний фермент згідно з цим описом може бути модифікований або мутований заміною пар нуклеотидів, вставками, заміщеннями і т. п.

Ї0О67| Гени, що кодують ферменти, залучені до шляху біосинтезу жирних кислот і шляху біосинтезу ізопреноїду є переважними мішенями для мутацій. Згідно деяким варіантам реалізації ген-мішень кодує ацил-КоА-карбоксилазу. Згідно іншим варіантам реалізації ген- бо мішень кодує ГМГ-КоА-редуктазу. Згідно іншим варіантам реалізації ген-мішень кодує скваленепоксидазу. Згідно іншим варіантам реалізації ген-мішень кодує скваленсинтазу. Згідно певним варіантам реалізації ген-мішень кодує АТФ-цитрат-ліазу. Мутації можуть бути спрямовані на зниження чи усунення активності ферменту, посилення активності ферменту або зміну активності ферменту (наприклад, зміну субстратної селективності). 0068) У жирових дріжджах дикого типу ацетил-КоА глибоко залучений у біосинтез жирних кислот за допомогою ацетил-КоА-карбоксилази (АССази). Таким чином, для того, щоб збільшити кількість ацетил-КоА, доступного для синтезу сквалену, бажано знизити експресію фермента або специфічну активність АССази. Типовою генною послідовністю АССази є ген

АССІ1 Ббасспаготусе5 сегемізіае, що відповідає номеру доступу 271631. Відповідно, згідно певним варіантам реалізації, знижена внутрішньоклітинна активність АССази, ферменту вузлового етапу між біосинтезом мевалонату і біосинтезом тригліцеридів буде знижувати кількість ацетил-КоА, задіяного у синтезі жирів, тим самим збільшуючи його доступність для ізопренового шляху.

І0069| ГМГ-КоА-редуктазна активність лімітує швидкість біосинтезу ізопрену. Типові генні послідовності ГМГ-КоА-редуктази включають гени НМО1 ії НМО1 Засспаготусе5 сегемівіає, наведені в номерах доступу МС 001145 і МС 001144 відповідно. Таким чином, згідно визначеним варіантам реалізації ГМГ-КоА-редуктазна активність буде збільшуватися в результаті модифікації гена ГМГР, що призводить до стимуляції транскрипції, стабілізації білкового продукту і/або зниження інгібування продукту за типом зворотного зв'язку.

І0079| За допомогою зниження АСсСазної активності і/або збільшення ГМГ-КоА-редуктазної активності в дріжджах можна створити базовий організм для синтезу ізопреноїдів, здатного синтезувати ряд споріднених ізопреноїдних продуктів за допомогою управління ферментами, що лежать нижче, зазначеного сигнального шляху.

І0071| Сквален-епоксидаза каталізує перший етап, задіяний у біосинтезі стеролу. Типова генна послідовність скваленепоксидази представлена геном ЕКОС1 Засспаготусез сегемівіає, який відповідає номеру доступу МС 001139. Відповідно, згідно певним варіантам реалізації скваленепоксидазна активність, чутливість до інгібіторів і/або експресія будуть ослаблені в дріжджах, наприклад, каталітично значущими залишками в амінокислотній послідовності ферменту.

Зо І0072| Скваленсинтаза каталізує синтез сквалену конденсацією двох с15 попередників ізопрену (фарнезилдифосфат (ФДФ)). Типовою генною послідовністю скваленсинтази є ген

ЕКСО9 Засспаготусез сегемізіає, який відповідає номеру доступу МС 001140. Відповідно, згідно певним варіантам реалізації скваленсинтазна активність і/або експресія в дріжджах буде(уть) збільшенайії).

І0073| АТФ-цитрат-ліаза (ЕС 4.1.3.8) каталітично розщеплює цитрат з утворенням ацетил-

КоА і оксалоацетату. Ацетил КоА може використовуватися АССазою для біосинтезу жирних кислот або ацетил-КоА-ацетилтрансферазою для синтезу ізопренів та їх похідних, таких як сквален.

І0074| Мевалонаткіназа являє собою перший після ГМГ-КоА-редуктази фермент мевалонатного шляху і каталізує перетворення мевалонату в мевалонат-5-фосфат. Відповідно, згідно певним варіантам реалізації, рівні мевалонаткіназної активності і/або експресії будуть збільшуватися в дріжджах, наприклад, за допомогою зміни каталітично значущих залишків в амінокислотній послідовності ферменту або збільшення дози гена чи кількості транскриптів.

І0075)| Гліцеринкіназа каталізує перенесення фосфату від АТФ до гліцерину з утворенням гліцеринфосфату. Відповідно, згідно певним варіантам реалізації, рівні гліцеринкіназної активності і/або експресії збільшують у дріжджах, наприклад, за допомогою заміни каталітично важливих залишків у амінокислотній послідовності ферменту або збільшення дози гена чи рівнів його транскрипції.

І0076)| Результатом метаболічних змін згідно з певними варіантами реалізації є передача вуглецю від ацетил-КоА до сквалену і ослаблення основних конкурентних шляхів для вказаного потоку вуглецю, що призводить до значного збільшення кількості продукованого сквалену.

І0077| Доставка олігополімерів нуклеїнових основ для генної репарації в дріжджові клітини

І0078| Для трансформації дріжджової клітини за допомогою олігополімера нуклеїнових основ для генної репарації згідно з запропонованим у даному винаході способом може застосовуватися будь-який загальновідомий метод. Типові способи включають застосування електропорації, ГіОАс, біолістики, сферопластів і/або Адгобрасіегішт (див., наприклад,

Месіеїапа, СМ., Спапа, УС, апа Киоп-Спипо, КУ (2005) Рипда! Сепеїйсв апа Віоіоду 42:904-913).

І0079| Згідно певним варіантам реалізації олігополімер нуклегтових основ для генної репарації вводять у дріжджову клітину із застосуванням електропорації. Згідно з деякими бо варіантами реалізації олігополімер нуклеїнових основ для генної репарації вводять у дріжджову клітину, хімічно оброблену ПЕГ (мол. маса 3350 або 4000) і/або ацетатом літію із застосуванням електропорації. Згідно певним варіантам реалізації олігополімер нуклеїнових основ для генної репарації вводять у дріжджову клітину із застосуванням ПЕГ (мол. м. 3350 або 4000) і/або ацетату літію.

І0080| Спеціальні умови для застосування мікроносіїв згідно способам, запропонованим в даному винаході, описані в міжнародній публікації УМО 99/07865, 0О509/129298. Наприклад, охолоджені до температури льоду мікроносії (60 мг/мл), змішаний дуплексний олігонуклеотид (60 мг/мл), 2,5 М Сасі2 та 0,1 М спермідину змішують у зазначеному порядку; суміш обережно перемішують, наприклад, на вортексі, протягом 10 хвилин і залишають при кімнатній температурі на 10 хвилин, після чого мікроносії розводять у 5 частинах етанолу, центрифугують і ресуспендують у 100 95 етанолі. Типові концентрації компонентів в адгезивному розчині становлять 8-10 мкг/мкл для мікроносіїв, 14-17 мкг/мкл для змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,1-1,4 М для Сасі?2 ї 18-22 мМ для спермідину. Згідно одному з прикладів, концентрації зазначених компонентів складають: 8 мкг/мкл для мікроносіїв, 16,5 мкг/мкл для змішаного дуплексного олігонуклеотиду, 1,3 М для Сасіг і 21 мМ для спермідину.

І00О81| Згідно деяким варіантам реалізації олігополімери нуклеїнових основ для генної репарації можуть бути доставлені у зазначену дріжджову клітину із застосуванням електропорації, відповідно до загальновідомих для фахівців у даній області техніки методик (див., наприклад ВесКег, ОМ, апа Сипцагепіє, Її. Нідпй Ейісіепсу Тгапетогтайоп ої Уеазі ру

ЕІесігорогайоп ("Високоефективна трансформація дріжджів за допомогою електропорації").

Меїтоавз іп Епгутоіоду, мої. 194, взесійоп (12) рр. 182-186. 1991. ЕІбвемієї Асадетіс Ргезв, І опаоп. (00821 Відбір дріжджів із потрібним модифікованим ферментом

І0083| Дріжджі, що експресують зазначений модифікований фермент, можуть бути ідентифіковані за допомогою одного з декількох способів. Згідно одному зі способів використовується стратегія спільної конверсії із застосуванням олігополімерів нуклеїнових основ для генної репарації (ЗКОМ) для спрямованої взаємодії як при конверсії, що селектується (тобто з маркером), так і при конверсії, що не селектується (наприклад, потрібного гена-мішені) в ході одного і того ж експерименту. Таким чином, клітини, в які не були вбудовані ОКОМ, або які не здатні здійснювати перебудови, обумовлені СОКОМ, будуть усунені. Оскільки доставка

СКОМ, націлених на незв'язані гени, імовірно не буде селективною, можна очікувати, що колонія, яка успішно пройшла відбір на перетворення, також буде з певною частотою перетворена за одним із інших генів-мішеней. Конверсійні події можуть бути проаналізовані шляхом аналізу одиночного нуклеотидного поліморфізму (ЗМР). 0084) Таким чином, геномну ДНК виділяють із дріжджів і проводять скринінг індивідуальних зразків ДНК із застосуванням ПЛР-аналізу, наприклад, алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції (АС-ПЛР), для кожної мішені. Для незалежного підтвердження зазначеної зміни послідовності у позитивних дріжджів відповідна ділянка зазначеного гена-мішені може бути ампліфікована ПЛР; отриманий амплікон або секвенується безпосередньо, або клонується, і множинні вставки секвенують. 0085) Як варіант, вбудовування мутації в потрібний ген може бути визначене за допомогою однієї з молекулярно-біологічних технік, розроблених для визначення мутацій одиночних нуклеотидів у виділеній нуклеїновій кислоті (наприклад, технік ампліфікації, таких як ПЛР- ампліфікація і аналіз методом подовження праймеру для одиночних нуклеотидів). Більш об'ємні мутації можуть бути визначені із застосуванням ампліфікації та секвенування ділянки гена- мішені, в яку має бути введена мутація. (0086) Як варіант, дріжджі або дріжджові клітини, що містять модифікований фермент, можуть бути ідентифіковані, наприклад, за допомогою аналізу композиції ізопреноїдів, яка продукується зазначеними дріжджами. Цей спосіб має на увазі культивування зазначених дріжджів, виділення олій та їхній аналіз із застосуванням відомих у даній області техніки способів (наприклад, газової хроматографії або ВЕРХ).

ПРИКЛАДИ

І0087| Приклад 1. Системи трансформації Сгуріососси5 сигмайиз5 і Кподоїогиїа дішіпіб (0088) Для створення системи трансформації на основі Сгуріососси5 сигмайи5 (АТСС штам 20508) і КПподоїогша дішіпіз (АТСС штами 10788 і 204091), експресійну касету КАММХ (промотор-ген-термінатор), яка дає стійкість до канаміцину у 5. сегемізіае, застосовують як селективний маркер для перетворення штамів, чутливих до канаміцину, у стійкі до канаміцину (див. наприклад, Вашцаіп, А., еї аїІ. (1993) Мисієїс Асідй5 Кезеагсп (21) 3329-3330). Зазначені штами трансформують тільки зазначеною експресійною касетою, а також КАММХ, легованою в рестрикційні фрагменти плазміди, описаною для К. дішіпи5 (див., наприклад, ОіокКе, УК, апа 60 аск, ВА (2006) Агйісап доштаї ої Віоїтесппоіоду 5 (4):327-332), яка містить ДНК-точки початку реплікації. ДНК вводять у С. сигмайи5 і К. дішіпіз із застосуванням електропорації, ГІОАс, біолістики, сферопластів і/або Адгорасієгічт (МеоСіейапа, СМ., Спапд, С, апа Кмиоп-Спипа, КУ (2005) Рипда! Сепеїїсв апа Віоіоду 42:904-913). (0089) Приклад 2. Маркери, що селектуються

І0090| Для отримання урацил-аутотрофних мутантів Стуріососси5 сигмай5 і Кпоаоїогиїа дішіпіє клітини вирощували на мінімальному середовищі, яке містить антиметаболіт 5- фтороротову кислоту для відбору стійких мутантів з ушкодженнями в генах игаЗз або пгаб5.

Зберігали 33 стабільні 5-РОАК колонії Стгуріососси5 сигмайи5 і 20 стабільних 5-РОАК колоній

Аподоїогша дішіпіз. Гени ШКАЗ дикого типу з Стгуріососси5 сигмайи5 і Кпоаоїогиціа дішіпіб клонують і секвентують мутантні гени игаз з 5-ЕОАК ізолятів.

ІЇ0091| Інші ауксотрофні маркери клонують шляхом функціональної комплементації в

Засспаготусев сегемізіае (див. Но, УА, Спапо, МО (1988) Спіпезе доштаї ої Містобіо(оду апа

Іттипоіоду 21 (1): 1-8). Геномні і/або кКДНК-бібліотеки конструюють з Стуріососси5 сигмацив і

КПподоїогиїа дішіпіз для лігування в урацил-селектувальний експресійний вектор Засспаготусев5 для трансформації в штам УРН5БОО (МАТо; игаз-52 Іуз2-801 аде2-101 їр1-дб3 піз3-А200 Іец2-А 1) для відбору лізінових, аденінових, триптофанових, гістидинових і лейцінових прототрофів. На основі цих прототрофів з геномної або кКДНК-вставки секвентують гени, що відповідають І 52,

АРЕ2, ТЕР, НІЗЗ і ГЕ0О2.

І0092| Приклад 2. Маніпулювання генами дріжджів із застосуванням технології спрямованого мутагенезу КТО5 0093) Алелі генів Іец2, Іуз5 і игаЗ3 штаму АТСС 90811 Уаїтоу/ла Ігроїуїса (Іеи2-35 Іу55-12 игаз- 18 ХРЕ2В) були клоновані за допомогою ПЛР, а їхні послідовності порівнювалися з алелями дикого типу для ідентифікації відмінностей.

ІЇ0094| Для гена игаЗ відмінності були виявлені в положеннях 1365 (АС мутація, яка призводить до мовчання ААА-ААдО, що кодують лізин), 1503 (додаткові ААСАА послідовності у

АТСС 90811, які викликають зміщення рамки з поверненням на місце в положенні 1511, призводячи до появи 7 додаткових амінокислот, після яких зазначена послідовність продовжується як У ОКАЗ з СепВапкК), 1511 (додатковий Т в АТСС 90811), та 1978 (С - т мутація, яка призводить до стоп-мутації, що обрізає білок за 24 амінокислоти до карбоксильного

Зо кінця). Олігонуклеотид ОКОМ для відновлення прототрофності був отриманий шляхом конверсії

ЗТОР (ТОА) -» К (СОА) для отримання 264К на основі "ШказЗ-УиІ 040564 нумерації амінокислот.

Застосовували СОКОМ, які являють собою УІШгаз31264/С/40/5'"Суз / Уїас, з послідовністю:

МССАСОТСТОТАСООССАСААССОАСАТССТАТТОАССАССН, і

УОгаз31264/чС/40/5'Суз/зчас, який має наступну послідовність: 35 МОСТОСТСААТАВСАТСТОСаИтстООосСсСОТАСАСАССТСОН, де М-СУЗ; НАЗ'МТт ас СРО. 10, ії 50 мкг кожного СКОМ трансформували в штам Матоміа Іроїуйса АТСС 90811 з застосуванням ацетату літію і висівали на ига-середовище з 2 95 глюкози. Усього було отримано 82 ига т колоній з СОКОМ, сконструйованих за допомогою кодуючої нитки, і 6 колоній із ОКОМ, сконструйованих за допомогою некодуючої нитки, що демонструє перевагу однієї з ниток, характерну для трансформації олігонуклеотидами, що репарують пробіли. Секвенування 18 із зазначених трансформантів, отриманих із застосуванням кодуючої нитки, показало наявність необхідних змін у 17 клонах. 0095) Для І 02 відмінності були виявлені в положеннях 1710 (відсутність додаткового С, яка веде до зміщення рамки і передчасної термінації білка); 1896 (додатковий Т); 2036 (ї- А мутація, розташована за стоп-кодоном); 2177 (відсутній додатковий Т за стоп-кодоном). (0096 Для ГБ? відмінності були виявлені в положеннях 1092 (5 - А ТО -» ТСА, консервативне заміщення (серин)); 1278 (5 - А САб -» САА, консервативне заміщення (глутамін)); 1279 (5 -- А ОТ -» АТТ, заміна М -» І).

І0097| Відповідно, зазначені мутації можуть застосовуватися з різними цілями, наприклад, для перетворення прототрофних дріжджів в ауксотрофні і навпаки.

І0098| Схожа стратегія демонстрації ефективності технології КТО5 застосовується для

Стгуріососси5 сигмайи5 і Кподоїогиа дішіпі5 згідно з описом для Маїтоу/іа Ііроїуїїса, де мутації игаз коректують для відновлення прототрофності. 0099) Згідно певним варіантам реалізації зазначена ефективність КТО5 для У. Іроїуїса може бути продемонстрована вбудовуванням у його геном мутантної версії гена гігроміціну Е. соїї. Така версія зазначеного гена, яка містить точкову мутацію 534Т, кодує мутацію Е125ТОР, що не порушує природну чутливість до гігроміціну У. ІПроїмїса. Трансформація за допомогою

СКОМ, яка коригує цю мутацію, буде надавати стійкості вказаному штаму У. Ііроїуїіса, наприклад, до концентрацій гігроміціну до 1000 мкг/мл. Також конструюють подвійні мутації гена бо стійкості до гігроміціну (НОСН), які складаються з 5341 АЗ7Т (Е12А5ТОР К1З35ТОР), що піддаються корекції одиночним ОКОМ, і (3347 71495 (Е125ТОР У46 5ТОР), що піддаються корекції двома СОКОМ. 00100) Для перевірки активності СОКОМ у Маїтом/іа використовували природну чутливість

УХагтом/а Ійроїуїїса дикого типу до аміноглікозидних антибіотиків гігроміціну В. Гігроміцін В (пт) являє собою аміноциклітольний антибіотик, який продукується 5ігеріотусе5 пудгозсоріси5, що інгібує синтез білків як у прокаріотів, так і у еукаріотів за допомогою порушення рибосомальної транслокації та амінсацил-тРНК розпізнавання. Стійкості можна домогтися введенням гена прп (також відомого як арп (4)) з Б. сої (СЕМВАМК М01499), який кодує аміноциклітолфосфотрансферазу, яка інактивує гігроміцін В ковалентним приєднанням фосфатної групи в положенні 4 циклітольного кільця. Штам Роїд Маїтоу/а Ііроїуїса (Маї с« игаз- 302: ОВАЗ Ієц2-270 хрг2-322 ахр-2 з Уеазіегп) трансформували геном Пр БЕ. соїї, який містить або одиночну (Е125іор в С34Т), або подвійну мутацію Е12510рК13510ор (534Т.АЗ7Т), клонованим у вектор ру ЕХІ-2и-ига3-13, забезпечуючи контроль над геном промотору Пра4 і термінатору

ХРК2. Лінеаризований вектор вбудовували в геном після відбору на відновлення прототрофності, виконаного за допомогою ГЕШ2 маркера. Отримані штами містили непрацюючі версії гена гігроміцинфосфотрансферази (і тому були чутливі до гігроміціну) і були перетворені за допомогою наступних ОКОМ, які відновлюють 534Т або 534Т.АЗ7Т до дикого типу (стійкого до гігроміціну).

СКОМ для відновлення Е125іор до дикого типу (Т34С1)

НРН2/С/42/5'Суз/з'ЯС

Б'Суз- (АААСТСАсСасаАаса тетатоаАпААа ТТ ТоТаАТСОПАААда-з'ас

НРН2/МС/42/5'Суз/З'аС

Б'Суз-нНСТТТТССАТСАСАААСТТСТОСАСАСАССЯ ТСЯаСОСаТадаИтто-з'ас

СКОМ для відновлення Е12510рК13510р до дикого типу (1346 Т37А)

НРНЗ/С/43/5'Суз/з'ЇС

БСуз-СтТсАсСса,асСа,аАса,атстатоаАпаААа ТТ ТТоТаАТСИ,ААААаТТоа-3'аС

НРНЗ/МС/43/5'Суз/З'С

Б'Суз-СПААСТТ ГТ ССАТСАСАААСТТСТоОАСАсСАСса таб, тада-З'ас 00101) 30 мкг зазначеного ОКОМ застосовували для перетворення Прі штаму, який містить

Зо одиночну або подвійну мутацію, в повторних культурах (х б), об'єднували і аліквоту поміщали на чашки з МЕР, які містять 100-1000 мкг/мл гігроміцину для оптимізації відношення сигнал/шум.

Для обох штамів було отримано значну кількість імовірно перетворених колоній при будь-якій концентрації гігроміцину вище контролю "без ДНК", з вираженою перевагою нитки ОКОМ, що не кодує, в обох випадках. У сукупності ці результати дозволяють припустити наявність СКОМ- конверсії вказаного гена-мішені гігроміцинфосфотрансферази у Маїгтом/іа Іроїуйса, а також можливість конверсії двох мутацій (1340 Т37А) із застосуванням одиночного ОКОМ. Для підтвердження відновлення генотипу дикого типу проводять секвенування ДНК.

Штам ДНК Колонії Колонії Колонії Колонії Колонії Колонії на 100 на 200 на 400 на 600 на 800 на 1000 мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл гігро- гігро- гігро- гігро- гігро- гігро- міцину міцину міцину міцину міцину міцину о Емевюр, | Беднк| 0 / 0 | 1 | 1 | 0 | 0

Е1251ор 30 мкг 1 1 1 нитка, що кодує

Е12510р 30 мкг 20 21 21 12 10 нитка, що не кодує о ЕтовіоркіЗвор | Без ДНК | 0 / 0 | 4 | 1 | 0 | о0

Е т1251оркК1З5Іор | 30 мкг 2 2 1 2 2 нитка, що кодує

Е т1251оркК1З5Іор | 30 мкг 5 З 5 7 нитка, що не кодує

І00102| Приклад 3. Клонування генів-мішеней 00103) Послідовності АССази, ГМГР, скваленсинтази і скваленепоксидази, доступні в базі даних МСВІ для Ззасспаготусев5 та інших дріжджів, застосовують як джерело ПЛР -праймерів, відповідні гени клонують із Стуріососси5 сигмайи5 і Кподоїогиїа дішіпіє разом із відповідними регуляторними областями (промоторами, термінаторами). Для ідентифікації "підвищуючих" і "понижуючих" мутацій промоторів, які підвищують або знижують рівні транскрипції відповідно, промотори зазначених чотирьох генів клонують ДНК полімеразою порівняно низької точності для отримання точкових мутацій в зазначених промоторах, і ці фрагменти клонують у плазміди, злиті з репортерними генами зеленого флуоресцентного білка (СЕР) або бета-галактозидази для тестування іп міго у 5. сегемібіае або Е. соїї. Промоторні "підвищуючі" мутації повторно вводять у геномні послідовності ГМГР і скваленсинтази за допомогою КТО5, тоді як "понижуючі" промоторні мутації отримують у геномних послідовностях АССази і скваленепоксидази.

Промотори важливих генів (наприклад, ГАФДГ, актину) у К. дішіпів і С. сигмайи5 клонують для застосування при гетерологічній експресії генів. Праймери для ПЛР-клонування отримують із гомологів цих генів у 5. сегемівзіає. 00104) Приклад 4. Маніпулювання генами-мішенями для збільшення синтезу сквалену (00105) АССаза. Визначають кількість копій гена АСсСази для К. адішіпів, С. сигмай5 та інших дріжджів. КТОЗ5 застосовують для зниження експресії АССази введенням стоп-кодонів безпосередньо за ділянкою старту трансляції в будь-яких додаткових копіях. 00106) Скваленепоксидаза. Подібним чином, збільшення акумуляції сквалену у 5. сегемівзіає досягається за допомогою руйнування однієї копії скваленепоксидази у диплоїдних клітинах.

Катітига, М., Нідака, М., МазакКі, Н., Оогиті, ГТ. (1994) Аррі. Місгоб. Віоїеси. 42: 353-357.

Визначають кількість копій скваленепоксидази у К. дішіпіх, С. сигмайш5 та інших дріжджів, і застосовують КТО5 для створення або вставки стоп-кодону безпосередньо за ділянкою старту трансляції в додаткових копіях, окрім першої копії.

ІЇ00107| Згідно деяким варіантам реалізації активність скваленепоксидази знижують додаванням тербінафіну (інгібітора скваленепоксидази) в середовище. Згідно певним варіантам реалізації у зазначеній скваленепоксидазі здійснюють амінокислотні заміни для збільшення чутливості скваленепоксидази до тербінафіну (наприклад, заміни амінокислот, гомологічних 305, І 37Р і К2696 на карті ЕКО1 Засспаготусев). Згідно деяким варіантам реалізації заміни амінокислот отримують генним синтезом і заміщенням гена дикого типу мутантною версією шляхом гомологічної рекомбінації. Згідно деяким варіантам реалізації зміни в гені дикого типу отримують за допомогою КТО5.

І00108| ГМГР. Ферменти ГМГР, як у Засспаготусе5 сегемізіає, так і у ссавців, містять амінокислотні послідовності в лінкерних ділянках, які присутні в багатьох короткоживучих білках - учасниках швидкого внутрішньоклітинного обміну речовин у клітині (див. Кодегв, 5., УмМеїЇв6, К., апа Веснзієїпег, М. (1986) Зсіепсе 234: 364-368; та Спип, КТ, апа Зітопі, КО (1991) 9. Віої.

Сет. 267 (6): 4236-4246). Подібні послідовності, в разі їхньої наявності, ідентифіковані в генах

ГМГР у У. Іроїуйса, К. дішіпіє або С. сигмайшв5, і усуваються із застосуванням КТО5 для зниження обміну білка ГМГР. Такі подібні послідовності знайдені в гені скваленсинтази 5. сегемізіає, і вони також виявляються у випадку присутності в генах скваленсинтази "У. Іроїуїіса,

КЕ. аїшіпіє і/або С. сигмайш5. Зазначені послідовності, в разі наявності в скваленсинтазі У.

Іроїуїіса, ЕК. дішіпів і/або С. сигмай5, також усуваються із застосуванням КТО5 для зниження білкового обміну.

І00109| ГМГР у 5. сегемізіає містить два висококонсервативних домени, 552 М-кінцеві амінокислоти яких відповідають за зв'язок із мембраною. Надекспресія усіченого білка НМО1, який містить тільки С-кінцевий каталітичний фрагмент, веде до 40-кратного збільшення активності ГМГ-КоА у 5. сегемізіае із збільшенням накопичення сквалену до 5,5 95 сухої маси (РоїакомубКі, Т., еїані, 0., апа, С. (1998) Аррі. Містобріо!І. Віоїесп. 49:66-71). Визначають, чи мають ГМГР білки У. Іпроїуїіса, К. дішіпів і С. сигмайи5 лінійну структуру; у цьому випадку можуть експресуватися фрагменти, що містять тільки розчинний каталітичний домен.

ІЇ00110| Білкова структура і послідовність ДНК ГМГР мають високу консервативність у еукаріотів, від грибів до ссавців, включаючи мембранозв'язаний М-кінцевий домен і каталітичний

С-кінцевий домен. Кордон між двома доменами може бути визначений як область амінокислот 500-600 гена НМОЇ1 Маїгтом/а Ііроїміса (сепоїЇемиге5 Матом/іа Іроїуїйса МАГІОЕО48079), де карта гідрофобності переходить із гідрофобної в гідрофільну область. Залишки 548 і 544 обирають шляхом оцінки карти гідрофобності НМО1Уаїтом/а Ііроїуїіса і її гомології М-кінця усічених білків засспаготусев сегемівіаеє (ОопаЇїд, КАС, єї аї, 1997. Аррі. Епмігоп. Місто. 163 (9): 3341-3344) і

Сапаїда шіїв (Зпітада, Н. еї аї, 1998. Аррі. Епмігоп. Місто. 64 (7):2676-2680). Відповідно, згідно з одним із прикладів, експресуються амінокислоти 548-1000 С-кінцевого домену НМО1 І Магтгоула

Іроїуїїса; в іншому прикладі експресуються амінокислоти 544-1000 С-кінцевого домену НМОЇ І

Уаїтом/а Ігроїміса. У споріднених прикладах експресуються амінокислоти 543-1000 С-кінцевого домену НМО1 | Маїггоула Ійроїуїйса або амінокислоти 545-1000 С-кінцевих доменів НМОЇ1 І

Уаїтоу/а Ігроїуїїса; або амінокислоти 546-1000 С-кінцевих доменів НМО1 І Маттом/а Ігроїуїїса; або амінокислоти 547-1000 С-кінцевих доменів НМО1 І Магтом/а Іроїуїса; або амінокислоти 549- 1000 С-кінцевих доменів НМО І Магтом/а Ійроїуєіса.

Зо 00111) Експресія С-кінцевого каталітичного домену з 457 амінокислот ГМГР (залишки 543- 1000) у штаму Роїзд У. Ігроїуїса дає 2 9о сквалену від загального вмісту ліпідів, у порівнянні з 0 95 в контрольному штамі, який містить тільки вектор, при експериментах у колбах, які струшують.

Зазначений процес повторюють у збільшеному об'ємі із застосуванням ферментерів.

ІО101) У сирійського хом'ячка активність каталітичного домену ГМГР знижуюче регулюється фосфорилюванням АМФ-залежної кінази (ОтКитаг, КМ, Юагпау, ВО, і КоамеїІ, МУ (1994) 9.

ВіоІ. Снет. 269:6810-6814), схожий тип регуляції описаний і для 5. сегемізіае. Визначають, чи регулюються білки ГМГР у К. дішіпіб5, С. сигмайш5 та інших дріжджів подібним чином, і в такому випадку застосовують КТО5 для видалення сайту фосфорилювання.

І0102| Скваленсинтаза. Скваленсинтаза у ссавців узгоджено регулюється на рівні транскрипції, поряд із ГМГ-КоА-синтазою і фарнезилдифосфатсинтазою, за допомогою факторів ЗКЕВР (білки, що зв'язують стеролрегулюючі елементи) (52Коріпзаа, А., Зм/е7ем5кКа,

Е., Каївії, Е (2000) Віоспет. Віорпуз. Нез5. ботт. 267:473-477). ЗРЕВР існують у трьох формах, одна з яких зв'язує промотор скваленсинтази. Визначають, чи присутні такі транскрипційні фактори і/або сайти зв'язування на промоторі скваленсинтази у К. дішіпі5, С. сигмай5 та інших дріжджів, і в такому випадку застосовують КТО5 для внесення змін у транскрипційні фактори і/або сайти зв'язування, які підсилюють транскрипцію скваленсинтази. 0103) Надекспресія скваленсинтази У. ІПроїуїйса в штамі У. Проїуйса Род призводила до отримання 2 95 сквалену від загального вмісту ліпідів в порівнянні з 0 95 у контрольному штамі, який містить лише вказаний вектор, у колбах, які струшують. Зазначений процес повторюють у збільшеному об'ємі із застосуванням ферментерів. 0104) Приклад 5. Умови культивації Стуріососси5 сигмай5

ІО105| Зростання Сгуріососси5 сигмай5 оцінювали для визначення найкращих джерел вуглецю для максимізації клітинної маси в культурі. На багатому поживному середовищі з дріжджовим екстрактом (10 г/л дріжджового екстракту, 20 г/л пептону), С. сигмайи5 добре ріс у присутності 2-20 95 (маса/об'єм) глюкози, досягаючи максимального рівня у 55 г/л сухої клітинної маси (СКМ) при 16 95 (маса/об'єм) глюкози і вище через 4 дні. Подібним чином С. сигмайи5 ріс на тому ж середовищі з 3-12 95 (маса/об'єм) гліцерину, досягаючи СКМ 40 г/л у 12 95 (маса/об'єм) гліцерину через 5 днів. С. сигмайш5 також культивували на біодизельному гліцерині (Іпрегіаї

УМевієгп Ргодисіб5, СоаспеМйа, СА) у концентрації до 3,595 (маса/об'єм), що призводило до 60 одержання 23 г/л СКМ.

ІО106)| Приклад 6. Середовищне маніпулювання генами-мішенями для збільшення синтезу сквалену

І0107| Середовищні маніпуляції перевіряють на здатність збільшувати вихід сквалену. Такі маніпуляції включають (а) інгібування експресії і/або активності АССази за допомогою олеїнової кислоти, оливкової або іншої(их) рослинної(их) оліїолій), інозитолу, холіну, сорафену, флуазіфопу і клетодиму або інших гербіцидів, що інгібують АСсСазу, (Б) інгібування експресії і або активності скваленепоксидази за допомогою тербінафіну, толнафтату і ергостеролу або інших фунгіцидів, що інгібують скваленепоксидазу, (с) маніпулювання співвідношенням С/М у середовищах на основі гліцерину (у початковому середовищі або внесенням добавок), (а) варіювання джерела азоту в середовищі (органічний/неорганічний - просте/комплексне з'єднання), (ее) варіювання режимів додавання вуглецю (наприклад, одноразове завантаження/додавання), (Її) дослідження впливу нестачі поживних речовин, окрім джерела вуглецю, (9) варіювання джерела вуглецю, включаючи суміші цукрів, цукрові спирти, спирти, поліспирти і органічні кислоти, (й) відбір на зростання у присутності сполук, що інгібують ГМГР, таких як ловастатин або інші інгібітори статинового ряду, і (ї) відбір на високі рівні синтезу олій у культурі із застосуванням ліпофільних контрастів або барвників і/або аналізу на ліпіди, що екстрагуються, із застосуванням, наприклад, методів гравіметрії та газової хроматографії. 0108) Наприклад, Маїтом/а Імрроїуйса АТСС 90904 в присутності високих рівнів вуглецю / азоту в середовищі (С/М-420, Її, МН., ім, В., 27пао, 2В., Апа Ваї, ЕМУ. 2006 "Оріїтігей Сипиге

Мейдішт апа Рептепіайоп Сопаййопе ог рій Ргодисіоп бу АНодозрогідійт югиїоідев" (Оптимізоване культуральне середовище та умови ферментації для синтезу ліпідів у

АПодозрогідійт огиіоіде5") Спіпезе Чоцта! ої Віоїєсппоіоду 22 (4): 650-656) (тут і далі "середовище СУМОО1") з додаванням 0-50 мкг/мл тербінафіну при 30 "С, 300 об./хв. протягом 120 год. Концентрації тербінафіну 12,5 мкг/мл або вище призводили до отримання до 18,5 95 сквалену від загального вмісту ліпідів.

ІО0109| Для отримання ліпідів і сквалену застосовують різні штами Маїтоміа Ііроїуїіса, включаючи АТСС 20688, АТСС 90811, АТСС 90904, АТСС 90812, АТСС МУА-2613 і Меавіегп род. Наприклад, штам Маїтоу/а Іроїміса род (Уеавіетп) культивували в присутності високих рівнів вуглецю / азоту в середовищі (С/М-420, Гі, МН., Пи, В., 2пао, 28., Ваї, ЕМУ. 2006 "Орійтігей

Зо Сийиге Медішт апа ЕРептепіайоп Сопайіоп5 ог ІГірій Ргодисіюп Бу Аподозрогіаійт югиоідев" (Оптимізоване культуральне середовище та умови ферментації для синтезу ліпідів в

АПодозрогідійт огиоіде5"), Спіпезе Уоцйгта! ої Віоїесппоїоду 22 (4): 650-656) (тут і далі "середовище СУМОО1") з додаванням 0-50 мкг/мл тербінафіну при 30 "С, 300 об./хв. протягом 120 год. Концентрації тербінафіну 12,5 мкг/мл або вище призводили до отримання до 38 95 частки сквалену від загального вмісту ліпідів і частки ліпідів до 51 95 від сухої клітинної маси. 0110) Згідно з іншим прикладом штам Маїтом/іа Іроїуїйса АТСС 90904 культивували в середовищі СУМОО1 з додаванням від 0 до 50 мкг/мл олеїнової кислоти при 30 "С, 300 об./хв. протягом 120 год. Виявлено, що додавання 10 мкл/мл олеїнової кислоти збільшує акумуляцію ліпідів відносно СКМ (сухої клітинної маси) 10-кратно в порівнянні з акумуляцією без додавання.

ІО111| Згідно з іншим прикладом МУаїтгтом/а Ійроїуїса АТОС 90904 культивували в середовищі

СУМОО1 з додаванням 0-200 мкМ клетодиму при 30 "С, 300 об./хв протягом 120 год. Додавання 200 мкМ клетодиму призводило до 60-кратного збільшення виходу сквалену (мг) в колбі на 60 мл.

ІО112| Збільшення кількості кисню, як було показано, призводить до диференціальної регуляції НМОЇ і НМО2 у 5. сегемізіае, що викликає швидке розкладання НМСа2 і збільшення експресії НМОЇ1 в аеробних умовах (Сазеу, МУМ, Кеезіег, СА, Рагк5, І ММ (1992) . Васі. 174:7283- 7288). З'ясовується, чи впливає кисень на якісь з генів ГМГР у використовуваних нами жирових дріжджах, і в цьому випадку їхнью експресією й активністю керують у ферментері за допомогою змінення рівнів кисню.

І0113| З "середовищем СУМОО1" як базовим (Ії, МН., іш, В., 7пйао, 2В., Ваї, ЕМУ. (2006)

СНіпезе ЧдЧоштаї ої Віотесппоїоду 22 (4):650-656) використовують різні компоненти і концентрації компонентів (у тому числі додають нові компоненти) для покращення росту клітин, збільшення частки загального вмісту ліпідів на одиницю клітинної маси і процентного вмісту сквалену в загальній масі ліпідів. Оцінювані компоненти середовища включають: джерела вуглецю: гліцерин, глюкозу; джерела азоту: сполуки амонію, нітрати, амінокислоти; мінеральні солі: калію, магнію, натрію, заліза, марганцю, цинку, кальцію, міді; дріжджовий екстракт; попередники ліпідів і ефектори синтезу ліпідів: тербінафін, клетодим, олеїнову кислоту, пальмітолеїнову кислоту, лінолеву кислоту, ліноленову кислоту; та противоспінюючі агенти. Інші прийняті до уваги фактори включають: процентний вміст інокуляту, витрачений на ферментацію час,

температуру, рН, зворотний тиск, розчинений кисень (00), поживний склад, стратегію завантаження поживних речовин і стратегію перемішування. 0114) Приклад 7. Відбір штамів

ІЇО115|) Для збільшення чистої продуктивності сквалену застосовують загальноприйняті способи відбору штамів жирових дріжджів. Штами мутагенізують ультрафіолетом, нітрозогуанідином або етилметансульфонатом, проводять скринінг або відбір за підвищеною акумуляцією сквалену. Штами також піддають багаторазовій селекції, наприклад, багаторазово проводять через середовище УЕР (15 г/л дріжджового екстракту, 5 г/л пептону), яке містить З Фо гліцерину, або середовище, яке містить ловастатин та інші відомі інгібітори ГМГР. Штами також багаторазово проводять через середовище СУМОО1, яке містить варіюючі кількості гліцерину і або глюкози, або середовище, яке містить ловастатин і/або інші відомі інгібітори ГМГР і/або інгібітори скваленсинтази для отримання спонтанних мутантів із збільшеною ГМГР і/або скваленсинтазною активністю. Такі мутації можуть розташовуватися в ГМГР, скваленсинтазі або інших генах ("мутації за вторинними сайтам"). 0116) Якщо не вказано інше, всі технічні та наукові терміни, які використовуються у даній заявці, мають значення, загальноприйняті та зрозумілі фахівцям у області техніки, до якої належить даний винахід.

ІО117| Винаходи, описані в даному документі як приклади, можуть за необхідності застосовуватися при відсутності будь-якого(их) елемента(ів), обмеження або обмежень, не описаних прямо в даному документі. Так, наприклад, терміни "що містить", "що включає", "має в складі" і т. п. повинні розумітися широко і без обмежень. Крім того, терміни і вирази, що використовуються в цьому документі, застосовуються з метою опису, а не обмеження, і застосування таких термінів і виразів не призначене для виключення будь-яких еквівалентів представлених і описаних ознак або їхніх частин, і необхідно розуміти, що є можливими різні модифікації в рамках об'єму, описаного в даній заявці винаходу.

ІО118) Таким чином, слід розуміти, що, незважаючи на те, що даний винахід було певним чином розкрито у вигляді переважних варіантів реалізації і додаткових характеристик, фахівці в даній області техніки можуть вдатися до модифікацій, покращень і варіацій втілень розкритого в даній заявці винаходу, і такі модифікації, покращення і варіації розглядаються як такі, що входять до об'єму даного винаходу. Матеріали, способи і приклади, запропоновані в даній заявці, являють собою бажані варіанти реалізації, є прикладами і не призначені для обмеження об'єму даного винаходу.

ІО119| Даний винахід було описано в даному документі загалом і в цілому. Будь-який із конкретних видів або підродових груп, що підпадають під загальне розкриття сутності винаходу, також є частиною даного винаходу. Сюди включено узагальнений опис даного винаходу з обмовкою або негативним обмеженням, яка(є) стосується видалення будь-якого об'єкта винаходу зі вказаного роду об'єктів, незалежно від того, чи був виключений матеріал конкретно процитований у цьому документі. 01201 Крім того, в тих випадках, коли властивості або аспекти даного винаходу описані в термінах груп Маркуша, фахівцям у даній області техніки буде ясно, що даний винахід, таким чином, відноситься і до будь-якого конкретного представника або підгрупи зазначеної групи

Маркуша. 0121) Всі публікації, патентні заявки, патенти та інші посилання, згадані в даній заявці, прямо включені сюди за допомогою посилання в усій повноті, в тій же мірі, коли б кожна з них була включена допомогою посилання в індивідуальному порядку. У разі суперечностей даний опис, включаючи визначення, буде мати переважну силу.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб одержання сквалену із застосуванням генетично змінених або тих, що не зазнали генетичних змін, дріжджів, причому зазначений спосіб включає культивування зазначених дріжджів із протигрибковим агентом, причому зазначені дріжджі є штамом Уаптом/а Л/роуїса Уеавтет роїд, а зазначеним протигрибковим агентом є аліламіновий протигрибковий агент.

2. Спосіб за п. 1, у якому дріжджі є генетично модифікованими дріжджами, і при цьому спосіб включає підвищення або зниження активності або експресії одного або білоше ферментів шляху біосинтезу ізопреноїдів, при цьому активність або експресія зазначеного ферменту підвищені або знижені в результаті однієї або більше спрямованої мутації, при цьому зазначені одна або більше спрямовані мутації знаходяться у певних положеннях у зазначеному ферменті, при цьому зазначені генетично змінені дріжджі продукують підвищені кількості ізопреноїдів у 60 порівнянні з нативними дріжджами.

З. Спосіб за п. 1, у якому протигрибковим агентом є аліламіновий протигрибковий агент у концентрації від 10 до 15 мкг/мл.

4. Спосіб за п. 2, у якому в зазначені один або більше модифікованих ферментів вводять мутації за допомогою олігополімерів нуклеїнових основ генної репарації.

5. Спосіб за п. 4, у якому олігополімер нуклеїнових основ генної репарації вибраний з групи, що складається зі змішаних дуплексних олігонуклеотидів, що не містять нуклеотиди молекул і однониткових олігодезоксинуклеотидів.

б. Спосіб за п. 5, у якому зазначений олігополімер нуклеїнових основ генної репарації є змішаним дуплексним олігонуклеотидом.

7. Спосіб за п. 6, у якому зазначений змішаний дуплексний олігонуклеотид складається менше ніж з 100 нуклеотидів, але більше ніж з 50 нуклеотидів.

8. Спосіб за п. 5, у якому зазначені перша та друга нитки змішаного дуплексного олігонуклеотиду містять дві ділянки, які гомологічні двом фрагментам зазначеного гена-мішені.

9. Спосіб за п. 2, у якому зазначені один або більше модифікованих ферментів включають фермент, вибраний з групи, що складається з ацетил-КоА-карбоксилази (АККази), ГМГ-КоА- редуктази, скваленепоксидази, скваленсинтази, АТФ-цитратліази, АТФ-цитратсинтази, мевалонаткінази, гліцеринкінази та 5-амінолевулінатсинтази.

10. Спосіб за п. 9, у якому зазначена мевалонаткіназа має підвищені активність або експресію.