TWI854090B

TWI854090B - 抗e-選滯蛋白抗體、組合物及使用方法

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Publication number: TWI854090B
Application number: TW110102479A
Authority: TW
Inventors: 詹姆士瑞森納艾波葛; 雪爾路比歐包里; 瓊恩伊莉莎貝斯阿里斯艾爾威爾; 羅拉林; 賈汀那魯拉; 春蕾帕恩; 黛博拉德妮恩皮特曼; 史瓦普尼爾雷克; 志義俞
Original assignee: 美商輝瑞大藥廠
Priority date: 2020-01-24
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2024-09-01

Abstract

本發明提供特異性結合於E-選滯蛋白之抗體及其抗原結合片段。本發明包括使用該等抗體及其抗原結合片段之用途及相關方法。

Description

抗E-選滯蛋白抗體、組合物及使用方法

本發明係關於特異性結合E-選滯蛋白之抗體及其抗原結合片段，以及其組合物、方法及用途，包括使用本發明之抗體治療鐮狀細胞疾病(SCD)，包括治療及預防與SCD相關之血管閉塞性危象(VOC)。

鐮狀細胞疾病(SCD)為一種嚴重、罕見的遺傳病症，僅美國(US)就有超過100,000人受到其影響(疾病控制及預防中心(Center for Disease Control and Prevention))。該疾病為醫療需求高度未滿足之群體中發病率及死亡率很高的一種慢性病狀。患有SCD之個體遭受進行性器官損傷且預期壽命明顯縮短，中值存活期為大約56年(Gardner等人, Blood 2016; 128(10)1436-38)。

SCD之特徵在於存在異常形式之血紅蛋白(Hb)-鐮狀血紅蛋白(HbS)。β-血球蛋白基因(HBB)之單個核苷酸取代產生殘基6 (HBS對偶基因)處之一個胺基酸取代(纈胺酸取代麩胺酸)。HBS同種接合之個體具有最常見且最嚴重形式之鐮狀細胞疾病(SCD-SS)。當個體具有HBS之一個複本及另一HBB基因之一個突變複本時，產生SCD之變異形式。具有HBS對偶基因之1個複本及血紅蛋白C對偶基因(HBC)之1個複本的個體患有SC疾病(SCD-SC)。當個體具有HBS之1個複本及β-地中海型貧血對偶基因之一個複本時，SCD之嚴重程度視β-地中海型貧血對偶基因之嚴重程度而定，其中Hbβ°-地中海型貧血缺失(SCD-Sβ°-thal)通常比Hbβ⁺ -地中海型貧血對偶基因(SCD-Sβ+-thal)或另一相互作用HB變異體(SCD-SVariant)更嚴重(Frenett及Atweh J. Clin. Invest. 2007; 117:850-858)。

SCD之分子發病機制中之主要事件為HbS傾向於在低氧張力條件下聚合，從而使得紅血球(RBC)變得剛性且變成鐮狀(Fabry及Nagel Blood 1982; 60(6)1370-77)。微毛細管靜脈床中之低氧引起內皮發炎及嗜中性白血球之黏附，並減少嗜中性白血球的滾動及流速。此等細胞聚集體經由與內皮細胞相互作用而滯留於血管結構中。鐮狀RBC、白血球及內皮細胞之黏著相互作用阻塞血管結構，從而引起血管閉塞(Zhang等人, Blood 2016:127:801-809; Okpala, 2006; Frenette及Atweh, J. Clin. Invest. 2007; 117:850-858)。氧化氮內穩定失調促使SCD之血管功能障礙(Aslan及Freeman, 2007)。血球聚集體引起血管阻塞、器官梗塞及缺血發作，其臨床上表現為嚴重疼痛發作。貧血係由溶血及血管閉塞所致之紅血球壽命縮短引起，該溶血及血管閉塞係由血管內皮與鐮狀RBC、白血球及血小板之間的相互作用引發(Rees等人, Lancet 2010; 376:2018-31)。

血管閉塞性危象(VOC)為SCD之最常見臨床表現且為伴隨日常生活功能障礙之SCD發病的主要原因(Ballas及Lusardi, Am. J. Hematol. 2005; 79:17-25; Piel等人, New Engl. J. Med. 2017; 376:1561-1573; Darbari等人, PloS One 2013; 8(11):e79923)。VOC係由氧張力最低的毛細管後微靜脈中鐮狀RBC與血管內皮之間的相互作用引發(Manwani及Frenette, Blood 2013; 122(24):3892-8)。此引起內皮損傷，從而觸發發炎反應且使得白血球、血小板及額外RBC募集至發炎部位(Zhang等人, Blood 2016; 127(7):801)。此等細胞聚集體引起血管阻塞(Turhan等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 2002; 99(5):3047-51)且減緩毛細管後微靜脈中之血流，其引起局部組織低氧及進一步之組織發炎。此引起RBC之更多去氧化及鐮狀化以及閉塞之傳播，有時被稱為鐮狀細胞及閉塞血管之二次募集(Stuart及Nagel, Lancet 2004; 364(9942):1343-60)。

VOC可表現於最小6個月大的患有SCD之患者中，但與大齡兒童或成人相比，VOC在嬰幼兒中要少見得多(Benjamin等人, Amer. Pain Soc. 1994;第1卷, 第94頁)。大約60%之患有同種接合SCD的患者每年有至少1次嚴重VOC發作，然而一部分患者有更多次發作(Platt等人, N. Engl. J. Med. 1991; 325(1);11-6)。在此同一研究中，5.2%之具有SCD基因型的患者每年有3-10次嚴重VOC發作且較小比例(＞1%)之患者每年有10次或更多次發作。

疼痛為初始及進行中的血管閉塞及缺血之臨床表現(Ballas, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2005; 19(5):785-802)，其對於具有SCD-SS基因型之患者而言可能尤其嚴重，亦已觀測到與其他基因型相比，該等患者具有較高死亡率(Platt等人, N. Engl. J. Med. 1994; 330(23);1639-44)。

白血球募集至血管內皮損傷區域涉及黏著分子之選滯蛋白家族：E-選滯蛋白(亦稱為CD62E)；P-選滯蛋白(亦稱為CD62P)；及L-選滯蛋白(亦稱為CD62L)，其均作為發炎反應之一部分受到調節(Ernst及Magnani Nat. Rev. Drug Discov. 2009; 8(8):661-77; Morikis等人, Blood 2017; 130(19):2101-10)。雖然結構類似，但各選滯蛋白展現不同的分佈、配位體結合動力學及病理及生理功能方面之多樣性。

黏著分子之選滯蛋白家族及其配位體係藉由鐮狀紅血球及經活化內皮細胞中之改變所促進之SCD中促發炎反應之一部分。選滯蛋白亦在調節細胞-細胞黏著之初始接觸、內皮上之白血球滾動及整合素活化及細胞之轉移方面起關鍵作用。白血球黏著於發炎內皮及循環中之細胞聚集體為SCD之標誌事件。

碳水化合物結合蛋白之選滯蛋白家族共有類似結構，其中各自具有Ca² ⁺ 依賴性(C型)凝集素所特有的N端碳水化合物識別域，隨後為表皮生長因子(EGF)樣域、與互補序列調節域同源之一系列短共同重複序列、跨膜域及短胞質尾區(McEver及Zhu, 2010)。選滯蛋白及其配位體介導血小板及白血球自血液募集至血管內皮，從而促使慢性促發炎環境之產生。

SCD之病理生理學係複雜且異質的。症狀包括疼痛危象、慢性貧血、急性胸部症候群、中風、脾臟離症(splenic sequestration)、血管閉塞性急性疼痛事件或危象、腎功能障礙及容易細菌感染(Ashley-Koch等人, Am. J. Epidemiol. 2000; 151:839-845；Steinberg, New Engl. J. Med. 1999; 340:1021-1030；Piel等人, New Engl. J. Med. 2017; 376:1561-1573)。與SCD相關之急性終末器官併發症可包括急性胸部症候群、急性中風、恆久勃起、肝膽併發症、脾臟離症及急性腎衰竭。SCD累積損害引起之慢性併發症包括缺血性壞死、肺高血壓、腎併發症、眼科併發症、腿潰瘍及復發性恆久勃起(Yawn等人, JAMA 2014; 312:1033-48)。

羥基尿素經批准用於SCD之預防性療法。機制上，羥基尿素增加胎兒血紅蛋白(HbF)濃度且減少疼痛危象之數目(Charache等人, New Engl. J. Med. 1995; 332:1317-1322)。儘管羥基尿素被視為預防VOC之標準照護療法，但羥基尿素具有約30%-35%之失敗率且在急性VOC期間不能有效治療症狀。ENDARI (L-麩醯胺酸)最近經批准用於預防性SCD治療，然而，其作用機制並不明確且臨床益處不太大(Quinn, Blood 2018; 132:689-693)。急性VOC發作之當前治療主要為利用類鴉片鎮痛劑、水化(hydration)、氧療及輸液之支持性治療。此外，大部分患者在家治療VOC且並不尋求直接醫療干預(Smith等人, Ann. Intern. Med. 2008; 148:94-101；Callaghan等人, Blood 2017; 130:973)。

對於SCD之預防及治療，且尤其以解決患者之復發性及致衰弱VOC之基礎病理生理學(例如，減少發炎及細胞聚集)仍有很大的需求。本發明提供特異性結合於E-選滯蛋白且能夠中和E-選滯蛋白功能活性之新穎治療性抗體。此等抗體可有利地在用作針對SCD之預防性治療時用於預防VOC或減少VOC之發生，且用於藉由減少VOC之持續時間(例如，減少使VOC消退的時間)、強度及/或嚴重程度來治療患有SCD之患者的急性VOC。

本發明提供特異性結合於E-選滯蛋白之抗體及其抗原結合片段，以及用途及相關方法。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲由以下實施例(E)涵蓋。 E1. 一種經分離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合於E-選滯蛋白(例如人類及/或石蟹獼猴E-選滯蛋白)。 E2. 如E1之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群的HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列：SEQ ID NO: 8、23、52、63、77、92、111、125、9、24、29、38、41、44、53、64、78、93、112、126、10、54、65、79、94、113及127。 E3. 如E1至E2中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含選自由以下組成之群的LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列：SEQ ID NO: 2、18、47、68、82、97、106、9、24、29、38、41、44、53、64、78、93、112、126 10、54、65、79、94、113及127。 E4. 如E1至E3中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含(a)-(f)中之一或多者 (a) LCDR-1胺基酸序列，其選自由SEQ ID NO:2、18、47、68、82、97及106之序列組成之群； (b) LCDR-2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NO:3、19、48、69、83、98、107及120之序列組成之群； (c) LCDR-3胺基酸序列，其選自由SEQ ID NO:4、20、49、70、84、99、108及121之序列組成之群； (d) HCDR-1胺基酸序列，其選自由SEQ ID NO:8、23、52、63、77、92、111及125之序列組成之群； (e) HCDR-2胺基酸序列，其選自由SEQ ID NO:9、24、29、38、41、44、53、64、78、93、112及126之序列組成之群；及 (f) HCDR-3胺基酸序列，其選自由SEQ ID NO:10、54、65、79、94、113及127之序列組成之群。 E5. 如E1至E4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含以下中之一或多者：包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的LCDR-1，包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的LCDR-2，包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的LCDR-3，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR-1，包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HCDR-2，及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的HCDR-3。 E6. 如E1至E5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID NO: 11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118及128組成之群之序列的該等HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列。 E7. 如E1至E6中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID NO: 5、21、27、32、50、57、71、73、85、87、100、102、109、116及122組成之群之序列的該等LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列。 E8. 如E1至E7中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID NO: 7、13、22、28、34、37、40、43、51、59、62、74、76、89、91、103、110、117及124組成之群之序列的該等HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列。 E9. 如E1至E8中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個選自由SEQ ID NO: 1、17、26、31、46、56、67、72、81、86、96、101、105、115及119組成之群之序列的該等LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列。 E10. 如E1至E9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO:11之該等HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列。 E11. 如E1至E10中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO:5之該等LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列。 E12. 如E1至E11中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO:7或13之該等HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列。 E13. 如E1至E12中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含具有SEQ ID NO:1之該等LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列。 E14. 如E1至E13中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的LCDR-1、包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的LCDR-2、包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的LCDR-3、包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR-1、包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HCDR-2及包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的HCDR-3。 E15. 如E1至E4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的LCDR-1、包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的LCDR-2、包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的LCDR-3。 E16. 如E1至E15中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR-1、包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HCDR-2、包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的HCDR-3。 E17. 如E1至E16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含衍生於選自由以下組成之群之人類生殖系VL序列的VL構架序列：IGKV1-12*01、IGKV1-13*02、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-5*01、IGKV3-11*01、IGKV3-15*01、IGKV3-20*01、IGKV3D-20*02、及IGKV4-1*01。 E18. 如E1至E17中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含衍生於選自由以下組成之群之人類生殖系VH序列的VH構架序列：IGHV1-2*02、IGHV1-3*01、IGHV1-46*01、IGHV1-69*01、IGHV1-69*02、IGHV1-8*01、IGHV3-7*01、IGHV3-13*01、IGHV3-23*01、IGHV3-23*04、IGHV3-30*01、IGHV3-30*18、IGHV5-10-1*01、IGHV5-10-1*04、及IGHV5-51*01。 E19. 如E1至E18中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含IGHV1-39*01 VL構架序列。 E20. 如E1至E19中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含IGHV3-07*01 VH構架序列。 E21. 如E1至E20中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL構架序列及VH構架序列，且其中該VL構架序列與衍生其之該人類生殖系序列至少72%一致。 E22. 如E1至E21中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL構架序列及VH構架序列，且其中該VL構架序列與衍生其之該人類生殖系序列至少72%、74%、75%、77%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。 E23. 如E1至E22中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL構架序列及VH構架序列，且其中該VH構架序列與衍生其之該人類生殖系序列至少53%一致。 E24. 如E1至E23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL構架序列及VH構架序列，且其中該VH構架序列與衍生其之該人類生殖系序列至少53%、58%、60%、63%、71%、72%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。 E25. 如E1至E24中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH域，該VH域包含與SEQ ID NO:11至少90%一致之胺基酸序列。 E26. 如E1至E25中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH域，該VH域包含與SEQ ID NO:11至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E27. 如E1至E26中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VH域，該VH域包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。 E28. 如E1至E27中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL域，該VL域包含與SEQ ID NO:5至少90%一致之胺基酸序列。 E29. 如E1至E28中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL域，該VL域包含與SEQ ID NO:5至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E30. 如E1至E29中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含VL域或由該VL域組成，該VL域包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。 E31. 如E1至E30中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：VH域，該VH域包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；及VL域，該VL域包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。 E32. 如E1至E31中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含Fc域。 E33. 如E32之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc域係IgA (例如IgA₁ 或IgA₂ )、IgD、IgE、IgM或IgG (例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 或IgG₄ )之Fc域。 E34. 如E33之抗體或其抗原結合片段，其中該Fc域為IgG之Fc域。 E35. 如E34之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG係選自由以下組成之群：IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 及IgG₄ 。 E36. 如E35之抗體或其抗原結合片段，其中該IgG係IgG₁ 。 E37. 如E1至E36中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13至少90%一致之胺基酸序列。 E38. 如E1至E37中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E39. 如E1至E38中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。 E40. 如E1至E39中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO: 22、28、34、37、40、43、51、59、62、74、76、89、91、103、110、117及124中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E41. 如E1至E40中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含LC，該LC包含與SEQ ID NO:1至少90%一致之胺基酸序列。 E42. 如E1至E41中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含LC，該LC包含與SEQ ID NO:1至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。 E43. 如E1至E42中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含LC，該LC包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。 E44. 如E1至E43中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的輕鏈。 E45. 如E1至E45中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈，該輕鏈包含與SEQ ID NO:17、26、31、1、46、56、67、72、81、86、96、101、105、115及119中之任一者至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。 E46. 如E1至E45中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126529之質體之插入物編碼的該HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3。 E47. 如E1至E46中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126530之該質體之插入物編碼的該LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3。 E48. 如E1至E47中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126529之該質體之插入物編碼的VH域。 E49. 如E1至E48中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126530之該質體中之該插入物編碼的VL域。 E50. 如E1至E49中任一項之抗體或其抗原結合片段，其包含由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126529之該質體中之該插入物編碼的HC胺基酸序列及由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126530之該質體中之該插入物編碼的LC胺基酸序列。 E51. 如E1至E50中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段為Fc融合蛋白、單功能抗體、最大抗體、雙功能抗體、scFab、scFv、肽體。 E52. 如E1至E52中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約或小於選自由以下組成之群之值的K_D 結合人類E-選滯蛋白：約800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、175 nM、150 nM、125 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM、1 nM、900 pM、800 pM、700 pM、600 pM及500 pM。 E53. 如E1至E52中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約或小於選自由以下組成之群之值的K_D 結合石蟹獼猴E-選滯蛋白：約800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、175 nM、150 nM、125 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM、1 nM、900pM、800 pM、700 pM、600 pM及500 pM。 E54. 如E1至E53中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約10 nM至約200 nM之K_D 結合人類E-選滯蛋白。 E55. 如E1至E54中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約68.4 +/- 3.18 nM之K_D 結合人類E-選滯蛋白。 E56. 如E1至E55中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約10 nM至約200 nM之K_D 結合石蟹獼猴E-選滯蛋白。 E57. 如E1至E56中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約64.9 +/- 1.13 nM之K_D 結合石蟹獼猴E-選滯蛋白。 E58. 如E1至E57中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中抗E-選滯蛋白抗體以選自由以下組成之群的K_D 結合人類E-選滯蛋白：約92.85 nM、約70.3 nM、約65.2 nM、約61.8 nM、約60.5 nM、約68.0 nM、約21.6 nM、約324 nM、約54.4 nM、約628.5 nM及2940 nM。 E59. 如E1至E58中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗E-選滯蛋白抗體以選自由以下組成之群的K_D 結合石蟹獼猴E-選滯蛋白：約138.5 nM、約78.3 nM、約76.5 nM、約81.5 nM、約67.8 nM、約45.8 nM、約243.5 nM、約45.4 nM、約492 nM及3145 nM。 E60. 如E1至E59中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中石蟹獼猴之平均半衰期在以10 mg/kg之劑量進行靜脈內(IV)投與後為至少約14.4天(345小時)。 E61. 如E1至E60中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中石蟹獼猴之該平均半衰期在以3 mg/kg之劑量進行靜脈內投與後為至少約12天(287小時)。 E62. 如E1至E61中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中石蟹獼猴之該平均半衰期在以3 mg/kg之劑量進行皮下(SC)投與後為約21.5天(518小時)。 E63. 如E1至E62中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段並不誘導抗藥物抗體。 E64. 如E1至E63中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如藉由t-區域抗原決定基(t-regitope；T-Reg)調節之評分指示，該抗體之預測免疫原性潛能小於約-30。 E65. 如E1至E64中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如藉由該t-區域抗原決定基(T-Reg)調節之評分指示，該抗體之該預測免疫原性潛能小於約-45且存在0個非生殖系T細胞抗原決定基。 E66. 如E1至E65中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如藉由該T-Reg調節之評分指示，該抗體之該預測免疫原性潛能小於選自由以下組成之群的該T-Reg調節之評分：約-24、-26、-27、-30、-32、-33、-34、-35、-36、-37、-38、-39、-40、-41、-42、-43、-44、-45、-46、-47及-48。 E67. 如E1至E66中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如藉由T-Reg調節之評分指示，該抗體之該預測免疫原性潛能為約-45或-46。 E68. 如E1至E67中之任一項之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，其中如藉由例如AC-SINS分析、DNA結合分析及/或胰島素結合分析所量測，該抗體或其抗原結合片段處於多反應性低風險。 E69. 如E1至E68中之任一項之抗體或其抗原結合片段，其中當在25℃下藉由例如動態光散射(DLS)量測時，該抗體或抗原結合片段具有選自由以下組成之群的黏度：約23 mg/mL濃度下之約7.97 +/- 1.83 cP、約48 mg/mL濃度下之約12.38 +/- 5.28 cP、約90 mg/mL濃度下之約4.26 +/- 0.6 cP、約102 mg/mL濃度下之約5.58 +/- 0.99 cP、約121 mg/mL濃度下之約8.44 +/- 1.54 cP、約140 mg/mL濃度下之約9.78 +/- 2.32 cP、約158 mg/mL濃度下之約17.47 +/- 3.24 cP及約188 mg/mL濃度下之約37.99 +/- 7.03 cP。 E70. 如E1至E69中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中當在25℃下藉由例如DLS量測時，該抗體或抗原結合片段在約150 mg/mL至約190 mg/mL之濃度下具有約15 cP至40 cP之黏度。 E71. 如E1至E70中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中當在25℃下藉由例如Anton Parr方法量測時，該抗體或抗原結合片段在185.7 mg/mL下具有33.4 cP之黏度。 E72. 如E1至E71中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如藉由例如使用例如Octet生物感測器之競爭分析所測定，該抗體或其抗原結合片段結合於人類E-選滯蛋白之三個抗原決定基中之至少一者。 E73. 如E72之抗體或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基中之至少2個重疊。 E74. 如E1至E73中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之至少一個胺基酸殘基相互作用，該至少一個胺基酸殘基選自由以下組成之群：T7、E8、A9、M10、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、N105、E107、R108、S110、K111、K112、K113及其組合。 E75. 如E1至E74中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之3.8 Å內的至少一個胺基酸殘基相互作用，該至少一個胺基酸殘基選自由以下組成之群：T7、E8、A9、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E92、Y94、N105、E107、R108、S110、K111、K112及其組合。 E76. 如E1至E75中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與內埋表面積(Å² )＞5 Å² 之人類E-選滯蛋白中的至少一個胺基酸殘基相互作用，該至少一個胺基酸殘基選自由以下組成之群：T7、E8、A9、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、E107、R108、S110、K111、K112、K113及其組合。 E77. 如E1至E76中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段經由氫鍵與人類E-選滯蛋白之至少一個胺基酸殘基相互作用，該至少一個胺基酸殘基選自由以下組成之群：E8、S47、N82、N83、E88、E92、Y94、N105、E107、R108、S110、K112及其組合。 E78. 如E1至E77中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段經由鹽橋與人類E-選滯蛋白之選自由K111、K112及其組合組成之群的至少一個胺基酸殘基相互作用。 E79. 如E1至E78中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段經由水介導之氫鍵與人類E-選滯蛋白之選自由R97、K112及其組合組成之群的至少一個胺基酸殘基相互作用。 E80. 如E1至E79中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之至少一個胺基酸殘基相互作用，該至少一個胺基酸殘基亦在3.8 Å之sLex胺基酸殘基內相互作用，該至少一個胺基酸殘基選自由以下組成之群：Y48、N82、N83、E92、Y94、R97、N105、E107及其組合。 E81. 如E1至E80中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中HMMS之百分比及/或LMMS百分比在40℃下儲存於選自由以下組成之群的溶液中4週後小於5%：20 mM Tris (pH 7.5)、20 mM組胺酸(pH 5.8)及20 mM麩胺酸(pH 4.5)，且其中視情況藉由aSEC進行分析。 E82. 如E1至E81中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中HMMS之該百分比在4℃或25℃下儲存於選自由以下組成之群的溶液中直至6週後小於5%：20 mM Tris、8.5%蔗糖(pH 7.5)，20 mM組胺酸、8.5%蔗糖、0.005% EDTA (pH 5.8)及下20 mM麩胺酸、8.5%海藻糖(pH 4.5)；其中該抗體之濃度為約150 mg/ml；且其中視情況藉由aSEC進行該分析。 E83. 如E1至E82中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 1)或該抗體之C_H 2展開50%之溫度為約65℃或更高。 E84. 如E1至E83中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 1)或該抗體之該C_H 2展開50%之該溫度介於65℃與72℃之間。 E85. 如E1至E84中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 1)或該抗體之該C_H 2展開50%之該溫度為約71.7℃。 E86. 如E1至E85中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 2)或該抗體之Fab展開50%之溫度為約74℃或更高。 E87. 如E1至E86中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 2)或該抗體之該Fab展開50%之該溫度介於74℃與78℃之間。 E88. 如E1至E87中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 2)或該抗體之該Fab展開50%之該溫度為約78.2℃。 E89. 如E1至E88中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 3)或該抗體之C_H 3展開50%之溫度為約82℃或更高。 E90. 如E1至E89中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 3)或該抗體之該C_H 3展開50%之該溫度介於82℃與86℃之間。 E91. 如E1至E90中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有熱穩定性，其中如藉由差示掃描量熱法所量測，其熔融溫度(T_m 3)或該抗體之該C_H 3展開50%之該溫度為約84.3℃。 E92. 如E1至E91中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由FACS所量測，該抗體或其抗原結合片段對於細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合親和力(表示為EC₅₀ )小於或等於50 nM，例如小於或等於48 nM、45 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.75 nM、0.5 nM、0.25 nM或0.1 nM。 E93. 如E1至E92中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由FACS所量測，該抗體或其抗原結合片段對於細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合親和力(表示為EC₅₀ )為約0.66 nM。 E94. 如E1至E93中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由FACS所量測，該抗體或其抗原結合片段對於細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的結合親和力(表示為EC₅₀ )小於或等於50 nM，例如小於或等於48 nM、45 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.75 nM、0.5 nM、0.25 nM或0.1 nM。 E95. 如E1至E94中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由FACS所量測，該抗體或其抗原結合片段對於細胞表面表現之人類P-選滯蛋白的結合親和力(表示為EC₅₀ )大於或等於350 nM，例如大於或等於400 nM、450 nM、500 nM、550 nM、600 nM、650 nM或更大。 E96. 如E1至E95中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對於可溶性大鼠、小鼠或兔E-選滯蛋白或對於可溶性人類L-選滯蛋白或P-選滯蛋白具有弱結合或不具有結合。 E97. 如E1至E96中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段對於細胞表面表現之人類P-選滯蛋白具有弱結合或不具有結合。 E98. 如E1至E97中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由SPR所量測，該抗體或其抗原結合片段在至多405 nM下展現對於大鼠、小鼠或兔E-選滯蛋白或對於可溶性人類L-選滯蛋白或P-選滯蛋白之無結合。 E99. 如E1至E98中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由直接結合ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段展現對於可溶性小鼠或大鼠E-選滯蛋白之弱-不飽和之結合，其比對於人類或大鼠E-選滯蛋白之結合低約＞100倍。 E100. 如E1至E99中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由直接結合ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段在至多133.3 nM下展現對於可溶性小鼠或大鼠E-選滯蛋白之弱-不飽和結合。 E101. 如E1至E100中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於2 nM，例如小於或等於0.010 nM、0.015 nM、0.020 nM、0.025 nM、0.030 nM、0.035 nM、0.040 nm、0.045 nM、0.05nM、0.055 nM、0.06 nM、0.065 nM、0.070 nM、0.075 nM、0.080 nM、0.085 nM、0.090 nM、0.10 nM、0.12 nM、0.15 nM、0.2 nM、0.5 nM、0.9 nM、0.95 nM、1.0 nM、1.5 nM、18 nM或1.9 nM之EC₅₀ 結合於可溶性人類E-選滯蛋白。 E102. 如E1至E101中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由直接結合ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以約0.085 nM至約0.12 nM之EC₅₀ 結合於可溶性人類E-選滯蛋白。 E103. 如E1至E102中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以小於或等於1 nM，例如小於或等於0.010 nM、0.015 nM、0.020 nM、0.025 nM、0.030 nM、0.035 nM、0.040 nm、0.045 nM、0.05nM、0.055 nM、0.06 nM、0.065 nM、0.070 nM、0.075 nM、0.080 nM、0.085 nM、0.090 nM、0.10 nM、0.12 nM、0.15 nM、0.2 nM、0.5 nM、0.9 nM或0.95 nM之EC₅₀ 結合於可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白。 E104. 如E1至E103中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如藉由直接結合ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以0.071 nM至0.093 nM之EC₅₀ 結合於可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白。 E105. 如E1至E104中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段以約1 nM至約3 nM之IC₅₀ 且較佳以約1.2 nM之IC₅₀ 結合人類血清中之游離可溶性人類E-選滯蛋白。 E106. 如E1至E105中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性人類E-選滯蛋白之結合。 E107. 如E1至E106中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以約2.87 nM至約3.01 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性人類E-選滯蛋白之結合。 E108. 如E1至E107中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。 E109. 如E1至E108中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以約2.39 nM至約2.91 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。 E110. 如E1至E109中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白之結合。 E111. 如E1至E110中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以約1.88 nM至約2.89 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白之結合。 E112. 如E1至E111中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。 E113. 如E1至E112中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，該抗體或其抗原結合片段以約1.47 nM至約2.65 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。 E114. 如E1至E113中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。 E115. 如E1至E114中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約3.36 nM至約4.7 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。 E116. 根據E1至E115之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在靜態條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約3.84 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的黏著。 E117. 如E1至E116中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM或2 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。 E118. 如E1至E117中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約4.25 nM至約4.56 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。 E119. 如E1至E118中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約4.32 nM至約4.35 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的黏著。 E120. 如E1至E119中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以小於或等於300 nM，例如小於或等於290 nM、280 nM、270 nM、260 nM、250 nM、150 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、5 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。 E121. 如E1至E120中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約13.28 nM至約15.94 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。 E122. 如E1至E121中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約9.45 nM至約16.33 nM之IC₅₀ 抑制經活化人類嗜中性白血球(例如經TNF-α活化)與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的黏著。 E123. 如E1至E122中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約2.87 nM至約4.65 nM之IC₅₀ 抑制經活化人類嗜中性白血球(例如經TNF-α活化)與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。 E124. 如E1至E123中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約6.17 nM至約18.66 nM之IC₅₀ 抑制來自SCD患者之血球與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。 E125. 如E1至E124中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中如例如在生理流動條件下所量測，該抗體或其抗原結合片段以約12.4 nM之IC₅₀ 抑制來自SCD患者之血球與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。 E126. 一種經分離核酸分子，其包含編碼如E1至E125中任一項之抗體或其抗原結合片段的核酸序列。 E127. 一種經分離核酸分子，其包含至少一個編碼如E1至E125中任一項之抗體或其抗原結合片段的核酸序列。 E128. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段之VL、VH或兩者，其中該核酸分子包含SEQ ID NO:136之核酸序列、SEQ ID NO:137之核酸序列或兩者。 E129. 一種經分離核酸分子，其包含SEQ ID NO:136之核酸序列、SEQ ID NO:137之核酸序列或兩者，或由該等序列組成。 E130. 一種經分離核酸分子，其包含如SEQ ID NO:136所示之核酸序列或由該序列組成。 E131. 一種經分離核酸分子，其包含如SEQ ID NO:137所示之核酸序列或由該序列組成。 E132. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段之該VH，該核酸分子包含至少一個選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:136、144、146、148、150、151、152、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171及173。 E133. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段之該VH，該核酸分子包含與選自由SEQ ID NO:136、144、146、148、150、151、152、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171及173組成之群的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核酸。 E134. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段之該VL，該核酸分子包含至少一個選自由以下組成之群的核酸序列：SEQ ID NO:137、145、147、149、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172及174。 E135. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段之該VL，該核酸分子包含與選自由SEQ ID NO:137、145、147、149、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172及174組成之群的核酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核酸。 E136. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段之輕鏈、重鏈或兩者，其中該核酸分子包含SEQ ID NO:206或138之核酸序列；SEQ ID NO:139之核酸序列；或兩者。 E137. 一種經分離核酸分子，其包含SEQ ID NO:206或138之核酸序列；SEQ ID NO:139之核酸序列或兩者；或由該等序列組成。 E138. 一種經分離核酸分子，其包含SEQ ID NO:206或138之核酸序列或由該序列組成。 E139. 一種經分離核酸分子，其包含SEQ ID NO:139之核酸序列或由該序列組成。 E140. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段，其中該核酸分子包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列。 E141. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段，其中該核酸分子包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。 E142. 一種經分離核酸分子，其編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段，其中該核酸包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列，及以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。 E143. 一種經分離核酸分子，其包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列。 E144. 一種經分離核酸分子，其包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。 E145. 一種經分離核酸分子，其包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列，及以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。 E146. 一種載體，其包含如E126至E145中任一項之核酸分子。 E147. 一種宿主細胞，其包含如E126至E145中任一項之核酸分子或如E146之載體。 E148. 如E147之宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。 E149. 如E147或E148之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞、HEK-293細胞、NS0細胞、PER.C6®細胞或Sp2.0細胞。 E150. 一種製造抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在其中該抗體或抗原結合片段由如E147至E149中任一項之宿主細胞表現之條件下培養該宿主細胞。 E151. 如E150之方法，其進一步包含分離該抗體或其抗原結合片段。 E152. 一種醫藥組合物，其包含如E1至E125及E221中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 E153. 如E152之醫藥組合物，其中該組合物包含1.12 mg/mL L-組胺酸、2.67 mg/mL L-組胺酸鹽酸鹽單水合物、85 mg/mL蔗糖、0.05 mg/mL乙二胺四乙酸二鈉二水合物、0.2 mg/mL聚山梨醇酯80 (pH 5.8)。 E154. 如E152或E153之醫藥組合物，其中該組合物包含20 mM組胺酸、8.5%蔗糖及0.02%聚山梨醇酯80、0.005%EDTA (pH 5.8)。 E155. 如E152至E154中任一項之醫藥組合物，其中該組合物包含約25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL、150 mg/ml抗體或其抗原結合片段。 E156. 如E155之醫藥組合物，其中該組合物包含約100 mg/mL抗體或其抗原結合片段。 E157. 如E152至E156中任一項之醫藥組合物，其中該劑量為1 mL劑量。 E158. 如E152至E157之醫藥組合物，其中該組合物適用於皮下及/或靜脈內投與。 E159. 如E152至E158中任一項之醫藥組合物，其包含含有以下之抗體或其抗原結合片段：i) SEQ ID NO:11之HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列以及SEQ ID NO:5之LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列；ii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL域；或iii)包含SEQ ID NO:7或13之胺基酸序列的HC及包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的LC。 E160. 如E152至E159中任一項之醫藥組合物，其包含選自由以下組成之群的額外治療活性化合物：L-麩醯胺酸(例如ENDARI)；抗P-選滯蛋白抗體(例如立贊利珠單抗(crizanlizumab) (ADAKVEO))；調節HbS以使其維持在其R狀態(亦即含氧)之化合物，例如2-胺基喹啉及描述於WO 2020/109994(以引用之方式併入本文中)中之彼等物；調節HbS之氧親和力的化合物(例如沃西洛特(voxelotor) (OXBRYTA))；藉由調節2,3-二磷酸甘油酸之生成而靶向HbS聚合的化合物；藉由誘發胎兒血紅蛋白之表現而靶向HbS聚合的化合物(例如羥基尿素，例如DROXIA、HYDREA)；靶向功能障礙性細胞黏著、血管功能障礙及/或發炎之化合物(例如磷酸二酯酶-9抑制劑)；增加血液中氧化氮之含量的化合物(例如可溶性鳥苷酸環化酶刺激劑，例如IW-1701、瑞司瓜特(riociguat) (ADEMPAS))；靜脈內用免疫球蛋白(IG)；靶向高血液凝固性之化合物(例如瑞司瓜特(ADEMPAS)、阿派沙班(apixaban) (ELIQUIS)、利伐沙班(rivaroxaban) (XARELTO))；阻斷NMDA受體結合之化合物(例如美金剛胺(memantine) (NAMENDA))及其組合。 E161. 如E152至E159中任一項之醫藥組合物，其包含選自由以下組成之群的額外治療活性化合物：預防肺炎球菌感染之青黴素預防、羥基尿素(例如DROXIA、HYDREA)、L-麩醯胺酸(例如ENDARI)、立贊利珠單抗(ADAKVEO)、沃西洛特(OXBRYTA)、阿派沙班(ELIQUIS)、利伐沙班(XARELTO)、非類固醇消炎藥、鎮痛劑(一般為類鴉片鎮痛劑)、IW-1701、瑞司瓜特(ADEMPAS)、替卡格雷(ticagrelor) (BRILINTA)、美金剛胺(NAMENDA)及其組合。 E162. 一種減少或抑制E-選滯蛋白活性之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如E1至E125、E221中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如E152至E161中任一項之醫藥組合物，且將投與之前E-選滯蛋白之活性與投與該抗體之後的E-選滯蛋白活性之含量進行比較，由此降低E-選滯蛋白之該活性。 E163. 如E162之方法，其中降低或抑制E-選滯蛋白活性治療藉由移除、抑制或減少E-選滯蛋白活性而得到改善、緩解、抑制或預防之疾病、病症或病狀。 E164. 如E162至E163中任一項之方法，其中E-選滯蛋白之該活性係選自由以下組成之群： (a)白血球繫鏈至內皮細胞； (b)穩定黏著於內皮細胞之活化； (c)白血球緩慢滾動直至阻滯； (d)白血球之有效跨內皮遷移； (e)CD18整合素之親和力及親合力； (f)運輸白血球至急性發炎部位； (g)增加胞溶質鈣； (h)增加使p38 MAP激酶及Syk激酶活化之酪胺酸磷酸化； (i)自該血液募集血小板及白血球至血管內皮；及 (j)產生促發炎環境。 E165. 一種降低有需要之個體中之游離E-選滯蛋白之含量的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之如E1至E125中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如E152至E161中任一項之醫藥組合物。 E166. 一種治療及/或預防與E-選滯蛋白表現及/或E-選滯蛋白結合於配位體相關或由其介導之疾病、病症及/或病狀的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如E1至E125中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如E152至E161中任一項之醫藥組合物。 E167. 如E166之方法，其中該疾病、病症及/或病狀為選自由以下組成之群的至少一者：SCD、血管閉塞性危象(VOC)、疼痛、器官梗塞、缺血、中風、終末器官功能障礙、急性胸部及血管阻塞、皮膚病(例如牛皮癬)、發炎疾病(例如類風濕性關節炎)及糖尿病併發症。 E168. 如E167之方法，其中該VOC與SCD相關。 E169. 如E166至E168中任一項之方法，其包含藉由預防或減少VOC之發生對SCD進行預防性治療。 E170. 如E167至E169中任一項之方法，其包含藉由減少VOC之持續時間(例如，減少使VOC消退之時間)及強度對SCD進行急性治療。 E171. 如E166至E170中任一項之方法，其中該治療為預防性治療。 E172. 如E166至E171中任一項之方法，其治療、預防及/或改善SCD之至少一種病徵及/或症狀，例如，影響以下之彼等病徵及/或症狀：心胸系統(例如慢性限制性肺病、左心室舒張性疾病、肺高血壓、急性胸部症候群、心律不整、猝死、血管閉塞性危象)、神經系統(例如出血性中風、靜脈竇栓塞、腦之無症狀腦梗塞、慢性疼痛、腦之急性缺血性中風、增生性視網膜病變、眼眶梗塞、認知障礙)、網狀內皮系統(例如脾臟離症、功能性低脾功能症、貧血、溶血)、肌骨胳系統(例如缺血性壞死、皮膚潰瘍)、泌尿生殖系統(例如乳頭狀壞死、蛋白尿、腎衰竭、血尿、夜間遺尿、恆久勃起)及腸胃系統(例如膽石症、膽管病、肝病、腸系膜血管閉塞)。 E173. 如E166至E172中任一項之方法，其中該個體為人類。 E174 如E166至E173中任一項之方法，其中該個體為患有SCD之患者。 E175. 如E166至E174中任一項之方法，其中該個體具有HBSS、HBSC、HBS/β°thal、HBS/β⁺ thal或HBS-變異體基因型。 E176. 如E166至E175中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物係經皮下投與。 E177. 如E166至E176中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物係經靜脈內投與。 E178. 如E166至E177中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物係經約一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、一個月兩次、一個月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每四個月一次、每五個月一次、每六個月一次、每七個月一次、每八個月一次、每九個月一次、每十個月一次、每十一個月一次或每十二個月一次進行投與。 E179. 如E166至E177中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物係經一個月一次投與。 E180. 如E166至E179中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物係經一週一次投與。 E181. 如E66至E180中任一項之方法，其中該治療有效量包含約1 mg至約800 mg的該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之劑量。 E182. 如E181之方法，其中該劑量為初始固定劑量。 E183. 如E181至E182中任一項之方法，其中該劑量為約1 mg至約10 mg、約10 mg至約20 mg、約20 mg至約30 mg、約30 mg至約40 mg、約40 mg至約50 mg、約50 mg至約60 mg、約60 mg至約70 mg、約70 mg至約80 mg、約80 mg至約90 mg、約90 mg至約100 mg、約100 mg至約150 mg、約150 mg至約200 mg、約200 mg至約300 mg、約300 mg至約400 mg、約400 mg至約500 mg、約500 mg至約600 mg、約600 mg至約700 mg或約700 mg至約800 mg之該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。 E184. 如E181至E183中任一項之方法，其中該劑量為約15 mg、40 mg、100 mg、150 mg、300 mg、500 mg或600 mg之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。 E185. 如E181至E184中任一項之方法，其中該劑量為約150 mg之該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。 E186. 如E81至E185中任一項之方法，其包含一週一次、每2週一次、一個月一次、每兩個月一次或其組合進行投與該劑量。 E187. 如E162至E186中任一項之方法，其中該抗體為抗體1444且該抗原結合片段為抗體1444之片段。 E188. 如E162至E187中任一項之方法，其中該投與為皮下或靜脈內投與。 E189. 如E162至E188中任一項之方法，其包含投與包含以下之抗體或其抗原結合片段：i) SEQ ID NO:11之HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列以及SEQ ID NO:5之LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列；ii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL域；或iii)包含SEQ ID NO:7或13之胺基酸序列的HC以及包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的LC。 E190. 如E162至E188中任一項之方法，其包含投與醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有以下之抗體或其抗原結合片段：i) SEQ ID NO:11之HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列以及SEQ ID NO:5之LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列；ii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL域；或iii)包含SEQ ID NO:7或13之胺基酸序列的HC以及包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的LC。 E191. 如E162至E190中任一項之方法，其中該個體為患有SCD之患者。 E192. 一種治療SCD之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，其包含i) SEQ ID NO:11之HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3序列以及SEQ ID NO:5之LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3序列；ii)包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL域；或iii)包含SEQ ID NO:7或13之胺基酸序列的HC以及包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的LC；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 E193. 如E192之方法，其中治療SCD包括治療SCD(包括VOC)之至少一種症狀。 E194. 如E192至E193中任一項之方法，其中該個體為患有SCD之患者。 E195. 如E192至E194中任一項之方法，其包含經皮下及/或靜脈內投與該抗體或其抗原結合片段。 E196. 如E192至E195中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係經約一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、一個月兩次、一個月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每四個月一次、每五個月一次、每六個月一次、每七個月一次、每八個月一次、每九個月一次、每十個月一次、每十一個月一次或每十二個月一次進行投與。 E197. 如E192至E196中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物係經一週一次、每2週一次、每3週一次、一個月一次或其組合進行投與。 E198. 如E192至E197中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段係以約1 mg至約800 mg之間的劑量進行投與。 E199. 如E192至E198中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物係以選自由以下組成之群的劑量進行投與：約15 mg、約40 mg、約100 mg、約150 mg、約300 mg、約500 mg及約600 mg。 E200. 如E192至E199中任一項之方法，其中該抗體或其抗原結合片段與治療有效量之一或多種在治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面有效的額外治療活性化合物或治療方法進行組合投與。 E201. 如E192至E200中任一項之方法，其中該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之量及在治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面有效的該治療活性化合物或治療方法之量係以在該治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面一起達成協同效應之量進行投與。 E202. 如E192至E201中任一項之方法，其中該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之該量及/或在治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面有效的該治療活性化合物或治療方法之該量，各自以低於若不以組合形式將投與之劑量的劑量進行投與。 E203. 如E192至E202中任一項之方法，其中該額外治療活性化合物係選自由以下組成之群：預防肺炎球菌感染之青黴素預防、羥基尿素(例如DROXIA、HYDREA)、L-麩醯胺酸(例如ENDARI)、立贊利珠單抗(ADAKVEO)、沃西洛特(OXBRYTA)、阿派沙班(ELIQUIS)、利伐沙班(XARELTO)、非類固醇消炎藥、鎮痛劑(一般為類鴉片鎮痛劑)、IW-1701、瑞司瓜特(ADEMPAS)、替卡格雷(BRILINTA)、美金剛胺(NAMENDA)及其組合。 E204. 如E192至E203中任一項之方法，其中該額外治療活性化合物係選自由以下組成之群：L-麩醯胺酸(例如ENDARI)；抗P-選滯蛋白抗體(例如立贊利珠單抗(ADAKVEO))；調節HbS以使其維持在其R狀態(亦即含氧)之化合物，例如2-胺基喹啉及描述於WO 2020/109994(以引用之方式併入本文中)中之彼等物；調節HbS之氧親和力的化合物(例如沃西洛特(OXBRYTA))；藉由調節2,3-二磷酸甘油酸之生成而靶向HbS聚合的化合物；藉由誘發胎兒血紅蛋白(HbF)之表現而靶向HbS聚合的化合物(例如羥基尿素，例如DROXIA、HYDREA)；靶向功能障礙性細胞黏著、血管功能障礙及/或發炎之化合物(例如磷酸二酯酶-9抑制劑)；增加血液中氧化氮之含量的化合物(例如可溶性鳥苷酸環化酶刺激劑，例如IW-1701、瑞司瓜特(ADEMPAS))；靜脈內用免疫球蛋白；靶向高血液凝固性之化合物(例如瑞司瓜特(ADEMPAS)、阿派沙班(ELIQUIS)、利伐沙班(XARELTO))；阻斷NMDA受體結合之化合物(例如美金剛胺(NAMENDA))及其組合。 E205. 如E192至E204中任一項之方法，其中適用於治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的該治療活性治療方法係選自由以下組成之群：補充氧；輸血，視情況伴有鐵螯合；骨髓移植；基因療法(例如LentiGlobin®)；藉由CRISPR之基因編輯療法(例如CTX001)或鋅指技術及其組合。 E206. 如E200至E205中任一項之方法，其中將該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段及在治療及/或預防SCD之至少一種病徵及或症狀有效的該治療活性化合物或治療方法進行共投與。 E207. 如E200至E206中任一項之方法，其中組合療法係根據相同給藥方案(例如，兩種療法係每天進行投與)或根據不同給藥方案(例如，一種療法係每天進行投與，另一種療法係每週進行投與)進行投與。 E208. 如E200至E207中任一項之方法，其中該等組合療法係藉由相同或不同投與途徑向個體投與。 E209. 一種如E152至E161中任一項之醫藥組合物在製造用於治療由E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀(例如SCD)的藥劑中的用途。 E210. 一種如E1至E125或E221中任一項之抗體或其抗原結合片段在製造用於治療及/或預防與E-選滯蛋白表現及/或E-選滯蛋白結合於配位體相關或由其介導之疾病、病症或病狀的藥劑中之用途。 E211. 一種如E152至E161中任一項之醫藥組合物在製造用於治療及/或預防與E-選滯蛋白表現及/或E-選滯蛋白結合於配位體相關或由其介導之疾病、病症或病狀的藥劑中之用途。 E212. 如E1至E125或E221中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如E152至E161之醫藥組合物，其適用作藥劑。 E213. 如E1至E125或E221中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如E152至E161中任一項之醫藥組合物，其用於治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀。 E214. 如E213之供使用之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中SCD之該症狀為VOC。 E215. 如E213至E214中任一項之供使用之抗體、或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中該治療及/或預防進一步包含額外治療劑，諸如但不限於在治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面有效的至少一種其他治療活性化合物或治療方法。 E216. 如E215之供使用之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中該額外治療劑係作為標準照護療法之用於預防及/或治療SCD之至少一種病徵及/或症狀的藥劑(例如L-麩醯胺酸、羥基尿素、輸血及此項技術中已知之任何其他療法)。 E217. 如E215至E216之供使用之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中該治療及/或預防包含i)協同治療有效量之該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，及ii)協同治療有效量之額外治療劑。 E218. 如E215或E216之供使用之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中該治療及/或預防包含i)協同治療有效量之該抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，及ii)協同治療有效量之該治療方法。 E219. 如E152至E161中任一項之醫藥組合物，其中如該組合中用於向患有SCD之患者投與之各化合物之適當量係藉由考慮選自由以下組成之群的至少一個因素確定：年齡、體重、一般健康狀況、投與之化合物、投與途徑、SCD治療之性質及進展及其他藥物之存在。 E220. 一種如E152至E161中任一項之醫藥組合物，其經調配適用作用於治療由E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀(例如SCD)的藥劑。 E221. 一種特異性結合E-選滯蛋白之經分離單株抗體，其中該抗體為抗體0039、0164、0158、0159、0170、0180、0841、1282 1284、1444或1448。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張於2020年1月24日申請之美國臨時專利申請案第62/965,688號、2020年10月22日申請之美國臨時專利申請案第63/104,213號及2020年12月4日申請之美國臨時專利申請案第63/121,467號之優先權，該等申請案中之各者之內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明提供抗體及其抗原結合片段，其特異性結合於E-選滯蛋白且降低或抑制E-選滯蛋白活性，包括但不限於E-選滯蛋白與包含碳水化合物結構(其中糖蛋白或糖脂上具有唾液酸路易斯(sLex)決定子)之配位體相互作用(例如結合)的能力。本發明亦提供用於製造、製備或產生抗E-選滯蛋白抗體之方法。本發明之抗體適用於診斷、預防及/或治療由E-選滯蛋白活性(例如結合)介導或與其相關之病症或病狀，包括但不限於SCD、血管閉塞性危象、疼痛、器官梗塞、缺血、中風及血管阻塞。本發明進一步涵蓋抗體之表現及包含本發明之抗體或其抗原結合片段的組合物(諸如使用抗體之藥劑)之製備及製造。

提供編碼結合E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。亦提供編碼抗體重鏈或輕鏈或二者之多核苷酸。提供表現抗E-選滯蛋白抗體之宿主細胞。提供使用針對E-選滯蛋白之抗體的治療方法。該等方法包括但不限於治療及/或預防與E-選滯蛋白表現及/或E-選滯蛋白結合於sLex配位體相關或由其介導之疾病的方法，包括但不限於SCD、血管閉塞性危象、疼痛、器官梗塞、缺血、中風、終末器官功能障礙、急性胸部及血管阻塞。

不希望受任何特定理論之束縛，黏著分子之選滯蛋白家族(例如E-選滯蛋白)及其配位體在調節細胞-細胞黏著之初始接觸、內皮上之白血球滾動、整合素活化及細胞之轉移方面起關鍵作用，所有均為SCD中促發炎反應之一部分，其在臨床上表現為嚴重疼痛或血管閉塞性危象(包括例如血管阻塞、器官梗塞及缺血)之發作。因此，本發明之抗體及其抗原結合片段能夠選擇性拮抗E-選滯蛋白活性及血管系統中之結合，從而減少個體中之血管閉塞。在本文實例中所揭示之一些實施例中，當E-選滯蛋白處於溶液中或表現於細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、來自患有SCD之患者的嗜中性白血球及/或血球)上及其配位體處於溶液中或表現於細胞(例如HL-60細胞、人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、石蟹獼猴肺微血管內皮細胞(CLMEC))上時，針對E-選滯蛋白之抗體及其抗原結合片段已顯示抑制、中和或減少E-選滯蛋白與其配位體之結合。

抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段(包括人類化抗體)可單獨或與第二療法組合用於預防、治療及/或改善SCD之至少一種病徵及/或症狀，包括血管閉塞性危象、疼痛、器官梗塞、缺血、中風及血管阻塞。

本文所用之章節標題係僅出於組織目的且不應解釋為限制所描述之主題。

本文所引用之所有參考文獻(包括專利申請案、專利公開案、UniProtKB寄存編號)均以引用之方式併入本文中，如同具體地且單獨地指出各個別參考文獻以全文引用之方式併入本文中一般。

本文中所描述或參考之技術及程序一般可由熟習此項技術者使用習知方法良好理解及共同使用，諸如描述於以下文獻中之廣泛使用之方法：Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編, (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames及G. R. Taylor編. (1995)), Harlow及Lane編. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney)編, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths及D. G. Newell編, 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir及C. C. Blackwell編); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller及M. P. Calos編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編, 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway及P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)); The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra,編, Harwood Academic Publishers, 1995)；以及其更新版。

參考以下本發明之例示性實施例之詳細描述及其中所包括之實例可更易於理解本發明。

當本發明之態樣或實施例根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代群組進行描述時，本發明不僅涵蓋整體列出之全部群組，而且涵蓋獨立群組之各成員及主群組之所有可能子組，以及缺乏一或多個群組成員之主群組。本發明亦設想明確排除所主張之發明中之任何群組成員中之一或多者。定義

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與於本發明所屬領域一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。在有矛盾的情況下，將以本發明(包括定義)為準。

此外，除非情景另有需要或另外明確地指出，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

儘管闡述本發明之廣泛範疇的數值範圍及參數為近似值，但特定實例中所示之數值應儘可能精確地報告。然而，任何數值均固有地含有因其對應測試量測值中發現之標準差所必然引起的某些錯誤。此外，本文所揭示之所有範圍應理解為涵蓋其中所包含之任何及所有子範圍。舉例而言，「1至10」之陳述範圍應視為包括最小值1與最大值10之間(包括端值)的任何及所有子範圍；亦即，以最小值1或更大開始(例如1至6.1)且以最大值10或更小結束(例如5.5至10)之所有子範圍。

除非另外指示，否則如本文所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。

如本文所用，術語「及/或」係指及涵蓋相關所列項目中之一或多者之任何及所有可能組合，以及當以替代性「或」解釋時不具有組合。

如本文所用，術語「約」或「大約」係指可量測之值，諸如生物活性之量、多核苷酸或多肽序列之長度、G及C核苷酸之含量、密碼子適應指數、CpG二核苷酸之數目、劑量、時間、溫度及其類似者，且除非另有說明，否則自上下文可見，意指涵蓋在指定量之任一方向(大於或小於)上25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或甚至0.1%之變化，或除此以外其中該數目將超過可能值之100%。

如本文所用，術語「改善」意謂個體之疾病、病症或病狀(例如SCD)或其症狀(例如血管閉塞性危象)或潛在細胞反應中之可偵測或可量測的改善。可偵測或可量測的改善包括由疾病、病症或病狀之症狀改善或恢復所引起或與其相關之併發症之發生、頻率、嚴重程度、進展或持續時間的主觀或客觀降低、減少、抑制、遏制、限制或控制。

如本文所用之「另一」可意謂至少第二個(種)或更多個(種)。除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般熟習此項技術者通常理解之含義。另外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

如本文所用，若一者之存在、含量及/或形式與另一者之存在、含量及/或形式相關，則術語「與相關」係指與另一者相關。舉例而言，若特定實體(例如，多肽、基因標籤、代謝物、微生物等)之存在、含量及/或形式與(例如，在整個相關群體中)疾病、病症或病狀之發生及/或對疾病、病症或病狀之易感性相關，則將該特定實體視為與該特定疾病、病症或病狀相關。在一些實施例中，若兩個或更多個實體直接或間接相互作用，使得其彼此具有及/或保持物理接近性，則其彼此物理上「相關」。在一些實施例中，彼此物理上相關之兩個或更多個實體彼此共價連接；在一些實施例中，彼此物理上相關之兩個或更多個實體彼此不共價連接，但以非共價形式相關，例如藉助於氫鍵、凡得瓦爾力相互作用(van der Waals interaction)、疏水相互作用、磁性及其組合。

如本文所用，術語「編碼序列」係指編碼特定蛋白或「編碼核酸」之序列，其表示當置於適當之調節序列的控制下(可操作地連接於適當之調節序列)時，該核酸序列經轉錄(在DNA之情況下)及轉譯(在mRNA之情況下)成活體外或活體內多肽。編碼序列之邊界藉由5'(胺基)端之起始密碼子及3'(羧基)端之轉譯終止密碼子來確定。編碼序列可包括但不限於來自原核或真核mRNA之cDNA、來自原核或真核DNA之基因組DNA序列，及甚至合成DNA序列。

在整個本說明書及申請專利範圍中，詞語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises/comprising)」之變化形式及詞語「具有/包括」應理解為意味著包括所陳述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。除非另外為情形所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在術語「例如(e.g./for example)」之後的任何實例並不意謂為窮盡性或限制性的。應理解，在本文中任何地方之實施例皆用語言「包含」描述，或亦提供用術語「由組成」及/或「基本上由組成」所描述之類似實施例。

如本文所用，術語「保守性取代」係指由生物學上、化學上或結構上類似之殘基替代一種胺基酸。生物學上類似意謂取代基並不破壞生物活性。結構上類似意謂胺基酸之側鏈具有類似長度(諸如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸)或具有類似尺寸。化學相似性意謂殘基具有相同電荷或均為親水性或疏水性的。特定實例包括一種疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一種，或一種極性殘基取代另一種，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺酸取代天冬醯胺、絲胺酸取代蘇胺酸及類似取代。保守性取代之特定實例包括一種疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代另一種，一種極性殘基取代另一種，諸如精胺酸取代離胺酸、麩胺酸取代天冬胺酸或麩醯胺酸取代天冬醯胺及類似取代。保守性胺基酸取代通常包括例如以下基團內之取代：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸；天冬醯胺、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。「保守性取代」亦包括使用經取代胺基酸而非未經取代母體胺基酸。

如本文所用，術語「表現控制序列」意謂引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如組成型或可誘導型啟動子；或強化子。表現控制序列可操作地連接於待轉錄之核酸序列。

如本文所用，藥物、化合物或醫藥組合物之術語「有效劑量」或「有效量」為足以影響任何一或多種有益或所需結果之量。在更具體態樣中，有效量預防、緩解及/或改善疾病(例如SCD)之至少一種病徵及/或症狀。對於預防性用途，有益或所需結果包括消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度或延緩疾病發生，該疾病包括疾病、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理性表型之生物化學、組織及/或行為症狀。對於治療性用途，有益或所需結果包括諸如減輕E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀之至少一種病徵及/或症狀、降低治療該疾病所需之其他藥物之劑量、增強另一藥物之效應及/或延緩患者之疾病進展的臨床結果。可以一或多次投與形式來投與有效劑量。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療之量。如在臨床情形下所理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或不可連同另一藥物、化合物或醫藥組合物一起達成。因此，「有效劑量」可視為處於投與一或多種治療劑的情形下，且若連同一或多種其他藥劑可達成或已達成所需結果，則單個藥劑可視為以有效量給出。

如本文所用，術語「功能性」係指生物分子呈展現出特性及/或活性之形式，其藉由該特性及/或活性表徵。生物分子可具有兩種功能(亦即雙功能)或多種功能(亦即多功能)。

如本文所用，術語「糖基化型態」意謂碳水化合物單元之型態，該等碳水化合物單元共價附著於蛋白質(例如糖型)以及位點，在該(等)位點，糖型共價附著於蛋白質，更具體言之免疫球蛋白之肽主鏈。

如本文所用，術語「同源」或「同源性」係指在指定區域或片段上共有至少部分一致性的兩個或更多個參考實體(例如核苷酸或多肽序列)。舉例而言，當兩種肽中之胺基酸位置由相同胺基酸佔據時，該等肽在彼位置為同源的。值得注意地，同源肽將保留與未經修飾或參考肽相關之活性或功能，且經修飾肽一般將具有與未經修飾序列之胺基酸序列「實質上同源」的胺基酸序列。當提及多肽、核酸或其片段時，「實質上同源性」或「實質上類似性」意謂當與另一多肽、核酸(或其互補股)或其片段最佳地以適當插入或缺失比對時，序列一致性在該序列之至少約95%至99%。兩個序列之間的同源性(一致性)之程度可使用電腦程式及數學演算法確定。該等計算序列同源性(或一致性)百分比之演算法一般考慮比較區或區域內之序列空隙及錯配。例示性程式及演算法提供於下文中。

如本文所用，術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且意謂個別細胞或細胞培養物，其可為或已為用於併入多核苷酸插入物之載體的受體。宿主細胞包括「轉型體」、「經轉型細胞」及「經轉導細胞」，其包括原代經轉型細胞或經轉導細胞及自其衍生之後代，不考慮繼代次數。由於自然、偶然或目的性突變，宿主細胞後代可能未必與原始母細胞完全相同(在形態或基因組DNA互補序列方面)。宿主細胞包括經本發明之多核苷酸(例如編碼抗E-選滯蛋白抗體之胺基酸序列的多核苷酸)活體內轉染及/或轉型之細胞。

如本文所用，術語「一致性」或「與一致」係指聚合分子之間，例如核酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。「一致性」量測空隙比對藉由電腦程式之特定數學模型(亦即「演算法」)定址之兩個或更多個序列之間的一致匹配百分比。

在一些實施例中，若聚合分子序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致，則將其視為彼此「實質上一致」。

舉例而言，兩個核酸或多肽序列之一致性百分比之計算可藉由出於最佳比較目的而比對兩個序列來執行(例如可將空隙引入第一序列及第二序列中之一者或兩者以用於最佳比對，且可出於比較目的而忽略非一致序列)。在某些實施例中，出於比較目的比對之序列長度為參考序列長度之至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。接著比較對應位置處之核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置處相同之殘基(例如核苷酸或胺基酸)佔據時，則分子在彼位置處一致。在考慮到需要引入以供用於最佳比對兩個序列的空隙之數目及各空隙之長度的情況下，該兩個序列之間的一致性百分比與該等序列共有之一致位置之數目有關。比較序列及測定兩個序列之間的一致性百分比可使用數學演算法來實現。

為確定一致性百分比，可使用方法及電腦程式(包括BLAST，在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上可用)比對序列。其他比對程式包括生物資訊軟體之Lasergene®程式組中之MegAlign®程式(DNASTAR®，Madison公司，WI)。另一比對演算法為FASTA，其在遺傳學計算群組(Genetics Computing Group；GCG)封裝(來自Wis.，Madison，美國)中可用。用於比對之其他技術描述於Methods in Enzymology, 第266卷: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), Doolittle編, Academic Press, Inc.中之方法中。尤其受關注的為允許序列中之空隙的比對程式。Smith-Waterman為一種類型之允許序列比對中之空隙的演算法。參見Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)。此外，使用Needleman及Wunsch比對方法之GAP程式可用於比對序列。參見J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)。

此外，所關注的為BestFit程式使用Smith及Waterman之局部同源演算法(1981，Advances in Applied Mathematics 2: 482-489)以確定序列一致性。空隙生成罰分一般將在1至5、通常2至4之範圍內，且在一些實施例中將為3。空隙擴展罰分一般將在約0.01至0.20之範圍內，且在一些情況下將為0.10。程式具有由經輸入以相比較之序列確定的預設參數。較佳地，使用由程式確定之預設參數來確定序列一致性。亦自遺傳學計算群組(GCG)套裝軟體(來自Madison,WI，美國)商購此程式。

另一所關注程式為FastDB演算法。FastDB描述於Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁, 1988, Alan R. Liss, Inc.中。基於以下參數藉由FastDB計算序列一致性百分比：不匹配罰分：1.00；空隙罰分：1.00；空隙大小罰分：0.33；及連接罰分：30.0。

如本文所用，術語「增加」、「提高」、「降低」或「減少」指示相對於基線量測值之值，諸如在開始本文所描述之治療之前相同個體之量測值，或在不存在本文所描述之治療情況下對照個體(或多個對照個體)之量測值。在一些實施例中，「對照個體」為罹患與所治療之個體相同形式的疾病或損傷之個體。在一些實施例中，「對照個體」為未罹患與所治療之個體相同形式之疾病或損傷的個體。

如本文所用，術語「經分離分子」(其中分子為例如多肽、多核苷酸或抗體或其抗原結合片段)意謂以下分子：其藉助於其來源或衍生源(1)不與在其天然狀態下與其伴隨之天然相關組分結合；(2)實質上不含來自同一物種之其他分子；(3)由來自不同物種之細胞表現，或(4)不在自然界中出現。因此，經化學合成或在與天然來源之細胞不同之細胞系統中表現之分子將與其天然相關組份「分離」。使用此項技術中熟知之純化技術，藉由分離亦可使分子實質上不含天然相關之組分。可藉由此項技術中熟知之多種方式分析分子純度或均勻性。舉例而言，多肽樣品之純度可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠染色以使用此項技術中熟知之技術使多肽顯現來分析。出於某些目的，可藉由使用HPLC或此項技術中用於純化之其他熟知方式提供更高解析度。

如本文所用，術語「前導肽」或「前導序列」或「前導信號序列」或「信號序列」(在本文中可互換使用)意謂任何核酸序列或由此經編碼之胺基酸序列，其可存在於核酸分子之5'端上及/或多肽之N端處或附近，其在存在時可介導多肽輸送至目的細胞器，包括但不限於自細胞分泌多肽。該等前導序列包括但不限於：核酸序列，其包含例如ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 140)及ATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTGGCAACAGCTACAGGCGTGCACTCC (SEQ ID NO:141)；及由此經編碼之胺基酸序列，諸如但不限於MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO:129)及MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO:130)；或其他前導序列，諸如MGWSCIILFLVATATGAHS (SEQ ID NO:131)。本發明涵蓋此項技術中已知或待鑑別之此等及任何其他前導信號(核酸及胺基酸序列)，其會使得多肽輸送至所需細胞器(例如內質網)及/或自細胞分泌。一般而言，信號肽自成熟多肽移除及/或不存在於成熟多肽中。

如本文所用，術語「殘基」意謂在蛋白質及其相關胺基酸一致性中之位置。舉例而言，天冬醯胺297 (亦稱為Asn297、亦稱為N297)為人類抗體IgG1中之殘基。

術語「類似性」為相關概念，但相比於「一致性」，其係指包括一致匹配與保守取代匹配之類似性量度。由於保守取代適用於多肽而非核酸分子，故類似性僅適用於多肽序列比較。若兩個多肽序列具有例如10/20個一致胺基酸，且剩餘物為所有非保守取代，則一致性百分比及類似性兩者將均為50%。若在同一實例中，有5個更多存在保守取代的位置，則一致性百分比仍為50%，但類似性百分比將為75% (15/20)。因此，在存在保守取代之情況下，兩個多肽序列之間的類似性程度將高於此兩個多肽序列之間的一致性百分比。

如本文所用，術語「個體」意謂哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物亦包括但不限於農耕動物(例如母牛、豬、馬、雞等)、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體處於由E-選滯蛋白結合於其配位體介導或與其相關之疾病、病症或病狀之風險下。在一些實施例中，個體為患有如本文所描述之疾病、病症或病狀(例如SCD)的患者。在一些實施例中，個體(例如患者)患有SCD、SCD變異體或SC疾病。在一些實施例中，個體(例如患者)患有HBSS、HBSC、HBS/β°thal、HBS/β⁺ thal、HBS/HPHP、HBSE或HBS-變異體基因型。

如本文所用，術語「實質上純的」意謂對象物種為存在之主要物種(亦即以莫耳計，其比組合物中之任何其他個別物種更充足)，且較佳地實質上純化的餾份為其中對象物種(例如糖蛋白，包括抗體或受體)包含所存在之所有大分子物種為至少約50%(以莫耳計)的組合物。一般而言，實質上純的組合物將包含超過約80%、更佳超過約85%、90%、95%及99%之組合物中所存在之所有大分子物種。最佳地，將對象物種純化至基本均質性(無法藉由習知偵測方法在組合物中偵測到污染物種)，其中組合物基本上由單一大分子物種組成。在某些實施例中，實質上純的材料為至少50%純(亦即，不含污染物)、更佳至少90%純、更佳至少95%純、又更佳至少98%純、且最佳至少99%純。

根據本發明之多肽或抗體「片段」或「部分」可藉由自多肽之N端及/或C端末端截短，例如藉由移除一或多個胺基酸來製造。可以此方式自N及/或C端移除一個、2、3、4、5個、至多10個、至多20個、至多30個、至多40個或更多個胺基酸。片段亦可由一或多個內部缺失生成。

如本文所用，術語「核酸序列」及「核苷酸序列」可互換地指由單體核苷酸構成或包含單體核苷酸之任何分子。核酸可為寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可為DNA或RNA(例如基因組DNA、cDNA、反義DNA、mRNA、tRNA、rRNA等)。核苷酸序列可經化學修飾或人工修飾。核苷酸序列包括肽核酸(PNA)、嗎啉(mopholino)及鎖核酸(LNA)以及二醇核酸(GNA)及蘇糖核酸(TNA)。此等序列中之各者與天然存在之DNA或RNA的區別在於分子主鏈之變化。此外，可使用硫代磷酸酯核苷酸。其他去氧核苷酸類似物包括可用於本發明之核苷酸序列中之甲基膦酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸酯、N3'-P5'-胺基磷酸酯、以及寡核糖核苷酸硫代磷酸酯及其2'-0-烯丙基類似物及2'-0-甲基核糖核苷酸甲基膦酸酯。

如本文所用，術語「核酸構築體」係指由使用重組DNA技術(例如重組核酸)產生之非天然存在之核酸分子。核酸構築體為呈單股或雙股之核酸分子，其已經修飾以含有核酸序列之區段，該等區段以自然界中未發現之方式組合及排列。核酸構築體可為「載體」(例如質體)，亦即，經設計以將外源產生之DNA傳遞至宿主細胞中的核酸分子。

如本文所用，術語「可操作地連接」係指功能關係中多核苷酸(或多肽)元件之連接。當將核酸置於與另一核酸序列具有之功能關係中時，該核酸可操作地連接。舉例而言，若啟動子或其他轉錄調節序列(例如強化子)影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或其他轉錄調節序列可操作地連接於該編碼序列。在一些實施例中，可操作地連接意謂連接之核酸序列為連續的。在一些實施例中，可操作地連接並不意謂核酸序列為連續連接的，而介入序列即在彼等連接之核酸序列之間。

如本文所用，術語「多核苷酸」(在本文中亦稱為「核酸分子」)係指由磷酸二酯鍵連接之核苷酸序列。在本文中在自5'至3'方向之方向上呈現多核苷酸。本發明之多核苷酸可為去氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子且係指核酸之所有形式，諸如雙股分子、單股分子、小或短髮夾RNA(shRNA)、微小RNA、小或短干擾RNA(siRNA)、反式剪接RNA、反義RNA。在多核苷酸為DNA分子的情況下，該分子可為基因、cDNA、反義分子或前述分子中之任一者之片段。在本文中藉由單字母碼指示核苷酸鹼基：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸(腺)嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌核苷(I)及尿嘧啶(U)。可使用熟習此項技術者所熟知之標準技術來製備本發明之多核苷酸。

如本文所用，由多核苷酸(核酸序列或核苷酸序列)編碼之術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」係指如同天然存在蛋白質之全長天然序列以及功能性子序列、經修飾形式或序列變異體，只要子序列、經修飾形式或變異體保留天然全長蛋白質之一定程度之功能即可。在本發明之方法及用途中，由多核苷酸序列編碼之該等多肽、蛋白質及肽可能但不必需與內源蛋白一致，該內源蛋白為缺陷性的或其表現不足或在經基因療法治療之個體中缺乏。

如本文所用，術語「預防(prevent/prevention)」係指延緩特定疾病、病症或病狀(例如SCD)之發作，及/或降低其之至少一種病徵及/或症狀(例如血管閉塞性危象、疼痛)之頻率及/或嚴重程度。在一些實施例中，在群體基礎上評估預防以使得若在易患疾病、病症或病狀之群體中觀測到疾病、病症或病狀之一或多個症狀之發展、頻率及/或強度之統計學上顯著的降低，則藥劑被視為「預防」特定疾病、病症或病狀。當疾病、病症或病狀之發作已延緩預定時間段時，預防可視為完成。

如本文所用，術語「重組」係指載體、多核苷酸、多肽或細胞為選殖、限制或連接步驟(例如與包含於其中之多核苷酸或多肽相關)及/或導致構築體不同於在自然界中發現之產物的其他程序之各種組合的產物。

如本文所用，術語「治療(treat/treatment)」意謂投與部分或完全緩解、改善、減輕、抑制特定疾病、病症及/或病狀(例如SCD)，延緩其發作，降低其嚴重程度及/或降低其一或多個症狀之發病率、特性及病因的療法。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於以下中之一或多者：存活率提高(死亡率降低)、組織纖維化之量降低、疾病損壞程度降低、疾病持續時間減少及/或與疾病相關之症狀的數目、程度或持續時間降低。術語包括投與本發明之化合物或藥劑以預防或延緩疾病之症狀、併發症或生化指標發作，從而緩解症狀或阻滯或抑制疾病、病狀或病症之進一步發展。治療可為預防性(以預防或延緩疾病發作或預防其臨床或亞臨床症狀之顯現)或治療性抑止或緩解在疾病顯現後之症狀。在一些實施例中，疾病、病狀或病症為SCD。抗體

「抗體」或「Ab」為能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變區中之至少一個抗原識別位點識別及結合於特異性目標或抗原(Ag) (諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等)之免疫球蛋白分子。如本文所用，術語「抗體」可涵蓋任何類型之抗體，包括但不限於單株抗體、多株抗體、保留特異性結合於既定抗原(例如E-選滯蛋白)之能力的完整抗體之抗原結合片段(或部分)、及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之組態。

抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其子類)，且該抗體不必為任何特定類別。免疫球蛋白可視其重鏈(HC)之恆定區之抗體胺基酸序列而歸為不同類別。存在五種主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等免疫球蛋白中之若干者可以進一步劃分成子類(同型)，例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ 。在一些實施例中，本發明之抗E-選滯蛋白抗體為IgG1抗體。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白的子單元結構及三維組態已熟知。

抗體可衍生於任何包括但不限於人類、猴、豬、馬、兔、狗、貓、小鼠、大鼠(例如史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rat))等之哺乳動物或其他動物，諸如鳥類(例如雞)、魚類(例如鯊魚)及駱駝(例如駱馬)。

術語「抗原」係指用於對具有免疫潛能之脊椎動物免疫接種以產生識別抗原之抗體或篩選表現庫(例如噬菌體、酵母或核糖體展示庫以及其他庫)的分子實體。在本文中，抗原為較概括之稱呼且一般意欲包括藉由抗體特異性識別之目標分子，因此包括該分子之片段或模擬物，其用於使抗體產生之免疫接種法或篩選選擇抗體之庫中。因此，對於本發明之結合於E-選滯蛋白、來自哺乳動物物種(例如人類、猴(包括石蟹獼猴)、小鼠、兔及大鼠)之全長E-選滯蛋白(包括單體及多聚體，諸如其二聚體、三聚體等)；E-選滯蛋白之經截斷及其他變異體(例如細胞外域)以及可溶性E-選滯蛋白及細胞表面表現之E-選滯蛋白的抗體而言，該等E-選滯蛋白在本文中均被稱為抗原。

抗體之「抗原結合片段 」係指全長抗體之一或多個片段，其保留特異性結合於抗原(較佳以實質上相同之結合親和力)之能力。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合片段」內涵蓋之結合片段的實例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，包含兩個由鉸鏈區處之二硫橋鍵連接之Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單個臂之VL及VH域組成之Fv片段，(v) dAb片段(Ward等人, Nature 1989; 341:544-546)，其由VH域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)、二硫鍵連接之Fv (dsFv)及抗個體基因型(抗Id)抗體及內抗體。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH係藉由單獨的基因編碼，但其可使用重組法藉由合成連接子接合，該合成連接子使得其能夠成為單個蛋白鏈，其中VL及VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv))；參見例如Bird等人, Science 1988; 242:423-426及Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 1988 USA 85:5879-5883。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」內。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL域表現於單個多肽鏈上，但使用過短而不允許相同鏈上之兩個域之間配對的連接子，由此迫使該等域與其他鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:6444-6448; Poljak等人, Structure 1994; 2:1121-1123)。

抗體「可變域」係指單獨或組合形式之抗體輕鏈(VL)之可變區或抗體重鏈(VH)之可變區。如此項技術中已知，重鏈及輕鏈之可變區各自由藉由三個「互補決定區」(CDR)連接之四個構架區(FR)組成，且促成抗體之抗原結合位點之形成。若需要對象可變區之變異體，尤其在取代CDR區外部(亦即構架區中)之胺基酸殘基的情況下，則合適的胺基酸取代，較佳保守性胺基酸取代可藉由比較對象可變區與其他抗體之可變區來鑑別，該等其他抗體之可變區含有處於與對象可變區相同之典型類別中之CDR1及CDR2序列(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 1987; 196(4): 901-917)。

可變域中之殘基通常係根據Kabat編號，Kabat提供用於抗體之編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。參見Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有對應於可變域之FR或CDR之縮短或向其中之插入的較少或額外胺基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52之後的單一胺基酸插入物(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如根據Kabat之殘基82a、82b及82c)。可藉由在抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列比對來確定所指定抗體之殘基的Kabat編號。用於指派Kabat編號之各種演算法係可用的。舉例而言，在Abysis之發行版本2.3.3 (www.abysis.org)中實施之演算法可用於將Kabat編號指派至可變區LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3、HCDR-2及HCDR-3，且AbM定義接著可用於HCDR-1。

在某些實施例中，對於CDR之確定性描繪及對於包含抗體結合位點之殘基的鑑別藉由求解抗體之結構及/或求解抗體-配位體複合物之結構來實現。在某些實施例中，其可藉由熟習此項技術者已知之多種技術中之任一者來實現，諸如X射線結晶法。在某些實施例中，可採用各種分析方法以鑑別或估計CDR區。該等方法之實例包括但不限於Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、接觸定義及構形定義。

「互補決定區」(CDR)可根據Kabat、Chothia之定義，Kabat及Chothia兩者之累計，AbM、接觸、North及/或構形定義或此項技術中熟知之任何CDR確定方法來鑑別。參見例如Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版(高變區); Chothia等人, Nature 1989; 342:877-883 (結構環結構)。特定抗體中構成CDR之胺基酸殘基之一致性可使用此項技術中熟知之方法確定。CDR之AbM定義係Kabat與Chothia之間的折衷方案且使用Oxford Molecular AbM抗體建模軟體(Accelrys®)。

CDR之「接觸」定義係基於MacCallum等人, J. Mol. Biol. 1996; 262:732-745中所示之所觀測抗原接觸。CDR之「構形」定義係基於對抗原結合作出焓貢獻之殘基(參見例如Makabe等人, J. Biol. Chem., 2008; 283:1156-1166)。North已使用CDR定義之不同較佳集合鑑別典型CDR構形(North等人, J. Mol. Biol. 2011; 406: 228-256)。在本文中被稱為CDR之「構形定義」之另一方法中，CDR之位置可經鑑別為對抗原結合作出焓貢獻之殘基(Makabe等人, J. Biol. Chem. 2008, 283:1156-1166)。其他CDR邊界定義仍可不嚴格遵循以上方法中之一者，但仍然將與Kabat CDR之至少一部分重疊，但其可根據以下預測或實驗結果而縮短或延長：特定殘基或殘基組或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合。如本文所用，CDR可指由此項技術中已知之任何方法，包括方法之組合所定義之CDR。本文中所用之方法可利用根據此等方法中任一者所定義之CDR。對於含有超過一個CDR之任何既定實施例，CDR (或抗體之其他殘基)可根據Kabat、Chothia、North、擴展、AbM、接觸及/或構形定義中之任一者定義。

如本文中關於抗體或由此特異性結合之抗原所使用，「接觸殘基」係指存在於包含至少一個重原子(亦即非氫)之抗體/抗原上之胺基酸殘基，其中該重原子在同源抗體/抗原上所存在之胺基酸殘基中之4 Å或更小範圍之重原子內。

「構架」(FR)殘基為除了CDR殘基之外的抗體可變域殘基。VH或VL域構架包含四個構架子區FR1、FR2、FR3及FR4，穿插有呈以下結構之CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

如此項技術中已知，抗體之「恆定區」係指單獨或組合形式之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。

如本文中可互換地使用之術語「IgG Fc區」、「Fc區」、「Fc域」及「Fc」係指免疫球蛋白(IgG)分子之一部分，其與藉由IgG分子之番木瓜蛋白酶(papain)消化獲得之可結晶片段相關。如本文所用，該等術語係關於排除第一恆定區免疫球蛋白域之抗體恆定區且進一步係關於彼區域之部分。因此，Fc係指IgA、IgD及IgG之最後兩個恆定區免疫球蛋白域，及IgE及IgM之最後三個恆定區免疫球蛋白域以及此等域之可撓性鉸鏈N端，或其部分。對於IgA及IgM，Fc可包括J鏈。

對於IgG，Fc包含免疫球蛋白域Cγ2及Cγ3 (C伽瑪2及C伽瑪3)及Cγ1 (C伽瑪1)與Cγ2 (C伽瑪2)之間的鉸鏈。雖然可改變Fc區之邊界，但人類IgG重鏈Fc區通常經界定以包含相對於其羧基端之殘基C226或P230，其中編號係根據Edelman等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1969; 63(1):78-85之EU指數及如描述於Kabat等人, 1991中。通常，Fc域包含人類IgG1恆定域之約胺基酸殘基236至約447。例示性人類野生型IgG1 Fc域胺基酸序列闡述於SEQ ID NO: 16及SEQ ID NO: 15 (包括視情況選用之末端離胺酸(K)殘基)中。Fc多肽可指此獨立區域，或此在抗體之情況下的區域，或其抗原結合片段，或Fc融合蛋白。

重鏈恆定域包含Fc區且進一步包含CH1結構域及鉸鏈以及IgG重鏈之CH2及CH3 (及視情況選用之IgA及IgE之CH4)域。

「功能性Fc區」擁有天然序列Fc區之至少一種效應功能。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調、B細胞活化等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域(例如，抗體可變域或其抗原結合片段)組合，且可使用此項技術中已知用於評估該等抗體效應功能之各種分析來評估。

如本文所用，「Fc受體」或「FcR」描述結合於抗體之Fc區的受體。在一些實施例中，FcγR為天然人類FcR。在一些實施例中，FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括彼等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，兩者具有主要在其細胞質域方面不同的類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM) (參見例如Daeron, Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:203-234)。FcR綜述於例如Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 1991; 9:457-92; Capel等人, Immunomethods 1994; 4:25-34;及de Haas等人, J. Lab. Clin. Med. 1995; 126:330-41中。其他FcR包括待在將來鑑別之彼等FcR，由本文術語「FcR」涵蓋。

術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人, J. Immunol. 1976; 117:587及Kim等人, J. Immunol. 1994; 24:249)且調節免疫球蛋白之穩態。與FcRn之結合之量測方法為已知的(參見例如Ghetie及Ward., Immunol. Today 1997; 18(12):592-598; Ghetie等人, Nature Biotechnology, 1997; 15(7):637- 640; Hinton等人, J. Biol. Chem. 2004; 279(8):6213-6216; WO 2004/92219)。

「人類效應細胞」為表現一或多個FcR且執行效應功能之白血球。在某些實施例中，該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球的實例包括外周血液單核細胞(PBMC)、自然殺手(NK)細胞、單核球、巨噬細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球。效應細胞可自天然來源，例如自血液分離。

如本文所用，「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指細胞毒性形式，其中結合至某些細胞毒性細胞(例如，NK細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上存在之Fc受體(FcR)上之分泌Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合於攜帶抗原之目標細胞且隨後用細胞毒素殺死目標細胞。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。為評估所關注分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析，諸如描述於美國專利第5,500,362, 5,821,337號或第6,737,056號中之彼等。適用於該等分析之效應細胞包括PBMC及NK細胞。或者或另外，可活體內評估所關注分子之ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 1998; 95:652-656中所揭示之彼等動物模型。具有變化之Fc區胺基酸序列及提高或減少之ADCC活性的額外抗體描述於例如美國專利第7,923,538號及美國專利第7,994,290號。

具有「增強的ADCC活性」之抗體係指在活體外或活體內介導ADCC方面相比於親本抗體更有效之抗體，其中抗體及親本抗體不同之處在於至少一種結構態樣，且當用於分析之該抗體及親本抗體之量基本上相同時。在一些實施例中，抗體及親本抗體具有相同胺基酸序列，但抗體經去岩藻糖基化而親本抗體經岩藻糖基化。在一些實施例中，ADCC活性將使用如本文所揭示之活體外ADCC分析測定，但涵蓋用於測定ADCC活性之其他分析或方法，例如在動物模型中等。在一些實施例中，具有增強的ADCC活性之抗體具有對Fc γ RIIIA增強的親和力。

具有「變化的」FcR結合親和力或ADCC活性之抗體為相比於親本抗體具有增強的或減弱之FcR結合活性及/或ADCC活性的抗體，其中抗體及親本抗體不同之處在於至少一種結構態樣。「展示」與FcR「提高之結合」的抗體以比親本抗體更高之親和力結合至少一種FcR。「展示」與FcR「減少之結合」的抗體以比親本抗體更低之親和力結合至少一種FcR。相比於天然序列IgG Fc區，展示與FcR減少之結合的該等抗體與FcR之結合可極少或無明顯結合，例如0-20%結合至FcR。

「對FcγRIIIA之增強的親和力」係指相較於親本抗體對FcγRIIIA具有更大之親和力的抗體，其中抗體及親本抗體不同之處在於至少一種結構態樣。

「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指目標細胞在補體存在下裂解。經典補體路徑之活化藉由補體系統(Clq)之第一組分結合於(適當子類之)抗體起始，該等抗體結合於其同源抗原。為評估補體活化，可進行CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人, J. Immunol. Methods 1996; 202: 163中所描述。例如在美國專利第6,194,551號、美國專利第7,923,538號、美國專利第7,994,290號及WO 1999/51642中描述具有變化的Fc區胺基酸序列及提高或降低之Clq結合能力的抗體。

重鏈恆定域包含Fc區且進一步包含CH1域及鉸鏈以及IgG重鏈之CH2及CH3 (及視情況選用之IgA及IgE之CH4)域。

在抗E-選滯蛋白抗體在重鏈多肽上包含C端離胺酸(K)胺基酸殘基(例如，人類IgG1重鏈包含末端離胺酸)之一些實施例中，熟習此項技術者將理解，可剪切離胺酸殘基，從而產生重鏈缺乏C端離胺酸殘基之抗體。另外，該抗體重鏈可使用不編碼離胺酸之核酸產生。因此，在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體包含重鏈，其中不存在另外存在的末端離胺酸。

在某些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc域。Fc域可衍生於IgA (例如IgA₁ 或IgA₂ )、IgD、IgE、IgM或IgG (例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 或IgG₄ )。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體為IgG抗體。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)為IgG₁ 抗體。

「Fc融合」蛋白為其中一或多個多肽可操作地連接於Fc多肽之蛋白質。Fc融合將免疫球蛋白之Fc區與融合搭配物組合。

「天然序列Fc區」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。「變異Fc區」包含藉助於至少一個胺基酸修飾而與天然序列Fc區之胺基酸序列不同但又保留天然序列Fc區之至少一種效應功能的胺基酸序列。較佳地，相比於天然序列Fc區或相比於親本多肽之Fc區，變異Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如約一個至約十個胺基酸取代；且較佳地，在天然序列Fc區中或親本多肽之Fc區中具有約一個至約五個胺基酸取代。在本文中，變異Fc區與原生序列Fc區及/或親本多肽之Fc區較佳具有至少約80%序列一致性，且與其最佳具有至少約90%序列一致性，與其更佳具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性。

「抗原決定基」係指抗體特異性結合之抗原區域或區，例如包含與抗體相互作用之殘基的區域或區，如藉由此項技術中熟知之任何方法所確定，例如藉由習知免疫分析或如本發明之實例9及10中所描述。此項技術中已知許多對蛋白質上之抗原決定基位置進行定位及表徵的方法，包括求解抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭分析、基因片段表現分析及基於合成肽之分析，如例如Harlow及Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999之第11章中所描述。在額外實例中，抗原決定基定位可用於確定抗E-選滯蛋白抗體所結合之序列。抗原決定基定位可購自各種來源，例如肽掃描系統(Pepscan Systems) (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands)。或者，在探索過程期間，抗體之生成及表徵可闡明關於所需抗原決定基之資訊。根據此資訊，接著可競爭性地篩選結合於同一抗原決定基之抗體。達成此之方法為執行競爭及交叉競爭研究以尋找彼此競爭或交叉競爭結合於E-選滯蛋白之抗體，例如競爭結合於抗原之抗體。

另外，抗E-選滯蛋白抗體所結合之抗原決定基可藉由使用衍生於E-選滯蛋白(例如，人類E-選滯蛋白序列)之重疊肽及確定抗體結合來在系統篩選中確定。根據基因片段表現分析，可將編碼E-選滯蛋白之開放閱讀框架隨機或藉由特異性基因構造分成片段且測定E-選滯蛋白之表現片段與待測試之抗體的反應性。基因片段可例如藉由PCR產生，且接著在放射性胺基酸存在下活體外轉錄且轉譯成蛋白質。接著藉由免疫沈澱及凝膠電泳測定抗體與放射性標記之E-選滯蛋白片段的結合。

某些抗原決定基亦可藉由使用呈現於噬菌體顆粒(噬菌體庫)或酵母(酵母展示)之表面上之隨機肽序列的大型庫來鑑別。或者，可在簡單結合分析中測試重疊肽片段之所定義庫與測試抗體的結合。在額外實例中，可進行抗原之突變誘發、域交換實驗及丙胺酸掃描突變誘發以鑑別抗原決定基結合所需、足夠及/或必需的殘基。

在其最詳細之程度上，用於抗原與抗體之間相互作用之抗原決定基可藉由定義存在於抗原-抗體相互作用中之原子觸點之空間座標以及關於其對結合熱力學之相對貢獻的資訊來定義。在較不詳細之程度上，抗原決定基可藉由定義抗原與抗體之間原子觸點的空間座標來表徵。在更不詳細之程度上，抗原決定基可藉由其所包含之胺基酸殘基表徵，如由特定準則所定義，例如藉由抗體與抗原中之原子(例如重原子，亦即非氫原子)之間的距離表徵。在更不詳細之程度上，抗原決定基可由功能，例如由與其他抗體之競爭結合來表徵。抗原決定基亦可更一般地如所包含之胺基酸殘基來定義，對於該等胺基酸殘基而言，經另一胺基酸取代將改變抗體與抗原之間相互作用之特徵(例如使用丙胺酸掃描)。

根據視所使用之抗原決定基定位法而定，在不同細節程度下獲得抗原決定基之描述及定義的事實，由此得出可類似地在不同細節程度下執行對同一抗原上之不同抗體之抗原決定基的比較。

若以例如由X射線晶體分析法、核磁共振(NMR)光譜法、氫/氘交換質譜分析法(H/D-MS)測定之胺基酸水準進行描述之抗原決定基含有相同胺基酸殘基組，則稱該等抗原決定基為一致的。若抗原決定基共用至少一個胺基酸，則稱該等抗原決定基為重疊的。若抗原決定基不共用胺基酸殘基，則稱該等抗原決定基為獨立(獨特)的。

可用於表徵抗E-選滯蛋白抗體之又另一方法為使用與已知結合於相同抗原之其他抗體的競爭分析(例如，如本發明之實例9中所描述)，以確定抗E-選滯蛋白抗體是否結合於與其他抗體相同之抗原決定基。競爭分析已為熟習此項技術者所熟知。若相對應的抗體之結合為互斥的，亦即一個抗體之結合排除另一抗體之同時或連續結合，則稱藉由競爭結合表徵之抗原決定基為重疊的。若抗原能夠同時容納兩個相對應抗體之結合，則稱該等抗原決定基為獨立(獨特)的。

抗原決定基可為線性的或構形的。在線性抗原決定基中，蛋白質與交互分子(諸如抗體)之間的所有相互作用點沿著蛋白質之一級胺基酸序列以線性方式存在。「非線性抗原決定基」或「構形抗原決定基」包含在對抗原決定基具有特異性之抗體所結合之抗原蛋白質內的非連續多肽(或胺基酸)。

抗體之結合親和力可表示為K_D 值，其係指特定抗原-抗體相互作用之解離速率。K_D 為解離速率(亦稱為「解離速率(k_解離 )」或「k_d 」)與締合速率(亦稱為「締合速率(k_締合 )或「k_a 」)之比率。因此，K_D 等於k_解離 /k_締合 (或k_d /k_a )且表示為莫耳濃度(M)，且K_D 愈小，結合之親和力愈強。抗體之K_D 值可使用此項技術中沿用已久之方法測定。一種用於量測K_D 之例示性方法為通常使用生物感測器系統(諸如BIACORE®系統)之表面電漿子共振(SPR)。BIAcore動力學分析包含分析抗原與在表面上具有固定分子(例如包含抗原決定基結合域之分子)之晶片的結合及解離。另一種用於測定抗體之K_D 之方法係藉由使用生物層干涉量測術(Bio-Layer Interferometry)，通常使用OCTET技術(Octet QKe系統，ForteBio)。或者或另外，亦可使用KinExA(動力排除分析)分析，其購自Sapidyne Instruments (Boise, ID)。

「優先結合」或「特異性結合」 (在本文中可互換地使用)於抗原決定基之抗體為此項技術中已充分理解之術語，且用以確定該特異性或優先結合之方法亦為此項技術中所熟知。若分子(例如蛋白質、核酸、抗體及其類似者)與特定細胞或物質之反應或締合比其與替代性細胞或物質之反應或締合更頻繁、更快速、持續時間更長及/或親和力更大，則稱該分子展現「特異性結合」或「優先結合」。若抗體與目標之結合比與其他物質之結合具有更大親和力、親合力、更容易及/或具有更長持續時間，則該抗體「特異性結合」或「優先結合」於目標。舉例而言，特異性或優先結合於E-選滯蛋白抗原決定基之抗體為比與其他E-選滯蛋白抗原決定基或非E-選滯蛋白抗原決定基(包括P-選滯蛋白及/或L-選滯蛋白抗原決定基)之結合以更大親和力、親合力、更容易及/或以更長持續時間結合特定抗原決定基的抗體。因此，在指定分析條件下，特定結合部分(例如抗體或其抗原結合片段或受體或其配位體結合片段)優先結合於特定目標分子且不會大量結合於測試樣品中存在之其他組分。一般而言，但未必，提及結合意謂優先結合。

各種分析形式可用於選擇特異性結合所關注分子之抗體或肽。舉例而言，固相ELISA免疫分析(包括競爭結合ELIA)、AlphaLISA®免疫分析(Perkin-Elmer)、免疫沈澱、BIAcore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)、螢光活化細胞分選(FACS)、Octet™ (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA)及西方墨點分析等許多分析法可用於鑑別與抗原特異性反應之抗體或與同源配位體或結合搭配物特異性結合之受體或其配位體結合片段。通常，特異性或選擇性反應將處於至少兩倍的背景信號或雜訊下，且更通常為處於超過10倍的背景、超過50倍的背景、超過1000倍的背景或更多倍下。當平衡解離常數(K_D )≤1 µM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM或≤100 pM時，則稱抗體「特異性結合」抗原。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體以＜70 nM(例如68.4 +/- 3.18 nM)之K_D 結合E-選滯蛋白(例如人類E-選滯蛋白)。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體以＜68 nM(例如64.9 +/- 1.13 nM)之K_D 結合E-選滯蛋白(例如石蟹獼猴E-選滯蛋白)。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體以選自由以下組成之群之K_D 結合人類E-選滯蛋白：約92.85 nM、約70.3 nM、約65.2 nM、約61.8 nM、約60.5 nM、約68.0 nM、約21.6 nM、約324 nM、約54.4 nM、約628.5 nM及2940 nM。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體以選自由以下組成之群之K_D 結合石蟹獼猴E-選滯蛋白：約138.5 nM、約78.3 nM、約76.5 nM、約81.5 nM、約67.8 nM、約45.8 nM、約243.5 nM、約45.4 nM、約492 nM及3145 nM。

如本文所使用之關於抗體之術語「競爭」意謂第一抗體或其抗原結合片段與抗原之結合減少同一抗原藉由第二抗體或其抗原結合片段之後續結合。替代方案可能但不必如此：在第一抗體存在下第二抗體與抗原之結合亦可偵測地減少。亦即，第一抗體可抑制第二抗體與抗原之結合，而第二抗體並不抑制第一抗體與其對應抗原決定基之結合。然而，當各抗體無論在相同、較大或較小的程度上可偵測地抑制另一抗體與其同源抗原決定基或配位體之結合時，則稱該等抗體為彼此「交叉競爭」結合其對應抗原決定基。本發明涵蓋競爭抗體及交叉競爭抗體兩者。無論該競爭或交叉競爭發生之機制(例如位阻、構形變化或結合於共同抗原決定基或其片段)如何，熟習此項技術者基於本文中所提供之教示內容將瞭解，該等競爭及/或交叉競爭抗體涵蓋於且可適用於本文中所揭示之方法中。

標準競爭分析可用於確定兩個抗體是否與彼此競爭。一種用於抗體競爭之適合分析涉及使用Biacore技術，其可使用表面電漿子共振(SPR)技術，通常使用生物感測器系統(諸如BIACORE系統)量測相互作用之程度。舉例而言，SPR可用於活體外競爭性結合抑制分析，以確定一個抗體抑制第二抗體之結合的能力。用於量測抗體競爭之另一分析使用基於ELISA之方法。

此外，基於抗體之競爭將該等抗體「分組(binning)」之高通量方法描述於國際專利申請案第WO2003/48731號中。若一種抗體(或片段)減少另一抗體(或片段)與E-選滯蛋白之結合，則存在競爭。舉例而言，可使用依序結合競爭分析，其中不同抗體經依序添加。可添加第一抗體以達成接近飽和之結合。接著，添加第二抗體。若未偵測到第二抗體與E-選滯蛋白之結合，或與在不存在第一抗體之情況下的平行分析(該值可設定為100%)相比，該結合顯著減少(例如至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%之減少)，則將兩種抗體視為彼此競爭。

術語「互補位」之定義藉由將視角逆轉而衍生於以上「抗原決定基」之定義。因此，術語「互補位」係指抗體上特異性結合抗原之區域或區，亦即抗體上與抗原(E-選滯蛋白或其片段)進行接觸之胺基酸殘基作為「觸點」在本文別處定義。給定抗體/抗原對之互補位可藉由常規方法來鑑別。舉例而言，可將抗體及目標分子組合且可使抗體/抗原複合物結晶。可測定複合物之晶體結構且將其用於鑑別抗體與其目標之間相互作用的特定位點。

在一些實施例中，抗體為「變異抗體」。變異抗體可包含來自本文所揭示之特定序列及片段，且尤其表2中之1、2、3、4、5、至多10、至多20、至多30或更多個胺基酸取代及/或缺失及/或插入。「缺失」變異體可包含缺失個別胺基酸；缺失較小胺基酸組，諸如1、2、3、4或5個胺基酸；或缺失較大胺基酸區，諸如缺失特定胺基酸域或缺失其他特徵。「插入」變異體可包含插入個別胺基酸；插入較小胺基酸組，諸如1、2、3、4或5個胺基酸；或插入較大胺基酸區，諸如插入特定胺基酸域或插入其他特徵。「取代」變異體較佳涉及用相同數目之胺基酸置換一或多個胺基酸及進行保守性胺基酸取代。舉例而言，胺基酸可經具有類似特性之替代胺基酸取代，例如另一鹼性胺基酸、另一酸性胺基酸、另一中性胺基酸、另一帶電荷胺基酸、另一親水性胺基酸、另一疏水性胺基酸、另一極性胺基酸、另一芳族胺基酸或另一脂族胺基酸。

取代變異體將抗體分子中之至少一個胺基酸殘基移除且將不同殘基插入其位置。最引人關注之取代型突變誘發之位點包括高變區，但亦涵蓋構架變化。保守性取代顯示於表1中。若該等取代致使生物活性變化，則可引入以下所示之命名為「例示性取代」或如下文關於胺基酸種類所進一步描述之更實質性的變化，且篩選產物。表1 胺基酸及取代

原始殘基	保守性取代	例示性取代
丙胺酸ALA (A)	Val	Val；Leu；Ile
精胺酸Arg (R)	Lys	Lys；Gln；Asn
天冬醯胺Asn (N)	Gln	Gln；His；Asp，Lys；Arg
天冬胺酸Asp (D)	Glu	Glu；Asn
半胱胺酸Cys (C)	Ser	Ser；Ala
麩醯胺酸Gln (Q)	Asn	Asn；Glu
麩胺酸Glu (E)	Asp	Asp；Gln
甘胺酸Gly (G)	Ala	Ala
組胺酸His (H)	Arg	Asn；Gln；Lys；Arg
異白胺酸Ile (I)	Leu	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸
白胺酸Leu (L)	Ile	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
離胺酸Lys (K)	Arg	Arg；Gln；Asn
甲硫胺酸Met (M)	Leu	Leu；Phe；Ile
苯丙胺酸Phe (F)	Tyr	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
脯胺酸Pro (P)	Ala	Ala
絲胺酸Ser (S)	Thr	Thr
蘇胺酸Thr (T)	Ser	Ser
色胺酸Trp (W)	Tyr	Tyr；Phe
酪胺酸Tyr (Y)	Phe	Trp；Phe；Thr；Ser
纈胺酸Val (V)	Leu	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸

抗體生物特性之實質修飾係藉由選擇在維持以下之作用方面顯著不同的取代來實現：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如呈β片狀或螺旋狀構形；(b)目標位點處分子之電荷或疏水性；或(c)側鏈之主體。基於共同側鏈特性將天然存在之殘基劃分成以下群組： i. 非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； ii. 極性不帶電荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； iii. 酸性(帶負電)：ASP、Glu； iv. 鹼性(帶正電)：Lys、Arg； v. 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及 vi. 芳族：Trp、Tyr、Phe、His。

非保守性取代藉由將此等種類之一者中之一員換成另一種類來進行。

舉例而言，可進行之一種類型之取代為將抗體中可化學反應之一或多個半胱胺酸改變成諸如但不限於丙胺酸或絲胺酸之另一殘基。舉例而言，可存在非典型半胱胺酸之取代。取代可在抗體的可變域之CDR或構架區或恆定區中進行。在一些實施例中，半胱胺酸為典型的。不參與維持抗體之適當構形的任何半胱胺酸殘基一般亦可經絲胺酸取代，以提高分子之氧化穩定性且防止異常交聯。反之，尤其當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時，可將半胱胺酸鍵添加至抗體以提高其穩定性。

在稱為「生殖系化」之過程中，VH及VL序列中之某些胺基酸可突變以匹配在生殖系VH及VL序列中天然存在之彼等胺基酸。特定言之，VH及VL序列中之構架區之胺基酸序列可突變以匹配生殖系序列，從而降低投與抗體時免疫原性之風險。如本文所用，術語「生殖系」係指抗體基因及基因片段在其經由生殖細胞自父代傳遞至後代時的核苷酸序列及胺基酸序列。此生殖系序列與編碼抗體之核苷酸序列的區別在於成熟B細胞，其在B細胞成熟過程期間已經由於重組及超突變事件而改變。「利用」特定生殖系之抗體具有大部分與該生殖系核苷酸序列或與其所指定之胺基酸序列緊密比對的核苷酸或胺基酸序列。與生殖系序列相比，該等抗體頻繁突變。人類VH及VL基因之生殖系DNA序列係此項技術中已知的(參見例如「Vbase」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat, E. A.等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson等人, J. Mol. Biol. 1992; 227:776-798;及Cox等人, Eur. J. Immunol. 1994; 24:827-836)。對於 E - 選滯蛋白之抗體

本發明提供結合於E-選滯蛋白之抗體及其抗原結合片段。E-選滯蛋白亦稱為CD62抗原樣家族成員E(CD62E)、內皮-白血球黏著分子1 (ELAM -1)或白血球-內皮細胞黏著分子2 (LECAM2)。

如本文所用，術語「E-選滯蛋白」包括人類E-選滯蛋白之變異體、同功異型物、同源物、直系同源物及旁系同源物。在一些實施例中，本文中所揭示之抗體或其抗原結合片段與來自除人類以外之物種的E-選滯蛋白(諸如石蟹獼猴之E-選滯蛋白)以及不同形式之E-選滯蛋白交叉反應。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可對人類E-選滯蛋白具有完全特異性且可不展現物種交叉反應性(例如不結合小鼠E-選滯蛋白)或其他類型之交叉反應性(例如不結合P-選滯蛋白及/或L-選滯蛋白)。如本文所用，除非上下文另外規定，否則術語E-選滯蛋白係指天然存在之人類E-選滯蛋白。因此，「E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段」、「抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段」或其他類似名稱意謂特異性及/或優先與E-選滯蛋白，其同功異型物、片段或衍生物締合、結合或反應的任何抗體或其抗原結合片段(如本文所定義)。如由UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P16581(胺基酸22-610)所表示之人類E-選滯蛋白之全長成熟形式在本文中以SEQ ID NO:132提供。如由UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號Q00690(胺基酸22-612)所表示之小鼠E-選滯蛋白之全長成熟形式在本文中以SEQ ID NO:134提供。如由UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號G8F370(胺基酸22-610)所表示之石蟹獼猴E-選滯蛋白之全長成熟形式在本文中以SEQ ID NO:201提供。

E-選滯蛋白表現於內皮細胞上，L-選滯蛋白組成型表現於白血球微絨毛上，且P-選滯蛋白儲存於血小板之α-顆粒及內皮細胞之懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade body)中(Tedder等人, FASEB J. 1995; 9:866-873; Kanas等人, Blood 1996; 88:3259-3287)。該等選滯蛋白全部結合於醣蛋白或醣脂上具有唾液酸路易斯(sLex)決定子的碳水化合物結構(Chase等人, Ann. Biomed. Eng. 2012; 40(4):849-885)。P-選滯蛋白及L-選滯蛋白亦需要對配位體進行硫酸化以用於最佳結合，而結合於配位體之E-選滯蛋白更能容許僅需要唾液酸路易斯決定子。P-選滯蛋白醣蛋白配位體-1 (PSGL-1)表現於白血球上且結合於所有選滯蛋白。E-選滯蛋白亦與包括L-選滯蛋白配位體、CD44及E-選滯蛋白配位體-1 (ESL-1)之配位體相互作用(Chase等人, Ann. Biomed. Eng. 2012; 40(4):849-885; Hidalgo等人, Immunity 2007; 26(4):477-489)。

E-選滯蛋白藉由內皮細胞之表現需要回應於低氧或發炎刺激之新蛋白質合成。E-選滯蛋白對於嗜中性白血球黏著於內皮及在內皮上生成活化信號波為關鍵的，該等信號產生經活化αMβ2整合素之極化表現(Hidalgo等人, Nat. Med. 2009; 15:384-391; Pruenster等人, Nat. Commun. 2015; 6:6915; Manwani及Frenette, Blood 2014; 122:3892-3898)。E-選滯蛋白缺乏型小鼠未展現可與野生型小鼠區分之明顯表型(Labow等人, Immunity 1994; 1:709-720)。

除內皮細胞E-選滯蛋白以外，在循環中發現可溶性E-選滯蛋白(sE-選滯蛋白)。sE-選滯蛋白釋放至循環中之機制可為酶促裂解或由受損或活化內皮細胞之排出引起；然而，尚不知曉精確機制(Roldán等人, Thromb. Haemost. 2003; 90:1007-1020)。sE-選滯蛋白之濃度似乎與其在內皮細胞之表面上的表現相關，因此血漿sE-選滯蛋白濃度可為內皮細胞損傷或活化之標記(Leeuwenberg等人, Immunology 1992; 77(4):543-549; Roldán等人, Thromb. Haemost. 2003; 90:1007-1020)。已發現在多種疾病病況中有增加水準的循環可溶性E-選滯蛋白含量，該等疾病病況包括高血壓、糖尿病及高脂質血症(Roldán等人, Thromb. Haemost. 2003; 90:1007-1020)。Kato等人研究了160個SCD患者及41個對照個體，且發現與對照相比，可溶性E-選滯蛋白在SCD患者血漿中顯著升高(中值74.6. 41.5 ng/mL，p＜0.001) (British J. Haem. 2005; 130:943-953)。輕度及中度之肺高血壓水準與sE-選滯蛋白之線性濃度顯著相關且在SCD患者中具有增加之早期死亡相對風險(RR為4.2；95% CI 2.0,8.9) (Kato等人)。

較佳地，本發明之抗體及其抗原結合片段與E-選滯蛋白結合但不與其他選滯蛋白(例如，P-選滯蛋白、L-選滯蛋白)結合或以較低親和力結合。在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段特異性結合E-選滯蛋白，且更佳地，特異性結合人類及/或石蟹獼猴E-選滯蛋白。本發明亦提供包含該等抗體及其抗原結合片段之組合物，以及該等抗體之用途，包括治療性及醫藥用途。

抗E-選滯蛋白抗體(較佳地，高親和力抗體(例如特異性抗體))可在血管系統及多個組織區室中有效，其中E-選滯蛋白表現於內皮細胞之表面上或以可溶性形式發現，且認為與表現E-選滯蛋白配位體之目標細胞(例如，嗜中性白血球、單核球、嗜酸性球、記憶效應T樣淋巴球、自然殺手細胞、骨髓細胞)相互作用。本發明之抗體及其抗原結合片段具有抑制E-選滯蛋白與配位體之結合的潛力，該等配位體包括例如具有唾液酸路易斯(sLex)決定子之糖蛋白或糖脂(例如α2,3唾液酸化及α1,3或α1,4岩藻糖基化四醣類唾液酸路易斯x)、唾液酸路易斯A決定子、E-選滯蛋白配位體-1 (ESL-1)、L-選滯蛋白、CD44、P-選滯蛋白糖蛋白配位體-1 (PSGL-1)、締合溶酶體之膜蛋白1 (LAMP1)、締合溶酶體之膜蛋白2 (LAMP2)、死亡-3 (DR3)及αMβ2整合素(CD11b/CD18；Mac-1) (Chase等人, Annals Biomed. Engin. 2012; 40(4): 849-859)。不希望受任何特定理論束縛，E-選滯蛋白細胞配位體相互作用之阻斷抑制對內皮之白血球(例如嗜中性白血球)黏著，從而防止細胞聚集體阻斷血流且引起VOC。

中和或「阻斷」抗體係指與E-選滯蛋白結合之抗體(i)干擾、限制或抑制E-選滯蛋白或E-選滯蛋白片段與E-選滯蛋白配位體(諸如sLex決定子)之間的相互作用；及/或(ii)導致對E-選滯蛋白結合之至少一種生物功能的抑制。確定藉由本發明之抗體進行中和之分析在本文別處描述且為此項技術中熟知的。

E-選滯蛋白之「生物功能」或「生物活性」意謂包括白血球繫鏈、白血球向內皮細胞之緩慢滾動及活化白血球對內皮細胞之穩定黏著、在發炎部位處之選擇性及高效外滲信號傳導。E-選滯蛋白之「生物功能」或「生物活性」包括介導以下方面之增加：CD18整合素之親和力及親合力，以支持PMN減速及運輸至急性發炎部位；胞溶質鈣；酪胺酸磷酸化，以活化p38 MAP激酶及Syk激酶；以及其他現在此項技術中已知或隨後鑑別之方面。E-選滯蛋白之生物功能或生物活性可(但未必)由E-選滯蛋白與其配位體之間的相互作用介導。

本發明包括可調節E-選滯蛋白之生物活性的抗體或其抗原結合片段。亦即，本發明包括經分離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合E-選滯蛋白且調節至少一種可偵測E-選滯蛋白活性，使得該抗體：(a)減少白血球繫鏈至內皮細胞；(b)減少穩定黏著於內皮細胞之活化；(c)減少白血球緩慢滾動直至阻滯；(d)減少白血球之有效跨內皮遷移；(e)降低CD18整合素之親和力及親合力；(f)減少運輸白血球至急性發炎部位；(g)減少胞溶質鈣；(h)減少使p38 MAP激酶及Syk激酶活化之酪胺酸磷酸化；(i)減少自血液募集血小板及白血球至血管內皮；及/或(j)並不產生促發炎環境。

E-選滯蛋白之生物活性可在活體外靜態中和結合分析中，使用E-選滯蛋白(例如可溶性E-選滯蛋白或表現E-選滯蛋白之CHO細胞)及配位體(例如可溶性唾液酸路易斯配位體或細胞表面表現之配位體(例如在HL-60細胞上))來評估。E-選滯蛋白之結合亦可在此項技術中已知及本發明之實例部分所示之生理流動分析中，使用可溶性或細胞表面表現之蛋白質來評估。中和抗體預防E-選滯蛋白結合之能力亦可藉由在不存在或存在增加濃度之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之情況下，將表現E-選滯蛋白(例如人類、石蟹獼猴)之細胞與可溶性(唾液酸路易斯抗原)或細胞表面表現(例如在HL-60細胞、HUVEC、CLMEC上)之E-選滯蛋白配位體一起培育來評估。

在一些實施例中，本發明之抗E-選滯蛋白抗體涵蓋一種抗體，其與具有如SEQ ID NO:11所示之重鏈可變區之胺基酸序列及如SEQ ID NO:5所示之輕鏈可變區之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段，競爭結合於人類E-選滯蛋白及/或結合同一抗原決定基。

在一些實施例中，本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段涵蓋抑制或減少E-選滯蛋白與至少一種E-選滯蛋白配位體(例如，具有唾液酸路易斯(sLex)決定子之糖蛋白或糖脂(例如α2,3唾液酸化及α1,3或α1,4岩藻糖基化四醣類唾液酸路易斯x)、唾液酸路易斯A決定子、ESL-1、L-選滯蛋白、CD44、PSGL-1、LAMP1、LAMP2、DR3及αMβ2整合素(CD11b/CD18；Mac-1))之結合的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，本發明涵蓋一種抗體或其抗原結合片段，其與具有如SEQ ID NO:11所示之重鏈可變區之胺基酸序列及如SEQ ID NO:5所示之輕鏈可變區之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段，競爭抑制E-選滯蛋白與配位體之結合。

在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包括IgG1重鏈恆定區，例如如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13(無C端離胺酸)所示之抗E-選滯蛋白重鏈。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包括κ輕鏈恆定區，例如如SEQ ID NO:1所示之抗E-選滯蛋白輕鏈。

本發明之抗E-選滯蛋白抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異結合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體片段之融合蛋白(例如域抗體)、人類化抗體及包含具有所需特異性之抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任一其他經修飾組態，該經修飾組態包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及經共價修飾之抗體。抗體可為鼠類、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合或人類化抗體)。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體為人類或人類化抗體。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體為嵌合抗體。

表2提供如本文所描述之嵌合及人類化抗E-選滯蛋白抗體的胺基酸及核苷酸序列。一般而言，除非特定指示，否則本發明之抗E-選滯蛋白抗體可包括一或多個CDR之任何組合。在一些實施例中，本發明之抗E-選滯蛋白抗體可包括如表2中所示之一或多個VH及/或VL序列與由表3中之SEQ ID NO:定義之特定抗體的任何組合。使用Kabat定義在經延長H1之情況下定義抗E-選滯蛋白VH及VL之CDR。對於HCDR-1，最末殘基包括H36位置之前的任何插入物(亦即，H35a、H35b、H35c等)。CDR定義如下：HCDR-1(H26至H35c)、HCDR-2(H50至H65)、HCDR-3(H95至H102)、LCDR-1(L24至L34)、LCDR-2(L50至L56)及LCDR-3(L89至L87)。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含HC、LC、VL域及/或VH域，其包含與表2之胺基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含HC、LC、VL域及/或VH域，其由與表2之核酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核酸序列編碼。

表 2 . E-選滯蛋白肽、抗E-選滯蛋白抗體及其片段之序列。

SEQ	描述	序列
1	1444_最佳化_L (LC)	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQNIE RYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ DNAWPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
2	1444_最佳化_L CDR_L1	KTSQNIERYL N
3	1444_最佳化_L CDR_L2	AASSLQS
4	1444_最佳化_L CDR_L3	LQDNAWPLT
5	1444_最佳化_L FV_L (VL)	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQNIE RYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ DNAWPLTFGQ GTKVEIK
6	1444_最佳化_L FW_L4	FGQGTKVEIK
7	1444_最佳化_H (HC) (具有C端離胺酸(K))	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVTGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
8	1444_最佳化_H CDR_H1	GYAIRSAYMH
9	1444_最佳化_H CDR_H2	RIDPANGNTI YVDSVTG
10	1444_最佳化_H CDR_H3	DLYSTSEY
11	1444_最佳化_H FV_H (FV)	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVTGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSS
12	1444_最佳化_H FW_H4	WGQGTLVTVS S
13	1444_最佳化_H (HC) (不具有C端離胺酸(K))	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVTGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
14	1444_最佳化_L CL	RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
15	1444_最佳化_H CH (具有C端離胺酸(K))	ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
16	1444_最佳化_H CH (不具有C端離胺酸(K))	ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGA PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
17	0841_人類化1_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQNIN RYLNWYQQKP GKAPKLLIYN ANSLQTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ DNSWPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
18	0841_人類化1_L CDR_L1	KTSQNINRYL N
19	0841_人類化1_L CDR_L2	NANSLQT
20	0841_人類化1_L CDR_L3	LQDNSWPLT
21	0841_人類化1_L FV_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQNIN RYLNWYQQKP GKAPKLLIYN ANSLQTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ DNSWPLTFGQ GTKVEIK
22	0841_人類化1_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYNIR SSYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY AEKFKIRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
23	0841_人類化1_H CDR_H1	GYNIRSSYMH
24	0841_人類化1_H CDR_H2	RIDPANGNTI YAEKFKI
25	0841_人類化1_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYNIR SSYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY AEKFKIRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSS
26	0978_人類化2_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQNIN RYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ DNSWPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
27	0978_人類化2_L FV_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQNIN RYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ DNSWPLTFGQ GTKVEIK
28	0978_人類化2_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYNIR SSYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVKGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
29	0978_人類化2_H CDR_H2	RIDPANGNTI YVDSVKG
30	0978_人類化2_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYNIR SSYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVKGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSS
31	0164_嵌合體_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKTSQNIN RYLNWYQQKL GEAPKLLIYN ANSLQTGIPS RFSASGSGTD FTLTINSLQP EDVATYFCLQ DNSWPLTFGS GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
32	0164_嵌合體_L FV_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKTSQNIN RYLNWYQQKL GEAPKLLIYN ANSLQTGIPS RFSASGSGTD FTLTINSLQP EDVATYFCLQ DNSWPLTFGS GTKLEIK
33	0164_嵌合體_L FW_L4	FGSGTKLEIK
34	0164_嵌合體_H	EVQLQQSGAE FGKPGTSVKL SCKVSGYNIR SSYMHWVNQR PGKGLEWIGR IDPANGNTIY AEKFKIKAIL TADSSSNTAY MQLSQLKSDD TAIYFCAMDL YSTSEYWGQG VMVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
35	0164_嵌合體_H FV_H	EVQLQQSGAE FGKPGTSVKL SCKVSGYNIR SSYMHWVNQR PGKGLEWIGR IDPANGNTIY AEKFKIKAIL TADSSSNTAY MQLSQLKSDD TAIYFCAMDL YSTSEYWGQG VMVTVSS
36	0164_嵌合體_H FW_H4	WGQGVMVTVS S
37	1448_最佳化_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVKERFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
38	1448_最佳化_H CDR_H2	RIDPANGNTI YVDSVKE
39	1448_最佳化_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVKERFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSS
40	1284_最佳化_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VESVEGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
41	1284_最佳化_H CDR_H2	RIDPANGNTI YVESVEG
42	1284_最佳化_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VESVEGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSS
43	1282_最佳化_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVEGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
44	1282_最佳化_H CDR_H2	RIDPANGNTI YVDSVEG
45	1282_最佳化_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYAIR SAYMHWVRQA PGKGLEWVAR IDPANGNTIY VDSVEGRFTI SADNAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAMDL YSTSEYWGQG TLVTVSS
46	0525_人類化_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQTVG INVDWYQQKP GKAPKLLIYG ASNRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYCCLQ YGSIPHTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
47	0525_人類化_L CDR_L1	KASQTVGINV D
48	0525_人類化_L CDR_L2	GASNRHT
49	0525_人類化_L CDR_L3	LQYGSIPHT
50	0525_人類化_L FV_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQTVG INVDWYQQKP GKAPKLLIYG ASNRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYCCLQ YGSIPHTFGQ GTKVEIK
51	0525_人類化_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLT GYYMQWVRQA PGKGLEWMGF IRSSGSTEYN SEFKSRFTIS RDNAKNSVYL QMNSLRAEDT AVYYCARCPY KYSSFVYVGV MDAWGQGTLV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE AAGAPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG
52	0525_人類化_H CDR_H1	GFSLTGYYMQ
53	0525_人類化_H CDR_H2	FIRSSGSTEY NSEFKS
54	0525_人類化_H CDR_H3	CPYKYSSFVY VGVMDA
55	0525_人類化_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLT GYYMQWVRQA PGKGLEWMGF IRSSGSTEYN SEFKSRFTIS RDNAKNSVYL QMNSLRAEDT AVYYCARCPY KYSSFVYVGV MDAWGQGTLV TVSS
56	0039_嵌合體_L	EIVMTQSPTS MSTSIGERVT LNCKASQTVG INVDWYQQTP GQPPKLLIYG ASNRHTGVPD RFTGSGFGRD FTLTISNVEA EDLAVYCCLQ YGSIPHTFGP GTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
57	0039_嵌合體_L FV_L	EIVMTQSPTS MSTSIGERVT LNCKASQTVG INVDWYQQTP GQPPKLLIYG ASNRHTGVPD RFTGSGFGRD FTLTISNVEA EDLAVYCCLQ YGSIPHTFGP GTKLELK
58	0039_嵌合體_L FW_L4	FGPGTKLELK
59	0039_嵌合體_H	QVQLKETGPG LVQPTQTLSI TCTVSGFSLT GYYMQWVRQT PGKGLEWMGF IRSSGSTEYN SEFKSRLSIS RDTSKNQVFL KMNSLKTEDT GVYYCARCPY KYSSFVYVGV MDAWGQGAPV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE AAGAPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
60	0039_嵌合體_H FV_H	QVQLKETGPG LVQPTQTLSI TCTVSGFSLT GYYMQWVRQT PGKGLEWMGF IRSSGSTEYN SEFKSRLSIS RDTSKNQVFL KMNSLKTEDT GVYYCARCPY KYSSFVYVGV MDAWGQGAPV TVSS
61	0039_嵌合體_H FW_H4	WGQGAPVTVS S
62	0265_0254_人類化_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFSIS TYNVHWLRQA PGKGLEWMGM MWSGGSPDYN SALKSRFTIS RDTAKNSVYL QMNSLRAEDT AVYYCARWGG GFDYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPG
63	0265_0254_人類化_H CDR_H1	GFSISTYNVH
64	0265_0254_人類化_H CDR_H2	MMWSGGSPDY NSALKS
65	0265_0254_人類化_H CDR_H3	WGGGFDY
66	0265_0254_人類化_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGFSIS TYNVHWLRQA PGKGLEWMGM MWSGGSPDYN SALKSRFTIS RDTAKNSVYL QMNSLRAEDT AVYYCARWGG GFDYWGQGTL VTVSS
67	0265_0254_人類化_L	DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASHSIG TNLHWYQQKP GKAPKLLIYF TSQSISGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ TQSWPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
68	0265_0254_人類化_L CDR_L1	RASHSIGTNL H
69	0265_0254_人類化_L CDR_L2	FTSQSIS
70	0265_0254_人類化_L CDR_L3	QQTQSWPLT
71	0265_0254_人類化_L FV_L	DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASHSIG TNLHWYQQKP GKAPKLLIYF TSQSISGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ TQSWPLTFGQ GTKVEIK
72	0158_嵌合體_L	DIVLTQSPTT LSVTPGETVS LSCRASHSIG TNLHWYQQKT NESPRLLIKF TSQSISGIPS RFSASGSGTD FTLNINNVEF DDVSSYFCQQ TQSWPLTFGS GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
73	0158_嵌合體_L FV_L	DIVLTQSPTT LSVTPGETVS LSCRASHSIG TNLHWYQQKT NESPRLLIKF TSQSISGIPS RFSASGSGTD FTLNINNVEF DDVSSYFCQQ TQSWPLTFGS GTKLEIK
74	0158_嵌合體_H	QVQLKESGPG LVQPSETLSL TCTVSGFSIS TYNVHWLRQP PGKGLEWMGM MWSGGSPDYN SALKSRLSIS RDTSKNQVFL KMNSLQSEDT TTYYCARWGG GFDYWGQGVM VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGAPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
75	0158_嵌合體_H FV_H	QVQLKESGPG LVQPSETLSL TCTVSGFSIS TYNVHWLRQP PGKGLEWMGM MWSGGSPDYN SALKSRLSIS RDTSKNQVFL KMNSLQSEDT TTYYCARWGG GFDYWGQGVM VTVSS
76	0929_0548_人類化_H	QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKVSGYNIR STYMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPANGNTIY AEKFKRRVTL TRDTSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAMEV RVSFEYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
77	0929_0548_人類化_H CDR_H1	GYNIRSTYMH
78	0929_0548_人類化_H CDR_H2	RIDPANGNTI YAEKFKR
79	0929_0548_人類化_H CDR_H3	EVRVSFEY
80	0929_0548_人類化_H FV_H	QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKVSGYNIR STYMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPANGNTIY AEKFKRRVTL TRDTSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAMEV RVSFEYWGQG TLVTVSS
81	0929_0548_人類化_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNIN KYLDWYQQKP GKAPKLLIYY TNNLHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCLQ HDSGYTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
82	0929_0548_人類化_L CDR_L1	KASQNINKYL D
83	0929_0548_人類化_L CDR_L2	YTNNLHT
84	0929_0548_人類化_L CDR_L3	LQHDSGYT
85	0929_0548_人類化_L FV_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNIN KYLDWYQQKP GKAPKLLIYY TNNLHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCLQ HDSGYTFGQG TKVEIK
86	0159_嵌合體_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKASQNIN KYLDWYQQKL GEGPKLLIYY TNNLHTGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYFCLQ HDSGYTFGAG TKLELKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
87	0159_嵌合體_L FV_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKASQNIN KYLDWYQQKL GEGPKLLIYY TNNLHTGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYFCLQ HDSGYTFGAG TKLELK
88	0159_嵌合體_L FW_L4	FGAGTKLELK
89	0159_嵌合體_H	EVQLQQSGAE LGKPGTSVKL SCKVSGYNIR STYMHWVSQR PGKGLEWIGR IDPANGNTIY AEKFKRKATL TADTSSNTAY MQLSQLKSDD RAIYFCAMEV RVSFEYWGQG VMVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
90	0159_嵌合體_H FV_H	EVQLQQSGAE LGKPGTSVKL SCKVSGYNIR STYMHWVSQR PGKGLEWIGR IDPANGNTIY AEKFKRKATL TADTSSNTAY MQLSQLKSDD RAIYFCAMEV RVSFEYWGQG VMVTVSS
91	0955_0300_人類化_H	QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKVSGYSIR STYMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPANGNTIY AERFKNRVTL TADTSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAVEI LGIFDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
92	0955_0300_人類化_H CDR_H1	GYSIRSTYMH
93	0955_0300_人類化_H CDR_H2	RIDPANGNTI YAERFKN
94	0955_0300_人類化_H CDR_H3	EILGIFDY
95	0955_0300_人類化_H FV_H	QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKVSGYSIR STYMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPANGNTIY AERFKNRVTL TADTSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAVEI LGIFDYWGQG TLVTVSS
96	0955_0300_人類化_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNID KYLDWYQQKP GKAPKLLMYN TNSLHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ HNSGYTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
97	0955_0300_人類化_L CDR_L1	KASQNIDKYL D
98	0955_0300_人類化_L CDR_L2	NTNSLHT
99	0955_0300_人類化_L CDR_L3	LQHNSGYT
100	0955_0300_人類化_L FV_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQNID KYLDWYQQKP GKAPKLLMYN TNSLHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ HNSGYTFGQG TKVEIK
101	0170_嵌合體_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKASQNID KYLDWYQQKL GEAPKLLMYN TNSLHTGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYFCLQ HNSGYTFGAG TKLELKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC
102	0170_嵌合體_L FV_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKASQNID KYLDWYQQKL GEAPKLLMYN TNSLHTGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYFCLQ HNSGYTFGAG TKLELK
103	0170_嵌合體_H	EVQLQQSGAE LGKPGTSVKL SCKVSGYSIR STYMHWVNQR PGKGLEWVGR IDPANGNTIY AERFKNKATL TADTSSNTAY MQLSQLKSDD TAIYFCAVEI LGIFDYWGQG VMVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
104	0170_嵌合體_H FV_H	EVQLQQSGAE LGKPGTSVKL SCKVSGYSIR STYMHWVNQR PGKGLEWVGR IDPANGNTIY AERFKNKATL TADTSSNTAY MQLSQLKSDD TAIYFCAVEI LGIFDYWGQG VMVTVSS
105	0564_人類化_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQHIN RYLNWYQQKP GKAPKLLIYD ANNLQTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ HNSWPNTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
106	0564_人類化_L CDR_L1	KASQHINRYL N
107	0564_人類化_L CDR_L2	DANNLQT
108	0564_人類化_L CDR_L3	LQHNSWPNT
109	0564_人類化_L FV_L	DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQHIN RYLNWYQQKP GKAPKLLIYD ANNLQTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYFCLQ HNSWPNTFGQ GTKVEIK
110	0564_人類化_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGYKIR SSYMHWVRQA PGKGLEWIGR IDPANGNTIY GDKFKSRFTL SSDTAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAIDI GTTFDYWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG
111	0564_人類化_H CDR_H1	GYKIRSSYMH
112	0564_人類化_H CDR_H2	RIDPANGNTI YGDKFKS
113	0564_人類化_H CDR_H3	DIGTTFDY
114	0564_人類化_H FV_H	EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAVSGYKIR SSYMHWVRQA PGKGLEWIGR IDPANGNTIY GDKFKSRFTL SSDTAKNSAY LQMNSLRAED TAVYYCAIDI GTTFDYWGQG TLVTVSS
115	0180_嵌合體_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKASQHIN RYLNWYQQKL GEAPKLLIYD ANNLQTGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYFCLQ HNSWPNTFGA GTKLELKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
116	0180_嵌合體_L FV_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRVT INCKASQHIN RYLNWYQQKL GEAPKLLIYD ANNLQTGIPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYFCLQ HNSWPNTFGA GTKLELK
117	0180_嵌合體_H	EVQLQQSGAE LGKPGTSVKL SCKVSGYKIR SSYMHWVNQR PGKGLEWIGR IDPANGNTIY GDKFKSKATL TSDTSSNTAY IQLSQLKSDD TAIYFCAIDI GTTFDYWGQG VMVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKKVEPKSC DKTHTCPPCP APEAAGAPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
118	0180_嵌合體_H FV_H	EVQLQQSGAE LGKPGTSVKL SCKVSGYKIR SSYMHWVNQR PGKGLEWIGR IDPANGNTIY GDKFKSKATL TSDTSSNTAY IQLSQLKSDD TAIYFCAIDI GTTFDYWGQG VMVTVSS
119	0027_嵌合體_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRIT INCKTSQNIN RYLNWFQQKL GEPPKLLIYN ANSLQADIPS RFSGSGSGTD FTLTITSLQP EDVATYFCLQ HHFWPYTFGA GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
120	0027_嵌合體_L CDR_L2	NANSLQA
121	0027_嵌合體_L CDR_L3	LQHHFWPYT
122	0027_嵌合體_L FV_L	DIQMTQSPSF LSASVGDRIT INCKTSQNIN RYLNWFQQKL GEPPKLLIYN ANSLQADIPS RFSGSGSGTD FTLTITSLQP EDVATYFCLQ HHFWPYTFGA GTKLELR
123	0027_嵌合體_L FW_L4	FGAGTKLELR
124	0027_嵌合體_H	EVHLHQSGPE LGRPGSSVKI SCKASGYTFT DYVMNWVRQS PGQGLEWIGW INPEDYSFDS GEKFLERATL TAATSSNTVY IQLSGLTSDD TATYFCVRGG LPGDWFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGAP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
125	0027_嵌合體_H CDR_H1	GYTFTDYVMN
126	0027_嵌合體_H CDR_H2	WINPEDYSFD SGEKFLE
127	0027_嵌合體_H CDR_H3	GGLPGDWFAY
128	0027_嵌合體_H FV_H	EVHLHQSGPE LGRPGSSVKI SCKASGYTFT DYVMNWVRQS PGQGLEWIGW INPEDYSFDS GEKFLERATL TAATSSNTVY IQLSGLTSDD TATYFCVRGG LPGDWFAYWG QGTLVTVSS
129	1444_L前導序列	MGWSCIILFL VATATGVHS
130	1444_H前導序列	MEWSWVFLFF LSVTTGVHS
131	0164_嵌合體_L前導序列	MGWSCIILFL VATATGAHS
132	人類E-選滯蛋白(UniProtKB序列P16581之胺基酸殘基22-610)	WSYNTSTEAM TYDEASAYCQ QRYTHLVAIQ NKEEIEYLNS ILSYSPSYYW IGIRKVNNVW VWVGTQKPLT EEAKNWAPGE PNNRQKDEDC VEIYIKREKD VGMWNDERCS KKKLALCYTA ACTNTSCSGH GECVETINNY TCKCDPGFSG LKCEQIVNCT ALESPEHGSL VCSHPLGNFS YNSSCSISCD RGYLPSSMET MQCMSSGEWS APIPACNVVE CDAVTNPANG FVECFQNPGS FPWNTTCTFD CEEGFELMGA QSLQCTSSGN WDNEKPTCKA VTCRAVRQPQ NGSVRCSHSP AGEFTFKSSC NFTCEEGFML QGPAQVECTT QGQWTQQIPV CEAFQCTALS NPERGYMNCL PSASGSFRYG SSCEFSCEQG FVLKGSKRLQ CGPTGEWDNE KPTCEAVRCD AVHQPPKGLV RCAHSPIGEF TYKSSCAFSC EEGFELHGST QLECTSQGQW TEEVPSCQVV KCSSLAVPGK INMSCSGEPV FGTVCKFACP EGWTLNGSAA RTCGATGHWS GLLPTCEAPT ESNIPLVAGL SAAGLSLLTL APFLLWLRKC LRKAKKFVPA SSCQSLESDG SYQKPSYIL
133	人類E-選滯蛋白細胞外域	WSYNTSTEAM TYDEASAYCQ QRYTHLVAIQ NKEEIEYLNS ILSYSPSYYW IGIRKVNNVW VWVGTQKPLT EEAKNWAPGE PNNRQKDEDC VEIYIKREKD VGMWNDERCS KKKLALCYTA ACTNTSCSGH GECVETINNY TCKCDPGFSG LKCEQIVNCT ALESPEHGSL VCSHPLGNFS YNSSCSISCD RGYLPSSMET MQCMSSGEWS APIPACNVVE CDAVTNPANG FVECFQNPGS FPWNTTCTFD CEEGFELMGA QSLQCTSSGN WDNEKPTCKA VTCRAVRQPQ NGSVRCSHSP AGEFTFKSSC NFTCEEGFML QGPAQVECTT QGQWTQQIPV CEAFQCTALS NPERGYMNCL PSASGSFRYG SSCEFSCEQG FVLKGSKRLQ CGPTGEWDNE KPTCEAVRCD AVHQPPKGLV RCAHSPIGEF TYKSSCAFSC EEGFELHGST QLECTSQGQW TEEVPSCQVV KCSSLAVPGK INMSCSGEPV FGTVCKFACP EGWTLNGSAA RTCGATGHWS GLLPTCEAPT ESNIP
134	小鼠E-選滯蛋白(UniProtKB序列Q00690之胺基酸殘基22-612)	WYYNASSELM TYDEASAYCQ RDYTHLVAIQ NKEEINYLNS NLKHSPSYYW IGIRKVNNVW IWVGTGKPLT EEAQNWAPGE PNNKQRNEDC VEIYIQRTKD SGMWNDERCN KKKLALCYTA SCTNASCSGH GECIETINSY TCKCHPGFLG PNCEQAVTCK PQEHPDYGSL NCSHPFGPFS YNSSCSFGCK RGYLPSSMET TVRCTSSGEW SAPAPACHVV ECEALTHPAH GIRKCSSNPG SYPWNTTCTF DCVEGYRRVG AQNLQCTSSG IWDNETPSCK AVTCDAIPQP QNGFVSCSHS TAGELAFKSS CNFTCEQSFT LQGPAQVECS AQGQWTPQIP VCKAVQCEAL SAPQQGNMKC LPSASGPFQN GSSCEFSCEE GFELKGSRRL QCGPRGEWDS KKPTCSAVKC DDVPRPQNGV MECAHATTGE FTYKSSCAFQ CNEGFSLHGS AQLECTSQGK WTQEVPSCQV VQCPSLDVPG KMNMSCSGTA VFGTVCEFTC PDDWTLNGSA VLTCGATGRW SGMPPTCEAP VSPTRPLVVA LSAAGTSLLT SSSLLYLLMR YFRKKAKKFV PASSCQSLQS FENYHVPSYN V
135	小鼠E-選滯蛋白細胞外域	WYYNASSELM TYDEASAYCQ RDYTHLVAIQ NKEEINYLNS NLKHSPSYYW IGIRKVNNVW IWVGTGKPLT EEAQNWAPGE PNNKQRNEDC VEIYIQRTKD SGMWNDERCN KKKLALCYTA SCTNASCSGH GECIETINSY TCKCHPGFLG PNCEQAVTCK PQEHPDYGSL NCSHPFGPFS YNSSCSFGCK RGYLPSSMET TVRCTSSGEW SAPAPACHVV ECEALTHPAH GIRKCSSNPG SYPWNTTCTF DCVEGYRRVG AQNLQCTSSG IWDNETPSCK AVTCDAIPQP QNGFVSCSHS TAGELAFKSS CNFTCEQSFT LQGPAQVECS AQGQWTPQIP VCKAVQCEAL SAPQQGNMKC LPSASGPFQN GSSCEFSCEE GFELKGSRRL QCGPRGEWDS KKPTCSAVKC DDVPRPQNGV MECAHATTGE FTYKSSCAFQ CNEGFSLHGS AQLECTSQGK WTQEVPSCQV VQCPSLDVPG KMNMSCSGTA VFGTVCEFTC PDDWTLNGSA VLTCGATGRW SGMPPTCEAP VSPTRP
136	1444_H FV_H	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TGCCATCCGT TCTGCCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GTGGACTCCG TGACCGGCCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC G
137	1444_L FV_L	GATATTCAGA TGACGCAGTC CCCATCTTCC CTTTCAGCAT CTGTGGGTGA CCGGGTTACA ATCACTTGTA AAACATCCCA GAACATTGAG CGTTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCG GGTAAAGCCC CGAAACTATT GATTTATGCC GCGTCCTCGC TGCAATCCGG CGTGCCGAGT CGTTTTAGCG GCTCCGGGAG CGGCACCGAT TTTACTCTTA CCATTTCGAG TCTGCAGCCG GAAGACTTTG CCACTTATTT CTGTCTCCAG GATAACGCCT GGCCATTAAC CTTCGGTCAG GGTACCAAAG TTGAAATTAA A
138	1444_HC(具有C端離胺酸(K))	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TGCCATCCGT TCTGCCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GTGGACTCCG TGACCGGCCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC GGCGTCGACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCACCC TCCTCCAAGA GCACCTCTGG GGGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCCCTGA CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCGGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAGCTTGG GCACCCAGAC CTACATCTGC AACGTGAATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA AAGTTGAGCC CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCACCTGAAG CCGCTGGGGC ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA TAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CCCCGGGAAA A
139	1444_LC	GATATTCAGA TGACGCAGTC CCCATCTTCC CTTTCAGCAT CTGTGGGTGA CCGGGTTACA ATCACTTGTA AAACATCCCA GAACATTGAG CGTTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCG GGTAAAGCCC CGAAACTATT GATTTATGCC GCGTCCTCGC TGCAATCCGG CGTGCCGAGT CGTTTTAGCG GCTCCGGGAG CGGCACCGAT TTTACTCTTA CCATTTCGAG TCTGCAGCCG GAAGACTTTG CCACTTATTT CTGTCTCCAG GATAACGCCT GGCCATTAAC CTTCGGTCAG GGTACCAAAG TTGAAATTAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT
140	1444_H前導序列	ATGGAATGGA GCTGGGTCTT TCTCTTCTTC CTGTCAGTAA CTACAGGTGT CCACTCC
141	1444_L前導序列	ATGGGATGGA GCTGTATCAT CCTCTTCTTG GTGGCAACAG CTACAGGCGT GCACTCC
142	1444_H CH(具有C端離胺酸(K))	GCGTCGACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCACCCT CCTCCAAGAG CACCTCTGGG GGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACCCAGACC TACATCTGCA ACGTGAATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAA AGTTGAGCCC AAATCTTGTG ACAAAACTCA CACATGCCCA CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGCTGGGGCA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACAT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CTGAGGTCAA GTTCAACTGG TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GCAGTACAAC AGCACGTACC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC AGGACTGGCT GAATGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGCC CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGGAGGAG ATGACCAAGA ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTATCC CAGCGACATC GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC GCCTCCCGTG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAT AGCAAGCTCA CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC CCCGGGAAAA
143	1444_L CL	CGTACGGTGG CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA GGGGAGAGTG T
144	0841_人類化1_H FV_H	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TAACATCCGT TCTAGCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GCTGAGAAGT TCAAAATCCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC G
145	0841_人類化1_L FV_L	GATATTCAGA TGACGCAGTC CCCATCTTCC CTTTCAGCAT CTGTGGGTGA CCGGGTTACA ATCACTTGTA AAACATCCCA GAACATTAAC CGTTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCG GGTAAAGCCC CGAAACTATT GATTTATAAC GCGAACTCGC TGCAAACTGG CGTGCCGAGT CGTTTTAGCG GCTCCGGGAG CGGCACCGAT TTTACTCTTA CCATTTCGAG TCTGCAGCCG GAAGACTTTG CCACTTATTT CTGTCTCCAG GATAACTCCT GGCCATTAAC CTTCGGTCAG GGTACCAAAG TTGAAATTAA A
146	0978_人類化2_H FV_H	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TAACATCCGT TCTAGCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GTGGACTCCG TGAAAGGCCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC G
147	0978_人類化2_L FV_L	GATATTCAGA TGACGCAGTC CCCATCTTCC CTTTCAGCAT CTGTGGGTGA CCGGGTTACA ATCACTTGTA AAACATCCCA GAACATTAAC CGTTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCG GGTAAAGCCC CGAAACTATT GATTTATGCC GCGTCCTCGC TGCAATCCGG CGTGCCGAGT CGTTTTAGCG GCTCCGGGAG CGGCACCGAT TTTACTCTTA CCATTTCGAG TCTGCAGCCG GAAGACTTTG CCACTTATTT CTGTCTCCAG GATAACTCCT GGCCATTAAC CTTCGGTCAG GGTACCAAAG TTGAAATTAA A
148	0164_嵌合體_H FV_H	GAAGTCCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAG TTTGGGAAAC CTGGGACCTC AGTCAAGTTG TCTTGCAAGG TTTCTGGGTA TAACATTAGG AGTTCATACA TGCACTGGGT GAATCAGAGG CCTGGAAAGG GCCTGGAATG GATAGGAAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GCTGAGAAGT TCAAAATCAA GGCCATTCTG ACTGCAGATT CATCGTCCAA CACAGCCTAC ATGCAACTCA GCCAACTGAA ATCTGACGAC ACAGCAATCT ATTTTTGTGC TATGGACCTC TACAGTACCT CTGAATACTG GGGCCAAGGA GTCATGGTCA CAGTCTCCTC A
149	0164_嵌合體_L FV_L	GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCTTCATTC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA CAGAGTCACT ATCAACTGCA AAACGAGTCA GAATATTAAC AGGTACTTAA ACTGGTACCA GCAAAAGCTT GGAGAAGCTC CCAAACTCCT GATATATAAT GCAAACAGTT TGCAAACGGG CATCCCATCA CGGTTCAGTG CCAGTGGATC CGGTACTGAT TTCACACTCA CCATCAACAG CCTGCAGCCT GAAGATGTTG CCACATATTT TTGCTTGCAG GATAATAGTT GGCCGCTCAC GTTCGGTTCT GGGACCAAGC TGGAGATCAA A
150	1448_最佳化_H FV_H	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TGCCATCCGT TCTGCCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GTGGACTCCG TGAAAGAGCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC G
151	1284_最佳化_H FV_H	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TGCCATCCGT TCTGCCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GTGGAGTCCG TGGAGGGCCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC G
152	1282_最佳化_H FV_H	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TGCCATCCGT TCTGCCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GTGGACTCCG TGGAGGGCCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC G
153	0525_人類化_H FV_H	GAGGTACAGT TGGTGGAATC TGGCGGCGGC CTGGTCCAGC CGGGCGGGTC TTTGCGCCTG AGTTGTGCAG CGAGTGGGTT TAGCCTGACG GGCTACTACA TGCAATGGGT CCGTCAGGCG CCGGGCAAAG GTCTGGAATG GATGGGTTTT ATACGGAGTA GTGGAAGCAC AGAGTATAAT TCAGAGTTCA AATCCCGTTT TACCATCTCT CGCGATAACG CGAAAAACAG CGTGTATCTG CAGATGAATA GCCTGCGCGC CGAAGATACC GCCGTGTACT ACTGCGCGCG TTGCCCGTAT AAATATAGTT CATTTGTATA TGTGGGTGTC ATGGATGCGT GGGGCCAGGG TACACTGGTT ACCGTGAGCT CG
154	0525_人類化_L FV_L	GATATCCAAA TGACGCAATC GCCTAGCAGC TTATCCGCGT CAGTTGGCGA TCGCGTGACC ATCACTTGCA AAGCGTCGCA AACCGTCGGA ATCAACGTGG ATTGGTACCA ACAGAAACCG GGCAAGGCGC CGAAACTGCT GATCTATGGA GCCAGCAATC GCCACACAGG AGTGCCGTCC CGTTTTAGCG GCAGCGGGAG CGGTACGGAT TTTACCCTGA CGATTTCTTC ACTCCAACCC GAAGACTTTG CAACCTATTG CTGCTTGCAA TATGGTTCAA TCCCGCATAC TTTCGGCCAG GGTACAAAAG TGGAAATTAA A
155	0039_嵌合體_H FV_H	CAGGTGCAGC TGAAGGAGAC AGGACCTGGC CTGGTGCAAC CAACACAGAC CCTGTCCATC ACATGTACTG TTTCTGGGTT CTCATTAACC GGCTATTATA TGCAGTGGGT TCGCCAGACT CCAGGAAAGG GGCTAGAATG GATGGGATTT ATACGGAGTA GTGGAAGCAC AGAGTATAAT TCAGAGTTCA AATCCCGACT TAGCATCAGC AGGGACACCT CCAAGAACCA AGTTTTCTTA AAAATGAACA GTCTGAAAAC AGAAGATACA GGCGTGTATT ACTGTGCCAG ATGCCCTTAT AAGTATAGCA GCTTTGTCTA CGTAGGGGTT ATGGATGCCT GGGGTCAAGG AGCTCCAGTC ACTGTCTCCT CA
156	0039_嵌合體_L FV_L	GAAATTGTGA TGACCCAGTC TCCCACATCC ATGTCCACAT CAATAGGAGA GAGGGTCACC CTGAACTGCA AGGCCAGTCA GACTGTGGGT ATTAATGTTG ACTGGTACCA ACAGACACCA GGGCAGCCTC CTAAACTACT GATATATGGG GCATCCAACC GACACACTGG GGTCCCTGAT CGCTTCACAG GCAGTGGATT TGGGAGAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAA CGTGGAGGCT GAAGACCTAG CTGTTTATTG CTGTCTGCAA TATGGCTCCA TTCCTCACAC GTTTGGACCT GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A
157	0265_0254_人類化_H FV_H	GAAGTGCAGT TAGTGGAAAG TGGCGGTGGC CTGGTGCAAC CGGGAGGATC CTTACGTTTA AGCTGCGCCG TGTCCGGGTT TAGTATCAGC ACCTATAATG TACACTGGCT GCGTCAAGCC CCGGGCAAAG GGTTAGAATG GATGGGAATG ATGTGGAGTG GTGGAAGCCC AGATTATAAT TCAGCTCTCA AATCCCGATT CACTATTAGT CGCGATACCG CAAAAAACTC CGTGTACCTT CAGATGAACT CTCTTCGCGC AGAGGATACG GCGGTTTACT ACTGTGCTCG CTGGGGCGGC GGGTTTGATT ACTGGGGCCA GGGAACGCTG GTAACGGTTT CCAGT
158	0265_0254_人類化_L FV_L	GACATTCAAC TGACCCAGAG CCCGTCCAGC TTATCTGCGA GTGTTGGGGA CCGGGTCACG ATTACCTGCC GGGCTAGTCA CAGCATTGGG ACGAACTTGC ATTGGTACCA GCAGAAACCT GGCAAAGCTC CGAAACTGCT GATTTATTTT ACATCCCAAA GCATCAGCGG TGTCCCCTCC CGATTTTCCG GGTCCGGATC CGGTACCGAT TTTACTTTAA CGATCAGCAG TCTGCAGCCA GAGGATTTCG CCACCTACTA TTGTCAGCAA ACTCAGTCTT GGCCCCTGAC CTTTGGCCAA GGGACCAAGG TAGAAATCAA G
159	0158_嵌合體_H FV_H	CAGGTGCAGC TGAAGGAGTC AGGACCTGGC CTGGTGCAGC CCTCAGAGAC CCTGTCCCTC ACCTGCACTG TCTCTGGGTT CTCAATAAGC ACCTATAACG TACACTGGCT TCGACAGCCT CCAGGAAAAG GTCTGGAGTG GATGGGAATG ATGTGGAGTG GTGGAAGCCC AGATTATAAT TCAGCTCTCA AATCCCGACT GAGCATCAGC AGGGACACCT CCAAGAACCA AGTTTTCTTA AAAATGAACA GTCTGCAAAG TGAAGACACA ACCACTTACT ACTGTGCCAG ATGGGGGGGG GGCTTTGATT ACTGGGGCCA AGGAGTCATG GTCACAGTCT CCTCA
160	0158_嵌合體_L FV_L	GACATCGTGC TGACTCAGTC TCCAACCACC CTGTCTGTGA CTCCAGGAGA GACAGTCAGT CTCTCCTGCA GGGCTAGCCA TAGTATTGGC ACAAATCTAC ACTGGTATCA ACAAAAAACA AATGAGTCTC CAAGGCTTCT CATCAAGTTT ACTTCCCAGT CCATCTCTGG GATCCCCTCC AGGTTCAGTG CCAGTGGATC AGGGACAGAT TTTACTCTCA ACATCAACAA TGTGGAGTTT GATGATGTCT CAAGTTATTT TTGTCAACAG ACTCAAAGCT GGCCCCTCAC GTTCGGTTCT GGGACCAAGC TGGAGATCAA A
161	0929_0548_人類化_H FV_H	CAAGTACAAC TGGTGCAGAG TGGGGCCGAA GTGAAAAAAC CCGGCGCTAG CGTGAAAGTC AGCTGTAAAG TGTCCGGTTA TAATATTAGA AGCACCTATA TGCATTGGGT GCGTCAAGCG CCGGGCCAGG GCTTAGAGTG GATGGGTAGG ATTGATCCTG CAAATGGAAA TACTATTTAT GCTGAGAAGT TCAAAAGGAG AGTTACGCTG ACCCGCGACA CGTCCACCTC GACGGCCTAT ATGGAGCTGT CTTCTTTACG CTCAGAGGAC ACTGCAGTTT ACTATTGTGC CATGGAAGTT AGAGTTAGCT TCGAATATTG GGGTCAAGGC ACATTGGTCA CGGTCAGCAG T
162	0929_0548_人類化_L FV_L	GATATCCAGA TGACTCAATC TCCATCGAGC CTTTCGGCGT CAGTGGGTGA TCGTGTTACC ATCACTTGTA AGGCCTCCCA AAACATTAAT AAATATCTGG ACTGGTACCA GCAGAAACCG GGCAAAGCCC CAAAGTTACT GATCTACTAT ACAAATAACC TACACACAGG TGTTCCATCA CGCTTTTCAG GTAGCGGAAG CGGGACCGAC TTTACGTTTA CGATCTCCAG CTTGCAACCA GAAGACATTG CCACTTATTA TTGTCTCCAG CATGACAGTG GCTATACCTT TGGACAGGGT ACTAAGGTGG AAATCAAG
163	0159_嵌合體_H FV_H	GAAGTCCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAG CTAGGGAAAC CTGGGACCTC AGTCAAGTTG TCTTGCAAGG TTTCTGGCTA TAACATTAGG AGTACCTACA TGCACTGGGT GAGTCAGAGG CCTGGAAAGG GCCTGGAATG GATAGGAAGG ATTGATCCTG CAAATGGAAA TACTATTTAT GCTGAGAAGT TCAAAAGGAA GGCCACACTG ACTGCAGATA CATCGTCCAA CACAGCCTAC ATGCAACTCA GCCAACTGAA ATCTGACGAC AGAGCAATCT ATTTTTGTGC TATGGAAGTA CGGGTGTCCT TTGAGTACTG GGGCCAGGGA GTCATGGTCA CCGTCTCCTC A
164	0159_嵌合體_L FV_L	GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCTTCATTC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA CAGAGTCACT ATCAACTGCA AAGCAAGTCA GAATATTAAC AAGTACTTAG ACTGGTATCA GCAAAAGCTT GGTGAAGGTC CCAAACTCCT GATATATTAT ACAAACAATT TACATACAGG AATCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC TGGTACTGAT TTCACACTTA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATGTTG CCACATATTT CTGCCTTCAG CATGACAGTG GGTACACGTT TGGAGCTGGG ACCAAGCTGG AACTGAAA
165	0955_0300_人類化_H FV_H	CAAGTGCAGC TGGTACAGTC TGGTGCCGAG GTTAAAAAGC CGGGTAGTAG CGTGAAAGTA AGCTGCAAAG TGAGTGGTTA TAGCATTCGT TCAACCTATA TGCACTGGGT TCGTCAGGCG CCAGGCCAAG GTCTCGAGTG GATGGGAAGG ATTGATCCTG CAAATGGAAA TACAATATAT GCTGAGAGGT TCAAAAACCG CGTGACGCTG ACCGCAGATA CCAGCACTTC CACGGCGTAC ATGGAACTGT CCTCCCTGCG GTCCGAAGAT ACCGCAGTAT ATTATTGCGC CGTAGAAATC CTAGGCATTT TTGATTATTG GGGGCAGGGC ACACTGGTCA CCGTATCGAG C
166	0955_0300_人類化_L FV_L	GATATACAAA TGACACAGAG TCCGAGTTCC CTATCAGCGA GCGTGGGAGA CAGGGTTACC ATAACGTGTA AAGCATCGCA GAATATTGAC AAATATCTCG ACTGGTATCA ACAGAAGCCG GGCAAAGCAC CAAAACTCCT TATGTATAAC ACCAACTCTT TACATACTGG CGTCCCAAGT CGTTTTTCGG GGTCTGGCAG CGGCACAGAT TTTACGCTCA CCATTAGTTC GCTGCAGCCA GAAGACTTTG CTACCTACTT CTGTCTGCAA CATAATAGCG GCTACACCTT CGGTCAGGGG ACTAAAGTTG AAATAAAA
167	0170_嵌合體_H FV_H	GAAGTCCAGC TGCAGCAGTC CGGGGCTGAG CTTGGGAAAC CTGGGACCTC AGTCAAGTTG TCTTGCAAGG TTTCTGGCTA TAGTATTAGG AGTACCTACA TGCACTGGGT GAATCAGAGG CCTGGAAAGG GCCTGGAATG GGTAGGAAGG ATTGATCCTG CAAATGGAAA TACAATATAT GCTGAGAGGT TCAAAAACAA GGCCACACTG ACTGCAGATA CATCGTCCAA CACAGCCTAC ATGCAACTCA GCCAACTGAA ATCTGACGAC ACAGCAATCT ATTTTTGTGC TGTGGAGATC CTTGGGATCT TTGATTACTG GGGCCAAGGA GTCATGGTCA CAGTCTCCTC A
168	0170_嵌合體_L FV_L	GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCTTCATTC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA CAGAGTCACT ATCAACTGCA AAGCAAGTCA GAATATTGAC AAGTACTTAG ACTGGTATCA GCAAAAGCTT GGTGAAGCTC CCAAACTCCT GATGTATAAT ACAAACAGTT TGCATACAGG AATTCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGTACTGAT TTCACACTTA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATGTTG CCACATATTT CTGCCTTCAG CATAACAGTG GGTACACGTT TGGAGCTGGG ACCAAGCTGG AACTGAAA
169	0564_人類化_H FV_H	GAGGTACAGC TGGTTGAATC GGGTGGTGGT CTGGTTCAGC CGGGTGGCTC ATTAAGACTG TCATGCGCCG TGTCTGGTTA TAAAATCCGC AGCAGTTATA TGCATTGGGT TCGTCAAGCT CCGGGTAAAG GTTTAGAATG GATCGGGAGG ATTGATCCTG CAAATGGAAA TACTATATAC GGTGACAAGT TCAAAAGTCG GTTTACTCTG TCATCCGATA CCGCGAAAAA CTCAGCCTAT CTGCAAATGA ATTCCCTGCG CGCGGAAGAC ACTGCTGTCT ATTATTGCGC AATTGATATC GGTACCACGT TTGATTATTG GGGCCAGGGT ACGTTGGTGA CGGTTAGCTC C
170	0564_人類化_L FV_L	GACATCCAAA TGACCCAATC TCCGAGTTCT CTGTCTGCTT CCGTGGGCGA CCGAGTCACC ATAACCTGTA AGGCTTCGCA ACACATCAAC CGTTATTTGA ACTGGTATCA ACAGAAACCG GGGAAAGCGC CGAAATTGCT GATTTATGAT GCTAACAACC TGCAGACAGG CGTACCATCG CGATTTAGCG GCTCCGGAAG CGGGACGGAT TTTACTCTCA CCATCAGCTC TCTGCAGCCG GAAGACTTTG CAACCTATTT CTGTTTACAG CATAATTCCT GGCCGAATAC CTTTGGCCAG GGGACAAAGG TGGAAATCAA A
171	0180_嵌合體_H FV_H	GAGGTCCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAG CTTGGGAAAC CTGGGACCTC AGTCAAGTTG TCTTGCAAGG TTTCTGGCTA TAAGATTAGG AGTTCCTACA TGCACTGGGT GAATCAGAGG CCTGGAAAGG GCCTGGAATG GATAGGAAGG ATTGATCCTG CAAATGGAAA TACTATATAC GGTGACAAGT TCAAAAGTAA GGCCACACTG ACTTCAGATA CATCGTCCAA CACAGCCTAC ATCCAACTCA GCCAACTGAA ATCTGACGAC ACAGCAATCT ATTTTTGTGC TATAGATATA GGTACAACCT TTGATTATTG GGGCCAAGGA GTCATGGTCA CAGTCTCCTC A
172	0180_嵌合體_L FV_L	GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCTTCATTC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA CAGAGTCACT ATCAACTGCA AAGCAAGTCA GCATATTAAT AGGTACTTAA ACTGGTACCA GCAAAAGCTT GGAGAAGCTC CCAAACTCCT GATATATGAT GCAAACAATT TGCAAACGGG CATCCCATCA CGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGTACTGAT TTCACACTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT GAAGATGTTG CCACATATTT CTGCTTGCAG CATAATAGTT GGCCGAACAC GTTTGGGGCT GGGACCAAGC TGGAATTGAA A
173	0027_嵌合體_H FV_H	GAAGTCCACC TGCACCAGTC TGGGCCTGAG CTTGGGAGGC CTGGGTCCTC AGTCAAGATT TCTTGCAAGG CTTCTGGCTA CACCTTTACA GATTACGTTA TGAACTGGGT GAGGCAGAGT CCTGGACAGG GGCTGGAATG GATAGGATGG ATCAATCCTG AAGATTATAG TTTTGATTCT GGTGAGAAGT TCCTAGAGAG GGCCACACTG ACTGCAGCTA CGTCCTCCAA CACAGTCTAC ATCCAGCTTA GCGGCCTGAC ATCTGACGAC ACAGCCACCT ATTTTTGTGT TAGAGGGGGA CTACCCGGGG ATTGGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGCACTC TGGTCACTGT CTCTTCA
174	0027_嵌合體_L FV_L	GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCTTCATTC CTGTCTGCAT CTGTGGGAGA CAGAATCACT ATCAACTGCA AGACAAGTCA GAATATTAAC AGGTACTTAA ACTGGTTCCA GCAAAAGCTT GGAGAACCTC CCAAACTCCT GATATATAAT GCAAACAGTT TGCAAGCGGA CATTCCATCA CGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGTACTGAT TTCACACTCA CCATCACCAG CCTGCAGCCT GAAGATGTTG CCACATATTT CTGCTTGCAG CATCATTTCT GGCCGTACAC GTTTGGAGCT GGGACCAAGC TGGAACTGAG A
175	經截斷石蟹獼猴E-選滯蛋白(UniProtKB序列G8F370之胺基酸殘基22-556)	WSYNTSTEAMTYDEASAYCQQRYTHLVAIQNKEEIEYLNSILSYSPSYYWIGIRKVNNVWVWVGTQKPLTEEAKNWAPGEPNNRQKDEDCVEIYIKRDKDVGMWNDERCSKKKLALCYTAACTNTSCSGHGECVETINNYTCKCDPGFSGLECEQIVNCTALESPEHGSLVCSHPLGNFSYSSSCSVSCDRGYLPSSVETTQCMSSGEWSVPIPACKVVECDAVTNPANGFVECFQNPGSFPWNTTCTFDCEEGFELMGAQSLQCTSSGNWDNEKPTCKAVTCRAIRQPQNGSVRCSHSPAGEFTFKSSCNFTCEEGFMLQGAAQVECTTQGQWTQQVPVCEAFQCTALSNPERGYMNCLPSASGSFRNGSSCEFSCEQGFVLKGSKRLQCGPTGEWDNEKPTCEAVRCDAVHQPQRGLVRCAHSPIGEFTYKSSCAFSCEEGFELHGSTQLECTSQGQWTEEVPSCQVVKCSSLAVLEKINMSCSGEPVFGTVCNFACPEGWRLNGSAAMTCGATGHWSGMLPTCEAPTESNTP
176	HC CDR2中NG去醯胺(加下劃線)之位點	IDPANG NTIYAEK
177	LC CDR1中NR去醯胺(加下劃線)之位點	TSQNINR YLNWYQQKPGK
178	H27預測之非生殖系T細胞抗原決定基	YNIRSSYMH
179	H63預測之非生殖系T細胞抗原決定基	FKIRFTISA
180	H65預測之非生殖系T細胞抗原決定基	IRFTISADN
181	L29預測之非生殖系T細胞抗原決定基	INRYLNWYQ
182	L46預測之非生殖系T細胞抗原決定基	LLIYNANSL
183	L47預測之非生殖系T細胞抗原決定基	LIYNANSLQ
184	L48預測之非生殖系T細胞抗原決定基	IYNANSLQT
185	L49預測之非生殖系T細胞抗原決定基	YNANSLQTG
186	H59-H65之DP-54序列	YVDSVKG
187	H63預測之T細胞抗原決定基	VKGRFTISA
188	H27預測之T細胞抗原決定基	YAIRSAYMH
189	H63預測之T細胞抗原決定基	VEGRFTISA
190	H63預測之T細胞抗原決定基	VTGRFTISA
191	H63預測之T細胞抗原決定基	VKERFTISA
192	L29預測之T細胞抗原決定基	IERYLNWYQ
193	E-選滯蛋白之胰蛋白酶肽	CSSLAVLEK
194	1444 HC CDR2區	IDPANGNTIYVDSVTGR
195	1444 LC CDR1區	TSQNIERYLNWYQQKPGK
196	人類E-選滯蛋白UniProtKB P16581(前導序列為加下劃線的)	MIASQFLSALTLVLLIKESGA WSYNTSTEAMTYDEASAYCQQRYTHLVAIQNKEEIEYLNSILSYSPSYYWIGIRKVNNVWVWVGTQKPLTEEAKNWAPGEPNNRQKDEDCVEIYIKREKDVGMWNDERCSKKKLALCYTAACTNTSCSGHGECVETINNYTCKCDPGFSGLKCEQIVNCTALESPEHGSLVCSHPLGNFSYNSSCSISCDRGYLPSSMETMQCMSSGEWSAPIPACNVVECDAVTNPANGFVECFQNPGSFPWNTTCTFDCEEGFELMGAQSLQCTSSGNWDNEKPTCKAVTCRAVRQPQNGSVRCSHSPAGEFTFKSSCNFTCEEGFMLQGPAQVECTTQGQWTQQIPVCEAFQCTALSNPERGYMNCLPSASGSFRYGSSCEFSCEQGFVLKGSKRLQCGPTGEWDNEKPTCEAVRCDAVHQPPKGLVRCAHSPIGEFTYKSSCAFSCEEGFELHGSTQLECTSQGQWTEEVPSCQVVKCSSLAVPGKINMSCSGEPVFGTVCKFACPEGWTLNGSAARTCGATGHWSGLLPTCEAPTESNIPLVAGLSAAGLSLLTLAPFLLWLRKCLRKAKKFVPASSCQSLESDGSYQKPSYIL
197	經截斷人類E-選滯蛋白(UniProtKB序列P16581之胺基酸殘基22-178)	WSYNTSTEAMTYDEASAYCQQRYTHLVAIQNKEEIEYLNSILSYSPSYYWIGIRKVNNVWVWVGTQKPLTEEAKNWAPGEPNNRQKDEDCVEIYIKREKDVGMWNDERCSKKKLALCYTAACTNTSCSGHGECVETINNYTCKCDPGFSGLKCEQIV
198	小鼠E-選滯蛋白UniProtKB Q00690(前導序列為加下劃線的)	MNASRFLSALVFVLLAGESTA WYYNASSELMTYDEASAYCQRDYTHLVAIQNKEEINYLNSNLKHSPSYYWIGIRKVNNVWIWVGTGKPLTEEAQNWAPGEPNNKQRNEDCVEIYIQRTKDSGMWNDERCNKKKLALCYTASCTNASCSGHGECIETINSYTCKCHPGFLGPNCEQAVTCKPQEHPDYGSLNCSHPFGPFSYNSSCSFGCKRGYLPSSMETTVRCTSSGEWSAPAPACHVVECEALTHPAHGIRKCSSNPGSYPWNTTCTFDCVEGYRRVGAQNLQCTSSGIWDNETPSCKAVTCDAIPQPQNGFVSCSHSTAGELAFKSSCNFTCEQSFTLQGPAQVECSAQGQWTPQIPVCKAVQCEALSAPQQGNMKCLPSASGPFQNGSSCEFSCEEGFELKGSRRLQCGPRGEWDSKKPTCSAVKCDDVPRPQNGVMECAHATTGEFTYKSSCAFQCNEGFSLHGSAQLECTSQGKWTQEVPSCQVVQCPSLDVPGKMNMSCSGTAVFGTVCEFTCPDDWTLNGSAVLTCGATGRWSGMPPTCEAPVSPTRPLVVALSAAGTSLLTSSSLLYLLMRYFRKKAKKFVPASSCQSLQSFENYHVPSYNV
199	經截斷小鼠E-選滯蛋白(UniProtKB序列Q00690之胺基酸殘基22-178)	WYYNASSELMTYDEASAYCQRDYTHLVAIQNKEEINYLNSNLKHSPSYYWIGIRKVNNVWIWVGTGKPLTEEAQNWAPGEPNNKQRNEDCVEIYIQRTKDSGMWNDERCNKKKLALCYTASCTNASCSGHGECIETINSYTCKCHPGFLGPNCEQAV
200	石蟹獼猴E-選滯蛋白UniProtKB G8F370(前導序列為加下劃線的)	MIASQFLSAL TLVLLIKESG A WSYNTSTEA MTYDEASAYC QQRYTHLVAI QNKEEIEYLN SILSYSPSYY WIGIRKVNNV WVWVGTQKPL TEEAKNWAPG EPNNRQKDED CVEIYIKRDK DVGMWNDERC SKKKLALCYT AACTNTSCSG HGECVETINN YTCKCDPGFS GLECEQIVNC TALESPEHGS LVCSHPLGNF SYSSSCSVSC DRGYLPSSVE TTQCMSSGEW SVPIPACKVV ECDAVTNPAN GFVECFQNPG SFPWNTTCTF DCEEGFELMG AQSLQCTSSG NWDNEKPTCK AVTCRAIRQP QNGSVRCSHS PAGEFTFKSS CNFTCEEGFM LQGAAQVECT TQGQWTQQVP VCEAFQCTAL SNPERGYMNC LPSASGSFRN GSSCEFSCEQ GFVLKGSKRL QCGPTGEWDN EKPTCEAVRC DAVHQPQRGL VRCAHSPIGE FTYKSSCAFS CEEGFELHGS TQLECTSQGQ WTEEVPSCQV VKCSSLAVLE KINMSCSGEP VFGTVCNFAC PEGWRLNGSA AMTCGATGHW SGMLPTCEAP TESNTPLVAG LSAAGLSLLT LAPFLLWLRK CFRKAKKFVP ASSCQSLESD GSYQKPSYIL
201	石蟹獼猴E-選滯蛋白(UniProtKB序列G8F370之胺基酸殘基22-610)	WSYNTSTEAMTYDEASAYCQQRYTHLVAIQNKEEIEYLNSILSYSPSYYWIGIRKVNNVWVWVGTQKPLTEEAKNWAPGEPNNRQKDEDCVEIYIKRDKDVGMWNDERCSKKKLALCYTAACTNTSCSGHGECVETINNYTCKCDPGFSGLECEQIVNCTALESPEHGSLVCSHPLGNFSYSSSCSVSCDRGYLPSSVETTQCMSSGEWSVPIPACKVVECDAVTNPANGFVECFQNPGSFPWNTTCTFDCEEGFELMGAQSLQCTSSGNWDNEKPTCKAVTCRAIRQPQNGSVRCSHSPAGEFTFKSSCNFTCEEGFMLQGAAQVECTTQGQWTQQVPVCEAFQCTALSNPERGYMNCLPSASGSFRNGSSCEFSCEQGFVLKGSKRLQCGPTGEWDNEKPTCEAVRCDAVHQPQRGLVRCAHSPIGEFTYKSSCAFSCEEGFELHGSTQLECTSQGQWTEEVPSCQVVKCSSLAVLEKINMSCSGEPVFGTVCNFACPEGWRLNGSAAMTCGATGHWSGMLPTCEAPTESNTPLVAGLSAAGLSLLTLAPFLLWLRKCFRKAKKFVPASSCQSLESDGSYQKPSYIL
202	IGHV3-07*01 (DP-54)重鏈生殖系	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
203	IGHJ4*01	YFDYWGQGTLVTVSS
204	IGKV1-39*01 (DPK-9)輕鏈生殖系	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
205	IGKJ1*01	WTFGQGTKVEIK
206	1444 HC核酸序列(不具有C端離胺酸(K))	GAAGTGCAGC TTGTGGAATC CGGGGGCGGC TTGGTCCAAC CGGGTGGCAG CCTCCGTCTG TCGTGCGCGG CTTCGGGCTA TGCCATCCGT TCTGCCTACA TGCACTGGGT TCGCCAGGCG CCTGGGAAGG GCCTGGAATG GGTGGCCAGG ATTGATCCTG CAAACGGAAA TACTATATAT GTGGACTCCG TGACCGGCCG CTTTACAATC AGCGCCGACA ACGCTAAGAA TTCCGCCTAC CTGCAAATGA ATAGCCTGCG GGCAGAGGAT ACCGCGGTGT ACTATTGTGC CATGGATTTA TATTCCACGT CTGAATATTG GGGCCAAGGA ACCCTGGTAA CGGTGTCGTC GGCGTCGACC AAGGGCCCAT CGGTCTTCCC CCTGGCACCC TCCTCCAAGA GCACCTCTGG GGGCACAGCG GCCCTGGGCT GCCTGGTCAA GGACTACTTC CCCGAACCGG TGACGGTGTC GTGGAACTCA GGCGCCCTGA CCAGCGGCGT GCACACCTTC CCGGCTGTCC TACAGTCCTC AGGACTCTAC TCCCTCAGCA GCGTGGTGAC CGTGCCCTCC AGCAGCTTGG GCACCCAGAC CTACATCTGC AACGTGAATC ACAAGCCCAG CAACACCAAG GTGGACAAGA AAGTTGAGCC CAAATCTTGT GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCACCTGAAG CCGCTGGGGC ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA TAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CCCCGGGA

表 3 . 抗E-選滯蛋白抗體。

抗體	HCDR-1	HCDR-2	HCDR-3	LCDR-1	LCDR-2	LCDR-3	VH	VL	JH (FW_H4)	JK (FW_L4)	CL	CH	HC	LC	L 前導	H 前導	FV_H DNA	FV_L DNA
1444最佳化	8	9	10	2	3	4	11	5	12	6	14	15/16	7/ 13	1	129	130	136	137
0841人類化	23	24	10	18	19	20	25	21	12	6	14	16	22	17	129	129	144	145
0978人類化	23	29	10	18	3	20	30	27	12	6	14	16	28	26	129	129	146	147
0164嵌合體	23	24	10	18	19	20	35	32	36	33	14	15	34	31	131	131	148	149
1448最佳化	8	38	10	2	3	4	39	5	12	6	14	16	37	1	129	129	150	137
1284最佳化	8	41	10	2	3	4	42	5	12	6	14	16	40	1	129	129	151	137
1282最佳化	8	44	10	2	3	4	45	5	12	6	14	16	43	1	129	129	152	137
0525人類化	52	53	54	47	48	49	55	50	12	6	14	16	51	46	129	129	153	154
0039嵌合體	52	53	54	47	48	49	60	57	61	58	14	15	59	56	131	131	155	156
0265_0254人類化	63	64	65	68	69	70	66	71	12	6	14	16	62	67	129	129	157	158
0158嵌合體	63	64	65	68	69	70	75	73	36	33	14	15	74	72	131	131	159	160
0929_0548人類化	77	78	79	82	83	84	80	85	12	6	14	16	76	81	129	129	161	162
0159嵌合體	77	78	79	82	83	84	90	87	36	88	14	15	89	86	131	131	163	164
0955_0300人類化	92	93	94	97	98	99	95	100	12	6	14	16	91	96	129	129	165	166
0170嵌合體	92	93	94	97	98	99	104	102	36	88	14	15	103	101	131	131	167	168
0564人類化	111	112	113	106	107	108	114	109	12	6	14	16	110	105	129	129	169	170
0180嵌合體	111	112	113	106	107	108	118	116	36	88	14	15	117	115	131	131	171	172
0027嵌合體	125	126	127	18	120	121	128	122	12	123	14	15	124	119	131	131	173	174

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VH域，該VH域包含與SEQ ID NO:11之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VH域，該VH域包含SEQ ID NO:11之胺基酸或由其組成。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VH域，該VH域可包含與SEQ ID NO: 11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118及128中之任一者之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VH域，該VH域可包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118及128中之任一者之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VL域，該VL域包含與SEQ ID NO:5之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VL域，該VL域包含與SEQ ID NO:5之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VL域，該VL域可包含與SEQ ID NO: 5、21、27、32、50、57、71、73、85、87、100、102、109、116及122中之任一者之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VL域，該VL域可包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 5、21、27、32、50、57、71、73、85、87、100、102、109、116及122中之任一者之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:39、42或45中之任一者之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:55之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:57之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:60之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:71之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:66之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:73之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:75之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:80之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:90之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:100之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:102之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:104之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:109之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:114之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列的VH域。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列的VH域。

抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含：包含SEQ ID NO:5、21、27、32、50、57、71、73、85、87、100、102、109、116及122中之任一者之胺基酸序列的VL域，及包含SEQ ID NO:11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118及128中之任一者之胺基酸序列的VH域。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3，如SEQ ID No:5、21、27、32、50、57、71、73、85、87、100、102、109、116及122中之至少一者之胺基酸序列中所示。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進一步包含HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3，如SEQ ID NO:11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118及128中之至少一者之胺基酸序列中所示。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含：如SEQ ID NO:5之胺基酸序列中所示之LCDR-1、LCDR-2、LCDR-3，及如SEQ ID NO:11之胺基酸序列中所示之HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含：LCDR-1，其包含SEQ ID NO:2之胺基酸；LCDR-2，其包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列；及LCDR-3，其包含SEQ ID NO:4之胺基酸。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含：HCDR-1，其包含SEQ ID NO:8之胺基酸；HCDR-2，其包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列；及HCDR-3，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含：HCDR-1，其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列；HCDR-2，其包含SEQ ID NO:38、41或44中之任一者之胺基酸序列；及HCDR-3，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含：LCDR-1，其包含SEQ ID NO:2、18、47、68、82、97或106中之任一者之胺基酸；LCDR-2，其包含SEQ ID NO:3、19、48、69、83、98、107或120中之任一者之胺基酸序列；及LCDR-3，其包含SEQ ID NO:4、20、49、70、84、99、108或121之胺基酸。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含：HCDR-1，其包含SEQ ID NO:8、23、52、63、77、92、111或125之胺基酸；HCDR-2，其包含SEQ ID NO:9、24、29、38、41、44、53、64、78、93、112或126之胺基酸序列；及HCDR-3，其包含SEQ ID NO:10、54、65、79、94、113或127之胺基酸。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3，如藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物編碼的胺基酸序列中所示。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3，如藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物編碼的胺基酸序列中所示。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物編碼的LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3胺基酸序列，及藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物編碼的HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物編碼的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物編碼的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物編碼的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含藉由以ATCC寄存具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物編碼的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含LC，該LC包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由其組成。

LC可包含與SEQ ID NO:1、17、26、31、46、56、67、72、81、86、96、101、105、115或119中之任一者之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體LC可包含含有SEQ ID No: 1、17、26、31、46、56、67、72、81、86、96、101、105、115或119中之任一者或由其組成之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含HC，該HC包含與SEQ ID NO:7或13之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含HC，該HC包含與SEQ ID NO:7或13之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含重鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO:7、13、22、28、34、37、40、43、51、59、62、74、76、89、91、103、110、117或124中之任一者之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體HC可包含含有SEQ ID NO:7、13、22、28、34、37、40、43、51、59、62、74、76、89、91、103、110、117或124中之任一者或由其組成之胺基酸序列。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由其組成的LC，及包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13之胺基酸序列或由其組成的HC。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段缺乏效應功能(亦即，為效應無效的)。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含重鏈，該重鏈包含含有SEQ ID NO: 11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118及128中之任一者之胺基酸序列(例如SEQ ID NO: 11)的VH域，且該重鏈進一步包含IgG1恆定域(例如包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16之胺基酸序列的IgG1恆定域)。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含重鏈，該重鏈包含含有SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VH域且進一步包含含有SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16之胺基酸序列的IgG1恆定域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成之VH域，且進一步包含由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16之胺基酸序列組成之IgG1恆定域。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體缺乏效應功能。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有輕鏈恆定區，其選自例如(例如人類) κ輕鏈恆定區(例如由SEQ ID NO:14之胺基酸序列編碼)或λ輕鏈恆定區。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含含有SEQ ID NO: 5、21、27、32、50、57、71、73、85、87、100、102、109、116及122中之任一者之胺基酸序列(例如SEQ ID NO:5)的VL域；且進一步包含κ恆定域，該恆定區包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含輕鏈，該輕鏈包含由SEQ ID NO:5之胺基酸序列組成的VL域；且進一步包含κ恆定域，該恆定區由SEQ ID NO:14之胺基酸序列組成。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之恆定區可經改變，例如經突變以修飾抗體之特性(例如，以增加或降低以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基之數目、效應細胞功能及/或補體功能)。

在一些態樣中，抗體或抗原結合片段變異體包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個保守性或非保守性取代，及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個對於全長重鏈(例如SEQ ID NO:7或13之胺基酸序列的HC)及/或全長輕鏈之添加及/或缺失。在另一態樣中，變異抗體與全長重鏈共有至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性，且其中該抗體或抗原結合片段特異性結合E-選滯蛋白。在另一態樣中，變異抗體與全長輕鏈(例如，SEQ ID NO:1之胺基酸序列的LC)共有至少65%、至少75%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性，且其中該抗體或抗原結合片段特異性結合E-選滯蛋白。 生殖系取代

各種受體人類生殖系序列係可用的且用於使在人類中使用之非人類物種抗體「人類化」的方法在此項技術中為熟知的且亦在本文中別處已論述。因此，熟習此項技術者應瞭解，來自小鼠、大鼠等之以上CDR序列可在人類可變域胺基酸序列之情形下置放。藉此，一般使受體人類生殖系序列發生變化以保存抗體結合及原始親本(亦即供體)抗體之其他所需特徵。CDR及構架區(FW)兩者可如下經工程改造。

在某些實施例中，取代為人類生殖系取代，其中(供體) CDR殘基經相應人類生殖系(受體)殘基置換，以增加人類胺基酸含量且潛在地降低抗體之免疫原性，如例如美國專利申請公開案第2017/0073395號及Townsend等人, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2015; 112(50):15354-15359中所描述，該等文獻兩者均以全文引用之方式併入本文中。

抗體或其抗原結合片段可包含VH構架，該VH構架包含人類生殖系VH構架序列。在一些態樣中，可使用來自以下生殖系之VH構架：IGHV1-2*02、IGHV1-3*01、IGHV1-46*01、IGHV1-69*01、IGHV1-69*02、IGHV1-8*01、IGHV3-7*01、IGHV3-13*01、IGHV3-23*01、IGHV3-23*04、IGHV3-30*01、IGHV3-30*18、IGHV5-10-1*01、IGHV5-10-1*04或IGHV5-51*01(生殖系名稱係基於IMGT生殖系定義)。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段使用來自生殖系IGHV3-7*01(SEQ ID NO:202)之VH構架。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段使用來自生殖系IGHV3-7*01(SEQ ID NO:202)之VH構架用於CDR區及來自IGHJ4*01(SEQ ID NO:203)之VH構架用於構架區。

較佳的人類生殖系輕鏈構架係衍生於VK或Vλ生殖系之構架。在一些態樣中，可使用來自以下生殖系之VL構架：IGKV1-12*01、IGKV1-13*02、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-5*01、IGKV3-11*01、IGKV3-15*01、IGKV3-20*01、IGKV3D-20*02及IGKV4-1*01 (生殖系名稱係基於IMGT生殖系定義)。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段使用來自生殖系IGHV1-39*01 (SEQ ID NO:204)之VL構架。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段使用來自生殖系IGHV1-39*01(SEQ ID NO:204)之VL構架用於CDR區及來自IGKJ1*01(SEQ ID NO:205)之VL構架用於構架區。

或者或另外，構架序列可為人類生殖系共同構架序列，諸如以下各者之構架：人類Vλ1共同序列、VK1共同序列、VK2共同序列、VK3共同序列、VH3生殖系共同序列、VH1生殖系共同序列、VH5生殖系共同序列或VH4生殖系共同序列。人類生殖系構架之序列可獲自各種公眾資料庫，諸如V-base、IMGT、NCBI或Abysis。

抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VL構架，該VL構架包含人類生殖系VL構架序列。VL構架可包含一或多個胺基酸取代、添加或刪除，同時仍保留與衍生該VL構架之生殖系的功能及結構類似性。在一些態樣中，VL構架與人類生殖系VL構架序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VL構架，該VL構架相對於人類生殖系VL構架序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸取代、添加或缺失。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代、添加或缺失僅在構架區中。在一些實施例中，一致性百分比係基於與不包括在本文中定義為CDR之彼等部分之VL域的類似性。

人類生殖系VL構架可為例如IGKV1-39*01之構架。人類生殖系VL構架可為例如IGKV1-33*01之構架。人類生殖系VL構架可為人類共同序列中之任一者之構架，該人類共同序列包括：Vλ、Vλ1、Vλ3、VΚ、VΚ1、VΚ2或VΚ3。

在一些實施例中，VL構架為IGK-39*01_IGKJ1*01。亦預測其他類似構架區以遞送本發明之有利抗體，該抗體包含：以下之CDR：SEQ ID NO: 2-4、18-20、47-49、68-70、82-84、97-99、106-108、120及121；及由以下VL胺基酸序列說明之CDR：SEQ ID NO: 5、21、27、32、50、57、71、73、85、87、100、102、109、116、122，該等構架區相對於IGKV1-12*01、IGKV1-13*02、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-5*01、IGKV3-11*01、IGKV3-15*01、IGKV3-20*01、IGKV3D-20*02及IGKV4-1*01中之任一者分別可包含99%、97%、96%、80%、76%、74%及66%一致性。在一些實施例中，一致性百分比係基於與不包括在本文中定義為CDR之彼等部分之VL的類似性。

抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可包含VH構架，該VH構架包含人類生殖系VH構架序列。VH構架可包含一或多個胺基酸取代、添加或刪除，同時仍保留與衍生該VH構架之生殖系的功能及結構類似性。在一些態樣中，VH構架與人類生殖系VH構架序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含VH構架，該VH構架相對於人類生殖系VH構架序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸取代、添加或缺失。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代、添加或缺失僅在構架區中。在一些實施例中，一致性百分比係基於與不包括在本文中定義為CDR之彼等部分之VH域的類似性。

人類生殖系VH構架可為例如IGHV3-7*01之構架。人類生殖系VH構架可為例如IGHV1-46*01之構架。人類生殖系VH構架可為例如IGHV1-69*01。人類生殖系VH構架可為人類VH生殖系共同序列之構架。人類生殖系VH構架可為人類生殖系共同序列之構架，該人類生殖系共同序列包括：VH3、VH5、VH1或VH4。

在一些實施例中，VH構架為IGHV3-7*01。亦預測其他類似構架區以遞送本發明之有利抗體，該抗體包含以下之CDR：SEQ ID NO:8-10、23、24、29、38、41、44、52-54、63-65、77-79、92-94、111-113、125-127；及由以下VH胺基酸序列中之任一者說明之CDR：SEQ ID NO:11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118、128，該等構架區包括IGHV1-2*02、IGHV1-3*01、IGHV1-46*01、IGHV1-69*01、IGHV1-69*02、IGHV1-8*01、IGHV3-7*01、IGHV3-13*01、IGHV3-23*01、IGHV3-23*04、IGHV3-30*01、IGHV3-30*18、IGHV5-10-1*01、IGHV5-10-1*04或IGHV5-51*01，該等構架區可相對於DP-54之FW區分別包含92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性及在共同結構特徵方面之一個或更少之胺基酸差異(Kabat編號)。在一些態樣中，一致性百分比係基於與不包括在本文中定義為CDR之彼等部分之VH域的類似性。

在某些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含(i) VH域，該VH域包含與SEQ ID NO:11之胺基酸序列至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列，及/或(ii) VL域，該VL域包含與SEQ ID NO:5之胺基酸序列至少50%、至少60%、至少66%、至少70%、至少75%、至少76%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。本發明亦涵蓋此等VL及VH序列之任何組合。

在某些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含：(i) HC，該HC包含與SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列；及/或(ii) LC，該LC包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致之胺基酸序列。本發明亦涵蓋此等HC及LC序列之任何組合。

在某些實施例中，本文所描述之抗體或其抗原結合片段包含Fc域。Fc域可衍生於IgA (例如IgA₁ 或IgA₂ )、IgG、IgE或IgG (例如IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 或IgG₄ )。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體為IgG1抗體。抗 E - 選滯蛋白抗體之生物活性

除了結合E-選滯蛋白上之抗原決定基之外，本發明之抗體或其抗原結合片段亦可介導生物活性。亦即，本發明包括經分離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合E-選滯蛋白且介導至少一種選自以下之可偵測活性： (i) 特異性結合於人類E-選滯蛋白 (ii) 特異性結合於石蟹獼猴E-選滯蛋白； (iii) 減少、抑制及/或中和可溶性E-選滯蛋白(例如人類、石蟹獼猴)與E-選滯蛋白配位體(例如唾液酸-路易斯A及/或唾液酸-路易斯X配位體)之間的相互作用(例如結合)； (iv) 減少、抑制及/或中和細胞表面表現之E-選滯蛋白(例如人類、石蟹獼猴)與E-選滯蛋白配位體(例如唾液酸-路易斯A及/或唾液酸-路易斯X配位體)之間的相互作用(例如結合)； (v) 減少、抑制及/或中和細胞表面表現之E-選滯蛋白(例如人類、石蟹獼猴)與細胞表面表現之E-選滯蛋白配位體(例如，例如HL-60細胞上之唾液酸-路易斯A及/或唾液酸-路易斯X配位體)之間的相互作用(例如黏著)； (vi) 減少、抑制及/或中和可溶性E-選滯蛋白與表現E-選滯蛋白配位體之細胞(例如HL-60)的相互作用(例如黏著)； (vii) 在靜態及生理流動條件下，減少、抑制及/或中和表現E-選滯蛋白配位體之細胞(例如HL-60)對表現E-選滯蛋白之細胞的黏著； (viii) 在生理流動條件下，減少、抑制及/或中和活化人類嗜中性白血球對表現E-選滯蛋白(例如人類及石蟹獼猴)之細胞的黏著； (ix) 結合於至少一個胺基酸殘基，其選自：人類E-選滯蛋白之T7、E8、A9、M10、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、N105、E107、R108、S110、K111、K112及K113； (x) 在25℃下，在約187 mg/mL之濃度下，黏度為約38 +/- 7 cP； (xi) 在以3 mg/kg之劑量進行皮下投與時，具有約21.5天(518小時)之半衰期； (xii) 顯示適合之調配物特性，包括高程度之熱穩定性及高濃度下之最少聚集；以及 (xiii) 可在大規模製造條件下顯示可再現之表現及純度。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有對於可溶性人類E-選滯蛋白的結合親和力，表示為K_D ，其小於或等於200 nM，例如小於或等於195 nM、190 nM、180 nM、160 nM、140 nM、120 nM、110 nM、100 nM、90 nM、80 nM、75 nM、50 nM。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有對於可溶性人類E-選滯蛋白的結合親和力，表示為K_D ，其如藉由SPR所量測小於或等於200 nM。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段具有對於可溶性人類E-選滯蛋白的結合親和力，表示為K_D ，其如例如藉由SPR所量測為約61.8至約68.4 +/- 3.18 nM。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有對於可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白的結合親和力，表示為K_D ，其小於或等於200 nM，例如小於或等於195 nM、190 nM、180 nM、160 nM、140 nM、120 nM、110 nM、100 nM、90 nM、80 nM、75 nM、50 nM。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段具有對於可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白的結合親和力，表示為K_D ，其如例如藉由SPR所量測為約64.9 +/- 1.13 nM至約81.5 nM。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有對於細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合親和力，表示為EC₅₀ ，其如例如藉由FACS所量測小於或等於50 nM，例如小於或等於48 nM、45 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.75 nM、0.5 nM、0.25 nM或0.1 nM。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段具有對於細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合親和力，表示為EC₅₀ ，其如例如藉由FACS所量測為約0.66 nM。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有對於細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的結合親和力，表示為EC₅₀ ，其如例如藉由FACS所量測小於或等於50 nM，例如小於或等於48 nM、45 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.75 nM、0.5 nM、0.25 nM或0.1 nM。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段具有對於細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的結合親和力，表示為EC₅₀ ，其如例如藉由FACS所量測為約0.75 nM。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有對於細胞表面表現之人類P-選滯蛋白的結合親和力，表示為EC₅₀ ，其如例如藉由FACS所量測大於或等於350 nM，例如大於或等於400 nM、450 nM、500 nM、550 nM、600 nM、650 nM或更大。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段對可溶性大鼠、小鼠或兔E-選滯蛋白或可溶性人類L-選滯蛋白或P-選滯蛋白具有弱結合或無結合。在一些實施例中，如例如藉由SPR所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段在至多405 nM下展現對於可溶性大鼠、小鼠或兔E-選滯蛋白或可溶性人類L-選滯蛋白或P-選滯蛋白之無結合。在一些實施例中，如例如藉由直接結合ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段在至多133.3 nM下展現對於可溶性小鼠或大鼠E-選滯蛋白之弱-不飽和之結合(例如低＞100倍)。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於2 nM，例如小於或等於0.010 nM、0.015 nM、0.020 nM、0.025 nM、0.030 nM、0.035 nM、0.040 nm、0.045 nM、0.05 nM、0.055 nM、0.06 nM、0.065 nM、0.070 nM、0.075 nM、0.080 nM、0.085 nM、0.090 nM、0.10 nM、0.12 nM、0.15 nM、0.2 nM、0.5 nM、0.9 nM、0.95 nM、1 nM、1.5 nM、1.8 nM或1.9 nM之EC₅₀ 結合於可溶性人類E-選滯蛋白。在一些實施例中，如例如藉由直接結合ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約0.085 nM至約0.12之EC₅₀ 結合於可溶性人類E-選滯蛋白。

在一些實施例中，如例如藉由AlphaLisa均質競爭分析所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於2 nM，例如小於或等於0.010 nM、0.015 nM、0.020 nM、0.025 nM、0.030 nM、0.035 nM、0.040 nm、0.045 nM、0.05 nM、0.055 nM、0.06 nM、0.065 nM、0.070 nM、0.075 nM、0.080 nM、0.085 nM、0.090 nM、0.10 nM、0.12 nM、0.15 nM、0.2 nM、0.5 nM、0.9 nM、0.95 nM、1 nM、1.5 nM、1.8 nM或1.9 nM之EC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性人類E-選滯蛋白之結合。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於1 nM，例如小於或等於0.010 nM、0.015 nM、0.020 nM、0.025 nM、0.030 nM、0.035 nM、0.040 nm、0.045 nM、0.05 nM、0.055 nM、0.06 nM、0.065 nM、0.070 nM、0.075 nM、0.080 nM、0.085 nM、0.090 nM、0.10 nM、0.12 nM、0.15 nM、0.2 nM、0.5 nM、0.9 nM或0.95 nM之EC₅₀ 結合於可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白。在一些實施例中，如例如藉由直接結合ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以0.071 nM至0.093 nM之EC₅₀ 結合於可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以約1 nM至約3 nM之IC₅₀ 且較佳以約1.2 nM之IC₅₀ 結合人類血清中之游離可溶性人類E-選滯蛋白。

在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性人類E-選滯蛋白之結合。在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約2.87 nM至約3.01 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性人類E-選滯蛋白之結合。

在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約2.39 nM至約2.91 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與可溶性石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。

在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於50 nM，例如小於或等於48 nM、45 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白之結合。在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以約1.88 nM至約2.89 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白之結合。

在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。在一些實施例中，如例如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以約1.47 nM至約2.65 nM之IC₅₀ 中和唾液酸-路易斯A配位體與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合。

在一些實施例中，如例如在靜態條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。在一些實施例中，如例如在靜態條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約3.36 nM至約4.7 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。

在一些實施例中，如例如在靜態條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約3.84 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的黏著。

在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於100 nM，例如小於或等於95 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、5 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約4.25 nM至約4.56 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著。

在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約4.32 nM至約4.35 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的黏著。

在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以小於或等於300 nM，例如小於或等於290 nM、280 nM、270 nM、260 nM、250 nM、150 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、20 nM、5 nM、2 nM或1 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約13.28 nM至約15.94 nM之IC₅₀ 抑制表現E-選滯蛋白配位體(例如E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體)之細胞與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。

在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約2.87 nM至約4.65 nM或9.45 nM至約16.33 nM之IC₅₀ 抑制活化人類嗜中性白血球與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白或細胞表面表現之石蟹獼猴E-選滯蛋白的黏著。在一些實施例中，嗜中性白血球由TNF-α活化。

在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約6.17 nM至約18.66 nM之IC₅₀ 抑制來自SCD患者之血球與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。在一些實施例中，如例如在生理流動條件下所量測，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以約12.4 nM之IC₅₀ 抑制來自SCD患者之血球與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著。

在一些實施例中，如藉由例如競爭分析使用例如Octet生物感測器所測定，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段結合於人類E-選滯蛋白之三個抗原決定基中之至少一者。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段結合於人類E-選滯蛋白之至少一個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多個胺基酸殘基，其選自由以下組成之群：T7、E8、A9、M10、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、N105、E107、R108、S110、K111、K112、K113及其組合。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之胺基酸殘基T7、E8、A9、M10、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、N105、E107、R108、S110、K111、K112及K113相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之3.8 Å內的至少一個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多個胺基酸殘基相互作用，該等胺基酸殘基選自由以下組成之群：T7、E8、A9、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E92、Y94、N105、E107、R108、S110、K111、K112及其組合。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之3.8 Å內的胺基酸殘基T7、E8、A9、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E92、Y94、N105、E107、R108、S110、K111及K112相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與內埋表面積(Å² )＞5 Å² 之人類E-選滯蛋白中的至少一個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多個胺基酸殘基相互作用，該等胺基酸殘基選自由以下組成之群：T7、E8、A9、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、E107、R108、S110、K111、K112、K113及其組合。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與內埋表面積(Å² )＞5 Å² 之人類E-選滯蛋白中的胺基酸殘基T7、E8、A9、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、E107、R108、S110、K111、K112及K113相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段經由氫鍵與人類E-選滯蛋白之至少一個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多個胺基酸殘基相互作用，該等胺基酸殘基選自由以下組成之群：E8、S47、N82、N83、E88、E92、Y94、N105、E107、R108、S110、K112及其組合。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段經由氫鍵與人類E-選滯蛋白之胺基酸殘基E8、S47、N82、N83、E88、E92、Y94、N105、E107、R108、S110及K112相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段經由鹽橋與人類E-選滯蛋白之選自由K111、K112及其組合組成之群的至少一個胺基酸殘基相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段經由鹽橋與人類E-選滯蛋白之胺基酸殘基K111及K112相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段經由水介導之氫鍵與人類E-選滯蛋白之選自由R97、K112及其組合組成之群的至少一個胺基酸殘基相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段經由水介導之氫鍵與人類E-選滯蛋白之胺基酸殘基R97及K112相互作用。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之至少一個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、更多個胺基酸殘基相互作用，該等胺基酸殘基亦在3.8 Å之sLex胺基酸殘基觸點內相互作用，該等胺基酸殘基選自由以下組成之群：Y48、N82、N83、E92、Y94、R97、N105、E107及其組合。

在一些實施例中，視情況根據晶體結構，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之胺基酸殘基Y48、N82、N83、E92、Y94、R97、N105及E107相互作用，該等胺基酸殘基亦在3.8Å之sLex胺基酸殘基觸點內相互作用。

抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段與人類E-選滯蛋白之至少一或多個胺基酸殘基的結合或相互作用可根據此項技術中已知之方法來確定，包括如對本文實例中所描述之結合分子之晶體結構的分析。

在一些實施例中，如藉由例如AC-SINS分析、DNA結合分析及/或胰島素結合分析所量測，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段處於多反應性低風險。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有低免疫原性風險，例如具有約-44、-45、-46或-47之T-reg調節之評分。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段在靜脈內投與時展現至少一種預測之人類藥物動力學(PK)參數，其選自：(i)約0.15 mL/h/kg至約0.39 mL/h/kg之全身性清除；(ii)22 mL/kg至36 mL/kg之穩態下分佈之表觀體積；(iii)約102小時至約345小時之平均半衰期。在一些實施例中，皮下投與之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段展現約243至約518小時之半衰期。

在一些實施例中，在以0.3 mg/kg之劑量進行靜脈內投與之後，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之平均半衰期為至少約102小時(約4.25天)。在一些實施例中，在以0.6 mg/kg之劑量進行靜脈內投與之後，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之平均半衰期為至少約264小時(約11天)。在一些實施例中，在以1.0 mg/kg之劑量進行靜脈內投與之後，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之平均半衰期為至少約188小時(約7.8天)。在一些實施例中，在以10 mg/kg之劑量進行靜脈內投與之後，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之平均半衰期為至少約345小時(約14.4天)。

在一些實施例中，在以1.0 mg/kg之劑量進行皮下投與之後，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之平均半衰期為至少約243小時(約10天)。在一些實施例中，在以3.0 mg/kg之劑量進行皮下投與之後，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之平均半衰期為至少約518小時(約21.5天)。

在一些實施例中，當在25℃下藉由例如動態光散射(DLS)量測時，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有選自由以下組成之群的黏度：約23 mg/mL濃度下之約7.97 +/- 1.83 cP、約48 mg/mL濃度下之約12.38 +/- 5.28 cP、約90 mg/mL濃度下之約4.26 +/- 0.6 cP、約102 mg/mL濃度下之約5.58 +/- 0.99 cP、約121 mg/mL濃度下之約8.44 +/- 1.54 cP、約140 mg/mL濃度下之約9.78 +/- 2.32 cP、約158 mg/mL濃度下之約17.47 +/- 3.24 cP及約188 mg/mL濃度下之約37.99 +/- 7.03 cP。

在一些實施例中，當在25℃下藉由例如DLS量測時，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段在約150 mg/mL至約190 mg/mL之濃度下具有約15 cP至40 cP之黏度。

在一些實施例中，當在25℃下藉由例如Anton Parr方法量測時，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段在185.7 mg/mL下具有33.4 cP之黏度。 免疫原性

免疫原性係開發及利用包括抗體及Fc融合蛋白之蛋白治療劑的主要障礙。若干因素可影響蛋白質免疫原性，包括但不限於蛋白質序列、投與途徑及頻率以及患者群體。儘管對非人類蛋白質(諸如鼠類抗體)之免疫反應通常為最嚴重的，但甚至具有大部分或完全人類序列含量之治療劑可為免疫原性的。免疫原性係對於感知為外源之物質的一系列複雜反應，且可包括產生中和及非中和抗體、形成免疫複合體、補體活化、肥大細胞活化、發炎及全身性過敏反應。非所需免疫反應可能藉由直接干擾抗原識別、改變與效應分子之相互作用或擾動治療劑之血清半衰期或組織分佈來降低抗體及Fc融合蛋白治療劑之功效。

可使用市售服務(諸如藉由R.I., Providence之Epivax公司提供之服務)分析蛋白質治療劑以預測潛在免疫原性抗原決定基之存在。亦可使用諸如IEDB共識法(Consensus method)之方法預測潛在免疫原性抗原決定基。在一些實施例中，電子雜交演算法可預測結合於II類MHC分子之抗原決定基。用該等演算法分析多肽之資料集提供經預測之抗原決定基。經預測之抗原決定基用於製造肽，其藉由自動化肽合成或重組DNA技術之標準方法製備。自Epivax提供之評分資訊可提供在群體中識別經預測之抗原決定基之分佈廣泛程度的指示。評分愈低，預測之免疫原性潛力愈低。

如本文所用，「T-區域抗原決定基(T-regitope)」為單株抗體構架區內之胺基酸序列，其可潛在地活化天然調節T細胞且減少非所需免疫反應。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段包含8、7、6、5、4、3、2、1或0個非生殖系T細胞抗原決定基。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段具有低免疫原性風險，例如具有約-45.11、-45.32、-46.16或-46.26之T-reg調節之評分。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段具有約-45.11之T-reg調節之評分及0個非生殖系T細胞抗原決定基。編碼抗 E - 選滯蛋白抗體之核酸

本發明亦提供編碼本發明抗體中之任一者之多核苷酸，包括本文所描述之抗體部分及經修飾抗體。本發明亦提供製造本文所描述之多核苷酸中之任一者的方法。可藉由此項技術中已知之程序製造多核苷酸及表現蛋白質。

所需抗體或其抗原結合片段及編碼該抗體或其抗原結合片段之核酸的序列可使用標準定序技術測定。可將編碼所需抗體或其抗原結合片段之核酸分子插入至各種載體(諸如選殖及表現載體)中以用於重組產生及表徵。編碼重鏈或重鏈之抗原結合片段的核酸分子及編碼輕鏈或輕鏈之抗原結合片段的核酸分子可經選殖至同一載體或不同載體中。

在一些實施例中，本發明提供編碼以下抗E-選滯蛋白抗體及其抗原結合片段中之任一者之胺基酸序列的多核苷酸：抗體1444、0841、0978、0164、1448、1284、1282、0525、0039、0265_0254、0158、0929_548、0159、0955_0300、0170、0564、0180及0027。在一個實施例中，本發明提供編碼抗E-選滯蛋白抗體1444及其抗原結合片段之胺基酸序列的多核苷酸。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗E-選滯蛋白抗體HC多肽之多核苷酸，該等多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:7、13、22、28、34、37、40、43、51、59、62、74、76、89、91、103、110、117及124。在一些實施例中，本發明提供編碼抗E-選滯蛋白抗體HC多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗E-選滯蛋白抗體LC多肽之多核苷酸，該等多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1、17、26、31、46、56、67、72、81、86、96、101、105、115及119。在一些實施例中，本發明提供編碼抗E-選滯蛋白抗體LC多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗E-選滯蛋白抗體VH域多肽之多核苷酸，該等多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:11、25、30、35、39、42、45、55、60、66、75、80、90、95、104、114、118及128。在一些實施例中，本發明提供編碼抗E-選滯蛋白抗體VH域多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明提供編碼一或多種抗E-選滯蛋白抗體VL域多肽之多核苷酸，該等多肽包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5、21、27、32、50、57、7、73、85、87、100、102、109、116及122。在一些實施例中，本發明提供編碼抗E-選滯蛋白抗體VL域多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或由其組成。

本發明提供多核苷酸，其包含編碼抗體1444之HC域的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列。本發明亦提供多核苷酸，其包含編碼抗體1444之LC的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。另外，本發明提供多肽，其包含由以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之DNA插入物編碼的胺基酸序列，該插入物編碼抗體1444之VH域。本發明進一步提供多肽，其包含由以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物編碼的胺基酸序列，該插入物編碼抗體1444之VL域。

本發明亦提供多核苷酸，其包含：編碼抗體1444之HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列；以及編碼抗體1444之LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。

本發明亦提供多核苷酸，其包含：編碼抗體1444之VH域的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列；以及編碼抗體1444之VL域的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。

本發明亦提供多核苷酸，其包含：編碼抗體1444之重鏈的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之質體之插入物的核酸序列；以及編碼抗體1444之輕鏈的以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之質體之插入物的核酸序列。

在一些實施例中，本發明提供編碼抗E-選滯蛋白抗體之多核苷酸及其變異體，其中該等變異體多核苷酸與表2中所揭示之核酸序列中之任一者共有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%核酸序列一致性。此等量並不意謂為限制性的，且所敍述百分比之間的增量特定地設想為本發明之部分。

在一個實施例中，VH及VL域或其抗原結合片段或全長HC或LC由獨立多核苷酸編碼。或者，VH及VL兩者或其抗原結合片段或HC及LC由單個多核苷酸編碼。

本發明亦涵蓋與任何該等序列互補之多核苷酸。多核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股的，且可為DNA (基因組、cDNA、或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子；及mRNA分子，其不含內含子。額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於本發明之多核苷酸內，且多核苷酸可(但未必)連接於其他分子及/或支撐材料。

多核苷酸可包含編碼抗體或其片段之核酸序列或可包含該序列之變異體。多核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，以使得經編碼多肽之結合特徵相對於天然抗體分子不會降低。可如本文所描述大體上評估對藉由變異體核酸序列編碼之多肽之結合特徵的效應。在一些實施例中，多核苷酸變異體展現與編碼不包含任何取代、添加、缺失及/或插入之原始(親本)抗體或其片段的多核苷酸序列之至少約70%一致性、至少約80%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性、至少98%一致性或至少99%一致性。此等一致性百分比並不意謂為限制性的，且所述百分比之間的增量特定地設想為本發明之部分。

如本文中所描述，根據最大一致性比對時，若兩個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則稱該兩個多核苷酸或多肽序列「一致」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗口比較序列以鑑別且比較局部區之序列類似性來進行。如本文中所使用之「比較窗口」係指具有至少約20個鄰近位置，通常30至約75或40至約50之片段，其中兩個序列經最佳比對之後，序列可與具有相同數目之鄰近位置的參考序列相比較。在一些實施例中，多核苷酸與本文所揭示之多核苷酸至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%一致。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VL域由包含選自由SEQ ID NO:137、145、147、149、154、165、158、160、162、164、166、168、170、172及174組成之群之核酸序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VL域由包含與選自由SEQ ID NO:137、145、147、149、154、165、158、160、162、164、166、168、170、172及174組成之群之核酸至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核酸序列的多核苷酸編碼。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VL域由包含與SEQ ID NO:137之核酸序列至少90%一致之核酸序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VL域由包含SEQ ID NO:137之核酸序列或由其組成的多核苷酸編碼。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VH域由包含選自由SEQ ID NO:136、144、146、148、150、151、152、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171及173組成之群之核酸序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VH域由包含與選自由SEQ ID NO: 136、144、146、148、150、151、152、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171及173組成之群的核酸至少80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核酸序列的多核苷酸編碼。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VH域由包含與SEQ ID NO:136至少90%一致之核酸序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體VH域由包含SEQ ID NO:136之核酸序列或由其組成的多核苷酸編碼。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體HC由包含與SEQ ID NO:206或207至少90%一致之核酸序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體HC由包含SEQ ID NO:206或138之核酸序列或由其組成的多核苷酸編碼。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體LC由包含與SEQ ID NO:139至少90%一致之核酸序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體LC由包含SEQ ID NO:139之核酸序列的多核苷酸編碼。

多核苷酸變異體亦可或可替代地實質上與基因或其片段或互補序列同源。該等多核苷酸變異體在適當嚴格條件下能夠與編碼抗體(或互補序列)之天然存在DNA序列雜交。

合適的「適當嚴格條件」包括在5×SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌；在約50℃至65℃下使5×SSC (0.75 M NaCl，0.075 M檸檬酸鈉)雜交隔夜；隨後在65℃下用含有0.1% SDS之2×、0.5×及0.2×SSC中之各者洗滌兩次，持續20分鐘。

如本文所用，「高度嚴格條件」或「較高嚴格度條件」如下：(1)使用低離子強度及高溫用於洗滌，例如在50℃下0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下具有0.1%牛血清白蛋白之50% (v/v)甲醯胺/0.1%菲科爾(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/具有750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之50 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺、5×SSC、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×Denhardt氏溶液、音波處理鮭魚精子DNA (50 µg/mL)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，其中在42℃下在0.2×SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃下在50%甲醯胺中洗液，隨後在55℃下用由含EDTA之0.1×SSC組成的較高嚴格度洗液洗滌。熟習此項技術者將認識到如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似物之因素。

一般熟習此項技術者應瞭解，由於遺傳密碼之簡併性，存在多種編碼如本文所描述之多肽之胺基酸序列的核苷酸序列。此等多核苷酸中之一些帶有與任何天然基因之核苷酸序列的最小同源性。亦即，存在用以編碼20個天然胺基酸之64個不同密碼子，其中一些胺基酸具有編碼其之多個密碼子(例如6個不同密碼子編碼白胺酸)。因此，大量核酸序列可編碼相同蛋白質序列，使得編碼相同多肽胺基酸序列之兩個核酸可共有極低核酸序列一致性。因此，本發明特定涵蓋因密碼子使用差異而改變之多核苷酸。

此外，包含本文所提供之多核苷酸序列之基因的對偶基因在本發明範疇內。對偶基因係由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加及/或取代)而改變的內源基因。所得mRNA及蛋白可(但未必)具有經改變的結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來鑑別。

本發明之多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學多核苷酸合成方法為此項技術中所熟知且無需詳細描述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商用DNA合成器以產生所需DNA序列。

為使用重組方法製備多核苷酸，可將包含所需序列之多核苷酸插入適合載體中，且繼而可將載體引入適合宿主細胞中進行複製及擴增，如本文中進一步論述。可藉由此項技術中已知之任何方式來將多核苷酸插入宿主細胞中。藉由利用直接吸收、內吞作用、轉染、F-配對或電穿孔將外源性多核苷酸引入來使細胞轉型。一旦引入，外源性多核苷酸可作為非整合載體(諸如質體)維持在細胞內或整合至宿主細胞基因體中。如此擴增之多核苷酸可藉由此項技術中熟知之方法與宿主細胞分離。參見例如Sambrook等人, 1989。

或者，PCR允許DNA序列複製。PCR技術在此項技術中熟知且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis等人編, Birkauswer Press, Boston, 1994。

RNA可藉由使用適當載體中之經分離DNA且將其插入適合宿主細胞中獲得。當細胞複製且DNA轉錄成RNA時，可接著使用熟習此項技術者熟知方法分離RNA，例如，如Sambrook等人, 1989中所示。

如本文所用，術語「載體」意謂構築體，其能夠在宿主細胞中傳遞且較佳表現一或多個所關注之基因或序列(例如，編碼抗E-選滯蛋白抗體之HC、LC、VH、VL及/或其片段之核酸)。載體之實例包括但不限於病毒載體(例如AAV)、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞，諸如生產細胞。

適合的選殖及表現載體可包括多種組分，諸如啟動子、強化子及其他轉錄調節序列。載體亦可經構築以允許抗體可變域後續選殖至不同載體中。適合選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量在此項技術中可用之選殖載體。儘管所選選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞而變化，但適用選殖載體一般將能夠自我複製，可具有特定限制性核酸內切酶之單一目標，及/或可載有可用於選擇含有載體之純系的標記物之基因。適合實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。此等及許多其他選殖載體可購自商業供應商，諸如BioRad、Stratagene及Invitrogen。

進一步提供表現載體。表現載體一般為含有根據本發明之多核苷酸的可複製多核苷酸構築體。此意味著表現載體，作為游離基因體或作為染色體DNA之整體部分，在宿主細胞中必須為可複製的。適合表現載體包括但不限於質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分可一般包括但不限於以下中之一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記物基因；適合轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯),亦通常需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯啟動位點及終止密碼子。

在一些實施例中，細胞(例如經分離或在生物體內)經包含編碼異源多核苷酸(例如抗E-選滯蛋白抗體之HC、LC、VH域、VL域，或其抗原結合片段)之重組核酸及AAV衣殼的重組AAV (rAAV)轉導。重組核酸可進一步包含用於在經轉導細胞內表現異源多核苷酸之調節元件(例如，啟動子、強化子、內含子、外顯子、polyA)。重組核酸可進一步包含病毒反向串聯重複(ITR)序列。在一些實施例中，AAV衣殼為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或此項技術中已知之任何其他野生型或重組AAV衣殼。ITR序列可為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10，或此項技術中已知之任何其他野生型或重組ITR序列(例如AAV2)。在一些實施例中，rAAV包含編碼抗E-選滯蛋白抗體之HC、LC、VH域、VL域，或其抗原結合片段之重組核酸；啟動子；AAV ITR及病毒衣殼。該rAAV適用於在細胞中表現抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以治療或預防個體(例如患者)中之由E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀(例如SCD)。

含有所關注多核苷酸之載體及/或多核苷酸本身可藉由多種適當方式中之任一者引入宿主細胞中，包括電穿孔，使用氯化鈣或聚乙烯亞胺(PEI)、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如其中載體為諸如痘瘡病毒之感染物)。引入載體或多核苷酸之選擇將通常視宿主細胞之特徵而定。

在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO: 137、145、147、149、154、165、158、160、162、164、166、168、170、172及174組成之群的核酸序列。在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:137之核酸序列至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核酸序列。在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含SEQ ID NO:137之核酸序列或由其組成。

在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含選自由SEQ ID NO: 136、144、146、148、150、151、152、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171及173組成之群的核酸序列。在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:136至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核酸序列。在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含SEQ ID NO:136之核酸序列或由其組成。

在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含i)SEQ ID NO:136之核酸序列；ii)SEQ ID NO:137之核酸；或iii)兩者。

在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:206或138至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核酸序列。在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含SEQ ID NO:206或138之核酸序列或由其組成。

在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含與SEQ ID NO:139至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致之核酸序列。在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含SEQ ID NO:139之核酸序列或由其組成。

在一些實施例中，載體包含多核苷酸，其包含i)SEQ ID NO:206或138之核酸序列；ii)SEQ ID NO:139之核酸；或iii)兩者。

如本文所用，術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且意謂個別細胞或細胞培養物，其可為或已為用於多核苷酸及/或併入多核苷酸插入物之載體的受體。宿主細胞包括「轉型體」、「經轉型細胞」及「經轉導細胞」，其包括原代經轉型細胞或經轉導細胞及自其衍生之後代，不考慮繼代次數。由於自然、偶然或目的性突變，宿主細胞後代可能未必與原始母細胞完全相同(在形態或基因組DNA互補序列方面)。宿主細胞包括經本發明之多核苷酸(例如編碼抗E-選滯蛋白抗體之胺基酸序列的多核苷酸)或包含其之載體進行活體內轉染及/或轉型之細胞。

宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。例示性真核細胞包括哺乳動物細胞，諸如靈長類動物或非靈長類動物細胞；真菌細胞，諸如酵母；植物細胞；以及昆蟲細胞。

抗體或其抗原結合片段可使用適合之宿主細胞以重組方式製得。本發明之編碼抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之核酸可選殖至表現載體中，該表現載體接著可引入至宿主細胞中，其中該細胞不會以其他方式產生免疫球蛋白蛋白質，以獲得重組宿主細胞中抗體之合成。對細胞培養物敏感及蛋白質或多肽表現敏感之任何宿主細胞均可根據本發明使用。在某些實施例中，宿主細胞為哺乳動物。可作為宿主用於表現之哺乳動物細胞株為此項技術中所熟知且包括許多可購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)之永生化細胞株。非限制性例示性哺乳動物細胞包括但不限於NS0細胞、HEK 293及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，以及其衍生物，諸如293-6E及CHO DG44細胞，CHO DXB11，及Potelligent® CHOK1SV細胞(BioWa/Lonza, Allendale, NJ)。哺乳動物宿主細胞亦包括但不限於人類子宮頸癌細胞(HeLa，ATCC CCL 2)、嬰兒倉鼠腎(BHK，ATCC CCL 10)細胞、猴腎細胞(COS)及人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)。可根據本發明使用之哺乳動物細胞之其他非限制性實例包括人類視網膜母細胞(PER.C6®；CruCell, Leiden, The Netherlands)；經SV40 (COS-7，ATCC CRL 1651)轉型之猴腎CV1細胞株；經次選殖以用於在懸浮培養物中生長之人類胚胎腎細胞株293 (HEK 293)或293細胞(Graham等人, J. Gen Virol. 1997; 36:59)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell) (TM4, Mather, Biol. Reprod. 1980; 23:243-251)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci. 1982; 383:44-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；人類肝癌細胞株(Hep G2)；及大量骨髓瘤細胞株，包括但不限於BALB/c小鼠骨髓瘤細胞株(NS0/1，ECACC號：85110503)、NS0細胞及Sp2/0細胞。

另外，任何數目之市售及非市售的表現多肽或蛋白質之細胞株均可根據本發明使用。熟習此項技術者將瞭解，不同細胞株可具有不同營養需求及/或可需要不同培養條件以實現最佳生長及多肽或蛋白質表現，且將能夠視需要改變條件。用途 治療方法

在一些實施例中，本發明提供用於使用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段來降低或抑制E-選滯蛋白活性之治療方法，其中該治療方法包含投與治療有效量之包含抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物。所治療之病症為藉由去除、抑制或降低E-選滯蛋白活性來改善、緩解、抑制或預防之任何疾病或病狀(例如SCD)。

使用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之方法包括但不限於治療及/或預防與E-選滯蛋白表現及/或E-選滯蛋白結合於配位體(例如，sLex A及/或X決定子)相關或由其介導之疾病、病症及病狀的方法，該等疾病、病症及病狀包括但不限於SCD、血管閉塞性危象、疼痛、器官梗塞、缺血、中風、終末器官功能障礙、急性胸部及血管阻塞。本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段亦可用於治療及/或預防其他疾病、病症及病狀，諸如皮膚病(例如牛皮癬)、發炎疾病(例如類風濕性關節炎)及糖尿病併發症。

本發明提供特異性結合於E-選滯蛋白且能夠中和E-選滯蛋白功能活性之新穎治療性抗體。此等抗體在用作SCD之預防性治療時，可有利地用於預防VOC或減少VOC之發生。在一些實施例中，與未用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之個體或個體群組(例如患有SCD之患者)中之VOC的發生率相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之VOC的發生率減少了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，與在用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之前的相同個體中之VOC的發生率相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之VOC的發生率減少了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之VOC的發生率與未患有SCD之個體或個體群體中之VOC的發生率並無顯著不同。在一些實施例中，在一段時間內量測VOC之發生率(例如VOC事件之數目)。在一些實施例中，在數天、數週、數月或數年內量測VOC之發生率(例如VOC事件之數目)。

在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可降低發生鐮狀細胞相關疼痛危象之按年計算速率。如本文所提及，鐮狀細胞相關疼痛危象為疼痛急性發作，除了血管閉塞事件以外並無醫學上確定之病因，其可引起前往醫療機構就診及/或可引起用經口或非經腸麻醉劑或用非經腸類固醇消炎藥進行治療。在一些實施例中，急性胸部症候群、肝臟離症、脾臟離症及恆久勃起被視為鐮狀細胞相關疼痛危象。

在一些實施例中，與未用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之個體或個體群組(例如患有SCD之患者)中發生之鐮狀細胞相關疼痛危象的按年計算速率相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之鐮狀細胞相關疼痛危象的按年計算速率低了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，與在用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之前的相同個體中發生之鐮狀細胞相關疼痛危象的按年計算速率相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之鐮狀細胞相關疼痛危象的按年計算速率低了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之鐮狀細胞相關疼痛危象的按年計算速率與未患有SCD之個體或個體群體中發生之鐮狀細胞相關疼痛危象的按年計算速率並無顯著不同。

在一些實施例中，與未用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之個體或個體群組(例如患有SCD之患者)中發生之第一次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之第一次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間長了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，與在用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之前的相同個體中發生之第一次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之第一次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間長了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之第一次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間與未患有SCD之個體或個體群體中發生之第一次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間並無顯著不同。

在一些實施例中，與未用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之個體或個體群組(例如患有SCD之患者)中發生之第二次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之第二次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間長了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，與在用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之前的相同個體中發生之第二次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之第二次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間長了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中發生之第二次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間與未患有SCD之個體或個體群體中發生之第二次鐮狀細胞相關疼痛危象的中值時間並無顯著不同。

在一些實施例中，與未用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之個體或個體群組(例如患有SCD之患者)中之無併發症鐮狀細胞相關疼痛危象的中值速率相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之無併發症鐮狀細胞相關疼痛危象的中值速率低了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，無併發症危象係除急性胸部症候群、肝臟離症、脾臟離症及/或恆久勃起以外之危象。在一些實施例中，與在用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之前的相同個體中之無併發症鐮狀細胞相關疼痛危象的中值速率相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之無併發症鐮狀細胞相關疼痛危象的中值速率低了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之無併發症鐮狀細胞相關疼痛危象的中值速率與未患有SCD之個體或個體群體中之無併發症鐮狀細胞相關疼痛危象的中值速率並無顯著不同。

本發明之抗體亦可有利地用於藉由減少VOC之持續時間(例如，減少使VOC消退的時間)、嚴重程度及/或強度來治療患有SCD之患者中的急性VOC。在一些實施例中，與未用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之個體或個體群組(例如患有SCD之患者)中之VOC的持續時間、嚴重程度及/或強度相比，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之VOC的持續時間、嚴重程度及/或強度減少了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，與在用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段進行治療之前的相同個體中之VOC的持續時間、嚴重程度及/或強度相比，用抗E-選滯蛋白抗體治療之個體(例如患有SCD之患者)中之VOC的持續時間、嚴重程度及/或強度減少了約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施例中，用抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之個體(例如患有SCD之患者)中之VOC的持續時間、嚴重程度及/或強度與未患有SCD之個體或個體群體中之VOC的持續時間、嚴重程度及/或強度並無顯著不同。

抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段亦可用於治療、預防及/或改善SCD之至少一種征狀及/或症狀，例如，影響以下之彼等征狀及/或症狀：心胸系統(例如慢性限制性肺病、左心室舒張性疾病、肺高血壓、急性胸部症候群、心律不整、猝死、血管閉塞性危象)、神經系統(例如出血性中風、靜脈竇栓塞、腦之無症狀腦梗塞、慢性疼痛、腦之急性缺血性中風、增生性視網膜病變、眼眶梗塞、認知障礙)、網狀內皮系統(例如脾臟離症、功能性低脾功能症、貧血、溶血)、肌骨胳系統(例如缺血性壞死、皮膚潰瘍)、泌尿生殖系統(例如乳頭狀壞死、蛋白尿、腎衰竭、血尿、夜間遺尿、恆久勃起)及腸胃系統(例如膽石症、膽管病、肝病、腸系膜血管閉塞)。

在一些實施例中，本發明包括經分離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合E-選滯蛋白且調節至少一種可偵測E-選滯蛋白活性，使得該抗體：(a)減少白血球繫鏈至內皮細胞；(b)減少穩定黏著於內皮細胞之活化；(c)減少白血球緩慢滾動直至阻滯；(d)減少白血球之有效跨內皮遷移；(e)降低CD18整合素之親和力及親合力；(f)減少運輸白血球至急性發炎部位；(g)減少胞溶質鈣；(h)減少使p38 MAP激酶及Syk激酶活化之酪胺酸磷酸化；(i)減少自血液募集血小板及白血球至血管內皮；及/或(j)並不產生促發炎環境。

使用本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段治療之方法包括預防性及/或治療性治療。若在病狀之臨床表現之前投與治療，則治療視為預防性的。舉例而言，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之投與在用作針對SCD之預防性治療(例如，在一段時間內之一或多次劑量)時可用於預防VOC(例如，減少VOC事件之頻率)。治療性治療包括例如改善或減輕疾病之嚴重程度或縮短疾病時長。舉例而言，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之投與可用於藉由減少VOC之持續時間、強度及/或嚴重程度來治療患有SCD之患者中的急性VOC。

在一些實施例中，待治療之個體可為哺乳動物，且尤其人類患者，例如患有SCD之患者。個體可能需要治療，此係因為，由於HBB基因編碼序列中之一或多個突變，β-血球蛋白蛋白質不當地表現，例如具有不恰當的胺基酸序列。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之投與可用於治療及/或預防SCD(例如VOC)、SCD或SC病之變異體之至少一種病徵及/或症狀。抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之投與可用於治療及/或預防具有HBSS、HBSC、HBSE、HBS/β°thal、HBS/β⁺ thal或HBS-變異體基因型之個體中之至少一種病徵及/或症狀。

本發明進一步涵蓋如本文所定義之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其用於所定義之治療及/或預防方法中。在提及如本文所描述之治療及/或預防方法之實施例中，該等實施例亦包括關於抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物用於彼治療及/或預防，或替代地用於製造供治療及/或預防SCD症狀用之藥劑的其他實施例。 組合療法

本發明之抗體或其抗原結合片段可與一或多種可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的額外治療活性化合物或治療方法組合投與。本發明涵蓋治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的方法，其包含向有需要之患者投與一定量之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，與一定量之可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的治療活性化合物或治療方法的組合。在一些實施例中，治療SCD之症狀包括減少急性VOC之持續時間及強度。在一些實施例中，預防SCD之症狀包括減少VOC事件之頻率。

本發明亦涵蓋治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的方法，其包含向有需要之患者投與一定量之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段及一定量之可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的治療活性化合物或治療方法，其中該等量結合在一起可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀。

在另一實施例中，本發明係關於治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的方法，其包含向有需要之患者投與一定量之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段及一定量之可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的治療活性化合物或治療方法，其中該等量結合在一起達成治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面的協同效應，亦即，該組合為「協同的(synergistic)」(亦即，該組合提供比兩種或多於兩種個別療法之簡單累加效應更大的效應)。該等協同組合療法可以有利地利用較低劑量之所投與治療劑，從而避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。

適用於治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的額外治療活性化合物包括例如：預防肺炎球菌感染之青黴素預防、羥基尿素(例如DROXIA、HYDREA)、L-麩醯胺酸(例如ENDARI)、立贊利珠單抗(ADAKVEO)、沃西洛特(OXBRYTA)、阿派沙班(ELIQUIS)、利伐沙班(XARELTO)、非類固醇消炎藥、鎮痛劑(一般為類鴉片鎮痛劑)、IW-1701、瑞司瓜特(ADEMPAS)、替卡格雷(ticagrelor) (BRILINTA)、美金剛胺(NAMENDA)及其組合。

適用於治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的額外治療活性化合物包括以下化合物，諸如：抗P-選滯蛋白抗體(例如立贊利珠單抗(ADAKVEO))；調節HbS之化合物；調節HbS之氧親和力的化合物(例如沃西洛特(OXBRYTA))；藉由調節2,3-二磷酸甘油酸之生成而靶向HbS聚合的化合物；藉由誘發胎兒血紅蛋白(HbF)之表現而靶向HbS聚合的化合物(例如羥基尿素)；靶向功能障礙性細胞黏著、血管功能障礙及/或發炎之化合物(例如磷酸二酯酶-9抑制劑)；增加血液中氧化氮之含量的化合物(例如可溶性鳥苷酸環化酶刺激劑，例如IW-1701、瑞司瓜特(ADEMPAS))；靜脈內用免疫球蛋白；靶向高血液凝固性之化合物(例如瑞司瓜特(ADEMPAS)、阿派沙班(ELIQUIS)、利伐沙班(XARELTO))；阻斷NMDA受體結合之化合物(例如美金剛胺(NAMENDA))。

適用於治療及/或預防SCD(例如VOC)之至少一種病徵及/或症狀的額外治療活性化合物為調節HbS以使其維持在其R狀態(亦即含氧狀態)之化合物，諸如WO 2020/109994中所描述且以引用之方式併入本文中之彼等化合物。在一些實施例中，調節HbS以使其維持在其R狀態之化合物包括2-胺基喹啉化合物。在一些實施例中，調節HbS以使其維持在其R狀態之化合物為6-{(1S)-1-[(2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基]乙基}-5-(1 H-吡唑-1-基)吡啶-2-醇、視情況以固體形式製備為其醯胺互變異構體(S)-6-(1-((2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基)乙基)-5-(1 H-吡唑-1-基)吡啶-2(1H)-酮、。

適用於治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的治療活性治療方法包括補充氧；輸血，視情況伴有鐵螯合；骨髓移植；基因療法(例如LentiGlobin®)；藉由CRISPR之基因編輯療法(例如CTX001)或鋅指技術及其組合。

本發明涵蓋一種醫藥組合物，其包含：抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段；治療活性化合物或治療方法，其可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀；及醫藥學上可接受之載劑，其用於治療及/或預防SCD(例如VOC)之至少一種病徵及/或症狀。本發明涵蓋一種醫藥組合物，其包含：協同治療有效量之抗E-選滯蛋白抗體；協同治療有效量之治療活性化合物或治療方法，其可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀；及醫藥學上可接受之載劑，其用於治療及/或預防SCD(例如VOC)之至少一種病徵及/或症狀。組合物可進一步包含額外治療劑，諸如但不限於至少一種可有效治療及/或預防SCD(例如VOC)之至少一種病徵及/或症狀的其他治療活性化合物或治療方法。

熟習此項技術者應理解，基於其中所提供之揭示內容，治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的方法涵蓋向先前用或當前正接受至少一種治療及/或預防SCD(例如VOC)之至少一種病徵及/或症狀的額外治療劑之患者，投與協同治療有效量之抗E-選滯蛋白抗體及協同治療有效量之可有效治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀的治療活性化合物或治療方法。

該額外治療劑涵蓋作為治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀之標準照護療法的藥劑。亦即，可將本發明之組合療法添加至已接受不同療法之SCD患者的治療方案中，該不同療法包括但不限於L-麩醯胺酸、羥基尿素、輸血(視情況伴有鐵螯合)及此項技術中已知之任何其他療法。

熟習此項技術者將能夠根據已知方法在考慮諸如年齡、體重、一般健康狀況、所投與化合物、投與途徑、SCD治療之性質及進展及其他藥物之存在的因素的情況下，確定向患有SCD之患者投與如本發明之組合中所用的各化合物的適當量、劑量(dose)或劑量(dosage)。

組合療法之預防劑或治療劑(包括抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段)可以同一醫藥組合物向個體投與(例如，該等療法為共調配的)。或者，組合療法之預防劑或治療劑可以獨立醫藥組合物向個體同時投與(例如，該等療法為共投與的)。組合療法之預防劑或治療劑可根據相同給藥方案(例如，兩種療法係每天進行投與)或根據不同給藥方案(例如，一種療法係每天進行投與，另一種療法係每週進行投與)進行投與。預防劑或治療劑可藉由相同或不同投與途徑向個體投與。

組合療法之預防劑或治療劑(包括抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段)及6-{(1S)-1-[(2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基]乙基}-5-(1 H-吡唑-1-基)吡啶-2-醇、視情況以固體形式製備為其醯胺互變異構體(S)-6-(1-((2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基)乙基)-5-(1 H-吡唑-1-基)吡啶-2(1H)-酮可以獨立醫藥組合物向個體同時投與(例如該等療法為共投與的)。組合療法之該預防劑或治療劑可根據相同給藥方案(例如，兩種療法係每天進行投與)或根據不同給藥方案(例如，一種療法係每天進行投與，另一種療法係每週進行投與)進行投與。此外，該預防劑或治療劑可藉由相同或不同投與途徑向個體投與。

預防劑或治療劑(包括抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段)及6-{(1S)-1-[(2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基]乙基}-5-(1H-吡唑-1-基)吡啶-2-醇、視情況以固體形式製備為其醯胺互變異構體(S)-6-(1-((2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基)乙基)-5-(1H-吡唑-1-基)吡啶-2(1H)-酮可以組合形式投與，以在個體中減少VOC之持續時間(例如減少使VOC消退的時間)、嚴重程度及/或強度，降低鐮狀細胞相關疼痛危象產生之按年計算速率，增加第一次鐮狀細胞相關疼痛危象產生之中值時間，增加第二次鐮狀細胞相關疼痛危象產生之中值時間及/或降低無併發症鐮狀細胞相關疼痛危象產生之中值速率。

本發明進一步涵蓋如本文所定義之包括抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之組合療法之預防劑或治療劑，其用於所定義之治療及/或預防方法中。在提及如本文所描述之治療及/或預防方法之實施例中，該等實施例亦包括關於組合療法(包括抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物)用於彼治療及/或預防，或可替代地用於製造供彼治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀用之藥劑的其他實施例。

本發明提供用於向有需要之個體單獨或與其他療法組合投與包含本發明之E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物的方案。本發明之組合療法中之療法(例如，預防劑或治療劑)可向個體同時或連續投與。本發明之組合療法中之療法(例如，預防劑或治療劑)亦可循環投與。循環療法涉及在一段時間內投與第一療法(例如第一預防劑或治療劑)，隨後在一段時間內投與第二療法(例如第二預防劑或治療劑)且重複此依序投與，亦即循環，以降低對該等療法(例如藥劑)中之一者之耐藥性之發展，以避免或降低該等療法(例如藥劑)中之一者之副作用，及/或改良該等療法之功效。

本發明之組合療法中之療法(例如，預防劑或治療劑)可同時向個體投與。術語「同時」不限於在恰好同一時間投與療法(例如，預防劑或治療劑)，但實際上其意謂包含本發明之E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物以一順序且在一時間間隔內向個體投與，以使得本發明之抗體或其結合物可與其他療法一起起作用以提供比其以其他方式投與時增加的益處。舉例而言，各療法可同時或按任何次序在不同時間點連續向個體投與；然而，若未同時投與，則其應在時間充分接近時經投與以提供所需治療性或預防劑效應。各療法可以任何適當形式且藉由任何適合途徑分別向個體投與。在各種實施例中，可相隔小於15分鐘、小於30分鐘、小於1小時，相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時，相隔約2小時至約3小時，相隔約3小時至約4小時，相隔約4小時至約5小時，相隔約5小時至約6小時，相隔約6小時至約7小時，相隔約7小時至約8小時，相隔約8小時至約9小時，相隔約9小時至約10小時，相隔約10小時至約11小時，相隔約11小時至約12小時，相隔24小時，相隔48小時，相隔72小時或相隔1週向個體投與療法(例如，預防劑或治療劑)。在其他實施例中，兩種或多於兩種療法(例如，預防劑或治療劑)可在同一患者就診期內投與。

組合療法中之預防劑或治療劑可以同一醫藥組合物向個體投與。或者，組合療法中之預防劑或治療劑可以獨立醫藥組合物同時向個體投與。預防劑或治療劑可藉由相同或不同投與途徑向個體投與。 診斷用途

本發明之抗E-選滯蛋白抗體、抗體組合物及方法具有活體外及活體內效用，包括免疫分析及用於診斷及評估E-選滯蛋白介導之病症之治療的用途。該等方法尤其適用於診斷、評估及治療患有與E-選滯蛋白存在相關之病症的人類患者。與E-選滯蛋白存在相關之此病症包括但不限於SCD、皮膚病(例如牛皮癬)、發炎疾病(例如類風濕性關節炎)及糖尿病併發症。

本發明提供用於偵測樣品中E-選滯蛋白之存在的方法，該方法包含使疑似包含E-選滯蛋白之樣品與對E-選滯蛋白具有特異性之抗體接觸，且偵測與該抗體結合之E-選滯蛋白的存在，由此偵測該樣品中之E-選滯蛋白。用於偵測與該抗體結合之E-選滯蛋白的方法為此項技術中熟知的，包括但不限於以下之分析，其中使E-選滯蛋白結合於固體支撐物且向其中添加樣品，從而允許該抗體結合該樣品中之E-選滯蛋白。添加與結合於固體支撐物之抗體相同或不同的第二E-選滯蛋白抗體且可藉由直接標記(亦即，使第二抗體與可偵測標記結合)或藉由添加例如來自與第二抗體之恆定域反應且包含可偵測標記之另一物種的第三抗體來偵測。因此，該分析可用於偵測樣品中E-選滯蛋白之存在或不存在。

本發明亦提供用於測定樣品中E-選滯蛋白之濃度的方法，該方法包含：提供經標記之競爭物，其包含偶合至可偵測標記之E-選滯蛋白；提供特異性結合E-選滯蛋白之抗體或其抗原結合片段；合併樣品、抗體及經標記之競爭物，其中樣品中之E-選滯蛋白與經標記之競爭物競爭結合於抗體；以及藉由利用偵測標記而量測未結合於抗體之經標記競爭物之量來測定該樣品中E-選滯蛋白之濃度。將在無樣品存在下結合於抗體之經標記競爭物的量與在添加樣品時結合於抗體之經標記競爭物的量進行比較。在無樣品存在下所結合之經標記競爭物的減少量為存在於樣品中未經標記之E-選滯蛋白之量的指標，使得該分析可用於評估樣品中E-選滯蛋白之存在及含量。在一些實施例中，E-選滯蛋白為可溶性E-選滯蛋白。在一些實施例中，E-選滯蛋白為膜結合E-選滯蛋白。

在一個實施例中，本發明提供用於評估針對與個體中E-選滯蛋白之含量增加相關之疾病或病症之治療有效性的方法，該方法包含向個體投與治療，且將治療前自個體獲得之樣品中E-選滯蛋白之含量與治療後自個體獲得之其他方面相同之樣品中E-選滯蛋白之含量進行比較，其中使用E-選滯蛋白特異性抗體評估樣品中E-選滯蛋白之含量，且此外其中，與治療前自個體收集之樣品中E-選滯蛋白之含量相比，治療後自個體收集之樣品中E-選滯蛋白之較低含量為治療過程之有效性的指標。

關於E-選滯蛋白特異性抗體或經標記競爭物之術語「經標記」包括藉由將可偵測物質偶合(亦即實體連接)至抗體或經標記競爭物進行之直接標記，以及藉由使抗體或經標記競爭物與經直接標記之另一試劑偶合而進行的抗體或經標記競爭物之間接標記。間接標記之實例包括使用經螢光標記之二級抗體偵測初級抗體。用於偵測本發明之多肽的活體外技術包括酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、西方墨點法(Western blot)、免疫沈澱法及免疫螢光法。

術語「樣品」意欲包括自個體分離之組織、細胞及生物流體(例如血液、CSF、尿液等)，以及存在於個體內之組織、細胞及流體。

本文所描述之抗體、經標記競爭物及潛在治療劑亦適用於與多種具有一系列偵測系統之其他均質及異質免疫分析中之任一者一起使用。組合物

本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可調配為醫藥組合物。醫藥組合物可進一步包含呈凍乾調配物或水溶液形式之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑(Remington: The Science and practice of Pharmacy第21版, 2005, Lippincott Williams及Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」包括在與活性成分合併時使該成分保留生物活性且與個體之免疫系統無反應性的任何材料。

實例包括但不限於標準醫藥學載劑中之任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、水、標準生理鹽水(0.9%)、乳液(例如油/水乳液)及各種類型之濕潤劑。用於噴霧劑或非經腸投與之較佳稀釋劑為PBS及標準生理鹽水。

可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在該等劑量及濃度下對接受者無毒性，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、氯化苯索銨；苯酚、丁基醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如TWEEN^TM 、PLURONICS^TM 、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80 (PS80)、聚山梨醇酯60 (PS60)、聚山梨醇酯20 (PS20))或聚乙二醇(PEG)。醫藥學上可接受之賦形劑進一步描述於本文中。

本發明之醫藥化合物可包括一或多種醫藥學上可接受之鹽。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生於無毒無機酸之彼等物，諸如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及其類似物；以及衍生於無毒有機酸之彼等物，諸如脂族單甲酸及脂族二甲酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物。鹼加成鹽包括衍生於鹼土金屬之彼等物，諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及衍生於無毒有機胺之彼等物，諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物。

本發明之醫藥組合物亦可包括醫藥學上可接受之抗氧化劑。醫藥學上可接受之抗氧化劑之實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及其類似物；(2)油溶性抗氧化劑，諸如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及其類似物；及(3)金屬螯合劑，諸如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸及其類似物。

可用於本發明之醫藥組合物中之適合水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣材料、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。

此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。防止微生物之存在可藉由滅菌程序及藉由包括各種抗菌劑及抗真菌劑(例如,對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保。亦可能需要在組合物中包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外，對於可注射醫藥形式之延長吸收可藉由包括延遲吸收之藥劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來達成。

醫藥組合物通常必須在製造及儲存條件下為無菌且穩定的。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於較高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇以及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。在多數情況下，組合物中適合包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。對於可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收之藥劑(例如，單硬脂酸酯鹽及明膠)來達成。

無菌可注射溶液可藉由視需要將所需量之活性化合物與上文所列之一種成分或成分組合併入適當溶劑中，隨後進行滅菌微過濾來製備。

一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自以上所列舉成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其自其經預先無菌過濾之溶液產生具有活性成分加任何額外所需成分之粉末。

本發明之醫藥組合物可以適用於經眼投與之調配物形式製備、封裝或出售。該等調配物可例如呈滴眼劑形式，包括例如0.1%-1.0% (w/w)之活性成分於水性或油性液體載劑中之溶液或懸浮液。該等滴劑可進一步包含本文所描述之緩衝劑、鹽或一或多種其他額外成分。適用之其他可經眼投與之調配物包括包含呈微晶形式或脂質體製劑之活性成分的彼等調配物。

如本文所用，「額外成分」包括但不限於以下中之一或多者：賦形劑；界面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；粒化劑及崩解劑；黏合劑；潤滑劑；甜味劑；調味劑；著色劑；防腐劑；生理學上可降解之組合物，諸如明膠；水性媒劑及溶劑；油性媒劑及溶劑；懸浮劑；分散劑或潤濕劑；乳化劑、緩和劑；緩衝劑；鹽；增稠劑；填充劑；乳化劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；穩定劑；及醫藥學上可接受之聚合或疏水性物質。本發明之醫藥組合物可包括之其他「額外成分」為此項技術中已知且描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Genaro編, Mack Publishing Co., Easton, PA (1985)中，該文獻以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，在1 mL緩衝水溶液中，在含有100 mg抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段之小瓶中調配抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，在1 mL緩衝水溶液中，在含有150 mg抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段之小瓶中調配抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，在1 mL緩衝水溶液中，在含有15 mg、40 mg、100 mg、300 mg或600 mg之抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段之小瓶中調配抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，視情況用於皮下投與。在一些實施例中，在1 mL緩衝水溶液中，在含有500 mg抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段之小瓶中調配抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，視情況用於靜脈內投與。

在一些實施例中，醫藥組合物包含約25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL、150 mg/ml抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，醫藥組合物包含約100 mg/mL抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，適用於皮下及/或靜脈內投與之醫藥組合物包含約100 mg/mL抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以靜脈內或皮下調配物形式作為無菌水溶液投與，該無菌水溶液包含含有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以靜脈內或皮下調配物形式作為無菌水溶液投與，該無菌水溶液包含含有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段以靜脈內或皮下調配物形式作為無菌水溶液投與，該無菌水溶液包含含有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13之胺基酸序列的多肽及含有SEQ ID NO:1之胺基酸序列的多肽。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段以靜脈內或皮下調配物形式投與，該靜脈內或皮下調配物為含有約5 mg/mL、約10 mg/mL、約15 mg/mL、約20 mg/mL之抗體、約25 mg/mL、約50 mg/mL、約75 mg/mL、約100 mg/mL、約125 mg/mL或約150 mg/mL之抗體或其抗原結合片段的無菌水溶液。在一些實施例中，靜脈內或皮下調配物為包含乙酸鈉、聚山梨醇酯80及氯化鈉之無菌水溶液(pH在約5至6範圍內)。在一些實施例中，靜脈內調配物為含有5或10 mg/mL之抗體，以及20 mM乙酸鈉、0.2 mg/mL聚山梨醇酯80及140 mM氯化鈉的無菌水溶液(pH 5.5)。另外，包含抗體或其抗原結合片段之溶液可在許多其他化合物當中包含麩胺酸、組胺酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘胺酸、聚(伸乙基)二醇、EDTA、甲硫胺酸、聚山梨醇酯80及其任何組合，以及相關技術中已知之許多其他化合物。

在一個實施例中，本發明之醫藥組合物包含以下組分：50 mg/mL或100 mg/mL之本發明之抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或抗原結合片段、20 mM組胺酸、8.5%蔗糖及0.02%聚山梨醇酯80、0.005% EDTA (pH 5.8)。在一個實施例中，本發明之醫藥組合物包含以下組分：100 mg/mL之本發明之抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或抗原結合片段、10 mM組胺酸、5%蔗糖及0.01%聚山梨醇酯80 (pH 5.8)。

在一些實施例中，醫藥組合物包含濃度為100 mg/mL之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段(例如抗體1444)、1.12 mg/mL L-組胺酸、2.67 mg/mL L-組胺酸鹽酸鹽單水合物、85 mg/mL蔗糖、0.05 mg/mL二水合乙二胺四乙酸二鈉及0.2 mg/mL聚山梨醇酯80，pH為5.8，標稱填充體積為1.0 mL。該醫藥組合物適用於皮下或靜脈內投與。

該等醫藥組合物可以液體調配物或以凍乾粉末形式提供。當粉末以完整體積復原，組合物保持相同配方。或者，粉末可以一半體積復原，在此情況下組合物包含相同組分但濃度為兩倍。

關於其中藥劑為例如待用於組合療法中之小分子之治療劑，其可以生理學上可接受之酯或鹽形式存在於醫藥組合物中，諸如如此項技術中熟知與生理學上可接受之陽離子或陰離子組合。

本文所描述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後開發之任何方法來製備。一般而言，該等製備型方法包括使活性成分與載劑或一或多種其他附屬成分締合，且接著必要時或需要時將產物塑形或封裝成所需單劑量單位或多劑量單位之步驟。

在一些實施例中，本發明之組合物為實質上不含內毒素及/或相關熱解物質的無熱原質調配物。內毒素包括限制於微生物內且當微生物分解或死亡時經釋放之毒素。熱解物質亦包括來自細菌及其他微生物外膜之致熱、熱穩定物質(糖蛋白)。若向人類投與，此等物質則均可導致發熱、低血壓及休克。由於潛在有害影響，因此自靜脈內投與之醫藥藥物溶液移除即使低量之內毒素為有利的。食品與藥物管理局(「FDA」)已設定每劑量每公斤體重在單個一小時內用於靜脈內藥物應用之上限為5內毒素單位(EU) (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000))。當以每公斤體重幾百毫克或幾千毫克之量投與治療蛋白時，移除即使痕量之內毒素為有利的。在一個實施例中，組合物中之內毒素及熱原質含量小於10 EU/mg，或小於5 EU/mg，或小於1 EU/mg，或小於0.1 EU/mg，或小於0.01 EU/mg，或小於0.001 EU/mg。在另一實施例中，組合物中之內毒素及熱原質含量小於約10 EU/mg，或小於約5 EU/mg，或小於約1 EU/mg，或小於約0.1 EU/mg，或小於約0.01 EU/mg，或小於約0.001 EU/mg。給藥及投與

為製備包括本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之醫藥或無菌組合物，使該抗體與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合(參見上文)。治療劑及診斷劑之調配物可藉由與生理學上可接受之呈例如凍乾粉末、漿料、水溶液、洗劑或懸浮液形式的載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(參見例如, Hardman等人(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams及Wilkins, New York, N. Y.; Avis等人(編) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman等人(編) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman等人(編) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner及Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.)。

選擇治療劑之投與方案視若干因素而定，包括實體之血清或組織周轉率、症狀程度、實體之免疫原性及生物基質中之目標細胞之可接近性。在某些實施例中，投與方案根據副作用之可接受程度來使遞送至患者之治療劑之量最大化。因此，所遞送之生物製劑之量部分地視特定實體及所治療之病狀嚴重程度而定。可獲得選擇適當抗體、細胞介素及小分子劑量之導引(參見例如, Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (編), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (編),1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.; Baert等人, New Engl. J. Med. 2003; 348:601-608; Milgrom等人, New Engl. J. Med. 1999; 341:1966-1973; Slamon等人, New Engl. J. Med. 2001; 344:783-792; Beniaminovitz等人, New Engl. J. Med. 2000; 342:613-619; Ghosh等人, New Engl. J. Med. 2003; 348:24-32; Lipsky等人, New Engl. J. Med. 2000; 343:1594-1602)。

適當劑量由臨床醫師例如使用此項技術中已知或疑似影響治療或經預測影響治療之參數或因素來確定。一般而言，初始劑量為稍微小於最佳劑量的量，且其後以較小增量遞增，直至達成所需或最佳作用(相對於任何負面的副作用而言)。特定劑量方案可為涉及避免顯著不良副作用之最大劑量或給藥頻率的劑量方案。

如本文所用之術語「減小、減少、中和或抑制與E-選滯蛋白之相互作用」意謂，與在任何治療性干預之前的相互作用程度相比，減小、減少、中和或抑制E-選滯蛋白與配位體之相互作用。如本文所用，「游離E-選滯蛋白」意謂與另一分子(例如，游離或細胞表面表現之E-選滯蛋白配位體)不結合或以其他方式複合之E-選滯蛋白。

E-選滯蛋白之含量包括個體中之自由E-選滯蛋白之含量，其中使用本文中所揭示之方法或用於評估此項技術中已知之自由E-選滯蛋白之含量的任何其他方法來評估該含量。

在一個實施例中，與在投與本發明之抗E-選滯蛋白抗體之前的個體中之E-選滯蛋白之含量相比，游離E-選滯蛋白之含量有所降低。在一個實施例中，與游離E-選滯蛋白相關或指示個體罹患與游離E-選滯蛋白相關或由其介導之疾病、病症或病狀的游離E-選滯蛋白標準含量相比，游離E-選滯蛋白之含量有所降低。

在一些實施例中，本發明涵蓋將游離E-選滯蛋白之含量降低至其中降低或完全不存在由游離E-選滯蛋白介導或與其相關之可偵測有害影響之含量。在一些實施例中，投與有效劑量之抗E-選滯蛋白抗體以中和E-選滯蛋白功能活性，諸如(a)白血球繫鏈至內皮細胞；(b)穩定黏著於內皮細胞之活化；(c)白血球緩慢滾動直至阻滯；(d)白血球之跨內皮遷移；(e)CD18整合素之親和力及親合力；(f)運輸白血球至急性發炎部位；(g)增加胞溶質鈣；(h)增加使p38 MAP激酶及Syk激酶活化之酪胺酸磷酸化；(i)自血液募集血小板及白血球至血管內皮；及/或(j)並不產生促發炎環境。

如本文所用，藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量(effective dosage/effective dose)」、「有效量」、或「治療有效量」為足以實現任何一或多種有益或所需結果之量。對於預防性用途，有益或所需結果包括消除或降低風險、降低發生頻率(例如在一段時間內，例如每週、每月、每年)、減輕疾病嚴重度及/或延緩疾病發作，包括疾病、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理性表型之生物化學、組織學及/或行為症狀。對於治療性用途，有益或所需結果包括可偵測臨床結果，諸如減輕VOC或降低VOC之速率或減輕E-選滯蛋白之表現產生的一或多個症狀、降低治療該疾病所需之其他藥物之劑量、增強另一藥物之效應及/或延緩患者之疾病進展。可以一或多次投與形式來投與有效劑量。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療之量。如在臨床情形下所理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或不可連同另一藥物、化合物或醫藥組合物一起達成。因此，「有效劑量」可視為處於投與一或多種治療劑的情形下，且若連同一或多種其他藥劑可達成或已達成所需結果，則單個藥劑可視為以有效量給出。

在一些實施例中，向患有SCD、皮膚病(例如牛皮癬)、發炎疾病(例如類風濕性關節炎)及糖尿病併發症之患者投與有效劑量之抗E-選滯蛋白抗體。

在一些實施例中，投與抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)之有效劑量以治療及/或預防與E-選滯蛋白表現及/或E-選滯蛋白結合於配位體(例如sLex A及/或X決定子)相關或由其介導之疾病、病症及病狀，該疾病、病症及病狀包括但不限於SCD、血管閉塞性危象、疼痛、器官梗塞、局部缺血、中風、終末器官功能障礙、急性胸部及血管阻塞。

在一些實施例中，在用作針對SCD之預防性治療時，投與抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)之有效劑量以預防VOC或減少VOC之發生。在一些實施例中，一次性投與抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)之預防性投與。在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)之預防性投與係在持續的基礎上進行投與(例如在一段時間內之一或多於一次劑量)。

在一些實施例中，藉由減少VOC之持續時間、強度及/或嚴重程度，投與抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)之有效劑量以治療患有SCD之患者中之急性VOC。

在一些實施例中，投與抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)之有效劑量以治療、預防及/或改善SCD之至少一種病徵及/或症狀，例如，影響以下之彼等病徵及/或症狀：心胸系統(例如慢性限制性肺病、左心室舒張性疾病、肺高血壓、急性胸部症候群、心律不整、猝死、血管閉塞性危象)、神經系統(例如出血性中風、靜脈竇栓塞、腦之無症狀腦梗塞、慢性疼痛、腦之急性缺血性中風、增生性視網膜病變、眼眶梗塞、認知障礙)、網狀內皮系統(例如脾臟離症、功能性低脾功能症、貧血、溶血)、肌骨胳系統(例如缺血性壞死、皮膚潰瘍)、泌尿生殖系統(例如乳頭狀壞死、蛋白尿、腎衰竭、血尿、夜間遺尿、恆久勃起)及腸胃系統(例如膽石症、膽管病、肝病、腸系膜血管閉塞)。

在一些實施例中，該方法或用途包含投與約1 mg至約800 mg之劑量。在一些實施例中，該方法或用途包含投與作為初始固定劑量之約1 mg至800 mg之劑量。在一些實施例中，該方法或用途包含投與視情況作為初始固定劑量之以下劑量：約1 mg至約2 mg、約2 mg至約5 mg、約5 mg至約10 mg、約10 mg至約20 mg、約20 mg至約30 mg、約30 mg至約40 mg、約40 mg至約50 mg、約50 mg至約60 mg、約60 mg至約70 mg、約70 mg至約80 mg、約80 mg至約90 mg、約90 mg至約100 mg、約100 mg至約150 mg、約150 mg至約200 mg、約200 mg至約300 mg、約300 mg至約400 mg、約400 mg至約500 mg、約500 mg至約600 mg、約600 mg至約700 mg或約700 mg至約800 mg。在一些實施例中，該方法或用途包含投與約15 mg、40 mg、100 mg、150 mg、300 mg、500 mg或600 mg劑量之本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物。在一些實施例中，該劑量為初始固定劑量。

在一些實施例中，該方法或用途包含投與約150 mg劑量之本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物。在一些實施例中，該方法或用途包含以每週一次投與約150 mg劑量之本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物。在一些實施例中，該方法或用途包含以每週一次皮下投與約150 mg劑量之本發明之抗E-選滯蛋白抗體(例如抗體1444)或其抗原結合片段或其醫藥組合物。

在一些實施例中，該方法或用途包含投與視情況作為初始劑量之約0.01 mg/kg至約30 mg/kg劑量之本發明之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物。在該初始劑量之後可為一或多個後續劑量。在一些實施例中，一或多個後續劑量可按每週、每隔一週、每三週、每四週、每五週、每六週、每七週、每八週、每九週、每十週、每十一週或每十二週中之至少任一者投與。

在初始劑量之後可為一或多個後續劑量。在一些實施例中，與初始劑量相比，後續劑量為相同劑量、較低劑量或較高劑量之抗E-選滯蛋白抗體。在一些實施例中，一或多個後續劑量可按每週、每隔一週、每三週、每四週、每五週、每六週、每七週、每八週、每九週、每十週、每十一週或每十二週中之至少任一者投與。特定劑量方案為涉及避免顯著不良副作用之最大劑量或給藥頻率的劑量方案。

本發明之醫藥組合物亦可經由一或多種投與途徑、使用此項技術中已知多種方法中之一或多者來投與。如熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式將視所需結果而變化。用於本發明之抗體之所選投與途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊髓或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。非經腸投與可表示除經腸及局部投與外之通常藉由注射的投與模式，且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。或者，本發明之組合物可經由非經腸途徑投與，諸如表面、表皮或經黏膜投與途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或表面。

在一些實施例中，靜脈內投與本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，皮下投與本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，以每週一次靜脈內或皮下投與本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，以每週一次約15 mg、約40 mg、約100 mg、約150 mg、約300 mg或約600 mg之單位劑量投與本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，以每週一次約150 mg或約500 mg之單位劑量靜脈內投與本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段。

在一些實施例中，以每週一次向個體投與本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段，且以每天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次或根據需要向個體投與可有效治療及/或預防疾病(例如SCD)之至少一種病徵及/或症狀的治療活性化合物或治療方法。本發明提供用於向有需要之個體單獨或與其他療法組合投與包含本發明之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物的方案。本發明之組合療法中之療法(例如，預防劑或治療劑)可向個體同時或連續投與。本發明之組合療法中之療法(例如，預防劑或治療劑)亦可循環投與。

在一些實施例中，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段、或包含其之醫藥組合物係經約一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、一個月兩次、一個月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每四個月一次、每五個月一次、每六個月一次、每七個月一次、每八個月一次、每九個月一次、每十個月一次、每十一個月一次或每十二個月一次進行投與。

在一些實施例中，部分劑量藉由靜脈內推注投與且其餘劑量藉由抗體調配物輸注投與。舉例而言，抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之0.01 mg/kg靜脈內注射可以推注形式提供，且其餘部分之抗體劑量可藉由靜脈內注射投與。預定劑量之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段可例如在一個半小時至兩小時至五小時之時間段內投與。

必要時，組合物亦可包括助溶劑及諸如利多卡因(lidocaine)之局部麻醉劑以減輕注射部位之疼痛。另外，亦可採用經肺投與，例如使用吸入器或噴霧器，及具有氣霧劑之調配物。參見例如美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號；及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，其各者以全文引用之方式併入本文中。套組

本發明亦提供一種套組，其包含本文所描述之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段中之任一者或全部。本發明之套組包括一或多個包含本文所描述之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段的容器，及根據本文所描述之本發明方法中之任一者的使用說明書。一般而言，此等說明書包含對用於上文所描述之治療性治療之抗體投與的說明。在一些實施例中，提供套組用於產生單劑量投與單位。在某些實施例中，套組可含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，包括含有施用器(例如，單室及多室預填充注射器或裝置(例如，液體注射器及冷凍乾燥物注射器))之套組。

在一些實施例中，套組含有包含抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之施用器，其中該施用器經設計或可接受由患者(例如，患有SCD之患者)自我投與。在一些實施例中，自我投與係藉由皮下投與。

與抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之使用相關的說明書一般包括關於用於預期治療之劑量、給藥時程及投與途徑(例如皮下或靜脈內)的資訊。容器可為單位劑量、散裝封裝(例如，多劑量封裝)或次單位劑量。本發明之套組中所供應之說明書為通常在標籤或藥品說明書(例如套組中所包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁化或光學儲存盤上載有的說明書)亦為可接受的。

本發明之套組處於適合封裝中。適合之封裝包括但不限於小瓶、瓶子、罐、軟質封裝(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋與特定裝置，諸如吸入器、經鼻投與裝置(例如，霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)組合使用之封裝。套組可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有藉由皮下注射針可刺穿之塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗E-選滯蛋白抗體。容器可進一步包含額外治療劑。

在一個實施例中，本發明包括一種進一步包含第二治療活性化合物或治療方法之套組，其可在治療或預防SCD之症狀方面有效，其中抗E-選滯蛋白抗體及第二化合物或治療方法之量結合在一起在治療或預防SCD之症狀方面達成協同效應，亦即，該組合為「協同的」(亦即，該組合提供比兩種或多於兩種個別療法之簡單累加效應更大的效應)。該包含協同組合療法之套組可有利地利用較低劑量之所投與治療劑，從而避免與各種單一療法相關之可能毒性或併發症。

在一些實施例中，套組可進一步包含適用於治療或預防SCD之病徵及/或症狀的至少一種額外治療活性化合物，該病徵及/或症狀包括例如：青黴素、羥基尿素(例如DROXIA、HYDREA)、L-麩醯胺酸(例如ENDARI)、立贊利珠單抗(ADAKVEO)、沃西洛特(OXBRYTA)、阿派沙班(ELIQUIS)、利伐沙班(XARELTO)、非類固醇消炎藥、鎮痛劑(一般為類鴉片鎮痛劑)、IW-1701、瑞司瓜特(ADEMPAS)、替卡格雷(BRILINTA)或美金剛胺(NAMENDA)。

套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及說明性資訊。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相關聯之標籤或藥品說明書。

本發明亦提供診斷套組，其包含本文所描述之抗體或其抗原結合片段中之任一者或全部。診斷套組適用於例如偵測樣品中之E-選滯蛋白的存在。在一些實施例中，診斷套組可用於鑑別患有潛在疾病、病症或病狀之個體，該疾病、病症或病狀可使其處於罹患E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀之風險。在一些實施例中，診斷套組可用於偵測疑似患有E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀之個體中的E-選滯蛋白之存在及/或含量。

本發明之診斷套組包括一或多個包含本文所描述之抗E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段的容器，及根據本文所描述之本發明方法中之任一者的使用說明書。一般而言，說明書包含對E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段之用途的描述，其用於偵測處於E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀風險下或疑似患有E-選滯蛋白介導之疾病、病症或病狀(諸如疑似或已知罹患SCD之患者中之VOC及或與β-血球蛋白之異常形式(包括：HbS、HbC、Hbβ⁺ -地中海型貧血、Hbβ°-地中海型貧血或其他Hb變異體)相關或由其介導之任何其他病狀)之個體中E-選滯蛋白之存在。在一些實施例中，例示性診斷套組可經組態以含有試劑(諸如例如E-選滯蛋白抗體或其抗原結合片段)、陰性對照樣品、陽性對照樣品及使用套組之說明。生物寄存

抗E-選滯蛋白抗體1444之重鏈及輕鏈於2019年12月6日遵循根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之條款下以美國典型培養物保藏中心(ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA)寄存。

抗體	描述	ATCC 寄存編號
1444	Ab 1444-HC (抗體1444之重鏈)	PTA-126529
1444	Ab 1444-LC (抗體1444之輕鏈)	PTA-126530

按照國際承認用於專利程序的微生物寄存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)及其下條例(布達佩斯條約)之規定進行寄存。此確保自寄存日起維持寄存物之活培養物30年。寄存將由ATCC遵循布達佩斯條約之條款提供，且受制於Pfizer公司與ATCC之間的協定，其確保在相關美國專利發佈後或在任何美國或外國專利申請案對公眾公佈後(以先者為準)，公眾可永久且無限制地使用寄存物培養物之後代，且確保由美國專利及商標局專員根據35 U.S.C.第122節及依據其之專員規則(包括37 C.F.R.第1.14節，特定參考886 OG 638)指定有權享有者可使用後代。

本申請案之受讓人已同意，若在適合條件下培養時，處於寄存之物質的培養物死亡或丟失或破壞，則將通知以即時用另一相同物質置換該等物質。所寄存物質之可供使用性不應解釋為許可在違反由任何政府部門根據其專利法授予之權利的情況下實踐本發明。通用技術

應理解，本發明不限於特定合成製備方法，其當然可有所變化。除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般熟習此項技術者通常理解之含義。另外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。一般而言，本文所描述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白與核酸化學及雜交結合使用的命名法及其技術為此項技術中熟知且常用之彼等。

除非另外指示，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其處於此項技術之技術範圍內。該等技術在諸如以下之文獻中得以充分解釋：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(Sambrook等人, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編, 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney編, 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編, 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及C.C. Blackwell編); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編, 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人編, 1991); Sambrook及Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow及Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Coligan等人, Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway及P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti及J.D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)。

酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書，如此項技術中通常所實現或如本文所描述來進行。本文所描述之與分析化學、生物化學、免疫學、分子生物學、合成有機化學、及醫學及醫藥化學結合使用之命名法、及其實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等。標準技術用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者治療。等效物

前述描述及以下實例詳述本發明之某些特定實施例，且描述本發明人預期之最佳模式。然而，應瞭解，無論以文字呈現之前述內容如何詳細，本發明可以許多方式實踐，且本發明應根據所附申請專利範圍及其任何等效物解釋。

雖然已參考不同申請案、方法、套組及組合物描述所揭示教示內容，但應瞭解，在不背離本文中之教示內容及下文所主張之本發明情況下可進行不同變化及修改。提供以下實例以更好地說明本發明之教示內容，且並不意欲限制本文中所呈現之教示內容之範疇。儘管已根據此等例示性實施例描述本發明之教示內容，但熟習此項技術者將容易理解在無不當實驗情況下可能對此等例示性實施例進行許多變化及修改。所有該等變化及修改皆在本教示內容之範疇內。

本文中所引用之全部參考文獻(包括專利案、專利申請案、論文、課本及類似者)及其中所引用的參考文獻(就其尚未被引用而言)，在此以全文引用之方式併入本文中。在所併入之文獻及類似材料中之一或多者(包括但不限於經定義之術語、術語用法、所描述之技術等)與本申請案不同或抵觸的情況下，以本申請案為準。實例

為了可以更好地理解本發明，闡述以下實例。此等實例僅為達成說明之目的且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。實例1：分離結合於人類E-選滯蛋白之大鼠單株抗體。

使用Rappid IP免疫接種方法，用可溶性人類E-選滯蛋白細胞外域(Uniprot P16581殘基22-556；SEQ ID NO:133)使史泊格多利大鼠免疫。使用直接結合HRP-ELISA，篩選融合瘤上清液之與可溶性人類(ID NO:133)及小鼠(SEQ ID NO:135)E-選滯蛋白細胞外域及經截斷人類E-選滯蛋白(UniProtKB P16581殘基22-178；SEQ ID NO:197)及經截斷小鼠E-選滯蛋白(UniProtKB Q00690殘基22-178；SEQ ID NO:199)之結合。在該組結合物中，選擇與可溶性及經截斷人類E-選滯蛋白結合之6種抗體(0039、0158、0159、0164、0170及0180)，且選擇與可溶性及經截斷小鼠E-選滯蛋白結合之一種抗體(0027)。此等七種抗體經選擇用於分子選殖及子序列分析。實例2：大鼠抗E-選滯蛋白抗體重鏈及輕鏈可變區之選殖。

使用SMART® cDNA合成系統(California, Mountain View之Clontech Laboratories公司)選殖結合於人類E-選滯蛋白(抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180)或小鼠E-選滯蛋白(抗體0027)之抗E-選滯蛋白抗體之重鏈(HC)及輕鏈(LC)可變區，隨後進行PCR擴增。使用RNEasy套組(Qiagen)及SMART® IIA寡核苷酸(Clontech Laboratories公司)用Superscript^TM III逆轉錄酶(英傑)，由自大約500,000個融合瘤細胞(對於各純系0027、0039、0158、0159、0164、0170及0180而言)所分離之1 µg總RNA合成cDNA。接著使cDNA藉由PCR使用黏接至SMART® IIA寡核苷酸序列之引子及大鼠恆定區特異性引子(對於輕鏈為大鼠κ，及對於重鏈為大鼠IgG1)、用Q5®高保真2倍預混液(High-Fidelity 2X Master Mix) (New England Biolabs公司)進行擴增。將重鏈及輕鏈PCR產物次選殖至pCR4-TOPO載體(Invitrogen)中且測定核酸序列。此方法為有利的，因為不需要關於該DNA序列之先前知識。此外，不藉由使用簡併PCR引子來改變所得DNA序列。

將可變重鏈區(抗體0039之VH (SEQ ID NO:60之胺基酸序列)、抗體0158之VH (SEQ ID NO:75之胺基酸序列)、抗體0159之VH (SEQ ID NO:90之胺基酸序列)、抗體0164之VH (SEQ ID NO: 35之胺基酸序列)、抗體0170之VH (SEQ ID NO:104之胺基酸序列)、抗體0180之VH (SEQ ID NO:118之胺基酸序列)及抗體0027之VH (SEQ ID NO:128之胺基酸序列))選殖至含有經突變以消除效應功能之人類IgG1恆定區的pTT5哺乳動物表現載體(Leu234Ala、Leu235Ala及Gly237Ala，Eu編號；美國專利案第5,624,821號) (SEQ ID NO:15之胺基酸序列)中，從而產生嵌合重鏈。將可變輕鏈區(抗體0039之VL (SEQ ID NO:57之胺基酸序列)、抗體0158之VL (SEQ ID NO:73之胺基酸序列)、抗體0159之VL (SEQ ID NO:87之胺基酸序列)、抗體0164之VL (SEQ ID NO: 32之胺基酸序列)、抗體0170之VL (SEQ ID NO:102之胺基酸序列)、抗體0180之VL (SEQ ID NO:116之胺基酸序列)及抗體0027之VL (SEQ ID NO:122之胺基酸序列))選殖至含有人類κ恆定區的pTT5哺乳動物表現載體(SEQ ID NO:14之胺基酸序列)中，從而產生嵌合輕鏈。實例 3 ：抗 E - 選滯蛋白抗體之結合及中和。

抗E-選滯蛋白抗體與人類(SEQ ID NO:133加10 His純化尾端之胺基酸序列)及小鼠(SEQ ID NO:135之胺基酸序列加10 His純化尾部) E-選滯蛋白細胞外域之結合係使用重組抗原結合ELISA與HPR偵測來量測。384孔Maxisorp培養盤用於捕捉人類及小鼠之經His標記之重組E-選滯蛋白多肽。將多肽與不同濃度之嵌合抗體一起培育且用經HRP標記之抗人類IgG1抗體偵測。抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180分別以0.02 nM、0.03 nM、0.02 nM、0.02 nM、0.01 nM及0.01 nM之EC₅₀ 結合於人類E-選滯蛋白。此等抗體中無一者以＞133 nM之EC₅₀ 結合於小鼠E-選滯蛋白。抗體0027以0.02 nM之EC₅₀ 結合於小鼠E-選滯蛋白，但不以＞133 nM之EC₅₀ 結合於人類E-選滯蛋白。

在AlphaLISA均質競爭分析中量測抗E-選滯蛋白抗體之中和能力。此處抗體針對人類E-選滯蛋白細胞外域(SEQ ID NO:133之胺基酸序列加10 His純化尾部)、小鼠E-選滯蛋白細胞外域(SEQ ID NO:135之胺基酸序列加10 His純化尾部)或石蟹獼猴E-選滯蛋白細胞外域(SEQ ID NO:175之胺基酸序列加10 His純化尾部)與唾液酸-路易斯A配位體之相互作用而競爭。對於此實驗，將1 µL抗體添加至384孔培養盤之孔中，隨後添加1 µL唾液酸路易斯A-PAA-生物素，直至最終濃度為1.75 nM。將此盤在室溫下培育15分鐘，隨後添加1.4 µL人類、小鼠或石蟹獼猴E-選滯蛋白，直至最終濃度為7 nM。將此盤再次在室溫下培育15分鐘。為此，為使最終分析濃度為10 µg/mL，添加1.4 µL AlphaLISA珠粒(Ni供體/SA受體)。將此盤於暗處在室溫下培育至少10小時。接著使用AlphaLISA方案(Envision)讀取培養盤。

針對嵌合抗E-選滯蛋白抗體0027、0158、0159、0164、0170及0180，量測人類、小鼠及石蟹獼猴E-選滯蛋白之中和之EC₅₀ 。抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180對於人類E-選滯蛋白之EC₅₀ 值＜1 nM，而抗體0027並未中和人類E-選滯蛋白且其EC₅₀ ＞133 nM。抗體0158、0159、0164、0170及0180對於石蟹獼猴E-選滯蛋白之EC₅₀ 值＜1 nM，抗體0039對於石蟹獼猴E-選滯蛋白之EC₅₀ 值＞63 nM，且抗體0027並未中和石蟹獼猴E-選滯蛋白且其EC₅₀ ＞133 nM。抗體0027對於小鼠E-選滯蛋白之EC₅₀ 值為1 nM，而抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180並未中和小鼠E-選滯蛋白且其EC₅₀ ＞133 nM (表4)。

表 4 . 使用HRP結合ELISA及AlphaLISA中和分析的抗E-選滯蛋白嵌合抗體對於人類、小鼠及石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合及中和。

抗體	HC SEQ ID NO	LC SEQ ID NO	HRP 結合之 EC₅₀ ( nM )	alphaLISA 中和之 EC₅₀ ( nM )
人類 E - 選滯蛋白	小鼠 E - 選滯蛋白	人類 E - 選滯蛋白	小鼠 E - 選滯蛋白	石蟹獼猴 E - 選滯蛋白
0027	124	119	＞133	0.02	＞133	1	＞133 nM
0039	59	56	0.02	＞133	＜1	＞133 nM	＞63
0158	74	72	0.03	＞133	＜1	＞133 nM	＜1
0159	89	86	0.02	＞133	＜1	＞133 nM	＜1
0164	34	31	0.02	＞133	＜1	＞133 nM	＜1
0170	103	101	0.01	＞133	＜1	＞133 nM	＜1
0180	117	115	0.01	＞133	＜1	＞133 nM	＜1

實例 4 ： 使用表面電漿子共振 ( SPR ) 來對抗 E - 選滯蛋白進行動力學評估。

製備人類(SEQ ID NO:133之胺基酸序列)、小鼠(SEQ ID NO:135之胺基酸序列)及石蟹獼猴(SEQ ID NO:175之胺基酸序列) E-選滯蛋白細胞外域蛋白質。各蛋白質含有用於純化之C端10殘基組胺酸標籤。抗人類Fc感測器晶片係根據製造商方案藉由抗人類IgG抗體(目錄號BR-1008-39，GE Healthcare)與經羧基甲基化聚葡萄糖塗佈之感測器晶片(CM5) (目錄號BR100530，GE Healthcare)之所有四個流槽的胺偶合來製備。藉由以10 μL/分鐘之流動速率注射400 mM 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及100 mM N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之1:1混合物持續7分鐘來使流槽活化。抗人類IgG抗體在10 mM乙酸鈉(pH 5.0)中稀釋至25 μg/mL且以10 μL/分鐘在所有流槽中注射7分鐘。以10 μL/分鐘用1 M乙醇胺-HCl (ETH)阻斷所有流槽7分鐘。捕捉抗體之最終固定含量為大約10,000共振單位(RU)。用於固定化及動力學之操作緩衝液為HBS-EP+ (10 mM 4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸(HEPES) (pH 7.4)、150 mM氯化鈉、3 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.05% (v/v) Tween-20)。

為表徵抗體與人類、石蟹獼猴及小鼠E-選滯蛋白之結合，將抗體於HBS-EP+中稀釋至0.5 μg/mL，且在10 μL/分鐘之流動速率下藉由固定於流槽2、3及4上之抗人類IgG捕捉30秒至1分鐘以達成70至300 RU之捕捉含量。流槽1用作參考表面。在抗體捕捉之後，使流動速率增加至50 μL/分鐘，且在締合期間將在HBS-EP+中濃度範圍為15 nM至405 nM之緩衝液或E-選滯蛋白蛋白質在所有流槽中注射1.0分鐘，且接著使其解離6至15分鐘。針對所捕捉之各抗體收集的HBS-EP+緩衝液循環用於雙參考(Myszka DG. J. Mol. Recognition 1999; 12(5):279-84)。在各循環結束時，整個抗IgG表面藉由30秒3 M MgCl₂ 之脈衝及30秒離子緩衝液脈衝(1.83 M MgCl₂ 、0.92 M脲、1.83 M鹽酸胍，pH 7.4)再生(Andersson K. Analy. Chem. 1999; 71(13): 2475-81)。在BIAcore^TM T200儀器(GE Healthcare)上以10赫茲(Hz)之收集速率在25℃下進行動力學分析。速率常數及親和力藉由在BIAcore^TM T200評估軟體3.0版(GE Healthcare)中將資料擬合至1:1結合模型來確定。

藉由首先使抗體與固定化抗人類IgG結合，測定抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180對於人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白以及抗體0027對於小鼠E-選滯蛋白的結合親和力。在抗體捕捉之後，使E-選滯蛋白蛋白質之稀釋物流過，且測定結合於人類、石蟹獼猴及小鼠E-選滯蛋白之締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)、t½及K_D 值(表5-7)。在此SPR分析中，抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180對於人類E-選滯蛋白之親和力(K_D )分別為68.0 nM、21.6 nM、324 nM、54.4 nM、628 nM及2940 nM。嵌合抗體0039、0159、0164、0170及0180對於石蟹獼猴E-選滯蛋白之親和力K_D 分別為45.8 nM、243.5 nM、45.4 nM、492 nM及3145 nM。抗體0158未顯示結合於石蟹獼猴E-選滯蛋白。嵌合抗體0027對於小鼠E-選滯蛋白之親和力K_D 為1.2 nM。

表 5 . 藉由表面電漿子共振量測的抗E-選滯蛋白抗體對於人類E-選滯蛋白之親和力。

抗體	HC SEQ ID NO	LC SEQ ID NO	分析物
人類 E - 選滯蛋白
ka	kd	t ½	K_D
(1/Ms)	(1/s)	(s)	(nM)
0039	59	56	6.42E+04	4.21E-03	173.64	68.0
0158	74	72	8.10E+04	1.75E-03	397.16	21.6
0159	89	86	1.15E+05	3.71E-02	18.71	324
0164	34	31	2.07E+05	1.13E-02	61.61	54.4
0170	103	101	8.74E+04	5.49E-02	12.64	628.5
0180	117	115	2.62E+05	6.66E-01	1.05	2940

表 6 . 藉由表面電漿子共振量測的抗E-選滯蛋白抗體對於石蟹獼猴E-選滯蛋白之親和力。

抗體	HC SEQ ID NO	LC SEQ ID NO	分析物
石蟹獼猴 E - 選滯蛋白
ka	kd	t ½	K_D
(1/Ms)	(1/s)	(s)	(nM)
0039	59	56	8.24E+04	3.77E-03	184.07	45.8
0158	74	72	ND	ND		弱
0159	89	86	1.54E+05	3.74E-02	18.53	243.5
0164	34	31	2.65E+05	1.20E-02	57.75	45.4
0170	103	101	1.15E+05	5.64E-02	12.30	492
0180	117	115	2.45E+05	7.49E-01	0.93	3145

ND：未偵測到

表 7 . 藉由表面電漿子共振量測的抗小鼠E-選滯蛋白抗體對於小鼠E-選滯蛋白之親和力。

抗體	HC SEQ ID NO	LC SEQ ID NO	分析物
小鼠 E - 選滯蛋白
ka	kd	t ½	K_D
(1/Ms)	(1/s)	(s)	(nM)
0027	124	119	1.92E+05	2.31E-04	3010.95	1.2

實例 5 ： 在靜態結合分析中對抗 E - 選滯蛋白抗體之配位體結合的中和。

在靜態中和分析中使用競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)評估抗E-選滯蛋白抗體中和配位體結合的能力，以評估唾液酸路易斯抗原與經工程改造以表現E-選滯蛋白之中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的中和。

簡言之，使表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞在培養基(最低必需培養基(MEM) Alpha培養基，補充有10%經透析胎牛血清、100 nM甲胺喋呤及100單位/mL青黴素及100單位/mL鏈黴素)中生長且以12,500個細胞/孔接種至96孔組織培養盤中且在37℃、5% CO₂ 下培育48小時以形成匯合單層。隨後用200 μL不含鈣鎂之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌培養盤兩次。在存在經生物素標記之唾液酸路易斯A聚丙烯醯胺(Carbosynth LLC；OS45446)與抗生蛋白鏈菌素/辣根過氧化酶之小型合成結合物(總計100 µL)的情況下，向分析中添加抗E-選滯蛋白抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180或IgG1同型對照物，且在37℃、5% CO₂ 下培育2小時。接著用200 μL不含鈣鎂之PBS洗滌培養盤兩次。在培育之後，將細胞用200 µL含有2 mM氯化鈣(50 mM三胺基甲烷[TRIS]、150 mM氯化鈉；0.05%聚山梨醇酯20，pH 7.4；2 mM氯化鈣)之洗滌緩衝液洗滌兩次。藉由添加100 µL之1-Step Ultra TMB受質(Thermo Scientific，34028)且在室溫下培育30分鐘來產生信號。使用2 M硫酸使反應停止且在450 nm下讀取吸光度(Spectramax M5e)。使用GraphPad Prism軟體(8.0.2版)分析且圖示資料。經估計半最大抑制濃度(IC₅₀ )值自該分析推導出(表8)。

所測試之抗體以劑量依賴性方式中和配位體與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合。在中和分析中對於嵌合抗體0039、0164、0158、0159、0170及0180之經估計IC₅₀ 值分別為3.76 nM、2.77 nM、2.87 nM、3.24 nM、2.3 nM及3.83 nM。抗體0027並未中和唾液酸路易斯A聚丙烯醯胺配位體與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合。人類IgG對照抗體在此等分析中並未展現效應。實例 6 ：在抗 E - 選滯蛋白抗體之靜態黏著分析中抑制細胞結合。

評估嵌合抗E-選滯蛋白抗體0039、0164、0158、0159、0170及0180在靜態條件下抑制表現E-選滯蛋白配位體之細胞對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著之能力。

將表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞在Alpha培養基(最低必需培養基[MEM]) Alpha培養基，Corning)/10%經透析胎牛血清(GIBCO)/100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素(streptomycin) (Gibco)/100 nM甲胺喋呤中培養且在37℃下、在5% CO₂ 及95%濕度情況下維持。將HL-60細胞(表現E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體之人類前髓細胞細胞株)在37℃下、在5% CO₂ 及95%濕度情況下維持於RPMI/麩醯胺酸生長培養基(Gibco)/10%胎牛血清(Gibco)/100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素(Gibco)中。將表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞以11,500個細胞/孔之密度接種於96孔平底黑色培養盤中且在含濕氣培育箱中在37℃、5% CO₂ 及95%空氣下培育48小時以形成匯合單層。

對於靜態黏著中和分析，使處於對數期之HL-60細胞在PBS中洗滌三次且再懸浮於500 µL之PBS及相等體積之2 µM羧基螢光素二乙酸丁二醯亞胺酯螢光染料[(CFSE) (ThemoFisher)]中。將細胞在室溫下於暗處培育10分鐘。藉由在冰上添加4 mL冷HL-60生長培養基持續5分鐘來使標記停止。將經標記之HL-60細胞在Hanks平衡鹽溶液(HBSS) /1%牛血清白蛋白(BSA)/0.1%疊氮化鈉中洗滌三次，以400,000個細胞/mL之密度再懸浮以用於靜態黏著分析。

在HBSS/1% BSA/0.1%疊氮化鈉中連續稀釋抗E-選滯蛋白嵌合抗體0039、0164、0158、0159、0154、0170及0180，陰性對照抗P-選滯蛋白抗體及對照人類IgG(濃度範圍為1333 nM至1.83 nM)。對於各抗體，未製備抗體對照物。將E-選滯蛋白CHO細胞單層用HBSS/1% BSA/0.1%疊氮化鈉溫和地洗滌三次，且將100 µL細胞懸浮液添加至孔中且在冰上培育一小時。每孔添加五十µL(20,000個)經CFSE標記之HL-60細胞，而不移除抗體。將經標記之HL-60細胞與CHO細胞單層一起在37℃下、5% CO₂ 及95%空氣下於含濕氣培育箱中培育1小時。將培養盤用HBSS/1% BSA/0.1%疊氮化鈉洗滌三次，添加100 µL HBSS/1% Triton-X100且於暗處培育10分鐘。經結合HL-60細胞之螢光係在494/521奈米之激發/發射波長下使用Spectramax i3X(分子裝置)量測以測定黏著的HL-60細胞之數量。使用來自無細胞對照孔之信號減去背景結合且使用人類IgG對照物測定黏著率%為100%。在GraphPad Prism套件中確定經估計EC₅₀ 值。

在靜態黏著條件下，抗體0158及0164在16.5 nM下以＞50%之抑制率抑制HL-60細胞對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著。抗體0159在49.4 nM下以＞50%之抑制率抑制HL-60細胞對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著。抗體0170及0180在444 nM下以＞50%之抑制率抑制HL-60對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著。濃度為至多1333 nM之抗體0039並未抑制HL-60細胞對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著。陰性對照抗體並未抑制HL-60細胞之黏著(表8)。實例 7 ：抗 E - 選滯蛋白抗體之細胞表面結合 ( FACS ) 。

使用螢光活化細胞分選(FACS)評估抗體與經工程改造以表現E-選滯蛋白或P-選滯蛋白之細胞的結合。亦評估與石蟹獼猴之物種交叉反應性。

將表現人類E-選滯蛋白或P-選滯蛋白之CHO細胞在補充有10%經透析胎牛血清(GIBCO)、100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素(Gibco)之Alpha培養基(最低必需培養基[MEM]) Alpha培養基，Corning)中培養。對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞，生長培養基亦補充有100 nM甲胺喋呤。將表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞在補充有10%熱滅活胎牛血清(GIBCO)、100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素及125 µg/mL吉歐黴素(Zeocin) (GIBCO)之R1培養基(RI杜氏改良伊格爾培養基/哈姆氏F12改良(RI Dulbecco's Modifies Eagle's Medium/Ham's F12 modification))中培養。將細胞於含濕氣培育箱中在37℃、5% CO₂ 及95%空氣下維持於生長培養基中。在培養進行實驗之前，自培養基移除甲胺喋呤或吉歐黴素。使用檸檬酸鹽水(135 mM KCl、15 mM檸檬酸鈉)自T-150燒瓶分離CHO-E選滯蛋白細胞或P-選滯蛋白細胞，且藉由將CaCl₂ 添加至所分離細胞中立即再鈣化，直至最終濃度為1 mM。緊接著將生長培養基添加至經分離細胞中，接著在室溫下以300×g離心5分鐘以集結細胞。在濕冰上將細胞接種於96孔V底培養盤中，置於低溫CHO緩衝液中，持續5分鐘，該緩衝液由磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)組成，pH為7.4，含有最終濃度為1%之牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)、最終濃度為1 mM之氯化鈣及最終濃度為0.1%之疊氮化鈉。在培育之後，將細胞在4℃下以300×g離心2分鐘以移除緩衝液。

使用CHO緩衝液作為稀釋劑用連續稀釋液(在1333.3 nM至0.0022 nM範圍內)製備測試抗體溶液，且添加100 µL且在指定體積之經連續稀釋之抗體中培育且在冰上培育45分鐘。在培育之後，移除抗體，且使細胞在4℃下藉由以300×g離心1分鐘來洗滌細胞三次且再懸浮於低溫CHO緩衝液中。將經洗滌之細胞在濕冰上與100 µL之1:1000稀釋的APC結合的親和純化F(ab')₂ 片段山羊抗人類IgG, Fcγ (Jackson Immunoresearch)一起培育30分鐘。將細胞洗滌三次或四次，隨後使其再懸浮於CHO緩衝液中用於流式細胞量測分析。將使用640奈米雷射線之Becton Dickinson LSRFortessa儀器用於獲取細胞螢光資料。藉由FlowJo套裝軟體(FlowJo, LLC)分析細胞之幾何平均螢光且相對於抗體濃度進行繪製。在Prism套件(格拉夫帕德，8版)中使用非線性回歸分析計算經估計EC₅₀ 值(表8)。

嵌合抗體0039、0164、0158、0159、0154、0170及0180展現以1.99 nM至4.99 nM範圍內之經估計EC₅₀ 值與CHO細胞上細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合(表8)。抗體0039、0164、0158、0159、0170及0180以3.37至13.98範圍內之經估計EC₅₀ 值亦結合於表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞。抗體0164、0158、0159、0154、0170及0180並未結合於CHO表現之人類P-選滯蛋白，指示針對E-選滯蛋白之選擇率。抗體0039展現以＞354 nM之經估計EC₅₀ 值與CHO表現之人類P-選滯蛋白的極小結合。

表 8 . 抗E-選滯蛋白抗體之細胞結合及中和。

	靜態中和	藉由FACS 之細胞表面抗體結合
抗體	唾液酸路易斯配位體黏著CHO-人類E-選滯蛋白細胞的IC₅₀ (nM)	HL-60細胞黏著CHO-人類E-選滯蛋白細胞的IC₅₀ (nM)	結合於CHO-人類E-選滯蛋白細胞的EC₅₀ (nM)	結合於CHO-石蟹獼猴E-選滯蛋白細胞的EC₅₀ (nM)	結合於CHO-人類P-選滯蛋白細胞的EC₅₀ (nM)
0039	3.76	ND	4.99	4.07	＞ 354 nM
0164	2.77	在16.5 nM下＞50%	4.43	1.73	ND
0158	2.87	在16.5 nM下＞50%	3.75	13.98	ND
0159	3.24	在49.4 nM下＞50%	2.44	3.37	ND
0170	2.30	在444 nM下＞50%	1.99	3.76	ND
0180	3.83	在444 nM下＞50%	4.31	3.66	ND
ND=未偵測到

實例 8 ： 使用生理流動分析之抗 E - 選滯蛋白抗體之離體中和

在生理流動條件下使用BioFlux™系統(Fluxion，San Francisco，CA，USA)使用BioFlux™培養盤/腔室(Fluxion Biosciences，48孔低剪切，0-20達因/cm² ；910-0004)分析離體細胞黏著。使用重組純化之可溶性E-或P-選滯蛋白蛋白質及人類HL-60細胞(ATCC CCL-240)進行黏著分析。HL-60細胞表現E選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯配位體。將HL-60細胞在37℃、在5% CO₂ 及95%濕度情況下維持於具有10%胎牛血清(Gibco)、1×青黴素/鏈黴素(Gibco)之RPMI/麩醯胺酸生長培養基(Gibco)中。將細胞在37℃下維持，隨後灌注且在室溫下進行BioFlux™分析。首先，為模擬經活化內皮細胞之表面，使流動腔室塗佈有等量的人類E-選滯蛋白可溶性重組蛋白及P-選滯蛋白可溶性重組蛋白。使BioFlux™流動微通道塗佈有10 µg/mL之可溶性重組人類P-選滯蛋白(R & D Systems，ADP3)及E-選滯蛋白(R & D Systems，ADP1)中之各者，該等選滯蛋白於PBS中製備，以1達因/cm² 灌注5分鐘，在室溫下培育1小時並以1達因/cm² 用PBS洗滌3-5分鐘。將E-選滯蛋白嵌合抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180在PBS中稀釋且將培養盤以1達因/cm² 用測試物品(濃度為1.6至1000 nM)或媒劑對照物處理1小時。將HL-60細胞在1000 rpm下離心5分鐘，用鈣黃綠素(Calcein) AM(鈣黃綠素；Life Technologies™；C3099)染色30分鐘，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；Gibco)洗滌兩次，且在PBS中再懸浮直至濃度為約3×10⁶ 個細胞/mL。亦將經稀釋之抗體儲備液添加至細胞懸浮液中，隨後在流動腔室中進行灌注。在各通道中以1達因/cm² 之生理剪切流量對HL-60細胞之100 µL的等分試樣進行灌注10分鐘。以1達因/cm² 灌注PBS持續2-3分鐘以移除非黏著細胞。觀測黏著細胞且使用具有40倍放大率之Nikon Eclipse Ti-S (NIS-Elements BR 3.2 64位)倒置級相位對比螢光顯微鏡對其進行計數。使細胞計數相對於磷酸鹽緩衝液媒劑對照物進行標準化。各實驗具有兩個孔/條件。使用GraphPad Prism (8.0.2)圖示且分析資料。經估計半最大抑制濃度(IC₅₀ )值自該分析推導出。

在此等經設計以模擬離體經由血管結構之血流的研究中，E-選滯蛋白抗體0039、0164、0158、0159、0170及0180分別以264.7 nM、1.7 nM、17.9 nM、21 nM、74.2 nM及224.7 nM之經估計IC₅₀ 值中和HL-60細胞對於可溶性重組E-選滯蛋白蛋白質之黏著(表9)。

表 9 . 對HL-60在生理流動下結合於可溶性人類E-選滯蛋白蛋白質之中和。

抗體	對HL -60 細胞在生理流動下結合於可溶性人類E - 選滯蛋白蛋白質之中和的IC₅₀ (nM )
0039	264.7
0164	1.7
0158	17.9
0159	21
0170	74.2
0180	224.7

實例9：抗E-選滯蛋白抗體之抗原決定基分組

基於競爭分析，使用Octet生物感測器將六種中和嵌合抗體(0039、0158、0159、0164、0170及0180)分組成抗原決定基組。將經抗人類FC (AHC)塗佈之尖端轉移至含有20 µg/mL之七個抗體中之一者的孔持續600秒，以允許第一抗體結合於抗人類FC。將尖端轉移至具有300 nM人類E-選滯蛋白細胞外域(SEQ ID NO:133加10 His純化尾部)之第二孔且使其締合100秒。最後，將尖端轉移至含有第二抗體之第三孔中持續100秒。若第二抗體顯示生物感測器信號之增加高於第一抗體產生之生物感測器信號，則將抗體評估為非競爭性的，且若第二抗體不產生信號之額外增加，則將其評估為競爭性的(表10)。

基於此等競爭資料，抗體0159、0164、0170及0180定義一個抗原決定基組，0158定義第二抗原決定基組及0039定義第三抗原決定基組。第一組與第二組部分重疊，第二組與第三組部分重疊，且第一組與第三組並不重疊。在表10中，「+」指示在第一抗體(由列標題指示)存在下所結合之第二抗體(由行標題指示)。「-」指示在添加第二抗體後信號之未增加。

表 10 . 藉由Octet生物感測器進行之抗IL-E-選滯蛋白抗體之抗原決定基分組

第一 Ab ( 列 )	0039	0158	0159	0164	0170	0180
第二 Ab ( 行 )
0039	-	-	+	+	+	+
0158	-	-	-	-	-	-
0159	+	-	-	-	-	-
0164	+	-	-	-	-	-
0170	+	-	-	-	-	-
0180	+	-	-	-	-	-

實例 10 ： 晶體結構及抗原決定基

藉由用番木瓜蛋白酶使全長IgG裂解且使用蛋白A樹脂移除Fc來獲得抗E-選滯蛋白嵌合抗體0164之Fab片段。以1:1莫耳比將Fab與經截短人類E-選滯蛋白(描述於實例1中)混合且藉由尺寸排阻層析(SEC)純化所得複合物。複合物晶體形成於200 mM乙酸鈣(pH 7.5)、20% PEG 3350中。在先進光子源中，在光束線17-ID處收集2.68 Å之資料。藉由分子置換解析結構並精確至0.243/0.252之R/Rfree (圖 1 )。晶體結構在空間群P3121之不對稱單元中具有結合於單個0164 Fab片段之單個E-選滯蛋白複本。

基於晶體結構，與抗體0164相互作用之E-選滯蛋白之殘基係基於以下而確定：i) 3.8 Å內之殘基，ii)由於0164抗體殘基及E-選滯蛋白殘基對之間的相互作用而內埋的標準化表面積(Å² )＞5 Å² ，iii)鹽橋之形成，iv)氫鍵之形成或v)水介導之氫鍵的形成。編號係基於成熟人類E-選滯蛋白序列(SEQ ID NO:132)之殘基的清單包括T7、E8、A9、M10、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、N105、E107、R108、S110、K111、K112及K113 (表11)。

E-選滯蛋白與其天然配位體唾液酸-路易斯X (sLeX)藉由X射線晶體分析法之相互作用顯示於PDB結構(1g1t)中(參見www.rcsb.org/structure/1g1t)。在此結構中，基於SEQ ID NO:132之編號，在3.8 Å之sLeX內且類似於與抗體0164之相互作用的E-選滯蛋白殘基為Y48、N82、N83、E92、Y94、R97、N105及E107。亦在3.8埃之sLex內之其他殘基為E80、E98及D106 (基於SEQ ID NO:132之編號)。鑒於sLex及抗體0164之抗原決定基顯著重疊，可能由此抗體證明之中和活性係直接阻斷sLeX及其他類似配位體(如唾液酸-路易斯A (sLeA))與E-選滯蛋白之相互作用的結果。

表 11 . E-選滯蛋白與抗E-選滯蛋白抗體0164或sLeX之相互作用。

E-選滯蛋白位置	胺基酸	與抗體0164之相互作用	與sLeX之相互作用
在3.8 Å內	內埋表面積(Å² )	氫鍵	鹽橋	H₂ O介導之相互作用	在3.8 Å內
7	T	X	13.3
8	E	X	94.5	1
9	A	X	39.2
10	M		5
11	T	X	7.3
46	P	X	56.2
47	S	X	36.1	1
48	Y	X	13.1				X
82	N	X	29.5	1			X
83	N	X	29.4	1			X
85	Q	X	35.7
88	E		9.9	1
92	E	X	6.9	1			X
94	Y	X	9.3	1			X
97	R		29.7			X	X
105	N	X	1.4	1			X
107	E	X	30.6	1			X
108	R	X	72.6	2
110	S	X	29.3	1
111	K	X	63.9		X
112	K	X	112.6	1	X	X
113	K		15.1
80	E						X
98	E						X
106	D						X

實例 11 ： 大鼠抗 E - 選滯蛋白抗體之人類化

中和大鼠嵌合抗體0039、0158、0159、0164、0170及0180之人類化版本由互補決定區(CDR)移植(在下文被稱為「經CDR移植」)生成。對於抗體0039、0158、0164及0180，將重鏈CDR移植至人類DP-54構架區(VH3子組)。人類化抗體0039含有大鼠胺基酸殘基，包括位置48處之甲硫胺酸、位置49處之甘胺酸及位置78處之纈胺酸。人類化抗體0158含有大鼠胺基酸殘基，包括位置24處之纈胺酸、位置48處之甲硫胺酸、位置49處之甘胺酸、位置73處之蘇胺酸及位置78處之纈胺酸。人類化抗體0164含有大鼠胺基酸殘基，包括位置71處之丙胺酸、位置78處之丙胺酸及位置94處之甲硫胺酸。人類化抗體0180含有大鼠胺基酸殘基，包括位置48處之異白胺酸、位置49處之甘胺酸、位置69處之白胺酸、位置71處之絲胺酸、位置73處之蘇胺酸、位置78處之丙胺酸及位置94處之異白胺酸。

對於抗體0159，將重鏈CDR移植至DP-7構架區(VH1子組)。人類化抗體0159含有大鼠胺基酸殘基，包括位置24處之纈胺酸、位置69處之白胺酸、位置78處之丙胺酸及位置94處之甲硫胺酸。

對於抗體0170，將重鏈CDR移植至DP-10構架區(VH1子組)。人類化抗體0170含有大鼠胺基酸殘基，包括位置24處之纈胺酸、位置69處之異白胺酸、位置73處之蘇胺酸及位置94處之纈胺酸。

所有6種人類化抗體均與JH4 J-區段(SEQ ID NO:6之胺基酸序列)接合。

對於抗體0039、0158、0164、0170及0180，將輕鏈CDR移植至人類DPK9構架區(VKI子組)。人類化抗體0039含有L87處之大鼠胺基酸殘基半胱胺酸。人類化抗體0158含有位置4處之大鼠胺基酸殘基甲硫胺酸。人類化抗體0164及180含有位置87處之大鼠胺基酸殘基苯丙胺酸。人類化抗體0170含有大鼠胺基酸殘基，包括位置48處之甲硫胺酸及位置87處之苯丙胺酸。

對於抗體0159，將輕鏈CDR移植至人類DPK1構架區(VKI子組)。

將人類化V_H 區接合於效應功能突變的人類IgG1恆定區(SEQ ID NO:16之胺基酸序列)且接著次選殖至專有表現載體以生成經CDR移植之重鏈SEQ ID NO:51 (0039 CDR移植；抗體0525之重鏈)、SEQ ID NO:62 (0158 CDR移植；抗體265_254之重鏈)、SEQ ID NO:76 (0159 CDR移植；抗體0929_0548之重鏈)、SEQ ID NO:22 (0164 CDR移植；抗體0841之重鏈)、SEQ ID NO:91(0170 CDR移植；抗體0955_0300之重鏈)及SEQ ID NO:110 (0180 CDR移植；抗體0564之重鏈)。

將人類化V_L 區融合於人類κ恆定區(SEQ ID NO:14之胺基酸序列)且接著次選殖至專有表現載體以產生經CDR移植之輕鏈SEQ ID NO:46 (0039 CDR移植；抗體0525之輕鏈)、SEQ ID NO:67 (0158 CDR移植；抗體0265_0254之輕鏈)、SEQ ID NO:81 (0159 CDR移植；抗體0929_0548之輕鏈)、SEQ ID NO:17 (0164 CDR移植；抗體0841之輕鏈)、SEQ ID NO:96 (0170 CDR移植；抗體0955_0300之輕鏈)及SEQ ID NO:105 (0180 CDR移植；抗體0564之輕鏈)。

表 12 . 抗E-選滯蛋白抗體。

嵌合抗體	人類化抗體	最佳化抗體
0164	0841
	0978	1444 1448 1282 1284
0039	0525
0158	0265_0254
0159	0929_0548
0170	0955_0300
0180	0564
0027

實例 12 ： 使用表面電漿子共振進行之人類化抗 E - 選滯蛋白之動力學評估。

在類似於實例4中所描述之方法的方法中，使用SPR測定人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白對於人類化抗體0841 (HC SEQ ID NO:22，LC SEQ ID NO:17)之結合親和力。此藉由首先使抗體結合於固定化抗人類IgG來進行。在抗體捕捉之後，使E-選滯蛋白蛋白質之稀釋物流過，且測定結合於人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白之締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)、t½及K_D 值(表13)。在此SPR分析中，人類化抗E-選滯蛋白抗體0841對於人類E-選滯蛋白及石蟹獼猴E-選滯蛋白之親和力分別為92.85 nM及138.5 nM。

表 13 . 藉由表面電漿子共振量測的抗E-選滯蛋白抗體對於人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白之親和力。

抗體	分析物
人類 E - 選滯蛋白	石蟹獼猴 E - 選滯蛋白
Ka	kd	t ½	K_D	ka	kd	t ½	K_D
(1/Ms)	(1/s)	(s)	(nM)	(1/Ms)	(1/s)	(s)	(nM)
0841	2.55E+05	2.37E-02	29.31	92.85	1.82E+05	2.52E-02	27.56	138.5

實例 13 ： 人類化抗 E - 選滯蛋白抗體 ( 0841 ) 之細胞表面結合 ( FACS )

使用關於經工程改造以表現E-選滯蛋白之細胞的流式細胞量測術(FACS)來評估抗體結合。亦評估與石蟹獼猴之物種交叉反應性。

將表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞在補充有10%經透析胎牛血清(GIBCO)、培養基(Gibco)中之100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素之Alpha培養基(最低必需培養基[MEM]) Alpha培養基，Corning)中培養。對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞，生長培養基亦補充有100 nM甲胺喋呤。將表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞在補充有10%熱滅活胎牛血清(GIBCO)、100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素及125 µg/mL吉歐黴素(GIBCO)之R1培養基(RI杜氏改良伊格爾培養基/哈姆氏F12改良)中培養。將細胞於含濕氣培育箱中在37℃、5% CO₂ 及95%空氣下維持於生長培養基中。在培養進行實驗之前，自培養基移除甲胺喋呤或吉歐黴素。使用檸檬酸鹽水(135 mM KCl、15 mM檸檬酸鈉)自T-150燒瓶分離CHO-E選滯蛋白細胞，且藉由將CaCl₂ 添加至所分離細胞中而立即再鈣化直至最終濃度為1 mM。緊接著將生長培養基添加至經分離細胞中，接著在室溫下以300×g離心5分鐘以集結細胞。在濕冰上將細胞接種於96孔圓底培養盤中，置於低溫CHO緩衝液中，持續5分鐘，該緩衝液由磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)組成，pH為7.4，含有最終濃度為1%之牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)、最終濃度為1 mM之氯化鈣及最終濃度為0.1%之疊氮化鈉。在培育之後，將細胞在4℃下以300×g離心2分鐘以移除緩衝液。

使用CHO緩衝液作為稀釋劑用連續稀釋液(在1333.3 nM至0.0022 nM範圍內)製備測試抗體溶液，在指定體積之經連續稀釋之抗體中添加100 µL且在冰上培育45分鐘。在培育之後，移除抗體，且使細胞在4℃下藉由以300×g離心1分鐘來洗滌細胞三次且再懸浮於低溫CHO緩衝液中。將經洗滌之細胞再懸浮且在濕冰上與100 µL之1:1000稀釋的APC結合的親和純化F(ab')₂ 片段山羊抗人類IgG, Fcγ (Jackson Immunoresearch)一起培育30分鐘。將細胞洗滌三次或四次，隨後使其再懸浮於CHO緩衝液中用於流式細胞量測分析。將使用640奈米雷射線之Becton Dickinson LSRFortessa儀器用於獲取細胞螢光資料。藉由FlowJo套裝軟體(FlowJo, LLC)分析細胞之幾何平均螢光且相對於抗體濃度進行繪製。在GraphPad Prism套件中使用非線性回歸分析計算經估計EC₅₀ 值。

人類化抗體0841與表現於CHO細胞表面上之人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白的結合在分別為1.62及1.54 nM之經估計EC₅₀ 值之情況下為類似的(表14)。相同分析中抗體0164之經估計EC₅₀ 值類似於CHO表現之人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白之經估計EC₅₀ 值(分別為1.39及1.73 nM) (表14)。實例 14 ： 對配位體結合於表現人類或石蟹獼猴 E - 選滯蛋白之 CHO 細胞的人類化抗 E - 選滯蛋白抗體中和

在靜態配位體細胞黏著分析中，辣根過氧化酶(HRP)結合E-選滯蛋白配位體且E-選滯蛋白抗體競爭結合於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞上表現之人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白。在靜態中和分析中使用競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)評估抗E-選滯蛋白抗體中和配位體結合的能力，以評估唾液酸路易斯抗原與經工程改造以表現人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白之中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的中和。

將表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞在培養基(補充有10%經透析胎牛血清、100 nM甲胺喋呤及100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素之最低必需培養基(MEM)Alpha培養基)中生長，且將表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞在補充有10%熱滅活胎牛血清(GIBCO)、100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素及125 µg/mL吉歐黴素(GIBCO)之R1培養基(RI杜氏改良伊格爾培養基/哈姆氏F12改良)中培養。將表現E-選滯蛋白之CHO細胞以12,500個細胞/孔接種至96孔組織培養盤中且在37℃、5% CO₂ 下培育48小時以形成匯合單層。隨後用200 μL不含鈣鎂之PBS洗滌培養盤兩次。在存在經生物素標記之唾液酸路易斯A聚丙烯醯胺(Carbosynth LLC，OS45446)或唾液酸路易斯X聚丙烯醯胺(Glycotech，01-045)與抗生蛋白鏈菌素/辣根過氧化酶之小型合成結合物(總計100 µL)的情況下，向分析中添加抗E-選滯蛋白抗體或IgG1同型對照物，且在37℃、5% CO₂ 下培育2小時。接著用200 μL不含鈣鎂之PBS洗滌培養盤兩次。在培育之後，將細胞用200 µL含有2 mM氯化鈣(50 mM三胺基甲烷[TRIS]、150 mM氯化鈉；0.05%聚山梨醇酯20，pH 7.4；2 mM氯化鈣)之洗滌緩衝液洗滌兩次。藉由添加100 µL之1-Step Ultra TMB受質(Thermo Scientific，34028)且在室溫下培育30分鐘來產生信號。使用2 M硫酸使反應停止且在450 nm下讀取吸光度(Spectramax M5e)。使用GraphPad Prism軟體(8.0.2版)分析且圖示資料。經估計半最大抑制濃度(IC₅₀ )值自該分析推導出。

藉由人類化抗體0841之對唾液酸路易斯配位體結合於表現於CHO細胞表面上之人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白的中和在分別為3.81及1.74 nM之經估計IC₅₀ 值之情況下為類似的(表14)。相同分析中0164之經估計IC₅₀ 值類似於CHO表現之人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白之經估計IC₅₀ 值(分別為5.17及2.00 nM)。實例 15 ： 在生理流動下對細胞黏著之人類化抗 E - 選滯蛋白抗體中和

進行離體細胞滾動/黏著研究以評估抗體0841及0164之效力及中和活性，從而使用生理流動系統抑制HL-60細胞對於CHO-人類E-選滯蛋白細胞之黏著。

將CHO-人類E-選滯蛋白細胞在37℃下、在5% CO₂ 及95%濕度情況下維持於Alpha培養基/10%經透析胎牛血清(GIBCO)/青黴素/鏈黴素(1×)及100 nM甲胺喋呤中。使BioFlux™培養盤以1達因/cm² 之流動速率塗佈有50 µg/mL於PBS中之纖維結合蛋白且在室溫下培育1小時。表現人類E-選滯蛋白之中國倉鼠卵巢細胞(人類CHO-E-選滯蛋白細胞)經製備用於藉由在37℃下以1:1比率處理0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)及StemPro阿庫酶(Accutase) (Gibco；A1110501)5分鐘之分析，經等體積之生長培養基中和，加以收集，以1000 rpm離心5分鐘且使其再懸浮，直至在生長培養基中之最終濃度為約30×10⁶ 個細胞/mL。將培養盤在室溫下用CHO-人類E-選滯蛋白生長培養基以1達因/cm² 灌注兩次持續2-3分鐘。移除所有培養基且以3-4達因/cm² 灌注30 µL之CHO-人類E-選滯蛋白細胞(處於30×10⁶ 個細胞/mL)持續25秒。自儀器移出培養盤且在37℃下在5% CO₂ 培育箱中培育1小時。移除培養基且添加500 µL新鮮生長培養基，且在37℃下在5% CO₂ 培育箱中培育細胞隔夜。培育之後，在具有新鮮生長培養基之BioFlux儀器上洗滌(3-4達因/cm² ) CHO-E單層。將PBS中之抗體0841(連續稀釋液)、同型對照抗體及IgG1對照抗體(200 nM)以及媒劑對照物以1達因/cm² 灌注1小時。

將HL-60細胞在37℃、在5% CO₂ 及95%濕度情況下維持於具有10%胎牛血清(Gibco)及1×青黴素/鏈黴素(Gibco)之RPMI/麩醯胺酸生長培養基(Gibco)中。在灌注之前將細胞維持在37℃下。將HL-60細胞在1000 rpm下離心5分鐘，用鈣黃綠素AM(Life Technologies™；C3099)染色30分鐘，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；Gibco)洗滌兩次，且在PBS中再懸浮直至濃度為約3×10⁶ 個細胞/mL。亦將經稀釋之抗體儲備液添加至細胞懸浮液中，隨後在流動腔室中進行灌注。在各通道中以1達因/cm² 之生理剪切流量對HL-60細胞之100 µL的等分試樣加抑制劑進行灌注10分鐘。將PBS以1達因/cm² 灌注2-3分鐘以移除非黏著細胞，且使培養盤成像且加以分析。分析係在室溫下進行。

抗體0841及0164在生理流動條件下分別以4.17及3.73 nM之經估計IC₅₀ 值抑制HL-60細胞對於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的中和(表14)。

表 14 . 藉由抗體0841及0164之結合及中和。

	靜態中和	在生理流動下之中和	藉由FACS 之細胞表面抗體結合
抗體	唾液酸路易斯配位體黏著CHO-人類E-選滯蛋白細胞的IC₅₀ (nM)	唾液酸路易斯配位體黏著CHO-石蟹獼猴E-選滯蛋白細胞的IC₅₀ (nM)	HL-60細胞黏著於CHO-人類E-選滯蛋白細胞的IC₅₀ (nM)	結合於CHO-人類E-選滯蛋白細胞的EC₅₀ (nM)	結合於CHO-石蟹獼猴E-選滯蛋白細胞的EC₅₀ (nM)
0841	3.81	1.74	4.17	1.62	1.54
0164	5.17	2.00	3.73	1.39	1.73

實例 16 ： 人類化抗 E - 選滯蛋白之生物物理表徵 熱穩定性

將差示掃描量熱法用於確定人類化抗體0841(包含SEQ ID NO:22之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:17之LC胺基酸序列)之穩定性。對於此分析，將處於0.3 mg/mL之樣品藉由自動取樣器(Malvern Instruments公司)分配至MicroCal VP-毛細管DSC之樣品盤中，在10℃下平衡5分鐘，且接著以每小時100℃之速率掃描直至110℃。選擇16秒之過濾期。將原始資料經基線校正且將蛋白質濃度標準化。Origin軟體7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA)係用於利用適當轉譯數目將資料擬合至MN2-狀態模型。下表15顯示Tris/Suc緩衝液(20 mM Tris、8.5%蔗糖，pH 7.5)、His/Suc緩衝液(20 mM組胺酸、8.5%蔗糖、0.005% EDTA，pH 5.8)及Glu/Tre緩衝液(20 mM麩胺酸、8.5%海藻糖，pH 4.5)中分子之熔融溫度(T_m 1 - T_m 4及FAB)。此分子顯示出良好穩定性，其中CH2域中之第一轉變(T_m 1)在Tris/Suc及Glu/Tre緩衝液中大於65℃，且僅在Glu/Tre緩衝液中低於65℃。

表 15 . 人類化抗體0841之熱轉變。

調配物	Tm1( ℃ )	Tm2( ℃ )	Tm3( ℃ )	Tm4( ℃ )	Tm Fab( ℃ )
Tris/Suc	75.04 ± 0.24	77.99 ± 0.04	85.31 ± 0.03	---	77.8
His/Suc	68.65 ± 0.05	77.48 ± 0.24	79.44 ± 0.08	84.65 ± 0.09	78.9
Glu/Tre	64.78 ± 0.13	77.44 ± 0.21	79.71 ± 0.10	---	79.0

強制降解

將人類化抗體0841充分透析至三種緩衝液中：Tris (20 mM Tris，pH 7.5)、His (20 mM組胺酸，pH 5.8)及Glu (20 mM麩胺酸，pH 4.5)，以用於在40℃下進行4週強制降解研究。在透析之後，將樣品濃度調節至5 mg/mL。在T0、T2及T4週時，獲取樣品用於分析性尺寸排阻層析(aSEC)、成像毛細電泳法(iCE)及生物分析測試。

藉由aSEC確定經加熱樣品之聚集狀態。將樣品注射至具有20 mM磷酸鈉、400 mM精胺酸(pH 7.2)作為移動相的與Agilent 1260 HPLC系統(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)連接之YMC-Pack Diol-200管柱(300×8.0 mm，孔隙尺寸200 Å)。將流動速率為0.75毫升/分鐘持續20分鐘的等度程式施用至aSEC管柱進行樣品溶離，且使用Agilent OpenLAB資料分析軟體分析資料以整合及定量聚集物、所關注蛋白質及低分子量物種的峰面積。所有樣品顯示出HMMS(高分子量物種)%及LMMS(低分子量物種)%之變化極小，亦即百分比小於5% (表16)。

表 16 . 對人類化0841之T4週強制降解樣品進行之aSEC。

	抗體0841 (HC SEQ ID NO: 22 ； LC ID SEQ NO: 17)
調配物	濃度 ( mg / mL )	HMMS %	LMMS %
Tris pH 7.5	5	3.05	0.48
His pH 5.8	5.2	2.75	0.39
Glu pH 4.5	5.3	2.73	0.84

iCE用於偵測強制降解樣品之基於電荷之異質性。iCE在高電壓下分離蛋白質電荷物種且在吸光度280 nm下偵測。載體兩性電解質產生pH梯度且蛋白質遷移，直至其淨電荷為零。分析電泳圖以確定酸性、主要及鹼性物種之pI值及峰面積。使用具有PrinCE自動取樣器之Protein Simple iCE3儀器分析樣品。將蛋白質於水中稀釋至2 mg/mL。樣品稀釋劑含有0.01 mg/mL pI標記物4.65、0.01 mg/mL pI標記物9.5、4.0% Pharmalyte (pH 3-10)、0.25%甲基纖維素及2.0 M脲。樣品含有15 μL 2 mg/mL之蛋白質及85 μL樣品稀釋劑。將樣品在1500伏下聚焦1分鐘且接著在3000伏下聚焦6分鐘。Empower軟體用於資料分析。

對於iCE分析中具有高百分比之酸性/鹼性物種之樣品，需要額外質譜分析來鑑定CDR區上之序列傾向性(sequence liabilities)。對組胺酸及麩胺酸緩衝液中之樣品的分析顯示酸性及鹼性物種之典型增加。然而，鹼性物種比對於Tris緩衝液中穩定抗體所預期的有更大增加，表明存在可能的化學修飾(表17)。使用質譜三部分分析及肽定位進一步分析全部三種緩衝液中之樣品。

表 17 . 對人類化抗體0841 (HC SEQ ID NO:22及LC SEQ ID NO:17)之強制降解樣品的iCE分析。

抗體 0841	40 ℃	pI	酸性物種 %	主要物種 %	鹼性物種 %
Tris ， pH 7.5	T0 wk	8.8	23.6	72.1	4.3
T2 wk	8.8	37.4	51.9	10.7
T4 wk	8.8	45.3	41.4	13.3
His ， pH 5.8	T0 wk	8.9	24.3	71.5	4.2
T2 wk	8.9	32.9	60.8	6.3
T4 wk	8.9	40.9	51.7	7.4
Glu ， pH 4.5	T0 wk	8.8	24.2	71.3	4.4
T2 wk	8.8	35.1	56.0	8.9
T4 wk	8.8	42.0	47.3	10.8

質譜分析

對於3部分質譜分析，使用FabALACTICA消化抗體。將50 µg抗體mAb添加至100-150 mM NaPO4 (pH 7.0)，體積為25 µL。添加1.5 µL之FabALACTICA酶(40 U/µL)且在37℃下在平緩振盪下培育隔夜(16-18小時)。在此之後，添加50 µL 8M Guan-HCl、12.5 µL 1 M DTT及12.5 µL 150 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0)。將此在37℃下在平緩振盪下培育1小時。將7-8 µg(約15 µL)用於3部分液相層析質譜(LC-MS)分析。

使用偶合至Waters H-類(Waters，Milford，MA) UPLC之Bruker maXis II質譜儀(Bruker，Billerica，MA)進行LC-MS分析。經維持於65℃下之Waters BEH C4 (1.7Å，2.1×150 mM)管柱以300 µL/min之流動速率分離經FabALACTICA消化及還原之樣品。移動相A為具有5%乙腈及0.05% TFA之水，移動相B為50:50之乙腈:2-丙醇及0.05% TFA。質譜儀在僅正MS模式下運行且用oTOF控制軟體獲取資料。TOF-MS信號係使用Compass DataAnalysis v 4.2 (Bruker)中之最大熵值進行解卷積。在時間四週(T4W)時對麩胺酸、組胺酸及Tris緩衝液中之強制降解0841樣品之分析顯示與在時間0 (T0)時之樣品相比類似的型態(圖 2 )。PyroE-Fd(來自IgG重鏈之在N端處具有焦麩胺酸(PyroE)的Fd片段)顯示尤其在Tris緩衝液中之T4W樣品的稍微增加(約3.5%)。另外，在T0及T4W樣品中偵測到約5% Fd D/P夾子(具有經裂解天冬胺酸/脯胺酸(D/P)位點之Fd片段)。藉由 LC - MS 之肽定位

為了進一步研究樣品穩定性，利用肽定位LC-MS。對於肽定位，抗體0841之變性及還原在37℃下在5 M Guan:HCl NaAc (pH 5.0)、10 mM TCEP中進行1小時。用100 mM MES (pH 6.0)、0.5 mM TCEP緩衝液稀釋反應混合物10次。接下來，以1:10比率添加LysC/胰蛋白酶混合物，隨後以37℃隔夜消化。用0.5% TFA/H₂ O(最終濃度)淬滅反應。接著將此消化混合物注射至Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos上以用於LC-MS分析。

LC-MS肽定位分析使用偶合至Waters H類(Waters，Milford，MA) UPLC之Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(Thermo Scientific，Waltham，MA)進行。將經消化樣品經維持在60℃下之Waters BEH C18 (300Å，1.7um 2.1×150 mM)管柱以200 µL/min之流動速率分離。移動相A為水中之0.05% TFA，且移動相B為乙腈中之0.05% TFA。使用梯度：0.5%比35% B，在135分鐘內將肽自管柱溶離。質譜儀在僅正MS模式掃描中自300至1600 m/z運行且用Xcalibur軟體獲得資料。資料分析及資料庫搜尋係使用Xcalibur軟體(Thermo Fisher Scientific，Waltham MA)及Peaks AB(Bioinformatics Solutions公司，Toronto，Canada)兩者進行。

對Tris、組胺酸及麩胺酸緩衝液之T4W樣品的高保真度肽定位分析鑑別HC CDR2肽中痕量之脫醯胺(＜1%)，其中序列IDPAN * G NTIYAEK(NG脫醯胺位點為加下劃線的；SEQ ID NO:176)。NG為常見脫醯胺位點，但在此情況下主要為穩定的。在具有序列TSQNIN * R YLNWYQQKPGK (NR脫醯胺位點為加下劃線的；SEQ ID N:177)之LC CDR1肽中偵測到潛在脫醯胺(呈丁二醯亞胺-N形式)，Tris T4W樣品中之脫醯胺增加至約5.1% (MS2光譜指示N(30)R位點為最可能脫醯胺位點，然而，N28及N34亦可潛在地具有痕量之脫醯胺) (表18)。

表 18 . 對人類化抗體0841之強制降解樣品的LC/MS肽定位。

HC CDR2 肽	常規肽 %	脫醯胺 %	丁二醯亞胺肽 %	總脫醯胺肽
T0	99.74%	0.07%	0.15%	0.26%
Glu T4W	99.62%	0.18%	0.16%	0.38%
His T4W	99.59%	0.16%	0.17%	0.41%
Tris T4W	99.36%	0.30%	0.15%	0.65%
LC CDR1 肽	常規肽 %	脫醯胺 %	丁二醯亞胺肽 %	總脫醯胺肽
T0	99.12%	0.00%	0.88%	88.00%
Glut T4W	98.08%	0.00%	1.48%	1.48%
His T4W	95.20%	0.08%	3.95%	4.03%
Tris T4W	93.46%	0.27%	4.85%	5.12%

競爭結合 ELISA

為了另外評估強制降解樣品之穩定性，在競爭結合ELISA中評估應激樣品之活性。在此，針對T0、T2W及T4W樣品與經生物素標記之嵌合抗體0164(包含HC SEQ ID NO:34及LC SEQ ID NO:31)競爭結合於人類E-選滯蛋白之能力，比較此等樣品之穩定性。人類E-選滯蛋白儲存於500 µg/mL之具有Ca/Mg之PBS中且用具有Ca/Mg之PBS稀釋至1 µg/mL之濃度。將此添加至384孔MaxiSorp培養盤中，加以密封且在4℃下在平緩振盪下培育隔夜。次日，將各孔中之試劑移出，隨後向各孔中添加50 μL阻斷緩衝液(具有Ca/Mg的PBS中之1% BSA)。將該等孔密封且在室溫下在平緩震盪下培育約1小時。在0.2 mg/mL之起始濃度下，將抗體0841用具有Ca/Mg之PBS以1/3稀釋之步驟連續稀釋總計12個濃度。

將經生物素標記之抗體0164在具有Ca/Mg之2% BSA/PBS中稀釋至0.04 µg/mL。將等體積之經稀釋抗體0841與經生物素標記之抗體0164混合。接下來，在TITERTEK上用1% BSA與PBST (0.05% Tween)阻斷洗滌培養盤3個循環，各洗滌使用80 µL。將培養盤輕拍於紙巾上以汲水。向384孔培養盤之各孔(一式兩份的孔)中添加抗體0841與經生物素標記之抗體0164的二十五µL混合物，且在室溫下在平緩振盪下培育2-4小時。重複洗滌步驟，重複3個2次洗滌之循環。接著，向各孔中添加稀釋抗生蛋白鏈菌素-HRP(約1/7500稀釋於阻斷緩衝液中)且在室溫下在平緩振盪下培育該培養盤約40分鐘至1小時。再次用3個2次洗滌循環重複洗滌步驟，輕拍乾燥，且隨後添加25 µL TMB受質(單組分HRP微孔受質)。此隨後為添加25 µL 0.18 M硫酸以在顏色達到飽和(藉由觀察顯色來確定)時停止反應。接著在Envision盤式讀取器上讀取培養盤之OD450量測值，且用GraphPad,Prism7分析資料。

競爭結合結果顯示於圖3中且在三種緩衝液中之任一者中的T0、T2W及T4W樣品之間未見差異。此等資料表明，在高溫條件(亦即40℃)下儲存後，抗體0841保持其與E-選滯蛋白結合之能力。 高濃度穩定性

將人類化抗體0841充分透析至三種緩衝液中：Tris/Suc (20 mM Tris、8.5%蔗糖，pH 7.5)、His/Suc (20 mM組胺酸、8.5%蔗糖、0.005% EDTA，pH 5.8)及Glu/Tre (20 mM麩胺酸、8.5%海藻糖，pH 4.5)。在透析之後，使用旋濾濃縮器將樣品濃縮至150 mg/mL且儲存於4℃及25℃下。在T0、T1、T2、T4及T6週時，獲取樣品用於即時aSEC分析。

高濃度樣品之聚集狀態如上文針對強制降解分析所描述藉由aSEC確定。儲存於4℃及25℃下之樣品在T6週(T6W)時在高濃度下穩定，但在所有三種緩衝液條件下HMMS之百分比有極少增加(＜5%) (表19)。

表 19 . 在T0及T6週時對人類化抗體0841 (HC SEQ ID NO:22，LC SEQ ID NO:17)之高濃度樣品的aSEC分析。

	抗體 0841
調配物	濃度 (mg/mL)	% HMMS T0	% HMMS T6W 4 ℃	% HMMS T6W 25 ℃
Tris/Suc ， pH 7.5	149.6	3.3	3.99	4.66
His/Suc ， pH 5.8	157.1	3.2	3.34	3.56
Glu/Tre ， pH 4.5	150.5	3.1	3.24	3.37

在T0、T3 (T3W)及T6週時，藉由iCE及毛細管凝膠電泳(CGE)分析樣品。使用與用於強制降解研究中之方法類似的方法，使用iCE偵測高濃度樣品之基於電荷的異質性。在His/Suc及Glu/Tre緩衝液中，在25℃下在儲存6週內觀測到酸性物種%及鹼性物種%之極小變化，其中酸性及鹼性物種之較大變化與Tris/Suc緩衝液相關(表20)。

表 20 . 對人類化抗體0841 (HC SEQ ID NO:22，LC SEQ ID NO:17)之高濃度樣品的iCE分析。

抗體 0841	25 ℃取樣時間	pI	酸性物種 %	主要物種 %	鹼性物種 %
Tris/Suc ， pH 7.5	T0 wk	9.0	25.8	69.9	4.3
T3 wk	9.0	32.3	60.7	6.9
T6 wk	9.0	37.6	53.1	9.3
His/Suc ， pH 5.8	T0 wk	9.0	25.9	69.4	4.7
T3 wk	9.0	27.6	67.2	5.1
T6 wk	9.0	28.7	65.6	5.7
Glu/Tre ， pH 4.5	T0 wk	9.0	25.6	69.6	4.8
T3 wk	9.0	28.0	65.8	6.2
T6 wk	9.0	30.1	63.1	6.9

進行CGE以確定抗體0841之高濃度樣品之片段化。使用來自Perkin Elmer之LabChip Touch HT蛋白質表現分析來分析樣品。根據製造商說明設置分析且使用經修改之方法製備樣品。簡言之，將處於1 mg/mL的5 µL樣品與35 µL之含有碘乙醯胺以用於非還原(nrCGE)或二硫蘇糖醇以還原CGE的樣品緩衝液混合，且在70℃下培育10分鐘。在加熱之後，將70 µL去離子水添加至各樣品中，隨後在Touch系統上進行分析。使用LabChip GX軟體定量各樣品之片段化尺寸及程度。

對片段化%及HMMS%之定量表明，高濃度之抗體0841在所有三種緩衝液中為穩定的(表21)。

表 21 . 對人類化抗體0841 (HC SEQ ID NO:22，LC SEQ ID NO:17)之高濃度樣品的CGE分析。

	片段化 % ( 25 ℃ )
	nrCGE	Tris/Suc pH 7.5	His/Suc pH 5.8	Glu/Tre pH 4.5
抗體 0841	T0 wk	0.49	0.87	0.51
T3 wk	0.75	0.3	0.75
T6 wk	1.1	0.31	1.69
	% HMMS (25 ℃ )
抗體 0841	nrCGE	Tris/Suc pH 7.5	His/Suc pH 5.8	Glu/Tre pH 4.5
T0 wk	0.03	0.03	0
T3 wk	0.31	0	0
T6 wk	0	0.38	0

實例 17 ： 對人類化抗 E - 選滯蛋白之電腦模擬免疫原性風險及 t 細胞抗原決定基預測。

使用電腦模擬工具預測人類化抗E-選滯蛋白抗體0841之免疫原性風險以預測MHCII肽結合。使用此等工具：(1)用於鑑別序列中各個個別肽之潛在MHCII結合的抗原決定基，(2)用於抗原決定基分類，以評估潛在MHCII肽結合物之風險，及(3)用於總體序列評分，以預測具有MHCII結合相關免疫原性風險之整個序列的總體風險。方法於下文中描述。 抗原決定基鑑別

使用兩種方案(下文所描述)分析序列以鑑別抗原決定基。對於任一方案，由本文中所描述之規則標記之任何序列視為抗原決定基。此等方法主要以胺基酸9-聚體之含量檢驗序列。方案 1 ： ISPRI / EpiMatrix

提供序列以用於ISPRI套裝軟體(ISPRI v 1.8.0，EpiVax公司，Providence，RI (2017))中之EpiMatrix分析(Schafer JRA等人(1998) Vaccine 16(19): 1880-84)。原始結果提供各9-聚體胺基酸片段針對8種不同HLA類型之結合的可能性之等級。因此，對於各9-聚體存在8個預測(「觀測結果」)。在序列之各個別線性編號位置處開始生成9-聚體(因此，同一9-聚體有可能在同一序列中出現超過一次)。若任何4個觀測結果指示9-聚體在結合物前5%中(意謂預測9-聚體在至少4個HLA類型之結合物前5%中)，則9-聚體被視為預測抗原決定基(「抗原決定基」)。或者，若8個預測中之任何1個指示9-聚體在結合物之前1%中，則9-聚體亦被視為預測抗原決定基。方案 2 ： IEDB 共同法

提供序列以用於使用IEDB (Vita R.等人, Nucleic Acids Res. 2015; 28 (43): D405-12; IEDB MHC-II Binding Predictions, www.iedb.org)中之MHC-II結合共同法(Wang P.等人(2010) BMC Bioinformatics 11: 568; Wang P.等人(2008) PLoS Comput. Biol. 4(4),e1000048)進行分析。軟體之輸出值根據15-聚體排列結果。提供15-聚體及HLA類型之各組合的共同評分及百分比等級。衍生各15-聚體之共識的個別評分為15-聚體中發現之某些9-聚體之等級：用於共識之各方法報告15-聚體內之9-聚體之百分比等級。視為總體15-聚體之值的共識為對於具有中值評分之9-聚體的預測。若(a)選擇9-聚體作為15-聚體之共識代表，及(b)對於所考慮之HLA類型的結合物之前10%中具有百分比等級，及若對於同一9-聚體之三種或更多種不同HLA類型出現標準(a)及(b) (亦即，三個觀測結果)，則將9-聚體分類為抗原決定基。所考慮之HLA類型為DRB1*01、1*03、1*04、1*07、1*08、1*11、1*13及1*15，其與標準ISPRI/EpiMatrix報告中之HLA類型相同。因此，儘管該方法之主要輸出值為15-聚體之等級，但為了易於與方案1比較，吾等將資料重新解釋以獲得預測之9-聚體抗原決定基之清單。 抗原決定基分類

各抗原決定基分類為生殖系或非生殖系抗原決定基。對於抗體，吾等基於各抗原決定基在抗體(CDR或非CDR)內之位置進一步分類各抗原決定基。吾等過濾自IMGT獲得之人類V域之序列(www.imgt.org)以移除標註為假基因之生殖系或開放閱讀框架(ORF)。其餘序列中發現之任何預測之9-聚體抗原決定基被視為生殖系抗原決定基。在J或C區(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)中發現之抗原決定基或此等區之間的接合點亦分類為生殖系抗原決定基。否則，抗原決定基被分類為非生殖系抗原決定基。可變域殘基係基於Kabat之編號系統(Kabat EA等人(1991) US Department of Health and Human Services, NIH Publication第91-3242號)進行編號。編號之後，CDR經界定為包括以下殘基：CDR-H1 (H26-H35，包括插入，諸如H35A，直至但不包括H36)、CDR-H2 (H50-H65，包括端點)、CDR-H3 (H95-H102，包括端點)、CDR-L1 (L24-L34，包括端點)、CDR-L2 (L50-L56，包括端點)、CDR-L3 (L89-L97，包括端點)。若所預測之9-聚體抗原決定基之胺基酸中之任一者為CDR區之一部分，則該抗原決定基為CDR抗原決定基。應注意，吾等選擇之CDR-H1之起始位置(H26)不同於使用Kabat標註之一些其他出版物。 總序列評分 ( 經 T - reg 調節之評分 )

對於個別鏈，或對於抗體VH及VL域之配對，藉由對各組成9聚體進行求和來計算總評分，如下。檢驗9-聚體及HLA類型之所有個別組合(「觀測結果」)，不管9-聚體是否為抗原決定基。若特定觀測結果指示肽在給定HLA類型之結合物的前5%中，則將此觀測結果之EpiMatrix Z-評分添加至與整個蛋白質序列相關之運行總計。亦記錄所檢驗之觀測結果的總數目。唯一例外為，假定藉由ISPRI鑑別為「T-抗原決定基」之9-聚體的所有觀測結果均具有零之EpiMatrix評分。在運行總計中，自各觀測結果(包括T-抗原決定基)減去0.05*2.2248之基線評分。最終評分經電腦計算如下：

經T-reg調節之評分=(運行總計)*1000/(觀測結果之數目)

較低評分指示較低之經預測免疫原性潛能。應注意，評分僅包括來自ISPRI/EpiMatrix之預測，且不包括來自IEDB之資訊。因此，藉由IEDB而非ISPRI預測之任何強HLA結合物並不影響評分。理論上，若EpiMatrix亦未預測相同序列為可能結合物，則序列可含有許多IEDB預測之HLA結合物且仍具有有利的經Treg調節之評分。

此等工具用於預測人類化抗體0841 (包含SEQ ID NO:25之VH胺基酸序列及SEQ ID NO:21之VL胺基酸序列)中之非生殖系T細胞抗原決定基之數目及總序列評分。使用兩種方案，在VH及VL序列(H27: YNIRSSYMH (SEQ ID NO:178)、H63: FKIRFTISA (SEQ ID NO:179)、H65: IRFTISADN (SEQ ID NO:180)、L29: INRYLNWYQ (SEQ ID NO:181)、L46: LLIYNANSL (SEQ ID NO:182)、L47: LIYNANSLQ (SEQ ID NO:183)、L48: IYNANSLQT (SEQ ID NO:184)及L49: YNANSLQTG (SEQ ID NO:185))中鑑別8個非生殖系抗原決定基(圖 4 )。另外，總序列評分為-30.34。抗原決定基之數目及總序列評分之降低經預測可降低序列之整體免疫原性風險。實例 18 ： 人類化抗 E - 選滯蛋白抗體之最佳化。 抗體 0841 之基於結構之合理突變誘發

抗E-選滯蛋白抗體0841含有若干預測的T細胞抗原決定基，其在向個體投與時可能增加免疫原性風險。此等包括VH及VL序列中所含之8個非生殖系抗原決定基(H27: YNIRSSYMH、H63: FKIRFTISA、H65: IRFTISADN、L29: INRYLNWYQ、L46: LLIYNANSL、L47: LIYNANSLQ、L48: IYNANSLQT及L49: YNANSLQTG)。另外，在熱強制降解之後對抗體之肽定位鑑別出L30位置處之NR脫醯胺傾向性。除L30處之NR脫醯胺傾向性以外，鑑別其他潛在傾向性位點，包括重鏈位置H54處之NG位點、位置L52處之NS位點及位置L92處之NS位點。基於結構之最佳化方法用於移除經預測之T細胞抗原決定基及序列傾向性位點。

起初雖然生成了另一人類化抗體0978(包含SEQ ID NO:28之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:26之LC胺基酸序列)，但該抗體將CDR-L2生殖至DPK9 CDR-L2 (AASSLQS (SEQ ID NO:3))且將CDR-H2之末端生殖至(H59-H65 YVDSVKG (SEQ ID NO:186))之DP-54序列。使用實例16中所描述之競爭結合分析，顯示抗體0978維持類似於抗體0841之結合。使此兩個伸長段生殖化移除了經預測T細胞抗原決定基中之5個(H63: FKIRFTISA (SEQ ID NO:179)、L46: LLIYNANSL (SEQ ID NO:182)、L47: LIYNANSLQ (SEQ ID NO:183)、L48: IYNANSLQT (SEQ ID NO:184)及L49: YNANSLQTG (SEQ ID NO:185)，但引入了新的經預測T細胞抗原決定基(H63: VKGRFTISA (SEQ ID NO:187))。另外，L2之突變移除了位置L52處之潛在NS傾向性位點，但H2末端之突變添加了作為另一潛在傾向性位點之位置H61處之DS位點。對抗體0978使用結合於E-選滯蛋白之c型凝集素域(殘基22-178)的抗體0164之x射線晶體結構進行基於結構之最佳化，以移除剩餘的3個經預測之T細胞抗原決定基及序列傾向。

為確定用於突變誘發之適合位置，使用Discovery Studio 4.5 (Dassault Systems Biovia公司)及FoldX進行親和力變化及穩定性變化兩者之突變的計算預測。耐受突變為對於Discovery Studio及FoldX方法兩者均未預測到具有ΔΔG＞1 kcal/mol之彼等突變。自此等預測，鑑別一組經預測對結合及穩定性具有最小影響同時移除預測的T細胞抗原決定基及序列傾向的殘基且將其示於表22中。

表 22 . 經預測以移除藉由基於合理設計之結構鑑別的序列傾向性模體或預測的T細胞抗原決定基之突變清單。

特徵	WT	突變體
L30脫醯胺位點模體NR	L30 NR	L30 ER
L92脫醯胺位點模體NS	L92 NS	L92 NA
H61異構化位點模體DS	H61 DS	H61 ES
H27預測之T細胞抗原決定基	H27: YN IRSS YMH (SEQ ID NO:178)	H27: YA IRSA YMH (SEQ ID NO:188)
H63預測之T細胞抗原決定基	H63: VK GRFTISA (SEQ ID NO:187)	H63: VE GRFTISA (SEQ ID NO:189)
H63: VK GRFTISA (SEQ ID NO:187)	H63: VT GRFTISA (SEQ ID NO:190)
H63: VKG RFTISA (SEQ ID NO:187)	H63: VKE RFTISA (SEQ ID NO:191)
L29預測之T細胞抗原決定基	L29: IN RYLNWYQ (SEQ ID NO:181)	L29: IE RYLNWYQ (SEQ ID NO:192)

使用此組突變，生成4種最佳化構築體，其移除表22中鑑別之3種序列傾向性及3個T細胞抗原決定基。此等構築體為抗體1282(包含SEQ ID NO:43之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)、抗體1284(包含SEQ ID NO:40之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)、抗體1444(包含SEQ ID NO:13之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)及抗體1448(包含SEQ ID NO:37之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)。相對於抗體0978之突變顯示於表23中。使用實例16中所描述之競爭結合分析證實此等突變體之結合親和力與抗體0978類似。

表 23 . 新序列之清單經最佳化以移除t細胞抗原決定基及序列傾向性。

抗體	HC 突變體	LC 突變體
1282	K64E	N30E，S93A
1284	D61E，K64E	N30E，S93A
1444	K64T	N30E，S93A
1448	G64E	N30E，S93A

實例 19 ： 對最佳化抗 E - 選滯蛋白抗體的中和。 ( 0164 、 0841 、 1282 、 1284 、 1444 、 1448 ) 對配位體結合於表現細胞表面 E - 選滯蛋白之 CHO 的中和

在靜態配位體細胞黏著分析中，辣根過氧化酶(HRP)結合的E-選滯蛋白配位體(唾液酸路易斯抗原)及E-選滯蛋白抗體競爭結合於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞上表現之人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白。在靜態中和分析中使用競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)評估抗E-選滯蛋白抗體中和配位體結合的能力，以評估唾液酸路易斯抗原與經工程改造以表現人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白之中國倉鼠卵巢細胞(CHO)的中和。

使表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞在培養基(最低必需培養基(MEM) Alpha培養基，補充有10% (體積/體積)經透析胎牛血清、100 nM甲胺喋呤及100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素)中生長。將表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞在補充有10%熱滅活胎牛血清(GIBCO)、100單位/mL青黴素及100 µg/mL鏈黴素及125 µg/mL吉歐黴素(GIBCO)之R1培養基(RI杜氏改良伊格爾培養基/哈姆氏F12改良)中培養。

將表現E-選滯蛋白之CHO細胞以12,500個細胞/孔接種至96孔組織培養盤中且在37℃、5% CO₂ 下培育48小時以形成匯合單層。隨後用200 μL不含鈣鎂之PBS洗滌培養盤兩次。在存在經生物素標記之唾液酸路易斯A聚丙烯醯胺(Carbosynth LLC，OS45446)或唾液酸路易斯X聚丙烯醯胺(Glycotech，01-045)與抗生蛋白鏈菌素/辣根過氧化酶之小型合成結合物(總計100 µL)的情況下，向分析中添加抗E-選滯蛋白抗體或IgG1同型對照物(IgG對照物)，且在37℃、5% CO₂ 下培育2小時。接著用200 μL不含鈣及鎂之PBS洗滌培養盤兩次。在培育之後，將細胞用200 µL含有2 mM氯化鈣(50 mM三胺基甲烷[TRIS]、150 mM氯化鈉；0.05%聚山梨醇酯20，pH 7.4；2 mM氯化鈣)之洗滌緩衝液洗滌兩次。藉由添加100 µL之1-Step Ultra TMB受質(Thermo Scientific，34028)且在室溫下培育30分鐘來產生信號。使用2 M硫酸使反應停止且在450 nm下讀取吸光度(Spectramax M5e)。使用GraphPad Prism軟體(8.0.2版)分析且圖示資料。自該分析推導出之經估計半最大抑制濃度(IC₅₀ )對於人類E-選滯蛋白而言在1.38至2.89 nM之範圍內且對於石蟹獼猴E-選滯蛋白而言在1.85至2.65 nM之範圍內(圖 5 及圖 6 ) (表24)。

表 24 . 對配位體結合於表現細胞表面E-選滯蛋白之CHO的中和

	對唾液酸路易斯配位體黏著之靜態中和
抗體	CHO - 人類E - 選滯蛋白細胞IC₅₀ (nM )	CHO - 石蟹獼猴E - 選滯蛋白細胞IC₅₀ (nM )
0164	2.69	2.25
0841	2.56	NT
1282	1.38	1.29
1284	2.77	1.91
1444	2.89	2.65
1448	2.78	1.85
NT=在此分析中未測定

在其他靜態中和分析中，使用類似於上文所描述之彼等方法的方法，抗體1444分別以1.88 nM至2.33 nM及1.47 nM至1.49 nM之經估計IC₅₀ 值中和配位體與由CHO細胞表現之人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白蛋白質的結合。 對配位體結合於可溶性重組蛋白的中和

在無鈣及鎂之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中製備經重組組胺酸標記之E-選滯蛋白、石蟹獼猴E-選滯蛋白(Sino Biologicals；190169-C08H)及人類E-選滯蛋白(Sino Biologicals；13025-H08H)儲備溶液，最終濃度為3 µg/mL。將經稀釋之重組E-選滯蛋白蛋白質之一百µL/孔添加至Ni-NTA HisSorb 96孔培養盤(Qiagen，35061)中且將培養盤在定軌振盪器上在室溫下培育2小時。將唾液酸路易斯A聚丙烯醯胺生物素亦即合成E-選滯蛋白配位體(GlycoTech公司01-044)與抗生蛋白鏈菌素HRP(辣根過氧化酶) (超級抗生蛋白鏈菌素(Ultra Streptavidin) HRP，Thermo Scientific N504)結合且稀釋於含有2 mM氯化鈣(BD OptEIA緩衝液；BD Biosciences，555213)之分析稀釋劑中。

抗體之兩倍濃縮儲備溶液(IgG1對照物，0160、1282、1284、1444及1448)亦在含有2 mM氯化鈣之分析稀釋劑中製得。在培育之後，將培養盤用200 µL含有2 mM氯化鈣(50 mM三胺基甲烷[TRIS]；150 mM氯化鈉；0.05%聚山梨醇酯20，pH 7.4；2 mM氯化鈣)之洗滌緩衝液洗滌5次。在此之後，重複兩次地添加100 µL抗體混合物(IgG1對照物，0160、1282、1284、1444及1448)及HRP結合的唾液酸路易斯A，且在定軌振盪器上在室溫下培育培養盤2小時。最終抗體濃度在200 nM至0.09 nM之範圍內且HRP結合的唾液酸路易斯A之最終濃度為5 µg/mL。如之前所提及洗滌培養盤且添加100 µL/孔之1-Step Ultra TMB受質(Thermo Scientific，34028)，且在室溫下培育5分鐘。用100 µl之2 M硫酸使反應停止且在450 nm下讀取吸光度(Spectramax M5e)。使用GraphPad Prism軟體(8.0.2版)分析且圖示資料。經估計半最大抑制濃度(IC₅₀ )值自該分析推導出(表25)。

經估計半最大抑制濃度(IC₅₀ )值自該分析推導出且在2.96 nM至3.59 nM(對於配位體結合於可溶性重組人類E-選滯蛋白之抗體中和)及2.74 nM至3.29 nM(對於配位體結合於可溶性重組石蟹獼猴E-選滯蛋白之抗體中和)之範圍內。

表 25 . 對配位體結合於可溶性重組E-選滯蛋白的中和

	對唾液酸路易斯配位體黏著之靜態中和
抗體	重組人類E - 選滯蛋白 —IC₅₀ (nM )	重組石蟹獼猴E - 選滯蛋白 —IC₅₀ (nM )
0164	3.39	3.29
1282	3.39	3.23
1284	3.59	3.39
1444	3.01	2.91
1448	2.96	2.74

在其他靜態中和分析中，使用類似於上文所描述之彼等方法的方法，抗體1444分別以2.87 nM至2.91 nM及2.39 nM至2.45 nM之經估計IC₅₀ 值中和配位體與人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白蛋白質的結合。實例 20 ： 使用表面電漿子共振進行之最佳化抗 E - 選滯蛋白之動力學評估。

在類似於實例4之方法中使用SPR測定人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白針對最佳化抗體1282、1284、1444及1448的結合親和力。此藉由首先使抗體結合於固定化抗人類IgG來進行。在抗體捕捉之後，使E-選滯蛋白蛋白質之稀釋物流過，且測定結合於人類及石蟹獼猴之締合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)、t½及K_D 值(表26)。在此SPR分析中，1282、1284、1444及1448對於人類E-選滯蛋白之親和力分別為70.3 nM、65.2 nM、61.8 nM及60.5 nM。1282、1284、1444及1448對於石蟹獼猴E-選滯蛋白的親和力分別為78.3 nM、76.5 nM、81.5 nM及67.8 nM。

表 26 . 藉由表面電漿子共振量測的抗E-選滯蛋白抗體對於人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白之親和力。

抗體 ( HC SEQ ID NO . ； LC SEQ ID NO .)	分析物
人類 E - 選滯蛋白	石蟹獼猴 E - 選滯蛋白
ka	Kd	t ½	K_D	ka	kd	t ½	K_D
(1/Ms)	(1/s)	(s)	(nM)	(1/Ms)	(1/s)	(s)	(nM)
1282 (43 ； 1)	2.01E+05	1.41E-02	49.3	70.3	2.27E+05	1.76E-02	39.4	78.3
1284 (40 ； 1)	2.22E+05	1.45E-02	48	65.2	2.36E+05	1.80E-02	38.5	76.5
1444 (13 ； 1)	2.64E+05	1.63E-02	42.7	61.8	2.11E+05	1.71E-02	40.5	81.5
1448 (37 ； 1)	2.10E+05	1.26E-02	55	60.5	2.22E+05	1.50E-02	46.2	67.8

實例 21 ： 最佳化抗 E - 選滯蛋白抗體 ( 0164 、 0841 、 1282 、 1284 、 1444 及 1448 ) 之細胞表面結合 ( FACS ) 及中和。 藉由 FACS 之細胞表面結合

藉由FACS分析抗體0841、0164、1282、1284、1444及1448與膜結合E-選滯蛋白的結合。表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞在Alpha培養基((最低必需培養基[MEM]) Alpha培養基，50-012-PC，Corning；)中培養，該培養基補充有經透析胎牛血清(GIBCO) (最終濃度為10%)及青黴素/鏈黴素(1X)且補充有甲胺喋呤。簡言之，使解凍之細胞最初在100 nM甲胺喋呤存在下生長。對於後續培養，自生長培養基中省去甲胺喋呤。

將內皮細胞自冷凍儲備液解凍且最初接種於再塗佈有無菌0.1%明膠溶液(Sigma，ES-006-B)之T-25燒瓶(Corning，353108)中。人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在內皮細胞生長培養基(Sigma Aldrich，211-500)中生長，而石蟹獼猴肺微血管內皮細胞(CLMEC)在完整猴內皮細胞培養基(Cell Biologics，MK1168)中生長。細胞在達到90%匯合度時分離且接種至三個預塗有0.1%明膠之T-175燒瓶中。

使用不含酶之細胞解離緩衝液(GIBCO，13151014)自匯合燒瓶分離表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞株。緊接著將生長培養基添加至經分離細胞中，接著在室溫下以300×g離心5分鐘以集結細胞。接著將細胞再懸浮於低溫CHO緩衝液中，該緩衝液由磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (pH 7.4)組成，含有最終濃度為1%之牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich，A3059)、最終濃度為1 mM之氯化鈣及最終濃度為0.1%之疊氮化鈉。

對於初級細胞亦即HUVEC或CLMEC，藉由用內皮細胞基本培養基(Sigma-Aldrich，210-500)置換生長培養基而使90%匯合度之培養物無血清饑餓。使細胞在37℃、5% CO₂ 及95%空氣下在含濕氣培育箱中培育2小時。緊接在血清饑餓之後，將含有10 ng/mL人類組織壞死因子-α (TNF-α；GIBCO)之內皮細胞基本培養基添加至細胞中以誘導E-選滯蛋白表現。在TNF-α刺激4小時後，使用檸檬酸鹽水(135 mM氯化鉀、15 mM檸檬酸鈉)使細胞分離且緊接著藉由添加氯化鈣再鈣化，直至達到1 mM最終濃度。將細胞在4℃下以300×g離心且藉由在濕冰中再懸浮於含有4%多聚甲醛(PFA；Electron Microscopy Sciences，15710)之PBS中固定15分鐘。藉由離心移除PFA且將細胞再懸浮於CHO緩衝液中隔夜。

使用96孔圓底培養盤之兩列重複兩次地進行使用CHO細胞之結合研究，而在96孔V底培養盤之單列中進行使用初級內皮細胞之結合研究。將培養盤在4℃下以300×g離心2分鐘，且將細胞再懸浮且藉由在濕冰上在CHO緩衝液中培育10分鐘來阻斷。在培育之後，將細胞在4℃下以300×g離心2分鐘以移除緩衝液。接著使各孔中之細胞集結粒再懸浮且在指定體積之連續稀釋抗體(人類IgG1對照物，0841，1282，1284，1444及1448)中培育且使其在濕冰上培育30分鐘。藉由三倍稀釋系列(1333 nM至0.0226 nM)使用CHO緩衝液作為稀釋劑製備測試抗體溶液。在與抗體一起培育之後，藉由在4℃下以300×g離心1分鐘來洗滌細胞三次且使其再懸浮於低溫CHO緩衝液中。將經洗滌之細胞再懸浮且在濕冰上與100 µL之1:1000稀釋的AlexaFluor647結合的山羊抗人類F(ab')₂ 片段(Fcγ片段特異性抗體，[Jackson Immunoresearch，109-606-170]一起培育45分鐘(CHO細胞)或30分鐘(內皮細胞)。將細胞洗滌三次或四次，隨後使其再懸浮於CHO緩衝液中用於流式細胞量測分析。將使用640奈米雷射線之Becton Dickinson LSRFortessa儀器用於獲取細胞螢光資料。藉由FlowJo套裝軟體(FlowJo, LLC)分析細胞之幾何平均螢光且相對於抗體濃度進行繪製。在Prism套件(格拉夫帕德，8版)中使用非線性回歸分析計算經估計EC₅₀ 值。

抗體0841、1282、1284、1444及1448以亞至低nM範圍內之類似經估計EC₅₀ 值結合於經工程改造以表現之人類E-選滯蛋白的CHO細胞(表27)。對照人類IgG並未展現與表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的任何結合。

抗體0164、1282、1284、1444及1448結合於用TNF-α處理4小時以誘導E-選滯蛋白表現的HUVEC及CLMEC上之細胞表面人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白。與未偵測到結合之IgG1同型對照物相比，觀測到與經TNF-α活化之HUVEC或CLMEC之細胞表面上之內源性表現之E-選滯蛋白的結合。觀測到高螢光背景且未計算EC₅₀ 值(表27)。

表 27 . 藉由FACS之細胞表面抗體結合

抗體	結合於CHO - 人類E - 選滯蛋白細胞的EC₅₀ (nM )	結合於經活化HUVEC 細胞	結合於經活化CLMEC 細胞
0164	NT	結合	結合
0841	0.71	NT	NT
1282	0.85	結合	結合
1284	0.64	結合	結合
1444	0.66	結合	結合
1448	0.75	結合	結合

實例 22 ： 最佳化抗 E - 選滯蛋白抗體對細胞黏著之靜態中和

E-選滯蛋白結合於血球表面上表現之經唾液酸化路易斯修飾之配位體。在此研究中，人類前髓細胞性細胞株(HL-60)用作E-選滯蛋白配位體之細胞來源。在靜態中和黏著分析中評估抗體0164、1282、1284、1444及1448對HL-60細胞黏著於細胞表面E-選滯蛋白(CHO細胞上)的中和活性。

使表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞在補充有100 nM甲胺喋呤之新鮮生長培養基中生長。在細胞之此初始繼代之後，自生長培養基中省去甲胺喋呤用於後續培養。表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞在R1培養基中培養。在細胞之此初始繼代之後，自生長培養基中省去吉歐黴素用於後續培養。

將對數期之HL-60細胞使用羧基螢光素二乙酸丁二醯亞胺基酯螢光染料(CFSE)標記套組(ThemoFisher，65-0850-84)進行標記。將經標記之HL-60細胞以400,000個細胞/mL之密度再懸浮於CHO緩衝液(PBS，pH 7.4/1%牛血清白蛋白(BSA)/1 mM氯化鈣(CaCl₂ )/0.1%疊氮化鈉(NaN₃ ))中以用於靜態黏著分析。

評估抗體0164、1282、1284、1444及1448在靜態條件下抑制HL-60細胞對於表現E-選滯蛋白之CHO細胞的細胞黏著的能力。簡言之，將CHO細胞以100,000個細胞/孔之密度接種於96孔(技術複製)平底黑色培養盤之兩列上且使其在含濕氣培育箱中在37℃、5% CO₂ 及95%空氣下形成匯合單層(通常在24小時之後)。使用CHO緩衝液平緩地洗滌細胞單層，接著將指定孔與抗體溶液(0164、1282、1284、1444及1448)以三倍稀釋系列(範圍介於200 µg/mL或1333 nM至0.003 µg/mL或0.022 nM)一起培育。緊接著向孔中添加適當體積之經CFSE標記之HL-60細胞懸浮液(400,000個細胞/mL)，使得最終抗體濃度(範圍介於200 µg/mL或1333 nM至0.003 µg/mL或0.022 nM)得以維持。將經標記之HL-60細胞與CHO細胞單層一起在37℃、5% CO₂ 及95%空氣下於含濕氣培育箱中培育45分鐘。在培育之後，將培養盤用CHO緩衝液洗滌三次，且所結合HL-60細胞之螢光係在494/521奈米之激發/發射波長下使用Spectramax i3X (Molecular Devices)量測。將螢光單位繪製為抗體濃度之函數且使用非線性回歸分析使用GraphPad Prism軟體(8.0.2版)估計IC₅₀ 。

抗體之經估計IC₅₀ 值為類似的且在3.4 nM至6.2 nM之範圍內(圖 7 ) (表28)。

表 28 . HL-60細胞黏著之靜態中和。

HL -60 細胞黏著之靜態中和
抗體	CHO - 人類E - 選滯蛋白細胞 -IC₅₀ (nM )
0164	4.4
1282	3.4
1284	4.4
1444	4.7
1448	6.2

在另一靜態中和分析中，使用類似於上文所描述之彼等方法的方法，抗體1444分別以3.36 nM及3.84 nM之經估計IC₅₀ 值中和HL-60與細胞表面人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白兩者的黏著(表38)。實例 23 ： 最佳化抗 E - 選滯蛋白抗體之內源性人類 E - 選滯蛋白結合。

使用IP-LC/MS/MS方法，進行對藉由最佳化抗E-選滯蛋白抗體1282、1284、1444及1448在人類血漿中抑制E-選滯蛋白結合的分析。此方法定量人類血清中之游離可溶性人類E-選滯蛋白或石蟹獼猴血清中之游離可溶性猴E-選滯蛋白。該方法使用在250 μL PBS中之50 μL血清，將其在4℃下(在冷室中，在500 rpm下振盪)與1.0 μg經生物素標記之抗E-選滯蛋白抗體0164一起培育隔夜。在培育之後，將30 µL Invitrogen T1抗生蛋白鏈菌素磁性珠粒添加至各樣品中，隨後在室溫下培育40分鐘(在1000 rpm下振盪)。使用Hamilton Microlabstar，將磁性珠粒接著用PBS/0.05% Tween-20洗滌兩次，隨後用PBS洗滌一次。接著，將可溶性E-選滯蛋白自具有145 µL之30 mM鹽酸(HCl)的珠粒溶離，且用32 µL之1 M Tris HCl (pH 8)中和。隨後添加50 fmol之經穩定同位素標記(SIL)之內部標準物，之後添加二硫蘇糖醇(DTT，10 µL×50 mM)。在60℃下培育35分鐘之後，使樣品冷卻至室溫，隨後添加碘乙醯胺(IAA，10 µL×100 mM)。接著將樣品置於暗處持續30分鐘，向其中添加1 μg Promega LysC/胰蛋白酶(10 µL×100 µg/mL)，且接著在37℃下消化隔夜。

在隔夜培育之後，將50 µL所製備樣品注射至奈米ESILC-MS/MS。藉由監測可溶性E-選滯蛋白之胰蛋白酶肽(CSSLAVLEK (SEQ ID NO:193))進行定量。此定量顯示抗體1282、1284、1444及1448具有類似之對人類E-選滯蛋白的抑制，其中IC₅₀ 分別為2.4 nM、1.1 nM、1.2 nM及1.8 nM，且IC₉₀ 分別為4.9 nM、4.8 nM、6.5 nM及8.6 nM。實例 24 ： 對人類化抗 E - 選滯蛋白之生物物理表徵。 熱穩定性

差示掃描量熱法用於確定四種最佳化抗E-選滯蛋白抗體1282、1284、1444及1448之穩定性。使用與實例16中所描述之方法類似的DSC方法。下表29顯示Tris/蔗糖(「Tris/Suc」)緩衝液(20 mM Tris、8.5%蔗糖，pH 7.5)、組胺酸/蔗糖(「His/Suc」)緩衝液(20 mM組胺酸、8.5%蔗糖、0.005% EDTA，pH 5.8)及麩胺酸/海藻糖(「Glu/Tre」)緩衝液(20 mM麩胺酸、8.5%海藻糖，pH 4.5)中此等分子之熔融溫度(T_m 1 - T_m 3及FAB)。所有四個分子展現良好穩定性，其中Tris/Suc、His/Suc及Glu/Tre緩衝液中CH2域中之第一轉變(T_m 1)大於65℃。此等分子顯示His/Suc及Glu/Tre緩衝液中之穩定性有略微增加，及Tris/Suc緩衝液中之穩定性有略微降低。

表 29 . 藉由差示掃描量熱法確定之最佳化抗E-選滯蛋白抗體的熱穩定性。

抗體	調配物	Tm1( ℃ )	Tm2( ℃ )	Tm3( ℃ )	Fab 之表觀 Tm ( ℃ )
1282	Tris/Suc，pH 7.5	71.41 ± 0.01	77.23 ± 0.04	85.86 ± 0.02	71.7
His/Suc/EDTA，pH 5.8	71.70 ± 0.02	77.64 ± 0.05	84.42 ± 0.01	72.0
Glu/Tre，pH 4.5	65.99 ± 0.02	74.81 ± 0.01	82.99 ± 0.02	74.9
1284	Tris/Suc，pH 7.5	71.56 ± 0.01	78.12 ± 0.02	85.52 ± 0.02	71.7
His/Suc/EDTA，pH 5.8	71.52 ± 0.06	76.09 ± 0.16	84.23 ± 0.02	73.0
Glu/Tre，pH 4.5	65.95 ± 0.02	75.42 ± 0.01	83.07 ± 0.02	75.5
1444	Tris/Suc，pH 7.5	71.25 ± 0.01	77.78 ± 0.02	85.47 ± 0.02	71.4
His/Suc/EDTA，pH 5.8	71.69 ± 0.01	78.17 ± 0.02	84.34 ± 0.01	71.8
Glu/Tre，pH 4.5	65.79 ± 0.01	74.28 ± 0.01	82.88 ± 0.02	74.3
1448	Tris/Suc，pH 7.5	72.06 ± 0.01	77.70 ± 0.02	85.47 ± 0.01	72.2
His/Suc/EDTA，pH 5.8	73.10 ± 0.10	76.24 ± 1.54	84.34 ± 0.02	73.5
Glu/Tre，pH 4.5	65.65 ± 0.01	74.62 ± 0.03	76.58 ± 0.02	75.2

強制降解

製備最佳化抗E-選滯蛋白抗體1282、1284、1444及1448用於在40℃下藉由充分透析至三種緩衝液中進行4週強制降解研究：Tris (20 mM Tris，pH 7.5)、His (20 mM組胺酸，pH 5.8)及Glu (20 mM麩胺酸，pH 4.5)。在透析之後，將樣品濃度調節至5 mg/mL。在T0、T2及T4週時，將樣品等分用於aSEC、iCE及生物分析測試。

如實例16中所描述，藉由aSEC確定強制降解樣品之聚集狀態。所有樣品在T4週時顯示最小變化，小於5% LMMS及小於1% HMMS物種(表30)。

表 30 . 對最佳化抗E-選滯蛋白抗體之強制降解樣品進行之aSEC

	抗體 1282
第4週，40℃	% HMMS	主要 %	% LMMS
Tris (pH 7.5)	0.38	97.18	2.43
His (pH 5.8)	0.33	97.44	2.23
Glu (pH 4.5)	0.47	95.91	3.62
	抗體 1284
第4週，40℃	% HMMS	主要 %	% LMMS
Tris (pH 7.5)	0.62	96.38	3.00
His (pH 5.8)	0.34	97.51	2.15
Glu (pH 4.5)	0.51	95.65	3.84
	抗體 1444
第4週，40℃	% HMMS	主要 %	% LMMS
Tris (pH 7.5)	0.56	95.55	3.89
His (pH 5.8)	0.31	97.70	2.00
Glu (pH 4.5)	0.59	95.63	3.78
	抗體 1448
第4週，40℃	% HMMS	主要 %	% LMMS
Tris (pH 7.5)	0.68	94.96	4.36
His (pH 5.8)	0.33	97.56	2.11
Glu (pH 4.5)	0.61	95.68	3.72

成像毛細管等電聚焦(iCE)用於偵測強制降解樣品之基於電荷之異質性。此使用與實例16中使用之方法類似的方法完成。對於iCE分析中具有高%之酸性/鹼性物種之樣品，需要額外質譜分析來鑑定CDR區中之序列傾向性。對Tris、His及Glu緩衝液中之樣品的分析顯示酸性及鹼性物種之典型增加(表31)。使用質譜三部分分析及肽定位進一步分析抗體1444以用於與人類化0841比較。

表 31 . 對最佳化抗E-選滯蛋白抗體之強制降解樣品的iCE分析。

抗體 1282	40 ℃	iCE pI	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris，pH 7.5	T0W	7.66	19.7	75.4	5.0
T2W	7.66	38.8	48.4	12.8
T4W	7.66	45.6	38.5	15.9
His，pH 5.8	T0W	7.74	18.2	77.7	4.1
T2W	7.73	25.9	65.2	8.9
T4W	7.74	33.7	55.9	10.4
Glu，pH 4.5	T0W	7.67	20.2	74.5	5.3
T2W	7.67	31.5	55.5	13.0
T4W	7.66	40.6	42.8	16.6
抗體 1284	40 ℃	iCE pI	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris，pH 7.5	T0W	7.66	22.3	73.4	4.4
T2W	7.66	36.3	51.7	12.0
T4W	7.66	49.2	36.0	14.8
His，pH 5.8	T0W	7.74	19.5	76.8	3.7
T2W	7.75	27.5	65.6	6.9
T4W	7.74	35.6	55.7	8.8
Glu，pH 4.5	T0W	7.67	21.1	74.3	4.6
T2W	7.67	32.1	56.6	11.4
T4W	7.67	41.9	43.8	14.2
抗體 1444	40 ℃	iCE pI	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris，pH 7.5	T0W	8.02	25.1	71.3	3.6
T2W	8.02	36.2	52.3	11.5
T4W	8.02	51.4	34.2	14.4
His，pH 5.8	T0W	8.08	25.7	70.8	3.6
T2W	8.08	33.2	59.7	7.1
T4W	8.09	44.6	47.1	8.4
Glu，pH 4.5	T0W	8.03	20.7	75.8	3.6
T2W	8.03	36.3	52.4	11.3
T4W	8.03	44.3	40.9	14.8
抗體 1448	40 ℃	iCE pI	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris，pH 7.5	T0W	8.01	24.5	71.8	3.7
T2W	8.01	39.1	50.4	10.5
T4W	8.01	54.0	33.0	13.0
His，pH 5.8	T0W	8.07	25.6	70.7	3.8
T2W	8.07	34.8	57.2	8.0
T4W	8.08	40.0	51.0	9.0
Glu，pH 4.5	T0W	8.02	22.3	73.8	3.9
T2W	8.02	31.6	54.5	13.9
T4W	8.02	39.9	42.3	17.8

質譜分析

對最佳化抗體1444進行3部分質譜分析。對Glu、His及Tris緩衝液中之T4W處抗體1444之強制降解的分析顯示與T0相比之類似概況。在應激樣品中觀測到低含量之scFc(單鏈Fc)氧化及D/P夾子，偵測到低含量之oxi_Fd(氧化Fd)，偵測到痕量Fd+ HexNAc(糖化Fd)，偵測到痕量Fd D/P夾子(具有裂解D/P位點之Fd片段)，且觀測到低含量PyroE Fd(在N末端具有焦麩胺酸之Fd片段) (圖 8 )。

使用與實例16中使用之方法類似的方法進行抗體1444之肽定位。對Tris、His或Glu緩衝液中T0及T4週強制降解樣品的高保真肽定位分析指示，僅在抗E-選滯蛋白抗體1444 HC CDR 2肽IDPANGNTIYVDSVTGR (SEQ ID NO:194)中偵測到痕量異構化及脫醯胺化(表32)。所有樣品均具有＞96%常規肽，其中發現小於1%為脫醯胺肽且發現小於2%為含有異構化(IsoD)之肽。此經最佳化變異體不再在輕鏈位置30處含有經突變成Glu之化學不穩定模體。對於LC CDR1肽TSQNIERYLNWYQQKPGK (SEQ ID NO:195)，未偵測到修飾。

表 32 . 對來自最佳化抗E-選滯蛋白抗體1444之HC CDR2肽之強制降解樣品進行的LC/MS肽定位。

HC CDR2 肽	常規肽 %	脫醯胺肽 %	isoD 肽 %
T0	99.00%	0.07%	0.32%
Glu T4W	98.30%	0.18%	0.56%
His T4W	96.60%	0.16%	0.65%
Tris T4W	97.80%	0.30%	1.20%

為了另外評估強制降解樣品之穩定性，在競爭結合ELISA中評估應激樣品(抗體1282、1284、1444、1448)之活性。在此，針對T0、T2W及T4W樣品與經生物素標記之嵌合抗體0164競爭結合於人類E-選滯蛋白之能力，進行比較。此方法類似於實例16中所描述之方法。競爭結合結果顯示於圖 9A - 9D 中且T0、T2W及T4W樣品之間並未可見差異，指示抗體結合於E-選滯蛋白之能力在高溫培育之後為穩定的。 高濃度穩定性

將最佳化抗E-選滯蛋白抗體1282、1284、1444及1448充分透析至三種緩衝液中：Tris/Suc (20 mM Tris、8.5%蔗糖，pH 7.5)、His/Suc (20 mM組胺酸、8.5%蔗糖、0.005% EDTA，pH 5.8)及Glu/Tre(20 mM麩胺酸、8.5%海藻糖，pH 4.5)。在透析之後，使用旋濾濃縮器將樣品濃縮至150 mg/mL且儲存在4℃及25℃下。在時間零(T0)、一週(T1W)、兩週(T2W)、四週(T4W)、六週(T6W)及七週(T7W)時，將樣品等分用於即時aSEC分析，其中在研究結束時進行T0、T3及T7週時之iCE及CGE分析。

如實例16中所描述，藉由aSEC確定高濃度樣品之聚集狀態。在4℃及25℃下之樣品在所有時間點顯示良好高濃度穩定性，其中在所有三個緩衝液條件下之HMMS極少增加(總計＜5%) (圖 10A - 10D )。

使用與實例16所描述之方法類似的方法，使用iCE偵測高濃度樣品之基於電荷的異質性。經由7週研究，在25℃下儲存於Tris/Suc、His/Suc及Glu/Tre緩衝液中之抗體中可見酸性物種%及鹼性物種%之最小變化(表33)。

表 33 . 對最佳化抗E-選滯蛋白抗體之25℃高濃度樣品的iCE分析。

抗體 1282
緩衝液 / 時間	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris/Suc T0	17.7	77.5	4.8
Tris/Suc T3W	25.1	67.0	7.9
Tris/Suc T7W	35.1	54.1	10.8
His/Suc T0	13.2	82.7	4.1
His/Suc T3W	15.4	79.1	5.5
His/Suc T7W	18.3	75.6	6.1
Glu/Tre T0	16.9	77.3	5.8
Glu/Tre T3W	18.1	74.6	7.3
Glu/Tre T7W	21.1	69.5	9.5
抗體 1284
緩衝液 / 時間	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris/Suc T0	22.4	73.2	4.4
Tris/Suc T3W	29.6	63.3	7.1
Tris/Suc T7W	37.2	53.4	9.4
His/Suc T0	16.5	79.8	3.7
His/Suc T3W	19.3	76.1	4.6
His/Suc T7W	22.4	71.9	5.7
Glu/Tre T0	18.6	77.0	4.5
Glu/Tre T3W	20.0	73.7	6.2
Glu/Tre T7W	22.7	69.9	7.4
抗體 1444
緩衝液 / 時間	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris/Suc T0	24.0	72.4	3.6
Tris/Suc T3W	31.9	61.0	7.1
Tris/Suc T7W	39.2	51.1	9.8
His/Suc T0	24.7	71.1	4.3
His/Suc T3W	24.4	70.9	4.7
His/Suc T7W	29.5	64.1	6.5
Glu/Tre T0	24.0	72.4	3.6
Glu/Tre T3W	26.7	67.0	6.4
Glu/Tre T7W	29.7	63.0	7.3
抗體 1448
緩衝液 / 時間	酸性物種 %	主要 %	鹼性物種 %
Tris/Suc T0	30.4	65.3	4.4
Tris/Suc T3W	35.1	58.6	6.3
Tris/Suc T7W	43.3	48.0	8.7
His/Suc T0	28.1	67.5	4.4
His/Suc T3W	30.7	63.5	5.8
His/Suc T7W	32.4	61.2	6.3
Glu/Tre T0	27.9	68.4	3.8
Glu/Tre T3W	29.2	63.9	6.9
Glu/Tre T7W	32.8	57.9	9.2

進行CGE分析以確定最佳化抗體1282、1284、1444及1448之高濃度樣品的片段化。該分析使用與實例16所描述之方法類似的方法完成。定量片段化%及HMMS%展現在25℃下所有三種緩衝液中抗體1282、1284、1444及1448之良好高濃度穩定性(表34)。

表 34 . 對最佳化抗E-選滯蛋白抗體之25℃高濃度樣品的CGE分析。

			非 HLC %
抗體 1282 緩衝液 / 時間	HLC % 之總和	非 HLC %	片段 % ( LMMS )	其他 % ( HMMS )
Tris/Suc，T0	99.89	0.11	0.07	0.04
Tris/Suc，T3W	99.88	0.12	0.05	0.07
Tris/Suc，T7W	99.86	0.14	0.07	0.07
His/Suc，T0	99.92	0.08	0.04	0.04
His/Suc，T3W	99.95	0.05	0.04	0.01
His/Suc，T7W	99.90	0.10	0.07	0.03
Glu/Tre，T0	99.96	0.04	0.00	0.04
Glu/Tre，T3W	99.84	0.16	0.11	0.05
Glu/Tre，T7W	99.77	0.23	0.20	0.03
			非 HLC %
抗體 1284 緩衝液 / 時間	HLC % 之總和	非 HLC %	片段 % ( LMMS )	其他 % ( HMMS )
Tris/Suc，T0	99.99	0.01	0.00	0.01
Tris/Suc，T3W	99.79	0.21	0.10	0.11
Tris/Suc，T7W	99.79	0.21	0.11	0.10
His/Suc，T0	99.92	0.08	0.05	0.03
His/Suc，T3W	99.90	0.10	0.05	0.05
His/Suc，T7W	99.75	0.25	0.19	0.06
Glu/Tre，T0	99.86	0.14	0.09	0.05
Glu/Tre，T3W	99.84	0.16	0.11	0.05
Glu/Tre，T7W	99.76	0.24	0.19	0.05
			非 HLC %
抗體 1444 緩衝液 / 時間	HLC % 之總和	非 HLC %	片段 % ( LMMS )	其他 % ( HMMS )
Tris/Suc，T0	99.68	0.32	0.19	0.13
Tris/Suc，T3W	99.79	0.21	0.07	0.14
Tris/Suc，T7W	99.03	0.97	0.66	0.31
His/Suc，T0	99.70	0.30	0.20	0.10
His/Suc，T3W	99.85	0.15	0.05	0.10
His/Suc，T7W	99.43	0.57	0.42	0.15
Glu/Tre，T0	99.76	0.24	0.12	0.12
Glu/Tre，T3W	99.57	0.43	0.32	0.11
Glu/Tre，T7W	99.31	0.69	0.59	0.10
			非 HLC %
抗體 1448 緩衝液 / 時間	HLC % 之總和	非 HLC %	片段 % ( LMMS )	其他 % ( HMMS )
Tris/Suc，T0	99.74	0.26	0.14	0.12
Tris/Suc，T3W	99.52	0.48	0.20	0.28
Tris/Suc，T7W	99.28	0.72	0.35	0.37
His/Suc，T0	99.62	0.38	0.27	0.11
His/Suc，T3W	99.29	0.71	0.56	0.15
His/Suc，T7W	99.25	0.75	0.57	0.18
Glu/Tre，T0	99.59	0.41	0.27	0.14
Glu/Tre，T3W	99.18	0.82	0.68	0.14
Glu/Tre，T7W	99.23	0.77	0.65	0.12

黏度

最佳化抗體1282、1284、1444及1448之黏度係使用以下基於DLS(動態光散射)珠粒之方法來量測。使用膜卡匣裝置10K MWCO(Thermo Scientific)，將PBS中之蛋白質針對20 mM組胺酸、85 mg/mL蔗糖、0.05 mg/mL EDTA (pH 6.0)充分透析。將蛋白質自透析收集且使用0.2 µM針筒過濾器加以過濾。使用Vivaspin離心式濃縮器10K MWCO (GE Healthcare)濃縮蛋白質。隨著蛋白質體積減小且蛋白質濃度增加，自濃縮器滯留物移除樣品等分試樣(12 μL)。將300 nm珠粒(Nanosphere，Thermo Scientific)添加至蛋白質樣品及空白緩衝液(buffer blank)。將珠粒以1:10稀釋於20 mM組胺酸、85 mg/mL蔗糖、0.05 mg/mL EDTA (pH 6.0)中且將0.75 μL經稀釋之珠粒摻入蛋白質樣品中。藉由平緩渦流混合蛋白質/珠粒及緩衝液/珠粒樣品。將八μL樣品轉移至1536孔培養盤(SensoPlate，玻璃底部(glass bottom)，Greiner Bio-One)以藉由DLS分析。用光學透明膠帶密封該培養盤且以2000 RPM離心2分鐘以移除氣泡。

使用DynaPro盤式讀取器(Wyatt Technology，Santa Barbara，Calif.)進行DLS量測。在25℃下培育樣品且在15次連續25秒獲取情況下進行量測。珠粒之半徑經平均化以獲取具有可接受衰減曲線之資料。基於斯托克斯-愛因斯坦方程式(Stokes-Einstein equation)計算黏度。樣品黏度計算為所量測之表觀半徑除以標稱珠粒半徑乘以0.893厘泊(cP)，亦即在25℃下水之黏度。

高濃度調配物為抗體之所需特性，允許較高給藥劑量高及較低給藥頻率。最佳化抗體皆顯示良好黏度概況，其中其黏度不達到20 cP直至大約160 mg/mL。為證實此量測值，使用下文所描述之Anton Parr方法進行各最佳化抗體在單一濃度下之額外黏度量測。

使用50 kDa分子量截止值之Amicon離心式過濾器單元(EMD Millipore，Billerica，MA)，將蛋白質樣品濃縮至170-180 mg/mL之目標。藉由在SoloVPE可變路徑長度系統(Variable Pathlength System) (C Technologies公司，Bridgewater，NJ)上進行之280 nm分析來測定蛋白質濃度。在25℃下以150 rpm之恆定轉速使用CP25-1圓錐及培養盤在MCR-302流變儀(Anton Paar USA公司，Ashland，VA)上進行黏度量測。每個樣品收集總計各自10秒之10次量測結果且使用Rheoplus (Anton Paar USA公司) V 3.62軟體分析資料。在179.5 mg/mL下量測1282之黏度為36.29 cP。在171.9 mg/mL下量測1284之黏度為27.38 cP。在185.7 mg/mL下量測1444之黏度為33.43 cP。在186.8 mg/mL下量測1448之黏度為33.35 cP。所有此等量測結果均與DLS黏度量測結果之曲線擬合充分擬合，從而增強其準確性(圖 11 )。實例 25 ： 對最佳化抗 E - 選滯蛋白之電腦模擬免疫原性風險及 T 細胞抗原決定基預測。

使用電腦模擬工具預測最佳化抗E-選滯蛋白抗體1282、1284、1444及1448之免疫原性風險以預測MHCII肽結合。使用之方法與實例17中所描述之方法類似。最佳化抗體顯示經改善之總序列評分，自-30.34(對於人類化抗體0841)減少至評分-46.26(對於抗體1282)、-46.16(對於抗體1284)、-45.11(對於抗體1444)及-45.32(對於抗體1448)。另外，在最佳化抗體中移除8種所預測之非生殖系T細胞抗原決定基(表35)。

表 35 . 對最佳化抗E-選滯蛋白抗體之電腦模擬免疫原性分析。

抗體	VH Seq ID NO	VL Seq ID NO	總序列評分	抗原決定基
所有	非生殖系	CDR	非生殖系 CDR
0841	25	21	-30.34	15	8	9	8
1282	45	5	-46.26	10	0	4	0
1284	42	5	-46.16	10	0	4	0
1444	11	5	-45.11	10	0	4	0
1448	39	5	-45.32	10	0	4	0

實例 26 ： 最佳化抗 E - 選滯蛋白抗體之自相互作用及多反應性。

測試結合於DNA及胰島素之最佳化抗體1444 (包含SEQ ID NO:13之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)、1282 (包含SEQ ID NO 43之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)、1284 (包含SEQ ID NO:40之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)及1448 (包含SEQ ID NO:37之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)，且除此之外亦在AC-SINS分析中測試自相互作用(親和力捕捉自相互作用奈米粒子質譜分析(affinity-capture self-interaction nanoparticle spectroscopy)；Liu等人(2014) mAbs 6:483-92)。在AC-SINS分析中，若在金奈米球上捕捉之mAb彼此結合且因此引起珠粒聚集，則該等mAb誘導吸光度最大值之偏移。已表明此分析中之較高評分與較低或較差溶解度及非特異性膜相互作用相關(Liu等人, mAbs 2014; 6:483-92)。抗體1282、1284、1444及1448具有極低AC-SINS評分及DNA/胰島素評分，其與陰性對照物之彼等評分類似(表36)。此等資料表明此等抗體處於低多反應性風險下，類似於陰性對照物之彼等風險。

表 36 . E-選滯蛋白抗體之非特異性結合及自相互作用。

抗體	AC - SINS ( 相對於空白之最大吸光度波長， nm )	相對於空白標準化之 DNA 結合	相對於空白標準化之胰島素結合
1282	1	2	1
1284	1	2	2
1444	1	3	2
1448	1	2	2
多反應性陰性對照物	1	2	4
多反應性陽性對照物(MJ4-2 v1.1/P33)	22	34	36

實例 27 ： 使用表面電漿子共振進行之最佳化抗 E - 選滯蛋白之交叉反應性評估。

使用如實例20中所描述之SPR，測定人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白對於最佳化抗體1444(包含SEQ ID NO:13之HC胺基酸序列及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)的結合親和力。使用具有405 nM之高分析物濃度的類似方法，吾等亦使用與實例5中所描述之方法類似的方法評估此抗體對於大鼠E-選滯蛋白、小鼠E-選滯蛋白、兔E-選滯蛋白、人類L-選滯蛋白及人類P-選滯蛋白之同源物的結合親和力。在25℃下，觀測到在至多405 nM下抗體1444與大鼠E-選滯蛋白、小鼠E-選滯蛋白、兔E-選滯蛋白、人類L-選滯蛋白及人類P-選滯蛋白之結合或未觀測到此結合(圖 12 )。抗體1444以68.35 +/- 3.18 nM之K_D 結合於人類E-選滯蛋白，且以64.9 +/- 1.13 nM之K_D 結合於石蟹獼猴E-選滯蛋白。實例 28 ： 對抗體 1282 、 1284 、 1444 及 1448 之基於培養盤之直接結合 ELISA 分析。

直接結合ELISA用於表徵抗體0841、1282、1284、1444及1448與各種固定化可溶性重組選滯蛋白之結合。在無鈣及鎂之磷酸鹽緩衝鹽水中製備經重組組胺酸標記之人類P-選滯蛋白、E-選滯蛋白或L-選滯蛋白(Sino Biologicals)、小鼠E-選滯蛋白(Sino Biologicals)、大鼠E-選滯蛋白(Sino Biologicals)及石蟹獼猴E-選滯蛋白(Sino Biologicals)儲備溶液，最終濃度為1 µg/mL。對照物包括針對L-選滯蛋白之抗體(BioLegend；304811)或針對P-選滯蛋白之抗體或陰性對照物IgG。將一百µL/孔之經稀釋之重組選滯蛋白蛋白質添加至Ni-NTA HisSorb 96孔培養盤(Qiagen；35061)中。將培養盤在室溫下於定軌振盪器上培育2小時。在培育之後，將培養盤用200 µL之洗滌緩衝液(50 mM三胺基甲烷[TRIS]；150 mM氯化鈉；0.05%聚山梨醇酯20，pH 7.4)洗滌3次。為減少非特異性結合，將培養盤用200 µL阻斷緩衝液(BD OptEIA緩衝液；555213；BD Biosciences)處理，在室溫下於定軌振盪器上培育1小時且如上文所描述加以洗滌。在四倍稀釋系列(範圍介於133.33 nM至0.004 nM，在BD OptEIA緩衝液中進行)情況下將抗體(IgG1對照抗體、抗E-選滯蛋白抗體、抗P-選滯蛋白抗體或抗L-選滯蛋白抗體)以100 µL/孔重複兩次地添加至反應，在定軌振盪器上培育1小時且如上文所描述加以洗滌。添加一百µL特異性偵測抗體(描述如下)且培育1小時： ․ 使用按1比25000或1比50000稀釋的過氧化酶結合的山羊抗人類IgG Fc γ (Jackson ImmunoResearch Lab；109-035-008)偵測到IgG1對照物、0841、1282、1284、1444、1448、抗小鼠E-選滯蛋白及抗P-選滯蛋白抗體； ․ 使用按1比25000稀釋的過氧化酶結合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch Lab；)偵測到抗L-選滯蛋白及抗大鼠E-選滯蛋白抗體。

洗滌培養盤且添加100 µL/孔之1-Step Ultra TMB受質(Thermo Scientific，)，且在室溫下培育5分鐘。用100 µL之2 M硫酸使反應停止且在450 nm下讀取吸光度(Spectramax M5e)。使用GraphPad Prism軟體(8.0.2)分析且圖示資料。經估計半最大濃度(EC₅₀ )值自該分析推導出。

在經估計EC₅₀ 值分別為0.362 nM及0.081 nM之針對L-選滯蛋白或P-選滯蛋白之抗體情況下，觀測到與固定化人類L-選滯蛋白或人類P-選滯蛋白之劑量依賴性結合。相比之下，未觀測到0841、1282、1284、1444或1448對於可溶性人類L-選滯蛋白或P-選滯蛋白蛋白質之交叉反應性(圖 13 )。此等研究表明，抗體(例如1444)選擇性地結合於E-選滯蛋白，而未觀測到結合於人類L-選滯蛋白或P-選滯蛋白。

在具有低至亞-奈莫耳結合(分別為0.153 nM及0.0139 nM)之對照大鼠或小鼠抗E-選滯蛋白抗體情況下，觀測到與小鼠E-選滯蛋白及大鼠E-選滯蛋白之劑量依賴性結合。相比之下，觀測到0841、1282、1284、1444或1448與小鼠及大鼠E-選滯蛋白之弱結合，且與陽性對照抗體相比，結合曲線向右偏移。結合曲線指示與針對對照大鼠或小鼠E-選滯蛋白之抗體相比的較弱、非飽和或可變結合(表37)。

表 37 . 對於可溶性重組E-選滯蛋白蛋白質之抗體交叉反應性。

抗體	人類E - 選滯蛋白 EC₅₀ (nM)	石蟹獼猴E - 選滯蛋白 EC₅₀ (nM)	小鼠E - 選滯蛋白 EC₅₀ (nM)	大鼠E - 選滯蛋白 EC₅₀ (nM)
0841	0.17	0.081	弱、不飽和	弱、可變
1282	NT	NT	弱、不飽和	弱、可變
1284	0.10	0.082	弱、不飽和	弱、可變
1444	0.12	0.093	弱、不飽和	弱、可變
1448	NT	NT	弱、不飽和	弱、可變
NT=未測定

在另一直接結合ELISA中，使用與上文所描述之彼等類似的方法，抗體1444以0.085之EC₅₀ 結合於固定化可溶性重組人類E-選滯蛋白且以0.071至0.075 nM之EC₅₀ 結合於固定化可溶性重組石蟹獼猴E-選滯蛋白(表38)。實例 29 ： 靜脈內或皮下投與後之猴中最佳化抗體 1444 之藥物動力學。

最佳化抗體1444之藥物動力學研究係在石蟹獼猴中使用靜脈內及皮下投與進行。血清抗體1444(包含SEQ ID NO:7之HC胺基酸序列(其包括末端離胺酸)及SEQ ID NO:1之LC胺基酸序列)濃度之定量係使用Meso-Scale Discovery® (MSD)分析平台上之免疫分析來確定。在分析中，為定量抗E-選滯蛋白抗體1444，使經生物素標記之山羊抗人類免疫球蛋白G (IgG)結合於阻斷的抗生蛋白鏈菌素塗佈之小斑點培養盤上。抗E-選滯蛋白抗體1444由配位體、重組人類可溶性E-選滯蛋白捕捉。用釕化山羊抗人類IgG偵測所結合抗E-選滯蛋白抗體1444。在MSD SECTOR成像器6000上讀取培養盤，且藉由使用經釕標記之山羊抗人類IgG抗體及三丙胺(TPA)進行最終偵測，以在MSD儀器內產生代表所結合抗E-選滯蛋白抗體1444之量的電化學發光信號。樣品濃度由使用5參數邏輯方程式(標準曲線之加權公式為1/y^2)進行擬合之標準曲線的插值確定。100%血清中之定量範圍為40.0 ng/mL至2560 ng/mL。

向兩個動物各自靜脈內(IV)投與0.3、0.6、1、3或10 mg/kg之後，抗體1444展現自時間0至最後可量測濃度(CL₀ _- _tlast )計算的平均全身性清除率分別為0.39、0.31、0.15、0.18及0.18 mL/h/kg，且在穩態(V_ss ₍ ₀ _- _tlast ₎ )下分佈之表觀體積分別為25、22、27、35及36 mL/kg。抗體1444顯示劑量依賴性藥物動力學，清除率隨著指示目標介導之藥物處置的劑量之增加而降低。對於以0.3、0.6、1、3或10 mg/kg靜脈內投與之平均半衰期(t₁ _/ ₂ )分別為102、264、188、287及345小時。

在向兩隻動物各自皮下(SC)投與1或3 mg/kg之後，當與靜脈內投與1 mg/kg之抗體相比時，抗體1444在以1 mg/kg皮下投與之後具有50%之平均生物可用性(%F)。在皮下投與3 mg/kg之抗體1444後，當與靜脈內投與3 mg/kg之抗體1444相比時，抗體1444具有65%之平均%F。對於以1及3 mg/kg皮下投與抗體1444之平均半衰期(t₁ _/ ₂ )分別為243及518小時。

在Meso Scale Discovery平台上，證實配位體結合分析可偵測石蟹獼猴血清中抗藥物抗體(ADA)之存在。在此方法中，各培養盤上包括2種不同濃度之陽性對照物(由摻入石蟹獼猴血清中之小鼠單株抗-抗體1444抗體組成)及陰性對照物(由彙集之正常石蟹獼猴血清組成)以監測分析效能。在所有劑量組中，對於抗體1444之ADA誘導的總發生率為0% (0/18動物)。實例 30 ： 在生理流動分析中藉由最佳化抗體 1444 對細胞黏著之離體中和

在塗佈有重組蛋白或細胞單層之微流體通道內進行離體細胞黏著實驗，以評估抗體1444抑制表現E-選滯蛋白配位體之細胞之黏著的效能及中和活性。細胞黏著在生理流動條件下使用BioFlux™ (S/N-008-0180-08)系統(Fluxion，San Francisco，CA，USA)分析。使用經工程改造以表現細胞表面上之E-選滯蛋白(人類或石蟹獼猴)的重組純化可溶性E-選滯蛋白或P-選滯蛋白蛋白質或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞進行黏著分析。將表現E-選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯X配位體之人類HL-60細胞，表現E-選滯蛋白配位體之經純化人類嗜中性白血球或獲自患有鐮狀細胞疾病的患者之全血，用於測試對於重組E-選滯蛋白及P-選滯蛋白及表現E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著。

將BioFlux™培養盤/腔室(Fluxion Biosciences，48孔低剪切，0-20達因/cm² ；910-0004)用於此等研究。將表現人類E-選滯蛋白(人類CHO-E，Pfizer)或石蟹獼猴E-選滯蛋白(石蟹獼猴CHO-E，Pfizer)之CHO細胞及HL-60細胞在37℃下、在5% CO₂ 及95%濕度情況下維持於其對應生長培養基中。在使用HL-60細胞或經純化人類嗜中性白血球之研究中，將細胞在1000 rpm下離心5分鐘，用鈣黃綠素AM(鈣黃綠素；LifeTechnologies™；C3099)染色30分鐘，用具有鈣及鎂之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (Gibco；目錄號14040-133)洗滌兩次，且使其再懸浮於PBS中直至濃度為3×10⁶ 個細胞/mL，隨後在流動腔室中進行灌注。將細胞在37℃下維持，隨後灌注且在室溫下進行BioFlux™分析。觀測黏著細胞且使用具有40倍放大率之Nikon Eclipse Ti-S (NIS-Elements BR 3.2 64位)倒置級相位對比螢光顯微鏡對其進行計數。使細胞計數相對於磷酸鹽緩衝液媒劑對照物進行標準化。各實驗根據每一條件具有兩個孔。使用GraphPad Prism (8.0.2)圖示且分析資料。自該分析推導出之經估計半最大抑制濃度(IC₅₀ )值四捨五入至十進制小數點之兩個有效數位。藉由相對於媒劑對照物(=100%，無抑制)使資料標準化來計算經估計IC₅₀ 值。 對於細胞黏著於重組 E - 選滯蛋白之中和

首先，為模擬經活化內皮細胞之表面，使流動腔室塗佈有等量的人類E-選滯蛋白可溶性重組蛋白及P-選滯蛋白可溶性重組蛋白。使BioFlux™流動微通道塗佈有20 µg/mL之可溶性重組人類P-選滯蛋白及E-選滯蛋白(Sino Biologicals)中之各者，該等選滯蛋白於PBS中製備，以1達因/cm² 灌注5分鐘，在室溫下培育1小時並以1達因/cm² 用0.1%牛血清白蛋白(BSA)/PBS洗滌3-5分鐘。將培養盤以1達因/cm² 用包括抗體1444(濃度為0.78至200 nM)、同型陰性對照抗體(200 nM)、PBS中之陽性對照抗E選滯蛋白抗體(200 nM)及媒劑對照物之測試製品處理1小時。在各通道中以1達因/cm² 之生理剪切流量對HL-60細胞之100 µL的等分試樣進行灌注10分鐘。將PBS以1達因/cm² 灌注2-3分鐘以移除非黏著細胞且如所描述進行分析。

在腔室中灌注抗體1444(0.78至200 nM)、同型陰性對照抗體或媒劑以抑制E-選滯蛋白結合。在此等研究中，使表現E-選滯蛋白配位體、PSGL-1及其他唾液酸路易斯X配位體之HL-60細胞以1達因/cm流動。抗體1444以15.26 nM之經估計IC₅₀ 值降低HL-60細胞對於純化可溶性人類E-選滯蛋白蛋白質的黏著。同型陰性對照物在分析中無作用。陽性對照抗E選滯蛋白抗體使HL-60黏著度減少約43%。

在其他流動黏著中和分析中，使用與上文所描述之方法類似的方法，抗體1444以13.28 nM-15.94 nM之經估計IC₅₀ 值中和HL-60對於重組人類E-選滯蛋白蛋白質之黏著(表38)。 對細胞黏著於表現 E - 選滯蛋白之中國倉鼠卵巢細胞之中和

使BioFlux™培養盤在PBS中以1達因/cm² 之流動速率塗佈有100 µg/mL纖維結合蛋白(Advanced BioMatrix，目錄號5050-1MG)且在室溫下培育1小時。表現E-選滯蛋白之中國倉鼠卵巢細胞(人類或石蟹獼猴CHO-E細胞)經製備用於藉由在37℃下以1:1比率處理0.05%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA) (Gibco，25300054)及StemPro阿庫酶(Gibco；A1110501)5分鐘之分析，經等體積之生長培養基中和，加以收集，以1000 rpm離心5分鐘且使其再懸浮於其對應生長培養基中，直至最終濃度為60×10⁶ 個細胞/mL。將培養盤在室溫下以1達因/cm² 用250 µL之CHO生長培養基灌注2-3分鐘總計兩次，移除所有培養基且將10-20 µL之CHO-E細胞(處於60×10⁶ 個細胞/mL)以2-3達因/cm² 灌注15秒。自儀器移出培養盤且在37℃下在5% CO₂ 培育箱中培育1小時。移除培養基且添加500 µL新鮮生長培養基，且在37℃下在5% CO₂ 培育箱中培育細胞隔夜。培育之後，在具有新鮮生長培養基之BioFlux儀器上洗滌(3-4達因/cm² ) CHO-E單層。將培養盤以1達因/cm² 用包括抗體1444(濃度為0.78至200 nM)、同型陰性對照抗體(200 nM)、PBS中之陽性對照商用抗E選滯蛋白抗體(200 nM)及媒劑對照物之測試製品處理1小時。在各通道中以1達因/cm² 之生理剪切流量對HL-60細胞之100 µL的等分試樣進行灌注10分鐘。將PBS以1達因/cm² 灌注2-3分鐘以移除非黏著細胞，且使培養盤成像且如所描述進行分析。

E-選滯蛋白表現於內皮細胞表面上。使表現E-選滯蛋白(人類或石蟹獼猴)之CHO細胞附著於流動腔室之表面以形成細胞單層。將抗體1444灌注於腔室中(0.78至200 nM)且在生理流動下以1達因/cm² 灌注HL-60細胞。陰性對照物包括同型陰性對照抗體及媒劑。抗E-選滯蛋白抗體1444以4.41 nM之經估計IC₅₀ 值中和HL-60細胞與人類CHO-E-選滯蛋白細胞的細胞黏著。另外，使HL-60對於表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之細胞中和的經估計IC₅₀ 值為4.34 nM。同型陰性對照抗體並未中和HL-60與表現人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞的結合。在200 nM下之陽性對照抗體測試使HL-60對於表現人類E-選滯蛋白之細胞的黏著度降低約44%。

在其他流動黏著中和分析中，使用與上文所描述之方法類似的方法，抗體1444分別以4.25 nM-4.56 nM及4.32 nM-4.35 nM之經估計IC₅₀ 值中和HL-60與表現人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著(表38)。 對經純化嗜中性白血球黏著於表現 E - 選滯蛋白之中國倉鼠卵巢細胞之中和

如所描述在Bioflux培養盤上製備人類及石蟹獼猴CHO細胞單層。全血獲自四個健康志願者供體(Pfizer)且彙集3 mL之各者，且將嗜中性白血球根據製造商方案使用Miltenyi套組(MACSxpress全血嗜中性白血球分離套組，人類，130-104-434)進行純化。

以1達因/cm² 對包括抗體1444(濃度為0.78至200 nM)、同型陰性對照抗體(200 nM)、PBS中之陽性對照抗E選滯蛋白抗體(200 nM)及媒劑對照物之測試製品進行灌注1小時。在分析之前，將經純化嗜中性白血球用鈣黃綠素染色且在37℃下用腫瘤壞死因子-α (TNF-α) (Biotang公司，50-751，5681)處理10分鐘。在室溫下收集嗜中性白血球300×g持續10分鐘，且使其再懸浮於PBS(具有鈣及鎂)中。以1達因/cm² 灌注嗜中性白血球10分鐘。將PBS以1達因/cm² 灌注2-3分鐘以移除非黏著細胞，且使培養盤成像且加以分析。

嗜中性白血球表現E-選滯蛋白配位體且E-選滯蛋白介導對於內皮之嗜中性白血球黏著性。評估在離體生理流動下抗E-選滯蛋白抗體對於人類嗜中性白血球相對於表現E-選滯蛋白(人類或石蟹獼猴)之CHO單層的中和。將抗體1444、同型陰性對照抗體或媒劑灌注至腔室中。將人類嗜中性白血球自4個健康供體純化，彙集，且在分析中評估經TNF-α活化(10 ng/mL)之嗜中性白血球。抗體1444以2.87 nM之經估計IC₅₀ 值中和經活化人類嗜中性白血球對於人類CHO-E-選滯蛋白細胞的黏著。中和經活化人類嗜中性白血球對於石蟹獼猴CHO-E-選滯蛋白細胞的黏著之經估計IC₅₀ 為16.33 nM。

在其他流動黏著中和分析中，使用與上文所描述之方法類似的方法，抗體1444分別以4.65 nM及9.45 nM之經估計IC₅₀ 值中和經活化人類嗜中性白血球與表現人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞的黏著(表38)。 SCD 血球黏著之中和

SCD中之促發炎反應藉由鐮狀紅血球及經活化內皮細胞中之變化促成(Manwani D及Frenette PS Blood 2013；122(24):3892-98)。紅血球鐮狀化、溶血及內皮細胞功能障礙引起發炎及細胞活化且促成SCD發病機制。用鈣黃綠素及赫斯特(Hoechst)標記來自患有SCD之2個供體的全血，以觀察滾動及黏著。簡言之，在出現之後24小時分析血液，且用含有1 mM氯化鈣、1 mM氯化鎂、10 mM N-2-羥乙基哌嗪-N-2-甲磺酸、0.25% BSA、0.1%葡萄糖(pH 7.4)之HBSS(漢克氏平衡鹽溶液)緩衝液稀釋至15%之血容比。在分析之前，將血球在37℃下用鈣黃綠素及赫斯特(Thermo Scientific，目錄號33342)染料(1:1000)染色30分鐘。使流動腔室以1達因/cm² 塗佈有20 µg/mL之於PBS中製備之可溶性重組人類E-選滯蛋白及P-選滯蛋白蛋白質(Sino Biologicals)中之各者持續5分鐘，在室溫下培育1-2小時並以1達因/cm² 用0.1% BSA/PBS洗滌3-5分鐘。

對於重組人類E-選滯蛋白及P-選滯蛋白蛋白質之黏著，評估來自兩個供體之血液。使包括抗體1444、PBS中之抗P-選滯蛋白抗體對照物(0.78-200 nM)、同型陰性對照抗體(200 nM)、對照抗E-選滯蛋白抗體(200 nM)或媒劑之測試製品以1達因/cm² 流動1小時。使經稀釋之SCD血液以0.6達因/cm² 流動10分鐘。將PBS以1達因/cm² 灌注2-3分鐘以移除非黏著細胞，且使培養盤成像且加以分析。如上文所描述計算經估計IC₅₀ 值。基於下式：(IC₅₀ *效應)/(100-效應)，計算經估計IC₂₀ 、IC₈₀ 及IC₉₀ 。計算係基於最大效應模型(E_max Tmodel)[E=(E_最大值 +C)/(C+EC₅₀ )]。

同型陰性對照抗體並未中和結合。在200 mM下測試之陽性對照抗體減少的細胞結合黏著在10%-35%之間。抗體1444以6.17 nM及18.66 nM(平均值為12.4 nM)之經估計IC₅₀ 值中和人類SCD細胞與重組E-選滯蛋白之結合(圖 14 )。IC₂₀ 、IC₈₀ 及IC₉₀ 值分別經估計為3.1 nM、49.6 nM及111.6 nM。使用可溶性E-選滯蛋白及P-選滯蛋白蛋白質塗佈之腔室在類似生理流動條件下，與P-選滯蛋白抑制相比，在E-選滯蛋白抑制下觀測到細胞黏著之較大中和。

表 38 . 抗體1444之關鍵藥理學特性之概述。

分析	藥效學活性
*活體外分析*
與可溶性重組蛋白的 SPR 結合
人類E-選滯蛋白	K_D = 68.4 +/- 3.18 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	K_D = 64.9 +/- 1.13 nM
小鼠E-選滯蛋白	無結合(至多405 nM)
大鼠E-選滯蛋白	無結合
兔E-選滯蛋白	無結合
與可溶性重組蛋白的直接結合 ELISA 結合
人類E-選滯蛋白	EC₅₀ = 0.085 nM - 0.12 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	EC₅₀ = 0.071 nM - 0.093 nM
人類P-選滯蛋白	無結合
人類L-選滯蛋白	無結合
小鼠E-選滯蛋白	弱、不飽和結合(至多133.3 nM)
大鼠E-選滯蛋白	弱、不飽和結合(至多133.3 nM)
與細胞表面表現之 E - 選滯蛋白的 FACS 結合
CHO 細胞
人類E-選滯蛋白	EC₅₀ = 0.66 nM - 2.33 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	EC₅₀ = 0.75 nM - 1.37 nM
初級細胞 - 經 TNF α 活化
人類-HUVECS	結合
石蟹獼猴-CLMEC	結合
選擇性
CHO人類P-選滯蛋白細胞	無結合
CHO DUKX親本	無結合
功能分析
對配位體結合 ( 唾液酸路易斯 A ) 之中和
CHO 細胞
人類E-選滯蛋白	IC₅₀ = 1.88 nM - 2.89 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	IC₅₀ = 1.47 nM - 2.65 nM
可溶性重組蛋白
人類E-選滯蛋白	IC₅₀ = 2.87 nM - 3.01 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	IC₅₀ = 2.39 nM - 2.91 nM
HL - 60 細胞 ( 內源性配位體 ) 之靜態黏著中和
CHO 細胞
人類E-選滯蛋白	IC₅₀ = 3.36 nM - 4.7 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	IC₅₀ = 3.84 nm
HL - 60 細胞 ( 內源性配位體 ) 之流動黏著中和
可溶性重組蛋白
人類E-選滯蛋白	IC₅₀ = 13.28 nM - 15.94 nM
CHO 細胞
人類E-選滯蛋白	IC₅₀ = 4.25 nM - 4.56 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	IC₅₀ = 4.32 nM - 4.35 nM
人類嗜中性白血球 ( 內源性配位體 ) 之中和
CHO 細胞
人類E-選滯蛋白	IC₅₀ = 2.87 nM - 4.65 nM
石蟹獼猴E-選滯蛋白	IC₅₀ = 9.45 nM - 16.33 nM
SCD 患者細胞之中和
可溶性人類重組蛋白	IC₅₀ = 12.4 nM
	IC₂₀ = 3.2 nM
	IC₈₀ = 49.6 nM
	IC₉₀ = 111.6 nM

實例 31 ： 最佳化抗 E - 選滯蛋白抗體 1444 之細胞表面結合 ( FACS ) 及中和。

E-選滯蛋白表現於內皮細胞表面上及內皮細胞功能障礙之條件下，諸如發炎反應，從而使經由配位體-黏著分子相互作用而黏著於血管內皮之血球循環。評估抗體1444結合細胞表面表現之E-選滯蛋白的能力。在此等研究中，使用表現膜結合人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞株表徵抗體1444與細胞表面表現之E-選滯蛋白的結合。

藉由FACS分析使用抗體1444、同型對照IgG1及兩種對照P-選滯蛋白抗體來評估細胞表面上表現E-選滯蛋白(人類或石蟹獼猴)或人類P-選滯蛋白之CHO細胞及對照未經轉染之CHO細胞(CHO-DUKX)。抗體1444以0.66至2.33 nM之經估計EC₅₀ 結合於人類E-選滯蛋白(基於6次實驗)。抗體1444以0.75至1.37 nM之經估計EC₅₀ 結合於石蟹獼猴E-選滯蛋白(基於6次實驗)。抗體1444未結合於對照CHO-DUKX，指示不存在可偵測細胞表面結合。此外，抗體1444並未結合細胞表面P-選滯蛋白。觀測到對照抗P-選滯蛋白抗體與CHO-P-選滯蛋白細胞之劑量依賴性結合，指示P-選滯蛋白之表現。在同型對照IgG1下未觀測到結合(表38)。實例 32 ： 石蟹獼猴中之耐受性及毒理動力學研究

石蟹獼猴係唯一基於活體外藥理學研究之藥理學相關非臨床物種，該研究經設計以評估抗體1444抑制E-選滯蛋白結合及/或生物活性之能力。在整個所評估之分析中，對於人類及石蟹獼猴E-選滯蛋白之結合親和力類似，與其相比而言，對於來自小鼠、兔或大鼠之E-選滯蛋白不存在強效結合。活體外功能分析中，抗體1444以劑量依賴性方式中和人類前髓細胞對於可溶性重組人類E-選滯蛋白蛋白質及細胞表現之重組人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白的細胞黏著。另外，抗體1444以在低nM範圍內之經估計50%抑制濃度(IC₅₀ )值，中和經純化之嗜中性白血球對於人類及石蟹獼猴細胞E-選滯蛋白兩者的黏著。30 mg/kg之皮下劑量與353 μg/mL之總最大觀測濃度(C_最大值 )及92,500 μg•h /mL之時間0至336小時之濃度-時間曲線下面積(AUC₃₃₆ )相關；而100 mg/kg之靜脈內劑量與693 μg/mL之總C_最大值及108,000 μg•h /mL之AUC₃₃₆ 相關。每週一次持續1個月以至多200 mg/kg/週之劑量向雄性及雌性石蟹獼猴靜脈內投與抗體1444，且耐受良好。活體外人類補體組分1q (C1q)及片段可結晶γ Fc受體(FcγR)結合分析及組織交叉反應性評估未產生安全問題。實例 33 ： 動物之藥物動力學及產物代謝

在靜脈內及/或皮下給藥抗體1444之後，評估石蟹獼猴中之單次劑量PK及重複劑量TK。在石蟹獼猴中單次靜脈內給藥後，觀測到劑量依賴性清除(CL)且與飽和目標介導之藥物處置(TMDD)一致。在以0.3至10 mg/kg之劑量範圍單次靜脈內給藥後，抗體1444展現分別大約0.39至0.15 mL/h/kg及22至36 mL/kg之平均CL及平均VSS。在以1 mg/kg或3 mg/kg單次皮下給藥抗體1444之後，在72及96小時時分別觀測到T_最大值，且皮下生物可用性為＞50%。以3 mg/kg用於靜脈內之抗體1444之經估計T₁ _/ ₂ 為大約12天。

在1個月GLP重複劑量毒性研究中，重複皮下及靜脈內給藥後全身性暴露量無明顯性別相關差異(如藉由最大觀測濃度[C_最大值 ]、濃度-時間曲線下面積[AUC]評估)。全身性暴露量隨著劑量(皮下)增加而增加且在重複皮下及靜脈內給藥後較高。每週一次持續1個月(5個總劑量)以15或50 mg/kg/週(皮下)或200 mg/kg/週(靜脈內)之劑量向雄性及雌性石蟹獼猴投與抗體1444。在每週一次以15及50 mg/kg/週重複給藥之後，在第1天及第22天之給藥後，平均T_最大值在72與112小時之間。全身性暴露量在重複給藥後較高，其中對於15 (皮下)、50 (皮下)及200 (靜脈內) mg/kg/週，平均蓄積率分別為5.5、3.2及1.9 (AUC₁₆₈ ，第22天/第1天)。

所預測的在人類中有效之劑量為單次皮下投與150 mg之抗體1444。在150 mg皮下給藥時所預測之最小有效濃度及暴露量分別為14 µg/mL之平均濃度(C_av [1至168小時])及2400 µg٠h/mL之AUC₁₆₈ 。實例 34 ： 動物中之 E - 選滯蛋白含量、聚集體及 ICAM - 1 表現

藉由液相層析-質譜分析(LC-MS)，按照0.3至10 mg/kg範圍之抗體1444劑量對石蟹獼猴之血清中可溶性E-選滯蛋白進行表徵。抗體1444顯示呈濃度依賴性方式之E-選滯蛋白的有效結合，且在所有劑量組中觀測到對可溶性E-選滯蛋白之＞90%抑制作用，指示抗體1444之活體內E-選滯蛋白結合活性。

在用抗體1444給藥之後，將血液自石蟹獼猴收集且使用螢光活化細胞分選(FACS)分析以偵測細胞聚集體及黏著標記物。檢驗單核球血小板聚集體及嗜中性白血球-血小板聚集體。在此FACS分析中，CD14用於使用大小掃描區別單核球及嗜中性白血球，且CD41用於偵測單核球-血小板聚集體及嗜中性白血球-血小板聚集體。抗體1444顯示在處理之後減少石蟹獼猴中單核球-血小板及嗜中性白血球-血小板聚集體之作用。

使用FACS分析，在抗體1444給藥之後，檢驗石蟹獼猴之白血球中的白血球細胞間黏著分子1 (ICAM-1)表現。給藥後觀測到ICAM-1之減少。

圖 1 描繪與經截斷人類E-選滯蛋白共結晶之抗E-選滯蛋白抗體0164之Fab的例示性晶體結構。E-選滯蛋白示為灰色表面(右側之分子)。0164 Fab(左側之分子)示為VL呈淺灰色且VH呈深灰色之帶狀物。

圖 2 描繪來自對於最佳化抗E-選滯蛋白抗體0841在時間0(T0)及在40℃下儲存於Tris緩衝液(TrisT4)、組胺酸緩衝液(HisT4)或麩胺酸(Glu4)緩衝液中4週後之三部分質譜分析的例示性資料。

圖 3 描繪在強制降解後對於抗體841(亦稱為0841)之例示性競爭ELISA分析。在時間0(0wk)及在40℃下在Tris、His或Glu緩衝液中培育2週(2wk)或4週(4wk)後分析抗體841。

圖 4 描繪人類化抗體0841之VH及VL區的預測非生殖系T細胞抗原決定基。藉由Epivax/ISPRI或IEDB預測之涵蓋未發現於人類生殖系中之T細胞抗原決定基的胺基酸殘基係加下劃線的。

圖 5 描繪對於唾液酸路易斯A配位體黏著於表現人類E-選滯蛋白之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的例示性中和。所測試抗體包括抗E-選滯蛋白抗體164(亦稱為0164)、1282、1284、1444及1448以及IgG同型對照物。

圖 6 描繪對於唾液酸路易斯X配位體黏著於表現石蟹獼猴E-選滯蛋白之CHO細胞的例示性中和。所測試抗體包括抗E-選滯蛋白抗體164(亦稱為0164)、1282、1284、1444、1448及IgG同型對照物。

圖 7 描繪藉由抗體1282、1284、1444、1448及164(亦稱為0164)，對於HL-60細胞黏著於表現人類E-選滯蛋白之CHO細胞的例示性中和。

圖 8 描繪來自對於最佳化抗E-選滯蛋白抗體1444在時間0(頂部圖)及在40℃下儲存於Tris、His或Glu緩衝液中4週後之三部分質譜分析的例示性資料。

圖 9A - 9D 描繪在強制降解後對於抗體1282(圖9A)、1284(圖9B)、1444(圖9C)及1448(圖9D)之例示性競爭ELISA分析。在時間1(T0)及在40℃下在Tris、His或Glu緩衝液中培育2週(T2)或4週T(4)後分析抗體。

圖 10A - 10D 描繪對於最佳化抗E-選滯蛋白抗體樣本中之高濃度樣本的aSEC分析。在時間0(0)及在4℃或25℃下儲存於Tris/Suc、His/Suc或Glu/Tre緩衝液中1、2、4、6及7週後分析濃度為150 mg/mL之抗體。對高分子質量物種之百分比(% HMMS)進行定量。圖10A描繪抗體1282之結果；圖10B描繪抗體1284之結果；圖10C描繪抗體1444之結果；圖10D描繪抗體1448之結果。

圖 11 描繪最佳化抗E-選滯蛋白抗體之例示性黏度曲線。最佳化抗體1282、1284、1444及1448之黏度係使用基於DLS珠粒之方法來量測。針對使用Anton Paar錐體及平板法之各者，提供額外單一資料點。

圖 12 描繪對於最佳化抗體1444結合於人類E-選滯蛋白(rhE-選滯蛋白)、同源物P-選滯蛋白及L-選滯蛋白，以及兔、大鼠、小鼠(muE-選滯蛋白)及石蟹獼猴(rcyE-選滯蛋白)之物種同源物的例示性SPR分析。

圖 13 描繪抗E-選滯蛋白抗體(0841、1282、1284、1444及1448)與固定化人類L-選滯蛋白及人類P-選滯蛋白之例示性結合。抗L-選滯蛋白對照抗體及抗P-選滯蛋白對照抗體分別結合人類L-選滯蛋白及人類P-選滯蛋白。

圖 14 描繪在生理流動下對於SCD患者細胞(供體11253及供體22358)與重組E-選滯蛋白之黏著的例示性中和。

Claims

一種特異性結合於人類E-選滯蛋白之經分離抗體，其包含以下中之至少一者：(a)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LCDR-1)、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的LCDR-2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的LCDR-3、包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HCDR-1)、包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的HCDR-2及包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的HCDR-3；(b)如SEQ ID NO：11之胺基酸序列中所示之該等HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3胺基酸序列，及如SEQ ID NO：5之胺基酸序列中所示之該等LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3胺基酸序列；(c)重鏈可變域(VH)，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；及輕鏈可變域(VL)，其包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列；(d)VH，其包含如由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126529之該質體之插入物編碼的胺基酸序列中所示之胺基酸序列，及VL，其包含如由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126530之該質體之插入物編碼的胺基酸序列中所示之胺基酸序列；(e)重鏈(HC)，其包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13之胺基酸序列；及輕鏈(LC)，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列；及(f)HC，其包含如由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126529之該質體之插入物編碼的胺基酸序列中所示之胺基酸序列，及LC，其包含如由寄存於ATCC處且具有ATCC寄存編號PTA-126530之該質體之插入物編碼的胺基酸序列中所示之胺基酸序列。
如請求項1之經分離抗體，其包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)，該VH包含與SEQ ID NO：11之序列至少99%一致之胺基酸序列，以及該VL包含與SEQ ID NO：5之序列至少99%一致之胺基酸序列。
如請求項1之經分離抗體，其包含重鏈(HC)及輕鏈(LC)，該HC包含與SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13之序列至少99%一致之胺基酸序列，以及該LC包含與SEQ ID NO：1之序列至少99%一致之胺基酸序列。
一種特異性結合於人類E-選滯蛋白之經分離抗體，其包含：包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之LCDR-1、LCDR-2及LCDR-3的VL胺基酸序列；及包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HCDR-1、HCDR-2及HCDR-3的VH胺基酸序列。
如請求項4之經分離抗體，其包含：包含SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16之胺基酸序列的抗體重鏈恆定區(CH)及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的抗體輕鏈恆定區(CL)。
一種特異性結合於人類E-選滯蛋白之經分離抗體，其包含LC及HC，該LC包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，以及該HC包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
一種特異性結合人類E-選滯蛋白之經分離抗體，其包含抗體VL區及抗體VH區，其中該抗體VL區包含與SEQ ID NO：5至少99%一致之胺基酸序列，且包含由SEQ ID NO：2之胺基酸序列組成之LCDR-1、由SEQ ID NO：3之胺基酸序列組成之LCDR-2及由SEQ ID NO：4之胺基酸序列組成之LCDR-3；以及其中該抗體VH區包含與SEQ ID NO：11至少99%一致之胺基酸序列，且包含由SEQ ID NO：8之胺基酸序列組成之HCDR-1、由SEQ ID NO：9之胺基酸序列組成之HCDR-2及由SEQ ID NO：10之胺基酸序列組成之HCDR-3。
一種特異性結合於人類E-選滯蛋白之經分離抗體，其包含：抗體HC，其包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之該插入物編碼的胺基酸序列，及抗體LC，其包含以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之該插入物編碼的胺基酸序列。
如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其包含選自由以下組成之群的人類Fc域：IgA₁、IgA₂、IgD、IgE、IgM、IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄之Fc域；選自κ或λ之輕鏈恆定區；及其組合。
如請求項1至8中任一項之經分離抗體，i)其中抗體重鏈同型為IgG1、ii)其中該輕鏈恆定區為κ輕鏈、或iii)i)及ii)兩者。
如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體為人類化抗體、人類抗體、鼠類抗體、嵌合抗體或駱駝抗體。
如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體或其抗原結合片段以約或小於選自由以下組成之群之值的K_D結合人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白：200nM、175nM、150nM、125nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、2nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM及500pM。
如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其中該抗體以約200nM至約2nM之K_D結合人類或石蟹獼猴E-選滯蛋白。
如請求項1至8中任一項之經分離抗體，其特異性結合人類E-選滯蛋白且展現至少一個選自以下之可偵測特徵：(i)如藉由SPR所量測，以200nM或更小之K_D結合於人類E-選滯蛋白；(ii)如藉由SPR所量測，以200nM或更小之K_D結合於石蟹獼猴E-選滯蛋白；(iii)如藉由FAC所量測，以50nM或更小之EC₅₀結合於細胞表面表現之E-選滯蛋白；(iv)如藉由ELISA所量測，以2nM或更小之EC₅₀結合於可溶性人類E-選滯蛋白；(v)如藉由AlphaLisa競爭分析所量測，以2nM或更小之EC₅₀中和唾液酸化-路易斯A配位體(sialyl-Lewis A ligand)與可溶性人類E-選滯蛋白之結合；(vi)以約1nM至約3nM之IC₅₀結合於人類血清中之游離可溶性人類E-選滯蛋白；(vii)如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，以100nM或更小之IC₅₀中和唾液酸化-路易斯A配位體(sialyl-Lewis A ligand)與可溶性人類E-選滯蛋白之結合；(viii)如在靜態條件下藉由競爭ELISA所量測，以50nM或更小之IC₅₀中和唾液酸化-路易斯A配位體與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的結合；(ix)如在靜態條件下所量測，以100nM或更小之IC₅₀抑制表現E-選滯蛋白配位體之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著；(x)如在生理流動條件下所量測，以100nM或更小之IC₅₀抑制表現E-選滯蛋白配位體之細胞與細胞表面表現之人類E-選滯蛋白的黏著；(xi)如在生理流動條件下所量測，以約6.17nM至約18.66nM之IC₅₀抑制來自SCD患者之血球與可溶性人類E-選滯蛋白的黏著；(xii)結合於至少一個選自以下的人類E-選滯蛋白之胺基酸殘基：T7、E8、A9、M10、T11、P46、S47、Y48、N82、N83、Q85、E88、E92、Y94、R97、N105、E107、R108、S110、K111、K112及K113；(xiii)在以10mg/kg之劑量進行靜脈內(IV)投與之後具有約14.4天(345小時)之平均半衰期；(xiv)在以約3mg/kg之劑量進行皮下(SC)投與之後具有約21.5天(518小時)之平均半衰期；(xv)當在25℃下藉由Anton Parr方法量測時，在185.7mg/mL下具有33.4cP之黏度；(xvi)展現商業上適合之調配特性，包括高度熱穩定性及高濃度下之極少聚集；及(xix)展現大規模製造條件下可再現之表現及純度。
如請求項14之經分離抗體，其中該E-選滯蛋白配位體係選自由下列組成之群：E選滯蛋白配位體、PSGL-1、其他唾液酸路易斯配位體及其組合。
一種經分離核酸分子，其編碼如請求項1至15中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種經分離核酸分子，其包含以下中之至少一者：a)編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體之VH、VL或兩者之核酸，其中該核酸包含：i)SEQ ID NO：136之核酸序列、ii)SEQ ID NO：137之核酸序列、或iii)i)及ii)兩者；b)編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體之HC、LC或兩者之核酸，其中該核酸包含：i)SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：206之核酸序列、ii)SEQ ID NO：139之核酸序列、或iii)i)及ii)兩者；及c)編碼特異性結合人類E-選滯蛋白之抗體之VH、VL或兩者之核酸，其中該核酸包含：以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126529之該質體之插入物的核酸序列，以ATCC寄存且具有寄存編號PTA-126530之該質體之插入物的核酸序列，或兩者。
一種載體，其包含如請求項16或17之核酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項18之載體。
如請求項19之宿主細胞，其中該宿主細胞為選自由以下組成之群的哺乳動物細胞：CHO細胞、COS細胞、HEK-293細胞、NS0細胞、PER.C6細胞或Sp2.0細胞。
一種製造抗體之方法，其包含在其中該抗體或其抗原結合片段由如請求項19或20之宿主細胞表現之條件下，培養該宿主細胞。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
如請求項22之醫藥組合物，其包含：i)包含抗體重鏈及抗體輕鏈之抗體，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，ii)包含抗體重鏈及抗體輕鏈之抗體，該抗體重鏈包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列且該抗體輕鏈包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或iii)i)及ii)兩者。
一種如請求項1至15中任一項之特異性結合於人類E-選滯蛋白之經分離抗體用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於治療由下列介導或與其相關之醫學病狀、疾病或病症：i)E-選滯蛋白之表現、ii)E-選滯蛋白與配位體之結合、或iii)i)及ii)兩者。
如請求項24之用途，其中該醫學病狀、疾病或病症為下列之一或多者：SCD、皮膚病、發炎疾病及糖尿病併發症。
如請求項25之用途，其中該皮膚病為牛皮癬，以及該發炎疾病為類風濕性關節炎。
一種如請求項1至15中任一項之特異性結合於人類E-選滯蛋白之經分離抗體用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於針對個體之SCD之至少一種病徵或症狀治療、預防及改善之一或多者，該個體之SCD之至少一種病徵或症狀選自由影響以下系統之彼等病徵及/或症狀組成之群：心胸系統、神經系統、網狀內皮系統、肌骨胳系統、泌尿生殖系統及腸胃系統。
如請求項27之用途，其中影響心胸系統之該SCD之病徵或症狀係選自由以下組成之群：慢性限制性肺病、左心室舒張性疾病、肺高血壓、急性胸部症候群、心律不整、猝死、血管閉塞性危象(VOC)、及其組合。
如請求項27之用途，其中影響神經系統之該SCD之病徵或症狀係選自由以下組成之群：出血性中風、靜脈竇栓塞、腦之無症狀腦梗塞、慢性疼痛、腦之急性缺血性中風、增生性視網膜病變、眼眶梗塞、認知障礙、及其組合。
如請求項27之用途，其中影響網狀內皮系統之該SCD之病徵或症狀係選自由以下組成之群：脾臟離症(splenic sequestration)、功能性低脾功能症、貧血、溶血、及其組合。
如請求項27之用途，其中影響肌骨胳系統該SCD之病徵或症狀係：i)缺血性壞死、ii)皮膚潰瘍、或iii)i)及ii)兩者。
如請求項27之用途，其中影響泌尿生殖系統之該SCD之病徵或症狀係選自由以下組成之群：乳頭狀壞死、蛋白尿、腎衰竭、血尿、夜間遺尿、恆久勃起、及其組合。
如請求項27之用途，其中影響腸胃系統之該SCD之病徵或症狀係選自由以下組成之群：膽石症、膽管病、肝病、腸系膜血管閉塞、及其組合。
如請求項27之用途，其中VOC之治療包括i)藉由減少急性VOC之持續時間、強度或二者而治療該VOC，ii)預防或減少VOC之發生，或iii)i)及ii)兩者。
一種如請求項1至15中任一項之特異性結合於人類E-選滯蛋白之經分離抗體用於製備醫藥品之用途，其中該醫藥品係用於降低個體中之E-選滯蛋白生物活性。
如請求項35之用途，其中該抗體降低至少一種可偵測E-選滯蛋白生物活性，其中所降低之活性係選自由以下組成之群：(a)白血球與內皮細胞之繫栓；(b)穩定黏著於內皮細胞之活化；(c)白血球緩慢滾動停滯；(d)白血球之有效跨內皮遷移；(e)E-選滯蛋白與CD18整合素之親和力及親合力；(f)運輸白血球至急性發炎部位；(g)胞溶質鈣；(h)使p38 MAP激酶及Syk激酶活化之酪胺酸磷酸化；(i)自血液募集血小板及白血球至血管內皮；及(j)產生促發炎環境。
如請求項24至36中任一項之用途，其中該醫藥品係用於與至少一種額外治療活性化合物或治療方法併用，該額外化合物及治療方法在治療及/或預防SCD之至少一種病徵或症狀有效。
如請求項37之用途，其中該至少一種額外治療活性化合物係選自由以下組成之群：青黴素預防劑、羥基尿素(DROXIA、HYDREA)、L-麩醯胺酸(ENDARI)、立贊利珠單抗(crizanlizumab)(ADAKVEO)、沃西洛特(voxelotor)(OXBRYTA)、阿派沙班(apixaban)(ELIQUIS)、利伐沙班(rivaroxaban)(XARELTO)、非類固醇消炎藥、鎮痛劑、IW-1701、瑞司瓜特(riociguat)(ADEMPAS)、替卡格雷(ticagrelor)(BRILINTA)、美金剛胺(memantine)(NAMENDA)及其組合。
如請求項38之用途，其中該鎮痛劑為類鴉片鎮痛劑。
如請求項38之用途，其中該至少一種額外治療活性化合物係選自由以下組成之群：抗P-選滯蛋白抗體；調節HbS以使其維持在其R狀態(亦即含氧)之化合物；調節HbS之氧親和力的化合物；藉由調節2,3-二磷酸甘油酸之生成而靶向HbS聚合的化合物；藉由誘發胎兒血紅蛋白(HbF)之表現而靶向HbS聚合的化合物；靶向功能障礙性細胞黏著、血管功能障礙及/或發炎之化合物；與投與化合物之前的氧化氮(NO)之含量相比，增加血液中NO之含量的該化合物；靜脈內IG；靶向高血液凝固性之化合物；阻斷NMDA受體結合之化合物；及其組合。
如請求項40之用途，其中調節HbS以使其維持在其R狀態(亦即含氧)之該化合物係選自由以下組成之群：6-{(1S)-1-[(2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基]乙基}-5-(1H-吡唑-1-基)吡啶-2-醇、(S)-6-(1-((2-胺基-6-氟喹啉-3-基)氧基)乙基)-5-(1H-吡唑-1-基)吡啶-2(1H)-酮及其組合。
如請求項37之用途，其中該至少一種額外治療活性治療方法係選自由以下組成之群：補充氧；輸血；骨髓移植；基因療法；藉由CRISPR或鋅指技術之基因編輯療法；及其組合。
如請求項42之用途，其中該輸血為伴有鐵螯合之輸血。
如請求項37之用途，其中在治療及/或預防SCD之至少一種病徵或症狀有效之該至少一種額外治療活性化合物或治療方法之投與係與該醫藥品之投與同時、依次或分開進行，該至少一種額外治療活性化合物或治療方法可在治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面有效。
一種用於治療SCD之套組，其包含治療有效量之如請求項1至15中任一項之抗E-選滯蛋白抗體。
如請求項45之套組，其進一步包含協同治療有效量之至少一種可在治療及/或預防SCD之至少一種病徵及/或症狀方面有效的額外治療活性化合物或治療方法。