TWI840442B - 對抗檢查點分子之多特異性結合構築體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於藉由減少免疫檢查點抑制來抑制腫瘤逃避之組合物及方法。於一些實施例中，本文中提供組合物，該等組合物阻斷PD-1與其配位體(例如，PD-1及/或PD-L2)之間之相互作用，同時促進PD-1及其配位體在其上表現之細胞的相互作用。本發明亦提供使用此等組合物之方法。

Description

對抗檢查點分子之多特異性結合構築體及其用途
癌症為美國及全世界導致死亡之主要原因之一。雖然在20世紀期間常見治療(諸如手術、放射、化療、激素療法、靶向療法及免疫療法)已降低癌症相關之死亡之比率，但是截至2012年全世界診斷出有14.1百萬例新癌症病例且8.2百萬例癌症死亡。即使在20世紀期間總體癌症生存率提高，但是癌症仍是全世界七分之一死亡之原因。參見美國癌症協會，全球癌症事實與數據(American Cancer Society, Global Cancer Facts & Figures)第3版，Atlanta: American Cancer Society; 2015。
近幾年，越來越多證據表明免疫系統作為腫瘤形成及進展之重要屏障運作。具有抗腫瘤潛力或活性之天然產生之T細胞存在於患有癌症之患者中的原理已將腫瘤學中之免疫治療方法之開發合理化。免疫細胞(諸如T細胞、巨噬細胞及自然殺手細胞)可展示抗腫瘤活性及有效控制惡性腫瘤之出現及生長。腫瘤特異性或腫瘤相關抗原可誘導免疫細胞識別並消除惡性腫瘤(Chen & Mellman, (2013)Immunity 39(1):1-10)。儘管存在腫瘤特異性免疫反應，但是惡性腫瘤經常通過各種免疫調節機制逃避或避免免疫攻擊，從而導致控制腫瘤出現及進展失敗(Motz & Coukos, (2013)Immunity 39(1):61-730)。的確，癌症之新興標誌為開發此等免疫調節機制及使抗腫瘤免疫反應無能，其導致腫瘤逃避及逃脫免疫殺死(Hanahan及 Weinberg (2011)Cell 144(5):646-674)。
癌症之免疫療法之新穎方法涉及對抗此等免疫逃避及逃脫機制及誘導內源免疫系統以排斥腫瘤。然而，仍需要有效對抗免疫逃避之新穎治療劑，特定言之癌症治療劑。
本發明係部分基於靶向PD-1及PD-L1二者之新穎多特異性及多價構築體，諸如雙特異性及四價構築體。如本文中所證實，此等多特異性構築體與個別抗體之組合相比，以及與臨床檢查點阻斷劑相比，具有改良之活體外及活體內效能。本文中亦提供用於此等多特異性及多價構築體之新穎單株抗PD-1抗體及其抗原結合片段，及新穎單株抗PD-L1抗體及其抗原結合片段。此等新穎單株抗PD-1抗體及新穎單株抗PD-L1抗體中之一些共用共同輕鏈，從而允許產生具有驚人的優異類藥物性質(DLP)及易於製造，以及類似於其親本抗體之親和力之多特異性及多價構築體。本發明亦部分基於以下發現：阻斷藉由免疫細胞表現之PD-1與在第二細胞上表現之其配位體(例如，PD-L1或PD-L2)之間之相互作用，同時橋接該免疫細胞與該第二細胞(例如，另一免疫細胞或表現PD-1配位體之腫瘤細胞)強烈增強例如T細胞增殖、IFNγ產生及分泌、及T細胞之溶細胞活性。因此，本文中提供阻斷PD-1與其配位體之間之相互作用同時促進PD-1及其配位體(PD-L1或PD-L2)在其上表現之細胞之相互作用(橋接)的組合物。如本文中所例示，具有「阻斷及橋接」能力之本發明之此等組合物與例如具有化學計量量之單獨結合受體及配位體之藥劑之混合物或結合受體或配位體之單藥劑相比提供優越抗腫瘤功效(如例如藉由IFNγ產生及分泌及活體內活性所量測)。亦發現本文中所述之靶向PD-1及PD-L1二者之多特異性及多價構築體以價依賴方式引起細胞表面上之PD-1之表現之損失。當以化學計量當量使用親本抗體之組合時，未觀察到此PD-1表現之損失。因此，本文中所述之靶向PD-1及PD-L1二者之多特異性及多價構築體提供用於治療癌症之具有增加之效能及功效的新穎免疫治療劑。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者結合至至少兩個不同受體或抗原決定基(例如，PD-1及PD-L1)，其中藉由多特異性抗原結合構築體結合之該等兩個不同受體或抗原決定基在相同細胞之表面上表現。例如，於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體同時結合至PD-1及PD-L1，其中該PD-1及PD-L1在相同細胞之表面上表現。於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者結合至至少兩個不同受體或抗原決定基(例如，PD-1及PD-L1)，其中藉由多特異性抗原結合構築體結合之該等兩個不同受體或抗原決定基在兩個不同細胞之表面上表現。例如，於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體同時結合至在第一細胞之表面上表現之PD-1及在第二細胞之表面上表現之PD-1配位體，例如，PD-L1或PD-L2。
於一些實施例中，本發明提供包含至少兩個抗原結合臂之多特異性抗原結合構築體，其中第一臂結合藉由免疫細胞表現之PD-1，及第二臂結合藉由第二細胞表現之PD-1配位體，其中該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體之相互作用。於一些實施例中，該PD-1配位體為PD-L2。於一些實施例中，該PD-1配位體為PD-L1。於一些實施例中，該免疫細胞為T細胞。於一些實施例中，該T細胞為CD8+ T細胞。於一些實施例中，該免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。於一些實施例中，該免疫細胞為巨噬細胞。於一些實施例中，該第二細胞為第二免疫細胞。於一些實施例中，該第二免疫細胞為T細胞、B細胞、巨噬細胞、源自骨髓之抑制細胞、樹突狀細胞、或間質基質細胞中之任一者或多者。於一些實施例中，該第二免疫細胞為調節性T細胞。於一些實施例中，該第二細胞為腫瘤細胞。於一些實施例中，該腫瘤細胞係選自由以下組成之群：血癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、神經癌、黑色素瘤、乳癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、胰癌、泌尿生殖器癌、骨癌、腎癌及血管癌。於一些實施例中，兩個臂具有至少1 x 10-7 M、至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9 M或至少1 x 10-10 M之KD 。於一些實施例中，一個臂與其靶之結合不阻斷另一臂與其靶之結合。於一些實施例中，該第一臂及第二臂結合至其各自靶且兩個臂保持同時結合。於一些實施例中，該第一臂及該第二臂與其各自靶之結合可將免疫細胞與第二細胞橋接在一起。於一些實施例中，該免疫細胞與該第二細胞之橋接係藉由流動式細胞測量術測定。於一些實施例中，該第一臂為PD-1之拮抗劑。
於多特異性抗原結合構築體之一些實施例中，該第一臂結合至PD-1且包含：(a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 70 (FTFX1 X2 YAX3 X4 ，其中X1 =S、R、G或N；X2 =D、S、N、A、R或G；X3 = M或L；X4 = S、L或N)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 72 (ARGLDFIVGX5 TGNDY，其中X5 =A、Y或R)之CDRH3；及(b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 76 (FTFSSYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 77 (FTFSSYAML)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 78 (FTFSNYALS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 79 (FTFSAYAMN)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 81 (FTFGRYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 82 (FTFNSYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 83 (FTFSNYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 84 (FTFSGYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 86 (FTFSSYAMN)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)。於一些實施例中，該第一臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)，該第一臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及該第一臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)。
於一些實施例中，該第一臂之該CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第一臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)及該第一臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 87至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 88至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 89至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 90至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 91至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 92至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 93至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 94至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 95至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 96至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 97至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 98至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 99至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第一臂之該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 59至少90%相同之胺基酸序列。
於一些實施例中，該第二臂為PD-1配位體之拮抗劑。於一些實施例中，該第二臂為PD-L2之拮抗劑。於一些實施例中，該第二臂為PD-L1之拮抗劑。於一些實施例中，該第二臂結合至PD-L1且包含：a.重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 2 (GGIIPX1 X2 GX3 ATYA，其中X1 為V或I；X2 為F、L或V；且X3 為T或A)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 3 (ARLKX1 ELKDAFDI，其中X1 為G、F或N)之CDRH3；及b.輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 4 (RASQX1 ISSYLN，其中X1 為S、W或Q)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 6 (X1 QSYSTPLT，其中X1 為Q或F)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 12 (RASQWISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 13 (RASQQISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 33 (GGIIPIVATANYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 33 (GGIIPIVATANYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 34 (GGIIPIFGKATYA)，及該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)。於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 34 (GGIIPIFGKATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)，該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 38 (FQSYSTPLT)。
於一些實施例中，該第二臂之該CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，該第二臂之CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，該第二臂之CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；該第二臂之CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，該第二臂之CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及該第二臂之CDRL3包含SEQ ID NO: 39 (QQSYSTILT)。
於一些實施例中，該第二臂包含：a.重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 14 (GTFSSYAFS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2及(iii)包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；及b.輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(i)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 24 (GGIIPIVGIANYA)之CDRH2，及(iii)包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3。於一些實施例中，該第二臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(i)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及(iii)包含SEQ ID NO: 25 (ARLKGEFKDAFDI)之CDRH3。於一些實施例中，該第二臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(i)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 26 (GRIIPLFGTAHYA)之CDRH2，及(iii)包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3。於一些實施例中，該第二臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(i)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 27 (GRINPILGTANYA)之CDRH2，及(iii)包含SEQ ID NO: 28 (ARLKGELKDAFSI)之CDRH3。於一些實施例中，該第二臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(i)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及(iii)包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)之CDRH3。於一些實施例中，該第二臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(i)包含SEQ ID NO: 122 (GTKSSYAIS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及(iii)包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)之CDRH3。於一些實施例中，該第二臂進一步包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該第二臂包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含(i)包含SEQ ID NO: 36 (GPFRSHAVS)之CDRH1，(ii)包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及(iii)包含SEQ ID NO: 37 (ARLKSELKDAFDI)之CDRH3。於一些實施例中，該第二臂包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些實施例中，該結合PD-L1之第二臂包含包含與SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58中之任一者至少90%相同之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63中之任一者至少90%相同之胺基酸序列的輕鏈可變區。
於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 35 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTMVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 40 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAFSWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 41 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 42 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPNFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKGAGDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 43 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKFELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 44 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDEWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 45 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTAST)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 46 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKNELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 47 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGVIPFLGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGILKDALDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 48 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQDLEWMGGIIPIVGIANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 49 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGEFKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 50 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPLFGTAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 51 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRINPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFSIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 52 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGRIIPIFGTADYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 53 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGKFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKCAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 54 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 55 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGAATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 56 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVATANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 57 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 58 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSHAVSWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKSELKDAFDIWGQGTLVTVSS)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 59 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 60 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 61 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQQISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 62 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQSYSTPLTFGGGTKVEIK)至少90%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該第二臂之該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 63 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTILTFGGGTKVEIK)至少90%相同之胺基酸序列。
於本文中所述態樣中之任一者之一些實施例中，該構築體為雙特異性抗體。於一些實施例中，該雙特異性抗體為PD-1及PD-1配位體二者之拮抗劑。於一些實施例中，該構築體包含共同輕鏈。於一些實施例中，該等臂中之一者或二者為適體。於一些實施例中，該等臂中之一者或二者為除了抗體外之蛋白質。於一些實施例中，該構築體包含至少兩個雙特異性抗體。於一些實施例中，該等至少兩個雙特異性抗體中之一者對PD-1係單價。於一些實施例中，該等至少兩個雙特異性抗體中之一者對PD-1配位體係單價。於一些實施例中，該等臂中之至少一者為特異性針對PD-1之二價抗體。於一些實施例中，該等臂中之至少一者為特異性針對PD-L1之二價抗體。於一些實施例中，該等臂中之至少一者為特異性針對PD-1之二價抗體，且該等臂中之至少一者為特異性針對PD-L1之二價抗體。於一些實施例中，該等臂中之至少一者對PD-1係二價。於一些實施例中，該等臂中之至少一者對PD-L1係二價。於一些實施例中，該等臂中之至少一者對PD-1係二價，且該等臂中之至少一者對PD-L1係二價。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合PD-1上之兩個不同抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合PD-1配位體上之兩個不同抗原決定基。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者包含至少兩個單特異性抗體。於一些實施例中，該等單特異性抗體中之至少一者為抗PD-1抗體。於一些實施例中，該抗PD-1抗體為二價抗PD-1抗體。於一些實施例中，該等單特異性抗體中之至少一者為抗PD-L1抗體。於一些實施例中，該抗PD-1抗體為二價抗PD-L1抗體。於一些實施例中，該構築體包含二價抗PD-1抗體及二價抗PD-L1抗體。於一些實施例中，該構築體為融合構築體，其中包含抗PD-1抗體之可變重鏈之多肽融合至包含抗PD-L1抗體之可變重鏈之多肽。於一些實施例中，該包含抗PD-1抗體之可變重鏈之多肽藉助連接子融合至包含抗PD-L1抗體之可變重鏈之多肽。於一些實施例中，該融合構築體包含共同輕鏈。於一些實施例中，在共同輕鏈之存在下該融合構築體之N-端可變重鏈結合至PD-1，及在共同輕鏈之存在下該融合構築體之C-端可變重鏈結合至PD-L1。於一些實施例中，在共同輕鏈之存在下該融合構築體之N-端可變重鏈結合至PD-L1，及在共同輕鏈之存在下該融合構築體之C-端可變重鏈結合至PD-1。
於一些態樣及實施例中，本發明提供包含至少兩個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中第一抗原結合單元結合PD-1，及第二抗原結合單元結合PD-1配位體。於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合藉由免疫細胞表現之PD-1。於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合藉由第二細胞表現之PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之相互作用。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之相互作用。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少兩個結合PD-1之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含兩個結合PD-1之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少兩個結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含兩個結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少四個抗原結合單元，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含四個抗原結合單元，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)。於一些實施例中，各抗原結合單元能獨立地結合至其同源抗原，即，PD-1或PD-1配位體，諸如PD-L1或PD-L2。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體促進來自細胞之PD-1表現之損失。於一些實施例中，該PD-1表現之損失係由於PD-1脫落。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之相互作用。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含共同輕鏈。例如，至少兩個抗原結合單元包含共同輕鏈。
於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含： (a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 70 (FTFX1 X2 YAX3 X4 ，其中X1 =S、R、G或N；X2 =D、S、N、A、R或G；X3 = M或L；X4 = S、L或N)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 72 (ARGLDFIVGX5 TGNDY，其中X5 =A、Y或R)之CDRH3；及 (b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些此等實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含： (a)包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)之CDRH3； (b)包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (c)包含SEQ ID NO: 76 (FTFSSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (d)包含SEQ ID NO: 77 (FTFSSYAML)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (e)包含SEQ ID NO: 78 (FTFSNYALS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (f)包含SEQ ID NO: 79 (FTFSAYAMN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (g)包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (h)包含SEQ ID NO: 81 (FTFGRYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (i)包含SEQ ID NO: 82 (FTFNSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (j)包含SEQ ID NO: 83 (FTFSNYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)之CDRH3； (k)包含SEQ ID NO: 84 (FTFSGYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)之CDRH3； (l)包含SEQ ID NO: 86 (FTFSSYAMN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2及包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)之CDRH3；或 (m)包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)，及包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)之CDRH3。
於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含： (a)包含與SEQ ID NO: 87至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (b)包含與SEQ ID NO: 88至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (c)包含與SEQ ID NO: 89至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (d)包含與SEQ ID NO: 90至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (e)包含與SEQ ID NO: 91至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (f)包含與SEQ ID NO: 92至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (g)包含與SEQ ID NO: 93至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (h)包含與SEQ ID NO: 94至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (i)包含與SEQ ID NO: 95至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (j)包含與SEQ ID NO: 96至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (k)包含與SEQ ID NO: 97至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (l)包含與SEQ ID NO: 98至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區；或 (m)包含與SEQ ID NO: 99至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區。
於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含包含與SEQ ID NO: 59至少90%相同之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L2。於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1。於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含： a.重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 2 (GGIIPX1 X2 GX3 ATYA，其中X1 為V或I；X2 為F、L或V；且X3 為T或A)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 3 (ARLKX1 ELKDAFDI，其中X1 為G、F或N)之CDRH3；及 b.輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 4 (RASQX1 ISSYLN，其中X1 為S、W或Q)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 6 (X1 QSYSTPLT，其中X1 為Q或F)之CDRL3。
於一些此等實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含： (a)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (b)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (c)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (d)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (e)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 12 (RASQWISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (f)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 13 (RASQQISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (g)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (h)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (i)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (j)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)之CDRH3； (k)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (l)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)之CDRH3； (m)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (n)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)之CDRH3； (o)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (p)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)之CDRH3； (q)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (r)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)之CDRH3； (s)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (t)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (u)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (v)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3； (w)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (x)包含SEQ ID NO: 1 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(GPFRSHAVS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 37 (ARLKSELKDAFDI)之CDRH3；或 (pp)包含SEQ ID NO: 36 (GPFRSHAVS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 37 (ARLKSELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些此等實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含包含與SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58中之任一者至少90%相同之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63中之任一者至少90%相同之胺基酸序列的輕鏈可變區。
於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含包含以下之重鏈可變區： (a)與SEQ ID NO: 35至少90%相同之胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO: 40至少90%相同之胺基酸序列； (c)與SEQ ID NO: 41至少90%相同之胺基酸序列； (d)與SEQ ID NO: 42至少90%相同之胺基酸序列； (e)與SEQ ID NO: 43至少90%相同之胺基酸序列； (f)與SEQ ID NO: 44至少90%相同之胺基酸序列； (g)與SEQ ID NO: 45至少90%相同之胺基酸序列； (h)與SEQ ID NO: 46至少90%相同之胺基酸序列； (i)與SEQ ID NO: 47至少90%相同之胺基酸序列； (j)與SEQ ID NO: 48至少90%相同之胺基酸序列； (k)與SEQ ID NO: 49至少90%相同之胺基酸序列； (l)與SEQ ID NO: 50至少90%相同之胺基酸序列； (m)與SEQ ID NO: 51至少90%相同之胺基酸序列； (n)與SEQ ID NO: 52至少90%相同之胺基酸序列； (o)與SEQ ID NO: 53至少90%相同之胺基酸序列； (p)與SEQ ID NO: 54至少90%相同之胺基酸序列； (q)與SEQ ID NO: 55至少90%相同之胺基酸序列； (r)與SEQ ID NO: 56至少90%相同之胺基酸序列； (s)與SEQ ID NO: 57至少90%相同之胺基酸序列；或 (t)與SEQ ID NO: 58至少90%相同之胺基酸序列。
於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含包含以下之輕鏈可變區： (a)與SEQ ID NO: 59至少90%相同之胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO: 60至少90%相同之胺基酸序列； (c)與SEQ ID NO: 61至少90%相同之胺基酸序列； (d)與SEQ ID NO: 62至少90%相同之胺基酸序列；或 (e)與SEQ ID NO: 63至少90%相同之胺基酸序列。
於一些態樣及實施例中，本文中亦提供包含四個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-L1，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 100或102之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列，及與SEQ ID NO: 101或103之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。
於一些態樣及實施例中，本文中亦提供包含四個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-L1，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。
於一些態樣及實施例中，本文中亦提供包含四個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-L1，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。
於一些實施例中，該構築體不包含Fc域。於一些實施例中，該第一臂或第二臂或二者包含包含一或多個免疫球蛋白Fc修飾之重鏈。於一些實施例中，該重鏈之免疫球蛋白Fc域包含促進該第一臂與該第二臂之異二聚之一或多個胺基酸突變。於一些實施例中，該突變係存在於該重鏈之CH3域。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體於四源雜交瘤細胞中產生。於一些實施例中，該構築體包含一或多個免疫球蛋白恆定區修飾。於一些實施例中，該免疫球蛋白恆定區包含促進抗體之異二聚之一或多個胺基酸突變。於一些實施例中，一或多個突變係存在於一個臂之輕鏈恆定區中及一或多個突變係存在於另一臂之重鏈恆定區中。於一些實施例中，該雙特異性抗體為選自由以下組成之群之形式：雙特異性IgG、雙特異性抗體片段、雙特異性融合蛋白、附加IgG及雙特異性抗體結合物。於一些實施例中，該Fc區具有減少之效應功能。於一些實施例中，該Fc區增強構築體之半衰期。
於一些實施例中，該構築體包含與SEQ ID NO: 100或102之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列。於一些實施例中，該構築體包含與SEQ ID NO: 101或103之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。於一些實施例中，該構築體包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。於一些實施例中，該構築體包含與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者係無糖基化。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合人類PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合鼠科PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合食蟹猴PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能以類似親和力結合人類、鼠科及食蟹猴PD-1。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者能降低細胞上之PD-1水平。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能誘導PD-1降解。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能減少PD-1表現。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能減少PD-1細胞表面表現。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能藉由誘導PD-1自細胞表面脫落來減少PD-1細胞表面表現。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合PD-1及PD-L1二者且降低細胞上之PD-1水平。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合PD-1及PD-L1二者且誘導PD-1降解。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合PD-1及PD-L1二者且減少PD-1表現。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能誘導PD-1自免疫細胞脫落。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合PD-1及PD-L1二者且誘導PD-1自免疫細胞脫落。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能隔離PD-L1，使得PD-L1不可結合CD80。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能隔離PD-L1，使得PD-L1不可結合CD80，且其中CD80可自由結合CD28。於一些實施例中，該細胞為免疫細胞，諸如T細胞。於一些實施例中，該免疫細胞(例如，T細胞)為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合分子與藉由腫瘤微環境中之免疫細胞表現之PD-1的接合導致藉由該免疫細胞之PD-1下調。於一些實施例中，該免疫細胞為T細胞。於一些實施例中，該免疫細胞(例如，T細胞)為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者與參考抗原結合構築體(例如，派姆單抗(pembrolizumab)或阿特珠單抗(atezolizumab))相比或與抗原結合構築體之參考組合(例如，包含多特異性抗原結合構築體之PD-1臂及PD-L1臂之組合物，其中該組合物中之PD-1臂及PD-L1臂不彼此結合)相比能誘導至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%更大的干擾素-γ水平(例如，如於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )腸毒素A (「SEA」)檢定中所量測)。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體與參考抗原結合構築體(例如，派姆單抗或阿特珠單抗)相比或與抗原結合構築體之參考組合(例如，包含多特異性抗原結合構築體之PD-1臂及PD-L1臂之組合物，其中該組合物中之PD-1臂及PD-L1臂不彼此結合)相比能誘導至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%更大的介白素-2水平(例如，如於SEA檢定中所量測)。
於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體與參考抗原結合構築體(例如，派姆單抗或阿特珠單抗)相比或與抗原結合構築體之參考組合(例如，包含多特異性抗原結合構築體之PD-1臂及PD-L1臂之組合物，其中該組合物中之PD-1臂及PD-L1臂不彼此結合)相比誘導至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、200%、300%、400%或500%更多的腫瘤細胞(例如，白血病細胞、淋巴瘤細胞、黑色素瘤或乳癌細胞)殺死。
於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能延長患有癌症(例如，白血病、淋巴瘤、黑色素瘤及/或乳癌)之個體之生存期長於經投與參考抗原結合構築體(例如，派姆單抗或阿特珠單抗)或抗原結合構築體之參考組合(例如，包含多特異性抗原結合構築體之PD-1臂及PD-L1臂之組合物，其中該組合物中之PD-1臂及PD-L1臂不彼此結合)之個體至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、200%、300%、400%或500%。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體與未經處理之免疫細胞相比或與經參考抗原結合構築體(例如，派姆單抗或阿特珠單抗)或抗原結合構築體之參考組合(例如，包含多特異性抗原結合構築體之PD-1臂及PD-L1臂之組合物，其中該組合物中之PD-1臂及PD-L1臂不彼此結合)處理之免疫細胞相比能誘導至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、200%、300%、400%或500%更多的PD-1自免疫細胞之脫落。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體與未經處理之免疫細胞相比或與經參考抗原結合構築體(例如，派姆單抗或阿特珠單抗)或抗原結合構築體之參考組合(例如，包含多特異性抗原結合構築體之PD-1臂及PD-L1臂之組合物，其中該組合物中之PD-1臂及PD-L1臂不彼此結合)處理之免疫細胞相比能(例如，藉由引起PD-1自細胞表面脫落及/或誘導PD-1降解及/或減少PD-1表現)降低PD-1水平至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、100%、200%、300%、400%或500%。
於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合分子與藉由細胞表現之PD-1之接合會導致PD-1藉由細胞之細胞表面表現之下調及/或損失。細胞表面表現之此下調或損失可係部分由於例如細胞外PD-1自免疫細胞表面之脫落。於一些實施例中，該細胞為免疫細胞，諸如T細胞。於一些實施例中，該免疫細胞(例如，T細胞)為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合分子與藉由腫瘤微環境中之免疫細胞表現之PD-1之接合導致PD-1藉由該免疫細胞之下調。於一些實施例中，該免疫細胞為T細胞。於一些實施例中，該免疫細胞(例如，T細胞)為腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。
於一些態樣中，本發明提供一種治療有需要個體之增殖性病症之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者，從而治療該個體之增殖性病症。於一些實施例中，該增殖性病症為癌症。於一些實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：血癌、神經癌、黑色素瘤、乳癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、胰癌、泌尿生殖器癌、骨癌及血管癌。於一些實施例中，本發明提供一種增強有需要個體之免疫反應之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者，從而增強該個體之免疫反應。於一些實施例中，該增強之免疫反應包括增強之T細胞功能、增強之NK細胞功能或增強之巨噬細胞功能中之任一者或多者。於一些實施例中，該T細胞功能之增強與結合PD-1或PD-1配位體之藥劑，或包含結合PD-1之藥劑及結合PD-1配位體之藥劑之混合物相比，在投與該多特異性抗原結合構築體後係更大。於一些實施例中，該T細胞功能為增加之自T細胞之IFNγ產生、增強之T細胞生存、增加之T細胞增殖或自耗盡之T細胞表現型之營救中的任一者或多者。於一些實施例中，該增強之T細胞功能與結合PD-1或PD-1配位體之藥劑，或包含結合PD-1之藥劑及結合PD-1配位體之藥劑之混合物相比，在投與該多特異性抗原結合構築體後係更大。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體係經皮下、經靜脈內、經皮內、經腹膜內、經口、經肌肉內或經顱內投與。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體結合至在個體之相同細胞之表面上表現的PD-1及PD-L1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體結合至在個體之第一細胞之表面上表現的PD-1，且其中該多特異性抗原結合構築體結合至在個體之第二細胞之表面上表現的PD-L1。
於一些實施例中，本發明提供抗PD1抗體或其抗原結合片段，其中該抗PD-1抗體或抗原結合片段包含：(a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 70 (FTFX1 X2 YAX3 X4 ，其中X1 =S、R、G或N；X2 =D、S、N、A、R或G；X3 = M或L；X4 = S、L或N)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 72 (ARGLDFIVGX5 TGNDY，其中X5 =A、Y或R)之CDRH3；及(b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。於一些實施例中，該抗PD-1抗體或抗原結合片段包含：(a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 73、76、77、78、79、80、81、82、83、84或86中之任一者之胺基酸序列之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 74、75或85中之任一者之胺基酸序列之CDRH3；及(b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。於一些實施例中，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99中之任一者之胺基酸序列至少85%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 59之胺基酸序列至少85%相同之胺基酸序列。
於一些實施例中，本發明提供抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該抗PD-L1抗體或抗原結合片段包含：a.重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 2 (GGIIPX1 X2 GX3 ATYA，其中X1 為V或I；X2 為F、L或V；且X3 為T或A)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 3 (ARLKX1 ELKDAFDI，其中X1 為G、F或N)之CDRH3；及b.輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 4 (RASQX1 ISSYLN，其中X1 為S、W或Q)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 6 (X1 QSYSTPLT，其中X1 為Q或F)之CDRL3。於一些實施例中，該抗PD-L1抗體或抗原結合片段包含：(a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1、14、23、36或122中之任一者之胺基酸序列之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 11、15、16、21、24、26、27、29、31、33或34中之任一者之胺基酸序列之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 8、17、18、19、20、22、25、28、30、32或37中之任一者之胺基酸序列之CDRH3；及(b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9、12或13中之任一者之胺基酸序列之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10、38或39中之任一者之胺基酸序列之CDRL3。於一些實施例中，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或35中之任一者之胺基酸序列至少85%相同之胺基酸序列。於一些實施例中，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63中之任一者之胺基酸序列至少85%相同之胺基酸序列。
於一些實施例中，本發明提供一種治療有需要個體之增殖性病症之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之抗體或本文中所揭示之抗原結合構築體中之任一者，從而治療該個體之增殖性病症。於一些實施例中，該增殖性病症為癌症。於一些實施例中，該癌症係選自由以下組成之群：血癌、神經癌、黑色素瘤、乳癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、胰癌、泌尿生殖器癌、骨癌及血管癌。
於一些實施例中，本發明提供一種增強有需要個體之免疫反應之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之抗體或本文中所揭示之抗原結合構築體中之任一者，從而增強該個體之免疫反應。
於一些實施例中，本文中所述方法中之任一者可涉及在與本文中所述之多特異性抗原結合分子接觸之前及/或之後檢測藉由一或多個細胞(或細胞群體，諸如TIL)之PD-1表現的存在或不存在。例如，本文中所述方法中之任一者可涉及在向個體(例如，癌症患者)投與本文中所述之多特異性抗原結合分子之前及/或之後檢測藉由一或多個細胞(或細胞群體，諸如TIL)之PD-1表現的存在或不存在。此等方法可用於例如測定用於治療給定患者或患者群體之治療上有效量之分子。檢測表現之存在、減少及/或PD-1表現之不存在的方法為熟習此項技術者已知，例如，使用流動式細胞測量術、西方墨點法(Western blotting)、ELISA等。
於另一態樣中，本發明特徵為一種方法，其包括在與本文中所述之多特異性抗原結合分子接觸之前及/或之後量測藉由一或多個細胞(或細胞群體，諸如TIL)之PD-1表現的水平。於一些實施例中，該方法包括在向個體(例如，癌症患者)投與本文中所述之多特異性抗原結合分子之前及/或之後量測藉由一或多個細胞(或細胞群體，諸如TIL)之PD-1表現的水平。
於又一態樣中，本發明特徵為一種方法，其包括在與本文中所述之多特異性抗原結合分子接觸之前及/或之後量測藉由一或多個細胞(或細胞群體，諸如TIL)之PD-1表現的水平。例如，本文中所述方法中之任一者可涉及在向個體(例如，癌症患者)投與本文中所述之多特異性抗原結合分子之前及/或之後量測藉由一或多個細胞(或細胞群體，諸如TIL)之PD-1表現的水平。此等方法可尤其用於檢測或量測本文中所述分子對個體之生物效應。於一些實施例中，於用本文中所述之多特異性抗原結合分子處理後藉由免疫細胞(例如，自患者單離之TIL)之PD-1表現之水平的降低指示該分子已具有個體之生物效應。於一些實施例中，於用本文中所述之多特異性抗原結合分子處理後藉由免疫細胞(例如，自患者單離之TIL)之PD-1表現之水平的降低指示該患者應接受該分子之一或多個劑量，或以其他方式繼續包含該分子之療法。
於又一態樣中，本發明特徵為用於測定生物效應是否於用本文中所述之多特異性抗原結合分子處理之患者或患者群體中發生的方法。該方法包括檢測藉由獲自已經投與本文中所述之多特異性抗原結合分子之一個或多個患者之一或多個測試免疫細胞(例如，效應免疫細胞，諸如於腫瘤微環境中之彼等)之PD-1表現的存在或量，其中PD-1藉由一或多個免疫細胞之PD-1表現(例如，細胞表面表現)水平相對於對照表現水平(例如，在投與該分子之前藉由作為測試免疫細胞之相同組織學類型之免疫細胞的PD-1表現水平)降低，指示生物效應已於患者或患者群體中產生。於一些實施例中，該方法包括在檢測之前投與該多特異性抗原結合分子。於一些實施例中，該方法包括向已經測定產生生物效應之患者或患者群體投與多特異性抗原結合分子。於一些實施例中，對照PD-1表現水平大約為藉由尚未經診斷為患有癌症之個體群體中之相同組織學類型之免疫細胞之PD-1的中間或平均表現水平。於一些實施例中，對照PD-1表現水平大約為藉由尚未經投與本文中所述之多特異性抗原結合分子及/或結合及/或抑制PD-1之藥劑之個體群體中之相同組織學類型之免疫細胞之PD-1的中間或平均表現水平。
於又一態樣中，本發明特徵為一種減少藉由個體(例如，癌症患者)中之一或多個免疫細胞之PD-1表現的方法，該方法包括向個體投與本文中所述之多特異性抗原結合分子，從而減少藉由個體中之一或多個免疫細胞之PD-1表現。於一些實施例中，該方法包括測定藉由患者中之一或多個免疫細胞之PD-1表現之減少是否產生。於一些實施例中，該方法包括自個體獲得包含一或多個免疫細胞之生物樣品(例如，腫瘤活組織檢查) (例如，於向個體投與該分子後)。於一些實施例中，該方法包括量測藉由生物樣品中之一或多個免疫細胞之PD-1表現的水平。
於又一態樣中，本發明特徵為一種抑制個體(例如，癌症患者)中之PD-L1與CD80之間之結合的方法，該方法包括向個體投與本文中所述之多特異性抗原結合分子，從而抑制該個體中之PD-L1與CD80之間之結合。
相關申請案之交互參照 本申請案主張2018年11月13日申請之美國臨時申請案號62/760,801、2019年5月31日申請之美國臨時申請案號62/855,580、2019年9月11日申請之美國申請案號62/898,991、及2019年11月6日申請之美國申請案號62/931,478的優先權之效益。上述申請案之全文係以引用的方式併入本文中。
除非另有指定，否則本文中所用之所有技術術語、註釋及其他科學術語意欲具有熟習本發明從屬之技術者通常理解之含義。於一些情況下，出於清晰及/或便於參考，本文中定義具有通常理解之含義之術語，且本文中此等定義之納入不應必須解釋為表示與此項技術中通常理解內容之差異。本文中所述或參考之技術及程序一般由熟習此項技術者充分理解及通常使用習知方法採用，諸如，例如，於Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY中所述之廣泛利用之分子選殖方法。視情況而定，除非另有指定，否則一般根據製造商限定之方案及/或參數進行涉及使用市售套組及試劑之程序。
如本文中所用，除非上下文中另有明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數指示物。
於本說明書及申請專利範圍中，術語「約」係用於修飾例如於描述本發明之實施例中所採用之組合物中之成分的數量、濃度、體積、製程溫度、製程時間、產率、流率、壓力及類似值及其範圍。術語「約」係指可例如通過用於製備化合物、組合物、濃縮物或使用調配物之典型量測及操作程序；通過此等程序中之非有意誤差；通過用於進行該等方法之起始物質或成分之製造、來源或純度方面之差異及類似就近考量產生之數值量的變化。術語「約」亦涵蓋由於具有特定初始濃度之調配物或混合物之老化而不同的量，及由於混合或處理具有特定初始濃度之調配物或混合物而不同的量。在藉由術語「約」修飾之情況下，隨附申請專利範圍包括此等數量之等效物。若使用術語之上下文中提供一般技術者不清楚之該術語之用途，則「約」將意指特定值之至多加或減10%。
關於抗原結合蛋白/區/臂與靶分子之結合，術語「特異性結合」、「特異性結合至」、「特異性用於」、「選擇性結合」及「選擇性用於」特定抗原(例如，多肽靶)或特定抗原上之抗原決定基意指可量測地不同於非特異性或非選擇性相互作用之結合。特異性結合可例如藉由測定分子之結合與對照分子之結合比較來量測。特異性結合亦可藉由與類似於靶之對照分子(諸如過量未經標記之靶)競爭來測定。於該情況下，若經標記之靶與探針之結合藉由過量未經標記之靶競爭抑制，則指示特異性結合。
術語「抗原決定基」意指能特異性結合至抗原結合蛋白之抗原之組分。抗原決定基往往由表面可接近胺基酸殘基及/或糖側鏈組成且可具有特定三維結構特徵，以及特定電荷特徵。辨別構象及非構象抗原決定基在於在變性溶劑之存在下喪失與前者但非後者之結合。抗原決定基可包含直接涉及結合之胺基酸殘基，及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基。可使用用於抗原決定基測定之已知技術，諸如例如，測試結合至具有不同點突變之抗原變異體之抗原結合蛋白來測定抗原結合蛋白結合之抗原決定基。
在多肽序列與參考序列之間之「同一性」百分比經定義為於比對序列及若必要引入空隙後以達成最大序列同一性百分比，與參考序列中之胺基酸序列相同之多肽序列中之胺基酸殘基的百分比。出於測定胺基酸序列同一性百分比之目的之比對可以此項技術之技能內之各種方式達成，例如，使用公共可得電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN (DNASTAR)、CLUSTALW或CLUSTAL OMEGA軟體。於一些實施例中，使用CLUSTAL OMEGA軟體進行比對。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適宜參數，包括達成跨正在比較之序列之全長之最大比對所需的任何演算法。
如本文中所用，術語「能」意指藥劑或方法(例如，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體或方法中之任一者)具有達成適宜背景下之特定性質之能力(如由熟習工人所瞭解)，但是不需要與任何特定時刻之性質相關聯。例如，當向表現PD-1及/或PD-L1之細胞投與時，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者可能夠結合PD-1及/或PD-L1，但是當該等構築體係於缺乏PD-1或PD-L1蛋白質之組合物中時，不期望該等構築體結合PD-1及/或PD-L1。
「保留性取代」或「保留性胺基酸取代」係指一或多個胺基酸經一或多個化學或功能相似胺基酸取代。提供相似胺基酸之保留性取代表係此項技術中熟知。具有此等取代之多肽序列被稱作「經保留性修飾之變異體」或「變異體」。此等經保留性修飾之變異體係補充且不排除多晶型變異體、種間同源物及對偶基因。保留性取代之一些實例可見於例如Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties 第2版(1993) W. H. Freeman & Co., New York, NY中。
本文中所揭示之多肽可包含非天然產生之胺基酸序列。此等變異體必需具有與起始分子小於100%序列同一性或相似性。於某些實施例中，該變異體將具有與起始(例如，天然產生或野生型)多肽之胺基酸序列約75%至小於100%，更佳地約80%至小於100%，更佳地約85%至小於100%，更佳地約90%至小於100% (例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)及最佳地約95%至小於100%胺基酸序列同一性或相似性之胺基酸序列(例如，跨變異體分子之長度)。
如本文中所用，「抗體」可係指完整抗體(例如，完整免疫球蛋白)及抗體部分，例如，抗原結合部分。抗原結合部分包含至少一個抗原結合域。抗原結合域之一個實例為藉由VH -VL 二聚體形成之抗原結合域。抗體及抗原結合部分可藉由其特異性結合之抗原描述。例如，PD-L1抗體或抗PD-L1抗體為特異性結合至PD-L1之抗體。
可將VH 及VL 區進一步細分成散布有更保留性之區之高可變性區(高可變區(HVR)，亦稱作互補決定區(CDR))。將更保留性區稱作框架區(FR)。各VH 及VL 一般包含以下列順序(自N端至C端)排列之三個CDR及四個FR：FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4。該等CDR係涉及抗原結合，且賦予抗原特異性及對抗體之結合親和力。(參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest 第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD。)
CDR係涉及抗原結合且賦予抗原特異性及對抗體之結合親和力。於重鏈及輕鏈之可變域各者中存在三個CDR，其針對可變域各者經指定為CDR1、CDR2及CDR3。如本文中所用，術語「CDR集」係指於能結合靶抗原之單一重鏈或輕鏈可變域中出現之三個CDR之群組。此等CDR之精確邊界已根據不同系統不同限定。可將三個重鏈CDR稱作CDRH1、CDRH2及CDRH3，及可將三個輕鏈CDR稱作CDRL1、CDRL2及CDRL3。
藉由Kabat所述之系統，亦稱作「根據Kabat編號」、「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」提供適用於抗體之任何可變域之明確殘基編號系統，且提供限定各鏈之三個CDR之精確殘基邊界。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)及(1991)，其內容之全文係以引用的方式併入)。此等CDR被稱作Kabat CDR且包含輕鏈可變域中之約殘基24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)及89-97 (CDR3)及重鏈可變域中之31-35 (CDR1)、50-65 (CDR2)及95-102 (CDR3)。當根據Kabat定義CDR時，輕鏈FR殘基係位於約殘基1-23 (LCFR1)、35-49 (LCFR2)、57-88 (LCFR3)及98-107 (LCFR4)及重鏈FR殘基係位於重鏈殘基中之約殘基1-30 (HCFR1)、36-49 (HCFR2)、66-94 (HCFR3)及103-113 (HCFR4)。「如於Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
此項技術中亦使用其他CDR編號系統(參見，例如，表 A )。Chothia及同仁發現Kabat CDR內之某些子部分採取幾乎相同肽骨架構象，儘管其在胺基酸序列之水平下具有極大多樣性。(Chothia等人(1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917；及Chothia等人(1989) Nature 342: 877-883)。可將此等子部分指定為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中該「L」及該「H」各自指定輕鏈區及重鏈區。可將此等CDR稱作「Chothia CDR」、「Chothia編號」或「根據Chothia編號」，且包含輕鏈可變域中之約殘基24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)及89-97 (CDR3)，及重鏈可變域中之26-32 (CDR1)、52-56 (CDR2)及95-102 (CDR3)。Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。
藉由MacCallum所述之系統，亦稱作「根據MacCallum編號」或「MacCallum編號」包含輕鏈可變域中之約殘基30-36 (CDR1)、46-55 (CDR2)及89-96 (CDR3)，及重鏈可變域中之30-35 (CDR1)、47-58 (CDR2)及93-101 (CDR3)。MacCallum等人((1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-745)。
藉由AbM所述之系統，亦稱作「根據AbM編號」或「AbM編號」包含輕鏈可變域中之約殘基24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)及89-97 (CDR3)，及重鏈可變域中之26-35 (CDR1)、50-58 (CDR2)及95-102 (CDR3)。
亦可使用可變區之IMGT (國際免疫遺傳學資訊系統)編號，其為根據IIMGT之方法之免疫球蛋白可變重鏈或輕鏈中之殘基的編號，該等方法如於Lefranc, M.-P., 「The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T cell Receptors and Ig-like domains」, The Immunologist, 7, 132-136 (1999)中所述且其全文係以引用的方式明確地併入本文中。如本文中所用，「IMGT序列編號」或「根據IMTG編號」係指根據IMGT之編碼可變區之序列之編號。針對重鏈可變域，當根據IMGT編號時，高可變區範圍針對CDR1自胺基酸位置27至38，針對CDR2自胺基酸位置56至65，及針對CDR3自胺基酸位置105至117。針對輕鏈可變域，當根據IMGT編號時，高可變區範圍針對CDR1自胺基酸位置27至38，針對CDR2自胺基酸位置56至65，及針對CDR3自胺基酸位置105至117。
於本文中所述之構築體及抗原結合臂之一些實施例中，當根據Chothia編號來編號時，本文中詳述之CDR包含輕鏈可變域中之約殘基24-34 (CDR1)、49-56 (CDR2)及89-97 (CDR3)，及重鏈可變域中之27-35 (CDR1)、49-60 (CDR2)及93-102 (CDR3)。於一些實施例中，當根據Chothia編號來編號時，輕鏈可變域中之CDR2可包含胺基酸49-56。表 A ： CDR 定義
CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
Kabat 31-35 50-65 95-102 24-34 50-56 89-97
根據 Chothia 編號之替代 CDR 27-35    49-60 93-102 24-34 50-56 89-97
Chothia 26-32 52-56或50-56 95-102 24-34 50-56 89-97
MacCallum 30-35 47-58 93-101 30-36 46-55 89-96
AbM 26-35 50-58 95-102 24-34 50-56 89-97
IMGT 27-38    56-65 105-117 27-38 56-65 105-117
雖然與本文中所述之彼等相似或等效之方法及材料亦可用於實施或測試本發明所揭示之方法及組合物，但是本文中描述較佳方法及材料。本文中提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻之全文係以引用的方式併入。
以下進一步詳細描述本發明之各種態樣。整篇本說明書闡述額外定義。
免疫系統具有識別及消除腫瘤細胞之能力；然而，腫瘤可使用多種策略來逃避免疫。最近研究已顯示抑制免疫檢查點分子通過各種抗腫瘤抑制機理促進癌症進展。免疫檢查點之阻斷為活化或重新活化治療性抗腫瘤免疫之方法中之一者。已針對許多同源抑制免疫檢查點受體描述各種配位體。例如於Nair及Elkord，Immunology & Cell Biology (2018), 96:21-33；及Jenkins等人，British J. of Cancer (2017), 118:9-16中評論。
程式化死亡1 (PD-1)蛋白為T細胞調節劑之延伸之CD28/CTLA-4家族之抑制成員(Okazaki等人(2002)Curr Opin Immunol 14: 391779-82；Bennett等人(2003)J. Immunol. 170:711-8)。CD28家族之其他成員包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。表明PD-1呈單體存在，其缺少其他CD28家族成員之未配對之半胱胺酸殘基特徵。PD-1在經活化之B細胞、T細胞及單核細胞上表現。
PD-1基因編碼55 kDa I型跨膜蛋白(Agata等人(1996)Int Immunol. 8:765-72)。雖然結構上類似於CTLA-4，PD-1缺少對B7-1及B7-2結合而言重要之MYPPY基序。已識別PD-1之兩種配位體，PD-L1 (B7-H1)及PD-L2 (B7-DC)，已顯示該等配位體在結合至PD-1後下調T細胞活化(Freeman等人(2000)J. Exp. Med. 192:1027-34；Carter等人(2002)Eur. J. Immunol. 32:634-43)。PD-L1及PD-L2均為結合至PD-1但是不結合至其他CD28家族成員之B7同源物。PD-L1於各種人類癌症中係豐富的(Dong等人(2002)Nat. Med. 8:787-9)。
PD-1被稱作免疫抑制蛋白，其負調節TCR信號(Ishida, Y.等人(1992)EMBO J. 11:3887-3895；Blank, C.等人(Epub 2006 Dec. 29)Immunol. Immunother. 56(5):739-745)。PD-1與PD-L1之間之相互作用可充當免疫檢查點，其可導致例如腫瘤浸潤淋巴細胞之減少、T細胞受體介導之增殖之減少、及/或藉由癌細胞之免疫逃避(Dong等人(2003)J. Mol. Med. 81:281-7；Blank等人(2005)Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314；Konishi等人(2004)Clin. Cancer Res. 10:5094-100)。免疫抑制可藉由抑制PD-1與PD-L1或PD-L2之局部相互作用逆轉；亦當PD-1與PD-L2之相互作用經阻斷時，該效應係累加(Iwai等人(2002)Proc. Nat'l. Acad. Sci . USA 99:12293-7；Brown等人(2003)J. Immunol. 170:1257-66)。
PD-L1，亦稱作分化簇274 (CD274)或B7同源物1 (B7-H1)，為40kDa 1型跨膜蛋白，其在特定事件(諸如妊娠、組織同種異體移植、自體免疫性疾病及其他疾病狀態，諸如肝炎)期間於抑制免疫系統中起作用。舉例而言，人類PD-L1包含SEQ ID NO: 115 (UniProt Q9NZQ7)之胺基酸序列。正常地，免疫系統對與外源或內源危險信號相關聯之外來抗原反應，其觸發抗原特異性CD8+ T細胞及/或CD4+輔助細胞之增殖。於癌症中，在癌細胞上表現之PD-L1結合至免疫效應細胞(例如，T細胞)上之其配位體PD-1。PD-L1與PD-1之結合傳送抑制信號，該信號減少淋巴結中之抗原特異性T細胞之增殖，同時減少調節性T細胞(抗發炎抑制性T細胞)之細胞凋亡。PD-1/PD-L1相互作用亦誘導腫瘤特異性T細胞之細胞凋亡，促進CD4+ T細胞分化成Foxp3+ 調節性T細胞，及促進腫瘤細胞抗細胞毒性T淋巴細胞(CTL)攻擊，因此允許腫瘤逃避宿主免疫系統。
本發明係關於藉由減少由於PD-1與其配位體(例如，PD-L1及/或PD-L2)之間之相互作用產生之免疫檢查點抑制來抑制腫瘤逃避的組合物及方法。特定言之，本文中提供包含新穎多特異性及多價構築體(諸如雙特異性及四價構築體)之組合物，該等構築體阻斷PD-1與其配位體(例如，PD-1及/或PD-L2)之間之相互作用，同時促進細胞之相互作用(橋接)，在該等細胞上表現PD-1及其配位體。具有「阻斷及橋接」能力之本發明之此等組合物與個別抗體之組合相比，以及與臨床檢查點阻斷劑相比增加活體外及活體內效能及強烈增強例如T細胞增殖、IFNγ產生及/或分泌、T細胞之溶細胞活性、及/或自功能耗盡營救T細胞以提供優越抗腫瘤功效(可藉由各種方法顯現之生物效應，其包括但不限於例如腫瘤體積之減少、腫瘤細胞數目之減少、腫瘤細胞增殖之減少、及/或腫瘤細胞生存之減少)。本文中亦提供用於此等多特異性及多價構築體之新穎單株抗PD-1抗體及其抗原結合片段，及新穎單株抗PD-L1抗體及其抗原結合片段。此等新穎單株抗PD-1抗體及新穎單株抗PD-L1抗體中之一些共用共同輕鏈，從而允許產生具有優異類藥物性質及可製造性，以及類似於其親本抗體之親和力之多特異性及多價構築體。
因此，本發明提供包含至少兩個抗原結合臂或抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中第一臂或抗原結合單元結合藉由免疫細胞表現之PD-1，及第二臂或抗原結合單元結合藉由第二細胞表現之一或多種PD-1配位體(例如，PD-L1及/或PD-L2)。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與其配位體之相互作用。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體橋接表現PD-1及其配位體之細胞以促進表現PD-1之免疫細胞之相互作用及/或功效。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之至少一者針對PD-1係二價的。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之至少一者針對PD-L1係二價的。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之至少一者針對PD-1係二價的，及該等抗原結合臂中之至少一者針對PD-L1係二價的。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少兩個結合PD-1之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含兩個結合PD-1之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少兩個結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含兩個結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少四個抗原結合單元，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含四個抗原結合單元，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)。於本文中所述態樣中之任一者之一些實施例中，該構築體為雙特異性抗體。於一些實施例中，該雙特異性抗體為PD-1及PD-1配位體二者之拮抗劑。於一些實施例中，該構築體包含共同輕鏈。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之一者或二者為適體。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之一者或二者為除了抗體外之蛋白質。於一些實施例中，該構築體包含至少兩個抗體。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之至少一者為特異性針對PD-1之二價抗體。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之至少一者為特異性針對PD-L1之二價抗體。於一些實施例中，該等抗原結合臂中之至少一者為特異性針對PD-1之二價抗體，及該等抗原結合臂中之至少一者為特異性針對PD-L1之二價抗體，使得該構築體係四價。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合PD-1上之兩個不同抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體結合PD-1配位體上之兩個不同抗原決定基。於一些態樣中，本文中亦提供特異性結合PD-L1或PD-1之新穎單離抗體及其抗原結合部分。於一些實施例中，特異性結合PD-L1或PD-1之此等新穎單離抗體及其抗原結合部分(諸如CDR、可變重鏈及/或可變輕鏈)可用於本文中所述之多特異性抗原結合構築體之一或多個臂或抗原結合單元。
因此，如本文中所用，所揭示之多特異性抗原結合構築體包含雙特異性、三特異性、四特異性或多特異性抗體或其抗原結合部分。所述多特異性構築體針對至少一個，較佳地兩個抗原結合臂較佳地係二價，即，為雙特異性及三價，或雙特異性及四價分子。於各種態樣及實施例中，本文中所述之多特異性構築體包含一或多個抗體及/或其抗原結合部分。例如，抗原結合臂可包含PD-1之給定抗體及/或PD-L1之給定抗體之可變重鏈及/或可變輕鏈或其互補決定區(CDR)。因此，於本文中所述態樣中之任一者之一些實施例中，第一抗原結合臂、第二抗原結合臂、第一抗原結合單元、第二結合單元或其任何組合可包含抗體或其抗原結合部分。於本文中所述態樣中之任一者之一些實施例中，第一抗原結合臂、第二抗原結合臂、第一抗原結合單元、第二結合單元或其任何組合為抗體或其抗原結合部分。
A. PD-L1 拮抗劑 於一些態樣及實施例中，本發明提供抗PD-L1拮抗劑。於一些實施例中，該抗PD-L1拮抗劑為本文中所揭示之抗PD-L1抗體或抗原結合分子中之任一者。於一些實施例中，該抗PD-L1抗體或抗原結合分子非多特異性抗原結合構築體之一部分，即，該抗PD-L1抗體或抗原結合分子非結合至多個抗原決定基之蛋白質構築體之一部分。於一些實施例中，該抗PD-L1抗體或抗原結合部分可與不同抗體或抗原結合部分組合以形成多特異性抗原結合構築體。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合PD-L1上之抗原決定基及另一蛋白質上之抗原決定基。於一些實施例中，該另一蛋白質上之抗原決定基係在PD-1上。
因此，於一些態樣中，本文中提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分。於一些態樣中，該特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分包含(a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 2 (GGIIPX1 X2 GX3 ATYA，其中X1 為V或I；X2 為F、L或V；且X3 為T或A)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 3 (ARLKX1 ELKDAFDI，其中X1 為G、F或N)之CDRH3；及(b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 4 (RASQX1 ISSYLN，其中X1 為S、W或Q)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 6 (X1 QSYSTPLT，其中X1 為Q或F)之CDRL3。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb1。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 12 (RASQWISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb2。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 13 (RASQQISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb3。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb4。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之另一代表性抗體為mAb24。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 14 (GTFSSYAFS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 14 (GTFSSYAFS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb5。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb6。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb7。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb8。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb9。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb10。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb11。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 24 (GGIIPIVGIANYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 24 (GGIIPIVGIANYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb12。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 25 (ARLKGEFKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 25 (ARLKGEFKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb13。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 26 (GRIIPLFGTAHYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 26 (GRIIPLFGTAHYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb14。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 27 (GRINPILGTANYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 28 (ARLKGELKDAFSI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 27 (GRINPILGTANYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 28 (ARLKGELKDAFSI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb15。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb16。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 122 (GTKSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 122 (GTKSSYAIS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb17。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb18。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 33 (GGIIPIVATANYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 33 (GGIIPIVATANYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb19。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 34 (GGIIPIFGKATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 34 (GGIIPIFGKATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb20。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 36 (GPFRSHAVS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，及CDRH3包含SEQ ID NO: 37 (ARLKSELKDAFDI)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 36 (GPFRSHAVS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 37 (ARLKSELKDAFDI)，CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb21。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 38 (FQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb22。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 39 (QQSYSTILT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb23。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)，CDRH3包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)，CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)，及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb24。
在詳述特定序列之各情況下，亦提供包含具有與詳述序列(例如，SEQ ID NO: 1-34及36-39)至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之序列之實施例。
於一些態樣中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含：包含與SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一些態樣中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含包含與SEQ ID NO: 40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈可變區及包含與SEQ ID NO: 59至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一些態樣中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含包含與SEQ ID NO: 35至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈可變區及包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈可變區。
抗體mAb1至mAb23為衍生自親本抗體mAb24之親和力成熟抗體，如實例中所述。親和力成熟抗體或其抗原結合部分為具有一或多個更改(例如，於一或多個CDR或FR中)之抗體或抗原結合片段，其與缺少該(該等)更改之親本抗體相比導致抗體對其抗原之親和力之提高。於一些實施例中，親和力成熟抗體具有對PD-L1之奈莫耳或皮莫耳親和力。於一些實施例中，該PD-L1抗體或其抗原結合部分具有至少1 x 10-7 M、至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9 M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M、至少1 x 10-12 M、或至少1 x 10-13 M之KD 。
表1顯示mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13、mAb14、mAb15、mAb16、mAb17、mAb18、mAb19、mAb20、mAb21、mAb22及mAb23 (即，mAb24之親和力成熟變異體)與人類PD-L1之結合親和力(KD )。如本文中所用，術語KD 係指特定抗體-抗原相互作用之解離平衡常數。KD =kd /ka 。如本文中所用，術語kd (sec-1 )係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數。亦將該值稱作koff 值。如本文中所用，術語ka (M-1 x sec-1 )係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率常數。亦將該值稱作kon 值。表 1. mAb1 至 mAb23 與人類 PD-L1 之結合親和力
mAb KD (nM) 改善 倍數
1 4.16 1.1
2 2.2 2.0
3 0.9 4.8
4 4.9 0.9
5 27.1 0.2
6 35.9 0.1
7 -- --
8 3.7 1.2
9 5.4 0.8
10 6.3 0.7
11 156 --
12 358 --
13 52.3 0.1
14 -- --
15 -- --
16 -- --
17 -- --
18 527 --
19 817 --
20 53.9 0.1
21 91.5 0.1
22 2.5 1.8
23 369 --
表2提供mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13、mAb14、mAb15、mAb16、mAb17、mAb18、mAb19、mAb20、mAb21、mAb22及mAb23 (即，mAb24之親和力成熟變異體)與人類PD-L1 (「huPDL1」)、食蟹猴PD-L1或鼠科PD-L1 (「muPDL1」)之細胞結合數據。人類或食蟹猴PD-L1係在HEK細胞上表現；鼠科PD-L1係在A20細胞上表現。將結合表示為EC50 值，其可自在外源表現所關注抗原之細胞上滴定不同濃度之mAb來估計。可使用螢光靶向之二級體來檢測及量化mAb結合。使用GRAPHPAD中之內建函數將表2中所示之數據擬合至1:1結合模型，其產生EC50 值。表 2. mAb1 至 mAb23 與細胞上表現之人類、食蟹猴及鼠科 PD-L1 之細胞結合
mAb huPDL1 EC50 (nM) 改善倍數 食蟹猴 PDL1 EC50 (nM) 改善倍數 muPDL1 EC50 (nM) 改善 倍數
1 0.04 3.3 0.09 3.21 0.74 5.26
2 0.06 2.2 0.08 3.76 2.00 1.96
3 0.11 1.3 ND  -- 1.27 3.08
4 0.04 3.3 0.07 4.10 NB  --
5 0.09 1.5 0.39 0.74 NB  --
6 0.13 1.1 0.47 0.61 NB  --
7 ND --  NB  -- NB  --
8 ND  -- 0.08 3.42 NB  --
9 0.06 2.5 0.07 4.15 NB  --
10 0.04 3.2 0.09 3.05 NB  --
11 1.37 0.1 NB  -- NB  --
12 1.23 0.1 NB  -- NB  --
13 1.43 1.0 ND  -- NB  --
14 1.54 0.1 NB  -- NB  --
15 ND --  NB  -- NB  --
16 NB --  NB --  NB  --
17 0.76 0.2 NB --  NB  --
18 0.38 0.4 0.06 4.96 0.84 4.67
19 1.20 0.1 0.26 1.08 2.84 1.38
20 0.13 1.0 0.12 2.31 2.66 1.47
21 0.14 1.0 NB  -- NB  --
22 0.18 0.8 0.32 0.89 NB  --
23 0.83 0.2 NB  -- NB  --
*NB =不結合；ND =未測定；人類及食蟹猴PDL1在HEK細胞上表現；鼠科PDL1在A20細胞上表現
本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含：包含與SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58中之任一者至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63中之任一者至少90%相同(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58中之任一者15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。於一些實施例中，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63中之任一者15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。表3及4各自提供重鏈可變序列SEQ ID No: 35及40-58，及輕鏈可變序列SEQ ID No: 59-63之序列。表 3. 重鏈抗 PD-L1 可變序列
SEQ ID 編號 序列
35 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTMVTVSS
40 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAFSWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
41 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
42 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPNFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKGAGDIWGQGTLVTVSS
43 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKFELKDAFDIWGQGTLVTVSS
44 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDEWGQGTLVTVSS
45 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTAST
46 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKNELKDAFDIWGQGTLVTVSS
47 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGVIPFLGTANY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGILKDALDIWGQGTLVTVSS
48 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQDLEWMGGIIPIVGIANY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
49 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGEFKDAFDIWGQGTLVTVSS
50 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPLFGTAHY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
51 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRINPILGTANY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFSIWGQGTLVTVSS
52 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGRIIPIFGTADY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
53 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGKFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKCAFDIWGQGTLVTVSS
54 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
55 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGAATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
56 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVATANY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
57 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGKATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRKGELKDAFDIWGQGTLVTVSS
58 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFRSHAVSWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTATY AQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLKSELKDAFDIWGQGTLVTVSS
表 4. 輕鏈可變序列
SEQ ID 編號 序列
59 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
60 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
61 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQQISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
62 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCFQSYSTPLTFGGGTKVEIK
63 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTILTFGGGTKVEIK
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59、60、61、62或63之輕鏈可變區中之任一者之輕鏈CDR。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59、60、61、62或63之輕鏈可變區中之任一者之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據Kabat編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59、60、61、62或63之輕鏈可變區中之任一者之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據Chothia編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59、60、61、62或63之輕鏈可變區中之任一者之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據MacCallum編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59、60、61、62或63之輕鏈可變區中之任一者之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據AbM編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59、60、61、62或63之輕鏈可變區中之任一者之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據IMGT編號。
B. PD-1 拮抗劑 於一些態樣及實施例中，本發明提供抗PD-1拮抗劑。於一些實施例中，該抗PD-1拮抗劑為本文中所揭示之抗PD-1抗體或抗原結合分子中之任一者。於一些實施例中，該抗PD-1抗體或抗原結合分子非多特異性抗原結合構築體之一部分，即，該抗PD-1抗體或抗原結合分子非結合至多個抗原決定基之蛋白質構築體之一部分。於一些實施例中，該抗PD-1抗體或抗原結合部分可與不同抗體或抗原結合部分組合以形成多特異性抗原結合構築體。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合PD-1上之抗原決定基及另一蛋白質上之抗原決定基。於一些實施例中，該另一蛋白質上之抗原決定基係在PD-L1上。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者包含PD-1拮抗劑。於一些實施例中，該PD-1拮抗劑為「抑制性受體」。如本文中所用，「抑制性受體」一般係指當藉由同源配位體結合時，引起免疫反應之抑制之免疫檢查點分子，諸如已知增強腫瘤逃避之彼等。然而，於如本文中所用之一些實例中，「抑制性受體」具體係指PD-1。
PD-1為免疫檢查點抑制性受體，其含有包含胺基酸(S/I/V/L)xYxx(I/V/L)之保留序列之「免疫受體酪胺酸基抑制基序」或「ITIM」，其中x為任何胺基酸。分析PD-1活性是否已受抑制之方法係此項技術中已知且可藉由熟習此項技術者容易設計。此等分析包括例如測試PD-1於活體外或活體內之任何下游信號傳導路徑之效應。於PD-1與其配位體相互作用後，該ITIM基序藉由例如Src激酶家族之酵素磷酸化，允許其募集其他酵素，例如，磷酸酪胺酸磷酸酶SHP-1及SHP-2，或稱作SHIP之肌醇-磷酸酶。已顯示此等磷酸酶減少涉及細胞信號傳導之分子之活化。參見，例如，Barrow及Trowsdale (2006) Eur J Immunol. 36 (7): 1646-53。因此，可使用此項技術中之已知方法評估PD-1內之ITIM基序之磷酸化狀態。同樣，亦可檢查下游因子(諸如磷酸酪胺酸磷酸酶)之存在。此外，檢測作為PD-1活性之代表之下游因子(例如，經活化之T-細胞之核因子(NFAT)作為PD-1抑制之量度)之存在之各種基於細胞的分析及套組係此項技術中已知。於其他實例中，可使用簡單結合檢定來測定本發明之構築體是否可阻斷PD-1與其配位體之結合，如上所討論。
因此，於一些態樣中，本文中提供特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合部分。於一些態樣中，該特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合部分包含(a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 70 (FTFX1 X2 YAX3 X4 ，其中X1 =S、R、G或N；X2 =D、S、N、A、R或G；X3 = M或L；X4 = S、L或N)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 72 (ARGLDFIVGX5 TGNDY，其中X5 =A、Y或R)之CDRH3；及(b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb25。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb26。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 76 (FTFSSYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 76 (FTFSSYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb27。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 77 (FTFSSYAML)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 77 (FTFSSYAML)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb28。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 78 (FTFSNYALS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 78 (FTFSNYALS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb29。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 79 (FTFSAYAMN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 79 (FTFSAYAMN)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb30。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb31。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 81 (FTFGRYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 81 (FTFGRYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb32。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 82 (FTFNSYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 82 (FTFNSYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb33。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 83 (FTFSNYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 83 (FTFSNYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb34。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 84 (FTFSGYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 84 (FTFSGYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb35。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 86 (FTFSSYAMN)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 86 (FTFSSYAMN)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb36。
於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)，CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)及CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)。於此等態樣及本文中所述之所有此等態樣之一些實施例中，CDRH1包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)；CDRH2包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)；CDRH3包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)；CDRL1包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)；CDRL2包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)；及CDRL3包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)。具有此等重鏈及輕鏈可變CDR區之代表性抗體為mAb37。
於詳述特定序列之各情況下，亦提供包含具有與詳述序列(例如，SEQ ID NO: 5、9、10或71-86)至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)同一性之序列之實施例。
於一些態樣中，本發明亦提供特異性結合PD-1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含包含與SEQ ID NO: 87-99中之任一者至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO: 59至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈可變區。於一些實施例中，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 90至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列，及輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 59至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列。各自地，表7提供重鏈可變序列SEQ ID No: 87-99之序列，及表4提供輕鏈可變序列SEQ ID NO: 59。於一些實施例中，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 87-99中之任一者15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。於一些實施例中，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 59 15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。
抗體mAb26至mAb37為衍生自親本抗體mAb25之親和力成熟抗體，如實例中所述。親和力成熟抗體或其抗原結合部分為具有一或多個更改(例如，於一或多個CDR或FR中)之抗體或抗原結合片段，其與缺少該(該等)更改之親本抗體相比導致抗體對其抗原之親和力之提高。於一些實施例中，親和力成熟抗體具有對PD-1之奈莫耳或皮莫耳親和力。於一些實施例中，該PD-1抗體或其抗原結合部分具有至少1 x 10-7 M、至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9 M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M、至少1 x 10-12 M、或至少1 x 10-13 M之KD 。
表5及6提供mAb25、mAb26、mAb27、mAb28、mAb29、mAb30、mAb31、mAb32、mAb33、mAb34、mAb35、mAb36及mAb37(即，mAb25之親和力成熟變異體)與人類PD-1 (「huPD-1」)、食蟹猴PD-1 (「cyPD-1」)或鼠科PD-1 (「muPD-1」)之細胞結合數據。人類、食蟹猴或鼠科PD-1係在CHO細胞上表現。將結合表示為EC50 值，其可自在外源表現所關注抗原之細胞上滴定不同濃度之mAb來估計。可使用螢光靶向之二級體來檢測及量化mAb結合。使用GRAPHPAD中之內建函數將表5中所示之數據擬合至1:1結合模型，其產生EC50 值。表 5 ： mAb25 至 mAb37 與人類 PD-1 之結合親和力
mAb KD (nM) 超過親本之提高倍數
mAb25 240  
mAb26 10 24
mAb27 2.3 104
mAb28 5.6 43
mAb29 8.6 28
mAb30 3.1 77
mAb31 5.5 44
mAb32 2.1 114
mAb33 7 34
mAb34 7.2 33
mAb35 9 27
mAb36 7.7 31
mAb37 14 17
表 6. mAb25 至 mAb37 與細胞上表現之人類、食蟹猴及鼠科 PD-1 之細胞結合
mAb huPD-1 EC50 (nM) 超過親本之改善倍數 cyPD-1 EC50 (nM) 超過親本之改善倍數 muPD-1 EC50 (nM)
mAb25 0.915   8.59   NB
mAb26 3.74 0.2 1.54 5.6 17.9
mAb27 1.75 0.5 1.53 5.6 6.14
mAb28 3.94 0.2 1.48 5.8 0.814
mAb29 1.27 0.7 1.73 5.0 2.14
mAb30 2.77 0.3 2.05 4.2 4.05
mAb31 1.71 0.5 1.9 4.5 1.87
mAb32 1.51 0.6 1.29 6.7 2.8
mAb33 1.04 0.9 1.33 6.5 10.4
mAb34 3.87 0.2 1.33 6.5 20.5
mAb35 1.64 0.6 2.66 3.2 PF
mAb36 1.01 0.9 1.19 7.2 PF
mAb37 0.75 1.2 1.09 7.9 0.942
*NB =不結合；PF =差擬合；人類、食蟹猴、鼠科PD-1在CHO細胞上表現表 7. 重鏈抗 PD-1 可變序列
SEQ ID 編號 序列
87 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGATGNDYWGQGTLVTVSS
88 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
89 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
90 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMLWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
91 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYALSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
92 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
93 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
94 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGRYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
95 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS
96 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGATGNDYWGQGTLVTVSS
97 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGRTGNDYWGQGTLVTVSS
98 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGRTGNDYWGQGTLVTVSS
99 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGRTGNDYWGQGTLVTVSS
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59之輕鏈可變區之輕鏈CDR。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59之輕鏈可變區之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據Kabat編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59之輕鏈可變區之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據Chothia編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59之輕鏈可變區之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據MacCallum編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59之輕鏈可變區之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據AbM編號。
於一些實施例中，本發明亦提供特異性結合PD-L1之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含SEQ ID NO: 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99之重鏈可變區中之任一者之重鏈CDR，及SEQ ID NO: 59之輕鏈可變區之輕鏈CDR，其中該等重鏈及輕鏈CDR殘基係根據IMGT編號。
C.多特異性抗原結合構築體 於一些態樣中，本發明提供藉由抑制PD-L1與PD-1之間之相互作用(例如，在腫瘤細胞上表現之PD-L1與在T細胞上表現之PD-1之間之相互作用)來增強對腫瘤細胞之免疫反應的組合物及方法。提供特異性或選擇性結合PD-L1或PD-1之抗體或其抗原結合部分。如本文中所用，術語「特異性結合至」、「特異性用於」、「選擇性結合」及「選擇性用於」PD-L1或PD-1，或PD-L1或PD-1上之抗原決定基意指可量測地不同於非特異性或非選擇性相互作用之結合。於一些實施例中，該抗體或其抗原結合部分特異性結合至人類PD-L1或PD-1及/或小鼠PD-L1或PD-1。特異性結合可例如藉由測定分子之結合與對照分子之結合比較來量測。特異性結合亦可藉由與類似於靶之對照分子(諸如過量未經標記之靶)競爭來測定。於該情況下，若經標記之靶與探針之結合藉由過量未經標記之靶競爭抑制，則指示特異性結合。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者結合至至少兩個不同受體或抗原決定基(例如，PD-1及PD-L1)，其中藉由該多特異性抗原結合構築體結合之該等兩個不同受體或抗原決定基係在相同細胞之表面上表現。例如，於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體同時結合至PD-1及PD-L1，其中該PD-1及PD-L1係在相同細胞之表面上表現。於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者結合至至少兩個不同受體或抗原決定基(例如，PD-1及PD-L1)，其中藉由該多特異性抗原結合構築體結合之該等兩個不同受體或抗原決定基係在兩個不同細胞之表面上表現。例如，於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體同時結合至在第一細胞之表面上表現之PD-1及在第二細胞之表面上表現之PD-L1。
於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合人類PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合鼠科PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能結合食蟹猴PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體能以相似親和力結合人類、鼠科及食蟹猴PD-1。
於一些態樣及實施例中，本發明提供包含至少兩個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中第一抗原結合單元結合PD-1，及第二抗原結合單元結合PD-1配位體。於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合藉由免疫細胞表現之PD-1。於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合藉由第二細胞表現之PD-1。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之相互作用。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之相互作用。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少兩個結合PD-1之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含兩個結合PD-1之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少兩個結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含兩個結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之抗原結合單元。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含至少四個抗原結合單元，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含四個抗原結合單元，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)。於一些實施例中，各抗原結合單元能獨立地結合至其同源抗原，即，PD-1或PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體促進來自細胞之PD-1表現之損失。於一些實施例中，該PD-1表現之損失係由於PD-1脫落。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體(諸如PD-L1或PD-L2)之相互作用。於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含共同輕鏈。例如，至少兩個抗原結合單元包含共同輕鏈。
於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含： (a)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 70 (FTFX1 X2 YAX3 X4 ，其中X1 =S、R、G或N；X2 =D、S、N、A、R或G；X3 = M或L；X4 = S、L或N)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 72 (ARGLDFIVGX5 TGNDY，其中X5 =A、Y或R)之CDRH3；及 (b)輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些此等實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含： (a)包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)之CDRH3； (b)包含SEQ ID NO: 73 (FTFSDYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (c)包含SEQ ID NO: 76 (FTFSSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (d)包含SEQ ID NO: 77 (FTFSSYAML)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (e)包含SEQ ID NO: 78 (FTFSNYALS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (f)包含SEQ ID NO: 79 (FTFSAYAMN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (g)包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (h)包含SEQ ID NO: 81 (FTFGRYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (i)包含SEQ ID NO: 82 (FTFNSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 75 (ARGLDFIVGYTGNDY)之CDRH3； (j)包含SEQ ID NO: 83 (FTFSNYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 74 (ARGLDFIVGATGNDY)之CDRH3； (k)包含SEQ ID NO: 84 (FTFSGYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)之CDRH3； (l)包含SEQ ID NO: 86 (FTFSSYAMN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)之CDRH2及包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)之CDRH3；或 (m)包含SEQ ID NO: 80 (FTFRSYAMS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 71 (SAISNSGTYTYYA)，及包含SEQ ID NO: 85 (ARGLDFIVGRTGNDY)之CDRH3。
於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含： (a)包含與SEQ ID NO: 87至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (b)包含與SEQ ID NO: 88至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (c)包含與SEQ ID NO: 89至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (d)包含與SEQ ID NO: 90至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (e)包含與SEQ ID NO: 91至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (f)包含與SEQ ID NO: 92至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (g)包含與SEQ ID NO: 93至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (h)包含與SEQ ID NO: 94至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (i)包含與SEQ ID NO: 95至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (j)包含與SEQ ID NO: 96至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (k)包含與SEQ ID NO: 97至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區； (l)包含與SEQ ID NO: 98至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區；或 (m)包含與SEQ ID NO: 99至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區。
於一些實施例中，該第一抗原結合單元結合PD-1且包含包含與SEQ ID NO: 59至少90%相同之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L2。於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1。於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含： a.重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1；(ii)包含SEQ ID NO: 2 (GGIIPX1 X2 GX3 ATYA，其中X1 為V或I；X2 為F、L或V；且X3 為T或A)之CDRH2；及(iii)包含SEQ ID NO: 3 (ARLKX1 ELKDAFDI，其中X1 為G、F或N)之CDRH3；及 b.輕鏈可變區，其包含：(i)包含SEQ ID NO: 4 (RASQX1 ISSYLN，其中X1 為S、W或Q)之CDRL1；(ii)包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2；及(iii)包含SEQ ID NO: 6 (X1 QSYSTPLT，其中X1 為Q或F)之CDRL3。
於一些此等實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含： (a)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (b)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 7 (GGIIPILGAATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (c)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (d)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (e)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 12 (RASQWISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (f)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 13 (RASQQISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (g)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (h)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (i)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 15 (GGIIPIFGIANYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (j)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)之CDRH3； (k)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 16 (GGIIPNFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 17 (ARLKGELKGAGDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (l)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)之CDRH3； (m)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 18 (ARLKFELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (n)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)之CDRH3； (o)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 19 (ARLKGELKDAFDE)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (p)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)之CDRH3； (q)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 20 (ARLKNELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (r)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)之CDRH3； (s)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 21 (GGVIPFLGTANYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 22 (ARLKGILKDALDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (t)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (u)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 29 (GRIIPIFGTADYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (v)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3； (w)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 31 (GGIIPILGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (x)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 33 (GGIIPIVATANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3； (y)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 33 (GGIIPIVATANYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (z)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 34 (GGIIPIFGKATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3； (aa)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 34 (GGIIPIFGKATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 32 (ARRKGELKDAFDI)之CDRH3，包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (bb)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 38 (FQSYSTPLT)之CDRL3； (cc)包含SEQ ID NO: 1 (GTFSSYAIN)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 39 (QQSYSTILT)之CDRL3； (dd)包含SEQ ID NO: 14 (GTFSSYAFS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (ee)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 24 (GGIIPIVGIANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (ff)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 24 (GGIIPIVGIANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (gg)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 25 (ARLKGEFKDAFDI)之CDRH3； (hh)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 25 (ARLKGEFKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (ii)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 26 (GRIIPLFGTAHYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3； (jj)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 26 (GRIIPLFGTAHYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 8 (ARLKGELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (kk)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 27 (GRINPILGTANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 28 (ARLKGELKDAFSI)之CDRH3； (ll)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 27 (GRINPILGTANYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 28 (ARLKGELKDAFSI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (mm)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)之CDRH3； (nn)包含SEQ ID NO: 23 (GTFSSYAIS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 30 (ARLKGELKCAFDI)；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3； (oo)包含SEQ ID NO: 36 (GPFRSHAVS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 37 (ARLKSELKDAFDI)之CDRH3；或 (pp)包含SEQ ID NO: 36 (GPFRSHAVS)之CDRH1，包含SEQ ID NO: 11 (GGIIPVFGTATYA)之CDRH2，及包含SEQ ID NO: 37 (ARLKSELKDAFDI)之CDRH3；包含SEQ ID NO: 9 (RASQSISSYLN)之CDRL1，包含SEQ ID NO: 5 (AASSLQS)之CDRL2，及包含SEQ ID NO: 10 (QQSYSTPLT)之CDRL3。
於一些此等實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含包含與SEQ ID NO: 35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58中之任一者至少90%相同之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含與SEQ ID NO: 59、60、61、62或63中之任一者至少90%相同之胺基酸序列之輕鏈可變區。
於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含包含以下之重鏈可變區： (a)與SEQ ID NO: 35至少90%相同之胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO: 40至少90%相同之胺基酸序列； (c)與SEQ ID NO: 41至少90%相同之胺基酸序列； (d)與SEQ ID NO: 42至少90%相同之胺基酸序列； (e)與SEQ ID NO: 43至少90%相同之胺基酸序列； (f)與SEQ ID NO: 44至少90%相同之胺基酸序列； (g)與SEQ ID NO: 45至少90%相同之胺基酸序列； (h)與SEQ ID NO: 46至少90%相同之胺基酸序列； (i)與SEQ ID NO: 47至少90%相同之胺基酸序列； (j)與SEQ ID NO: 48至少90%相同之胺基酸序列； (k)與SEQ ID NO: 49至少90%相同之胺基酸序列； (l)與SEQ ID NO: 50至少90%相同之胺基酸序列； (m)與SEQ ID NO: 51至少90%相同之胺基酸序列； (n)與SEQ ID NO: 52至少90%相同之胺基酸序列； (o)與SEQ ID NO: 53至少90%相同之胺基酸序列； (p)與SEQ ID NO: 54至少90%相同之胺基酸序列； (q)與SEQ ID NO: 55至少90%相同之胺基酸序列； (r)與SEQ ID NO: 56至少90%相同之胺基酸序列； (s)與SEQ ID NO: 57至少90%相同之胺基酸序列；或 (t)與SEQ ID NO: 58至少90%相同之胺基酸序列。
於一些實施例中，該第二抗原結合單元結合PD-L1且包含包含以下之輕鏈可變區： (a)與SEQ ID NO: 59至少90%相同之胺基酸序列； (b)與SEQ ID NO: 60至少90%相同之胺基酸序列； (c)與SEQ ID NO: 61至少90%相同之胺基酸序列； (d)與SEQ ID NO: 62至少90%相同之胺基酸序列；或 (e)與SEQ ID NO: 63至少90%相同之胺基酸序列。
於一些實施例中，本發明提供多特異性抗原結合構築體，其包含本文中所揭示之PD-1拮抗劑中之任一者及本文中所揭示之PD-1配位體(諸如PD-L1)之拮抗劑中之任一者。例如，雙特異性體3為特異性結合人類PD-1及人類PD-L1之多特異性四價抗原結合構築體。該構築體包含抗PD-1 IgG1抗體(mAb28)，其中該抗體之重鏈為在其C端進一步包含抗PD-L1抗體(mAb1)之重鏈可變區之融合蛋白，該抗PD-L1抗體經由聚GGGS (SEQ ID NO: 120)連接子連接至抗BCMA抗體之Fc區。構築體之抗PD-1部分及抗PD-L1部分之輕鏈係相同(SEQ ID NO: 101)。雙特異性體3 (其結構由圖 13A 中之說明表示)包含SEQ ID NO: 100中詳述之重鏈序列及SEQ ID NO: 101中詳述之輕鏈序列。
於一些實施例中，本發明提供特異性結合PD-1及PD-L1之多特異性抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含包含與SEQ ID NO: 100或102至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈區及包含與SEQ ID NO: 101或103至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈區。
於一些實施例中，本發明提供特異性結合PD-1及PD-L1之多特異性抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含包含與SEQ ID NO: 100至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈區，及包含與SEQ ID NO: 101至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈區。於一些實施例中，該重鏈區包含與SEQ ID NO: 100 15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。於一些實施例中，該輕鏈區包含與SEQ ID NO: 101 15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。
於一些實施例中，本發明提供特異性結合PD-1及PD-L1之多特異性抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分包含包含與SEQ ID NO: 102至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之重鏈區，及包含與SEQ ID NO: 103至少85% (例如，至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同)之胺基酸序列之輕鏈區。於一些實施例中，該重鏈區包含與SEQ ID NO: 102 15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。於一些實施例中，該輕鏈區包含與SEQ ID NO: 103 15個胺基酸或更少、14個胺基酸或更少、13個胺基酸或更少、12個胺基酸或更少、11個胺基酸或更少、10個胺基酸或更少、9個胺基酸或更少、8個胺基酸或更少、7個胺基酸或更少、6個胺基酸或更少、5個胺基酸或更少、4個胺基酸或更少、3個胺基酸或更少、2個胺基酸或更少、或1個胺基酸不同之胺基酸序列。
於一些態樣及實施例中，本文中亦提供包含四個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-L1，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 100或102之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列，及與SEQ ID NO: 101或103之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。
於一些態樣及實施例中，本文中亦提供包含四個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-L1，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 100之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO: 101之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。
於一些態樣及實施例中，本文中亦提供包含四個抗原結合單元之多特異性抗原結合構築體，其中兩個抗原結合單元結合PD-1及兩個抗原結合單元結合PD-L1，且其中該構築體包含與SEQ ID NO: 102之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO: 103之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。表 8. 多特異性重鏈序列
SEQ ID 編號 序列
100 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMLWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSV KVSCKASGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGAATYAQKFQGRVTITADESTSTA YMELSSLRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
102 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMLWVRQAPGKGLEWVSAISNSGTYTYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGLDFIVGYTGNDYWGQGTLVTVSS AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDL YTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPP KPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFASTFRSVSEL PIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTC MITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVL HEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKA SGGTFSSYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGAATYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSS LRSEDTAVYYCARLKGELKDAFDIWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLG CLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHP ASSTKVDKKIVPRDCG
表 9. 多特異性輕鏈序列
SEQ ID 編號 序列
101 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
103 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKRADAAPTVSIFPPSS EQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTK DEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
如本文中所用，術語「多特異性抗原結合構築體」係指雙特異性、三特異性或多特異性抗原結合構築體，及其抗原結合部分或片段。多特異性抗原結合構築體可為單個多功能多肽或其可為彼此共價或非共價締合之兩個或更多個分子(例如，多肽及/或適體)之多聚複合物。術語「多特異性抗原結合構築體」包括可與另一功能分子(例如，另一種肽、蛋白質及/或適體)連接或共同表現之抗體(或其抗原結合片段)。例如，抗體或其片段可與一或多種其他分子實體(諸如蛋白質或其片段)功能上連接(例如，藉由化學偶聯、遺傳融合、非共價締合或其他方式)以產生具有第二結合特異性之雙特異性或多特異性抗原結合分子。如本文中所用，術語「多特異性抗原結合構築體」亦包括雙特異性、三特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段。於某些實施例中，抗體與另一抗體或其抗原結合片段功能連接以產生具有第二結合特異性之雙特異性抗體。本文中其他地方描述本發明之雙特異性及多特異性抗體。
如本文中所用，抗原結合「臂」係指形成結合至抗原之多特異性抗原結合構築體之區域之該構築體的單元、域、區或類似者。因此，「第一臂」與多特異性抗原結合構築體之「第二臂」形成該構築體之分離結合區，各臂形成抗原結合單元。一般而言，一「臂」(第一臂)在其抗原結合或抗原特異性方面不同於另一「臂」(第二臂)。因此，於雙特異性二價抗體之實例中，該抗體之一臂結合至抗原A，而該抗體之另一臂結合至抗原B。於一些實施例中，於雙特異性二價抗體之實例中，該抗體之一臂結合至抗原A，而該抗體之另一臂結合至抗原B或C (與兩種抗原(諸如PD-L1及PD-L2)交叉反應，由於例如結構相似性)。參見，例如，美國專利9,845,356。類似地，於四價雙特異性抗體(例如，藉由接合兩個不同抗體形成)之實例中，一「臂」係指結合至抗原A之抗體之區域(即使二價抗體之兩個結合位點結合至抗原A)及「另一臂」係指結合至抗原B之抗體之區域(即使二價抗體之兩個結合位點結合至抗原B)。於一些實施例中，於四價雙特異性抗體(例如，藉由接合兩個不同抗體形成)之實例中，一「臂」係指結合至抗原A之抗體之區域(即使二價抗體之兩個結合位點結合至抗原A)及「另一臂」係指結合至抗原B或C之抗體之區域(即使二價抗體之兩個結合位點可結合至抗原B或C)。參見，例如，美國專利9845356。如對熟習此項技術者顯然，「第一」或「第二」可交換使用。
當用於描述抗原結合構築體或蛋白質或抗原結合臂時，術語「價」係指抗原結合構築體或蛋白質中之識別(結合)位點之數目，不管彼等不同識別或結合位點是否結合至相同抗原決定基。各識別位點特異性識別及因此能結合抗原上之一個抗原決定基(結合位點)。當抗原結合蛋白包含超過一個識別位點時(例如，當抗原結合蛋白為IgG時，其具有其可變區中之兩個識別位點)，各識別位點可特異性識別相同抗原上之相同抗原決定基，或不同抗原決定基，無論是否在相同或不同抗原上。多價可增加親和力，即，抗原結合臂或構築體與相關抗原或靶受體之間之結合強度。親和力係與抗原決定位與抗原結合單元上之其結合位點之間之親和力，及該抗原結合單元上存在之相關結合位點之實際數目二者相關。
於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者包含多價(例如，二價)抗體或抗原結合片段，其中該等價中之至少兩者特異性結合PD-1。於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者包含多價(例如，二價)抗體或抗原結合片段，其中該等價中之至少兩者特異性結合PD-1配位體(例如，PD-L1或PD-L2)。於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者包含多價(例如，二價)抗體或抗原結合片段，其中該等價中之至少兩者特異性結合PD-L1。於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者包含第一多價(例如，二價)抗體或抗原結合片段及第二多價(例如，二價)抗體或抗原結合片段，其中該第一多價抗體或抗原結合片段之價中之至少兩者特異性結合PD-1，且其中該第二多價抗體或抗原結合片段之價中之至少兩者特異性結合PD-L1。於一些實施例中，本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體中之任一者為四價構築體，其中該四價構築體包含第一二價抗體或抗原結合片段及第二二價抗體或抗原結合片段，其中該第一二價抗體或抗原結合片段之價均特異性針對PD-1上之相同抗原決定基，且其中該第二二價抗體或抗原結合片段之價均特異性針對PD-L1上之相同抗原決定基。於此等四價構築體之一些實施例中，該第一及第二二價抗體或其抗原結合片段或部分使用具有相同胺基酸序列之輕鏈。換言之，該四價構築體包含共同輕鏈。例如，具有SEQ ID NO: 101或SEQ ID NO: 103之序列之輕鏈。
於一些實施例中，該第一臂為PD-1之拮抗劑。於一些實施例中，該第二臂為PD-1配位體，例如，PD-L1及/或PD-L2之拮抗劑。於一些實施例中，該第一臂為PD-1之拮抗劑，且該第二臂為同源PD-1配位體-例如，PD-L1及/或PD-L2之拮抗劑。
當提及抗原結合臂之生物活性使用時，術語「拮抗劑」、「拮抗」及「抑制」指示抗原結合臂結合各自細胞上之其靶(例如，PD-1)及部分或完全阻斷、抑制及/或減少通過PD-1之生物反應。於一些實施例中，在拮抗劑之存在下以劑量依賴性方式觀察到抑制。於一些實施例中，量測之信號(例如，生物活性)係低於在可比較條件下利用陰性對照量測之信號至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。本文中亦揭示識別適用於本發明之方法之拮抗劑的方法。例如，此等方法包括(但不限於)諸如酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、FORTE BIO©系統及放射免疫檢定(RIA)之結合檢定。此等檢定測定拮抗劑結合所關注多肽(例如，PD-1或其配位體)之能力及因此指示該拮抗劑抑制、中和或阻斷所關注多肽之活性之能力。亦可使用功能檢定測定拮抗劑之功效，諸如拮抗劑抑制多肽之功能之能力。例如，功能檢定可包括使多肽與候選拮抗劑分子接觸及量測與該多肽正常相關聯之一或多種生物活性之可檢測的變化。拮抗劑之效能通常藉由其IC50 值(抑制促效劑反應之50%所需之濃度)定義。IC50 值越低，拮抗劑之效能越大及抑制最大生物反應所需之濃度越低。
於一些實施例中，至少一個抗原結合臂具有至少1 x 10-7 M、至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9 M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M、至少1 x 10-12 M或至少1 x 10-13 M之KD 。於一些實施例中，抗原結合臂二者均具有相同或相似KD 。如本文中所用，術語「KD 」 (M)係指特定抗原結合臂/抗原相互作用之解離平衡常數。KD = kd /ka 。如本文中所用，術語kd (sec-1 )係指特定抗原結合臂/抗原相互作用之解離速率常數。亦將此值稱作koff 值。如本文中所用，術語ka (M-1 x sec-1 )係指特定抗原結合臂/抗原相互作用之締合速率常數。亦將此值稱作kon 值。
於一些實施例中，多特異性抗原結合構築體之一臂(例如，第一臂)與其靶之結合不阻斷另一臂(例如，第二臂)與其靶之結合。於一些實施例中，一臂之結合不空間上阻礙第二臂結合其靶。例如，在第一臂結合至PD-1後，第二臂自由結合PD-1之配位體(例如，PD-L1及/或PD-L2)。因此，於一些實施例中，第一臂及第二臂結合至其各自靶及兩個臂保持同時結合。
於一些實施例中，第一臂及第二臂與其各自靶之結合將免疫細胞與第二細胞橋接在一起，使兩個細胞緊密靠近。如本文中所用，「橋接」係指接合兩種細胞類型(例如，表現PD-1之一種免疫細胞，及表現其配位體– PD-L1之第二細胞)，或使兩個細胞緊密靠近在一起；該等兩個細胞不必物理接觸。因此，該多特異性抗原結合構築體充當兩個細胞之連接體(例如，橋)，該等兩個細胞各者表現PD-1或其配位體。
用於測定兩個細胞是否藉由本發明之構築體橋接或連接在一起之方法係此項技術中已知。例如，於一些實施例中，免疫細胞及第二細胞之橋接係藉由例如流動式細胞測量術、FRET、免疫沉澱、顯微鏡或螢光板讀取器測定。
於一些實施例中，多特異性構築體之第一臂及第二臂與其各自靶之結合導致胞外域之下調及/或脫落及/或靶(例如，PD-1)之降解。如本文中所用，「下調」係指一過程，藉由該過程細胞減少細胞組分(諸如RNA或蛋白)之數量。於細胞表面蛋白質受體之情況下，下調可通過由於結合至配位體或本文中所述構築體中之任一者之受體之內部化產生。脫落或胞外域脫落係指一種過程，藉由該過程細胞表面蛋白質經蛋白質水解裂解，導致其胞外域釋放至細胞外環境中。調節胞外域脫落之脫落酶之非限制性實例包括去整合素(disintegrin)及金屬蛋白酶(ADAM)家族之成員，諸如ADAM8、ADAM9、ADAM 10、ADAM12、ADAM15、ADAM 17及ADAM 28，及基質金屬蛋白酶(MMP)，諸如MMP2、MMP3、MMP7、MMP9及MMP14。據信，距質膜之距離及裂解位點區之結構比胞外域脫落中之特定序列更重要。蛋白質降解或蛋白質水解係指一組過程，該等過程導致蛋白質中之肽鍵中之一或多者通過稱作蛋白酶之蛋白質水解酵素之催化或非酶促(例如在極低或極高pH下)的水解。於真核細胞中，兩種主要路徑—泛素蛋白酶體路徑及溶酶體蛋白質水解—介導蛋白質降解。用於測定靶受體是否藉由本文中所揭示之多特異性構築體下調及/或脫落及/或降解之方法係此項技術中已知，且述於實例中，參見，例如，圖12A至12C；例如，流動式細胞測量術、西方墨點法、免疫沉澱、顯微鏡或螢光板讀取器。
如本文中所述，本發明之構築體可橋接表現PD-1之免疫細胞，及表現其配位體之第二細胞，諸如第二免疫細胞及/或癌症或腫瘤細胞。熟習此項技術者應知曉，免疫細胞之類型取決於待治療之疾病之背景；可根據在考量之病症容易確定免疫細胞之特定類型。於一些實施例中，該免疫細胞為T細胞，例如，調節性T細胞(亦稱作抑制T細胞)，包括CD8+ T細胞及CD4+ T細胞，及亞型，諸如CD4+ FOXP3+ Treg 細胞、CD4+ FOXP3- Treg 細胞、Tr1細胞、Th3細胞及Treg 17細胞。於一些實施例中，該免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。於一些實施例中，該免疫細胞為B細胞。於一些實施例中，該免疫細胞為巨噬細胞。
類似地，第二細胞之類型取決於在考量之病症。於一些實施例中，該第二細胞(表現PD-1配位體之細胞)為第二免疫細胞，例如，調節性免疫細胞。於一些實施例中，該調節性免疫細胞為調節性T細胞、B細胞、巨噬細胞、源自骨髓之抑制細胞、樹突狀細胞或間質基質細胞中之任一者或多者。於一些實施例中，該調節性免疫細胞為調節性T細胞，例如，CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。
於一些實施例中，該第二細胞為腫瘤細胞。如本文中所用，「腫瘤細胞」不但有時與「癌細胞」可交換使用，而且包含與正常細胞相比展示增加之增殖之非惡性(非癌)細胞。於一些實施例中，該腫瘤細胞為可藉由阻斷藉由免疫細胞表現之PD-1與在第二細胞上表現之其配位體(例如，PD-L1或PD-L2)之間之相互作用，同時橋接該免疫細胞及該腫瘤細胞來治療之癌症。於一些實施例中，該腫瘤細胞係選自由以下組成之群：血癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、神經癌、黑色素瘤、乳癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、胰癌、泌尿生殖器癌、骨癌、腎癌及血管癌。於一些實施例中，該腫瘤細胞係選自由以下組成之群：卡波西氏(Kaposi's)肉瘤、白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、髓母細胞前髓細胞髓單核細胞性單核細胞性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病、套細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt’s)淋巴瘤及邊緣區B細胞淋巴瘤、真性紅細胞增多淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏病、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom's)巨球蛋白血症、重鏈病、實體腫瘤、肉瘤及癌、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏(Ewing's)瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸肉瘤、結腸直腸癌、胰癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝瘤、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏(Wilm's)瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、鼻咽癌、食道癌(esophageal carcinoma)、基底細胞癌、膽道癌、膀胱癌、骨癌、腦及中樞神經系統(CNS)癌、子宮頸癌、絨膜癌、結腸直腸癌、結締組織癌、消化系統癌、子宮內膜癌、食道癌(esophageal cancer)、眼癌、頭頸癌、胃癌、上皮內腫瘤、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌(小細胞、大細胞)、黑色素瘤、神經母細胞瘤；口腔癌(例如唇、舌、口及咽)、卵巢癌、胰癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、直腸癌；呼吸系統癌、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌及泌尿系統癌。
如本文中所述，本發明之多特異性抗原結合構築體包含雙特異性、三特異性、四特異性或多特異性抗體(免疫球蛋白)或其抗原結合部分或片段。
術語「免疫球蛋白」係指一類結構上相關之蛋白質，其一般包含兩對多肽鏈：一對輕(L)鏈及一對重(H)鏈。於「完整免疫球蛋白」中，此等鏈中之所有四者藉由二硫鍵互相連接。已良好表徵免疫球蛋白之結構。參見，例如，Paul,Fundamental Immunology 第7版，第5章(2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA。簡言之，各重鏈通常包含重鏈可變區(VH )及重鏈恆定區(CH )。該重鏈恆定區通常包含三個域，CH1 、CH2 及CH3 。各輕鏈通常包含輕鏈可變區(VL )及輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區通常包含一個域，縮寫為CL 。本文中術語「免疫球蛋白」 (Ig)有時可與術語「抗體」交換使用。
術語「抗體」描述一種免疫球蛋白分子及本文中以其最廣泛意義使用。抗體特定言之包含完整抗體(例如，完整免疫球蛋白)，及抗體片段(諸如抗體之抗原結合片段)，如本文中所述。因此，「抗體」可係指完整抗體以及其抗原結合片段。抗體包含至少一個抗原結合域。抗原結合域之一個實例為由VH -VL 二聚體形成之抗原結合域。抗體可藉由其特異性結合之抗原描述。例如，PD-1抗體(或者稱作抗PD-1抗體)為特異性結合至抑制性受體PD-1之抗體。
可將VH 及VL 區進一步細分成散布更保留性區之高可變區(「高可變區(HVR)」；亦稱作「互補決定區」(CDR))。更保留性區被稱作框架區(FR)。各VH 及VL 一般包含以下列順序(自N端至C端)排列之三個CDR及四個FR：FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4。該等CDR涉及抗原結合，及賦予抗原特異性及抗體之結合親和力。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest 第5版(1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD，其全文係以引用的方式併入。
可基於恆定域之序列將來自脊椎動物物種之輕鏈分配至稱作κ及λ之兩種類型中之一者。
可將來自脊椎動物物種之重鏈分配至五種不同類別(或同種型)中之一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。亦將此等類別各自指定為α、δ、ε、γ及µ。根據序列及功能之差異將IgG及IgA類別進一步分成子類別。人類表現下列子類別：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
產生及篩選對抗所需靶之抗體之方法係此項技術中熟知。針對增強之性質(例如，增強之親和力、嵌合、人源化)進一步修飾抗體以及產生如本文中所述之抗原結合片段之方法亦此項技術中熟知。
術語「嵌合抗體」係指抗體，其中重鏈及/或輕鏈之組分係源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分係源自不同來源或物種。
非人類抗體之「人源化」形式為含有源自該非人類抗體之最小序列之嵌合抗體。人源化抗體一般為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自一或多個CDR之殘基經來自非人類抗體(供體抗體)之一或多個CDR之殘基取代。該供體抗體可為具有所需特異性、親和力或生物效應之任何適宜非人類抗體，諸如小鼠、大鼠、兔、雞或非人類靈長類動物抗體。於一些實例中，受體抗體之所選框架區殘基經來自供體抗體之對應框架區殘基取代。人源化抗體亦可包含於受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。可作出此等修飾以進一步精修抗體功能。進一步細節參見Jones等人，(1986)Nature , 321:522-525；Riechmann等人，(1988)Nature , 332:323-329；及Presta, (1992)Curr. Op. Struct. Biol. , 2:593-596，其各者之全文係以引用的方式併入。
「人類抗體」為具有對應於藉由人類或人類細胞產生或源自非人類來源之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者，該非人類來源利用人類抗體庫或人類抗體編碼序列(例如，獲自人類來源或重新設計)。人類抗體特定言之排除人源化抗體。
於一些實施例中，抗體分子包括雙體抗體及單鏈分子，以及抗體之抗原結合片段(例如，Fab、F(ab′)2 及Fv)。例如，抗體分子可包含重(H)鏈可變域序列(本文中縮寫為VH)，及輕(L)鏈可變域序列(本文中縮寫為VL)。於一些實施例中，抗體分子包含或由重鏈及輕鏈組成(稱作半抗體)。於另一實例中，抗體分子包含兩個重(H)鏈可變域序列及兩個輕(L)鏈可變域序列，從而形成兩個抗原結合位點，諸如Fab、Fab′、F(ab′)2 、Fc、Fd、Fd′、Fv、單鏈抗體(例如，scFv)、單可變域抗體、雙體抗體(Dab) (二價及雙特異性)及嵌合(例如，人源化)抗體，其可藉由修飾全抗體或使用重組DNA技術重新合成之彼等產生。此等功能抗體片段保留與其各自抗原選擇性結合之能力。抗體及抗體片段可係來自抗體之任何類別，包括(但不限於) IgG、IgA、IgM、IgD及IgE，及來自抗體之任何子類別(例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。抗體分子之製備可係單株或多株。抗體分子亦可為人類、人源化、CDR接枝或活體外產生之抗體。抗體可具有選自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區。抗體亦可具有選自例如κ或λ之輕鏈。於一些實施例中，抗體包含具有與SEQ ID NO: 64 (ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之IgG1重鏈恆定區。於一些實施例中，抗體包含具有與SEQ ID NO: 68 (ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之IgG4重鏈恆定區。於一些實施例中，抗體包含具有與SEQ ID NO: 69 (ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG)至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同之胺基酸序列之IgG4重鏈恆定區。
抗體分子之抗原結合部分或片段係此項技術中熟知，且包括例如：(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab′)2片段，包含在鉸鏈區處藉由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之VL及VH域組成之Fv片段，(v)雙體抗體(dAb)片段，其由VH域組成；(vi)駱駝科或駱駝化可變域；(vii)單鏈Fv (scFv)，參見，例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；及Huston等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；(viii)單域抗體。使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得此等抗體片段，及針對與完整抗體相同之方式之效用篩選該等片段。
抗體分子亦可為單域抗體。單域抗體可包括其互補決定區為單域多肽之部分之抗體。實例包括(但不限於)重鏈抗體、天然缺乏輕鏈之抗體、衍生自習知4-鏈抗體之單域抗體、經工程改造之抗體及除了衍生自抗體之彼等之單域支架。單域抗體可為此項技術中之任一者，或任何將來單域抗體。單域抗體可源自任何物種，包括(但不限於)小鼠、人類、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、兔及牛。根據本發明之另一態樣，單域抗體為稱作缺乏輕鏈之重鏈抗體之天然產生之單域抗體。例如，於WO 9404678中揭示單域抗體。出於清晰原因，本文中將源自天然缺乏輕鏈之重鏈抗體之此可變域稱作VHH或奈米抗體以將其區別於四鏈免疫球蛋白之習知VH。此VHH分子可係源自於駱駝科物種中(例如於駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝及原駝中)養育之抗體。除了駱駝科外之其他物種可產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體；此等VHH係於本發明之範圍內。
於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體包含雙特異性抗體。雙特異性抗體具有對不超過兩種抗原之特異性，但是可具有超過兩個結合位點，如本文中所述。雙特異性抗體分子特徵在於具有對第一抗原(例如，PD-1)結合特異性之第一免疫球蛋白可變域序列及具有對第二抗原(例如，PD-1配位體，諸如PD-L1配位體)結合特異性之第二免疫球蛋白可變域序列。於一些實施例中，雙特異性抗體分子包含具有對第一抗原結合特異性之scFv或其片段，及具有對第二抗原結合特異性之scFv或其片段。參見，例如，Kontermann & Brinkmann, (2015), Drug Discovery Today, 20(7):838-47，其全文係以引用的方式併入。
可用於產生本文中所述之多價及/或多特異性構築體，諸如不對稱及對稱架構二者之多價及/或多特異性抗體形式的各種形式及方法係此項技術中已知。此等形式之非限制性實例包括(i)少Fc之雙特異性抗體形式，諸如串聯單鏈可變片段(scFv2、taFv)及三抗體，包括雙特異性T細胞接合子(BiTE)及雙特異性殺手細胞接合子(BiKE)分子；包含單域抗體之雙特異性單域抗體融合蛋白，諸如VH或VL域、VHH、VNAR及奈米抗體；雙體抗體及雙體抗體衍生物，包括串聯雙體抗體及雙重親和力再靶向(DART)蛋白質；Fab融合蛋白；及其他少Fc融合蛋白，通過使用異二聚肽或來自各種蛋白質之微抗體，例如，具有螺旋線圈結構之白胺酸拉鍊；(ii)具有不對稱架構之雙特異性IgG，諸如具有來自兩個不同抗體之重鏈及輕鏈之不對稱IgG；具有不對稱Fc區之雙特異性IgG，其使用隆突入穴方法，靜電相互作用(轉向)以避免CH3域之同源二聚化，藉由引入電荷對至IgG1及IgG2之鉸鏈區之較佳重鏈異二聚化，經股交換工程改造之域(SEED)異二聚體及基於T細胞受體(BEAT)技術藉由抗體之雙特異性接合；不對稱Fc及CH3融合蛋白；(iii)具有對稱架構之雙特異性抗體，諸如藉由融合scFv、融合域抗體及支架蛋白、融合Fab臂及融合額外可變重鏈及輕鏈域之附加IgG；經修飾之IgG分子；對稱Fc-及CH3-基雙特異性抗體；及使用免疫球蛋白衍生之同源二聚域之雙特異性抗體。參見，例如，「The making of bispecific antibodies,」 Brinkmann及Kontermann，MABS 2017，第9卷：2，第182至212頁，其內容之全文係以引用的方式併入本文中。亦參見例如美國專利案第5,731,168號中所述之「隆突入穴」方法；如於例如WO 09/089004、WO 06/106905及WO 2010/129304中所述之靜電轉向Fc配對；如於例如WO 07/110205中所述之經股交換工程改造之域(SEED)異二聚體形成；如於例如WO 08/119353、WO 2011/131746及WO 2013/060867中所述之Fab臂交換；雙抗體結合物，例如，使用具有胺反應性基團及巰基反應性基團之異雙功能試劑藉由抗體交聯以產生雙特異性結構，如於例如美國專利案第4,433,059號中所述；藉由通過兩個重鏈之間之二硫鍵之還原及氧化循環重組來自不同抗體之半抗體(重-輕鏈對或Fab)產生的雙特異性抗體決定位(determinant)，如於例如美國專利案第4,444,878號中所述；三功能抗體，例如，通過巰基反應性基團交聯之三個Fab′片段，如於例如美國專利案第5,273,743號中所述；生物合成結合蛋白，例如，通過C-端尾，較佳地通過二硫鍵或胺反應性化學交聯而交聯之scFv對，如於例如美國專利案第5,534,254號中所述；雙功能抗體，例如，通過已取代恆定域之白胺酸拉鍊(例如，c-fos及c-jun)二聚之具有不同結合特異性的Fab片段，如於例如美國專利案第5,582,996號中所述；雙特異性及寡特異性單價及寡價受體，例如，通過一種抗體之CH1區與通常具有相關輕鏈之另一種抗體之VH區之間之多肽間隔子連接之兩種抗體(兩個Fab片段)的VH-CH1區，如於例如美國專利案第5,591,828號中所述；雙特異性DNA-抗體結合物，例如，抗體或Fab片段通過DNA之雙股片之交聯，如於例如美國專利案第5,635,602中所述；雙特異性融合蛋白，例如，含有兩個scFv與其間之親水性螺旋肽連接子及全恆定區之表現構築體，如於例如美國專利案第5,637,481號中所述；多價及多特異性結合蛋白，例如，具有Ig重鏈可變區之結合區之第一域及具有Ig輕鏈可變區之結合區之第二域之多肽的二聚體，一般稱作雙體抗體(亦包含針對雙特異性、三特異性或四特異性分子創建之更高階結構)，如於例如美國專利案第5,837,242號中所述；進一步與肽間隔子連接至抗體鉸鏈區及CH3區之具有經連接之VL及VH鏈的微抗體構築體，其可經二聚化以形成雙特異性/多價分子，如於例如美國專利案第5,837,821號中所述；與短肽連接子(例如，5或10個胺基酸)或根本無連接子以任何方向連接之VH及VL域，其可形成形成雙特異性雙體抗體之二聚體、三聚體及四聚體，如於例如美國專利案第5,844,094號中所述；進一步與VL域締合以形成一系列FV (或scFv)之在C端具有可交聯基團之藉由肽鏈連接之VH域(或家族成員中之VL域)串，如於例如美國專利案第5,864,019號中所述；及通過肽連接子連接之具有VH及VL域二者之單鏈結合多肽通過非共價或化學交聯組合至多價結構以形成例如使用scFV或雙體抗體型形式二者之同源二價、異源二價、三價及四價結構，如於例如美國專利案第5,869,620號中所述。額外示例性多特異性及雙特異性分子及製備其之方法見於例如美國專利案第5,910,573號、美國專利案第5,932,448號、美國專利案第5,959,083號、美國專利案第5,989,830號、美國專利案第6,005,079號、美國專利案第6,239,259號、美國專利案第6,294,353號、美國專利案第6,333,396號、美國專利案第6,476,198號、美國專利案第6,511,663號、美國專利案第6,670,453號、美國專利案第6,743,896號、美國專利案第6,809,185號、美國專利案第6,833,441號、美國專利案第7,129,330號、美國專利案第7,183,076號、美國專利案第7,521,056號、美國專利案第7,527,787號、美國專利案第7,534,866號、美國專利案第7,612,181、US2002004587A1、US2002076406A1、US2002103345A1、US2003207346A1、US2003211078A1、US2004219643A1、US2004220388A1、US2004242847A1、US2005003403A1、US2005004352A1、US2005069552A1、US2005079170A1、US2005100543A1、US2005136049A1、US2005136051A1、US2005163782A1、US2005266425A1、US2006083747A1、US2006120960A1、US2006204493A1、US2006263367A1、US2007004909A1、US2007087381A1、US2007128150A1、US2007141049A1、US2007154901A1、US2007274985A1、US2008050370A1、US2008069820A1、US2008152645A1、US2008171855A1、US2008241884A1、US2008254512A1、US2008260738A1、US2009130106A1、US2009148905A1、US2009155275A1、US2009162359A1、US2009162360A1、US2009175851A1、US2009175867A1、US2009232811A1、US2009234105A1、US2009263392A1、US2009274649A1、EP346087A2、WO0006605A2、WO02072635A2、WO04081051A1、WO06020258A2、WO2007044887A2、WO2007095338A2、WO2007137760A2、WO2008119353A1、WO2009021754A2、WO2009068630A1、WO9103493A1、WO9323537A1、WO9409131A1、WO9412625A2、WO9509917A1、WO9637621A2、WO9964460A1中。上述申請案之內容之全文係以引用的方式併入本文中。
於一些實施例中，本發明之多特異性抗原結合構築體為雙特異性抗體。根據本發明之雙特異性抗體可對抗PD-1及PD-L1或對抗PD-1及PD-L2產生。該雙特異性抗體之抗體臂可藉由標準技術產生，如本文中所揭示。於一些實施例中，對抗PD-1及其配位體之任何已知抗體可用於產生根據本發明之雙特異性抗體。例如，本文中已例示此等雙特異性構築體(參見，例如，圖3中派姆單抗(PD-1抗體)與阿特珠單抗(PD-L1抗體)接合；圖4中納武單抗(PD-1抗體)與阿特珠單抗(PD-L1抗體)接合)。如本文中所例示，可使用此項技術中已知及/或可得抗體產生本文中所述之多特異性抗原結合構築體(例如，雙特異性抗體)。
於一些實施例中，該雙特異性抗體係二價，例如，一臂針對PD-1係單價，而另一臂針對PD-L1或PD-L2或二者係單價，–例如，與兩種配位體交叉反應)。於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，諸如本文中所述之新穎雙特異性體3及雙特異性體4抗體。例如，如圖3中所說明，派姆單抗結合臂針對PD-1係二價，各結合PD-1上之相同抗原決定基，而阿特珠單抗結合臂針對PD-L1係二價，各結合PD-L1上之相同抗原決定基。此亦可見於例如圖8中之雙特異性形式(圖8中呈現之工作流程之步驟2之左圖中所說明的示例性共同輕鏈雙特異性)。圖8中之示例性共同輕鏈雙特異性形式(工作流程之步驟2之右圖中所說明的形式)表示四價雙特異性形式之另一實例。與四價雙特異性形式(其中第一抗原結合臂係接合至Fc區之相對端上之第二抗原結合臂)相比，此處第一抗原結合臂之各Fab係接合至第二抗原結合臂之各Fab。例如，使用連接子將第一抗原結合臂之一個Fab連接至第二抗原結合臂之Fab，其中各抗原結合臂共用一個共同輕鏈。參見，圖8，工作流程之步驟2之右圖中所說明之形式。
於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，其中一臂針對PD-1係二價，各結合PD-1上之兩個不同抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，其中一臂針對PD-1之配位體(PD-L1及/或PD-L2)係二價，各結合PD-1之配位體上之兩個不同抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，其中一臂針對PD-1係二價，各結合PD-1上之兩個不同但是重疊抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，其中一臂針對PD-1配位體(PD-L1及/或PD-L2)係二價，各結合PD-1配位體(PD-L1及/或PD-L2)上之兩個不同但是重疊抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，其中一臂針對PD-1係二價且各結合PD-1上之相同抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，其中一臂針對PD-1配位體(PD-L1及/或PD-L2)係二價，且各結合PD-1配位體(PD-L1及/或PD-L2)上之相同抗原決定基。於一些實施例中，該雙特異性抗體係四價，其中一臂針對PD-1上之相同抗原決定基係二價；及另一臂針對PD-1配位體(PD-L1及/或PD-L2)上之相同抗原決定基係二價。
於一些實施例中，該雙特異性抗體為PD-1及PD-L1二者之拮抗劑。於一些實施例中，該雙特異性抗體為PD-1及PD-L2二者之拮抗劑。於一些實施例中，該雙特異性抗體為PD-1及配位體PD/L1及PD-L2二者之拮抗劑(例如，與兩種配位體交叉反應)。
於某些實施例中，該第一抗原結合臂及第二抗原結合臂藉由至少一個胺基連接子胺基酸序列連接。視情況，該連接子胺基酸序列包含GGGGSx (SEQ ID NO: 121)，其中x為1至6之間及包含1至6之整數。
於一些實施例中，該多特異性抗原結合構築體不包含免疫球蛋白Fc域。
於一些實施例中，該構築體包含免疫球蛋白Fc域。於一些實施例中，該構築體之第一臂或第二臂或二者包含包含一或多個免疫球蛋白Fc修飾之重鏈。於一些實施例中，該重鏈之免疫球蛋白Fc域包含一或多個胺基酸突變，該等突變例如促進第一臂及第二臂之異二聚，促進血清半衰期，及/或修飾效應功能。於一些實施例中，該突變存在於重鏈之CH3域中。參見，例如，Xu等人，mAbs 7(1): 231-42, 2015。
雖然傳統Fc融合蛋白及抗體為非引導相互作用對之實例，已設計呈不對稱相互作用對之各種經工程改造之Fc域(Spiess等人，(2015) Molecular Immunology 67(2A): 95-106)以促進例如第一抗原結合臂及第二抗原結合臂之異二聚。增加單個細胞系中之含Fc多肽鏈之所需配對以以可接受產率產生較佳不對稱融合蛋白的各種方法係此項技術中已知[參見，例如，Klein等人(2012) mAbs 4:653-663；及Spiess等人(2015) Molecular Immunology 67(2PartA): 95-106]。獲得含Fc多肽之所需配對之方法包括(但不限於)基於電荷之配對(靜電轉向)、「隆突入穴」立體配對、SEEDbody配對及基於白胺酸拉鍊之配對。參見，例如，Ridgway等人(1996) Protein Eng 9:617-621；Merchant等人(1998) Nat Biotech 16:677-681；Davis等人(2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202；Gunasekaran等人(2010); 285:19637-19646；Wranik等人(2012) J Biol Chem 287:43331-43339；US5932448；WO 1993/011162；WO 2009/089004及WO 2011/034605。
例如，可促進特異性多肽之間之相互作用之一種方法為藉由將隆凸入腔(隆突入穴)互補區工程改造，諸如述於Arathoon等人，U.S.7,183,076；Carter等人，U.S.5,731,168；及Kumar等人，WO 2016/164089中，其全文係以引用的方式併入本文中。「隆凸」藉由用更大側鏈(例如，酪胺酸或色胺酸)取代來自第一多肽(例如，第一相互作用對)之介面之小胺基酸側鏈來構造。與隆凸相同或相似大小之互補「腔」視情況在第二多肽(例如，第二相互作用對)之介面上藉由用更小者(例如，丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈來創建。在適宜定位及定尺寸之隆凸或腔存在於第一多肽或第二多肽之介面之情況下，僅需分別將在相鄰介面之對應腔或隆凸工程改造。
在中性pH (7.0)下，天冬胺酸及麩胺酸係帶負電及離胺酸、精胺酸及組胺酸係帶正電。可使用此等帶電殘基促進異二聚體形成及同時阻止同型二聚體形成。吸引相互作用在相反電荷之間發生及排斥相互作用在相似電荷之間發生。部分地，本文中所揭示之蛋白質複合物利用用於促進異多聚體形成(例如，異二聚體形成)之吸引相互作用，及視情況用於阻止同型二聚體形成(例如，同型二聚體形成)之排斥相互作用進行帶電介面殘基之定點突變。
例如，IgG1 CH3域介面包含涉及域-域相互作用之四個獨特帶電殘基對：Asp356-Lys439’、Glu357-Lys370’、Lys392-Asp399’及Asp399-Lys409’ [第二鏈中之殘基編號藉由(’)指示]。應注意，本文中指定IgG1 CH3域中之殘基所用之編號方案與Kabat之EU編號方案一致。由於存在於CH3-CH3域相互作用中之2倍對稱，各獨特相互作用將在結構中表示兩次(例如，Asp-399-Lys409’及Lys409-Asp399’)。於野生型序列中，K409-D399’支持異二聚體及同型二聚體形成二者。於第一鏈中之轉換電荷極性之單一突變(例如，K409E；正電至負電)導致用於形成第一鏈同型二聚體之不利相互作用。由於相同電荷之間發生之排斥相互作用，不利相互作用產生(負-負；K409E-D399’及D399-K409E’)。於第二鏈中之轉換電荷極性之相似突變(D399K’；負至正)導致用於第二鏈同型二聚體形成之不利相互作用(K409’-D399K’及D399K-K409’)。但是，同時，此等兩種突變(K409E及D399K’)導致用於異二聚體形成之有利相互作用(K409E-D399K’及D399-K409’)。對異二聚體形成及同型二聚體阻止之靜電轉向作用可進一步藉由另外帶電殘基之突變增強，該等帶電殘基可或可不與第二鏈中之相反帶電殘基(包括例如Arg355及Lys360)配對。參見，例如，WO 2016/164089。
因此，於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合構築體(例如，雙特異性構築體)可包含免疫球蛋白之恆定域，包括例如，免疫球蛋白之Fc部分。例如，第一臂可包含源自IgG (IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA (IgAl或IgA2)、IgE或IgM免疫球蛋白之Fc域之胺基酸序列。視情況，第二臂可包含源自IgG (IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA (IgAl或IgA2)、IgE或IgM之Fc域之胺基酸序列。此等免疫球蛋白域可包含促進異二聚體形成之一或多個胺基酸修飾(例如，缺失、添加及/或取代)。於一些實施例中，多特異性抗原結合構築體為IgG1同種型。於一些實施例中，多特異性抗原結合構築體為IgG1同種型且包含取代。於一些實施例中，多特異性抗原結合構築體為IgG2同種型。於一些實施例中，多特異性抗原結合構築體為IgG3同種型。於一些實施例中，多特異性抗原結合構築體為IgG4同種型。於一些實施例中，多特異性抗原結合構築體為IgG4同種型且包含取代。於一些實施例中，當根據EU編號編號時，該取代係在Ser228處。於一些實施例中，該Ser228處之取代為S228P。於一些實施例中，第一臂及第二臂包含源自相同免疫球蛋白類別及亞型之Fc域。於一些實施例中，第一臂及第二臂包含源自不同免疫球蛋白類別或亞型之Fc域。類似地，第一臂及/或第二臂(例如，不對稱對或非引導相互作用對)包含免疫球蛋白之經修飾之恆定域，包括例如，促進異二聚體形成之一或多個胺基酸修飾(例如，缺失、添加及/或取代)。產生具有所需異二聚體形成之Fc修飾之方法係此項技術中已知。
於一些實施例中，該Fc域可經修飾以增加本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體之血清半衰期。包含例如在酸性pH下與中性pH相比增強或減少與Fc受體之抗體結合之一或多個突變的Fc域係此項技術中已知。例如，本文中所揭示之構築體可包含Fc域之CH 2或CH 3區中之突變，其中該(該等)突變增加Fc域與FcRn在酸性環境中(例如，於核內體中，其中pH範圍自約5.5至約6.0)之親和力。當向動物投與時，此等突變可導致構築體之血清半衰期之增加。針對所需特徵(諸如增加之血清半衰期)修飾Fc域之方法係此項技術中已知。
於一些實施例中，本文中所述之構築體包含經改變之重鏈恆定區，其相對於其對應未經改變之恆定區具有減少之(或無)效應功能。涉及本文中所述構築體之恆定區之效應功能可藉由改變該恆定區或Fc區之性質來調節。經改變之效應功能包括例如下列活性中之一或多者之調節：抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、細胞凋亡、結合至一或多個Fc-受體及促發炎反應。調節係指藉由含有經改變之恆定區之個體抗體展示之效應功能活性與該恆定區之未經改變形式之活性相比的增加、減少或消除。於特定實施例中，調節包括活性經廢除或完全不存在的情況。
具有經改變之FcR結合親和力及/或ADCC活性及/或經改變之CDC活性之經改變的恆定區為與該恆定區之未經改變形式相比具有增強或減少之FcR結合活性及/或ADCC活性及/或CDC活性的多肽。顯示與FcR增加之結合之經改變的恆定區結合至少一個FcR，較未經改變之多肽具有更大親和力。顯示與FcR減少之結合之經改變的恆定區結合至少一個FcR，較該恆定區之未經改變形式具有更低親和力。顯示與FcR減少之結合之此等變異體可具有與天然序列免疫球蛋白恆定區或Fc區與FcR之結合水平相比與FcR很少或無可觀結合，例如，與FcR結合之0至50% (例如，小於50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1%)。類似地，顯示經調節之ADCC及/或CDC活性之經改變之恆定區可展示與未經改變之恆定區相比增加或減少之ADCC及/或CDC活性。例如，於一些實施例中，包含經改變之恆定區之本文中所述抗體中之任一者或多者可展示該恆定區之未經改變形式之ADCC及/或CDC活性的約0至50% (例如，小於50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1%)。包含顯示降低之ADCC及/或CDC之經改變之恆定區之本文中所述的多特異性抗原結合構築體可展示降低之或無ADCC及/或CDC活性。
於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合構築體展示減少之或無效應功能。於一些實施例中，該等多特異性抗原結合構築體包含雜合恆定區或其部分，諸如G2/G4雜合恆定區(參見，例如，Burton等人(1992)Adv Immun 51:1-18；Canfield等人(1991)J Exp Med 173:1483-1491；及Mueller等人(1997)Mol Immunol 34(6):441-452)。
於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合構築體可含有展示增強或降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)之經改變的恆定區。經調節之CDC活性可藉由於抗體之Fc區中引入一或多個胺基酸取代、插入或缺失來達成。參見，例如，美國專利案第6,194,551號。
本文中所述之構築體及抗原結合臂可部分包含支架域、蛋白質或部分，例如，不提供靶受體結合活性，但是可提供構築體之部分或域之分子，該構築體之部分或域提供空間組織、結構支援、連接多種受體結合單元之裝置或其他所需特性(例如，提高之半衰期)。各種支架技術及組合物係此項技術中已知且可容易連接或結合至本文中所述之抗原結合單元。該支架域、蛋白質或部分可源自抗體或不源自抗體。此等支架蛋白及其域一般通過先前存在之抗原結合蛋白之基於組合化學之改編獲得。
可認為非抗體蛋白支架分成兩種結構類別，域大小構築體(於6至20 kDa之範圍內)及限制肽(於2至4 kDa範圍內)。域大小非抗體支架包括(但不限於) 親合體、人泛素、抗運載蛋白(anticalin)、atrimer、DARPin、FN3支架(諸如黏附素及centyrin)、fynomer、Kunitz域、pronectin及OBody。肽大小非抗體支架包括例如艾菲爾親和聚體(avimer)、雙環肽及半胱胺酸結。此等非抗體支架及基於其或衍生其之基礎蛋白或肽藉由例如Simeon及Chen，Protein Cell 9(1): 3-14 (2018)；Vazquez-Lombardi等人，Drug Discovery Today 20: 1271-1283 (2015)，及藉由Binz等人，Nature Biotechnol. 23: 1257-1268 (2005) (其各者之內容之全文係以引用的方式併入本文中)評論。使用非抗體支架之優點包括增加之親和力、靶中和及穩定性。各種非抗體支架亦可克服抗體支架之一些限制，例如，就組織滲透、更小尺寸及熱穩定性而言。當期望雙特異性構築體時，一些非抗體支架亦可允許更容易構建，不被例如輕鏈相關問題阻止。在非抗體支架上構建構築體之方法為一般技術者已知。雖然不正式在抗體支架上，此等構築體經常包含抗體結合域，無論是否呈單域抗體、scFv或提供特異性靶結合能力之其他抗體結合域變異體之形式。
因此，於本文中所述態樣中之任一者之一些實施例中，構築體可包含非抗體支架蛋白。於本文中所述態樣中之任一者之一些實施例中，受體結合單元中之至少一者可包含非抗體支架蛋白。熟習此項技術者應瞭解於一些實施例中，非抗體支架蛋白之支架部分可包含例如源自人類第十纖維連接蛋白III型域(10Fn3)之黏附素支架或部分；源自人類脂質運載蛋白之抗運載蛋白支架(例如，諸如述於例如WO2015/104406中之彼等)；源自低密度相關蛋白(LRP)及/或極低密度脂蛋白受體(VLDLR)之A域之艾菲爾親和聚體支架或蛋白質片段；FYN酪胺酸激酶之SH3域之fynomer支架或部分；Kunitz型蛋白酶抑制劑，諸如人類胰蛋白酶抑制劑、抑肽酶(牛胰腺胰蛋白酶抑制劑)、阿茲海默氏(Alzheimer’s)澱粉樣前驅蛋白及組織因子路徑抑制劑之kunitz域支架或部分；打結素支架(半胱胺酸結微蛋白)，諸如基於來自噴瓜(E. elaterium )之胰蛋白酶抑制劑者；金黃色葡萄球菌(S. aureus )蛋白A之Z域之親合體支架或所有或部分；β-髮夾模擬支架；經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)支架或基於錨蛋白重複(AR)蛋白之人工蛋白支架；或源自或基於人類鐵傳遞蛋白、人類CTLA-4、人類晶狀體球蛋白及人類泛素之任何支架。例如，可使人類鐵傳遞蛋白或人類鐵傳遞蛋白受體之結合位點多樣化以創建鐵傳遞蛋白變異體之不同庫，該等變異體中之一些已獲得對不同抗原之親和力。參見，例如，Ali等人(1999)J. Biol. Chem. 274:24066-24073。未參與結合受體之人類鐵傳遞蛋白之部分保持不帶電及用作支架，類似抗體之框架區，以呈現不同結合位點。然後篩選庫，及根據本文中所述之方法，抗體庫係對抗所關注之靶抗原以識別具有對該靶抗原之最佳選擇性及親和力之彼等變異體。參見，例如，Hey等人(2005)TRENDS Biotechnol. 23(10):514-522。
D.用於產生多特異性抗原結合構築體之方法
本發明亦特徵為用於產生本文中所述之多特異性抗原結合構築體中之任一者的方法。於一些實施例中，用於產生本發明之構築體之方法包括用於製備如本文中所述之抗體及/或其片段之方法。此等方法係此項技術中熟知且包括例如將個體(例如，非人類哺乳動物)用適宜免疫原免疫。例如，為產生結合至PD-1之抗體，熟習技工可將適宜個體(例如，非人類哺乳動物，諸如大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、狗、貓、豬、山羊、馬或非人類靈長類動物)用全長PD-1多肽，諸如包含SEQ ID NO.: 114 (GenBank寄存編號NP_005009.2；UniProt Q15116)中所述之胺基酸序列之全長人類PD-1多肽、其抗原片段及/或其變異體免疫。類似地，為產生結合至PD-1配位體(例如，PD-L1)之抗體，熟習技工可將適宜個體用全長PD-L1多肽，諸如包含SEQ ID NO.: 115 (GenBank寄存編號NP 054862.1，UniProt Q9NZQ7)中所述之胺基酸序列之全長人類PD-L1多肽、其抗原片段及/或其變異體免疫。類似地，為產生結合至PD-L2之抗體，熟習技工可將適宜個體用全長PD-L2多肽，諸如包含SEQ ID NO.: 116 (GenBank寄存編號NP_079515.2，UniProt Q9BQ51)中所述之胺基酸序列之全長人類PD-L2多肽、其抗原片段及/或其變異體免疫。
熟習此項技術者將知曉，全長多肽(PD-1、PD-L1或PD-L2)可用作抗原及可針對所需結合性質(例如，阻斷PD-1/配位體相互作用；橋接表現PD-1及其配位體之細胞之能力)篩選抗體。熟習此項技術者亦將知曉可基於多肽之已知結構特徵選擇多肽(PD-1、PD-L1或PD-L2)之抗原片段。例如，已結構上良好表徵PD-1/PD-L1及PD-1/PD-L2相互作用(參見，例如，Zak, K.等人(2015) Structure 23(12):2341-48；Ghiotto, M.等人(2010) Int’l Immuno. 22(8):651-60；Freeman, G. (2008) PNAS 105(30):10275-76；Lazar-Molnar, E.等人(2008) PNAS 105:10483-88，其全文係以引用的方式併入)。因此，例如基於此項技術中可得之受體/配位體介面資訊之PD-1、PD-L1及/或PD-L2內之區可用於設計具有所需結合性質之適宜抗原片段。例如，PD-1胞外域含有典型CD28家族之單一IgV域，其中PD-L1及PD-L2由典型B7家族之IgV及IgC域組成。PD-1、PD-L1及/或PD-L2之結構顯示1:1化學計量，主要在IgV域之面之間相互作用。IgV域包含約120個胺基酸，該等胺基酸經組織成9個平行β股(ABCC’C”DEFG)與連接該等股之環。已顯示PD-1使用前β面(GFCC’股及CC’、CC”及FG環)結合至PD-L1之β面(GFCC’)或PD-L2之β面(AGFC股及FG環)。此外，PD-1之C、F及G股之六個胺基酸形成凹的疏水核，該核與F及G股以及PD-L2之FG環相互作用。涉及結合至PD-1之14個殘基中之八者係相同或在PD-L1與PD-L2之間高度保留。使用此資訊，熟習此項技術者可確定產生具有所需性質之抗體之適宜抗原區。例如，熟習此項技術者可產生與配位體PD-L1及PD-L2二者交叉反應之抗體(參見，例如，美國專利9845356)。
可將適宜個體(例如，非人類哺乳動物)用適宜抗原免疫連同隨後加強免疫許多次足以引起藉由該哺乳動物產生抗體。可向個體(例如，非人類哺乳動物)投與免疫原與佐劑。可用於於個體中產生抗體之佐劑包括(但不限於)蛋白質佐劑；細菌佐劑，例如，全菌(BCG、短小棒桿菌(Corynebacterium parvum )或明尼蘇達沙門氏菌(Salmonella minnesota ))及包含細胞壁骨架、海藻糖二黴菌酸酯、單磷醯基脂質A、結核菌(tuberclebacillus )之甲醇可提取殘餘物(MER)、完全或不完全弗氏(Freund’s)佐劑之細菌組分；病毒佐劑；化學佐劑，例如，氫氧化鋁及碘乙酸鹽及半琥珀酸膽固醇酯。可用於誘導免疫反應之方法中之其他佐劑包括例如霍亂毒素及副痘病毒蛋白質。亦參見Bieg等人(1999) Autoimmunity 31(1):15-24。亦參見例如Lodmell等人(2000) Vaccine 18:1059-1066；Johnson等人(1999) J Med Chem 42:4640-4649；Baldridge等人(1999) Methods 19:103-107；及Gupta等人(1995) Vaccine 13(14): 1263-1276。
於一些實施例中，該等方法包括製備分泌結合至免疫原之單株抗體之雜交瘤細胞系。例如，將適宜哺乳動物(諸如實驗室小鼠)用如上所述之多肽(例如，PD-1、PD-L1、PD-L2)或抗原片段免疫。可於免疫原之至少一個加強免疫2至4天後將經免疫哺乳動物之抗體產生細胞(例如，脾之B細胞)單離及然後於培養物中短暫生長，之後與適宜骨髓瘤細胞系之細胞融合。可在融合促進劑(諸如例如，牛痘病毒或聚乙二醇)之存在下將細胞融合。將融合中獲得之雜交細胞選殖，及選擇分泌所需抗體之細胞純系。例如，可將利用適宜免疫原免疫之Balb/c小鼠之脾細胞與骨髓瘤細胞系PAI或骨髓瘤細胞系Sp2/0-Ag 14之細胞融合。於融合後，將細胞於補充有選擇介質(例如HAT介質)之適宜培養基中以規則間隔擴增以防止正常骨髓瘤細胞長得超過所需雜交瘤細胞。然後篩選獲得之雜交瘤細胞用於分泌所需抗體(例如，結合至PD-1之抗體)。
於一些實施例中，熟習技工可自非免疫偏向庫識別抗PD-1抗體，如於例如美國專利案第6,300,064號(頒與Knappik等人；Morphosys AG)及Schoonbroodt等人(2005)Nucleic Acids Res 33(9) :e81中所述。
於一些實施例中，本文中所述之方法可涉及或用於與例如噬菌體呈現技術、細菌呈現、酵母表面呈現、真核病毒呈現、哺乳動物細胞呈現及無細胞(例如，核糖體呈現)抗體篩選技術聯合(參見，例如，Etz等人(2001) J Bacteriol 183:6924-6935；Cornelis (2000)Curr Opin Biotechnol 11:450-454；Klemm等人(2000)Microbiology 146:3025-3032；Kieke等人(1997)Protein Eng 10:1303-1310；Yeung等人 (2002)Biotechnol Prog 18:212-220；Boder等人(2000)Methods Enzymology 328:430-444；Grabherr等人(2001)Comb Chem High Throughput Screen 4:185-192；Michael等人(1995)Gene Ther 2:660-668；Pereboev等人(2001)J Virol 75:7107-7113；Schaffitzel等人(1999)J Immunol Methods 231:119-135；及Hanes等人(2000)Nat Biotechnol 18:1287-1292)。
使用各種噬菌體呈現方法識別抗體之方法係此項技術中已知。於噬菌體呈現方法中，功能抗體域係在攜帶編碼其之多核苷酸序列之噬菌體粒子的表面上呈現。可利用此噬菌體呈現抗體之抗原結合域，諸如自庫或組合抗體庫(例如，人類或鼠科)表現之Fab、Fv或經二硫鍵穩定之Fv抗體片段。此等方法中使用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，諸如fd及M13。抗原結合域經表現為噬菌體外殼蛋白pIII、pVIII或pIX中之任一者之重組融合蛋白。參見，例如，Shi等人(2010)JMB 397:385-396。可用於製備本文中所述之免疫球蛋白或其片段之噬菌體呈現方法的實例包括揭示於以下之彼等：Brinkman等人(1995)J Immunol Methods 182:41-50；Ames等人(1995)J Immunol Methods 184:177-186；Kettleborough等人(1994)Eur J Immunol 24:952-958；Persic等人(1997)Gene 187:9-18；Burton等人(1994)Advances in Immunology 57:191-280；及PCT公開案編號WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982及WO 95/20401。適宜方法亦述於例如美國專利案第5,698,426號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,750,753號、第5,821,047號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,516,637號、第5,780,225號、第5,658,727號、第5,733,743及第5,969,108號中。
於一些實施例中，可使用自經免疫哺乳動物之B細胞收集之mRNA產生噬菌體呈現抗體庫。例如，可將包含B細胞之脾細胞樣品自如上所述之用PD-1多肽免疫之小鼠單離。可將mRNA自細胞單離及使用標準分子生物技術轉化成cDNA。參見，例如，Sambrook等人(1989) 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版」 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Harlow及Lane (1988)，見上；Benny K. C. Lo (2004)，見上；及Borrebaek (1995)，見上。編碼免疫球蛋白之重鏈及輕鏈多肽之可變區之cDNA係用於構建噬菌體呈現庫。產生此庫之方法述於例如Merz等人(1995)J Neurosci Methods 62(1-2):213-9；Di Niro等人(2005)Biochem J 388(Pt 3):889-894；及Engberg等人(1995)Methods Mol Biol 51:355-376中。
於一些實施例中，可採用選擇及篩選之組合來識別來自例如源自雜交瘤之抗體群體或噬菌體呈現抗體庫之所關注抗體。適宜方法係此項技術中已知且述於例如Hoogenboom (1997)Trends in Biotechnology 15:62-70；Brinkman等人(1995)，見上；Ames等人(1995)，見上；Kettleborough等人(1994)，見上；Persic等人(1997)，見上；及Burton等人(1994)，見上中。例如，使用標準分子生物技術產生各編碼噬菌體外殼蛋白(例如，M13噬菌體之pIII、pVIII或pIX)之融合蛋白之複數個噬菌粒載體及不同抗原結合區及然後引入細菌(例如，大腸桿菌(E. coli ))群體。於一些實施例中，噬菌體於細菌中之表現可需要使用輔助噬菌體。於一些實施例中，不需要輔助噬菌體(參見，例如，Chasteen等人，(2006)Nucleic Acids Res 34(21):e145)。回收自細菌產生之噬菌體及然後與例如結合至固體擔體(經固定)之靶抗原接觸。亦可使噬菌體與抗原於溶液中接觸，及隨後使複合物結合至固體擔體。
可使用此項技術中已知之任何基於免疫學或生物化學之方法表徵使用上述方法篩選之抗體之子群體的特異性及對特定抗原(例如，人類PD-1)的結合親和力。例如，可例如使用基於免疫學或生物化學之方法(諸如但不限於如上所述之ELISA檢定、SPR檢定、免疫沉澱檢定、親和力層析法及平衡透析)測定抗體與PD-1之特異性結合。可用於分析抗體之免疫特異性結合及交叉反應性之免疫檢定包括(但不限於)使用諸如以下之技術之競爭性及非競爭性檢定系統：西方墨點法、RIA、ELISA (酶聯免疫吸附檢定)、「夾心」免疫檢定、免疫沉澱檢定、免疫擴散檢定、凝集檢定、補體固定檢定、免疫放射測量檢定、螢光免疫檢定、及蛋白A免疫檢定。此等檢定係常規及此項技術中熟知。
應瞭解，上述方法亦可用於測定例如抗PD-1抗體是否不結合至全長人類PD-1及/或PD-1蛋白。
於選定之CDR胺基酸序列為短序列(例如，長度少於10至15個胺基酸)之實施例中，可如於例如Shiraishi等人(2007)Nucleic Acids Symposium Series 51(1) :129-130及美國專利案第6,995,259號中所述化學合成編碼該等CDR之核酸。針對編碼受體抗體之給定核酸序列，可使用標準分子生物技術將編碼該等CDR之核酸序列之區用經化學合成之核酸取代。可合成經化學合成之核酸之5’及3’端以包含用於將該等核酸選殖至編碼供體抗體之可變區之核酸的黏性端限制酶位點。或者，可使用此項技術中已知之DNA組裝技術(例如，Gibson組裝)將一起能編碼抗體之經化學合成之核酸之片段接合在一起。
可進一步修飾選擇之任何抗體以產生如本文中所述之抗原結合片段，及/或使用此項技術中已知之技術操作以產生如文本中所述之多特異性抗原結合構築體。例如，可使用交聯方法以使用具有胺反應性基團及巰基反應性基團之異雙功能試劑產生雙特異性結構，如於例如美國專利案第4,433,059號中所述；可藉由通過兩條重鏈之間之二硫鍵之還原及氧化循環重組來自不同抗體之半抗體(重鏈-輕鏈對或Fab)產生雙特異性抗體決定位，如於例如美國專利案第4,444,878號中所述；三功能抗體，例如，可通過巰基反應性基團交聯三個Fab′片段，如於例如美國專利案第5,273,743號中所述。本文中描述產生雙特異性構築體之其他方法(例如，產生具有共同輕鏈之雙特異性構築體之方法)。本文中所述構築體中所用之共同輕鏈之胺基酸序列的非限制性實例包括SEQ ID NO: 59-63。
E.多特異性抗原結合構築體之表現及純化 可使用分子生物學及蛋白質化學技術中已知之各種技術產生本文中所述之其多特異性抗原結合構築體。例如，可將編碼多特異性抗原結合構築體(作為單一多功能多肽或作為多聚複合物之分離分子–例如，一個抗原結合臂與另一抗原結合臂分離)之核酸插入含有轉錄及轉譯調節序列之表現載體中，該等調節序列包括例如啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄開始及終止序列、轉譯開始及終止序列、轉錄終止信號、多腺苷酸化信號、及增強子或活化子序列。該等調節序列包含啟動子及轉錄開始及終止序列。此外，該表現載體可包含超過一個複製系統使得其可維持於兩種不同生物體中，例如於哺乳動物或昆蟲細胞中表現及於原核宿主中選殖及擴增。
若干可能載體系統可用於來自哺乳動物細胞之核酸之經選殖之重鏈及輕鏈多肽的表現。一類載體依賴於所需基因序列整合至宿主細胞基因組。已穩定整合DNA之細胞可藉由同時引入耐藥基因，諸如大腸桿菌gpt (Mulligan及Berg (1981)Proc Natl Acad Sci USA 78:2072)或Tn 5 neo (Southern及Berg (1982)Mol Appl Genet 1:327)來選擇。可將可選擇之標記基因連接至待表現之DNA基因序列，或藉由共轉染引入相同細胞(Wigler et al. (1979)Cell 16:77)。第二類載體利用對染色體外質粒賦予自主複製能力之DNA要素。此等載體可源自動物病毒，諸如牛乳頭瘤病毒(Sarver等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA , 79:7147)、巨細胞病毒、多瘤病毒(Deans等人(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:1292)或SV40病毒(Lusky及Botchan (1981)Nature 293:79)。
可以適用於核酸之隨後表現之方式將表現載體引入細胞。引入方法主要由以下討論之靶向細胞類型指示。示例性方法包括CaPO4 沉澱、脂質體融合、陽離子脂質體、電穿孔、病毒轉染、葡聚糖介導之轉染、聚凝胺(polybrene)介導之轉染、原生質體融合及直接顯微注射。
用於抗體或其抗原結合片段之表現之適宜宿主細胞包括酵母、細菌、昆蟲、植物及哺乳動物細胞。特別關注為細菌(諸如大腸桿菌)、真菌(諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )及畢赤酵母(Pichia pastoris ))、昆蟲細胞(諸如SF9)、哺乳動物細胞系(例如，人類細胞系)以及原代細胞系。
於一些實施例中，抗體或其片段可於轉殖基因動物(例如，轉殖基因哺乳動物)中表現及自轉殖基因動物純化。例如，抗體可於轉殖基因非人類哺乳動物(例如，齧齒動物)中產生及自乳單離，如於例如Houdebine (2002)Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629；van Kuik-Romeijn等人(2000)Transgenic Res 9(2):155-159；及Pollock等人(1999)J Immunol Methods 231(1-2):147-157中所述。
抗體及其片段可自細胞藉由在足以允許蛋白質表現之條件下培養用含有編碼該等抗體或片段之核酸之表現載體轉形的宿主細胞及持續一定量之時間產生。用於蛋白質表現之此等條件將隨著表現載體及宿主細胞之選擇變化，及將藉由熟習此項技術者通過常規實驗容易確定。例如，於大腸桿菌中表現之抗體可自內含體再折疊(參見，例如，Hou等人(1998)Cytokine 10:319-30)。細菌表現系統及其使用方法係此項技術中熟知(參見Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons，及Molecular Cloning--A Laboratory Manual –第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001))。密碼子、適宜表現載體及適宜宿主細胞之選擇將取決於許多因素變化，且可根據需要容易最佳化。本文中所述之抗體(或其片段)可於哺乳動物細胞中或於其他表現系統中表現，該等表現系統包括(但不限於)酵母、桿狀病毒及或活體外表現系統(參見，例如，Kaszubska等人(2000)Protein Expression and Purification 18 :213-220)。
於表現後，可單離抗體及其片段。抗體或其片段可以熟習此項技術者已知之各種方法依賴於樣品中存在之其他組分單離或純化。標準純化方法包括電泳、分子、免疫學及層析法技術(包括離子交換、疏水、親和及逆相HPLC層析法)。例如，可使用標準抗抗體管柱(例如，蛋白-A或蛋白-G管柱)純化抗體。超濾及滲濾技術與蛋白質濃度結合亦係有用。參見，例如，Scopes (1994) 「Protein Purification，第3版」，Springer-Verlag, New York City, New York。必要純化程度將取決於所需用途變化。於一些實例中，不純化表現之抗體或其片段將係必要。
測定經純化之抗體或其片段之產率或純度的方法係此項技術中已知且包括例如Bradford檢定、UV光譜法、縮二脲蛋白質檢定、Lowry蛋白質檢定、胺基黑蛋白質檢定、高壓液相層析法(HPLC)、質譜法(MS)及凝膠電泳法(例如，使用蛋白質染色，諸如考馬斯藍或膠體銀染色)。
F.多特異性抗原結合構築體之修飾 可將多特異性抗原結合構築體按照其表現及純化修飾為單個多功能多肽，或為多聚複合物之分離分子，例如，一個抗原結合臂與另一抗原結合臂分離。該等修飾可為共價或非共價修飾。可藉由例如使多肽之靶向胺基酸殘基與能與所選側鏈或末端殘基反應之有機衍生劑反應將此等修飾引入抗體或抗原結合片段中。可使用各種標準中之任一者選擇用於修飾之適宜位點，該標準包括例如抗體或片段之結構分析或胺基酸序列分析。
本文中所提供之胺基酸序列係以單字母胺基酸代碼闡述，該單字母胺基酸代碼可與三字母胺基酸代碼交換使用。胺基酸係指可併入肽、多肽或蛋白質之任何單體單元。20種天然或經遺傳編碼之α-胺基酸係如下：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩胺醯胺(Gln或Q)、麩胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、蛋胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)及纈胺酸(Val或V)。此等20種天然胺基酸之結構示於例如Stryer等人，Biochemistry ，第5版，Freeman and Company (2002)中。術語胺基酸亦包括非天然胺基酸、經修飾之胺基酸(例如，具有經修飾之側鏈及/或骨架)及胺基酸類似物。
於兩種或更多種核酸或多肽序列之情況下，術語相同或同一性百分比係指當在比較窗或指定區上針對最大對應度比較及比對時，相同或具有相同核苷酸或胺基酸殘基之指定百分比(例如，在指定區90%或95%或更大同一性)之兩種或更多種序列或子序列，如使用下列序列比較演算法中之一者或藉由手工比對及視覺檢查所量測。
將關於序列之同一性或相似性定義為於比對序列及引入空隙(若必要)以達成最大序列同一性%後與起始胺基酸殘基相同之候選序列中之胺基酸殘基(即，相同殘基)的百分比。用於比較之序列比對之方法係此項技術中熟知。用於比較之序列之最佳比對可例如藉由Smith及Waterman之局部同源性演算法(Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)，藉由Needleman及Wunsch之同源性比對演算法(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)，藉由Pearson及Lipman之搜索相似性方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)，藉由此等演算法之電腦實施(例如，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由手工比對及視覺檢查(參見，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995增刊))進行。
如同所有肽、多肽及蛋白質(包括其片段)，應瞭解，本文中所述之構築體、抗體或其抗原結合部分之胺基酸序列中(例如，於重鏈可變區及/或輕鏈可變區中)之另外修飾可發生，該等修飾不改變抗體或其抗原結合片段之性質或功能。此等修飾包括保留性胺基酸取代，使得各詳述之序列視情況含有一或多個保留性胺基酸取代。下列基團各含有彼此保留性取代之胺基酸。此等基團示例為其他保留性取代為熟習此項技術者已知。 1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)； 2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)； 3)天冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)； 4)精胺酸(R)、離胺酸(K)； 5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、蛋胺酸(M)、纈胺酸(V)； 6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)； 7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及 8)半胱胺酸(C)、蛋胺酸(M)
舉例而言，當提及特定殘基處之天冬胺酸時，亦涵蓋該殘基處之保留性取代，例如，麩胺酸。亦涵蓋非保留性取代，例如，用甘胺酸取代脯胺酸。
於一些實施例中，構築體、抗體或其抗原結合部分可結合至異源部分。該異源部分可為例如異源多肽、治療劑(例如，毒素或藥物)或可檢測標記，諸如(但不限於)放射性標籤、酶促標籤、螢光標籤、重金屬標籤、發光標籤或親和力標記(諸如生物素或鏈黴抗生物素)。適宜異源多肽包括例如用於純化抗體或片段之抗原標記(例如，FLAG (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 117)、聚組胺酸(6-His；HHHHHH (SEQ ID NO: 118))、血凝素(HA；YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 119))、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP))。異源多肽亦包括可用作診斷或可檢測標記物之多肽(例如，酵素)，例如，螢光素酶、螢光蛋白(例如，綠色螢光蛋白(GFP))或氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)。適宜放射性標籤包括例如32 P、33 P、14 C、125 I、131 I、35 S及3 H。適宜螢光標籤包括(不限於)螢光素、異硫氰酸螢光素(FITC)、綠色螢光蛋白(GFP)、DYLIGHT™ 488、藻紅蛋白(PE)、碘化丙啶(PI)、PerCP、PE-ALEXA FLUOR® 700、Cy5、別藻藍蛋白及Cy7。發光標籤包括例如各種發光鑭系(例如，銪或鋱)螯合物中之任一者。例如，適宜銪螯合物包括二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)或四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)之銪螯合物。酶促標籤包括例如鹼性磷酸酶、CAT、螢光素酶及辣根過氧化物酶。
可使用許多已知化學交聯劑中之任一者將兩種蛋白質(例如，抗體及異源部分)交聯。此等交聯劑之實例為經由鍵聯連接兩個胺基酸殘基之彼等，該鍵聯包括「受阻」二硫鍵。於此等鍵聯中，交聯單元內之二硫鍵經保護(藉由阻礙二硫鍵之任一側上之基團)免於藉由例如還原型谷胱甘肽或酶二硫還原酶之作用還原。一種適宜試劑，4-琥珀醯基氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫)甲苯(SMPT)利用蛋白質中之一者上之末端離胺酸及另一者上之末端半胱胺酸形成兩種蛋白質之間的此鍵聯。亦可使用藉由各蛋白質上之不同偶聯部分交聯之異雙功能試劑。其他有用交聯劑包括(不限於)連接兩個胺基之試劑(例如，N-5-疊氮基-2-硝基苯甲醯基氧基琥珀醯亞胺)、連接兩個巰基之試劑(例如，1,4-雙-馬來醯亞胺基丁烷)、連接胺基及巰基之試劑(例如，間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯)、連接胺基及羧基之試劑(例如，4-[對疊氮基水楊醯胺基]丁胺)及連接胺基及存在於精胺酸側鏈中之胍鎓基之試劑(例如，對疊氮基苯基乙二醛單水合物)。
於一些實施例中，可將放射性標籤直接結合至抗體之胺基酸骨架。或者，可包含放射性標籤作為更大分子之部分(例如，與游離胺基酸結合以形成相關蛋白質之間碘苯基(mIP)衍生物(參見，例如，Rogers等人(1997)J Nucl Med 38:1221-1229)或螯合物(例如，DOTA或DTPA))之間[125 I]碘苯基-N-羥基琥珀醯亞胺([125 I]mIPNHS)中的125 I)，其繼而結合至蛋白質骨架。將放射性標籤或含其之更大分子/螯合物結合至本文中所述之抗體或抗原結合片段之方法係此項技術者已知。此等方法涉及在促進放射性標籤或螯合物與蛋白質結合之條件(例如，pH、鹽濃度及/或溫度)下用放射性標籤培育蛋白質(參見，例如，美國專利案第6,001,329號)。
將螢光標籤(有時稱作「螢光團」)結合至蛋白質(例如，抗體)之方法係蛋白質化學技術中已知。例如，可使用附接至螢光團之琥珀醯基(NHS)酯或四氟苯基(TFP)酯部分將螢光團結合至蛋白質之游離胺基(例如，離胺酸之)或巰基(例如，半胱胺酸)。於一些實施例中，可將螢光團結合至異雙功能交聯劑部分，諸如磺基-SMCC。適宜結合方法涉及在促進螢光團與蛋白質結合之條件下用螢光團培育抗體蛋白或其片段。參見，例如，Welch及Redvanly (2003) 「Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry and Applications,」 John Wiley and Sons (ISBN 0471495603)。
於一些實施例中，可例如利用改良例如血液、血清或其他組織中循環之抗體之穩定化及/或滯留的部分修飾抗體或片段。例如，抗體或片段可經如於例如Lee等人(1999)Bioconjug Chem 10(6): 973-8；Kinstler等人(2002)Advanced Drug Deliveries Reviews 54:477-485；及Roberts等人(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476中所述之PEG化或HES化(Fresenius Kabi，德國；參見，例如，Pavisić等人(2010)Int J Pharm 387(1-2):110-119)。穩定部分可改良抗體(或片段)之穩定性或滯留至少1.5 (例如，至少2、5、10、15、20、25、30、40或50或更多)倍。
於一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合片段可經糖基化。於一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合片段可經歷酶促或化學處理，或自細胞產生使得抗體或片段具有減少之或不存在糖基化。產生具有減少之糖基化之抗體之方法係此項技術中已知且述於例如美國專利案第6,933,368號；Wright等人(1991)EMBO J 10(10):2717-2723；及Co等人(1993)Mol Immunol 30:1361中。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段係無糖基化。
G.醫藥組合物及調配物 本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之多特異性抗原結合構築體與與本文中所揭示之方法一起使用之醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。此等醫藥組合物可用於患有例如如本文中所揭示之癌症之個體中。
於某些實施例中，可接受之調配物較佳地係在採用之劑量及濃度下對接受者無毒。於某些實施例中，該(該等)調配物係用於皮下及/或靜脈內投與。於某些實施例中，該醫藥組合物可包含用於改性、維持或保存例如該組合物之pH、滲透壓、黏度、澄清、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透之調配物。於某些實施例中，適宜調配物包括(但不限於)胺基酸(諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；膨脹劑(諸如甘露醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如伸乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填料；單醣；二醣；及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽抗衡離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、噻汞撒、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己啶、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(諸如普朗尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、triton、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal)；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳地氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇、山梨醇)；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。(Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A. R. Gennaro編輯，Mack Publishing Company (1995))。於某些實施例中，該調配物包含PBS；20 mM NaOAC，pH 5.2，50 mM NaCl；及/或10 mM NAOAC，pH 5.2，9%蔗糖。於某些實施例中，最佳醫藥組合物將藉由熟習此項技術者根據例如意欲投與途徑、遞送形式及所需劑量確定。參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，見上。於某些實施例中，此等組合物可影響多特異性抗原結合構築體之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及/或活體內清除率。
於某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑可天然係水性或非水性。例如，於某些實施例中，適宜媒劑或載劑可為可補充有用於非經腸投與之組合物中常見之其他物質的注射用水、生理鹽水溶液或人工腦脊髓液。於某些實施例中，該鹽水包含等滲磷酸鹽緩衝鹽水。於某些實施例中，中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合之鹽水為另外示例性媒劑。因此於某些實施例中，醫藥組合物包含約pH 7.0至8.5之Tris緩衝液或約pH 4.0至5.5之乙酸鹽緩衝液，其可進一步包含山梨醇或適宜替代物。於某些實施例中，包含本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體之組合物可藉由將具有所需純度之所選組合物與視情況可選的調配劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，見上)混合呈凍乾餅或水溶液形式製備用於儲存。此外，於某些實施例中，可使用適宜賦形劑(諸如蔗糖)將包含本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體之組合物調配成凍乾物。
於某些實施例中，可選擇該醫藥組合物用於非經腸遞送。於某些實施例中，可選擇該等組合物用於吸入或用於通過消化道遞送，諸如經口。此等醫藥上可接受之組合物之製備係於熟習此項技術者之能力內。
於某些實施例中，調配組分以投與位點可接受之濃度存在。於某些實施例中，使用緩衝液將組合物維持在生理pH下或在稍微更低pH下，通常在約5至約8之pH範圍內。
於某些實施例中，當考慮非經腸投與時，治療組合物可呈無熱原非經腸可接受之水溶液之形式，其包含多特異性抗原結合構築體於醫藥上可接受之媒劑中。於某些實施例中，用於非經腸注射之媒劑為無菌蒸餾水，其中多特異性抗原結合構築體經調配成無菌等滲溶液及適當保存。於某些實施例中，製備可涉及所需分子與可提供產品之可控或持續釋放之藥劑，諸如可注射微球、可生物侵蝕之粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂質體之調配，然後該產品可經由積存注射遞送。於某些實施例中，亦可使用透明質酸且可具有促進循環中之持續時間之作用。於某些實施例中，可使用可移植藥物遞送裝置引入所需分子。
於某些實施例中，可調配醫藥組合物用於吸入。於某些實施例中，可將多特異性抗原結合構築體調配成乾粉用於吸入。於某些實施例中，可利用推進劑調配包含多特異性抗原結合構築體之吸入溶液用於噴霧遞送。於某些實施例中，可使溶液成霧狀。肺投與進一步述於PCT申請案編號PCT/US94/001875中，其描述經化學修飾之蛋白質之肺遞送。
於某些實施例中，期望調配物可經口投與。於某些實施例中，以此方式投與之多特異性抗原結合構築體可利用或不利用於諸如錠劑及膠囊之固體劑型之混合中習慣使用之彼等載劑調配。於某些實施例中，可設計當生物可利用率最大化及前全身降解最小化時使膠囊在胃腸道之點處釋放調配物之活性部分。於某些實施例中，可包含至少一種額外劑以促進多特異性抗原結合構築體之吸收。於某些實施例中，亦可採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
於某些實施例中，醫藥組合物可涉及有效量之多特異性抗原結合構築體與適用於製造錠劑之無毒賦形劑混合。於某些實施例中，藉由將錠劑溶解於無菌水或另一種適宜媒劑中，可呈單位劑型製備溶液。於某些實施例中，適宜賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
額外醫藥組合物將對熟習此項技術者明顯，其包含涉及持續或可控遞送調配物中之多特異性抗原結合構築體之調配物。於某些實施例中，用於調配各種其他持續或可控遞送裝置(諸如脂質體載體、可生物侵蝕之微粒或多孔珠及積存注射)之技術亦為熟習此項技術者已知。參見，例如，PCT申請案編號PCT/US93/00829，其描述用於遞送醫藥組合物之多孔聚合微粒之可控釋放。於某些實施例中，持續釋放製劑可包含呈成型物品(例如，膜或微膠囊)之形式之半滲透聚合物基質。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸(美國專利案第3,773,919號及EP 058,481)、L-麩胺酸及γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人Biopolymers, 22:547-556 (1983))、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯) (Langer等人，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及Langer, Chem. Tech., 12:98- 105 (1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，見上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。於某些實施例中，持續釋放組合物亦可包含脂質體，其可藉由此項技術中已知之若干方法中之任一者製備。參見，例如，Eppstein等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)；EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949。
用於活體內投與之醫藥組合物通常係無菌的。於某些實施例中，此可藉由通過無菌過濾膜過濾實現。於某些實施例中，在組合物經凍乾之情況下，可在凍乾及復原之前或之後進行使用此方法殺菌。於某些實施例中，用於非經腸投與之組合物可呈凍乾形式或呈溶液儲存。於某些實施例中，一般將非經腸組合物放入具有無菌存取埠之容器(例如，靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之瓶塞之小瓶)中。
於某些實施例中，一旦已調配醫藥組合物，可將其呈溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或呈脫水或凍乾粉末儲存於無菌小瓶中。於某些實施例中，此等調配物可呈即用形式或呈在投與之前復原之形式(例如，凍乾)儲存。
於某些實施例中，提供用於產生單一劑量投與單元之套組。於某些實施例中，該套組可包含具有乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。於某些實施例中，包含含有單室及多室預填充注射器(例如，液體注射器及凍乾劑注射器(lyosyringe))之套組。
於某些實施例中，治療上採用之有效量之包含多特異性抗原結合構築體之醫藥組合物將取決於例如治療環境及目標。熟習此項技術者將瞭解，根據某些實施例之治療之適宜劑量水平因此將部分取決於遞送之分子、使用多特異性抗原結合構築體之適應症、投與途徑及患者之尺寸(體重、體表或器官大小)及/或條件(年齡及一般健康)變化。於某些實施例中，臨床醫生可滴定劑量及修改投與途徑以獲得最佳治療效果。
於某些實施例中，給藥頻率將考慮所用之調配物中之多特異性抗原結合構築體之藥物動力學參數。於某些實施例中，臨床醫生將投與組合物直至達到達成所需效果之劑量。於某些實施例中，組合物因此可以單一劑量或以兩個或更多個劑量(其可或可不含有相同量之所需分子)隨時間，或以連續輸注經由移植裝置或導管投與。適宜劑量之另外精修由一般技術者常規作出及係於由該等一般技術者常規進行之任務之範圍內。於某些實施例中，適宜劑量可通過使用適宜劑量-回應數據確定。
於某些實施例中，醫藥組合物之投與途徑係符合已知方法，例如，經口，通過注射藉由靜脈內、腹膜內、大腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、皮下、眼內、動脈內、門靜脈內或病竈內途徑；藉由持續釋放系統或藉由移植裝置。於某些實施例中，組合物可藉由團式注射或藉由輸注連續投與或藉由移植裝置投與。於某些實施例中，組合療法之個別要素可藉由不同途徑投與。
於某些實施例中，組合物可經由膜、海綿狀物或另一適宜材料之移植局部投與，所需分子已經吸收或封裝在該材料上。於某些實施例中，在使用移植裝置之情況下，可將該裝置移植入任何適宜組織或器官，及所需分子之遞送可係經由擴散、定時釋放團塊或連續投與。於某些實施例中，可期望以離體方式使用包含多特異性抗原結合構築體之醫藥組合物。於此等實例中，將已自患者移除之細胞、組織及/或器官暴露於包含多特異性抗原結合構築體之醫藥組合物中，之後將該等細胞、組織及/或器官隨後移植回患者中。
於某些實施例中，多特異性抗原結合構築體可藉由移植某些細胞遞送，該等細胞已使用諸如本文中所述之彼等之方法遺傳工程改造以表現及分泌多肽。於某些實施例中，此等細胞可為動物或人類細胞，且可係自體同源、異源或異基因。於某些實施例中，可將該等細胞永生化。於某些實施例中，為減少免疫反應之機會，可將該等細胞封裝以避免周圍組織之浸潤。於某些實施例中，封裝材料通常為允許釋放蛋白質產物但是防止細胞藉由患者之免疫系統或藉由來自周圍組織之其他有害因素破壞的可生物降解半滲透聚合外殼或膜。
H.使用方法 如本文中所述，本發明提供一種治療有需要個體之增殖性病症之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之本發明之多特異性抗原結合構築體。於一些實施例中，本發明提供一種增強有需要個體之免疫反應(例如，增強之T細胞功能，諸如自T細胞功能耗盡營救；增強之T細胞介導之反應；增加之發炎性細胞激素分泌及/或產生，例如，自T細胞之IFNγ分泌及/或產生；增強之NK細胞功能；增強之巨噬細胞功能)之方法，其包括向該個體投與治療上有效量之本發明之多特異性抗原結合構築體。如本文中所例示，在投與本文中所揭示之多特異性抗原結合構築體後免疫反應之增強與結合PD-1或其配位體(例如PD-L1或PD-L2)之藥劑(例如抗體)，或包含結合PD-1之藥劑(例如抗體)及結合其配位體之藥劑(例如抗體)之混合物相比係更大。於一些實施例中，該免疫反應之增強(例如，增強之T細胞功能，諸如自T細胞功能耗盡營救；增強之T細胞介導之反應；增加之自T細胞之發炎性細胞激素IFNγ分泌及/或產生；增強之NK細胞功能；增強之巨噬細胞功能)與結合PD-1或其配位體之藥劑(例如抗體)，或包含結合PD-1之藥劑(例如抗體)及結合其配位體之藥劑(例如抗體)之混合物相比大至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%或更多。本文中亦提供藉由向個體投與有效量之如本文中所述之多特異性抗原結合構築體、抗體或其抗原結合片段、醫藥組合物或蛋白質結合物治療或延遲個體之癌症進展或減少或抑制個體之腫瘤生長的方法。
本文中所述之組合物尤其可用於治療或預防個體之各種癌症之方法中。
可使用各種方法向個體(例如，人類個體)投與組合物，該等方法部分取決於投與途徑。該途徑可為例如靜脈內注射或輸注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜內(IP)注射、肌肉內注射(IM)或鞘內注射(IT)。該注射可係以團式或連續輸注。
如本文中所用，術語「個體」意指哺乳動物個體。示例性個體包括(但不限於)人類、猴、狗、貓、小鼠、大鼠、牛、馬、駱駝、山羊及綿羊。於一些實施例中，該個體為人類。於一些實施例中，該個體患有或疑似患有可用本文中所提供之多特異性抗原結合構築體治療之疾病或病狀。於一些實施例中，該疾病或病狀為癌症。於一些實施例中，該個體為患有可用本文中所提供之多特異性抗原結合構築體治療之癌症之人類。於一些實施例中，該個體為疑似患有可用本文中所提供之多特異性抗原結合構築體治療之癌症之人類。
於一些實施例中，任何疾病或病症之「治療(treating/treatment)」係指改善存在於個體中之疾病或病症。於另一實施例中，「治療(treating/treatment)」包括改善至少一個物理參數，該參數可係藉由個體難以識別。於又一實施例中，「治療(treating/treatment)」包括身體上(例如，可識別症狀之穩定)或生理上(例如，物理參數之穩定)或二者調節疾病或病症。於又一實施例中，「治療(treating/treatment)」包括延遲或預防疾病或病症之發作。
如本文中所用，術語「治療上有效量」或「有效量」係指當向個體投與時，有效治療疾病或病症之多特異性抗原結合構築體之量。
如本文中所用，「投與(administer/administration)」係指注射或以其他方式物理遞送存在於身體外面之物質(例如，本文中所提供之多特異性抗原結合構築體)至患者的行為，諸如藉由黏膜、皮內、靜脈內、肌肉內遞送及/或本文中所述或此項技術中已知之物理遞送之任何其他方法。當治療疾病或其症狀時，物質之投與通常於該疾病或其症狀發作後發生。當預防疾病或其症狀時，物質之投與通常在該疾病或其症狀發作之前發生。
投與可藉由例如局部輸注、注射或藉助移植物達成。移植物可為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜，諸如矽橡膠膜或纖維。移植物可經構造用於將組合物持續或週期釋放至個體。參見，例如，美國專利申請公開案第20080241223號；美國專利案第5,501,856號、第4,863,457號及第3,710,795號；EP488401；及EP 430539，其各者之揭示內容之全文係以引用的方式併入本文中。可經由基於例如擴散、可侵蝕或對流系統(例如，滲透泵、可生物降解移植物、電擴散系統、電滲透系統、蒸汽壓力泵、電解泵、泡騰泵、壓電泵、基於侵蝕之系統或電機系統)之可移植裝置將組合物遞送至個體。
於一些實施例中，本發明之多特異性抗原結合構築體係經由局部投與治療上遞送至個體。
如本文中所用，術語「增強之T細胞功能」或「T細胞之活化」係指細胞過程，其中在其表面上表現抗原特異性T細胞受體之成熟T細胞識別其同源抗原及藉由進入細胞循環、分泌細胞激素或裂解酶及啟動或變得有能力進行基於細胞之效應功能來回應。T細胞活化需要至少兩個信號以被完全活化。第一個在藉由抗原主要組織相容性複合體(MHC)接合T細胞抗原特異性受體(TCR)後發生，及第二個藉由隨後接合共刺激分子(例如CD28)。此等信號經傳送至核及導致T細胞之純系擴增，細胞表面上之活化標記物之上調，分化成效應細胞，誘導細胞毒性或細胞激素分泌，誘導細胞凋亡，或其組合。於一些實施例中，「增強之T細胞功能」亦涵蓋增強之T細胞之生存率及/或增強之T細胞之增殖。量測此等活性之方法係常規及此項技術中已知。於一些實施例中，「增強之T細胞功能」亦涵蓋T細胞自耗盡之表現型之營救，使得達成一或多個T細胞功能之恢復或增加。如此項技術中所知，T細胞耗盡之狀態藉由T細胞效應功能之連續喪失，諸如除了共抑制受體之寬陣列之持續上調外之發炎性細胞激素產生、增殖能力、代謝適應性、及獨特轉錄及表觀遺傳特徵表徵。可使用此項技術中已知及本文中所述之技術(例如，活體外非特異性T細胞+ K562-PD-L1腫瘤靶細胞檢定)量測T細胞耗盡及其改變。
如本文中所用，術語T細胞介導之反應係指藉由T細胞，包括(但不限於)效應T細胞(例如CD8+ 細胞、效應γδ T細胞)及輔助T細胞(例如CD4+ 細胞，包括其子集，諸如TH 1、TH 2、TH 3、TH 17、TH 9及TFH 細胞)介導之任何反應。T細胞介導之反應包括例如T細胞細胞毒性、T細胞細胞激素分泌及增殖。本文中所述之抗體或其片段之適宜劑量(該劑量能治療或預防個體之癌症)可取決於各種因素，包括例如待治療之個體之年齡、性別及體重及所用之特定抑制劑化合物。例如，治療患有癌症之個體可需要整個多特異性抗原結合構築體與治療相同個體所需之多特異性抗原結合構築體之片段(例如Fab’抗體)之劑量相比的不同劑量。影響向個體投與之劑量之其他因素包括例如癌症之類型或嚴重度。例如，患有轉移性黑色素瘤之個體與患有膠質母細胞瘤之個體相比可需要投與多特異性抗原結合構築體之不同劑量。其他因素可包括例如組合或先前影響個體之其他醫學病症、個體之一般健康、個體之遺傳傾向、飲食、投與時間、排泄率、藥物組合及向個體投與之任何其他額外療法。亦應瞭解，任何特定個體之特定劑量及治療方案亦將取決於治療醫師(例如醫生或護士)之判斷。本文中描述適宜劑量。於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合構築體在高及低劑量二者下均有效。
醫藥組合物可包含治療上有效量本文中所述之多特異性抗原結合構築體。此等有效量可藉由一般技術者部分基於所投與抗體之效應或抗體及一或多種額外活性劑之組合效應(若使用超過一種藥劑)容易確定。本文中所述之抗體或其片段之治療上有效量亦可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重，及抗體(及一或多種額外活性劑)引起個體之所需反應(例如，腫瘤生長之減少)之能力之因素變化。例如，多特異性抗原結合構築體之治療上有效量可抑制(減輕特定病症之嚴重度或消除特定病症之發生)及/或預防特定病症及/或此項技術中已知或本文中所述之特定病症之症狀中之任一者。治療上有效量亦為其中組合物之任何毒性或有害效應被治療上有益效益超過者。
可進一步於例如I期劑量遞增研究中評價本文中所述之多特異性抗原結合構築體中之任一者之適宜人類劑量。參見，例如，van Gurp等人(2008)Am J Transplantation 8(8):1711-1718；Hanouska等人(2007)Clin Cancer Res 13(2, part 1):523-531；及Hetherington等人(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10): 3499-3500。
此等組合物之毒性及治療功效可藉由已知醫藥程序於細胞培養物或實驗動物(例如本文中所述之癌症中之任一者的動物模型)中測定。此等程序可用於例如測定LD50 (對群體之50%致死之劑量)及ED50 (於群體之50%中治療有效之劑量)。毒性與治療效果之間之劑量比率為治療指數及可將其表示為比率LD50 /ED50 。展示高治療指數之抗體或其抗原結合片段係較佳。雖然可使用展示毒性副作用之組合物，但是應小心設計將此等化合物靶向受影響組織之位點之遞送系統及使對正常細胞之潛在損害最小化及從而減少副作用。
可於調配用於人類之劑量範圍中使用獲自細胞培養檢定及動物研究之數據。此等抗體或其抗原結合片段之劑量一般位於包含具有很少或無毒性之ED50 之該等抗體或片段之循環濃度的範圍內。劑量可取決於所採用之劑型及所利用之投與途徑於此範圍內變化。針對本文中所述之多特異性抗原結合構築體，治療上有效劑量可自細胞培養檢定最初評估。可於動物模型中調配劑量以達成包含如於細胞培養物中所測定之EC50 (即，達成症狀之半最大抑制之構築體，例如，抗體之濃度)之循環血漿濃度範圍。此資訊可用於更精確確定人類中之可用劑量。血漿水平可例如藉由高效液相層析法量測。於一些實施例中，例如，在期望局部投與(例如，至眼或關節)之情況下，可使用細胞培養或動物建模來確定達成局部位點內之治療上有效濃度所需之劑量。
於一些實施例中，可結合其他癌症療法進行該等方法。例如，可在放射、手術、靶向或細胞毒性化療、化學放射療法、激素療法、免疫療法、基因療法、細胞移植療法、精確藥劑、基因組編輯療法、或其他醫藥療法同時、之前或之後向個體投與組合物。
如上所述，本文中所述之多特異性抗原結合構築體係用於治療選自由以下組成之群之各種癌症：血癌、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、神經癌、皮膚癌、乳癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、胰癌、泌尿生殖器癌、骨癌、腎癌及血管癌。視情況，癌症係選自由以下組成之群：卡波西氏肉瘤、白血病、急性淋巴細胞性白血病(etv6、aml1、親環蛋白b)、急性髓細胞性白血病、髓母細胞前髓細胞髓單核細胞性單核細胞性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性(粒細胞性)白血病、慢性淋巴細胞性白血病(親環蛋白b)、套細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤(Ig-個體遺傳型)、真性紅細胞增多淋巴瘤、霍奇金氏病(Imp-1、EBNA-1)、非霍奇金氏病、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、重鏈病、實體腫瘤、肉瘤、癌、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸肉瘤、結腸癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、胰癌、乳癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、卵巢癌、前列腺癌(前列腺特異性抗原(PSA)及其抗原決定基PSA-1、PSA-2及PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌(HER2/neu、c-erbB-2)、肝瘤、肝細胞癌(α-胎蛋白)、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏瘤、子宮頸癌、子宮癌、睾丸瘤(NY-ESO-1)、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤(E-鈣黏著蛋白、α-連環蛋白、β-連環蛋白、γ-連環蛋白、p120ctn)、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤(p5蛋白質、gp75、癌胚抗原、GM2及GD2神經節苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100)、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、食道癌(esophageal carcinoma)、基底細胞癌、膽道癌(p21ras)、膀胱癌(p21ras)、骨癌、腦及中樞神經系統(CNS)癌、子宮頸癌(p53、p21ras)、絨膜癌(CEA)、結腸直腸癌(結腸直腸相關抗原(CRC)-CO17-1A/GA733、APC)、結締組織癌、消化系統癌、子宮內膜癌、食道癌(esophageal cancer)、眼癌、頭頸癌、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733醣蛋白)、上皮細胞癌(親環蛋白b)、上皮內腫瘤、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌(小細胞、大細胞) (CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、口腔癌(例如唇、舌、口及咽癌)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、胰癌、直腸癌、呼吸系統癌、皮膚癌、甲狀腺癌及泌尿系統癌。
於一些實施例中，本文中所述之多特異性抗原結合構築體可作為單藥療法向個體投與。或者，如上所述，抗體或其片段可作為與另一治療(例如，針對癌症之另一治療)之組合療法向個體投與。例如，該組合療法可包括向個體(例如，人類患者)投與對患有癌症或有發展癌症風險之個體提供治療效益之一或多種額外藥劑。適用於與本發明之組合物共同投與之化療劑包括例如：紫杉醇(taxol)、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基蒽二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素(actinomycin) D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同系物。另外藥劑包括例如抗代謝物(例如，胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如，二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、噻替派(thioTEPA)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)、洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈脲黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C、順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)、普魯苄肼(procarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、沙鉑(satraplatin)或四硝酸三鉑)、蒽環黴素(anthracycline) (例如柔紅黴素(先前稱作柔紅黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如更生黴素(先前稱作放線菌素)、博來黴素(bleomycin)、光神黴素及安麯黴素(anthramycin) (AMC))及抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼及長春鹼)及替莫唑胺(temozolomide)。於一些實施例中，同時投與該多特異性抗原結合構築體及該一或多種額外活性劑。於其他實施例中，第一時間投與該多特異性抗原結合構築體及第二時間投與該一或多種額外活性劑。於一些實施例中，第一時間投與該一或多種額外活性劑及第二時間投與該多特異性抗原結合構築體。
本文中所述之多特異性抗原結合構築體可替換或增強先前或目前投與之療法。例如，在用多特異性抗原結合構築體治療後，一或多種額外活性劑之投與可停止或減少，例如，在更低水平或劑量下投與。於一些實施例中，可維持先前療法之投與。於一些實施例中，將維持先前療法直至多特異性抗原結合構築體之水平達到足以提供治療效果之水平。可組合投與該等兩種療法。
如本文中所定義，監測個體(例如人類患者)癌症改善意指評價個體疾病參數之變化，例如，腫瘤生長之減少。於一些實施例中，在投與至少一(1)小時，例如，至少2、4、6、8、12、24或48小時，或至少1天、2天、4天、10天、13天、20天或更多，或至少1週、2週、4週、10週、13週、20週或更多後進行評價。可在下列時期中之一或多者評價個體：在開始治療之前、在治療期間、或於已投與治療之一或多個要素後。評價可包括評價進一步治療之需要，例如，評價是否應改變劑量、投與頻率或治療之持續時間。其亦可包括評價添加或放棄選定治療模式(例如，添加或放棄本文中所述癌症之治療中之任一者)之需要。
於一些實施例中，投與本文中所述之多特異性抗原結合構築體以例如藉由增加T細胞活化及/或增殖來調節患者之T細胞反應。阻斷藉由免疫細胞表現之PD-1與其配位體之間之相互作用強烈增強T細胞增殖、IFNγ產生及分泌及T細胞之溶細胞活性。橋接表現PD-1之免疫細胞與表現PD-1配位體(例如PD-L1或PD-L2)之第二細胞(例如另一免疫細胞或腫瘤細胞)可強烈增強T細胞增殖、IFNγ產生及分泌及T細胞之溶細胞活性。因此，於一些實施例中，向有需要患者投與本發明之多特異性抗原結合構築體以誘導或增加T細胞活化、增強T細胞增殖、誘導IFNγ之產生及/或分泌、及/或誘導溶細胞性T細胞反應。
實例 雖然已參考其特定實施例描述本發明，但是熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之真正精神及範圍下作出各種變化及可取代等效物。此外，可作出許多修改以使特定情況、材料、物質之組成、製程、製程步驟適應於本發明之目標、精神及範圍。意欲所有此等修改係於本發明之範圍內。
實例 1 ：誘導 T 細胞中之干擾素 -γ (IFNγ) 為評估PD1/PDL1雙特異性抗體對T-細胞活化之效應，於混合淋巴細胞反應(MLR)中分析IFNγ產生。測試組合納武單抗x阿特珠單抗、949x阿特珠單抗、J43x阿特珠單抗、帕地單抗(Pidilizumab) x阿特珠單抗、阿特珠單抗x納武單抗或度伐單抗(Durvalumab) x納武單抗之結合域之無糖基化的雙特異性抗體。抗體949係指如美國專利9102728中所揭示之PD-1抗體。抗體J43係指抗鼠科PD-1抗體。將KEYTRUDA (阻斷PD-1 (Merck)且已知誘導IFNγ產生之人源化抗體)用作比較。納武單抗x阿特珠單抗、949x阿特珠單抗及阿特珠單抗x納武單抗之示意圖及胺基酸序列各自示於圖 4 至 6 中。使用此項技術中已知方法產生本文中例示及測試之雙特異性體形式各者。例如，如圖4中所示，使用此項技術中已知方法將阿特珠單抗Fab之重鏈部分與納武單抗之重鏈Fc部分交聯。本文中描述利用或不利用連接子序列交聯兩種蛋白質(諸如Fab之重鏈及IgG分子之重鏈)之適宜方法。此研究證實各種濃度之上述雙特異性抗體可誘導T細胞中之IFNγ反應。
自源自三個獨立人類供體(D985、D7603及D5004)之leukopak (HemaCare, Van Nuys, CA)單離外周血單核細胞(PBMC)。使用免疫磁性細胞分離(EASYSEPTM ；Stemcell Technologies，Vancouver BC)藉由陰性選擇自PBMC濃化總T細胞。使用免疫磁性細胞分離(EASYSEPTM ；Stemcell Technologies，Vancouver BC)自PBMC單離單核細胞。分別將T細胞在1x106 個細胞/ml濃度下再懸浮於完全RPMI中及將單核細胞調整至5x105 個細胞/ml。於96孔板中，將100 µl含有T細胞之培養基以1x105 個細胞/孔密度接種，接著添加100 µl單核細胞懸浮液(E:T比率2:1)。接下來，添加50 µl含有抗體之各種稀釋之培養基以達到0 nM、0.5 nM、5 nM或50 nM之最終濃度。將板在37℃下於CO2 培育箱中培育5天。在培育期結束時，收集細胞上清液及藉由MSD檢定(Mesoscale Diagnostics, Rockville, MD)分析IFNγ水平。
實例 2 ：誘導用派姆單抗 / 阿特珠單抗雙特異性抗體處理之 T 細胞中之干擾素 -γ (IFNγ) 為評估PD1/PDL1雙特異性抗體對T-細胞活化之效應，於混合淋巴細胞反應(MLR)中分析IFNγ產生。將派姆單抗x阿特珠單抗雙特異性體、派姆單抗mAb、阿特珠單抗Fab、KEYTRUDA及阿特珠單抗Fab之混合物、及KEYTRUDA (阻斷PD-1 (Merck)且已知誘導IFNγ產生之人源化抗體)用作比較。派姆單抗x阿特珠單抗雙特異性抗體之示意圖及胺基酸序列示於圖 3 中。如針對本文中所例示及測試之其他雙特異性形式相似所述，使用此項技術中已知方法產生圖3中所示之雙特異性形式。如圖3中所示，使用此項技術中已知方法使阿特珠單抗Fab之重鏈部分與派姆單抗之重鏈Fc部分之c端交聯。本文中描述利用或不利用連接子序列交聯兩種蛋白質(諸如Fab之重鏈及IgG分子之重鏈)之適宜方法。此等結果指示，派姆單抗x阿特珠單抗(靶向PD-1及PD-L1之雙特異性抗體)與單獨派姆單抗、阿特珠單抗Fab或KEYTRUDA處理相當地誘導T細胞中之IFNγ反應。
如上所述製備T細胞。添加體積50 µl之含有抗體之各種稀釋之培養基以達到0 nM、0.5 nM、5 nM或50 nM之最終濃度。將板在37℃下於CO2 培育箱中培育5天。在培育期結束時，收集培養物上清液及藉由MSD檢定(Mesoscale Diagnostics, Rockville, MD)分析IFN-γ水平。
實例 3 ：比較用靶向 PD-1 及 PD-L1 之雙特異性抗體或靶向 PD-1/PD-L1 之單株抗體之混合物處理之 T 細胞中的干擾素 -γ (IFNγ) 誘導 為評估PD-1xPD-L1或PD-L1xPD-L1雙特異性抗體對T細胞活化之效應，於混合淋巴細胞反應(MLR)中分析IFN-γ產生。測試派姆單抗x阿特珠單抗雙特異性抗體、納武單抗x阿特珠單抗雙特異性抗體、KEYTRUDA及阿特珠單抗之混合物、納武單抗及阿特珠單抗之混合物及使用單獨KEYTRUDA (阻斷PD-1 (Merck)且已知誘導IFNγ產生之人源化抗體)作為比較。
如上所述製備T細胞。添加體積50 µl之含有抗體之各種稀釋之培養基以達到0 nM、0.01 nM、0.001 nM或0.0001 nM之最終濃度。將板在37℃下於CO2 培育箱中培育5天。在培育期結束時，收集培養物上清液及藉由MSD檢定(Mesoscale Diagnostics, Rockville, MD)分析IFN-γ水平。
圖 1 顯示在所測試抗體之最終濃度下以pg/mL之IFN-γ之濃度，如所指示。此等結果指示，雙特異性PD-1xPD-L1抗體(諸如派姆單抗x阿特珠單抗)或PDL1/PDL1雙特異性抗體納武單抗/阿特珠單抗較PD1及PDL1特異性抗體之混合物或單獨PD-1抗體(KEYTRUDA)誘導更高的IFNγ反應。
實例 4 ：比較用靶向 PD-1/PD-L1 之雙特異性抗體或靶向 PD-1 或 PD-L1 之單株抗體處理之 T 細胞中的干擾素 -γ (IFNγ) 誘導 為評估PD-1xPD-L1或PD-L1xPD-L1雙特異性抗體對T細胞活化之效應，於混合淋巴細胞反應(MLR)中分析IFNγ產生。測試派姆單抗x納武單抗雙特異性抗體、阿特珠單抗x阿特珠單抗四價單特異性抗體及使用單獨納武單抗、單獨阿特珠單抗及KEYTRUDA (派姆單抗) (阻斷PD-1 (Merck)且已知誘導IFNγ產生之人源化抗體)作為比較。
如上所述製備T細胞。添加體積50 µl之含有抗體之各種稀釋之培養基以達到0 nM、0.01 nM、0.001 nM或0.0001 nM之最終濃度。將板在37℃下於CO2 培育箱中培育5天。在培育期結束時，收集培養物上清液及藉由MSD檢定(Mesoscale Diagnostics, Rockville, MD)分析IFN-γ水平。
圖 2 顯示於PBS中在所測試抗體之最終濃度下以pg/mL計之IFN-γ的濃度，如所指示。此等結果指示，雙特異性體PD1xPDL1 (派姆單抗x納武單抗)或PD-L1xPD-L1抗體(阿特珠單抗x阿特珠單抗) 誘導T細胞中與單獨PD-1 (阿特珠單抗或KEYTRUDA)或PD-L1 (納武單抗)特異性抗體相似之IFN-γ反應。
圖 7 顯示於PBS中在所測試抗體之最終濃度下以pg/mL計之IFN-γ的濃度，如所指示。此等結果指示，呈多特異性形式之雙特異性抗體PD-1xPD-L1 (派姆單抗x阿特珠單抗)或(納武單抗x阿特珠單抗)與派姆單抗及阿特珠單抗之混合物或納武單抗及阿特珠單抗之混合物相比於混合淋巴細胞反應(MLR)中在飛莫耳濃度下誘導更高的IFN-γ反應。此等結果表明由多特異性形式引起之協同效應。
圖 8 顯示用於識別證實協同之多特異性(例如雙特異性)抗體之示例性工作流程。該過程包括無偏篩選混合淋巴細胞反應(MLR)中之檢查點阻斷劑組合，其量測在各種濃度下以pg/mL之IFNγ釋放，如本文中其他地方所述(參見，例如，以下題名為非特異性T細胞+ K562-PD-L1腫瘤靶細胞檢定之小節)。於所說明之工作流程之第二步驟中，產生共同輕鏈雙特異性體以進一步測試其功效及描述各種示例性共同輕鏈雙特異性體形式。經識別之共同輕鏈雙特異性體形式勝過T細胞活化檢定中之已知PD-1阻斷劑。
實例 5 ：抗 PD-1 及抗 PD-L1 抗體構築體及多特異性抗原結合分子之產生及表徵 抗 PD-L1 抗體之親和力成熟 衍生自PD-L1抗體mAb24之親和力成熟之抗PD-L1抗體係經由構建突變庫、哺乳動物呈現分選及篩選單株IgG產生。在CDRH1、CDRH2及CDRH3之合成多樣性之情況下，引入含有重鏈突變之庫，而保持輕鏈序列恆定(除了在一些情況下)以維持與單一輕鏈構築體之相容性。該庫經歷3輪哺乳動物呈現分選，該分選目的在於增加對人類PD-L1之親和力及維持小鼠交叉反應性。於各輪中，於最初結合至經生物素化之抗原(即，用過量未經標記之抗原或親本IgG培育1小時)後採用低速率競爭步驟。於最後分選輪後，挑選純系，分析其序列，及經由Wasatch SPR結合動力學及細胞結合平衡檢定分析獨特純系以識別首要候選。
將自不同選擇輪得到之抗PD-L1抗體在kd /ka 雙對數圖上繪圖。在SPRi讀取器(MX96, Carterra, Salt Lake City, UT)上於PBS-Tween 0.01%之運行緩衝液中測定表觀締合及解離動力學速率常數(ka 及kd 值)。使抗人類PD-L1抗體在CFM (Carterra)上之羧甲基葡聚糖水凝膠50 L晶片(XanTec bioanalytics GmbH，Dusseldorf，德國)上共價結合。使用新鮮混合之活化試劑(150 μl 0.4 M EDC及150 μl 0.1 M磺基-NHS含於5 ml H2 O中)將SPR受質之表面活化7分鐘。使用含於乙酸緩衝液pH 4.5中之10 mg/ml之抗體印刷15分鐘。然後將印刷之晶片在SPRi讀取器(MX96, Carterra)上用1M乙醇胺淬滅15分鐘。針對動力學分析，依序注射經純化之重組His標記之人類PD-L1 (0、2.05、5.12、12.8、32、80、200、500 nM)。針對各濃度，存在5分鐘締合，接著10分鐘解離。於SPR檢驗工具及Scrubber軟體(Biosensor Tools LLC, Salt Lake City, UT)中處理及分析數據。將該動力學數據參考空隙參考點及雙參考緩衝週期，及然後全域擬合至1:1結合模型以測定其表觀締合及解離動力學速率常數(ka 及kd 值)。比率kd /ka 係用於匯出各抗原/mAb相互作用之KD 值，即，KD =kd /ka 。
抗 PD-1 抗體之親和力成熟 衍生自PD-1抗體mAb25之親和力成熟之抗PD-1抗體係經由構建突變庫、噬菌體呈現淘選及篩選單株抗體產生。在CDRH1、CDRH2及CDRH3之合成多樣性之情況下，引入含有重鏈突變之庫，而保持輕鏈序列恆定以維持與單一輕鏈構築體之相容性。該庫經歷4輪噬菌體呈現淘選輪，該等輪目的在於增加對人類PD-1之親和力及獲得小鼠交叉反應性。於各輪中，於最初結合至經生物素化之抗原(即，用過量未經標記之抗原或親本IgG培育1小時)後採用低速率競爭步驟。於最後淘選輪後，挑選純系，分析其序列，及經由Octet SPR結合動力學及細胞結合平衡檢定分析獨特Fab純系以識別領頭候選。將領頭候選自Fab轉變成人類IgG並進一步表徵。
將自不同選擇輪得到之抗PD-1抗體在kd /ka 雙對數圖上繪圖。在SPRi讀取器(MX96, Carterra, Salt Lake City, UT)上於PBS-Tween 0.01%之運行緩衝液中測定表觀締合及解離動力學速率常數(ka 及kd 值)。使抗人類PD-1抗體在CFM (Carterra)上之羧甲基葡聚糖水凝膠50 L晶片(XanTec bioanalytics GmbH，Dusseldorf，德國)上共價結合。使用新鮮混合之活化試劑(150 μl 0.4 M EDC及150 μl 0.1 M 磺基-NHS含於5 ml H2 O中)將SPR受質之表面活化7分鐘。使用含於乙酸緩衝液pH 4.5中之10 mg/ml之抗體印刷15分鐘。然後將印刷之晶片在SPRi讀取器(MX96, Carterra)上用1 M乙醇胺淬滅15分鐘。針對動力學分析，依序注射經純化之重組His標記之人類PD-1 (0、2.05、5.12、12.8、32、80、200、500 nM)。針對各濃度，存在5分鐘締合，接著10分鐘解離。於SPR檢驗工具及Scrubber軟體(Biosensor Tools LLC, Salt Lake City, UT)中處理及分析數據。將該動力學數據參考空隙參考點及雙參考緩衝週期，及然後全域擬合至1:1結合模型以測定其表觀締合及解離動力學速率常數(ka 及kd 值)。比率kd /ka 係用於匯出各抗原/mAb相互作用之KD 值，即，KD =kd /ka 。
非特異性 T 細胞 + K562-PD-L1 腫瘤靶細胞檢定 使用陰性選擇套組將T細胞自先前冷凍之PBMC (外周血單核細胞)單離及使用IMMUNOCULTTM 抗CD3/CD28 T細胞活化劑於補充有10 % FBS之X-VIVO 15培養基(「X-10」)中活化。於3天後，將細胞更換至含有5 ng/ml IL-2及2.5 ng/ml IL-7之X-10培養基(「hX-10」)中。每2至3天，將細胞飼喂新鮮hX-10。於活化10天後，將經IMMUNOCULTTM 擴增之T細胞經CELLTRACETM Violet標記及於具有50,000個T細胞及25,000個K32P細胞/孔之96孔圓底板中與K562細胞共培養，該等K562細胞經穩定轉導以表現人類CD32B及PD-L1 (「K32P」)。以10倍稀釋進行之10與0.001 nM之間之最終濃度下添加抗體(雙特異性體3、KEYTRUDA及同種型對照)連同0.25 µg/ml抗CD3 (純系OKT3)。於3天後，收集上清液用於經由MSD板量測IFNγ細胞激素產生，及將細胞染色用於流動式細胞測量術，及然後在BD LSRFORTESSATM 細胞計上運行以查看T細胞活化及靶細胞殺死。藉由計數實驗孔中之活K32P靶之數目與一組無CD3對照孔中之K32P靶之數目比較來量測靶細胞殺死。然後於GraphPad Prism中分析所有數據。如圖 9A 至 9B 中所示，雙特異性體3與同種型對照抗體及KEYTRUDA二者相比誘導更高量之IFNγ及K32P靶細胞之殺死。
CMV 抗原召回檢定 將第12天擴增之來自HLA A02:01供體之CMV抗原特異性CD8+ T細胞解凍及於含2 ug/ml DNA酶I之hX-10培養基中休息過夜。第二天，收集細胞，及使用Ficoll分離移除死亡細胞。然後將剩餘細胞與表現HLA-A02:01、CMV蛋白質pp65-IRES-GFP及PD-L1之K562細胞(「KACP」，GFP+)及表現HLA-A02:01之K562細胞(「KA」，GFP-)於具有25,000個CMV T細胞、50,000個KACP細胞及50,000 KA個細胞/孔之96孔圓底板中共培養。在10與0.0001 nM之間之最終濃度下添加抗體(雙特異性體3、KEYTRUDA、mAb1與mAb28之組合及同種型對照)。此劑量包括10與0.1 nM之間之10倍稀釋及然後2倍稀釋直至0.0001 nM。於共培養2天後，經由流動式細胞測量術分析KACP腫瘤靶之特異性殺死。將特異性殺死比率計量地定義為活GFP+ KACP細胞與GFP- KA細胞之比率，當不存在T細胞時，標準化至此等細胞之比率。如圖 10A 中所示，雙特異性體3增加腫瘤抗原靶細胞之特異性殺死。藉由雙特異性體3介導之增加經常較針對KEYTRUDA所見更高，而在高劑量下，mAb1與mAb28之組合殺死相等數目之KACP細胞。關鍵地，在抗體之低劑量(0.001至0.01 nM)下，雙特異性體3與KEYTRUDA及mAb1與mAb28之組合二者相比顯示殺死KACP細胞之增加，指示雙特異性體3可用於在較低劑量下介導靶細胞之抗原特異性殺死。
於單獨實驗中，以類似於以上針對K562細胞特異性殺死檢定所述之方式檢查雙特異性體3對Raji細胞特異性殺死之效應。簡言之，將CMV抗原特異性CD8+ T細胞與表現HLA-A02:01、CMV蛋白質pp65-IRES-GFP及PD-L1之Raji細胞(「RACP」，GFP+)及表現HLA-A02:01之Raji細胞(「RA」，GFP-)於具有25,000個CMV T細胞、50,000個RACP細胞及50,000個RA細胞/孔之96孔圓底板中共培養。在10與0.0001 nM之間之最終濃度下添加抗體(雙特異性體3、KEYTRUDA、mAb1與mAb28之組合及同種型對照)。此劑量包括10與0.1 nM之間之10倍稀釋及然後2倍稀釋直至0.0001 nM。於共培養2天後，經由流動式細胞測量術分析RACP腫瘤靶之特異性殺死。將特異性殺死比率計量地定義為活GFP+ RACP細胞與GFP- RA細胞之比率，當不存在T細胞時，標準化至此等細胞之比率。如圖 10B 中所示，雙特異性體3增加腫瘤抗原靶細胞之特異性殺死。藉由雙特異性體3介導之增加較針對KEYTRUDA或mAb1與mAb28之組合所見明顯更高，而在高劑量下，雙特異性體3及mAb1與mAb28之組合引起可相比擬的靶細胞殺死。此等數據指示雙特異性體3可用於在較低劑量下介導靶細胞之抗原特異性殺死。
金黃色葡萄球菌腸毒素 A ( 「 SEA 」 ) 檢定 將先前冷凍之PBMC解凍及用0.1 mg/ml DNA酶I於PBS中培育15分鐘，通過40 µm尼龍網過濾器，及然後於X-10培養基中以100,000個細胞/96孔圓底板之孔接種。在10與0.0001 nM之間之最終濃度下添加抗體(雙特異性體3、KEYTRUDA、mAb1與mAb28之組合及同種型對照)，連同10 ng/ml SEA。於共培養3天後，分析IL-2細胞激素產生。如圖 11 中所示，雙特異性體3較KEYTRUDA在所有測試劑量下誘導更多IL-2。重要的是，雙特異性體3與KEYTRUDA及mAb1與mAb28之組合二者相比誘導在抗體之較低濃度下開始之增加之IL-2產生。
PD-1 表現測定檢定 將先前冷凍之PBMC解凍及用0.1 mg/ml DNA酶 I於PBS中培育15分鐘，通過過濾器，及然後於具有0.25 µg/ml抗CD3 (純系OKT3)及0.25 µg/ml抗CD28 (純系CD28.2)之hX-10中以1x106 個細胞/ml接種3天。於3天後，藉由旋轉下細胞及移除過量培養基將細胞調整至2 x 106 個細胞/ml含於hX-10中。然後將細胞再懸浮及於48孔板中以1x106 個細胞/孔(0.5 ml)接種。然後添加抗體(雙特異性體3、KEYTRUDA、mAb1與mAb28之組合、阿特珠單抗或同種型對照)至各孔以得到1 ml/孔hX-10之最終體積，其中0.01 nM或1 nM抗體之最終濃度。於過夜培養後，將細胞收集至1.5 ml Eppendorf管中及於含有蛋白酶抑制劑混合物之100 μl裂解緩衝液中裂解。於旋轉使粒子之上清液澄清後，將經澄清之上清液儲存在-80℃直至用於西方墨點法。針對西方墨點法，調整樣品以包含1X LDS樣品緩衝液及1X還原劑，在70℃下加熱10分鐘，然後將20 μl/孔負載於4至12% Bis-Tris凝膠上。於凝膠運行後，將其轉移至硝化纖維膜，在室溫下用含5%乾乳之TBS-0.1% Tween-20 (TBST)阻斷1小時，於TBST中洗滌，及然後在4℃下於含5%牛血清白蛋白之TBST中用抗PD-1 (純系D4W2J，Cell Signaling Technologies)或抗β-肌動蛋白(純系13E5，Cell Signaling Technologies)抗體培育過夜。第二天，將膜於TBST中洗滌，用HRP結合之抗兔IgG抗體培育，於TBST中洗滌，然後用SUPERSIGNALTM Pico受質顯色。在Amersham成像儀600上收集化學發光及白光影像及疊加以產生所示影像。如圖 12A 中所示，雙特異性體3於其藉由PD-1之內部化及/或隨後降解及/或脫落引起細胞PD-1表現之損失的能力方面係獨特的。
於隨後檢定中，將先前冷凍之PBMC解凍及用0.1 mg/ml DNA酶I於PBS中培育15分鐘，通過過濾器，及然後於具有0.25 µg/ml抗CD3 (純系OKT3)及0.25 µg/ml抗CD28 (純系CD28.2)之hX-10中以1x106 個細胞/ml接種3天。於3天後，藉由旋轉下細胞及移除過量培養基將細胞調整至2 x 106 個細胞/ml含於hX-10中。然後將細胞再懸浮及於48孔板中以1x106 個細胞/孔(0.5 ml)接種。然後添加抗體(雙特異性體3、KEYTRUDA、mAb1與mAb28之組合、阿特珠單抗、阿特珠單抗與KEYTRUDA、具有50 nM mAb 1之雙特異性體3或同種型對照)至各孔以得到1 ml/孔hX-10之最終體積，其中0.1 nM、1 nM或10 nM抗體之最終濃度。於過夜培養後，將細胞收集至1.5 ml Eppendorf管中及於含有蛋白酶抑制劑混合物之100 μl裂解緩衝液中裂解。於旋轉使粒子之上清液澄清後，將經澄清之上清液儲存在-80℃直至用於西方墨點法。針對西方墨點法，調整樣品以包含1X LDS樣品緩衝液及1X還原劑，在70℃下加熱10分鐘，然後將10 μl/孔負載於4至12% Bis-Tris凝膠上。於凝膠運行後，將其轉移至硝化纖維膜，在室溫下用含5%乾乳之TBS-0.1% Tween-20 (TBST)阻斷1小時，於TBST中洗滌，及然後在4℃下於含5%牛血清白蛋白之TBST中用抗PD-1 (純系D4W2J，Cell Signaling Technologies)或抗β-肌動蛋白(純系13E5，Cell Signaling Technologies)抗體培育過夜。第二天，將膜於TBST中洗滌，用HRP結合之抗兔IgG抗體培育，於TBST中洗滌，然後用SUPERSIGNALTM Pico受質顯色。在Amersham成像儀600上收集化學發光及白光影像及疊加以產生所示影像。如圖 12B 至 12C 中所示，雙特異性體3於其通過PD-1之內部化及/或隨後降解及/或PD-1之脫落引起細胞表面PD-1表現之損失的能力方面係獨特的。此外，當將抗PD-L1抗體mAb1以50 nM添加至含有雙特異性體3之孔中時，雙特異性體3藉由PD-1內部化及/或PD-1之隨後降解及/或脫落驅動細胞表面PD-1表現之損失的能力失去。此表明應接合雙特異性體3之兩臂以藉由PD-1之內部化及/或降解及/或脫落驅動細胞表面PD-1表現之損失。
圖 12D 顯示當同時接合雙特異體3之兩個結合臂時，用該雙特異性體處理增加上清液中之PD-1之量。當PD-L1靶向臂藉由mAb1 (親本PD-L1臂抗體)阻斷時，此效應喪失。此表明雙特異性體3增加PD-1脫落至上清液中。
接下來研究價對結合臂之順序之效應。產生新穎雙特異性體(雙特異性體5)，其具有源自mAb1之VH及VL序列之結合PD-L1之第一N端Fab，及源自mAb28之VH及VL序列之結合PD-1之第二N端Fab。換言之，當其共用用於結合至PD-1及PD-L1之相同VH及VL序列時，雙特異性體5與雙特異性體3 (其具有結合PD-L1之二價臂及結合PD-1之二價臂)相比具有結合PD-L1之一個單價臂及結合PD-1之一個單價臂。
於T75燒瓶中於含有IL-2及IL-7之hX-10培養基中將40 x 106 個PBMC用0.25 μg/ml抗CD3及0.25 μg/ml抗CD28處理3天。將細胞於燒瓶中培育3天，無操作。在第3天，收集細胞無需洗掉舊培養基中之任一者。將細胞在1 ml之最終體積下接種於48孔板之孔中，其中1 x 106 個細胞/孔及抗體在0.01 nM、0.1 nM、1 nM及10 nM下。於過夜培育後，將細胞收集至1.5 ml管中，洗滌以自孔收集所有細胞，然後裂解及用於西方墨點法。針對PD-1及肌動蛋白運行西方墨點法。圖 12E 證實結合臂之價影響PD-1表現損失之程度。如所示，PD-1表現之損失在雙特異性體5 (單價結合臂，總價=2或二價)相比雙特異性體3 (二價結合臂，總價=4或四價)之更高劑量下開始出現，表明雙特異性體3之增加之價對此差異負責。
接下來，使用巴馬司他(多種MMP及ADAM之廣譜抑制劑，該等MMP及ADAM為負責將蛋白質自細胞質膜裂解掉之脫落酶或蛋白酶)檢查ADAM/MMP抑制之效應。簡言之，於T75燒瓶中於含有IL-2及IL-7之hX-10培養基中將40 x 106 個PBMC用0.25 μg/ml抗CD3及0.25 μg/ml抗CD28處理3天。將細胞於燒瓶中培育3天，無操作。在第3天，收集細胞無需洗掉舊培養基中之任一者。將細胞在1 ml之最終體積下接種於48孔板之孔中，其中1 x 106 個細胞/孔。在抗體添加之前至少½小時，以0 μM、1.25 μM、2.5 μM、5 μM及10 μM之增加濃度添加巴馬司他或DMSO媒劑及在37℃下預培育以查看ADAM/MMP抑制之結果。然後以1 nM添加同種型對照及雙特異性體3。於過夜培育後，將細胞收集至1.5 ml管，洗滌以自孔收集所有細胞，然後裂解及用於西方墨點法。針對PD-1及肌動蛋白運行西方墨點法。圖 12F 證實用巴馬司他(多種MMP及ADAM之廣譜抑制劑)預處理極大降低細胞相關之PD-1損失之量，表明PD-1損失或脫落係由於藉由MMP或ADAM蛋白酶之裂解。圖12G 表明當雙特異性體3結合至呈反式構型(即，藉由不同細胞表現)之PD-1及PD-L1時，其主要驅動細胞表面PD-1表現之損失。考慮到PD-1及PD-L1可在相同細胞上表現，研究結合至順式PD-1及PD-L1之雙特異性體3是否導致PD-1表現之損失或PD-1脫落，或藉由雙特異性體3結合是否需要呈反式，其中雙特異性體3橋接第一細胞(諸如表現PD-L1之腫瘤細胞)及第二細胞(諸如表現PD-1之T效應細胞)。實驗中使用表現僅PD-1、僅PD-L1或PD-1及PD-L1二者之Jurkat細胞。簡言之，將總計0.5 x 106 個表現PD-1之Jurkat細胞、表現PD-1及PD-L1之Jurkat細胞、或僅表現PD-1或僅表現PD-L1之Jurkat細胞之1:1混合物用同種型對照或雙特異性體3在0.01、0.1及1 nM下處理。於過夜培育後，將細胞收集至1.5 ml管中，洗滌以自孔收集所有細胞，然後裂解及用於西方墨點法。運行西方墨點法以測定PD-1及肌動蛋白水平。
雙特異性體 3 之活體內功能 收集第13天擴增之來自HLA A02:01供體之CMV抗原特異性CD8+ T細胞及然後與表現HLA-A02:01、CMV蛋白質pp65-IRES-GFP及PD-L1之K562細胞(「KACP」)以2:1 KACP:CMV T細胞之比率及基質膠混合使得100 µl包含1X 基質膠、5x106 個KACP細胞及2.5x106 個CMV T細胞。將NSG小鼠在其側腹皮下移植100 μl製備之基質膠-KACP-CMV T細胞混合物/小鼠。在移植當天開始抗體給藥及在等莫耳量(針對各單株200 µg，針對雙特異性體3 333 µg)下提供及每3天將小鼠用抗體再給藥。處理組包含於單獨基質膠中提供KACP腫瘤細胞之對照組(「無T細胞轉移」)及提供同種型、KEYTRUDA、mAb1及mAb28 (mAb1+mAb28)或雙特異性體3之組。每組有5隻小鼠，及每日監測小鼠，每週兩次量測腫瘤。於圖 13A 中示意性描述方案。如圖 13B 中所示，無T細胞轉移組較含有T細胞之任何組具有更侵略性生長之腫瘤。於此模型中，KEYTRUDA在延遲KACP腫瘤生長方面與同種型對照相比不提供效益。雙特異性體3及組合mAb1與mAb28組二者與同種型及KEYTRUDA組二者相比具有腫瘤生長之顯著延遲。在第24天，雙特異性體3組與用mAb1與mAb28之組合處理之組之間存在顯著分歧，其中雙特異性體3與組合相比引起腫瘤生長之延遲。
實例 6 ：針對雙特異性體 3 之藥理學研究之活體內研究 NSG 小鼠之 K562-A2-CMV-PD-L1 靶細胞及 CMV T 細胞之共接種模型 於利用圖 13A 中示意性所述之方案之兩個單獨研究中，將NSG雌性小鼠用含有5 x 106 個K562-A2-CMV-PD-L1 (「KACP」)細胞及2.5 x 106 (圖 13B 及14A ；效應子：靶比率= 0.5:1)或5 x 106 (圖 14B ；效應子：靶比率= 1:1)個自相同供體活體外擴增之CMV特異性T細胞之100 μL基質膠皮下共注射。在接種日各自將小鼠盲分成5組，5隻小鼠/組或10隻小鼠/組。為測定人類T細胞之抗腫瘤活性，於兩個研究中將第一組小鼠僅用腫瘤細胞注射。第二組接受人類IgG1同種型對照抗體(0.2 mg Q3Dx5)。第三組接受KEYTRUDA (0.2 mg Q3Dx5)，將第四組用雙特異性體3 (0.333 mg Q3Dx5)處理，及第五組接受抗PD-1 (mAb28)及抗PD-L1 (mAb1)抗體(各0.2 mg Q3Dx5)之組合。所有抗體係經腹膜內注射及在移植日開始給藥。藉由腫瘤體積量測監測之腫瘤生長、體重損失及總生存測定抗腫瘤活性。每週量測腫瘤大小及體重2至3次，當腫瘤接近2000 mm3 或小鼠損失體重之20%時，將小鼠安樂死。使用Graph Pad Prism軟體分析數據並繪圖。如圖 14A 及14B 中所述，雙特異性體3與所測試之不同單株抗體相比顯示增加之抗腫瘤功效。
可移植同基因小鼠模型 將乳癌EMT-6細胞(5 x 104 個/小鼠)移植於BALB/c雌性小鼠之乳房脂肪墊中。當建立腫瘤(腫瘤體積約50 mm3 )時，將小鼠分組(n=8)及用人類IgG1同種型對照(0.2 mg Q3Dx3)或雙特異性體3 (0.333 mg Q3Dx3)處理。將抗體藉由腹膜內注射遞送。
使用類似研究設計，於雌性C57BL/6小鼠中皮下注射膀胱癌MB-49細胞(5 x 105 個/小鼠)。當建立腫瘤(腫瘤體積約75 mm3 )時，將小鼠分組(n=8)及用人類IgG1同種型對照(0.2 mg Q3Dx3)或雙特異性體3 (0.333 mg Q3Dx3)處理。將抗體藉由腹膜內注射遞送。
針對兩種研究，每週量測腫瘤大小及體重2至3次，當腫瘤接近2000 mm3 或小鼠損失體重之20%時，將小鼠安樂死。將結果藉由Graph Pad Prism軟體繪圖及分析。雙特異性體3與同種型對照處理相比顯示於EMT-6乳癌細胞模型(圖 15A )中及於MB-49細胞模型(圖 15B )中之更大抗腫瘤功效。
轉殖基因小鼠之經工程改造之可移植同基因模型 將經工程改造以表現人類PD-L1 (MC-38-hPD-L1)之小鼠結腸癌MC-38細胞皮下注射於C57BL/6雌性小鼠中，其中PD-1及PD-L1之細胞外域經人類PD-1及PD-L1取代，而不修飾受體-配位體對之跨膜域及信號域。人類PD-1及PD-L1之遺傳敲入允許測試與KEYTRUDA頭對頭之吾人雙特異性PD-1xPD-L1抗體，其不與小鼠PD-1相互作用，及因此不可於同基因小鼠模型中評價。將具有建立之MC-38-hPD-L1腫瘤之小鼠分組(n=8)及用同種型對照(0.2 mg Q3Dx3)、KEYTRUDA (0.2 mg Q3Dx3)或雙特異性體3 (0.333 mg Q3Dx3)腹膜內處理。用雙特異性體3處理控制MC-38-hPD-L1腫瘤生長較同種型對照處理或KEYTRUDA處理顯著更好(圖 16A )。此外，雙特異性體3處理與經同種型對照或KEYTRUDA處理之小鼠相比導致MC-38-hPD-L1腫瘤小鼠之生存之增加(圖 16B )。
於分開研究中，將C57BL/6人類PD-1/PD-L1轉殖基因雌性小鼠用1 x 105 個B16F10-hPD-L1細胞(極具侵略性小鼠黑色素瘤細胞系)皮下注射。一旦黑色素瘤係可見(於腫瘤細胞接種4天後)就將小鼠分組(n=8)成5組，其接受下列處理。組1接受同種型對照人類IgG1 (0.2 mg Q3Dx3)，組2阿伏魯單抗(0.2 mg Q3Dx3)，組3 KEYTRUDA (0.2 mg Q3Dx3)，組4雙特異性體3 (0.333 Q3Dx3)及組5 KEYTRUDA與阿伏魯單抗之組合(各0.2 mg Q3Dx3)。針對兩種研究，每週量測腫瘤大小及體重2至3次，及當腫瘤接近2000 mm3 或小鼠損失體重之20%時，將小鼠安樂死。記錄及分析生存。將數據藉由Graph Pad Prism軟體繪圖及分析。如圖 17A 及17B 中所述，雙特異性體3與所測試之其他處理組相比顯著更有效延遲B16F10-hPD-L1小鼠中之腫瘤生長。此外，用雙特異性體3處理之B16F10-hPD-L1小鼠較接受其他所測試之治療之小鼠生存平均更長(圖 17C 及圖 17E )。
實例 7 ：雙特異性體 3 具有類單株 DLP 及類親本結合 圖 18A 至 18D 證實雙特異性體3具有類似於行為良好之單株抗體之類藥物性質(DLP)且維持親本PD-1及PD-L1結合。圖 18A 顯示雙特異性體3顯示與親本純系mAb28類似結合至表現人類PD-1之CHO細胞(上圖)，及與親本純系mAb1類似結合至表現人類PD-L1之CHO細胞(下圖)。圖 18B 顯示雙特異性體3顯示與親本純系mAb28類似結合至表現食蟹猴PD-1之CHO細胞(上圖)，及與親本純系mAb1類似結合至表現食蟹猴PD-L1之CHO細胞(下圖)。圖 18C 顯示雙特異性體3顯示與親本純系mAb28類似結合至表現小鼠PD-1之CHO細胞(上圖)，及與親本純系mAb1類似結合至表現小鼠PD-L1之CHO細胞(下圖)。圖 18D 顯示雙特異性體3於蛋白A層析法後之尺寸排阻層析跡線(上圖)，其證實具有大於98%純度之單峰及雙特異性體3之示差掃描螢光法(DSF)跡線(下圖)，其證實該分子具有高的熱穩定性。
序列 SEQ ID NO: 114 (GenBank寄存編號NP_005009.2，UniProt Q15116 –全長人類PD-1前驅體) mqipqapwpv vwavlqlgwr pgwfldspdr pwnpptfspa llvvtegdna tftcsfsnts esfvlnwyrm spsnqtdkla afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsv vrarrndsgt ylcgaislap kaqikeslra elrvterrae vptahpspsp rpagqfqtlv vgvvggllgs lvllvwvlav icsraargti garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqw rektpeppvp cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadg prsaqplrpe dghcswpl SEQ ID NO: 115 (GenBank寄存編號NP_054862.1，UniProt Q9NZQ7 –人類PD-L1) mrifavfifm tywhllnaft vtvpkdlyvv eygsnmtiec kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg adykritvkv napynkinqr ilvvdpvtse heltcqaegy pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin tttneifyct frrldpeenh taelvipelp lahppnerth lvilgaillc lgvaltfifr lrkgrmmdvk kcgiqdtnsk kqsdthleet SEQ ID NO: 116 (GenBank寄存編號NP_079515.2，UniProt Q9BQ51 –人類PD-L2) miflllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk asyrkinthi lkvpetdeve ltcqatgypl aevswpnvsv pantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvr eltlasidlq sqmeprthpt wllhifipfc iiafifiatv ialrkqlcqk lysskdttkr pvtttkrevn sai
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圖 1 顯示於用包括派姆單抗x阿特珠單抗雙特異性、納武單抗(Nivolumab)x阿特珠單抗雙特異性、KEYTRUDA及阿特珠單抗之混合物、及納武單抗及阿特珠單抗之混合物之各種抗體混合物或雙特異性抗體處理之混合淋巴細胞反應(MLR)檢定中之干擾素-γ (IFNγ)的誘導，與單獨KEYTRUDA相比。結果顯示在所測試抗體之最終濃度下之以pg/mL計之IFNγ的濃度，如所指示。
圖 2 顯示於用包括派姆單抗x納武單抗雙特異性、阿特珠單抗x阿特珠單抗四價融合、納武單抗及阿特珠單抗之各種單株及雙特異性抗體處理之混合淋巴細胞反應(MLR)檢定中之干擾素-γ (IFNγ)的誘導，與單獨KEYTRUDA相比。結果顯示在所測試抗體之最終濃度下之以pg/mL計之IFNγ的濃度，如所指示。
圖 3 顯示派姆單抗x阿特珠單抗雙特異性體之示意圖及胺基酸序列。針對派姆單抗_aglyco-IgG1-(G4S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 104)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 105)及針對阿特珠單抗_ FabH-(G4S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 106)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 107)提供單獨序列。
圖 4 顯示納武單抗x阿特珠單抗雙特異性體之示意圖及胺基酸序列。針對納武單抗aglyco-IgG1-(G4 S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 108)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 109)及針對阿特珠單抗FabH-(G4S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 106)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 107)提供單獨序列。
圖 5 顯示949 aglyco-IgG1x阿特珠單抗雙特異性體之示意圖及胺基酸序列。針對949_aglyco-IgG1-(G4 S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 110)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 111)及針對阿特珠單抗_ FabH-(G4S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 106)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 107)提供單獨序列。
圖 6 顯示阿特珠單抗x納武單抗雙特異性體之示意圖及胺基酸序列。針對阿特珠單抗_aglyco-IgG1-(G4S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 112)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 107)及納武單抗_HC Fab-(G4S)4 重鏈(H鏈；SEQ ID NO: 113)及輕鏈(L鏈；SEQ ID NO: 109)提供單獨序列。
圖 7 顯示作為在各種濃度下測試之抗體之函數之混合淋巴細胞反應(MLR)檢定中的IFN-γ釋放，單位pg/mL (右圖)。此等結果指示呈多特異性形式之雙特異性抗體PD-1xPD-L1 (派姆單抗x阿特珠單抗)或(納武單抗x阿特珠單抗)與派姆單抗及阿特珠單抗之混合物或納武單抗及阿特珠單抗之混合物相比在飛莫耳濃度下誘導更大IFN-γ反應。顯示針對mAb前驅體之雙特異性形式之尺寸排阻層析法(左圖)。
圖 8 顯示識別證明協同作用之多特異性(例如，雙特異性)抗體之工作流程的實例。該過程包括於混合淋巴細胞反應(MLR)檢定中無偏篩選檢查點阻斷劑組合，該檢定量測各種濃度下之IFN-γ釋放，單位pg/mL。於所說明工作流程之第二步驟中，產生共同輕鏈雙特異性體以進一步測試其功效；此處，描述各種雙特異性形式。在T細胞活化檢定中，經識別之雙特異性形式勝過已知PD-1阻斷劑。
圖 9A 至 9B 顯示在抗原非特異性T細胞檢定中，雙特異性體3與同種型對照抗體及KEYTRUDA二者相比，誘導更高之藉由CD3/CD28擴增之T-細胞之K562-CD32-PDL1靶細胞殺死(圖 9A )及增加之IFNγ產生(圖 9B )。甚至在0.01 nM之低濃度下可見此增加之藉由雙特異性體3之殺死。
圖 10A 至 10B 顯示雙特異性體3對腫瘤細胞殺死之效應。圖 10A 顯示雙特異性體3與KEYTRUDA及mAb1與mAb28之組合二者相比增加K562-A2-CMV-PDL1腫瘤抗原靶細胞藉由在0.001至0.01 nM之低濃度下之CMV特異性T-細胞之特異性殺死，指示雙特異性體3可用於介導靶細胞在較低劑量下之抗原特異性殺死。圖 10B 顯示雙特異性體3較KEYTRUDA或mAb1與mAb28之組合在藉由在0.001 nM之低濃度下之CMV特異性T-細胞特異性殺死Raji-A2-CMV-PDL1細胞腫瘤抗原靶細胞中更有效，再次指示雙特異性體3可用於介導靶細胞在較低劑量下之抗原特異性殺死。
圖 11 顯示於SEA刺激檢定中，在所有測試劑量下，雙特異性體3較KEYTRUDA誘導更多的IL-2。重要的是，雙特異性體3與KEYTRUDA及mAb1與mAb28二者相比誘導增加之在更低抗體濃度下開始之IL-2產生。
圖 12A 至 12G 證實雙特異性體3具有引起PD-1之內部化及隨後降解或PD-1之表現之損失的獨特能力，及此性質係取決於分子之PD-1靶向臂及PD-L1靶向臂二者之接合。圖 12A 至 12B 證實當與同種型對照、KEYTRUDA、mAb1與mAb28、阿特珠單抗、或阿特珠單抗與KEYTRUDA相比時，僅雙特異性體3導致PD-1之內部化及隨後降解或PD-1表現之損失。此外，如圖 12C 中所示，當在添加雙特異性體3之前5分鐘將抗PD-L1抗體mAb1在50 nM下添加至孔中時，雙特異性體3驅動PD-1內部化之能力喪失。此表明雙特異性體3之兩個臂應經接合以驅動PD-1表現損失及/或內部化及/或降解。圖 12D 顯示當雙特異性體之兩個結合臂同時接合時，經雙特異性體3處理增加上清液中之PD-1之量。當PD-L1靶向臂藉由mAb1阻斷時，此效應喪失。此表明雙特異性體3增加PD-1進入上清液之脫落。圖 12E 證實結合臂之價影響PD-1表現之損失程度。製備雙特異性體5，其具有基於mAb1之VH及VL序列之第一N端Fab結合PD-L1且具有基於mAb28之VH及VL序列之第二N端Fab結合PD-1。換言之，雙特異性體5與雙特異性體3 (其具有結合PD-L1之二價臂及結合PD-1之二價臂)相比具有一個結合PD-L1之單價臂及一個結合PD-1之單價臂。如所示，PD-1表現之損失在雙特異性體5 (二價)相比雙特異性體3 (四價)之更高劑量下開始出現，表明雙特異性體3之增加之價對此差異負責。圖 12F 證實用巴馬司他(Batimastat)(其為多種MMP及ADAM (負責使蛋白質自細胞質膜裂解之脫落酶或蛋白酶)之廣譜抑制劑)預處理極大減少細胞相關之PD-1損失之量，這表明PD-1損失或脫落係由於藉由MMP或ADAM蛋白酶之裂解。圖 12G 表明當雙特異性體3結合至呈反式構型(即，藉由不同細胞表現)之PD-1及PD-L1時，其主要驅動細胞表面PD-1表現之損失。
圖 13A 至 13B 顯示使用雙特異性體3之活體內結果。圖 13A 描繪實驗方案之示意圖。圖 13B 證實雙特異性體3及組合mAb1與mAb28組二者與同種型及KEYTRUDA組二者相比顯著延遲腫瘤生長。此外，在第24天，在雙特異性體3組與經mAb1與mAb28之組合處理之組之間存在顯著分歧，其中雙特異性體3與該組合相比引起腫瘤生長之更大延遲。無T細胞轉移組較含有T細胞之任何組具有更侵略性生長之腫瘤。於此模型中，KEYTRUDA在延遲KACP腫瘤生長方面與同種型對照相比不提供效益。
圖 14A 至 14B 顯示於K562-A2-CMV-PD-L1腫瘤小鼠模型中使用雙特異性體3之活體內結果。圖 14A 及 14B 為說明以下之圖：雖然不同處理組各者與未經處理之小鼠相比導致平均腫瘤生長之延遲，但是用T細胞及雙特異性體3處理導致隨時間之平均腫瘤生長之最大延遲。無T細胞轉移組較含有T細胞之任何組具有更侵略性生長之腫瘤。於此模型中，KEYTRUDA在延遲K562-A2-CMV-PD-L1腫瘤生長方面與同種型對照相比不提供效益。
圖 15A 至 15B 說明於若干協同腫瘤模型中使用雙特異性體3之活體內結果。圖 15A 為顯示EMT-6協同腫瘤模型經雙特異性體3處理與對照處理相比導致腫瘤生長之更大延遲的圖。圖 15B 為顯示MB49協同腫瘤模型經雙特異性體3處理與對照處理相比導致腫瘤生長之更大延遲的圖。
圖 16A 至 16B 顯示於人源化PD-1/PD-L1轉殖基因小鼠之MC38-hPD-L1模型中使用雙特異性體1之活體內結果。圖 16A 顯示KEYTRUDA及雙特異性體1處理二者與經對照處理之小鼠相比均有效控制MC38-hPD-L1腫瘤小鼠之腫瘤生長。圖 16B 為生存率圖及說明雙特異性體1與經對照處理之小鼠相比增加MC38-PD-L1腫瘤小鼠之生存率。
圖 17A 至 17F 說明於B16F10-hPD-L1模型中使用雙特異性體3之活體內結果。圖 17A 為各顯示不同處理對B16F10-HuPD-L1小鼠之15天截止時量測之腫瘤生長之影響的一系列圖。不同組小鼠(n=8)係經雙特異性體3、KEYTRUDA、阿伏魯單抗(Avelumab)、KEYTRUDA +阿伏魯單抗組合、或同種型對照抗體處理。圖 17A 顯示各組之個別腫瘤體積跡線。轉移酶係於腫瘤大小截止之前死亡之多隻小鼠中識別。圖 17B 顯示跨處理組之平均腫瘤體積之差異，證實到於腫瘤細胞接種後第15天，雙特異性體3處理延遲B16F10-HuPD-L1小鼠中之平均腫瘤生長，較所測試之其他處理中之任一者顯著更長。****，P＜0.0001；**，P＜0.01，*，P＜0.05，二因子ANOVA及塔基多重比較檢驗。圖 17B 為比較不同處理對B16F10-HuPD-L1小鼠之在15天截止時量測之腫瘤體積之影響的圖。轉移酶係於腫瘤大小截止之前死亡之多隻小鼠中識別。如圖 17B 中所示，雙特異性體3處理延遲B16F10-hPD-L1小鼠中之平均腫瘤生長，較所測試之其他處理中之任一者顯著更長。圖 17C 為生存率圖及說明與利用所測試之其他處理中之任一者之生存率相比，經雙特異性體3處理增加B16F10-hPD-L1腫瘤小鼠之生存率。圖 17D 顯示到腫瘤細胞接種後第21天，雙特異性體3處理繼續延遲B16F10-hPD-L1小鼠中之平均腫瘤生長，顯著好於經KEYTRUDA處理。圖 17E 為生存率圖及說明與利用所測試之其他處理中之任一者之生存率相比，經雙特異性體3處理增加B16F10-HuPD-L1腫瘤小鼠之生存率。圖 17F 提供顯示不同處理組各者之無腫瘤小鼠之數目的表格。經雙特異性體3處理之組具有3隻無腫瘤小鼠，而KEYTRUDA與阿伏魯單抗之組合具有1隻無腫瘤小鼠。
圖 18A 至 18D 證實雙特異性體3具有類似於行為良好單株抗體之類藥物性質(DLP)且維持親本PD-1及PD-L1結合。圖 18A 顯示雙特異性體3顯示與親本純系mAb28類似結合至表現人類PD-1之CHO細胞(上圖)及與親本純系mAb1類似結合至表現人類PD-L1之CHO細胞(下圖)。圖 18B 顯示雙特異性體3顯示與親本純系mAb28類似結合至表現食蟹猴PD-1之CHO細胞(上圖)及與親本純系mAb1類似結合至表現食蟹猴PD-L1之CHO細胞(下圖)。圖 18C 顯示雙特異性體3顯示與親本純系mAb28類似結合至表現小鼠PD-1之CHO細胞(上圖)及與親本純系mAb1類似結合至表現小鼠PD-L1之CHO細胞(下圖)。圖 18D 顯示雙特異性體3於蛋白質A層析後之尺寸排阻層析跡線(上圖)，其證實具有大於98%純度之單峰，以及雙特異性體3之示差掃描螢光法(DSF)跡線(下圖)，其證實分子具有高的熱穩定性。
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Claims (25)

  1. 一種多特異性抗原結合構築體，其包含至少兩個抗原結合臂，其中：第一臂結合PD-1且包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該第一臂之該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：77之CDRH1、SEQ ID NO：71之CDRH2及SEQ ID NO：75之CDRH3，第二臂結合PD-1配位體且包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該第二臂之該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：1之CDRH1、SEQ ID NO：7之CDRH2及SEQ ID NO：8之CDRH3；其中該第一臂之該輕鏈可變區及該第二臂之該輕鏈可變區各包含SEQ ID NO：9之CDRL1、SEQ ID NO：5之CDRL2及SEQ ID NO：10之CDRL3；且其中該多特異性抗原結合構築體阻斷PD-1與PD-1配位體之相互作用。
  2. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第二細胞為表現PD-L1之腫瘤細胞。
  3. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂結合PD-1，且該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：90至少85%相同之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂結合PD-1，且該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：90至少90%相同之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第二臂結合PD-L1，且該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：55至少90%相同之胺基酸序列。
  6. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一及第二抗原結合臂各包含共同輕鏈可變區。
  7. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該構築體包含至少兩個結合PD-1之臂，及至少兩個結合PD-L1之臂。
  8. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該構築體包含特異性針對PD-1之二價抗體，及特異性針對PD-L1之二價抗體，其中該特異性針對PD-1之二價抗體及特異性針對PD-L1之二價抗體係經連接。
  9. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該構築體包含與SEQ ID NO：100之胺基酸序列至少85%相同之重鏈胺基酸序列，且其中該構築體包含與SEQ ID NO：101之胺基酸序列至少85%相同之輕鏈胺基酸序列。
  10. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該構築體包含含有SEQ ID NO：100之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列，且其中該構築體包含含有SEQ ID NO：101之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列。
  11. 一種如請求項1至10中任一項之多特異性抗原結合構築體的用途，其係用於製備治療有需要個體之增殖性病症及/或增強免疫反應之藥物。
  12. 如請求項11之用途，其中該增殖性病症為癌症。
  13. 如請求項11之用途，其中該多特異性抗原結合構築體結合在癌症細胞之表面上表現之PD-L1。
  14. 如請求項11之用途，其中該增殖性病症為選自由以下組成之群之癌症：血癌、神經癌、黑色素瘤、乳癌、肺癌、頭頸癌、胃腸癌、肝癌、胰癌、泌尿生殖器癌、骨癌、及血管癌。
  15. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少95%相同之胺基酸序列。
  16. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。
  17. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂之該重鏈可變 區包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列。
  18. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少95%相同之胺基酸序列。
  19. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第二臂之該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。
  20. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第二臂之該重鏈可變區包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列。
  21. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂之重鏈具有與SEQ ID NO：100之胺基酸序列至少95%相同之胺基酸序列，且其中該第一臂及該第二臂之輕鏈具有與SEQ ID NO：101之胺基酸序列至少90%相同之胺基酸序列。
  22. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂之重鏈具有與SEQ ID NO：100之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列，且其中該第一臂及該第二臂之輕鏈具有與SEQ ID NO：101之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。
  23. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第一臂結合藉由免疫細胞表現之PD-1。
  24. 如請求項1之多特異性抗原結合構築體，其中該第二臂結合藉由第二細胞表現之PD-1配位體。
  25. 如請求項24之多特異性抗原結合構築體，其中該第二細胞為腫瘤細胞，且該PD-1配位體為PD-L1。
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