TWI820034B - 眼部疾病之細胞模式及用於眼部疾病的療法 - Google Patents

眼部疾病之細胞模式及用於眼部疾病的療法 Download PDF

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Abstract

本申請案揭示眼睛疾病之細胞模式。此外，本申請案揭示用於治療或預防眼睛疾病之方法及組成物。

Description

眼部疾病之細胞模式及用於眼部疾病的療法
相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 U.S.C.§ 119(e)主張2017年7月31日申請之名稱為「CELLULAR MODELS OF AND THERAPIES FOR OCULAR DISEASES」的美國申請案第62/539,473號的優先權。以上申請案之整個內容茲此以引用之方式併入。
本發明係有關於眼部疾病之細胞模式及用於眼部疾病的療法。
發明背景
結晶樣視網膜色素變性(Bietti's Crystalline Dystrophy，BCD)
結晶樣視網膜色素變性(BCD，又名結晶樣角膜視網膜變性(Bietti Crystalline Corneoretinal Dystrophy)、結晶樣視網膜病變(Bietti Crystalline Retinopathy)、Bietti視網膜變性(Bietti's Retinal Dystrophy)(OMIM 210370))為一種罕見的體染色體隱性且致盲的視網膜變 性，其特徵在於在視網膜的後極存在許多細小閃光的黃白色晶體樣沈積物，與視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)的萎縮、色素凝塊(pigment clumps)及脈絡膜硬化相關。其在1937年由G.B.Bietti博士首次發現。BCD患者之眼底照片及SD-OCT影像顯示，結晶狀沈積物主要位於視網膜色素上皮(RPE)之視網膜側。(H.Kojima,A.Otani,K.Ogino等人，「Outer retinal circular structures in patients with Bietti crystalline retinopathy」,British Journal of Ophthalmology，第96卷，第390-393頁，2012)。角膜緣(corneal limbus)中的結晶狀沈積物被估計發生於具有BCD之人的四分之一至三分之一中(Kaiser-Kupfer等人Clinical biochemical and pathologic correlations in Bietti's crystalline dystrophy,Am J Ophthalmol.,1994,118：569-82)。在一些情況下，亦在晶狀體中觀測到晶體沈積物(Chung等人，J Ophthalmol.57：447-450,2013)。在晚期階段，BCD患者具有晚期脈絡膜硬化，結晶狀沈積物減少或不存在，且視網膜血管變薄(Wada等人Am J Ophthalmol 2005；139：894-9)。在BCD中亦存在異常的ERG及視網膜變薄。
在臨床上，BCD為進行性的且與RPE的變性及退化相關。常見同一患者之雙眼間存在顯著的不對稱。疾病發作年齡及進程隨BCD患者而異，即使是在同一家族內。大部分患者會發展出夜盲症、視野收縮、色覺(color vision)差、黃斑退化且在生命的第2個與第4個十 年間視力下降，並在生命的第3個與第6個十年間進行至法定盲(legal blindness)。
RPE位於脈絡膜毛細管層血管與光感受器之感光外部區段之間，其為與光感受器(視錐及視桿)密切地相互作用以維持視覺功能的單層色素細胞。RPE之主要功能為供給營養，且從光感受器去除廢物，光感受器為感覺神經視網膜。RPE的其他功能包括但不限於：光吸收、上皮運輸、空間離子緩衝(spatial ion buffering)、視覺週期(visual cycle)、吞噬作用、分泌及免疫調節(Strauss,2005,The retinal pigment epithelium in visual function.Physiol Rev 85：845-81)。因此，RPE的功能障礙及退化引起導致視力喪失的光感受器功能障礙及退化。考慮到BCD是與RPE之進行性變性及退化相關，RPE對於研究及治療BCD而言至關重要。
BCD為罕見疾病。一個資料來源估計BCD發病率為1：67,000(全球資訊網(World Wide Web)上之ghr.nlm.nih.gov/condition/bietti-crystalline-dystrophy#statistics)。另一個資料來源估計BCD盛行率為所有RP患者之2.5%(121名RP指標性患者(index patients)中有3名BCD指標性患者，參見Mataftsi等人，Retina.24：416-426,2004)。基於此估計且考慮到RP發病率被估計為1：4000(Hartong等人，Lancet.368：1795-1809,2006)，BCD發病率被估計為1：160,000。因為BCD症狀相似於其他進行性地破壞視網膜之眼睛病症的症狀，所以 有時一般被診斷為視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)(Mataftsi A等人Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy：a cross-sectional study.Retina.2004；24：416-426)。雖然世界不同地區都報導有BCD患者，包括亞洲、非洲、歐洲、中東、北美洲及南美洲，但是BCD被報導較常見於具有東亞血統的人中，尤其是在中國及日本的族群中(Hu 1983,Ophthalmic genetics in China.Ophthal Paed Genet 2：39-45；Li等人，Am J Hum Genet.2004年5月；74(5)：817-826)。
目前尚無經核准用於BCD的治療，且患者最終會失明。對於為患有此罕見疾病的患者開發能改變生活的治療選項，存在有強烈未滿足的醫療需求。
CYP4V2
CYP4V2(細胞色素P450，家族4，亞家族V，多肽2，(OMIM 608614)，同義詞：CYP4AH1)為在細胞色素P450超家族中的蛋白質之一且為血紅素硫醇鹽細胞色素P450亞家族4(CYP4)之成員。細胞色素P450(CYP)為重要的含血紅素的蛋白質，以其等之單加氧酶反應聞名。其等參與異生物質及內源性化合物(諸如類固醇及脂肪酸)的代謝。人類CYP為位於線粒體之內膜中或細胞之內質網中的主要膜相關蛋白。P450蛋白質可以藉由其等之特徵序列元件(signature sequence element)FxxGxxxCxG(SEQ ID NO：30)來鑑定，其中加底線的半胱胺酸係作為血紅素鐵的軸向配位體(axial ligand)。P450 蛋白質之另一特徵序列元件為ExxR(SEQ ID NO：31)。人類基因組計劃(Human Genome Project)已將人類P450基因之數目設定為57。作為參考，有103個小鼠P450基因及89個大鼠P450基因。(Guengerich & Cheng,Pharmacological Reviews,2011年9月，63(3)684-699)。
人類CYP4家族由12個基因及10個偽基因組成。人類CYP4V2基因(HGNC：23198)位於4q35處且具有11個外顯子。CYP4V2基因中之突變導致BCD(Li等人，Am J Hum Genet.74：817-826,2004)。雖然CYP4V2在幾乎所有的組織中表現，但是其在視網膜及RPE中以高位準表現且在角膜中以稍微低的位準表現，該等組織顯示BCD之主要臨床發現(clinical finding)(Li等人，Am J Hum Genet.74：817-826,2004；Nakano M,Kelly EJ,Rettie AE：Expression and Characterization of CYP4V2 as a Fatty Acid omega-Hydroxylase.Drug Metab Dispos 2009；Nakano M,Kelly EJ,Wiek C,Hanenberg H,Rettie AE：CYP4V2 in Bietti's crystalline dystrophy：ocular localization,metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids,and functional deficit of the p.H331P variant.Mol Pharmacol 2012；82：679-686)。
因為CYP4V2為P450家族之相對較新的成員且BCD為罕見疾病，所以CYP4V2之功能尚未被廣泛 地研究。先前的研究顯示，CYP4V2蛋白質主要活躍於脂肪酸代謝中。已證實，在BCD患者之血清、淋巴細胞及皮膚纖維母細胞中存在脂肪酸及其代謝之異常(Lee J,Jiao X,Hejtmancik JF等人：The metabolism of fatty acids in human Bietti crystalline dystrophy.Invest Ophthalmol Vis Sci 2001；42：1707-1714；Lai T,Chu KO,Chan KP等人：Alterations in serum fatty acid concentrations and desaturase activities in Bietti crystalline dystrophy unaffected by CYP4V2 genotypes.Invest Ophthalmol Vis Sci 2010；51：1092-1097)。另一研究顯示，CYP4V2為ω-3-多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)羥化酶且為在經轉化人類RPE細胞株ARPE-19中高度表現P450(Nakano M,Kelly EJ,Wiek C,Hanenberg H,Rettie AE：CYP4V2 in Bietti's crystalline dystrophy：ocular localization,metabolism of omega-3-polyunsaturated fatty acids,and functional deficit of the p.H331P variant.Molecular pharmacology 2012；82：679-686)。
已在CYP4V2基因中鑑定到諸多突變且該等突變引起BCD，其中在基因之11個外顯子中各有至少一個突變。BCD患者中最常見的CYP4V2突變為c.802-8_810del17insGC(係指17個鹼基缺失且二個鹼基(GC)插入於從CYP4V2基因之內含子6的末端起距離8個鹼基的位置中，亦稱為IVS6-8 del/insGC，參見SEQ ID NO：46，其顯示包含c.802-8_810del17insGC突變之人類CYP4V2基因組DNA區域的序列；以及SEQ ID NO：47，其顯示相應的野生型序列)。c.802-8_810del17insGC突變展示於以下顯示人類CYP4V2內含子6-外顯子7接合的序列中。內含子6序列以小寫字母顯示且外顯子7序列以大寫字母顯示。17bp缺失及GC插入係在括號內：caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa(tca tac agG TCA TCG CT)(GC)GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA(SEQ ID NO：46)，導致外顯子7之跳躍(skipping)。(Xiao等人，Biochem Biophys Res Commun.409：181-6,2011；Meng等人，2014,Mol.Vis.,20：1806-14；Wada等人，Am J Ophthalmol.139：894-9,2005；Jiao等人，European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471)。最近的研究估計c.802-8_810del17insGC突變之存在時間(age)在中國族群中為1,040至8,200世代(generations)且在日本族群中為300至1100世代。參見Jiao等人，European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471。
多種類型的CYP4V2突變被發現與BCD相關，包括但不限於誤義(missense)、重複、剪接位、框移、刪除、插入、插入或缺失(indel)、無意義、多型性(例如單核苷酸多型性)及提前終止(premature termination)，以及CYP4V2基因整個缺失。在人類BCD患者中挑選出之CYP4V2突變的概述提供於本文表1且可在各種出版物及 線上資料庫中找到，例如LOVD(全球資訊網上之databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2)、OMIM(全球資訊網上之omim.org/allelicVariant/608614)及ClinVar(全球資訊網上之ncbi.nlm.nih.gov/clinvar？term=608614[MIM])。
Figure 107126585-A0305-02-0010-1
Figure 107126585-A0305-02-0011-2
這僅是一個選擇清單，且可能未包含迄今為止所鑑定及所報導的所有在BCD患者中之病理性CYP4V2突變/變異體。突變係相對於參考序列(NM_207352.3)及(NP_997235.3)而言。在BCD患者中 不斷地鑑定出新的CYP4V2病理性突變。所有與BCD相關的已鑑定的及未來將鑑定的病理性CYP4V2突變/變異體均以引用之方式併入本文中。
遺傳性視網膜退化(Inherited Retinal Degeneration，IRD)
遺傳性視網膜退化(IRD)為失明的主要原因。目前已知IRD及相關病症涉及超過200個基因。在人類中，視網膜色素變性(RP)為IRD之主要形式。RP有三種一般遺傳模式(體染色體顯性、體染色體隱性及X性聯)。估計全世界RP之發病率為4000分之1，其中體染色體隱性RP佔RP之50%-60%(Hartong DT,Berson EL,Dryja TP.Retinitis pigmentosa.Lancet.2006；368：1795-809)。歐洲的一項研究估計，BCD盛行率為所有RP患者的2.5%且為具有非症候群型體染色體隱性RP之人的約10%(Mataftsi A,Zografos L,Millá E,Secr é tan M,Munier FL.Bietti's crystalline corneoretinal dystrophy：a cross-sectional study.Retina.2004；24：416-26)。同一項研究亦指出，BCD常常被普遍地診斷為是RP。因此，BCD可能一直缺乏良好診斷(under-diagnosed)。BCD為世界性疾病，但是其在東亞中最為常見，尤其是在中國及日本族群中(Li等人，Am J Hum Genet.2004年5月；74(5)：817-826)。
關於表1突變之參考文獻：
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發明概要
細胞株請求項
細胞株及疾病模式請求項
細胞株組成物
在一個態樣中，提供一種細胞疾病模式，其包括一細胞株。此類疾病模式包括(a)由個體提供之幹細胞或從由個體提供之細胞所重編程(reprogrammed)的幹細胞，或(2)一細胞，其衍生自由個體提供之幹細胞或衍生自從由個體提供之細胞所重編程的幹細胞，其在目標基因中包含一或多個突變。
在一些實施例中，幹細胞為誘導性多能幹(induced pluripotent stem，iPS)細胞。在一些實施例中，幹細胞為胚胎幹(embryonic stem，ES)細胞、體(或成體)幹細胞或間質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)。在一些實施例中，由個體提供之細胞屬於任何細胞類型及/ 或來自個體之任何組織。在一些實施例中，由個體提供之細胞為皮膚細胞、纖維母細胞或血球。在一些實施例中，其中由個體提供之細胞為皮膚纖維母細胞或周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。在一些實施例中，由個體提供之細胞為尿路細胞(urinary cell)、腎上皮細胞、毛囊或真皮乳頭細胞(dermal papilla cell)。
在一些實施例中，衍生自幹細胞之細胞為眼細胞(ocular cell)。在一些實施例中，眼細胞為視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞(photoreceptor cell，PRC，包括視桿細胞、視錐細胞及光感受器先驅細胞)、視網膜細胞、角膜細胞、角膜上皮細胞(corneal epithelial cell，CEC)、視神經細胞、晶狀體細胞、脈絡膜內皮(choroidal endothelial，CE)細胞、視神經細胞或脈絡膜細胞。在一些實施例中，衍生自幹細胞之細胞為神經元細胞。
在一些實施例中，該突變對個體而言為內源性的。在一些實施例中，該突變對個體而言為外源性的。在一些實施例中，該突變經由基因編輯(genetic editing)或基因操作(genetic manipulation)而人工引入。在一些實施例中，細胞株包含多個對個體而言為內源性及/或外源性的突變。
在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。
在一些實施例中，目標基因包含表4中所闡述之基因。在一些實施例中，目標基因包含突變的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、 CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。在一些實施例中，目標基因為CYP4V2。
在一些實施例中，細胞株包含iPS細胞。在一些實施例中，細胞株包含iPS-RPE細胞。在一些實施例中，細胞株包含iPS-光感受器(iPS-PRC)細胞、iPS-角膜上皮細胞(iPS-CEC)、iPS-脈絡膜內皮(CE)細胞、iPS-角膜細胞、iPS-脈絡膜細胞、iPS-視神經細胞、iPS-眼細胞或iPS-神經元細胞。在一些實施例中，細胞株中之CYP4V2突變對個體而言為內源性的。在一些實施例中，個體在CYP4V2基因中或在CYP4V2基因之異種同源物(ortholog)中具有病理性突變。
在一些實施例中，個體具有表1中所闡述之至少一個突變。在一些實施例中，個體具有遺傳性視網膜退化(IRD)或視網膜色素變性(RP)。在一些實施例中，個體具有結晶樣視網膜色素變性(BCD，又名結晶樣角膜視網膜變性、結晶樣視網膜病變、Bietti視網膜變性)或處於罹患BCD的風險中。
在一些實施例中，細胞株包含CYP4V2突變，該突變對個體而言為外源性的且係經由基因編輯或基因操作而人工引入。
在一些實施例中，細胞株包含iPS細胞、ES細胞、MSC或成體幹細胞，或是衍生自iPS細胞、ES細胞、MSC或成體幹細胞的RPE細胞、光感受器細胞、角膜上皮細胞、脈絡膜內皮(CE)細胞或脈絡膜細胞。在一些 實施例中，iPS細胞或其他類型的幹細胞的特徵在於以下之一或多者：a. iPS、ES或MSC之獨特形態；b.一或多種多能性標記物，諸如Oct-4、Sox-2、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、NANOG及AP；c.分化成所期望之細胞類型(例如，RPE)的能力；及/或d.畸胎瘤分析(terotoma assay)。
在一些實施例中，iPS-RPE細胞或衍生自其他類型之幹細胞的RPE細胞的特徵在於：a.形態：色素及六角形，及/或b.以下生物標記物中之一或多者：視黃醛結合蛋白1(retinaldehyde-binding protein 1，RLBP1，別名：CRALBP)、RPE65、斑萎蛋白-1(BESTROPHIN-1)、MITF、LRAT、RDH5、PAX6、MERTK、TYR、ZO-1及/或黏著斑蛋白(VINCULIN)。
在另一態樣中，提供BCD人類細胞模式或CYP4V2功能細胞模式。此類模式包括包含衍生自BCD患者之細胞或細胞株或衍生自具有人工產生之CYP4V2突變的細胞或細胞株的iPS細胞或iPS細胞株，或iPS-RPE細胞或iPS-RPE細胞株。
在一些實施例中，該細胞株相比於健康對照組之相應細胞株在以下化合物群組中之一或多種化合物具有異常生化譜(biochemical profile)：(i)脂肪酸、(ii)神經醯胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神經鞘胺醇、(v)二氫鞘胺醇或(vi)羥基-脂肪酸。在一些實施例中，該細胞株相比於健康對照組之相應細胞株在表2中所闡述之一或多種化合物具有異 常生化譜。
製作細胞疾病模式之方法：
在另一態樣中，提供製作由iPS衍生之BCD疾病模式的方法。此類方法包括：從在CYP4V2基因中具有內源性突變之個體獲得細胞，或是獲得在CYP4V2基因中無內源性突變但是在此階段或以下任一階段經由基因編輯或基因操作而人工引入外源性CYP4V2突變的細胞；誘導該等細胞中之多能性或重編程該等細胞以產生iPSC；在引起iPSC分化成所期望的眼細胞的條件下培養iPSC，從而產生由iPS衍生之眼細胞株。
在一些實施例中，從個體獲得的細胞為體細胞。在一些實施例中，從個體獲得的細胞為皮膚細胞、纖維母細胞、血球、周邊血液單核細胞(PBMC)或眼細胞。在一些實施例中，從個體獲得的細胞為尿路細胞、腎上皮細胞、毛囊或真皮乳頭細胞。在一些實施例中，眼細胞為視網膜色素上皮(RPE)細胞、角膜上皮細胞(CEC)、光感受器細胞(PRC)、脈絡膜內皮(CE)細胞、視神經細胞、視網膜細胞、角膜細胞或脈絡膜細胞。在一些實施例中，使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC轉錄因子中之一或多者，誘導多能性或重編程細胞。
在一些實施例中，突變為病理性的。在一些實施例中，細胞株包含表1中所闡述之突變中的一或多種突變。在一些實施例中，細胞株對於突變而言為雜合(heterozygous)的。在一些實施例中，細胞株對於突變而 言為純合(homozygous)的。
在一些實施例中，相比於健康對照組之相關細胞株中之位準，細胞疾病模式顯示來自以下化合物群組之一或多種化合物的異常位準：(i)脂肪酸、(ii)神經醯胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神經鞘胺醇、(v)二氫鞘胺醇或(vi)羥基-脂肪酸。在一些實施例中，相比於健康對照組之相關細胞株中之表2中所闡述之一或多種化合物的位準，細胞疾病模式顯示異常位準。
生化分析方法：
在一個態樣中，提供一種發現疾病細胞模式中之異常或表型的方法。此類方法通常包括在患者細胞株(或經基因編輯或操作而在該基因中包含引起該疾病之外源性突變的細胞株)與健康對照組之細胞株之間評估及比較一或多種化合物之位準，其中一或多種化合物係選自下組：(i)脂肪酸、(ii)神經醯胺、(iii)鞘磷脂、(iv)神經鞘胺醇、(v)二氫鞘胺醇及/或(vi)羥基-脂肪酸。
在一些實施例中，所評估之化合物中之一或多者闡述於表2中。在一些實施例中，使用LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS、GC-MS/MS及/或FIA-MS/MS進行化合物位準之鑑定及/或評估。在一些實施例中，疾病細胞模式包含表4中所闡述之突變的或有缺陷的基因。在一些實施例中，疾病細胞模式包含以下基因中的突變的或有缺陷的基因：CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、 AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
使用BCD細胞模式(藥物、劑量及裝置篩選)之方法
在另一態樣中，提供一種篩選用於針對BCD之治療功效的測試劑的方法。此類方法通常包括：使來自衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株的細胞或來自因為人工基因編輯或操作而包含突變的或有缺陷的CYP4V2基因之iPS-RPE細胞株的細胞與測試劑接觸；及針對以下各者評估該等細胞：相比於接觸該測試劑之前，表2中所闡述之一或多種化合物之位準的標準化；該等細胞中之無缺陷的CYP4V2核酸序列之增加；該等細胞中之CYP4V2多肽之量的增加；及/或改良的細胞結構、形態或功能；其中相比於用該測試劑處理之前，表2中所闡述之一或多種化合物之位準的標準化；該等細胞中之無缺陷的CYP4V2核酸序列之增加；該等細胞中之CYP4V2多肽之量的增加；及/或改良的細胞結構、形態或功能，表明測試劑展現針對BCD之治療功效。
在一些實施例中，測試劑係選自由以下組成之群：核酸或其類似物、含有核酸序列或編碼多肽之載體、多肽或其類似物、抗體、化學物質、小分子及/或其任何組合。在一些實施例中，該等細胞係使用PCR技術、免疫分析、定序、生化分析、功能分析、顯微術或其組合來評估。
在另一態樣中，提供一種篩選包含用於BCD之測試劑的製劑、載體或構建體之功效或效率的方法。此類方法通常包括：使來自衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株的多個細胞樣品或來自因為人工基因編輯或操作而包含突變的或有缺陷的CYP4V2基因之iPS-RPE細胞株的多個細胞樣品與配製或包裝於各種製劑、載體或構建體中之測試劑接觸；及針對以下各者評估該等細胞樣品：相比於用該測試劑處理之前及/或相比於用相同的但配製或包裝於不同製劑、載體或構建體中之測試劑處理的細胞樣品，表2中所闡述之一或多種化合物之位準的標準化；該等細胞中之無缺陷的CYP4V2核酸序列之增加；該等細胞中之CYP4V2多肽之量的增加；改良的細胞結構、形態或功能；及/或細胞耐受性或死亡，用以測定及比較該製劑、載體或構建體之效率或功效；其中該等細胞係使用PCR技術、免疫分析、定序、生化分析、細胞活力分析、顯微術或其組合來評估。
在一個態樣中，提供一種篩選用於BCD之測試劑之有效及安全劑量範圍的方法。此類方法通常包括：使來自衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株的多個細 胞樣品或來自因為人工基因編輯或操作而包含突變的或有缺陷的CYP4V2基因之iPS-RPE細胞株的多個細胞樣品與測試劑以針對各細胞樣品之不同劑量接觸；針對以下各者評估該等細胞樣品：相比於用該測試劑處理之前及/或相比於用相同測試劑但用不同劑量處理的細胞樣品，表2中所闡述之一或多種化合物之位準的標準化；該等細胞中之無缺陷的CYP4V2核酸序列之增加；該等細胞中之CYP4V2多肽之量的增加；改良的細胞結構、形態或功能及/或細胞耐受性或死亡，用以測定及比較不同劑量之有效性及安全性，從而確定恰當的劑量範圍；其中該等細胞係使用PCR技術、免疫分析、定序、生化分析、細胞活力分析、功能分析、顯微術或其組合來評估。
在另一態樣中，提供一種篩選用於向視網膜或視網膜細胞遞送治療劑之遞送裝置或方法或評估其功效或效率的方法。此類方法通常包括：(i)在不採用該遞送裝置或方法的情況下，使來自衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株的細胞樣品或來自因為人工基因編輯或操作而包含突變的或有缺陷的CYP4V2基因之iPS-RPE細胞株的細胞樣品與測試劑接觸；(ii)採用該遞送裝置或方法，使來自衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株的另一個細胞樣品或來自因為人工基因編輯或操作而包含突變的或有缺陷的CYP4V2基因之iPS-RPE細胞株的另一個細胞樣品與跟(i)中相同劑量的該測試劑接觸；(iii)針對以下各者評估及比較來自(i)及(ii)之細胞樣品：相比於在用該測試劑處理 及/或用相同劑量的相同測試劑但是不採用該遞送裝置或方法進行處理之前，表2中所闡述之一或多種化合物之位準的標準化；該等細胞中之無缺陷的CYP4V2核酸序列之增加；該等細胞中之CYP4V2多肽之量的增加；改良的細胞結構、形態或功能；細胞耐受性或死亡；及/或該測試劑在該等細胞中之位準，從而測定該遞送裝置或技術之功效或效率；其中該等細胞係使用PCR技術、免疫分析、定序、生化分析、功能分析、顯微術或其組合來評估。
在一些實施例中，視網膜細胞為RPE細胞。
CRISPR基因編輯療法
在一個態樣中，提供一種組成物，其包括：(a)靶向距離CYP4V2基因100bp或100bp內之核酸序列(「目標序列」)的CRISPR引導RNA，及(b)功能性CRISPR相關蛋白(Cas)。在一些實施例中，此類組成物可以進一步包括(c)供體核酸序列，該供體核酸序列包含該CYP4V2基因之野生型序列或功能序列之全部或一部分，其用於校正、破壞或替代CYP4V2基因或其一部分。
在一些實施例中，其一或多種組分按以下形式提供：編碼該組分之DNA分子、編碼該組分之mRNA分子、RNA分子、多肽及/或核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)或蛋白質-RNA複合物。在一些實施例中，其二種或更多種組分係在各別分子中或組合於一個分子或一個複合物中、在各別載體中或組合於一個載體中、在一或多個核酸複合物中、在一或多個RNP複 合物中。在一些實施例中，供體核酸序列以單股供體寡核苷酸(single-stranded donor oligonucleotide，ssODN)或載體形式提供。在一些實施例中，載體為質體、重組AAV載體、重組慢病毒載體及/或其組合。
在一些態樣中，提供一種包括具有病理性CYP4V2突變之細胞的組成物，其包含本文中所描述之組成物中之任一者。在一些實施例中，(a)該CRISPR引導RNA包含(i)CRISPR RNA(crRNA)，其包含與距離目標基因(「目標基因」)100bp或100bp內之目標序列互補的原型間隔區元件序列(protospacer element sequence)及對應於反式活化crRNA(tracrRNA)之互補區的序列，及(ii)tracrRNA，其包含與該crRNA之對應區域互補的區域及與CRISPR相關蛋白9(Cas9)相互作用的序列，且(b)該功能性CRISPR相關蛋白包含Cas9。
在一些實施例中，原型間隔區元件為約20個鹼基、約19個鹼基、約21個鹼基、約19-21個鹼基、約18-22個鹼基或約16-24個鹼基。在一些實施例中，crRNA及tracrRNA在各別分子中。在一些實施例中，將crRNA及tracrRNA組合成單引導RNA(single guide RNA，sgRNA)。在一些實施例中，sgRNA為約88-150bp。
在一些實施例中，Cas9包含Cas9異種同源物或突變型Cas9，其選自：釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(SpCas9)、SpCas9切口酶(nickase)(Cas9n D10A)、SpCas9(D1135E)、eSpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9 VRER、SpCas9 VQR、SpCas9EQR、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)、腦膜炎雙球菌(Neisseria Meningitidis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumnoniae)、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、變種鏈球菌(Streptococcus mutans)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、犬黴漿菌(mycoplasma canis)及糞腸球菌(enterococcus faecalis)。在一些實施例中，CRISPR相關蛋白Cas9或Cpf1進一步包括一個、二個、三個或更多個位於N端及/或C端的核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)，及/或選擇標記物，其包括但不限於GFP或EGFP。
在一些實施例中，(a)CRISPR引導RNA包含crRNA，該crRNA包含與距離目標基因100bp或100bp內之目標序列互補的原型間隔區元件序列，且(b)功能性CRISPR相關蛋白包含Cpf1。在一些實施例中，原型間隔區元件為約20個鹼基、約21個鹼基、約22個鹼基、約23個鹼基、約24個鹼基、約19-25個鹼基、約18-26個鹼基或約16-28個鹼基。
在一些實施例中，原型間隔區元件序列係選 自由SEQ ID NO：48至52組成之群，或與SEQ ID NO：48至52中之一者共用至少85%序列同一性，其用於與具有NGG作為原型間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)之Cas蛋白質一起使用以靶向CYP4V2基因之c.802-8_810del17insGC突變。在一些實施例中，供體核酸序列係選自SEQ ID NO：56及57(此為二個供體模板序列)或與SEQ ID NO：56及57或其互補序列中之一者共用至少90%序列同一性，其用於校正、破壞或替代CYP4V2基因之c.802-8_810del17insGC突變。
CRISPR基因療法之方法請求項
在另一態樣中，提供一種治療或預防具有突變的CYP4V2基因之個體或細胞中之BCD的方法。此類方法包括(i)經由定序鑑定該個體或該細胞中之病理性突變；(ii)找出跨度為距離參與該突變之第一個核苷酸之上游約100bp至距離參與該突變之最後一個核苷酸之下游約100bp的區域內的Cas相關PAM位點；(iii)鑑定與(ii)中所鑑定的各PAM位點有關的各種靶向該CYP4V2序列之原型間隔區元件序列；(iv)基於該原型間隔區元件序列及PAM，評定包含(iii)中所鑑定之原型間隔區元件序列的各CRISPR引導RNA之活性位準及脫靶編輯譜(off-target editing profile)；(v)基於(iv)選擇一或多個CRISPR引導RNA設計；(vi)基於同源定向修復(homology-directed repair，HDR)設計一或多個供體核酸序列，用於校正、破壞或替代所靶向的CYP4V2突變； (vii)構建如組成物請求項1至18中所提供之該CRISPR引導RNA、Cas及供體核酸序列；(viii)視情況在從該個體分離之細胞、或衍生自該個體之iPS細胞或從衍生自該個體之幹細胞分化的細胞、或從該個體分離之基因組DNA或自其分離或衍生之細胞中，驗證並進一步選擇(vii)之該等組分，以評定該活性位準及/或脫靶編輯譜；以及(ix)經由選自由以下組成之群的遞送系統向該個體或該細胞施用(viii)中之該等組分：核糖核蛋白或蛋白質-RNA複合物、載體、蛋白質、核酸分子、奈米粒子、脂質體、微胞、病毒體、核酸複合物及/或其組合，其中該遞送係藉由電穿孔或經由脂質介導之轉染或核轉染或病毒轉導或注射或其組合進行；(x)其中關於體外細胞中之處理，視情況在(viii)中之該等組分中添加或加上選擇標記物，其包括但不限於GFP、EGFP或嘌呤黴素(puromycin)抗性。
在一個態樣中，提供一種基因編輯組成物，其用於在個體體內或在體外細胞中校正或替代CYP4V2基因中之c.802-8_810del17insGC突變。此類組成物通常包括：(i)CRISPR引導RNA，其包含選自SEQ ID NO：48至52中之一者或與SEQ ID 48至52中之序列中之一者共用至少80%序列同一性的原型間隔區元件序列；(ii)供體核酸序列，其選自SEQ ID NO：56及57中之一者，或與SEQ ID NO：56及57或其互補序列中之一者共用至少90%序列同一性；及(iii)Cas9蛋白質(示範性序列顯示於SEQ ID NO：58中)，其視情況含有1、2、3個或更多個 NLS，及/或選擇標記物，其包括但不限於GFP或EGFP。
在一些實施例中，在原型間隔區元件序列之前添加視情況選用之核苷酸G。在一些實施例中，CRISPR引導RNA包括crRNA(示範性序列(不包括5'原型間隔區元件序列)顯示於SEQ ID NO：53中)及tracrRNA(示範性序列顯示於SEQ ID NO：54中)；且原型間隔區元件序列包含於該crRNA中。在一些實施例中，CRISPR引導RNA包括含有原型間隔區元件序列之單引導RNA(sgRNA)(示範性sgRNA序列(不包括5'原型間隔區元件序列)顯示於SEQ ID NO：55中)。
在一些實施例中，(i)、(ii)及(iii)之一或多種組分按以下形式提供：編碼該組分之DNA分子、編碼該組分之mRNA分子、核酸分子、載體、RNA分子、多肽、核糖核蛋白(RNP)或蛋白質-RNA複合物及/或其組合。
BCD細胞療法、眼部疾病自體細胞療法及組合之治療請求項
BCD細胞療法
針對BCD之無基因修復的同種異體(allogenic)細胞療法或自體細胞療法
在一些態樣中，提供一種治療或預防個體之眼睛疾病的方法，其中該疾病與CYP4V2基因中之病理性遺傳或表觀遺傳改變相關。此類方法通常包括向個體施用細胞組成物，其中該細胞組成物包括：視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器或光感受器先驅細胞(PRC)、角膜 上皮細胞(CEC)、脈絡膜內皮(CE)細胞及/或其他衍生自幹細胞的眼細胞。
在一些實施例中，幹細胞為胚胎幹(ES)細胞、iPC細胞、MSC、成體幹細胞或組織特異性幹細胞。在一些實施例中，幹細胞係來自或衍生自一或多個不具有BCD或不具有病理性CYP4V2基因的個體。在一些實施例中，幹細胞係來自或衍生自一或多個在CYP4V2基因中具有病理性突變的個體。在一些實施例中，個體為人類個體。
針對BCD之基因修復的自體細胞療法
在另一態樣中，提供一種細胞組成物，其包括(a)從分離自患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突變之個體的細胞重編程的幹細胞或從該個體分離的幹細胞，或(b)從幹細胞分化的細胞，該幹細胞分離自患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突變之個體或從分離自該個體之細胞重編程。
在一些實施例中，從分離自該個體之細胞重編程的幹細胞為iPC細胞。在一些實施例中，iPS細胞從該個體之任何組織之任何細胞重編程。在一些實施例中，iPS細胞從皮膚細胞、血球、尿路細胞、毛髮細胞、纖維母細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、腎上皮細胞、毛囊或真皮乳頭細胞重編程。在一些實施例中，從個體分離之幹細胞為MSC、成體幹細胞或組織特異性幹細胞。在一些實施例中，從幹細胞分化之細胞為眼細胞。在一些實施例 中，從幹細胞分化之細胞為RPE細胞、PRC、視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、CEC或CE細胞。在一些實施例中，從幹細胞分化之細胞為iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE細胞。
在一些實施例中，對以下細胞進行基因修復以改善突變的CYP4V2基因之影響：(i)從患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突變之個體分離以用於重編程成iPSC的細胞；(ii)從患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突變之個體分離之幹細胞或從分離自該個體之細胞重編程的iPS細胞；或(iii)從分離自患有BCD或在CYP4V2基因中具有病理性突變之個體之幹細胞分化的細胞或由從分離自該個體之細胞重編程的iPS細胞分化的細胞。在一些實施例中，基因修復係在重編程成iPS細胞之前進行。在一些實施例中，基因修復係在重編程成iPS細胞之後進行。在一些實施例中，基因修復係在幹細胞或iPS細胞之分化之前進行。在一些實施例中，基因修復係在幹細胞或iPS細胞之分化之後進行。在一些實施例中，基因修復係經由基因轉移療法。在一些實施例中，基因修復係經由基因轉移療法，藉由使用基因療法請求項中任一項之任何組成物或方法。在一些實施例中，基因修復係經由基因編輯。在一些實施例中，基因修復係經由基因編輯，藉由使用CRiSPR基因療法請求項中任一項之任何組成物或方法。
在另一態樣中，提供一種治療或預防患有 BCD或在CYP4V2基因中具有病理性遺傳或表觀遺傳改變之個體的眼睛疾病的方法。此類方法通常包括向個體施用本文中所描述之CYP4V2自體細胞組成物中之任一者，其中該細胞組成物包括：視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器或光感受器先驅細胞(PRC)、角膜上皮細胞(CEC)、脈絡膜內皮(CE)細胞及/或其他衍生自個體之幹細胞的眼細胞。
在一些實施例中，幹細胞為iPC細胞、MSC、成體幹細胞或組織特異性幹細胞。在一些實施例中，iPS細胞係使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC轉錄因子中之一或多者重編程。在一些實施例中，基因修復的細胞相比於在進行基因修復之前展現以下中之一或多者：表2中所闡述之一或多種化合物之位準的標準化；該等細胞中之無缺陷的CYP4V2核酸序列之增加；該等細胞中之功能性CYP4V2多肽之量的增加；及/或改良的細胞結構、形態或功能。
在一些實施例中，在單次給藥中所施用的細胞之量為約1,000至約1億個細胞。在一些實施例中，經由注射給藥。在一些實施例中，經由視網膜下注射給藥。在一些實施例中，經由玻璃體內注射給藥。在一些實施例中，經由直接視網膜注射給藥。在一些實施例中，經由角膜注射給藥。在一些實施例中，藉由任何其他有效地將細胞遞送至個體眼睛之視網膜下位置、後段或角膜的給藥方法來給藥。在一些實施例中，經由注射細胞懸浮液來施用 細胞。在一些實施例中，細胞作為層片(sheet)、基質、支架或組織之一部分施用。
在一些實施例中，使用天然及/或合成支架來施用RPE細胞以產生功能性RPE單層。在一些實施例中，個體為人類個體。
針對眼部疾病之基因修復的自體細胞療法
在另一態樣中，提供一種細胞組成物，其包括(a)從分離自患病個體之細胞重編程的幹細胞或從該個體分離之幹細胞，該個體患有由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因引起的疾病，或(b)從幹細胞分化的細胞，該幹細胞從患病個體分離或從分離自該個體之細胞重編程，該個體患有由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因引起的疾病。
在一些實施例中，從分離自該個體之細胞重編程的幹細胞為iPS細胞。在一些實施例中，iPS細胞從該個體之任何組織之任何細胞重編程。在一些實施例中，iPS細胞從皮膚細胞、血球、尿路細胞、毛髮細胞、纖維母細胞、周邊血液單核細胞(PBMC)、腎上皮細胞、毛囊或真皮乳頭細胞重編程。在一些實施例中，從個體分離之幹細胞為MSC、成體幹細胞或組織特異性幹細胞。
在一些實施例中，該基因涉及眼部發育或功能及/或其突變引起眼部疾病或為引起眼部疾病的風險因素。在一些實施例中，該基因涉及神經元的發育或功能及/ 或其突變引起神經退化性疾病或為引起神經退化性疾病的風險因素。在一些實施例中，該基因為細胞色素P450基因。在一些實施例中，該基因為表4中所闡述之基因。
在一些實施例中，該基因包括突變的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、 SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
在一些實施例中，從幹細胞分化之細胞為任何類型的細胞。在一些實施例中，從幹細胞分化之細胞為眼細胞。在一些實施例中，從幹細胞分化之細胞為RPE細胞、PRC、視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、CEC、CE細胞或視神經細胞。在一些實施例中，從幹細胞分化之細胞為iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE細胞。在一些實施例中，從幹細胞分化之細胞為神經元。
在一些實施例中，對以下細胞進行基因修復以改善突變的或有缺陷的基因之影響：(i)從患病個體分離以用於重編程成iPSC的細胞，該個體患有由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因引起的疾病；(ii)從患病個體分離的幹細胞或從分離自該個體之細胞重編程的iPS細胞，該個體患有由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因引起的疾病；或(iii)從分離自患病個體之幹細胞分化的細胞或由從分離自該個體之細胞重編程的iPS細胞分化的細胞，該個體患有由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因引起的疾病。
在一些實施例中，基因修復係在重編程成iPS細胞之前進行。在一些實施例中，基因修復係在重編 程成iPS細胞之後進行。在一些實施例中，基因修復係在幹細胞或iPS細胞之分化之前進行。在一些實施例中，基因修復係在幹細胞或iPS細胞之分化之後進行。在一些實施例中，基因修復係經由基因轉移療法。在一些實施例中，基因修復係經由基因轉移療法，藉由使用與基因療法相關之請求項中任一項之任何組成物或方法。在一些實施例中，基因修復係經由基因編輯療法。在一些實施例中，基因修復係經由基因編輯療法，藉由使用與CRiSPR基因療法相關之請求項中任一項之任何組成物或方法。
在另一態樣中，提供一種治療或預防患病個體之疾病的方法，該個體患有由表4中所闡述之突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因引起的疾病。此類方法通常包括向個體施用如本文中所描述之自體細胞組成物，其中該細胞組成物包括：視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器或光感受器先驅細胞(PRC)、角膜上皮細胞(CEC)、神經元、脈絡膜內皮(CE)細胞及/或其他衍生自該個體之幹細胞的眼細胞，且其中該細胞組成物中之該突變的或有缺陷的基因已經基因修復。
在另一態樣中，提供一種自體治療個體之方法。此類方法通常包括(i)提供來自具有眼睛疾病之個體的細胞；(ii)在來自該個體之細胞中誘導多能性以產生iPSC；(iii)基因修復衍生自該個體之iPSC中於表4中所闡述之突變的或有缺陷的基因中之一或多個突變；(iv)將 iPSC分化成眼細胞；(v)作為步驟(iii)的替代方案，經由基因轉移療法基因修復iPS-眼細胞；以及(vi)將iPS-眼細胞引入該個體中，從而自體治療具有眼睛疾病之個體。
在一些實施例中，幹細胞為iPC細胞、MSC、成體幹細胞或組織特異性幹細胞。在一些實施例中，iPS細胞係使用OCT4、SOX2、KLF4及c-MYC轉錄因子中之一或多者來重編程。在一些實施例中，基因修復的細胞，相比於在進行基因修復之前，展現以下中之一或多者：該等細胞中之無缺陷的目標基因核酸序列之增加；該等細胞中由該目標基因編碼之功能性多肽之量的增加；改良的細胞結構、形態或功能；及/或該等細胞中改良的或標準化的生化功能。在一些實施例中，在單次給藥中所施用的細胞之量為約1,000至約1億個細胞。
在一些實施例中，經由注射給藥。在一些實施例中，藉由視網膜下注射給藥。在一些實施例中，藉由玻璃體內注射給藥。在一些實施例中，藉由直接視網膜注射給藥。在一些實施例中，藉由角膜注射給藥。在一些實施例中，藉由任何其他有效地將細胞遞送至個體眼睛之視網膜下位置、後段或角膜的給藥方法來給藥。在一些實施例中，經由注射細胞懸浮液來施用細胞。在一些實施例中，細胞作為層片、基質、支架或組織之一部分施用。在一些實施例中，使用天然及/或合成支架來施用RPE細胞以產生功能性RPE單層。在一些實施例中，個體為人類個體。
在一些實施例中，該疾病與個體中之遺傳或 表觀遺傳改變或風險因素相關。在一些實施例中，該疾病為光感受器退化、視網膜色素上皮細胞退化、視網膜退化、角膜退化及/或脈絡膜病症。在一些實施例中，該疾病為遺傳性視網膜退化(IRD)。在一些實施例中，該疾病為視網膜色素變性(RP)。在一些實施例中，該疾病為結晶樣視網膜色素變性(亦稱為結晶樣角膜視網膜變性；BCD)。在一些實施例中，該疾病係關於神經退化。在一些實施例中，該疾病為角膜變性。在一些實施例中，該個體具有BCD或處於罹患BCD的風險。
在一些實施例中，該等細胞為纖維母細胞、血球或眼細胞。在一些實施例中，該等細胞從尿液或從毛髮或毛囊獲得。在一些實施例中，眼細胞為視網膜色素上皮(RPE)細胞、角膜上皮細胞(CEC)、脈絡膜內皮(CE)細胞或光感受器細胞(PRC)。
在一些實施例中，遺傳或表觀遺傳改變係選自由以下組成之群：突變、插入、單核苷酸多型性、不當甲基化、不當去甲基化及其組合。在一些實施例中，遺傳或表觀遺傳改變為突變。在一些實施例中，個體之iPS-眼細胞中之遺傳或表觀遺傳改變已使用基因編輯進行基因修復。在一些實施例中，基因編輯法利用鋅指核酸酶、TALEN技術或CRISPR技術。在一些實施例中，個體之iPSC-眼細胞中之遺傳或表觀遺傳改變已使用基因轉移進行基因修復。在一些實施例中，基因轉移法利用重組AAV載體或另一病毒載體或非病毒載體將目標基因之健康拷貝 (例如，cDNA)遞送至待移植的細胞。
在一些實施例中，給藥步驟發生在疾病症狀發作之前或發生在疾病症狀發作之後。在一些實施例中，向眼睛或向另一個包含神經元的器官或組織給藥。在一些實施例中，藉由注射給藥。在一些實施例中，藉由視網膜下或玻璃體內注射給藥。在一些實施例中，藉由直接視網膜注射給藥。在一些實施例中，藉由角膜注射給藥。在一些實施例中，藉由任何其他有效地將細胞遞送至個體眼睛之視網膜下位置、後段或角膜的給藥方法來給藥。
在一些實施例中，該方法進一步包括：在給藥或移植之前，對細胞進行基因型分析，以鑑定在表4中所闡述之一或多個基因中存在或不存在遺傳或表觀遺傳改變。在一些實施例中，遺傳或表觀遺傳改變為突變。在一些實施例中，突變係在CYP4V2核酸分子中。在一些實施例中，該方法進一步包括：在給藥之前，評估該個體之眼睛以鑑定受損的或殘留的光感受器、視網膜細胞或角膜細胞的區域及程度。
在一些實施例中，該方法進一步包括在給藥之後監測該個體。在一些實施例中，監測包含進行非侵入性視網膜成像、角膜測試、視野測量、ERG、OCT、視敏度測試及/或功能研究。在一些實施例中，監測包含評估個體之免疫反應。在一些實施例中，該方法進一步包括：在給藥之後，評估該個體之眼睛以鑑定受損的或殘留的光感受器、視網膜細胞或角膜細胞的區域及程度。
細胞療法-RNP請求項
RNP請求項
在另一態樣中，提供一種組成物，其包括在核糖核蛋白(RNP)或蛋白質-RNA複合物中之：(a)靶向距離目標基因(「目標基因」)100bp或100bp內之核酸序列(「目標序列」)的CRISPR引導RNA，及(b)功能性CRISPR相關蛋白。
在一些實施例中，該組成物進一步包括(c)供體核酸序列，該供體核酸序列包括目標基因之野生型序列或功能序列之全部或一部分，其用於校正或替代該目標基因或其一部分。在一些實施例中，該目標基因涉及眼部發育或功能及/或其突變引起眼部疾病或為引起眼部疾病的風險因素。在一些實施例中，該目標基因涉及神經元的發育或功能及/或其突變引起神經退化性疾病或為引起神經退化性疾病的風險因素。
在一些實施例中，該目標基因為細胞色素P450基因。在一些實施例中，該目標基因包括表4中所闡述之基因，該基因為突變的或有缺陷的，或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質。在一些實施例中，供體核酸序列以單股供體寡核苷酸(ssODN)或載體形式提供。
在一些實施例中，(a)該CRISPR引導RNA包括(i)CRISPR RNA(crRNA)，其包括與距離目標基因100bp或100bp內之目標序列互補的原型間隔區元件序 列及對應於反式活化crRNA(tracrRNA)之互補區的序列，及(ii)tracrRNA，其包括與該crRNA之對應區域互補的區域及與CRISPR相關蛋白9(Cas9)相互作用的序列，且(b)該功能性CRISPR相關蛋白包含Cas9。
在一些實施例中，原型間隔區元件為約20個鹼基、約19個鹼基、約21個鹼基、約19-21個鹼基、約18-22個鹼基或約16-24個鹼基。在一些實施例中，crRNA及tracrRNA在不同的核酸分子中。在一些實施例中，將crRNA及tracrRNA組合成單引導RNA(sgRNA)。在一些實施例中，sgRNA為約88-150bp。
在一些實施例中，Cas9包含Cas9異種同源物或突變型Cas9，其選自：釀膿鏈球菌(SpCas9)、SpCas9切口酶(Cas9n D10A)、SpCas9(D1135E)、eSpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9 VRER、SpCas9 VQR、SpCas9EQR、金黃色葡萄球菌(SaCas9)、腦膜炎雙球菌、嗜熱鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸彎曲桿菌、空腸彎曲桿菌、變種鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、長雙歧桿菌、史氏芽孢桿菌、齒垢密螺旋體、犬黴漿菌及糞腸球菌。
在一些實施例中，(a)CRISPR引導RNA包含crRNA，該crRNA包含與距離目標基因100bp或100bp內之目標序列互補的原型間隔區元件序列，且(b)功能性CRISPR相關蛋白包含Cpf1。在一些實施例中，原型間隔區元件為約20個鹼基、約21個鹼基、約22個鹼基、約23個鹼基、約24個鹼基、約19-25個鹼基、約18-26 個鹼基或約16-28個鹼基。在一些實施例中，CRISPR相關蛋白Cas9或Cpf1進一步包含一個、二個、三個或更多個位於N端及/或C端的核定位序列(NLS)，及/或選擇標記物，其包括但不限於GFP或EGFP。
在一些實施例中，原型間隔區元件與目標序列100%互補或含有1、2、3、4或5個對應於目標序列的核苷酸誤配。在一些實施例中，crRNA序列進一步包含G核苷酸，該G核苷酸視情況添加至crRNA序列緊接在原型間隔區元件之前。在一些實施例中，CRISPR引導RNA、crRNA及/或tracrRNA或sgRNA經化學修飾。
在一些實施例中，對於以ssODN提供之供體核酸序列，該供體核酸序列不超過約1kb、800bp、600bp、500bp、400bp、300bp、280bp、260bp、240bp、220bp或200bp；且對於以載體提供之供體核酸序列，該供體核酸序列不超過約30kb、25kb、20kb、15kb、10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4.5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、0.5kb、0.2kb或0.1kb。在一些實施例中，目標基因之野生型形式編碼一酶。
在一些實施例中，目標基因包括突變的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、 TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因。
在一些實施例中，其任何一或多種組分，包括CRISPR引導RNA、CRISPR相關蛋白及/或供體核酸序列，係各別地及/或額外地以能夠轉錄及/或轉譯成該組分之載體、DNA及/或mRNA提供。在一個態樣中，提供一種包括本文中所描述之組成物中之任一者的藥學製劑。
在另一態樣中，提供一種治療個體之由突變 的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因所引起之疾病的方法。此類方法包括藉由向個體施用本文中所描述之組成物中之任一者來破壞、校正或替代該基因。
在另一態樣中，提供一種治療個體之由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因所引起之眼部疾病或改善與其相關之風險因素的方法。此類方法包括藉由向個體施用本文中所描述之組成物中之任一者來破壞、校正或替代該基因。
在另一態樣中，提供一種治療個體之由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因所引起之神經退化性疾病或改善與其相關之風險因素的方法。此類方法包括藉由向個體施用本文中所描述之組成物中之任一者來破壞、校正或替代該基因。
在另一態樣中，提供一種治療個體之由突變的或有缺陷的細胞色素P450基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的細胞色素P450基因所引起之疾病或改善與其相關之風險因素的方法。此類方法包括藉由向個體施用本文中所描述之組成物中之任一者來破壞、校正或替代該基因。
在一些實施例中，被破壞、校正或替代的突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因為表4中所闡述之基因之突變的或有缺陷的形式，或表4中所闡述之基因之編碼具有有缺陷的 或部分的功能或活性之蛋白質的形式。在一些實施例中，突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因存在於纖維母細胞、血球、RPE細胞、光感受器細胞、視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、視神經細胞、神經元細胞或幹細胞或任何類型的衍生自幹細胞的細胞中。
在一些實施例中，將其中之組成物遞送至纖維母細胞、血球、RPE細胞、光感受器細胞、視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、視神經細胞、神經元細胞或幹細胞或任何類型的衍生自幹細胞的細胞。在一些實施例中，遞送係藉由電穿孔或經由脂質介導之轉染或核轉染或病毒轉導或注射或其組合來進行。在一些實施例中，其任何一或多種組分，包括CRISPR引導RNA、CRISPR相關蛋白及/或供體核酸序列，係經由選自由以下組成之群的遞送系統向該個體或向該等細胞施用：核糖核蛋白或蛋白質-RNA複合物、奈米粒子、脂質體、微胞、病毒體、核酸複合物及/或其組合。
在一些實施例中，該處理係對個體體內進行。在一些實施例中，該處理係在以下細胞中體外進行：纖維母細胞、血球、RPE細胞、光感受器細胞、視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、視神經細胞、神經元細胞或幹細胞或任何類型的衍生自幹細胞的細胞。在一些實施例中，將經處理之細胞體內移植至個體，或若經處理之細胞為幹細胞，則使該幹細胞分化成用於移植之所期 望類型的細胞，然後將經分化的細胞體內移植至個體中。
在一些實施例中，突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因被替代。在一些實施例中，突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因中有一或多個突變被校正或替代。在一些實施例中，突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因被破壞。
在一些實施例中，突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因中有1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-1000、1001-10000個鹼基對的核苷酸或突變被破壞、校正或替代。在一些實施例中，突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因的區域被破壞、校正或替代。在一些實施例中，突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因的小於約10、8、6、4、2或1kb之區域被破壞、校正或替代。
在一些實施例中，經由插入及/或刪除核苷酸來破壞、校正或替代突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因。在一些實施例中，在一個等位基因或二個等位基因中破壞、校正或替代突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因。在一些實施例中，使用二種或 更多種不同的CRISPR引導RNA、CRISPR相關蛋白及/或供體核酸序列來破壞、校正或替代突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能之蛋白質的基因中之一或多個突變或缺陷。
在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，該方法改善眼的發育或功能，或預防眼、視網膜或角膜的退化。在一些實施例中，該方法改善神經的發育或功能，或預防神經退化。在一些實施例中，該方法改善P450酶之表現或功能。
在一些實施例中，以供體核酸序列為基礎的同源定向修復得到目標基因之內含子及/或外顯子。在一些實施例中，以供體核酸序列為基礎的同源定向修復得到目標基因之剪接受體(splice acceptor)。此類方法可以進一步包括(c)包含表4中所闡述之目標基因之全部或一部分的供體核酸序列，其具有用於產生突變的或改變的目標基因或其一部分的突變或改變。
在一些態樣中，提供一種產生由突變的或有缺陷的基因或編碼具有有缺陷的或部分的功能或活性之蛋白質的基因所引起之疾病的細胞疾病模式的方法，該方法係藉由在該基因中產生突變。此類方法包括經由本文中所描述之組成物中之任一者將此類基因遞送至健康形式的細胞。在一些實施例中，遞送係藉由電穿孔或經由脂質介導之轉染或核轉染或病毒轉導或顯微注射或其組合進行。在一些實施例中，該等細胞為纖維母細胞、血球、RPE細胞、 光感受器細胞、視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、視神經細胞、神經元細胞或幹細胞或任何類型的衍生自幹細胞的細胞。
在另一態樣中，提供一種組成物，其包括含有表4中所闡述之突變的或有缺陷的基因的細胞。
在另一態樣中，提供一種組成物，其包括含有以下基因的細胞：突變的或有缺陷的CYP4V2、CYP1B1、MYO7A、DFNB31、USH1C、USH1G、CDH23、PCDH15、CLRN1、ACO2、AFG3L2、ATXN2、AUH、C12orf65、CISD2、FOXC1、FOXF2、LTBP2、MTPAP、MYOC、NDUFS1、NR2F1、OPA1、OPA3、OPTN、PAX6、PDGF、PITX2、POLG、SPG7、TEK、TXNRD2、WFS1、ABCA4、REP-1、RPE65、CEP290、PDE6B、RPGR、MERTK、MT-ND4、FAM47E、GBA、GCH1、HTRA2、LRRK2、PARK2、PINK1、SNCA、SYNJ1、NPC1、NPC2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1或CYP46A基因，該組成物包含本文中之請求項中任一項之組成物。
在一些實施例中，載體為AAV載體。在一些實施例中，原型間隔區元件序列係選自由SEQ ID NO：48至52組成之群，或與SEQ ID NO：48至52中之一者共用至少80%序列同一性，其用於與具有NGG作為原型間隔區相鄰基序(PAM)之Cas蛋白質一起使用以靶向 CYP4V2基因之c.802-8_810del17insGC突變。在一些實施例中，供體核酸序列係選自SEQ ID NO：56及57，或與SEQ ID NO：56及57或其互補序列中之一者共用至少90%序列同一性，其用於校正、破壞或替代CYP4V2基因之c.802-8_810del17insGC突變。
基因療法請求項
密碼子最佳化的序列相關請求項：
在一個態樣中，提供一種核酸分子，其包括SEQ ID NO：2之編碼人類CYP4V2蛋白質的核酸序列或與SEQ ID NO：2之核酸序列共用至少90%序列同一性的核酸序列。
在另一態樣中，提供一種表現匣，其包括如本文中所描述之核酸分子及一或多個可操作地連接至核酸序列之調節序列。在另一態樣中，提供一種載體，其包括如本文中所描述之核酸分子或如本文中所描述之表現匣。
在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係選自由以下組成之群：重組腺病毒載體、重組慢病毒載體、重組單純疱疹病毒載體、重組仙台病毒載體(recombinant sendai virus vector)及重組反轉錄病毒載體。在一些實施例中，載體為重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體或質體。在一些實施例中，載體為質體或非病毒載體。在一些實施例中，非病毒載體係選自由裸核酸(naked nucleic acid)、脂質體、樹狀體(dendrimer)及奈米粒子組成之群。
在一些實施例中，宿主細胞包括本文中所描述之核酸分子中之任一者及/或本文中所描述之組成物中之任一者。在一些實施例中，宿主細胞為細菌細胞、大腸桿菌細胞(E.Coli cell)、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞為HEK293、希拉細胞(HeLa)、Vero、V27、A549、K562、B50、WI38、Hep G2或BHK細胞。
在另一態樣中，使用本文中所描述之核酸分子中之任一者、本文中所描述之表現匣中之任一者或本文中所描述之載體中之任一者，在下列中表現由此類核酸分子所編碼之產物：細菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、RPE細胞、光感受器或光感受器先驅細胞(PRC)、視網膜細胞、角膜細胞、眼細胞、神經元、神經元細胞、血球、上皮細胞、體細胞、iPS細胞、ES細胞、MSC、成體幹細胞、幹細胞或任何衍生自幹細胞的細胞。
EFS及/或SPA相關請求項
在另一態樣中，提供一種自身互補型腺相關病毒(self-complementary adeno-associated virus，scAAV)載體，其包括可操作地連接至編碼多肽之核酸分子、干擾RNA分子或寡核苷酸的延長因子1α短型(elongation factor 1α short，EFS)啟動子及/或小多腺苷酸化(polyadenylation，polyA)信號(SPA)。在一些實施例中，EFS啟動子係由與SEQ ID NO：35具有至少80%序列同一性的核酸序列所組成且SPA係由與SEQ ID NO： 36具有至少80%序列同一性的核酸序列所組成。
在一些實施例中，將scAAV載體遞送至一細胞，使得由核酸分子所編碼之產物在該細胞中表現。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞為視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、腦細胞、神經元、神經元細胞、iPS細胞、ES細胞、MSC、幹細胞或任何衍生自幹細胞的細胞。
在一個態樣中，提供一種用以降低對病毒載體之免疫反應且保持基因療法中之轉導效率及/或使對具有同一種遺傳疾病之不同患者的治療效果最大化的方法。此類方法包括(a)建立多於一種重組病毒載體(例如，rAAV)的庫，該等重組病毒載體在該基因療法所針對之目標細胞類型中具有足夠的轉導效率。該病毒載體庫可以藉由產生具有抗原區突變之變異體或在該等病毒載體之殼體上產生其他突變或變異體來擴增，且該等突變或變異體經確認在與疾病有關之目標細胞中(例如，對針對BCD之CYP4V2基因療法而言，係在iPS-RPE細胞株中)具有足夠的轉導效率；(b)檢測需要該基因療法之個體中預先存在的針對不同病毒載體血清型及/或殼體突變或變異體的中和抗病毒載體抗體(neutralizing anti-viral vector antibodies，NAb)，及/或測試及比較衍生自該個體之患者特異性細胞(例如，iPS-RPE細胞)中之不同病毒載體；(c)從該病毒載體庫中選擇具有足夠的轉導有效性且與該個體中預先存在的NAb具有最低的交叉反應性的病毒載 體及/或在個體之患者特異性細胞中具有最佳表型拯救結果的一種病毒載體，該病毒載體庫包含不同血清型及殼體經修飾之病毒載體(例如，包括但不限於殼體突變型AAV及/或殼體蛋白變異型AAV)；(d)使用選自(c)之病毒載體向該個體給藥；及(e)每當該個體需要施用基因療法時，重複以上的(b)至(d)(僅重複與預先存在的NAb相關的部分)，包括但不限於向同一隻眼睛進行後續給藥或向對側眼睛或向另一器官給藥。
在另一態樣中，提供一種用於治療或預防個體之疾病的組成物，其包括有效量之載體及藥學上可接受的載劑。該載體通常包括可操作地連接至調節序列之編碼非突變型或功能性CYP4V2蛋白質的核酸分子或其非病原性變異體。
在一些實施例中，該疾病為結晶樣視網膜色素變性(亦稱為結晶樣角膜視網膜變性；BCD)。在一些實施例中，該疾病與個體中之遺傳或表觀遺傳改變相關。在一些實施例中，該疾病為光感受器退化、視網膜色素上皮細胞退化、視網膜退化、角膜退化或脈絡膜退化。在一些實施例中，視網膜退化為視網膜色素變性(RP)。在一些實施例中，視網膜退化為遺傳性視網膜退化(IRD)。在一些實施例中，該疾病為BCD。在一些實施例中，該疾病為角膜變性。在一些實施例中，該個體具有BCD或處於罹患BCD的風險。
在一個態樣中，提供一種載體，其包括可操 作地連接至調節序列之編碼非突變型或功能性CYP4V2蛋白質的核酸分子或其非病原性變異體。
在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係選自由以下組成之群：腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)載體、腺病毒載體、慢病毒載體、單純疱疹病毒載體、仙台病毒載體及反轉錄病毒載體。在一些實施例中，AAV為重組AAV(rAAV)。在一些實施例中，rAAV包含AAV基因組或其衍生物，及/或AAV殼體蛋白或其衍生物。在一些實施例中，rAAV為嵌合AAV、重排AAV(shuffled AAV)或殼體經修飾之AAV。
在一些實施例中，AAV基因組或AAV殼體蛋白來自以下中之任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV之另一天然衍生之血清型或分離株或分支(Glade)、或其任何衍生物或雜合體。在一些實施例中，rAAV為假型化AAV(pseudotyped AAV)(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/12、AAV2/10及AAV2/9)。在一些實施例中，rAAV為雜合AAV(例如，AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9)。在一些實施例中，rAAV經由定向進化(directed evolution)及/或合理設計來開發(例如，AAV 7m8或AAV-PHP.B)。
在一些實施例中，該rAAV包含一或多個殼體突變(例如，Y-F、K-R、T-A、S-A及/或T-V突變(例 如，AAV2具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中之一或多個殼體突變，或針對不同AAV血清型之相應突變(例如，AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)及AAV2(四Y-F+T-V(quadY-F+T-V)))))。在一些實施例中，rAAV之血清型係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Anc80、rh10及ShH10。在一些實施例中，rAAV載體係選自由以下組成之群：AAV2/5、AAV2/8、AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/9、AAV2/6、AAV2/7、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV12、Anc80、AAV 7m8、AAV-DJ、ShH10、AAV-PHP.B或其雜合體、衍生物或變異體。
在一些實施例中，rAAV載體為單股AAV載體或自身互補型AAV(scAAV)載體。在一些實施例中，載體為質體或非病毒載體(例如，裸核酸、脂質體、樹狀體及奈米粒子)。
在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含：(i)人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)；(ii)人類CYP4V2蛋白質或功能性CYP4V2蛋白質之變異體(例如，改變胺基酸及/或剪接變異體)(例如，SEQ ID NO：5)；(iii)功能性CYP4V2蛋白 質之一或多個片段(例如，SEQ ID NO：6)；(iv)來自其他物種之CYP4V2異種同源物中之一或多者的序列之全部或一部分；(v)來自一或多種其他P450蛋白質之序列的全部或一部分，其他P450蛋白質包括但不限於其他CYP4蛋白質及CYP46A1；(vi)能夠改善、治療或遏制患者細胞(例如，BCD患者之iPS-RPE細胞)中之表4中所列基因中之一或多者的一或多種生化異常的多肽；及/或(vii)以上各者之組合。
在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含SEQ ID NO：4、5或6中所示之胺基酸序列之全部或一部分。在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之全部或一部分：CYP4V2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1及CYP46A1(SEQ ID NO：4-18)及其衍生物、雜合體、變異體及/或片段。在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含選自由以下組成之群的胺基酸序列中之全部或部分：黑猩猩、恆河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、雞、蛙、馬、兔及果蠅之CYP4V2(或CYP4V2之異種同源物)(SEQ ID NO：19-29)、及其衍生物、雜合體、變異體及/或片段。
在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含與選自由SEQ ID NO： 4-29組成之群的序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列同一性(例如，至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性)的多肽。在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含FxxGxxxCxG及ExxR(SEQ ID NO：30及31)之序列元件。在一些實施例中，非突變型或功能性CYP4V2蛋白質為能夠改善、治療或遏制患者細胞(例如，BCD患者之iPS-RPE細胞)中之表4中所列基因中之一或多者的一或多種生化異常的化合物或試劑。
在一些實施例中，核酸分子編碼如請求項43至50中任一項之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質。在一些實施例中，核酸分子編碼包含SEQ ID NO：4、5或6中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4、5或6中之任一者具有至少80%序列同一性之胺基酸序列的非突變型或功能性CYP4V2蛋白質。在一些實施例中，核酸分子與SEQ ID NO：1、2或3中之序列中之任一者具有至少60%序列同一性。在一些實施例中，核酸分子與SEQ ID NO：1、2或3中之序列中之任一者具有至少70%序列同一性。在一些實施例中，核酸分子與SEQ ID NO：1、2或3中之序列中之任一者具有至少75%序列同一性。在一些實施例中，核酸分子與SEQ ID NO：1、2或3中之序列中之任一者具有至少76%序列同一性。在一些實施例中，核酸分子包含SEQ ID NO：1、2或3中所示之序列。
在一些實施例中，調節序列包含啟動子。在一些實施例中，啟動子為RPE細胞特異性啟動子、視網膜細胞特異性啟動子、角膜細胞特異性啟動子、眼細胞特異性啟動子或組成型啟動子(constitutive promoter)。在一些實施例中，啟動子為哺乳動物β肌動蛋白啟動子或病毒啟動子。
在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：CAG啟動子(雜合CMV早期強化子/雞β肌動蛋白啟動子，亦稱為CAGGS啟動子、CB啟動子或CBA啟動子)、雞β肌動蛋白啟動子、小CBA(smCBA)啟動子、CBSB啟動子或CBh啟動子、諸如人類β肌動蛋白啟動子之另一β-肌動蛋白啟動子、延長因子1α短型(EFS)啟動子、延長因子1α短型(EF-1α)啟動子、CMV啟動子、PGK啟動子、UBC啟動子、GUSB啟動子、UCOE啟動子、VMD2(卵黃狀黃斑變性2(vitelliform macular dystrophy 2)；亦稱為BEST1)啟動子、RPE65啟動子或其雜合體或衍生物。
在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子(雜合CMV早期強化子/雞β肌動蛋白啟動子，亦稱為CAGGS啟動子、CB啟動子或CBA啟動子)、延長因子1α短型(EFS)啟動子、延長因子1α短型(EF-1α)啟動子或CMV啟動子或其衍生物或雜合體。在一些實施例中，調節序列包含強化子。
在一些實施例中，強化子為病毒強化子，包 括但不限於WPRE強化子、HPRE強化子、CTE強化子或其衍生物或雜合體。在一些實施例中，調節序列包含多腺苷酸化(polyA)信號。在一些實施例中，polyA信號為牛生長激素多腺苷酸化信號(bGH polyA)、小polyA信號(SPA)、人類生長激素多腺苷酸化信號(hGH polyA)、SV40 polyA信號、SV40晚期polyA信號或其衍生物或雜合體。在一些實施例中，調節序列包含科札克序列(Kozak sequence)(SEQ ID NO：37或38)。
在一些實施例中，組成物與適合用於特定給藥途徑之載劑及額外組分來配製。
在另一態樣中，提供一種宿主細胞，其包括本文中所描述之載體中之任一者。
在另一態樣中，提供一種治療或預防個體之眼睛疾病的方法，該方法包括向該個體施用載體，其中該載體包含可操作地連接至調節序列之編碼人類CYP4V2蛋白質或功能性CYP4V2蛋白質的核酸分子或其非病原性變異體。
在一個態樣中，提供一種預防、遏制或減緩進展或改善眼細胞之功能障礙、變性、病症、退化及/或死亡的方法，該方法包括向眼細胞遞送載體，其中該載體包含可操作地連接至調節序列之編碼人類CYP4V2蛋白質或功能性CYP4V2蛋白質的核酸分子或其非病原性變異體。
在一些實施例中，疾病為結晶樣視網膜色素 變性(亦稱為結晶樣角膜視網膜變性；結晶樣視網膜病變；Bietti視網膜變性；BCD)。在一些實施例中，個體患有其他由CYP4V2基因突變引起的眼科臨床定義的病狀(例如，遺傳性視網膜退化(IRD)、視網膜色素變性(RP)或角膜變性)。在一些實施例中，眼睛疾病為光感受器退化、視網膜色素上皮細胞退化、視網膜退化、角膜變性或BCD。
在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體係選自由以下組成之群：重組腺相關病毒(rAAV)載體、重組腺病毒載體、重組慢病毒載體、重組單純疱疹病毒載體、重組仙台病毒載體及重組反轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為rAAV載體。在一些實施例中，rAAV載體包含選自以下任何血清型的VP1、VP2或VP3殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV之另一天然衍生之血清型或分離株或分支、或其雜合體、變異體或衍生物。
在一些實施例中，rAAV載體5' AAV ITR係選自以下中之任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV之另一天然衍生之血清型或分離株或分支、或其突變、嵌合體、變異體或融合物。在一些實施例中，rAAV載體3' AAV ITR係選自以下中之任一者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV之 另一天然衍生之血清型或分離株或分支、或其突變、嵌合體、變異體或融合物。在一些實施例中，rAAV為嵌合AAV、重排AAV或殼體經修飾之AAV。在一些實施例中，rAAV為假型化AAV(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/12、AAV2/10及AAV2/9)。在一些實施例中，rAAV為雜合AAV(例如，AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9)。在一些實施例中，rAAV經由定向進化及/或合理設計來開發(例如，AAV 7m8或AAV-PHP.B)。
在一些實施例中，該rAAV包含一或多個殼體突變(例如，Y-F、K-R、T-A、S-A及/或T-V突變(例如，AAV2具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中之一或多個殼體突變，或針對不同AAV血清型之相應突變(例如，AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)及AAV2(四Y-F+T-V))))。在一些實施例中，rAAV之血清型係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、Anc80、rh10及ShH10。在一些實施例中，rAAV載體係選自由以下組成之群：AAV2/5、AAV2/8、AAV2/8(Y733F)、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/9、AAV2/6、AAV2/7、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV12、Anc80、AAV 7m8、AAV-DJ、ShH10、AAV-PHP.B 或其雜合體、衍生物或變異體。
在一些實施例中，rAAV載體為單股AAV載體或自身互補型AAV(scAAV)載體。在一些實施例中，載體為質體或非病毒載體。在一些實施例中，非病毒載體係選自由裸核酸、脂質體、樹狀體及奈米粒子組成之群。
在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含：(i)人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)；(ii)人類CYP4V2蛋白質或功能性CYP4V2蛋白質之變異體(例如，改變胺基酸及/或剪接變異體)(例如，SEQ ID NO：5)；(iii)功能性CYP4V2蛋白質之一或多個片段(例如，SEQ ID NO：6)；(iv)來自其他物種之CYP4V2異種同源物中之一或多者的序列之全部或一部分；(v)來自一或多種其他P450蛋白質之序列的全部或一部分，其他P450蛋白質包括但不限於其他CYP4蛋白質及CYP46A1；(vi)能夠改善、治療或遏制患者細胞(例如，BCD患者之iPS-RPE細胞)中之表4中所列一或多個基因中之一或多種生化異常的多肽；及/或(vii)以上各者之組合。
在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含SEQ ID NO：4、5或6中所示之胺基酸序列之全部或一部分。在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含選自由以下組成之群的胺基酸序列之全部或一部分：CYP4V2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、 CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1及CYP46A1(SEQ ID NO：4-18)及其衍生物、雜合體、變異體及/或片段。
在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含選自由以下組成之群的胺基酸序列中之部分的全部：黑猩猩、恆河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、雞、蛙、馬、兔及果蠅之CYP4V2(或CYP4V2之異種同源物)(SEQ ID NO：19-29)、及其衍生物、雜合體、變異體及/或片段。在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含與選自由SEQ ID NO：4-29組成之群的序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列同一性(例如，至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性)的多肽。
在一些實施例中，由核酸序列編碼之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質包含FxxGxxxCxG及ExxR(SEQ ID NO：30及31)之序列元件。在一些實施例中，非突變型或功能性CYP4V2蛋白質為能夠改善、治療或遏制患者細胞(例如，BCD患者之iPS-RPE細胞)中之表4中所列基因中之一或多者的一或多種生化異常的化合物或試劑。在一些實施例中，核酸分子編碼如請求項91至97中任一項之非突變型或功能性CYP4V2蛋白質。在一些實施例中，核酸分子編碼包含SEQ ID NO：4、5或6中所示 之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4、5或6中之任一者具有至少80%序列同一性之胺基酸序列的非突變型或功能性CYP4V2蛋白質。在一些實施例中，編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸分子具有SEQ ID NO：1、2或3中所示之核酸序列。在一些實施例中，編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸分子與SEQ ID NO1、2或3中之任一者具有至少60%之序列同一性。
在一些實施例中，調節序列包含啟動子。在一些實施例中，啟動子為RPE細胞特異性啟動子、視網膜細胞特異性啟動子、角膜細胞特異性啟動子或眼細胞特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子為組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子為哺乳動物β肌動蛋白啟動子或病毒啟動子。
在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：CAG啟動子(雜合CMV早期強化子/雞β肌動蛋白啟動子，亦稱為CAGGS啟動子、CB啟動子或CBA啟動子)、雞β肌動蛋白啟動子、小CBA(smCBA)啟動子、CBSB啟動子或CBh啟動子、諸如人類β肌動蛋白啟動子之另一β-肌動蛋白啟動子、延長因子1α短型(EFS)啟動子、延長因子1α短型(EF-1α)啟動子、CMV啟動子、PGK啟動子、UBC啟動子、GUSB啟動子、UCOE啟動子、VMD2(卵黃狀黃斑變性；亦稱為BEST1)啟動子、RPE65啟動子或其雜合體或衍生物。在一些實施例中，啟動子為CAG啟動子(雜合CMV早期強化子/雞β肌動蛋白啟動 子，亦稱為CAGGS啟動子、CB啟動子或CBA啟動子)、延長因子1α短型(EFS)啟動子、延長因子1α短型(EF-1α)啟動子或CMV啟動子或其衍生物或雜合體。
在一些實施例中，調節序列包含強化子。在一些實施例中，強化子為病毒強化子，其包括但不限於WPRE強化子、HPRE強化子、CTE強化子或其衍生物或雜合體。在一些實施例中，調節序列包含多腺苷酸化(polyA)信號。在一些實施例中，polyA信號為牛生長激素多腺苷酸化信號(bGH polyA)、小polyA信號(SPA)、SV40 polyA信號、人類生長激素多腺苷酸化信號(hGH polyA)、SV40晚期polyA信號或其衍生物或雜合體。在一些實施例中，調節序列包含科札克序列(SEQ ID NO：37或38)。
在一些實施例中，對於體外治療，以約1×103 GC/細胞至約1×106 GC/細胞之劑量(MOI)感染目標細胞(GC：基因組拷貝，測量含有AAV粒子之基因組(又名載體基因組(vector genome，vg)或基因組粒子(genome particle，gp))。在一些實施例中，對於向個體之眼睛的體內給藥，單次給藥可為大概約從1×106至2×1013 GC(例如，約1×1011 GC至約1×1012 GC之高劑量範圍、約1×1010 GC至約1×1011 GC之中等劑量範圍、約1×109 GC至約1×1010 GC之低劑量範圍、約1×106 GC至約1×109 GC之極低劑量範圍及約1×1012 GC至約2×1013 GC之極高劑量範圍)，或在這些範圍內的足夠提供所期望之效果的 任何劑量。
在一些實施例中，施用步驟發生在疾病症狀發作之前或發生在疾病症狀發作之後。在一些實施例中，向眼睛給藥。在一些實施例中，藉由視網膜下注射給藥。在一些實施例中，藉由玻璃體內注射給藥。在一些實施例中，藉由直接視網膜注射給藥。在一些實施例中，藉由任何其他有效地將載體遞送至個體之視網膜下位置、眼睛後段、角膜或RPE細胞、光感受器細胞或角膜上皮細胞的給藥方法來給藥。
在一些實施例中，藉由角膜遞送給藥。在一些實施例中，藉由經由血流遞送而達成眼睛給藥。在一些實施例中，經由滴眼劑給藥。在一些實施例中，藉由遞送至晶狀體來給藥。在一些實施例中，給藥至視網膜下腔、角膜、晶狀體中或給藥至玻璃體中。在一些實施例中，眼細胞係選自由以下組成之群：視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞(PRC)、角膜上皮細胞(CEC)、脈絡膜內皮(CE)細胞、視網膜細胞、角膜細胞、晶狀體細胞、神經節細胞、視神經細胞及/或脈絡膜細胞，以及衍生自幹細胞(包括但不限於iPSC、ES細胞、MSC、成體幹細胞及/或組織特異性幹細胞)的該等類型的細胞。
在一些實施例中，本文中所描述之方法可以進一步包括鑑定具有BCD或處於罹患BCD的風險的個體。
EFS及/或SPA在包含編碼Cas之核酸序列的rAAV 載體中的用途相關請求項
在一個態樣中，提供一種組成物，其包括重組腺相關病毒(rAAV)載體，該載體包含可操作地連接至編碼CRISPR相關蛋白(Cas)之核酸分子的延長因子1α短型(EFS)啟動子及/或小多腺苷酸化(polyA)信號(SPA)。
在一些實施例中，EFS啟動子係由與SEQ ID NO：35具有至少80%序列同一性的核酸序列所組成，且SPA係由與SEQ ID NO：36具有至少80%序列同一性的核酸序列所組成。在一些實施例中，由可操作地連接至EFS啟動子及/或SPA之核酸序列所編碼之Cas係Cas9或Cpf1。
提供包括如本文中所描述之rAAV的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為細菌細胞、大腸桿菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞為體細胞或幹細胞。在一些實施例中，宿主細胞為視網膜細胞、角膜細胞、脈絡膜細胞、眼細胞、腦細胞、神經元、神經元細胞、iPS細胞、ES細胞、MSC、成體幹細胞、組織特異性細胞、幹細胞或任何衍生自幹細胞的細胞。在一些實施例中，將rAAV載體遞送至宿主細胞，使得由核酸分子所編碼之Cas在細胞中表現。在一些實施例中，宿主細胞包含如請求項131至134中任一項之任何細胞。
本發明之其他特徵及優勢根據實施方式、圖式簡單說明及實例以及申請專利範圍將變得顯而易見。本 文中所提及之所有出版物、專利申請案、專利、序列、資料庫條目及其他參考文獻均以全文引用之方式併入。
定義
應理解，如本說明書及申請專利範圍中所使用的「一個(a)」或「一種(an)」可以視其所處的上下文而意謂一或多個。因此，舉例而言，提及「一個細胞」時意謂「至少一個細胞」或「多於一個細胞」。
術語「約」或「大約」或符號「~」係指在給定值或狀態之正或負10%(包括端值)範圍內。除非上下文另有明確說明，否則本文中所提供之所有數值均由術語約來修飾。
術語「AAV.CYP4V2」係指包含編碼功能性CYP4V2蛋白質之多核苷酸的重組腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)載體。
術語「CYP4V2基因療法」係指將功能性CYP4V2蛋白質或編碼功能性CYP4V2蛋白質之多核苷酸引入細胞及/或個體中。參見本揭示內容中之詳述論述。
術語「有效量」或「有效劑量」或「治療有效劑量」係指化合物(例如，載體)及/或細胞在向需要治療 之個體施用時足以實現及/或適合實現此治療的量。有效量將視所使用的治療劑之具體活性、患者之疾病病況的嚴重程度及個體之年齡、身體狀況、其他疾病病況之存在情況及營養狀況而變化。另外，患者正在接受的其他藥物及/或治療亦將影響待施用治療劑之有效量的確定。關於更詳細的論述，參見本文中之說明。
術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指為了包括下列之目的而施用如本文中所揭示之組成物(例如，包含轉基因之AAV及/或細胞)至一個體：1)預防疾病或病狀或提供保護以免患上該疾病或病狀，亦即使得臨床症狀不發展；2)抑制疾病或病狀，亦即遏制、減緩、改善或抑止臨床症狀之發展；3)減輕疾病或病狀，亦即引起臨床症狀消退；及/或4)替代患病的細胞、組織及/或器官及/或恢復其喪失的功能。在一些實施例中，術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指減輕疾病或病狀；亦即引起臨床症狀消退。在一些實施例中，術語「治療(treatment)」或「治療(treating)」交替地或另外地係指有需要之個體的防治性治療(prophylactic treatment)。防治性治療可藉由向具有患病痛風險之個體提供適當劑量之治療劑，從而實質上避免病痛發作來實現。熟習此項技術者應理解，因為最重要的誘導事件可能是未知的或潛在的，或患者可能直到事件出現很久之後才被確診，所以並不總能區分「預防」與「抑止」。因此，如本文所用之術語「防治(prophylaxis)」意欲作為「治療」之要素以涵蓋 如本文中所定義之「預防」及「抑止」兩者。
術語「個體」係指動物，諸如哺乳動物，例如人類。本文中所描述之方法可以適用於人類治療、臨床前及獸醫應用。在一些實施例中，個體為哺乳動物，且在一些實施例中，個體為人類。
「變異體」為與參考生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白質，其保留該生物活性蛋白之至少一部分治療及/或生物活性。舉例而言，與參考生物活性蛋白相比，變異蛋白可以具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列同一性。術語「生物活性蛋白」包括經過故意修飾的蛋白質，如例如藉由定點誘變、插入或偶然經由突變來進行修飾。「變異體」包括「片段」，其為天然或非天然生物活性蛋白之保留至少一部分治療及/或生物活性的截短形式。
術語「核酸」在本文中用以指所有形式的核酸、多核苷酸及寡核苷酸，包括去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。核酸包括基因組DNA、cDNA及RNA。多核苷酸包括天然產生的、合成的及經故意修飾或改變的多核苷酸。多核苷酸可為單鏈體、雙鏈體或三鏈體，線性或環狀，且可為任何長度。特定多核苷酸之序列或結構在本文中可以根據以5'至3'方向提供序列的慣例來描述。
術語「序列變異體」意謂相比於其天然或初始序列已藉由一或多個核苷酸或胺基酸插入、缺失及/或取 代而修飾的基因或多肽。插入可以位於基因或蛋白質之任一端或兩端，及/或可以定位於核苷酸序列或胺基酸序列之內部區域內。在缺失變異體中，如本文中所描述之基因或多肽中之一或多個核苷酸或胺基酸殘基被去除。在取代變異體中，基因或多肽之一或多個核苷酸或胺基酸殘基被去除且用替代性殘基替代。在一個態樣中，取代本質上為保守的，且此類型之保守取代為此項技術中所熟知的。
如本文中所使用之術語「療法」或「治療」可以體內施用於個體或體外施用於細胞中。
如本文中所使用之質體為一種類型的載體。
如本文中所使用之術語「經基因修復的」或「基因修復」係指一細胞最初在基因中攜帶遺傳缺陷(例如，突變或病理性改變)，但經由基因校正或破壞細胞之基因組DNA或mRNA(本文中被定義為「基因編輯」、「基因編輯療法」或「基因校正」)，或經由將表現對應於有缺陷的基因之功能蛋白的外源核酸分子基因轉移至該細胞或向該細胞補充該外源核酸分子(本文中定義為「基因轉移療法」或「基因療法」)，其遺傳缺陷已被修復。
如本文中所使用之術語「序列同一性百分比」或「序列同一性」應如下測定及計算。在計算序列同一性(百分比)時，排比兩個序列並確定該兩個序列之間相同匹配的核苷酸或胺基酸殘基的數目。相同匹配的數目除以排比區域之長度(亦即，所排比的核苷酸或胺基酸殘基之數目)並乘以100，得到序列同一性百分比數值(且無條件 進位至下一個較高的整數(例如，65.01%將無條件進位至66%且出於本文之目的視為66%))。應瞭解，排比區域之長度可為一個或兩個序列之一部分至較短序列之整個淨長度(不施加空位(gap))大小。為了確定兩個蛋白質編碼核苷酸序列之間的相同匹配並計算序列同一性，應該在提交兩個序列用於排比及計算序列同一性之前先去除任何非編碼核苷酸序列(例如但不限於內含子、UTR、科札克序列、啟動子、強化子或其他調節序列)。為了確定兩個序列之間的核苷酸或胺基酸殘基之相同匹配的數目而進行的兩個序列的排比可以藉由使用雙序列排比(Pairwise Sequence Alignment)EMBOSS Needle來進行，該雙序列排比EMBOSS Needle使用尼德曼-翁施演算法(Needleman-Wunsch algorithm)(可在歐洲生物資訊研究所(European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI)獲得及在全球資訊網：ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html上獲得關於核苷酸排比及ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/獲得關於蛋白質排比)及使用預設參數(關於核苷酸序列，使用：矩陣：EDNAFULL。空位開放罰分(Gap Open Penalty)：10。空位擴展罰分(Gap Extend Penalty)：0.5。輸出格式：一對。末端空位罰分(End Gap Penalty)：假的。末端空位開放罰分(End Gap Open Penalty)：10。末端空位擴展罰分(End Gap Extend Penalty)：0.5。關於蛋白質序列，使用：矩陣：EBLOSUM62。空位開放罰分：10。空位擴展罰分： 0.5。輸出格式：一對。末端空位罰分：假的。末端空位開放罰分：10。末端空位擴展罰分：0.5)來創建兩個序列之最佳全局排比(global alignment)。
術語「腺相關病毒載體(adeno-associated virus vector)」係指衍生自以下的核酸：任何AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12血清型，或任何其他在其殼體蛋白序列方面與AAV血清型之殼體蛋白享有同源性的病毒或血清型。術語「重組腺相關病毒」或「rAAV」係指由封裝所關注之核酸分子的AAV蛋白質外殼構成的傳染性複製缺陷型病毒，在該核酸分子之一側或兩側側接有AAV ITR。如本文中所使用，提及特定AAV血清型時意謂具有該AAV血清型之至少一種殼體蛋白的AAV。舉例而言，術語「AAV2」係指具有至少一種AAV血清型2殼體蛋白之AAV。
術語「CYP4V2」係指細胞色素P450 4V2或細胞色素P450家族4亞家族V多肽2(有時稱為CYP4AH1)，及其於其他物種中之異種同源物(orthologues)。CYP4V2中之突變與BCD(參見例如Li等人，Am J Hum Genet.74：817-826,2004)及視網膜色素變性(參見例如Wang等人，PLOS ONE 7：e33673,2012)相關。全長基因組人類CYP4V2基因之長度為約22,053bp且可以例如在全球資訊網genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene=CYP4V2&key words=CYP4V2上找到該基因。如本文中所使用之術語「hCYP4V2」係指人類CYP4V2基因或蛋白質。應理解，hCYP4V2及CYP4V2可以指含有遺傳或表觀遺傳改變之基因或蛋白質或不含遺傳或表觀遺傳改變之基因或蛋白質。
如本文中所使用之術語「功能性CYP4V2」係指能夠有效地向個體(例如，在CYP4V2分子中具有遺傳或表觀遺傳改變之個體)提供治療益處(例如，改善或拯救目標細胞中之異常脂肪酸位準(例如，DHA位準))的蛋白質或在表現時產生該蛋白質的核苷酸分子。功能性CYP4V2分子可以對應於野生型hCYP4V2序列或其天然產生之變異體(例如，多型性變異體；例如不含病理性改變之變異體)或最佳化序列。在一些實施例中，功能性CYP4V2分子為來自另一物種(例如，另一哺乳動物，諸如嚙齒動物、兔、狗、豬或非人類靈長類動物)之與人類CYP4V2享有相似異種同源性(orthology)的CYP4V2分子。舉例而言，人類CYP4V2序列之異種同源物為鼠類mCyp4v3序列。在一些實施例中，功能性CYP4V2分子為另一P450分子(例如，CYP4蛋白質)。
術語「眼細胞」係指眼中或與眼功能相關的任何細胞，包括但不限於視網膜細胞、視網膜雙極細胞、光感受器細胞或光感受器先驅細胞(包括視桿及/或視錐，統稱「PRC」)、神經節細胞、視網膜色素上皮(RPE)細胞、脈絡膜上皮(CE)細胞、角膜上皮細胞(CEC)、脈絡膜細胞 或角膜細胞或視神經細胞。
術語「功能喪失」或「功能障礙」係指細胞功能(例如，光感受器功能、光感受器細胞功能、視網膜色素上皮細胞功能、晶狀體功能、脈絡膜功能或角膜功能)相比於正常非患病細胞或相比於另一隻眼睛或同一隻眼睛在較早時間點時有所下降或喪失。如本文中所使用之「退化」、「萎縮」、「病症」、「疾病」及/或「變性(dystrophy)」在功能喪失方面可以同義地使用。術語「增加的功能」意謂相比於患病的眼睛(具有相同眼部疾病)、同一隻眼睛在較早時間點時、同一隻眼睛之未治療部分或同一名患者之對側眼睛，改善功能(例如，光感受器、光感受器細胞、視網膜色素上皮細胞、脈絡膜細胞或角膜細胞之功能)或增加功能性光感受器或細胞(例如，光感受器細胞、視網膜色素上皮細胞、脈絡膜細胞或角膜細胞)之數目或百分比。
術語「轉基因(transgene)」係指意欲引入或已引入細胞或生物體中之供體核酸。轉基因包括任何基因，諸如表4中所闡述之基因或cDNA。
術語「藥學上可接受的製劑」及「生理學上可接受的製劑」及「藥學上可接受的載劑」意謂生物學上可接受的製劑、氣體、液體或固體或其混合物，其適合一或多種給藥途徑、體內遞送、體外遞送或接觸，且可包括針對其他疾病之療法(例如針對其他眼部疾病之基因療法或細胞療法)中所用的製劑或載劑。「藥學上可接受的」或「生理學上可接受的」組成物為一種非在生物學上或其他方 面非所欲的材料，例如該材料可施用至個體而不引起實質性非所欲的生物效應。因此，此藥學組成物可用於例如施用蛋白質、多核苷酸、質體、病毒載體或奈米粒子至細胞或個體。該等組成物包括但不限於與藥物施用或體內或體外接觸或遞送相容的溶劑(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳劑(例如，水包油或油包水)、懸浮液、糖漿、酏劑、分散及懸浮介質、包衣、等張劑及吸收促進劑或延遲劑。水性及非水性溶劑、溶液及懸浮液可以包括懸浮劑、潤滑劑及增稠劑。該等藥學上可接受的載劑包括錠劑(有包衣或無包衣)、膠囊(硬的或軟的)、微珠、粉末劑、顆粒劑及晶體。亦可在組成物中摻入補充性活性化合物(例如，防腐劑、抗細菌劑、抗病毒劑及抗真菌劑及免疫抑制劑)。如本文中所闡述或熟習此項技術者所知，可以將藥學組成物配製成與特定的給藥或遞送途徑相容。因此，藥學組成物包括適合於藉由各種途徑給藥的載劑、稀釋劑或賦形劑。
術語「crRNA」係指CRISPR RNA，其含有原型間隔區元件(protospacer element)及與tracrRNA互補之額外核苷酸兩者。
術語「tracrRNA」係指反式活化crRNA(transactivating crRNA)，其與crRNA雜合並結合於Cas9蛋白質，活化複合物以在基因組序列內之特異性位點創造雙股斷裂。
術語「sgRNA」係指單引導RNA(single-guide RNA)，其將crRNA與tracrRNA組合成單 一RNA構建體，該crRNA及tracrRNA為釀膿鏈球菌(S.pyogenes)中之天然CRISPR/Cas9系統中之各別分子。
術語「PAM」係指「原型間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif)」，其為被CRISPR核酸酶識別為切割位點之基因組任一股中之短序列。PAM隨核酸酶(例如，Cas9、Cpf1等)而變。原型間隔區元件序列通常直接位於PAM位點上游。
術語「原型間隔區元件」(亦稱為「引導RNA」或「CRISPR gRNA」或「gRNA」或g1、g2、g3、g4、g5等)係指crRNA(或sgRNA)之與基因組DNA目標序列互補的部分。
DHA：二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid)，一種多元不飽和ω-3脂肪酸，亦稱為22：6(ω-3)或C22：6 n3。
AA：花生四烯酸(Arachidonic Acid)，一種多元不飽和ω-6脂肪酸，亦稱為20：4(ω-6)或C20：4 n6或ARA。
PBS(+)：含鈣與鎂的磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)。
PBS(-)：不含鈣或鎂的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在以下圖示及圖式中進一步說明本發明，這些圖示及圖式不限制申請專利範圍中所描述之本發明的範疇。
細胞株專利：
圖1：衍生自BCD患者之iPS細胞株
(a)由BCD患者之皮膚生檢樣品之纖維母細胞產生的iPS細胞：
(i)患者1(P1)iPS細胞
(ii)患者2(P2)iPS細胞
(iii)以Oct-4、Sox-2及SSEA-4標記物特徵化P1及P2 iPS細胞株
(iv)以Nanog及Tra-1-60標記物特徵化P1及P2 iPS細胞株
(b)由BCD患者及健康對照組產生的來自血液樣品之周邊血液單核細胞(PBMC)的iPS細胞：
(i)iPS細胞株之相位差影像(phase contrast image)
(ii)iPS細胞株之AP染色結果
(c)由BCD患者衍生之iPS細胞核型影像，顯示了顯然正常的人類核型。
圖2：衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株：
(a)衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株的光場照片， 顯示了RPE獨特形態-六角形、色素沉著及單層：
(i)P1 iPS-RPE細胞
(ii)P2 iPS-RPE細胞
(b)BCD患者之iPS-RPE細胞的RPE標記物結果，顯示RPE特異性標記物RPE65、CRALBP及MITF的存在。
圖3：iPS-RPE樣品中之CYP4V2表現的qRT-PCR結果。WT(對照組)。WT AVE(對照組之平均值)。P1(BCD患者1)。P1-AAV8(經AAV8.CYP4V2fv以MOI=1.5×10e4 GC/細胞處理之P1樣品)。
圖4：iPS-RPE樣品中之CYP4V2op表現的qRT-PCR結果。WT(對照組)。WT AVE(對照組之平均值)。P1及P2(BCD患者1及患者2)。P1-AAV2(經AAV2.CYP4V2op以2×10e4 GC/細胞之MOI處理之P1樣品)。P2-AAV2(經AAV2.CYP4V2op以2×10e4 GC/細胞之MOI處理之P2樣品)。P2-scAAV1(經scAAV1.CYP4V2op以2×10e4 GC/細胞之MOI處理之P2樣品)。
圖5：未暴露於藍光之iPS-RPE樣品的細胞活力影像。WT(對照組)。P1及P2(BCD患者1及患者2)。紅色(死/病細胞)；綠色(活/健康細胞)。圖5(a)：只有紅色。圖5(b)：紅色及綠色。
圖6：iPS-RPE樣品在暴露於藍光1小時後的細胞活力影像。WT(對照組)。P1及P2(BCD患者1 及患者2)。紅色(死/病細胞)；綠色(活/健康細胞)。圖6(a)：只有紅色。圖6(b)：紅色及綠色。
基因療法：
圖7：示範性CYP4V2表現匣及重組AAV(rAAV)載體之示意圖及對其的註釋。
(a)包裝於單股AAV(ssAAV)載體中之CYP4V2表現匣
(b)包裝於自身互補型AAV(self-complementary AAV，scAAV)或ssAAV載體中之CYP4V2表現匣。
註釋：可以將CYP4V2表現匣(如圖所示，側接有AAV ITR)包裝於具有來自任何AAV血清型或其雜合體或變異體之殼體的rAAV載體中。ITR：反向末端重複序列(Inverted terminal repeats)(可為AAV2 ITR或來自其他AAV血清型之ITR)。示範性AAV2 ITR序列顯示於SEQ ID NO：42及43中。CYP4V2：編碼人類CYP4V2蛋白質或其功能變異體之cDNA，例如編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之CYP4V2st(SEQ ID NO：1)或CYP4V2op(SEQ ID NO：2)，或編碼功能性CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：5)之CYP4V2fv(SEQ ID NO：3)。緊接在CYP4V2 cDNA序列之前插入科札克序列(序列顯示於SEQ ID NO：37或38中)。CAG：雜合CAG啟動子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：32中)。亦可使用本文中所論述之其他啟動子，包括但不限於CMV啟動子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：40中)或EF-1α啟動子(示範性序 列顯示於SEQ ID NO：41中)。WPRE：土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(示範性序列顯示於SEQ ID NO：33中)。bGH polyA：牛生長激素多腺苷酸化信號(示範性序列顯示於SEQ ID NO：34中)。可以使用替代性polyA信號，例如SV40晚期poly A信號(示範性序列顯示於SEQ ID NO：39中)。EFS：延長因子1α短型(EFS)核心啟動子。示範性序列顯示於SEQ ID NO：35中。SPA：小polyA信號。示範性序列顯示於SEQ ID NO：36中。突變/截短ITR：scAAV載體中所用的兩個ITR中之一者為突變/截短ITR(顯示為ITR*)。示範性序列顯示於SEQ ID NO：44中。
圖8：BCD患者衍生之iPS-RPE樣品在暴露於藍光1小時後的細胞活力影像(無AAV.CYP4V2處理對比用AAV2.CYP4V2op或scAAV1.CYP4V2op以1×10e5 GC/細胞之MOI處理)。P1及P2(BCD患者1及患者2)。紅色(死/病細胞)；綠色(活/健康細胞)。圖8(a)：只有紅色。圖8(b)：紅色及綠色。
圖9：BCD患者衍生之iPS-RPE樣品在暴露於藍光1小時後的細胞活力影像(無AAV.CYP4V2處理對比用AAV5.CYP4V2op、AAV5.CYP4V2st或AAV8.CYP4V2fv以1×10e5 GC/細胞之MOI處理)。P1(BCD患者1)。紅色(死/病細胞)；綠色(活/健康細胞)。圖9(a)：只有紅色。圖9(b)：紅色及綠色。
圖10：BCD患者衍生之iPS-RPE樣品在暴 露於藍光1小時後的細胞活力影像(無AAV.CYP4V2處理對比用AAV5.CYP4V2op、scAAV1.CYP4V2op或scAAV5.CYP4V2op以1×10e4 GC/細胞之MOI處理)。P2(BCD患者2)。紅色(死/病細胞)；綠色(活/健康細胞)。圖10(a)：只有紅色。圖10(b)：紅色及綠色。
圖11：BCD患者衍生之iPS-RPE樣品在暴露於藍光1小時後的細胞活力影像(無AAV.CYP4V2處理對比用scAAV9.CYP4V2op以1×10e5 GC/細胞之MOI處理)。P1(BCD患者1)。紅色(死/病細胞)；綠色(活/健康細胞)。圖11(a)：只有紅色。圖11(b)：紅色及綠色。
細胞療法：
圖12顯示CYP4V2序列之區域及引導RNA(guide RNA，gRNA)相對於c.802-8_810del17insGC突變設計的位置及用於gRNA活性分析之引子(橘色箭頭)
圖13顯示體外surveyor分析。泳道1：擴增子+Cas9；泳道2：擴增子+g1+Cas9；泳道3：擴增子+g2+Cas9；泳道4：擴增子+g3+Cas9；泳道5：擴增子+g4+Cas9；泳道6：擴增子+g5+Cas9；泳道7：僅擴增子；泳道M：1kb DNA標記物。
圖14為序列比較，確認surveyor分析中所用之DNA來源。上方：未經處理之擴增子；中間：來自經g2處理之擴增子的片段；下方：CYP4V2基因座，指出了突變位點。
圖15為gRNA載體建構的圖解說明。
圖16為gRNA(以g1為例)、Cas9及PuroR共表現質體pX459-hSpCas9-2A-Puro之載體圖譜。
圖17顯示在pX459-hSpCas9-2A-Puro質體中，gRNA(以g1為例)相對於U6啟動子的位置。U6啟動子與gRNA之間的「G」核苷酸係用於增強由U6啟動子驅動之轉錄效率。當使用不同啟動子時或當gRNA始於「G」核苷酸時，其為視情況選用的而非必需的。
較佳實施例之詳細說明
用於BCD細胞疾病模式之方法及組成物
開發恰當的BCD疾病模式並確定BCD之分子位準表型對於BCD相關之研究、針對BCD之藥物及治療選項的開發及測試至關重要。其對CYP4V2功能之研究亦很重要。如本文背景部分中所概述，自80年前以來，已經特徵化、建立並研究了BCD之臨床表型，對導致BCD之遺傳突變的鑑定已超過十年。然而，臨床表型(例如，BCD患者之視網膜中之晶體樣沈積物)與潛在的CYP4V2突變之間仍存在差距。
先前關於BCD之研究發現，在BCD患者中，包括在纖維母細胞、淋巴細胞及血清中，脂肪酸位準異常。舉例而言，在Lee等人，The Metabolism of Fatty Acids in Human Bietti Crystalline Dystrophy,Invest Ophthalmol Vis Sci.2001年7月；42(8)：1707-14中，研究人員使用脈衝追蹤法(pulse-chase method)來研究BCD患者之纖維母細胞及淋巴細胞中之異常。將BCD患者及正常對照組之纖維母細胞及淋巴細胞與[(14)C]18：3n-3或[(14)C]18：2n-6一起培育。來自具有BCD之患者的纖維母細胞顯示，18：3n-3轉化成多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)之轉化相比於正常個體而言降低，但18：2n-6之轉化未降低。在另一項研究(Lai等人，Alterations in Serum Fatty Acid Concentrations and Desaturase Activities in Bietti Crystalline Dystrophy Unaffected by CYP4V2 Genotypes,Invest Ophthalmol Vis Sci 2010；51：1092-7)中，研究人員使用 GC-MS來分析BCD患者及對照組之血清樣品中之血清脂肪酸濃度。該研究發現，在BCD患者之血清中，十八酸(18：0)之濃度比對照組個體中高，而且十八碳二烯酸(18：1n-9)之濃度比對照組個體中低。此外，BCD中之總單不飽和脂肪酸濃度顯著低於對照組中的。然而在不使用BCD患者樣品作為研究個體的另一項研究(Nakano等人，CYP4V2 in Bietti’s Crystalline Dystrophy：Ocular Localization,Metabolism of omega-3-Polyunsaturated Fatty Acids,and Functional Deficit of the p.H331P Variant,Mol Pharmacol 82：679-686,2012)中，結果表明，CYP4V2酶具有對ω-3-PUFA的ω-羥化酶活性。
重要的是確認BCD患者之纖維母細胞及血清中所發現的異常脂肪酸位準是否實際上存在於BCD患者之RPE細胞中，RPE細胞為BCD的致病細胞。因此，需要一種能允許直接研究BCD患者之RPE細胞的BCD疾病模式來對BCD疾病病理學及CYP4V2功能獲得更多瞭解，以及評定潛在治療選項之功效。然而，鑒於RPE之位置及BCD之罕見性，從BCD患者獲得天然RPE細胞是不實際的。
本揭示內容提供BCD細胞模式及用以產生BCD細胞模式之方法。BCD細胞模式由BCD患者特異性幹細胞(包括但不限於誘導性多能幹細胞(iPSC)、胚胎幹(ES)細胞、體(或成體)幹細胞、間充質幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC))及衍生自BCD患者之 任何幹細胞的眼細胞(包括但不限於RPE細胞、光感受器(視桿或視錐)細胞、光感受器先驅細胞、角膜上皮細胞、晶狀體細胞及/或脈絡膜細胞)所組成。除了患者特異性幹細胞之外，BCD細胞模式亦可藉由在沒有BCD之個體的細胞中創建人工CYP4V2突變來產生，且該等細胞可為ES細胞、iPS細胞或其他幹細胞或任何可以被重編程成為幹細胞的細胞或任何眼細胞(無論是否衍生自幹細胞)。
誘導性多能幹細胞技術為動物模式之疾病模型化提供了另一種選擇。然而，並非所有疾病都能使用iPSC成功模型化。(Urbach,A.,Bar-Nur,O.,Daley,G.Q.& Benvenisty,N.Differential Modeling of Fragile X Syndrome by Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell 6,407-411(2010))。此外，鑒於所報導的與BCD相關之脂肪酸合成代謝，尚不清楚是否可以藉由iPS技術產生BCD患者特異性iPS或患者特異性iPS-RPE細胞。
A.誘導多能性
誘導性多能幹細胞(iPSC)之製造方法為本發明所屬技術領域中已知的。幾乎所有類型的體細胞都可被用作iPSC重編程的來源細胞。簡言之，iPSC可以藉由將特定的一組蛋白質(例如，編碼特定的一組蛋白質的核酸或藉由蛋白質之直接遞送)引入細胞中而製得。熟習此項技術者應理解，一種示範性非限制性方法係藉由引入一或多個編碼OCT4、SOX2、KLF4及/或c-MYC中之一或多者 的轉基因(例如，「山中因子(Yamanaka factors)」)。在一些實施例中，重編程使用所有四個轉錄因子。在一些實施例中，可以使用一個、兩個或三個轉錄因子。Li等人，Stem Cells,2009；27：2992-3000。Zhu等人，Cell Stem Cell 2010；7：651-655。在一些實施例中，iPSC可以藉由直接遞送重編程蛋白而產生。Kim等人，Cell Stem Cell.2009；4(6)：472-6。實例部分提供使用非整合方法，例如藉由仙台病毒(Sendai virus)(實例1)或藉由附加型方法(實例2)產生iPSC的方法。然而，任何產生iPSC之方法被思量於本揭示內容之範疇內。
可使用各種方法(例如，仙台病毒、附加型方法、具有或不具有小分子)產生iPSC，參見實例部分，亦參見例如Hubbard等人，J.Vis.Exp.,2014,92：52009。此外，本發明所屬技術領域中已知從多種不同細胞類型製造iPSC的方法。參見例如Hayashi等人，2012,PLoS One,7(9)：e45435；Poon等人2015,PLoS One,10(7)：e0131288；Lamba等人2010,PLoS One,5(1)：e8763。iPSC通常表現可檢測位準的至少一種標記物，其包括但不限於Oct-4、Sox-2、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、AP及/或NANOG。
可以使用任何類型的幹細胞產生本文中所描述之BCD細胞模式，其包括但不限於誘導性多能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(hematopoetic stem cell，HSC)、胚胎幹(ES)細胞、間充質幹細胞、成體幹細胞或組織特異 性幹細胞。用於本文中所描述之方法中的幹細胞可為多能(pluripotent)、多潛能(multipotent)或全能(totipotent)幹細胞。
如本文中所使用之術語「多能」係指細胞至少能夠發育成外胚層、內胚層及中胚層細胞中之一者。在一個實施例中，術語「多能」係指細胞為全能的及多潛能的。如本文中所使用之術語「全能」細胞係指細胞能夠發育成所有譜系的細胞。如本文中所使用之術語「多潛能」係指未發生終末分化(terminally differentiated)的細胞。本文中揭示內容之多能細胞可為任何幹細胞，或使用本發明所屬技術領域中已知之誘導、去分化及核轉移方法，由非多能細胞(諸如纖維母細胞)所產生。本文中所描述之多能細胞無論是幹細胞還是由非多能細胞所產生，都可以來自具有BCD或具有CYP4V2突變之個體，或來自不具有BCD以用作對照組或用於創建人工CYP4V2突變的健康個體。
幾乎任何類型的細胞都可以被重編程成為iPS細胞。參見本文標題為「細胞起源」之小節中的論述。
B. iPSC之分化
將BCD患者iPS細胞分化成iPS-RPE細胞(或另一類型之眼細胞(例如，iPS-CEC、iPS-CE細胞或iPS-PRC)。將iPSC分化成RPE細胞或另一類型之眼細胞(例如，CEC及PRC)的方法為已知的。參見例如實例部分；Hayashi等人，2012,PLoS One,7(9)：e45435； Songstad等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science 2015年12月，第56卷，8258-8267；及Lamba等人，PLoS One.2010年1月20日；5(1)：e8763。舉例而言，可以產生從細胞重編程的誘導性多能幹細胞(iPSC)並將該等細胞進一步分化成例如RPE細胞(本文中稱為「iPS-RPE」)、角膜上皮細胞(本文中稱為「iPS-CEC」)、光感受器細胞(或光感受器先驅細胞；本文中稱為「iPS-PRC」)或iPS-脈絡膜內皮(CE)細胞(稱為「iPS-CE」)。
測試經分化之細胞(例如iPS-RPE細胞)的生化功能(如本文中及實例部分中所描述)，以相比於健康對照組之iPS-RPE細胞評定其生化缺陷/異常。
如本文中所描述般產生的iPS-RPE細胞株展現能指示RPE細胞的形態(例如，色素沉著及六角形)及/或表現一或多種能指示RPE細胞的生物標記物。RPE細胞(及iPS-RPE細胞)之生物標記物為已知的且包括但不限於RLBP1(又名CRALBP)、RPE65、斑萎蛋白-1(BESTROPHIN-1)、MITF、黏著斑蛋白(VINCULIN)、LRAT、RDH5、PAX6、MERTK、TYR及/或ZO-1中之一或多者，且可用以判定或確認RPE分化已經發生。同樣地，CEC(及iPS-CEC)及PRC(及iPS-PRC)之生物標記物為已知的且包括例如針對角膜上皮細胞之細胞角蛋白12(cytokeratin 12)及細胞角蛋白3；及針對光感受器之Crx、針對視桿及視錐之恢復蛋白(recoverin)及針對視桿 之Nrl。
經由如實例部分中所描述之iPS重編程及RPE分化方法，BCD患者特異性iPS及iPS-RPE細胞可被成功地產生。
C用以鑑定BCD患者之iPS-RPE細胞中之生化缺陷/異常之生化分析及用以評定RPE萎縮之細胞活力分析
一組生化分析被開發並被使用來評定及測定BCD患者特異性iPS-RPE細胞中之表型。
首先，我們的生化分析中包括了較為完整的脂肪酸列表。在先前的研究中已鑑定到BCD患者中之異常的血清脂肪酸位準，測試樣品中之以下脂肪酸：16：0、16：1、18：0、18：1n-9、18：2n-6、18：3n-3、20：3n-6、20：4n-6、22：5n-3、22：6n-3、24：0及24：1。該研究發現，在BCD患者之血清中，十八酸(18：0)之濃度比對照組個體中高，而且十八碳二烯酸(18：1n-9)之濃度比對照組個體中低。為了判定在BCD患者特異性iPS-RPE細胞中是否存在相同的脂肪酸異常及是否有更多其他脂肪酸的異常，使用LC-MS開發一項涵蓋更多脂肪酸的生化分析(參見表2)。
此外，為了判定BCD患者特異性iPS-RPE細胞是否攜帶除了脂肪酸之外的其他異常，在該分析中包括其他脂質種類，包括神經醯胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神經鞘胺醇及二氫鞘胺醇(SOSA)，以便分析BCD疾病模式中之表型並測定CYP4V2蛋白質之生化功能。參見表2之 用以測試BCD患者特異性iPS-RPE細胞之生化分析中所包括的不同種類及化合物的列表。
出人意料地，測試結果(參見實例部分)顯示，BCD患者特異性iPS-RPE細胞具有一種脂肪酸異常譜(fatty acids abnormality profile)，其係不同於BCD患者之血清中所發現者。
眼睛為人體的感光器官。BCD始於RPE萎縮，RPE萎縮繼而引起光感受器死亡及視覺喪失。RPE之關鍵功能為光吸收(Strauss,2005,The retinal pigment epithelium in visual function.Physiol Rev 85：845-81)。環境光曝露可能影響人類視網膜退化的發展及進展，人類視網膜退化諸如年齡相關性黃斑退化(age-related macular degeneration，AMD)及視網膜色素變性(RP)。在眼部疾病模式中使用光曝露為適合研究視網膜退化的模式系統。包括藍光曝露在內的光曝露已廣泛用於視網膜研究中(Dual roles of polyunsaturated fatty acids in retinal physiology and pathophysiology associated with retinal degeneration,Masaki Tanito & Robert Anderson(2009)Clinical Lipidology,4：6,821-827.Seko等人，Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.2001年1月；239(1)：47-52.Blue light-induced apoptosis in cultured retinal pigment epithelium cells of the rat.Narimatsu等人，Exp Eye Res.2015年3月；132：48-51.Blue light-induced inflammatory marker expression in the retinal pigment epithelium-choroid of mice and the protective effect of a yellow intraocular lens material in vivo)。藍光存在於環境光中，諸如陽光及人工照明(例如，辦公室照明)，以及來自電子顯示裝置，諸如TV、顯示器、智慧型手機、筆記型電腦及平板電腦(Moon等人，Blue light effect on retinal pigment epithelial cells by display devices,Integr Biol(Camb).2017,22；9(5)：436-443.doi：10.1039/c7ib00032d)。
在此研究中，細胞活力分析發現了BCD細胞模式中之RPE萎縮。暴露於(藍色)光在BCD患者之iPS-RPE樣品中引起的細胞死亡顯著高於在對照組樣品中所引起的。BCD之臨床表型(亦即RPE萎縮)在BCD細胞模式中為明顯的。AAV.CYP4V2在BCD細胞模式中展現出拯救RPE萎縮之功效。
D. BCD細胞模式之應用
除了評定與BCD相關之細胞位準表型之外，BCD細胞模式亦可用於疾病模式之其他應用，包括但不限於藥物篩選、開發治療劑或裝置、測定劑量範圍、安全性及毒性測試、針對BCD或其他與CYP4V2相關之病狀測試不同製劑、或研究CYP4V2功能及用途，包括但不限於開發及篩選包含或表現CYP4V2蛋白質之藥物，例如CYP4V2基因療法。此外，BCD患者特異性iPS-RPE(及其他由BCD患者特異性幹細胞衍生之眼細胞，其包括但 不限於iPS-光感受器細胞、iPS-角膜細胞)可以用作細胞療法，以未經修飾之形式使用或在基因修復(例如，藉由如本文中所描述之基因轉移或基因編輯)之後使用。實例部分提供BCD細胞模式應用之非限制性實例的實例。
E.篩選化合物的方法
值得注意的是，本文中所描述之iPSC-RPE細胞株可以提供人類細胞疾病模式(例如，BCD、視網膜色素變性、IRD)。可被統稱為「iPSC-眼細胞」之該等iPSC-RPE細胞、iPSC-CEC細胞或iPSC-PRC細胞，可用於BCD患者或視網膜色素變性患者或具有另一類型之遺傳性視網膜疾病之患者的診斷、預後、預測疾病發作、嚴重程度及進展率。舉例而言，該等iPSC-眼細胞株亦可用於篩選出測試化合物中可能具有治療或預防與CYP4V2核酸中之遺傳或表觀遺傳改變相關之疾病(例如，BCD)的治療功效的化合物。
本文中所描述之多能細胞，尤其是由在CYP4V2中具有遺傳或表觀遺傳改變之個體或具有眼睛疾病(例如，BCD)之個體產生的多能細胞，可以作為研究工具用於鑑定能作為用於治療、診斷、預後或預防眼睛疾病(例如，BCD)之治療候選者的化合物之方法中。應理解，測試化合物可以是任何類型的化合物。其可具有天然來源或可以藉由化學合成產生。其可為一具有下列的庫(library)：結構限定的化合物、未特徵化的化合物或物質或化合物混合物。熟習此項技術者應瞭解，測試化合物可 為，但不限於，核酸或其類似物、多肽或其類似物、抗體、化學製品及小分子。
可以在存在或不存在測試化合物的情況下評估本文中所描述之細胞的生長能力及其在動物模式中(例如，在動物模式之眼睛中)之功能並評估其形成腫瘤的傾向或沒有這種傾向。可以使用多種方法來評估細胞，其包括但不限於PCR技術、免疫分析及/或脂質/脂肪酸代謝分析。
用於細胞療法之方法及組成物
如本文中所論述，CYP4V2基因療法展現出校正BCD患者特異性iPS-RPE細胞中之生化異常的功效。然而，基因療法在體內起作用的前提條件是個體仍有一些RPE及光感受器細胞留在正被治療的眼睛中。關於眼中只留下少量或沒留下RPE細胞或光感受器細胞的晚期BCD患者，細胞療法可以作為替代方案或與基因療法組合使用，作為一種治療選項。
細胞療法涉及移植新細胞來替代死細胞或退化細胞。關於BCD，新細胞可為RPE細胞、光感受器細胞(視錐及/或視桿)、光感受器先驅細胞、脈絡膜細胞、角膜上皮細胞、晶狀體細胞或其他類型之眼細胞，這取決於個體中哪種類型的細胞顯示出退化並需要替代。以下說明及本文中之實例使用iPS-RPE細胞來說明該等方法及過程。可將其應用於其他類型的眼細胞。
針對BCD及其他類型之眼部疾病的細胞療 法可以如下分類，其他類型之眼部疾病包括但不限於遺傳性視網膜疾病(IRD)、視網膜色素變性(RP)、黃斑退化(包括年齡相關性黃斑退化(AMD))。
(1)同種異體移植：
在一個實施例中，可以在同種異體移植中使用來自健康供體之RPE細胞、PRC、CEC、CE細胞及其他衍生自胚胎幹細胞(ESC)或iPSC之眼細胞作為BCD之細胞療法。其涉及將來自健康個體(亦即不含CYP4V2突變者)之健康ESC或iPSC分化成RPE細胞及將該ESC-RPE細胞移植至BCD患者之眼睛。本文在實例部分中提供重編程iPSC及將ESC或iPSC分化成RPE的方法。在先前的研究中，胚胎幹細胞(ESC)衍生之RPE細胞已被使用來治療年齡相關性黃斑退化(AMD)，參見Schwartz等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science 2016年4月，第57卷，ORSFc1-ORSFc9。同種異體移植物(allo-graft)或同種異體移植之優點是它比自體移植便宜，因為一共同來源可用於治療多位患者。然而，其亦有顯著的缺點，諸如宿主個體之免疫排斥可能顯著地影響其功效及持續時間。此外，其需要長期免疫抑制劑，這可能導致嚴重的全身性副作用。最後，使用ESC可能會產生道德問題。
(2)無基因修復之自體移植：
在一個實施例中，可以在針對BCD之細胞療法中使用自體細胞。一個此類自體來源為衍生自BCD 患者之iPS細胞及iPS-RPE細胞，其可被移植至該BCD患者之眼睛。BCD為相對晚發性疾病。BCD患者之症狀通常在生命之第2、第3或甚至第4個十年間出現。此外，iPS重編程方法對iPS細胞及衍生自iPS細胞之細胞具有一定程度的「重置時鐘(reset the clock)」作用。因此，衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞及其他iPS-眼細胞可以作為細胞療法使用而移植至BCD患者，甚至不需要對iPS-RPE細胞中之CYP4V2突變進行任何基因修復。提供iPS重編程及RPE分化方法於本文中之實例部分中。作為預防措施，無論iPS重編程及RPE分化過程期間是否產生任何致病突變，都可以進行全基因體定序來比較iPS或iPS-RPE細胞中之基因組DNA與來源細胞(例如，纖維母細胞或血球)中之基因組DNA。
(3)用於針對BCD及其他類型的IRD及RP之細胞療法的經基因修復之患者自體細胞
本揭示內容在此提供用於產生供細胞療法用之經基因修復的自體細胞的方法及組成物。如本文中所使用之「經基因修復的」或「基因修復」係指經由基因編輯患者之基因組(例如，直接在染色體上使用例如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、鋅指、TALEN)或經由將通常不整合至基因組中的CYP4V2基因之健康拷貝(cDNA、RNA或其他形式)基因轉移至患者細胞中(例如，如文本中所描述之CYP4V2基因療法)或校正或補償患者細胞中之有缺陷的mRNA來校正CYP4V2突變。
至於由遺傳突變引起之疾病，用於在針對BCD或另一IRD或RP之細胞療法中使用的自體細胞理想地應該在移植之前就已修復其遺傳缺陷(亦即CYP4V2突變)及/或其功能異常性CYP4V2蛋白質。在一個實施例中，該基因修復可以藉由如本文中所論述之基因轉移療法來達成，包括但不限於編碼及表現功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列的AAV介導之基因療法轉移。本文中提供CYP4V2基因轉移療法之組成物及方法，參見本文中之實施方式及實例部分。BCD患者特異性來源細胞iPS或iPS-RPE細胞可以用AAV.CYP4V2(如本文中所提供)處理，接著進行iPS重編程及/或RPE分化(若適用)及驗證改良的生化功能(如本文中所提供)，然後移植至原患者之眼睛。在另一實施例中，該基因修復可以藉由基因編輯來達成，例如校正BCD患者細胞中之基因組或RNA中之CYP4V2突變。除了作為細胞療法之一部分在體外施用之外，該基因編輯亦可作為基因療法直接在體內施用。該基因編輯可以對患者之來源細胞(例如，纖維母細胞或血球)、iPS、iPS-RPE或其他類型之iPS-眼細胞進行。用於產生患者特異性iPS及iPS-RPE之iPS重編程及RPE分化可以在基因修復(例如，基因轉移療法或基因編輯)之前或之後進行。
本揭示內容在此提供經由基因編輯校正CYP4V2突變之組成物及方法。本文實例部分中之描述說明了使用CRISPR/Cas9構建體校正BCD患者中最常見的 突變c.802-8_810del17insGC突變的組成物及方法。其亦可適用於其他基因編輯方法(例如，CRISPR/Crp1、TALEN、鋅指)及其他IRD突變(例如，但不限於，表1中之其他CYP4V2突變)，與本發明所屬技術領域中已知之方法相組合。
BCD患者中最常見的CYP4V2突變為c.802-8_810del17insGC(係指17個鹼基缺失且兩個鹼基(GC)插入於從CYP4V2基因之內含子6的末端起8個鹼基的位置中，亦稱為IVS6-8 del/insGC，參見SEQ ID NO：46，其顯示包含c.802-8_810del17insGC突變之人類CYP4V2基因組DNA區域的序列，及SEQ ID NO：47，其顯示相應的野生型序列)。c.802-8_810del17insGC突變展示於以下顯示人類CYP4V2內含子6-外顯子7接合(human CYP4V2 intron 6-exon 7 junction)的序列中。內含子6序列以小寫字母顯示且外顯子7序列以大寫字母顯示。17bp缺失及GC插入位於括號內：caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa(tca tac agG TCA TCG CT)(GC)GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA(SEQ ID NO：46)，導致預測之跳過外顯子7。(Xiao等人，Biochem Biophys Res Commun.409：181-6,2011；Meng等人，2014,Mol.Vis.,20：1806-14；Wada等人，Am J Ophthalmol.139：894-9,2005；Jiao等人，European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471)。最近的研究估計，c.802-8_810del17insGC突變之存在時間在 中國族群中為1,040至8,200世代且在日本族群中為300至1100世代。參見Jiao等人，European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471。
細胞療法(cell therapy)(亦稱為細胞療法(cellular therapy)或細胞療法(cytotherapy))可如本文中所描述般使用，用於治療或預防個體之眼睛疾病。如本文所描述，本文中所提及之BCD、某些RP、IRD及其他眼睛疾病係與CYP4V2核酸序列中之遺傳或表觀遺傳改變相關。
細胞療法一般涉及注射、植入、移植或以其他方式遞送包括細胞之組成物至個體(例如，至患者之組織或器官(例如，眼睛)中)。本文中所描述之方法係獨特的，因為其允許了對具有眼睛疾病之個體的經基因修復之自體細胞療法。
本文中所描述之方法包括：從具有眼睛疾病(例如，與CYP4V2核酸序列中之遺傳或表觀遺傳改變相關)之個體獲得細胞並使用例如基因編輯來修復CYP4V2核酸(例如，DNA或RNA)內之突變，或經由遞送編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列來修復(例如，基因轉移)。在將細胞施用返回至個體中(例如，至個體之眼中)之前，可以使細胞變成多能細胞(例如，藉由誘導多能性，例如以製造iPSC)且可以將其分化成一或多個眼細胞(例如，iPS-RPE、iPS-CEC、iPS-PRC)。應瞭解，可以在細胞變成多能細胞之前或之後或在細胞分化成眼細胞之後對 細胞進行基因修復。
A.細胞起源
在一些情況下，可以在本文中所描述之細胞療法方法中使用自體細胞(例如，個體(例如，患者)-特異性細胞)。舉例而言，可以從個體獲得諸如纖維母細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)之細胞且使用該等細胞產生iPSC，如實例部分中所描述。幾乎所有類型的細胞都可用於產生iPSC，因此都可用作來源細胞。在一些情況下，可以使用從尿液(參見例如Zhou等人，2012,Nat.Protoc.,7：2080-9)或毛囊或真皮乳頭細胞(dermal papilla cells)(參見例如Muchkaeva等人，2014,Acta Naturae,6：45-53)獲得的細胞來產生iPSC。
B.誘導多能性
誘導性多能幹細胞(iPSC)之製造方法為本發明所屬技術領域中已知的。簡言之，iPSC可以藉由將特定的一組蛋白質(例如，編碼特定的一組蛋白質的核酸)引入細胞中而製得。熟習此項技術者應理解，一種示範性非限制性方法係藉由引入一或多個編碼OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC(例如，「山中因子」)之轉基因。在一些實施例中，重編程使用所有四個轉錄因子。在一些實施例中，可以使用一個、兩個或三個轉錄因子。Li等人，Stem Cells,2009；27：2992-3000。Zhu等人，Cell Stem Cell 2010；7：651-655。在一些實施例中，iPSC可以藉由直接遞送重編程蛋白而產生。Kim等人，Cell Stem Cell. 2009；4(6)：472-6。實例部分提供使用非整合方法，例如藉由仙台病毒(實例1)或藉由附加型方法(實例2)產生iPSC的方法。然而，任何產生iPSC之方法被思量於本揭示內容之範疇內。
可使用各種方法(例如，仙台病毒、附加型方法、具有或不具有小分子)產生iPSC，參見實例部分，亦參見例如Hubbard等人，J.Vis.Exp.,2014,92：52009。此外，本發明所屬技術領域中已知從多種不同細胞類型製造iPSC的方法。參見例如Hayashi等人，2012,PLoS One,7(9)：e45435；Poon等人2015,PLoS One,10(7)：e0131288；Lamba等人2010,PLoS One,5(1)：e8763。iPSC通常表現可檢測位準的至少一種標記物，其包括但不限於Oct-4、Sox-2、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、AP及/或NANOG。
可以在本文中所描述之細胞療法方法中使用任何類型的幹細胞，其包括但不限於誘導性多能幹細胞(iPSC)、造血幹細胞(HSC)、胚胎幹(ES)細胞、間充質幹細胞、成體幹細胞或組織特異性幹細胞。用於本文中所描述之方法中的幹細胞可為多能、多潛能或全能幹細胞。
如本文中所使用之術語「多能」係指細胞至少能夠發育成外胚層、內胚層及中胚層細胞中之一者。在一個實施例中，術語「多能」係指細胞為全能的及多潛能的。如本文中所使用之術語「全能」細胞係指細胞能夠發育成所有譜系的細胞。如本文中所使用之術語「多潛能」 係指未發生終末分化的細胞。本發明之多能細胞可為任何幹細胞，或使用本發明所屬技術領域中已知之誘導、去分化及核轉移方法，由非多能細胞(諸如纖維母細胞)所產生。本文中所描述之多能細胞，無論是幹細胞還是由非多能細胞所產生者，都可以來自具有BCD或具有CYP4V2突變之個體或健康個體。
iPSC可藉由以下中之一或多者來特徵化：a.iPSC之獨特形態；b.一或多種多能性標記物，諸如Oct-4、Sox-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog及AP；c.分化成所欲細胞類型(例如，RPE細胞)的能力；及/或d.畸胎瘤分析。以上各者並非全部都是特徵化iPSC及驗證多能性所必須的(例如，畸胎瘤(teratoma)；參見例如Buta等人，2013,Stem Cell Res.,11(1)：552-562)。
C.基因編輯
在本文中所描述之方法中可以使用多種基因編輯技術來修復個體之CYP4V2核酸中所存在的遺傳或表觀遺傳改變。基因編輯可以使用任何數目之技術進行，該等技術包括常間回文重複序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)技術(參見例如美國專利第8,697,359號；第8,889,418號；第8,999,641號；及US 2014/0068797)、類轉錄活化因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術(參見例如Li等人，2011,Nucleic Acids Res.,39(14)：6315-25)或鋅指核酸 酶技術(參見例如Wright等人，2005,The Plant J.,44：693-705)。
為了使用CRISPR技術完成基因編輯，可以將編碼核酸酶(例如，時常是Cas9核酸酶，但亦可以使用其他核酸酶(例如，其他Cas核酸酶，例如Cpf1，或非Cas核酸酶))之核酸併入一或多個載體中，並如本文中所描述之施用於個體。僅舉例而言，本文中所描述之細胞(例如，在重編程成iPSC前的個體細胞、在分化成RPE、角膜上皮細胞或光感受器細胞之前或在分化成RPE、角膜上皮細胞或光感受器細胞之後的個體iPSC(本文中稱為「iPSCs-RPE」、「iPSC-CEC」或「iPSC-PRC」))可以用一或多種含有及/或編碼至少一種引導RNA(gRNA)、至少一種CRISPR相關蛋白(例如，Cas9或Cpf1)及至少一種供體模板核酸之構建體(例如，載體、RNP、mRNA)轉導或轉染。在一些實施例中，不需要供體模板核酸，例如當經由剔除(knock out)達成基因修復時。
同樣地，為了使用TALEN技術完成基因編輯，可以將編碼TALEN(例如，二聚轉錄因子/核酸酶)之核酸併入載體中並如本文中所描述之施用於個體。同樣，為了使用鋅指核酸酶技術完成基因編輯，可以將編碼定製DNA核酸內切酶(custom DNA endonuclease)(例如，異二聚體，其中各次單元含有鋅指域(zinc finger domain)及FokI核酸內切酶域(FokI endonuclease domain))之核酸併入一或多個載體中並如本文中所描述之施用於個體。
進行這些技術中之每一者所需的組分可在商業上獲得且可針對特定目標序列定製。參見例如Caribou Biosciences；GenScript,CRISPR Therapeutics；Editas Medicine；Cellectis Bioresearch；Life Technologies；Sangamo BioSciences；或Sigma Aldrich Chemical Co.。
在適當情況下，可以發生基因編輯，使得個體之CYP4V2核酸中之遺傳或表觀遺傳改變被修復，從而使功能性CYP4V2蛋白質被表現。當CYP4V2核酸(例如，CYP4V2 mRNA)之存在被恢復、CYP4V2蛋白質之存在被恢復、或CYP4V2蛋白質之功能被恢復時，CYP4V2核酸序列得到修復。同樣地，「修復」或「校正」可以指將受影響序列(例如，遺傳或表觀遺傳改變)恢復為如本文中所描述之野生型序列或另一非突變序列。
可能有一些欲使用基因編輯將一或多個突變引入細胞中(例如，CYP4V2核酸中)的情況。這是一種可創建疾病(例如，BCD)之細胞模式的方式。舉例而言，可以對胚胎幹細胞(ES細胞)進行基因編輯以產生具有人工CYP4V2突變之細胞株，然後將該等細胞株分化成RPE細胞。或者，可以對來自健康個體(例如，非BCD個體)之iPS細胞株或對RPE細胞株(例如，ARPE-19細胞株)進行基因編輯以產生CYP4V2突變型iPS或RPE細胞株。
在一些情況下，在基因編輯步驟完成之後篩選細胞(例如，使用全基因體定序)以確認所靶向之突變已 被修復且未發生顯著的脫靶編輯(off-target editing)係所欲的。
CRISPR及CRISPR相關蛋白9(Cas9)被稱為CRISPR-Cas9，由RNA引導之核酸酶(RNA-guided nuclease)(Cas9)及引導RNA(guide RNA)組成，產生位點特異性DNA斷裂，該等斷裂係藉由內源性細胞機制來修復。該方法之可能結果包括經由誘變性非同源性末端接合(non-homologous end-joining，NHEJ)使特異性位點突變、在斷裂位點產生插入或缺失(插入缺失(indels))、及使用從外源引入的供體模板經由同源重組(homologous recombination，HR)精確改變基因組序列。CRISPR引導RNA由兩個RNA構成，這兩個RNA被稱為CRISPR靶向RNA(crRNA，在本文中又稱為CRISPR RNA)及反式活化crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)。crRNA通常為約20個核苷酸(nt)長。其藉由華生-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)與目標DNA序列雜交且引導Cas核酸內切酶裂解目標基因組DNA。
為了經由基因編輯基因修復最常見的CYP4V2突變，各種CYP4V2突變CRISPR校正構建體(參見實例部分)被開發。使用CRISPR是因為其實施起來較為簡單且其編輯效率高於其他形式的基因編輯，諸如TALEN及鋅指核酸酶。CRISPR構建體含有經過最佳化及體外驗證的gRNA序列及不同的構建體選項，其可以很容易地用於校正BCD患者細胞株中之 c.802-8_810del17insGC突變，產生可用於針對BCD之細胞療法中之經基因修復的細胞，該細胞療法包括但不限於自體細胞療法。
CRISPR基因編輯療法涉及使用CRISPR相關蛋白(Cas)，其為核酸酶及CRISPR引導RNA。CRISPR引導RNA之作用為將Cas引導至被CRISPR引導RNA靶向之序列，其係經由CRISPR引導RNA中所含的與目標序列互補(或對目標序列具有特異性)的原型間隔區元件。為了使Cas(例如，Cas9或Crf1)結合至及裂解目標序列或目標序列附近，亦需要存在原型間隔區相鄰基序(PAM)序列。PAM序列為一短延伸DNA(short stretch of DNA)(通常為2-6個核苷酸)，其供作為Cas之結合信號。不同的Cas可以具有不同的PAM及裂解模式。舉例而言，對於釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)，典型的PAM序列為NGG。對於金黃色葡萄球菌(SaCas9)，PAM序列為NGRRT或NGRRN。對於腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis，NM)及齒垢密螺旋體(Treponema denticola，Td)，PAM序列分別為NNNNGATT及NAAAAC。經工程改造或突變的Cas亦能引起PAM序列改變。舉例而言，SpCas9 VQR變異體(D1135V、R1335Q及T1337R)之PAM序列為NGAN或NGNG。SpCas9 EQR變異體(D1135E、R1335Q及T1337R)之PAM序列為NGAG。SpCas9 VRER變異體(D1135V、G1218R、R1335E及T1337R)之PAM序列為NGCG。對於Cpf1， PAM序列為TTTN。Cas通常產生雙股斷裂(double-stranded break，DSB)，但被改變的Cas則會引起單股斷裂(例如，SpCas9切口酶(SpCas9 Nickase)(Cas9n D10A))或不引起斷裂(dCas9)。Cas9在PAM位點上游3nt處產生平末端(blunt end)，而Cpf1則以交錯方式裂解，在遠離PAM 18-23個鹼基處產生5核苷酸5'突出端(overhang)。
Cas9之CRISPR引導RNA通常包含CRISPR RNA(crRNA)及反式活化crRNA(tracrRNA)。crRNA包含被設計成與所靶向之用於校正、破壞或替代的基因內至靠近該基因的所靶向序列互補(或對所靶向序列具有特異性)的原型間隔區元件序列，以及對應於tracrRNA之互補區的序列。tracrRNA包含與crRNA之對應區域互補的區域及與CRISPR相關蛋白9(Cas9)相互作用之序列。Cpf1不需要tracrRNA。
原型間隔區元件之長度通常為約20個核苷酸。亦可使用較長或較短的原型間隔區元件序列(約16-24nt)。原型間隔區元件可以與目標序列100%互補或可以含有與目標序列之誤配。在一些實施例中，可以視情況在原型間隔區元件序列的起點添加「G」核苷酸。
在DNA分子被Cas裂解之後，其可被兩種方式中之一種修復。易錯的非同源性末端接合(NHEJ)修復可導致插入缺失突變，該插入缺失突變會破壞由該基因編碼之蛋白質的功能。NHEJ可用於在細胞株中產生人工突 變。在一些實施例中，其可用於在沒有內源性CYP4V2突變之細胞株(例如，ES細胞、iPS細胞或ARPE-19細胞株)的CYP4V2基因中產生突變(例如，外顯子或剪接受體區域中之插入缺失)，由此產生疾病細胞模式(例如，BCD細胞模式)。此外，可以一起使用另外兩個CRISPR引導RNA來剔除目標基因之被靶向區域或整個目標基因，從而產生剔除模式。在一些實施例中，使用基於CRISPR之基因靜默來破壞(或靜默)或缺陷基因，例如治療顯性遺傳疾病。在基因靜默期間，細胞嘗試修復斷裂的DNA，但是NHEJ在這麼做時常常伴隨破壞基因的錯誤因而有效地靜默該基因。在一些實施例中，NHEJ亦可能造成對突變之校正，例如尤其是當突變為單核苷酸變異(single nucleotide variation)或不超過約10個核苷酸時。或者，若供體核酸序列可供使用，則DNA斷裂可以藉由同源定向修復(HDR)來修復以用於校正或替代目標基因。供體核酸序列可以單股DNA(single-stranded DNA，ssDNA)，或單股寡DNA核苷酸(single-stranded oligo DNA nucleotide，ssODN)或載體形式提供。在一些實施例中，對於以ssODN形式提供之供體核酸序列，該供體核酸序列不超過約1kb、800bp、600bp、500bp、400bp、300bp、280bp、260bp、240bp、220bp或200bp。在一些實施例中，對於以載體形式提供之供體核酸序列，該供體核酸序列不超過約25kb、20kb、15kb、10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4.5kb、4kb、3.5kb或3kb。在一些實施例中，供體核酸 序列為對稱的。在一些實施例中，供體核酸序列為不對稱的。在一些實施例中，供體核酸序列之長度可以為了較高的HRD率而被調整。在一些實施例中，若CRISPR基因編輯中所使用的Cas所靶向之PAM亦存在於供體核酸序列中，則可以使其突變(變為不同核苷酸)，使得PAM不再存在於供體核酸序列中，從而避免供體模板或由供體模板修復之DNA序列被Cas裂解及破壞。除了校正或替代突變的或有缺陷的基因或其一部分之外，HDR亦可用於在沒有內源性CYP4V2突變之細胞株(例如，ES細胞、iPS細胞或ARPE-19細胞株)之CYP4V2基因中產生人工突變(例如，在外顯子或剪接受體區域(splice acceptor region)中插入突變)，由此產生疾病細胞模式(例如，BCD細胞模式)。
CRISPR基因編輯療法中所使用的CRISPR引導RNA及Cas可以載體(例如，質體(例如pX330、pX458、pX459)、重組AAV載體或重組慢病毒載體(recombinant lentivirus vector))或編碼此類組分之mRNA及/或RNA及蛋白質的形式提供。
供體模板可以ssDNA(例如，ssODN)形式提供或選殖於質體或其他類型之載體(例如，AAV載體(例如，AAV2或AAV6))中以便用於HDR中。
可以使用多種組成物及方法來改善中靶編輯(on-target editing)或修復效率及/或降低潛在脫靶。舉例而言，可以使用不同的Cas(例如，Cas9或Cpf1)或不 同物種之Cas(例如，SpCas9、SaCas9、NMCas9)或變異體(SpCas9、SpCas9 VQR)來拓寬可供目標序列使用之PAM選擇，從而增強特異性。若目標序列區域缺乏用於SpCas9之NGG PAM位點但是富含AT，則可以改為考慮Cpf1。Cas9切口酶(例如，Cas9 D10A)在目標DNA中僅產生單股斷裂，因此需要兩個配對的CRISPR引導RNA來產生雙股斷裂。此需求顯著增加了目標特異性，因為不太可能在足夠接近的範圍內產生兩個脫靶切口(off-target nick)而造成DSB。此外，不對稱供體模板能夠增強HDR率。催化活性喪失(catalytically inactive)的dCas9不會切割目標DNA，但仍然可以實現序列替代而不會出現通常伴隨Cas9切割的任何易錯修復。參見Richardson等人，Nature Biotechnology 34,339-344(2016)。
達成靶向基因校正且同時避免或最小化脫靶編輯為基因編輯的兩個目的。先前的研究揭示了由基因編輯技術引起的脫靶突變，該等基因編輯技術包括但不限於CRISPR及TALEN，參見例如Tsai等人，Nature Biotechnology 33,187-197(2015)；Wang等人，Nature Biotechnology 33,175-178(2015)；Wu,W.H.等人CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa.Mol.Ther.24,1388-1394(2016)。對於在體內或在細胞療法中(例如，先體外在細胞中，然後將細胞移植於體內)使用的基因編輯，第二個目的，避免或最小化脫靶編輯與達成靶向基 因校正一樣重要，因為脫靶編輯可能會造成疾病或誘導腫瘤形成。應注意的是，並非所有的脫靶編輯都可以用電腦軟體或演算法來預測。
因此，使用了精心的設計、驗證及改良來開發及驗證CYP4V2突變CRISPR基因校正構建體：
(1)以含有c.802-8_810del17insGC突變之突變型CYP4V2核酸序列為基礎，產生多個候選gRNA；
(2)使用以下標準選出前5個gRNA(參見SEQ ID NO：48-52，表5及圖12)：a. gRNA裂解位點與修飾位點之靠近程度，及b. gRNA之脫靶譜(off-target profile)；
(3)在具有純合c.802-8_810del17insGC突變之BCD患者之基因組DNA中驗證前5個gRNA之活性(參見圖13)；
(4)根據(2)及(3)選擇三個gRNA。將3個gRNA中之每一者與編碼Cas9之核酸序列及嘌呤黴素抗性基因(Puro)一起選殖至pX459質體中(參見圖15及18)，以便使用嘌呤黴素選擇經轉染的細胞。
(5)產生提供HDR供體核酸序列之兩個供體模板(正反均互補)。藉由IDT合成含有供體模板序列之ssODN(參見SEQ ID NO：56及57)。
(6)除了質體構建體之外，亦開發CRISPR RNP構建體。RNP構建體具有某些優於其他構建體的優點。詳述論述提供於下文及實例部分中。
(7)在衍生自具有純合c.802-8_810del17insGC突變之BCD患者的iPS細胞中驗證CYP4V2 CRISPR校正構建體。
(8)在未經修飾之細胞及藉由CYP4V2突變CRISPR校正構建體基因修復之iPS細胞中進行全基因體定序以確認c.802-8_810del17insGC突變之校正並評定脫靶編輯。
提供用以確定在iPSC中轉染之最佳條件及用於選擇經轉染之細胞的方法。詳細說明參見實例部分。可預期的是，這些構建體不僅可以用於體外治療BCD患者特異性iPS細胞，而且還能用於體外治療來源細胞(例如，纖維母細胞或PBMC)或iPS-RPE、iPS-PRC、iPS-CE細胞或iPS-CEC細胞或其他衍生自BCD患者特異性iPS細胞之眼細胞，並且可以用於具有c.802-8_810del17insGC突變之患者的體內。在一個實施例中，可以直接使用構建體之組分。在一些實施例中，構建體中之組分可以經修飾，或選殖至不同載體中以達成較高體內轉導效率或對目標細胞類型之較高特異性或達成其他目的。舉例而言，可以將Cas9修飾為Cas9切口酶(Cas9n D10A)，其含有允許核酸內切酶產生單股切口而非雙股斷裂的突變。將具有SpCas9切口酶之兩個相對(opposite facing)的gRNA序列配對為一種能防止形成不合需要之插入缺失的有效基因編輯方法。除了質體之外，用於包裝CRISPR組分之其他常見載體包括慢病毒載體及腺相關病毒(AAV)載體。當使用AAV載體時，可使用金 黃色葡萄球菌Cas9異種同源物(SaCas9)作為核酸內切酶，因為SaCas9比SpCas9短大約1kb，且提供對AAV包裝限制的額外靈活性。
對CRISPR RNP構建體進行了各種改良。使用合成sgRNA而非IVT sgRNA或crRNA：tracrRNA雙鏈體。合成gRNA具有比IVT sgRNA高的純度，因此能夠降低由sgRNA中之雜質引起之脫靶編輯的風險。此外，對sgRNA施加化學修飾以防止sgRNA發生細胞內降解，這可以提高編輯效率。更多細節可參見實例部分。
可預期的是，除了本文中所描述之質體構建體及CRISPR RNP構建體之外，亦可以使用包含Cas9編碼mRNA及引導RNA寡核苷酸的mRNA構建體。
在用CYP4V2突變CRISPR校正構建體轉染BCD患者特異性iPS細胞之後，使用嘌呤黴素選擇經轉染的細胞。應理解，可以將諸如GFP之其他標記物併入構建體中並將其用作代替嘌呤黴素之標記物或用作除了嘌呤黴素之外的標記物。在選擇後進行單細胞選殖，之後從單細胞選殖株收集一些細胞用於定序。在定序結果確認中靶基因編輯成功且未發現致病基因編輯之後，相同選殖株的剩餘細胞被用於分化成所期望的眼細胞類型，例如iPS-RPE細胞。
D. iPSC之分化
將經基因修復的BCD患者iPS細胞分化成iPS-RPE細胞(或另一類型之眼細胞(例如，iPS-CEC、 iPS-CE細胞或iPS-PRC)。將iPSC分化成RPE細胞或另一類型之眼細胞(例如，CEC及PRC)的方法為已知的。參見例如Hayashi等人，2012,PLoS One,7(9)：e45435；Songstad等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science 2015年12月，第56卷，8258-8267；及Lamba等人，PLoS One.2010年1月20日；5(1)：e8763。舉例而言，可以產生從細胞重編程的誘導性多能幹細胞(iPSC)並將該等細胞進一步分化成例如RPE細胞(本文中稱為「iPS-RPE」)、角膜上皮細胞(本文中稱為「iPS-CEC」)、光感受器細胞(或光感受器先驅細胞；本文中稱為「iPS-PRC」)或iPS-脈絡膜內皮(CE)細胞(稱為「iPS-CE」)。
測試經分化之細胞(例如iPS-RPE細胞)之生化功能(如實例部分中所描述)，以確認其生化功能相比於無基因修復之患者之iPS-RPE細胞已改良。
如本文中所描述般產生之iPSC-RPE細胞株展現能指示RPE細胞的形態(例如，色素沉著及六角形)及/或表現一或多種能指示RPE細胞的生物標記物。RPE細胞(及iPS-RPE細胞)之生物標記物為已知的且包括但不限於RLBP1(又名CRALBP)、RPE65、斑萎蛋白-1、MITF、黏著斑蛋白、LRAT、RDH5、PAX6、MERTK、TYR及/或ZO-1中之一或多者，且可用以判定或確認RPE分化已經發生。同樣地，CEC(及iPS-CEC)及PRC(及iPS-PRC)之生物標記物為已知的且包括例如針對角膜上 皮細胞之細胞角蛋白12及細胞角蛋白3；及針對光感受器之Crx、針對視桿及視錐之恢復蛋白及針對視桿之Nrl。
E.給藥/遞送
經基因修復的iPS-RPE細胞可以用於自體移植至衍生出該iPS-RPE細胞的患者中。具有BCD或另一種由於CYP4V2突變所引起的眼科病狀的患者可以用本文中所提供之細胞療法方法治療。同樣地，該方法可用於提供一種針對其他由一或多個遺傳突變引起之眼部疾病的經基因修復之自體細胞療法。
施用或遞送細胞之方法為已知的，且施用或遞送細胞至眼睛之方法為已知的，參見例如Wert等人，J Vis Exp.2012；(69)：4286；WO 2016/179496；Schwartz等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science 2016年4月，第57卷，ORSFc1-ORSFc9。在一個實施例中，眼細胞可以經由注射細胞懸浮液(例如RPE細胞懸浮液)來移植。在另一實施例中，細胞可以作為層片或支架之一部分來移植，例如使用天然及/或合成支架來產生極化之功能性RPE單層的體外組織。
施用於眼睛之細胞的治療有效量為熟習此項技術者所知且將隨以下各者而變化：待移植細胞之類型；待移植細胞之成熟度及是否期望在移植後分裂；所靶向之進行替代的區域大小或細胞數目；及待治療個體(例如，待治療個體之年齡、性別、體重、疾病及病狀之發展階段)；給藥途徑；及所需方案。在單次給藥中，眼細胞療 法中所用細胞之治療有效量可以在約1*103至約1*108個細胞之範圍內。
雖然可以為了單獨的個體產生iPSC細胞株，但亦可以產生具有共同HLA單倍型(或其中HLA單倍型已經過基因操作)之iPSC細胞庫，其將被設計成能與大部分患者群體達成免疫匹配。參見例如Turner等人，Cell Stem Cell,13：382-384,2013。此外，iPSC細胞株可被產生為免疫靜默的，無論受試者之基因型為何(參見例如Riolobos等人，Mol.Ther.,21：1232-41,2013)。當與這些方法組合時，患者特異性iPS細胞及iPS-眼細胞不僅可以用於狹義自體上，而且亦可以用於移植至其他患者。
細胞療法施用步驟通常發生在疾病症狀發作之後或個體已經顯示出視網膜退化或角膜變性的跡象之後(若適用)。在一個實施例中，本文中所提供之眼細胞療法可以獨立地用於治療眼部疾病(例如，BCD)。在另一實施例中，本文中所提供之眼細胞療法可以與一或多種其他治療選項組合使用，其他治療選擇包括但不限於本文中所提供之CYP4V2基因轉移療法及/或CYP4V2 CRISPR基因編輯療法。
同樣地，給藥可以發生一次或多次(例如，在幾週、幾個月或幾年之內)且可以施用至同一隻眼睛或至對側眼睛。此外，一或多種類型之細胞可以按單次給藥或分開給藥來施用。
治療後評定可以使用本文CYP4V2基因療 法部分中所描述的方法，其包括但不限於經由眼睛檢查，諸如視覺功能，例如如藉由視敏度、視野、暗適應、視覺功能及/或光同調斷層掃瞄(Optical Coherence Tomography，OCT，例如譜域-OCT(Spectral Domain-OCT，SD-OCT))及ERG來測量。
在眼細胞療法及基因療法中使用CRISPR RNP之方法
CRISPR RNP為一種基因編輯核糖核蛋白(RNP)複合物，其包括與Cas蛋白質(例如，Cas9蛋白質)複合的引導RNA。引導RNA由兩個被稱為CRISPR RNA(crRNA)及反式活化crRNA(tracrRNA)的RNA構成。在一個實施例中，crRNA及tracrRNA以兩個各別的核酸分子被提供。在另一實施例中，crRNA及tracrRNA可以組合於嵌合單引導RNA(chimeric single guide RNA，sgRNA)中。sgRNA之長度可為約100個核苷酸(nt)，或根據需要或必要時，可以更短或更長。5'端處二十個nt(crRNA)藉由華生-克里克鹼基配對與目標DNA序列雜交且引導Cas核酸內切酶裂解目標基因組DNA，3'側剩餘的雙股結構用於Cas9識別。
與傳統的Cas9/gRNA構建體(例如，併入有CRISPR引導RNA及Cas9蛋白質之核酸序列的質體構建體)相比，CRISPR RNPs具有優點及缺點。舉例而言，引導RNA(crRNA及tracrRNA)及Cas9蛋白質可以作為完整複合物遞送至目標細胞中，從而不需要細胞自身的轉錄機制來表現CRISPR組分。因此，CRISPR RNPs能夠在 轉染後迅速編輯。此外，CRISPR組分從細胞中消耗得更快，此可降低脫靶編輯的可能性。此外，其可降低由質體引起之整合誘變的可能性。鑒於這些優勢，RNP在體內基因編輯中也是有利的。然而，另一方面，由於RNP經由蛋白質降解從細胞中快速清除，所以RNP的中靶編輯效率可能低於在細胞中之表現持續時間較久的質體構建體。
為了評估上述假設並證明CRISPR RNP構建體是否能夠達成眼細胞療法中所欲的基因編輯及基因療法這兩個目的，設計兩組構建體。一個構建體為質體構建體，而另一個為RNP構建體。兩個構建體均使用同一位BCD患者之iPS細胞進行轉染，接著對其進行定序以分析各構建體之中靶基因修復及脫靶編輯。藉由與來自同一位患者之未經修飾之纖維母細胞的基因組DNA進行比較來確定脫靶編輯。可以比較來自質體構建體及RNP構建體之結果。
關於RNP、RNP之形成方法及使用RNP構建體來為BCD患者產生經基因修復之細胞(iPS及iPS-RPE細胞)的詳細說明提供於實例部分中。
應注意，可以使用類似的CRISPR RNP構建體來校正或失活BCD之其他突變及其他RP及IRD之突變。在一個態樣中，將本文中所用之crRNA序列改為另一個特異性靶向不同的目標突變序列的crRNA序列。在另一態樣中，RNP構建體中之引導RNA或sgRNA可經修飾以增強基因編輯效率。參見Hendel等人，Nat Biotechnol.2015年9月；33(9)：985-989。在一些實施例中，CRISPR RNP構建體可以使用電穿孔轉染。在一些實施例中，CRISPR RNP構建體可以使用脂質體轉染(lipofection)或核轉染(nucleofection)來轉染。在一些實施例中，CRISPR RNP構建體可以經由顯微注射來遞送。
除了體外基因修復及治療患者細胞之外，CRISPR RNP構建體亦可用於體內治療由遺傳突變引起之眼部疾病且在體內應用中具有優於其他類型之CRISPR構建體(例如，編碼CRISPR組分之質體及/或mRNA)的優勢。舉例而言，與體外轉錄的Cas9 mRNA及sgRNA相比，CRISPR RNP構建體具有更高的效力，更低的脫靶風險及/或更低的毒性或先天性免疫反應活化。在一個實施例中，可以將包含與靶向突變DNA序列區域之引導RNA複合的Cas9蛋白質的CRISPR RNP構建體直接注射至個體之眼睛中(例如，視網膜下注射、玻璃體內注射或注射至角膜)。在另一實施例中，可以使用經工程改造而具有多個SV40核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)之Cas9變異體，其已顯示在體內腦細胞中之編輯效率提高(Staahl等人，Nat Biotechnol.2017年5月；35(5)：431-434)，以在眼細胞中達成較高的編輯效率。具有一或多個NLS(在N端及/或C端)之Cas9蛋白質可從各種諸如IDT及Feldan之CRO商業上獲得。在一些實施例中，CRISPR RNP構建體「按原樣(as is)」遞送。在一些實施例中，CRISPR RNP構建體在遞送時與藥學上可 接受的載劑一起配製。在一些實施例中，CRISPR RNP構建體以包裝形式遞送，例如在奈米粒子中遞送。
應理解，CRISPR RNP組分(例如，引導RNA及Cas9蛋白質)之間的比率可以藉由在體外或體內治療之前在體外測試患者細胞株中之不同比率(例如，BCD患者特異性iPS細胞或iPS-RPE細胞)來調整及最佳化。CRISPR RNP構建體可以獨立使用或與另一CRISPR構建體組合使用，另一CRISPR構建體包括但不限於編碼CRISPR引導RNA或crRNA之質體或載體、或Cas蛋白質或其組合；Cas9編碼mRNA；引導RNA寡核苷酸；另一CRISPR RNP構建體；或其組合或雜合體。此外，CRISPR RNP構建體可用於校正或失活與一種或多於一種眼部疾病相關的一個或多於一個突變。
基因療法與細胞療法組合治療
本文之揭示內容為BCD及其他由CYP4V2突變引起之眼部疾病提供多種治療選項，其包括但不限於CYP4V2基因轉移療法及CYP4V2 CRISPR基因編輯療法。CYP4V2基因轉移療法及CYP4V2基因編輯療法可以在體內或體外使用或在體內及體外均可以使用。當在體內實施時，CYP4V2基因轉移療法及/或CYP4V2 CRISPR基因編輯療法可以作為基因療法治療受BCD影響的剩餘眼細胞。當在體外實施於患者細胞或由患者衍生之細胞中時，作為細胞療法，可以將經過CYP4V2基因轉移療法及/或CYP4V2 CRISPR基因編輯療法治療的細胞移植到患 者中，以替代死亡的或退化的眼細胞。值得注意的是，本文中所提供之基因療法及細胞療法組成物及方法可以組合，從而為患者提供通過單獨使用基因療法或細胞療法所無法達成之額外益處。「組合治療」亦可擴大合格的患者基數。舉例而言，對於沒有留下或幾乎沒有留下光感受器或RPE細胞的晚期患者，基因療法不如在早期患者中那般有效。在此情況下，細胞療法可以藉由提供新細胞(例如，RPE或光感受器細胞)來獲益，而基因療法可以藉由拯救剩餘的RPE或光感受器細胞及/或藉由改善脈絡膜細胞(其健康影響眼細胞之狀況)之病狀來改善細胞療法的效果。組合基因療法與細胞療法各自之「拯救」與「替代」效果，使得組合治療成為基因療法或細胞療法之改良。此組合治療方法可施用於其他由一或多種遺傳突變引起的眼部疾病。
用於CYP4V2基因療法之方法及組成物
本揭示內容係關於包含編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸分子的各種組成物及利用該等組成物來治療眼細胞及/或眼部疾病的各種方法。在一個實施例中，功能性CYP4V2蛋白質可以直接用於治療目的。在一些實施例中，使用編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸分子。在一些實施例中，使用表現匣來引導及控制核酸分子之產物的表現，該表現匣包含與一或多個調節序列可操作地連接的此類編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸分子。在一些實施例中，使用載體來包裝此包含編碼功能性 CYP4V2蛋白質之核酸分子及一或多個調節序列的CYP4V2表現匣，以便增強對目標細胞之遞送及達成此CYP4V2編碼核酸分子之產物及表現匣的所期望的表現。
在一些實施例中，載體為重組腺相關病毒(rAAV)載體。在一些實施例中，載體為質體。在一些實施例中，載體為另一類型之病毒載體或非病毒載體。治療方法包含將有效量(或有效濃度)之該等載體施用或遞送至個體之眼睛及/或目標細胞。在一個實施例中，該治療係直接在體內施用。在另一實施例中，該治療包含目標細胞(例如，眼細胞)中之離體治療及將經治療之目標細胞移植至個體中(例如，移植至個體之眼睛)。該等治療方法係針對眼部疾病及其他與CYP4V2突變相關之病狀。在一個實施例中，眼部疾病為結晶樣視網膜色素變性(BCD)。
A.功能性CYP4V2蛋白質及編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸
CYP4V2(細胞色素P450家族4亞家族V多肽2，(MIM 608614)，同義詞：CYP4AH1)為細胞色素P450超家族(P450)中之蛋白質之一且為細胞色素P450亞家族4(CYP4)之成員。細胞色素P450(CYP)為重要的含血紅素的蛋白質(heme-containing protein)，以其作為氧化酶之角色而為人所知。術語P450衍生自酶在處於還原態時且與一氧化碳複合時的最大吸收波長(450nm)下的分光光度峰。其參與異生物質及內源性化合物的代謝，諸如類固醇及脂肪酸。已經在所有生物界中鑑定到CYP 酶：動物、植物、真菌、原生生物、細菌、古細菌，以及甚至病毒。然而，其並非無所不在；例如，尚未在大腸桿菌中發現CYP酶。
P450蛋白質擔當結構中之關鍵要素。舉例而言，P450蛋白質可以藉由其特徵序列元件FXXGXXXCXG(SEQ ID NO：30)來鑑定，其中半胱胺酸充當血紅素鐵的軸向配位體。P450蛋白質中的序列同一性相對為低，但其一般形貌(topography)及結構摺疊為高度保守的。保守的核心由稱為『meander』之線圈(coil)、四螺旋束(four-helix bundle)、螺旋J與K以及兩組β-褶板構成。這些構成血紅素結合環(haem-binding loop)(具有絕對保守的半胱胺酸，其充當血紅素鐵之第5配位體)、質子轉移槽(proton-transfer groove)及螺旋K中之保守的EXXR基序(SEQ ID NO：31)。P450蛋白質為位於細胞的線粒體內膜中或內質網中的主要膜相關蛋白。
除了結構相似性之外，P450蛋白質亦享有功能相似性。由P450酶催化的最常見的反應為單加氧酶反應，例如將一個氧原子插入有機受質(RH)之脂肪族位置而其他氧原子則被還原為水：RH+O2+NADPH+H+ → ROH+H2O+NADP+
許多羥基化反應(插入羥基)使用P450酶。許多P450酶具有類固醇及/或脂肪酸作為受質。
人類CYP4V2蛋白質(NCBI RefSeq：NP_997235.3)具有525個胺基酸(胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：4中)。存在有人類CYP4V2蛋白質之變異體，包括病理性變異體(亦即突變)(關於BCD患者中之CYP4V2突變之選擇列表，參見本文中之表1)及非病理性(亦即功能性)變異體。
在一個態樣中，功能性CYP4V2蛋白質為人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)。在其他態樣中，功能性CYP4V2蛋白質為人類CYP4V2蛋白質之功能性變異體或片段，包括但不限於具有如SEQ ID NO：5中所示之胺基酸序列的蛋白質。
功能性CYP4V2蛋白質亦可為另一功能性CYP4V2蛋白質之變異體。以下是基於改變本文中所描述之多肽的胺基酸以產生等同或甚至改良的第二代分子的討論。舉例而言，在蛋白質結構中，某些胺基酸可經取代為其他胺基酸，而不會明顯喪失與諸如例如受質分子上之結合位點(例如脂肪酸之結合位點)的結構的相互結合能力。因為是蛋白質的相互作用能力及性質決定了蛋白質的生物功能活性，所以可以在蛋白質序列及其基礎(underlying)DNA或RNA編碼序列中進行某些胺基酸取代，但仍然產生具有相似特性的蛋白質。因此可預期的是，可以在功能性CYP4V2蛋白質之胺基酸序列或基因的DNA或RNA序列或其編碼區中作出各種改變，而不會明顯喪失其生物學效用或活性，如本文中所論述。舉例而言，SEQ ID NO：5為CYP4V2蛋白質變異體之胺基酸序列，其相比於SEQ ID NO：4中所示之人類CYP4V2蛋白質序 列有一個胺基酸改變。
可以使用各種技術、演算法、軟體及工具來設計或工程改造功能性CYP4V2蛋白質(例如人類CYP4V2蛋白質)之功能衍生物、變異體及/或片段。舉例而言，各種多肽之結構及功能或改變可以藉由NMR、x射線結晶學或電腦模型化(例如ClustalW、SWISS-MODEL服務器、Swiss-Pdb Viewer、Polyphen-2、PROVEAN、SIFT、Condel、MutationAssessor及FatHMM)來模型化、解決或預測。
功能性CYP4V2蛋白質亦可為功能性CYP4V2蛋白質之片段或衍生自其片段。舉例而言，人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)及其變異體(SEQ ID NO：5)均具有在從N端起約第13個胺基酸殘基與約第35個殘基之間的跨膜域(transmembrane domain)。人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之骨架位於約36-525aa之間。因此，功能性CYP4V2可以衍生自人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：6)中前面約35個胺基酸之缺失及用替代性跨膜域序列替代此缺失。功能性CYP4V2蛋白質之另一來源為功能性CYP4V2蛋白質之剪接變異體。
預測的CYP4V2跨膜區段位於N端附近，其後為CYP450家族典型的球狀域(globular domain)。CYP4V2之球狀域包括18個螺旋及β結構區段。血紅素基團位於蛋白質表面附近，與朝向蛋白質內部之I螺旋及表面上之L螺旋配位(coordinate)。Li等人，Am J Hum Genet.74：817-826,2004。CYP4V2蛋白質主要活躍於脂肪酸代謝中。許多其他P450酶亦參與脂肪酸代謝。CYP4V2在幾乎所有組織及器官中遍在地表現。在心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟、視網膜、視網膜色素上皮、角膜及淋巴細胞中發現了CYP4V2之表現(Li等人，Am J Hum Genet.74：817-826,2004)。然而，大部分其他P450酶不存在於眼細胞中。舉例而言，CYP4V2及CYP1B1為ARPE-19細胞株中僅有的以高位準表現的P450酶；CYP2E1、CYP2J2及CYP3A4僅以低位準(CYP4V2 mRNA表現之5%)轉錄，且檢測不到CYP4A11、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3及CYP4F12之轉錄物(Nakano等人，Mol Pharmacol 2012；82：679-686)。事實上，CYP4V2突變之症狀侷限於眼睛，在眼睛中，CYP4V2為除了CYP1B1之外表現的唯一的主要P450酶及唯一表現的P450亞家族4(CYP4)酶，而在CYP4V2與其他P450酶一起存在的器官中不顯示該等症狀，表明其他P450酶，特別是CYP4酶，可用於取代CYP4V2的全部或部分功能。實際上，已發現CYP4亞家族在脂肪酸代謝中具有共同作用，包括但不限於作為PUFA之羥化酶。參見Hardwick,Biochem.Pharmacol.,75(12)：2263-75；Fer等人，J.Lipid Res.,49(11)：2379-89；Nakano等人，Mol.Pharmacol.,2012,82：679-686。人類CYP4蛋白質之蛋白質序列顯示於SEQ ID NO：8-18中。
除了與CYP4亞家族之其他蛋白質共用受質及功能之外，計算分析顯示CYP4V2係由CYP46A(SEQ ID NO：7)之祖先複製形成，其然後經複製產生整個CYP4家族。Pan等人，Int.J.Mol.Sci.,2016,17(7)pii：E1020.doi：10.3390/ijms17071020。
此外，許多物種中之CYP4V2基因(或CYP4V2基因之異種同源物，例如小鼠之Cyp4v3)為保守的，包括但不限於人類、黑猩猩、恆河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、雞、蛙、馬、兔及果蠅(SEQ ID NO：19-29)。已在196種生物體中發現了含有人類基因CYP4V2之異種同源物。
功能性CYP4V2蛋白質可以包含以下或由以下設計、工程改造或衍生者，包括但不限於：(i)人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)；(ii)人類CYP4V2蛋白質或功能性CYP4V2蛋白質之變異體(例如，改變胺基酸及/或剪接變異體)(例如，SEQ ID NO：5)；(iii)功能性CYP4V2蛋白質之一或多個片段(例如，SEQ ID NO：6)；(iv)其他物種之CYP4V2(或異種同源物)；(v)另一CYP4蛋白質或CYP46A1；(vi)能夠改善、治療或遏制患者細胞(例如，BCD患者之iPS-RPE細胞)中之表2中所列一或多種化合物中之一或多種生化異常的多肽；及/或 (vii)以上(i)至(vi)中之任何一或多者的衍生物、雜合體或變異體。
可預期的是，本文中所揭示之組成物及方法可用於表現如上所述之任何功能性CYP4V2蛋白質。在一個實施例中，功能性CYP4V2蛋白質為包含SEQ ID NO：4、5或6中所示之胺基酸序列中之全部或一部分的多肽。在一些實施例中，功能性CYP4V2蛋白質為包含選自由以下組成之群的胺基酸序列中之全部或一部分的多肽：CYP4V2、CYP4A11、CYP4A22、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP4F8、CYP4F11、CYP4F12、CYP4F22、CYP4X1、CYP4Z1及CYP46A(SEQ ID NO：4-18)，及黑猩猩、恆河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、雞、蛙、馬、兔及果蠅之CYP4V2(SEQ ID NO：19-29)，及其衍生物、雜合體、變異體及/或片段。在一些實施例中，功能性CYP4V2蛋白質可以與選自由SEQ ID NO：4-29組成之群之序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列同一性(例如，至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性)。在一個實施例中，功能性CYP4V2蛋白質為包含FxxGxxxCxG及ExxR(SEQ ID NO：30及31)之序列元件的多肽。
在一些實施例中，功能性CYP4V2蛋白質為能夠改善、治療或遏制患者細胞(例如，BCD患者之iPS-RPE細胞)中之一或多種生化異常的化合物或藥劑。
在一個實施例中，功能性CYP4V2蛋白質可以直接用於治療BCD，類似於針對其他疾病之以蛋白質為基礎的藥物。在另一實施例中，使用編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸分子以在所靶向細胞中表現功能性CYP4V2蛋白質。在一個實施例中，核酸分子為RNA。在另一實施例中，核酸分子為DNA，包括但不限於互補DNA(complementary DNA，cDNA)，用於長期表現。cDNA可為正義(positive-sense)或負義(negative-sense)、單股或雙股。在一些實施例中，編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸與一或多個調節序列可操作地連接以形成CYP4V2表現匣。在一些實施例中，這種表現匣被包裝於載體中以增強遞送及/或表現效率。
密碼子由一組三個核苷酸組成且編碼特定的胺基酸或造成轉譯終止(亦即終止密碼子)。絕大部分胺基酸(通常是除了甲硫胺酸之外的所有胺基酸)都由多個密碼子編碼。因此，可以用不同的核酸序列表現相同的蛋白質。編碼相同蛋白質序列的兩個核酸分子之間的序列同一性可以在0%至超過99%的範圍內。舉例而言，均能編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之一核酸序列(SEQ ID NO：1)與另一核酸序列(SEQ ID NO：2)僅共用77%之序列同一性。
核酸序列之密碼子最佳化可以改善及/或穩定蛋白質表現而不改變所編碼之胺基酸序列。密碼子最佳化係將核酸序列中所存在的密碼子用編碼相同胺基酸之較 佳密碼子替代，例如對於哺乳動物表現而言較佳的密碼子。在密碼子最佳化中可以使用各種策略及參數，包括但不限於密碼子使用偏好、GC含量、CpG二核苷酸含量、mRNA二級結構、隱蔽剪接位點(cryptic splicing site)、早期PolyA位點(premature PolyA site)、內部χ位點(internal chi site)及核糖體結合位點、負CpG島(negative CpG island)、RNA不穩定基序(RNA instability motif，ARE)、重複序列(正向重複(direct repeat)、反向重複(reverse repeat)及雙向重複(Dyad repeat))及可能干擾選殖的限制性位點。密碼子最佳化方法為本發明所屬技術領域中已知的，例如美國專利第6,114,148號及US 20110081708。給定胺基酸序列或編碼多肽之核酸序列的密碼子最佳化核酸序列可以藉由本文中所描述之方法及/或藉由使用各種密碼子最佳化軟體產生，包括經由線上軟體產生。
應瞭解，視所使用的密碼子最佳化方法、配置、演算法或軟體而定，可以產生編碼相同蛋白質的不同密碼子最佳化核酸序列。然而，密碼子最佳化並不總是引起改良的表現，相比於野生型未經修飾之核酸序列。參見Alexeyev MF,Winkler HH：Gene synthesis,bacterial expression and purification of the Rickettsia prowazekii ATP/ADP translocase.Biochim Biophys Acta.1999,1419：299-306.10.1016/S0005-2736(99)00078-4；Curran KA,Leavitt JM,Karim AS,Alper HS：Metabolic engineering of muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae.Metab Eng.2013,15：55-66；Agashe D,Martinez-Gomez NC,Drummond DA,Marx CJ：Good codons,Bad transcript：large reductions in gene expression and fitness arising from synonymous mutations in a Key enzyme.Mol Biol Evol.2013,30(3)：549-560.10.1093/molbev/mss273.doi：10.1093/molbev/mss273。
本文中提供編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之密碼子最佳化核酸序列(SEQ ID NO：2)。SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2均編碼同一種人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)。密碼子最佳化核酸序列(SEQ ID NO：2)之密碼子適應指數(codon adaptation index，CAI)為0.95，相比於SEQ ID NO：1中所示之核酸序列的CAI 0.94有所改良。在所期望的表現生物體中，CAI 1.0視為完美。應理解，本揭示內容涵蓋所有形式及類型的密碼子最佳化核酸序列，如由SEQ ID NO：2中所示之cDNA序列表示，包括對應於此cDNA序列或由其衍生之任何RNA序列或DNA序列或其他核酸序列，且其可為呈單股或雙股形式之本文中所提供之序列，及/或正義、負義、反義(anti-sense)或互補有義(complementary-sense)於本文中所提供之序列。
除了密碼子最佳化之外，亦可使用其他方法 來改良轉譯性能。舉例而言，可以使用科札克序列或夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno Sequence)來提高轉譯起始效率。可以使用不同的終止密碼子(例如，TGA)來提高轉譯終止效率。除了ORF序列之外，編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列亦可包括一或多個非編碼序列(諸如UTR)及/或一或多個內含子來改良蛋白質表現。可以緊接在編碼cDNA之CYP4V2之前插入科札克序列(示範性序列顯示於SEQ ID NO：36中)以增強表現。
如本文中所論述，可預期的是，可以採用人類CYP4V2蛋白質之功能變異體及/或片段。編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之功能變異體(SEQ ID NO：5)的核酸序列提供於SEQ ID NO：3中。
在一些實施例中，CYP4V2核酸分子為編碼任何功能性CYP4V2蛋白質之多核苷酸分子，功能性CYP4V2蛋白質包括但不限於SEQ ID NO：4-30，或編碼與SEQ ID NO：4-30中所示之序列中之任一者具有至少80%胺基酸序列同一性的多肽。在一些實施例中，CYP4V2核酸分子為與SEQ ID NO：1、2或3中之任一者共有至少60%序列同一性的多核苷酸。
如本文中所描述之載體(例如，病毒載體或非病毒載體)及CYP4V2表現匣通常含有一或多個CYP4V2核酸分子或其片段。應理解，核酸分子可以採用多種形式，包括但不限於DNA或RNA、單股核酸(例如，ssDNA、ssRNA)、雙股核酸(例如，dsDNA、dsRNA)、正股 (plus-strand)或負股(minus-strand)核酸、互補DNA(cDNA)、基因組DNA、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)及/或DNA引導RNA干擾(DNA directed RNA interference，ddRNAi)。核酸分子亦可以包括一或多種核苷酸類似物或骨架修飾。此外，應理解，cDNA可在由反轉錄酶催化之反應中由mRNA模板合成，或可以其欲編碼之蛋白質為基礎進行設計及合成，包括但不限於密碼子最佳化cDNA，或可由另一核酸分子經由誘變合成。亦應理解，cDNA可以只含外顯子，或可以含有外顯子加其他序列，例如非轉譯區(untranslated region，UTR)及/或內含子。在一些情況下，本文中所描述之載體及CYP4V2表現匣可以包括具有編碼人類CYP4V2蛋白質或其功能變異體或片段之序列的核酸分子。
合適的核酸序列可為任何編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列。此核酸序列可以含有或可以不含非編碼元件，諸如UTR、內含子或科札克序列。其可以包括野生型序列或合成序列或經修飾序列(例如，密碼子最佳化的序列)。編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列可以如本文中所描述般產生或藉由本發明所屬技術領域中已知之其他方法產生。
具有如SEQ ID NO：1中所示編碼人類CYP4V2蛋白質之序列的核酸分子在本文中稱為「CYP4V2st」。具有如SEQ ID NO：2中所示編碼人類 CYP4V2蛋白質之密碼子最佳化的序列的核酸分子在本文中稱為「CYP4V2op」。具有SEQ ID NO：3中所示編碼人類CYP4V2蛋白質之功能變異體之序列的核酸分子在本文中稱為「CYP4V2fv」。在一些實施例中，編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列與SEQ ID NO 1、2或3中之一者具有至少60%之序列同一性。
功能性CYP4V2蛋白質及編碼此功能性CYP4V2蛋白質之核酸分子可以用本發明所屬技術領域中已知之方法合成或分離、純化及檢測。此外，蛋白質合成或分離、純化及檢測亦可經由包括Wuxi Apptec(Shanghai,China)及GenScript(Piscataway,New Jersey)之CRO商業上獲得。核酸分子合成或分離、純化選殖及檢測可經由包括GenScript(Piscataway,New Jersey)及Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)之CRO商業上獲得。
可以合成(例如，經由重組蛋白質表現或化學合成)或分離多肽。如本文中所使用之「經純化的」多肽為已從天然伴隨其之細胞組分分離或純化的多肽。通常，當多肽以乾重計至少70%(例如，至少75%、80%、85%、90%、95%或99%)不含與其天然聯合的多肽及天然產生之分子時，認為該多肽為「經純化的」。因為化學合成多肽本質上與天然伴隨其之組分是分離的，所以合成多肽為「經純化的」。
多肽可以藉由已知方法，諸如DEAE離子交 換、凝膠過濾及羥磷灰石層析法(hydroxyapatite chromatography)，從天然來源(例如，生物樣品)純化。多肽亦可以例如藉由表現在表現載體中之核酸來純化。此外，經純化的多肽可以藉由化學合成獲得。多肽之純度可以使用任何適當的方法，例如管柱層析法、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析來測量。
多肽通常使用抗體來檢測。使用抗體檢測多肽之技術包括酶聯免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、西方墨點法(Western blot)、免疫沈澱法及免疫螢光法。抗體可為多選殖抗體或單選殖抗體。對多肽或多肽之一部分具有特異性結合親和力的抗體可以使用本發明所屬技術領域中熟知之方法產生。可使用本發明所屬技術領域中已知之方法將抗體附接至固體載體，諸如微量滴定板。在多肽存在下，形成抗體-多肽複合物。
「經分離的」核酸分子通常指不含以下序列的核酸分子：天然側接在衍生出該經分離的核酸分子之生物體之基因組中之核酸的一端或兩端的序列(例如，藉由PCR或限制性核酸內切酶消化產生之cDNA或基因組DNA片段)。一般將此類經分離的核酸分子引入構建體(例如，選殖構建體或用於基因療法中之表現構建體)中，通常是為了方便操作、用於表現蛋白質、用於產生融合蛋白、或出於其他目的，包括但不限於用於包裝至載體(例如，病毒載體或非病毒載體)中。
核酸可以使用本發明所屬技術領域中之常規技術分離。舉例而言，核酸可以使用任何方法分離，包括但不限於重組核酸技術、位點特異性誘變、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)及/或其他基因工程改造方法。一般的PCR技術描述於例如PCR Primer：A Laboratory Manual,Dieffenbach & Dveksler編，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995中。重組核酸技術包括例如限制酶消化及連接(ligation)，其可用於分離核酸。誘變方案描述於例如In Vitro Mutagenesis Protocols,Braman編，Humana Press,2002中。
經分離的核酸亦可以單一核酸分子形式或以一系列寡核苷酸形式化學合成。
含有核酸之構建體為本發明所屬技術領域中已知的。構建體，包括選殖構建體及表現構建體，可以在商業上定製或可以藉由本發明所屬技術領域中之常規重組DNA技術產生。構建體可以具有可操作地連接於待表現之核酸的調節序列，且可以進一步包括序列，諸如編碼可選標記物(例如，抗生素抗性基因)之序列。本文中論述了調節序列。含有核酸之構建體可以編碼嵌合或融合多肽(亦即，可操作地連接於異源多肽之多肽，異源多肽可位於該多肽之N端或C端)。代表性異源多肽為可以在所編碼多肽之純化或檢測中使用的多肽(例如，6×His標籤、麩胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase，GST)、CFP、Fc、FLAG、HA、Myc、RFP、Strep、VSV、GFP及YFP)。
可以將攜帶核酸序列之構建體引入宿主細胞中。如本文中所使用之「宿主細胞」係指要引入核酸的特定細胞且亦包括此類細胞之攜帶該構建體之子代。宿主細胞可為任何原核細胞或真核細胞。舉例而言，宿主細胞可為細菌細胞，諸如大腸桿菌細胞，或昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)、COS細胞、HEK293細胞、希拉細胞、Vero、V27、A549、K562、B50、WI38及BHK細胞)。其他宿主細胞包括但不限於iPS細胞、ES細胞、RPE細胞、iPS-RPE細胞、iPS-光感受器細胞、ES-RPE細胞、ARPE-19細胞、角膜細胞、光感受器細胞、脈絡膜細胞、視神經細胞、本文中所論述之任何其他類型的眼細胞、神經元細胞、上皮細胞、血球、纖維母細胞、淋巴細胞及由幹細胞衍生之細胞。許多用於將攜帶核酸轉基因之核酸或載體或表現匣體內及體外引入宿主細胞中的方法係本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的，且該等方法包括但不限於電穿孔、聲致穿孔(sonoporation)、磷酸鈣沈澱、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)轉化、熱休克、脂質體轉染、顯微注射及病毒介導之核酸轉移。
核酸可以使用任何數目之擴增技術(參見例如PCR Primer：A Laboratory Manual,1995,Dieffenbach & Dveksler編，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；及美國專利第4,683,195號；第4,683,202號；第4,800,159號； 及第4,965,188號)，用一對適當的寡核苷酸(例如，引子)來檢測。已對原始PCR開發出許多修改版本，且可以使用該等修改版本檢測核酸。核酸亦可以使用雜交來檢測。核酸之間的雜交詳細論述於Sambrook等人(1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；章節7.37-7.57、9.47-9.57、11.7-11.8及11.45-11.57)中。Sambrook等人揭示了小於約100個核苷酸之寡核苷酸探針之合適的南方墨點(Southern blot)條件(章節11.45-11.46)及大於約100個核苷酸之寡核苷酸探針之合適的南方墨點條件(參見章節9.47-9.54)。
B.載體
在一些實施例中，藉助於載體，將編碼功能性CYP4V2蛋白質或其片段之核酸分子遞送至需要治療之眼細胞。關於遞送至眼細胞，所欲的治療載體為無毒的且可有效將核酸分子(例如，DNA、RNA)遞送至目標細胞中。基因療法載體為本發明所屬技術領域中已知的且可為病毒載體或非病毒載體。
一種用於將核酸體內引入細胞中之方法係藉由使用含有核酸分子(例如cDNA)之病毒載體。用病毒載體感染細胞的優勢是，大部分的目標細胞能夠接收到核酸分子。進一步，病毒載體內所編碼之分子(例如由病毒載體中所含之cDNA)可有效地在已接受含有核酸分子之病毒載體的細胞中表現。
可以使用的病毒載體之實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、慢病毒載體、疱疹病毒(herpes virus，HV)載體，諸如單純疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)載體、乳頭瘤病毒載體、痘病毒載體、人類泡沫病毒(human foamy virus，HFV)載體、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)載體、痘瘡病毒載體、仙台病毒載體及反轉錄病毒載體。亦可使用質體將核酸分子遞送至目標細胞中。在一些情況下，病毒載體為重組病毒載體，諸如重組AAV(rAAV)載體。熟習此項技術者應理解，某些載體將整合或較傾向於整合至宿主細胞(例如，個體之細胞)之基因組中，而其他載體將不整合或不太傾向於整合至宿主細胞之基因組中(例如，染色體外表現)。
重組AAV(rAAV)載體常用於基因療法方法中。AAV屬於細小病毒科且各自含有單股DNA。rAAV載體為目前認為在哺乳動物細胞中最安全且最有效的基因轉移平台(Salganik等人，2015,Microbiol.Spectr.,3(4)：doi：10.1128/microbiolspec.MDNA3-0052-2014)。迄今為止，已從人類及非人類靈長類動物組織樣品(參見例如Gao等人，2005,Curr.Gene Ther.,5：285-97)及其他物種中分離出12種AAV血清型(AAV1至AAV12)及超過100種變異體。天然產生的及經修飾的AAV類型均可以用於本文中所描述之方法中。
野生型AAV含有封入殼體內之線性單股DNA基因組，殼體由三種蛋白質VP1、VP2及VP3構成。 在重組AAV(rAAV)中，來自野生型AAV基因組之rep及cap基因通常用側接有用於包裝所需之AAV反向末端重複序列(inverted terminal repeat，ITR)的轉基因表現匣來替代。如本文中所使用之「rAAV載體」係指含有一或多種AAV病毒之或衍生自一或多種AAV病毒之一或多個殼體元件的重組AAV載體。
雖然AAV及其他病毒載體介導之基因療法有該等優勢，但是並非所有病毒載體及並非所有AAV類型皆適合治療特定疾病。使用病毒載體(例如，AAV載體)之基因療法面臨著兩個主要挑戰。首先，期望AAV載體在靶向治療之細胞類型中有足夠的轉導效率。其次，需要考慮由病毒載體觸發的潛在免疫反應。參見Madsen等人，Adeno-associated virus serotype 2 induces cell-mediated immune responses directed against multiple epitopes of the capsid protein VP1.J Gen Virol 90,2622-2633(2009)；Mingozzi等人，CD8(+)T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans.Nat Med 13,419-422(2007)。雖然與大多數其他器官及組織相比，眼睛被認為是相對於許多其他器官的免疫豁免器官(immune-privileged organ)且眼中由AAV介導之基因療法中的免疫反應可以藉由使用免疫抑制劑來控制，但是在大型動物中，在眼睛之AAV轉導中，諸如中和抗體(neutralizing antibody，NAB)之免疫反應的作用尚不清楚。此外，玻璃體內AAV給藥比視網膜下給藥更容易與 免疫系統相互作用。因此，眼部基因療法中所用之病毒載體將觸發極小的或不觸發免疫反應，由此避免潛在副作用並確保病毒載體之轉導/表現效率基本上不會因為免疫反應(例如個體中預先存在之NAB)而降低，及/或由此降低rAAV載體之劑量。
可以使用與AAV載體設計及選擇相關的各種組成物及方法來解決這些挑戰。關於使用CYP4V2基因療法治療BCD，當靶向治療之細胞主要為RPE細胞時，在RPE細胞中具有足夠的轉導效率的載體係所欲的。當治療BCD患者之角膜細胞時，在角膜細胞中具有足夠的轉導效率的載體係所欲的。在一些實施例中，使用在RPE細胞具有足夠的轉導效率的載體。在一些實施例中，使用在角膜細胞中具有足夠的的轉導效率的載體。在一些實施例中，使用在RPE及光感受器細胞中具有足夠的轉導效率的載體。在一些實施例中，使用在RPE、光感受器及脈絡膜細胞中具有足夠的轉導效率的載體。在一些實施例中，使用在視網膜細胞中具有足夠的的轉導效率的載體。在一些實施例中，使用在眼細胞具有足夠的轉導效率的載體。在一些實施例中，使用在眼細胞及/或血球中具有足夠的轉導效率的載體。為了解決潛在的免疫反應(例如，抗基因療法載體之NAB及基於細胞的免疫反應)，可以使用不同的AAV血清型及變異體、經修飾之AAV載體及/或免疫抑止方案。
本文中所用之rAAV載體可以基於或衍生自 野生型AAV(例如，從人類或其他物種分離之AAV1至AAV12或其他野生型AAV變異體中之一者，包括但不限於AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及AAV12)或經修飾之AAV。經修飾之AAV可以許多不同方式產生，包括但不限於假型化AAV(例如，AAV2/5、AAV2/8、AAV2/1、AAV2/4、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/9、AAV2/12、AAV8/2)、嵌合AAV(例如，AAV-DJ)、殼體經修飾之AAV(例如，殼體突變型AAV(例如，具有Y-F、K-R、T-A、S-A及/或T-V突變之AAV，及AAV-DJ/8或AAV-DJ/9，其為來自AAV-DJ之殼體突變型AAV)、殼體變異型AAV(例如，AAV 7m8及衍生物)、祖先AAV(ancestral AAV，例如，Anc80)、包括天然產生之AAV或變異體之基因組及/或殼體的任何改變的重組AAV，及其任何組合。應理解，可以用不同的方式來提及經修飾之AAV，包括但不限於人工的、經修飾的、經合成的、經重建構的、經工程改造的、經進化的、經設計的、經衍生的或增強的AAV，或經由合理設計及/或定向進化及/或DNA重排(DNA shuffling)產生之AAV，或AAV變異體。與未經修飾之AAV相比，使用經修飾之AAV可具有某些優勢，包括但不限於更高的轉導效率、更高的組織或細胞特異性、更少的免疫反應及/或更適合於某些類型的給藥(例如，玻璃體內注射或經由血流遞送)。
在一些實施例中，本文中所用之經修飾之 AAV載體為假型化AAV。AAV假型化係指混合來自不同病毒血清型之殼體及基因組。這些血清型用斜線表示，因此AAV2/5表示含有包裝於血清型5之殼體中的血清型2之基因組(例如，ITR)的病毒。在一些實施例中，AAV載體為AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/6、AAV2/9、AAV2/4、AAV2/7、AAV2/10或AAV2/12載體。
在一些實施例中，本文中所用之經修飾之AAV載體為嵌合(有時亦稱為雜合或經重排的)AAV，其衍生自不同AAV血清型，包括從不同物種分離的不同AAV血清型。在一些實施例中，AAV載體為AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9。AAV-DJ為藉由DNA重排方法由八種血清型之AAV雜合體庫產生的AAV變異體。Grimm,D.等人(2008).J.Virol.82：5887-5911。其能夠有效轉導包括眼細胞在內的廣泛細胞類型。此外，嵌合AAV比天然產生之AAV具有更強的避開免疫中和的能力，因此可以有效地遞送更高數量的治療性轉基因。可以進一步修飾雜合AAV。舉例而言，AAV-DJ/8及AAV-DJ/9係藉由在AAV-DJ之肝素結合域(heparin binding domain，HBD)中製造點突變而產生。Grimm,D.等人(2008).J.Virol.82：5887-5911。
在一些實施例中，本文中所用之經修飾之AAV為殼體突變型AAV。其涉及在AAV殼體蛋白中產生一或多個突變(例如，點突變)。相比於未經修飾之AAV， 殼體突變型AAV具有優勢。舉例而言，AAV殼體蛋白之表面暴露的酪胺酸(Y)殘基之點突變被報導為一種用於避開磷酸化及隨後之泛素化(ubiquitination)的簡單且有效的方法，在體外及體內均致使更高的轉導效率(Zhong等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2008；105(22)：7827-32；Markusic等人，Mol Ther.2010；18(12)：2048-56；Li等人，Hum Gene Ther.2010年11月；21(11)：1527-1543)。舉例而言，藉由苯丙胺酸殘基取代達成之七個AAV2殼體酪胺酸殘基(Y252、Y272、Y444、Y500、Y700、Y704及Y730)中之每一者的定點誘變可引起載體轉導及轉基因表現增加，其係藉由在體外人類細胞及體內鼠類肝細胞中避開EGFR-PTK磷酸化及泛素-蛋白酶體途徑(Zhong等人，Virology.2008年11月25日；381(2)：194-202)。亦有報導稱，AAV殼體上在特定酪胺酸(Y)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及離胺酸(K)殘基處之點突變在體外及體內均可顯著改良轉導(Gabriel等人，Hum Gene Ther Methods.2013；24(2)：80-93；Sen等人，Hum Gene Ther Methods.2013；24(2)：104-16；Sen等人，Sci Rep.2013；3：1832；Wu等人，J Virol.2006；80(22)：11393-7)。亦可對經修飾之AAV進行殼體突變以產生另一經修飾之AAV。舉例而言，AAV-DJ/8及AAV-DJ/9係藉由在AAV-DJ之肝素結合域(heparin binding domain，HBD)中製造點突變而產生，AAV-DJ為一種雜合AAV。Grimm,D.等人(2008).J.Virol.82：5887-5911。殼體突變亦能使AAV避開NAB 並產生較少免疫反應。此外，某些殼體突變能使AAV更加適合於玻璃體內遞送。Kay等人，PLoS One,8：e62097,2013。在一些實施例中，本文中所用之AAV載體為具有一或多個殼體突變的經修飾之AAV，該等突變包括但不限於酪胺酸突變為苯丙胺酸(Y-F)、蘇胺酸突變為纈胺酸(T-V)、離胺酸突變為精胺酸(K-R)、蘇胺酸突變為丙胺酸(T-A)、絲胺酸突變為丙胺酸(S-A)，及/或影響AAV之肝素結合域(HBD)之突變，及/或在其抗原區中之突變，包括但不限於在位置459、493及551處之突變。在一些實施例中，AAV載體為具有Y444F、Y500F、Y730F、Y252F、Y272F、Y700F、Y704F及T491V中之一或多種殼體突變的AAV2，其中數字(例如，444)表示AAV殼體之點突變位置。在一些實施例中，AAV載體為具有Y263F及Y719F中之一或多種殼體突變的AAV5。在一些實施例中，AAV載體為具有Y447F、Y733F及T494V中之一或多種殼體突變的AAV8。在一些實施例中，AAV載體為具有Y731F之殼體突變體之AAV1。在一些實施例中，AAV載體為具有Y445F及Y731F中之一或多種殼體突變的AAV6。在一些實施例中，AAV載體為具有Y731F之殼體突變的AAV9。在一些實施例中，AAV載體為具有K137R、T251A及S503A中之一或多種殼體突變的AAV-DJ、AAV-DJ/8或AAV-DJ/9。
在一些實施例中，經修飾之AAV載體為具有變異型AAV殼體蛋白的AAV。變異型AAV殼體蛋白 為本發明所屬技術領域中已知的。在一些實施例中，非天然產生之殼體蛋白可以包括與異源序列(例如，從不同經選擇的AAV血清型、相同AAV血清型之非連續部分、從非AAV病毒來源或從非病毒來源所獲得的序列)組合的經選擇的AAV序列(例如，vp1殼體蛋白之片段)。在一些實施例中，經修飾之AAV載體在殼體蛋白GH環中包括一或多個胺基酸插入(例如，約5個胺基酸至約11個胺基酸)。相比於非變異型AAV(例如，野生型AAV)對視網膜細胞之感染性，變異型AAV殼體蛋白可賦予增加的視網膜細胞感染性。在一些實施例中，經修飾之AAV為能夠穿過血眼屏障(blood-ocular barrier，BOB)遞送轉基因的一者，此特性使其適合經由血流遞送，從而為眼部基因療法中所用之習知給藥方式(例如，視網膜下注射或玻璃體內注射)提供了替代性給藥/遞送途徑。在一些實施例中，具有變異型AAV殼體蛋白之AAV為AAV 7m8或其衍生物或變異體(Dalkara等人，Science Translation Medicine,5：189ra76,2013；PCT申請案第PCT/US2012/034413號、PCT申請案第PCT/US2014/039015號、美國申請案第14/214,011號及美國申請案第13/899,481號)。在一些實施例中，具有變異型AAV殼體蛋白之AAV為AAV-PHP.B。
在一些實施例中，可以經由重建構病毒革命譜系(viral revolutionary lineage)來重建構或合成AAV載體。該重建構可以產生祖先、古代或親代AAV。在一個 實施例中，AAV載體為Anc80(AAV1、2、8及9之祖先)或其衍生物。Zinn等人，Cell Rep.2015年8月11日；12(6)：1056-68。
在一些實施例中，一或多個AAV及/或其他病毒載體可以藉由本發明所屬技術領域中已知之技術(包括例如「定向進化」及/或「合理設計」)為手段來修飾(例如，針對玻璃體內遞送、增強目標細胞類型(例如，RPE細胞)中之轉導或針對經由血流之遞送而進行最佳化)。參見例如Asuri等人，Mol Ther.20：329-338,2012及Yang等人，Methods Mol Biol.709：127-139,2011。可以將經修飾之AAV或其他病毒載體描述為例如經「工程改造」、「雜合」、「進化」、「增強」或「設計」之載體。該等修飾可以例如改良載體靶向(例如，改良玻璃體內遞送或經由血流遞送之適合性)、轉導效率及/或降低免疫反應，致使例如較低的所需劑量。在一些實施例中，rAAV載體為AAV血清型rh10(EP 20100178940)或ShH10。在一些實施例中，rAAV載體為AAV-PHP.B(US 20150079038)。
在一些實施例中，AAV載體可以產生於及/或選自於多於一種本文中所述之策略之組合。舉例而言，AAV-DJ/8及AAV-DJ/9係藉由在AAV-DJ之肝素結合域(HBD)中製造點突變而產生，AAV-DJ為一種雜合AAV。
本發明所屬技術領域中已知，某些AAV可能比一些其他AAV更適合玻璃體內遞送。許多此類用於玻璃體內遞送之AAV涉及經由突變修飾AAV殼體蛋白 (例如，AAV2(四Y-F+T-V)(Kay等人，PLoS One.2013年4月26日；8(4))或變異型AAV殼體蛋白(例如，AAV 7m8)。此外，存在適合經由血流遞送之AAV，例如AAV-PHP.B。然而，該等AAV之使用不限於玻璃體內遞送或經由血流遞送，例如其亦可作為AAV載體用於視網膜下及其他給藥途徑。
在一些實施例中，使用自身互補型AAV載體(scAAV)。野生型AAV具有單股DNA基因組。AAV之一個缺點為其單股DNA基因組。因為單股AAV基因組依賴細胞之DNA複製機制來合成互補股，所以轉基因表現延遲且不如雙股DNA穩健。關於CYP4V2基因療法，吾人開發了一種scAAV設計(參見圖7)來避開習知單股AAV載體中之限速第二股合成並促進穩健的轉基因表現。scAAV.CYP4V2包含分子內自身互補型CYP4V2 DNA結構，其消除了對宿主細胞DNA合成的需求並且在轉導時導致更快且更穩健的表現。然而，scAAV之自身互補型結構將scAAV載體之包裝限制從ssAAV之約4.7-5.0kb降低至scAAV之約2.4-2.5kb。因此，在scAAV設計中需要較短長度的調節序列(例如，啟動子、強化子及/或polyA信號)。為了確保表現匣不超過載體包裝限制並且視cDNA及所使用的其他調節序列之長度而定，可能需要從scAAV構建體中排除某些可選擇性的調節序列，諸如強化子。scAAV設計中之兩個ITR中之一者為經截短的ITR且在末端解析位點(terminal resolution site，TRS) 具有突變。關於scAAV結構、純化及產生之詳述論述，參見McCarthy,Molecular Therapy，第16卷，第10期，第1648-1656頁，2008年10月。
可以採用許多其他載體設計。舉例而言，可使用雙重載體系統(例如，基於AAV之雙重載體系統，例如反式剪接(trans-splicing)或雜合雙重AAV載體)來表現核酸序列(例如，CYP4V2核酸序列)。參見例如Colella等人，Gene Ther.21,450-456,2014。舉例而言，雙重載體系統可以包括(i)第一AAV載體多核苷酸，在該多核苷酸之各端(5'端及3'端)具有反向末端重複序列，且在反向末端重複序列之間具有合適的啟動子，其可操作地連接於編碼由所關注之核酸序列編碼之蛋白質之N端部分的部分編碼序列；及ii)第二AAV載體多核苷酸，在該多核苷酸之各端(5'端及3'端)具有反向末端重複序列，且在反向末端重複序列之間具有編碼由所關注之核酸序列編碼之蛋白質之C端部分的部分編碼序列，隨後為多腺苷酸化(pA)信號序列。
為了吾人之研究，設計並產生了各種rAAV載體，包括scAAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、scAAV2/5、AAV2/8、scAAV2/9及AAV2/2(Y444F+Y500F+Y730F)(參見本文圖7中之示意圖及註釋)。其證明，各種載體設計之rAAV載體可用於CYP4V2基因療法中。此外，鑒於患者群體中對抗某些AAV類型的預先存在中和抗體及其他個體免疫反應，包含多種rAAV載體作為選項可以幫助 減少CYP4V2基因療法中的潛在免疫反應。若需要對同一隻眼睛進行後續給藥或對同一個體之對側眼睛給藥，則其亦將提供更多選項。
用以產生病毒遞送載體，包括使用無輔助系統(helper-free system)產生病毒遞送載體的方法為本發明所屬技術領域中已知的。參見例如PCT/US2007/010055；第6458587號專利；第US 6428988 B1號專利。基因療法中所用的各種載體之製造，包括但不限於AAV載體、腺病毒載體、慢病毒載體及反轉錄病毒載體之製造，亦可經由委外研究機構(contract research organization，CRO)及委外生產服務(contract manufacturing organization，CMO)，例如Vector Biolabs(Malvern,PA)及Cell Biolabs,Inc.(San Diego,CA)，商業上獲得。
在一些實施例中，適用於本文中所描述之方法中的重組AAV載體可以藉由培養含有以下各者的宿主細胞(例如，HEK293細胞)而產生：編碼AAV血清型殼體蛋白之核酸分子或其片段；rep基因；袖珍基因(minigene)，其最少包含AAV反向末端重複序列(ITR)及所關注之核酸分子(例如，具有CYP4V2核酸序列)；及足以允許將所關注之核酸包裝到AAV殼體蛋白中的輔助功能。需要在宿主細胞中被培養以將核酸包裝於AAV殼體中的組分可以順式或反式提供給宿主細胞。或者，所需組分(例如，所關注之核酸分子、rep序列、cap序列及/或輔 助功能)中之任何一或多者可以由經工程改造而含有所需組分中之一或多者的穩定的宿主細胞提供。這些組分中之任一者可以選自任何合適的血清型。舉例而言，rAAV載體藉由用以下各者共同轉染生產細胞(producer cell)(例如，HEK 293細胞)而產生：(a)質體(AAV順式質體)，其含有由所關注基因(例如，編碼CYP4V2之cDNA)及其他所欲的側接有兩個AAV ITR之調節序列構成的經選殖的重組AAV基因組；(b)在反式AAV病毒Rep及Cap基因中表現的另一構建體；(c)腺病毒輔助因子，其藉由將提供這些腺病毒輔助因子之第三質體經由腺病毒感染或轉染至生產細胞中來提供。除了HEK293細胞之外，亦可使用其他細胞株來產生rAAV載體，包括但不限於希拉細胞、Vero、A549、B50、WI38及BHK細胞。
在一些實施例中，病毒遞送載體為rAAV2病毒、rAAV2/5病毒、rAAV2/8病毒、rAAV2/1病毒、rAAV2/4病毒、rAAV2/6病毒、rAAV2/9病毒、rAAV2/12病毒或具有來自AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及/或AAV12病毒中之一或多者的殼體元件的rAAV病毒。在一個實施例中，病毒遞送載體為具有一或多個Y-F突變之rAAV病毒，包括但不限於AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)或AAV8(Y733F)。
在一些實施例中，病毒遞送載體為單股rAAV(ssAAV)病毒。在一些實施例中，病毒遞送載體為自身互補型rAAV(scAAV)病毒。
除了AAV載體之外，亦可在CYP4V2基因療法中使用其他病毒載體。舉例而言，腺病毒載體亦已被證明適用於基因遞送。舉例而言，Mori等人，2002.IOVS,43：1610-1615揭示了一種腺病毒載體之用途，該腺病毒載體為E-1缺失、部分E-3缺失的5型Ad，其中轉基因(綠色螢光蛋白)由CMV啟動子驅動。在注射107至108個病毒粒子後展現峰值表現位準，視網膜下注射提供比玻璃體內注射更高位準的表現。
在一些實施例中，遞送載體為含有編碼人類CYP4V2蛋白質或其功能變異體或片段之核酸分子的質體。
非病毒載體亦可用於CYP4V2基因療法中。非病毒載體之實例包括但不限於裸核酸、樹狀體、脂質體(例如，陽離子或陰離子脂質體)、聚合物(例如，聚合複合物(polyplex))、脂質-聚合物系統及奈米粒子(例如，無機或合成奈米粒子)。舉例而言，Farjo等人，2006,PLoS 1：e38使用壓實的DNA奈米粒子(compacted DNA nanoparticles)作為用於非病毒基因轉移至眼部組織之系統，證實了有效的非病毒眼部基因轉移。作為概念驗證，使用pZEEGFP5.1(5,147bp)表現構建體，其編碼由CMV立即早期啟動子(CMV immediate-early promoter)及強化子轉錄控制的增強型綠色螢光蛋白(green fluorescent protein，GFP)cDNA。DNA奈米粒子係藉由將質體DNA與CK3OPEG10K混合來配製，CK3OPEG10K為具有N 端半胱胺酸的30-mer離胺酸肽，其係使用已知方法經由馬來亞醯胺鍵結與10kDa聚乙二醇共軛。將奈米粒子在鹽水中濃縮至4mg/ml的DNA。將壓實的DNA以0.6μg劑量遞送至玻璃體腔。藉由PCR及顯微術觀察晶狀體、視網膜及色素上皮/脈絡膜/鞏膜中之GFP表現。
此外，關於眼部基因轉移方法已頒佈了多項專利，包括但不限於美國專利第7,144,870號，其提供玻尿酸介導之腺病毒轉導方法；美國專利第7,122,181號及第6,555,107號，其提供慢病毒載體及其介導眼部基因遞送之用途；美國專利第6,106,826號，其提供單純疱疹病毒載體及其介導眼部基因遞送之用途；及美國專利第5,770,580號，其提供DNA表現載體及其介導眼部基因遞送之用途。
在本文實例部分中提供一種從不同載體中篩選及選擇適合用於CYP4V2基因療法中之載體的方法。實例使用不同的AAV載體來說明該方法。應理解，熟習此項技術者亦可用該方法在不同類型的載體中做出比較及選擇，例如病毒載體對比非病毒載體、腺病毒對比AAV、慢病毒對比AAV、HSV對比AAV等。
C. CYP4V2表現匣及調節序列
本發明亦提供一種表現匣，其包含編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列(例如，SEQ ID NO：1、2或3之核酸序列)及可操作地連接於CYP4V2編碼核酸序列之表現控制序列。除了編碼功能性CYP4V2蛋白質之核 酸分子之外，CYP4V2基因療法中所用的表現匣之其他關鍵元件包括一或多個用以控制該核酸分子之表現的調節序列。在一些實施例中，將表現匣包裝於遞送載體中(例如，側接有AAV ITR之rAAV載體中)以增強遞送、轉導及/或表現效率。在本文中所描述之方法中可以使用任何AAV ITR。本文實例中所描述之ssAAV載體含有兩個AAV2 ITR，各自約141bp(示範性序列顯示於SEQ ID NO 40中)。實例中所描述之scAAV載體含有兩個AAV2 ITR，其中一個為經截短的ITR(示範性序列顯示於SEQ ID NO 41中)。視所使用的親代載體而定，AAV2 ITR通常具有約132至約167bp之長度。
如本文中所使用之術語「調節序列」係指任何能夠對核酸序列之複製或表現(轉錄或轉譯)發揮調節作用或以其他方式指導、影響及/或調節核酸序列之表現的基因元件(例如，多核苷酸序列)。常見的表現控制序列包括啟動子、多腺苷酸化(polyA)信號、強化子、上游調節域(upstream regulatory domains)、內含子、UTR、反應元件或誘導元件、複製起點、內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)、轉錄起始序列、終止序列、RNA加工序列，諸如剪接及多腺苷酸化(polyA)序列、穩定細胞質mRNA之序列、增強轉譯效率之序列(亦即科札克共同序列)、增強蛋白質穩定性之序列或增強所編碼蛋白質之分泌的序列。調節序列可為細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物或病毒來源的調節序列、或可為其衍生物、雜合體或 變異體、或可為合成的，且載體可以含有來自不同來源之調節序列的組合。舉例而言，調節序列相對於由該等調節序列調節表現的編碼序列(例如，CYP4V2基因)可為異源的(例如，具有不同來源或來自不同基因；例如來自非CYP4V2基因)或同源的(例如，來自同一個基因；例如來自CYP4V2基因)。如本文中所使用之「可操作地連接」意謂啟動子及/或其他調節序列相對於核酸編碼序列以能夠指導、影響或調節該核酸編碼序列之表現這樣的方式定位。調節序列可與同一載體中或不同載體中之核酸編碼序列「可操作地連接」。一或多個可操作地連接於核酸編碼序列之調節序列可為連續的及/或可以反式或以一定距離起作用以指導、影響或調節核酸編碼序列之表現。在調節序列中，啟動子為必需的，而其他調節序列如強化子、內含子及終止子，可為有益的，但是是可選擇性的。
可以使用各種啟動子序列來驅動核酸編碼序列之表現。一些啟動子為組成型啟動子(constitutive promoter)，其指導幾乎所有組織及大多數細胞類型中之表現，而其他啟動子則受到更多控制。受調節的啟動子可能僅在某些組織或細胞中起作用(亦即組織或細胞特異性啟動子)或在發育的某些時間起作用(亦即發育階段特異性啟動子)及/或可取決於環境條件或外部刺激，諸如化學、氧氣位準、熱或光(亦即誘導型啟動子)。
在一些情況下，可能需要使用組成型啟動子(或泛在啟動子(ubiquitous promoter))。示範性組成型啟 動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)啟動子(Gray等人，Hum Gene Ther.2011年9月；22(9)：1143-1153；Norman等人，PLoS ONE 5(8)：e12413,2010年8月)、雞β-肌動蛋白啟動子、衍生自CMV/雞β肌動蛋白/兔β-球蛋白之雜合CAG(又名CAGGS、CBA或CB)啟動子(Miyazaki J,Takaki S,Araki K,Tashiro F,Tominaga A,Takatsu K,Yamamura K.1989.Expression vector system based on the chicken β-actin promoter directs efficient production of interleukin-5.Gene 79：269-277；Acland,G.M.等人MoI Then,2005,12：1072-1082)、小CBA(smCBA)啟動子(~953bp，參見Mah等人2003,Hum.Gene Ther.14：143-152；Haire等人2006 IOVS,2006,47：3745-3753)、CBh啟動子(~800bp，參見Gray等人，Hum Gene Ther.2011年9月；22(9)：1143-1153)、人類β-肌動蛋白啟動子(ACTB)(Norman等人，PLoS ONE 5(8)：e12413,2010年8月)、延長因子1α(EF-1 alpha)啟動子(參見Gill等人，Gene Ther.2001；8(20)：1539-1546；Norman等人，PLoS ONE 5(8)：e12413,2010年8月)、磷酸甘油酸激酶(PGK，人類或小鼠)啟動子(Norman等人，PLoS ONE 5(8)：e12413,2010年8月)、泛素C(UBC)啟動子(Norman等人，PLoS ONE 5(8)：e12413,2010年8月)、GUSB(葡糖醛酸糖苷酶β)啟動子、GUSB最小啟動子(hGBp)(Husain,Gene Therapy(2009)16,927-932)、UCOE啟動子、延長因子 1α短型(EFS)啟動子、猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子。關於各種啟動子之一般性比較及論述，參見例如Powell,Discov Med.2015年1月；19(102)：49-57。應理解，在一些情況下，「組成型」或「泛在」啟動子可能傾向於靜默或促進所選細胞類型中的差異表現強度，參見例如McCown等人，Brain Res.1996；713(1-2)：99-107；Gray等人，Hum Gene Ther.2011；22：1143-1153。
在一些情況下，使用細胞特異性或組織特異性啟動子係所欲的，其指導核酸編碼序列在特定類型之細胞或組織中之表現。基於本文中之揭示內容，應瞭解，細胞特異性或組織特異性啟動子可對眼細胞或組織或對淋巴細胞具有特異性。眼細胞類型包括但不限於視網膜細胞、視網膜雙極細胞、光感受器細胞、視桿細胞及視錐細胞、神經節細胞、視網膜色素上皮(RPE)細胞、脈絡膜細胞或角膜上皮細胞。因此，如本文中所描述之細胞特異性啟動子可為視網膜特異性啟動子(例如，RPE特異性、光感受器特異性(例如，視錐特異性及/或視桿特異性)及/或脈絡膜特異性)或角膜特異性啟動子。示範性眼細胞特異性啟動子包括但不限於人類G蛋白偶聯受體蛋白激酶1又名視紫質激酶1(GRK1)啟動子(Genbank登錄號AY327580)、GRK1啟動子之292nt片段(位置1793-2087)(參見Beltran等人，Gene Therapy 17：1162-74,2010)、人類光感受器間類視色素結合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)近端啟動子、hIRBP啟動子之235nt片段、RPGR近端啟動子、紅色視蛋白啟動子、紅色-綠色視蛋白啟動子、藍色視蛋白啟動子、小鼠視蛋白啟動子(長型及短型兩種，Le等人，Molecular Vision 2006；12：389-398；Beltran等人，Gene Therapy 17：1 162-74,2010)、視紫質(Rho)啟動子(Mussolino等人，Gene Therapy,18：637-45,2011)、視錐轉導蛋白之α-次單元(Morrissey等人，BMC Dev,Biol,11：3,2011)、β磷酸二酯酶(PDE)啟動子、視網膜色素變性(RP1)啟動子(Nicord等人，J.Gene Vied.9：1015-23,2007)、NXNL2/NXNL1啟動子(Lambard等人，PLoS One,5：el3025,2010)、RPE65啟動子(Li等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science,2002年12月，第43卷，3640)、視網膜退化緩慢/外周蛋白2(retinal degeneration slow/peripherin 2，Rds/perphZ)啟動子(Cai等人，Exp Eye Res,91：186-94,2010)、VMD2啟動子(卵黃狀黃斑變性2(vitelliform macular dystrophy 2)，又名BEST1，Kachi等人，Human Gene Therapy,20：31-9,2009)、IRBP/GNAT2啟動子(與視錐轉導蛋白α啟動子融合之hIRBP強化子)、Rds(視網膜退化緩慢)啟動子、hPDE6b啟動子或VEcad啟動子(VE-鈣黏附蛋白(VE-cadherin)/鈣黏附蛋白5(CDH5)/CD144啟動子)。應瞭解，基於本文中所提供之基本原理及論述，本發明所屬技術領域中已知之其他啟動子可以代替或加於本文中所 提供之任何示範性啟動子而使用。
示範性誘導型啟動子包括但不限於鈣敏感啟動子(例如，NFAT啟動子，參見Gene Ther.2013年3月；20(3)：248-54)、鋅誘導型羊金屬硫蛋白(zinc-inducible sheep metalioihionine，MX)啟動子、地塞米松(dexamethasone，Dex)誘導型小鼠乳房腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統、蛻皮激素昆蟲啟動子、四環素阻遏系統(tetracycline-repressible system)、四環素誘導系統、RU486誘導系統、雷帕黴素(rapamycin)誘導系統、多種商業上可獲得之誘導型啟動子及由特定生理狀態(例如溫度、急性期(acute phase)、細胞之特定分化狀態或僅在複製細胞中)調節的誘導型啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子為對特定眼細胞類型嚴格調節並具有特異性的啟動子。
啟動子可為另一啟動子及/或另一調節序列之雜合體、或其經截短/經縮短或經修飾之版本或以其他方式衍生自另一啟動子及/或另一調節序列者，例如CAG啟動子為CMV立即早期強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β-球蛋白基因之雜合體，smCBA啟動子為CBA啟動子之經截短的版本。啟動子可以含有其他元件，例如內含子、外顯子及/或強化子，例如CAG啟動子。可以在表現匣中一起使用多於一個啟動子。
在一些情況下，為了增加表現及/或將表現穩 定在高於由於啟動子而發生之表現，使用強化子序列係所欲的。代表性強化子序列包括但不限於轉錄後調節元件(例如，土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(又名WPRE)或B型肝炎病毒轉錄後調節元件(又名HPRE或HBVPRE，Donello等人，J Virol.1998年6月；72(6)：5085-92；Sun等人，DNA Cell Biol.2009年5月；28(5)：233-240)，或各種縮短、突變或經修飾之WPRE，例如含有極少WPRE之γ及α元件之~247bp縮短的WPRE(Choi等人，Mol Brain.2014；7：17；Donello等人，J Virol.1998年6月；72(6)：5085-5092；Zanta-Boussif等人，Gene Therapy(2009)16,605-619)，或1RBP強化子(Nicord等人，J.Gene Vied.9：1015-23,2007)、組成型運輸元件(constitutive transport element，CTE)強化子(例如，梅森-菲舍猴病毒(Mason-Pfizer Monkey Virus)CTE或禽白血病病毒CTE)、巨細胞病毒(CMV)立即早期強化子、衍生自免疫球蛋白基因之強化子或SV40強化子，或小鼠近端啟動子中所鑑定到的順式作用元件、內含子調節序列，例如衍生自SV-40之稱為SD-SA的小內含子(mini-intron)剪接供體/剪接受體，內部核糖體進入位點(IRES)，其可用於從單一基因轉錄物產生多於一個多肽，例如含有多於一個多肽鏈之蛋白質或兩個不同蛋白質，可為脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)內部核糖體進入序列，其支持RPE、光感受器及神經節細胞中之轉基因表現。
轉錄物之多腺苷酸化對於核輸出、轉譯及 mRNA穩定性至關重要。因此，轉錄物多腺苷酸化之效率對於轉基因表現很重要。代表性PolyA信號序列包括但不限於SV40 polyA信號、SV40晚期polyA信號、SV40早期polyA信號、牛生長激素多腺苷酸化(bovine growth hormone polyadenylation，bGH polyA)信號、小polyA或人類生長激素多腺苷酸化信號(hGH polyA)。在一些情況下，可使用上游強化子(upstream enhancer，USE)序列來提高polyA信號之效率，例如SV40晚期2xUSE、HIV-1 USE(人類免疫缺陷病毒1)、GHV USE(地松鼠肝炎病毒(Ground squirrel hepatitis virus))、腺病毒(L3)USE(腺病毒)、hTHGB USE(人類凝血酶原)或hC2 USE(人類C2補體基因)(Schambach A,Galla M,Maetzig T,Loew R,Baum C.Improving transcriptional termination of self-inactivating gamma-retroviral and lentiviral vectors.Mol Ther.2007；15(6)：1167-1173)。
如啟動子序列一般，表現匣中使用的其他調節序列可為調節序列之雜合體、調節序列之經縮短/經截短、經修飾或以其他方式衍生的版本。例如，經縮短的WPRE、SV40晚期2×USE、SV40晚期polyA。除了本文中所描述之元件之外，表現匣亦可含有其他調節序列，例如內含子、UTR及連接序列。已經證明，包含剪接位點(亦即，側接有兩個內含子之外顯子)適用於增加來自表現匣之蛋白質的基因表現。
本發明所屬技術領域中已知，調節序列或雜 合調節序列經常具有多種版本且具有不止一個名稱。舉例而言，各種啟動子、強化子及polyA信號具有多種版本，其包括但不限於CMV啟動子、EF1α啟動子、WPRE強化子及SV40 polyA信號。CAG啟動子具有多個替代名稱，其包括但不限於CBA啟動子、CB啟動子或CAGGS啟動子。此外，本發明所屬技術領域中亦已知，調節序列可以縮短、經修飾或與其他序列組合，以產生衍生物或變異體，例如CAG(又名CBA、CB或CAGGS)啟動子為CMV立即早期強化子、雞β肌動蛋白啟動子及兔β-球蛋白基因之雜合體，smCBA啟動子為經截短的CAG啟動子，CBSB啟動子為縮短的CAG啟動子，在CMV立即早期強化子之5'端相差約152bp。此外，調節序列可以有不同的稱謂，例如諸如HPRE或WPRE之轉錄後調節元件亦可被稱作強化子。本文中所描述之任何調節序列均涵蓋此調節序列之所有變體、衍生物及/或雜合體。本文中所提供之與調節序列相關的任何示範性序列在本質上為示範性的且並不將此調節序列之定義或範疇限於示範性序列中所示者。
在一些實施例中，可以在表現匣設計中使用微小RNA(miRNA)技術以達成靶向表現特異性，例如經由阻遏脫靶轉基因表現，僅舉例而言且不限制，可以緊接在CYP4V2 cDNA之下游添加miR181(一種已證明僅在神經節細胞及內視網膜中表現的miRNA)之目標序列來抑制表現匣介導之CYP4V2蛋白質在神經節細胞及內視網 膜細胞中之合成。同樣地，僅在某些細胞類型中表現的miRNA的目標序列可用於阻遏這些類型的細胞中由表現匣介導之CYP4V2蛋白質表現，以達成靶向之組織或細胞特異性表現。
D.設計用於CYP4V2基因療法之有效表現匣及遞送載體
關於CYP4V2表現匣及遞送載體設計方法及這些研究之各種設計的詳細論述提供於本文實例部分中。
使用EFS啟動子及/或小PolyA信號(SPA)治療眼部疾病
如本文中所論述，基因遞送載體具有包裝大小限制。舉例而言，單股AAV載體之包裝限制為約4.7-5.0kb，超過此大小，轉導及表現效率將顯著下降。對於自身互補型AAV(scAAV)，包裝限制減半至約2.4-2.5kb。因此，對於由載體介導之基因遞送及基因療法而言，大小很重要。對於雙股自身互補型載體，使用小尺寸調節序列來為轉基因(例如，cDNA)留出足夠的空間是所欲的並且有時是關鍵的。因為此大小限制，大啟動子亦不適合於與scAAV一起使用。關於CYP4V2基因療法，鑒於cDNA之大小為約1578bp且AAV ITR(含突變)為約258bp，故僅剩下約500-600bp留給調節序列。因為CYP4V2幾乎遍在地表現，所以在一些實施例中，使用組成型啟動子來驅動CYP4V2轉基因表現係所欲的。然而，沒有空間留 給吾人在單股AAV設計中所用的約1.7kb之組成型CAG啟動子或約953bp之縮短的CBA啟動子(smCBA)或約800bp之CBh啟動子，對於許多其他組成型啟動子，例如約600bp之CMV啟動子，同樣如此。可以改為使用長度較短的EFS啟動子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：34中)用於scAAV設計。相同的大小限制適用於其他調節序列，例如polyA信號。bGH Poly A為約225bp，SV40 polyA為約240bp及SV40晚期polyA為約120bp。其中任一者都將佔據留給包括啟動子之調節序列之~500bp長度之大部分。因此，scAAV設計使用小polyA信號(SPA)，其僅約54bp(示範性序列顯示於SEQ ID NO：35中)。
使用EFS啟動子及SPA之設計僅佔據約300bp且與AAV ITR一起總共佔據約600bp，從而留下約1.8-1.9kb的剩餘包裝空間給編碼所欲之蛋白質之核酸序列及為scAAV設計之表現匣中之任何其他序列，並留下約4.1-4.4kb的剩餘包裝空間給編碼所欲之蛋白質之核酸序列及為ssAAV設計之表現匣中之任何其他序列。因此，相比於使用較大的啟動子及polyA信號序列，包括但不限於CMV啟動子、CAG啟動子、smCBA啟動子、CBh啟動子、EF1α啟動子、bGH polyA、SV40 polyA及SV40晚期polyA，可以在含有EFS啟動子及SPA之rAAV載體中包裝大小較大的cDNA及/或其他序列。
包含EFS啟動子及SPA之表現匣的示意圖 提供於圖4b中。圖7b中所示之構建體包括CYP4V2 cDNA。為了用於其他轉基因表現之表現匣，CYP4V2 cDNA可以用另一所關注之基因替代。
在此研究中測試在表現匣及遞送載體中使用EFS啟動子及SPA來驅動核酸編碼序列以治療眼部疾病。產生含有EFS啟動子、CYP4V2 cDNA及SPA之scAAV2/1載體，稱為scAAV1.EFS.CYP4V2op.SPA。在BCD患者之iPS-RPE細胞中施用scAAV1-EFS-CYP4V2op-SPA。儘管EFS啟動子及SPA之長度很短，但是scAAV1-EFS-CYP4V2op-SPA在短短4天之內就在BCD患者之iPS-RPE細胞中顯示出快速且穩健的作用(參見表3)。這表明，EFS啟動子及/或SPA為非常適用於眼部基因療法之scAAV系統中的小尺寸調節序列。此外，scAAV載體之穩健表現使得scAAV設計亦適合於除了視網膜下遞送之外的其他給藥途徑(例如，玻璃體內遞送)。
EFS啟動子及/或SPA之使用不限於CYP4V2基因療法或scAAV構建體中。其可用於涉及其他基因之基因療法，其中轉基因大小及/或scAAV設計需要使用長度較短的啟動子及polyA信號來驅動快速且足夠的蛋白質表現。
E.治療選項、個體選擇及給藥
CYP4V2基因療法可以多種方式施用。在一些情況下，可經由將含有CYP4V2表現匣之遞送載體有效 遞送至個體之靶向治療之細胞、組織或器官，例如RPE、光感受器、脈絡膜、角膜、淋巴細胞、視網膜或眼睛，從而在個體(例如，BCD患者)體內施予治療。在一些情況下，可在體外在所靶向細胞(例如，患者iPS-RPE細胞、患者iPS-光感受器細胞、iPS-光感受器先驅細胞、iPS-CEC、淋巴細胞)中施予治療。然後可以將經治療之細胞移植至有需要之個體(例如，BCD患者)。在一些情況下，可經由組合體內方法與體外方法兩者來施予治療。在一些情況下，CYP4V2基因療法可以獨立地使用。在一些情況下，CYP4V2基因療法可以與另一治療選項一起使用。
作為本發明治療方法之候選者的個體包括經診斷患有BCD之個體。患有其他由CYP4V2基因突變引起之眼科臨床定義病狀(例如，遺傳性視網膜退化(IRD)、視網膜色素變性(RP)或角膜變性)的個體亦可使用本文中所描述之方法治療。由CYP4V2基因突變引起之BCD、IRD、RP、角膜變性或另一眼科病狀之診斷可以使用本發明所屬技術領域中已知之方法進行。本文中所描述之方法可以包括：鑑定具有BCD或由CYP4V2基因突變引起之另一眼科病狀或懷疑具有BCD或由CYP4V2基因突變引起之另一眼科病狀(例如，根據存在病狀症狀且沒有其他明顯的病因)的個體，例如兒童、青少年或成年個體；及從該個體獲得包含基因組DNA之樣品，使用已知的分子生物學方法檢測CYP4V2基因中突變之存在。
已在CYP4V2基因中鑑定到諸多突變且該等突變引起BCD，其中在基因之11個外顯子中各有至少一個突變。基因型分析顯示，BCD患者中最常見的CYP4V2突變為c.802-8_810del17insGC(係指17個鹼基缺失且兩個鹼基(GC)插入於從CYP4V2基因之內含子6的末端起8個鹼基的位置中，亦稱為IVS6-8 del/insGC；此插入-缺失突變位於內含子6-外顯子7接合處且17bp缺失包括外顯子7剪接受體位點，引起編碼62個胺基酸之外顯子7的框內缺失)，導致跳過外顯子7。(Xiao等人，Biochem Biophys Res Commun.409：181-6,2011；Meng等人，2014,Mol.Vis.,20：1806-14；Wada等人，Am J Ophthalmol.139：894-9,2005；Jiao等人，European Journal of Human Genetics(2017)25,461-471)。在與BCD相關之CYP4V2突變中發現了各種類型的突變，包括但不限於錯義、剪接位點、框移、缺失、插入、插入缺失、無義、多型性(例如，單核苷酸多型性)及提前終止。人類BCD患者中之選擇CYP4V2突變的彙總提供於表1中且可在各種出版物及線上資料庫中找到，例如LOVD(全球資訊網上之databases.lovd.nl/shared/genes/CYP4V2)、OMIM(全球資訊網上之omim.org/allelicVariant/608614)及ClinVar(全球資訊網上之ncbi.nlm.nih.gov/clinvar？term=608614[MIM])。
應注意，表1中之人類CYP4V2突變並不詳 盡。未來可能會鑑定到更多CYP4V2突變。應理解，並非所有相對於參考序列之變異都是突變。一些變異為非病理性的。確認遺傳變異是否是病理性變異(亦即是否是突變)的方法為本發明所屬技術領域中已知的，包括但不限於將變異與先前臨床上鑑定的已知突變進行比較，及/或判定是否存在相應的功能改變。舉例而言，確定遺傳變異是否為病理性變異(亦即突變)的一種方法為測試衍生自如本文中所描述之個體的iPS-RPE細胞株的生化功能，並與健康對照組之iPS-RPE細胞株的生化功能相比，評定是否存在任何異常。
可以使用本文中所描述之方法治療的具有BCD或由於CYP4V2突變引起之另一眼科病狀的患者較佳保留若干光感受器及視覺功能，例如如藉由視敏度、視野、視覺功能及/或光同調斷層掃瞄(OCT，例如譜域-OCT(SD-OCT))所量測。
在給藥之前，最終產物將經歷一連串步驟(例如，超純化)以滿足臨床級標準。臨床級生產可經由各種GMP設施商業上獲得，包括但不限於NIH基因療法資源計劃(Gene Therapy Resource Program，GTRP)及委外生產服務(CMO)中之設施。
在給藥之前，個體可以測試預先存在的對抗個體將要接受給藥的AAV載體類型的中和抗體(NAb)。在一個實施例中，若個體具有預先存在的對抗此AAV類型之NAb，則可以使用對個體之預先存在的NAb具有低交 叉反應性的替代性AAV載體或具有經修飾之殼體結構的AAV載體來向該個體給藥，從而降低免疫反應並保留足夠的經由AAV載體之轉導效率。使免疫反應最小化的其他方法為本發明所屬技術領域中已知的，包括但不限於在治療前、在治療期間及/或在治療後施予免疫抑止劑及方案。
病毒載體或非病毒載體或其組合(例如，雜合載體)可以使用一或多種物理手段遞送至個體之眼細胞中。如本文中所使用之眼細胞係指(但不限於)視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞、角膜上皮細胞、視網膜細胞、視網膜雙極細胞、視桿細胞、視錐細胞、神經節細胞、脈絡膜細胞及/或晶狀體細胞。除此之外或作為進一步一種選擇，可將載體遞送至附近或鄰近細胞或可與所靶向之細胞接觸的細胞中，包括但不限於腦中之細胞或視神經中之細胞或血球。
體外治療可以使用可有效地將載體遞送至靶向治療之細胞(例如，BCD患者之iPS-RPE細胞)的任何方法或多種方法及/或藥劑之組合。體外治療可以經由一輪或多於一輪的感染來進行。在一些情況下，直接在所培養的細胞中施予載體以轉染或轉導該等細胞。在一些情況下，可以使用其他的遞送至細胞中及/或增強細胞中之轉染/轉導效率的方法，包括但不限於多重轉染/轉導、電穿孔、磁性轉染(magnetofection)或聲致穿孔。用載體或表現匣感染/轉染細胞時所用的方法及藥劑為本發明所屬技術領域中已知的，包括但不限於如本文實例部分中所述的。
接著可將經過體外治療的細胞移植至個體之眼睛。舉例而言，可將經基因修復的來自BCD患者之iPS-RPE細胞經由視網膜下注射移植至患者。將細胞移植至眼睛所用的方法、藥劑及裝置為本發明所屬技術領域中已知的，參見例如Wert等人，J Vis Exp.2012；(69)：4286；WO 2016/179496；Schwartz等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science 2016年4月，第57卷，ORSFc1-ORSFc9。
關於體內治療，載體及/或表現匣可以遞送至所靶向進行體內治療的細胞(例如，經由施用於需要治療之個體的眼睛，從而遞送至靶向治療的細胞)。向目標眼細胞體內遞送核酸分子、表現匣、載體之方法為本發明所屬技術領域中已知的。舉例而言，對眼睛給藥可以根據靶向治療之細胞使用任何可有效地將載體而遞送至視網膜、視網膜下空間、脈絡膜或通常是眼後段、角膜、晶狀體或玻璃體的方法(或多種方法及/或藥劑之組合)。給藥可以經由任何合適的手段，包括但不限於注射(例如，視網膜下注射、玻璃體內注射、直接視網膜注射、直接注射至眼後部脈絡膜上腔中)、滴眼劑，且可以與其他遞送技術(例如，電輔助遞送至角膜上皮)組合施予。亦可使用例如DNA粒子撞擊(例如，藉由基因槍)、流體動力基因轉移(hydrodynamic gene transfer)、滴眼劑、電穿孔、磁性轉染或聲致穿孔，將CYP4V2核酸、表現匣及/或遞送載體引入細胞中。對眼睛的給藥及遞送方法及技術為本發明所屬技術領域中已 知的。僅舉例而言，參見(但不限於)Wert等人，J Vis Exp.2012；(69)：4286；WO 2016/179496；Mohan等人，Prog Retin Eye Res.2012年1月；31(1)：43-64。
除了使用視網膜下注射對RPE細胞進行習知的遞送之外，本文中所論述之方法之一個態樣為玻璃體內遞送核酸分子(例如，具有非突變CYP4V2核酸序列)來治療或預防眼睛疾病。一些載體(例如，AAV2(四Y-F+T-V)及AAV 7m8)經由玻璃體內給藥顯示出在視網膜中有效轉導的特殊前景。此外，AAV或其他病毒載體可以藉由本發明所屬技術領域中已知之技術手段進行修飾，包括例如「定向進化」及「合理設計」，從而改良或最佳化其作為以不同於習知視網膜下注射之方式基因遞送至一種或多種類型之細胞或組織(例如，玻璃體內注射)的載體的適合性。除了視網膜下遞送之外，亦可在玻璃體內遞送中使用scAAV載體，因為其迅速且穩健的表現譜(expression profile)。因為CYP4V2幾乎遍在地分佈且在視網膜中具有特別高的表現，所以CYP4V2之遺傳及表觀遺傳改變特別適合經由玻璃體內施用一或多種載體來進行修復。目前的基因療法方法通常需要在視網膜下施用載體。因此，藉由本文中所揭示之材料及方法達成的技術進展之一為玻璃體內遞送核酸序列(例如，野生型或非突變型核酸序列，或編碼基因編輯多肽之核酸序列)及/或多肽來治療及預防與CYP4V2之核酸序列中之遺傳或表觀遺傳改變相關的眼睛疾病。
可以使用某些技術及藥劑來促進給藥或遞送過程。非限制性實例包括使用潤滑劑，以避免載體黏附至遞送媒介(例如，針)。此外，在給藥或遞送過程之前、期間及/或之後使用免疫抑制藥物能夠增加感染或轉導效率。
可以使用各種藥學上及/或生理學上可接受的媒介賦形劑、稀釋劑及/或載劑來配製用於遞送至個體之眼細胞中的載體。適合對眼睛給藥的媒介賦形劑、稀釋劑及/或載劑可稱作藥學上可接受的載劑，其實例包括無菌無熱原水及無菌無熱原緩衝鹽水(例如，使用磷酸鹽或其他緩衝劑緩衝的鹽水，諸如保持pH在適當的生理位準的HEPES)、等張氯化鈉溶液、平衡鹽溶液、乳劑(例如，油/水乳劑)及各種類型的潤濕劑。在一些情況下，製劑可以包括其他藥劑(medicinal agent)、醫藥劑(pharmaceutical agent)、穩定劑、緩衝劑、載劑、佐劑及稀釋劑。在一些情況下，製劑可以包括DBPS、甘油或Tween20用於長期儲存。
確定最有效的給藥手段及治療有效劑量的方法為熟習此項技術者已知的且將隨以下各者而變化：載體、其殼體結構、載體設計(例如，ssAAV對比scAAV)、表現匣之組成、載體之表現位準、啟動子、其他調節序列或核酸分子、載體力價、目標細胞類型、目標表現位準、所靶向細胞之區域大小或數目及待治療之個體(例如，待治療個體之年齡、性別、體重、疾病及病狀之發展階段及潛 在免疫反應)；給藥途徑；靶向治療之細胞的位置(例如，視網膜對比角膜)；相關基因在野生型細胞及/或組織中之性質及表現位準；及所需方案。治療有效劑量可以在疾病模式(例如，BCD細胞模式(例如，來自BCD患者之iPS-RPE細胞株)或動物模式)中測定及評估，且藉由臨床試驗確認或改良。關於細胞之體外治療，劑量通常用MOI表示，然後MOI乘以待治療細胞之數目。MOI一般在約1×103 GC/細胞至約1×106 GC/細胞的範圍內或感染MOI為約100至約10,000 GC/細胞(GC：基因組拷貝，測量含有AAV粒子之基因組(又名載體基因組(vg)或基因組粒子(gp))。關於體內治療，除了以上所描述之因素之外，實際給藥劑量亦會受到給藥期間每個患者特有的個體情況影響，例如在下文所描述之無脈絡膜症(Choroideremia)的情況下，患者6在視網膜下給藥期間之劑量減小。因此，體內單次給藥的治療有效劑量可為大概約1×106至2×1013 GC且包括端值(例如，約1×1011 GC至約1×1012 GC之高劑量範圍、約1×1010 GC至約1×1011 GC之中等劑量範圍、約1×109 GC至約1×1010 GC之低劑量範圍、約1×106 GC至約1×109 GC之極低劑量範圍及約1×1012 GC至約2×1013 GC之極高劑量範圍)，或在這些範圍內的足夠提供所欲效果的任何劑量。在一個實施例中，組成物以約1×106至2×1013 GC之劑量施用。在另一實施例中，體內給藥劑量藉由靶向治療之細胞的數目乘以目標MOI(例如，1×103 GC/細胞至約1×106 GC/細胞)來確定。在 對眼睛的任何單次給藥中含有rAAV載體之藥劑的體積可以在約1μL(0.001mL)至約1000μL(1mL)的範圍內。
如本文中所描述之組成物可以配製成單劑量或多個劑量。同樣地，給藥可以發生一次或多次(例如，在幾週、幾個月或幾年之內)且可以施用於同一隻眼睛或對側眼睛。在多次給藥的情況下，可以考慮相同或不同的AAV血清型及/或給藥途徑。給藥亦可用於治療不同的組織及細胞，例如一個給藥靶向RPE且另一個給藥靶向角膜。
用於基因療法(包括眼部基因療法)中的病毒載體產生方法、GMP產生方法、純化方法、配製方法及劑量為熟習此項技術者已知的，且病毒載體之製備方法可藉由任何如下文關於LCA-2之各組基因療法研究中所顯示的多個公司及多種方法進行。可以將本文中所提供之表現匣插入任何下文所列之示範性病毒載體中。或者，可以根據下文所提供之實例產生病毒載體。參見Bainbridge等人，2008.N Engl J Med.358：2231-9；Maguire等人，2008.N Engl J Med.358：2240-8；Hauswirth等人，Hum Gene Ther.2008年10月；19(10)：979-990。
舉例而言，在Bainbridge研究中，使用tgAAG76載體進行基因遞送，該載體為血清型2之重組腺相關病毒載體。該載體含有人類RPE65編碼序列，其由人類RPE65啟動子驅動且藉由牛生長激素多腺苷酸化位點終止，如其他地方所述。該載體由Targeted Genetics Corporation根據良好生產規範(Good Manufacturing Practice)準則產生，使用B50包裝細胞株、含有tgAAG76載體基因組之腺病毒-腺相關病毒雜合穿梭載體(adenovirus-adeno-associated virus hybrid shuttle vector)及腺病毒5輔助病毒。將該載體以1×1011個載體粒子/毫升之力價填充於緩衝鹽水溶液中，並在-70℃下以1ml等分試樣冷凍。
Maguire使用重組AAV2.hRPE65v2病毒載體，其為含有RPE65 cDNA的複製缺陷型AAV載體，據記載，在犬LCA2模式中在單次視網膜下注射AAV2.RPE65之後，其能提供長期持久(>7.5年，持續觀察)的視覺功能恢復。用於產生AAV2.RPE65之順式質體含有康黴素(kanamycin)抗性基因。該病毒由細胞與分子治療中心(The Center for Cellular and Molecular Therapeutics)在三重轉染HEK293細胞之後製造且藉由微流體化、過濾、陽離子交換層析法(POROS 50HS；GE Healthcare,Piscataway,N.J.)、密度梯度超速離心法及在PBS中透濾(diafiltration)來分離及純化。此組合能提供最佳純度的AAV載體產物，包括有效去除空殼體及殘留的氯化銫。以PF68 NF Prill泊洛沙姆(Poloxamer)188(PF68；BASF,Ludwigshafen,Germany)補充一部分的產物以防止載體隨後於產物接觸表面的損失。接著使用60-ml無菌注射器及針筒過濾器使含有或不含PF68的經純化病毒通過0.22-μm過濾器，並將其冷凍(-80℃)儲存 於無菌管中直至使用。將1.5×1010個AAV2.hRPE65v2載體基因組於體積為150μl之補充有Pluronic F-68 NF Prill泊洛沙姆188之磷酸鹽緩衝鹽水中的注射劑施用於視網膜下腔中。
Hauswirth所使用之病毒載體為重組腺相關病毒血清型2(rAAV2)載體，其經改變以攜帶人類RPE65基因(rAAV2-CBSB-hRPE65)，先前已在具有RPE65缺乏之動物模式中被證實能夠恢復視力。RPE65-LCA病毒載體藉由視網膜下注射遞送(150μl中5.96×1010個載體基因組)。
治療劑(例如，蛋白質、核酸分子、表現匣、基因療法載體、細胞)之給藥方法及方案，包括但不限於對眼睛給藥，及其他程序及方案(包括但不限於免疫學測試、眼睛檢查及免疫抑制劑)，為本發明所屬技術領域中已知的。舉例而言，下面為MacLaren在治療無脈絡膜症時使用的視網膜下注射AAV載體的實例。手術首先使用平衡鹽溶液(Alcon Laboratories,Fort Worth,TX,USA)經由41G特氟龍插管(Teflon cannula)(DORC International BV,Zuidland,Netherlands)將視網膜剝離。一旦視網膜目標區域從下方的視網膜色素上皮剝離，將含有1×1010個AAV2.REP1基因組粒子的固定體積(0.1mL)經由新的注射器注射至在前五位患者中創建的視網膜下腔中。在患者6中注射至多6×109個基因組粒子的降低劑量。經由相同的視網膜切開處(retinotomy)緩慢注射載體，造成該剝 離進一步地擴大。在前五位患者中，手術並不困難複雜，但在患者6中，視網膜難以從周圍黃斑剝離，使得必需誘導從靠近中央凹的點剝離，這導致乳頭黃斑束(papillomacular bundle)的可見拉伸。因為擔心具有6/7．5視力之患者中這種重要結構的拉伸相關的損傷，在第二個步驟中注射較小體積的載體(最多0.06mL)。在所有患者中，注射器中存留的剩餘載體經由插管排出至聚丙烯小瓶中，然後冷凍。之後在轉導由人類衍生之HT1080細胞株之後，用西方墨點法測試此剩餘載體之效力。用10天去氫皮質醇(prednisolone)口服療程治療患者，從術前2天開始，連續7天以1mg/kg(70-100mg)，然後減少至40mg服用1天，20mg服用1天及10mg服用1天。在術前及在術後1週與術後5-6週，獲取血液樣品進行免疫測試。參見MacLaren等人，Lancet.2014年3月29日；383(9923)：1129-1137。
在Hauswirth研究中，給藥進行如下。在輕度靜脈內鎮靜後，手術眼接受眼球後麻醉(retrobulbar anesthesia)，然後以標準無菌方式準備及覆蓋。進行標準的三端口23號核心(three-port 23-gauge core)及周邊玻璃體切除術。用Westcott剪刀及0.3鑷子解剖右側鞏膜切開處(sclerotomy)的結膜。藉由橡皮擦尖端燒灼術(eraser-tipped cautery)保持止血。用20號MVR刀片擴大鞏膜切開處，使得視網膜下插管可以容易地插入眼睛中。將載體吸入39號注射插管(Synergetics,O'Fallon, MO)並引入視網膜下腔中。在手術結束時，用7.0 Vicryl縫合線固定鞏膜切開部，並用間斷縫合線閉合結膜。結膜下施用抗生素及類固醇。手術後，局部使用抗生素及類固醇20天。參見Hauswirth等人，Hum Gene Ther.2008年10月；19(10)：979-990。
關於體外CYP4V2基因療法治療，治療後評定可以比較患者細胞之細胞形態及/或生化功能障礙，例如比較治療前及治療後在BCD患者之iPS-RPE細胞(或iPS-PRC或iPS-CEC細胞，若適用)中顯示異常的化合物之位準，以評定在治療之後細胞之形態及/或生化功能是否改良。
關於體內CYP4V2基因療法治療，治療後評定可以使用本發明所屬技術領域中關於視網膜及角膜疾病已知的眼睛及視網膜檢查(及角膜測試，若適用)，包括但不限於暗適應、對比敏感度、視野測試、視敏度測試、色覺測試、ERG、OCT、眼底成像、角膜檢查、諸如移動性之功能測試等。功效可藉由以下各者中之一者來驗證：視力改善、疾病進展停止或比預期的視網膜退化或視力喪失之速率慢。
由病毒載體介導之基因療法的一項挑戰為接受該基因療法之個體的免疫反應。除了習知與個體相關的風險之外，免疫反應亦會顯著降低病毒載體之轉導效率及/或造成無法確立長期的轉基因表現。Mingozzi F,Meulenberg JJ,Hui DJ,Basner-Tschakarjan E, Hasbrouck NC,Edmonson SA,Hutnick NA,Betts MR,Kastelein JJ,Stroes ES,High KA,AAV-1-mediated gene transfer to skeletal muscle in humans results in dose-dependent activation of capsid-specific T cells.Blood.2009年9月3日；114(10)：2077-86。
或許，部分是因為眼睛獨特的免疫環境，所以各種重組病毒載體(例如，AAV、慢病毒、腺病毒)在眼部基因療法中之免疫效應似乎相當良性。儘管如此，在眼內施用腺病毒之後，仍然會發展出顯著的細胞介導之免疫反應。但AAV及慢病毒均不會引發細胞介導之反應，因此係用於治療慢性眼部(視網膜)疾病之有前景的載體。J Bennett,Immune response following intraocular delivery of recombinant viral vectors,Gene Therapy(2003)10,977-982.doi：10.1038/sj.gt.3302030。然而，另一方面，先前的研究顯示，玻璃體內施用AAV載體引起非人類靈長類動物之玻璃體液以及血清中之抗AAV抗體位準增加。此外，猴子血清中預先存在的中和抗體力價的存在情況與玻璃體內施用AAV後的弱轉基因表現、衰退的轉基因表現或無轉基因表現強烈相關。Kotterman等人，Antibody Neutralization Poses a Barrier to Intravitreal Adeno-Associated Viral Vector Gene Delivery to Non-Human Primates,Gene Ther.2015年2月；22(2)：116-126。因此，降低眼部基因療法中之免疫反應係所欲的，尤其是中和抗體(NAb)之免疫反應，從而 保持所欲的轉導效率及/或長期轉基因表現。
歷史上，基因療法領域之公司的常見做法是使用一種血清型的AAV載體。通常使用在其他基因療法之動物研究及/或臨床試驗中具有良好轉導效率及大量安全數據的載體類型。舉例而言，AAV2為臨床試驗中最常用於眼部基因療法的AAV血清型。然而，由於免疫系統之個體差異，例如在預先存在的抗AAV抗體方面的個體差異，對某位患者而言最佳的血清型對於另一位患者而言未必總是最佳的。舉例而言，對抗特定AAV血清型之預先存在的抗AAV中和抗體的盛行率在各國家及各群體中是不同的。此外，免疫反應會顯著降低轉導效率，這會降低所施予之基因療法的功效及/或需要施用更高的劑量。
本文中提供一種用以在病毒載體介導之基因療法中降低對病毒載體之免疫反應、保持轉導效率、降低病毒載體及/或免疫抑制劑劑量及/或使針對具有同一種遺傳疾病之不同患者的治療效果達到最大的方法，其包含：
(a)建立在該基因療法所針對之目標細胞類型中具有足夠的轉導效率的多於一個重組病毒載體(例如，rAAV)的庫。可以藉由產生具有抗原區突變之變異體或在該等病毒載體之殼體上產生其他突變或變異體，在確認該等突變或變異體在與該疾病有關之目標細胞中(例如，對針對BCD之CYP4V2基因療法而言，係在iPS-RPE或RPE細胞株中)具有足夠的轉導效率後，擴增該病毒載體庫。
(b)檢測需要該基因療法之個體中預先存在的對抗不 同病毒載體血清型及/或殼體突變或變異體的中和抗病毒載體抗體(NAb)，及/或測試及比較衍生自該個體之患者特異性疾病目標細胞(例如，iPS-RPE細胞)中之不同病毒載體。
(c)從該病毒載體庫中選擇病毒載體，該病毒載體(i)在該等疾病目標細胞中具有足夠的轉導效率及(ii)與該個體中之該等預先存在的Nab具有低交叉反應性，及/或(iii)在該個體之患者特異性疾病目標細胞(例如，對於針對BCD之CYP4V2基因療法而言，為患者特異性iPS-RPE或RPE細胞株)中具有良好的表型拯救結果，其中該病毒載體庫包含不同血清型及/或殼體經修飾之病毒載體(例如，包括但不限於殼體突變型AAV及/或殼體蛋白變異型AAV)。
(d)使用選自(c)之病毒載體向該個體給藥。
(e)每當該個體需要施用基因療法時，包括但不限於向同一器官(例如，眼睛或對側眼睛)或向另一器官進行後續給藥，重複以上的(b)至(d)(僅重複與預先存在的NAb相關的部分)。
此方法之潛在益處包括：免疫抑制劑的使用減少，rAAV載體之劑量較低，轉導效率較高且轉基因表現期間較長，及/或適合該基因療法之患者的百分比較高。
應瞭解，此方法可以結合其他病毒載體使用。此外，此方法可以用於所有類型的眼部基因療法及非眼部基因療法中，無論該療法係與CYP4V2基因相關還是 與其他基因相關。
預先存在的抗AAV抗體之檢測方法為本發明所屬技術領域中已知的。值得注意的是，抗AAV抗體包括中和抗體及非中和抗體兩種。用以檢測預先存在的抗AAV抗體及其他針對AAV之免疫反應的方法為本發明所屬技術領域中已知的。Melvin Y Rincon等人，JMIR Res Protoc.2016年4月至6月；5(2)：e102；Hauswirth等人，Hum Gene Ther.2008年10月；19(10)：979-990。雖然中和抗體之作用最顯著，但是即使是非中和抗體亦能藉由免疫系統觸發載體清除。非中和抗體可以藉由ELISA檢測。Boutin S,Monteilhet V,Veron P,Leborgne C,Benveniste O,Montus MF,Masurier C,Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9 in the healthy population：implications for gene therapy using AAV vectors.Hum Gene Ther.2010年6月；21(6)：704-12。
除非進一步定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語，與標的方法及組成物所屬領域之一般技術者通常所理解者具有相同的含義。除了本文中所提供之術語定義之外，分子生物學中之常見術語的定義亦可見於以下各者中：Glossary of Genetics：Classical and Molecular,Rieger等人，1991，第5版，Springer-Verlag；Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人編，1998年增刊，Greene Publishing Associates,Inc.及John Wiley & Sons,Inc.；Current Protocols in Cell Biology,Bonifacino等人編，1999年增刊，JohnWiley & Sons,Inc.；及Current Protocols in Neuroscience,Crawley等人編，1999年增刊，John Wiley & Sons,Inc.。
本文中描述了代表性方法及材料；本發明所屬技術領域中已知之其他合適的方法及材料亦可以使用。該等方法及材料僅為說明性的且不意欲為限制性的。
實例
在以下實例中進一步描述本發明，該等實例不限制本發明及申請專利範圍之範疇。
此等研究由Reflection Biotechnologies Limited(「ReflectionBio」)發起、設計、組織並贊助，其為一家由患有罕見視網膜疾病之患者及家庭創建與推動的生物技術公司。罕見疾病患者承擔著人類遺傳突變的不可避免的機率，但往往被社會所忽視，而且公共資源支持不足。作為一家由患者推動的生物技術公司，ReflectionBio採用『源於患者，造福患者(By Patients,For Patients)』的方式為患者提供聯合力量，並在推動罕見疾病及其他具有挑戰性的疾病的科學及醫學研發方面發揮更積極的作用。
在此研究中包括經診斷患有BCD且具有不同的雙等位基因CYP4V2突變(包括純合CYP4V2突變或 複合雜合(compound heterozygous)CYP4V2突變)的患者。特定言之，一位患者(本文中稱為患者1、P1或RB001)具有純合c.802-8_810del17insGC突變。c.802-8_810del17insGC突變引起編碼62個胺基酸之外顯子7之框內缺失。c.802-8_810del17insGC突變為BCD患者中最常見的突變。患者2(P2或RB002)具有複合雜合CYP4V2突變，該等突變中之每一者為在525個胺基酸長的CYP4V2蛋白質中僅引起一個胺基酸發生改變的單一核苷酸改變。
獲得知情同意書。程序遵循赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)指南，且經由研究倫理審查委員會批准。
BCD人類細胞疾病模式實例
臨床上，BCD與RPE萎縮相關，RPE萎縮繼而引起光感受器死亡及視覺喪失。因此，建立並使用一種人類RPE模式來研究BCD及開發針對BCD之治療至關重要。
實例1-產生及特徵化衍生自BCD患者之誘導性多能幹細胞(iPSC)
在該研究中，使用無整合方法從BCD患者產生iPSC。用於iPSC重編程的傳統技術(例如，慢病毒、反轉錄病毒)整合至目標細胞之基因組中。所得iPSC及從那些iPSC分化的細胞將含有外源DNA且可能不安全並且在細胞療法及藥物發現應用中使用時可能存在問題。此 外，整合可能發生在基因組之關鍵區域，導致無關的發育過程出現問題。與傳統的重編程方法相比，無整合重編程方法產生不含可檢測載體或轉基因的iPSC，從而使其更適合用於細胞療法及藥物發現應用。
在該研究中，使用兩種不同的無整合重編程方法從BCD患者產生iPSC，一種採用仙台病毒，另一種採用附加型載體(episomal vector)。使用兩種不同類型的樣品，一種為皮膚樣品(皮膚纖維母細胞)，且另一種為血液樣品(周邊血液單核細胞(PBMC))。這兩種方法均可用於從皮膚、血液或其他樣品(諸如尿液及毛髮樣品)產生BCD患者特異性iPSC。
A.從皮膚樣品進行iPSC重編程
對BCD患者進行皮膚生檢，且從該生檢獲得人類纖維母細胞。然後使用仙台病毒將BCD患者特異性纖維母細胞重編程成iPS細胞株，仙台病毒為一種無痕的RNA病毒，其沒有改變宿主基因組之風險。其他載體，包括但不限於慢病毒，亦可用於iPS重編程，但具有整合至宿主細胞基因組中的風險。關於衍生自BCD患者之iPS細胞的照片，參見圖1。來自健康個體之纖維母細胞亦以相同方式重編程以產生野生型(或對照組)iPS細胞株。
為了產生iPSC，將5×104個纖維母細胞種植並培養在12孔盤中直至該等細胞發生附著(約12小時)並且有約70%-80%匯合。去除培養基，且用表現Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc之仙台病毒(CytoTuneTM-iPS 2.0 仙台重編程套組，A16517，Life Technologies)以5：5：3：5之MOI在500μl纖維母細胞培養基中轉染細胞。將細胞在37℃及5% CO2下培育過夜，之後去除含有病毒的培養基且用KO-DMEM培養基(剔除DMEM，15%剔除血清替代品、1份L-麩醯胺酸、1份非必需胺基酸、1份青黴素-鏈黴素、0.1mM β-巰基乙醇、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)10ng/ml)替代。將經轉染細胞培育約7天，每天更換培養基。
將經轉染細胞在PBS中洗滌，暴露於胰蛋白酶(例如，TrypLE Express，於37℃達4分鐘)，且再懸浮於含有10μM ROCK抑制劑的2ml KO-DMEM培養基中。然後將細胞種植在經絲裂黴素-C(mitomycin-C)處理之MEF飼養層上，並恢復至37℃及5% CO2。24小時後及之後的每一天，去除培養基並用KO-DMEM培養基(不含ROCK抑制劑)替代。繼代後7-14天可見集落。用含有10μM ROCK抑制劑之KO-DMEM培養基簡單處理後，將每個iPS集落顯微切割成約100-150個細胞的塊，然後在KO-DMEM培養基中在37℃及5% CO2下再培養一週。
iPSC特徵化是使用多能標記物之第一抗體來進行：OCT4 Santa Cruz sc-9081兔poly、SOX2 R&D Systems 245610小鼠IgG、TRA-1-60 Millipore(Chemicon)MAB4381小鼠IgM、SSEA4 Millipore(Chemicon)MAB4304小鼠IgG、Nanog R&D Systems AF1997山羊poly。通常，為了使用標記物進行特徵化，將細胞洗滌，阻斷(例如，用3%血清及0.1% Triton X)，暴露於第一抗體(1：200)並在室溫下培育2-3小時。再次洗滌細胞，將其暴露於第二抗體並在室溫下培育60分鐘。然後對細胞進行核複染(例如，在PBST中使用1：10000 Dapi)。
關於由BCD患者之纖維母細胞產生之iPSC及藉由Oct-4、Sox-2、SSEA-4、Nanog及Tra-1-60標記物達成之特徵化，參見圖1(a)。
B.從血液樣品進行iPSC重編程
除了皮膚生檢樣品之外，亦由BCD患者及健康對照組之血液樣品產生iPSC。使用附加型方法，由周邊血液單核細胞(PBMC)產生iPSC。方案描述如下。
T細胞活化：
a)解凍冷凍的PBMC，並使用戴諾磁珠(Dynabeads)(人類T活化因子，CD3/CD28，Thermo Fisher，目錄號11132D)根據製造商之方案對約50萬個活細胞進行T細胞活化。
b)然後使活化的T細胞在血球培養基中擴增10-14天。
重編程：
a)為了產生iPSC株，使用Neon轉染系統(目錄號MPK10096，Invitrogen)根據製造商之說明書將活化的T細胞與戴諾磁珠解離並用附加型iPSC重編程載體 (Episomal iPSC Reprogramming Vectors，目錄號A14703，Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)電穿孔。
b)將兩組經電穿孔之細胞種植於兩組35mm培養皿上，這兩組培養皿經過CF1 MEF飼養器(目錄號ASF-1213，Applied StemCell,Milpitas,CA,USA)預培養。每天用人類iPSC生長培養基飼養細胞。
c)2-3週後，挑取人類ESC樣iPSC集落，並將其轉移至塗有基質膠(matri-gel)之24孔盤進行擴增。
d)然後使患者特異性人類iPSC株在人類iPSC無飼養細胞生長培養基(mTeSRTM1，目錄號05850，StemCell Technologies Inc.,Vancouver,Canada)中於基質膠(Matrigel)(Corning目錄號354277)上生長及繼代，再繼代2-3次，直至獲得足夠的細胞數目，然後冷凍保存。
鹼性磷酸酶：
a)關於鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)染色，將iPSC固定，然後用鹼性磷酸酶染色溶液(萘酚/固紅紫，Sigma)染色。
b)使用Olympus顯微鏡(IX51，Olympus,Tokyo,Japan)捕獲細胞影像。
關於由BCD患者及健康對照組之血液樣品的周邊血液單核細胞(PBMC)產生的iPSC的相位差影像及AP染色結果，參見圖1(b)。
關於由BCD患者衍生之iPS核型影像，參見圖1(c)，該圖顯示明顯正常的人類核型。
實例2-BCD患者之iPSC分化成視網膜色素上皮(RPE)細胞
BCD患者及健康對照組之所有iPSC株的iPSC分化皆始於第3至6代。關於分化，前14天在經過1：50稀釋之基質膠(CORNING,356230)預處理的6孔培養皿(Costar,Corning,Corning,NY)中之分化培養基中培養iPS集落至匯合(confluence)，該分化培養基由剔除(KO)DMEM(Thermo Fisher Scientific，10829018)、15% KO血清替代品(Thermo Fisher Scientific，10829028)、1%非必需胺基酸(Thermo Fisher Scientific，11140050)、2mmol/L麩醯胺酸(Thermo Fisher Scientific，35050061)、50U/ml青黴素-鏈黴素(Thermo Fisher Scientific，10378016)及10mmol/L菸醯胺(Sigma-Aldrich，N0636)組成。在分化之第15天至第28天期間，給分化培養基補充100ng/ml人類活化素-A(PeproTech，120-14)。從第29天起，去除活化素-A，直至分化完成。8-10週後，形成呈現顏色的簇，手動挑取該等簇並將其種植於塗有基質膠之培養皿上。將那些細胞維持在以MEM(α修飾，Sigma-Aldrich，M-4526)為基礎的RPE培養基中，該培養基含有N1補充劑(每500ml培養基5ml)、牛磺酸(每500ml培養基125mg)、氫化可體松(Hydrocortisone)(每500ml培養基10μg)、三碘甲狀腺胺酸(Triiodo-thyronin)(每500ml培養基0.0065μg)(皆來自Sigma-Aldrich)、2mmol/L麩醯胺酸、50 U/ml青黴素-鏈黴素、1%非必需胺基酸及5%胎牛血清(皆來自GIBCO-BRL)。將細胞再培養6-8週，使其形成功能性單層用於功能分析。
在光學顯微鏡下觀察從BCD患者之iPSC分化的RPE細胞，看到不同的RPE色素及六角形細胞形狀(參見圖2)。除形態差異外，來自BCD患者之由iPS衍生的RPE細胞亦藉由RPE特異性標記物RPE65、CRALBP及MITF的存在來驗證。關於BCD患者之iPS-RPE細胞的RPE標記物結果，參見圖2(b)，該圖顯示RPE特異性標記物RPE65、CRALBP及MITF之存在。
可以使用多種方案將iPSC分化成RPE細胞。本文中所描述之RPE分化方案為擴展方案，其通常需要超過3個月。其他方案所需時間較少，例如少於2個月。雖然較短方案與擴展方案均能將iPSC分化成RPE細胞，但是在由不同方案產生之iPSC-RPE細胞中腫瘤發生的風險方面可能存在差異。與iPSC分化相關的腫瘤發生的風險歸因於在方案結束時一部分iPS細胞保持未分化或未完全分化，並且擴展方案可能有助於不形成腫瘤，因為iPSC完全分化成了成熟的RPE細胞。長期方案用於確保為生化分析及其他分析及功能研究而產生的iPS-RPE細胞株的純度，並支持iPSC-RPE細胞用於細胞療法的安全性，細胞療法包括但不限於自體移植。
實例3-BCD細胞模式之生化分析、細胞活力分析及其他分析以及CYP4V2功能研究
脂質分析：
先前關於BCD及CYP4V2酶功能之研究集中在脂肪酸上。在此研究中，使用更多的脂質分析來分析BCD疾病模式中之生化異常/表型並分析CYP4V2蛋白質之生化功能，該等脂質分析不僅包括脂肪酸，而且包括神經醯胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神經鞘胺醇及二氫鞘胺醇(SOSA)。
游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)、神經醯胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神經鞘胺醇及二氫鞘胺醇(SOSA)之生化分析在哥倫比亞大學(Columbia University)(New York,NY,USA)之生物標記物核心實驗室(Biomarkers Core Laboratory)基於其相關分析及方案而進行。
游離脂肪酸(FFA)、神經醯胺、神經鞘胺醇及二氫鞘胺醇藉由使用氯仿：甲醇來提取。簡言之，將約100萬個iPS-RPE細胞在150μL水中均質化。將100μL勻漿與含有內標(棕櫚酸-D31、C12神經醯胺、C25神經醯胺、C17神經鞘胺醇、C17二氫鞘胺醇)的3mL氯仿：甲醇(v：v=2：1)混合。將樣品充分渦旋並添加0.5mL水以進行相分離。將混合物再次渦旋並在4℃下以3,000g離心10分鐘。使用巴斯德吸管(Pasteur pipette)將下層有機相轉移至另一個乾淨的玻璃管中。向殘留的水相中添加2ml氯仿，然後渦旋混合並再次離心以提取任何剩餘的脂質。合併下層有機相且在氮氣下在37℃下蒸發。將所提取的脂質在50μl甲醇：乙睛(v：v=1：1)中重構，並轉移至LC 自動進樣器小瓶用於注射。鞘磷脂與其他脂質一樣，亦藉由氯仿：甲醇提取，但僅放置2μL細胞勻漿用於鞘磷脂的樣品製備。所有分析皆在Waters Xevo TQ MS ACQUITY UPLC系統(Waters,Milford,MA,USA)上進行。用100mm Waters ACQUITY UPLC HSS C18管柱洗提FFA。神經醯胺、神經鞘胺醇、二氫鞘胺醇、鞘磷脂在100mm Waters ACQUITY UPLC BEH苯基管柱上分離。FFA藉由使用陰性SIR方法監測，而其他脂質藉由陽性MRM採集來監測。
生化分析中所測試之化合物的列表提供於下表2中。購買某些化合物用作此研究中之標準品(如表2中所註釋，Nu-Chek：Nu-Chek Prep,Inc.,Elysian,MN,USA；Cayman：Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI,USA)。其他化合物使用可在哥倫比亞大學(New York,NY,USA)之生物標記物核心實驗室獲得的現有標準品。所有FFA皆由單一MS檢測，而其他類型的化合物藉由MS/MS檢測。
Figure 107126585-A0305-02-0193-3
Figure 107126585-A0305-02-0194-5
Figure 107126585-A0305-02-0195-6
羥基-脂肪酸分析：
此外，使用LC-MS/MS來檢測iPS-RPE細胞中之羥基-脂肪酸，包括16-HEPE、17-HEPE、18-HEPE、19-HEPE、20-HEPE、17-HDHA、18-HDHA、19-HDHA、20-HDHA、21-HDHA、22-HDHA、19(20)-EpDPA(正式名稱：(±)19,20-環氧-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-二十二碳五烯酸，又名(±)19,20 EDP、(±)19,20-環氧二十二碳五烯酸、(±)19,20-環氧DPA、(±)19,20-EpDPE)及19(20)-DiHDPA(正式名稱：(±)19,20-二羥基-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z-二十二碳五烯酸，又名：(±)19,20-DiHDoPE)。相應地，HDHA化合物為DHA之羥基代謝物且HEPE化合物為EPA之羥基代謝物。19(20)-EpDPA為DHA環氧化酶代謝物，經由DHA之ω-3雙鍵之環氧化衍生而來。19(20)-DiHDPA亦為DHA之代謝物。DHA為對腦及視網膜而言重要的脂肪酸且為最豐富的ω-3脂肪酸。先前的研究指出，CYP4V2為ω-3脂肪酸的羥化酶，尤其是DHA。
材料：羥基-脂肪酸標準品(±)18-HEPE(商品編號32840)、(±)20-HDHA(商品編號33750)、(±)19(20)-EpDPA(商品編號10175)及(±)19(20)-DiHDPA(商品編號10007001)購自Cayman Chemical Company(Ann Arbor,MI,USA)。內標氘化棕櫚酸(C16-D31脂肪酸)購自C/D/N Isotopes Inc.(#D-2002,Quebec,Canada)。
應理解，除了上文所描述之LC-MS或LC-MS/MS方法之外，該研究中所測試之化學物種及化合物亦可藉由使用其他方法來檢測及/或定量。舉例而言，對於具有甲基化預處理的FFA，存在GC-MS或GC-MS/MS方法。對於Cer及SM，可以使用FIA-MS/MS或GC-MS/MS。
細胞活力分析：
暴露藍光：將iPS-RPE細胞接種於3.5cm培養皿及4孔室培養皿中。2個月後，使其等在含有10μg/ml葡萄糖之PBS(+)中以1.5mW/cm2暴露於430±20nm(藍)光1小時。所有細胞株使用相同接種密度。在暴露藍光之後，用新鮮的RPE培養基飼養經處理細胞且使該等細胞在5% CO2及37℃之培養箱中恢復過夜。
除了1小時外，亦可使用更短或更長的光曝露持續時間，例如不曝露、曝露30分鐘、45分鐘、75分鐘、90分鐘或120分鐘等。同樣地，亦可暴露於不同波長或較寬光譜之光。此外，可以使用不同培養天數(例如，在RPE培養物中2個月、3個月、4個月、5個月或6個月)的iPS-RPE樣品，例如以研究衰老的影響。
細胞活力分析：活/健康細胞用細胞滲透染料鈣黃綠素AM(Thermo Fisher Scientific，目錄號：C3099，USA)標記，最終濃度為3μmol/ml PBS(+)(每個3.5cm培養皿1ml，或每個室200μl)，且死/病細胞用碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)(Thermo Fisher Scientific，目錄號：P3566，USA)標記，最終濃度為2μg/ml PBS(+)(每個3.5cm培養皿1ml，或每個室200μl)，在室溫下達1小時。由於PI為結合DNA的且對活細胞不具有滲透性，因此其通常用於檢測群體中之死細胞。然後在用PBS(-)洗滌之後，觀測細胞螢光位準，並藉由倒置螢光顯微鏡(Nikon Eclipse Ts2R)以20倍放大率拍攝照片。在用ImageJ(Fiji)處理照片後，計算死/活細胞 比率。
除了生化分析及細胞活力測試之外，亦可以在BCD患者iPS-RPE細胞中進行RPE功能測試，諸如吞噬活性、跨上皮電阻。
CYP4V2表現：
進行實驗以檢測及比較對照組及BCD患者特異性iPS-RPE細胞中的CYP4V2表現位準。可以藉由抗CYP4V2抗體(西方墨點法)或藉由定量PCR來評定細胞株中的CYP4V2表現。
CYP4V2西方墨點法：將來自每個iPS-RPE樣品的45μg全細胞蛋白質在7.5%十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS page)凝膠上跑膠，然後濕式轉移至膜上。將膜用PBST中之5% BSA在室溫下阻斷1小時，然後與第一抗體(產生於兔中之抗CYP4V2，Sigma Aldrich目錄號：SAB 1410565，USA)一起以1：1000之濃度在5% BSA中在4℃下培育過夜。用PBST洗滌3×10分鐘。然後將膜與第二抗體山羊抗兔IgG HRP(Santa Cruz目錄號：sc-2004，USA)一起以1：3000之濃度在5% BSA中在4℃下培育4小時。用PBST最後洗滌3×10分鐘。GAPDH用作上樣對照組(loading control)。
CYP4V2西方墨點法在對照組之iPS-RPE樣品中檢測到CYP4V2蛋白質表現，但是在BCD患者iPS-RPE樣品中未檢測到該表現。在用AAV.CYP4V2處理後，在BCD患者特異性iPS-RPE樣品中檢測到 CYP4V2蛋白質。
即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)及相對mRNA定量：收集健康對照組(WT)之、BCD患者之、BCD患者之經AAV.CYP4V2處理之iPS-RPE樣品，且將其用TRIZOL試劑(Invitrogen)溶解。根據製造商之說明書分離總RNA。然後進行DNase I(Invitrogen)處理以防止基因組DNA污染。藉由Superscript III反轉錄套組進行反轉錄反應，且使用隨機六聚物(random hexamer)(Invitrogen)產生cDNA。使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(Fisher Scientific)以StepOne Real-time PCR系統(Invitrogen)進行Real-time PCR方法來定量基因表現位準(38個循環)。使用分別對CYP4V2外顯子7區域及CYP4V2op具有特異性的引子。使用肌動蛋白作為持家基因(housekeeping gene)。
結果：進行定量PCR以測試CYP4V2及CYP4V2op在iPS-RPE細胞樣品中之表現。CYP4V2及CYP4V2op之轉錄位準分別由患者樣品及對照組樣品標準化。對於CYP4V2，所有非患者對照組樣品中之CYP4V2表現位準相似，比患者樣品中之CYP4V2表現位準高幾百倍。在AAV.CYP4V2處理後，患者樣品CYP4V2表現位準增加超過100倍，達到與非患者對照組樣品相當的位準(圖3)。對於CYP4V2op，與未處理之樣品相比，所有經AAV處理之樣品的表現位準要高得多(圖4)。這些結果證明AAV載體能夠將CYP4V2 cDNA遞送至BCD 患者之iPS-RPE細胞中，並且表現匣能夠表現該基因。
實例4-BCD細胞模式中之表型及關於CYP4V2功能之發現
脂質測試結果：
為了確定BCD細胞模式(例如，BCD患者iPS-RPE細胞)中是否存在生化缺陷/異常(亦即表型)及存在哪些生化缺陷/異常(亦即表型)，使用實例3中所描述之生化分析來檢測及定量衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞中之脂肪酸、神經醯胺、鞘磷脂、神經鞘胺醇、二氫鞘胺醇及羥基-脂肪酸，與衍生自健康對照組之iPS-RPE細胞中的相比較。
測試前，如下收集細胞。將衍生自BCD患者之大約100萬個iPS-RPE細胞用PBS洗滌兩次，然後藉由塑料細胞鏟(cell lifter)與培養皿脫離並使用1ml移液管轉移至1.5ml微量離心管(Eppendorf tube)中。在測試前，將微量離心管放置在-80℃冰箱中。以相同方式收集健康對照組iPS-RPE細胞。生化分析結果顯示於下表3中：
Figure 107126585-A0305-02-0200-7
Figure 107126585-A0305-02-0201-108
表3之註腳：
WT：野生型對照組iPS-RPE。P1：患者1iPS-RPE。P2：患者2iPS-RPE。
患者未經處理及經AAV處理之樣品為培養日及選殖株匹配的。
P1 AAV2.op及P2 AAV2.op樣品用AAV2.CYP4V2op(1天，MOI：5×104 GC/細胞)處理且在處理後10天收集。P2 AAV2trip.op樣品用AAV2tri(Y-F).CYP4V2op(1天，MOI：5×104 GC/細胞)處理且在處理後10天收集。P2 AAV8.fv樣品用AAV8.CYP4V2fv(1天，MOI：2×105 GC/細胞)處理且在處理後10天收集。P2 scAAV1.op樣品用scAAV1.CYP4V2op(1天，MOI：2×105 GC/細胞)處理且在處理後4天收集。
結果顯示，BCD患者iPS-RPE細胞樣品具有與對照組不同的脂肪酸譜(fatty acid profile)。特定言之，BCD患者樣品具有比對照組高得多的DHA(22：6 n3)位準及omega-3(ω-3或n3)脂肪酸總位準(C18：3 n3 α、C20：5 n3 EPA、C22：6 n3 DHA及C22：5 n3 DPA之總量)。這證實了先前研究中所提出的CYP4V2影響ω-3脂肪酸代謝。
出人意料地，除了n3脂肪酸位準異常之外，BCD患者iPS-RPE細胞亦顯示較高位準的C20：4 n6(花生四烯酸或AA)。先前與BCD相關之研究中尚未報導過AA位準異常。
有趣的是，在測試BCD患者之血清中之脂肪酸位準的先前研究中，沒有發現n3脂肪酸(包括DHA)及n6脂肪酸(包括AA)之異常。BCD患者iPS-RPE細胞及血清之不同脂肪酸譜支持以下假設：CYP4V2之功能被 非視網膜或非RPE細胞中之其他CYP4酶取代，其中許多在其他器官及組織中與CYP4V2一起表現，只不過CYP4V2為唯一在RPE細胞中具有相對較高表現位準的CYP4酶。
除了脂肪酸之外，BCD患者iPS-RPE細胞亦可以具有在其他化合物或化合物類別中之表型。進行實驗以篩選其他化合物類別中的表型，該等化合物類別包括但不限於皮質類固醇、鞘脂及磷脂，包括鞘磷脂、神經醯胺、神經鞘胺醇及二氫鞘胺醇，以及脂質信號傳導中之表型。此外，在BCD患者之iPS-RPE細胞中進行同位素示蹤實驗及蛋白質體學分析(例如，基於質譜的蛋白質體學分析)。
此外，先前的研究發現，CYP4V2為ω-3脂肪酸(DHA及EPA)羥化酶。有趣的是，使用LC-MS/MS在健康對照組或BCD患者之iPS-RPE細胞中均未檢測到實例3中所描述之羥基-DHA或羥基-EPA。CYP4V2之酶功能可能在活細胞中與在先前研究中進行的活細胞外之化學反應中不同，或者羥基脂肪酸為在活細胞中快速轉化成其他化合物或其他形式的中間體，或者羥基脂肪酸處於痕量位準而只有在樣品含有非常大量的細胞時才能被檢測到。
細胞活力分析結果：
臨床上，BCD與RPE萎縮相關，RPE萎縮繼而引起光感受器死亡及視覺喪失。細胞活力分析(如上文 實例3中所描述)揭示了BCD患者之iPS-RPE細胞樣品中之RPE萎縮。關於對照組及BCD患者之iPS-RPE樣品之間的細胞活力比較，參見圖5及6(圖5-不暴露於藍光；圖6-在暴露於藍光1小時後)。
值得注意的是，這些影像揭示：
(1)在曝露光後，在衍生自BCD患者(P1及P2)之iPS-RPE樣品中顯示出比對照組(WT1及WT2)中高得多的顯著的細胞死亡位準(參見圖6)。舉例而言，P1 iPS-RPE之死/活細胞比率為20.87%，而WT2 iPS-RPE為3.0%。BCD之臨床表型RPE萎縮在BCD細胞模式中是明顯的。
(2)在BCD P1與P2 iPS-RPE樣品之間觀察到不同位準的RPE萎縮。P1 iPS-RPE顯示比P2 iPS-RPE高的細胞死亡位準。
(3)即使無曝露藍光，BCD患者iPS-RPE樣品(P1)亦顯示出RPE萎縮(圖5)。
BCD患者之疾病發作年齡及進展相差很大。BCD發作的範圍為從早期十幾歲到生命的第3個十年或甚至超過第3個十年；導致在生命的第3個十年到第6個十年期間出現法定盲。此外，具有相同CYP4V2突變的BCD同胞患者(sibling patients)可能在疾病發作年齡及進展方面有實質差異。以前沒有解釋過這些差異。不同BCD患者之iPS-RPE樣品之間RPE萎縮位準的差異在細胞層級上提供了關於BCD患者中疾病發作及進展之差異 的導引。
在此研究之BCD細胞模式中發現了多種表型(分子層級表型，諸如生化(例如，脂質)異常，及細胞層級表型，諸如細胞活力)，包括BCD之臨床表型(亦即RPE萎縮)。
實例5-使用來自BCD個體之iPS及iPS-RPE細胞篩選候選藥物及劑量範圍，研究BCD及CYP4V2功能及細胞療法，並評定患者特異性反應
作為BCD疾病人類細胞模式，來自BCD患者之iPS及iPS-RPE細胞具有廣泛範圍的應用，包括但不限於研究BCD及CYP4V2功能(例如參見以上實例3及4)；篩選用於BCD及相關疾病之候選藥物及劑量範圍(參見本文中之實例)。
在本文中之實例中詳細描述使用BCD細胞模式(例如，BCD患者特異性iPS-RPE細胞株或具有人工產生之CYP4V2突變的iPS-RPE細胞株)之方法及實例，該等實例與BCD細胞模式在基因療法及細胞療法中之用途相關。除了測試基因療法及作為細胞療法之細胞基礎之外，此BCD細胞模式亦可用於以與本文中之實例中詳細描述的方式相同或相似的方式篩選以下各者並測試其功效及/或安全性：用於治療BCD、IRD或RP之其他治療劑(例如，候選藥物)及其劑量、製劑及載體(病毒載體或非病毒載體)或裝置或遞送機制。
在使用BCD細胞模式時，治療劑之功效可 以藉由比較在以此治療劑治療前及治療後以上實例3及4及本文中之其他實例中所描述之各種物種中之化合物位準及RPE萎縮來評定，並評定這些化合物之位準是否異常及在治療後BCD細胞模式中之RPE萎縮是否改善。同樣地，可以使用BCD細胞模式比較治療劑之不同劑量、製劑(例如，化合物製劑、活性醫藥成分或用於基因療法之載體類型及/或殼體或用於基因編輯之載體類型)或關鍵構建體(例如，基因療法表現匣中之啟動子或其他調節序列)。此外，BCD細胞模式亦可用於測試醫療裝置或方法之功效，包括但不限於在將治療劑遞送至眼細胞方面或在改善轉導或轉染效率方面的功效。將被理解的是，經處理細胞可以與未處理細胞或在暴露於化合物之前的相同細胞進行比較。可用不同劑量確定有效劑量範圍(以每個細胞、每100萬個細胞或每50萬個細胞等測量)。與健康對照組之RPE或iPS-RPE細胞中的數據相比，與BCD患者之iPS-RPE細胞(治療後對比未治療)中之在以上實例3及4中所述之不同脂肪酸化合物及其他化合物之位準及RPE萎縮相關的數據可用於評定治療效果及有效劑量範圍。
此外，可使用BCD患者特異性iPS細胞株、iPS-RPE細胞株及其他由iPS衍生之細胞株來評定此患者對治療劑、劑量或裝置的個體反應。患者特異性iPS細胞、iPS-RPE細胞及其他由iPS衍生之細胞具有特異性針對每個患者的性狀，包括但不限於免疫反應(例如，細胞內免疫、RPE免疫)、基因型(例如，患者之間可能導致不同反 應的不同突變)。這種應用可用於開發及篩選針對相同疾病的不同患者的個體化治療劑(例如，不同的AAV載體血清型或殼體突變)或個人化最佳劑量。此方法可用於其他疾病，包括但不限於其他眼部疾病。
因為BCD患者特異性iPS-RPE在BCD患者中顯示出個體差異，其可用於評定個體化最佳劑量並開發個人化用藥。例如，如在下面的基因療法實例中所見，在相同的1×10e5 MOI劑量下，AAV2.CYP4V2op在P1及P2之iPS-RPE之間對RPE萎縮達成不同的拯救位準(亦即不同的功效位準)。此為BCD細胞模式優於動物模式之優勢。
BCD患者特異性iPS-RPE細胞(亦即BCD細胞模式)可用於藉由以下來評定及建議用於體內治療之治療有效劑量：在BCD細胞模式中確定的體外最佳劑量位準(例如，基因療法之MOI)乘以所估計的體內靶向治療之眼細胞的數目，由此推導出基因療法載體(例如，GC或gp)之劑量位準。此載體劑量位準係藉由乘數來調整(例如，1至10(例如，對於視網膜下注射，1至5；或對於玻璃體內注射，5至10)；影響待應用之乘數的其他因素包括：所靶向細胞之區域大小或數目，及待治療之個體(例如，待治療個體之年齡、體重、疾病及病狀之發展階段及潛在的免疫反應(亦即預先存在的NAb)；靶向治療之細胞的位置及密度；以及正使用的AAV.CYP4V2載體之轉導效率及拯救功效)，從而提出供用於體內之治療有效劑量範 圍，其可以藉由臨床試驗來確認或改良。該方法亦可用於評定個體患者之個人化最佳劑量。
實例6-具有人工產生之CYP4V2突變的BCD細胞模式
因為BCD為一種罕見疾病，所以很難獲得患者樣品。為了解決這個困難，可以藉由使用諸如CRISPR之基因編輯技術來產生BCD細胞模式以在非BCD患者細胞中之CYP4V2基因中建立人工突變，該非BCD患者細胞諸如來自無BCD之個體的胚胎幹(ES)細胞株或iPS細胞。
舉例而言，如本文實例中所顯示，sgRNA 1、sgRNA 2、sgRNA 3、sgRNA 4或sgRNA 5(關於sg$NA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4及sgRNA5中之每一者的原型間隔區元件序列，分別參見SEQ ID NO：48至52；關於IVT sgRNA的額外序列，參見SEQ ID NO：55及59)與SpCas9蛋白質組合使用，以在BCD患者之基因組DNA之含有c.802-8_810del17insGC突變的CYP4V2基因區域中引起裂解，該突變為BCD患者中最常見的CYP4V2突變。其中，sgRNA 3、sgRNA 4及sgRNA 5對c.802-8_810del17insGC突變序列沒有特異性，且因此會在健康細胞(例如，沒有CYP4V2突變之ES或iPSC)之CYP4V2基因中引起雙股DNA斷裂(DSB)。特定言之，在轉染後，sgRNA4及Cas9會在CYP4V2基因之外顯子7中引起DSB，其可導致當DNA在細胞中經由非同源末 端連接(NHEJ)修復時，在外顯子7中(一個或兩個等位基因中)產生突變，例如由NHEJ產生的插入缺失錯誤(indel error)會引起框移突變。因此，一些細胞具有人工產生的CYP4V2突變且可以用作BCD細胞疾病模式或用於產生BCD細胞模式(例如將ES或iPS細胞分化成RPE細胞以產生含有CYP4V2突變之ES-RPE或iPS-RPE細胞)。同樣地，可以使用用以在CYP4V2基因之不同區域引起DSB的兩組gRNA設計以在CYP4V2基因內產生大缺失或剔除突變或剔除細胞中之整個CYP4V2基因，從而產生含有CYP4V2突變之BCD細胞模式。關於如何使用CRISPR系統來切割及/或校正目標序列及如何驗證結果的更詳細的論述提供於實例及其中的揭示內容中。
這些具有人工產生之CYP4V2突變的BCD細胞模式可用於在研究BCD及CYP4V2功能時以及在如本文中所論述之相關應用中模擬BCD患者特異性細胞模式，相關應用包括但不限於測試及比較候選藥物，確定劑量範圍及測試醫療裝置或遞送方法。
同一方法亦可用於產生針對眼部疾病或其他疾病之具有人工產生之突變的細胞疾病模式，其他疾病包括與表4中所闡述之一或多個基因中之突變或遺傳缺陷相關的疾病。
實例7-用於眼部疾病之同基因型對照組的產生及使用
突變經校正的同基因型患者特異性iPS細胞 株及/或衍生自其的其他細胞株(例如，iPS-RPE細胞、iPS-RPC、iPS-CEC、iPS-CE細胞或其他iPS-眼細胞)可以作為同基因型對照組用於研究特定突變或有缺陷的基因的疾病及/或影響。衍生自ES或另一個體之習知對照組(例如，細胞株，例如ES-RPR或iPS-RPE細胞株)具有個體差異，除了疾病相關基因的差異之外，亦包括與患者的遺傳差異。此實例提供一種用於消除對照組與由此產生的「背景噪聲」之間的個體差異的方法。其包含產生並使用來自患者之突變經校正的同基因型對照組，將其與同一患者之攜帶該突變之細胞株相比較。由於衍生自同一患者之患者特異性疾病模式及突變經校正的同基因型對照組沒有任何個體差異，因此可以對其進行分析及比較，以精確鑑定與患者之突變或有缺陷的基因相關的表型、生化異常以及其他結構缺陷及功能缺陷。突變經校正的同基因型對照組可以藉由使用基因編輯技術產生，基因編輯技術包括但不限於CRISPR、ZFN及TALEN。關於如何使用CRISPR基因編輯來校正BCD患者中之最常見突變c.802-8_810del17insGC突變，從而從BCD患者產生同基因型對照組的具體實例提供於本文實例中。同一方法亦可用於產生其他眼部疾病之同基因型對照組。同基因型對照組具有優於習知對照組之顯著優勢且在研究具有隱蔽表型(例如，年齡相關性黃斑退化(AMD))之眼部疾病時是必不可少的。此外，同基因型對照組可用於比較及鑑定多種遺傳風險因素、突變及/或多個基因在眼部疾病中的影響差 異，其係藉由產生具有遺傳風險因素、突變或經校正基因中之每一者的同基因型對照組並將此同基因型對照組與疾病模式進行比較，以確定相關風險因素、突變或基因在眼部疾病及其他疾病中的影響，其他疾病包括與表4中所闡述之一或多個基因中之突變或遺傳缺陷相關的疾病。
可以比較同基因型對照組與患者特異性細胞疾病模式來鑑定與遺傳突變及/或相關的有缺陷的蛋白質相關的表型、生化異常及其他結構缺陷及功能缺陷。關於如何使用生物分析來鑑定患者細胞株與對照組之間的生化異常/表型的特定非限制性實例及論述在本文中提供於以上實例3及4中，包括但不限於脂質體學(lipidomics)、蛋白質體學(proteomics)及同位素示蹤。
有關BCD人類細胞疾病模式之論述
鑒於BCD為罕見疾病，經由生檢從BCD患者獲得顯示出疾病的人類RPE細胞是不切實際的。缺乏可行的BCD人類疾病模式使得先前對BCD的研究僅限於使用非BCD致病細胞(例如，纖維母細胞及淋巴細胞，其並非眼睛的部分)及來自BCD患者之血清作為研究對象。這些研究的結果集中在脂肪酸合成代謝上。
在本文中所描述之研究中，成功體外產生了衍生自BCD患者之iPS細胞株並用其產生攜帶BCD疾病表型的患者特異性BCD疾病RPE細胞。直接在BCD患者特異性iPS-RPE細胞中鑑定BCD表型，該BCD患者特異性iPS-RPE細胞為受BCD影響的原代細胞類型。在 本研究之前，尚不清楚iPS細胞株及iPS-RPE細胞株是否能夠成功產生，部分原因在於與BCD相關之脂肪酸合成代謝。
生化測試顯示，來自BCD患者之iPS-RPE細胞相比於健康對照組之iPS-RPE細胞具有異常的脂肪酸位準，包括先前的BCD研究中尚未報導的那些。BCD疾病特異性iPS-RPE細胞之體外表型為由CYP4V2調節之途徑及BCD之發病機制提供了更多的見解，並為BCD之發病機制及CYP4V2蛋白質之功能提供了寶貴的見解，並進一步支持使用來自BCD患者之iPS-RPE細胞株作為可行且穩健的BCD人類疾病模式。
來自BCD患者之iPS細胞株、iPS-RPE細胞株及其他iPS-眼細胞株具有其他應用，諸如用於藥物篩選、開發新穎的治療劑或測定劑量範圍，以及用於細胞療法中。
除了BCD患者特異性iPS、iPS-RPE及其他iPS-眼細胞株之外，亦可經由基因編輯在衍生自非BCD個體之ES細胞或iPS細胞的其他細胞株中人工產生病理性CYP4V2突變，而開發出BCD人類疾病細胞模式，該其他細胞株包括但不限於ES細胞株、iPS細胞株及RPE細胞株。
此外，提供用於產生眼部疾病之同基因型對照組的方法。同基因型對照組與患者特異性疾病模式沒有個體差異。因此，同基因型對照組在研究眼部疾病方面有 優於習知對照組的優勢。
CYP4V2基因療法
實例8-編碼人類CYP4V2蛋白質及功能性CYP4V2蛋白質之cDNA
在該研究中使用三個cDNA。具有SEQ ID NO：1中所示之序列的cDNA(本文中稱為CYP4V2st)及具有SEQ ID NO：2中所示之序列的cDNA(本文中稱為CYP4V2op)均編碼人類CYP4V2蛋白質(胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：4中，NP_997235.3)。具有SEQ ID NO：3中所示之序列的cDNA(本文中稱為CYP4V2fv)編碼人類CYP4V2蛋白質之功能變異體(胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：5中)。
SEQ ID NO：5為人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之功能變異體的胺基酸序列。這兩種蛋白質(SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5)均為如本文中所定義之功能性CYP4V2蛋白質。SEQ ID NO：5中所示之功能性CYP4V2蛋白質與SEQ ID NO：4中所示之人類CYP4V2蛋白質具有一個胺基酸改變。SEQ ID NO：3中所示之編碼功能性CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：5)的cDNA與SEQ ID NO：1中所示之編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)的cDNA具有兩個核苷酸差異。SEQ ID NO：2中所示之密碼子最佳化的cDNA及SEQ ID NO：1中所示之cDNA均編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)且共用77%之序列同一性。
本文中提供編碼SEQ ID NO：5之功能性CYP4V2蛋白質的密碼子最佳化的cDNA(CYP4V2fv-op)，其包含CYP4V2op之cDNA序列(SEQ ID NO：2)，但CYP4V2 fv-op序列在SEQ ID NO：1與3之間保留有一個或兩個核苷酸差異。
除了CYP4V2op及CYP4V2fv-op之外，其他編碼人類CYP4V2蛋白質或功能性CYP4V2蛋白質(例如，SEQ ID NO：4至29中之任一者)的密碼子最佳化的cDNA或核酸序列可以藉由本發明中所描述之方法產生。編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)或功能性CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：5，或SEQ ID No：6至29中之任一者)的密碼子最佳化的核酸分子可以在BCD患者特異性iPS-RPE細胞株(或具有人工產生之CYP4V2突變的RPE細胞)中測試以測定及/或確認其表現效率及治療BCD之拯救功能。該等測試包括但不限於蛋白質表現(例如，對其所編碼之功能性CYP4V2蛋白質具有特異性的西方墨點法)、用以檢測相關基因表現的PCR及/或本文中所提供之組成物(例如，在表現匣及/或載體中)及方法拯救BCD患者特異性iPS-RPE細胞株中之生化異常及RPE萎縮的功效。
SEQ ID NO：1(CYP4V2st cDNA，1578bp)
Figure 107126585-A0305-02-0215-9
SEQ ID NO：2(CYP4V2op cDNA，1578bp)
Figure 107126585-A0305-02-0215-10
SEQ ID NO：3(CYP4V2fv cDNA，1578bp)
Figure 107126585-A0305-02-0216-11
SEQ ID NO：4(人類CYP4V2蛋白質，NP_997235.3，525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0216-12
SEQ ID NO：5(人類CYP4V2蛋白質之功能變異體；525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0216-13
SEQ ID NO：6(CYP4V2之不含跨膜域的片段；490 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0217-14
實例9-設計用於CYP4V2基因療法之有效表現匣及遞送載體
如本文中所描述，表現匣及遞送載體包含各種元件。根據不同的設計，結果會有很大差異。鑒於每個重要元件都有大量選項，包括但不限於下面所列出者及其多種組合，故為了CYP4V2基因療法之成功，需要經過深思熟慮之設計的有效表現匣及遞送載體。此外，設計方法需要考慮疾病表型及特徵(例如，靶向治療之細胞/組織之類型)及安全性(例如，毒性、免疫反應)。最後，需要在合理的疾病模式中測試及驗證設計。
(a)遞送載體之類型；(b)載體血清型及殼體設計/選擇；(c)額外載體設計，例如ssAAV對比scAAV；(d)cDNA設計；(e)啟動子設計/選擇；(f)polyA信號設計/選擇；及(g)任何其他調節序列，例如強化子，或接合/連接序列。
關於(a)，選擇病毒載體以在目標細胞(例如，人類RPE)中達成高轉導效率。在各種類型的病毒載體中，選擇AAV載體，因為其安全譜及CYP4V2編碼核 酸(例如，CYP4V2 cDNA)之大小符合AAV載體之包裝限制。具有較大包裝限制之載體，例如HSV載體、慢病毒載體、桿狀病毒或腺病毒載體，亦可用於CYP4V2基因療法。除了病毒載體之外，非病毒載體，例如奈米粒子，包括但不限於脂質體奈米粒子、固體脂質奈米粒子、脂質體魚精蛋白/DNA脂質複合物(LPD)，亦可用於CYP4V2基因療法。
關於(b)，因為RPE細胞為針對BCD之CYP4V2基因療法中靶向治療的原代細胞類型，所以在RPE細胞中具有足夠的轉導效率的AAV血清型較佳。此外，考慮以下因素。因為在各種人類組織及器官中，例如在心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰臟、視網膜、RPE、角膜及淋巴細胞中，皆能廣泛地觀測到CYP4V2之表現，且除了RPE之外，BCD亦影響脈絡膜、光感受器且在一些患者中亦影響角膜，且先前已報導過BCD患者之皮膚纖維母細胞、淋巴細胞及血清中之異常，除了在RPE細胞中具有良好轉導效率的AAV血清型及殼體結構之外，亦可以設計及/或選擇不會將AAV轉導僅限制在RPE細胞中，反而亦能轉導其他細胞/組織(例如光感受器、脈絡膜及/或角膜)的AAV血清型及殼體結構。因此，廣泛範圍的AAV血清型及殼體結構為合適的且可以使用。選擇AAV2、AAV5、AAV8、AAV1、AAV9及殼體突變型AAV載體(AAV2(Y444F+Y500F+Y730F))用於研究。除了轉導效率之外，另一個考慮因素為預先存在 的針對一般群體中之不同AAV血清型的NAB以及患者之間的其他潛在個體差異(包括但不限於其他類型的免疫反應(例如，細胞內免疫或RPE免疫)或由於基因型的差異(例如，不同的突變))。在此設計中，使用並測試了多種AAV類型，包括與NAB具有低交叉反應性以降低潛在免疫反應並最大化對不同患者的治療效果的AAV類型。
關於(c)，因為全長CYP4V2 cDNA為1578bp(包括起始密碼子及終止密碼子)，所以ssAAV及scAAV設計均可以用於CYP4V2基因療法中。ssAAV及scAAV設計各自有其自身的優缺點，如本文中所描述。相比於ssAAV，scAAV設計提供快速表現及較高的DNA穩定性。然而，其包裝限制(約2.4-2.5kb)限制了較大尺寸且可能活性更大的調節序列(例如，啟動子、PolyA信號)的使用。此外，視所用啟動子之大小而定，scAAV設計可能需要縮短或不需要一些視情況選用之調節序列(例如，強化子)。ssAAV及scAAV載體均係為了用於CYP4V2基因療法中而設計並產生的。產生各種假型化AAV，其含有AAV2基因組(例如，AAV2 ITR(SEQ ID NO：42及43))及來自以上在(b)中所描述之AAV類型中之每一者的殼體。關於scAAV，兩個AAV2 ITR中之一者為截短/突變的(SEQ ID NO：44)。
關於(d)，如本文中所論述，存在多種功能性CYP4V2蛋白質。此外，多個核酸序列能編碼同一種蛋白質。在該研究中產生三(3)個cDNA：第一個(SEQ ID NO： 1，稱為CYP4V2st)編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)，第二個為編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之經過密碼子最佳化的cDNA(SEQ ID NO：2，稱為CYP4V2op)，且第三個(SEQ ID NO：3，稱為CYP4V2fv)編碼人類CYP4V2蛋白質之功能變異體(SEQ ID NO：5)。在cDNA起始密碼子之前插入科札克序列(示範性序列顯示於SEQ ID NO：37或38中)。
關於(e)，類似於(b)中之基本原理，啟動子需要很好地起作用來驅動目標細胞(例如，當用於治療的目標細胞類型為RPE時，目標細胞為RPE細胞；當目標細胞類型為角膜細胞時，目標細胞為角膜細胞)中之表現。啟動子為基因療法載體之表現匣中之主要元件。最佳啟動子選擇能夠增強目標特異性及基因表現。視靶向治療之細胞或組織類型而定，CYP4V2基因療法中所用的啟動子可為組成型啟動子或細胞特異性啟動子(例如，對RPE細胞具有特異性的啟動子、對RPE及光感受器均具有特異性的啟動子、對RPE細胞及脈絡膜細胞具有特異性的啟動子、對RPE、光感受器及脈絡膜細胞具有特異性的啟動子、對角膜細胞具有特異性的啟動子、對RPE、光感受器、脈絡膜及角膜細胞具有特異性的啟動子或對眼細胞具有特異性的啟動子)。因為CYP4V2幾乎遍在地表現且BCD影響多種細胞類型(主要的細胞類型為RPE，其他細胞類型包括例如角膜、視網膜、淋巴細胞)，所以在此設計中選擇組成型啟動子來拓寬表現匣及遞送載體在多種組織及細胞類型中 之作用。關於ssAAV載體中所用的表現匣，使用強組成型啟動子，長度為~1.7kb之CAG啟動子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：32中)。CAG啟動子(亦稱為CBA、CAGGS或CB啟動子)為強合成啟動子。CAG啟動子由以下調節元件構成：(C)巨細胞病毒(CMV)早期強化子元件；(A)雞β-肌動蛋白基因之啟動子區域及第一外顯子，及來自雞β-肌動蛋白基因及兔β-球蛋白基因之嵌合內含子；及(G)兔β-球蛋白基因之剪接受體。使用CAG啟動子係因為其具有比CMV啟動子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：40中)更強且持續時間更久的活性，CMV啟動子為最常用於在哺乳動物細胞中驅動表現的組成型啟動子。關於scAAV載體中所用的表現匣，由於scAAV之包裝大小限制，因此使用短得多的組成型啟動子：延長因子1α短型(EFS)啟動子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：35中)。EFS啟動子為EF-1α啟動子(~1.2Kb，示範性序列顯示於SEQ ID NO：41中)的小型化版本。EF-1α啟動子為衍生自人類延長因子-1α(EF-1α)之組成型啟動子。EFS啟動子亦可用於ssAAV之表現匣設計中。除了CAG啟動子、CMV啟動子、EF1α啟動子及EFS啟動子之外，亦可以使用其他組成型啟動子，包括但不限於另一病毒啟動子，諸如CMV啟動子；CAG(又名CBA、CAGGS或CB啟動子)之衍生物或變異體，諸如smCBA啟動子、CBSB啟動子或CBh啟動子；另一β-肌動蛋白啟動子，諸如人類β肌動蛋白啟動子；EF-1α啟動子之衍生物或變異體；PGK啟動 子；UBC啟動子；GUSB啟動子；UCOE啟動子或本文中所描述之其他啟動子。此外，可以使用細胞特異性啟動子，包括但不限於本文中所描述之眼細胞特異性啟動子，例如VMD2(又名BEST1)啟動子或RPE65啟動子，用於驅動RPE中之表現。
關於(f)，ssAAV中所用的表現匣設計使用bGH polyA(示範性序列顯示於SEQ ID NO：34中)，且scAAV中所用的表現匣設計使用較短的polyA信號，小polyA(SPA)(示範性序列顯示於SEQ ID NO：36中)。SPA亦可用於ssAAV之表現匣中。亦可改為使用其他polyA信號(包括衍生物或變異體)，包括但不限於SV40 polyA信號、SV40晚期polyA信號(示範性序列顯示於SEQ ID NO：39中)或如本文中所描述之其他polyA信號，包括但不限於與上游強化子(USE)組合使用的polyA信號。
關於(g)，ssAAV中所用的表現匣使用WPRE強化子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：33中)。關於scAAV中所用的表現匣設計，鑒於大小限制，故不包括強化子。然而，應注意，在scAAV CYP4V2表現匣中，可能包括短長度強化子序列，例如含有WPRE之最小γ及α元件之經縮短的WPRE，與小尺寸啟動子及polyA信號組合。除WPRE之外，亦可使用如本文中所描述之其他強化子，諸如HPRE強化子或CTE強化子。
在一些情況下，CYP4V2表現匣包括啟動子 (例如，CAG(又名CBA、CAGGS、CB)啟動子、EF-1α啟動子、smCBA啟動子、CBh啟動子、EFS啟動子、人類β-肌動蛋白啟動子、CMV啟動子、VMD2啟動子或RPE65啟動子)、編碼功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列(例如，編碼人類CYP4V2蛋白質或其功能變異體或片段之cDNA)，視情況與強化子序列(例如，WPRE強化子、HPRE強化子或經縮短之WPRE或HPRE強化子)及polyA信號(例如，bGH polyA、SPA或SV40 PolyA，或其片段或衍生物，例如SV40晚期polyA)及其他調節序列(例如，科札克序列)連接。示範性序列參見SEQ ID NO：1-41。
應理解，(i)SEQ部分中所提供之各種調節序列之示範性序列在本質上為示範性的且這些調節序列存在能夠達成相同或形似功能的不同形式；及(ii)這些序列存在亦可使用的不同變異體、片段及/或衍生物，例如經截短之CAG啟動子、經縮短之WPRE強化子、SV40晚期polyA。
基於上文所描述之設計方法，產生了多種用於CYP4V2基因療法中之CYP4V2 cDNA、CYP4V2表現匣及rAAV載體，包括：(1)三個CYP4V2 cDNA，分別如SEQ ID NO：1、2及3中所示。CYP4V2st(SEQ ID NO：1)及CYP4V2op(SEQ ID NO2)均編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)。CYP4V2fv(SEQ ID NO：3)編碼人類CYP4V2蛋白 質之功能變異體(SEQ ID NO：5)；(2)兩個CYP4V2表現匣(CYP4V2表示編碼人類CYP4V2蛋白質或功能性CYP4V2蛋白質之核酸序列。示意圖參見圖7)：(i)CAG-CYP4V2-WPRE-bGH polyA(ii)EFS-CYP4V2-SPA(3)將以上所提及之CYP4V2 cDNA及CYP4V2表現匣包裝於六個不同的AAV載體(AAV2、AAV5、AAV8、AAV1、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)及AAV9)中以產生以下含有CYP4V2 cDNA及表現匣之rAAV載體，包括ssAAV及scAAV載體構建體兩種：(i)重組AAV2/2-CAG-CYP4V2op-WPRE-bGH polyA(本文中稱為AAV2.CYP4V2op)，(ii)重組AAV2/2(Y444F+Y500F+Y730F)-CAG-CYP4V2op-WPRE-bGH PolyA(本文中稱為AAV2tri(Y-F).CYP4V2op或AAV2tri.CYP4V2op)，(iii)重組AAV2/5-CAG-CYP4V2op-WPRE-bGH PolyA(本文中稱為AAV5.CYP4V2op)，(iv)重組AAV2/5-CAG-CYP4V2st-WPRE-bGH polyA(本文中稱為AAV5.CYP4V2st)，(v)重組AAV2/8-CAG-CYP4V2fv-WPRE-bGH polyA(本文中稱為AAV8.CYP4V2fv)，(vi)重組自身互補型AAV2/1-EFS-CYP4V2op-SPA(本文中稱為 scAAV1.CYP4V2op)，(vii)重組自身互補型AAV2/5-EFS-CYP4V2op-SPA(本文中稱為scAAV5.CYP4V2op)，及(viii)重組自身互補型AAV2/9-EFS-CYP4V2op-SPA(本文中稱為scAAV9.CYP4V2op)。
當包裝於rAAV載體中時，表現匣側接兩個AAV2 ITR(SEQ ID NO：42及43)。關於scAAV，AAV2 ITR中之一者為截短/突變的(SEQ ID NO：44)。應理解，非AAV2基因組，包括非AAV2 ITR，亦可用於包裝表現匣。緊接在CYP4V2 cDNA之前插入科札克序列(SEQ ID NO：37或38)。示意圖參見圖7，該圖顯示這些表現匣之設計。應瞭解，CYP4V2 cDNA可以包裝於不同表現匣中且CYP4V2表現匣可以包裝於不同AAV載體中。舉例而言，CAG-CYP4V2-WPRE-bGH PolyA表現匣及EFS-CYP4V2-SPA表現匣中均可以使用CYP4V2op cDNA。CAG-CYP4V2-WPRE-bGH PolyA表現匣或EFS-CYP4V2-SPA表現匣可以包裝於任何合適的AAV載體中，包括但不限於AAV1、AAV2、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV5、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV6、AAV7、AAV4、AAV12、AAV-PHP.B及其他載體。scAAV設計可以用於任何合適的AAV載體中以產生重組scAAV載體，例如scAAV1、 scAAV2、scAAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、scAAV5、scAAV8、scAAV8(Y733F)、scAAV3、scAAV4、scAAV6、scAAV7、scAAV9、scAAV12等。
應理解，在設計用於CYP4V2基因療法之其他載體(例如，慢病毒載體或質體)時，可以使用類似的設計方法。視載體類型而定，以上所描述之某些元件可能不是必需的，或者可能需要相應地調整，例如啟動子序列。
除了本文中指定的cDNA、調節序列及AAV類型及設計之外，亦可使用用於CYP4V2表現匣及遞送載體之各關鍵元件的其他設計選項。關於如何比較在目標細胞類型中的各種AAV類型之轉導效率及不同啟動子之強度的實例係在本文中提供於實例部分中。可以使用類似的方法來評定及比較用於表現匣及遞送載體之其他關鍵元件的設計選項，例如cDNA、強化子、polyA信號、ssAAV對比scAAV、AAV對比HSV等。此外，如本文中所提供，CYP4V2表現匣及遞送載體之效率可以經由在BCD細胞模式中，例如在BCD患者之iPS-RPE細胞中，用本文中所描述之方法及/或其他用以評定生化異常、RPE功能或萎縮之方法的測試來評定及比較。
在BCD患者特異性人類iPS-RPE細胞株中測試以上所描述之CYP4V2 cDNA、表現匣及遞送載體，並在以下實例中顯示並討論結果。
此外，各種調節序列之間(包括但不限於ITR與啟動子之間、強化子與polyA信號之間或polyA信號與 ITR之間)或調節序列與cDNA之間(包括但不限於啟動子與cDNA之間、cDNA與強化子之間或cDNA與polyA信號之間)的接合/連接序列亦可在調節目標基因(例如，CYP4V2)之表現的過程中起作用。該研究中所用的不同CYP4V2表現匣之序列(包括ITR及接合/連接序列)列於以下實例11中。
本實例中所論述之某些調節序列及ITR序列之示範性序列提供如下：
SEQ ID NO：32(CAG啟動子，1715bp)
Figure 107126585-A0305-02-0227-15
SEQ ID NO：33(WPRE強化子，589bp)
Figure 107126585-A0305-02-0227-16
SEQ ID NO：34(bGH polyA，225bp)
Figure 107126585-A0305-02-0228-17
SEQ ID NO：35(EFS啟動子，235bp)
Figure 107126585-A0305-02-0228-18
SEQ ID NO：36(SPA，54bp)
GATCCAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG
SEQ ID NO：37(科札克序列，6bp)
GCCACC
SEQ ID NO：38(科札克序列，5bp)
CCACC
SEQ ID NO：39(SV40晚期PolyA，120bp)
TTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAT
SEQ ID NO：40(CMV啟動子，576bp)
Figure 107126585-A0305-02-0228-19
SEQ ID NO：41(EF-1α啟動子，1184bp)
Figure 107126585-A0305-02-0229-20
SEQ ID NO：42(AAV2 5'左側-ITR，141bp)
Figure 107126585-A0305-02-0229-21
SEQ ID NO：43(AAV2 3'右側-ITR，141bp)
Figure 107126585-A0305-02-0229-22
SEQ ID NO：44(scAAV構建體中之突變型AAV2 5' ITR，117bp)
Figure 107126585-A0305-02-0229-23
SEQ ID NO：45(scAAV構建體中之AAV2 3' ITR，141bp)
Figure 107126585-A0305-02-0229-24
實例10-使用BCD細胞模式測試、比較及篩選CYP4V2基因療法中之AAV血清型及殼體結構、啟動子及其他調節序列活性及cDNA表現位準以及載體之總體功 效及劑量位準並評定不同患者之個人化最佳載體及劑量的方法
BCD細胞模式(例如，BCD患者特異性iPS-RPE細胞株或具有人工產生之CYP4V2突變的ES-RPE、iPS-RPE或RPE細胞株)可用於藥物及劑量篩選。使用BCD患者特異性iPS-RPE樣品測試、比較及篩選CYP4V2基因療法之各種組分及劑量，包括載體類型(例如，AAV血清型及殼體結構)、啟動子、強化子、polyA信號及CYP4V2表現匣及CYP4V2 cDNA中之其他序列，以及載體之總體功效及劑量位準。表型拯救用於測試及比較功效。
不同的血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9)或殼體(例如，具有殼體突變之AAV，例如AAV2對比AAV2tri(Y-F))或結構(例如，scAAV對比ssAAV)的載體可以藉由使用具有相同表現匣之不同載體來測試、比較。例如，AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op皆具有相同的表現匣，但是AAV血清型/殼體不同。scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op皆共用相同的表現匣，但是AAV血清型不同。表型拯救結果可用於測試及比較AAV血清型/殼體(例如，AAV2對比AAV2tri(Y-F)對比AAV5)及結構(例如，scAAV5對比ssAAV5)在將CYP4V2 cDNA轉導及遞送至BCD患者RPE細胞時的效率差異。
同一方法可用於藉由測試相同構建體(但測試及比較之元件不同)之rAAV載體之表型拯救功效來測試及比較不同表現匣、cDNA或調節序列或其他序列(例如，接合/連接序列)的活性位準。
此外，如本文實例中所述，可以向同一患者之iPS-RPE樣品施加不同劑量(例如，1×10e4及1×10e5)的同一種載體(例如，rAAV載體，例如scAAV1.CYP4V2op)以評定治療有效劑量範圍(藉由MOI/細胞測量)。
此外，鑒於BCD細胞模式顯示個體差異，其亦可用於單獨地評定及探索各患者之個人化最佳劑量及載體構建體。
更多相關論述參見本文之相關實例及揭示內容。
實例11-產生各種攜帶功能性CYP4V2編碼核酸序列及表現匣的重組腺相關病毒(rAAV)載體
針對此研究設計之各種AAV.CYP4V2載體(參見本文中之實例)，包括AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op、AAV5.CYP4V2st、AAV5.CYP4V2op、AAV8.CYP4V2fv及scAAV1.CYP4V2op，是藉由Vector BioLabs(Malvern,PA,USA)定製。來自Vector BioLabs之重組AAV載體無輔助。製造方法涉及：(1)選殖pAAV順式質體，其為含有AAV2 ITR之質體，其包括相關CYP4V2 cDNA(亦 即CYP4V2st、CYP4V2op或CYP4V2fv)及CYP4V2表現匣之調節序列；(2)藉由使用Qiagen Endo-free Mega Prep套組，大規模製備pAAV順式質體及互補質體(攜帶相關AAV Rep-Cap基因之質體及提供從腺病毒分離之輔助基因之質體)；(3)將以上所描述之三個質體大規模共同轉染至HEK293細胞培養板中；(4)在轉染後兩天，收集細胞沈澱(cell pellet)，並使用三個凍融循環釋放出病毒。使用CsCl梯度超速離心純化AAV病毒，然後脫鹽；及(5)使用Real-time PCR測定病毒力價(基因組拷貝(GC)/ml)。將經純化之rAAV載體儲存在-80℃下直至使用。
包裝於各種AAV.CYP4V2載體中用於研究的不同CYP4V2表現匣之序列(包括ITR及接合/連接序列)列出如下。
SEQ ID NO：60-AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op中之CYP4V2表現匣之序列：左側ITR：1-141
CAG啟動子：237-1951
CYP4V2op cDNA：2002-3579
WPRE強化子：3736-4324
bGH polyA：4350-4574
右側ITR 4659-4799
Figure 107126585-A0305-02-0233-25
Figure 107126585-A0305-02-0234-26
Figure 107126585-A0305-02-0235-107
SEQ ID NO：61-AAV5.CYP4V2st中之CYP4V2表現匣之序列。AAV5.CYP4V2st與AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO：60)具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)，但是CYP4V2 cDNA及接合/連接序列不同：左側ITR：1-141
CAG啟動子：166-1880
CYP4V2st cDNA：1938-3515
WPRE強化子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右側ITR：4399-4539
Figure 107126585-A0305-02-0236-28
Figure 107126585-A0305-02-0237-29
SEQ ID NO：62-AAV8.CYP4V2fv中之CYP4V2表現匣之序列。AAV8.CYP4V2fv與AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO：61)具有相同的啟動子(CAG)、強化子 (WPRE)及polyA(bGH-polyA)及接合/連接序列，且只有CYP4V2 cDNA序列不同：左側ITR：1-141
CAG啟動子：166-1880
CYP4V2fv cDNA：1938-3515
WPRE強化子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右側ITR：4399-4539
Figure 107126585-A0305-02-0238-30
Figure 107126585-A0305-02-0239-31
SEQ ID NO：63-AAV5.CYP4V2op(新)中之CYP4V2表現匣之序列。AAV5.CYP4V2op(新)與AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO：61)及AAV8.CYP4V2fv(SEQ ID NO：62)具有相同的啟動子(CAG)、強化子 (WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/連接序列，但是CYP4V2 cDNA序列不同：左側ITR：1-141
CAG啟動子：166-1880
CYP4V2op cDNA：1938-3515
WPRE強化子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右側ITR：4399-4539
Figure 107126585-A0305-02-0240-32
Figure 107126585-A0305-02-0241-35
SEQ ID NO：64-scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op中之CYP4V2表現匣之序列：左側ITR(截短)：1-117
EFS啟動子：130-364
CYP4V2op cDNA：520-2097
SPA：2116-2169
右側ITR：2263-2403
Figure 107126585-A0305-02-0241-34
Figure 107126585-A0305-02-0242-36
為了評定CYP4V2st cDNA與CYP4V2op cDNA在CYP4V2基因療法中之功效差異，使用本文中所描述之細胞活力分析，比較兩個AAV5載體在拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE中之RPE萎縮的功效，這兩個載體具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/連接序列，一個攜帶CYP4V2st cDNA(AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO：61))且另一個攜帶CYP4V2op cDNA(AAV5.CYP4V2op(新)(SEQ ID NO：63))。
為了評定SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：63中所用的不同接合/連接序列是否會影響CYP4V2 cDNA或表現匣之表現，使用本文中所描述之細胞活力分析，比較兩個AAV5載體(AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO：60)及AAV5.CYP4V2op(新)(SEQ ID NO：63))在拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE中之RPE萎縮的功效，這兩個 載體具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的CYP4V2 cDNA(CYP4V2op(SEQ ID NO：2))，但是接合/連接序列不同。
應理解，可以在本文中所描述之任何CYP4V2表現匣中使用不同的CYP4V2 cDNA(SEQ ID No：1、2、3或其他的)代替本文中所提供之用於CYP4V2基因療法中之表現匣序列中所含的CYP4V2 cDNA。亦應理解，本文中所描述之各CYP4V2表現匣可以包裝於用於CYP4V2基因療法中之各種血清型/殼體之rAAV載體中，包括不同於此研究中所用之載體的載體(例如，AAV1、AAV2、AAV2(Y444F+Y500F+Y730F)、AAV5、AAV8及AAV9)。此外，在將scAAV構建體中所用之突變型AAV ITR改為ssAAV構建體中所用之非突變型AAV ITR之後，包裝於此研究中所用之scAAV載體中的CYP4V2表現匣亦可包裝於用於CYP4V2基因療法中之ssAAV載體中。此外，本文中所描述之CYP4V2 cDNA或表現匣(含或不含AAV ITR)可以包裝於用於CYP4V2基因療法中之其他病毒載體(亦即非AAV載體，諸如反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒及單純疱疹病毒或其他病毒載體)或非病毒載體(例如，質體、奈米粒子或基於脂質之奈米粒子(例如，脂質體-魚精蛋白-DNA複合物(LPD))中。
實例12-用AAV.CYP4V2處理由BCD患者衍生之iPS-RPE細胞
在無血清RPE培養基中用上文所描述之各 種AAV.CYP4V2載體感染衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞。1天後，用新鮮的含血清RPE培養基替代含病毒培養基以繼續RPE培養。為了評定不同劑量之治療效果，測試不同的感染複數(MOI，基因組拷貝(GC)/細胞)。
實例13-用以評定AAV.CYP4V2基因療法之作用的分析
在AAV.CYP4V2感染之後，在RPE培養基中培養BCD患者之iPS-RPE細胞，對於scAAV培養至少4天，或對於ssAAV培養至少10天，然後收集細胞進行測試。如先前所述，遵循細胞收集方案及樣品製備方案。
本文實例中所描述之用於檢測脂肪酸、神經醯胺(Cer)、鞘磷脂(SM)及神經鞘胺醇及二氫鞘胺醇(SOSA)的生化測試係在經過AAV.CYP4V2處理之BCD患者iPS-RPE細胞上進行且遵循使用LC-MS的同一生化測試方案。上表3顯示健康對照組iPS-RPE細胞、無AAV.CYP4V2處理及AAV.CYP4V2處理後的BCD患者iPS-RPE細胞的結果。
結果證明，AAV.CYP4V2基因療法改善或校正了BCD患者iPS-RPE細胞中之表型(例如，異常脂肪酸位準(例如，DHA、AA及總n3脂肪酸)，相比於對照組而言)。這確立了AAV.CYP4V2基因療法在由BCD患者衍生之iPS-RPE細胞株中的功效。因為BCD主要由RPE退化引起，所以AAV.CYP4V2基因療法在BCD患者特異性iPS-RPE細胞株中之功效確立了AAV.CYP4V2基因療 法對BCD患者之功效。
值得注意的是，scAAV1.CYP4V2op治療在很短的時間內(治療後僅4天)就達成了最顯著的改善。這證明scAAV起效快，因為其不需要細胞機制來合成互補DNA股。出於相同的原因，預期AAV.CYP4V2處理與為了測試而進行之細胞收集之間較長的時間窗口能夠產生更顯著的結果改善，特別是對於包裝於ssAAV載體中之CYP4V2基因療法而言。
scAAV載體在人類RPE細胞中所達成之快速且穩健的結果確定scAAV載體尤其適用於拯救早發性疾病及/或RPE或視網膜退化之晚期人類患者。此外，scAAV載體之穩健的表現譜使其亦適合經由玻璃體內給藥而遞送至視網膜。
用AAV.CYP4V2拯救RPE萎縮
將由BCD患者衍生之iPS-RPE樣品暴露於藍光1小時，然後在次日在樣品上進行細胞活力分析，如本文先前所描述。
本文中之圖中顯示了細胞活力影像，該等影像比較無AAV.CYP4V2處理與有AAV.CYP4V2處理的患者iPS-RPE樣品。
與未經處理之患者樣品相比，AAV2.CYP4V2op及scAAV1.CYP4V2op處理各自顯示出能拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE樣品中之RPE萎縮(圖8。MOI=1×10e5 GC/細胞)。有趣的是， AAV2.CYP4V2op及scAAV1.CYP4V2op在1×10e5 MOI下之拯救功效在P2 iPS-RPE中比在P1 iPS-RPE中高。這表明，使用AAV.CYP4V2基因療法治療BCD之最佳劑量會根據患者之間的個體差異而有所不同，且BCD患者特異性iPS-RPE為適用於評定不同患者之個人化最佳劑量的工具。
與未經處理之患者樣品相比，AAV5.CYP4V2op、AAV5.CYP4V2st及AAV8.CYP4V2fv處理各自拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE樣品中之RPE萎縮(圖9。MOI=1×10e5)。
與未經處理之患者樣品相比，AAV5.CYP4V2op、scAAV1.CYP4V2op及scAAV5.CYP4V2op處理各自拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE樣品中之RPE萎縮(圖10。MOI=1×10e4)。
與未經處理之患者樣品相比，scAAV9.CYP4V2op處理拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE樣品中之RPE萎縮(圖11。MOI=1×10e5。處理後2週)。
值得注意的是，較低劑量(MOI=1×10e4)之AAV.CYP4V2處理在P2樣品中所達成之結果與較高劑量(MOI=1×10e5 GC/細胞)之同一載體處理在P1樣品中所達成之結果類似或比它更好。這證明在細胞位準上，為了在拯救RPE萎縮方面達成相同或類似的功效，不同患者可能需要不同劑量。換言之，對於同一種疾病之所有患者， 一種載體及一個類似劑量可能不是基因治療的最具醫學或經濟效益的方法。BCD細胞模式及其他眼部疾病之類似細胞模式可以為個人化最佳劑量提供導引。
亦測試其他AAV.CYP4V2載體且該等載體顯示能改善BCD患者iPS-RPE樣品中之RPE萎縮，包括AAV2tri(Y-F).CYP4V2op處理(MOI為1×10e4)及AAV5.CYP4V2op(新)(SEQ ID NO：63)，採用不同的MOI位準(1×10e4及1×10e5 GC/細胞)。
另外，用ImageJ(Fiji)處理細胞活力影像以計數iPS-RPE樣品中之死細胞及活細胞的數目。每個樣品使用四個不同區域/影像來計數且對同一樣品之多個影像的死/活細胞比率求平均。死/活細胞比率證明AAV.CYP4V2處理能拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE中之RPE細胞萎縮。舉例而言，關於死/活細胞比率，WT2為3.0%，P1(無AAV.CYP4V2處理)為20.87%，且經AAV5.CYP4V2st處理之P1為9.69%。其他AAV.CYP42載體之處理亦能減小BCD患者iPS-RPE樣品中之死/活細胞比率。
這些結果表明：(1)各種AAV.CYP4V2載體、表現匣及CYP4V2 cDNA均能拯救BCD中之RPE萎縮；(2)自身互補型AAV載體(scAAV)能快速達成拯救功效；(3)可以在不同劑量位準下達成功效。
實例14-AAV.CYP4V2載體之安全性及用於臨床使用之GMP製造
先前的研究表明，CYP4V2在人類器官中幾乎遍在地表現且眼內在視網膜中之表現位準高。此外，已在其他疾病之基因療法研究及臨床試驗中確立了AAV載體之安全性。因此，可以合理地預期AAV.CYP4V2載體可安全地用於基因療法中。
在此研究中，使用各種AAV.CYP4V2載體以高劑量(例如，1×10e5 MOI)治療人類iPS-RPE樣品。除了如以上實例中所述AAV.CYP4V2能拯救由BCD患者衍生之iPS-RPE樣品中之RPE萎縮之外，在未經處理之樣品與經AAV.CYP4V2處理之樣品之間在細胞死亡方面未觀測到實質差異。這確立了AAV.CYP4V2載體之安全性且證明經轉導之CYP4V2編碼基因能夠達成高位準表現而沒有顯著的毒性證據。
除了在細胞株中測試之外，AAV.CYP4V2基因療法之安全性亦可在動物中，例如在小鼠、大鼠或非人類靈長類動物中，及/或經由人類臨床試驗來測試。
可用各種製造方法及平台來產生供人類臨床使用之重組AAV載體。舉例而言但不限制，rAAV載體之GMP製造可以使用雙質體轉染法或三質體轉染法，可以使用哺乳動物細胞株，諸如HEK293、A459或293T，或昆蟲細胞株，諸如桿狀病毒/Sf9細胞平台，可以使用附著或懸浮細胞培養。此外，各種方法、製程及/或平台，包 括但不限於基於單純疱疹病毒(HSV)之生產系統、一次性生物反應器(例如，iCELLis)、HYPERStack、滾瓶及管柱層析法，均可用於增加產量或力價，或改良純度，及/或避免潛在污染。這些rAAV載體臨床產生方法、製程、技術及平台為本發明所屬技術領域中已知的且在商業上可經由委外生產服務(CMOs)或學術GMP設施獲得，例如Lonza(USA)、Cobra Biologics(UK)、全國兒童醫院(Nationwide Children’s Hospital)(NCH.Ohio,USA)、費城兒童醫院(Children's Hospital of Philadelphia)(CHOP.USA)、WuXi Biologics(China及USA)。用於人類臨床使用之AAV.CYP4V2載體可以使用本文中所提及的及/或其他在本發明所屬技術領域中已知的或未來將開發的方法、製程、技術、平台及GMP設施中之任何一或多者來製造。
實例15-個體選擇及體內施用AAV.CYP4V2以治療BCD
AAV.CYP4V2人類臨床試驗之示範性個體合格標準列出如下：
入選標準
若個體滿足以下所有入選標準，則其有資格參與研究。
1.願意並能夠提供參與研究的知情同意書。
2.年齡
Figure 107126585-A0305-02-0249-104
18歲。
3.遺傳上已確診有雙等位基因CYP4V2突變。
4.在研究眼之黃斑區域內具有臨床可見的活動性疾病。
5.在研究眼中具有34-73 ETDRS字母的最佳矯正視敏度(best corrected visual acuity，BCVA)(相當於比20/40 Snellen敏銳度差或等於該敏銳度，但優於或等於20/200 Snellen敏銳度)。
排除標準
若個體滿足以下任何排除標準，則其沒有資格參與研究。
1.有資格的眼睛有弱視史。
2.若以AAV治療時，不願意使用為期3個月的屏障避孕法。
3.在首次就診後3個月內在研究眼中進行了預先眼內手術。
4.具有任何其他顯著的眼部或非眼部疾病/病症，該疾病/病症在研究者看來可能會使該個體因為參與研究而處於危險之中，或者可能影響研究結果或該個體參加研究之能力。這包括但不限於以下個體：
‧具有口服皮質類固醇(例如去氫皮質醇/強體松(prednisone))的禁忌症
‧具有有臨床意義的白內障
‧根據研究研究者之臨床意見，不適合作為外科手術(例如，視網膜下手術)之候選者。
5.已參與在過去12週內涉及研究產品的另一項研 究，或者之前任何時候接受過基於基因/細胞的療法。
關於用AAV.CYP4V2來治療BCD，患者應該經遺傳或分子確診有BCD，亦即經由基因測試(單基因測試，或若有醫療必要，亦可多基因檢測組合(multi gene panel)測試)確認雙等位基因CYP4V2突變。因為BCD有時會被診斷為是遺傳性視網膜病症(IRD)、視網膜退化(RD)或視網膜色素變性(RP)，所以AAV.CYP4V2亦可用於治療經遺傳確認有雙等位基因CYP4V2突變之IRD、RD或RP患者。
關於體內AAV.CYP4V2治療，患者應該具有活的視網膜細胞，其藉由光同調斷層掃瞄(OCT)及/或檢眼鏡檢查法所測定。較佳地，患者應該具有一些視力(例如，最佳矯正視敏度(BCVA)優於或等於20/200(待治療眼中的小數0.1))。
可以使用多種給藥手段/給藥途徑來將AAV.CYP4V2載體體內遞送至目標細胞(例如，視網膜或角膜細胞)，包括但不限於，視網膜給藥可以經由視網膜下注射、玻璃體內注射(使用適合於玻璃體內遞送之AAV載體，例如AAV2(Y444F+Y500+Y730F)、AAV 7m8或其衍生物)或經由血流遞送(使用能夠穿透血液-視網膜屏障的AAV載體，例如AAV9或AAV-PHP.B)來進行。此外，AAV.CYP4V2載體亦可封裝於一裝置中，該裝置將被經玻璃體內植入以作為一種給藥方式。
與基因療法相關之手術/給藥方法以及某些 用以改良遞送/轉導效率的技術(例如，內界膜(internal limiting membrane，ILM)剝離及玻璃體切除術(VIT))為本發明所屬技術領域中已知的。免疫抑制劑，例如皮質類固醇，可在AAV給藥以最小化免疫反應之前、在此期間及/或在此之後使用。
除了體內治療患者之外，CYP4V2基因療法(包括AAV.CYP4V2基因療法)可用於體外治療目標細胞(例如，BCD患者之iPS衍生之RPE細胞、視網膜細胞、角膜上皮細胞或角膜細胞)，然後將該等細胞移植至患者中，作為一種細胞療法。使用AAV.CYP4V2載體治療BCD患者iPS-RPE細胞之方法提供於實例及本文之揭示內容中。細胞植入/移植方法為本發明所屬技術領域中已知的，例如植入/移植至視網膜及角膜。舉例而言，可以使用相同或類似的用以將ES-RPE細胞移植至視網膜的方法及手術技術來移植BCD患者之iPS-RPE細胞。
治療有效劑量可以在疾病模式(例如，BCD細胞模式(例如，衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞株)或動物模式)中測定及評估，且藉由臨床試驗確認或改良。關於細胞之體外治療，劑量通常用MOI表示，然後MOI乘以待治療細胞之數目。MOI一般在約1×103 GC/細胞至約1×106 GC/細胞的範圍內或感染MOI為約100至約10,000 GC/細胞(GC：基因組拷貝，測量含有AAV粒子之基因組(又名載體基因組(vg)或基因組粒子(gp))。關於體內治療，確定劑量時應該考慮典型的臨床因素，諸如給 藥途徑；所靶向細胞之區域大小或數目；及待治療之個體(例如，待治療個體之年齡、體重、疾病及病狀之發展階段及潛在免疫反應)；靶向治療之細胞的位置(例如，視網膜對比角膜)。此外，亦應該考慮正使用的AAV.CYP4V2載體之轉導效率及拯救功效。最後，若有可能，則亦應該考慮患者之間在細胞位準上最佳劑量方面的個體差異，此等差異可以在患者特異性iPS-RPE細胞中評定。因此，向眼睛體內單次局部給藥的治療有效劑量可為大概從約1×106至約2×1013 GC且包括端值(例如，約1×1011 GC至約1×1012 GC之高劑量範圍、約1×1010 GC至約1×1011 GC之中等劑量範圍、約1×109 GC至約1×1010 GC之低劑量範圍、約1×106 GC至約1×109 GC之極低劑量範圍及約1×1012 GC至約2×1013 GC之極高劑量範圍)，或在這些範圍內的足夠提供所期望的效果的任何劑量。在一個實施例中，組成物以約1×106至2×1013 GC之劑量施用。在另一實施例中，體內給藥劑量藉由靶向治療之細胞的數目乘以目標MOI(例如，約1×103 GC/細胞至約1×106 GC/細胞)來確定。任何向眼睛的單次局部給藥中含有rAAV載體之藥劑的體積可以在約1μL(0.001mL)至約1000μL(1mL)範圍內。經由血流遞送來治療需要高得多的劑量且該劑量可以在每公斤體重約1×106至約2×1014 GC的範圍內。
關於更多說明，參見「E.治療選項、個體選擇及給藥」及本文中之其他揭示內容。
實例16-治療後評估
因為BCD之臨床症狀類似於許多其他類型的IRD、RD及RP之臨床症狀，例如視敏度喪失，視野受限，夜盲症，暗適應性、對比敏感度及色覺下降，視網膜(及一些患者之角膜)改變，及視網膜電圖(ERG)上的反應減弱，所以可以使用相關的衡量指標來評定BCD患者在治療前及治療後之疾病狀態及進展，從而評估治療結果。這些衡量指標及相關的檢查與測試為視網膜及角膜疾病之技術中已知的。舉例而言但不限制，最佳矯正視敏度(使用視敏度表)可用作BCD基因療法之主要結果衡量指標，以下一或多者作為次要結果衡量指標：微觀測量(microperimetry)(敏感度變化)、眼底自發螢光(fundus autofluorescence，AF)(AF變化)、光同調斷層掃瞄(OCT)(橢圓體帶及視網膜厚度)、對比敏感度(Pelli-Robson圖)、色覺(Farnsworth-Munsell 100色相測試)及ERG(ERG變化)。此外，諸如移動性測試之功能測試亦可用作主要或次要結果衡量指標。可以在治療後的不同時間點進行評估，例如治療後2週、1個月、2個月、3個月、6個月及12個月。結果可用於評估治療結果。功效可以表現為以下之一：主要或次要結果衡量指標中之一或多者的改善、疾病進展停止，或比預期的視網膜退化或視力喪失的速率低(必要時藉由使用自然史研究的數據)。
實例17：用以減少基因療法中之免疫反應並解決個體差異的方法
病毒載體介導之基因療法可以觸發細胞免疫反應、局部免疫反應或全身免疫反應，可能存在安全風險。免疫反應亦會降低轉導效率，從而減弱病毒載體介導之基因療法的治療效果。免疫反應可以按識別淋巴或血液中之抗原或病原體之體液反應(或抗體介導之反應)及/或細胞介導之免疫的形式發生。為了最小化免疫反應，常常結合基因療法給藥使用諸如皮質類固醇之免疫抑制劑。免疫抑制藥物具有例如可能引起眼內壓升高、白內障及其他不良事件(例如，長期使用免疫抑制劑可能增加癌症風險)的作用。除了免疫反應之外，患者之間亦存在其他個體差異，例如，對於不同類型(例如，不同血清型或不同殼體突變/結構)之載體的反應，或對於相同劑量的相同載體的反應。
一種用以在病毒載體介導之基因療法中降低對病毒載體之免疫反應、保持轉導效率、降低病毒載體及/或免疫抑制劑劑量及/或使針對具有同一種遺傳疾病之不同患者的治療效果達到最大的方法，其包含：
(a)建立在該基因療法所針對之目標細胞類型中具有足夠的轉導效率的多於一個重組病毒載體(例如，rAAV)的庫。可以藉由產生具有抗原區突變之變異體或在該等病毒載體之殼體上之其他突變或變異體來擴增該病毒載體庫，其係在確認該等突變或變異體在與該疾病有關之目標細胞中(例如，對針對BCD之CYP4V2基因療法而言，係在iPS-RPE或RPE細胞株中)具有足夠的轉導效率後。
(b)檢測需要該基因療法之個體中預先存在的針對不同病毒載體血清型及/或殼體突變或變異體的中和抗病毒載體抗體(NAb)，及/或測試及比較衍生自該個體之患者特異性疾病目標細胞(例如，iPS-RPE細胞)中之不同病毒載體。
(c)從該病毒載體庫中選擇病毒載體，該病毒載體(i)在疾病目標細胞中具有足夠的轉導效率且(ii)與該個體中預先存在的NAb具有低交叉反應性及/或(iii)在個體之患者特異性疾病目標細胞(例如，對針對BCD之CYP4V2基因療法而言，為患者特異性iPS-RPE或RPE細胞株)中具有良好表型拯救結果，其中該病毒載體庫包含不同血清型及/或殼體經修飾之病毒載體(例如，包括但不限於殼體突變型AAV及/或殼體蛋白變異型AAV)。
(d)使用選自(c)之病毒載體向該個體給藥。
(e)每當該個體需要施用基因療法時重複以上的(b)至(d)(僅重複與預先存在的NAb相關的部分)，其包括但不限於向同一器官(例如，眼睛或對側眼睛)或向另一器官進行後續給藥，。
具體而言，產生並測試多種rAAV載體來評定在此研究中不同患者之細胞株之間的差異，該等rAAV載體包括五種不同的AAV(AAV1、AAV2、AAV5、AAV8及AAV9)血清型及一種殼體突變AAV(AAV2.tri(Y-F))。
實例18：使用scAAV快速拯救視網膜疾病及在scAAV或AAV載體中使用EFS及/或SPA來治療眼部疾 病
如以上實例13中所表明，scAAV.CYP4V2治療在很短的時間內(僅4天)在BCD患者iPS-RPE細胞中達成了穩健的生化表型拯救。
此外，scAAV.CYP4V2在AAV治療後兩週在BCD患者iPS-RPE細胞株中顯示RPE萎縮拯救(參見圖11)。人類iPS-RPE細胞中由scAAV載體中之EFS啟動子(示範性序列顯示於SEQ ID NO：35中)及SPA(示範性序列顯示於SEQ ID NO：36中)驅動之快速且穩健的表現表明，EFS啟動子及/或SPA適合驅動人類眼細胞中之轉基因表現並治療人類眼部疾病。藉由含有EFS啟動子及SPA之scAAV載體達成的快速拯救使其尤其適用於治療快速進展的疾病或疾病晚期患者。
此外，該研究證明了scAAV設計在人類視網膜細胞中快速且穩健的表現。這使得scAAV介導之基因療法特別有助於治療早發性視網膜疾病患者或治療需要快速拯救的晚期患者。
關於CYP4V2基因療法之論述
BCD為罕見的致盲性眼睛疾病，其目前尚無經過批准的治療方法可用。在涉及使用BCD患者特異性iPS-RPE細胞株之臨床研究中，多種AAV.CYP4V2載體及表現匣設計在拯救BCD患者特異性iPS-RPE細胞中之表型方面的功效在此研究中被證實，如經由脂肪酸及脂質分析所評定。此外，測試不同劑量(MOI)，其可用作確定 體內治療劑量範圍的導引。最後，沒有充分的證據表明存在與AAV.CYP4V2基因療法相關之毒性。
細胞療法及CRISPR基因編輯療法實例
實例19-在細胞療法中使用來自BCD個體之iPSC、iPS-RPE或iPS-眼細胞
BCD為相對晚發性疾病。BCD患者之症狀通常在生命之第2、第3或甚至第4個十年間出現。此外，iPS重編程方法可能有一些「重置時鐘」作用。因此，衍生自BCD患者之iPS-RPE細胞及其他iPS-眼細胞可以作為細胞療法使用用於移植至BCD患者，甚至不需要對iPS-RPE細胞中之CYP4V2突變進行任何基因修復。
或者，衍生自BCD患者之iPSC、iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CE細胞、iPS-CEC及/或其他iPS-眼細胞可以在細胞療法移植之前進行基因修復。基因修復可以藉由如以上實例中所述之CYP4V2基因療法或藉由基因編輯來達成。關於基因編輯之更詳細描述，參見本文中之實例。
實例20-用於眼細胞療法之經基因修復的患者自體細胞
患者特異性iPSC衍生之細胞(例如，iPS-RPE細胞、iPS-CEC、iPS-CE細胞、iPS-PRC或iPS-眼細胞)可以作為自體細胞源用於在針對眼部疾病之細胞療法中之移植，該眼部疾病包括但不限於視網膜及角膜疾病。相比於由同種異體來源產生之細胞，諸如另一個體之 ES細胞(例如，ES-RPE細胞、ES-CEC或ES-PRC，及由該等ES衍生之細胞構成之組織)或iPS細胞，該等患者特異性iPS衍生之自體細胞及由該等細胞構成之組織通常幾乎不需要對患者進行免疫抑制，且沒有與ES及ES衍生之細胞之使用相關的道德問題。
然而，由患者來源細胞(例如，纖維母細胞或血球)產生之iPSC及衍生自該等患者特異性iPSC之細胞及組織(例如，患者特異性iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CEC、iPS-CE細胞及iPS-眼細胞)仍然具有致病突變及相關表型。為了產生由健康患者衍生之細胞及/或組織，可以用基因編輯技術來基因修復或校正病理性突變，基因編輯技術包括但不限於常間回文重複序列叢集(CRISPR)，其可經設計以校正患者細胞中之目標突變。這些經基因修復的健康iPSC然後可用於產生各種不再攜帶患者之病理性突變的細胞類型(例如，iPS-RPE細胞、iPS-CEC、iPS-CE細胞、iPS-PRC或其他iPS-眼細胞)。
此外，此概念驗證研究表明，這些經基因校正之iPSC及/或經基因校正之iPS衍生之細胞(例如，iPS-RPE細胞)不再具有如來自患者之(未校正的)iPS衍生之細胞中所見的表型(例如，藉由生物分析所評定的異常生化譜，例如脂質體學及/或蛋白質體學)。因此，這些經基因校正之細胞充當可使用作為細胞療法中之替代細胞的再生性經基因修復之自體細胞的來源。與經基因校正之患者自體細胞相關的組成物及方法詳細描述於本文及以下實 例中。
另一類型之經基因修復的患者細胞為經過如上文所描述之基因補充療法(例如，CYP4V2基因療法)處理的患者iPSC或iPS衍生之細胞(例如，iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CE細胞、iPS-CEC及iPS-眼細胞、iPS-神經元細胞)。在基因療法處理後，患者特異性細胞具有突變基因之健康拷貝(例如，cDNA)及/或表現由健康轉基因編碼之功能蛋白。此外，經基因療法處理之患者特異性細胞顯示出經改善或標準化之在未經處理之患者細胞中所看到的生化譜或其他表型。因此，其等亦可用作經基因修復之自體細胞的來源，該等自體細胞係供使用作為細胞療法中之替代細胞，例如經CYP4V2基因療法處理之BCD患者特異性iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CEC、iPS-CE細胞及iPS-眼細胞作為供使用於針對BCD之細胞療法中之經基因修復的患者自體細胞。與經CYP4V2基因療法處理之BCD患者特異性細胞相關的組成物及方法詳細描述於上文實例中。下文中之論述著重於藉由校正基因組DNA中之突變所達成之基因修復的類型。
用於與遺傳突變相關之眼及視網膜退化性疾病的自體細胞替代是取決於藉由經由基因編輯基因校正突變來修復患者之病理性突變或在移植前修復該突變或減輕該突變之後果(例如，經由遞送相對於疾病基因之轉基因的健康拷貝，例如CYP4V2基因療法)的能力。此處，產生來自具有最常見的CYP4V2突變 (c.802-8_810del17insGC)之BCD患者的患者特異性iPSC，且開發CRISPR基因編輯組分(CRISPR引導RNA及供體模板)及各種構建體(質體及RNP)來校正此突變。雖然本文中使用CRISPR/Cas9作為基因編輯手段，但是期望可以使用其他CRISPR系統(例如，Cpf1)及其他基因編輯技術來達成相同或類似的結果，該等基因編輯技術包括但不限於TALEN以及新興的及未來的基因編輯技術，諸如CRISPR/Cpf1。亦期望基因編輯不僅可以應用於iPSC，而且可以應用於將要用於產生iPSC之原始來源細胞以及由iPSC產生之細胞，從而校正該等細胞中之病理性突變。
雖然iPS衍生之細胞株係在患者特異性基礎上產生的，但是其在細胞療法中之應用不一定必須具有患者特異性。限制基於iPSC之細胞療法的廣泛使用的關鍵因素為人類個體之間的免疫學差異。解決此問題的方法有很多。舉例而言，一種方法為開發多個細胞庫，該等細胞庫含有有限數目的具有常見HLA單倍型之細胞株，其等經設計用於與大部分患者群體達成免疫學匹配。此類細胞庫可以藉由從具有所選擇之單倍型的患者產生iPSC或藉由HLA基因型之基因操作而產生。另一方法為產生無論患者之基因型如何都將免疫沉默的細胞類型。
下面描述關於以下的方法：如何產生經基因修復的患者特異性自體細胞、如何評定基因修復在該等細胞中之作用及如何在細胞療法中使用該等細胞。本文中提 供之實例與從具有CYP4V2基因中之c.802-8_810del17insGC突變的BCD患者產生經基因修復的患者自體細胞有關，該突變為BCD患者中最常見的突變。同一方法可用於從以下患者產生經基因修復的患者自體細胞：具有CYP4V2中之不同突變的患者，或具有與眼部疾病相關之另一基因中之突變的患者，或具有與其他類型之疾病相關之基因中之突變的患者，該突變係於包括但不限於表4中所含的任何基因中。
Figure 107126585-A0305-02-0262-37
Figure 107126585-A0305-02-0263-38
以具有CYP4V2突變之疾病BCD為例，從攜帶BCD患者之特異性突變的患者特異性細胞產生iPSC。用CRISPR引導RNA(gRNA)、Cas9核酸內切酶及供體同源模板轉染患者特異性iPSC。CYP4V2基因拷貝顯示突變已校正且轉化為野生型等位基因。經校正的iPSC然後用以產生經基因校正的iPS-RPE細胞。然後測試經基因校正的iPS-RPE細胞以確認其不再具有表型(例如，異常生化譜(例如，脂肪酸譜))。這些經基因修復的患者自體細胞可以移植(直接移植(例如，細胞懸浮液)或採用其他形式，諸如作為層、層片、基質、支架或組織之一部分)至原患者作為針對BCD之自體細胞療法。
(i)產生BCD患者特異性iPSC株：
iPSC由來自攜帶CYP4V2基因中之純合c.802-8_810del17insGC突變之BCD患者的患者特異性細胞產生，如本文中所描述。關於患者特異性iPSC之產生方法，參見實例1。BCD患者之突變藉由定序來鑑定
(ii)設計、篩選及選擇靶向該突變之CRISPR基因編輯組分及構建體：
CRISPR基因編輯療法之詳細說明參見本文中之實例。
(選擇CRISPR gRNA以最小化脫靶編輯及最大化直 接集中於突變位點之目標序列的特異性。篩選對含有患者特異性CYP4V2突變之區域具有高特異性的多個gRNA。將候選gRNA分別插入亦含有負責介導目標DNA裂解之Cas9核酸內切酶的表現載體中並轉染至293細胞株中。使用針對CYP4V2區域之引子，藉由PCR擴增患者基因組DNA，且分析PCR產物之DNA裂解活性。使用調查分析評定哪些候選gRNA對突變位點具有相對較高的活性。將具有最高切割效率之gRNA用於基因編輯。)
(iii)iPSC中之基因編輯：
CRISPR基因編輯療法之詳細說明參見以下實例。
對於如BCD之遺傳隱性疾病，一個等位基因或突變中之基因校正足矣。可使用靶向不同突變之多個CRISPR構建體來校正細胞所攜帶的多種突變。
(iv)從經基因校正的iPSC產生iPS-RPE細胞或其他iPS-眼細胞：
在經由定序確認精確校正病理性突變且沒有或只有最小的脫靶編輯之後，藉由基因編輯校正之iPSC用於分化成並產生iPS-RPE細胞或另一種類型的受如本文中所描述之相關疾病影響的iPS-眼細胞(例如，iPS-PRC、iPS-CEC或iPS-CE細胞)。衍生自BCD患者之經校正的iPS-RPE細胞然後經歷相同的RPE命運確認(例如，不同的RPE形態(例如，色素及/或六角形)及或RPE特異性標記物)。
(v)用以確認沒有表型的生物分析
生物分析用來確認這些經基因校正的iPSC及/或經基因校正的iPS衍生之細胞(例如，iPS-RPE細胞)不再具有如來自患者之(未校正的)iPS衍生之細胞中所見的表型。生物分析可為任何類型的能夠鑑定及評定患者細胞中與特定疾病相關之細胞及/或分子位準表型的生物學分析。舉例而言，其可以包括但不限於脂質體學、蛋白質體學、蛋白質表現及/或其他生化測試。對於BCD，生物分析包括如本文實例中所述之脂肪酸及神經醯胺測試。結果指出，衍生自BCD患者之這些經基因校正的iPS-RPE細胞不再具有如衍生自BCD患者之未校正的iPS-RPE細胞中所見的相關的生化缺陷/功能障礙。這證明，經基因校正的iPS-RPE細胞沒有表型，且因此為適合用於細胞療法之替代細胞的來源。
(vi)移植：
這些經基因修復的患者自體細胞(例如，iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CE細胞、iPS-CEC及其他iPS-眼細胞)可以移植(直接移植或作為層、層片、基質、支架或組織之一部分移植)至原患者，作為針對BCD之細胞療法。
實例21-針對眼部疾病之CRISPR基因編輯療法的特定實例
當gRNA正確地設計時，CRISPR/Cas9具有高特異性，但是特異性及脫靶編輯仍為主要問題，特別 是當CRISPR之臨床用途仍在開發中。以下實例詳細描述用以開發用於治療眼部疾病之具有高中靶特異性及低脫靶編輯風險的CRISPR基因編輯療法構建體的方法。此外，c.802-8_810del17insGC突變代表所有已知的CYP4V2突變及其他遺傳性眼部疾病中最難以校正的突變之一。儘管大部分CYP4V2突變為單一核苷酸改變、插入或缺失(參見表1：選擇BCD患者中之CYP4V2突變)，然而c.802-8_810del17insGC突變涉及17bp缺失及2bp插入，且涉及內含子及外顯子兩種。
設計及構建幾組用以校正最常見的病理性CYP4V2突變(c.802-8_810del17insGC突變)的CRISPR基因編輯療法構建體。以下為關於使用這些CRISPR CYP4V2基因編輯構建體校正突變並治療BCD之設計、組成物及方法的詳細說明。
(a)分析突變
c.802-8_810del17insGC突變涉及內含子與外顯子及缺失與插入，且其影響剪接受體位點。
c.802-8_810del17insGC突變係指17個鹼基缺失且兩個鹼基(GC)插入於從CYP4V2基因之內含子6的末端起距離8個鹼基的位置中，亦稱為IVS6-8 del/insGC；參見SEQ ID NO：46，其顯示包含c.802-8_810del17insGC突變之人類CYP4V2基因組DNA區域的序列，及SEQ ID NO：47，其顯示相應的野生型序列。c.802-8_810del17insGC突變展示於以下顯示 人類CYP4V2內含子6-外顯子7接合的序列中。內含子6序列以小寫字母顯示且外顯子7序列以大寫字母顯示。17bp缺失及GC插入位於括號內：caa aca gaa gca tgt gat tat cat tca aa(tca tac agG TCA TCG CT)(GC)GAA CGG GCC AAT GAA ATG AAC GCC AAT GA，預測其導致外顯子7之跳躍。野生型CYP4V2具有以下序列：CAA ACA GAA GCA TGT GAT TAT CAT TCA AA(T CAT ACA GGT CAT CGC T)GA ACG GGC CAA TGA AAT GAA CGC CAA TGA(SEQ ID NO：47)，而c.802-8_810del17insGC突變型CYP4V2具有以下序列：CAA ACA GAA GCA TGT GAT TAT CAT TCA AA(GC)GA ACG GGC CAA TGA AAT GAA CGC CAA TGA(SEQ ID NO：46)。野生型序列中加括號的核苷酸為缺失的17個核苷酸且突變序列中加括號的核苷酸為在17個鹼基對缺失之後插入的2個核苷酸。
為了用CRISPR達成良好修復率，期望Cas產生儘可能靠近突變序列的裂解。含有c.802-8_810del17insGC突變之CYP4V2基因組DNA區域具有多個SpCas9 PAM位點(NGG)。因此，可以使用規律的SpCas9來校正此突變。或者，可使用其他物種之Cas9、突變的Cas9或其他具有不同PAM(例如，對於存在於突變序列中之Cpf1，為TTTN)之CRISPR核酸酶(例如，Cpf1)來校正c.802-8_810del17insGC突變及/或其他突變。
(b)CRISPR gRNA設計及選擇
基於CYP4V2基因之c.802-8_810del17insGC突變區域中所存在的各種PAM位點，使用DeskGen軟體篩選多個相關的原型間隔區元件序列(本文中稱為gRNA，長度通常為20nt，但是可以採用不同長度，例如與Cas9一起使用時為17-22nt)。使用以下標準選擇五(5)個候選gRNA：a)gRNA/Cas9裂解位點與目標校正位點之靠近程度；及b)所預測的gRNA之脫靶譜(參見表5及圖12；gRNA序列參見SEQ ID NO：48至52)。
Figure 107126585-A0305-02-0268-39
用粗體突出對應於各候選gRNA之PAM位點。為了避免混淆，PAM序列不是gRNA(原型間隔區元件)序列之一部分。
(c)使用患者基因組DNA進行gRNA驗證
使用具有純合c.802-8_810del17insGC突變之BCD患者(P1)的基因組DNA來選擇及驗證gRNA。使用引子(參見表6及圖12)來製備側接含有突變位點及各種目標位點之CYP4V2區域的DNA擴增子。將DNA擴增子、藉由體外轉錄(in vitro transcription，IVT)製備之單引導RNA(sgRNA)(各自包含gRNA1、gRNA2、 gRNA3、gRNA4或gRNA5中之一者)及SpCas9蛋白質混合且在37℃下培育1小時。活性sgRNA介導Cas9蛋白質在擴增子中產生雙股斷裂且展示各種片段模式(表7)。加載反應物並在1.5%瓊脂糖凝膠上解析DNA片段(圖13)。
Figure 107126585-A0305-02-0269-40
Figure 107126585-A0305-02-0269-41
為了確認片段實際上源自擴增子，對未經處理之擴增子之DNA樣品(圖16，最上組(Top panel))及經g2處理之最小片段(圖16，中間組(middle panel))進行桑格定序(Sanger sequencing)(圖14)。5個gRNA全部顯示出所預測的裂解活性。
除了驗證攜帶突變之患者基因組DNA之外或作為其替代，亦可驗證患者細胞中之gRNA活性，患者細胞包括但不限於體細胞、幹細胞、iPSC或衍生自幹細胞之細胞。
(d)gRNA表現載體之構建
將三個具有最高活性及最高脫靶評分之gRNA(g1、g2及g3)藉由插入各活性gRNA之雙股寡核 苷酸匣(double-stranded oligo cassette)而選殖至pX-U6-CBh-Cas9-Puro gRNA表現載體中。各匣基於g1、g2及g3之gRNA序列之一者而合成。圖15及圖16中提供了示意圖，其顯示出表現載體之構建體及gRNA之插入位點。更詳細的圖解說明(以g1為例)參見圖17，該圖顯示在U6啟動子之後的整個IVT sgRNA序列(SEQ ID NO：55(不包括原型間隔區元件序列或視情況存在之「G」))。插入在各原型間隔區元件(gRNA)序列起始處的「G」核苷酸(SEQ ID NO：59)為視情況存在的。其主要用以增強U6啟動子之轉錄效率。若原型間隔區元件序列以「G」殘基開始或若使用非UT啟動子(例如，H1啟動子)，則不需要該「G」核苷酸。藉由限制酶消化及定序驗證所有gRNA構建體。
開發三個質體，其各自表現頂部gRNA(g1、g2或g3)且共同表現hSpCas9及嘌呤黴素抗性基因，即pX459-hSpCas9-2A-Puro(圖15及16)，且這三個質體被包括作為用於基因校正c.802-8_810del17insGC突變之構建體中之一者(參見下表8)。
應理解，引導RNA、Cas蛋白質及/或選擇標記物(例如，嘌呤黴素抗性基因及/或GFP、EGFP或RFP)可以包裝於一個質體中或各別質體中。此外，當使用多於一個gRNA時(以校正多種突變或校正同一種突變，例如用於與Cas9切口酶一起使用之配對gRNA)，其可以包裝於同一載體中或各別載體中。
除了本文中所描述之質體載體之外，亦可使用各種其他載體來包裝CRISPR基因編輯組分(引導RNA及/或Cas蛋白質)及/或選擇標記物，包括但不限於pX458質體載體、腺相關病毒(AAV)載體及/或慢病毒載體。除了編碼CRISPR組分之DNA構建體之外，亦可直接使用或在mRNA構建體或RNP構建體中使用引導RNA、Cas蛋白質及/或選擇標記物。
(e)CRISPR RNP之構建及驗證
除了載體(例如，如上所述之pX459質體)中之DNA構建體之外，開發CRISPR核糖核蛋白(RNP)構建體用於g1、g2、g3、g4及g5中之每一者(參見表5及8)。各RNP構建體包含(i)包含相關原型間隔區元件之嵌合單引導RNA(sgRNA)(參見表5及8及本文中之詳細說明)；及(ii)形成核糖核蛋白(RNP)複合物之SpCas9蛋白質。在患者基因組DNA中驗證各種RNP構建體(sgRNA1：Cas9、sgRNA2：Cas9、sgRNA3：Cas9、sgRNA4：Cas9、sgRNA5：Cas9)在CYP4V2基因之目標位點的裂解活性(參見圖12、13及14)，如上文在段落(c)中所述。
sgRNA之長度通常為約100nt，但其長度可以變化，包含17nt-22nt原型間隔區元件序列。sgRNA可為IVT衍生的或合成的。如上所述產生及驗證對應於g1、g2、g3、g4及g5之IVT sgRNA。如下所述從Synthego(Silicon Valley,CA,USA)定製對應於g1及g2之合成 sgRNA。
代替sgRNA，crRNA(示範性序列在SEQ ID NO：53中)及tracrRNA(示範性序列在SEQ ID NO：54中)雙鏈體可以與Cas蛋白質(例如，Cas9)一起使用，形成CRISPR RNP複合物(crRNA：tracrRNA：Cas9)。當使用Cpf1蛋白質時，不需要tracrRNA。
sgRNA或crRNA：tracrRNA可經化學修飾以避免細胞內RNA降解。舉例而言，經化學修飾之合成RNA可以在gRNA(Synthego(Silicon Valley,CA,USA))之5'端及3'端三個鹼基處含有2'-O-甲基類似物及3'硫代磷酸酯核苷酸間鍵合。以給定原型間隔區元件序列(例如，CRISPR g1、g2、g3、g4或g5(參見SEQ ID NO：48至52))為基礎的合成sgRNA或crRNA及tracrRNA可在商業上購得，例如購自Synthego Corporation(Silicon Valley,CA,USA)或IDT，且有化學修飾可供選擇。
(f)構建供體模板
在同源定向修復(HDR)中，使用供體模板來提供校正目標基因之突變序列所需的供體核酸序列。以單股寡聚去氧核苷酸(single-stranded Oligo DeoxyNucleotide，ssODN)形式產生兩個用於HDR之各別供體模板。第一個稱為CPY4V2供體模板1或CYP4V2ssODN 1(SEQ ID NO：56)，含有17bp校正且具有如下序列：5'-AGA AAA ATA AAT GAA AGA AAC TAG CAT ATT TTA TAA GAA AAT GTG TTA ACT AGG GTG CAT CCA AGT CCA AAC AGA AGC ATG TGA TTA TCA TTC AAA TCA TAC AGG TCA TCG CTG AAC GGG CCA ATG AAA TGA ACG CCA ATG AAG ACT GTA GAG GTG ATG GCA GGG GCT CTG CCC CCT CCA AAA ATA AAC GCA GGG CCT TT-3'；而第二供體模板稱為CYP4V2供體模板2或CYP4V2 ssODN 2(SEQ ID NO：57)，為CYP4V2供體模板1之反向互補序列。
任一供體模板均可以與上文所描述之任何gRNA或sgRNA(g1、g2、g3、g4或g5)及Cas9蛋白質一起使用，以產生同源定向修復(HDR)，從而校正目標CYP4V2(c.802-8_810del17insGC)突變。
本文中所提供之供體模板之長度為200nt。可以使用各種長度之供體模板。供體模板相對於目標位點可為對稱的或不對稱的。供體模板可由含有或編碼供體核酸序列之ssDNA、ssODN或載體(例如，質體或AAV載體)提供。若供體模板具有與CRISPR引導RNA中之原型間隔區元件互補的完整序列及Cas蛋白質所靶向之PAM序列，則為了避免此供體模板在細胞中被Cas蛋白質(例如，Cas9)降解，可以使供體模板突變，例如使供體模板中之Cas9 PAM「NGG」突變且將其改為「NGT」或另一非PAM序列。然而，若意欲藉由供體模板引入之PAM突變係在編碼區內，則需要注意確保其為沉默突變。
供體模板可以合成方式製得且可在商業上 購得。舉例而言，給定序列之DNA寡核苷酸可以定製(Ultramer® DNA寡核苷酸，Integrated DNA Technologies(IDT),Coralville,Iowa,USA)。
(g)Cas蛋白質及選擇標記物
CRISPR相關蛋白/核酸酶(Cas)(例如，Cas9或Cpf1)可在商業上購得，包括但不限於由質體編碼或作為重組蛋白質用於RNP構建體中。Cas蛋白質亦可包括一個、兩個或更多個核定位序列(NLS)(例如，目錄號：1074182，Integrated DNA Technologies(IDT),Coralville,Iowa,USA；目錄號：A034a-a-1000，Feldan(Quebec,Canada)；Cpf1：目錄號：1076158(IDT))且亦可與選擇標記物融合(例如，與EGFP融合之SpCas9蛋白質，目錄號：PR-137211-E(Novatein Biosciences,Woburn,MA,USA))。
當將CRISPR基因編輯構建體體外轉染於細胞中時，選擇標記物可用於評估轉染率及/或幫助挑取用於下一步加工的細胞。該過程中可以使用各種選擇標記物，包括但不限於螢光(例如，GFP、EGFP、RFP)及/或嘌呤黴素。選擇標記物可以與CRISPR構建體之任何組分整合或可以在轉染過程中個別提供。舉例而言，螢光標記可以與tracrRNA(IDT)或Cas9蛋白質(Novatein Biosciences，目錄號：PR-137211-E)組合以方便成像及手動分選或FACS分選經轉染細胞。可以在與CRISPR構建體共同轉染之載體中提供嘌呤黴素抗性基因以便使用嘌 呤黴素進行選擇。使用嘌呤黴素所進行之選擇在實例中加以說明。各種類型之選擇標記物，諸如抗生素選擇標記物(例如，嘌呤黴素)或螢光標記，可在商業上購得且可以整合至CRISPR組分(例如，Cas9蛋白質或CRISPR引導RNA)中或個別地提供(例如，表現嘌呤黴素抗性基因之表現質體)，包括但不限於：IDT、Sigma Aldrich、Novatein Biosciences、Clonetech Laboratories及InvivoGen。
(h)構建體及推薦方案
下表(表8)顯示針對3個gRNA(gRNA1、gRNA2及gRNA3)中之每一者而產生的CRISPR基因編輯構建體(質體及RNP)。其等含有三個gRNA質體構建體或相應的sgRNA、兩個供體模板(正向及反向互補)及SpCas9蛋白質。
Figure 107126585-A0305-02-0275-42
1 用於校正BCD患者中最常見的CYP4V2突變c.802-8_810del17insGC突變之構建體。用於校正其 他CYP4V2突變之CRISPR gRNA及構建體可以藉由使用如本文中所描述之方法來設計及驗證。除了質體及RNP構建體之外，亦可使用其他構建體來提供/表現一或多個CRISPR組分，其他構建體包括但不限於mRNA及病毒載體。
2 編碼CRISPR組分(sgRNA及SpCas9蛋白質)及作為選擇標記物之嘌呤黴素(Puro)抗性基因的pX459質體。參見圖17，該圖顯示編碼sgRNA之DNA構建體及序列(以g1為例，且圖15及16為載體構建體及圖譜)。各sgRNA序列含有(a)20nt原型間隔區元件(g1、g2及g3分別為SEQ ID NO：48、49或50)及(b)82nt序列(SEQ ID NO：55(序列以DNA形式顯示，包括於質體DNA中；對於RNA序列，使用「U」替代DNA序列中之「T」)。pX459載體含有「G」核苷酸(SEQ ID NO：59及圖17)，該核苷酸緊接在人類U6啟動子序列之後且在原型間隔區元件序列之前，用以增強由U6啟動子驅動之轉錄效率，其亦包括於IVT衍生之sgRNA中。亦可將CRISPR組分(gRNA及Cas蛋白質)選殖於其他載體中，包括但不限於諸如慢病毒載體或AAV載體的病毒載體。CRISPR gRNA及Cas蛋白質(例如，Cas9蛋白質)可以選殖於各別載體中或一個載體中。
3 基於各種原型間隔區元件之sgRNA(CYP4V2 g1、CYP4V2 g2或CYP4V2 g3，分別參見表5及SEQ ID NO：48、49或50)。IVT sgRNA參見以上 說明。除了IVT sgRNA之外，亦可從Synthego Corporation(Silicon Valley,CA,USA)訂購具有化學修飾之合成sgRNA。可以使用crRNA(包含CYP4V2 g1、g2或g3之20nt原型間隔區序列及crRNA之剩餘序列(示範性序列顯示於SEQ ID NO：53中))及tracrRNA(示範性序列顯示於SEQ ID NO：54中)雙鏈體來替代sgRNA。
4 用於同源定向修復(HDR)之供體模板。亦可使用不同長度之供體模板，且該等供體模板可以不同形式構建，其包括但不限於以ssODN形式或以載體形式(例如，腺相關病毒(AAV)載體(例如，AAV2或AAV6))。
各試劑之濃度為約1000(ng/μL)。
以下方案用於經由電穿孔及核轉染將CYP4V2突變CRISPR基因修復構建體遞送至患者iPSC。亦可使用其他方法，包括但不限於脂質體轉染、病毒載體轉導(例如，慢病毒或AAV載體(例如，使用AAV6來遞送供體模板)或顯微注射。使用第11代至第14代P1 iPSC。
1號方案(使用質體電穿孔)：
1.根據Neon®轉染系統(Life Technologies)說明書，將含有2.5μg(2.5μl儲備液)pX459.gRNA(項目# 1或2或3。不組合gRNA)及2.5μg(2.5μl儲備液)ssODN(項目# 7或8)的混合物用於約100萬個細胞。
2.施加電穿孔(EP)條件：a)1100V，30ms，1個脈衝；或b)1200V，30ms，1個脈衝。
3.在EP之後，將細胞均勻地分至含有Rock抑制劑(10μM)之6孔盤的3個孔中。
4.在種植後兩天，添加嘌呤黴素，如表9中所指示。
5.在添加嘌呤黴素後兩天，用新鮮的無嘌呤黴素培養基替換用過的培養基。
6.將培養物維持2週，然後挑取集落。
Figure 107126585-A0305-02-0279-43
2號方案(使用RNP電穿孔)：
1.使用冰桶。在冰上解凍一個sgRNA(項目# 4或5或6；不組合gRNA)、一個ssODN供體模板(項目# 7或8)及SpCas9蛋白質(項目# 9)以及Cas9-Puro表現載體。Cas9-Puro表現載體用作選擇標記物。其為pX459-hSpCas9-2A-Puro質體且具有圖15中所示之結構，但其不選殖至gRNA中。
2.清楚地標記1.7ml微量離心管及6孔盤。為各樣品準備一個微量離心管及1個孔。向各孔中添加3ml培養基(來自StemCell Technologies之TeSR-E8(目錄號05940))。
3.準備一個含有25ml PBS之10cm培養皿以洗滌Neon®尖端。
4.製備6孔盤用於種植經電穿孔之細胞。向各孔中添加3ml培養基。
5.在各微量離心管中，添加4μg(4μl儲備液)sgRNA(項目4、5或6。不組合sgRNA)及10μg(10μl儲備液)SpCas9蛋白質(項目# 9)，使管在室溫下達至少10分鐘。
6.在各管中添加5μg(5μl儲備液)ssODN(項目# 7或8)及2.5μg(2.5μl儲備液)Cas9-Puro表現載體。
7.將細胞再懸浮於適當的Neon® EP緩衝液R中，達到1×107個細胞/毫升之最終密度。
8.將105μL細胞懸浮液等分且添加至含有CRISPR RNP混合物之各微量離心管中。
9.向Neon®移液管中添加3ml緩衝液E2且將Neon®移液管置於Neon®移液管放置台上。
10.使用100μLNeon®尖端。從各微量離心管吸出100μL EP混合物且將其插入Neon®移液管中。
11.施加上表9中之一種EP條件且遵循上文1號方案之步驟3至6。
注意：若iPSC生長的不好，則推薦條件培養基。收集用過的培養基(無嘌呤黴素)並過濾該培養基，以除去細胞碎片。以1：1的比率混合用過的培養基與新鮮培養基。推薦使用基質膠(Corning目錄號354277)及來自StemCell Technologies之培養基TeSR-E8(目錄號05940)在整個基因編輯過程中於無飼養條件下培養人類iPSC。在EP後種植細胞時向培養基中添加Rock抑制劑(最終濃度10μM)達48小時將有助於保持細胞活力。
3號方案(使用RNP核轉染)：
1.Lonza 4D-核轉染，參數設置：Lonza程序，DS-150
2.分開製備RNP(cas9+gRNA)及ssODN(使體積最大為10μL)，使用前混合。參見表10。
(1)gRNA1 +CYP4V2正向ssODN(2)gRNA2 +CYP4V2正向ssODN
(3)gRNA1 +CYP4V2反向ssODN(4)gRNA2 +CYP4V2反向ssODN
Figure 107126585-A0305-02-0281-44
3.收集並計數細胞：5*105個iPS細胞
4.藉由輕輕地上下移液3-5次，用RNP+ssODN(10μL)懸浮細胞
5.向細胞懸浮液中添加Lonza套組緩衝液20μL，將核轉染前的培育時間降到最低。
6.將混合物(30μL)加載至Lonza套組孔中。檢查阻抗。
7.使用設置參數(DS150)對細胞進行電穿孔。
8.藉由將70μL mTeSR(含有Rock抑制劑)直接加入套組孔中，輕輕地再懸浮經電穿孔之細胞。
9.將細胞種植在6孔盤之一個孔中的繼代培養基中。
10.在電穿孔後24小時觀測細胞活力，並用培養用之培養基替換培養基。
注意：此方案不使用選擇標記物。挑取核轉染存活細胞進行單細胞擴增。除了Lonza DS-150程序之外，亦可使用諸如CB-150之其他參數。
實例22-產生經基因修復的患者細胞株且在產生經基 因修復的患者細胞株時及在眼細胞療法中使用RNP
含有CRISPR g1或g2(項目# 1或2)之表現質體構建體及含有sgRNA1或sgRNA2(項目# 4或5，Synthego,Silicon Valley,CA,USA)及SpCas9(項目# 9，目錄號：A034a-a-1000，來自Feldan(Quebec,Canada)，或來自Synthego(例如，釀膿鏈球菌Cas9核酸酶2NLS)之CRISPR RNP構建體以及CYP4V2供體模板(項目#7或#8，ssODN，Ultramer DNA寡核苷酸，Integrated DNA Technologies(IDT),Coralville,Iowa,USA)中之每一者，皆用於轉染攜帶c.802-8_810del17insGC突變之患者iPSC。
藉由同源定向修復(HDR)評定基因校正：
在轉染後，收集所挑取的細胞進行PCR，然後進行靶向擴增子定序，以評定含有c.802-8_810del17insGC突變之CYP4V2區域中之基因校正。經轉染細胞之深度定序顯示，讀段含有精確的突變校正，藉由插入17bp「TCATACAGGTCATCGCT」且缺失「GC」，促使將突變校正為野生型序列(SEQ ID NO：47)。任何未轉染之對照組iPSC中看不到突變校正。結果亦能供作為經轉染細胞中之HDR頻率的指示。
獲得具有最小脫靶編輯或沒有脫靶編輯的iPS選殖株：
在評定HDR之後，再次在攜帶c.802-8_810del17insGC突變之患者iPSC中進行轉染。 經轉染細胞經歷單細胞選殖及擴增。然後經由定序評定確認具有中靶HDR之選殖細胞株的脫靶編輯。對於臨床應用，使用全基因體定序(60×覆蓋率)來比較同一患者之經編輯及未轉染之細胞株。選擇沒有脫靶編輯或脫靶編輯最小且在基因組中已知沒有重大不利後果的經編輯選殖iPS細胞株。
將經基因校正的iPS分化成所期望類型的細胞
然後將所選擇的iPS選殖細胞株分化成iPS-RPE細胞(參見本文中之實例)。所選擇的iPS選殖細胞株可以分化成期望在細胞療法中使用的其他類型的細胞(例如，iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CE細胞、iPS-CEC或其他iPS-眼細胞)。
用以確認經基因修復的iPS或iPS衍生之細胞不再具有表型的生物分析
測試經基因校正(或經基因修復)之iPS-RPE細胞的生化功能(參見本文中之實例)並確認其不再具有如未經處理之患者iPS-RPE細胞中所看到的表型。檢測經基因修復的患者iPS-RPE細胞中之CYP4V2表現。
不同於引起所編碼之CRISPR組分(例如，gRNA、Cas核酸酶及/或供體模板)之持久表現的質體或其他載體構建體(例如，AAV、慢病毒)，CRISPR RNP構建體起效快(fast on)且停止作用亦快(fast off)。RNP構建體之組分在經轉染細胞中相對較快地降解。因此，與質體及其他構建體相比，使用RNP構建體能降低脫靶編輯風險。 這使得RNP構建體特別適合臨床應用，諸如用於產生適合移植的經基因修復的患者細胞，以及體內治療(例如，將RNP構建體注射至個體之眼睛進行體內基因校正)。除了治療BCD之外，本文中所提供之CRISPR RNP構建體及方法亦可用於治療其他疾病，包括與表4中所闡述之突變的或有缺陷的基因相關的疾病。
實例23：在眼細胞療法中使用經基因修復的細胞
可以將經基因修復的iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CEC、iPS-CE細胞或其他iPS-眼細胞移植至患者之眼睛作為一種眼細胞療法。舉例而言，其等可用作BCD患者中之死的或退化的RPE細胞、光感受器或其他眼細胞的自體替代細胞。經基因修復的細胞可以直接移植(例如，細胞懸浮液)或以其他形式移植，包括但不限於作為層、層片、基質、支架或組織之一部分。移植中所用的經基因修復的細胞之量視以下因素而定：靶向替代的細胞類型、需要替代細胞之區域的大小及待治療之個體(例如，待治療個體之年齡、性別、體重、疾病及病狀之發展階段)；給藥途徑；移植位置(例如，視網膜對比角膜)；移植形式(例如，細胞懸浮液對比作為層、層片、基質、支架或組織之一部分)；及所需之攝生法。單次移植給一隻眼睛之指定細胞類型(例如RPE細胞、光感受器、CEC或CE細胞)的細胞之量可以在約1,000個細胞至1000萬個細胞的範圍內。
必要時，可以在用於臨床使用的GMP設施 中製造細胞。用於細胞療法產品的GMP設施可經由研究機構、委外生產服務(CMO)及受託研究機構(CRO)而在商業上獲得，例如經由凱斯西儲大學(Case Western Reserve University)之細胞療法綜合服務(Cellular Therapy Integrated Services)、貝勒醫學院(Baylor College of Medicine)之細胞及基因療法中心(Center for Cell and Gene Therapy)、CELLforCURE、紐約幹細胞基金會(New York Stem Cell Foundation)及Lonza獲得。
對於視網膜退化疾病，包括受RPE退化影響的疾病，諸如年齡相關性黃斑退化(AMD)，患者特異性自體給藥可以使用與在同種異體眼細胞療法(例如，胚胎幹細胞衍生之RPE(ES-RPE)移植)中所用的相同的給藥/遞送方法。此類給藥/手術方法為此項技術中已知的。
實例24-針對眼部疾病之基因療法及細胞療法組合治療
本文中之揭示內容描述了在針對BCD之基因療法及細胞療法中使用的組成物及方法。對於眼部疾病，基因療法及細胞療法各自有其自身的優缺點。一方面，基因療法在疾病早期至中期，當患者仍留有大量視網膜(或眼部)細胞來接受基因療法治療並得到基因療法治療的拯救時，效果較好。然而，基因療法對於所有沒有剩下相關眼細胞(例如，RPE或PRC)之晚期患者效果不好或根本不起作用。另一方面，細胞療法提供替代細胞來替代患者眼中之死的或退化的細胞，且相對於基因療法，有其自己的 優勢，特別是對於晚期患者及顯性遺傳性疾病而言。然而，細胞療法不能拯救患者眼中剩餘的「原始」細胞，該等細胞之存活不僅能保留患者的剩餘視力，而且有助於整合替代細胞。
為了解決基因療法及細胞療法之限制並給患者帶去最大益處，開發一種針對BCD之基因療法及細胞療法組合治療方法，其亦可用於其他眼部疾病。該方法包含：(a)在體內在患者之眼睛中施加基因療法(例如，AAV.CYP4V2基因療法或CRISPR基因校正療法)；及(b)體外產生經基因修復的患者特異性自體iPS-眼細胞(例如，iPS-RPE細胞、iPS-PRC、iPS-CE細胞、iPS-CEC或其他類型的受該疾病影響的眼細胞)且將這些細胞移植至患者之眼睛中。
其中(a)及(b)可以依序施加(先(a)後(b)，或先(b)後(a))或同時施加(例如，在一次給藥中注射基因療法載體及細胞)。(a)或(b)各自可向同一隻眼睛施加一或多次。視疾病、疾病階段及患者之個體情況而定，(a)及(b)可以靶向相同類型或不同類型的眼細胞。舉例而言，在BCD的情況下，由泛在啟動子驅動之基因療法載體能引起RPE細胞、光感受器及其他視網膜細胞中之CYP4V2表現，而細胞療法則可集中於提供經再生的RPE細胞及/或光感受器。
在此情況下，細胞療法可以藉由提供新細胞 (例如，RPE或光感受器細胞)來獲益，而基因療法可以藉由拯救剩餘的RPE或光感受器細胞及/或藉由改善脈絡膜細胞之狀況來改善細胞療法的效果，脈絡膜細胞之健康影響眼細胞之狀況。基因療法與細胞療法各自對應的「拯救」與「替代」作用之組合使組合治療變成了基因療法或細胞療法之改良方案。此組合治療方法可應用於由一或多個遺傳突變引起的眼部疾病及其他疾病，包括但不限於與表4中所闡述之突變的或有缺陷的基因相關的疾病。
應理解，雖然本文中已結合多個不同態樣描述了標的方法及組成物，但是以上對各個態樣之描述是意欲用以說明而非限制標的方法及組成物的範疇。其他態樣、優勢及修改在以下申請專利範圍之範疇內。
所揭示者為可用於、可聯合用於、可用於製備或作為所揭示方法及組成物之產品的方法及組成物。本文中揭示這些及其他材料，且應理解，本文亦揭示了這些方法及組成物之組合、子集、相互作用、群組等。亦即，雖然這些組成物及方法的每種不同個體及集體組合及變更的具體參照可能未被明確揭示，但在本文中具體考量並描述了每一者。舉例而言，若揭示並論述了特定標的組成物或特定方法且論述了多種組成物或方法，則該等組成物及該等方法之每一種組合及變更都是經過具體考量的，除非有特別指出相反的情況。同樣地，這些的任何子集或組合亦經具體考量並揭示。
序列
序列表
* 除非另外註釋，否則序列中所用的所有參考編號均為NCBI參考編號。
第I部分：基因療法序列
A.cDNA及功能性CYP4V2蛋白質序列
SEQ ID NO：1-編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之cDNA序列(1578bp)，本文中稱為CYP4V2st。
SEQ ID NO：2-編碼人類CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：4)之密碼子最佳化的cDNA序列(1578bp)，本文中稱為CYP4V2op。
SEQ ID NO：3-編碼功能性CYP4V2蛋白質(SEQ ID NO：5)之cDNA序列(1578bp)，本文中稱為CYP4V2fv。
SEQ ID NO：4-人類CYP4V2蛋白質(NP_997235.3)之胺基酸序列(525 aa)
SEQ ID NO：5-人類CYP4V2蛋白質之功能變異體的胺基酸序列(525 aa)
SEQ ID NO：6-人類CYP4V2蛋白質之不含跨膜域的片段(490 aa)
SEQ ID NO：7-人類CYP46A1之胺基酸序列
SEQ ID NO：8-人類CYP4A11之胺基酸序列
SEQ ID NO：9-人類CYP4A22之胺基酸序列
SEQ ID NO：10-人類CYP4B1之胺基酸序列
SEQ ID NO：11-人類CYP4F2之胺基酸序列
SEQ ID NO：12-人類CYP4F3之胺基酸序列
SEQ ID NO：13-人類CYP4F8之胺基酸序列
SEQ ID NO：14-人類CYP4F11之胺基酸序列
SEQ ID NO：15-人類CYP4F12之胺基酸序列
SEQ ID NO：16-人類CYP4F22之胺基酸序列
SEQ ID NO：17-人類CYP4X1之胺基酸序列
SEQ ID NO：18-人類CYP4Z1之胺基酸序列
SEQ ID NO：19-黑猩猩CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：20-恆河猴CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：21-狗CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：22-牛CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：23-家鼠CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：24-挪威大鼠(Norway rat)CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：25-雞CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：26-熱帶爪蛙CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：27-馬CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：28-兔CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：29-果蠅CYP4V2之胺基酸序列
SEQ ID NO：30-P450特徵元件序列
SEQ ID NO：31-P450特徵元件序列
B.示範性調節序列及ITR序列
SEQ ID NO：32-CAG啟動子序列
SEQ ID NO：33-WPRE強化子序列
SEQ ID NO：34-bGH PolyA序列
SEQ ID NO：35-EFS啟動子序列
SEQ ID NO：36-小polyA(SPA)序列
SEQ ID NO：37-科札克序列
SEQ ID NO：38-科札克序列
SEQ ID NO：39-SV40晚期PolyA序列
SEQ ID NO：40-CMV啟動子序列
SEQ ID NO：41-EF-1α啟動子序列
SEQ ID NO：42-AAV2 5'左側-ITR序列
SEQ ID NO：43-AAV2 3'右側-ITR序列
SEQ ID NO：44-scAAV中所用之突變型AAV2 5' ITR序列
SEQ ID NO：45-scAAV中所用之AAV2 3' ITR序列
第II部分. 細胞療法序列
SEQ ID NO：46-含有c.802-8_810del17insGC突變之人類CYP4V2基因區域
SEQ ID NO：47-不含c.802-8_810del17insGC突變之野生型人類CYP4V2基因區域
SEQ ID NO：48-gRNA 1
SEQ ID NO：49-gRNA 2
SEQ ID NO：50-gRNA 3
SEQ ID NO：51-gRNA 4
SEQ ID NO：52-gRNA 5
SEQ ID NO：53-crRNA示範性序列
SEQ ID NO：54-tracrRNA示範性序列
SEQ ID NO：55-sgRNA示範性序列
SEQ ID NO：56-供體模板1序列
SEQ ID NO：57-供體模板2序列
SEQ ID NO：58-SpCas9胺基酸序列
SEQ ID NO：59-在質體構建體中及在IVT sgRNA中緊接在U6啟動子序列之後且在原型間隔區元件序列之前插入的額外核苷酸
第III部分：CYP4V2表現匣序列(包括AAV ITR及接合/連接序列)。
SEQ ID NO：60-AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op中之CYP4V2表現匣之序列。
SEQ ID NO：61-AAV5.CYP4V2st中之CYP4V2表現匣之序列。AAV5.CYP4V2st與AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO：60)具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)，但是CYP4V2 cDNA及接合/連接序列不同。
SEQ ID NO：62-AAV8.CYP4V2fv中之CYP4V2表現匣之序列。AAV8.CYP4V2fv與AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO：61)具有相同的啟動子(CAG)、強化子 (WPRE)及polyA(bGH-polyA)及接合/連接序列且僅CYP4V2 cDNA序列不同。
SEQ ID NO：63-AAV5.CYP4V2op(新)中之CYP4V2表現匣之序列。AAV5.CYP4V2op(新)與AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO：61)及AAV8.CYP4V2fv(SEQ ID NO：62)具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/連接序列，但是CYP4V2 cDNA序列不同。
SEQ ID NO：64-scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op中之CYP4V2表現匣之序列。
序列
SEQ ID NO：1(CYP4V2st cDNA，1578bp)
Figure 107126585-A0305-02-0292-45
SEQ ID NO：2(CYP4V2op cDNA，1578bp)
Figure 107126585-A0305-02-0293-46
SEQ ID NO：3(CYP4V2fv cDNA，1578bp)
Figure 107126585-A0305-02-0293-47
SEQ ID NO：4(人類CYP4V2蛋白質，NP_997235.3，525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0293-48
SEQ ID NO：5(人類CYP4V2蛋白質之功能變異體；525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0294-49
SEQ ID NO：6(CYP4V2之功能片段(缺乏跨膜域；490 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0294-50
SEQ ID NO：7(CYP46A1，NP_006659，500 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0294-51
SEQ ID NO：8(CYP4A11，NP_000769，519 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0294-52
SEQ ID NO：9(CYP4A22，NP_001010969，519 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0294-53
SEQ ID NO：10(CYP4B1，NP_000770，511 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0294-86
Figure 107126585-A0305-02-0295-55
SEQ ID NO：11(CYP4F2，NP_001073，520 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0295-56
SEQ ID NO：12(CYP4F3，NP_000887，520 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0295-57
SEQ ID NO：13(CYP4F8，NP_009184，520 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0295-58
SEQ ID NO：14(CYP4F11，NP_067010，524 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0295-59
SEQ ID NO：15(CYP4F12，NP_076433，524 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0296-60
SEQ ID NO：16(CYP4F22，NP_775754，531 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0296-61
SEQ ID NO：17(CYP4X1，NP_828847，509 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0296-62
SEQ ID NO：18(CYP4Z1，NP_835235，505 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0296-63
SEQ ID NO：19(細胞色素P450 4V2同功型(isoform)X1[黑猩猩(Pan troglodytes)(黑猩猩(chimpanzee))]，XP_001165629.1，525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0296-64
Figure 107126585-A0305-02-0297-65
SEQ ID NO：20(細胞色素P450 4V2[獼猴(恆河獼猴、恆河猴)]，NP_001180767.1，525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0297-66
SEQ ID NO：21(細胞色素P450 4V2[家犬(狗)]，XP_013975571.1，539 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0297-67
SEQ ID NO：22(細胞色素P450 4V2[牛(Bos taurus)(牛(cattle))]，NP_001029545，527 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0297-68
SEQ ID NO：23(Cyp4v3，細胞色素P450 4V2[小家鼠(家鼠)]，NP_598730.1，525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0297-69
Figure 107126585-A0305-02-0298-70
SEQ ID NO：24(Cyp4v3，細胞色素P450 4V2[褐家鼠(挪威大鼠)]，NP_001129072，525 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0298-71
SEQ ID NO：25(細胞色素P450 4V2[原雞(Gallus gallus)(雞)]，NP_001001879，530 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0298-72
SEQ ID NO：26(細胞色素P450家族4亞家族V成員2[熱帶爪蟾(熱帶爪蛙)]，NP_001072667.1，523 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0298-73
SEQ ID NO：27(細胞色素P450 4V2[馬(Equus caballus)(馬(horse))]，XP_014592182.1，469 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0298-74
SEQ ID NO：28(細胞色素P450 4V2[穴兔(兔)]，XP_002709379.1，524 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0299-75
SEQ ID：29(細胞色素P450-4c3[黑腹果蠅(果蠅)]，NP_524598，535 aa)
Figure 107126585-A0305-02-0299-76
SEQ ID NO：30(P450特徵元件，「x」表示任何胺基酸)
FxxGxxxCxG
SEQ ID NO：31(P450特徵元件，「x」表示任何胺基酸)
ExxR
SEQ ID NO：32(CAG啟動子，1715bp)
Figure 107126585-A0305-02-0300-77
SEQ ID NO：33(WPRE強化子，589bp)
Figure 107126585-A0305-02-0300-78
SEQ ID NO：34(bGH polyA，225bp)
Figure 107126585-A0305-02-0300-79
SEQ ID NO：35(EFS啟動子，235bp)
Figure 107126585-A0305-02-0300-80
SEQ ID NO：36(SPA，54bp)
GATCCAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG
SEQ ID NO：37(科札克序列，6bp)
GCCACC
SEQ ID NO：38(科札克序列，5bp)
CCACC
SEQ ID NO：39(SV40晚期PolyA，120bp)
TTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAT
SEQ ID NO：40(CMV啟動子，576bp)
Figure 107126585-A0305-02-0301-82
SEQ ID NO：41(EF-1α啟動子，1184bp)
Figure 107126585-A0305-02-0301-83
SEQ ID NO：42(AAV2 5'左側-ITR，141bp)
Figure 107126585-A0305-02-0301-84
SEQ ID NO：43(AAV2 3'右側-ITR，141bp)
Figure 107126585-A0305-02-0301-85
SEQ ID NO：44(scAAV構建體中之突變型AAV2 5' ITR，117bp)
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtgg
SEQ ID NO：45(scAAV構建體中之AAV2 3' ITR，141bp)
Figure 107126585-A0305-02-0302-87
SEQ ID NO：46(含有c.802-8_810del17insGC突變之人類CYP4V2基因區域)
CAAACAGAAGCATGTGATTATCATTCAAAGCGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGA
SEQ ID NO：47(不含c.802-8_810del17insGC突變之野生型人類CYP4V2基因區域)
CAAACAGAAGCATGTGATTATCATTCAAATCATACAGGTCATCGCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGA
SEQ ID NO：48(g1原型間隔區元件，RNA序列，20nt)
UGAUUAUCAUUCAAAGCGAA
SEQ ID NO：49(g2原型間隔區元件，RNA序列，20nt)
GAUUAUCAUUCAAAGCGAAC
SEQ ID NO：50(g3原型間隔區元件，RNA序列，20nt)
GAUAAUCACAUGCUUCUGUU
SEQ ID NO：51(g4原型間隔區元件，RNA序列，20nt)
UUCAUUGGCGUUCAUUUCAU
SEQ ID NO：52(g5原型間隔區元件，RNA序列，20nt)
CACAUGCUUCUGUUUGGACU
SEQ ID NO：53(crRNA示範性序列(不包括5'原型間 隔區元件序列，16nt)
GUUUUAGAGCUAUGCU
SEQ ID NO：54(tracrRNA示範性序列，67nt)
AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU
SEQ ID NO：55(sgRNA示範性序列，不包括5'原型間隔區元件序列及在原型間隔區元件前視情況存在的「G」。序列以DNA形式顯示，如在質體構建體中。對於呈RNA形式的序列，使用「U」替代「T」，82nt)
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagt cggtgctttttt
SEQ ID NO：56(CYP4V2供體模板1序列，200個鹼基)
Figure 107126585-A0305-02-0303-90
SEQ ID NO：57(CYP4V2供體模板2序列，CYP4V2供體模板1序列之反向互補序列，200個鹼基)
Figure 107126585-A0305-02-0303-89
SEQ ID NO：58(SpCas9示範性胺基酸序列(1368 aa))
Figure 107126585-A0305-02-0303-88
Figure 107126585-A0305-02-0304-91
SEQ ID NO：59(在質體構建體中及在IVT sgRNA中緊接在U6啟動子序列之後且在原型間隔區元件序列之前插入的額外核苷酸，1nt)
G
SEQ ID NO：60-AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op中之CYP4V2表現匣之序列：左側-ITR：1-141
CAG啟動子：237-1951
CYP4V2op cDNA：2002-3579
WPRE強化子：3736-4324
bGH polyA：4350-4574
右側-ITR 4659-4799
Figure 107126585-A0305-02-0305-92
Figure 107126585-A0305-02-0306-93
Figure 107126585-A0305-02-0307-94
SEQ ID NO：61-AAV5.CYP4V2st中之CYP4V2表現匣之序列。AAV5.CYP4V2st與AAV2.CYP4V2op、AAV2tri(Y-F).CYP4V2op及AAV5.CYP4V2op(SEQ ID NO：60)具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)，但是CYP4V2 cDNA及接合/連接序列不同：左側-ITR：1-141
CAG啟動子：166-1880
CYP4V2st cDNA：1938-3515
WPRE強化子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右側-ITR：4399-4539
Figure 107126585-A0305-02-0308-95
Figure 107126585-A0305-02-0309-96
SEQ ID NO：62-AAV8.CYP4V2fv中之CYP4V2表現匣之序列。AAV8.CYP4V2fv與AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO：61)具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及接合/連接序列且僅CYP4V2 cDNA序列不同：左側-ITR：1-141
CAG啟動子：166-1880
CYP4V2fv cDNA：1938-3515
WPRE強化子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右側-ITR：4399-4539
Figure 107126585-A0305-02-0310-97
Figure 107126585-A0305-02-0311-98
SEQ ID NO：63-AAV5.CYP4V2op(新)中之CYP4V2表現匣之序列。AAV5.CYP4V2op(新)與AAV5.CYP4V2st(SEQ ID NO：61)及AAV8.CYP4V2fv(SEQ ID NO：62)具有相同的啟動子(CAG)、強化子(WPRE)及polyA(bGH-polyA)及相同的接合/連接序列，但是CYP4V2 cDNA序列不同：左側-ITR：1-141
CAG啟動子：166-1880
CYP4V2op cDNA：1938-3515
WPRE強化子：3551-4139
bGH polyA：4163-4387
右側-ITR：4399-4539
Figure 107126585-A0305-02-0312-99
Figure 107126585-A0305-02-0313-100
SEQ ID NO：64-scAAV1.CYP4V2op、scAAV5.CYP4V2op及scAAV9.CYP4V2op中之CYP4V2表現匣之序列。
左側-ITR(截短)：1-117
EFS啟動子：130-364
CYP4V2op cDNA：520-2097
SPA：2116-2169
右側-ITR：2263-2403
Figure 107126585-A0305-02-0313-101
Figure 107126585-A0305-02-0314-102
Figure 107126585-A0305-02-0315-103

Claims (50)

  1. 一種載體，其包含可操作地連接至至少一個調節序列的核酸分子，該核酸分子包含編碼非突變型或功能性CYP4V2蛋白質或其變異體的序列，該非突變型或功能性CYP4V2蛋白質或其變異體與SEQ ID NOs：4-6及19-29中的任意者之胺基酸序列具有至少96%的序列同一性，其中該載體為重組腺相關病毒(rAAV)載體。
  2. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體包含選自以下任何血清型的VP1、VP2或VP3殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一天然衍生之血清型或分離株或分支、或其雜合體、變異體或衍生物。
  3. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體包含選自以下中的任一者的5’ AAV反向末端重複序列ITR或3’ AAV ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、或AAV的另一天然衍生之血清型或分離株或分支、或其突變體、嵌合體、變異體、衍生物或融合物。
  4. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體為嵌合AAV、重排AAV或殼體經修飾的AAV。
  5. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體為假型化AAV。
  6. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體為 雜合AAV。
  7. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體包含對一種或多種天然AAV殼體蛋白的一個或多個修飾。
  8. 如請求項7之載體，其中對AAV殼體蛋白的修飾包含Y被F取代、K被R取代、T被A取代、S被A取代或T被V取代中的一個或多個胺基酸殘基取代。
  9. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體選自由以下組成的群：AAV2/5、AAV2/8、AAV2/2、AAV2、AAV2/1、AAV2/9、AAV2/6、AAV2/4、AAV2/7、AAV5、AAV8、AAV1、AAV9、AAV6、AAV10、AAV3、AAV4、AAV7、AAV11、AAV12、Anc80、AAV 7m8、AAV-DJ、ShH10、AAV-PHP.B、rh10，及其雜合體、衍生物或變異體。
  10. 如請求項9之載體，其中該AAV2中的修飾為Y444F+Y500F+Y730F，或Y444F、Y500F、Y730F其中任意一個或多個修飾。
  11. 如請求項9之載體，其中該AAV2/8中的修飾為Y733F。
  12. 如請求項1之載體，其中該rAAV載體為單鏈AAV載體即ssAAV載體或自身互補型AAV載體即scAAV載體。
  13. 如請求項1之載體，其中該編碼非突變型或功能性CYP4V2蛋白質或其變異體的序列與SEQ ID NOs：1-3中的任意者之核酸序列具有至少60%的序列同一 性。
  14. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列包含啟動子。
  15. 如請求項14之載體，其中該啟動子為視網膜色素上皮(RPE)細胞特異性啟動子、光感受器細胞(photoreceptor cell)特異性啟動子、視網膜細胞特異性啟動子、角膜細胞特異性啟動子、眼細胞特異性啟動子、細胞特異性啟動子、組織特異性啟動子、組成型啟動子、泛在啟動子、受調節的啟動子、誘導型啟動子，或其衍生物、雜合體或組合。
  16. 如請求項14之載體，其中該啟動子選自由以下組成的群：CAG啟動子或稱為CAGGS啟動子或CB啟動子或CBA啟動子、雞β肌動蛋白啟動子、小CBA啟動子、CBSB啟動子、CBh啟動子、β-肌動蛋白啟動子、人類β肌動蛋白啟動子、延伸因數1α短型EFS啟動子、延伸因數1α即EF1 alpha或稱EF-1α啟動子、巨細胞病毒CMV啟動子、PGK啟動子、UBC啟動子、GUSB啟動子、UCOE啟動子、VMD2啟動子即卵黃狀黃斑變性2啟動子或BEST1啟動子、RPE65啟動子、GRK1啟動子、人類光感受器間類視色素結合蛋白近端啟動子、hIRBP啟動子的235nt片段、RPGR近端啟動子、紅色視蛋白啟動子、紅色-綠色視蛋白啟動子、藍色視蛋白啟動子、小鼠視蛋白啟動子、視紫紅質Rho啟動子、β磷酸二酯酶PDE啟動子、視網膜色素變性RP1啟動子、NXNL2/NXNL1啟動子、視 網膜退化緩慢/外周蛋白2啟動子、IRBP/GNAT2啟動子、視網膜退化緩慢Rds啟動子、hPDE6b啟動子、VEcad啟動子、鈣敏感啟動子、NFAT啟動子、鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白啟動子、地塞米松-誘導型小鼠乳房腫瘤病毒啟動子、T7聚合酶啟動子系統、蛻皮激素昆蟲啟動子、四環素阻遏系統、四環素誘導系統、RU486-誘導系統、和雷帕黴素誘導系統，其雜合體、變異體和衍生物。
  17. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列包含科札克(Kozak)序列或其變異體。
  18. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列包含強化子。
  19. 如請求項18之載體，其中該強化子包含轉錄後調節元件(PRE)、內部核糖體進入位點(IRES)、內含子調節序列、小內含子剪接供體/剪接受體(SD-SA)或組成型運輸元件(CTE)。
  20. 如請求項18之載體，其中該強化子選自由以下組成的群：土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)強化子、B型肝炎病毒轉錄後調節元件(HPRE或HBVPRE)強化子、IRBP強化子、梅森-菲舍猴病毒CTE強化子、巨細胞病毒(CMV)立即早期強化子、SV40強化子、禽白血病病毒CTE強化子、其衍生物、雜合體和變異體。
  21. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列包含多腺苷酸化(polyA)信號。
  22. 如請求項21之載體，其中該polyA信號選自由以下組成的群：牛生長激素多腺苷酸化信號(bGH polyA)、小polyA信號SPA、人類生長激素多腺苷酸化信號(hGH polyA)、SV40 polyA信號、SV40早期polyA信號、SV40晚期polyA信號、其衍生物、雜合體或變異體。
  23. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列包含可操作地連接至polyA信號的上游強化子(USE)。
  24. 如請求項23之載體，其中該USE選自由以下組成的群：SV40晚期2xUSE、人類免疫缺陷病毒1 USE、地松鼠肝炎病毒USE、腺病毒USE、人類凝血酶原USE、人類C2補體基因USE，及其衍生物、變異體和雜合體。
  25. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列包含內含子序列、UTR序列、剪接位點序列、上游調節域序列、反應元件序列、誘導元件序列、複製起點序列、內部核糖體進入位點IRES序列、轉錄起始序列、終止序列、終止子、RNA加工序列、接合序列、連接序列，其衍生物、雜合體或變異體。
  26. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列相對於由該調節序列調節表達的CYP4V2編碼序列為異源的或同源的。
  27. 如請求項1至13任一項之載體，其中該調節序列包含組織特異性或細胞特異性的微小RNA即 miRNA的目標序列。
  28. 如請求項1至13任一項之載體，其中該載體的任意部分與SEQ ID NO：60至64中的CYP4V2表現匣序列中的任意者有至少43%序列同一性或與以下序列中的任意者有至少43%序列同一性：SEQ ID NO：60的核苷酸nt 237-nt 3579；SEQ ID NO：61的nt 166-nt 3515；SEQ ID NO：62的nt 166-nt 3515；SEQ ID NO：63的nt 166-nt 3515；或SEQ ID NO：64的nt 130-nt 2097。
  29. 如請求項1至13任一項之載體，其包含在藥學上可接受的載劑及適合用於特定給藥途徑或遞送裝置的額外組分中。
  30. 一種細胞，其包含如請求項1至29任一項之載體。
  31. 如請求項30之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞或昆蟲細胞。
  32. 如請求項30之細胞，其中該細胞為HEK293細胞、293T細胞、A459細胞、Sf9細胞，或用於載體製備的其他細胞。
  33. 如請求項30之細胞，其中該細胞為視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞、光感受器先驅細胞、脈絡膜細胞、視網膜細胞、誘導多能性幹(iPS)細胞、胚胎幹(ES)細胞、成體幹細胞或間質幹細胞(MSC)，或源自患有結晶樣視網膜色素變性(BCD，或稱為結晶樣角膜視網膜變性或結晶樣視網膜病變或Bietti視網膜變性或 Bietti結晶營養不良)、或者具有雙等位基因CYP4V2突變的視網膜色素變性(RP)或遺傳性視網膜退化(IRD)的人類對象的該細胞。
  34. 如請求項33之細胞，其中該光感受器細胞為視桿(rod)細胞或視錐(cone)細胞。
  35. 如請求項33之細胞，其中該雙等位基因CYP4V2突變包括純合突變或複合雜合突變。
  36. 一種如請求項30至35中任一項之細胞在製備藥物的用途，該藥物是用於通過以下方法治療、減緩進展、遏制或預防人類對象中的結晶樣視網膜色素變性(BCD，或稱為結晶樣角膜視網膜變性或結晶樣視網膜病變或Bietti視網膜變性或Bietti結晶營養不良)、或者視網膜色素變性(RP)或遺傳性視網膜退化(IRD)，該方法包含向該人類對象的視網膜遞送治療有效量的如請求項30至35任一項之細胞。
  37. 一種如請求項1至29中任一項之載體在製備藥物的用途，該藥物是用於通過以下方法治療、遏制或減緩進展、拯救、改善或預防具有結晶樣視網膜色素變性(BCD，或稱為結晶樣角膜視網膜變性或結晶樣視網膜病變或Bietti視網膜變性或Bietti結晶營養不良)、或者具有雙等位基因CYP4V2突變的視網膜色素變性(RP)或遺傳性視網膜退化(IRD)的人類對象的眼細胞的功能障礙、功能喪失、變性、病症、營養不良、病變、退化、萎縮和/或死亡，該方法包含用治療有效量的如請求項1至29 任一項之載體轉導該眼細胞。
  38. 如請求項37之用途，其中該眼細胞為視網膜細胞、視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞、脈絡膜上皮細胞、角膜上皮細胞、脈絡膜細胞、角膜細胞、視網膜雙極細胞、光感受器先驅細胞、神經節細胞或視神經細胞。
  39. 如請求項38之用途，其中該光感受器細胞為視桿細胞或視錐細胞。
  40. 如請求項37之用途，其中該雙等位基因CYP4V2突變包括純合突變或複合雜合突變。
  41. 一種如請求項1至29中任一項之載體在製備藥物的用途，該藥物是用於通過以下方法治療、遏制或預防人類對象中的結晶樣視網膜色素變性(BCD，或稱為結晶樣角膜視網膜變性或結晶樣視網膜病變或Bietti視網膜變性或Bietti結晶營養不良)、或者具有雙等位基因CYP4V2突變的視網膜色素變性(RP)或遺傳性視網膜退化(IRD)，該方法包含：向該人類對象的視網膜遞送治療有效量的如請求項1至29任一項之載體，其中用該載體轉導該人類對象的一個或多個視網膜色素上皮(RPE)細胞、一個或多個脈絡膜細胞、或一個或多個光感受器細胞，從而在該人類對象中治療、遏制或預防這些疾病。
  42. 如請求項41之用途，其中該雙等位基因CYP4V2突變包括純合突變或複合雜合突變。
  43. 如請求項41之用途，其中該光感受器 細胞為視桿細胞或視錐細胞。
  44. 一種如請求項1至29中任一項之載體在製備用於在眼細胞或幹細胞中表現外源CYP4V2基因的方法的試劑中的用途，該方法包含使該眼細胞或幹細胞與如請求項1至29任一項之載體接觸，其中該眼細胞為視網膜細胞、視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞、脈絡膜上皮細胞、角膜上皮細胞、脈絡膜細胞、角膜細胞、視網膜雙極細胞、光感受器先驅細胞、神經節細胞或視神經細胞。
  45. 如請求項44之用途，其中該光感受器細胞為視桿細胞或視錐細胞。
  46. 如請求項44之用途，其中該幹細胞包含胚胎幹(ES)細胞、誘導多能性幹(iPS)細胞、成體幹細胞或間充質幹細胞(MSC)。
  47. 一種如請求項1至29中任一項之載體在製備藥物的用途，該藥物是用於通過以下方法治療、遏制或預防人類對象的與視網膜色素上皮(RPE)細胞的萎縮、變性、功能障礙、功能喪失、病症、營養不良、病變、退化或死亡相關的疾病，該方法包含：向該人類對象的視網膜遞送治療有效量的如請求項1至29任一項之載體，其中用該載體轉導該人類對象的一個或多個RPE細胞，從而在該人類對象中治療、遏制或預防該疾病。
  48. 一種如請求項1至29中任一項之載體在製備藥物的用途，該藥物是用於通過以下方法治療、遏 制或預防人類對象的與視網膜色素上皮(RPE)細胞的萎縮、變性、功能障礙、功能喪失、病症、營養不良、退化或死亡相關的疾病，該方法包含：向該人類對象的視網膜遞送治療有效量的RPE細胞、幹細胞或由幹細胞分化或衍生的細胞，其中該RPE細胞、幹細胞或由幹細胞分化或衍生的細胞包含如請求項1至29任一項之載體。
  49. 如請求項48之用途，其中該幹細胞包含胚胎幹(ES)細胞、誘導多能性幹(iPS)細胞、成體幹細胞或間充質幹細胞(MSC)。
  50. 一種重組腺相關病毒(rAAV)載體，其包含一表現匣，該表現匣包含編碼非突變型或功能性CYP4V2蛋白質的與SEQ ID NO：2之核酸序列共用至少80%之序列同一性的核酸序列及一或多個可操作地連接至該核酸序列的調節序列，其中該核酸序列所編碼的非突變型或功能性CYP4V2蛋白質與SEQ ID NOs：4-6中的任意者之胺基酸序列具有至少96%的序列同一性。
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