TWI718206B

TWI718206B - Pd-l1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

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Publication number: TWI718206B
Application number: TW105137421A
Authority: TW
Inventors: 屈向東; 胡齊悅; 徐韶瑜; 崔東冰; 金后聰; 陶維康; 張連山; 曹國慶; 孫飄揚
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2015-11-17
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2021-02-11
Also published as: WO2017084495A1; CN109608544A; BR112018009064A8; RU2018119165A3; RU2727914C2; RU2018119165A; MX2018005720A; US20180334504A1; US10815304B2; US20200399375A1; KR102683841B1; AU2016357901A1; EP3378871A4; CN107614529B; CN107614529A; TW201718657A; HK1247213A1; JP2018536401A; AU2016357901B2; JP6983371B2

Abstract

本發明涉及PD-L1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含該PD-L1抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含PD-L1抗體及其抗原結合片段的藥物組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。特别地，本發明涉及一種人源化的PD-L1抗體在製備用於治療PD-L1介導的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

PD-L1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

本發明涉及PD-L1抗體、PD-L1抗體的抗原結合片段、包含所述PD-L1抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含所述PD-L1抗體及其抗原結合片段的藥物組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。

腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域一個長時期的焦點，其中T細胞的腫瘤免疫治療又處於其核心位置。腫瘤免疫治療是充分利用、調動腫瘤患者體內的殺傷性T細胞，對腫瘤進行殺傷作用，它可能是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。與此同時，腫瘤逃逸是腫瘤免疫治療面臨的一個巨大障礙，腫瘤細胞利用其自身對免疫系統的抑制作用促進了腫瘤的快速生長。

腫瘤的免疫逃逸機制與有機體對腫瘤的免疫反應之間存在著極為複雜的關係。腫瘤免疫治療早期腫瘤特異性的殺傷性T細胞是有其生物活性的，但隨著腫瘤生長後期失去了殺傷的功能。所以腫瘤免疫治療是為了最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，它不但要在體內活化原有的免疫系統反應，更要維持免疫系統反應的持續時間和反應强度，才是免疫治療腫瘤的關鍵。

人體內T細胞的活化採取了兩條信号路徑系統，除了需要藉由抗原呈遞細胞呈現MHC-抗原肽給T細胞提供第一信号外，還需要一系列協同刺激分子提供第二信號，進而才能使T細胞產生正常的免疫反應。這個雙信號路徑系統對體內免疫系統的平衡起著至關重要的作用，它嚴格調控有機體對自身和非自身抗原產生不同的免疫反應。如果缺少協同刺激分子提供的第二信號，將會導致T細胞的無反應或持續特異性免疫反應，從而產生耐受。因此，第二信號路徑在有機體免疫反應的整個過程中起著非常關鍵的調節作用。

程序性死亡分子1(programmed death-1,PD-1)是1992年發現的表現在T細胞表面的一個蛋白受體，参與到細胞的凋亡過程之中。PD-1屬於CD28家族，與細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen 4,CTLA-4)具有23%的胺基酸同源性，但其表現却與CTLA不同，主要表現在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上。PD-1有兩個配體，分别為PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表現於T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cell,DC)上，在活化後細胞上的表現能够進行上調。而PD-L2的表現相對較局限，主要表現在抗原呈細胞上，如活化的巨噬細胞和樹突狀細胞。

PD-L1藉由和PD-1及B7-1的結合抑制免疫系統，很多腫瘤細胞及腫瘤組織微環境的免疫細胞表現PD-L1。新的研究發現乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌及肝癌等人類腫瘤組織中檢測到高PD-L1蛋白的表現，且PD-L1的表現水平和患者的臨床及預後緊密相關。

由於PD-L1起到第二信號路徑抑制T細胞增殖的作用，所以阻斷PD-L1/PD-1之間結合成為了腫瘤免疫治療領域一個非常有潛力的新興靶點。

目前有多家跨國製藥公司在研發針對PD-L1的單株抗體，它藉由阻斷PD-L1/PD-1之間結合，最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，從而達到對腫瘤細胞進行殺傷的目的。相關的專利如：WO0139722、WO2013173223、WO2014195852、WO2013181634、WO2015048520、WO2015036511、US2014335093、WO2014100079、WO2014055897、US6803192B1、WO2014022758、US8617546B2和WO2010089411A2。

本發明提供有著高親和力、高選擇性、高生物活性的PD-L1抗體。

本發明提供一種PD-L1抗體或其抗原結合片段，其包含任意1個選自以下的CDR區序列或其突變序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：10-12，SEQ ID NO：16-18；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：13-15，SEQ ID NO：19-21；具體如下：HCDR1選自：NDYWX₁ SEQ ID NO：10或SYWMH SEQ ID NO：16 HCDR2選自：YISYTGSTYYNPSLKS SEQ ID NO：11或RI X₄PNSG X₅TSYNEKFKN SEQ ID NO：17 HCDR3選自：SGGWLAPFDY SEQ ID NO：12或GGSSYDYFDY SEQ ID NO：18 LCDR1選自：KSSQSLFY X₂ SNQK X₃SLA SEQ ID NO：13或RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO：19 LCDR2選自：GASTRES SEQ ID NO：14或AASNLES SEQ ID NO：20 LCDR3選自：QQYYGYPYT SEQ ID NO：15或QQSFEDPLT SEQ ID NO：21；其中X₁選自N或T，X₂選自R或H，X₃選自N或H，X₄選自H或G，X₅選自G或F。

在本發明一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其包含任選自SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的抗體重鏈可變區HCDR序列或其突變序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其包含任選自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21的抗體輕鏈可變區LCDR 序列或其突變序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗體輕鏈可變區可進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區；其中抗體重鏈可變區可進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或IgG2或其變體的重鏈FR區、或IgG3或其變體的重鏈FR區。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述的包含鼠源FR區的抗體重鏈可變區選自SEQ ID NO：6、8或其突變序列，所述的包含鼠源FR區的抗體輕鏈可變區選自SEQ ID NO：7、9或其突變序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗體重鏈可進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區、或者λ鏈或其變體的輕鏈恆定區；其中抗體輕鏈可進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈恆定區、或IgG2或其變體的重鏈恆定區、或IgG3或其變體的重鏈恆定區。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體。根據本發明提供的PD-L1嵌合抗體或其片段，其進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。較佳，所述人源化抗體為人源化抗體9-2或人源化抗體24D5，所述人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈，其中：人源化抗體9-2重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV4-30-4*01和hjh2的組合序列；其包含人種系重鏈IGHV4-30-4*01的FR1、FR2、FR3區和hjh2的FR4區；人源化抗體24D5重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV1-46*01和hjh6.1的組合序列；其包含人種系重鏈IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區。進一步較佳，所述人源化抗體9-2的重鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為一個或多個選自W47Y、V71R、G27Y、I48M、V67L、F78Y、S30T、Q39K的胺基酸回復突變，更佳為選自W47Y和V71R的胺基酸回復突變；所述人源化抗體24D5的重鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為一個或多個選自T74K、R72V、M48I、M70L、R38Q、L83F、V68A、和V79A的胺基酸回復突變。更進一步較佳，所述人源化抗體的重鏈可變區序列如下：人源化抗體9-2重鏈可變區序列為SEQ ID NO：22所示的序列或其變體；或人源化抗體24D5重鏈可變區序列為SEQ ID NO：24所示的序列或其變體。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的 PD-L1抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。較佳，所述的人源化抗體為人源化抗體9-2或人源化抗體24D5，所述人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈，其中：人源化抗體9-2輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈IGKV4-1*01和hjk4.1的組合序列；其包含人種系輕鏈IGKV4-1*01的FR1、FR2、FR3區和hjk4.1的FR4區；人源化抗體24D5輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈IGKV7-3*01和hjk2.1的組合序列；其包含人種系輕鏈IGKV7-3*01的FR1、FR2、FR3區和hjk2.1的FR4區。進一步較佳，所述人源化抗體9-2的輕鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為P49S的胺基酸回復突變；所述人源化抗體24D5輕鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為一個或多個選自Y91F，T22S，G72E的胺基酸回復突變或者引入N85E去糖基化突變。更進一步較佳，所述人源化抗體的輕鏈可變區序列如下：人源化抗體Ab-1輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：23所示的序列或其變體；或人源化抗體Ab-2輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：25所示的序列或其變體。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述的人源化抗體或其片段可進一步進行親和力成熟設計。

在本發明一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中X₁為T，X₂為H，X₃ 為H，X₄為G，X₅為F。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，包括人源化抗體可變區序列如下：人源化抗體9-2：重鏈可變區序列為SEQ ID NO：26；輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：27；人源化抗體24D5：重鏈可變區序列為SEQ ID NO：28，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：29。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段，其中所述人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，更佳包含引入F234A和L235A突變的IgG4重鏈Fc區；所述人源化抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的恆定區。可進一步包含S228P突變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段為人源化抗體9-2或人源化抗體24D5，其中所述人源化抗體9-2包含重鏈抗體序列SEQ ID NO：30，和輕鏈抗體序列SEQ ID NO：32；其中所述人源化抗體24D5包含重鏈抗體序列SEQ ID NO：34，和輕鏈抗體序列SEQ ID NO：36。

本發明進一步提供一種藥物組成物，其含有治療有效量的如上所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

本發明進一步提供一種編碼如上所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段的DNA分子。

本發明進一步提供一種含有編碼如上所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段的DNA分子的表現載體。

本發明進一步提供一種用如上所述的表現載體轉化的宿主細胞，所述宿主細胞選自細菌、酵母菌和哺乳動物細胞；較佳哺乳動物細胞。

在本發明一個較佳的實施方案中，本發明所述的宿主細胞為細菌，較佳為大腸杆菌。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的宿主細胞為酵母菌，較佳為畢赤酵母。

在本發明另一個較佳的實施方案中，根據本發明提供的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗原結合片段為Fab、Fv、ScFv、F(ab’)₂。

本發明進一步提供一種根據本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段、或包含其的藥物組成物，在製備用於治療PD-L1介導的疾病或病症的藥物中的用途；其中所述的疾病較佳為癌症；更佳為表現PD-L1的癌症；所述的癌症最佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、膀胱癌；進一步較佳為非小細胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌和腎癌。

本發明進一步提供一種治療和預防PD-L1介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予所需患者治療有效量的根據本發明所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段、或包含其的的藥物組成物；其中所述的疾病較佳為癌症；更佳為表現PD-L1的癌症；所述的癌症最佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、膀胱癌；最佳為非小細胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌和腎癌。

第1圖：人源化選殖株構建時引子設計示意圖。

第2圖：人源化選殖株構建的載體構建示意圖。

第3圖：人源化抗體對PBMC的增殖的刺激。

一、術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分别為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差别，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高度變異區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高度變異區决定抗體的特異性，又稱為互補性决定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人PD-L1的單株抗體。製備時用PD-L1抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，所述的鼠源PD-L1抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恆定區。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以减輕鼠源性抗體誘發的免疫反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，所述的PD-L1嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。所述的PD-L1嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR 序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於携帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的强烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的参考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。

本發明中所述的“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及與人PD-L1結合的Fv片段ScFv片段；其包含本發明所述抗體的選自SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：21中的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但没有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能够形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接子將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。本發明的術語“與PD-L1結合”，指能與人PD-L1相互作用。本發明的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本發明抗體或抗原結合片段識别的三維空間位點。

本發明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表現Fc受體的細胞藉由識别抗體的Fc段直接殺傷被抗體包覆的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。所述的修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4chimera，IgG4的F234A/L235A突變。

本發明中所述的融合蛋白是一種藉由DNA重組得到的兩個基因共表現的蛋白產物。重組PD-L1胞外區Fc融合蛋白是藉由DNA重組將PD-L1胞外區和人抗體Fc片段共表現的融合蛋白。所述的PD-L1胞外區是指PD-L1蛋白表現在細胞膜以外的部分，序列見下面SEQID NO：4劃線區。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，老鼠可以用人PD-L1或其片段免疫，所得到的抗體能被復性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈(SEQID NO：30)和輕鏈(SEQID NO：32)的CDNA序列，可以選殖並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特别是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表現與人PD-L1特異性結合的抗體得到穩定的選殖株。陽性的選殖株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組成物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀况的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被减輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢定方法如Student t檢定、卡方檢定、依據Mann和Whitney的U檢定、Kruskal-Wallis檢定(H檢定)、Jonckheere-Terpstra檢定和Wilcoxon檢定確定，其在統計學顯著數目的患者中應當减輕目標疾病症狀。

本發明中所述的“或其突變序列”或“或其變體”中的“突變序列”或“變體”指對相關的序列進行“保守修飾”或“保守置換或取代”。所述的“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(参見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情况、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指根據情况在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情况在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基占據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤占據時，那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞株”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情况下，其由上下文清楚可見。

本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般参見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，所述方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“藥物組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，所述其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

二、實施例與測試例

以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手册，分子選殖手册；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1、PD-L1抗原及檢測用蛋白的製備一、蛋白設計及表現

以UniProt Programmed Cell Death1 Ligand1(PD-L1)isoform1(SEQ ID NO：1)的人PD-L1全長基因(義翹神州生物技術有限公司，HG10084-M)，作為本發明PD-L1的模板，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白的基因序列，可選地與抗體重鏈Fc片段(如human IgG1)重組，分别選殖到pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)或pTargeT載體上(promega,A1410)，在293F細胞(Invitrogen，R79007)瞬轉表現或CHO-S細胞(Invitrogen,k9000-20)穩定表現，純化，獲得編碼本發明抗原及檢測用蛋白。人PD-1基因購自ORIGENE，貨號SC117011，NCBI Reference Sequence：NM_005018.1。

1、人PD-L1全長胺基酸序列

SEQ ID NO：1

注釋：雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-18)；劃橫線部分為PD-L1胞外區(Extracellular domain：19-238)，其中19-127為Ig-like V-type Domain，133-225為Ig-like C2-type Domain；點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：239-259)；斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：260-290)。

2、免疫原：帶His、PADRE標籤的PD-L1：PD-L1(Extra Cellular Domain，簡稱ECD)-PADRE-His6

SEQ ID NO：2

注釋：劃橫線部分為PD-L1胞外區；點劃線部分為PADRE標記；斜體部分為His6-tag標記。

3、得到帶FLAG、HIS標籤的PD-L1：PD-L1(ECD)-Flag-His6，用於本發明抗體的性能測試。

SEQ ID NO：3

注釋：劃橫線部分為PD-L1胞外區；點劃線部分為FLAG-Tag標記；斜體部分為His6-tag標記。

4、PD-L1的Fc融合蛋白：PD-L1(ECD)-Fc，用作本發明的免疫抗原或檢測試劑。

VKL-PD-L1(ECD)-Fc(human IgG1)

SEQ ID NO：4

注釋：劃橫線部分為PD-L1胞外區；斜體部分為human IgG1 Fc部分。

5、PD-1的Fc融合蛋白：PD-1(ECD)-Fc，用於本發明抗體的性能測試。

SEQ ID NO：5

注釋：劃橫線部分為PD-1(ECD)胞外區；斜體部分為hFC(human IgG1)部分。

實施例2、PD-L1、PD-1重組蛋白以及雜交瘤抗體、重組抗體的純化

1、“帶His、PADRE標籤的PD-L1”：PD-L1(ECD)-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)重組蛋白的純化步驟

將細胞表現上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液換置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳柱，冲洗2-5倍柱體積。將置換後的上清樣品裝載於Ni柱(GE，17-5318-01)上。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A₂₈₀讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑冲洗層析柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。收集的沖提液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，流動相為PBS。去聚體峰，收集沖提峰。所得到的蛋白經電泳、肽指紋圖(安捷倫，6530 Q-TOF)、LC-MS(安捷倫，6530 Q-TOF)鑒定為正確後分裝備用。得到帶His、PADRE標籤的PD-L1：PD-L1(ECD)-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)用於本發明抗體的免疫原。

2、帶His標籤和Flag標籤的PD-L1(ECD)-Flag-His6(SEQ ID NO：3)重組蛋白的純化步驟

將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。將如上IMAC柱洗出的蛋白峰裝載於0.5×PBS平衡的flag親和柱(Sigma，A2220)上，冲洗2-5倍柱體積。將除雜後的細胞表現上清樣品裝載於柱上。用0.5×PBS冲洗柱子，至A₂₈₀讀數降至基線。用含有0.3M NaCl的PBS冲洗柱子，冲洗雜蛋白，並收集。用0.1M乙酸(pH3.5-4.0)沖提目的蛋白，並收集，調節pH至中性。收集的沖提液濃縮後用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，流動相為PBS。去聚體峰，收集沖提峰收集樣品經電泳、肽指紋圖、LC-MS鑒定正確後分裝備用。得到帶His標籤和Flag標籤的PD-L1：PD-L1(ECD)-Flag-His6(SEQ ID NO：3)，用於本發明抗體的性能測試。

3、PD-L1和PD-1的Fc融合蛋白的純化步驟

將細胞表現上清樣品高速離心去除雜質，濃縮至適當體積後裝載於ProteinA柱(GE，17-5438-01)上。用PBS沖洗柱子，至A₂₈₀讀數降至基線。用100mM醋酸鈉pH3.0沖提目的蛋白。1M TrisHCl中和後的蛋白上PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化。去聚體峰，收集沖提峰後，分裝備用。此方法用來純化PD-L1(ECD)-Fc(SEQ ID NO：4)和PD-1(ECD)-Fc(SEQ ID NO：5)。PD-L1(ECD)-Fc可用作本發明的免疫抗原或檢測試劑，PD-1(ECD)-Fc用於本發明抗體的性能測試。

實施例3、抗人PD-L1雜交瘤單株抗體的製備

1、免疫

抗人PD-L1單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6周齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1周，12/12小時光/暗周期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按兩種方案(方案A和方案B)免疫，每組6-10隻。免疫抗原為帶His、PADRE標籤的PD-L1：PD-L1(ECD)-PADRE-His6(SEQ ID NO：2)。

方案A用弗氏佐劑(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：初始免疫用弗氏完全佐劑(CFA)，其餘加强免疫用弗氏不完全佐劑(IFA)。抗原與佐劑比例為1：1，100ug/隻(初始免疫)，50ug/隻(加强免疫)。第0天腹膜內(IP)注射100ug/隻的乳化後抗原，初始免疫後每兩周一次，共6-8周。

方案B用Titermax(sigma Lot Num：T2684)與Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原與佐劑(titermax)比例為1：1，抗原與佐劑(Alum)比例為3：1，10-20ug/隻(初始免疫)，5ug/隻(加强免疫)。第0天腹膜內(IP)注射20/10μg/隻的乳化後抗原，初始免疫後每周一次，Titermax和Alum交替使用，共6-11周。免疫四周後，根據背部結塊和腹部腫脹情况，選擇背部或腹膜內注射抗原。

2、細胞融合

選擇血清中抗體滴度高(見後面的測試例1，結合PD-L1的ELISA方法)並且滴度趨於平台的小鼠進行脾細胞融合，融合前72小時衝刺免疫所選小鼠，PD-L1-His 10ug/隻，腹腔注射。採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到雜交瘤細胞。融合好的雜交瘤細胞用HAT完全培養基(含20%FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培養基)重懸，分裝於96孔細胞培養板中(1×10⁵/150ul/孔)，37℃、5%CO₂培育。融合後的第5天加入HAT完全培養基，50ul/孔，37℃、5%CO₂培育。融合後第7天至8天，根據細胞生長密度，全換液，培養基為HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，200ul/孔，37℃、5%CO₂培育。

3、雜交瘤細胞篩選

融合後第10-11天，根據細胞生長密度，進行結合PD-L1的ELISA方法檢測(見測試例1)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞進行PD-L1/PD-1結合的阻斷ELISA檢測(見測試例2)，陽性孔換液，並根據細胞密度及時擴大至24孔板中。移入24孔板的細胞株經過復測後進行保種和第一次亞選殖。第一次亞選殖篩選(見測試例1)為陽性的進行保種，並進行第二次亞選殖。第二次亞選殖為陽性(見測試例1)的進行保種和蛋白表現。多次融合獲得有阻斷PD-L1和PD-1結合效果(見測試例2)的雜交瘤細胞。

藉由阻斷實驗和結合實驗篩選得到雜交瘤株9-2和 24D5，用腹水法或用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。

其中測得雜交瘤株9-2的鼠抗可變區序列如下：>9-2mVH：9-2鼠源重鏈可變區序列

SEQ ID NO：6

>9-2mVL：9-2鼠源輕鏈可變區序列

SEQ ID NO：7

注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

其中測得雜交瘤株24D5的鼠抗可變區序列如下：24D5-VH：24D5鼠源重鏈可變區序列

SEQ ID NO：8

24D5-VL：24D5鼠源輕鏈可變區序列

SEQ ID NO：9

各重鏈及輕鏈CDR區序列如下：

其中，SEQ ID NO：38為SEQ ID NO：10的X₁為N時；SEQ ID NO：39為SEQ ID NO：17的X₄為H，X₅為G時；SEQ ID NO：40為SEQ ID NO：13的X₂為R，X₃為N時。

實施例4、抗人PD-L1雜交瘤單株抗體的人源化

1、雜交瘤株9-2人源化構架選擇

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE軟件，分别挑選與9-2和24D5同源性高的重輕鏈可變區種系基因作為模板，將這兩個鼠源抗體的CDR分别移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。

鼠源抗體9-2的人源化輕鏈模板為IGKV4-1*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV4-30-4*01和hjh2，人源化可變區序列如下：>9-2 hVH-CDR graft

SEQ ID NO：22

>9-2 hVL CDR graft

SEQ ID NO：23

2、雜交瘤株9-2的模板選擇和回復突變設計，見下表1：

注：如P49S表示依照Kabat編號系統，將49位P突變回S。

Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

注：該表表示各種突變組合所得的序列。如9_2-2表示，在人源化的鼠抗體9_2-2上的有輕鏈h9_2_VL1、重鏈h9_2-VH.1A兩種突變‘其它類推。

3、雜交瘤株24D5人源化構架選擇

PD-L1雜交瘤單抗24D5第96位為絲胺酸(Serine)，而生殖細胞系基因的該位點在FR3上是保守的半胱胺酸(Cysteine)，與第22位的半胱胺酸形成保守的鏈內二硫鍵。我們構建了24D5的嵌合抗體和第96位的絲胺酸回復突變為半胱胺酸的嵌合抗體，兩種形式的嵌合抗體的親和力和雜交瘤抗體一致。抗體人源化採用CDR移植策略進行，24D5的96位突變在骨架上，不會影響設計方案。

鼠源抗體24D5的人源化輕鏈模板為IGKV7-3*01和 hjk2.1，人源化重鏈模板為IGHV1-46*01和hjh6.1，人源化可變區序列如下：>24D5人源化重鏈可變區VH.1

SEQ ID NO：24

>24D5人源化輕鏈可變區VL.1

SEQ ID NO：25

4、雜交瘤株24D5的模板選擇和回復突變設計，見下表3：

注：如Y91F表示依照Kabat編號系統，將91位Y突變回F。

Grafted代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

注：該表表示各種突變組合所得的序列。如5表示，在人源化的鼠抗體5上的有重鏈h24D5_VH.1A、輕鏈h24D5_VL.1兩種突變。其它類推。

實施例5、人源化選殖株構建

設計引子PCR搭建各人源化抗體VH/VK基因片段，再與表現載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表現載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。

1、引子設計：利用在線軟件DNAWorks(v3.2.2)(http：//helixweb.nih.gov/dnaworks/)設計多條引子合成VH/VK含重組所需基因片段：5’-30bp信號肽+VH/VK+30bp CH1/CL-3’。引子設計原則：目的基因2與目的基因1有2個aa不一樣，則另設突變位點所在引子，如第1圖所示。

2、片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作說明書，用上面設計的多條引子，分兩步PCR擴增得到VH/VK含重組所需基因片段。

3、表現載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)構建及酶切

利用一些特殊的限制性內切酶，如BsmBI，識别序列與酶切位點不同的特性設計構建表現載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)，如第2圖所示。BsmBI酶切載體，切膠回收備用。

4、重組構建表現載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr

VH/VK含重組所需基因片段與BsmBI酶切回收表現載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)按3：1比例分别加入DH5H感受態細胞中，0℃冰浴30min，42℃熱擊90s，加入5倍體積LB介質，37℃培育45min，塗布LB-Amp平板，37℃培養過夜，挑取單選殖株送測序得到各目的選殖株。

5、根據本實施例的設計方案構建質粒，然後按實施例2表現純化蛋白，用檢測例SPR測定所得蛋白親和力。

6、結果：用BIACORE(測試例4)測定9_2-2的親和力與嵌合抗體相似，更多的回復突變只有細微的親和力增加。24D5的CDR直接嵌入人源化模板就有很好的親和力，但嵌合抗體本身的親和力就弱於雜交瘤抗體。輕鏈引入N85E突變，以去糖基化，可以提高產品的均一性，不影響親和力。

最終用BIACORE測試人源化回復突變體與人源PD-L1-his或雜交瘤抗體的親和力，篩選得到的人源化回復突變位點的選擇及序列組合如下表5：

實施例6、抗-PD-L1人源化抗體親和力成熟

1、構建人源化9-2-2和24D5噬菌粒載體

人源化後的9-2-2和24D5分别以scFv模式(VH-3個GGGGS-VL)構建到噬菌粒載體中，作為野生型序列(即相對於親和力成熟篩選得到的突變序列，作為原始或起始序列)。利用over-lap PCR拼接VH、(GGGGS)3 linker、VL，採用NcoI和NotI酶切位點連接人噬菌粒載體。

2、構建噬菌體展示文庫

利用構建好的野生型scFv為模板，採用codon-based引子，在引子合成過程中，突變區域每個密碼子都有50%野生型的密碼子和50%的NNK(反向引子為MNN))在所有CDR區引入突變構建突變文庫。PCR片段經過NcoI和NotI酶切，連接到噬菌粒體載體中，最後電轉化大腸杆菌TG1。每條codon-based引子建立一個獨立的文庫，期中9-2-2分為7個文庫，24D5分為8個文庫。

3、文庫淘篩

文庫經過拯救包裝出淘篩用的噬菌體顆粒後，利用生物素化的人PD-L1(ECD)抗原和鏈霉親和素磁珠進行液相法淘篩，並且每一輪篩選相對於上一輪都降低抗原濃度。三輪淘篩之後，9-2-2和24D5分别挑取250選殖株進行噬菌體ELISA檢測結合活性，陽性選殖株進行測序。

4、表面等離子體共振(SPR)檢測親合力

經過對測序選殖株進行比對分析，去除冗餘序列之後，將非冗餘序列轉換成全長IG(γ 1,κ)進行哺乳動物細胞表現。親和純化之後的全長IG採用BIAcore^TM X-100 instrument(GE Life Sciences)進行親合力測定。

經篩選確認選擇的可變區序列：>9-2 hVH(T)

SEQ ID NO：26

其中，CDR1為SEQ ID NO：10的X₁為T。

>9-2 hVL(H)

SEQ ID NO：27

其中，CDR1為SEQ ID NO：13的X₂為H，X₃為H。親和力成熟：>24-D5 hVH(GF)

SEQ ID NO：28

其中，CDR2為SEQ ID NO：17的X₄為G，X₅為F。

>24-D5 hVL

SEQ ID NO：29

注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列；下劃線為CDR序列，其中雙下劃線的位點為親和力成熟篩選後得到的位點。

實施例7、構建和表現抗-PD-L1人源IgG4類型

由於PD-L1在活化T細胞中也有表現，如果採用野生型IgG1恆定區會引起Fc介導的效應作用，比如ADCC和CDC，從而導致活化T細胞的消减。IgG1的Fc突變比如D265A、N297A、L234A/L235A或L234F/L235A等可以降低ADCC，P331S或附近的突變可降低CDC。IgG2的突變以及IgG2/4的Fc雜交抗體也可以降低ADCC和CDC。本文選擇突變IgG4以得到無ADCC和CDC的抗體。因此將親合力成熟得到的選殖株轉換成IgG4類型，IgG4的核心鉸鏈區包含S228P突變，可增强核心鉸鏈區內的二硫鍵連接，從而阻止IgG4 Fab臂交換，大大减少了半分子抗體的形成。並進一步引入F234A和L235A突變(mAbs 4：3,310-318； May/June 2012)，此種形式的IgG4突變抗體改變CH2結構域，降低與Fc受體的相互作用而達到降低ADCC活性的效果，本發明中藉由測試抗體對PD-L1 CHO-S細胞的ADCC活性獲得。根據本實施例表現純化的9-2 H2L10命名為HRP00049，24D5 29H1 GF命名為HRP00052。

這些蛋白將在測試例中進一步鑒定。

IgG4類型的突變體與人源PD-L1-his或恆河猴PD-L1-his的親合力測試，見測試例4，表6。

HRP00049：9-2(H2/L10)IgG4(AA)(S228P)

重鏈：HRP00049抗體重鏈序列

SEQ ID NO：30

HRP00049抗體重鏈序列編碼基因序列：

SEQ ID NO：31

輕鏈：HRP00049抗體輕鏈序列

SEQ ID NO：32

HRP00049抗體輕鏈序列編碼基因序列：

SEQ ID NO：33

HRP00052：24D5(GF)IgG4(AA)(S228P)

重鏈：HRP00052抗體重鏈序列

SEQ ID NO：34

HRP00052抗體重鏈序列編碼基因序列：

SEQ ID NO：35

輕鏈：HRP00052抗體輕鏈序列

SEQ ID NO：36

HRP00052抗體輕鏈序列編碼基因序列：

SEQ ID NO：37

注：劃線部分為抗體重鏈或輕鏈的可變區序列，或編碼其的核苷酸序列；未劃線部分為抗體恆定區序列及其相應的編碼核苷酸序列。

以下用生化測試方法驗證本發明性能及有益效果。

測試例1、結合PD-L1的ELISA

PD-L1(ECD)-Fc(SEO ID NO：4)1μg/ml，100μl/孔，4 ℃塗布過夜，5% Skim Milk(BD，232100，PBS配製)，150μl/孔，4℃封閉過夜；洗板2次，加入細胞上清，50μl/孔，37℃溫育2h；洗板3次，加入Peroxidase-AffiniPure Goat Anti-Human IgG(Jackson，115-035-003)，用KPL Milk(KPL，50-82-01)配製，1：5000稀釋，50μl/孔，37℃溫育1h。洗板4次，加入TMB，50μl/孔，37℃顯色10分鐘；加入1M H₂SO₄，50μl/孔，中止顯色；微盤分析儀(BMG Labtech，NOVOStar)OD450nm讀數。

測試例2、PD-L1/PD-1結合的阻斷ELISA

生物素(東仁化學，LK03：3 samples)和親和素(Sigma，S2438-250UG)的稀釋液為6% BSA(用含0.1%Tween20的PBS配製)，PBS為塗布溶液；PD-L1-Fc(SEQ ID NO：4)1μg/ml，100μl/孔，4℃塗布過夜；洗板3次。3% BSA(用含0.05%Tween20的PBS配製)120μl/孔，37℃封閉2h；洗板3次。加入細胞上清，50μl/孔。緊接著加入bio-PD-1-Fc(生物素標記的PD1-Fc，SEQ ID NO：5，2μg/ml，按東仁化學Biotin Labeling Kit-NH₂，LK03：3 samples，試劑盒方法標記PD-1-FC)，50μl/孔，在振盪器上振盪片刻使之混勻，37℃溫育1h；洗板6次。加入Streptavidin-Peroxidase Polymer(S2438-250UG，Sigma，1：400稀釋)，50μl/孔，室溫振盪溫育50min；洗板6次。加入100μl/孔TMB，37℃顯色5-10min；加入1M H₂SO₄，100μl/孔，中止顯色；微盤分析儀(BMG Labtech，NOVOStar)450nm讀數，計算PD-1抗體對配體PD-L1結合阻斷的IC₅₀值。本發明人源化抗體對PD-L1/PD-1結合的阻斷活性見下表6。

在篩選雜交瘤抗體的時候也使用了類似的單點阻斷實驗。

測試例3、PD-L1抗體對PD-L1和B7.1結合的阻斷

本實驗與以上PD-L1抗體對PD-L1和PD-1結合的阻斷實驗(測試例2)相似。將測試例2中的bio-human PD-1(ECD)-FC替換為bio-human-B7.1(human-B7.1，Sino Biological 10698-H03H-200)，其它步驟相同。另外，本發明用類似的方法也檢測了PD-L1抗體對PD-L2-Fc(Q9BQ51，胞外域(aa20-aa220))和PD-1結合阻斷的特異性，發現受測抗體不能阻斷PD-L2和PD-1的結合。

在篩選雜交瘤抗體的時候也使用了類似的單點阻斷實驗。

本發明人源化抗體對PD-L1和B7.1結合的阻斷，和對PD-L2和PD-1的結合阻斷活性見下表6。

注：NA表示没有阻斷活性。

測試例4、Biacore測定PD-L1抗體HRP00049和HRP00052 對PD-L1抗原的親和力

按照人抗捕獲試劑盒(GE，BR-1008-39)說明書中所述的方法，將人抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物晶片(GE，BR-1000-12)上，從而親和捕獲本發明的PD-L1抗體。然後於晶片表面流經一系列濃度的人PD-L1抗原(Sino biological，10084-H08H-200)，利用Biacore儀器(GE，BiacoreX100)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值。在實驗中每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒(GE)裡配置的再生溶液將生物晶片洗净再生。使用GE BIAevaluation軟件以1：1(Langmuir)結合模型分析所得數據，以此法測定ka(kon)、kd(koff)和KD值。雜交瘤抗體和人源化抗體的親和力已總結在其它實例中。下表7是親和力成熟後抗體以及對照抗體對人PD-L1抗原(huPD-L1-his，Sino biological，10084-H08H-200)、食蟹猴PD-L1抗原(Cyno PD-L1-his，Sino biological，90251-C08H-100)和鼠PD-L1抗原(Mouse PD-L1-his，Sino biological，50010-M08H-100)的親和力：

測試例5、體外細胞學實驗

新鮮人外周血單個核細胞(PBMC)在抗體作用下的增殖試驗，用來對PD-L1抗體進行細胞活性的檢測。

新鮮人PBMC(健康人隨機採取)調整細胞密度為2×10⁶/ml，每孔2ml接種於6孔板，37℃、5%CO₂培養箱中放置6小時，將懸浮細胞吸走，向貼壁細胞中加入2ml含有100ng/ml GM-CSF(粒細胞集落刺激生物因子，Peprotech，AF-300-03)和100ng/ml IL-4(Peprotech，AF-200-04)的RPMI1640培養基(Hyclone，SH30809.01B)，培養2天後每孔再加入1ml含有100ng/ml GM-CSF和100ng/ml IL-4的RPMI1640培養基，繼續培養2天後，每孔加入100ng/ml TNF-α(腫瘤壞死因子-α，Peprotech，AF-300-01A)，繼續培養2天得到成熟樹突細胞。將上述樹突細胞及同種異體的T細胞分别離心重懸成濃度為1×10⁶/ml和1×10⁵/ml，於96孔板中每孔各加入100μl，抗體用PBS按一定倍數稀釋成不同濃度梯度96孔板中每孔加入20μl，37℃、5% CO₂培養箱中培養5天，取100μl用CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay試劑盒(Promega，G7571)檢測細胞增殖；同時，檢測其細胞因子IFN-γ(干擾素-γ)的分泌。

HRP00052以及HRP00049都能有效地刺激細胞因子IFN-γ的分泌。同樣的方法也用於檢測人源化抗體對PBMC的增殖的刺激(第3圖)和對細胞因子IFN-γ的分泌的刺激(表8)。從第3圖和表8可發現本發明的人源化抗體相對於陽性對照MPDL3280A(Atezolizumab，WHO Drug Information,Vol.28,No.4,2014，P488)，對PBMC的增殖的刺激更强，對細胞因子IFN-γ的分泌的刺激更有效。

測試例6、對結核菌素刺激的PBMC增殖活性

對受測抗體HRP00052、HRP00049以及参照抗體在體外對結核菌素刺激的PBMC的增殖活性進行檢測。

取15ml新鮮PBMC細胞，約3×10⁷個，加人20μl結核菌素(上海碧優生物科技，cat#97-8800)，37℃、5% CO₂培養箱培養5天。第6天，取上述培養的細胞離心，重懸至新鮮的培養基中，調整密度為5×10⁵個/ml。在96孔細胞培養板中加入190μl重懸後的細胞，將人源化抗體HRP00052、HRP00049加入上述96孔細胞培養板的對應孔中，每孔10μl，對照組和空白組分别加入10μl PBS。細胞培養板置於37℃、5% CO₂培養箱培育72小時後檢測PBMC細胞增殖(Promega，cat#G7571)和IFN-γ的分泌(Neo Bioscience，cat#EHC102g)。結果如下表9。

結論：本實驗證明了本發明的人源化抗體對經外源抗原刺激後的PBMC增殖具有更强的刺激作用，該特性在適用於腫瘤治療時，有意料不到的效果。

測試例7、PD-L1抗體HRP00052抑制U87MG荷瘤小鼠腫瘤生長作用

本實驗採用免疫缺陷小鼠接種人腦膠質母細胞瘤U87MG細胞，成瘤後將用抗CD3抗體活化的人PBMC注射到腫瘤組織中，評價比較PD-L1抗體對腦膠質瘤U87 MG小鼠皮下移植瘤的療效。

從兩名志願者提供的血液中分離提取PBMC，使用抗 CD3抗體(Miltenyi Biotec，130-093-387)培養活化PBMC。將U87MG細胞接種於免疫缺陷小鼠(維通利華，11400700081219)右肋部皮下，待腫瘤生長滿2周，瘤體積

40mm³後去除體重、腫瘤過大和過小的，按腫瘤體積將小鼠隨機分組。將經CD3抗體刺激後的兩名志願者的PBMC以1：1比例混合注射到腫瘤組織中。同時開始皮下注射抗體和空白載體(5%葡萄糖溶液)，第0、7、14和21天，各給藥一次共4次。

實驗結果見表10，顯示PD-L1抗體HRP00052的3mg/kg劑量能顯著抑制人惡性腦膠質瘤U87MG小鼠皮下移植瘤的生長。

*：P<0.05,vs空白載體

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司

<120> PD-L1抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

<150> CN 201510788907.3

<151> 2015年11月17

<160> 40

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帶HIS、PADRE標籤的PD-L1(ECD)免疫原：PD-L1(ECD)-PADRE-His6

<400> 2

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 帶FLAG、HIS標籤的PD-L1(ECD免疫原)：PD-L1(ECD)-Flag-His6

<400> 3

<210> 4

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-L1的Fc融合蛋白：PD-L1(ECD)-Fc

<400> 4

<210> 5

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1的Fc融合蛋白：PD-1(ECD)-Fc

<400> 5

<210> 6

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠

<223> 9-2 VH

<400> 6

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠

<223> 9-2 VL

<400> 7

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠

<223> 24D5 VH

<400> 8

<210> 9

<211> 111

<212> PRT

<213> 小鼠

<223> 24D5 VL

<400> 9

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠9-2 HCDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠9-2 HCDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 13

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠9-2 LCDR2

<400> 14

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠9-2 LCDR3

<400> 15

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠24D5 HCDR1

<400> 16

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠24D5 HCDR2

<400> 17

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠24D5 HCDR3

<400> 18

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠24D5 LCDR1

<400> 19

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠24D5 LCDR2

<400> 20

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠24D5 LCDR3

<400> 21

<210> 22

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9-2人源化重鏈可變區序列

<400> 22

<210> 23

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9-2人源化輕鏈可變區序列

<400> 23

<210> 24

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24D5人源化重鏈可變區序列

<400> 24

<210> 25

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24D5人源化輕鏈可變區序列

<400> 25

<210> 26

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9-2親和力成熟後重鏈可變區序列

<400> 26

<210> 27

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 9-2親和力成熟後輕鏈可變區序列

<400> 27

<210> 28

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24D5親和力成熟後重鏈可變區序列

<400> 28

<210> 29

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 24D5親和力成熟後輕鏈可變區序列

<400> 29

<210> 30

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HRP00049 9-2重鏈序列

<400> 30

<210> 31

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列1

<220>

<223> HRP00049 9-2重鏈序列編碼基因

<400> 31

<210> 32

<211> 220

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HRP00049 9-2輕鏈序列

<400> 32

<210> 33

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRP00049 9-2輕鏈序列編碼基因

<400> 33

<210> 34

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HRP00052 24D5重鏈序列

<400> 34

<210> 35

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRP00052 24D5重鏈序列編碼基因

<400> 35

<210> 36

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HRP00052 24D5輕鏈序列

<400> 36

<210> 37

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HRP00052 24D5輕鏈序列編碼基因

<400> 37

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠9-2 HCDR1

<400> 38

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠24D5 HCDR2

<400> 39

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠9-2 LCDR1

<400> 40

Claims

一種PD-L1抗體或其抗原結合片段，其包含選自以下的CDR區序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：16至18；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：19至21；具體如下：HCDR1：SYWMH SEQ ID NO：16 HCDR2：RI X₄PNSG X₅TSYNEKFKN SEQ ID NO：17 HCDR3：GGSSYDYFDY SEQ ID NO：18 LCDR1：RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO：19 LCDR2：AASNLES SEQ ID NO：20 LCDR3：QQSFEDPLT SEQ ID NO：21；其中：X₄選自H或G，X₅選自G或F；且當X₄選自G時，X₅選自F；或者當X₄選自H時，X₅選自G。
如申請專利範圍第1項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗體輕鏈可變區進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區；其中抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或IgG2或其變體的重鏈FR區、或IgG3或其變體的重鏈FR區。
如申請專利範圍第2項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該包含鼠源FR區的抗體重鏈可變區選自SEQ ID NO：8，該包含鼠源FR區的抗體輕鏈可變區選自SEQ ID NO：9。
如申請專利範圍第2項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中抗體重鏈進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區、或者鼠源λ鏈或其變體的輕鏈恆定區；其中抗體輕鏈進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈恆定區、或IgG2或其變體的重鏈恆定區、或IgG3或其變體的重鏈恆定區。
如申請專利範圍第1項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體。
如申請專利範圍第1項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。
如申請專利範圍第6項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV1-46*01和hjh6.1的組合序列；其包含人種系重鏈IGHV1-46*01的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區。
如申請專利範圍第7項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈FR區序列有1至8個胺基酸的回復突變；其中該胺基酸的回復突變選自T74K、R72V、M48I、M70L、R38Q、L83F、V68A和V79A的胺基酸回復突變。
如申請專利範圍第7項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈可變區序列為SEQ ID NO：24所示的序列。
如申請專利範圍第6項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈IGKV7-3*01和hjk2.1的組合序列；其包含人種系輕鏈IGKV7-3*01的FR1、FR2、FR3區和hjk2.1的FR4區。
如申請專利範圍第10項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的輕鏈FR區序列有1至3個胺基酸的回復突變，或者引入N85E去糖基化突變；該胺基酸的回復突變選自Y91F、T22S和G72E的胺基酸回復突變。
如申請專利範圍第10項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：25所示的序列。
如申請專利範圍第6項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中X₄為G，X₅為F。
如申請專利範圍第13項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體可變區序列如下：重鏈可變區序列為SEQ ID NO：28，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：29。
如申請專利範圍第14項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG1、 IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區；該人源化抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的恆定區。
如申請專利範圍第14項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈進一步包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區。
如申請專利範圍第14項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈進一步包含引入F234A和L235A突變的IgG4重鏈恆定區。
如申請專利範圍第14項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含序列如SEQ ID NO：34重鏈，和序列如SEQ ID NO：3的輕鏈。
一種藥物組成物，其含有如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
一種編碼如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的PD-L1抗體或其抗原結合片段的DNA分子。
一種含有如申請專利範圍第20項所述的DNA分子的表現載體。
一種用如申請專利範圍第21項所述的表現載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞係選自細菌、酵母菌和哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第22項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞係哺乳動物細胞。
一種如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的PD- L1抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第19項所述的藥物組成物在製備用於治療PD-L1介導的疾病或病症的藥物中的用途。
如申請專利範圍第24項所述的用途，其中該疾病或病症為癌症。
如申請專利範圍第24項所述的用途，其中該疾病或病症為表現PD-L1的癌症。
如申請專利範圍第24項所述的用途，其中該疾病或病症為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、或者非小細胞肺癌。
如申請專利範圍第24項所述的用途，其中該疾病或病症進一步為非小細胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌或者腎癌。