TWI417054B - 新穎糞腸球菌ｌｊｓ－０１及其益生用途 - Google Patents

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新穎糞腸球菌LJS-01及其益生用途
本案係指一種乳酸菌之分離株Enterococcus faecium LJS-01及其對於動物健康之促進方法，特別應用於飼料與食品添加劑及健康食品等用途。本發明並具作為動物下痢症改善劑之潛力。
人類利用乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)醱酵來延長食物保存期限的方法已有數千年的歷史，因為醣類經乳酸菌同質醱酵後產生大量的乳酸，使酸鹼值(pH)降低，達到抑制細菌生長而防止食物腐壞。經長期的研究發現，乳酸菌抑制其他菌種生長的機制，除了產生乳酸等有機酸外，另有一種抑菌機制，是依靠抗菌胜肽(antibacterial peptides)之作用，這些抗菌胜肽又稱為抑菌素(bacteriocins)，具有抑制病原菌生長之活性。
隨著生物科技之進步，有許多研究報告指出乳酸菌對人體的優點，包括：(1)緩和乳糖不耐症；(2)改善嬰兒及成人的下痢；(3)調節身體免疫力；(4)改善過敏體質；(5)減低消化道病原菌酵素之產生；(6)與病原菌競爭消化道之棲息地；(7)降低膽固醇；(8)抗消化道性腫瘤之形成；(9)合成葉酸及B群維生素；(10)促進礦物質吸收及降血壓等。
在乳酸菌已知的多種功能中，應用乳酸菌以達到對抗病原菌、調節免疫系統及降低膽固醇等功能，正受到較廣泛的應用。由於乳酸菌及其所產生的抑菌素是一般被公認為安全的(Generally Recognized as Safe,GRAS)，並不會影響人類或其它真核生物，而具有促進健康的優點。
截至目前，已知從動物糞便中分離出能產生抑菌素(bacteriocin)之糞腸球菌，共計六篇相關報告中Strompfova等(2008)8 、Du Toit等(2000)1 、Theppangna等(2007)9 及Poeta等(2008)6 主要應用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)技術進行抑菌素結構基因之檢測，以瞭解所分離之糞腸球菌帶有抑菌素基因之種類，故仍屬於對可產生抑菌素之糞腸球菌較為初步之研究報告。另Marekova等(2003)4 則初步將分離自牛糞之糞腸球菌EK13進行其抑菌素A之純化及其特性之分析，而Strompfova等(2006)7 乃進一步將糞腸球菌EK13以小豬進行動物試驗，試驗結果證實可產生抑菌素A之EK13除能有效降低消化道中大腸桿菌之數量以及降低血液中膽固醇外，與對照組比較不論是豬隻血清生化值、體重、攝食量與活動力等健康情形並無差異，證實本菌屬於GRAS，具有益生菌之特質。
然上述能產生抑菌素之糞腸球菌尚無發現直接從動物腸道分離者，且沒有和Enterococcus faecium LJS-01相同，可在同一株細菌中同時擁有抑菌素(enterocin A)及enterocin B二種抑菌素基因。而其他有關益生菌特性之分析，如耐酸、耐膽鹽、腸上皮細胞吸附及降解膽固醇等能力之體外試驗和體內試驗則仍闕如。
本發明提供了一種乳酸菌即糞腸球菌(E. faecium )之分離株E. faecium LJS-01，該分離株具有下列之特色：1.首次自台灣本土豬隻腸道黏膜所分離者；2.經抑菌素結構基因檢測，證實該菌罕見的同時擁有抑菌素A及抑菌素B二種屬於能抑制多種病原菌之廣效性抑菌素基因；3.經體外及體內試驗，證實本菌具有良好抑菌、耐酸及耐膽鹽能力，能在動物體內通過胃腸消化液後，存活於腸道中；4.經體外及體內試驗，證實本菌對腸上皮細胞具有強吸附能力，進而對病原菌具有很好的競爭排除之功效；5.經體外及體內試驗，證實本菌具有很好的降解膽固醇能力。6.經實驗証實本菌具耐高温性質。
基於上述之特性，本發明之乳酸菌E. faecium LJS-01，預期將來可供作為健康食品、動物各種飼料與食品添加劑，作為益生用途以增進動物健康。此外，本發明之乳酸菌E. faecium LJS-01亦可應用添加於動物醫藥組合物中，應用於預防或治療病原菌之感染。
由於長期以來添加於飼料之動物用抗生素與病原菌產生抗藥性之原因息息相關，故目前歐盟國家已全面禁止使用，本國也逐步減少動物用抗生素添加於飼料中，因此亟需尋求其他方法作為促進動物健康之飼料添加劑。本發明分離出先天具有耐酸、耐膽鹽、產生乳酸、產生抑菌素及腸道上皮細胞強吸附能力以競爭排除(competition exclusion)病原菌等各種優秀能力之乳酸菌E. faecium LJS-01，作為促進動物健康之益生菌，含有此發明乳酸菌之組成物，得用以解決習知動物用抗生素之缺失，故可作為動物飼料添加劑、動物健康食品，並可為動物下痢症之改善劑。
本案提供一種糞腸球菌(E. faecium )之分離株E. faecium LJS-01，已寄存於台灣新竹食品工業發展研究所(Food industry Research and Development Institute,FIRDI)，寄存編號為BCRC 910421。
本發明之目標係提供一種飼料添加物，其包含一活性乳酸菌成分乳酸菌分離株E. faecium LJS-01，以及添加賦形劑、益生素(prebiotics)等。該飼料添加物利用其乳酸菌，如第四實施例膽鹽水解能力分析，第五實施例膽固醇降解能力測試，第六實施例耐酸及耐膽鹽能力測試，顯示具有耐酸、耐膽鹽之能力，可經口服到達動物腸道，發揮促進動物健康之效用。
本發明之另一目標係提供一種飼料添加物。如第七實施例體外(In vitro )腸上皮細胞株Int-407吸附試驗，第八實施例體內(In vivo )無特定病原(SPF)小雞腸上皮細胞吸附試驗，顯示可經由動物腸道上皮組織之強烈吸附能力而呈現競爭排除病原菌。該添加物混入飼料中得用為預防性抗菌劑、可一定程度代替抗生素作為腸道病原菌之防制劑。
本發明之另一目標係提供一種動物醫藥品組合物，包含乳酸菌分離株E. faecium LJS-01，及醫藥品可接受之賦形劑。如第二實施例抑菌能力測試，證實LJS-01對於各種李斯特菌(Listeria )屬之菌株均呈現強抑菌能力，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )及仙人掌桿菌(Bacillus cereus )亦呈現抑菌能力。而於第九實施例針對動物下痢症之改善，證實每日口服給予1克E. faecium LJS-01(3x1010 CFU/g)可改善動物罹患下痢之症候。顯示乳酸菌分離株LJS-01對腸上皮細胞具有強吸附能力，對病原菌具有很好的競爭排除之功效，可製成預防或治療病原菌感染之動物醫藥品。該醫藥品組合物亦可添加於固體或液體之醫藥品或飲食補充品，健康食品、動物各種飼料與食品添加劑，作為益生用途以增進動物健康。上述所稱之動物係包括人類以及哺乳動物、家畜、實驗動物、家禽、鳥類、野生動物、魚貝類等動物包括寵物動物。
本發明E. faecium LJS-01菌株經適當培養增殖，此培養液經濃縮提高菌數濃度後，得加入賦型劑等再以凍結乾燥法或低温(50O C以下)低壓乾燥法等予以乾燥。此粉狀物其菌數可在每克1012 個或以上，可依適當配方而包含於上述各發明目標的各組合物。該等組合物之形態並無限定，可為粉末狀、液體狀、固體狀、顆粒狀、片狀或膠囊狀等。
本發明將藉由下述之實施例及其配合之圖示，做進一步之詳細說明。下列之實施例係用以例示說明本發明之功效，而非用以限定本發明之範疇。
第一實施例： E. faecium LJS-01分離株之分離
本發明所分離出之乳酸菌株E. faecium LJS-01，採用API 20生化分析套組及16S核糖體去氧核糖核酸(ribosomal DNA,rDNA)序列分析等進行菌種鑑定。
(一)乳酸菌菌株之分離與保存
將豬隻之腸道檢體先經75%酒精消毒漿膜面，以剪刀剪開黏膜面後，取迴腸及十二指腸各2 cm，放入50 ml無菌離心管中，以0.005 M磷酸鹽緩衝液pH7.4(Phosphate Buffer Solution,pH7.4)(簡稱為磷酸鹽緩衝液)洗去糞便及黏液，反覆震盪清洗三次再以研磨器磨碎組織，與10 ml磷酸鹽緩衝溶液充分混合後靜置10分鐘，取100μl上清液與900 μl羅格莎選擇性乳酸桿菌瓊脂培養液(Rogosa SL broth)混合均勻，取100 μl菌液塗佈於含有0.5%碳酸鈣(CaCO3 )之Rogosa SL平板培養基，37℃厭氧培養48小時，各選取具相同菌落型態之細菌共10個，經由革蘭氏染色、觸酶(catalase test)等試驗後，再以MRS培養液培養，所得培養液並以二種方式保存：其一取100-200 μl菌液置於菌種保存液(含25% glycerol的MRS Broth)中，放置-80℃冷凍櫃中保存、其二取菌液加入適宜之賦形劑分裝於安瓶，經凍結乾燥，安瓶熔封，置-20℃以下冷凍櫃保存。
(二)　E. faecium LJS-01菌株鑑定
本實驗先以API 20生化分析套組進行菌種鑑定，操作步驟如下：首先將革蘭氏陽性且觸酶(catalase)反應為陰性之球菌，挑起單一菌落加入0.3 ml無菌水中混合均勻，倒入哥倫比亞血瓊脂平板(Columbia blood agar plate)中，於厭氧環境，37℃中培養18-24小時，評估其溶血能力。
將培養盒中加入約5 ml無菌水使盒中保持濕度，再將API 20 Strep strip上的鋁箔撕開放入盒中。將菌加入2 ml無菌水調整濃度至McFarland No. 4以上。先將菌液加入前十項試驗(VP至ADH )的小試管中(VP至LAP試驗凹糟部分各加入菌液約100 μl)。將剩餘菌液(約0.5 ml)加到葡萄糖-蛋白腖培養基(GP Medium)中，混合均勻後加入後十項試驗內(RIB 至GLYG )。在ADH 到GLYG 的凹糟中加入無菌礦物油。蓋上盒蓋放入37℃培養4小時，先進行判讀；若有必要，培養24小時再進行第二次判讀。
除API20生化分析鑑定外，應用PCR方式以BSF8 primer (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)及BSF1541 primer(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)進行16S rDNA序列之增幅。首先取單一菌落經100℃作用30分鐘，以4℃,13,000 xg離心30分鐘後，取含染色體之10 μl上清液為模版DNA，反應總體積為50 μl，分別為29.5 μl已滅菌之去離子水、5 μl 10x PCR緩衝液、2 μl脫氧核糖核苷-5'-三磷酸(dNTPs,2.5 mM)、2.5 μl氯化鎂(MgCl2 ,50 mM)、3 μl二甲基亞碸(DMSO,6%)、1μl正向及1μl反向引子(reverse primers,20 μM)、5μl DNA(10 ng)和1μl耐熱聚合酶(Taq DNA polymerase)。反應條件為94℃，2分鐘後，於94℃，30秒使模板DNA變性，62℃，45秒使引子與模板DNA進行黏合，72℃，1.5分鐘進行DNA延長作用，共35個循環，再以72℃，反應10分鐘使DNA充分延長。取5 μl PCR產物進行1%瓊脂凝膠電泳分析，確認核酸片段大小是否如預期大小，若相符則純化所增幅出的PCR產物進行DNA定序與序列比對(第一圖A,B)，序列比對方式乃將定序之結果，利用blastn生物資訊分析軟體輸入至NCBI網站中與GenBank已登錄之序列進行比對，取DNA相似度最高前五名分析，證實均為E. faecium 。
由以上利用API 20生化分析套組之分析鑑定及16S核糖體去氧核糖核酸(ribosomal DNA,rDNA)之序列分析可證實本菌為E. faecium ,菌株命名為E. faecium LJS-01。
第二實施例：抑菌能力測試
將E. faecium LJS-01培養於羅格莎平板培養基(Rogosa SL)上得到單一菌落，再將單一菌落培養至MRS培養液24小時，經離心後，E. faecium LJS-01以磷酸鹽緩衝液洗過，再以少量磷酸鹽緩衝液與E. faecium LJS-01混合形成菌液，取3μl菌液，接種於乳酸菌平板培養基(LCMG，Lactobacillus Carrying Medium with Glucose)，經37℃厭氧培養24小時後，以覆蓋共同培養(overlay co-culture)方式，分別將含有各種病原菌之半固態培養基(0.8%)覆蓋其上，以37℃厭氧培養18-24小時，檢測抑制圈(inhibition zone)之直徑大小，並判定抑菌範圍(表一)，依此推定本菌株對各種李斯特菌(Listeria )屬之菌種如李斯特菌(L. monocytogenes )、格氏李斯特菌(L. grayi )、英諾克李斯特菌(L. innocua )、威氏李斯特菌(L. welshiweri )等有強效抑菌力，對金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )及仙人掌桿菌(Bacillus cereus )也有抑菌能力。
第三實施例：抗生素敏感性試驗
本試驗係以抗生素感受性試驗紙錠(BD BBLTM Sensi-DiscTM Antimicrobial susceptibility Test Discs)之瓊脂紙錠擴散法(Agar Disc Diffusion)，進行16種抗生素之檢測，以表示E. faecium LJS-01對抗生素之敏感性。
試驗首先依據NCCLS的規範(Wayne,2003)10 以金黄色葡萄球菌(S. aureus ) ATCC 25923進行抗生素紙錠(Disc)之品管測試，方法為挑取S. aureus 單一菌落接種於腦心浸出物培養液(BHI Broth)，在35℃震盪培養4小時後，以8,000 xg離心5分鐘，去上清液，加入磷酸鹽緩衝液清洗1次，再以磷酸鹽緩衝液懸浮菌塊，調菌液濃度與McFarland No. 0.5(1.5×108 CFU/ml)標準懸濁液相同，再以無菌棉棒沾取菌液後均勻塗佈於水解酪蛋白瓊脂(Miller-Hinton agar,MHA)，分別貼上抗生素紙錠，置於35℃培養24小時，檢測各抗生素抑制圈之直徑大小，依擴散法藥敏試驗(Kirby-Bauer method)及BBL說明書判定抗藥性以確認抗生素紙錠有效濃度與操作之正確性。
將E. faecium LJS-01單一菌落以無菌方式接種於MRS培養液，37℃培養隔夜後，取1%菌液次培養於另3 ml MRS培養液，37℃培養4小時，菌液以8,000 rpm(JA20 rotor,Beckman)離心5分鐘後，以磷酸鹽緩衝液清洗2次，之後將菌體懸浮於2 ml磷酸鹽緩衝液中，並將菌液調製成McFarland No. 0.5之懸濁液，取1 ml與9 ml 1% MRS瓊脂(45℃)，快速均勻混合後倒入培養皿中，待凝固後，貼上各種抗生素紙錠，放入厭氧缸中，先放置於4℃隔夜，再以37℃厭氧培養48小時，檢測各藥物抑制圈之直徑大小，依照擴散法藥敏試驗及BBL說明書判定抗藥性(表二)。由結果得知E. faecium LJS-01對氨苄青黴素(ampicillin,AM10)、萬博黴素(amoxicillin,AMC30)、枯草菌素(bacitracin,B10)、甲基红黴素(clarithromycin,CLR15)、红黴素(erythromycin,E15)、紫菌素(gentamicin,GM10)、亞胺硫黴素(imipenem,IPM10)、新黴素(neomycin,N30)、新生黴素(novobiocin,NB30)、青黴素(penicillin,P10)及萬古黴素(vancomycin,VA30)敏感；對卷鬚黴素(ciprofloxacin,CIP5)、卡那黴素(kanamycin,K30)、鏈黴素(streptomycin,S10)及磺胺甲噁唑-甲氧芐啶(sulfamethoxazole/trimethoprim,SXT)有抗藥性。證實本菌並非萬古黴素抗藥性腸球菌(vancomycin resistance enterococcus,VRE)，且對大多數抑制細菌細胞壁合成之抗生素均具高度感受性。
第四實施例：膽鹽水解能力分析
根據先前研究報告得知，具膽鹽水解酵素(bile salts hydrolase,BSH)之乳酸菌株，其降解膽固醇的能力較佳(Kim et. al.,2008,Nguyen et. al.,2007)3,5 ，因此本發明先測試E. faecium LJS-01膽鹽水解酵素表現量，再進行其他特性之分析。
首先將E. faecium LJS-01經三次連續活化後，以無菌牙籤接種至MRS瓊脂平板(MRS agar plate)上，經37℃隔夜培養後，覆蓋一片孔徑為3 mm之無菌濾紙，再將含有乳酸菌之濾紙片置於內含0.5%牛磺脫氧膽酸鈉(taurodeoxycholic acid sodium salt，TDCA;Sigma)及0.37 g/l氯化鈣之MRS瓊脂培養皿上，經37℃培養72小時之後，測定無菌濾紙周圍白色沈澱環之直徑(第二圖)，有明顯的白色沈澱環即表示有強BSH活性。由結果可證實本菌具有BSH之活性，對降解膽固醇應有極高之潛力。
第五實施例：膽固醇降解能力測試
本試驗為檢測E. faecium LJS-01培養在含水溶性膽固醇之MRS及含0.4%膽鹽與水溶性膽固醇之MRS在24及48小時後，以離心方式取得上清液，並測量上清液中所剩下的膽固醇含量，以評估E. faecium LJS-01降解膽固醇之能力。試驗乃依據Gilliland等人(1985)2 所述之方法修飾後進行之。首先取1 ml上清液至一乾淨試管中，加入3 ml 95%乙醇及2 ml 50%氫氧化鉀，經震盪完全後，置於60℃水浴槽作用15分鐘，取出於室溫冷卻後加入10 ml正己烷，經震盪完全後加入3 ml無菌水，充分震盪約1分鐘，在室溫下靜置15分鐘，之後從有機層中吸取1 ml置於另一乾淨試管中，在60℃下以氮氣吹乾，再加入2 ml鄰苯二甲醛(o -phthalaldehyde)試劑(1 ml冰醋酸中含有0.5 mgo -phthalaldehyde)，混合後靜置10分鐘，再慢慢添加1 ml濃硫酸，經震盪後靜置10分鐘，最後以分光光度計於波長OD550 nm下，偵測吸光值。
此外，試驗取不同濃度之水溶性膽固醇(1 ml含0,10,20,30,40,50 μg)依上述之方法進行標準曲線之測定，作為吸光值與濃度之換算依據，由結果(第三圖)證實本菌不論是培養在含有膽固醇(cholesterol,Chlo.)之MRS溶液中，亦或在含有膽固醇與0.4%膽鹽之MRS中，在48 hrs後各呈現70%及63%的膽固醇降解能力。
此外，我們也應用產蛋雞進行本菌降解血清中膽固醇能力之體內(in vivo )試驗。首先將雞隻分為對照組(Control group,CG)及實驗組(Experimental group,EG)各6隻，在進行試驗前先採血分析其血清膽固醇含量，實驗組以口服方式給予本菌(4 x 1010 CFU/g/day/隻)，對照組則以口服方式給予脫脂奶粉(1 g/day/隻)，連續給予7日後停止，於第0、7、14天採血，測定血清膽固醇含量，分析血清膽固醇含量之變化(表三)。由結果顯示實驗組雞隻在連續給予本菌7日後其血清膽固醇值不論與對照組或實驗前比較，均具有約21%明顯的膽固醇下降效力，但停止給予本菌7日後，二組血清膽固醇值並無差異，推測本菌必須在雞隻腸道中維持高濃度之菌量，才具有降低膽固醇之能力。
第六實施例：耐酸及耐膽鹽能力測試
首先在耐酸試驗中，將E. faecium LJS-01接種於MRS Broth中，於37℃培養24小時活化後，各取1 ml菌液，分別加入pH 7.4(control)、pH 2.0、pH 3.0之9 ml磷酸鹽緩衝液(PBS)。將菌液與各磷酸鹽緩衝液混合後，置於37℃恆溫培養箱，分別經0小時、1小時、3小時處理後，各取出1 ml菌液，以磷酸鹽緩衝液進行10倍系列稀釋，取1 ml各倍數之稀釋液與1% MRS agar均勻混合，37℃厭氧培養48小時，計算菌落數，以評估其耐酸能力(表四)。
另外，在耐膽鹽試驗中，首先將E. faecium LJS-01改以10 ml含0.3%(w/v)牛膽汁(oxgall)之MRS broth，37℃培養，並分別在3、12、24小時，各取出1 ml菌液，以磷酸緩衝液行10倍系列稀釋，取1 ml各倍數之稀釋液與1% MRS agar均勻混合，37℃厭氧培養48小時，計算菌落數以評估其耐膽鹽之能力(表五)。
由結果顯示因本菌株在pH 2.0與pH 7.4條件下培養3小時，所得結果為二者細菌存活數(CFU/ml)約相同，並與起始(0小時)之存活數相當，顯示其存活並不受胃酸之影響。同時本菌株在含有0.3%牛膽汁之MRS培養基在37℃下培養，在培養3小時之菌落生成數(CFU/ml)與不加牛膽汁之對照組相當，在培養24小時之菌落生成數與對照組比對，約下降在對數1.0以內，顯示其耐膽鹽能力甚佳。證實本菌株具有優良的耐酸及耐膽鹽的性質。
第七實施例：體外( In vitro )腸上皮細胞株Int-407吸附試驗
將腸上皮細胞株(Intestine 407,ATCC: CCL-6)培養在含有10%胎牛血清之BME(Basal medium Eagle in Earle's BSS)生長培養基中，靜置於37℃,5%CO2 培養箱中生長至八分滿。以磷酸鹽緩衝液清洗細胞後，加入少量胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液(Trypsin-EDTA)將細胞懸浮，並經低速離心去除Trypsin-EDTA之後，將細胞以不含抗生素之生長培養基重新培養於24孔培養盤中，細目數為每孔104 個，經靜置於37℃,5%CO2 培養箱中生長至單層細胞。於吸附實驗進行前，先將測試菌株E. faecium ATCC 6057及E. faecium LJS-01分別以磷酸鹽緩衝液清洗2次，經5,000xg 離心5分鐘後重新懸浮於BME中，濃度為1×108 CFU/ml。單層培養完成之Intestine 407去除上清液後，每孔加入100 μl之待測菌株，於37℃ 5%CO2 培養箱中進行吸附反應2小時，每15分鐘輕輕搖晃培養盤，使吸附均勻，每個待測菌株進行2重覆。吸附反應後去除上清液，並以磷酸鹽緩衝液清洗2次，並進行以下定量方法。
1.革蘭氏染色法(Gram’s stain)：清洗後之細胞以10%中性福馬林固定30分鐘後，以磷酸鹽緩衝液清洗4次，對培養中之細胞與待測菌株進行格蘭氏染色。應用顯微鏡放大1,000倍隨意選擇20個視野，計算吸附在Int-407之乳酸菌數，平均在每個細胞上均超過40個LAB即表示該LAB具有良好的吸附能力。試驗證實本發明E. faecium LJS-01平均在每個細胞上均超過40個菌數能有效吸附在Int-407上，表示具有良好的吸附能力(第四圖A,B,C)。
2. PCR半定量法：將清洗後之24孔盤加入100 μl之Trypsin-EDTA懸浮所有細胞，並將每孔之內容物，轉至1.5 ml離心管中。以DNA萃取試劑組，將離心管中之內容物，依細菌檢體之操作流程，進行DNA萃取，並回溶於相等體積之無菌水中。將檢體DNA以待測菌體專一性的Primer BSF8(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)、Primer BSF1541(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)、2 mM dNTP、Taq聚合酶緩衝液、Taq聚合酶、1 mM MgCl2 於0.2 ml離心管內，於聚合酶鏈反應器(P.E. 9700)中，使其溫度變化為：94℃、5分鐘，再跑15-25個循環的94℃、1分鐘，56℃、30秒，72℃、1分鐘。經PCR反應的溶液，以DNA電泳法在尚未達到飽合的循環數下進行半定量分析。DNA電泳之結果，於分析軟體(AlphaEase FC software)對PCR預期產物部份進行光密度定量，並以待測菌株之測定值/標準菌株之測定值為吸附能力之參考(第五圖)，將L. casei Shirota的測定值設定為100%，即等於1，而待測菌株E. faecium LJS-01的測定值相對為140%，即等於1.4。由結果顯示E. faecium LJS-01對Int-407 cells之吸附能力為L. casei Shirota或E. faecium ATCC 6057之1.4倍以上。
第八實施例：體內( In vivo )SPF小雞腸上皮細胞吸附試驗
經由上述實驗，已篩選出具有抗菌、降解膽固醇及體外腸上皮細胞株int-407吸附能力良好之菌株E. faecium LJS-01，為評估E. faecium LJS-01菌株在動物體內消化道之耐膽鹽與耐酸及腸上皮細胞吸附能力，利用體內(in vivo )動物實驗，將E. faecium LJS-01以口服方式投予無特定病原(Specific Pathogen Free,SPF)小雞，並收集糞便及腸道黏膜，分析乳酸菌留滯腸道中的數量，評估其益生菌特性。實驗程序如下：準備無特定病原(SPF)雞蛋，大約21天後可孵化出無特定病原小雞。將小雞分為四組，分別為對照組、投予E. faecium LJS-01、投予E. faecium ATCC 6057、投予L. salivarius 17a之組別。試驗以SPF小雞孵出之日期為第0天，於第0天、第1天及第2天分別投予108 CFU/ml/隻E. faecium LJS-01、E. faecium ATCC 6057及L. salivarius 17a(表六)。
於第3及第7天，各犧牲兩隻小雞，收集空腸、迴腸及盲腸內容物各1g，以滅菌的磷酸鹽緩衝液來懸浮腸內容物，在室溫下靜置沉澱30分鐘。取上清液，以10倍連續稀釋，取100 μl各稀釋倍率之稀釋液塗抹於添加適當抗生素之Rogosa SL平板培養基，待各乳酸菌菌落生長後，計算菌量(CFU/ml)(表七)。
另外，收集空腸、迴腸及盲腸組織各3公分，以70%酒精噴灑漿膜面，將腸道剪開後放置於50 ml的離心管內，加入10 ml的滅菌磷酸鹽緩衝液輕微震盪10-20秒。如此反覆三次後，將清洗後之腸道墊在保鮮膜上，以玻片刮取腸黏膜組織，將刮取下來的腸黏膜組織沾於另一50 mL離心管上，同樣以10 ml的滅菌磷酸鹽緩衝液來懸浮腸黏膜組織，於室溫下靜置沉澱30分鐘。取上清液，以10倍連續稀釋，取100 μl各稀釋倍率稀釋液塗抹於添加適當的抗生素之Rogosa SL平板培養基，待各乳酸菌菌落生長後，計算菌量(CFU/ml)(表七)。
由第七天犧牲各組別SPF小雞之空、迴、盲腸內容物及腸黏膜組織之菌株的生長情形，得知在腸道內容物的採樣分析中，對照組雞隻在空、迴、盲腸段無上述乳酸菌菌株生長，試驗組在空腸段，除E. faecium ATCC 6057無法生長外，E. faecium LJS-01及L. salivarius 17a則均可生長。在迴腸及盲腸中，三種投予菌株均可生長。另外，在腸黏膜組織的採樣中，來自E. faecium LJS-01及L. salivarius 17a都可以生長於空、迴、盲腸等三段腸道中。值得注意的是，在空腸中E. faecium LJS-01之生長情形，優於L. salivarius 17a，顯示E. faecium LJS-01即使在口服後第七天在空腸黏膜上仍具有良好的拓殖能力(表七)。
動物給予益生菌多採取口服之途徑，而停留於消化道方能發揮功效，因菌體停留於口腔時間很短，故口腔影響因素可排除，益生菌菌株在消化道的穩定性需考慮胃之pH及腸內膽鹽之影響。根據本發明在SPF小雞的活體試驗，係以活體消化道環境，測試具抑菌能力之乳酸菌菌株是否可存活。如表六所示收集腸道內容物樣本，可測得的菌數越多即代表該菌株在消化道中的拓殖能力越好，而腸黏膜樣本的菌數越多則代表吸附腸道的能力越佳。測試結果顯示，本發明之糞腸球菌E. faecium LJS-01對酸及膽鹽有良好耐受性，且對腸上皮細胞具良好吸附能力，可作為促進動物健康之益生菌。
第九實施例：針對動物下痢症之改善
本試驗與中部某動物醫院合作，評估E .faecium LJS-01對患有下痢症之動物的改善能力。試驗首先將患有下痢症之動物記錄病歷後，每日口服給予1克E .faecium LJS-01(3x1010 CFU/g/隻)，每日紀錄其下痢之改善情形。結果顯示除一例長期下痢需5天療程外都於2至3天療程後恢復正常，試驗結果證實本乳酸菌對患有下痢的動物具有很好的改善效果(表八)。
第十實施例：飼料製程中 E. faecium LJS-01耐高溫能力試驗
由於飼料在製程中不論是打粒或攪拌常會產生高溫，故一般常以50℃ 30分鐘，作為乳酸菌是否具耐高溫之測試條件。本發明E. faecium LJS-01經隔夜培養後，得知其菌量為2.18x109 CFU/ml，將菌液平分成二部分，一部份置於50℃ 30分鐘，另一部份置於37℃ 30分鐘，最後所測得之E. faecium LJS-01活菌數二者均相近，約為5x109 CFU/ml。證實本發明E. faecium LJS-01具耐高溫之能力，製程不影響其活性，可作為飼料添加物並具有高量之活菌數。
惟以上所述僅為本發明之較佳實施例，非據此即拘限本發明之專利範圍，故舉凡運用本發明說明書及圖示內容所為之等效結構變化者，均同理包含於本發明之範圍內，合予陳明。
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圖一E. faecium LJS-01之16S rDNA片段序列分析(A)E. faecium LJS-01之16S rDNA片段序列以BSF8 primer進行定序(B)E. faecium LJS-01之16S rDNA片段序列與基因庫序列比對
圖二E. faecium LJS-01之膽鹽水解能力
圖三E. faecium LJS-01之膽固醇(Cholestrol,Cho.)降解能力含水溶性膽固醇之MRS(LJS-01+cho.)含0.4%膽鹽與水溶性膽固醇之MRS(LJS-01+cho.+bile)
圖四E. faecium LJS-01對Int-407細胞株之吸附活性(A)對照組(B)E. faecium ATCC 6057(C)E. faecium LJS-01
圖五E .faecium LJS-01對Int-407細胞株之吸附活性(A)　以PCR半定量法分析Lane M: 1 kb DNA marker。Lanes 1-4：分別為E .faecium 58、E .faecium LJS-01、E .faecium ATCC 6057及L .casei Shirota等實驗處理組之Int-407細胞株β-actin基因產物，作為定量控制組。Lanes 5-8：分別為E .faecium 58、E .faecium LJS-01、E .faecium ATCC 6057及L .casei Shirota之16S rDNA。Lane 9: Int-407細胞株之β-actin作為陰性控制組。(B)　吸附能力結果得知E .faecium LJS-01為L .casei Shirota及E .faecium ATCC 6057之1.4倍以上。

Claims (10)

  1. 一種糞腸球菌(Enterococcus faecium )分離株E.faecium LJS-01，寄存於台灣新竹食品工業發展研究所(Food industry Research and Development Institute,FIRDI)，寄存編號為BCRC 910421；該分離株具有耐酸、耐膽鹽、消化道上皮細胞吸附能力、降解膽固醇及抗菌等之性質，並具耐50℃温度之性質。
  2. 一種飼料添加物，該組成物包含申請專利範圍第1項之乳酸菌分離株E.faecium LJS-01。
  3. 如申請專利範圍第2項之飼料添加物，其提供動物使用。
  4. 如申請專利範圍第2項之飼料添加物，動物係包括哺乳動物、家畜、實驗動物、家禽、鳥類、野生動物、魚貝類等動物包括寵物動物。
  5. 如申請專利範圍第3項之飼料添加物，其乳酸菌可於動物腸道上皮組織具強吸附能力以排除競爭病原菌之作用。
  6. 一種飲食補充品，該組成物包含申請專利範圍第1項之乳酸菌分離株E.faecium LJS-01。
  7. 如申請專利範圍第6項之飲食補充品，其得供人類使用。
  8. 如申請專利範圍第6項之飲食補充品，其乳酸菌可於動物腸道上皮組織具強吸附能力以排除競爭病原菌之作用。
  9. 一種預防或治療病原菌感染之動物醫藥品組合物，其係包含申請專利範圍第1項之乳酸菌分離株E.faecium LJS-01，及醫藥品可接受之賦形劑。
  10. 如申請專利範圍第9項之組合物，其動物係包括人類以及哺乳動物、家畜、實驗動物、家禽、鳥類、野生動物、魚貝類等寵物動物。
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