TWI382847B - A protein having a protease activity, a nucleic acid sequence encoding the protein, a method for producing the protein, and a method for producing the same - Google Patents

Description

具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質、編碼該蛋白質之核酸序列、生產該蛋白質之方法及其應用

本發明係關於一種具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質及其基因、生產方法與應用，尤關於一種具有碎葉鬼傘之脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質及其基因、生產方法與應用。

脯胺酸寡胜肽酶(prolyl oligopeptidase)(EC 3.4.21.26)；也稱為脯胺酸內切胜肽酶(prolyl endopeptidase)或切脯胺酸後酶(post－proline cleaving enzyme)，能夠水解含脯胺酸之胜肽，其作用位置是在脯胺酸之羧基端(carboxyl side)(Polgr,1994；Polgr,2002)。

脯胺酸寡胜肽酶近來應用性研究很廣泛，一方面是脯胺酸寡胜肽酶能降解許多與記憶及學習有關的胜肽，被認為與記憶喪失症(amnesia)(如帕金森氏症(Parkinsonism))有關，所以有研究尋找其抑制劑以作為治療(Yoshimotoet al. ,1987；Atacket al. ,1991；Marighettoet al. ,2000；Leeet al. ,2004；Sorensenet al ,2004；Atta－ur－Rahmanet al. ,2005；Jarhoet al. ,2005)；另一方面研究脯胺酸寡胜肽酶應用在解決因富含脯胺酸(proline)之麩質(gluten)所引起之腹瀉(celiac disease)(Piperet al. ,2004；Martiet al. ,2005；Matysiak－Budniket al. ,2005；Pyleet al. ,2005；Gasset al. ,2005；)；或用以純化回收異源性表現胜肽酶(Xiuet al ., 2002)；另外也有應用在治療癌症上的研究使藥物先以前體藥物(prodrug)存在，減少對正常細胞的傷害，經脯胺酸寡胜肽酶作用後成為有功效的藥物(Heiniset al .,2004)。

脯胺酸寡胜肽酶存在動物、植物及微生物，但活性普遍不高。微生物方面脯胺酸寡胜肽酶曾在腦膜炎敗血黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum )(0.30 U/ml；Yashimotoet al .,1980)、乳酸菌(Lactobacillus casei )(0.15 U/g；Habibi-Najafi and Lee,1994)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )(4.3 mU/ml；Tobiassenet al .,1996)、洋菇(Agaricus bisporus )發酵液(0.15 U/ml；Abdus Sattaret al .,1990)、黃單胞菌(Xanthomonas spp.)(0.15 U/ml；Szwajcer-Deyet al .,1992)中被發現。

以基因工程方式將脯胺酸寡胜肽酶基因選殖(cloning)後以大腸桿菌(Eschericia coli ,E .coli )等作為宿主細胞，進行異源性大量表現可提高酶活性，如莢膜鞘單胞菌(Sphingomonas capsulata )在大腸桿菌中表現脯胺酸寡胜肽酶活性(0.2 U/ml)比原始母株高約七倍(Yoshimotoet al .,1998)；腦膜炎敗血黃桿菌之脯胺酸寡胜肽酶基因在大腸桿菌中表現最高可得0.7 U/ml(Diefenthalet al .,1993)，Uchiyama等人將腦膜炎敗血黃桿菌之脯胺酸寡胜肽酶重新構築在大腸桿菌表現之活性最高可得8.1 U/ml，純化後其比活性可高達124 U/mg(Uchiyamaet al .,2000)；嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila )脯胺酸寡胜肽酶基因在大腸桿菌中表現為原始母株100倍(1.48 U/ml)，純化後其比活性為8.8 U/mg(Kanataniet al. ,1993)；斑點氣單胞菌(Aeromonas punctata )脯胺酸寡胜肽酶基因在大腸桿菌中表現為原始母株112倍，純化後其比活性為67 U/mg(Liet al. ,2000)。

另外，極端嗜熱厭氧古菌(Pyrococcus furiosus )脯胺酸寡胜肽酶基因在大腸桿菌中表現後純化之比活性為232 U/mg(但其活性定義與前述各相關研究所使用之定義有相當大的不同，為每分鐘使OD₄₁₀ 吸光值產生0.1的改變即為1U，Harwoodet al. ,1997)及4 U/mg(Harwood and Schreier,2001)。

以上各例顯示出利用大腸桿菌表現脯胺酸寡胜肽酶基因並加以純化，確可提高其活性。然而各種脯胺酸寡胜肽酶分別適合不同的反應條件。在適合之反應條件下方可充分發揮其活性，而在不適合之反應條件下則僅能發揮部分活性。一般而言，活性高，且其所適用之環境條件貼近實際應用的環境條件之脯胺酸寡胜肽酶，比較具有應用潛力。而在評價其應用潛力時，通常觀察其反應最適溫度及最適pH值，而其適用範圍之寬窄，則視其於非最適環境條件下保有之活性比例高低，並測量其受熱後所餘之活性，以知其熱安定性。

就前揭各脯胺酸寡胜肽而言，嗜水氣單胞菌之脯胺酸寡胜肽酶之最適溫度為30℃，最適pH為8.0，在42℃預熱30分鐘時活性會減少50%；斑點氣單胞菌之脯胺酸寡胜肽酶之最適溫度為34℃，最適pH為8.4；腦膜炎敗血黃桿菌之脯胺酸寡胜肽酶最適pH為7.0，最適反應溫度為40℃，在42℃預熱15分鐘活性會減少50%(Yashimotoet al. ,1980)，而經易錯PCR(error－prone PCR)突變後之脯胺酸寡胜肽酶在60℃預熱1小時後活性(於pH7.0,30℃測定)會減少50%(Uchiyamaet al. ,2000)。目前利用大腸桿菌表現脯胺酸寡胜肽酶基因所得脯胺酸寡胜肽酶之中，以腦膜炎敗血黃桿菌之脯胺酸寡胜肽酶比活性最高，且經易錯PCR突變後其耐熱性也最佳。但腦膜炎敗血黃桿菌之為一株病源菌，在應用上有所疑慮，而其他的脯胺酸寡胜肽酶則有耐熱性不佳的缺點。

然而，由於生物體種類繁多，找出適當之生物體，並從生物體中分離純化出具有所需性質之脯胺酸寡胜肽酶，具有相當之困難，非本發明所屬技術領域中具有通常知識者可輕易得知或思及。例如，以往針對黑麴菌(Aspergillus niger )進行研究而最初篩選到之脯胺酸寡胜肽酶，其後經序列比對發現應屬另一種絲胺酸蛋白酶(serine protease)，而非脯胺酸寡胜肽酶；而到目前為止，在真菌中之絲狀真菌，尚未曾發現具有脯胺酸寡胜肽酶者，僅曾經在擔子菌中發現具有脯胺酸寡胜肽酶之真菌，目前也未見將真菌之脯胺酸寡胜肽酶在大腸桿菌中大量表現的案例。

有鑒於前述脯胺酸寡胜肽酶種類不足，而難以配合不同應用條件之問題，本發明之目的在於提供一種具有優異的脯胺酸寡胜肽酶活性，且耐熱性較佳的蛋白質及其基因、生產方法與應用。

本發明之發明人經研究及努力，終於自碎葉鬼傘(Coprinus clastophyllus )中，分離出可達成本發明目的之脯胺酸寡胜肽酶及其基因與生產方法。

為達成上述目的，本發明提供一種經分離的蛋白質，該蛋白質具有脯胺酸寡胜肽酶之活性，其係選自由下列組成之群(a)具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10之蛋白質；(b)由具有序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9之核酸序列所編碼之蛋白質；(c)具有與蛋白質(a)或(b)之胺基酸序列序列相似性大於60%的胺基酸序列，且具有同一活性之蛋白質。

其中由於胺基酸序列之變異並不必然影響其構成蛋白質之活性，因此只要該胺基酸序列之變異不影響該蛋白質之活性，仍屬於本發明之範圍。

本發明亦提供一種經分離的核酸，其係選自由下列組成之群：(a)編碼具有前述蛋白質之核酸；(b)具有序列SEQ ID NO：5之核酸；(c)具有與核酸(b)之核酸序列的序列相似性大於60%，且編碼具有同一活性之蛋白質之核酸；(d)具有序列SEQ ID NO：9之核酸；(e)具有與核酸(d)之核酸序列的序列相似性大於60%之核酸序列，且編碼具有同一活性之蛋白質之核酸；(f)與核酸(a)至(e)編碼具有相同胺基酸序列的蛋白質之核酸；(g)核酸(a)至(f)之反義核酸。

其中由於核酸序列之變異並不必然影響本發明所提供之序列編碼蛋白質之活性，因此只要在核酸序列之變異不影響該蛋白質之活性，仍屬於本發明之範圍。

本發明提供一種核酸探針，其係可藉由下列高度嚴格條件與前述之核酸雜合：(a)在FastHyb溶液中於50℃下反應16小時；(b)以適量2 X SSC,0.1 % SDS溶液於室溫下沖洗五分鐘；(c)反覆前述步驟(b)一次；(d)以0.5 X SSC,0.1 % SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；(e)反覆前述步驟(d)一次。

本發明提供一種具有前述核酸之嵌合基因，其係可操作的連結到一驅動子，而該驅動子可將該嵌合基因於一細胞中加以驅動表現。

一種核酸構築體，其包括前述之核酸，且該核酸係可操作地連接到控制序列，而該控制序列能夠在特定細胞中驅動該核酸所編碼的蛋白。

本發明提供一種載體，其包括有前述之核酸或前述之核酸構築體。

本發明提供一種轉形株(transformant)，其包括有前述之載體。

前述之轉形株，其係一BL21(DE3)大腸桿菌菌株。

前述之轉形株，其係一DH10B大腸桿菌菌株。

本發明提供一種具有解決因富含脯胺酸之麩質所引起腹瀉之功能的醫藥組成物，其含有前述之蛋白質作為有效成分，並含有醫藥上可接受之賦形劑。

本發明提供一種組成物，其含有一前體藥物、一醫藥上可接受之賦形劑與如申請專利第1項所述之蛋白質，該蛋白質係作為有效成分以處理該前體藥物而使其成為一有功效藥物。

本發明提供一種使用申請專利第1項所述之蛋白質之應用，其係用於製造純化回收異源性表現胜肽之回收處理劑。

本發明提供一種生產具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質之方法，其包括有以下步驟：(a)提供前述轉形株；(b)在可令具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質被表現之環境下培養該轉形株；及(c)進行純化以獲取該蛋白質。

由上述可知本發明所提供碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶之性質及其基因序列與生產方法之實施步驟，藉由該脯胺酸寡胜肽酶之性質，其所適用之範圍恰可彌補既有脯胺酸寡胜肽酶適用範圍之不足，具有更優秀之應用潛力；另一方面，藉由本發明所提供脯胺酸寡胜肽酶基因，可有效的利用前述之生產方法加以生產以供應用。

辭彙定義

相同度(Identity)：術語「相同度」於本文定義為二核酸序列之間或二胺基酸序列之間相互不歧異的程度。在本說明書中該相同度係採用基礎區域排比搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)程式測出Identity之讀值。

相似度(Similarity)：術語「相似度」於本文定義為二序列之間相關連的程度，其可以序列間相同比率及/或保留比率定之。在本說明書中該相同度係採用基礎區域排比搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)程式測出Similarity之讀值。

嵌合基因(chimeric gene)：術語「嵌合基因」於本文定義為攜帶來自不同來源之核酸之重組核酸形成之基因。例如來自相互無關之不同基因之核酸組成者，或由來自一基因的一部分片段與另一基因的一部分片段以重組技術形成者。

控制序列(controlling sequence)：術語「控制序列」於本文定義為一種能使一基因之核酸序列啟動或關閉，從而影響該基因核酸序列表現之序列；例如該控制序列可為一驅動子或一編碼訊號胜肽(signal peptide)之序列。

載體(vector)：術語「載體」於本文定義為一種用以轉移一核酸進入一宿主細胞之物，例如質體、噬菌體和其他病毒等。該載體亦可為一表現載體，其可例行地接受諸如具有重組核酸序列之核酸，並在將該核酸送入該宿主細胞之後，引起該核酸之核酸序列表現。其中載體與宿主細胞在配對使用上，係典型地根據載體與宿主細胞之間的相容性加以選擇。又，該載體可為線性或封閉環狀之核酸所構成之質體。

發明詳述

由於脯胺酸寡胜肽酶如前述與記憶學習相關胜肽之降解、以及富含脯胺酸之麩質所引起之腹瀉均有所關聯，且可用以純化回收異源性表現胜肽，或作用於前體藥物使之形成有效藥物，因此具有相當之研究與應用價值。

本發明提供具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質及其基因序列與生產方法之相關數據與具體實施步驟。本發明之具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質所適用之範圍恰可彌補既有脯胺酸寡胜肽酶適用範圍之不足，而該脯胺酸寡胜肽酶更具有極高之活性而具有更優秀之應用潛力；另一方面，可有效的利用本發明所提供分離自碎葉鬼傘之脯胺酸寡胜肽酶基因，以本發明所揭露之生產方法並進行製造醫藥組成物等相關應用。

又，藉由本發明提供之具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質，可用以製造醫藥組成物以解決因富含脯胺酸之麩質所引起腹瀉、或處理前體藥物使之成為有功效藥物；亦可用以製造能純化回收異源性表現胜肽之回收處理劑。

除此之外，本發明亦揭露了相關之核酸、載體及轉形株以作為生產與進一步研究之用。

根據本發明可作之不同修正及變化，以及所生產之脯胺酸寡胜肽酶在濃度數據或活性數據之小幅差距等，對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言，諸如採用不同的既有生物學方法或其他所屬技術領域中的習知技術等，均屬於顯而易知之不同修正而同樣的被涵蓋於本文之申請專利範圍之內。

蛋白質 本發明係相關一種經分離且具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質。為了提高脯胺酸寡胜肽酶之活性，在本發明中由原先所篩選到含有熱安定性較佳的脯胺酸寡胜肽酶(胞外活性0.03 U/ml)的碎葉鬼傘菌株(財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，編號BCRC 36074)中，選殖出脯胺酸寡胜肽酶之cDNA，並將其利用大腸桿菌作為宿主細胞以大量表現而獲取該蛋白質。

若定義在pH為7.0，反應溫度為45℃之條件下，每分鐘產生1微莫耳(μmole)重氮化對硝基苯胺之脯胺酸寡胜肽酶活性為1 U，則該具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質之活性在大腸桿菌菌株中於胞內所表現之脯胺酸寡胜肽酶活性為7.0 U/ml至8.0 U/ml，更佳的是7.2 U/ml至7.7 U/ml，最佳的是7.2 U/ml與7.7 U/ml；將該蛋白質純化後，其比活性為55.0 U/mg至70.0 U/mg，更佳的是56.1 U/mg至66.8 U/mg，最佳的是56.1 U/mg與66.8 U/mg。

又，該蛋白質最適反應pH為pH6至pH8，更佳的是pH6至pH7，最佳的是pH7。其於pH7之最適反應溫度係45℃，而其於pH8之最適反應溫度係37℃，且在受到未達55℃之短時間預熱時，仍保有相當之脯胺酸寡胜肽酶活性。

該蛋白質，較佳的是一種具有胺基酸序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10之蛋白質，或由具有序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9之核酸所編碼之蛋白質。又，該蛋白質具有與前述胺基酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、或由SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9編碼之胺基酸序列之序列相似性大於60%以上的胺基酸序列，且具有同一活性；較佳的是上述序列相似度較佳是70%以上，較佳的是上述序列相似度較佳是80%以上，更佳的是上述序列相似度較佳是90%以上，最佳的是上述序列相似度較佳是95%以上。即使胺基酸序列之間有所變異，其蛋白質仍可能發揮本發明所提供脯胺酸寡胜肽酶之活性；因此所屬領域中具有通常知識者可以理解：只要序列之變異不影響該蛋白質之功能或活性，仍屬於本發明之範圍。

再者，該蛋白質係由具有與序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9的序列相似性大於60%之核酸所編碼，且與前述蛋白質具有同一功能之蛋白質。

另外，該蛋白質係由一核酸所編碼，該核酸係可藉由：在FastHyb溶液中於50℃下反應16小時；以適量2 X SSC,0.1 % SDS溶液於室溫下沖洗五分鐘；如前一步驟再反覆沖洗一次；以0.5 X SSC,0.1 % SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；如前一步驟再反覆作用一次；之高度嚴格條件而得以與具有序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9之核酸雜合之核酸，且該蛋白質與前述本發明之蛋白質具有同一功能。

核酸 本發明亦相關於一種經分離之核酸，其具有編碼前述本發明蛋白質之核酸序列。該核酸係編碼具有前述蛋白質之核酸，較佳的是，其係具有序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9之核酸，或是具有與序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9之序列相似性大於60%之核酸序列，且編碼具有同一活性之蛋白質之核酸，皆屬於本發明涵蓋之範圍；較佳的是上述序列相似度較佳是70%以上，較佳的是上述序列相似度較佳是80%以上，更佳的是上述序列相似度較佳是90%以上，最佳的是上述序列相似度較佳是95%以上。

其中，序列SEQ ID NO：5與SEQ ID NO：9之間以及上述為本發明所涵蓋之核酸序列之間雖有變異，但其所編碼具有如前述SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：10等胺基酸序列或與之具有相當序列相似性之胺基酸序列的蛋白質均能發揮前述脯胺酸寡胜肽酶之功能，因此只要序列之變異不影響其所編碼蛋白質之功能或活性，仍屬於本發明之範圍。

又，與前述核酸編碼具有相同胺基酸序列的蛋白質之核酸，以及前述核酸之反義核酸，對所屬領域中具有通常知識者而言並不會偏離本發明之範圍，仍屬於本發明之範圍。

核酸探針(probe) 本發明亦相關於一種核酸探針，其係可藉由：在FastHyb溶液中於50℃下反應16小時；以適量2 X SSC,0.1 % SDS溶液於室溫下沖洗五分鐘；如前一步驟再反覆沖洗一次；以0.5 X SSC,0.1 % SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；如前一步驟再反覆作用一次；之高度嚴格條件而得以與前述之核酸雜合。

嵌合基因 本發明亦相關於一種具有前述核酸之嵌合基因，其係可操作的連結到一驅動子，而該驅動子可將該嵌合基因於一細胞中加以驅動表現。為研究或商業上之應用而將一核酸配合其他之核酸組合成嵌合基因以達其應用之目的，係為所屬技術領域中具有通常知識者可充份理解而能配合需要實施者。

核酸構築體(construct)及載體 本發明亦相關於一種核酸構築體，其包括前述之核酸，且該核酸係可操作地連接到一控制序列，而該控制序列至能夠在特定細胞中驅動該核酸所編碼的蛋白質。該等核酸構築體，例如重組質體，在研究或商業上均有多種應用，以一核酸構築一核酸構築體係為所屬技術領域中具有通常知識者可充份理解而能配合需要實施者。

又，本發明亦相關於一種載體，該載體係包括有前述本發明所相關之核酸或前述核酸構築體。

轉形株 本發明亦相關於一種轉形株(transformant)，其係一接受前述本發明所相關之核酸而被轉形之宿主細胞。該宿主細胞可為一大腸桿菌，該大腸桿菌菌株之例示包括有BL21(DE3)或DH10B等大腸桿菌菌株。

組成物 本發明亦相關於一種組成物，例如醫藥組成物，其包括有前述本發明所提供之蛋白質。

解決因富含脯胺酸之麩質所引起腹瀉，且本發明之具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質所適用之範圍恰可彌補既有脯胺酸寡胜肽酶適用範圍之不足，因此本發明之組成物更具優秀之應用潛力。其中，該有效成分係指該蛋白質成為該組成物之成分，而能發揮該組成物所欲達成之功效或功能；且本發明之組成物可更進一步包括有一賦形劑，以讓該組成物被調配成例如固體、半固體或液體等適當形態，使之更便於使用。

又，本發明亦相關於一種可配合具有哺胺酸殘基(residue)之前體藥物使用之組成物，其含有至少一醫藥上可接受之賦形劑與前述之蛋白質，並利用該蛋白質作為有效成分以發揮其脯胺酸寡胜肽酶活性，以處理該前體藥物而使其成為一有功效藥物。更佳的是，其進一步含有一與前述蛋白質結合之抗體。藉由將該抗體與前述蛋白質相結合，當該組成物被送入生物體之循環系統時，該蛋白質在生物體中可透過該抗體與特定組織之結合而定位。再接著將可配合使用之前體藥物送入生物體之循環系統，則由於僅在前述蛋白質定位處，該前體藥物方得以被該蛋白質所發揮之脯胺酸寡胜肽酶活性剪切為有效之藥物，因此可大幅增加該前體藥物之選擇性，而使作用之範圍更為精確，降低對其他組織產生影響。

用途 本發明亦相關於一種使用前述本發明之蛋白質之應用，其係利用前述蛋白質作為有效成分，發揮其脯胺酸寡胜肽酶活性，從而處理異源性表現胜肽以供回收，以用於製造純化回收異源性表現胜肽之回收處理劑。

生產方法 本發明亦相關於一種生產具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質之方法，其係以提供前述轉形株；在可令具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質被表現之環境下培養該轉形株；以及進行純化以獲取該蛋白質等步驟所組成。其中，該宿主細胞可採用但不限於前述BL21(DE3)或DH10B等大腸桿菌菌株形成之轉形株。

實施例

本發明之實際實施態樣及實施方法如下所示，但本發明所屬領域中常用、眾所周知或可得而知的各種已確立之技術手段，則酌減冗贅重覆之說明。又，各實施例係用以說明本發明而非限定本發明於該等實施例上。

實施例1

建立碎葉鬼傘cDNA庫(cDNA library)並選殖脯胺酸寡胜肽酶之cDNA 1.碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶基因片段之選殖及探針之製備 本發明先以人類的脯胺酸寡胜肽酶之胺基酸序列在NCBI網站上以blast分析真菌之基因體序列，找到較相關的灰蓋鬼傘岡山7#130菌株(Coprinopsis cinerea okayama7#130)與黃孢原毛平革菌RP－78菌株(Phanerochaete chrysosporium RP－78)之脯胺酸寡胜肽酶，並在本實施例中以灰蓋鬼傘岡山7#130菌株(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝genomeprj&cmd＝Retrieve&dopt＝Overview&list_uids＝9596)與黃孢原毛平革菌RP－78菌株(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝genomeprj&cmd＝Retrieve&dopt＝Overview&list_uids＝9525)二者之脯胺酸寡胜肽酶基因相似度高的區域設計引子(primer)，獲取Pro16引子：「5’－tacggcggmttcascatctc－3’(SEQ ID NO：1)」及Pro17引子：「5’－tgccaytcytcwccraactc－3’(SEQ ID NO：2)」，再以碎葉鬼傘DNA作為模板DNA(template DNA)，進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶連鎖反應)。

為進行PCR所調製之PCR混合液包括有：「最終濃度成份為1倍之PCR緩衝液、dNTP 0.2 mM、Pro16引子及Pro17引子各1 μM、5 U pfu DNA複製酶(pfu DNA polymerase)(Roach)以及適量的模板DNA(即前述碎葉鬼傘或cDNA)」並令該PCR混合液總體積為50 μl。

PCR所使用儀器為ABI 9700(Applied Bioscience)，所使用條件為：94℃,3分鐘[循環1次]；94℃,30秒,64℃,30秒,72℃,1分鐘[循環5次]；94℃,30秒,60℃,30秒,72℃,1分鐘[循環5次]；94℃,30秒,56℃,30秒,72℃,1分鐘[循環35次]；72℃,7分鐘[循環1次]。

藉由上述之PCR，可自前述模板DNA上擴增出一長度為128 bp(base pair，鹽基)之擴增片段，再利用生物學方法將該擴增片段選殖到PCR2.1－TOPO載體(購自Invitrogen)上，以獲取一質體(plasmid)，並稱該質體為p128，且利用可行之定序方法確認包含擴增片段的區域之序列。

接著利用p128之序列設計Pro20引子「5’－tacggcggattcagcatctc－3’(SEQ ID NO：3)」與Pro21「5’－tgccactcctcaccaaactc－3’(SEQ ID NO：4)」引子，再以PCR DIG標定套組(PCR DIG labeling kit，購自Roche)製作探針。製作探針過程中之PCR條件為：94℃,3分鐘[循環1次]；94℃,30秒,58℃,30秒,72℃,40秒[循環35次]；72℃,七分鐘[循環1次]。

依照該PCR DIG標定套組之操作方法並進行該PCR，可獲得一探針。

2.培養菌株 將碎葉鬼傘在YMA(購自Difco，編號Difco 0712)之平板(添加瓊膠製成之凝態培養基)上於25℃培養18天後，接菌於培養液N。該培養液N含有：2%葡萄糖(glucose，購自Merck),0.3%黃豆粉(soybean flour),1%胰化蛋白腖(Tryptone),0.3% KH₂ PO₄ (Merck),0.1% MgSO₄ (Merck)，且其pH值為6。接著於25℃、轉速200 rpm下培養七日。

3.建立碎葉鬼傘互補DNA文庫 將碎葉鬼傘如上述培養至第七天，取1.2 g除水菌絲體，依據TRIZOL反應劑(購自Invitrogen)之操作流程抽取全部RNA(total RNA)。

首先係抽取碎葉鬼傘之全部RNA，在本實施例中取得約325 μg，其OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 為2.05；但全部RNA之抽取量並不嚴格限定，取得多達500 μg之全部RNA亦無不可。

再者，依據PolyATractmRNA單離系統套組(PolyATractmRNA isolation systems kit，購自Promega)之操作流程，對所取得之全部RNA進行mRNA的萃取，取得6 μg且OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 為2.01之polyA mRNA(具有聚腺苷酸之mRNA)。

接著，取2－7 μg polyA mRNA依據ZAP－cDNAGigapackIII Gold選殖套組(ZAP－cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit，購自Stratagen)之操作流程建立碎葉菌互補DNA文庫。在本實施例中，係接著藉由該ZAP－cDNAGigapackIII Gold選殖套組回收0.75－3 kb DNA片段，並篩選8 x 10⁵ 顆溶菌斑(plaque)以建立互補DNA文庫。

該碎葉菌互補DNA文庫之中的個別菌株分別帶有不同的質體，且各質體係由至少一載體與至少一cDNA所構成。其中該載體上具有複數之限制酶切位(restriction site)，在本實施例中，該載體至少包括Eco RI與Hind III等限制酶(restriction enzyme)之切位，且其位於cDNA兩端處之序列係分別為對應於T3引子與T7引子之序列。

4.挑選溶菌斑 再依照GigapackIII Gold Cloning Kit(購自Stratagen)之後續操作流程進行溶菌斑雜合(Plaque hybridization)，得到複數由輔助噬菌體(helper phage)所形成之溶菌斑，並製作一溶菌斑採測材料(plaque lift)，其中通常採用硝化纖維素膜(nitrocellulose membrane)作為該溶菌斑採測材料。

該溶菌斑採測材料係先於FastHyb溶液(購自Biochain)在50℃下反應2小時進行預雜合(prehybridization)，再製備一含有探針之FastHyb溶液，並將該溶菌斑採測材料移入含有探針之FastHyb溶液中於50℃下反應16小時。

接著進行沖洗過程：(1)以適量2 X SSC,0.1 % SDS溶液於室溫下沖洗該溶菌斑採測材料五分鐘；(2)反覆前述步驟(1)一次；(3)對該溶菌斑採測材料以0.5 X SSC,0.1 % SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；(4)反覆前述步驟(3)一次。

經上述沖洗該溶菌斑採測材料後，再使用針對探針所附DIG之抗體進行抗體偵測，並以X光底片進行自動放射顯影，可得到不同的訊號，以區分出具有訊號之溶菌斑以及不具訊號之溶菌斑。

5.取得轉形株 經由上述方法，在本實施例中確定出93個有意義的訊號。依據ZAP－cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit操作流程，經過二次篩選得到純淨單一的溶菌斑，以T3引子與T7引子進行PCR，挑選PCR產物分子量最大的11個溶菌斑，並進行生體內剪接作用(in vivo excision)。

所得之轉形株質體以Eco RI與Hind III限制酶(restriction enzyme)同時作用進行確認，並用膠體電泳(gel electrophoresis)分析，並挑選出四個長度較長的轉形株，49－1、71－1、76－3與91－1。

6.進行定序

在此定序步驟中，先以前述質體之載體上現有引子進行定序得知cDNA兩端之序列後，再依據所得知的序列更進一步設計引子並定序，以逐步完成全長cDNA之定序。

7.獲取碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶之cDNA並確認其性質及相關數據

藉由上述步驟，可定出碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶cDNA之核酸序列(SEQ ID NO：5)，其全長2,508 nt，在第65 nt開始有一個2,217 nt之ORF，編碼739個胺基酸(SEQ ID NO：6)，該739個胺基酸之分子量為83.9 kD並構成一具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質。該碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶cDNA之核酸序列(SEQ ID NO：5)係：「 」。又該碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶cDNA之核酸序列(SEQ ID NO：5)所編碼739個胺基酸(SEQ ID NO：6)係：「

又如表一所示，將碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶胺基酸序列以套裝軟體GCG(Accelrys)之GAP程式與其他物種脯胺酸寡胜肽酶胺基酸序列比較，結果以非洲爪蟾(Xenopus tropicalis )相同性最高(45.8%)，其次為玉米黑穗菌(Ustilago maydis )(44.7%)，與人、鼠、豬、藍綠藻、阿拉伯芥及牛間之相同性(40~43.9%)反較同屬擔子菌屬之新型隱球菌(Cryptococcus neoformans )相同性(31.6~32%) 高。

由上述可知，在不同物種之中具有與SEQ ID NO：5所編碼之胺基酸序列SEQ ID NO：6之相似度在60%以下之各種胺基酸序列，其中由於胺基酸序列之變異並不必然影響其所構成蛋白質之活性，因此只要胺基酸序列之變異不影響該蛋白質之活性，仍屬於本發明之範圍。

上述相似度較佳是70%以上。

上述相似度更佳是80%以上。

上述相似度更較佳是90%以上。

上述相似度最佳是95%以上。

實施例2

碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶cDNA在大腸桿菌之表現

以Pro 31引子「5’-atggtgaccaaaacctgggt-3’(SEQ ID NO：7)」與Pro 32引子「5’-ctagagtgtagctttatctttc-3’(SEQ ID NO：8)」，使用pfu複製酶進行PCR增生一含有終止密碼子(stop codon)之完整脯胺酸寡胜肽酶cDNA。

該PCR所使用條件為：94℃,3分鐘[循環1次]； 94℃,30秒，58℃,30秒，72℃,180秒[循環35次]；72℃,3分鐘[循環1次]。

將上述PCR所得到的完整脯胺酸寡胜肽酶cDNA，以及一含有對應T7引子序列及N端His-tag(組胺酸標幟)的pET 151/D-TOPO表現載體(Invitrogen)進行接合反應，以構成一基因重組質體，並將該基因重組質體送入DH10B大腸桿菌菌株(購自Invitrogen)中並於37℃以LB培養液(購自USB)或LB平板(購自USB)培養之，以獲取複數菌落(colony)。從該複數菌落中挑選其中三菌落，並依生物學方法自各菌落之大腸桿菌中取得基因重組質體，再將該等基因重組質體送入BL21(DE3)大腸桿菌菌株(購自Invitrogen)中進行表現。

上述三組含基因重組質體之BL21(DE3)大腸桿菌菌株以LB培養液於搖瓶中培養至OD₆₀₀ 大約0.4-0.6時，加入終濃度為0.4 mM的IPTG繼續培養20小時，使各含有基因重組質體之BL21(DE3)大腸桿菌菌株表現其基因重組質體之碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶cDNA，其所表現之具有脯胺酸寡胜肽酶活性的蛋白質係參考pET系統(pET system，購自Novagen)使用手冊所揭露之蛋白質純化方法進行純化，以Bio-Rad蛋白質試驗(Bio-Rad Protein Assay)(購自Bio-Rad)測定蛋白質量，並使用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)做為標準，以其作出標準曲線(standard curve)後據以測定蛋白質量。

此外，亦可配合實際上應用或研究等需求，以上述之 技術手段，將上述脯胺酸寡胜肽酶cDNA置於一可驅動表現該脯胺酸寡胜肽酶cDNA之驅動子或控制序列的控制之下，使該脯胺酸寡胜肽酶cDNA可操作地連結到該驅動子或該控制序列以構築成一嵌合基因或一核酸構築體，並藉由該驅動子或該控制序列驅動表現之能力，令該嵌合基因或該核酸構築體於一細胞中被驅動表現。

實施例3

測定碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性

1.挑選pProHN14及pProHN17並測定其所編碼蛋白質脯胺酸寡胜肽酶之活性

取適當稀釋之脯胺酸寡胜肽酶溶液先與1 N HCl終止液反應，再加入其他試劑以作為控制組並建立OD₄₁₀ 對於重氮化對硝基苯胺(p-nitroaniline，購自Fluka)產生量的標準曲線，以作為測定之根據，並定義前述在pH為7.0，反應溫度為45℃之條件下，每分鐘產生1微莫耳(μmole)重氮化對硝基苯胺之脯胺酸寡胜肽酶活性為1 U。

於微量離心管中加入400 μl之0.1 M鈉-磷酸緩衝液(Na-phosphate buffer)、50μl之10mM Z-甘胺醯基-L-脯胺酸-4-硝基苯胺(Z-glycyl-L-proline-4-nitroanilide，購自Fluka)及50 μl之經適當稀釋具有脯胺酸寡胜肽酶活性蛋白質之溶液，反應5-60分鐘，加入500 μl之1 N HCl終止反應之後，以13,000 rpm離心5分鐘，取上清液測OD₄₁₀ 。

取前述上清液所測得之OD₄₁₀ ，對應上述標準曲線，分別求得前述三組BL21(DE3)大腸桿菌菌株所表現脯胺酸寡胜肽酶之活性，並從中選出表現活性較高之二組，其分別由基因重組質體pProHN14及pProHN17所編碼，而pProHN14及pProHN17之蛋白質在BL21(DE3)大腸桿菌菌株中於胞內所表現之脯胺酸寡胜肽酶活性分別為7.2 U/ml與7.7 U/ml。

2.對pProHN14及pProHN17之完整脯胺酸寡胜肽酶cDNA進行定序

將pProHN14及pProHN17以可行之定序方法進行定序。依定序結果可知pProHN17之完整脯胺酸寡胜肽酶cDNA之核酸序列符合原先設計，具有SEQ ID NO：5所記載之核酸序列。

另一方面，pProHN14則具有SEQ ID NO：9所示之核酸序列。相較於pProHN17，pProHN14由於在C端缺少4個核酸(CTAG)而造成讀框轉移(frame-shift)，使得pProHN14所表現之具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質的胺基酸序列(SEQ ID NO：10)在C端比預期多出24個胺基酸，其係：「RASSDPAANKA RKEAELAAAT AEQ」。該24個胺基酸亦可記載為：「Arg Ala Ser Ser Asp Pro Ala Ala Asn Lys Ala Arg Lys Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Glu Gln」。其中，前述pProHN14所具有SEQ ID NO：9之核酸序列係：「 」。前述pProHN14所表現之具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋 白質的胺基酸序列(SEQ ID NO：10)係：「 755 760」。以BCRC 36074為模版，於引子設計時特意使相對應之引子缺漏上述pProHN14在C端所缺少之4個核酸(CTAG)，即可利用PCR方式得到一序列，其C端較完整寡胜肽酶之DNA序列缺少4個核酸；進一步將該序列接入一表現載體，可獲取SEQ ID NO：6之核酸序列和SEQ ID NO：10之胺基酸序列。在一可行之實施態樣中，可採用pET151/D-TOPO作為該表現載體。

3.比較pProHN14與pProHN17所表現之之蛋白質以及既有脯胺酸寡胜肽酶之活性與比活性

如上所述，pProHN14及pProHN17之蛋白質在BL21(DE3)大腸桿菌菌株中於胞內所表現之脯胺酸寡胜肽酶活性分別為7.2 U/ml與7.7 U/ml，該活性近於腦膜炎敗血黃桿菌脯胺酸寡胜肽酶在大腸桿菌表現之活性(8.1 U/ml)，而優於其他大部分既有脯胺酸寡胜肽酶所表現之活性。

經由Ni-NTA管柱(管柱是自行裝填(packing)，其樹脂(resin)為購自Invitrogen之Ni-NTA瓊膠)親和性步驟可得pProHN14與pProHN17之蛋白質經純化後，可測得純化蛋白質之脯胺酸寡胜肽酶比活性分別為56.1 U/mg與66.8 U/mg，低於純化後之腦膜炎敗血黃桿菌脯胺酸寡胜肽酶比活性(124 U/mg)，而優於其他大部分既有脯胺酸寡胜肽酶在純化後所表現之比活性。

實施例4

pProHN14與pProHN17之脯胺酸寡胜肽酶基本性質分析

1.最適合碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶反應之pH值

最適反應pH之測定方法係以pH3-8之檸檬酸-亞磷酸氫鈉緩衝溶液(citric acid-Na₂ HPO₄ buffer solution)或pH9-12之甘胺酸-氫氧化鈉緩衝溶液(glycine-NaOH buffer solution)取代標準酶活性測定所用之緩衝液，其餘反應條件同上述脯胺酸寡胜肽酶活性之測定方法。

pProHN14與pProHN17之蛋白質皆於pH 7.0反應時表現出最高脯胺酸寡胜肽酵素酶活性。又pProHN14之蛋白質酶可較pProHN17之蛋白質適應更廣的pH範圍。其比較的結果如第一圖所示，在pH 6.0時，pProHN14之蛋白質約有90%活性而pProHN17之蛋白質僅約有50%活性。

2.最適合碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶之反應溫度

最適反應溫度之測定方法係令酶反應分別於25、30、37、45或55℃之溫度下進行，其餘反應條件同上述脯胺酸寡胜肽酶活性之測定方法。

其在pH 7.0時測定的結果如第二圖所示，pH 7.0時pProHN14之蛋白質與pProHN17之蛋白質皆在45℃反應時表現出最高酶活性，可知其最適溫度為45℃，而此最適溫度比現有比活性高的脯胺酸寡胜肽酶的最適溫度都高。

又在pH 8.0時測定的結果如第三圖所示，在pH 8.0時，pProHN14之蛋白質與pProHN17之蛋白質皆以37℃反應的酶活性最高。

3.碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶之熱安定性

酶之熱安定性之測定方法係將樣品於分別於30℃、37℃或45℃先預熱0、20、40、60或80分鐘，或於55℃下先預熱0、5、10、15、20、25或30分鐘，再以上述脯胺酸寡胜肽酶活性之測定方法進行酶活性測定。

其測定結果如第四圖所示，pProHN14之蛋白質於30℃與37℃分別預熱80分鐘後，尚保有99%與93%之活性；而pProHN17之蛋白質於同樣條件下預熱後，則保有80%與73%之活性。

在45℃預熱60分鐘後，pProHN14之蛋白質保有67%活性，而pProHN17之蛋白質僅保有32%活性，可知pProHN14之蛋白質之熱安定性高於pProHN17之蛋白質之熱安定性。

pProHN14之蛋白質與pProHN17之蛋白質在55℃預熱5分鐘均僅殘存9%活性。

第一圖：係揭露不同pH值對pProHN14與pProHN17之蛋白質之脯胺酸寡胜肽酶活性影響之折線圖。其中「●」符號之折線表示pProHN14之蛋白質；「▲」符號之折線表 示pProHN17之蛋白質。

第二圖：係揭露pH7.0時溫度對pProHN14與pProHN17之蛋白質活性影響之柱狀圖。其中實心黑色柱表示pProHN14之蛋白質；空心白色柱表示pProHN17之蛋白質。

第三圖：係揭露pH8.0時溫度對pProHN14與pProHN17之蛋白質之脯胺酸寡胜肽酶活性影響之柱狀圖。其中實心黑色柱表示pProHN14之蛋白質；空心白色柱表示pProHN17之蛋白質。

第四圖：係揭露重組脯胺酸寡胜肽酶熱安定性之折線圖。其中「實線」之折線表示pProHN14之蛋白質；「虛線」之折線表示pProHN17之蛋白質。又，「●」符號之折線表示以30℃預熱；「■」符號之折線表示以37℃預熱；「▲」符號之折線表示以45℃預熱；「◆」符號之折線表示以55℃預熱。

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<110> 財團法人食品工業發展研究所

<120> 具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質、編碼該蛋白質之核酸序列、生產該蛋白質之方法及其應用

<130> P84103

<160> 10

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成

<400> 4

<210> 5

<211> 2508

<212> DNA

<213> 碎葉菌(Coprinus clastophyllus)

<220>

<221> CDS

<222> (65)..(2284)

<400> 5

<210> 6

<211> 739

<212> PRT

<213> 碎葉菌(Coprinus clastophyllus)

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成

<400> 8

<210> 9

<211> 2289

<212> DNA

<213> 碎葉菌(Coprinus clastophyllus)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2289)

<400> 9

<210> 10

<211> 763

<212> PRT

<213> 碎葉菌(Coprinus clastophyllus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (171)..(171)

<223> The ’Xaa’ at location 171 stands for Tyr.

<400> 10

Claims (36)

1. 一種經分離的核酸分子，其係選自由下列：(a)由以下：(a-i)以SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2作為引子並以財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心寄存編號BCRC 36074碎葉鬼傘之DNA作為模板DNA，擴增出一長度為128鹽基之擴增片段；(a-ii)齊備包括有該擴增片段之探針；選殖該擴增片段，以獲取一質體；(a-iii)齊備一碎葉鬼傘互補DNA文庫；及(a-iv)以前述探針對前述碎葉鬼傘互補DNA文庫進行溶菌斑雜合；之步驟所獲取之全長2,508 nt，在第65 nt開始有一個2,217 nt之ORF，編碼739個胺基酸，且該739個胺基酸之分子量為83.9 kD並構成一具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質的核酸分子；(b)在FastHyb溶液中於50℃下反應16小時；以適量2 X SSC,0.1% SDS溶液於室溫下沖洗五分鐘；如前一步驟再反覆沖洗一次；以0.5 X SSC,0.1% SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；如前一步驟再反覆作用一次；之高度嚴格條件得以與前述核酸分子(a)雜合之核酸分子；及(c)前述核酸分子(a)或核酸分子(b)之反義核酸分子；所構成之群組。
2. 一種經分離的蛋白質，其由申請專利範圍第1項所述核酸分子所編碼具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質。
3. 一種經分離的核酸分子，其係選自由下列：(a)由以下：(a-i)採用申請專利範圍第1項所述之核酸為模板，並採用SEQ ID NO：7之核酸序列及將SEQ ID NO：8去除其5'端的「CTAG」等4個核酸後之核酸序列為引子，進行聚合酶連鎖反應以獲取一完整脯胺酸寡胜肽酶cDNA；(a-ii)將前述完整脯胺酸寡胜肽酶cDNA接合於一表現載體，以構成一基因重組質體；(a-iii)將前述基因重組質體送入一第一大腸桿菌菌株；及(a-iv)培養帶有前述基因重組質體之第一大腸桿菌菌株以形成菌落；之步驟自前述菌落中所取得，其較申請專利範圍第1項所述之核酸分子在3'端缺少4個核酸鹽基，且編碼一具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性而在C端較申請專利範圍第2項所述之蛋白質多出24個胺基酸殘基即「R ASSDPAANKA RKEAELAAAT AEQ」胺基酸殘基之蛋白質的核酸分子；(b)以DH10B大腸桿菌菌株為前述第一大腸桿菌菌株，如前述製得核酸分子(a)之步驟所製得的核酸分子； (c)在FastHyb溶液中於50℃下反應16小時；以適量2 X SSC,0.1% SDS溶液於室溫下沖洗五分鐘；如前一步驟再反覆沖洗一次；以0.5 X SSC,0.1% SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；如前一步驟再反覆作用一次；之高度嚴格條件得以與前述核酸分子(a)雜合之核酸分子；及(d)前述核酸分子(b)、核酸分子(c)或核酸分子(d)之反義核酸分子；所構成之群組。
4. 一種經分離的蛋白質，其由申請專利範圍第3項所述核酸分子所編碼具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質。
5. 如申請專利範圍第4項所述之蛋白質，其係將申請專利範圍第3項所述核酸分子送入一第二大腸桿菌菌株所表現具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質。
6. 如申請專利範圍第5項所述之蛋白質，該第二大腸桿菌菌株係BL21(DE3)。
7. 一種經分離的蛋白質，其具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性而在pH 7.0係於45℃反應時表現出最高脯胺酸寡胜肽酵素酶活性，且在pH 8.0係於37℃反應時表現出最高脯胺酸寡胜肽酵素酶活性；所述之蛋白質，其係由申請專利範圍第1項所述之核酸分子所編碼者。
8. 如申請專利範圍第7項所述之蛋白質，其在pH 6.0時約有90%脯胺酸寡胜肽酵素酶活性，且於45℃預熱60分 鐘後保有67%脯胺酸寡胜肽酵素酶活性。
9. 一種經分離的蛋白質，其具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性而在pH 7.0係於45℃反應時表現出最高脯胺酸寡胜肽酵素酶活性，且在pH 8.0係於37℃反應時表現出最高脯胺酸寡胜肽酵素酶活性；所述之蛋白質，其在pH 6.0時約有90%脯胺酸寡胜肽酵素酶活性，且於45℃預熱60分鐘後保有67%脯胺酸寡胜肽酵素酶活性；所述之蛋白質，其係由申請專利範圍第3項所述之核酸分子所編碼者。
10. 一種核酸構築體，其包括申請專利範圍第1項所述之核酸分子，且該核酸分子係可操作地連接到一控制序列，而該控制序列至能夠在特定細胞中驅動該核酸所編碼的蛋白。
11. 一種核酸構築體，其包括申請專利範圍第3項所述之核酸分子，且該核酸分子係可操作地連接到一控制序列，而該控制序列至能夠在特定細胞中驅動該核酸所編碼的蛋白。
12. 一種載體，其包括有如申請專利範圍第1項所述之核酸分子。
13. 一種載體，其包括有如申請專利範圍第3項所述之核酸分子。
14. 一種載體，其包括有如申請專利範圍第10項所述之核酸構築體。
15. 一種載體，其包括有如申請專利範圍第11項所述之核酸構築體。
16. 一種轉形株，其包括有如申專利範圍第12至15項中任一項所述之載體。
17. 如申請專利範圍第16項所述之轉形株，其係一BL21(DE3)大腸桿菌菌株或DH10B大腸桿菌菌株。
18. 一種具有解決因富含脯胺酸之麩質所引起腹瀉之功能的醫藥組成物，其含有如申請專利範圍第2及7至9項中任一項所述之蛋白質作為有效成分，並含有醫藥上可接受之賦形劑。
19. 一種可配合具有哺胺酸殘基之前體藥物使用之藥學組成物，其含有至少一醫藥上可接受之賦形劑與如申請專利第2及7至9項中任一項所述之蛋白質，該蛋白質係作為有效成分以處理該前體藥物而使其成為一有功效藥物。
20. 如申請專利範圍第19項所述之藥學組成物，其進一步含有一與前述蛋白質結合之抗體。
21. 一種使用申請專利第2及7至9項中任一項所述之蛋白質之應用，其係用於製造純化回收異源性表現胜肽之回收處理劑。
22. 一種生產具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質之方法，其包括有以下步驟：(a)提供申請專利範圍第16項所述之轉形株；(b)在可令具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質被表現之 環境下培養該轉形株；及(c)進行純化以獲取該蛋白質。
23. 一種生產具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質之方法，其包括有以下步驟：(a)提供申請專利範圍第17項所述之轉形株；(b)在可令具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質被表現之環境下培養該轉形株；及(c)進行純化以獲取該蛋白質。
24. 一種經分離的核酸分子，其係選自由下列：(a)具有SEQ ID NO：5核酸序列或SEQ ID NO：9核酸序列之核酸分子；(b)可藉由：在FastHyb溶液中於50℃下反應16小時；以適量2 X SSC,0.1% SDS溶液於室溫下沖洗五分鐘；如前一步驟再反覆沖洗一次；以0.5 X SSC,0.1% SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；如前一步驟再反覆作用一次；之高度嚴格條件而得以與核酸分子(a)雜合之核酸分子；(c)與前述核酸分子(a)或核酸分子(b)編碼具有相同胺基酸序列的蛋白質之核酸分子；及(d)前述核酸分子(a)、核酸分子(b)或核酸分子(c)之反義核酸分子；所構成之群組。
25. 一種經分離的蛋白質，其係選自由下列：(a)具有SEQ ID NO：6胺基酸序列或SEQ ID NO：10胺基 酸序列之蛋白質；(b)由具有SEQ ID NO：5核酸序列或SEQ ID NO：9核酸序列之核酸分子所編碼之蛋白質；及(c)可藉由：在FastHyb溶液中於50℃下反應16小時；以適量2 X SSC,0.1% SDS溶液於室溫下沖洗五分鐘；如前一步驟再反覆沖洗一次；以0.5 X SSC,0.1% SDS溶液於65℃下充分作用15分鐘；如前一步驟再反覆作用一次；之高度嚴格條件而得以與具有SEQ ID NO：5核酸序列或SEQ ID NO：9核酸序列之核酸分子雜合之核酸分子所編碼，且具有碎葉鬼傘脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質；所構成之群組。
26. 一種核酸構築體，其包括申請專利範圍第24項所述之核酸分子，且該核酸分子係可操作地連接到一控制序列，而該控制序列至能夠在特定細胞中驅動該核酸所編碼的蛋白。
27. 一種載體，其包括有如申請專利範圍第24項所述之核酸分子。
28. 一種載體，其包括有如申請專利範圍第26項所述之核酸構築體。
29. 一種轉形株，其包括有如申專利範圍第27或28項中任一項所述之載體。
30. 如申請專利範圍第29項所述之轉形株，其係一BL21(DE3)大腸桿菌菌株或DH10B大腸桿菌菌株。
31. 一種具有解決因富含脯胺酸之麩質所引起腹瀉之 功能的醫藥組成物，其含有如申請專利範圍第25項所述之蛋白質作為有效成分，並含有醫藥上可接受之賦形劑。
32. 一種可配合具有哺胺酸殘基之前體藥物使用之藥學組成物，其含有至少一醫藥上可接受之賦形劑與如申請專利第25項所述之蛋白質，該蛋白質係作為有效成分以處理該前體藥物而使其成為一有功效藥物。
33. 如申請專利範圍第32項所述之藥學組成物，其進一步含有一與前述蛋白質結合之抗體。
34. 一種使用申請專利第25項所述之蛋白質之應用，其係用於製造純化回收異源性表現胜肽之回收處理劑。
35. 一種生產具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質之方法，其包括有以下步驟：(a)提供申請專利範圍第29項所述之轉形株；(b)在可令具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質被表現之環境下培養該轉形株；及(c)進行純化以獲取該蛋白質。
36. 一種生產具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質之方法，其包括有以下步驟：(a)提供申請專利範圍第30項所述之轉形株；(b)在可令具有脯胺酸寡胜肽酶活性之蛋白質被表現之環境下培養該轉形株；及(c)進行純化以獲取該蛋白質。