TW202115122A - 抗b7-h3抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明關於抗體藥物技術領域，尤其關於一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，包含抗B7-H3抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段具有高的親和力和穩定性，抗腫瘤活性顯著，可用於製備抗腫瘤的藥物。

Description

抗B7-H3抗體及其應用
本發明關於抗體藥物技術領域，尤其關於一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，包含抗B7-H3抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。
B7-H3（CD276）屬於B7超家族，是一種跨膜醣蛋白，其胞外區結構分爲2種，一種是單價的2Ig-B7-H3，一種是由2個重複單元結構組成的雙價的4Ig-B7-H3。B7-H3作爲一種新型免疫檢查點，文獻報導中B7-H3透過與一種結構未知的受體作用，能夠抑制T細胞增殖及細胞因子釋放(Suh W K, et al. The B7 family member B7-H3 preferentially down-regulates T helper type 1-mediated immune responses[J]. Nature Immunology, 2003, 4(9):899)，抑制NK細胞對B7-H3高表現的患者來源的腫瘤細胞的裂解活性(Castriconi R, et al. Identification of 4Ig-B7-H3 as a neuroblastoma-associated molecule that exerts a protective role from an NK cell-mediated lysis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2004, 101(34):12640-12645)。雖然B7-H3受體未知，但是近年來關於B7-H3與受體作用在腫瘤免疫中的負調控的報導越來越多。腫瘤細胞表現B7-H3，使其規避CD8+ T細胞的免疫監視，小鼠模型中，抗鼠B7-H3抗體的使用，能增强CD8+ T細胞的免疫功能（Yonesaka K , et al. B7-H3 negatively modulates CTL-mediated cancer immunity [J]. Clinical Cancer Research, 2018, clincanres.2852.2017）。在Lee Y等人研究中，基因敲除小鼠B7-H3或者使用抗鼠B7-H3抗體均能顯著抑制腫瘤的生長，這種抑制作用依賴於CD8+ T和NK細胞的功能(Lee Y , et al. Inhibition of the B7-H3 immune checkpoint limits tumor growth by enhancing cytotoxic lymphocyte function[J]. Cell Research, 2017, 27(8):1034-1045)。在肺癌患者中的研究發現，B7-H3高表現患者的腫瘤浸潤性淋巴細胞少且更容易發生淋巴結轉移(Altan M, et al. B7-H3 expression in NSCLC and its association with B7-H4, PD-L1 and Tumor Infiltrating Lymphocytes[J]. Clinical Cancer Research, 2017, 23(17):5202).
B7-H3異常表現於多種腫瘤細胞、腫瘤基質、腫瘤血管及腫瘤浸潤的巨噬細胞和DC細胞。在來自病人的前列腺癌、胰腺癌、肝細胞癌、頭頸癌、腎癌等組織樣本中，B7-H3的表現比率均超過90%，而在正常組織中鮮見表現(Seaman S , et al. Eradication of Tumors through Simultaneous Ablation of CD276/B7-H3-Positive Tumor Cells and Tumor Vasculature.[J]. Cancer Cell, 2017, 31(4):501-515)。基於B7-H3的腫瘤特異性表現趨向，臨床在研究抗B7-H3靶點的抗體類藥物，均是借助B7-H3的腫瘤靶向性來進行藥物開發。Enoblituzumab，人源化抗B7-H3單株抗體，透過抗體靶向腫瘤介導抗體Fc段的ADCC效應來殺傷腫瘤。Burtomab是攜帶放射性碘的抗B7-H3鼠源抗體藥物耦聯物，在臨床中治療轉移性神經母細胞瘤，顯著提高兒童腫瘤患者生存期。
基於B7-H3在腫瘤環境中的高表現特性及其對免疫細胞的抑制活性特點，B7-H3可作爲抗腫瘤藥物開發的有效的靶點。需要提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其具有更高的親和力和穩定性，可阻斷B7-H3對腫瘤的免疫抑制，增强CD8+ T細胞和NK細胞對腫瘤的殺傷活性，並協同抗體Fc段的ADCC效應發揮抗腫瘤作用，從而具有更優異的抗腫瘤活性。
本發明一方面提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含重鏈可變區的互補決定區1（HCDR1）、重鏈可變區的互補決定區2（HCDR2）和/或重鏈可變區的互補決定區3（HCDR3），所述輕鏈可變區包含輕鏈可變區的互補決定區1（LCDR1）、輕鏈可變區的互補決定區2（LCDR2）和/或輕鏈可變區的互補決定區3（LCDR3）。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： （1）所述重鏈可變區包含選自如下群組的HCDR1、HCDR2和HCDR3： （a1） 如SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列； （a2） 如SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列； （a3） 如SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列；和 （a4） 如SEQ ID NO: 20、21和22所示的胺基酸序列； （a5） 與（a1）、（a2）、（a3）或（a4）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR；和 （2）所述輕鏈可變區包含選自如下群組的LCDR1、LCDR2和LCDR3： （a6）如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列； （a7）如SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列； （a8）如SEQ ID NO: 16、18和19所示的胺基酸序列； （a9）如SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列； （a10）如SEQ ID NO: 23、24和25所示的胺基酸序列；和 （a11）與（a6）、（a7）、（a8）、（a9）或（a10）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 1、2和3或與SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 4、5和6或與SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 7、8和9或與SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 10、11和12或與SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 13、14和15或與SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 16、18和19或與SEQ ID NO: 16、18和19所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 13、14和15或與SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 17、18和19或與SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其具有所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 20、21和22或與SEQ ID NO: 20、21和22所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 23、24和25或與SEQ ID NO: 23、24和25所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段是單株抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段或人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中 (1) 所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (b1) 如SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列； (b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（b1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b3) 與（b1）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (b4) 如SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 36所示的胺基酸序列； (b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（b4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b6) 與（b4）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO: 26經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 26功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 26具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 27，SEQ ID NO: 27經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 27功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 27具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 28，SEQ ID NO: 28經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 28功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 28具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO: 29經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 29功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 29具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 30，SEQ ID NO: 30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 30具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 31，SEQ ID NO: 31經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 31功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 31具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 30，SEQ ID NO: 30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 30具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 32，SEQ ID NO: 32經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 32功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 32具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 35，SEQ ID NO: 35經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 35功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 36，SEQ ID NO: 36經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 36功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 36具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO: 26經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 26功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 26具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 27，SEQ ID NO: 27經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 27功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 27具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 28，SEQ ID NO: 28經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 28功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 28具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO: 29經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 29功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 29具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 30，SEQ ID NO: 30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 30具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 31，SEQ ID NO: 31經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 31功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 31具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 16、18和19所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 30，SEQ ID NO: 30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 30具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 32，SEQ ID NO: 32經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 32功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 32具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 35，SEQ ID NO: 35經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 35功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 20、21和22所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 36，SEQ ID NO: 36經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 36功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 36具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 23、24和25所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗B7-H3抗體爲鼠源抗體，其還含有鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和鼠源的κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施方案中，根據本發明的抗B7-H3鼠源抗體還含有鼠源的IgG1或IgG2或其變體的重鏈恆定區，和鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體爲人源化抗體，其中： （1）所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1) 如SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73所示的胺基酸序列； (c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3) 與（c1）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4) 如SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79所示的胺基酸序列； (c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6) 與（c4）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體爲人源化抗體，其中： （1）所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1) 如SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 48所示的胺基酸序列； (c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3) 與（c1）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4) 如SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO: 51所示的胺基酸序列； (c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6) 與（c4）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體爲人源化抗體，其中： （1）所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1) 如SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56或SEQ ID NO: 57所示的胺基酸序列； (c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3) 與（c1）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4) 如SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61或SEQ ID NO: 62所示的胺基酸序列； (c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6) 與（c4）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體爲人源化抗體，其中： （1）所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1) 如SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64所示的胺基酸序列； (c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3) 與（c1）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4) 如SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69或SEQ ID NO: 70所示的胺基酸序列； (c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6) 與（c4）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體爲人源化抗體，其中： （1）所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1) 如SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73所示的胺基酸序列； (c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3) 與（c1）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 20、21和22所示的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4) 如SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79所示的胺基酸序列； (c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6) 與（c4）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 23、24和25所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 45，SEQ ID NO: 45經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 45功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 45具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 49，SEQ ID NO: 49經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 49功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 49具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 4、5和6所示的的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 52經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 52功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 52具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 59，SEQ ID NO: 59經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 59功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 59具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 63，SEQ ID NO: 63經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 63功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 63具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 65，SEQ ID NO: 65經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 65功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 65具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 64，SEQ ID NO: 64經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 64功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 64具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 67功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 67具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 72經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 72功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 72具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 20、21和22所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 77具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 23、24和25所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 22，SEQ ID NO: 22經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 22功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 22具有至少85%序列同一性且所述HCDR1、HCDR2和HCDR3如SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 25，SEQ ID NO: 25經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 25功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 25具有至少85%序列同一性且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3如SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗B7-H3人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，所述輕鏈包含人源的κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，所述的鼠源抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或進一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，所述的抗B7-H3嵌合抗體或其抗原結合片段的抗體輕鏈進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。所述抗B7-H3嵌合抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、gG4或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1或IgG2重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後顯著降低ADCC (抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4恆定區。
在一些具體的實施方案中，本發明的抗B7-H3人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。在一些較佳的實施方案中，本發明的抗B7-H3人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1或IgG2或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，本發明提供抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗原結合片段爲Fab、Fv、sFv或F(ab)2。
本發明的另一方面提供一種分離的核酸，其編碼根據本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86所示；編碼輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 87所示。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區SEQ ID NO: 45的核苷酸序列如SEQ ID NO: 80所示；編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:49的核苷酸序列如SEQ ID NO: 81所示。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區SEQ ID NO: 52的核苷酸序列如SEQ ID NO: 82所示；編碼輕鏈可變區SEQ ID NO: 59的核苷酸序列如SEQ ID NO: 83所示。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區SEQ ID NO: 64的核苷酸序列如SEQ ID NO: 84所示；編碼輕鏈可變區SEQ ID NO: 67的核苷酸序列如SEQ ID NO: 85所示。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其中編碼重鏈可變區SEQ ID NO: 72的核苷酸序列如SEQ ID NO: 86所示；編碼輕鏈可變區SEQ ID NO: 77的核苷酸序列如SEQ ID NO: 87所示。
本發明的另一方面提供一種表現載體，其表現本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段。根據本發明的表現載體其包含本發明的分離的核酸分子。
本發明的另一方面提供一種如上所述的表現載體轉化的宿主細胞。
在一些實施方案中，根據本發明的宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。在一些實施方案中，所述宿主細胞爲細菌，較佳爲大腸桿菌。在另一個較佳的實施方案中，所述宿主細胞爲哺乳動物細胞。
本發明的另一方面提供製備本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段的方法，包括在所述宿主細胞中表現抗體以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
本發明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發明的抗B7-H3人源化抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。在一些實施方案中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明的抗B7-H3人源化抗體或其抗原結合片段，還包含其他活性組分，如其他抗體、標靶藥物等。在一些實施方案中，所述藥學可接受的載體選自抗氧化劑、多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、醣、螯合劑、醣醇、離子和界面活性劑。在一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體爲緩衝水溶液。在另一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體爲脂質體的形式。
可以將本發明的抗B7-H3人源化抗體或其抗原結合片段與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、腦內、眼內、氣管內、皮下、鼻內途徑。所述製劑可以透過任何途徑施用，例如透過輸注或推注，透過經上皮或皮膚黏膜(例如口腔黏膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。所述製劑可透過本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的另一方面提供抑制B7-H3活性的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物。
本發明的另一方面提供本發明的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備抑制B7-H3活性的藥物中的應用。在一些實施方案中，所述抑制B7-H3活性的藥物用於治療白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、子宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和/或黑色素瘤。在一些實施方案中，本發明提供上述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備抗腫瘤的藥物中的應用，較佳地，所述腫瘤選自白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、子宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和黑色素瘤。
本發明提供的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段具有更高的親和力和穩定性，抗腫瘤作用顯著，可明顯抑制腫瘤增長，人源化後的抗體免疫原性大大降低，有效消除人體免疫系統對外源性單抗的排斥反應，可在製備用於治療各類腫瘤疾病的藥物中應用，具有廣闊的市場前景。
定義 除非另有定義，本文中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。本文中所述的細胞和組織培養、分子生物學以及蛋白質和寡或多核苷酸化學及雜交中使用的命名和技術是本領域習知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養與轉化(如電穿孔、脂質轉染)，使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生産商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域習知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約冷泉港(1989))。本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥學化學中使用的命名以及實驗室方法和技術是本領域習知且普遍使用的。
在本發明中，術語「至少80%序列同一性」是指至少80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在本發明中，術語「至少85%序列同一性」是指至少85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%的序列同一性。在一些較佳的實施方案中，本發明所述的序列同一性可以至少爲90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以透過National Center For Biotechnology Instutute網站上的BLASTN/BLASTP演算法來進行。
在抗體分子中，輕鏈的三個高變區和重鏈的三個高變區在三維空間中以相對彼此的位置排列以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原的三維表面互補，且每條重鏈和輕鏈的三個高變區均被稱作「互補決定區」或「CDR」。胺基酸向每個結構域的分配是根據Kabat《免疫學感興趣的蛋白質的序列》(國立衛生研究院，馬裏蘭州貝塞斯達(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196: 901-917(1987)，Chothia等，Nature 342: 878-883(1989)定義。
本發明所述的「抗原結合片段」是指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段及與人B7-H3結合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱爲單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)。
本發明所述的抗體指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特異性結合抗原(與其免疫反應)的抗原結合位點的分子。「特異性結合」指抗體與抗原的一種或多種抗原決定簇反應而不與其他多肽反應或以很低的親和性(Kd＞10-6 )結合其他多肽。抗體包括但不限於多株、單株、嵌合、dAb(結構域抗體)、單鏈、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表現庫。單株抗體（mAb）是由單一的複製細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的複製細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術及合成技術如CDR grafting或其它現有技術進行重組得到。
本發明所述的「鼠源抗體」爲根據本領域知識和技能製備的對人B7-H3的單株抗體。製備時用B7-H3抗原注射試驗對象，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。
本發明所述的「嵌合抗體」是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以减輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中複製可變區基因，再根據需要複製人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。
本發明所述的「人源化抗體」也稱爲CDR移植抗體，是將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架（FR）中産生的抗體。此類可變區框架序列可以從公共的DNA資料庫或公開的參考文獻獲得，例如從ImMunoGeneTics （IMGT）網站http: //imgt.cines.fr得到或從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
下面代表性的實施例是爲了更好地說明本發明，而非用於限制本發明的保護範圍。以下實施例中未註明條件的實驗方法通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手册、分子複製手册等，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件進行。實施例中使用的材料、試劑如無特殊說明均爲商購獲得。
實施例1  抗原蛋白及陽性對照抗體的製備
1、抗原蛋白及陽性對照抗體的表現載體構建
（1）抗原蛋白的表現載體構建
合成編碼4Ig-B7-H3蛋白胞外區全長的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO: 88所示。合成編碼2Ig-B7-H3蛋白的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO: 89所示。將4Ig-B7-H3的全長DNA序列（SEQ ID NO: 90）複製到真核表現質體pTargeT上，獲得其表現質體pTargeT-4Ig-B7-H3。
將人4Ig-B7-H3蛋白胞外區胺基酸序列與hIgG1-Fc或his標籤的胺基酸序列進行融合，胺基酸序列設計如SEQ ID NO: 91和SEQ ID NO: 92所示。將人2Ig-B7-H3蛋白胞外區胺基酸序列與hIgG1-Fc或his標籤胺基酸序列進行融合，胺基酸序列設計如SEQ ID NO: 93和SEQ ID NO: 94所示。對上述胺基酸序列進行密碼子最佳化後合成帶有標籤的B7-H3蛋白胞外區基因片段4Ig-B7-H3-hFc、4Ig-B7-H3-his、2Ig-B7-H3-hFc、2Ig-B7-H3-his並將其分別複製至真核表現質體pHR中，分別獲得上述標籤蛋白的表現質體pHR-4Ig-B7-H3-hFc、pHR-4Ig-B7-H3-his、pHR-2Ig-B7-H3-hFc、pHR-2Ig-B7-H3-his。
（2）陽性對照抗體hBRCA84D的表現載體構建
使用專利申請WO2011/109400中公開的人源化抗體hBRCA84D作爲陽性對照抗體，hBRCA84D的胺基酸序列如下所示： hBRCA84D重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO: 95； hBRCA84D輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO: 96。
根據WO2011/109400公開的方法製備hBRCA84D。hBRCA84D爲人IgG1型單株抗體，與天然IgG1相比，其Fc段含有特定突變位點(K214R、L235V、F243L、R292P、Y300L、D356E、L358M、P396L)。對hBRCA84D人源化抗體的胺基酸序列進行密碼子人工最佳化，獲得陽性對照抗體hBRCA84D的重鏈及輕鏈全長DNA序列。將hBRCA84D重鏈全長DNA片段複製到pHR載體上，獲得真核表現質體pHR-hBRCA84D-8mIgG1。將hBRCA84D輕鏈全長DNA片段複製到pHR載體上，獲得真核表現質體pHR-hBRCA84D-hΚ。
(3) 鼠源陽性對照抗體BRCA84D的表現載體構建
將陽性對照抗體hBRCA84D的重鏈可變區序列複製至含鼠mG2a重鏈恆定區的真核表現質體pHR-mG2a上，獲得pHR-hBRCA84D-mG2a的真核表現質體。將陽性對照抗體hBRCA84D的輕鏈可變區序列複製至含鼠Κ輕鏈恆定區的真核表現質體pHR-mΚ上，獲得pHR-hBRCA84D-mΚ的真核表現質體。
2、抗原蛋白及陽性對照抗體的表現與純化
（1）表現抗原蛋白的穩定轉染細胞株構建
將真核表現質體pTargeT-B7-H3在160V電壓，15msec的方形脈衝下以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞（中國科學院上海細胞生物學研究所），置於37℃，5% CO2 濃度的培養箱中培養。24h後採用含1000 μg/ml G418（Gibco，#10131-027）的培養基進行加壓培養。轉染16天後採用流式細胞術檢測轉染pool的陽性率，將陽性率較高的pool的細胞進行鋪盤（按照1x106 個/ml的細胞密度，100 μl/孔，鋪96孔盤），採用hBRCA84D抗體和Goat pAb to Hu IgG (PE)(Abcam, ab98596)抗體與細胞孵育，以流式細胞儀（ACEABIO, Novocyte 2060R）檢測585nm波長下mean值，使用GraphPad生成進行數據分析。將陽性細胞株進行亞複製，挑選出複製化的CHO-K1細胞株，該細胞株高程度表現B7-H3分子，命名爲CHO-K1-B7-H3。
（2）標籤抗原蛋白及陽性對照抗體的表現
在1L細胞培養瓶中接種密度爲0.5 x 106 個細胞/ml的293E細胞，加入新鮮的預熱的FreeStyle 293表現培養基，使接種後總體積達到250 mL，置37℃，8% CO2 ，加濕的CO2 培養箱中培養過夜。取8.5 mL FreeStyle 293表現培養基，加入1 mg/ml的PEI溶液500 μl，混合均勻，取250 μg待轉染質體加入8.5 ml FreeStyle 293表現培養基中，混合均勻，其中標籤抗原蛋白質體pHR-4Ig-B7-H3-hFc、pHR-4Ig-B7-H3-his、pHR-2Ig-B7-H3-hFc、pHR-2Ig-B7-H3-his分別轉染；陽性對照抗體hBRCA84D重鏈質體pHR-hBRCA84D-8mIgG1和輕鏈質體pHR-hBRCA84D-hΚ共同轉染；鼠源陽性對照抗體BRCA84D重鏈質體pHR-hBRCA84D-mG2a和輕鏈質體pHR-hBRCA84D-mΚ共同轉染。將PEI與FreeStyle 293表現培養基的混合溶液加入到質體中，混合均勻，然後加入細胞培養物中，置37℃，8% CO2 ，加濕的CO2 培養箱中培養。在細胞轉染後第1天和第3天對細胞進行補料，每瓶加入2.5ml的穀胺醯胺（母液濃度爲200 mM）和5 ml的葡萄醣（母液濃度爲180 g/L）。當細胞活力降至65%~75%時，收集細胞上清液。將細胞培養物以1500 rpm離心5 min，收集上清液，再以8000 rpm離心20 min，收集上清液。
（3）親和層析柱純化
利用AKTA（GE，AKTA pure-150）根據蛋白性質採用不同的親和層析柱進行純化（不同蛋白適配的親和層析柱見表1），具體純化步驟如下：
表1 不同蛋白適配的親和層析柱
蛋白屬性 適配柱子 品牌 型號
鼠單抗(融合瘤)、鼠源陽性對照抗體 Protein G 預裝柱 博格隆 Ezfast Protein G 4FF
4Ig-B7-H3-his/ 2Ig-B7-H3-his NI柱預裝柱 GE His Trap, HP 5ml
4Ig-B7-H3-hFc/ 2Ig-B7-H3-hFc Protein A 預裝柱 GE Hi Trap, MabselectSuRe  5ml
嵌合抗體、人源化抗體 Protein A 自裝柱 GE Mabselect LX  18ml
清洗：超純水清洗設備及管路2 min，流速10 mL/min，後用0.1M NaOH清洗層析系統； 接柱：將層析柱接入層析設備，並用超純水沖洗5 min；後0.1M NaOH沖洗30 min，保留時間5 min； 平衡：20 mM PB+ 0.15 M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV（柱體積）； 上樣品：將細胞表現上清液上樣品，保留時間5 min； 後平衡：20 mM PB+ 0.15 M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV； 洗脫：50 mM醋酸，pH =3.4洗脫，保留時間5 min。UV280至50 mAu左右時開始收集，降至50 mAu左右時停止收集。用1 M Tris-HCl，pH 9.0將樣品pH調節至7.0； 再平衡：20 mM PB+ 0.15 M NaCl，pH 7.2 平衡3個CV，保留時間5 min； 在線清洗：0.1 M NaOH清洗30 min，保留時間5 min； 清洗保存：純化水清洗10 min，後20%乙醇2個CV。
實施例2  單株抗體的製備
1、融合瘤單複製的製備
（1）動物免疫
採用不同標籤的4Ig-B7-H3抗原和2Ig-B7-H3抗原蛋白與佐劑共同使實驗動物發生免疫反應，實驗動物包括SJL品系小鼠/Balb/c品系小鼠/SD大鼠。免疫動物按照首次免疫使用50 μg抗原使一隻動物發生免疫反應，後期均使用25 μg使一隻動物發生免疫反應。免疫佐劑可以是弗氏佐劑（Sigma）或Quick Antibody-Mouse5W（北京博奧龍免疫技術有限公司）。採用弗氏佐劑乳化抗原，將不同標籤的4Ig-B7-H3或者2Ig-B7-H3抗原蛋白樣品逐滴加入到佐劑溶液中，邊滴加邊渦旋以充分混合，佐劑使用劑量參考說明書進行。混合均勻形成油包水的乳狀後使小鼠發生免疫反應。採用Quick Antibody-Mouse5W作爲佐劑，將不同標籤的4Ig-B7-H3或者2Ig-B7-H3抗原蛋白樣品與Quick Antibody-Mouse5W按照1:1的體積比進行混合，混勻後即採用肌肉注射的方式，使SD大鼠發生免疫反應。
採用表現B7-H3的穩定轉染細胞系CHO-K1-B7-H3使SD大鼠和Balb/c小鼠發生免疫反應，使之産生抗B7-H3的抗體。用胰蛋白酶消化處理實施例1中獲得的CHO-K1-B7-H3細胞，然後按照1000 rpm離心5 min，丟棄細胞上清液，用PBS使細胞沉澱物重新懸浮，取樣用細胞計數器計數，剩餘細胞按照1000 rpm離心5 min，去除上清液，用PBS使細胞沉澱物重新懸浮，加入適量的PBS以獲得1x108 個細胞/ml的細胞懸浮液。實驗組小鼠每隻對1x107 個細胞發生免疫反應，實驗組SD大鼠每隻對2x107 個細胞發生免疫反應。
免疫方案如表2所示：
表2 動物免疫方案
組別 抗原 動物 佐劑 免疫途徑
1 PBS SJL/Balb/c/SD大鼠 無 s.c./i.m.
2 4Ig-B7-H3-his/4Ig-B7-H3-hFc SJL/Balb/c 弗氏佐劑 s.c./i.m.
3 2Ig-B7-H3-his/2Ig-B7-H3-hFc Balb/c 弗氏佐劑 s.c./i.m.
4 4Ig-B7-H3-his/4Ig-B7-H3-hFc SD大鼠 Quick Antibody-Mouse5W i.m.
5 CHO-K1-B7-H3 Balb/c/SD大鼠 無 i.p.
*i.m. 肌內注射；s.c.皮下注射；i.p. 腹腔注射。
（2）融合瘤融合
脾細胞的獲取和製備：將加强免疫後的小鼠/大鼠犧牲後浸泡75%的酒精中。解剖取出脾臟，用研磨棒研磨後，經細胞篩網過濾後製備成單細胞懸浮液。將脾細胞懸浮液以2000 rpm離心5 min，去除上清液。加入2 mL紅血球裂解液，室溫裂解紅血球2 min，加入PBS至20 mL，以1500  rpm離心7 min，去除上清液，重新懸浮後進行活細胞計數。收集培養瓶中的Sp2/0細胞，以1000 rpm離心5 min後去除上清液，重新懸浮後進行活細胞計數。按脾細胞：Sp2/0細胞=1:1的比例混合細胞，以1500 rpm離心7 min後去除上清液。用20 mL電轉緩衝液重新懸浮細胞，以1500 rpm 離心7 min。去除上清液，重複一次。分別用適量電轉緩衝液重新懸浮細胞，保證細胞濃度2×107 個細胞/mL左右。把細胞懸浮液加入9 mL 電轉融合槽中融合。融合後將細胞懸浮液轉入到含有20% FBS的15 mL RPMI 1640完全培養基中，室溫放置20 min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20％FBS的RPMI 1640培養基重新懸浮融合細胞。按100 μl/孔將細胞懸浮液加到若干塊96孔細胞培養盤中，保證每孔細胞量約爲4×104 個細胞/孔，置於37℃細胞培養箱中培養。5天後補加100 µL/孔RPMI 1640完全培養基(含20% FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。
（3）融合瘤及亞複製篩選
融合一周後，取融合瘤母株的細胞培養上清液，透過ELISA篩選結合4Ig-B7-H3-his蛋白和食蟹猴B7-H3蛋白的融合瘤母株。進一步透過流式細胞術篩選出能結合CHO-K1- B7-H3穩定轉染細胞株的母株。將篩選陽性的母株擴至24孔盤，選擇培養2天的母株培養上清液，與T細胞進行共培養，檢測培養上清液中IFN-γ的釋放量。具體實驗操作如下所述：
1. Day 1以1 μg/ml anti-CD3e（R&D）塗佈T25細胞培養瓶，4℃條件下孵育過夜，於實驗前去除液體，用PBS緩衝液洗3次，待用。
2. Day 2復甦CD8+T細胞（用CD3和CD28誘導擴增獲得，90% FBS + 10% DMSO凍存），採用IMDM+10% FBS+游離100 ng/ml SEB +4 ng/ml IL-2 +100x雙抗的培養基重新懸浮細胞，於步驟1塗佈的T25中培養，培養密度2-3×106 cells/ml，培養48 h。
3. Day 3按照1 μg/ml anti-CD3e和10 μg/ml 4Ig-B7-H3-his共同塗佈96孔盤，設置塗佈空白組，anti-CD3e組，anti-CD3e+B7-H3-4Ig-his組，4℃條件下過夜孵育。
4. Day 4 將融合瘤培養上清液按照100 μl/孔加至上一步的96孔盤中，對照孔加入100 μl融合瘤培養基，於37℃孵育30min。
5. 取出已經刺激2天的CD8+T，將細胞密度調整至1×106 cell/ml，按照100 μl/孔加入到96孔盤，培養48 h。
6. Day 6 培養基上清液中IFN-γ釋放的檢測，按照R&D的duset（DY285B）檢測試劑套組，檢測培養基上清液中IFN-γ。
透過Elisa和FACS篩選出具有結合能力的母株，進一步評估母株分泌的細胞上清液誘導細胞因子IFN-γ釋放的程度，篩選出能促進IFN-γ釋放的陽性母株。利用有限稀釋法將陽性母株進行亞複製，培養一周後利用ELISA檢測亞複製上清液與4Ig-B7-H3分子的結合活性，進而獲得分泌抗B7-H3抗體的單複製細胞株。
2、亞型的鑒定
參照鼠抗體亞型鑒定試劑套組SBA Clonotyping Systerm-C57BL/6-HRP（SouthernBiotech，貨號：5300-05B）說明書對抗體進行亞型鑒定，結果如表3所示：
表3  抗體亞型鑒定結果
命名 抗體亞型
SHS007-17 IgG/k
SHS007-39 IgG/k
SHS007-51 IgG/k
SHS007-65 IgG/k
3、單株抗體的製備
根據亞複製上清液活性分析結果確定單株抗體母株株17、39、51、65，將其擴大培養。培養條件是含有10%胎牛血清、1x NAEE、1x 丙酮酸鈉、1%青鏈黴素雙抗的1640培養基，待細胞匯合度大於＞80%時，進將細胞繼代擴大培養，待培養至約50 ml時收集上清液，純化抗體。獲得抗體經SDS-PAGE凝膠電泳確定純度良好。
4、單株抗體定序
將經亞複製操作的陽性融合瘤細胞進行擴大培養，取適量細胞按RNeasy Plus Mini Kit （Qiagen，74134）試劑套組說明書提取總RNA，利用Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit （Takara，6110A）反轉錄試劑套組合成cDNA第一條鏈。
根據小鼠抗體亞型可變區設計特異性引子（5’端含有用於與真核表現載體發生同源重組的同源臂序列），以cDNA爲模板進行抗體可變區基因的PCR擴增，從而分別獲得小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區的基因片段；設計引子（參考文獻：1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester et al. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35–55; 2. Simon KorenMihaKosmačAnjaColjaVenturinietal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071–1078），進行DNA定序獲得序列，定序結果見表4。
表4  抗B7-H3鼠源單株抗體序列表
抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
SHS007-17 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27
SHS007-39 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29
SHS007-51 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31
SHS007-59 SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO:34
SHS007-65 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36
SHS007-72 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38
SHS007-90 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40
SHS007-95 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42
SHS007-108 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:44
實施例3  嵌合抗體的構建
將表4定序獲得的小鼠抗體重鏈可變區基因片段複製至含有特定突變位點(K214R, L235V, F243L, R292P, Y300L, D356E, L358M, P396L)的重鏈恆定區的真核表現質體(pHR-8mIgG1)上，將表4定序獲得的小鼠抗體輕鏈可變區基因片段複製至含人輕鏈恆定區的真核表現質體(pHR-hΚ)上。分別將構建的抗體重輕鏈質體轉化大腸桿菌DH5α勝任細胞，將混合液均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA定序。將定序正確的陽性株接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37℃震盪培養12小時以上，然後收集菌體進行質體提取，從而獲得嵌合抗體輕鏈與重鏈的表現質體，使用核酸定量分析儀檢測質體的濃度與純度。
將嵌合抗體重輕鏈質體共轉染HEK293E細胞，表現純化獲得抗體，將嵌合抗體分別命名爲SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-CHI、SHS007-65-CHI，然後進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
利用定點突變的方法，將嵌合抗體SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-CHI、SHS007-65-CHI進行基因突變，以篩選更佳的抗體。SHS007-51-CHI輕鏈CDR第34位G突變爲K，抗體穩定性提高，標記爲SHS007-51-G34K-CHI。嵌合抗體定序結果見表5。
表5  抗B7-H3嵌合抗體序列表
嵌合抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
SHS007-17-CHI SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27
SHS007-39-CHI SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29
SHS007-51-CHI SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 31
SHS007-51-G34K-CHI SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32
SHS007-65-CHI SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36
實施例4  人源化抗體的構建及生産
根據嵌合抗體的免疫活性和殺傷活性分析，選擇SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-G34K-CHI、SHS007-65-CHI進行人源化抗體改造。
抗體的人源化改造，首先是透過與免疫基因資料庫（IMGT）中的小鼠抗體序列進行比對，確認SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-G34K-CHI、SHS007-65-CHI抗體可變區的鼠源種系，經過同源比對，SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-G34K-CHI、SHS007-65-CHI抗體的重鏈可變區序列的FR區分別與小鼠抗體種系基因（IGHV1-69*02、IGHV1-2*02、IGHV3-21*01、IGHV3-48*01）最爲相似；抗體輕鏈可變區的FR序列則分別與小鼠抗體（IGKV2-28*01、IGKV3-11*01、IGKV2-30*02、IGKV3-11*01）最爲相似。以SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-G34K-CHI、SHS007-65-CHI抗體框架區序列FR1-FR3作爲模板，在人框架區庫中尋找3D結構相似但是免疫原性較低的全人框架替代SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-G34K-CHI、SHS007-65-CHI的FR1-FR3序列，重鏈/輕鏈全長序列進行3D建模並和原抗體重鏈/輕鏈序列進行結構比對分析，綜合考慮抗原性和3D結構相似度，最終選擇SHS007-17-CHI的4條人源化重鏈可變區（參見SEQ ID NO: 45、46、47、48）和3條人源化輕鏈可變區（參見SEQ ID NO: 49、50、51）、SHS007-39-CHI的6條人源化重鏈可變區（參見SEQ ID NO: 52、53、54、55、56、57）和5條人源化輕鏈可變區（參見SEQ ID NO: 58、59、60、61、62）、SHS007-51-G34K-CHI的2條人源化重鏈可變區（參見SEQ ID NO: 63、64）和6條人源化輕鏈可變區（參見SEQ ID NO: 65、66、67、68、69、70）及SHS007-65-CHI的3條人源化重鏈可變區（參見SEQ ID NO: 71、72、73）和6條人源化輕鏈可變區（參見SEQ ID NO: 74、75、76、77、78、79）進行下一步最佳化。SHS007-17-CHI、SHS007-39-CHI、SHS007-51-G34K-CHI、SHS007-65-CHI的人源化抗體非CDR區序列均達到95%以上人源化。
將以上設計好的人源化抗體輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列反轉錄成相對應的核苷酸序列，並生成相鄰片段之間含有互補序列的寡核苷酸片段，透過Overlap PCR將寡核苷酸片段退火後連接起來，再利用特異性引子（5’端含有用於與真核表現載體發生同源重組的同源臂序列）擴增出完整的輕鏈與重鏈可變區核苷酸片段；將純化後的輕鏈可變區核苷酸片段與線性化的含有人Κ輕鏈恆定區的真核表現質體（pHR-hΚ）共轉化大腸桿菌DH5α勝任細胞，將純化後的重鏈可變區核苷酸片段與人IgG1重鏈恆定區的真核表現質體（pHR-IgG1）共轉化大腸桿菌DH5α勝任細胞，分別將轉化質體的勝任細胞均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恆溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA定序。
將定序正確的陽性株接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37℃震盪培養12小時以上，然後收集菌體進行質體提取，從而獲得人源化抗體輕鏈與重鏈表現質體，使用核酸定量分析儀檢測質體的濃度與純度。
將質體轉染HEK293E細胞，表現純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
挑選純度、活性和親和力均較好的人源化抗體，標記爲hu17-00、hu39-01、hu65-13、hu51-G34K-12，序列見表6。
表6  抗B7-H3人源化抗體序列表
人源化抗體 胺基酸序列 核苷酸序列
重鏈可變區 輕鏈可變區 重鏈可變區 輕鏈可變區
hu17-00 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 49 SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 81
hu39-01 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 83
hu51-G34K-12 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 85
hu65-13 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 87
實施例5  與人B7-H3結合活性測定（ELISA）
採用ELISA分析抗體的結合活性。將人4Ig-B7-H3-His蛋白或2Ig-B7-H3-His蛋白（1 μg/孔，實施例1、2中製得）塗佈到96孔ELISA 微量盤，於4℃條件下孵育過夜。用1xPBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶37℃封閉2 h。用1xPBST清洗3次後，本發明提供的抗B7-H3抗體作爲一抗從2 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入ELISA 微量盤，共8個濃度，濃度分別爲2000 ng/mL、400 ng/mL、80 ng/mL、16 ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL、0.128 ng/mL、0.0256 ng/mL，37℃孵育2 h，陽性對照抗體爲hBRCA84D；用1xPBST清洗5次後，二抗使用Anti-Human IgG HRP （Jackson，109-035-003，1:5000），37℃孵育1 h。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用ELISA 微量盤（thermo，Multiskan FC）讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖1、2所示。
實驗結果顯示，本發明提供的人源化抗B7-H3抗體hu51-G34K-12、hu65-13均具有與人4Ig-B7-H3、2Ig-B7-H3結合的能力，且結合能力與陽性對照抗體hBRCA84D相當。
實施例6  與食蟹猴B7-H3結合活性測定（ELISA）
採用protein based Elisa分析抗體的結合活性。食蟹猴B7-H3-His（0.5μg/孔，Sino Biological，Cat.No. 90806-C08H）塗佈96孔ELISA 微量盤。本發明提供的抗B7-H3抗體作爲一抗從2 μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入ELISA 微量盤，共8個濃度，濃度分別爲2000 ng/mL、400 ng/mL、80 ng/mL、16 ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL、0.128 ng/mL、0.0256 ng/mL，37℃孵育2 h，陽性對照抗體爲hBRCA84D。二抗使用Anti-Human IgG HRP （Jackson，109-035-003，1:10000），加入顯色液TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺），終止後利用ELISA 微量盤（thermo，Multiskan FC）讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如圖3所示。
實驗結果顯示，本發明提供的人源化抗B7-H3抗體hu51-G34K-12、hu65-13均具有與食蟹猴B7-H3結合的能力，且結合能力與陽性對照抗體hBRCA84D相當。
實施例7  與腫瘤細胞表面B7-H3結合的測定（FACS）
採用FACS分析抗體與腫瘤細胞表面B7-H3的結合活性。FACS檢測的平均熒光强度（MFI）和EC50表示抗體與細胞的結合活性。786-0、MDA-MB-231細胞消化後，用2%FBS-PBS的溶液重新懸浮，計數。raji-B7-H3細胞收集細胞後，用2% FBS-PBS的溶液重新懸浮，計數。將上述細胞按照每孔1x105 個細胞的方式鋪於細胞培養盤，本發明提供的抗B7-H3抗體作爲一抗從20 μg/ml開始，梯度稀釋加入細胞培養盤，共8個濃度，濃度分別爲20000 ng/mL、10000 ng/mL、2000 ng/mL、400 ng/mL、80 ng/mL、16 ng/mL、3.2 ng/mL、0.64 ng/mL，4℃條件下孵育1 h，陽性對照抗體爲hBRCA84D；二抗使用PE-Anti-Human IgG （Biolegend，Cat.No. 409303，1.25μl/孔），洗滌後使用流式細胞儀檢測抗體與細胞表面結合産生的熒光强度。使用GraphPad計算EC50，結果如表7a和7b所示。
表7a  與腫瘤細胞表面B7-H3結合的測定
腫瘤細胞類型 平均熒光强度（MFI）
hBRCA84D hu65-13 hu51-G34K-12
786-0 2.33E+05 5.66E+05 5.84E+05
MDA-MB-231 3.58E+04 1.51E+05 1.56E+05
Raji-B7-H3 2.33E+05 5.66E+05 5.84E+05
表7b  與腫瘤細胞表面B7-H3結合的測定
腫瘤類型 EC50 （μg/ml）
hBRCA84D hu65-13 hu51-G34K-12
786-0 0.2256 0.2658 0.1199
MDA-MB-231 0.3844 0.1403 0.0501
Raji-B7-H3 0.2256 0.2658 0.1199
實驗結果顯示，本發明提供的人源化抗B7-H3抗體hu51-G34K-12、hu65-13均可與腫瘤細胞表面B7-H3結合，與腫瘤細胞的結合密度顯著高於對照抗體hBRCA84D，結合EC50和Emax均明顯優於對照抗體hBRCA84D。
實施例8  固定抗體法Biacore親和力測定
利用Biacore對實施例4中製得的人源化抗B7-H3抗體進行親和力測定。先將抗原4Ig-B7-H3-His耦聯至CM5晶片（GE，Cat.No. BR100012）表面，並用乙醇胺封閉未耦聯蛋白的活性基團。待基線平穩後，分別將hu39-01、hu65-13、hBRCA84D抗體進行等比梯度稀釋，稀釋後的各濃度抗體蛋白按順序放置於儀器的進樣盤上，設置程序分別進樣品。按Biacore X100的操作規程進行hu51-G34K-12、hu65-13、hBRCA84D抗體與4Ig-B7-H3-His抗原親和力測定，具體參數及實驗結果如表8所示。
表8與人B7-H3蛋白的親和力測定
抗體 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
hu51-G34K-12 4.90E-10 7.85E+05 3.85E-04
hu65-13 1.98E-10 9.54E+04 1.89E-05
hBRCA84D 4.55E-10 2.43E+05 1.11E-04
實驗結果顯示，hu51-G34K-12和hu65-13與人4Ig-B7-H3蛋白結合具有良好的親和力，且親和力數值與陽性對照抗體hBRCA84D相當。
實施例9  IFN-γ釋放檢測B7-H3鼠單抗、人源化抗體的阻斷活性
採用Ficoll（GE Healthcare, Cat.No.10268731）分離得到人外周血單個核細胞（PBMC），將分離獲得的PBMC用含10%FBS的IMDM（Life technologies，12440053）完全培養基重新懸浮，調整密度爲1*106 cell/mL。按照100 μL/孔將PBMC細胞加入到96孔盤中，靜置30 min。將待檢測抗體、Isotype 抗體用相同培養基配製爲終濃度20 μg/ml，加入到96孔盤，於37℃恆溫培養箱中培養1 h。用培養基配製終濃度爲100 ng/ml 的SEB（Toxin techonology，BT202）溶液，加入96孔盤對應孔中。上述96孔盤於恆溫培養箱中共培養72 h後，按照DuoSet檢測試劑套組（R&D，DY285B）說明書檢測上述培養上清液中的IFN-γ濃度，如圖4、5結果顯示抗人B7-H3鼠單抗SHS007-39、51、59、65、72等，在donor B和donor C來源的PBMC-SEB體系中，均能增加該體系中細胞因子IFN-γ的釋放。圖6、7結果顯示抗人B7-H3人源化抗體hu51、hu65增强PBMC-SEB實驗體系中IFN-γ的釋放。
實施例10  抗體依賴細胞介導的細胞毒ADCC實驗（LDH法）
人腎癌細胞786-0高表現人B7-H3，將786-0細胞按照20000個細胞每孔鋪於96孔盤。用熱滅活的胎牛血清（FBS，Gibco，Cat.No.10091-148）配置含2% FBS的RPMI-1640培養基。將SHS007-17CHI、SHS007-39CHI、SHS007-51CHI、SHS007-65CHI、hBRCA84D抗體10倍梯度稀釋溶於上述培養基，於37℃恆溫培養箱孵育1 h。按照Ficoll（GE Healthcare, Cat.No.10268731）試劑套組說明，提取人外周血PBMC作爲作用細胞，將PBMC細胞和上述抗體溶液加入到鋪有786-0細胞的96孔細胞培養盤。將細胞培養盤在37℃培養箱內培養4 h，按照Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST®（同仁化學，CK12）說明書，檢測細胞毒性。計算本發明抗體殺傷EC50降低倍數（即陽性對照hBRCA84D的EC50值與本發明提供抗體EC50值的比值），實驗結果如表9所示。
表9 嵌合抗體ADCC殺傷活性測定
抗體 EC50 比值
hBRCA84D 1
SHS007-17CHI 20.1
SHS007-39-CHI 211.5
SHS007-51-CHI 6.6
SHS007-59-CHI 4.4
SHS007-65-CHI 18.6
SHS007-72-CHI 7.1
SHS007-95-CHI 11.4
實驗結果顯示，與陽性對照hBRCA84D抗體相比，本發明提供的抗體具有更優異的殺傷EC50值，大大提高了ADCC殺傷活性。
實施例11  人源腫瘤細胞小鼠移植瘤模型的抗腫瘤試驗
1、實驗材料 （1）實驗細胞及動物 人惡性膠質瘤U87細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）； 人腎癌細胞786-0細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）； 人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）； SCID-Beige小鼠，雌性，6-8周齡，體重18-20克，購自上海靈暢實驗動物有限公司； （2）供試品及對照品 陰性對照品Isotype IgG1（貨號C0001-4）購自中美冠科生物技術有限公司。在小鼠移植瘤模型中hBRCA84D-IgG1效果遠優於hBRCA84D，故使用hBRCA84D-IgG1作爲陽性對照品。hBRCA84D-IgG1爲利用對標抗體hBRCA84D可變區序列構建的人IgG1形式單株抗體，恆定區與本發明的人IgG1嵌合抗體相同。
試驗前，將本發明的抗B7-H3嵌合抗體（SHS007-39-IgG1、SHS007-65-IgG1）用PBS配製爲1 mg/mL，Isotype IgG1和hBRCA84D-IgG1配製爲1 mg/mL。
2、實驗方法
（1）U87移植瘤模型
將人腫瘤細胞U87細胞接種於小鼠的右後邊，接種細胞數目爲5×106 /隻。待腫瘤生長至平均體積達140 mm3 時開始分組，尾靜脈給藥每周2次，每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式爲：V= 0.5a×b2 ，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。記錄連續給藥24天測量的腫瘤體積，用GraphPad Prism繪製瘤體積生長曲線，結果如表10所示。
表10 人惡性膠質瘤U87移植瘤模型抗腫瘤試驗結果
抗體 劑量( mg/kg) T/C (%)
Isotype IgG1 10 100
hBRCA84D-IgG1 10 56.9
SHS007-39-CHI 10 41.3
（2）786-0移植瘤模型
將人腫瘤細胞786-0細胞接種於小鼠的右後邊，接種細胞數目爲1×107 /隻。接種2周後，用無菌手術器械將786-O細胞接種長成的瘤塊取下，在生理鹽水中將生長旺盛期的瘤組織切成30 mm3 左右，在無菌條件下，接種於小鼠右後背。待腫瘤生長至平均體積達160 mm3 時開始分組，尾靜脈給藥每周2次，每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式爲：V= 0.5a×b2 ，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。記錄連續給藥19天測量的腫瘤體積，用GraphPad Prism繪製瘤體積生長曲線，結果如表11所示。
表11人腎癌細胞786-0移植瘤模型抗腫瘤試驗結果
抗體 劑量( mg/kg) T/C (%)
Isotype IgG1 10 100
hBRCA84D-IgG1 10 69.78
SHS007-39-CHI 10 63.93
SHS007-65-CHI 10 52.94
（3）MDA-MB-231移植瘤模型
將人腫瘤細胞MDA-MB-231細胞接種於小鼠的右後邊，接種細胞數目爲8×106 /隻。接種2周後，用無菌手術器械將MDA-MB-231細胞接種長成的瘤塊取下，在生理鹽水中將生長旺盛期的瘤組織切成30 mm3 左右，在無菌條件下，接種於小鼠右後背。待腫瘤生長至平均體積達150 mm3 時開始分組，尾靜脈給藥每周2次，每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式爲：V= 0.5a×b2 ，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。記錄連續給藥21天測量的腫瘤體積，用GraphPad Prism繪製瘤體積生長曲線，結果如表12所示。
表12 人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231移植瘤模型抗腫瘤試驗結果
抗體 劑量( mg/kg) T/C (%)
Isotype IgG1 10 100
hBRCA84D-IgG1 10 86.33
SHS007-39-CHI 10 62.84
SHS007-65-CHI 10 54.26
實驗結果顯示，本發明提供的抗體在人惡性膠質瘤U87細胞、人腎癌細胞786-0細胞、人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231接種的SCID-Beige小鼠移植瘤模型中具有抑制腫瘤生長的作用。抗體SHS007-39-CHI和SHS007-65-IgG1的抑瘤作用優於對照抗體hBRCA84D-IgG1。本發明提供的抗B7-H3抗體具有更加顯著的抑制腫瘤生長的作用。
實施例12  人源腫瘤細胞小鼠移植瘤模型的抗腫瘤試驗
1、實驗材料 （1）實驗細胞及動物 人腎癌細胞786-0細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）； 人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞購自美國典型培養物保藏中心（ATCC）； SCID-Beige小鼠，雌性，6-8周齡，體重18-20克，購自上海靈暢實驗動物有限公司； （2）供試品及對照品 對照品Isotype IgG1（貨號C0001-4）購自中美冠科生物技術有限公司，用來作為陰性對照品；對照品hBRCA84D-IgG1爲利用對標抗體hBRCA84D可變區序列構建的人IgG1形式單株抗體，恆定區與本發明的人源化抗體相同，用來作為陽性對照品； 試驗前，將本發明的人源化抗B7-H3抗體hu65-13、hu51-G34K-12分別用PBS配製爲1 mg/mL或者2 mg/ml，Isotype IgG1和hBRCA84D-IgG1配製爲1 mg/mL或者2 mg/ml。
2、實驗方法
（1）786-0移植瘤模型
將人腫瘤細胞786-0細胞接種於小鼠的右後邊，接種細胞數目爲1×107 /隻。接種2周後，用無菌手術器械將786-O細胞接種長成的瘤塊取下，在生理鹽水中將生長旺盛期的瘤組織切成15 mm3 左右，在無菌條件下，接種於小鼠右後背。待腫瘤生長至平均體積達100 mm3 時開始分組，尾靜脈給藥每周2次，給藥至第21天，給藥頻率降低爲一周給藥一次。每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式爲：V= 0.5a×b2 ，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。記錄連續給藥36天測量的腫瘤體積，用GraphPad Prism繪製瘤體積生長曲線，結果如表13所示。
表13人腎癌細胞786-0移植瘤模型抗腫瘤試驗結果
抗體 劑量( mg/kg) T/C (%)
Isotype 10 100
hBRCA84D-IgG1 10 85.4
hu51-G34K-12 10 52.0
hu65-13 10 60.8
2）MDA-MB-231移植瘤模型
將人腫瘤細胞MDA-MB-231細胞接種於小鼠的右後邊，接種細胞數目爲8×106 /隻。接種2周後，用無菌手術器械將MDA-MB-231細胞接種長成的瘤塊取下，在生理鹽水中將生長旺盛期的瘤組織切成30 mm3 左右，在無菌條件下，接種於小鼠右後背。待腫瘤生長至平均體積達100 mm3 時開始分組，尾靜脈給藥每周2次，每周兩次用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，腫瘤體積的計算公式爲：V= 0.5a×b2 ，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。記錄連續給藥25天測量的腫瘤體積，用GraphPad Prism繪製瘤體積生長曲線，結果如表14所示。
表14人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231移植瘤模型抗腫瘤試驗結果
抗體 劑量( mg/kg) T/C (%)
Isotype IgG1 10 100
hBRCA84D-IgG1 20 59.38
hu65-13 10 52.55
實驗結果顯示，本發明提供的人源化抗體hu51-G34K-12和hu65-13在人腎癌細胞786-0細胞、人三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231接種的SCID-Beige小鼠移植瘤模型中具有抑制腫瘤生長的作用。hu51-G34K-12和hu65-13的抑瘤作用優於對照抗體hBRCA84D-IgG1。本發明提供的抗B7-H3抗體具有更加顯著的抑制腫瘤生長的作用。
以上實施例證明本發明提供的抗B7-H3抗體具有顯著的抗腫瘤作用，可明顯抑制腫瘤增長，提示該抗體可在製備抗腫瘤藥物中的應用，具有可預期的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的權利範圍並不限於上文所作的詳細描述，而應歸屬於申請專利範圍。
無
圖1是抗B7-H3人源化抗體與人4Ig-B7-H3結合活性測定（ELISA）結果，橫坐標爲抗體濃度ng/ml，縱坐標爲OD450值。 圖2是抗B7-H3人源化抗體與人2Ig-B7-H3結合活性測定（ELISA）結果，橫坐標爲抗體濃度ng/ml，縱坐標爲OD450值。 圖3是抗B7-H3人源化抗體與猴B7-H3結合活性測定（ELISA）結果，橫坐標爲抗體濃度ng/ml，縱坐標爲OD450值。 圖4是抗人B7-H3鼠單抗在SEB刺激的PBMC體系中IFNγ釋放程度檢測結果， PBMC來自donor B。橫坐標爲不同抗體，縱坐標爲IFNγ釋放量（pg/ml）。 圖5是抗人B7-H3鼠單抗在SEB刺激的PBMC體系中IFNγ釋放程度檢測結果，PBMC來自donor C。橫坐標爲不同抗體，縱坐標爲IFNγ釋放量（pg/ml）。 圖6是抗B7-H3人源化抗體hu65在SEB刺激的PBMC體系中IFNγ釋放程度檢測結果。橫坐標爲不同抗體，縱坐標爲IFNγ釋放量（pg/ml）。 圖7是抗B7-H3人源化抗體hu51-G34K在SEB刺激的PBMC體系中IFNγ釋放程度檢測結果。橫坐標爲不同抗體，縱坐標爲IFNγ釋放量（pg/ml）。
無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Claims (16)

  1. 一種抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： （1）所述重鏈可變區包含選自如下群組的HCDR1、HCDR2和HCDR3： （a1） 如SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列； （a2） 如SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列； （a3） 如SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列； （a4） 如SEQ ID NO: 20、21和22所示的胺基酸序列；和 （a5） 與（a1）、（a2）、（a3）或（a4）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR；和 （2）所述輕鏈可變區包含選自如下群組的LCDR1、LCDR2和LCDR3： （a6）如SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列； （a7）如SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列； （a8）如SEQ ID NO: 16、18和19所示的胺基酸序列； （a9）如SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列； （a10）如SEQ ID NO: 23、24和25所示的胺基酸序列；和 （a11）與（a6）、（a7）、（a8）、（a9）或（a10）所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR。
  2. 如請求項1所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其具有： 所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 1、2和3或與SEQ ID NO: 1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 4、5和6或與SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區； 所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 7、8和9或與SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 10、11和12或與SEQ ID NO: 10、11和12所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區； 所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 13、14和15或與SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 16、18和19或與SEQ ID NO: 16、18和19所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區； 所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 13、14和15或與SEQ ID NO: 13、14和15所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 17、18和19或與SEQ ID NO: 17、18和19所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區；或 所述HCDR1、HCDR2和HCDR3分別爲SEQ ID NO: 20、21和22或與SEQ ID NO: 20、21和22所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的重鏈可變區，和所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分別爲SEQ ID NO: 23、24和25或與SEQ ID NO: 23、24和25所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的CDR的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是鼠源單株抗體、人鼠嵌合抗體或人源化抗體。
  4. 如請求項1-3中之任一項所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中： (1) 所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (b1) 如SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 35所示的胺基酸序列； (b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（b1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b3) 與（b1）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (b4) 如SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 36所示的胺基酸序列； (b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（b4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b6) 與（b4）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
  5. 如請求項4所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體還含有鼠源的IgG1、IgG2或其變體的重鏈恆定區，鼠源的k鏈或其變體的輕鏈恆定區。
  6. 如請求項1-3中之任一項所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO: 26經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 26功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 26具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 27，SEQ ID NO: 27經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 27功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 27具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 28，SEQ ID NO: 28經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 28功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 28具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO: 29經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 29功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 29具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 30，SEQ ID NO: 30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 30具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 31，SEQ ID NO: 31經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 31功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 31具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 30，SEQ ID NO: 30經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 30功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 30具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 32，SEQ ID NO: 32經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 32功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 32具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 35，SEQ ID NO: 35經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 35功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 36，SEQ ID NO: 36經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 36功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 36具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  7. 如請求項1-3中之任一項所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體爲人源化抗體，其中： （1）所述重鏈可變區的胺基酸序列選自： (c1) 如SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73所示的胺基酸序列； (c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c1）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c3) 與（c1）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (c4) 如SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78或SEQ ID NO: 79所示的胺基酸序列； (c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與（c4）所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (c6) 與（c4）所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
  8. 如請求項7所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 45，SEQ ID NO: 45經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 45功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 45具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 49，SEQ ID NO: 49經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 49功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 49具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 52，SEQ ID NO: 52經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 52功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 52具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 59，SEQ ID NO: 59經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 59功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 59具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 63，SEQ ID NO: 63經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 63功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 63具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 65，SEQ ID NO: 65經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 65功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 65具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 64，SEQ ID NO: 64經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 64功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 64具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 67，SEQ ID NO: 67經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 67功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 67具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或 所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 72經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 72功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 72具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO: 77，SEQ ID NO: 77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO: 77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 77具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  9. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-8中之任一項所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段。
  10. 如請求項9所述的核酸，其中： (1) 編碼所述重鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 84或SEQ ID NO: 86所示； (2) 編碼所述輕鏈可變區胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85或SEQ ID NO: 87所示。
  11. 一種表現載體，其包含如請求項9或10所述的核酸。
  12. 一種宿主細胞，其轉化如請求項11所述的表現載體，所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，優先爲哺乳動物細胞。
  13. 一種製備如請求項1-8中之任一項所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段的方法，包括在如請求項12所述的宿主細胞中表現抗體，以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
  14. 一種藥物組合物，其包含如請求項1-8中之任一項所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。
  15. 一種如請求項1-8中之任一項所述的抗B7-H3抗體或其抗原結合片段或如請求項14的藥物組合物在製備用於抑制B7-H3活性的藥物中的應用。
  16. 一種如請求項15所述的應用，所述抑制B7-H3活性的藥物用於治療乳腺癌、腎癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤、白血病、淋巴瘤和/或黑色素瘤。
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