SE442820B - Gel av tverbunden hyaluronsyra for anvendning som glaskroppssubstitut - Google Patents

Description

8403090-7 Det ideala glaskroppssubstitutet måste vara höggradigt transparent och ha ungefär samma brytningsindex som glas- kroppen. Det ska vara icke-toxiskt, icke-inflammatoriskt samt icke-immunogent. Det ska vidare vara lätt att appli- cera, t ex genom injektion genom en smal sprutspets utan att egenskaperna försämras vid denna process, samt eventuellt ha en kontrollerbar svällande förmåga. För att under en lång tid kunna fungera som en support bör den utgöras av en svårnedbrytbar substans, företrädesvis i gelform. Sekundära reaktioner med celltíllväxt'och åtföljande membranbildning och traktion på näthinnan är en vanlig komplikation vid näthinneavlossning. Av vikt är därför att det substitut som införes ej fungerar som ett substrat för celltillväxt.

Ovan nämnda, tidigare beskrivna, glaskroppssubstitut upp- visar allvarliga brister i ett eller flera avseenden. Så har t ex silikonolja visat sig effektiv vid fästning av nät- hinnan men biverkningsfrekvensen är mycket hög med katarakt- bildning, glaukom och toxiska effekter på ögats vävnader. Av gaserna har framför allt luft använts under många år men denna liksom andra lågmolekylära ämnen som har testats uppvisar emellertid den nackdelen att de försvinner alltför snabbt och kommer därför ej att fixera näthinnan under en för läkning tillräckligt lång tid. Hyaluronsyra är en substans som normalt finns i ögat och injektion av detta ämne leder därför ej till nâgra toxikologiska eller immuno- logiska reaktioner. Trots att hyaluronsyran är en högmole- kylär substans med hög viskositet är dock dess tamponerande effekt ej tillräckligt varaktig för behandling av svårare fall av näthinneavlossning på grund av att substansen löser sig i kammarvattnet och transporteras bort; _ Vi har nu funnit att en gel av tvärbunden hyaluronsyra har egenskaper som mycket nära överensstämmer med dem som angivits som kännetecknande för ett idealt glaskropps- substitut. v-urwfl'» Kf: . ' -'_ 8403090-7 Föreliggande uppfinning avser därför en gel av tvärbunden hyaluronsyra för användning som glaskroppssubstitut samt ett förfarande för framställning av en sådan gel. Gelen enligt uppfinningen användes vid näthinneoperationer och efter vitrektomiingrepp, varvid en steril och pyrogenfri gel av tvärbunden hyaluronsyra införes i det utrymme som begränsas av näthinnan baktill samt strålkroppen och linsen framtill, så att detta ämne tillsammans med ev kvarvarande delar av glaskroppen uppfyller nämnda utrymme. I ögon där linsen av- lägsnats, s k afaka ögon, begränsas utrymmet framtill i stället av hornhinnan. Gelen användes vidare vid behandling av näthinneavlossning varvid en steril och pyrogenfri gel av tvärbunden hyaluronsyra införes i det utrymme som begränsas av näthinnan baktill samt strålkroppen och linsen framtill så att det tryck som gelen tillsammans med kvarvarande delar av glaskroppen utövar på receptorskiktet medför att detta bringas i kontakt med pigmentepitelskíktet under en för läkning tillräckligt lång tidsperiod.

Geler av tvärbunden hyaluronsyra för gelfiltrering har beskrivits av Laurent et al (Acta Chemica Scandinavica 18 (1964) 274 - 275). Schmut et al (Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 218 (1982) 311 - 314) anger att man för första gången lyckats framställa stabila geler från hyaluronat- lösningar vid fysiologiskt pH men att hyaluronsyra-Cu(2+)- gelerna ej är lämpliga för användning vid oftalmologiska applikationer bland annat beroende på kopparjonens toxicitet.

Hyaluronsyra är en i animal och human vävnad naturligt förekommande högviskös glukosaminoglykan med en molekylvikt som vanligen ligger i intervallet 20,000 till 8,000,000 beroende på källa och reningsmetod. Hyaluronsyrans molekyl- vikt är emellertid ej kritisk för utövande av uppfinningen då koncentrationer, val av tvärbindare samt tvärbindnings~ grad fackmannamässigt lätt anpassas till utgángsmaterialets molekylvikt. Om hyaluronsyran har låg molekylvikt tillsättes QUALITY 84Û3090~7 exempelvis en högre koncentration av denna och av tvär- bindaren jämfört med det fall utgångsmaterialet är hög- molekylärt. I en föredragen utföringsform väljes en relativt högmolekylär hyaluronsyra med en molekylvikt i intervallet 500,000 till 3,000,000. Av vikt är att hyaluronsyran renats från komponenter som kan förorsaka toxikologiska eller immunologiska reaktioner. Med fördel användes en sådan höggradigt renad produkt som beskrivs t ex i US 4,14l,973.

Tvärbindningen enligt föreliggande uppfinning genomföres med kända bi- eller polyfunktionella tvärbindningsreagens som ger stabila bindningar, t ex eter- eller amidbindningar. Det stora urvalet av beskrivna och kommersiellt tillgängliga reagens för tvärbindníng av hydroxylgrupphaltiga ämnen som t ex polysackarider är välkänt för fackmannen. Företrädesvis användes bi- eller polyfunktionella epoxider, t ex lägre alifatiska sådana, eller deras korresponderande halohydriner eller epihalohydriner eller halider som tvärbindare, efter- som dessa bildar eterbindningar till hyaluronsyramolekylerna.

Som exempel kan nämnas epiklorhydrin, divinylsulfon, l,4-butandioldiglycideter, l,2-etylendioldiglycideter, 1-(2,3-epoxypropyl)-2,3-epoxycyklohexan, N,N-diglycidanilin (Leuktherm X50 Bayer) och epoxysubstituerad pentaérythritol (Shell 162). Som tvärbindningsreagens kan även användas reaktiva polymerar som t ex dextran eller stärkelse vilka reagerats för att innehålla exempelvis glycidyletergrupper.

Produkter lämpliga för användning enligt uppfinningen erhålles genom att tvärbindningsreaktionen genomföres med en mängd tvärbindare i ett molärt förhållande av omkring 0.03 till 4.0 per disackaridrepeterande enhet i hyalurcnsyra- molekylen.

Hyaluronsyran eller ett salt av denna, t ex natriumsaltet, löses och reageras med tvärbindningsmedlet i alkalisk miljö under en för reaktionen lämplig tid, vanligen ett par timmar, eventuellt vid förhöjd temperatur, ca 50 OC. Gelen av tvärbunden hyaluronsyra kommer att innehålla en viss _,*- ÖUAmTr Äs QÖ-sx; 8403090-7 mängd oreagerad tvärbindare och det är därför av stor vikt att gelen tvättas mycket noggrant, t ex genom kokning i fosfatbuffrad fysiologisk saltlösning.

Vätskehalten i den svällda gelen är mycket hög och hyaluron- syragelerna är helt homogena och transparenta med ett brytningsindex som väl överensstämmer med den naturliga glaskroppens. Gelernas höga genomsiktlighet tillåter under- sökningar med spaltlampa och användade av fotokoagulerings- teknik för näthinnefixering. En lämplig komposition för applicering utgöres av en i en fosfatbuffrad fysiologisk saltlösning helt eller delvis svälld gel med en koncentra- tion motsvarande en torrhalt i intervallet 0.1-50 vikts- procent. Gelerna kan därvid användas antingen hela eller i krossad form. En finfördelad gel med en torrhalt i inter- vallet 0.1 till 2.5 viktsprocent, företrädesvis 0.2-1.5 viktsprocent, kan lätt injiceras genom en 0.9 mm sprutspets och den fyller det utrymme vari den insprutas till en klar optiskt homogen massa. En krympt hel gelkula med en torrvikt in intervallet 10-50 viktsprocent, företrädesvis 12-25 viktsprocent, kan genom ett operativt ingrepp införas i glaskroppsutrymmet. Kulan uppfyller sedan genom kontrollerad svällning och sin formbarhet tillgängligt utrymme, vilket innebär att den ska svälla upp till ca 20 mm diameter i det fall en fullständig vitrektomi utförts. Krympningen av gelkulan till den för införandet i ögat lämpliga dimen- sionen, dvs en diameter vanligen mindre än 6 mm kan ske t ex genom torkning i en gasström.

Kompositioner innehållande gel av tvärbunden hyaluronsyra kan naturligtvis framställas pà ett stort antal sätt genom att gelen blandas med komponenter som ej ger oönskade reaktioner av ovan nämnt slag. Sá är det t ex uppenbart att kompositionen kan innehålla, förutom hyaluronsyragelen, även andra polysackarider som t ex dextran och med hyaluronsyran närbesläktade föreningar av typ chondroitinsulfat. Kompo- nenter av detta slag kan även ingå vid tvärbindningsreak- tionen. 8405090-7 Gelerna är värmestabila och kan genom tvättning och värme- behandling helt befrias från spår av tvärbindningsreagens samt steriliseras genom autoklavering.

Uppfinningen kommer i det följande att belysas med några icke begränsande exempel.

EXEMPEL Framställning av hyaluronsyrageler Exempel 1 400 mg natriumhyaluronat (Mw ca 3 k 106) löstes i 3 ml 1 % natriumhydroxid i ett plaströr. Efter ca en halv timme tillsattes_25 ul l,4-butandioldiglycideter (BDDE). Röret centrifugerades så att en homogen lösning erhölls. Röret värmdes till 50 OC under två timmar och fick därefter stå vid rumstemperatur över natt. Den bildade gelen skars i mindre bitar och tvättades grundligt med dest vatten, med tillsats av ättika, i ett dygn. Efter ytterligare tvättning genom kokning i fostfatbuffrad fysiologisk saltlösning (o,276 g uaznPolrznzo; 0,03% g Nanzpoynzo; 8,476 g Nacl per 1 000 ml pH 7,3) i'8 timmar fick gelen rinna av och finfördelades till önskad grovlek och fylldes på injektionssprutor som autoklaverades.

Gelen hade en torrhalt (% av svälld gel i buffert) av 0,37 %.

Epoxidhalt (BDDE std) <1 ppm, bestämdes på hyaluronidasned- bruten gel som reagerats med nikotinamid enligt Nelis och Sinsheimer, Anal Biochem 115 (1981) 151-157. V Brytningsindex i fosfatbuffrad fysiologisk koksaltlösning l,3350.

POOR QUALITY 8403090-7 Exempel_§ Gelen framställdes som exempel l men med 40 ul BDDE. Den därvid erhållna gelen hade en torrhalt (% av svälld gel i buffert) av 0,66 %.

Epoxidhalt (BDDE std) <1 ppm.

Brytningsindex i fosfatbuffrad fysiologisk koksaltlösning l,3352.

Som tidigare nämnts kan geler av hyaluronsyra tillverkas med varierande mängder av tvärbindningsreagens, hyaluronat och hydroxid. Andra reaktionsparametrar såsom t ex tid och temperatur kan likaledes varieras så att gynnsamma beting- elser för gelbildning uppstår.

Reaktionen i Exempel l upprepades i en försöksserie där temperatur, tid, hyaluronatkoncentration, hydroxidkoncen- tration resp mängd BDDE varierades medan övriga parametrar hölls konstanta.

Temperatur Tid 25 OC ej gel 15 min ej gel 50 OC gel 2 tim gel 75 °C ej gel 4 tim gel 100 °C ej gel 9 tim gel Hyaluronatkoncentration Hydroxidkoncentration 2,5 % ej gel 0,1 % ej gel 5 % ej gel l % gel 13,3 % 7 gel 3 % ej gel 20 % gel I 6 % ej gel POÖR QUALITY '_ .l - -f- 8403090-7 Mängd BDDE 5 /ul ej gel 10 /ul ej gel 50 /ul gel 100 /ul gel 500 /ul gel Dessa värden ger en uppfattning om lämpliga reaktions- betingelser men det är naturligtvis uppenbart för fackmannen hur man genom att ändra flera parametrar i kombination kan uppnå gynnsamma betingelser för gelbidning.

Exempel 3 400 mg làgmolekylärt natrumhyaluronat (Mw ca 20 000) löstes i 1 ml 1,3 % natriumhydroxid varefter 300 ul BDDE tillsattes.

Efter reaktion under 2 timmar vid 50 OC tvättades gelen som ovan. I detta fall erhölls en gel med torrhalten.1,2 %.

Exempel 4 800 mg natriumhyaluronat (Mw ca 1 x 106) löstes i 3 ml 1 % natriumhydroxid. 50 ul BDDE tillsattes och efter reaktion under 2 timmar vid 50 OC tvättades produkten enligt ovan. En lös gel med torrhalten 0,23 % erhölls.

Exempel 5 400 mg natriumhyaluronat (Mw ca 3 x 106) löstes i 3 ml 1,3 % natriumhydroxid varefter 70 ul epiklorhydrin tillsattes.

Reaktion vid 50 OC under 2 timmar varefter produkten tvättades enligt ovan. Reaktionen gav en gel med torrhalten 0,9 %. ' POOR 'QUALITY 8403Û9Û~7 Exempel 6 200 mg natriumhyaluronat (MW ca 3 x 106) löstes i 1,5 ml 1 % natriumhydroxid varefter 5 ul divinylsulfon tillsattes.

Blandningen fick stå vid rumstemperatur över natt. Efter tvättning enligt ovan erhölls en spröd gel med torrhalt 0,8 %.

Exempel 7 50 g hyaluronsyragel, framställd enligt exempel 2, i dest vatten överfördes till en dialysslang som förslöts. Slangen hängdes upp och fick lufttorka. Efter tre dygn hade gel- vikten minskat till 5 g. Efter resuspension i fosfatbuffrad fysiologisk saltlösning svällde gelen på 24 timmar till 7,5 ml (so % svä11ning>. ' Exempel 8 1 200 ml hyaluronsyragelkross, framställd enligt Exempel 2, i fosfatbuffrad fysiologisk koksaltlösning, placerades i ett tryckkärl försett med en permeabel bottenplatta på vilken placerats ett ultrafiltermembran (Amicon Diaflo” XM l0OA).

Med hjälp av gastryck (3,5 kg/cmz) pressades 840 ml vätska ut ur gelen. Gelen finfördelades, fylldes på injektions- sprutor och autoklaverades. Denna gel kunde utan problem pressas ut genom en kanyl med 0,8 mm innerdiameter. 20 ml av den endast delvis svällda gelen försattes med ett överskott av fosfatbuffrad fysiologisk koksaltlösning, varvid den svällde till 53 ml inom 5 dygn.

Exempel 9 9,3 g hyaluronsyragel, enligt exempel 2, i fosfatbuffrad fysiologisk koksaltlösning suspenderades i 5M natriumklorid- IPÛOR QUALITY 3403090-7 10 lösning. Efter 24 timmar hade gelens vikt minskat till 7,7 g (83 % av ursprungsvikten). Gelen packades därefter på en kolonn vars volym lästes till gelens egen volym. Kolonnen eluerades med fysiologisk fosfatbuffert tills gelen jämviktats med denna. När gelen resuspenderats i bufferten svällde den åter på 24 timmar till sin ursprungliga vikt 9,3 g.

Exemgel 10 400 mg natriumhyaluronat (Mw ca 3 x 106) löstes i 3 ml l % natriumhydroxid. 100 ul BDDE.tillsattes. Droppar av lösningen portionerades ut i små polyetenrör med 3 ml av en blandning av etylendiklorid och toluen (61 % etylendiklorid 39 % toluen v/v. Eftersom hyaluronatlösningen har samma densitet som den omgivande lösningsmedelsblandningen erhölls fritt svävande sfärer av hyaluronsyra i lösningsmedlet. Rören värmdes under 2 timmar vid 50 OC och fick sedan stà över natt. Gelkulorna tvättades med dest vatten följt av fysio- logisk fosfatbuffert. En gelkula enligt ovan med vikt 2.4 g i fosfatbuffrad koksaltlösning jämviktades med dest.vatten och torkades i luftström till en vikt av 140 mg. Den torkade och krympta kulan fick därefter svälla i nämnda buffert och efter 72 tim hade den återtagit sin ursprungliga volym och vikt.

Cellodling på hyaluronsyragel Exemgel 11 Till försöken användes humana fibroblaster (linje Flow 2002), primära hjärtfibroblaster och en epitelcellinje (VERO). Som odlingsmedium användes DME/F10 (80:20) med tillsats av 2 mM L-glutamin, 1 % icke essentiella aminosyror och 10 % FCS. äööífcåztririrv a 8403090-7 Il Rundlar av gelerna (som framställts i form av plattor) stansades ut och överföres till bakteriologiska petriskâlar, odlingsmedium tillsattes tillsammans med ungefär 50 000 celler/skål. Kulturerna inkuberades i en humid atmosfär i 30 Oc (5 æ C02).

Skálarna avlästes var 24:e timme under en vecka. Antalet fästa och utspridda celler noterades. Som kontroll användes normala cellodlingsskálar.

Resultaten visar att celler (oberoende av celltyp) inte har förmåga att växa på hyaluronsyragel i en in vitro-situation.

Cellerna kan fästa men förmår inte att sprida sig eller att dela sig.

Användning av tvärbunden hyaluronsyragel som glaskroppssub- stitut pà vitrektomerade kaniner Exempel 12 Kaninerna (albino, Swedish loop, Q) sövdes med Mebumal-vet.

(ACO) 60 mg/ml som spätts 1:3. Pupillerna dilaterades med Mydriacyl 0,5 % (Alcon) och Cyklogyl” l % (Alcon). Tetracain (Alcon) användes som lokalanestetikum.

Konjunktiva fripreparerades och en hâllsutur fästes i rectus nasalis, varefter ett 1,5 mm långt snitt förbereddes 2 mm nedom limbus varefter en 5-0 Mersilene° U-sutur (Ethicon) placerades i det förberedda snittet. Suturöglorna lyftes upp ur incisionen och sklera perforerades med ett Superblade° (Medical Workshop). Därefter infördes Klöti Microstripper (Oertli) med infusionsmanschett påsatt. En plan kontaktlins placerades på cornea för att underlätta inspektion av medier och ögonbotten. Mikrostrippern fick arbeta i små cirkuler- ande rörelser under 15 min, varvid 20 ml vätska aspirerades genom instrumentet. .ÉWRÉ 935141? i 8403090-7 12 Sedan den centrala delen av glaskroppen klippts bort in- fördes en tunn Silastic” slang (Dow Corning Corp. Med.

Prod.), inuti stabiliserad med en kanyl vars innerdiameter var 0.6 mm, genom sclerotomin, varefter injektion av den tvärbundna hyaluronsyragelen framställd enligt Exempel l respektive 2 påbörjades. Efterhand som trycket ökar i glaskroppen kommer den lättflytande vätskan att rinna ut vid sidan av silasticslangen genom sclerotomin. Injektion av gelen genom den tunna slangen vållade inga problem. Sedan 0,6 till 0,7 ml av gelen injicerats slöts sclerotomin samtidigt som siliasticslangen avlägsnades. Conjunctival lambân slöts med 6-0 Catgut Plain (Davis + Geck), Totalt opererades 22 ögon och samtliga observerades under en fyraveckorsperiod. 14 ögon observerades därefter under ytterligare 5 månader. Det intraokulära trycket var normalt under hela den postoperativa perioden. Samtliga ögon läkte och blodet absorberades så att efter fyra veckor var nät- hinnan i samtliga fall intilliggande och glaskroppen helt klar. Inga bireaktioner i form av inflamatoriska retningar, cataract eller synekier kunde noteras. Vid försökstidens slut, d v s efter 6 månader, kunde hyaluronsyragel åter- finnas i glaskroppen hos de observerade försöksdjuren.

Claims (5)

8403090-7 l3 Patentkrav i

1. Steril och pvrogenfri gel av tvärbunden hyaluronsyra för användning som glaskroppssubstitut.

2. Gel enligt krav 1 k ä n n e t e c k n a d av att den har en torrhalt i intervallet 0.1 till 50 viktsprocent, företrädesvis 0.2 till 25 viktsprocent.

3. Gel enligt krav l eller 2 k ä n n e t e c k n a d av att tvärbindningen skett med reagens som ger eter- eller amidbindningar till hyaluronsyramolekylerna.

4. Gel enligt krav 3 k ä n n e t e c k n a d av att tvärbindningsreagenset är en bi- eller polyfunktionell epoxid eller en korresponderande halohydrin eller epihalohydrin eller halla.

5. Gel enligt något av kraven 1-4 k ä n n e t e c k n a d av att tvärbindningsreaktionen genomförts med en mängd tvärbindare i ett molärt förhållande av 0.03 till 4.0 per disackaridrepeterande enhet i hyaluronsyramolekylen. g Raon QÉLITY” i