RU2673551C2 - Proteotypic peptide q9y4w6-02 and method of spectrometric analysis of the content of afg3-like human protein on its basis - Google Patents
Proteotypic peptide q9y4w6-02 and method of spectrometric analysis of the content of afg3-like human protein on its basis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2673551C2 RU2673551C2 RU2012147933A RU2012147933A RU2673551C2 RU 2673551 C2 RU2673551 C2 RU 2673551C2 RU 2012147933 A RU2012147933 A RU 2012147933A RU 2012147933 A RU2012147933 A RU 2012147933A RU 2673551 C2 RU2673551 C2 RU 2673551C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- protein
- peptides
- q9y4w6
- concentration
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 263
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 35
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 title description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 127
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 122
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 59
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims abstract description 18
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 58
- 102100034215 AFG3-like protein 2 Human genes 0.000 claims description 41
- 101710135983 AFG3-like protein 2 Proteins 0.000 claims description 36
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 8
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 47
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 11
- 101000780591 Homo sapiens AFG3-like protein 2 Proteins 0.000 abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 abstract description 5
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000054037 human AFG3L2 Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 115
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 105
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 97
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 239000012482 calibration solution Substances 0.000 description 15
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 11
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 7
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 4
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 4
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- -1 zinc cations Chemical class 0.000 description 3
- 108010071550 ATP-Dependent Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000007566 ATP-Dependent Proteases Human genes 0.000 description 2
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 206010061811 demyelinating polyneuropathy Diseases 0.000 description 2
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008025 Cerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 206010008027 Cerebellar atrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010015995 Eyelid ptosis Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 208000036700 Oculomotor apraxia Diseases 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100162195 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) AFG3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001077 Spastic ataxia Diseases 0.000 description 1
- 208000020307 Spinal disease Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000025434 cerebellar degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005421 electrostatic potential Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000004424 eye movement Effects 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000018879 impaired coordination Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 210000004995 male reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- WZVXLJYENHHFPD-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanol;hydrochloride Chemical compound Cl.CNCO WZVXLJYENHHFPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 1
- 230000030363 nerve development Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004398 oculomotor muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 210000000449 purkinje cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000007847 structural defect Effects 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится настоящее изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к области биохимии и, более конкретно, протеомики. В частности, изобретение относится к новому протеотипическому пептиду AFG3-подобного белка-2 человека и способу определения концентрации последнего по содержанию этого протеотипического пептида в образцах, в том числе в сложных биологических смесях.The present invention relates to the field of biochemistry and, more specifically, proteomics. In particular, the invention relates to a new proteotypic peptide of AFG3-like human protein-2 and a method for determining the concentration of the latter by the content of this proteotypic peptide in samples, including complex biological mixtures.
Описание предшествующего уровня техники настоящего изобретенияDescription of the Related Art of the Present Invention
Основной задачей протеомики - сравнительно молодого направления современных биохимических исследований - является проведение инвентаризации белков, которые экспрессируются в клетке, что подразумевает их максимально точное качественное и количественное определение.The main task of proteomics - a relatively young area of modern biochemical research - is to conduct an inventory of proteins that are expressed in the cell, which implies their most accurate qualitative and quantitative determination.
В настоящее время реализуется крупный международный научный проект «Протеом человека», направленный на идентификацию всех белков человека. Одна из целей проекта - инвентаризовать белки, которые кодируются генами 18-й хромосомы.Currently, a large international scientific project “Human Proteome” is being implemented, aimed at identifying all human proteins. One of the goals of the project is to inventory proteins that are encoded by the genes of the 18th chromosome.
В результате выполнения проекта планируется создать дешевые и доступные методы медицинской диагностики, позволяющие определять самые ранние стадии развития заболеваний, индивидуальные методы лечения заболеваний, которые в настоящее время считаются неизлечимыми.As a result of the project, it is planned to create cheap and affordable methods of medical diagnostics that allow to determine the earliest stages of the development of diseases, individual methods of treating diseases that are currently considered incurable.
На сегодня нет рутинной технологии для обнаружения белков, представленных в ультранизких концентрациях. Единственная альтернатива - повышение чувствительности уже используемых методов, основанных, в частности, на двумерном электрофорезе, масс-спектрометрии. иммуноферментном анализе, атомно-силовой микроскопии.To date, there is no routine technology for detecting proteins present in ultra-low concentrations. The only alternative is to increase the sensitivity of already used methods, based, in particular, on two-dimensional electrophoresis, mass spectrometry. enzyme immunoassay, atomic force microscopy.
Наиболее перспективными являются методы, основанные на масс-спектрометрическом определении, которые позволяют селективно детектировать протеотипические пептиды (пептиды, которые при масс-спектрометрическом анализе характеризуют присутствие конкретного белка) в биологических образцах. Протеотипическими считаются протеолитические пептиды, соответствующие белковому продукту одного гена и не встречающиеся в продуктах других генов в составе генома, а также способные ионизироваться и детектироваться при масс-спектрометрическом анализе.The most promising methods are those based on mass spectrometric determination, which make it possible to selectively detect proteotypic peptides (peptides that characterize the presence of a specific protein during mass spectrometric analysis) in biological samples. Proteotypic peptides are considered that are proteolytic peptides corresponding to the protein product of one gene and not found in the products of other genes in the genome, as well as capable of being ionized and detected by mass spectrometric analysis.
Основным методом, применяемым для исследования протеома, является масс-спектрометрический анализ белковых молекул. Идентификация белков проводится алгоритмически, путем сопоставления масс и зарядов продуктов ферментативного гидролиза белков с теоретическими значениями, вычисленными на основе расшифрованного генома. При масс-спектрометрическом анализе белок считается идентифицированным, если установлено 1-2 специфичных пептидных фрагмента первичной структуры. По пептидным фрагментам последовательности удается различить белковые продукты разных генов.The main method used to study the proteome is mass spectrometric analysis of protein molecules. The identification of proteins is carried out algorithmically, by comparing the masses and charges of the products of enzymatic hydrolysis of proteins with theoretical values calculated on the basis of the decrypted genome. In mass spectrometric analysis, a protein is considered identified if 1-2 specific peptide fragments of the primary structure are identified. By peptide fragments of the sequence, it is possible to distinguish between protein products of different genes.
Специфичные для аллельных форм пептидные фрагменты (протеотипические пептиды с высокой вероятностью приходятся на неустановленную в ходе масс-спектрометрического эксперимента часть последовательности белка. Если же протеотипический пептид находится в идентифицируемой части последовательности, то наличие аллельного варианта трансляции гена вносит неоднозначность в интерпретацию масс-спектрометрических данных.Peptide fragments that are specific for allelic forms (proteotypic peptides are most likely to account for a part of the protein sequence that was not identified during the mass spectrometric experiment. If the proteotypic peptide is in the identifiable part of the sequence, the presence of the allelic variant of gene translation introduces ambiguity in the interpretation of mass spectrometric data.
Принципиальная проблема в области протеотипирования заключается в недостаточном покрытии пептидными фрагментами последовательностей белков, идентифицируемых масс-спектрометрическими методами.A fundamental problem in the field of proteotyping is the insufficient coverage of protein sequences identified by mass spectrometric methods with peptide fragments.
В настоящее время, MRM находит применение уже в ранней диагностике раковых заболеваний [Ang CS, Phung J, Nice EC, The discovery and validation of colorectal cancer biomarkers, Biomed Chromatogr. 2011 Jan; 25(1-2):82-99; Fortin T, Salvador A, Charrier JP, Lenz C, Locoux X, Moria A, Choquet-Kastylevsky G, Lemoine J, Clinical quantitation of prostate-specific antigen specific biomarker in the low nanogram/milliliter range by conventional bore liquid chromatorgraphy tandem mass spectrometry (multiple reaction monitoring) coupling and correlation with ELISA tests, Mol Cel Proteomics, 2009, 8(5), 1006-1015] и количественном определении метаболитов [Wei R, Li G, Seymour AB, High throughput and multiplexed LC/MS/MRM method for targeted metabolomics, Anal. Chem, 2010, 82(13), 5527-5533] в плазме крови человека.Currently, MRM is already being used in the early diagnosis of cancer [Ang CS, Phung J, Nice EC, The discovery and validation of colorectal cancer biomarkers, Biomed Chromatogr. 2011 Jan; 25 (1-2): 82-99; Fortin T, Salvador A, Charrier JP, Lenz C, Locoux X, Moria A, Choquet-Kastylevsky G, Lemoine J, Clinical quantitation of prostate-specific antigen specific biomarker in the low nanogram / milliliter range by conventional bore liquid chromatorgraphy tandem mass spectrometry (multiple reaction monitoring) coupling and correlation with ELISA tests, Mol Cel Proteomics, 2009, 8 (5), 1006-1015] and the quantification of metabolites [Wei R, Li G, Seymour AB, High throughput and multiplexed LC / MS / MRM method for targeted metabolomics, Anal. Chem, 2010, 82 (13), 5527-5533] in human plasma.
Белок AFG3L2, называемый AFG3-подобным белком-2 или параплегин-подобным белком, является АТФ-зависимой протеазой, функция которой заключается в разрушении белков в цитозоле. Кроме того. AFG3L2 участвует в процессах клеточной смерти, миелинизации, развитии нервов, в установочных рефлексах, связывании АТФ, а также в других процессах.The AFG3L2 protein, called the AFG3-like protein-2 or paraplegin-like protein, is an ATP-dependent protease whose function is to break down the proteins in the cytosol. Besides. AFG3L2 is involved in the processes of cell death, myelination, nerve development, installation reflexes, ATP binding, as well as in other processes.
Дефекты в AFG3L2 вызывают спиномозговую атаксию типа 28, клинически и генетически разнородную группу спиномозговых нарушений. У пациентов проявляется прогрессирующее нарушение координации при ходьбе и часто плохую координацию рук, речи и движения глаз из-за дегенерации мозжечка с поражением ствола мозга и спинного мозга. Кроме того дефекты в AFG3L2 являются причиной спастической атаксии аутосомно-рецессивного типа 5, нейродегенеративного нарушения, характеризующегося ранним наступлением спастичности, периферической нейропатии, птоза, глазодвигательной апраксии, дистонии, мозжечковой атрофии и прогрессирующей миоклональной эпилепсии.Defects in AFG3L2 cause
В предшествующем уровне техники авторами выявлен ряд патентных документов, имеющих отношение в целом в методу, но ни в одном из них AFG3-подобный белок-2 в качестве объекта идентификации не указан, не говоря уже о его протеотипических пептидах.In the prior art, the authors have identified a number of patent documents related generally to the method, but in none of them AFG3-like protein-2 is indicated as an object of identification, not to mention its proteotypic peptides.
Так, в патенте ЕР 2044443 раскрыт способ идентификации белков путем расщепления их на пептиды, ионизации полученных пептидов и проведения ионизирующей спектроскопии (MALDI). В патенте ЕР 1734367 раскрыт способ идентификации ферментов с помощью протеотипических пептидов. Способ предусматривает проведение масс-спектрометрии. В патенте ЕР 1891446 раскрыт способ идентификации ферментов с помощью протеотипических пептидов. Способ предусматривает проведение масс-спектрометрии. В патентной заявке CN 102411666 раскрыты способ и система для идентификации белков. Способ предусматривает расщепление белка с получением пептидов и сортировку их с использованием масс-спектрометрии. В патенте ЕР 1739424 раскрыт способ идентификации белков с использованием масс-спектрометрии их фрагментов. В патенте ЕР 1795896 раскрыт способ идентификации белков с использованием масс-спектрометрии и двумерного электрофореза. В патенте ЕР 1520243 раскрыт способ идентификации пептидов и белков с использованием данных тандемной спектрометрии, а также сравнения пептидов с информацией созданной базы данных. В патенте ЕР 1775581 раскрыты способ и система идентификации белков с использованием масс-спектрометрии их фрагментов. В патенте ЕР 1265072 раскрыты способ и система идентификации протеомных белков с использованием масс-спектрометрии полученных из них пептидов. В патенте ЕР 1469313 раскрыт способ выполнения масс-спектрометрии биологических образцов, в т.ч. пептидов. В патенте IL 200933 раскрыт способ масс-спектрометрии протеолитических сигнатурных пептидов для идентификации белков. В патентной заявке US 2012190560 раскрыт способ масс-спектрометрии изотопно меченных белков/пептидов. В патентной заявке US 2012156707 раскрыт способ идентификации протеомных белков. Способ предусматривает расщепление белка с получением пептидов и сортировку их с использованием масс-спектрометрии. В патентной заявке US 2009053819 раскрыты способ и система для идентификации и количественного определения белков и пептидов с помощью масс-спектрометрии. В патенте US 4782137 раскрыт идентификационный пептид, применяемый в очистке выбранного белка. В патентной заявке US 2012167238 раскрыты способ и композиция для быстрой идентификации полипептидов с использованием масс-спектрометрии. В патенте US7756646 раскрыт способ идентификации пептидов в биологическом образце с использованием масс-спектрометрии. В патентной заявке US 20120178111 раскрыт способ идентификации мембраносвязанных белков, используемых в качестве биомаркеров злокачественных опухолей с использованием MALDI/TOF масс-спектрометрии. В патенте US 2011178273 раскрыт способ и система идентификации и количественного определения белков и пептидов с помощью масс-спектрометрии. В патентной заявке US 2010173786 раскрыт способ масс-спектрометрии изотопно меченных белков/пептидов. В патентной заявке US 2010288918 раскрыты система и способ тандемной масс-спектрометрии для идентификации пептидов. В патентной заявке US 2004044481 раскрыт способ идентификации пептидов с применением базы данных пептидов и различных методов масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2004081535 раскрыт способ определения профиля протеомной структуры организма с помощью идентификации пептидов методами масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2011143386 раскрыт способ проведения протеомного анализа с помощью идентификации пептидов методами масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2011143760 раскрыт способ колоночной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии для идентификации пептидов. В международной патентной публикации WO 2011119235 раскрыт способ проведения протеомного анализа с помощью идентификации пептидов методами масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2004008151 раскрыты библиотека протеомно-реактивных маркерных молекул, а также способ проведения протеомного анализа с помощью идентификации пептидов методами масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2011149942 раскрыты способ, система и набор для идентификации пептидов с использованием MALDI/TOF масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2005114221 раскрыт способ идентификации гликопептидов с использованием масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2008049239 раскрыт способ идентификации эндометриальных маркеров, которыми могут быть протеотипические пептиды. Способ предусматривает проведение масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2008104746 раскрыт способ идентификации сигнатурных пептидов из базы данных. В международной патентной публикации WO02055989 раскрыт способ идентификации белков с использованием масс-спектрометрии протеолитических пептидов. В международной патентной публикации WO 2009098656 раскрыт способ диагностики и прогнозирования исхода злокачественных опухолей измерением уровня протеотипических пептидов с использованием ELISA, радиоиммуноанализа, протеомных методов и т.п. В международной патентной публикации WO 2012005838 раскрыт способ масс-спектрометрии для идентификации белков/пептидов. В международной патентной публикации WO 2008005455 раскрыт способ идентификации протеотипических пептидов с использованием различных методов масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2011110341 раскрыт способ получения пептидного стандарта с использованием различных методов масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2012006406 раскрыт способ проведения хроматографии и масс-спектрометрии для идентификации пептидов. В международной патентной публикации WO 2006134056 раскрыт способ идентификации ферментов с использованием протеотипических пептидов различными методами масс-спектрометрии. В международной патентной публикации WO 2004106915 раскрыта система анализа биомаркеров с использованием пептидной базы данных, методов хроматографии и масс-спектрометрии. В патенте RU 2253116 раскрыт способ получения субстрата для обнаружения аналитов в образце путем обработки образца, по меньшей мере в двух условиях селективности, определяемых комбинацией адсорбента и элюента, с использованием референсных полипептидов. Патент RU 2408011 относится к биоинформационным методам идентификации белков и пептидов по геномным базам данных. Способ заключается в том. что алгоритмы сопоставления масс-спектров с геномной базой данных применяются повторно после дополнения базы данных новыми записями, либо после удаления из базы данных записей, либо после замены базы данных базой данных, составленной из новых записей. Патент RU 2381505 относится к области медицины, в частности к способу диагностики сифилиса у пациента методом прямого протеомного профилирования сыворотки крови на основе выявления в опытном образце сыворотки биомаркеров сифилиса. Способ диагностики сифилиса предусматривает стадию фракционирования белков сыворотки с использованием магнитных частиц, масс-спектрометрический анализ образца элюата и анализ полученного масс-спектра на предмет наличия или отсутствия набора пиков, соответствующих биомаркерам сифилиса. Патент RU 2441240 относится к области медицины, а именно к способу диагностики аксонально-демиелинизирующих полиневропатий методом прямого протеомного профилирования сыворотки крови больного на основе выявления в образце сыворотки биомаркеров данных заболеваний. Сущность способа заключается в том, что стадию фракционирования белков сыворотки крови проводят с использованием магнитных микрочастиц. Далее осуществляют масс-спектрометрический анализ образца элюата. Проводят сравнительный анализ полученных масс-спектров на предмет наличия или отсутствия набора пиков, соответствующих биомаркерам аксонально-демиелинизирующих полиневропатий. В патенте ЕА 001033 раскрыт способ определения состояния организма, в соответствии с которым отбирают пробу исследуемого организма и определяют качественный и количественный состав низкомолекулярных пептидов в этой пробе, а о состоянии организма судят по результатам сравнения этого состава с эталоном. В патентной заявке ЕА 200600346 раскрыт набор сыворотки (n=248) женщин, обследуемых и оцениваемых на наличие рака яичников, для расширения применения анализа протеомного профиля сыворотки до применения высоко разрешающей масс-спектрометрической инструментальной платформы, для исследования существования множественных особых высокоточных диагностических наборов свойств, присутствующих в том же масс-спектре. В патентной заявке JP 2011090012 раскрыт способ выявления множества типов фосфорилированных белков в образце с использованием базы данных, содержащей данные о типах белков в образце. При этом для измерения массы пептидов используется метод масс-спектрометрии. В патентной заявке KR 100383529 раскрыты способ и система анализа биомаркера злокачественных опухолей на ранней стадии с использованием двумерного изображения протеома. В патентной заявке CN 101685080 раскрыт способ анализа протеома в образце с целью диагностики злокачественных опухолей.Thus, patent EP 2044443 discloses a method for identifying proteins by cleaving them into peptides, ionizing the resulting peptides and conducting ionizing spectroscopy (MALDI). EP 1734367 discloses a method for identifying enzymes using proteotypic peptides. The method involves mass spectrometry. EP 1891446 discloses a method for identifying enzymes using proteotypic peptides. The method involves mass spectrometry. CN 102411666 discloses a method and system for identifying proteins. The method involves splitting a protein to produce peptides and sorting them using mass spectrometry. EP 1739424 discloses a method for identifying proteins using mass spectrometry of fragments thereof. EP 1795896 discloses a method for identifying proteins using mass spectrometry and two-dimensional electrophoresis. EP 1,520,243 discloses a method for identifying peptides and proteins using tandem spectrometry data, as well as comparing peptides with information from a generated database. EP 1775581 discloses a method and system for identifying proteins using mass spectrometry of fragments thereof. EP 1265072 discloses a method and system for identifying proteomic proteins using mass spectrometry of the peptides derived from them. In patent EP 1469313 a method for performing mass spectrometry of biological samples is disclosed, including peptides. IL200933 discloses a mass spectrometry method for proteolytic signature peptides for protein identification. In patent application US 2012190560 a method for mass spectrometry of isotopically labeled proteins / peptides is disclosed. Patent application US 2012156707 discloses a method for identifying proteomic proteins. The method involves splitting a protein to produce peptides and sorting them using mass spectrometry. US patent application 2009053819 discloses a method and system for identifying and quantifying proteins and peptides using mass spectrometry. US 4,782,137 discloses an identification peptide used in the purification of a selected protein. In patent application US 2012167238, a method and composition for the rapid identification of polypeptides using mass spectrometry are disclosed. US7756646 discloses a method for identifying peptides in a biological sample using mass spectrometry. US patent 20120178111 discloses a method for identifying membrane-bound proteins used as biomarkers of malignant tumors using MALDI / TOF mass spectrometry. US 2011178273 discloses a method and system for identifying and quantifying proteins and peptides using mass spectrometry. US Pat. No. 2010173786 discloses a method for mass spectrometry of isotopically labeled proteins / peptides. US 2010288918 discloses a tandem mass spectrometry system and method for identifying peptides. US2004044481 discloses a method for identifying peptides using a database of peptides and various mass spectrometry methods. International patent publication WO2004081535 discloses a method for determining the profile of the proteomic structure of an organism by identifying peptides by mass spectrometry. International patent publication WO 2011143386 discloses a method for performing proteomic analysis by identifying peptides by mass spectrometry. International patent publication WO 2011143760 discloses a column chromatography and tandem mass spectrometry method for identifying peptides. International patent publication WO 2011119235 discloses a method for performing proteomic analysis by identifying peptides by mass spectrometry. International patent publication WO 2004008151 discloses a library of proteomic reactive marker molecules, as well as a method for performing proteomic analysis by identifying peptides by mass spectrometry. International patent publication WO 2011149942 discloses a method, system and kit for identifying peptides using MALDI / TOF mass spectrometry. International patent publication WO 2005114221 discloses a method for identifying glycopeptides using mass spectrometry. International patent publication WO2008049239 discloses a method for identifying endometrial markers, which may be proteotypic peptides. The method involves mass spectrometry. International patent publication WO 2008104746 discloses a method for identifying signature peptides from a database. International patent publication WO02055989 discloses a method for identifying proteins using mass spectrometry of proteolytic peptides. International patent publication WO 2009098656 discloses a method for diagnosing and predicting the outcome of malignant tumors by measuring the level of proteotypic peptides using ELISA, radioimmunoassay, proteomic methods, etc. International patent publication WO 2012005838 discloses a mass spectrometry method for identifying proteins / peptides. International patent publication WO 2008005455 discloses a method for identifying proteotypic peptides using various mass spectrometry methods. International patent publication WO 2011110341 discloses a method for producing a peptide standard using various mass spectrometry methods. International patent publication WO 2012006406 discloses a method for chromatography and mass spectrometry for identifying peptides. International patent publication WO 2006134056 discloses a method for identifying enzymes using proteotypic peptides using various mass spectrometry methods. International patent publication WO 2004106915 discloses a biomarker analysis system using a peptide database, chromatography methods and mass spectrometry. RU 2253116 discloses a method for producing a substrate for detecting analytes in a sample by treating the sample with at least two selectivity conditions determined by a combination of adsorbent and eluent using reference polypeptides. Patent RU 2408011 relates to bioinformation methods for the identification of proteins and peptides from genomic databases. The way is. that the algorithms for comparing mass spectra with the genomic database are re-used after the database is supplemented with new records, or after the records are deleted from the database, or after the database is replaced with a database composed of new records. Patent RU 2381505 relates to the field of medicine, in particular to a method for the diagnosis of syphilis in a patient by direct proteomic profiling of blood serum based on the identification of syphilis biomarkers in the experimental sample. A method for diagnosing syphilis involves the step of fractionating serum proteins using magnetic particles, mass spectrometric analysis of a sample of the eluate and analysis of the resulting mass spectrum for the presence or absence of a set of peaks corresponding to syphilis biomarkers. Patent RU 2441240 relates to the field of medicine, namely to a method for the diagnosis of axonal demyelinating polyneuropathies by the method of direct proteomic profiling of a patient’s blood serum based on the detection of these diseases in the serum sample of biomarkers. The essence of the method lies in the fact that the stage of fractionation of serum proteins is carried out using magnetic microparticles. Next, mass spectrometric analysis of the eluate sample is carried out. A comparative analysis of the obtained mass spectra is carried out for the presence or absence of a set of peaks corresponding to the biomarkers of axonal demyelinating polyneuropathies. Patent EA 001033 discloses a method for determining the state of an organism, according to which a sample of the organism under study is taken and the qualitative and quantitative composition of low molecular weight peptides in this sample is determined, and the state of the organism is judged by comparing this composition with a reference. Patent Application EA 200600346 discloses a serum kit (n = 248) of women screened and evaluated for ovarian cancer to expand the use of serum proteomic profile analysis to use a high resolution mass spectrometric instrument platform to study the existence of multiple specific highly accurate diagnostic property sets, present in the same mass spectrum. JP 2011090012 discloses a method for detecting many types of phosphorylated proteins in a sample using a database containing data on the types of proteins in the sample. In this case, the method of mass spectrometry is used to measure the mass of peptides. Patent application KR 100383529 discloses a method and system for analyzing a malignant tumor biomarker at an early stage using a two-dimensional image of a proteome. CN 101685080 discloses a method for analyzing a proteome in a sample for the diagnosis of malignant tumors.
Указанные документы проанализированы на предмет идентичности или сходства с раскрытым в настоящем документе изобретением. Наиболее близкие к объекту поиска решения, видимо, изложены в патенте ЕР 2044443, где раскрыт способ идентификации белков путем расщепления их на пептиды, ионизации полученных пептидов и проведения ионизирующей спектроскопии (MALDI); и в патенте ЕР 1734367, где раскрыт способ идентификации ферментов с помощью протеотипических пептидов, предусматривающий проведение масс-спектрометрии. Однако, как уже было сказано, это лишь относительное сходство, поскольку ни один документ не раскрывает способа масс-спектрометрического анализа содержания AFG3-подобного белка-2 человека на основании определения содержания протеотипического пептида.These documents are analyzed for identity or similarity to the invention disclosed herein. The solutions closest to the object of search are apparently set forth in patent EP 2044443, which discloses a method for identifying proteins by cleaving them into peptides, ionizing the resulting peptides and conducting ionizing spectroscopy (MALDI); and in patent EP 1734367, which discloses a method for identifying enzymes using proteotypic peptides, involving mass spectrometry. However, as already mentioned, this is only a relative similarity, since no document discloses a method for mass spectrometric analysis of the content of human AFG3-like protein-2 based on the determination of the content of the proteotypic peptide.
Для диагностики и лечения заболеваний, ассоциированных с AFG3-подобным белком-2, необходим достоверный и надежный способ определения его концентрации. Раскрытое в настоящем документе изобретение позволяет решить существующую в настоящей области техники потребность.For the diagnosis and treatment of diseases associated with AFG3-like protein-2, a reliable and reliable method for determining its concentration is required. The invention disclosed herein makes it possible to solve a need existing in the art.
Краткое описание графических материаловA brief description of the graphic materials
На фиг.1 представлены МРМ-спектр (а) и хроматограмма (б) компонентов пептида Q9Y4W6P2DC.Figure 1 presents the MRM spectrum (a) and the chromatogram (b) of the components of the peptide Q9Y4W6P2DC.
На фиг.2 представлены МРМ-спектр (а) и хроматограмма (б) компонентов пептида Q9Y4W6P5DC.Figure 2 presents the MRM spectrum (a) and the chromatogram (b) of the components of the peptide Q9Y4W6P5DC.
На фиг.3 представлены МРМ-спектр (а) и хроматограмма (б) компонентов пептида Q9Y4W6P3DC.Figure 3 presents the MRM spectrum (a) and the chromatogram (b) of the components of the peptide Q9Y4W6P3DC.
На фиг.4 представлена калибровочная кривая для пептида Q9Y4W6-02, построенная по данным таблицы 8.Figure 4 presents the calibration curve for the peptide Q9Y4W6-02, constructed according to table 8.
На фиг.5а представлена хроматограмма выхода материнского иона пептида Q9Y4W6-02 с m/z материнского иона 542,3 2+ Да при концентрации пептида 10-9 М.On figa presents a chromatogram of the yield of the maternal ion of the peptide Q9Y4W6-02 with m / z maternal ion 542.3 2+ Yes at a concentration of the peptide of 10 -9 M.
На фиг.5б представлена хроматограмма выхода фрагментных ионов пептида Q9Y4W6-02 с m/z фрагментных ионов с m/z 984.5 Да (квантор), 639,4 и 526,3 Да (спецификаторы), при концентрации пептида 10-9 М.On figb presents a chromatogram of the yield of fragment ions of the peptide Q9Y4W6-02 with m / z fragment ions with m / z 984.5 Da (quantifier), 639.4 and 526.3 Da (specifiers), at a concentration of the peptide 10 -9 M.
На фиг.5в представлен масс-спектр фрагментов материнского иона пептида Q9Y4W6-02 на пике хроматограммы, при концентрации пептида 10-9 М.On figv presents a mass spectrum of fragments of the parent ion of the peptide Q9Y4W6-02 at the peak of the chromatogram, at a concentration of peptide 10 -9 M.
Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention
Настоящее изобретение относится к применению пептида Q9Y4W6-02, характеризующегося аминокислотной последовательностью VSEEIFFGR, для хромато-масс-спектрометрического анализа содержания в образце AFG3-подобного белка-2 человека (идентификатор Q9Y4W6 в базе данных UniProt). The present invention relates to the use of the peptide Q9Y4W6-02, characterized by the amino acid sequence VSEEIFFGR, for chromatography-mass spectrometric analysis of the content of AFG3-like protein-2 in a sample (identifier Q9Y4W6 in the UniProt database).
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения анализ содержания указанного белка является количественным.According to one embodiment of the present invention, the analysis of the content of said protein is quantitative.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения анализ содержания указанного белка является качественным.According to another embodiment of the present invention, the analysis of the content of said protein is qualitative.
Указанный образец может представлять собой как простую систему, содержащую раствор белка(ов), так и сложный биологический образец.The specified sample can be a simple system containing a solution of protein (s), and a complex biological sample.
Настоящее изобретение также относится к способу хромато-масс-спектрометрического анализа содержания в образце AFG3-подобного белка-2 человека (идентификатор Q9Y4W6 в базе данных UniProt), предусматривающему следующие стадии:The present invention also relates to a chromatography-mass spectrometric method for analyzing the content of a human AFG3-like protein-2 in a sample (identifier Q9Y4W6 in the UniProt database), comprising the following steps:
а) хромато-масс-спектрометрическйй анализ пептида Q9Y4W6-02 с последующим построением калибровочной кривой;a) chromato-mass spectrometric analysis of the peptide Q9Y4W6-02 with the subsequent construction of a calibration curve;
б) хромато-масс-спектрометрический анализ полностью гидролизованного трипсином образца белка;b) chromatography-mass spectrometric analysis of a protein sample completely hydrolyzed by trypsin;
в) выявление среди продуктов гидролиза белка пиков m/z, характерных для пептида Q9Y4W6-02 и его фрагментов;c) the identification of m / z peaks among the protein hydrolysis products characteristic of the Q9Y4W6-02 peptide and its fragments;
г) определение концентрации пептида Q9Y4W6-02 в образце, рассчитанной по калибровочной кривой;d) determination of the concentration of the peptide Q9Y4W6-02 in the sample, calculated from the calibration curve;
д) определение концентрации AFG3-подобного белка-2 человека по концентрации в образце пептида Q9Y4W6-02.d) determining the concentration of AFG3-like human protein-2 by the concentration in the sample of the peptide Q9Y4W6-02.
Ниже будут подробно раскрыты причины выбора пептида Q9Y4W6-02, характеризующегося аминокислотной последовательностью VSEEIFFGR, в качестве протеотипического пептида для AFG3-подобного белка-2 человека, а также методы,Below, the reasons for choosing the Q9Y4W6-02 peptide, characterized by the amino acid sequence VSEEIFFGR, as a proteotypic peptide for human AFG3-like protein-2, as well as methods
которые позволили убедиться в применимости и надежности раскрытого в настоящем документе масс-спектрометрического анализа содержания AFG3-подобного белка-2 человека на основе указанного протеотипического пептида.which made it possible to verify the applicability and reliability of the mass spectrometric analysis of the content of human AFG3-like protein-2 based on the indicated proteotypic peptide disclosed herein.
Возможно использование двух методов определения в пептидном составе гидролизата пробы (пробы плазмы крови человека) пептидных компонентов, в т.ч. протеотипических пептидов, относящихся к биомаркерным белкам. Каждый из приведенных методов описан ниже с позиции своих преимуществ и недостатков, а также возможности использования для поисковой работы в соответствии с технологическими критериями, предъявляемыми к материально-измерительной базе, на которой проводятся поисковые и измерительные работы.It is possible to use two methods for determining the peptide components in the peptide composition of a sample hydrolyzate (human blood plasma sample), including proteotypic peptides related to biomarker proteins. Each of the above methods is described below in terms of its advantages and disadvantages, as well as the possibility of using it for exploratory work in accordance with the technological criteria for the material and measuring base on which prospecting and measuring works are carried out.
1. Дедуктивный, или эмпирический, подход подразумевает использование ионной ловушки (ITrap) и квадрупольных времяпролетных масс-спектрометров (Q-TOF) в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией для получения результатов структурного анализа пептидных ионов и идентификации белков. В дальнейшем при анализе полученных данных проводят идентификацию белков по пептидам, зарегистрированным во время масс-спектрометрического сканирования пробы и выбор фрагментных ионов из данных тандемных спектров, соответствующих прекурсорному иону идентифицированного пептида. Биологическая проба после гидролитического расщепления трипсином представляет собой смесь пептидов белков, содержащихся в пробе. Традиционно в протеомике, основанной на масс-спектрометрическом качественном анализе и количественном измерении, смесь пептидов разделяют по физико-химическим свойствам на хроматографической колонке или тандемно сопряженных хроматографических колонках с различными по своим физико-химическим и авидным свойствам носителями, на которых элюция осуществляется в источник ионизации масс-спектрометра. Наиболее эффективным способом ионизации для молекул биологической природы, в частности, для пептидов, является ионизация с помощью электростатического распыления, при котором достигается быстрое испарение пробы в растворителе в камере источника ионизации и прикладывается высокий электростатический потенциал для эффективной ионизации нейтральных молекул пептидов, что позволяет переводить их в состояние псевдомолекулярных ионов, поступающих в проводящую систему масс-спектрометра. Подбор и настройка параметров сканирования в режимах MS и MS/MS позволяют проводить анализ содержимого пробы с различной чувствительностью, разрешающей силой, эффективностью фрагментации ионов, скоростью сканирования, накопления ионов, временем цикла и т.д. Ионные ловушки представляют собой достаточно чувствительные типы масс-спектрометров (до 10-11 М) и высокой скоростью сканирования (до 26.000 m/z*c-1). Однако, они в значительной степени уступают разрешающей способностью и точностью измерения величины отношения масс к заряду иона, что затрудняет структурный анализ пептида по его фрагментам. В отличие от ионных ловушек квадрупольные времяпролетные масс-спектрометры обладают достаточно высокой разрешающей способностью (к примеру, до 25000 на 322 m/z). Однако, чувствительность Q-TOF масс-спектрометров (квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр) на порядок меньше в сравнении с ионными ловушками. Такие типы масс-спектрометров при фрагментации пептидного иона в ячейке соударения дают неодинаковое число однотипных фрагментных ионов и разное число типов фрагментных ионов. Так, для ионных ловушек характерны высокая степень фрагментации как по b-, так и по у-ионам в равной степени, также формируется большое число гидратированных/дегидратированных и дезаминированных форм b- и у-ионов, а также а-ионы. Для Q-TOF масс-спектрометров характерно формирование, в первую очередь, у-ионов, тогда как b-ионы и их аддукты образуются в значительно меньших количествах; а-ионы практически не формируются. Подобные отличия объясняются различиями в геометрии ячейки соударения, давлении инертного газа, используемом для фрагментации, потенциале, прикладываемом к элементам квадруполя, а также механизме и времени накопления ионов за один цикл сканирования, мобильности ионов при прохождении через электронную оптику и т.д. Тем не менее, обилие различных типов фрагментных ионов и их аддуктов при анализе ионной ловушкой затрудняет интерпретацию тандемных спектров фрагментации, так как представляют собой спектры с высоким уровнем присутствия пиков общего ионного химического тока. С другой стороны, невысокая чувствительность квадрупольных времяпролетных масс-спектрометров ограничивает возможность использования их для поисковой и аналитической работы белков, представленных в биологической пробе в низких концентрациях (10-11 М и менее). Как следствие, это накладывает рамки на количество идентифицируемых белков (их количество будет, в первую очередь, зависеть от порога чувствительности типа масс-спектрометра и индивидуальных настроек детектора/оптики в каждом случае), качество идентификации (погрешность измерения, отражения реального содержания пептида в пробе, степень покрытия (охвата) аминокислотной последовательности пептида по его фрагментам) и количестве пептидов для каждого идентифицированного белка. В свою очередь, использование хромато-масс-спектрометрической системы для поиска пептидов в составе гидролизата пробы, относящихся к целевым белкам, является также затратным по времени (в среднем, один цикл анализа занимает около одного часа), требующим высокой квалификации специалиста для корректного анализа и интерпретации получаемых результатов.1. The deductive or empirical approach involves the use of an ion trap (ITrap) and quadrupole time-of-flight mass spectrometers (Q-TOF) in combination with high-performance liquid chromatography to obtain the results of structural analysis of peptide ions and protein identification. Further, when analyzing the obtained data, proteins are identified by the peptides recorded during the mass spectrometric scanning of the sample and the selection of fragment ions from the data of the tandem spectra corresponding to the precursor ion of the identified peptide. A biological sample after hydrolytic digestion with trypsin is a mixture of the peptides of the proteins contained in the sample. Traditionally, in proteomics based on mass spectrometric qualitative analysis and quantitative measurement, a mixture of peptides is separated according to physicochemical properties on a chromatographic column or tandem conjugate chromatographic columns with carriers different in their physicochemical and avid properties, on which elution is carried out to an ionization source mass spectrometer. The most effective ionization method for molecules of biological nature, in particular, for peptides, is electrostatic spray ionization, in which a quick evaporation of the sample in a solvent in the chamber of the ionization source is achieved and a high electrostatic potential is applied for the effective ionization of neutral peptide molecules, which allows them to be translated to the state of pseudomolecular ions entering the conducting system of the mass spectrometer. Selection and adjustment of scanning parameters in the MS and MS / MS modes allow analyzing the contents of the sample with different sensitivity, resolution, ion fragmentation efficiency, scanning speed, ion accumulation, cycle time, etc. Ion traps are quite sensitive types of mass spectrometers (up to 10 -11 M) and a high scanning speed (up to 26.000 m / z * s -1 ). However, they are significantly inferior to the resolution and accuracy of measuring the ratio of mass to charge of the ion, which complicates the structural analysis of the peptide by its fragments. Unlike ion traps, quadrupole time-of-flight mass spectrometers have a fairly high resolution (for example, up to 25,000 at 322 m / z). However, the sensitivity of Q-TOF mass spectrometers (quadrupole time-of-flight mass spectrometer) is an order of magnitude lower in comparison with ion traps. Such types of mass spectrometers upon fragmentation of the peptide ion in the collision cell give an unequal number of the same type of fragment ions and a different number of types of fragment ions. So, ion traps are characterized by a high degree of fragmentation in both b and y ions equally, a large number of hydrated / dehydrated and deaminated forms of b and y ions, as well as a ions, are also formed. Q-TOF mass spectrometers are characterized primarily by the formation of γ-ions, while β-ions and their adducts are formed in much smaller quantities; а-ions practically do not form. Such differences are explained by differences in the geometry of the collision cell, the inert gas pressure used for fragmentation, the potential applied to the quadrupole elements, as well as the mechanism and time of accumulation of ions in one scanning cycle, ion mobility when passing through electronic optics, etc. Nevertheless, the abundance of various types of fragment ions and their adducts in the analysis by an ion trap makes it difficult to interpret the tandem fragmentation spectra, since they are spectra with a high level of presence of peaks of the total ionic chemical current. On the other hand, the low sensitivity of quadrupole time-of-flight mass spectrometers limits the possibility of using them for the search and analytical work of proteins present in biological samples at low concentrations (10 -11 M or less). As a result, this imposes a framework on the number of identifiable proteins (their number will primarily depend on the sensitivity threshold such as a mass spectrometer and individual settings of the detector / optics in each case), identification quality (measurement error, reflection of the actual peptide content in the sample , the degree of coverage (coverage) of the amino acid sequence of the peptide by its fragments) and the number of peptides for each identified protein. In turn, the use of a chromatography-mass spectrometric system to search for peptides in the sample hydrolyzate related to target proteins is also time-consuming (on average, one analysis cycle takes about one hour), requiring highly qualified specialist for the correct analysis and interpretation of the results.
2. Индуктивный, или синтетический, подход является более эффективным, так как сочетает в себе предварительный биоинформационный отбор целевых белков с их протеотипическими пептидами и аналитическую поисковую работу предсказанных пептидов и их фрагментов на масс-спектрометрах с тройным квадруполем. При предварительном биоинформационном анализе используют несколько открытых источников, данные с которых определяют вероятность нахождения того или иного белка в анализируемом типе биологической пробы, проведения отбора протеотипических пептидов белка и их отбор, проведение отбора характеристических фрагментов пептидного иона в соответствие с техническими требованиями и возможностями, прогнозировать вероятность идентификации пептида. Каждый открытый источник информации дает в совокупности со всеми как общее представление о белке и его протеотипических пептидах, так и прогностическую гипотезу регистрации его в биологической пробе.2. The inductive or synthetic approach is more effective because it combines the preliminary bioinformation selection of target proteins with their proteotypic peptides and the analytical search of the predicted peptides and their fragments on triple quadrupole mass spectrometers. In preliminary bioinformation analysis, several open sources are used, the data from which determine the probability of finding a protein in the analyzed type of biological sample, selecting proteotypic protein peptides and selecting them, selecting characteristic fragments of the peptide ion in accordance with technical requirements and capabilities, and predicting the probability peptide identification. Each open source of information gives, in combination with all, a general idea of the protein and its proteotypic peptides, as well as the prognostic hypothesis of registering it in a biological sample.
Для предсказания протеотипических пептидов и их поиска в составе плазмы крови человека после ферментативного гидролитического расщепления трипсином использовали несколько биоинформационных источников. Базы данных Uniprot https://www.uniprot.org/ - данный ресурс дает общую и ключевую информацию о белке, актуальную в момент обращения к ресурсу. Информация, содержащаяся в этом открытом источнике, представляет собой свод данных о молекулярной функции белка, связи и комплексообразовании с другими белками, тканеспецифичности (данная информация необходима для представления возможности регистрации белка в конкретной пробе, так как возможно, что белок экспрессируется только в злокачественных опухолях, или белок необходим только на ранней стадии эмбрионального развития, или белок коэкспрессируется при определенных физиологических условиях вместе с другими белками), его доменной организации (информация необходима для прогностических вариантов доступности сайтов гидролитического расщепления трипсином), первичной структуре белка (аминокислотной последовательности), возможных пострансляционных модификаций (данные предоставляются без уточнений по модифицируемой аминокислоте), полиморфизмах и сплайс-вариантах (для представления о инвариантности выбираемых при последующей работе протеотипических пептидах).Several bioinformation sources were used to predict proteotypic peptides and search for them in human blood plasma after enzymatic hydrolytic cleavage with trypsin. Uniprot Databases https://www.uniprot.org/ - this resource provides general and key protein information relevant at the time of accessing the resource. The information contained in this open source is a compendium of data on the molecular function of the protein, communication and complexation with other proteins, tissue specificity (this information is necessary to present the possibility of registering the protein in a specific sample, since it is possible that the protein is expressed only in malignant tumors, or a protein is necessary only at an early stage of embryonic development, or a protein is coexpressed under certain physiological conditions together with other proteins), its domain organization (information is necessary for prognostic options for the availability of trypsin hydrolytic cleavage sites), the primary structure of the protein (amino acid sequence), possible post-translational modifications (data are provided without refinement on the modified amino acid), polymorphisms and splice variants (to represent the invariance of proteotypic choices during subsequent work peptides).
В случае AFG3-подобного белка-2 (идентификатор Q9Y4W6) была собрана информация о структурно-функциональной и молекулярной функциональности белка. В частности, известно, что этот белок относится к классу АТФ-зависимых протеаз, необходимых для формирования и развития аксонов. AFG3-подобный белок-2 способен формировать гомоолигомеры и взаимодействовать с белком SPG7, что является необходимым условием для формирования митохондриального комплекса I дыхательной цепи переноса электронов. АРО3-подобный белок-2 использует катионы цинка (по одному иону на каждую субъединицу) в качестве кофактора и является белком внешней мембраны митохондрий. Синтез AFG3-подобного белка-2 не характеризуется тканеспецифичностью и распределен равномерно по всем тканям организма, однако наиболее высокая степень экспрессии белка зарегистрирована в клетках Пуркинье. Этот белок характеризуется присутствием более трех альфа-спиралей, пронизывающих мембрану митохондрии, а также трех участков связывания катионов бивалентных металлов, и одним участком связывания пуриновых нуклеотидов. Для AFG3-подобного белка-2 также характерна высокая степень инвариантности в цитозольном участке полипептидной цепи и высокая вариабельности в мембранных участках полипептидной цепи.In the case of AFG3-like protein-2 (identifier Q9Y4W6), information was collected on the structural, functional and molecular functionality of the protein. In particular, it is known that this protein belongs to the class of ATP-dependent proteases necessary for the formation and development of axons. AFG3-like protein-2 is able to form homo-oligomers and interact with protein SPG7, which is a necessary condition for the formation of the mitochondrial complex I of the respiratory chain of electron transfer. APO3-like protein-2 uses zinc cations (one ion per subunit) as a cofactor and is a protein of the mitochondrial outer membrane. The synthesis of AFG3-like protein-2 is not characterized by tissue specificity and is evenly distributed over all body tissues, however, the highest degree of protein expression is recorded in Purkinje cells. This protein is characterized by the presence of more than three alpha-helices permeating the mitochondrial membrane, as well as three binding sites of divalent metal cations, and one binding site of purine nucleotides. AFG3-like protein-2 is also characterized by a high degree of invariance in the cytosolic region of the polypeptide chain and high variability in the membrane regions of the polypeptide chain.
Таким образом, данная информация дала позволяет предположить возможность регистрации AFG3-подобного белка-2 в пробе плазмы крови человека благодаря отсутствию тканеспецифичности экспрессии, а также свойству крови омывать все ткани и органы человека. В то же время, информация о структурной принадлежности белка к мембранным и его субклеточной локализации в митохондриях свидетельствует о необходимости использования методов белковой экстракции с использованием неионных детергентов и хаотропных агентов для эффективного выделения AFG3-подобного белка-2 из пробы плазму крови человека. Вместе с тем, информация о структурной вариабельности участков полипептидной цепи AFG3-подобного белка-2 позволяет избежать использования трансмембранных областей для селекции протеотипических пептидов, так как эти участки белка являются стерически наименее доступными и наиболее вариабельными по своей аминокислотной последовательности, что может затруднять поиск и идентификацию пептидов, однако это наиболее интересный участок для поиска маркерных пептидов, связанных с медицинской значимостью AFG3-подобного белка-2.Thus, this information made it possible to suggest the possibility of registering AFG3-like protein-2 in a sample of human blood plasma due to the lack of tissue specificity of expression, as well as the property of blood to wash all human tissues and organs. At the same time, information on the structural affiliation of the protein to the membrane and its subcellular localization in mitochondria suggests the need for protein extraction methods using nonionic detergents and chaotropic agents to efficiently isolate AFG3-like protein-2 from human plasma samples. At the same time, information on the structural variability of regions of the AFG3-like protein-2 polypeptide chain allows avoiding the use of transmembrane regions for the selection of proteotypic peptides, since these protein regions are the sterically least accessible and most variable in their amino acid sequence, which can complicate the search and identification peptides, however, this is the most interesting site for the search for marker peptides associated with the medical significance of AFG3-like protein-2.
С использованием ресурсов Uniprot была получена информация о медицинской значимости AFG3-подобного белка-2. Так, известно, что функциональные изменения AFG3-подобного белка-2, обусловленные структурными дефектами, являются причиной развития таких заболеваний как мозжечковая атаксия 28-го типа, которое представляет собой клинически и генетически гетерогенное заболевание. Данное заболевание проявляется в симптомах прогрессирующей ослабленной координации движения рук, ротового аппарата и глазодвигательных мышц. Структурные и функциональные изменения в данном белке обусловлены вариациями канонической аминокислотной последовательности в участке полипептидной цепи 600-700 а.о. Данный участок является наиболее вариабельным и представляет наибольший интерес для поиска пептидных участков, способных диагностировать развитие заболеваний, вызванных дефектами белка AFG3-подобного белка-2.Using Uniprot resources, information was obtained on the medical significance of AFG3-like protein-2. Thus, it is known that functional changes in AFG3-like protein-2, caused by structural defects, are the cause of the development of diseases such as cerebellar ataxia of the 28th type, which is a clinically and genetically heterogeneous disease. This disease manifests itself in the symptoms of progressive weakened coordination of movements of the hands, oral apparatus and oculomotor muscles. Structural and functional changes in this protein are due to variations in the canonical amino acid sequence in the region of the polypeptide chain of 600-700 a.o. This site is the most variable and is of most interest for the search for peptide sites capable of diagnosing the development of diseases caused by defects in the AFG3-like protein-2 protein.
База данных Human Protein Atlas https://www.proteinatlas.org/. в которой представлены иммунохимические и гистохимические данных о локализации белков в различных тканях и клетках и культурах клеток, уровне экспрессии белков в различных тканях. Данный источник данных используется для определения возможности регистрации целевых белков в той или иной биологической пробе на основе предыдущих данных иммунохимического анализа.Human Protein Atlas Database https://www.proteinatlas.org/. which presents immunochemical and histochemical data on the localization of proteins in various tissues and cells and cell cultures, the level of expression of proteins in various tissues. This data source is used to determine the possibility of registering target proteins in a particular biological sample based on previous immunochemical analysis data.
На основании данных о AFG3-подобном белке-2, зарегистрированном и подтвержденном шестью различными антителами высокой специфичности была получена информация о высоком уровне экспрессии и присутствии белка в клетках крови, ткани печени человека, тканях желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы, мужской и женской репродуктивной системы, а также среднем уровне экспрессии в клетках кожи, дыхательной системы и эндокринной системы. При этом высокая и средняя степень экспрессии AFG3-подобного белка-2 зарегистрирована в раковых клетках при следующих патологиях: рак простаты, колоректальный рак, рак молочной железы, рак щитовидной железы. Распределение AFG3-подобного белка-2 по широкому диапазону функционально и гистохимически различных тканей подтверждает данные об отсутствии тканеспецифичности распределения и экспрессии этого белка, а наличие высокого уровня экспрессии и присутствия белка, зарегистрированного в тканях при различных типах онкологических заболеваний свидетельствует в пользу медицинской значимости диагностики AFG3-подобного белка-2.Based on the data on AFG3-like protein-2 registered and confirmed by six different high specificity antibodies, information was obtained on the high level of expression and the presence of protein in blood cells, human liver tissue, tissues of the gastrointestinal tract, central nervous system, male and female reproductive system, as well as the average level of expression in the cells of the skin, respiratory system and endocrine system. At the same time, a high and medium degree of expression of AFG3-like protein-2 was detected in cancer cells with the following pathologies: prostate cancer, colorectal cancer, breast cancer, thyroid cancer. The distribution of AFG3-like protein-2 over a wide range of functionally and histochemically different tissues confirms the data on the lack of tissue-specific distribution and expression of this protein, and the presence of a high level of expression and the presence of a protein registered in tissues for various types of cancer indicates the medical significance of the diagnosis of AFG3 -like protein-2.
Микрофотографии конфокальной микроскопии при окраске флуоресцентными антителами НРА004479 свидетельствуют о преимущественной локализации АРО3-подобного белка-2 в районе микротрубочек митохондрий.Microphotographs of confocal microscopy stained with fluorescent antibodies HPA004479 indicate the predominant localization of APO3-like protein-2 in the region of mitochondrial microtubules.
Таким образом, информация, полученная из источника Human Proteins Atlas подтверждает широкую распространенность АРО3-подобного белка-2 по тканям и органам человека, а так же повышенную экспрессию АРО3-подобного белка-2 при некоторых социально значимых патофизиологических и патоморфологических нарушениях, таких как раковые заболевания простаты, молочной железы, щитовидной железы и колоректального рака. Также подтверждается наибольшая степень локализации АРО3-подобного белка-2 в районе митохондрий.Thus, information obtained from the source of Human Proteins Atlas confirms the widespread prevalence of APO3-like protein-2 in human tissues and organs, as well as increased expression of APO3-like protein-2 in some socially significant pathophysiological and pathomorphological disorders, such as cancer prostate, breast, thyroid and colorectal cancer. The highest degree of localization of APO3-like protein-2 in the mitochondrial region is also confirmed.
База данных https://www.srmatlas.org/, в которой представлены масс-спектрометрические данные о регистрации пептидов, классифицированных по принадлежности их к белку. В базе данных собраны материалы об экспериментально подтвержденных регистрационных данных для искомого пептида (в случае его наличия в базе), количестве экспериментов, в которых пептид был зарегистрирован, консолидированный по нескольким экспериментам спектр пептида и данные о приборно-измерительной базе, на которой проводилась регистрация сигнала пептида.Database https://www.srmatlas.org/, which presents mass spectrometric data on the registration of peptides, classified by their protein. The database contains materials on experimentally confirmed registration data for the desired peptide (if available in the database), the number of experiments in which the peptide was registered, the peptide spectrum consolidated over several experiments, and data on the instrumentation base on which the signal was recorded peptide.
Данный источник информационных ресурсов необходим для определения степени исследованности AFG3-подобного белка-2 масс-спектрометрическими методами. По данным ресурса SRM атлас всего было зарегистрировано 38 различных протеотипических пептидов этого белка безотносительно к типу ткани и типу масс-спектрометрического детектора. Из этого числа пептидов 19 пептидов постоянно присутствовали в виде модифицированных по лизинам (метилирование) и цистеинам пептидов. С высоким коэффициентом вероятности (1,0) были зарегистрированы 15 протеотипических пептидов, при этом 10 пептидов из этого числа были зарегистрированы с использованием орбитальных ловушек или времяпролетных квадрупольных масс-спектрометров. Учитывая отсутствие четко обозначенной информации о происхождении и типе биологической пробы, в которых проводились исследования, а также типах масс-спектрометров, которыми проводилась регистрация пептидов, можно сделать выводы о высокой вероятности регистрации пептидов AFG3 подобного белка-2, однако следует исключить упомянутые пептиды с модифицированными аминокислотными остатками, а также пептиды с индексов вероятности идентификации ниже 1,0. Таким образом, для дальнейшей работы необходимо учитывать 15 протеотипических пептидов AFG3-подобного белка-2.This source of information resources is necessary to determine the degree of investigation of AFG3-like protein-2 by mass spectrometric methods. According to the SRM Atlas resource, a total of 38 different proteotypic peptides of this protein were registered regardless of the type of tissue and type of mass spectrometric detector. Of this number of peptides, 19 peptides were constantly present in the form of peptides modified for lysines (methylation) and cysteines. With a high probability coefficient (1.0), 15 proteotypic peptides were recorded, and 10 of these peptides were registered using orbital traps or time-of-flight quadrupole mass spectrometers. Given the lack of clearly identified information on the origin and type of biological sample in which the studies were carried out, as well as the types of mass spectrometers that recorded the peptides, it can be concluded that AFG3 peptides of this protein-2 are highly likely to be detected, however, the mentioned peptides with modified amino acid residues, as well as peptides with probability indices of identification below 1.0. Thus, for further work it is necessary to take into
Ресурс PRIDE https://www.ebi.ac.uk/pride предоставляет доступ к информации об экспериментах, в которых был зарегистрирован искомый белок. Данные классифицированы по типу эксперимента (типу биологической пробы, в которой при аналитической работе был зарегистрирован белок) и предоставляет общую информацию о регистрируемом пептиде в виде сводного консолидированного спектра фрагментации. Ресурс PRIDE использовали для выявления информации о типе биологической пробы, в которых был зарегистрирован AFG3-подобный белок-2 безотносительно к аминокислотной последовательности детектированного пептида этого белка. Эта информация необходима для прогнозирования вероятности детекции пептидов AFG3-подобного белка-2 в целевой биологической пробе. В базе PRIDE присутствует информация о 141 экспериментальном свидетельстве регистрации и идентификации AFG3-подобного белка-2, причем более чем в 50% случаев этот белок был неоднократно зарегистрирован в пробах плазмы или сыворотки человека, в четырех случаях данный белок был идентифицирован в экспериментах с тканью печени человека и в двух случаях - с клетками центральной нервной системы и костного мозга. В остальных случаях (54 эксперимента) AFG3-подобный белок-2 был зарегистрирован в клеточных культурах К-562. В экспериментах с плазмой крови человека исследователи использовали нормальную обогащенную и необогащенную плазму крови человека, для которых свидетельствовали отсутствие хронических, инфекционных или наследуемых заболеваний. Таким образом, информация о типе и частоте встречаемости идентификации AFG3-подобного белка-2 в пробах плазмы крови человека позволяет с высокой степенью вероятности говорить о возможности детекции протеотипических пептидов AFG3-подобного белка-2 в пробе плазмы крови человека без использования обогащения минорной фракции белков, а также о возможности регистрации в плазме здоровых добровольцев, то есть отсутствие поиска специфического по этимологии и развитию заболеваний биологического материала. Более того, принимая во внимание полученную информация о типе биологического материала. AFG3-подобный белок-2 можно зарегистрировать в наиболее доступном биологическом материала, то есть в плазме или сыворотке крови человека, не используя биопсийный материал.The PRIDE resource https://www.ebi.ac.uk/pride provides access to information about experiments in which the desired protein was registered. The data are classified by the type of experiment (the type of biological sample in which the protein was detected during analytical work) and provides general information about the registered peptide in the form of a consolidated consolidated fragmentation spectrum. The PRIDE resource was used to identify information about the type of biological sample in which an AFG3-like protein-2 was registered regardless of the amino acid sequence of the detected peptide of this protein. This information is necessary to predict the likelihood of detection of AFG3-like protein-2 peptides in a target biological sample. The PRIDE database contains information on 141 experimental evidence of registration and identification of AFG3-like protein-2, more than in 50% of cases this protein was repeatedly detected in samples of plasma or human serum, in four cases this protein was identified in experiments with liver tissue human and in two cases - with cells of the central nervous system and bone marrow. In the remaining cases (54 experiments), AFG3-like protein-2 was detected in K-562 cell cultures. In experiments with human blood plasma, the researchers used normal enriched and unenriched human blood plasma, for which they showed the absence of chronic, infectious or inherited diseases. Thus, information on the type and frequency of identification of AFG3-like protein-2 in samples of human blood plasma makes it possible to speak with high probability of the possibility of detecting proteotypic peptides of AFG3-like protein-2 in a blood plasma sample without using enrichment of the minor fraction of proteins, as well as the possibility of registering healthy volunteers in the plasma, that is, the lack of a search for biological material specific to the etymology and development of diseases. Moreover, taking into account the information received on the type of biological material. AFG3-like protein-2 can be registered in the most accessible biological material, i.e. in human plasma or blood serum, without using biopsy material.
Открытый источник данных Phosphosite https://www.phosphosite.org/ специализируется на накоплении информации о посттрансляционных модификациях (фосфорилировании и ацетилировании) в пептидах белков с указанием модифицируемого аминокислотного остатка в первичной структуре белковой молекулы, которые должны быть подтверждены экспериментально. Данные классифицированы по белковой принадлежности пептида. Для АРО3-подобного белка-2 идентифицировано с высокой частотой (более чем в пяти различных независимых экспериментах) посттрансляционное ацетилирование по аминокислотным остаткам лизина в положениях K306, K308, K543. Последний аминокислотный остаток лежит в области высокой вариативности аминокислотной последовательности белка, что подтверждено данными Uniprot в предварительном анализе. Два других лизина в положениях 306 и 308 находятся в стерически недоступном для ферментативного расщепления мембранном участке белка. Таким образом, информация о посттрансляционных модификациях предоставляет возможность сузить круг пептидов-кандидатов для определения АРО3-подобного белка-2.The open source data source Phosphosite https://www.phosphosite.org/ specializes in the accumulation of information about post-translational modifications (phosphorylation and acetylation) in protein peptides indicating the modified amino acid residue in the primary structure of the protein molecule, which must be experimentally confirmed. Data are classified according to the protein affiliation of the peptide. For APO3-like protein-2, post-translational acetylation at lysine amino acid residues at positions K306, K308, K543 was identified with a high frequency (in more than five different independent experiments). The last amino acid residue lies in the region of high variability of the amino acid sequence of the protein, as confirmed by Uniprot in a preliminary analysis. Two other lysines at positions 306 and 308 are in the membrane region of the protein that is sterically inaccessible to enzymatic cleavage. Thus, information on post-translational modifications provides the opportunity to narrow the range of candidate peptides for the determination of APO3-like protein-2.
Ресурс https://www.innovagen.se/custom-peptide-synthesis/peptide-property-calculator/peptide-property-lculator.asp, позволяющий в короткие сроки рассчитать основные физико-химические свойства пептида (изоэлектрическую точку, заряд пептида при нейтральном рН, относительную гидрофильность, диаграмму распределения гидрофобных/гидрофильных аминокислотных остатков в пептиде), необходим для возможной корректировки градиента элюции с целью максимальной воспроизводимости времени удержания пептида на колонке, ширины пика и симметрии.The resource https://www.innovagen.se/custom-peptide-synthesis/peptide-property-calculator/peptide-property-lculator.asp, which allows in a short time to calculate the main physicochemical properties of the peptide (isoelectric point, peptide charge at neutral pH, relative hydrophilicity, distribution diagram of hydrophobic / hydrophilic amino acid residues in the peptide) is necessary for possible adjustment of the elution gradient in order to maximize reproducibility of the retention time of the peptide on the column, peak width and symmetry.
Для первичного исследования с учетом информации, полученной из вышеописанных открытых источников, были отобраны следующие пептиды, для которых характерна высокая частота встречаемости в масс-спектрометрических исследованиях плазмы крови человека как типа исследуемого биологического материала, отсутствие вариабельных участков аминокислотной последовательности, стерическая близость к участкам связывания со специфическими антителами против AFG3-подобного белка-2, а также пептиды, находящиеся в доступных для ферментативного расщепления доменных структурных участках молекулы белка:For the initial study, taking into account the information obtained from the above open sources, the following peptides were selected, which are characterized by a high frequency of occurrence in mass spectrometric studies of human blood plasma as a type of biological material under study, the absence of variable regions of the amino acid sequence, steric proximity to binding sites with specific antibodies against AFG3-like protein-2, as well as peptides that are available for enzymatic cleavage I domain of structural parts of the protein molecule:
Однако в дальнейшем из этого предварительного списка пептидов, приведенного в таблице 1, на основании ресурса SSRC https://hs2.proteome.ca/SSRCalc/SSRCalcX.html была проведена дополнительная селекция пептидов. Ресурс SSRC представляет собой открытую программу для расчета коэффициента гидрофобности пептидов и относительного времени их удержания на колонках с обращенной фазой при различных диаметрах пор в частицах хроматографического носителя (от 100 до 300 А), и содержании ион-парного реагента в растворителях (трифторуксусная кислота или муравьиная кислота). Данный ресурс предоставляет возможность прогнозировать последовательность элюции целевых пептидов на колонке при выбранных оптимальных условия и корректировать условия хроматографического разделения.However, further from the preliminary list of peptides shown in Table 1, based on the SSRC resource https://hs2.proteome.ca/SSRCalc/SSRCalcX.html, additional selection of peptides was carried out. The SSRC resource is an open program for calculating the hydrophobicity coefficient of peptides and their relative retention time on reversed-phase columns at various pore diameters in chromatographic support particles (from 100 to 300 A) and ion-pair reagent content in solvents (trifluoroacetic acid or formic acid). This resource provides the opportunity to predict the sequence of elution of the target peptides on the column under the selected optimal conditions and adjust the conditions of chromatographic separation.
Таким образом, совокупность данных из различных открытых источников дает первичное представление и информацию для отбора протеотипических пептидов целевого белка для проведения дальнейшего анализа и поисковой работы. Для выбранных протеотипических пептидов в дальнейшем проводится отбор фрагментных ионов в соответствии с разработанными критериями, соответствующими наиболее вероятной воспроизводимости интенсивности фрагмента, частоте его встречаемости при фрагментации, возможности формирования этого типа иона при заданных условиях фрагментации, его инвариантности, а также родительских ионов на основании коэффициента относительной гидрофобности пептида, его заряда, изоэлектрической точки и т.д.Thus, the totality of data from various open sources gives a primary idea and information for the selection of proteotypic peptides of the target protein for further analysis and search. For the selected proteotypic peptides, fragment ions are subsequently selected in accordance with the developed criteria corresponding to the most probable reproducibility of the fragment intensity, its frequency of occurrence during fragmentation, the possibility of the formation of this type of ion under given fragmentation conditions, its invariance, and also parent ions based on the relative coefficient hydrophobicity of the peptide, its charge, isoelectric point, etc.
Для отбора фрагментных ионов и родительских ионов использовали следующие критерии:The following criteria were used to select fragment ions and parent ions:
а) длина пептида должна составлять не менее 6 и не более 20 аминокислотных остатков,a) the length of the peptide should be at least 6 and not more than 20 amino acid residues,
б) молекулярная масса пептида не должна превышать более 2400 Да,b) the molecular weight of the peptide should not exceed more than 2400 Yes,
в) пептид может быть либо в двух либо в трехзарядном состоянии при формировании псевдомолекулярного пептидного иона (в исключительных случаях возможно рассмотрение однозарядных ионов).c) the peptide can be either in two or in a tri-charged state during the formation of a pseudomolecular peptide ion (in exceptional cases, it is possible to consider singly charged ions).
г) для анализа используются стабильные b- и у-ионы, образующиеся при фрагментации пептидного иона, и не рассматриваются дегидратированные/гидратированные и дезаминированные аддукты фрагментных ионов пептида,d) for the analysis, stable b and y ions formed during fragmentation of the peptide ion are used, and dehydrated / hydrated and deaminated adducts of fragment peptide ions are not considered,
д) величина отношения массы к заряду для фрагментного иона не должна быть менее 300 и более 1000 (для двухзарядных фрагментных ионов не более 800 и не менее 380),e) the value of the ratio of mass to charge for a fragment ion should not be less than 300 and more than 1000 (for doubly charged fragment ions, not more than 800 and not less than 380),
е) если пептид имеет моноизотопную массу при усредненном распределении вклада в молекулярную массу каждого изотопа атомов, входящих в состав пептида, менее 500, то рассматриваются только у-ионы, если более 1500, то рассматриваются у-ионы в одно- и двухзарядных состояниях и b-ионы в однозарядном состоянии до величины m/z не превышающей 800,f) if the peptide has a monoisotopic mass with an average distribution of the contribution to the molecular weight of each isotope of the atoms that make up the peptide is less than 500, then only γ ions are considered, if more than 1500, then γ ions in single and double charged states are considered and b - ions in a singly charged state up to a value of m / z not exceeding 800,
ж) если в аминокислотной последовательности пептида встречается триплет из аминокислотных остатков глутаминовой кислоты (ЕЕЕ) или пролина (РРР), то для отбора учитываются все у- и b-ионы независимо от длины и зарядного состояния пептидного иона,g) if a triplet of the amino acid residues of glutamic acid (EEE) or proline (PPP) is found in the amino acid sequence of the peptide, then all γ and β ions are taken into account for selection, regardless of the length and charge state of the peptide ion,
з) длина фрагментного иона должна составлять не менее четырех аминокислотных остатков с С- или N-конца пептида,h) the length of the fragment ion must be at least four amino acid residues from the C- or N-terminus of the peptide,
и) среди отобранных фрагментных ионов не должны встречаться ионы, соответствующие по величине m/z прекурсорному пептидному иону в зарядных состояниях 1+ - 3+,i) among the selected fragment ions, no ions corresponding in magnitude m / z to the precursor peptide ion in the charged
к) для анализа не учитываются пептиды с коэффициентом относительной гидрофобности более 70,j) peptides with a relative hydrophobicity coefficient of more than 70 are not taken into account for analysis,
л) не учитывали пептиды с зарядом при рН=7,0, равным или более +3 или менее -3, а также изоэлектрической точке, лежащей в пределах, близких к критическим значениям (pi менее 3,0 и более 10,0).k) peptides with a charge at pH = 7.0 equal to or more +3 or less than -3, as well as an isoelectric point lying within close to critical values (pi less than 3.0 and more than 10.0) were not taken into account.
Далее рассмотрен отбор маркерных пептидов по результатам измерения масс-спектрометрических сигнатур AFG3-подобного белка-2 (Q9Y4W6). Для белка Q9Y4W6 (AFG3-подобного белка-2) были отобраны шесть протеотипических пептидов на первичном уровне аналитического биоинформационного отбора (таблица 3).Next, the selection of marker peptides by measuring the mass spectrometric signatures of AFG3-like protein-2 (Q9Y4W6) is considered. Six proteotypic peptides were selected for the Q9Y4W6 protein (AFG3-like protein-2) at the primary level of analytical bioinformation selection (table 3).
Из приведенной таблицы 3 видно, что все пептиды отличаются по длине (от 9 до 17 аминокислотных остатков) и коэффициенту относительной гидрофобности, К каждому протеотипическому пептиду применяют метод МРМ (отслеживания множественных реакций формирования фрагментных ионов). Качественный анализ и поиск пептида целевого белка проводится с учетом физико-химических свойств протеотипического пептида. Из первичной выборки протеотипических пептидов отбирается лишь часть пептидов по результатам масс-спектрометрических измерений на масс-спектрометре с тройным квадруполем Agilent6410.From table 3 it can be seen that all peptides differ in length (from 9 to 17 amino acid residues) and relative hydrophobicity coefficient. For each proteotypic peptide, the MRM method is used (tracking multiple reactions of fragment ion formation). Qualitative analysis and search for the target protein peptide is carried out taking into account the physicochemical properties of the proteotypic peptide. Only part of the peptides are selected from the initial sample of proteotypic peptides according to the results of mass spectrometric measurements on an Agilent6410 triple quadrupole mass spectrometer.
Для каждого прекурсорного пептидного иона была рассчитана эффективная энергия соударения по следующей формуле (1):For each precursor peptide ion, the effective collision energy was calculated by the following formula (1):
где СЕ - эффективная энергия соударения в электрон-вольтах, эВ; m/z - отношение массы к заряду прекурсорного пептидного иона; МН - средняя моноизотопная масса пептида, рассчитанная как средняя величина вклада изотопов каждого атома, входящего в состав пептида, L - длина пептида в аминокислотных остатках, k - поправочный коэффициент учета зарядного состояния псевдомолекулярного иона (2,58 для двухзарядных, 1,12 для трехзарядных и 3,71 для однозарядных).where CE is the effective collision energy in electron volts, eV; m / z is the ratio of mass to charge of the precursor peptide ion; MN is the average monoisotopic mass of the peptide, calculated as the average contribution of the isotopes of each atom included in the peptide, L is the length of the peptide in amino acid residues, k is the correction factor for the charge state of the pseudomolecular ion (2.58 for doubly charged, 1.12 for triply charged and 3.71 for singly charged).
Для каждого из приведенных в таблице 3 пептидов возможно существование как минимум 122 фрагментных ионов с учетом а, b, y-ионов, их аддуктов и внутренних пептидных ионов (данные приведены для самого короткого пептида Q9Y6Q6P4 длиной 9 аминокислотных остатков). Однако в соответствии с вышеизложенными критериями (а-к) авторами изобретения были отобраны от 9 до 28 возможных фрагментных ионов для каждого пептида.For each of the peptides listed in Table 3, at least 122 fragment ions can exist, taking into account a, b, y ions, their adducts and internal peptide ions (data are given for the shortest peptide Q9Y6Q6P4 with a length of 9 amino acid residues). However, in accordance with the above criteria (ak), the inventors selected from 9 to 28 possible fragment ions for each peptide.
Выбор пептидов осуществляли по нескольким статистическим критериям, относящимся к качественной оценке хроматографической и масс-спектрометрической составляющей анализа. Расчет всех статистических параметров и анализ полученных результатов проводили с помощью программного обеспечения Qualitative Analysis В04.01 patch 2, входящего в пакет программ Mass Hunter (Agilent). Для анализа полученных результатов выдвигали требование присутствия целевого пептида во всех трех технических повторениях анализа биологической пробы. При этом допускается толерантность по времени удержания пептида на колонке при одинаковых условиях хроматографического разделения не более +/- 0,5 минуты. Для каждого пептида, зарегистрированного при масс-спектрометрическом анализе, была определена вершина точки хроматографического пика времени удержания на колонке. Также для каждого пептида были рассчитаны ширина хроматографического пика, измеряемая в минутах и рассчитываемая как разница между точкой начала подъема самого интенсивного пика и точкой окончания спуска пика (формула 2), а также коэффициент симметрии пика (безразмерная величина), рассчитываемый как отношение полуширины хроматографического пика на спуске к полуширине хроматографического пика на подъеме на уровне 10% от максимальной высоты пика (формула 3). Ширина пика и симметрия пика являются вспомогательными величинами, позволяющими проводить порог отсечения ложноположительного сигнала в том случае, если в результате масс-спектрометрического анализа на хроматограмме были получены сигналы более одного пика.The selection of peptides was carried out according to several statistical criteria related to the qualitative assessment of the chromatographic and mass spectrometric components of the analysis. All statistical parameters and the analysis of the results were calculated using the Qualitative Analysis B04.01
где t1, t0 - время окончания и начала подъема хроматографического пика с максимальной интенсивностью.where t 1 , t 0 - the end time and the beginning of the rise of the chromatographic peak with maximum intensity.
где b - полуширина на спуске пика на высоте 10% от максимальной точки интенсивности, а - полуширина на подъеме хроматографического пика на высоте 10% от максимальной точки интенсивности хроматографического пика, h - значение максимальной высоты хроматографического пика.where b is the half width at the descent of the peak at a height of 10% of the maximum intensity point, and is the half width at the rise of the chromatographic peak at a height of 10% of the maximum intensity point of the chromatographic peak, h is the value of the maximum height of the chromatographic peak.
Выбраны следующие критерии для качественной хроматографической оценки пика: варьирование пределов ширины пика 0,15<β(t)<1,2, пределы варьирования коэффициента симметрии хроматографического пика 0,3<ω(t)<1,3. Одновременно с коэффициентом симметрии пика проводили оценку деконволюированности хроматографического пика, так как уровень деконволюции вносит основной вклад в разрешение пиков. Интегрирование площади пиков проводили после предварительного сглаживания хроматографических пиков по алгоритму Гауссовского распределения точек (вероятности сигнала) на хроматограмме по их интенсивности, предполагая, что полученный масс-спектрометрической сигнал есть физическая величина, подверженная большому числу случайных помех (общий ионный ток). При этом коэффициент смещения μ функции варьировал от 5 до 12 точек, а коэффициент масштаба
Одним из основных критериев в оценке качества хроматографического пика каждого фрагментного иона выступает величина отношения уровня сигнала к шуму. В данной работе нижнее пороговое значения отношения сигнала к шуму было установлено на уровне 7,0 (SN>7,0). Значение отношения уровня сигнала к шуму определяли как среднеквадратичное отклонение численного изменения интенсивности химического шума по каждому интервалу времени, в котором зарегистрирован сигнал предполагаемого хроматографического пика. При этом отношение сигнала считается к максимальному значению общего ионного тока по всему временному интервалу. Для расчета отношения сигнала к шуму возможно оперировать величинами площади пика или высоты пика как волновой амплитуде колебания; в данной работе расчет проводили по площади хроматографического пика в соответствии с формулой (4):One of the main criteria in assessing the quality of the chromatographic peak of each fragment ion is the ratio of the signal level to noise. In this paper, the lower threshold signal-to-noise ratio was set at 7.0 (SN> 7.0). The value of the ratio of signal level to noise was determined as the standard deviation of the numerical change in the intensity of chemical noise for each time interval in which the signal of the expected chromatographic peak was recorded. In this case, the signal ratio is considered to be the maximum value of the total ion current over the entire time interval. To calculate the signal-to-noise ratio, it is possible to operate with the values of the peak area or peak height as the wave amplitude of the oscillation; in this work, the calculation was performed according to the area of the chromatographic peak in accordance with the formula (4):
где μ - это ожидаемого или расчетное значение сигнала, а σ - среднеквадратичное отклонение шума.where μ is the expected or calculated value of the signal, and σ is the standard deviation of the noise.
Оптимизацию параметрических величин для масс-спектрометрической регистрации и хроматографического разделения осуществляли в направлении константных, лабильных и вариабельных параметров для достижения максимального значения уровня сигнала к шуму площади пика, форму хроматографического пика с коэффициентом асимметрии в интервале от 0.8 до 1,2. а также максимальною предела обнаружения пептида в биологической пробе.Optimization of parametric values for mass spectrometric registration and chromatographic separation was carried out in the direction of constant, labile and variable parameters to achieve the maximum signal level to noise peak area, the shape of the chromatographic peak with an asymmetry coefficient in the range from 0.8 to 1.2. as well as the maximum detection limit of a peptide in a biological sample.
Существуют константные (постоянные), лабильные (изменяющиеся независимо от характеристик прекурсорного или фрагментного иона) и вариабельные параметры (зависимые от значения отношения массы к заряду прекурсорного иона и от количества фрагментных ионов в методе), устанавливаемые в методе.There are constant (constant), labile (varying regardless of the characteristics of the precursor or fragment ion) and variable parameters (depending on the value of the ratio of mass to charge of the precursor ion and on the number of fragment ions in the method) established in the method.
К константным параметрам относятся потенциал на капилляре (-1970 В в данном случае), температура осушающего газа (азот) 305°С, скорость потока осушающего газа 5 л/мин, а также хроматографические параметра разделения пептидной смеси на колонке после гидролитического расщепления пробы. Разделяющая и обогащающая колонки интегрированы в хроматографический нанопотоковый чип и имеют прямой вывод на эмиттер в источник электростатической ионизации. Для анализа отбирают по 1 мкл пробы в растворе 5% муравьиной кислоты, загрузку которой осуществляют в изократическом растворителе С (5% ацетонитрил в водном растворе 0,1% муравьиной кислоты и 0,003% трифторуксусной кислоты) в течение 3,5 минут при скорости потока 2 мкл/мин на обогащающую колонку (Zorbax 300SB-C18 300А, длина колонки 4 мм, объем 40 нл, размер частиц 5 мкм). После предварительного обогащения пробы хроматографические разделения проводят на колонке с обращенной фазой Zorbax 300SB-C18 (150 мм × 75 мкм, размер частиц 5 мкм) в градиенте растворителей А (водный раствор 0,1% муравьиной кислоты) и В (80% ацетонитрил в водном растворе 0,1% муравьиной кислоты). Градиент элюции пептидов: 0-2 минуты - 5% В, 2-32 минуты - 5-65% В, 32-34 минуты - 65-100% В, 34-38 минут - 100% В, 38-41 минута - 100-5% В. Уравновешивание колонки в начальных условиях градиента элюции (5% В) в течение 6 минут.Разделение проводили на колонке при скорости потока 0,3 мкл/мин. В период элюции с колонки растворителем с высоким содержанием ацетонитрила (34-38 минут, 100% В), скорость потока градиентно в течение 2 минут увеличивали до 0,5 мкл/мин. Общее время одного анализа составляло 47 минут. Ввод пробы в капилляр седла осуществляют при скорости 4,1 мкл/мин, загрузку пробы в петлю хроматографа при скорости 8,2 мкл/мин. После каждого цикла ввода/вывода пробы иглу инжектора промывают раствором 30% этанола с 30% 2-пропанолом в воде в течение 4 секунд. Перед переключением перепускных клапанов изменения потока изократического растворителя для загрузки на обогащающую колонку, устанавливают время уравновешивания скорости потока насоса в течение 5 секунд. Пробы постоянно термостатируют при 6°С.The constant parameters include the potential on the capillary (-1970 V in this case), the temperature of the drying gas (nitrogen) 305 ° С, the flow rate of the drying gas 5 l / min, as well as the chromatographic parameters of the separation of the peptide mixture on the column after hydrolytic digestion of the sample. Separating and enriching columns are integrated into the chromatographic nanostream chip and have direct output to the emitter into the electrostatic ionization source. For analysis, 1 μl of a sample is taken in a solution of 5% formic acid, which is loaded in an isocratic solvent C (5% acetonitrile in an aqueous solution of 0.1% formic acid and 0.003% trifluoroacetic acid) for 3.5 minutes at a flow rate of 2 μl / min per enrichment column (Zorbax 300SB-C18 300A,
К лабильным характеристикам метода МРМ относятся параметрические величины, изменяющиеся после настройки и калибровки масс-спектрометра с тройным квадруполем: референсный потенциал на электронном умножителе конверсионного диодного детектора, потенциал усиления сигнала на электронном умножителе, референсный потенциал фрагментора, значения напряжения на электронной оптике. Верхняя граница значения потенциал усиления сигнала рассчитывается по формуле (5):The labile characteristics of the MRM method include parametric values that change after tuning and calibrating a mass spectrometer with a triple quadrupole: the reference potential on the electron multiplier of the conversion diode detector, the signal amplification potential on the electron multiplier, the reference potential of the fragmenter, and the voltage values on the electronic optics. The upper limit of the value of the signal amplification potential is calculated by the formula (5):
где 3000 - максимальное значение потенциала на реверсивном диодном детекторе в вольтах, a EMVd - текущее значение потенциала на электронном умножителе конверсионного детектора, установленное при настройке масс-спектрометра. Потенциал усиления сигнала (ΔEMV) возможно измерять при составлении метода в целях увеличения чувствительности масс-детектора при регистрации пептидов белков в низких и ультранизких концентрационных диапазонах.where 3000 is the maximum value of the potential at the reversible diode detector in volts, and EMVd is the current value of the potential at the electron multiplier of the conversion detector, which was set when tuning the mass spectrometer. The signal amplification potential (ΔEMV) can be measured when compiling the method in order to increase the sensitivity of the mass detector when registering protein peptides in the low and ultra-low concentration ranges.
К вариабельным параметрам метода МРМ относятся величина эффективной энергии соударения, которая рассчитывается по формуле (1) и является характеристической величиной для каждого прекурсорного иона, время накопления на каждый фрагментный ион, выражаемое в миллисекундах. В зависимости от числа переходов от прекурсорного иона к фрагментному иону, или от общего числа фрагментных ионов в методе, автоматически рассчитывается общее время одного цикла сканирования, то есть время, которое затрачивается на однократное сканирование (поиск) и накопление конкретного фрагментного иона, произошедшего от соответствующего прекурсорного иона, на третьем квадруполе масс-спектрометра. Общее время сканирования складывается из суммы времен накопления на каждый фрагментный ион и суммы времени задержки при передачи иона из ячейки соударения (второго квадруполя) в третий квадруполь (6)The variable parameters of the MRM method include the value of the effective collision energy, which is calculated by formula (1) and is a characteristic value for each precursor ion, the accumulation time for each fragment ion, expressed in milliseconds. Depending on the number of transitions from the precursor ion to the fragment ion, or on the total number of fragment ions in the method, the total time of one scan cycle is calculated automatically, that is, the time spent on a single scan (search) and accumulation of a specific fragment ion, which occurred from the corresponding precursor ion, on the third quadrupole of the mass spectrometer. The total scan time is the sum of the accumulation times for each fragment ion and the sum of the delay time when the ion is transferred from the collision cell (second quadrupole) to the third quadrupole (6)
где St - общее время одно цикла сканирования, мс; Dwt - время накопления на один фрагментный ион; Trt - время, затрачиваемое на перенос ионов из второго квадруполя в третий квадруполы n - число фрагментный ионов в одном цикле сканирования.where S t is the total time of one scan cycle, ms; Dw t is the accumulation time per fragment ion; Tr t is the time spent on the transfer of ions from the second quadrupole to the third quadrupole n is the number of fragment ions in one scan cycle.
Время накопления фрагментных ионов будет зависеть от эффективности ионизации пептида, стабильности его фрагментов при распаде в ячейке соударения и мобильности фрагментных ионов. В зависимости от этих параметров время накопления на ион выставляется в пределах 30<Dwt<52, с тем, чтобы общее одного цикла сканирования принадлежало интервалу 550<St<1300. Минимальное количество точек для построения хроматографического пика одного фрагмента составляет не менее 45 точек на минуту градиента элюции при толерантности пика ±2 минуты от вершины точки времени удержания хроматографического пика.The accumulation time of fragment ions will depend on the efficiency of the ionization of the peptide, the stability of its fragments during decay in the collision cell, and the mobility of the fragment ions. Depending on these parameters, the accumulation time per ion is set within 30 <Dw t <52, so that the total of one scan cycle belongs to the
Перечисленные параметры в совокупности дают возможность достоверной качественной оценки полученных хроматографических пиков анализируемых протеотипических пептидов и идентификации ложноположительных сигналов по установленным порогам отсечения. На фиг.2 (а) - 4 (а) показаны масс-спектрометрические спектры примеров протеотипических пептидов Q9Y4W6P2DC, Q9Y4W6P5DC и Q9Y4W6P3DC, консолидированные по компонентам фрагментации соответствующего прекурсорного иона (таблица 3). На фиг.2 (б) - 4 (б) показаны хроматограммы с разрешением фрагментных компонентов псевдомолекулярного пептидного иона, полученных в результате распада в ячейке соударения.The parameters listed above together enable reliable qualitative assessment of the obtained chromatographic peaks of the analyzed proteotypic peptides and the identification of false-positive signals according to the established cut-off thresholds. Figure 2 (a) - 4 (a) shows the mass spectrometric spectra of the examples of proteotypic peptides Q9Y4W6P2DC, Q9Y4W6P5DC and Q9Y4W6P3DC, consolidated by the fragmentation components of the corresponding precursor ion (table 3). Figure 2 (b) - 4 (b) shows chromatograms with resolution of the fragment components of the pseudomolecular peptide ion obtained by decay in the collision cell.
Пептид Q9Y4W6P1DC был исключен из выборки, так как обладает очень высоким зарядом при нейтральном значении реакции среды. Пептид Q9Y4W6P2DC исключен из рассматриваемой выборки в связи с высоким значением коэффициента относительной гидрофобности, а также из-за наличия аминокислотного остатка цистеина в полипептидной последовательности, который будет алкилирован в процессе пробоподготовки (фиг.2). Пептид Q9Y4W6P5DC исключен из выборки в связи с высокой молекулярной массой и длиной пептида, что сказывается на превалировании трехзарядных псевдомолекулярных пептидных ионов, также в пептиде присутствует аминокислотный остаток метионина. Также данный пептид был исключен из выборки так как при анализе масс-спектрометрических данных для данного пептида наблюдали присутствие четырех хроматографических пиков с различным временем удержания на колонке (фиг.3).The peptide Q9Y4W6P1DC was excluded from the sample, as it has a very high charge with a neutral reaction value of the medium. The peptide Q9Y4W6P2DC was excluded from the sample under consideration due to the high value of the coefficient of relative hydrophobicity, as well as due to the presence of the amino acid residue of cysteine in the polypeptide sequence, which will be alkylated during the sample preparation (Fig. 2). The peptide Q9Y4W6P5DC was excluded from the sample due to the high molecular weight and length of the peptide, which affects the prevalence of triply charged pseudomolecular peptide ions; the amino acid residue methionine is also present in the peptide. Also, this peptide was excluded from the sample since the presence of four chromatographic peaks with different retention times on the column was observed in the analysis of mass spectrometric data for this peptide (Fig. 3).
Пептид Q9Y4W6P6DC исключен из выборки в связи с критически высоким значением изоэлектрической точки. Пептид Q9Y4W6P3DC исключен из выборки в связи с нейтральным зарядным состоянием, что обусловлено присутствием четырех аминокислотных остатков глицина в пептидной последовательности, также присутствие множественных глицинов сказывается на вариабельности при формировании фрагментных ионов при масс-спектрометрическом анализе.The Q9Y4W6P6DC peptide was excluded from the sample due to the critically high value of the isoelectric point. The peptide Q9Y4W6P3DC was excluded from the sample due to the neutral charge state, which is due to the presence of four amino acid residues of glycine in the peptide sequence, and the presence of multiple glycines affects the variability in the formation of fragment ions during mass spectrometric analysis.
В пептиде Q9Y4W6P3DC также присутствует аминокислотный остаток метионина, который способен окисляться и вносить вариации в интерпретацию данных, а также как следствие изменять массу пептида со сдвигом в 17 Да и сдвигать время удержания на колонке в более гидрофобную область градиента элюции (фиг.4).The peptide Q9Y4W6P3DC also contains an amino acid residue of methionine, which is capable of oxidizing and introducing variations in the interpretation of the data, as well as changing the mass of the peptide with a shift of 17 Da and shifting the retention time on the column to a more hydrophobic region of the elution gradient (Fig. 4).
Сводные данные для хроматографических пиков, усредненные по трем техническим повторениям со стандартным отклонением для пептидов белка Q9Y4W6 приведены в таблице 4.Summary data for chromatographic peaks averaged over three technical repetitions with a standard deviation for Q9Y4W6 protein peptides are shown in Table 4.
Таким образом, в результате отбора фрагментных пептидов, необходимых для проведения поиска целевых белков в гидролизате пептидов биологической пробы плазмы крови человека или ткани печени человека, получаем следующую таблицу основных параметрических масс-спектрометрических величин для маркерного пептида-кандидата с аминокислотной последовательностью VSEEIFFGR белка Q9Y4W6 (таблица 5):Thus, as a result of the selection of fragment peptides necessary for the search for target proteins in the peptide hydrolyzate of a biological sample of human blood plasma or human liver tissue, we obtain the following table of the main parametric mass spectrometric values for the marker candidate peptide with the amino acid sequence VSEEIFFGR of protein Q9Y4W6 (table 5):
Как видно из таблицы 5. лишь часть фрагментных ионов была отобрана для дальнейшего поиска пептида. Так же видно, что в зависимости от линейных и структурных характеристик в соответствие с требованиями (а-к) для данного пептидного иона были выбраны как b-, так и y-типы фрагментных ионов с различными зарядными состояниями от 1+до 2+. Данная таблица представляет собой свод основных параметров для поиска и регистрации наиболее интенсивного, воспроизводимого по площади пика и времени удержания на колонке пептида с аминокислотной последовательностью VSEEIFFGR целевого белка с идентификатором Q9Y4W6 (AFG3-подобного белка-2) методом отслеживания множественных реакций формирования фрагментных ионов (МРМ). Каждый метод МРМ соответствует одному пептиду в одном зарядном состоянии какого-либо белка.As can be seen from table 5. only a portion of the fragment ions was selected for further search for the peptide. It is also seen that, depending on the linear and structural characteristics, both b and y types of fragment ions with different charge states from 1 + to 2+ were chosen for this peptide ion in accordance with the requirements (a-k). This table is a summary of the main parameters for searching and recording the most intense target protein reproduced by area and retention time on the column of the peptide with the amino acid sequence VSEEIFFGR of the target protein with the identifier Q9Y4W6 (AFG3-like protein-2) by tracking multiple reactions of the formation of fragment ions (MRM ) Each MRI method corresponds to one peptide in one charge state of a protein.
Для регистрации и поиска данного пептида с аминокислотной последовательностью VSEEIFFGR был разработан метод отслеживания формирования фрагментных ионов с использованием масс-спектрометра с тройным квадруполем и оптимизированы параметрические величины настройки масс-детектора, конверсионного диодного детектора и источника ионизации, а также параметры работы и градиента элюции высокоэффективной жидкостной системы хроматографического разделения пептидов из биологического материала.To register and search for this peptide with the amino acid sequence VSEEIFFGR, a method for tracking the formation of fragment ions using a triple quadrupole mass spectrometer was developed and the parametric settings of the mass detector, conversion diode detector, and ionization source were optimized, as well as the parameters and elution gradient of a highly efficient liquid systems for chromatographic separation of peptides from biological material.
Таким образом, отбор маркерного пептида с аминокислотной последовательностью VSEEIFFGR осуществляется по воспроизводимости масс-спектрометрического пика (соотношению фрагментных ионов) в ряду технических повторений, воспроизводимости времени удержания на колонке хроматографического пика, ширине и коэффициенту симметрии хроматографического пика, соотношению уровня сигнала к шуму, воспроизводимости хроматографических и масс-спектрометрических характеристик выбранного пика при анализе биологической пробы.Thus, the selection of a marker peptide with the amino acid sequence VSEEIFFGR is carried out according to the reproducibility of the mass spectrometric peak (fragment ion ratio) in a series of technical repetitions, reproducibility of the retention time on the column of the chromatographic peak, width and symmetry coefficient of the chromatographic peak, signal-to-noise ratio, chromatographic reproducibility and mass spectrometric characteristics of the selected peak in the analysis of biological samples.
Пример 1. Построение калибровочной кривой для определения концентрации белка AFG3-подобного белка-2 (инвентарный номер UniProt Q9Y4W6) по пептиду Q9Y4W6-02Example 1. Construction of a calibration curve for determining the concentration of protein AFG3-like protein-2 (accession number UniProt Q9Y4W6) according to the peptide Q9Y4W6-02
Концентрацию целевого белка определяли по концентрации выбранного маркерного (протеотипического) пептида данных белков, полученных после их гидролитического ферментативного расщепления. Подразумевалось, что при 100% расщеплении белка трипсином в ходе эксперимента пептид Q9Y4W6-02 находится в эквимолярной концентрации по отношению к белку. Концентрацию маркерного пептида определяли хромато-масс-спектрометрическим сравнением интенсивности пика маркерного пептида в пробе с калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой зависимости интенсивности отклика масс-спектрометрического детектора от концентрации пептида проводили хромато-масс-спектрометрический анализ калибровочных растворов пептидов с известной концентрацией. Калибровочные растворы характеризовались концентрациями 10~8, 10"9, 10-8, 10-9, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 М.The concentration of the target protein was determined by the concentration of the selected marker (proteotypic) peptide of these proteins obtained after their hydrolytic enzymatic cleavage. It was understood that with 100% trypsin cleavage of the protein during the experiment, the Q9Y4W6-02 peptide was in equimolar concentration with respect to the protein. The concentration of the marker peptide was determined by chromatography-mass spectrometric comparison of the peak intensity of the marker peptide in the sample with a calibration curve. To construct a calibration curve of the dependence of the response intensity of the mass spectrometric detector on the concentration of the peptide, a chromato-mass spectrometric analysis of calibration solutions of peptides with a known concentration was performed. Calibration solutions were characterized by concentrations of 10 ~ 8 , 10 " 9 , 10 -8 , 10 -9 , 10 -12 , 10 -13 , 10 -14 , 10 -15 M.
Анализ проводили на хромато-масс-спектрометре "Agilent", состоящем из жидкостного нанопотокового хроматографа "Agilent 1200" и масс-спектрометрического детектора с тройным квадруполем "Agilent6410".The analysis was performed on an Agilent chromatography-mass spectrometer, consisting of an Agilent 1200 liquid-chromatography liquid chromatograph and an Agilent6410 triple quadrupole mass spectrometric detector.
Стадия 1
Приготовление матрицы для калибровки.Preparing a matrix for calibration.
Матрица для приготовления калибровочных растворов представляла собой смесь из 8 белков, которые не могут присутствовать у человека.The matrix for the preparation of calibration solutions was a mixture of 8 proteins that cannot be present in humans.
1. Взвешивали 2,5 мг лиофилизированного порошка альбумина яичного (Sigma А5503) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.1. 2.5 mg of lyophilized egg albumin lyophilized powder (Sigma A5503) was weighed and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
2. Взвешивали 2,5 мг порошка уреазы соевых бобов (Sigma U1500) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.2. 2.5 mg of soybean urease powder (Sigma U1500) was weighed and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
3. Взвешивали 2,5 мг миоглобина скелетной мышцы лошади (Sigma Н0630) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.3. Weighed 2.5 mg of horse skeletal muscle myoglobin (Sigma H0630) and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
4. Взвешивали 2,5 мг лиофилизированного порошка гиалуронидазы бычьего семенника (Sigma Н3506) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.4. Weighed 2.5 mg of lyophilized bovine testis hyaluronidase powder (Sigma H3506) and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
5. Взвешивали 2,5 мг цитохрома С из бычьего сердца (Sigma С2037) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.5. 2.5 mg of bovine heart cytochrome C was weighed (Sigma C2037) and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
6. Взвешивали 2,5 мг фосфатазы щелочной из бычьих почек (Sigma Р3627) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.6. 2.5 mg alkaline phosphatase from bovine kidneys (Sigma P3627) was weighed and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
7. Взвешивали 2,5 мг алкогольдегидрогеназы дрожжей (Sigma А7011) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.7. 2.5 mg of yeast alcohol dehydrogenase (Sigma A7011) was weighed and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
8. Взвешивали 2,5 мг пероксидазы хрена (Sigma Р8375) и растворяли в 100 мкл деионизованной воды до конечной концентрации 25 мг/мл.8. 2.5 mg of horseradish peroxidase (Sigma P8375) was weighed and dissolved in 100 μl of deionized water to a final concentration of 25 mg / ml.
9. Объединяли полученные растворы и добавляли 200 мкл деионизованной воды. Полученный раствор содержал 8 белков, которые не могут присутствовать у человека, в эквивалентных количествах и суммарной концентрации белка 20 мг/мл.9. The resulting solutions were combined and 200 μl of deionized water was added. The resulting solution contained 8 proteins that cannot be present in humans, in equivalent amounts and a total protein concentration of 20 mg / ml.
10. Раствор разливали в пластиковые пробирки типа «Эппендорф» по 100 мкл и хранили в холодильнике при -70°С.10. The solution was poured into 100 μl Eppendorf type plastic tubes and stored in a refrigerator at -70 ° C.
11. Для приготовления калибровочных растворов проводили гидролитическое ферментативное расщепление 50 мкл белковой матрицы11. For the preparation of calibration solutions, hydrolytic enzymatic digestion of 50 μl of the protein matrix was performed
12. К 50 мкл полученного раствора белков добавляли 500 мкл денатурирующего буфера, состоящего из 12 мМ дезоксихолата натрия, 2 М тиомочевины, 2,5 мМ ЭДТА натрия двухзамещенного, 7,5 мМ Tris-HCl (N-гидроксиметиламинометан гидрохлорид), рН 8,2. Далее к полученному раствору смеси белков с суммарной концентрацией 10 мг/мл добавляли 1,4-дитиотриэтол (ДТТ) и трис-(2-карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР) до конечной концентрации 87 мМ и 6,7 мМ соответственно.12. To 50 μl of the resulting protein solution was added 500 μl of denaturing buffer consisting of 12 mM sodium deoxycholate, 2 M thiourea, 2.5 mM sodium EDTA, 7.5 mM Tris-HCl (N-hydroxymethylaminomethane hydrochloride),
13. Перемешивали на шейкере IKA Vortex при 800-900 об/мин и инкубировали при температуре 44°С в течение 60 мин в термошейкере Eppendorf Comfort.13. Stirred on an IKA Vortex shaker at 800-900 rpm and incubated at 44 ° C for 60 min in an Eppendorf Comfort thermo shaker.
14. В полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл вносили 10 мкл 4-винилпиридина и 90 мкл N,N-диметилформамида. Далее к полученному раствору добавляли 100 мкл денатурирующего буфера. В полученном растворе с помощью тестовой лакмусовой бумаги проверяли значение рН. которое не должно было превышать 9,0.14. 10 μl of 4-vinylpyridine and 90 μl of N, N-dimethylformamide were added to a 1.5 ml polypropylene tube. Next, 100 μl of denaturing buffer was added to the resulting solution. In the resulting solution, the pH value was checked using test litmus paper. which should not have exceeded 9.0.
15. К матрице добавляли 12 мкл полученного раствора и помещали в недоступное для света место при комнатной температуре. Инкубировали в течение 60 мин.15. To the matrix was added 12 μl of the resulting solution and placed in a place inaccessible to light at room temperature. Incubated for 60 minutes.
16. К полученному раствору добавляли 900 мкл буферного раствора для трипсинолиза, состоящего из 42 мМ триэтиламмония бикарбоната, 3 мМ кальция хлорида.16. To the resulting solution was added 900 μl of a trypsinolysis buffer solution consisting of 42 mM triethylammonium bicarbonate, 3 mM calcium chloride.
17. Для проведения трипсинолиза к пробе добавляли 50 мкл раствора трипсина с концентрацией 200 нг/мкл и инкубировали при 44°С в течение двух часов.17. For trypsinolysis, 50 μl of a trypsin solution with a concentration of 200 ng / μl was added to the sample and incubated at 44 ° C for two hours.
18. После инкубирования добавляли еще 25 мкл трипсина и выдерживали 2 часа при 37°С.18. After incubation, another 25 μl of trypsin was added and kept for 2 hours at 37 ° C.
19. Добавляли 50 мкл концентрированной муравьиной кислоты, перемешивали пипетированием и осветляли центрифугированием при 14000 об/мин в течение 10 мин.19. 50 μl of concentrated formic acid was added, mixed by pipetting and clarified by centrifugation at 14000 rpm for 10 minutes.
Стадия 2
Приготовление калибровочных растворов выбранных пептидов.Preparation of calibration solutions of selected peptides.
1. Для получения исходного раствора с концентрацией 10-3 М взвешивали 1 мг порошка выбранного пептида и растворяли в 5% (об.) растворе муравьиной кислоты в объеме, достаточном для приготовления 10-3 М раствора. Объем растворителя рассчитывали по формуле.1. To obtain a stock solution with a concentration of 10 -3 M, 1 mg of the powder of the selected peptide was weighed and dissolved in a 5% (vol.) Solution of formic acid in a volume sufficient to prepare a 10 -3 M solution. The volume of solvent was calculated by the formula.
V (мл)=1000/ М, гдеV (ml) = 1000 / M, where
V - объем 5% (об.) раствора муравьиной кислоты, необходимый для растворения,V is the volume of a 5% (vol.) Solution of formic acid, necessary for dissolution,
М - молекулярная масса пептидаM is the molecular weight of the peptide
Для выбранных пептидов объемы растворителя приведены в таблице 6.For the selected peptides, the volumes of solvent are shown in table 6.
2. 1 мкл полученного раствора добавляли к 1 мл 5% (об.) раствора муравьиной кислоты для получения раствора с концентрацией 10-6 M2. 1 μl of the resulting solution was added to 1 ml of a 5% (vol.) Solution of formic acid to obtain a solution with a concentration of 10 -6 M
3. 1 мкл полученного раствора с концентрацией 10-6 М добавляли к 99 мкл полученной после ферментативного расщепления белковой матрицы для получения калибровочного раствора с концентрацией 10-8 М (уровень "7")3. 1 μl of the resulting solution with a concentration of 10 -6 M was added to 99 μl of the protein matrix obtained after enzymatic digestion to obtain a calibration solution with a concentration of 10 -8 M (level "7")
4. 10 мкл полученного раствора с концентрацией 10-8 М добавляли к 99 мкл белковой матрицы для получения калибровочного раствора с концентрацией 10-9 М (уровень "6")4. 10 μl of the resulting solution with a concentration of 10 -8 M was added to 99 μl of the protein matrix to obtain a calibration solution with a concentration of 10 -9 M (level "6")
5. 1 мкл полученного раствора с концентрацией 10-9 М добавляли к 99 мкл белковой матрицы для получения калибровочного раствора с концентрацией 10-10 М (уровень "5")5. 1 μl of the resulting solution with a concentration of 10 -9 M was added to 99 μl of the protein matrix to obtain a calibration solution with a concentration of 10 -10 M (level "5")
6. 1 мкл полученного раствора с концентрацией 10-10 М добавляли к 99 мкл белковой матрицы для получения калибровочного раствора с концентрацией 10-11 М (уровень "4")6. 1 μl of the resulting solution with a concentration of 10 -10 M was added to 99 μl of the protein matrix to obtain a calibration solution with a concentration of 10 -11 M (level "4")
7. 1 мкл полученного раствора с концентрацией 10-12 М добавляли к 99 мкл белковой матрицы для получения калибровочного раствора с концентрацией 10-12 М (уровень "3")7. 1 μl of the resulting solution with a concentration of 10 -12 M was added to 99 μl of the protein matrix to obtain a calibration solution with a concentration of 10 -12 M (level "3")
8. 1 мкл полученного раствора с концентрацией 10-12 М добавляли к 99 мкл белковой матрицы для получения калибровочного раствора с концентрацией 10-13 М (уровень"2")8. 1 μl of the resulting solution with a concentration of 10 -12 M was added to 99 μl of the protein matrix to obtain a calibration solution with a concentration of 10 -13 M (level "2")
9. 1 мкл полученного раствора с концентрацией 10-13 М добавляли к 99 мкл белковой матрицы для получения калибровочного раствора с концентрацией 10-14 М (уровень "1")9. 1 μl of the resulting solution with a concentration of 10 -13 M was added to 99 μl of the protein matrix to obtain a calibration solution with a concentration of 10 -14 M (level "1")
Стадия 3
Хромато-масс-спектрометрический анализ калибровочных растворов для построения калибровочной кривой проводили на хромато-масс-спектрометре "Agilent", состоящем из жидкостного нанопотокового хроматографа "Agilent1200" и масс-спектрометрического детектора с тройным квадруполем "Agilent6410" согласно методике анализа соответствующего пептида.Chromato-mass spectrometric analysis of calibration solutions for constructing a calibration curve was carried out on an Agilent chromato-mass spectrometer, consisting of an Agilent1200 liquid nanostream chromatograph and an Agilent6410 triple quadrupole mass spectrometric detector according to the method of analysis of the corresponding peptide.
Так, для выбранных маркерных пептидов анализ проводили на хроматографической колонке с обращенной фазой Zorbax SB300-C18 (150 мм ×75 мкм размер частиц 5 мкм размер пор в частицах 300 ангстрем). В качестве изократической подвижной фазы использовали 5% раствор ацетонитрила в воде с 0.1% муравьиной кислотой и 0,03%) трифторуксусной кислотой; элюирующие подвижные фазы для создания градиента: подвижная фаза А 0,1% муравьиная кислота, подвижная фаза Б -80% раствор ацетонитрила в воде с 0,1% муравьиной кислотой. Схема градиента элюции: 0-2 мин - 5% буфера Б, 2-32 мин - 5-65% буфера Б, 32-34 мин- 65-100%) буфера Б, 34-38 мин - 100% буфера Б. 38-41 мин- 100-5% буфера с последующим уравновешиванием колонки в начальных условиях градиента (4:Б=95:5) в течение 6 минут.So, for the selected marker peptides, the analysis was performed on a Zorbax SB300-C18 reverse phase chromatography column (150 mm × 75
MS/MS анализ проводили в режиме положительной ионизации. Параметры анализа: фрагментор 135, Dwell 30. Для источника ионизации использовали следующие параметры: температура осушающего газа 325°С, поток осушающего газа 5 л/мин, напряжение на капилляре 2000 В.MS / MS analysis was performed in positive ionization mode. Analysis parameters: fragmentator 135,
В параметрах детектора выставляли родительские и дочерние ионы, необходимые для анализа выбранного пептида. Так, для пептида, приведенного в таблице 1, родительские и дочерние ионы приведены в таблице 7.In the detector parameters, the parent and daughter ions were set up, which were necessary for the analysis of the selected peptide. So, for the peptide shown in table 1, the parent and daughter ions are shown in table 7.
Стадия 4
1. Для построения калибровочной кривой проводили по три анализа каждого из калибровочных растворов с концентрациями 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14,10-15 М.1. To build a calibration curve, three analyzes of each of the calibration solutions with concentrations of 10 -8 , 10 -9 , 10 -10 , 10 -11 , 10 -12 , 10 -13 , 10 -14 , 10 -15 M were performed .
2. Калибровочную кривую зависимости отклика маркерного пептида от концентрации строили при помощи программного обеспечения Mass Hunter Quantitative Analysis B05.00, поставляемого как пакетное приложение Agilent Mass Hunter.2. A calibration curve of the concentration of the response of the marker peptide was constructed using the Mass Hunter Quantitative Analysis B05.00 software, which is supplied as a package application Agilent Mass Hunter.
3. При построении калибровки и обработки данных использовали файлы всех технических повторений анализа (21 файл=7 концентрационных точек X 3 технических повторения).3. When constructing calibration and data processing, files of all technical repetitions of the analysis were used (21 files = 7
4. Для построения калибровочной кривой в качестве начальных условий обработки данных устанавливали фрагментный пик-квантор (наиболее интенсивный пик фрагментного иона для конкретного прекурсорного иона, воспроизводимом в каждом техническом повторении каждой концентрационной точки), остальные фрагментные ионы выступали в качестве пиков-спецификаторов.4. To construct the calibration curve, the fragment quantifier peak (the most intense fragment ion peak for a specific precursor ion reproduced in each technical repetition of each concentration point) was established as the initial data processing conditions; the remaining fragment ions acted as specifier peaks.
5. Максимальное отклонение времени удержания пика выбирали как±1 минута от точки в вершине времени удержания пика. Сглаживание пиков не использовали, начальная функция зависимости площади пика от концентрации пептида как линейная без учета нулевой точки концентрации. Площади пика-квантора и пика-спецификатора суммировали как площадь общего хроматографического пика, технические повторения усредняли для отображения одной точки на графике для каждой концентрационной точки.5. The maximum deviation of the peak retention time was selected as ± 1 minute from the point at the top of the peak retention time. Peak smoothing was not used, the initial function of the dependence of the peak area on the concentration of the peptide as linear without taking into account the zero point of concentration. The areas of the quantifier peak and specifier peak were summed as the area of the total chromatographic peak, technical repetitions were averaged to display one point on the graph for each concentration point.
6. Используя данные параметры в программе Mass Hunter Quantitative Analysis B05.00 строили калибровочные кривые зависимости интенсивности масс-спектрометрического сигнала пептида от его концентрации. При этом параметр достоверности линейной аппроксимации должен быть не менее 0,8, а среднеквадратичное отклонение площади пика для трех повторных измерений и отклонение расчетной концентрации калибровочного раствора от истинной не должно превышать 20%.6. Using these parameters in the Mass Hunter Quantitative Analysis B05.00 program, we constructed calibration curves for the intensity of the peptide mass spectrometric signal versus its concentration. In this case, the reliability parameter of the linear approximation should be at least 0.8, and the standard deviation of the peak area for three repeated measurements and the deviation of the calculated concentration of the calibration solution from the true should not exceed 20%.
Полученную калибровочную кривую использовали для расчета концентрации маркерного пептида целевого белка после его ферментативного гидролитического расщепления. В настоящем примере анализ проводили на 3 образцах гомогената печени человека и 3 образцах плазмы крови человека.The obtained calibration curve was used to calculate the concentration of the marker peptide of the target protein after its enzymatic hydrolytic cleavage. In the present example, analysis was performed on 3 samples of human liver homogenate and 3 samples of human blood plasma.
Параметры калибровочной кривой и результаты анализа в 6 биологических образцах представлены в таблице 8, а сама калибровочная кривая - на фиг.4.The parameters of the calibration curve and the results of the analysis in 6 biological samples are presented in table 8, and the calibration curve itself is shown in figure 4.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147933A RU2673551C2 (en) | 2012-11-12 | 2012-11-12 | Proteotypic peptide q9y4w6-02 and method of spectrometric analysis of the content of afg3-like human protein on its basis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147933A RU2673551C2 (en) | 2012-11-12 | 2012-11-12 | Proteotypic peptide q9y4w6-02 and method of spectrometric analysis of the content of afg3-like human protein on its basis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012147933A RU2012147933A (en) | 2014-05-20 |
| RU2673551C2 true RU2673551C2 (en) | 2018-11-28 |
Family
ID=50695470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012147933A RU2673551C2 (en) | 2012-11-12 | 2012-11-12 | Proteotypic peptide q9y4w6-02 and method of spectrometric analysis of the content of afg3-like human protein on its basis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2673551C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2748540C1 (en) * | 2021-02-08 | 2021-05-26 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Сколковский институт науки и технологий" | Method for detecting sars-cov-2 virus by mass spectrometry |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6017693A (en) * | 1994-03-14 | 2000-01-25 | University Of Washington | Identification of nucleotides, amino acids, or carbohydrates by mass spectrometry |
| WO2009003694A2 (en) * | 2007-07-03 | 2009-01-08 | Andreas Reichert | Method for treating diseases related to mitochondrial dysfunction |
| GB2451963A (en) * | 2005-11-23 | 2009-02-18 | Micromass Ltd | A method of mass spectrometry suitable for the identification of peptide ions |
| EP2044443A2 (en) * | 2006-07-03 | 2009-04-08 | The Johns Hopkins University | Peptide antibody depletion and its application to mass spectrometry sample preparation |
-
2012
- 2012-11-12 RU RU2012147933A patent/RU2673551C2/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6017693A (en) * | 1994-03-14 | 2000-01-25 | University Of Washington | Identification of nucleotides, amino acids, or carbohydrates by mass spectrometry |
| GB2451963A (en) * | 2005-11-23 | 2009-02-18 | Micromass Ltd | A method of mass spectrometry suitable for the identification of peptide ions |
| EP2044443A2 (en) * | 2006-07-03 | 2009-04-08 | The Johns Hopkins University | Peptide antibody depletion and its application to mass spectrometry sample preparation |
| WO2009003694A2 (en) * | 2007-07-03 | 2009-01-08 | Andreas Reichert | Method for treating diseases related to mitochondrial dysfunction |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КОВАЛЕВА О.В. Протеолитические ферменты и ингибиторы протеиназ из растений и их влияние на пищеварительные протеиназы позвоночных животных, автор. ктн, Краснодар, 1998, стр. 10, найдено 12.07.2017 в Интернете [on-line] на сайте https://earthpapers.net/proteoliticheskie-fermenty-i-ingibitory-proteinaz-iz-rasteniy-i-ih-vliyanie-na-pischevaritelnye-proteinazy-pozvonochnyh-z#ixzz4mbxjqHoi. UniProtKB, Q9Y4W6 (AFG32_HUMAN), 27.04.2001, найдено 12.07.2017 в Интернете [on-line] на сайте https://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y4W6. Система трехквадрупольного ГХ-МС Agilent серии 7000, Agilent Technologies, Inc. 2011, найдено 12.07.2017 в Интернете [on-line] на сайте https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/7000_QQQConceptsGuide-RU.pdf. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2748540C1 (en) * | 2021-02-08 | 2021-05-26 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Сколковский институт науки и технологий" | Method for detecting sars-cov-2 virus by mass spectrometry |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012147933A (en) | 2014-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rozanova et al. | Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview | |
| Good et al. | Naturally occurring human urinary peptides for use in diagnosis of chronic kidney disease | |
| Gallien et al. | Selected reaction monitoring applied to proteomics | |
| Guerrera et al. | Application of mass spectrometry in proteomics | |
| Zhang et al. | Methods for peptide and protein quantitation by liquid chromatography-multiple reaction monitoring mass spectrometry | |
| Anderson et al. | Precision of heavy–light peptide ratios measured by MALDI-TOF mass spectrometry | |
| CA2680373C (en) | Mass spectrometric quantitation | |
| JP5199101B2 (en) | Methods for developing biomolecule assays | |
| US11467167B2 (en) | SRM methods in Alzheimer's disease and neurological disease assays | |
| Beasley-Green | Urine proteomics in the era of mass spectrometry | |
| JP2011501133A (en) | Method for detecting major cardiovascular or cerebrovascular adverse events | |
| JP2009540319A (en) | Mass spectrometry biomarker assay | |
| JP2011501133A5 (en) | ||
| Chiou et al. | Clinical proteomics: current status, challenges, and future perspectives | |
| Gao et al. | Protein analysis by shotgun proteomics | |
| Liao et al. | Shotgun proteomics in neuroscience | |
| Fuller et al. | Quantitative proteomics using iTRAQ labeling and mass spectrometry | |
| Gulcicek et al. | Proteomics and the analysis of proteomic data: an overview of current protein‐profiling technologies | |
| Trevisiol et al. | The use of proteases complementary to trypsin to probe isoforms and modifications | |
| JP2006510875A (en) | Constellation mapping and their use | |
| US20140051105A1 (en) | Mutant Proteins as Cancer-Specific Biomarkers | |
| RU2673551C2 (en) | Proteotypic peptide q9y4w6-02 and method of spectrometric analysis of the content of afg3-like human protein on its basis | |
| Kinter et al. | Application of selected reaction monitoring to highly multiplexed targeted quantitative proteomics | |
| US20160209412A1 (en) | Msia-srm assay for biomarker analysis | |
| Hossain et al. | Selected reaction monitoring mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA93 | Acknowledgement of application withdrawn (no request for examination) |
Effective date: 20151113 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20160801 |
|
| HE9A | Changing address for correspondence with an applicant |