RU2639533C2 - Monoclonal antibody, binding with ebola virus glycoprotein, dna fragments coding this antibody, and antigen-binding fragment - Google Patents
Monoclonal antibody, binding with ebola virus glycoprotein, dna fragments coding this antibody, and antigen-binding fragment Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639533C2 RU2639533C2 RU2015157143A RU2015157143A RU2639533C2 RU 2639533 C2 RU2639533 C2 RU 2639533C2 RU 2015157143 A RU2015157143 A RU 2015157143A RU 2015157143 A RU2015157143 A RU 2015157143A RU 2639533 C2 RU2639533 C2 RU 2639533C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- ebola virus
- seq
- antigen
- binding
- Prior art date
Links
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 title claims abstract description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 22
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 abstract description 6
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 6
- 101000944608 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010088468 Ebola virus envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)-2,2,6,6-tetramethylcyclohex-3-en-1-amine Chemical compound CC1(C)C(N)C(C)(C)CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 ZBQCCTCQUCOXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000030820 Ebola disease Diseases 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 208000007136 Filoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 241001115400 Zaire ebolavirus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- -1 activated biotin ester Chemical class 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к биотехнологии и биохимии, а именно к получению моноклонального антитела, связывающегося с гликопротеином вируса Эбола.The invention relates to biotechnology and biochemistry, in particular to the production of a monoclonal antibody that binds to the Ebola virus glycoprotein.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Впервые вирус Эбола (EBOV) появился в 1976 г. в Судане и Демократической республике Конго (в то время - Заир). Первоначальные вспышки не были массовыми, но привлекли к себе внимание из-за высокого уровня смертности, доходящего до 90%. Новый вариант вируса Эбола появился весной 2014 г. в Гвинее, где ранее такого заболевания не наблюдалось (Baize S., Pannetier D., Oestereich L. et al. Emergence of Zaire Ebola virus disease in Guinea // N. Engl. J. Med. 2014. Vol. 371. N15. P. 1418-1425). Несмотря на усилия международных организаций, эпидемия лихорадки Эбола распространилась на Сьерра-Леоне, Либерию и Нигерию.The Ebola virus (EBOV) first appeared in 1976 in the Sudan and the Democratic Republic of the Congo (at that time, Zaire). The initial outbreaks were not massive, but attracted attention due to the high mortality rate reaching up to 90%. A new variant of the Ebola virus appeared in the spring of 2014 in Guinea, where no such disease had previously been observed (Baize S., Pannetier D., Oestereich L. et al. Emergence of Zaire Ebola virus disease in Guinea // N. Engl. J. Med . 2014. Vol. 371. N15. P. 1418-1425). Despite the efforts of international organizations, the Ebola epidemic has spread to Sierra Leone, Liberia and Nigeria.
В течение последних 10 лет было предложено несколько подходов для лечения лихорадки Эбола. Внутривенное введение ингибиторов коагуляции крови, таких как рекомбинантный человеческий активированный белок С (Geisbert Т.W., Young Н.А., Jahrling Р.В., Davis K.J., Kagan Е., Hensley L.Е. Mechanisms underlying coagulation abnormalities in ebola hemorrhagic fever: overexpression of tissue factor in primate monocytes/macrophages is a key event // J. Infect. Dis. 2003. Vol. 188. N11. P. 1618-1629), повышает выживаемость на 18%. Другим подходом является использование синтетических антисмысловых аналогов олигонуклеотидов, образующих дуплексы со специфическими РНК вирусов (Geisbert Т.W., Hensley L.Е., Jahrling Р.В., Larsen Т., Geisbert J.В., Paragas J., Young H.A., Fredeking Т.M., Rote W.E., Vlasuk G.P. Treatment of Ebola virus infection with a recombinant inhibitor of factor VIIa/tissue factor: a study in rhesus monkeys // Lancet. 2003. Vol. 362. N9400. P. 1953-1958). Внутривенное введение малых интерферирующих РНК привело к повышению выживаемости в интервале от 66% до 100% в зависимости от количества инъекций (Warren Т.K., Warfield K.L., Wells J., Swenson D.L., Donner K.S., Van Tongeren S.A., Garza N.L., Dong L., Mourich D.V., Crumley S., Nichols D.K., Iversen P.L., Bavari S. Advanced antisense therapies for postexposure protection against lethal filovirus infections // Nat. Med. 2010. Vol. 16. N9. P. 991-994). Однако необходимо подчеркнуть, что все вышеописанные методы требуют начала лечения в течение первых 30-60 мин от момента заражения.Over the past 10 years, several approaches have been proposed for the treatment of Ebola. Intravenous administration of blood coagulation inhibitors, such as recombinant human activated protein C (Geisbert T.W., Young N.A., Jahrling R.V., Davis KJ, Kagan E., Hensley L.E. Mechanisms underlying coagulation abnormalities in ebola hemorrhagic fever: overexpression of tissue factor in primate monocytes / macrophages is a key event // J. Infect. Dis. 2003. Vol. 188. N11. P. 1618-1629), increases survival by 18%. Another approach is the use of synthetic antisense analogues of oligonucleotides that form duplexes with specific RNA viruses (Geisbert T.W., Hensley L.E., Jahrling R.V., Larsen T., Geisbert J. B., Paragas J., Young HA , Fredeking T.M., Rote WE, Vlasuk GP Treatment of Ebola virus infection with a recombinant inhibitor of factor VIIa / tissue factor: a study in rhesus monkeys // Lancet. 2003. Vol. 362. N9400. P. 1953-1958 ) Intravenous administration of small interfering RNAs resulted in increased survival rates ranging from 66% to 100% depending on the number of injections (Warren T.K., Warfield KL, Wells J., Swenson DL, Donner KS, Van Tongeren SA, Garza NL, Dong L., Mourich DV, Crumley S., Nichols DK, Iversen PL, Bavari S. Advanced antisense therapies for postexposure protection against lethal filovirus infections // Nat. Med. 2010. Vol. 16. N9. P. 991-994). However, it must be emphasized that all the above methods require the start of treatment within the first 30-60 minutes from the moment of infection.
Разработка средств антителотерапии в отношении вируса Эбола проводится с 1990-х годов. Из 8 белков вируса ключевой мишенью для средств иммунотерапии является вирусный гликопротеин (GP), являющийся решающим фактором патогенности. Этот белок находится на поверхности вирусного капсида и служит для прикрепления вируса и слияния с мембраной. GP подвергается пост-трансляционному расщеплению и образует две субъединицы, связанные дисульфидной связью: GP1 и GP2. Субъединица GP1 отвечает за прикрепление вируса к клеткам хозяина, a GP2 влияет на слияние мембран вируса и клетки (Volchkov V.E., Feldmann Н., Volchkova V.A., & Klenk H.D. Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. N10. P. 5762-5767). GP является центральным компонентом вакцин, а также мишенью для нейтрализующих антител и ингибиторов присоединения и слияния (Lee J E, Saphire Е О. Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry // Future Virol. 2009. Vol. 4. N6. P. 621-635).The development of antibody therapy for the Ebola virus has been under way since the 1990s. Of the 8 proteins of the virus, the key target for immunotherapy is viral glycoprotein (GP), which is a decisive factor in pathogenicity. This protein is located on the surface of the viral capsid and serves to attach the virus and fuse with the membrane. GP undergoes post-translational cleavage and forms two subunits linked by a disulfide bond: GP1 and GP2. The GP1 subunit is responsible for the attachment of the virus to the host cells, and GP2 affects the fusion of the virus and cell membranes (Volchkov VE, Feldmann N., Volchkova VA, & Klenk HD Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. N10. P. 5762-5767). GP is a central component of vaccines, as well as a target for neutralizing antibodies and inhibitors of addition and fusion (Lee JE, Saphire E O. Ebolavirus glycoprotein structure and mechanism of entry // Future Virol. 2009. Vol. 4. N6. P. 621-635 )
Вместе с тем, в опытах на приматах было показано, что в отличие от использования различных неспецифических средств антивирусной терапии пассивная иммунизация антителами позволяет добиться терапевтического эффекта при введении через 24 ч после инфицирования [Olinger G.G., Pettitt J., Kim D. et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. Vol. 109. N44. P. 18030-18035; Qiu X., Audet J., Wong G. et al. Successful treatment of Ebola virus-infected cynomolgus macaques with monoclonal antibodies // Sci. Transl. Med. 2012. Vol. 4. N138. P. 138ra81).However, in experiments on primates, it was shown that, in contrast to the use of various non-specific antiviral therapy, passive immunization with antibodies allows to achieve a therapeutic effect when administered 24 hours after infection [Olinger G.G., Pettitt J., Kim D. et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012. Vol. 109. N44. P. 18030-18035; Qiu X., Audet J., Wong G. et al. Successful treatment of Ebola virus-infected cynomolgus macaques with monoclonal antibodies // Sci. Transl. Med. 2012. Vol. 4. N138. P. 138ra81).
Известны моноклональные антитела к гликопротеину вируса Эбола (US 6,630,144 В1), характеризующиеся уникальной аминокислотной последовательностью и тем, что они нейтрализуют вирус Эбола и связываются с эпитопами гликопротеина.Monoclonal antibodies to the Ebola virus glycoprotein are known (US 6,630,144 B1), characterized by a unique amino acid sequence and in that they neutralize the Ebola virus and bind to glycoprotein epitopes.
Известны моноклональные антитела к гликопротеину вируса Эбола и их антиген-связывающие фрагменты (WO 2015/127136 А2), характеризующиеся уникальной аминокислотной последовательностью. Описаны 7 антител, из которых CAN9G1 узнает муциновый домен гликопротеина вируса Эбола и обладает выраженным защитным эффектом на летальной мышиной модели.Monoclonal antibodies to the Ebola virus glycoprotein are known and their antigen-binding fragments (WO 2015/127136 A2), characterized by a unique amino acid sequence. 7 antibodies are described, of which CAN9G1 recognizes the mucin domain of the Ebola virus glycoprotein and has a pronounced protective effect on the lethal mouse model.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей настоящего изобретения было получение моноклонального антитела, способного к связыванию с гликопротеином вируса Эбола и отличающегося по аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей от известных из предшествующего уровня техники моноклональных антител к белкам вируса Эбола. А также получение изолированных фрагментов ДНК, кодирующих участки легкой и тяжелой цепи указанного антитела и антигенсвязывающего фрагмента указанного моноклонального антитела.An object of the present invention was to provide a monoclonal antibody capable of binding to Ebola glycoprotein and differing in amino acid sequence of the light and heavy chain variable domains from monoclonal antibodies to Ebola virus proteins known from the prior art. As well as obtaining isolated DNA fragments encoding sections of the light and heavy chains of the indicated antibodies and antigen-binding fragments of the specified monoclonal antibodies.
Техническим результатом является получение нового моноклонального антитела мыши IgG1-изотипа, способного к связыванию с гликопротеином вируса Эбола и характеризующегося константой диссоциации комплекса антиген-антитело 1,8 нМ.The technical result is to obtain a new monoclonal mouse antibody of the IgG1 isotype capable of binding to the Ebola glycoprotein and characterized by a dissociation constant of 1.8 nM antigen-antibody complex.
Также техническим результатом является расширение арсенала средств аналогичного назначения, а именно получение нового моноклонального антитела к белкам вируса Эбола.Also the technical result is the expansion of the arsenal of funds for similar purposes, namely the receipt of a new monoclonal antibody to Ebola virus proteins.
Поставленная задача решается получением моноклонального антитела, селективно связывающего гликопротеин вируса Эбола, включающего вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, а вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержит последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.The problem is solved by obtaining a monoclonal antibody that selectively binds the Ebola virus glycoprotein, including the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody containing an amino acid sequence of at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and the variable region of the light chain (VL) of the specified the antibody contains an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2.
Поставленная задача решается также тем, что установлен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VH указанного антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.The problem is also solved by the fact that installed an isolated DNA fragment encoding the VH of the indicated antibodies with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
Поставленная задача решается также тем, что получен изолированный фрагмент ДНК, кодирующий VL указанного антитела с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4.The problem is also solved by the fact that the obtained isolated DNA fragment encoding the VL of the indicated antibodies with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
Поставленная задача решается также тем, что получен антигенсвязывающий фрагмент указанного моноклонального антитела, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1 (фиг. 1), и вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела с последовательностью аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2 (фиг. 1).The problem is also solved by the fact that the obtained antigen-binding fragment of the indicated monoclonal antibodies containing the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibodies with an amino acid sequence of at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1 (Fig. 1), and the variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody with an amino acid sequence not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2 (Fig. 1).
Моноклональное антитело, селективно связывающее гликопротеин вируса Эбола, настоящего изобретения характеризуется тем, что вариабельный участок тяжелой цепи (VH) указанного антитела содержит:A monoclonal antibody that selectively binds the Ebola virus glycoprotein of the present invention is characterized in that the variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody contains:
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот GYTFTSYV из SEQ ID NO: 1;(i) CDR1 with the amino acid sequence GYTFTSYV of SEQ ID NO: 1;
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот INPYNDGT из SEQ ID NO: 1;(ii) CDR2 with the amino acid sequence INPYNDGT from SEQ ID NO: 1;
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот ARGRGHYYAYVFDY из SEQ ID NO: 1.(iii) CDR3 with the amino acid sequence ARGRGHYYAYVFDY of SEQ ID NO: 1.
При этом вариабельный участок легкой цепи (VL) указанного антитела содержитMoreover, the variable region of the light chain (VL) of the indicated antibody contains
(i) CDR1 с последовательностью аминокислот SSVSY из SEQ ID NO: 2;(i) CDR1 with the SSVSY amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(ii) CDR2 с последовательностью аминокислот DTS из SEQ ID NO: 2;(ii) CDR2 with the DTS amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(iii) CDR3 с последовательностью аминокислот QQWSSNPPT из SEQ ID NO: 2.(iii) CDR3 with the amino acid sequence QQWSSNPPT from SEQ ID NO: 2.
Моноклональное антитело получено путем иммунизации мышей Balb/C конъюгатом рекомбинантного GP вируса Эбола с микобактериальным белком теплового шока HSP65, получением и селекцией линий гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантному GP вируса Эбола, анализа аффинности и специфичности отобранного МоАт, определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности его вариабельных доменов.A monoclonal antibody was obtained by immunizing Balb / C mice with a conjugate of recombinant Ebola virus GP with mycobacterial heat shock protein HSP65, obtaining and selection of hybridoma lines producing monoclonal antibodies to recombinant Ebola virus GP, analysis of the affinity and specificity of its selected MoAb amino acid sequence, and its determination domains.
Антитела обычно состоят из двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфидными связями, и легких цепей, ассоциированных с N-концом каждой из тяжелых цепей. Каждая тяжелая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Каждая легкая цепь содержит на N-конце вариабельный домен с константным доменом на другом конце. Вариабельные домены каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий участок. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей обладают похожей общей структурой, и каждый домен включает каркас из четырех участков, последовательности которых являются относительно консервативными, связанных посредством трех участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs). Четыре каркасных участка формируют конформацию типа бета-складчатого слоя. Участки CDRs расположены в близком соседстве друг с другом благодаря каркасным участкам и вносят вклад в образование антигенсвязывающего участка. Участки CDRs и каркасные участки антител могут быть определены путем ссылки на нумерационную систему Кабата (Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) в сочетании с данными рентгеноструктурного анализа, как указано в заявке WO 91/09967. Участки CDRs и каркасные участки антител могут также быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).Antibodies usually consist of two heavy chains linked together by disulfide bonds, and light chains associated with the N-terminus of each of the heavy chains. Each heavy chain contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain at the other end. Each light chain contains at the N-terminus a variable domain with a constant domain at the other end. The variable domains of each pair of light and heavy chains form an antigen-binding site. The variable domains of light and heavy chains have a similar overall structure, and each domain includes a framework of four regions, the sequences of which are relatively conservative, linked through three regions that define complementarity (complementarity determining regions, CDRs). Four frame sections form a beta-fold type conformation. Plots of CDRs are located in close proximity to each other due to the skeleton plots and contribute to the formation of antigen-binding plot. Plots of CDRs and frame regions of antibodies can be determined by reference to the Kabat numbering system (Kabat numbering system, Kabat et al., 1987 "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office) in combined with X-ray diffraction analysis data, as described in WO 91/09967. Plots of CDRs and frame regions of antibodies can also be determined by the nomenclature of the International Immunogenetics Information System, www.imgt.org.
Для получения антитела, которое может связываться с каким-либо специфическим антигеном, обычно используют методику Kohler и Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256:495-497). Моноклональные антитела получают путем слияния клеток селезенки из иммунизированного животного и клеток миеломы с получением гибридомы. Гибридомы могут быть проверены на способность к продукции нужного антитела, затем гибридомы могут быть выращены, из них могут быть выделены указанные антитела. Термин «выращенные клетки», использованный здесь, означает гибридомы или другие линии клеток, которые производят антитела. Методы получения и проверки таких выращенных клеток описаны Harlow и др. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988). Получение материала, использующегося в качестве антигена, для инъекции животных включают в себя методики, хорошо известные из уровня техники, например использование полноразмерного белка, использование пептида, выбранного из иммуногенных участков белка, а также любыми другими методами, известными из уровня техники. Смотри Harlow и др. (см. выше).Kohler and Milstein (Kohler et al., (1976) Nature 256: 495-497) are usually used to produce antibodies that can bind to any specific antigen. Monoclonal antibodies are obtained by fusion of spleen cells from an immunized animal and myeloma cells to produce a hybridoma. Hybridomas can be tested for the ability to produce the desired antibody, then hybridomas can be grown, and these antibodies can be isolated. The term "grown cells", as used here, means hybridomas or other cell lines that produce antibodies. Methods for obtaining and testing such grown cells are described by Harlow et al. (Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1988). The preparation of material used as an antigen for injection of animals includes techniques well known in the art, for example using a full-sized protein, using a peptide selected from immunogenic regions of the protein, as well as any other methods known in the art. See Harlow et al. (See above).
Подходящий способ для выделения антител, эффективных для использования в рамках настоящего изобретения, включает (a) назначение животному эффективного количества белка или пептида с целью получения антител, (b) выделение указанных антител, (c) определение последовательности антител.A suitable method for isolating antibodies effective for use in the framework of the present invention includes (a) administering to the animal an effective amount of a protein or peptide to produce antibodies, (b) isolating said antibodies, (c) determining the sequence of antibodies.
Для повышения эффективности иммунизации и качества получаемых моноклональных антител был получен иммуноконъюгат рекомбинантного гликопротеина вируса Эбола GP и микобактериального белка теплового шока HSP65.To increase the efficiency of immunization and the quality of the obtained monoclonal antibodies, a recombinant Ebola GP glycoprotein immunoconjugate and mycobacterial heat shock protein HSP65 were obtained.
Затем провели иммунизацию мышей Balb/c полученным конъюгатом по двум вариантам - в подушечки задних лапок и внутрибрюшинно. Полученные лимфоциты гибридизовали с клетками миеломы SP2/0. Тестирование супернатантов гибридом проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием биотинилированного GP. Все первичные культуры, показавшие активность в ИФА, были клонированы методом предельных разведений. Были отобраны группы клонов - потомков одной первичной культуры. Клетки каждого из субклонов были наработаны в культуре в количестве, достаточном для получения асцитных жидкостей. Моноклональные антитела, выделенные из асцитной жидкости, сравнивали методом непрямого ИФА, по результатам которого было отобрано антитело GPE118.Then immunized Balb / c mice with the resulting conjugate in two ways - in the pads of the hind legs and intraperitoneally. The resulting lymphocytes hybridized with SP2 / 0 myeloma cells. Hybridoma supernatants were tested by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using biotinylated GP. All primary cultures that showed activity in ELISA were cloned using the limiting dilution method. Groups of clones, descendants of one primary culture, were selected. The cells of each of the subclones were accumulated in culture in an amount sufficient to produce ascites fluids. Monoclonal antibodies isolated from ascites fluid were compared by indirect ELISA, which resulted in the selection of the GPE118 antibody.
Затем определяли субизотип полученного антитела, оценивали специфичность и иммунореактивность полученного антитела методом иммуноблоттинга и ИФА с биотинилированным антигеном в растворе. Была определена константа диссоциации моноклонального антитела GPE118.Then, the subisotype of the obtained antibody was determined, the specificity and immunoreactivity of the obtained antibody were evaluated by immunoblotting and ELISA with a biotinylated antigen in solution. The dissociation constant of the monoclonal antibody GPE118 was determined.
Далее клонировали и секвенировали последовательности кДНК, кодирующих вариабельные домены мышиного антитела GPE118 к гликопротеину вируса Эбола. Для этого была выделена суммарная РНК из клеток гибридом, проведена реакция обратной транскрипции-амплификации. Полученные фрагменты ДНК клонировали и секвенировали. Результаты секвенирования ДНК различных клонов сравнивали между собой и с базами данных GeneBank (IgBlast). В результате были найдены нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 3 (фиг. 1) и SEQ ID NO: 4 (фиг. 1), на основании которых была определены аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 вариабельных доменов указанного антитела. Участки CDRs были определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).Next, cloned and sequenced cDNA sequences encoding the variable domains of the murine anti-Ebola virus glycoprotein GPE118 antibody. For this, total RNA was isolated from hybridoma cells, and a reverse transcription-amplification reaction was performed. The resulting DNA fragments were cloned and sequenced. The DNA sequencing results of various clones were compared with each other and with GeneBank (IgBlast) databases. As a result, the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 (Fig. 1) and SEQ ID NO: 4 (Fig. 1) were found, based on which the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of the variable domains of the indicated antibody were determined . Plots of CDRs were identified by the nomenclature of the International Immunogenetics Information System, www.imgt.org.
В частности, антителом согласно настоящему изобретению является моноклональное антитело, обладающее способностью к связыванию рекомбинантного гликопротеина вируса Эбола.In particular, the antibody of the present invention is a monoclonal antibody having the ability to bind a recombinant Ebola glycoprotein.
Таким антителом является антитело, содержащее последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, в качестве вариабельного участка тяжелой цепи (VH) указанного антитела, последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2, в качестве вариабельного участка легкой цепи (VL) указанного антитела, и консервативные участки обеих цепей, необходимых для функционирования указанного антитела. Такое новое гуманизированное антитело селективно связывается с гликопротеином вируса Эбола. Консервативные участки тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG, IgM, IgA, IgD или IgE могут быть использованы в качестве консервативных участков для тяжелой цепи согласно настоящему изобретению. Консервативные участки легкой цепи человеческого иммуноглобулина каппа или лямбда могут быть использованы в качестве консервативных участков для легкой цепи антитела согласно настоящему изобретению.Such an antibody is an antibody containing an amino acid sequence that is not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 1, as a variable region of the heavy chain (VH) of the indicated antibody, an amino acid sequence that is not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2, as a variable region of the light chain (VL) of the indicated antibodies, and conservative sections of both chains necessary for the functioning of the specified antibodies. Such a new humanized antibody selectively binds to the Ebola virus glycoprotein. Conservative sections of the heavy chain of the human immunoglobulin IgG, IgM, IgA, IgD or IgE can be used as conservative sections for the heavy chain according to the present invention. Conservative regions of the light chain of the human immunoglobulin kappa or lambda can be used as conservative regions for the light chain of an antibody of the present invention.
В настоящем изобретении термин "антитело" использован для описания иммуноглобулинов или их фрагментов, мономеров или димеров легкой цепи или тяжелой цепи, одноцепочечных антител, таких как одноцепочечные антитела Fv's, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером, а также как природных, так и полученных методами рекомбинантных ДНК или другим образом, при условии, что антитело содержит по крайней мере один антигенсвязывающий участок. Остальная часть антитела не должна обязательно включать только последовательность, производную от иммуноглобулина. Например, может быть сконструирован ген, в котором часть цепи, последовательность ДНК, кодирующая часть цепи человеческого иммуноглобулина, соединена с последовательностью ДНК, кодирующей последовательность аминокислот полипептида эффектора или молекулы-репортера. Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми каркасными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от аминотерминального конца к карбокситерминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.In the present invention, the term "antibody" is used to describe immunoglobulins or fragments thereof, monomers or dimers of a light chain or heavy chain, single chain antibodies, such as Fv's single chain antibodies, in which the variable domains of the heavy and light chains are connected by a peptide linker, as well as natural, and obtained by recombinant DNA methods or in another way, provided that the antibody contains at least one antigen binding site. The rest of the antibody does not need to include only the sequence derived from immunoglobulin. For example, a gene can be constructed in which a part of a chain, a DNA sequence encoding a part of a chain of human immunoglobulin, is connected to a DNA sequence encoding the amino acid sequence of an effector polypeptide or reporter molecule. As used herein, the term “antibody” is intended to refer to immunoglobulin molecules composed of four polypeptide chains, with two heavy (H) chains and two light (L) chains linking to each other by disulfide bonds. Each heavy chain contains a variable region of the heavy chain (abbreviated herein as VH) and a constant region of the heavy chain. The constant region of the heavy chain consists of three domains: CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a variable region of the light chain (abbreviated herein as VL) and a constant region of the light chain. The constant region of the light chain consists of one domain: CL. The VH and VL regions can be further subdivided into hypervariability regions, which are called complementarity determining regions (CDRs), interspersed by regions with a higher level of conservatism, called framework regions (FR). Each VH and VL region is formed by three CDRs and four FRs, located from the amino terminal end to the carboxy terminal end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
В настоящем изобретении фраза "антитело, обладающее способностью к связыванию с рекомбинантным GP вируса Эбола», означает молекулу, которая связывается с GP и образует стабильный комплекс. Способность антитела к связыванию с антигеном может быть определена специалистом в данной области с использованием методов, включающих, но не ограничивающихся методом иммуноферментного анализа (ИФА), равновесным диализом, с использованием плазмон-поверхностного резонанса. Методы определения аффинности хорошо известны специалисту в данной области техники, подробно описаны Janeway и др. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).In the present invention, the phrase “antibody having the ability to bind to the recombinant GP of the Ebola virus” means a molecule that binds to the GP and forms a stable complex. The ability of an antibody to bind to an antigen can be determined by a person skilled in the art using methods including, but not limited to enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), equilibrium dialysis, using plasmon-surface resonance. Methods for determining affinity are well known to the person skilled in the art nicknames described in detail by Janeway et al. (Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Garland Publishing Company, 1996)).
Изолированным фрагментом ДНК, кодирующим антитело, согласно настоящему изобретению является фрагмент ДНК, кодирующий вариабельные легкую или тяжелую цепи моноклонального антитела, селективно связывающего гликопротеин вируса Эбола, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, и последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.An isolated DNA fragment encoding an antibody according to the present invention is a DNA fragment encoding the variable light or heavy chains of a monoclonal antibody that selectively binds an Ebola virus glycoprotein containing an amino acid sequence of at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence, not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2.
Ввиду вырожденности трансляционного кода могут быть различия в последовательности ДНК. Фрагменты ДНК согласно настоящему изобретению не ограничены фрагментами, показанными в SEQ ID NO: 3 или 4, при условии, что они кодируют участки цепей антитела, содержащего последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1, и последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2.Due to the degeneracy of the translation code, there may be differences in the DNA sequence. The DNA fragments of the present invention are not limited to the fragments shown in SEQ ID NO: 3 or 4, provided that they encode portions of the antibody chains containing an amino acid sequence of at least 90% homologous to SEQ ID NO: 1, and an amino acid sequence, not less than 90% homologous to SEQ ID NO: 2.
Используемый в настоящем документе термин «антигенсвязывающая область» антитела обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антигенсвязывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) отдельная определяющая комплементарность область (CDR). Более того, несмотря на то, что два домена в фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антигенсвязывающая область» антитела.As used herein, the term “antigen binding region” of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen. Examples of binding fragments included in the term “antigen binding region” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab ′) 2 fragment, a bivalent fragment consisting of two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single region of an antibody; (v) a dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546) consisting of the VH domain; and (vi) a separate complementarity determining region (CDR). Moreover, despite the fact that the two domains in the Fv, VL, and VH fragments are encoded by different genes, they can be combined using recombinant technologies using a synthetic linker that allows them to construct a single protein chain in which the VL and VH regions bind to the formation of monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 5879-5883). Such single chain antibodies are also included within the scope of the term “antigen binding region” of an antibody.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На Фиг. 1 показаны аминокислотные (SEQ ID NO: 1 и 2) и нуклеотидные (SEQ ID NO: 3 и 4) последовательности МоАт GPE118.In FIG. 1 shows the amino acid (SEQ ID NO: 1 and 2) and nucleotide (SEQ ID NO: 3 and 4) MoAt sequences of GPE118.
На Фиг. 2 показана гель-электрофореграмма МоАт GPE118 в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и β-меркаптоэтанола; М - белковые маркеры молекулярного веса, 1 - МоАт GPE118.In FIG. 2 shows a gel electrophoregram of MoAt GPE118 in a 10% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) and β-mercaptoethanol; M - protein markers of molecular weight, 1 - MoAt GPE118.
На Фиг. 3 показан иммуноблот рекомбинантного GP вируса Эбола, окрашенный с помощью МоАт GPE118; М - белковые маркеры молекулярного веса, 1 - МоАт GPE118; 2 - контрольное антитело Ru52; 3 - контроль антивидового пероксидазного конъюгата.In FIG. Figure 3 shows an immunoblot of recombinant GP Ebola virus stained with MoAt GPE118; M - molecular weight protein markers, 1 - MoAt GPE118; 2 - control antibody Ru52; 3 - control anti-species peroxidase conjugate.
На Фиг. 4 показано расположение участков CDRs в вариабельном домене легкой GPE118L и тяжелой GPE118H цепей МоАт GPE118. Участки CDRs подчеркнуты.In FIG. Figure 4 shows the location of CDRs in the variable domain of light GPE118L and heavy GPE118H MoAt chains of GPE118. Sites of CDRs are underlined.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки настоящего изобретения.The following examples are provided for purposes of explanation and do not in any way limit the scope of the present invention.
Ранее было показано, что конъюгирование рекомбинантных антигенов с микобактериальными белками теплового шока (M. tuberculosis HSP65) существенно повышает их иммуногенность, и в результате иммунизации мышей линии Balb/c позволяет получать высокоаффинные МоАт, направленные против эпитопов природных белков (Свешников П.Г., Малайцев В.В., Киселев В.И. Роль белков теплового шока в развитии реакций врожденного иммунитета, Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №5, 2007, стр. 108-117; Свешников П.Г., Малайцев В.В., Киселев В.И., Функции белков теплового шока в системе адаптивного иммунитета. Конструирование вакцин, Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, №6, 2007, стр. 96-106; P. Sveshnikov and V. Kiselev, "METHODS, KITS AND COMPOSITIONS FOR THE DEVELOPMENT AND USE OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO ANTIGENS OF LOW IMMUNOGENICITY", PCT/RU2004/000373, Filing date: 24.09.2004).Previously, it was shown that the conjugation of recombinant antigens with mycobacterial heat shock proteins (M. tuberculosis HSP65) significantly increases their immunogenicity, and as a result of immunization of Balb / c mice, it is possible to obtain high-affinity MoABs directed against epitopes of natural proteins (Sveshnikov P.G., Malaytsev VV, Kiselev VI The role of heat shock proteins in the development of innate immunity reactions, Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, No. 5, 2007, pp. 108-117; Sveshnikov PG, Malaytsev VV , Kiselev V.I., Thermal protein functions shock in the adaptive immunity system. Vaccine Construction, Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, No. 6, 2007, pp. 96-106; P. Sveshnikov and V. Kiselev, "METHODS, KITS AND COMPOSITIONS FOR THE DEVELOPMENT AND USE OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO ANTIGENS OF LOW IMMUNOGENICITY ", PCT / RU2004 / 000373, Filing date: 09.24.2004).
Пример 1. Получение мышиного моноклонального антитела против гликопротеина вируса ЭболаExample 1. Obtaining a mouse monoclonal antibody against Ebola glycoprotein
Для приготовления иммуноконъюгатов рекомбинантный гликопротеин вируса Эбола GP (IBT Bioservices, США) и HSP65 диализовали против 0.1М натрий фосфатного буфера pH 6.8 в течение ночи на холоду. Микобактериальный HSP65 активировали добавлением аденозиндифосфата в смеси с MgCl2 до концентрации 1 мМ и инкубировали при температуре 37°С 1 ч. Активированный HSP65 (150 мкг, 2 нмоль) добавляли к 50 мкг (0.8 нмоль) GP и инкубировали на шейкере с перемешиванием при комнатной температуре в течение 3 ч. Образовавшиеся комплексы фиксировали путем добавления глутарового альдегида до концентрации 0.05% (объем/объем) и инкубировали 30 мин при температуре 37°С. Останавливали реакцию добавлением глицина до концентрации 0,1 М. Инкубировали на шейкере при комнатной температуре 30 мин, а затем полученные конъюгаты переводили в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) при помощи диализа. Степень конъюгирования иммуногенов проверяли методом электрофореза в 10% SDS-PAGE.To prepare immunoconjugates, the recombinant Ebola GP glycoprotein GP (IBT Bioservices, USA) and HSP65 were dialyzed against 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.8 overnight in the cold. Mycobacterial HSP65 was activated by adding adenosine diphosphate mixed with MgCl 2 to a concentration of 1 mM and incubated at 37 ° C for 1 h. Activated HSP65 (150 μg, 2 nmol) was added to 50 μg (0.8 nmol) GP and incubated on a shaker with stirring at room temperature. temperature for 3 hours. The resulting complexes were fixed by adding glutaraldehyde to a concentration of 0.05% (v / v) and incubated for 30 min at 37 ° C. The reaction was stopped by adding glycine to a concentration of 0.1 M. It was incubated on a shaker at room temperature for 30 minutes, and then the resulting conjugates were transferred to phosphate-buffered saline (PBS) using dialysis. The degree of conjugation of immunogens was checked by electrophoresis in 10% SDS-PAGE.
Для иммунизации были взяты 2 двухмесячные мыши линии Balb/c. Одной из них вводили иммуноконъюгат HSP65-GP в подушечки задних лапок. Другой вводили иммуноконъюгат внутрибрюшинно. Иммуноген готовили следующим образом: по 20 мкг конъюгата на мышь доводили до объема 50 мкл с помощью ФСБ, затем добавляли равный объем адъюванта Фройнда и суспендировали до образования однородной эмульсии. Для первой иммунизации использовали полный адъювант Фройнда, для второй иммунизации, проводимой на 14 день по той же схеме, - неполный. Через два дня после второй иммунизации мыши, которым антиген вводился в подушечки лапок, были забиты, и спленоциты из подколенных лимфоузлов использованы для гибридизации с клетками мышиной миеломы. Финальная иммунизация оставшейся мыши была проведена через две недели после второй внутрибрюшинно конъюгатом HSP65-GP в ФСБ. Через два дня после заключительной иммунизации мыши были забиты для извлечения соответствующих клеток.For immunization, 2 two-month-old Balb / c mice were taken. One of them was injected immunoconjugate HSP65-GP in the pads of the hind legs. Another was given an immunoconjugate intraperitoneally. The immunogen was prepared as follows: 20 μg of conjugate per mouse was brought to a volume of 50 μl using PBS, then an equal volume of Freund's adjuvant was added and suspended until a homogeneous emulsion was formed. For the first immunization, Freund's complete adjuvant was used; for the second immunization, carried out on
Полученные лимфоциты гибридизовали с клетками миеломы SP2/0 по стандартной методике с использованием 50% ПЭГ 4000 (Kohler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. Vol. 256. N5517. P. 495-497). Клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты (по 6 планшетов на каждую гибридизацию) в ростовой среде DMEM с добавлением фетальной бычьей сыворотки до концентрации 8%, L-глутамина, пирувата, гентамицина, а также гипоксантина, тимидина и аминоптерина (HAT) в концентрациях, рекомендованных производителями добавок (полная селективная ростовая среда). Рост клеточных колоний оценивали визуально при помощи микроскопа. В большинстве лунок 96-луночных планшетов наблюдали рост 1-2 первичных культур на седьмой-десятый день после гибридизации. От каждой гибридизации было получено около 4000 НАТ-устойчивых первичных культур. Тестирование супернатантов гибридом проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием биотинилированного GP. Биотинилирование GP проводили при помощи активированного эфира биотина в соотношении биотин/GP в реакционной смеси равном 15:1.The obtained lymphocytes were hybridized with SP2 / 0 myeloma cells according to the standard method using 50% PEG 4000 (Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity // Nature. 1975. Vol. 256. N5517. P. 495-497). Cells were seeded in 96-well culture plates (6 plates for each hybridization) in DMEM growth medium supplemented with fetal bovine serum to a concentration of 8%, L-glutamine, pyruvate, gentamicin, as well as hypoxanthine, thymidine and aminopterin (HAT) in concentrations recommended by manufacturers of additives (complete selective growth medium). The growth of cell colonies was evaluated visually using a microscope. In most wells of 96-well plates, growth of 1-2 primary cultures was observed on the seventh to tenth day after hybridization. About 4,000 NAT-resistant primary cultures were obtained from each hybridization. Hybridoma supernatants were tested by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using biotinylated GP. GP biotinylation was carried out using activated biotin ester in the ratio of biotin / GP in the reaction mixture equal to 15: 1.
Моноклональные антитела нарабатывали в асцитных жидкостях мышей линии Balb/c. Асцитные жидкости получали введением 1 млн гибридомных клеток в перитонеальную полость мышей линии BALB/c. Мышам предварительно за неделю до введения клеток внутрибрюшинно вводили пристан по 0,5 мл на мышь. Через 11-14 сут после введения клеток собирали асцитную жидкость.Monoclonal antibodies were generated in ascites fluids of Balb / c mice. Ascitic fluid was obtained by introducing 1 million hybridoma cells into the peritoneal cavity of BALB / c mice. Mice were pre-injected with a 0.5 ml pristan per mouse intraperitoneally one week before the introduction of the cells. 11-14 days after the introduction of cells, ascites fluid was collected.
Результаты титрования в непрямом ИФА асцитов группы клонов, условно обозначенной GPE 1ХХ, представлены в Таблице 1. На основании полученных данных был отобран клон GPE118.The results of titration in indirect ELISA of ascites from a group of clones, conventionally designated GPE 1XX, are presented in Table 1. Based on the obtained data, clone GPE118 was selected.
Субизотип антитела определяли методом ИФА с использованием коммерческих антисывороток в соответствии с рекомендациями производителя (Набор для изотипирования Mouse Typer Isotyping Panel #1722055, Bio-Rad, США). Было установлено, что моноклональное антитело из клона гибридомы GPE118 относится к IgG1-изотипу. Одноименное антитело выделяли из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии на белок G-сефарозе (GE Healthcare, США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем,н и переводили диализом в ФСБ. Степень чистоты МоАт контролировали при помощи электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и β-меркаптоэтанола в ступенчатой буферной системе Лэммли (SDS-PAGE) (Фиг. 2), а также при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «AKTA explorer/purifier/basic» (GE Healthcare, США) в режиме гель-фильтрации с использованием колонки Superdex 200 (1×40 см). По данным электрофореза, в восстанавливающих условиях на геле присутствуют 2 полосы, соответствующие тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина мыши IgG1-изотипа.The antibody subisotype was determined by ELISA using commercial antisera in accordance with the manufacturer's recommendations (Mouse Typer Isotyping Panel # 1722055 Isotyping Kit # 1722055, Bio-Rad, USA). It was found that the monoclonal antibody from the clone of the hybridoma GPE118 belongs to the IgG1 isotype. The antibody of the same name was isolated from ascites fluid by affinity chromatography on G-Sepharose protein (GE Healthcare, USA) in accordance with the protocol recommended by the manufacturer, and transferred by dialysis to FSB. The purity of MoAt was monitored by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) and β-mercaptoethanol in stepwise Lemmli buffer system (SDS-PAGE) (Fig. 2), as well as by high performance liquid chromatography on a chromatograph "AKTA explorer / purifier / basic" (GE Healthcare, USA) in gel filtration mode using a Superdex 200 column (1 × 40 cm). According to electrophoresis, in reducing conditions, 2 bands are present on the gel, corresponding to the heavy and light chains of the mouse IgG1 immunoglobulin isotype.
Пример 2. Анализ мышиного моноклонального антитела против гликопротеина вируса Эбола.Example 2. Analysis of mouse monoclonal antibodies against Ebola glycoprotein.
Для определения специфичности и иммунореактивности мышиного МоАт против вируса Эболы изучали способность его связывания с антигеном в растворе с использованием биотинилированного GP вируса Эбола. Для этого в 96-луночный планшет с высокой связывающей способностью (Corning-Costar, Нидерланды, кат. номер 9018) сорбировали 5 мкг/мл мышиного МоАт GPE118 в ФСБ при 4°С в течение ночи. Планшет 5 раз промывали ФСБ с 0,05% Твин-20. Затем вносили конъюгат GP-биотин в ФСБ с 2% БСА в раститровке от 1 мкг/мл до 0,3 нг/мл, инкубировали 1 ч при 37°С, промывали 5 раз ФСБ с 0,05% Твин-20. Следующая стадия - инкубация с ЭкстрАвидин-пероксидазой в концентрации 0,15 мкг/мл (ФСБ, 2% БСА) в течение 1 ч при 37°С. Для проявления реакции лунки промывали 5 раз ФСБ с 0,05% Твин-20 и вносили по 100 мкл ТМБ субстрат (3,3,5,5-Тетраметил-бензидин), инкубировали 15 мин при комнатной температуре на шейкере. Реакцию останавливали 0,5 М H2SO4 и определяли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Результаты связывания МоАт GPE118 с биотинилированным GP вируса Эбола представлены в Таблице 2.To determine the specificity and immunoreactivity of mouse MoAB against the Ebola virus, the ability of its binding to the antigen in solution using the biotinylated GP Ebola virus was studied. For this, 5 μg / ml of mouse GPM118 MoAt was adsorbed into FSB at 4 ° C overnight in a 96-well plate with high binding capacity (Corning-Costar, Netherlands, Cat. No. 9018). The tablet was washed 5 times with PBS with 0.05% Tween-20. Then, the conjugate GP-Biotin was added to the FSB with 2% BSA in a culture of 1 μg / ml to 0.3 ng / ml, incubated for 1 h at 37 ° C, washed 5 times with FSB with 0.05% Tween-20. The next stage is incubation with ExtraAvidin-peroxidase at a concentration of 0.15 μg / ml (FSB, 2% BSA) for 1 h at 37 ° C. To manifest the reaction, the wells were washed 5 times with PBS with 0.05% Tween-20 and 100 μl TMB substrate (3,3,5,5-Tetramethyl-benzidine) was added, incubated for 15 min at room temperature on a shaker. The reaction was stopped with 0.5 M H 2 SO 4 and the absorbance was determined at a wavelength of 450 nm. The results of the binding of MoAt GPE118 to the biotinylated GP of the Ebola virus are presented in Table 2.
Исследование показало наличие специфического связывания GPE118 с GP в растворе.The study showed the presence of specific binding of GPE118 to GP in solution.
Для подтверждения специфичности полученного МоАт GPE118 использовали метод иммуноблоттинга. На первом этапе проводили электрофоретическое разделение антигена GP вируса Эбола в 12%-ном полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях. Затем осуществляли электрофоретический перенос (электроблоттинг) белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (Membrane filters cellulose nitrate; pore size 0,45 μm, S045A330R, Advantec MFS, Inc., США). Перенесенные белки выявляли на нитроцеллюлозной мембране с помощью непрямого ИФА (иммуноблот). Для этого мембрану блокировали раствором 5%-ного казеина в PBS в течение ночи при +4°С и трижды промывали буфером ФСБ, содержащим 0,05% Tween 20. Нитроцеллюлозную мембрану разрезали на полоски, помещали в раствор антител GPE118 и Ru 52 (антитело против Rubella virus в качестве отрицательного контроля) - по 100 мкг/мл, инкубировали 1 ч при +37°С. После трехкратной промывки полоски инкубировали с антивидовым пероксидазным конъюгатом антител против IgG мыши в течение 1 ч при 37°С. После повторной трехкратной промывки в ФСБ, содержащим 0,05% Tween 20, добавляли субстрат 3,3-диаминобензидин, 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода, инкубировали от 4 до 10 мин и останавливали реакцию, промывая полоски водой (Фиг. 3). По данным иммуноблота, GPE118 интенсивно взаимодействует с полноразмерной молекулой GP 94 кДа и с его фрагментом с молекулярной массой ~67 кДа, что подтверждает специфичность МоАт GPE118 к гликопротеину вируса Эбола.To confirm the specificity of the obtained MoAt GPE118, the method of immunoblotting was used. At the first stage, electrophoretic separation of the Ebola virus GP antigen was carried out in a 12% polyacrylamide gel under reducing conditions. Then, electrophoretic transfer (electroblotting) of proteins from the gel to a nitrocellulose membrane (Membrane filters cellulose nitrate; pore size 0.45 μm, S045A330R, Advantec MFS, Inc., USA) was carried out. Transferred proteins were detected on a nitrocellulose membrane using indirect ELISA (immunoblot). For this, the membrane was blocked with a solution of 5% casein in PBS overnight at + 4 ° C and washed three times with FSB buffer containing 0.05
Константы диссоциации МоАТ определяли в соответствии с методикой, предложенной Klotz I.M. (The Proteins. Ed. H. Neurath and K. Bailey Academic Press, New York. 1953. V. 1. P. 727) с модификациями из В. Friguet и др. (В. Friguet et. al. Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complex by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Immunological Methods, 77 (1985) 305-319). На первом этапе проводят инкубацию МоАт в постоянной концентрации 1 нМ (150 нг/мл) с антигеном GP в диапазоне концентраций 0.1-10 нМ (10-1000 нг/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре с постоянным перемешиванием на шейкере для достижения термодинамического равновесия в трехкомпонентной системе: свободный антиген, свободное антитело и комплекс антиген-антитело. На втором этапе осуществляют измерение концентрации свободных антител методом твердофазного ИФА с иммобилизованным на планшет GP. На заключительном этапе рассчитывают Кд по уравнению Клотца:MoAT dissociation constants were determined in accordance with the method proposed by Klotz I.M. (The Proteins. Ed. H. Neurath and K. Bailey Academic Press, New York. 1953. V. 1. P. 727) with modifications from B. Friguet et al. (B. Friguet et. Al. Measurements of the True Affinity Constant in Solution of Antigen-Antibody Complex by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Journal of Immunological Methods, 77 (1985) 305-319). At the first stage, MoAb is incubated at a constant concentration of 1 nM (150 ng / ml) with the GP antigen in the concentration range of 0.1-10 nM (10-1000 ng / ml) for 2 hours at room temperature with constant stirring on a shaker to achieve thermodynamic equilibrium in a three-component system: free antigen, free antibody and antigen-antibody complex. At the second stage, the concentration of free antibodies is measured by the method of solid-phase ELISA immobilized on a tablet GP. At the final stage, the cd is calculated according to the Klotz equation:
Ао/Ао-А=1+1/а Кд,Ao / Ao-A = 1 + 1 / a Cd,
где Ао - оптическая плотность, измеренная для антител в отсутствии антигена;where Ao is the optical density measured for antibodies in the absence of antigen;
А - оптическая плотность, измеренная для свободных антител в смеси антиген-антитело;A is the optical density measured for free antibodies in an antigen-antibody mixture;
а - концентрация антигена.and - antigen concentration.
Для МоАт GPE118 значение константы диссоциации комплекса антиген-антитело составило 1,8 нМ.For MoAt GPE118, the antigen-antibody complex dissociation constant was 1.8 nM.
Пример 3. Клонирование и секвенирование последовательностей кДНК, кодирующих вариабельные домены мышиного антитела GPE118 к гликопротеину вируса ЭболаExample 3. Cloning and sequencing of cDNA sequences encoding the variable domains of the mouse antibody to GPE118 glycoprotein of the Ebola virus
Гены вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей МоАТ GPE118 были получены с помощью реакции обратной транскрипции-амплификации тотальной РНК GPE118. РНК выделяли из 1-2×106 клеток гибридомы GPE118 с помощью реагента Trizol (Life Technologies, США) согласно рекомендуемому производителем протоколу. Обратную транскрипцию проводили, применяя обратную транскриптазу MMuLV (Евроген, Россия) и олиго(dT18)-праймер. Полученную кДНК амплифицировали с помощью ДНК-полимеразы Tersus (Евроген, Россия) с использованием набора праймеров, комплементарных областям константных доменов МоАт:The genes of the variable domains of the light and heavy chains of MoAT GPE118 were obtained using the reverse transcription-amplification reaction of total GPE118 RNA. RNA was isolated from 1-2 × 10 6 cells of the GPE118 hybridoma using Trizol reagent (Life Technologies, USA) according to the protocol recommended by the manufacturer. Reverse transcription was performed using reverse transcriptase MMuLV (Eurogen, Russia) and oligo (dT 18 ) primer. The obtained cDNA was amplified using Tersus DNA polymerase (Evrogen, Russia) using a set of primers complementary to the regions of the constant domains of MoAt:
SMRibo 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrGSMRibo 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGrGrG
RT-KAP 5'-GAGTCAGCACACGAAGAACTTGRT-KAP 5'-GAGTCAGCACACGAAGAACTTG
NesG 5'-CAGGGGCCAGTGGATAGACNesG 5'-CAGGGGCCAGTGGATAGAC
Полученные ПЦР-фрагменты длиной 600-650 п.о. клонировали в вектор pALT2 (Евроген, Россия) и отбирали не менее 10 положительных клонов как для легкой, так и для тяжелой цепи МоАТ, после чего с помощью секвенирования определяли нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные фрагменты. Затем проводили сравнение нуклеотидных последовательностей с помощью программ Chromas, CLC Sequence Viewer и GeneBee. В результате анализа были определены консенсусные нуклеотидные последовательности вариабельных доменов тяжелой (SEQ ID NO: 3) и легкой (SEQ ID NO: 4) цепей МоАт GPE118. На их основании с учетом трансляционного кода были определены аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой (SEQ ID NO: 1) и легкой (SEQ ID NO: 2) цепей МоАт GPE118. Для подтверждения достоверности определения аминокислотных последовательностей МоАт GPE118 был проведен масс-спектрометрический анализ фрагментов трипсинового гидролиза легких и тяжелых цепей исходного моноклонального МоАт GPE118. Полученные последовательности оценивали с помощью сравнения с гомологичными последовательностями, находящимися в базе данных GeneBank (IgBlast), что подтвердило их принадлежность к генам вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антител Mus musculus. Участки CDRs VL и VH (фиг. 4) были определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).The resulting PCR fragments with a length of 600-650 bp cloned into the pALT2 vector (Eurogen, Russia) and at least 10 positive clones were selected for both the light and heavy chains of MoAT, after which nucleotide sequences encoding variable fragments were determined by sequencing. Then, nucleotide sequences were compared using the Chromas, CLC Sequence Viewer, and GeneBee programs. As a result of the analysis, consensus nucleotide sequences of the variable domains of heavy (SEQ ID NO: 3) and light (SEQ ID NO: 4) MoAt chains of GPE118 were determined. Based on them, taking into account the translation code, the amino acid sequences of the variable domains of the heavy (SEQ ID NO: 1) and light (SEQ ID NO: 2) MoAt chains of GPE118 were determined. To confirm the reliability of the determination of the amino acid sequences of MoAt GPE118, mass spectrometric analysis of trypsin hydrolysis fragments of light and heavy chains of the original monoclonal MoAt GPE118 was performed. The obtained sequences were evaluated by comparison with homologous sequences located in the GeneBank database (IgBlast), which confirmed their belonging to the genes of the variable domains of the heavy and light chains of Mus musculus antibodies. Plots of CDRs VL and VH (Fig. 4) were identified by the nomenclature of the International Immunogenetics Information System, www.imgt.org).
Таким образом, были получены аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, а также нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.Thus, the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, as well as the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, were obtained.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015157143A RU2639533C2 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Monoclonal antibody, binding with ebola virus glycoprotein, dna fragments coding this antibody, and antigen-binding fragment |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015157143A RU2639533C2 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Monoclonal antibody, binding with ebola virus glycoprotein, dna fragments coding this antibody, and antigen-binding fragment |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015157143A RU2015157143A (en) | 2017-07-06 |
| RU2639533C2 true RU2639533C2 (en) | 2017-12-21 |
Family
ID=59309555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015157143A RU2639533C2 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Monoclonal antibody, binding with ebola virus glycoprotein, dna fragments coding this antibody, and antigen-binding fragment |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639533C2 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6630144B1 (en) * | 1999-08-30 | 2003-10-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Monoclonal antibodies to Ebola glycoprotein |
| RU2395576C1 (en) * | 2008-12-16 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus museums L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) |
| RU2395577C1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) |
| WO2015127136A2 (en) * | 2014-02-19 | 2015-08-27 | Jody Berry | Ebola monoclonal antibodies |
-
2015
- 2015-12-31 RU RU2015157143A patent/RU2639533C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6630144B1 (en) * | 1999-08-30 | 2003-10-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Monoclonal antibodies to Ebola glycoprotein |
| RU2395576C1 (en) * | 2008-12-16 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus museums L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) |
| RU2395577C1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-07-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING VP40 PROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) |
| WO2015127136A2 (en) * | 2014-02-19 | 2015-08-27 | Jody Berry | Ebola monoclonal antibodies |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015157143A (en) | 2017-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113354729B (en) | Monoclonal antibody for resisting novel coronavirus and application thereof | |
| CN112794899B (en) | Fully human monoclonal neutralizing antibody for resisting novel coronavirus and application thereof | |
| AU2006213775C1 (en) | Neutralizing monoclonal antibodies against severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus | |
| RU2764740C1 (en) | Bispecific antibody against rabies virus and its application | |
| CN110016079B (en) | Neutralizing antibody for resisting respiratory syncytial virus and application thereof | |
| CN109206514B (en) | TSLP monoclonal antibody and its preparation method and application | |
| US20170183396A1 (en) | Ebola monoclonal antibodies | |
| CA2963470A1 (en) | Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof | |
| BRPI0914012B1 (en) | PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE OF PHARMACEUTICAL COMPOSITION | |
| WO2022127793A1 (en) | Respiratory syncytial virus-specific binding molecule | |
| CN113354730B (en) | Monoclonal antibody for resisting novel coronavirus and application thereof | |
| CA2939034A1 (en) | Methods of modulating an immune response | |
| WO2021148884A1 (en) | Anti-wuhan coronavirus antibodies | |
| CN116836269A (en) | Monoclonal antibody for resisting respiratory syncytial virus and application thereof | |
| US10611827B2 (en) | Non-human primate-derived pan-ebola and pan-filovirus monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins | |
| JP2018203632A (en) | Monoclonal antibodies and assay kits | |
| CN110590943A (en) | Anti-dengue virus antibody and application thereof | |
| TWI487537B (en) | Monoclonal antibodies against enterovirus 71 and uses thereof | |
| JP4758148B2 (en) | Antibody enzyme against hemagglutinin of influenza virus | |
| JP2009524428A5 (en) | ||
| CN113661175A (en) | Antibodies comprising a common light chain and uses thereof | |
| CN114349853A (en) | anti-H1N 1 influenza virus hemagglutinin protein neutralizing monoclonal antibody ZJU11-01 and application thereof | |
| JP2014526886A (en) | Antibodies cross-reactive with macrophage migration inhibitory factor (MIF) and D-dopachrome tomerase (D-DT) | |
| RU2639533C2 (en) | Monoclonal antibody, binding with ebola virus glycoprotein, dna fragments coding this antibody, and antigen-binding fragment | |
| CN118388641A (en) | Antibodies against SARS-CoV-2 and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190101 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20200422 |