RU2597289C2 - Полипептиды, обладающие целлюлазной активностью - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биохимии. Предложен рекомбинантный полипептид, имеющий мутацию с заменой цистеина на серин в С-концевой области и обладающий целлюлазной активностью и улучшенной термостойкостью. Также представлен полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению, экспрессионный вектор, клетка-хозяин, ферментный препарат и способ обработки биомассы. Полипептид по настоящему изобретению может найти дальнейшее применение в качестве компонента препаратов для расщепления целлюлозы. 9 н.п. ф-лы, 15 ил., 11 табл.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка претендует на приоритет согласно 35 U.S.C. §119 в отношении предварительной заявки США серийный №61/166993, поданной 6 апреля 2009, и 61/177882, поданной 13 мая 2009, описания которых включены в данную заявку посредством ссылки.

УКАЗАНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ИССЛЕДОВАНИЯ, ФИНАНСИРУЕМОГО ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА

Правительство США обладает определенными правами на данное изобретение в соответствии с Грантом № GM 068664, предоставленным Национальным институтом здравоохранения, и Грантом № DAAD 19-03-0D-0004, предоставленным ARO - US Army Robert Morris Acquisition Center (Центром материально-технического обеспечения армии США Роберта Морриса).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к биомолекулярной инженерии и конструированию, и к белкам и нуклеиновым кислотам, полученным методами биоинженерии.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Качество целлюлазных смесей в процессах переработки биомассы зависит от многих свойств фермента, включая стабильность, ингибирование продуктом, синергизм среди различных целлюлазных ингредиентов, продуктивное связывание по сравнению с непродуктивной адсорбцией и рН зависимость, в дополнение к физическому состоянию и композиции целлюлозного субстрата. С учетом многовариантной природы гидролиза целлюлозы желательно иметь разнообразные целлюлазы для выбора из них с целью оптимизации ферментных препаратов для различных областей применения и исходного сырья.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В изобретении предложены рекомбинантные полипептиды, обладающие целлюлазной активностью и повышенной термостойкостью и активностью по сравнению с белком дикого типа. В изобретении предложено и продемонстрировано, что химеры и нативные ферменты CBHII, имеющие мутацию Cys на Ser на С-конце (например, примерно в аминокислоте 310-315 в зависимости от нативной последовательности белка, см., например, SEQ ID NO:2 и 4), гидролизуют более твердую целлюлозу, чем нативный фермент, в анализах на долгосрочный гидролиз.

В изобретении предложен рекомбинантный полипептид, содержащий замену C→S в С-концевой области в мотиве, включающем последовательность GECDG (SEQ ID NO:2 от 312-316), где вариант включает повышенную термостойкость и целлюлазную активность по сравнению с целлобиогидролазой дикого типа. Например, в изобретении предложены полипептиды, обладающие повышенной термостойкостью и целлюлазной активностью, включающие последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:2, содержащей C314S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:4, содержащей C311S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:12, содержащей C310S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:13, содержащей C312S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:14, содержащей C314S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:15, содержащей C315S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:16, содержащей C313S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:17, содержащей C311S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:19, содержащей C313S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:21, содержащей C312S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:22, содержащей C311S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:64, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:65, содержащей C407S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:66, содержащей C394S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:67, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:68, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:69, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:70, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:71, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:72, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:73, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:74, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:75, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:76, содержащей C407S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:77, содержащей C394S; или по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:78, содержащей C412S, где вышеуказанные полипептиды обладают целлюлазной активностью и улучшенной термостойкостью по сравнению с соответствующим исходным белком дикого типа, в котором отсутствует мутация Cys→Ser.

В изобретении также предложены по существу очищенные полипептиды, которые либо продуцированы рекомбинантным путем, либо получены синтетическим путем или созданы иным неприродным путем, где полипептид содержит последовательность, как изложено ниже, имеющую 1-10, 10-20 или 20-30 консервативных аминокислотных замен за исключением положения, идентифицированного ниже, где присутствует замена C→S: SEQ ID NO:2, содержащую C314S; SEQ ID NO:4, содержащую C311S; SEQ ID NO:12, содержащую C310S; SEQ ID NO:13, содержащую C312S; SEQ ID NO:14, содержащую C314S; SEQ ID NO:15, содержащую C315S; SEQ ID NO:16, содержащую C313S; SEQ ID NO:17, содержащую C311S; SEQ ID NO:19, содержащую C313S; SEQ ID NO:21, содержащую C312S; SEQ ID NO:22, содержащую C311S; SEQ ID NO:64, содержащую C400S; SEQ ID NO:65, содержащую C407S; SEQ ID NO:66, содержащую C394S; SEQ ID NO:67, содержащую C400S; SEQ ID NO:68, содержащую C400S; SEQ ID NO:69, содержащую C400S; SEQ ID NO:70, содержащую C400S; SEQ ID NO:71, содержащую C400S; SEQ ID NO:72, содержащую C400S; SEQ ID NO:73, содержащую C400S; SEQ ID NO:74, содержащую C400S; SEQ ID NO:75, содержащую C400S; SEQ ID NO:76, содержащую C407S; SEQ ID NO:77, содержащую C394S; или SEQ ID NO:78, содержащую C412S.

В изобретении предложен рекомбинантный полипептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (а) полипептида, обладающего по меньшей мере 85% или большей идентичностью SEQ ID NO:2, имеющей Ser в положении 314, где этот полипептид обладает целлюлазной активностью; (b) полипептида, обладающего по меньшей мере 70% или большей идентичностью SEQ ID NO:4, имеющей Ser в положении 311, где этот полипептид обладает целлюлазной активностью; (с) полипептида, обладающего 70% или большей идентичностью последовательности, выбранной из группы, состоящей из: (i) SEQ ID NO:12 и имеющей Ser в положении 310, (ii) SEQ ID NO:13 и имеющей Ser в положении 312, (iii) SEQ ID NO:14 и имеющей Ser в положении 314, (iv) SEQ ID NO:15 и имеющей Ser в положении 315, (v) SEQ ID NO:16 и имеющей Ser в положении 313, (vi) SEQ ID NO:17 и имеющей Ser в положении 311, (vii) SEQ ID NO:19 и имеющей Ser в положении 313, (viii) SEQ ID NO:21 и имеющей Ser в положении 312, и (ix) SEQ ID NO:22 и имеющей Ser в положении и имеющей Ser в положении 311, и где каждый из вышеуказанных полипептидов обладает целлюлазной активностью; и (d) химерного полипептида, содержащего по меньшей мере два домена от двух различных исходных целлобиогидролазных полипептидов, где эти домены содержат от N- к С-концу: (сегмент 1)-(сегмент 2)-(сегмент 3)-(сегмент 4)-(сегмент 5)-(сегмент 6)-(сегмент 7)-(сегмент 8); где: сегмент 1 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка примерно 1 до примерно x₁ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 2 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка x₁ до примерно x₂ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 3 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка x₂ до примерно x₃ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 4 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка x₃ до примерно x₄ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 5 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка примерно x₄ до примерно x₅ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 6 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка x₅ до примерно x₆ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 7 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка x₆ до примерно х₇ SEQ ID NO:2 (″1″) или SEQ ID NO:4 (″2″); и сегмент 8 содержит последовательность, по меньшей мере на 50-100% идентичную от аминокислотного остатка x₇ до примерно x₈ SEQ ID NO:2 (″1″) или SEQ ID NO:4 (″2″); где x₁ представляет собой остаток 43, 44, 45, 46 или 47 SEQ ID NO:2, либо остаток 42, 43, 44, 45 или 46 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₂ представляет собой остаток 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:2, либо остаток 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₃ представляет собой остаток 113, 114, 115, 116, 117 или 118 SEQ ID NO:2, либо остаток 110, 111, 112, 113, 114, 115 или 116 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₄ представляет собой остаток 153, 154, 155, 156 или 157 SEQ ID NO:2, либо остаток 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 или 156 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₅ представляет собой остаток 220, 221, 222, 223 или 224 SEQ ID NO:2, либо остаток 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₆ представляет собой остаток 256, 257, 258, 259, 260 или 261 SEQ ID NO:2, либо остаток 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 или 260 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₇ представляет собой остаток 312, 313, 314, 315 или 316 SEQ ID NO:2, либо остаток 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315 или 318 SEQ ID NO:4; и х₈ представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий С-концу полипептида, имеющего последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, где химерный полипептид содержит Ser в положении 314 SEQ ID NO:2 или в положении 311 SEQ ID NO:4, и где химерный полипептид обладает целлюлазной активностью и улучшенной термостойкостью и/или рН стабильностью по сравнению с полипептидом СВН II, содержащим SEQ ID NO:2, 4 или 6. В одной форме осуществления рекомбинантного полипептида сегмент 1 содержит аминокислотные остатки от примерно 1 до примерно x₁ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″) и имеет 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 2 составляют аминокислотные остатки от примерно x₁ до примерно x₂ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 3 составляют аминокислотные остатки от примерно x₂ до примерно x₃ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 4 составляют аминокислотные остатки от примерно x₃ до примерно x₄ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 5 составляют аминокислотные остатки от примерно x₄ до примерно x₅ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 6 составляют аминокислотные остатки от примерно x₅ до примерно x₆ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 7 составляют аминокислотные остатки от примерно х₆ до примерно x₇ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; и сегмент 8 составляют аминокислотные остатки от примерно x₇ до примерно x₈ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен за исключением положения 314 SEQ ID NO:2, положения 311 SEQ ID NO:4 или 313 SEQ ID NO:6. Еще в одной другой форме осуществления химерный полипептид содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:12-62 и 63.

В изобретении также предложен рекомбинантный полипептид, состоящий из последовательности, как представлено в SEQ ID NO:12-62 или 63.

В изобретении также предложен полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов, как описано выше, векторы, содержащие полинуклеотид, и клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид или вектор.

В изобретении также предложен ферментный препарат, содержащий полипептид по изобретению по существу в очищенной форме или в виде части клеточного лизата.

В изобретении также предложен способ обработки биомассы, содержащей целлюлозу, включающий приведение биомассы в контакт с полипептидом или ферментным препаратом по изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1А-В Электрофорез в ДСН-ПААГ супернатантов дрожжевой экспрессионной культуры родительского гена-кандидата СВН II. (А) Дорожки геля (слева направо): 1 - Н. jecorina, 2 - пустой вектор, 3 - H. insolens, 4 - С. thermophilum, 5 - Н. jecorina (второй повтор), 6 - Р. chrysosporium, 7 - Т. emersonii, 8 - пустой вектор (второй повтор), 9 - Н. jecorina (третий повтор). Цифрами внизу геля представлена концентрация восстанавливающего сахара (мкг/мл), присутствующего в реакционной смеси анализа гидролиза PASC после 2 ч при 50°С. Последующее сравнение ДСН-ПААГ со стандартом БСА дало возможность оценки уровня экспрессии Н. insolens как 5-10 мг/л. (В) Показан анализ с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ супернатантов экспрессионной культуры S. cerevisiae СВН II. Полосы СВН II видны непосредственно ниже стандарта молекулярной массы 60 кДа. Дорожки, слева направо, 1 - дикий тип Н. jeco, 2 - Н. jeco B7P3, 3 - Н. jeco C311S, 4 - дикий тип С. ther, 5 - дикий тип Н. inso, 6 - Н. inso B7P3, 7 - Н. inso C314S. Цифрами обозначены мкг эквиваленты глюкозы/мл объема реакционной смеси на мл эквивалент супернатанта экспрессионной культуры в ДСН-ПААГ, продуцированной в течение 100-минутной инкубации с PASC (1 мг/мл) при 50°С в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8. Значения для дорожек 1-4 разделены на 2 для коррекции на двукратный объем нанесенного концентрированного супернатанта культуры, где отсутствие этой коррекции сделало бы значения удельной активности ферментов Н. insolens искусственно низкими.

На фиг.2А-С показаны иллюстрации границ блоков библиотеки химер СВН II. (А) ленточная диаграмма каталитического домена Н. insolens СВН II с блоками, различающимися по цвету. Фермент СВН II образует комплекс с ингибитором гликозидазы изофагомином целлобиозного происхождения. (В) Линейное представление каталитического домена Н. insolens, показывающее элементы вторичной структуры, дисульфидные связи и деления на блоки, обозначенные черными стрелками. (С) Карта контактов боковых цепей, обозначающая контакты (тяжелые атомы боковых цепей в пределах 4,5 Å), которые могут быть разрушены посредством рекомбинации. Большинство разрушенных контактов возникает между блоками, следующими друг за другом.

На фиг.3 показано число разрушенных контактов (Е) и число мутаций по отношению к ближайшему родителю (m) для 23 секретированных/активных и 15 несекретированных/неактивных химер серии образцов.

На фиг.4 показана удельная активность, нормализованная на рН 5,0, как функция рН для родительских ферментов СВН II и трех термостойких химер. Представленные данные представляют собой средние для двух повторов, где ″усы″ для значений HJPlus и Н. jeco обозначают исследования для двух независимых испытаний. 16-часовая реакция, 300 мкг фермента/г PASC, 50°С, буфер 12,5 мМ цитрат натрия/12,5 мМ фосфат натрия при рН, как показано.

На фиг.5 показаны результаты анализа долговременного гидролиза целлюлозы (мкг эквиваленты восстанавливающего сахара глюкозы/мкг фермента СВН II) для родителей и термостойких химер на протяжении диапазона температур. ″Усы″ указывают стандартные ошибки для трех повторов ферментов СВН II HJPlus и Н. insolens. 40-часовая реакция, 100 мкг фермента/г PASC, 50 мМ ацетат натрия, рН 4,8.

На фиг.6 показаны нормализованные остаточные активности для оценки серии химер после 12-часовой инкубации при 63°С. Остаточные активности для ферментов СВН II в концентрированных супернатантах культуры определены в 2-часовом анализе с PASC в качестве субстрата, 50°С, буфер 25 мМ ацетат натрия, рН 4,8.

Фиг.7 Карта родительского и химерного экспрессионного вектора для фермента СВН II Yep352/PGK91-1-ss. Изображенный вектор содержит ген дикого типа Н. jecorina ceI6a (фермент СВН II). Как для химерного, так и для родительского фермента СВН II аминокислотная последовательность CBD/линкера, следующая за сайтом ss Lys-Arg Kex2, представляет собой:

ASCSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAA

STTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYS (SEQ ID NO:8).

На фиг.8 показаны наблюдаемые и предсказанные значения T₅₀ для родительских СВН II и 51 химерного СВН II. Кривая обозначает уравнение модели линейной регрессии (параметры в таблице 7). Значения Т₅₀ родительского СВН II обозначены в виде квадратов.

На фиг.9А-С показаны удельные активности СВН II в отношении Avicel в зависимости от температуры, (а) удельные активности родительского и химерного СВН II. (b) удельные активности родительского СВН II, мутанта C311S химеры В7Р3 с заменой одного блока. Реакции проводили в течение 16 часов в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8, при концентрации Avicel 15 мг/мл. (с) активности родительского СВН II, одиночного точечного мутанта химеры с заменой одного блока (мкг/глюкоза/мл реакционной смеси) в отношении Avicel в зависимости от температуры. Реакции проводили в течение 150 минут в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8, при концентрации Avicel 15 мг/мл. Супернатанты дрожжевой культуры СВН II дозировали до достижения приблизительно эквивалентных концентраций продукта восстанавливающего сахара при 55°С. Представленные данные представляют собой средние двух независимых повторов, где усы указывают значения активности двух повторов для каждой температурной точки.

На фиг.10 показано множественное выравнивание последовательностей ClustalW для блока 7 от родителя 1, Н. insolens, и родителя 3, C.thermophilum. Стрелками обозначены остатки, измененные в реверсионных мутантах.

На фиг.11 показаны значения Т₅₀ для точечных мутантов химеры 21111331. Значения показаны в виде среднего двух независимых повторов, усы указывают значения Т₅₀ двух повторов для каждого точечного мутанта. Инактивацию осуществляли в течение 10 минут при тестируемой температуре в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 4,8. Остаточную активность определяли путем инкубации с 1 г/л целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (PASC), в вышеуказанном буфере в течение 100 минут при 50°С.

На фиг.12 показаны значения Т₅₀ для родительских СВН II Н. insolens и Н. jecorina, одиночных точечных мутантов Ser химер с заменой блока В7Р3. Значения показаны в виде среднего трех независимых повторов, усы указывают одно стандартное отклонение для каждого СВН II. Инактивацию осуществляли в течение 10 минут при тестируемой температуре в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 4,8. Остаточную активность определяли путем инкубации с 1 г/л целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (PASC), в вышеуказанном буфере в течение 100 минут при 50°С.

На фиг.13 показаны значения Т₅₀ для химер СВН II 31311112, 13231111 и каталитического домена СВН II дикого типа из Р. chrysosporium (слитого с Н. jecorina CBM), гетерологично секретированных из S. cerevisiae. Значения показаны в виде двух независимых повторов, где усы показывают значения для каждого испытания. Инактивацию осуществляли в течение 10 минут при тестируемой температуре в 50 мМ натрийацетатном буфере, рН 4,8. Остаточную активность определяли путем инкубации с 1 г/л целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (PASC), в вышеуказанном буфере в течение 100 минут при 50°С.

На фиг.14A-D показаны границы раздела блоков рекомбинации СВН II. (а) сайты между блоками, где возможны новые неродительские пары остатков (соединенные круги), обычно экспонированы на поверхности, потенциально давая возможность растворителю экранировать взаимодействия. (b) Примерная граница раздела (В5-В6) иллюстрирует консервативность каркаса (изображения выровненных Н. jecorina и Н. insolens), вариабельные остатки на поверхности и сравнительно редкую возможность новой углубленной пары при остатках 173 и 253 (стрелка), (с) блоки 1-4 от Н. jecorina (черный рисунок) совпадают с родственными блоками Н.insolens (рисунок с цветовой маркировкой) без больших отклонений, хотя наблюдается перемещение, обусловленное связыванием субстрата (стрелка), в участке ВЗ (желтый), (d) родственные блоки 5-8 также являются сходными, хотя вставка-делеция на стыке В6, В7 (стрелка) потребует конформационного изменения.

На фиг.15 показан структурный анализ мутации C314S и ее стабилизирующий эффект, (а) Положения водорода для структуры высокого разрешения H.insolens (1ocn) были добавлены с помощью REDUCE.1 (b) Реконструкция геометрии аналогичной сериновой структуры было смоделировано с помощью PyMOL (http:(//)www.pymol.org). Оптимизация боковых цепей в платформе моделирования SHARPEN2 (с функцией энергии всех атомов Rosetta) также позволила предположить, что, как Cys314, так и Ser314 будут донорами водородной связи для карбонила Pro339 и акцепторами водородной связи от амида Gly316. Наилучшая способность серина к водородному связыванию может играть роль в более высокой стабильности серинсодержащих вариантов. Другим возможным объяснением является геометрическая комплементарность. Конкретно, положение Cys из 1ocn проявляет данные о конформационном напряжении, при котором боковая цепь заметно согнута (то есть неправильный угол между двумя плоскостями от N-C-Cα-Cβ составляет 6° от стандартного положения), увеличивая расстояние до карбонила Pro. Цифры на фиг., которым не предшествуют буквы, обозначают расстояния водородных связей (Å).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Как используют в описании и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст четко не диктует иное. Так, например, ссылка на ″домен″ включает множество таких доменов, и ссылка на ″белок″ включает ссылку на один или более чем один белок, и т.д.

Также использование ″или″ означает ″и/или″, Если не указано иное. Подобным образом, ″содержат″, ″содержит″, ″содержащий″, ″включают″, ″включает″ и ″включающий″ являются взаимозаменяемыми и не предназначены для ограничения.

Кроме того, должно быть понятно, что, где в описаниях различных форм осуществления используют термин ″содержащий″, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в некоторых конкретных случаях форма осуществления может быть описана альтернативно, используя выражение ″состоящий по существу из″ или ″состоящий из″.

Хотя методы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данной заявке, можно использовать в практике раскрытых способов и композиций, в данной заявке описаны примерные способы, устройства и материалы.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют такое же значение, как общепринято понимают обычные специалисты в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Таким образом, как используют на протяжении всей настоящей заявки, приведенные ниже термины имеют следующие значения.

В недавних исследованиях документированы превосходные характеристики целлюлаз из термофильных грибов относительно их мезофильных аналогов в процессах преобразования биомассы в лабораторном масштабе, где усиленная стабильность приводит к сохранению активности в течение более длительных периодов времени как при умеренных, так и при повышенных температурах. Целлюлазы грибов привлекательны, поскольку обладают высокой активностью и могут экспрессироваться в хозяевах-грибах, таких как Hypocrea jecorina (анаморф Trichoderma reesei), на уровнях вплоть до 40 г/л в супернатанте. К сожалению, набор документированных термостойких целлюлаз грибов мал. В случае процессивных ферментов целлобиогидролаз класса II (СВН II) менее 10 последовательностей природных термостойких генов аннотировано в базе данных CAZy.

Как более полно описано в данной заявке, с использованием рекурсивного создания химерных полипептидов и анализа конкретных стабилизированных доменов, наконец, были идентифицированы конкретные аминокислоты, придающие термостойкость и улучшенную активность.

Как более подробно описано ниже, изобретение основано, по меньшей мере частично, на создании и экспрессии новых ферментов, которые катализируют гидролиз целлюлозы. В одной форме осуществления предложены новые полипептиды, которые сконструированы для гидролиза целлюлозы при повышенных температурах. Такие полипептиды включают варианты целлобиогидролаз, которые изменены таким образом, что включают аминокислотные замены в указанных остатках. Хотя эти варианты описаны более подробно ниже, понятно, что полипептиды по изобретению могут содержать одну или более чем одну модифицированную аминокислоту. Присутствие модифицированных аминокислот может обладать преимуществом, например, при (а) увеличении периода полураспада полипептида, (b) термостойкости и (с) повышенному круговороту субстрата. Аминокислота(ы) модифицирована, например, котрансляционно или посттрансляционно во время рекомбинантного продуцирования (например, N-сцепленное гликозилирование при мотивах N-X-S/T во время экспрессии в клетках млекопитающих), либо модифицирована синтетическими способами. Соответственно, ″мутант″, ″вариант″ или ″модифицированный″ белок, фермент, полинуклеотид, ген или клетка означают белок, фермент, полинуклеотид, ген или клетку, которые изменены или преобразованы, либо являются каким-либо образом отличными или измененными по сравнению с родительским белком, фермент, полинуклеотид, ген или клеткой. Мутант или модифицированный белок или фермент обычно, хотя необязательно, экспрессирован с мутантного полинуклеотида или гена.

″Мутация″ означает любой процесс или механизм, результатом которого является мутантный белок, фермент, полинуклеотид, ген или клетка. Это включает любую мутацию, при которой белок, фермент, полинуклеотид или последовательность гена изменены, и любое обнаружимое изменение в клетке, возникающее в результате такой мутации. Типично мутация происходит в полинуклеотиде или последовательности гена в результате точечных мутаций, делеций или инсерций одного или множественных нуклеотидных остатков. Мутация включает как изменения полинуклеотида, возникающие в пределах кодирующей белок области гена, так и изменения в областях вне последовательности, кодирующей белок, таких как, но не ограниченных ими, регуляторные или промоторные последовательности. Мутация в гене может быть ″молчащей″, то есть не отражающейся в изменении аминокислоты при экспрессии, приводя к варианту гена ″консервативной последовательности″. Обычно это происходит, когда одна аминокислота соответствует более чем одному кодону.

Не ограничивающие примеры модифицированной аминокислоты включают гликозилированную аминокислоту, сульфатированную аминокислоту, пренилированную (например, фарнезилированную, геранилгеранилированную) аминокислоту, ацетилированную аминокислоту, ацилированную аминокислоту, пегилированную аминокислоту, биотинилированную аминокислоту, карбоксилированную аминокислоту, фосфорилированную аминокислоту и тому подобное. В литературе в изобилии имеются ссылки, адекватные для руководства специалиста в данной области техники по модификации аминокислот. Примерные протоколы находятся в Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM (Humana Press, Towata, N.J.).

Рекомбинантные способы продуцирования и выделения модифицированных полипептидов целлобиогидролаз по изобретению описаны в данной заявке. В дополнение к рекомбинантному продуцированию, полипептиды могут быть получены путем прямого синтеза пептидов с использованием твердофазных методов (например, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis (WH Freeman Co, San Francisco); и Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154). Пептидный синтез можно осуществлять, используя ручные методы, или путем автоматизации. Автоматизированный синтез может быть достигнут, например, с использованием пептидного синтезатора Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) в соответствии с инструкциями, предоставленными изготовителем.

″Целлобиогидролаза II″ или ″фермент СВН II″ означает фермент из семейства целлюлаз из 6 белков, который широко распространен в бактериях и грибах. Эти ферменты вовлечены в гидролиз целлюлозы.

Под ″целлюлазной активностью″ подразумевают фермент, который способен к гидролизу целлюлозы. Целлюлаза относится к классу ферментов, продуцируемых грибами, бактериями и простейшими, которые катализируют гидролиз целлюлозы. Однако также существуют целлюлазы, продуцируемые другими типами организмов, такими как растения и животные. Номером ЕС для данной группы ферментов является ЕС 3.2.1.4. Существует пять общих типов целлюлаз, основанных на типе катализируемой реакции: эндоцеллюлаза; экзоцеллюлаза, где в пределах этой категории имеется два основных типа экзоцеллюлаз (или целлобиогидролаз, сокращенно СВН) - один тип работает процессивно с восстанавливающего конца, и один тип работает процессивно с нередуцирующего конца целлюлозы; гидролитические целлобиаза или бета-глюкозидаза; окислительные целлюлазы и целлюлозофосфорилазы, которые деполимеризуют целлюлозу, используя фосфаты вместо воды. Большинство грибных целлюлаз имеет два домена: каталитический домен и целлюлозосвязывающий домен, которые соединены гибким линкером. В конкретных формах осуществления изобретения целлюлазной активностью является активность СВН. Последовательности, описанные в данной заявке, включают в некоторых случаях и целлюлозосвязывающий домен, и каталитический домен, или только каталитический домен. В тех случаях, где предложена последовательность только каталитического домена, понятно, что целлюлозосвязывающий домен (CBD), такой как представлено в SEQ ID NO:8, может быть функционально сцеплен (либо как часть кодирующей последовательности, либо слит позже) с каталитическим доменом, непосредственно или посредством линкера.

″Белок″ или ″полипептид″, где эти термины используют в данной заявке взаимозаменяемо, включает одну или более чем одну цепь химических строительных блоков, называемых аминокислотами, которые связаны вместе химическими связями, называемыми пептидными связями. ″Фермент″ означает любое вещество, предпочтительно полностью или большей частью состоящее из белка, которое катализирует или стимулирует, более или менее специфично, одну или более чем одну химическую или биохимическую реакцию. ″Нативный″ или ″дикого типа″ белок, фермент, полинуклеотид, ген или клетка означает белок, фермент, полинуклеотид, ген или клетку, которые встречаются в природе.

″Аминокислотная последовательность″ представляет собой полимер из аминокислот (белок, полипептид и т.д.) или последовательность символов, представляющую аминокислотный полимер, в зависимости от контекста. Термины ″белок″, ″полипептид″ и ″пептид″ используют в данной заявке взаимозаменяемо. ″Аминокислота″ представляет собой молекулу, имеющую структуру, где центральный атом углерода связан с атомом водорода, группой карбоновой кислоты (атом углерода которой называют в данной заявке ″карбоксильным атомом углерода″), аминогруппой (атом азота которой называют в данной заявке ″амино-атомом азота″) и группой боковой цепи, R. Когда она включена в пептид, полипептид или белок, аминокислота теряет один или более чем один атом ее карбоксильных групп аминокислоты в реакции дегидрирования, которая связывает одну аминокислоту с другой. В результате, когда аминокислота включена в белок, ее называют ″аминокислотным остатком″.

Конкретная аминокислотная последовательность данного белка (то есть ″первичная структура″ полипептида, записанная от амино-конца к карбокси-концу) определяется нуклеотидной последовательностью кодирующего участка мРНК, который, в свою очередь, определен генетической информацией, типично геномной ДНК (включая ДНК органелл, например, митохондриальную или хлоропластную ДНК). Таким образом, определение последовательности гена помогает при предсказании первичной последовательности соответствующего полипептида и более конкретно роли или активности полипептидов или белков, кодируемых этим геном или полинуклеотидной последовательностью.

″Консервативная аминокислотная замена″ или просто ″консервативные вариации″ конкретной последовательности относятся к замене одной аминокислоты или группы аминокислот по существу идентичными аминокислотными последовательностями. Специалисту в данной области техники понятно, что результатом индивидуальных замен, делеций или добавлений, которые изменяют, добавляют или делегируют одну аминокислоту или процентную долю аминокислот в кодируемой последовательности, являются ″консервативные вариации″, где эти изменения приводят в результате к делеций аминокислоты, добавлению аминокислоты или замене аминокислоты химически подобной аминокислотой.

Таблицы консервативных замен, в которых приведены функционально подобные аминокислоты, хорошо известны в данной области техники. Например, одна группа консервативных замен включает аланин (А), серин (S) и треонин (Т). Другая группа консервативных замен включает аспарагиновую кислоту (D) и глутаминовую кислоту (Е). Другая группа консервативных замен включает аспарагин (N) и глутамин (Q). Еще одна другая группа консервативных замен включает аргинин (R) и лизин (К). Другая группа консервативных замен включает изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М) и валин (V). Другая группа консервативных замен включает фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W).

Таким образом, ″консервативные аминокислотные замены″ перечисленных полипептидных последовательностей (например, SEQ ID NO:2, 4, 6 и 12-78) включают замены процентной доли, типично менее 10%, аминокислот полипептидной последовательности консервативно подобранной аминокислотой той же группы консервативных замен. Соответственно, консервативно замененная вариация полипептида по изобретению может содержать 100, 75, 50, 25 или 10 замен консервативно замененной вариацией одной и той же группы консервативных замен.

Понятно, что добавление последовательностей, которое не изменяет кодируемую активность молекулы нуклеиновой кислоты, такое как добавление нефункциональной или некодирующей последовательности, является консервативной вариацией базовой нуклеиновой кислоты. ″Активность″ фермента является мерой его активность катализа реакции, то есть ″функции″, и может быть выражена как скорость, с которой образуется продукт реакции. Например, активность фермента может быть представлена как количество продукта, образующегося в единицу времени или на единицу фермента (например, концентрации или массы), либо в отношении констант сродства или диссоциации. Как взаимозаменяемо используют в данной заявке, ″целлобиогидролазная активность или целлюлазная активность″, ″биологическая активность целлобиогидролазы или целлюлазьГ или ″функциональная активность целлобиогидролазы или целлюлазы″ относится к активности, проявляемой белком, полипептидом, обладающим целлюлазной активностью, и в конкретных формах осуществления к целлобиогидролазной активности на целлюлозном субстрате, которая определена in vivo или in vitro в соответствии со стандартными методами.

Специалисту в данной области техники понятно, что многие консервативные вариации нуклеиново-кислотных конструкций, которые раскрыты, дают функционально идентичную конструкцию. Например, как описано выше, благодаря вырожденности генетического кода, ″молчащие замены″ (то есть замены в нуклеиново-кислотной последовательности, которые не приводят в результате к изменению кодируемого полипептида) являются подразумеваемым признаком каждой нуклеиново-кислотной последовательности, которая кодирует аминокислоту. Подобным образом, ″консервативные аминокислотные замены″ в одной или в нескольких аминокислотах в аминокислотной последовательности, замененные другими аминокислотами с высоко подобными свойствами, также легко идентифицируют как высоко подобные раскрытой конструкции. Такие консервативные вариации каждой раскрытой конструкции являются признаком полипептидов, предложенных в данной заявке.

″Консервативные варианты″ представляют собой белки или ферменты, в которых данный аминокислотный остаток изменен без изменения общей конформации и функции белка или фермента, включая, но не ограничиваясь ими, замену аминокислоты другой, обладающей подобными свойствами, включающими полярный или неполярный характер, размер, форму и заряд. Аминокислоты, иные, чем те, которые указаны как консервативные, могут отличаться в белке или ферменте таким образом, что процент подобия белковой или аминокислотной последовательности между двумя белками подобной функции может варьировать и может составлять, например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90%, как определено в соответствии со схемой выравнивания. В отношении данной заявки ″подобие последовательностей″ означает степень, до которой нуклеотидные или белковые последовательности являются родственными. Степень подобия между двумя последовательностями может быть основана на проценте идентичности и/или консервативности последовательности. ″Идентичность последовательности″ в данной заявке означает степень, до которой две нуклеотидные или аминокислотные последовательности являются инвариантными. ″Выравнивание последовательностей″ означает процесс построения двух или более чем двух последовательностей в одну колонку до достижения максимальных уровней идентичности (и, в случае аминокислотных последовательностей, консервативности) с целью оценки степени подобия. В данной области техники известны многочисленные способы выравнивания последовательностей и оценки подобия/идентичности, такие как, например, кластерный метод, где подобие основано на алгоритме MEGALIGN, а также BLASTN, BLASTP и FASTA (Lipman and Pearson, 1985; Pearson and Lipman, 1988). При использовании всех этих программ предпочтительными установками являются те, которые приводят в результате к самой высокой степени подобия.

Неконсервативными модификациями конкретного полипептида являются те, которые заменяют любую аминокислоту, не характеризующуюся как консервативная замена, например, любая замена, которая выходит за границы шести групп, изложенных выше. Они включают замены основных или кислых аминокислот на нейтральные аминокислоты (например, Asp, Glu, Asn или Gin на Val, lie, Leu или Met), ароматической аминокислоты на основные или кислые аминокислоты (например, Phe, Tyr или Trp на Asp, Asn, Glu или Gin) или любую другую замену, не заменяющую аминокислоту подобной аминокислотой. Основные боковые цепи включают лизин (К), аргинин (R), гистидин (Н); кислые боковые цепи включают аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е); незаряженные полярные боковые цепи включают глицин (G), аспарагин (N), глутамин (Q), серин (S), треонин (Т), тирозин (Y), цистеин (С); неполярные боковые цепи включают аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (F), метионин (М), триптофан (W); бета-разветвленные боковые цепи включают треонин (Т), валин (V), изолейцин (I); ароматические боковые цепи включают тирозин (Y), фенилаланин (F), триптофан (W), гистидин (Н).

″Родительским″ белком, ферментом, полипептидом, геном или клеткой является любой белок, фермент, полипептид, ген или любая клетка, от которых имеют происхождение или получены другой белок, фермент, полипептид, ген или другая клетка с использованием любых способов, инструментов или методов, независимо от того, является ли сам родитель нативным или мутантным. Родительский полинуклеотид или ген кодирует родительский белок или фермент.

В дополнение к предложенным вариантам полипептидов СВН II предложены химерные полипептиды, которые содержат: 1) вариант домена, изолированного из первой родительской цепи и модифицированного таким образом, что включает аминокислотную замену; и 2) домен, изолированный из второй родительской цепи, либо немодифицированный, либо модифицированный таким образом, что включает новую активность или активность, которая комплементирует этот домен. Способы конструирования химерного полипептида по изобретению раскрыты в данной заявке.

В изобретении предложены варианты, мутанты и химеры целлюлазы и целлобиогидролазы (СВН) II, обладающие повышенной термостойкостью по сравнению с диким типом или родительским белком, где белок дикого типа состоит из SEQ ID NO:2, 4 или 6. Вариант содержит серин в С-концевой области в мотиве, включающем последовательность GEXDG, где Х представляет собой С, А или G (SEQ ID NO:107), где Х заменен серином, где этот вариант включает целлюлазную активность, и где полипептид обладает повышенной термостойкостью по сравнению с целлюлазой дикого типа, в которой отсутствует серин в последовательности GEXDG (SEQ ID NO:107). В одной форме осуществления варианты содержат по меньшей мере мутацию Cys→Ser в мотиве GECDG (см., например, SEQ ID NO:2, аминокислоты 312-316), обнаруженном в большинстве белков целлюлазы и целлобиогидролазы II (как более полно описано ниже), и могут содержать дополнительные мутации, которые улучшают термостойкость или активность. Идентичность между целлюлазами может быть достаточно низкой. Замена на серин, как описано выше, применима к любой целлюлазе, имеющей мотив SEQ ID NO:107 (например, где полипептид обладает по меньшей мере 60% или более высокой идентичностью SEQ ID NO:2 или 4).

Например, в изобретении предложены полипептиды, обладающие повышенной термостойкостью и целлюлазной активностью, включающие последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:2, содержащей C314S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:4, содержащей C311S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:12, содержащей C310S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:13, содержащей C312S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:14, содержащей C314S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:15, содержащей C315S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:16, содержащей C313S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:17, содержащей C311S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:19, содержащей C313S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:21, содержащей C312S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:22, содержащей C311S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:64, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:65, содержащей C407S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:66, содержащей C394S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:67, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:68, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:69, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:70, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:71, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:72, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:73, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:74, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:75, содержащей C400S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:76, содержащей C407S; по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:77, содержащей C394S; или по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 98%, 99% идентична SEQ ID NO:78, содержащей C412S, где вышеуказанные полипептиды обладают целлюлазной активностью и улучшенной термостойкостью по сравнению с их соответствующим родительским (дикого типа) белком, в котором отсутствует мутация Cys→Ser.

Еще в одной другой форме осуществления в изобретении предложены полипептиды, как описано выше, однако, они дополнительно содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, которая может быть определена путем выравнивания с SEQ ID NO:64, где SEQ ID NO:64 содержит Pro в положении 413, либо Ser или Thr в положении 231, либо Ser или Thr в положении 305, либо Gin или Asn в положении 410, либо Glu в положении 82, либо любую комбинацию вышеописанного. Подобные замены могут быть идентифицированы путем выравнивания последовательностей аминокислотной последовательности SEQ ID NO:64 с последовательностями SEQ ID NO:2, 4, 6, 12-63 и 65-78.

В изобретении также предложены по существу очищенные полипептиды, которые либо продуцированы рекомбинантным путем, либо получены синтетическим путем, либо образованы иным неприродным путем, где полипептид включает последовательность, как изложено ниже, имеющую 1-10, 10-20 или 20-30 консервативных аминокислотных замен за исключением положения, идентифицированного ниже, где присутствует замена C→S:

SEQ ID NO:2 содержащую C314S;

SEQ ID NO:4 содержащую C311S;

SEQ ID NO:12 содержащую C310S;

SEQ ID NO:13 содержащую C312S;

SEQ ID NO:14 содержащую C314S;

SEQ ID NO:15 содержащую C315S;

SEQ ID NO:16 содержащую C313S;

SEQ ID NO:17 содержащую C311S;

SEQ ID NO:19 содержащую C313S;

SEQ ID NO:21 содержащую C312S;

SEQ ID NO:22 содержащую C311S;

SEQ ID NO:64 содержащую C400S;

SEQ ID NO:65 содержащую C407S;

SEQ ID NO:66 содержащую C394S;

SEQ ID NO:67 содержащую C400S;

SEQ ID NO:68 содержащую C400S;

SEQ ID NO:69 содержащую C400S;

SEQ ID NO:70 содержащую C400S;

SEQ ID NO:71 содержащую C400S;

SEQ ID NO:72 содержащую C400S;

SEQ ID NO:73 содержащую C400S;

SEQ ID NO:74 содержащую C400S;

SEQ ID NO:75 содержащую C400S;

SEQ ID NO:76 содержащую C407S;

SEQ ID NO:77 содержащую C394S; или

SEQ ID NO:78 содержащую C412S.

″Изолированный полипептид″ относится к полипептиду, который отделен от других примесей, которые естественно сопровождают его, например, белков, липидов и полинуклеотидов. Этот термин охватывает полипептиды, которые извлечены или очищены из их естественной окружающей среды или экспрессионной системы (например, клетки-хозяина или синтеза in vitro).

″По существу чистый полипептид″ относится к композиции, в которой the полипептидное соединение является преобладающим присутствующим соединением (то есть на молярной или массовой основе он является более представленным, чем любые другие индивидуальные макромолекулярные соединения в композиции), и обычно представляет собой по существу очищенную композицию, где целевое соединение составляет по меньшей мере примерно 50 процентов моль/моль или % масс/масс присутствующих макромолекулярных соединений. Как правило, по существу чистая полипептидная композиция будет содержать примерно 60% или более, примерно 70% или более, примерно 80% или более, примерно 90% или более, примерно 95% или более и примерно 98% или более моль/моль или % масс/масс всех макромолекулярных соединений, присутствующих в композиции. В некоторых формах осуществления целевое соединение очищают по существу до гомогенности (то есть примесные соединения невозможно обнаружить в композиции общепринятыми способами обнаружения), где композиция состоит по существу из единственного макромолекулярного соединения. Соединение-растворитель, малые молекулы (<500 Дальтон) и элементарные ионные соединения не считают макромолекулярные соединениями.

″Референсная последовательность″ относится к определенной последовательности, используемой в качестве основы для сравнения последовательностей. Референсная последовательность может представлять собой подмножество большей последовательности, например, сегмент полноразмерного гена или полипептидной последовательности. Как правило, референсная последовательность может составлять по меньшей мере 20 нуклеотидов или аминокислотных остатков в длину, по меньшей мере 25 нуклеотидов или остатков в длину, по меньшей мере 50 нуклеотидов или остатков в длину или полную длину нуклеиновой кислоты или полипептида. Поскольку два полинуклеотида или полипептида могут каждый (1) включать последовательность (то есть участок полноразмерной последовательности), которая является подобной между двумя последовательностями, и (2) может дополнительно включать последовательность, которая является различающейся между двумя последовательностями, сравнения последовательности между двумя (или более) полинуклеотидами или полипептидами типично проводят путем сравнения последовательностей двух полинуклеотидов или полипептидов на протяжении ″окна сравнения″, чтобы идентифицировать и сравнить локальные области подобия последовательностей.

″Идентичность последовательности″ означает, что две аминокислотных последовательности по существу идентичны (то есть на основе последовательных аминокислот) на протяжении окна сравнения. Термин ″подобие последовательности″ относится к подобным аминокислотам, которые имеют общие биофизические характеристики. Термин ″процент идентичности последовательности″ или ″процент подобия последовательности″ вычисляют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения, определяя число положений, в которых идентичные остатки (или подобные остатки) встречаются в обеих полипептидных последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения (то есть на размер окна) и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательности (или процента подобия последовательности). В отношении полинуклеотидных последовательностей термины идентичность последовательности и подобие последовательности имеют значение, сравнимое с описанным для белковых последовательностей, где термин ″процент идентичности последовательности″ указывает на то, что две полинуклеотидных последовательности идентичны (на основе последовательных нуклеотидов) на протяжении окна сравнения. Как таковой, процент идентичности полинуклеотидной последовательности (или процент подобия полинуклеотидной последовательности, например, для молчащих замен или других замен, на основании алгоритма анализа) может быть также вычислен. Максимальное соответствие можно определить путем использования одного из алгоритмов последовательности, описанных в данной заявке (или других алгоритмов, доступных обычным специалистам в данной области техники), или путем визуальной проверки.

Применительно к полипептидам термин существенная идентичность или существенное подобие означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ BLAST, GAP или BESTFIT с использованием массы гэпов по умолчанию или путем визуальной проверки, обладают идентичностью последовательности или подобием последовательности. Подобным образом, применительно к контексту двух нуклеиновых кислот термин существенная идентичность или существенное подобие означает, что две нуклеиново-кислотные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ BLAST, GAP или BESTFIT с использованием массы гэпов по умолчанию (описанной в данной заявке в другом месте) или путем визуальной проверки, обладают идентичностью последовательности или подобием последовательности.

Одним из примеров алгоритма, который пригоден для определения процента идентичности последовательности или подобия последовательности, является алгоритм FASTA, который описан в Pearson, W. R. & Lipman, D. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. См. также W. R. Pearson, (1996) Methods Enzymology 266:227-258. Предпочтительные параметры, используемые при выравнивании последовательностей ДНК FASTA для вычисления процента идентичности или процента подобия, оптимизированы, BL50 Matrix 15: -5, k-tuple = 2; штраф на соединение = 40, оптимизация = 28; штраф на гэп -12, штраф на длину гэпа = -2; и ширина = 16.

Другим примером полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивных попарных выравниваний, чтобы показать отношение и процент идентичности последовательностей или процент подобия последовательностей. Он также строит дерево или дендрограмму, показывающую кластерные отношения, используемые для создания выравнивания. PILEUP использует упрощение прогрессивного способа выравнивания Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. Используемый способ подобен способу, описанному Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. Эта программа может выравнивать вплоть до 300 последовательностей, каждая максимальной длины 5000 нуклеотидов или аминокислот. Операция множественного выравнивания начинается с попарного выравнивания двух наиболее подобных последовательностей, создавая кластер двух выровненных последовательностей. Затем этот кластер выравнивают со следующей наиболее родственной последовательностью или кластером выровненных последовательностей. Два кластера последовательностей выравнивают путем простого распространения попарного выравнивания двух индивидуальных последовательностей. Конечное выравнивание достигается серией прогрессивных попарных выравниваний. Программа осуществляется путем определения конкретных последовательностей и их координат аминокислот или нуклеотидов для областей сравнения последовательности и путем определения параметров программы. Используя PILEUP, референсную последовательность сравнивают с другими тестируемыми последовательностями для определения отношения процента идентичности последовательностей (или процента подобия последовательностей) с использованием следующих параметров: взвешенные гэпы по умолчанию (3.00), взвешенная длина гэпов по умолчанию (0.10) и взвешенные концы гэпов. PILEUP может быть получена из пакета программ анализа последовательностей GCG, например, версии 7.0 (Devereaux et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:387-395).

Другим примером алгоритма, который пригоден для множественных выравниваний ДНК и аминокислотных последовательностей, является программа CLUSTALW (Thompson, J. D. et al., (1994) Nuc. Acids Res. 22:4673-4680). CLUSTALW проводит множественные попарные сравнения между группами последовательностей и собирает их в множественное выравнивание, основанное на идентичности последовательностей. Штрафы на открытие гэпа и удлинение гэпа составляют 10 и 0,05 соответственно. Для аминокислотных выравниваний можно использовать алгоритм BLOSUM в качестве весовой матрицы белков (Henikoff and Henikoff, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919).

Как упомянуто выше, члены семейств целлобиогидролаз и целлюлаз могут быть идентифицированы с помощью выравнивания последовательностей, и получена замена в мотиве GECDG (см., например, SEQ ID NO:2, аминокислоты 312-316). Затем модифицированный полипептид можно анализировать на активность, как описано ниже, при различных температурах и условиях, чтобы идентифицировать те модификации, которые вводят благоприятную активность. Примерные последовательности можно найти в приведенных ниже номерах по каталогу GenBank, которые включены в данную заявку посредством ссылки.

Еще в одних других формах осуществления семейство вариантов целлюлазных полипептидов, обладающих улучшенной термостойкостью, включает приведенные в нижеследующей таблице, имеющие замену C→S, G→S или A→S. Кроме того, полипептиды, обладающие 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичностью последовательности с любой из приведенных ниже последовательностей, имеющих идентифицированные замены, в нижеследующей таблице, обладающие целлюлазной активностью и термостойкостью, также охвачены изобретением.

Р07987	Q6E5B1
GUX2_TRIRE	Q6E5B1_9AGAR
Q9HEY8	В7Х920
Q9HEY8_TRIRE	В7Х920_СОРС1
Q7LSP2	A8NEJ3
Q7LSP2_RIKO	A8NEJ3_СОРС7
Q6UJX9	Q96V98
Q6UJX9 TRIVI	Q96V98 ORPSP
A3QVU7	Q7Z7X6
A3QVU7_TRIVI	Q727X6_PIREQ
1HCL5	Q870B2
Q1HCL5_TRIKO	Q870B2_9FUNG
Q66PN1	Q874E1
Q66PN1_9HYPO	Q874E1_ORPSP
B5TWC7	A9FHT2
B5TWC7_9HYPO	A9FHT2_SORC5
Q9C1S9	BOFEV9
GUX6_HUMIN	BOFEV9_9FUNG

Q2GMP2	Q6EY63
Q2GMP2_CHAGB	Q6EY63_9FUNG
A7E6G7	Q6EH22
A7E6G7_SCLS1	Q6EH22_NEOPR
QOUPA5	66EA50
QOUPA5_PHANO	B6EA50_NEOPA
A6S7A6	80FEV4
A6S7A6_BOTFB	80FEV_NEOPA
P49075	6EIY8
GUX3_AGABI	Q6EIY8_NEOPR
Q02321	Q9UW10
Q02321_PHACH	Q9UW10_9FUNG
Q9C1R4	Q12646
Q9C1R4_LENED	Q12646_NEOPA
Q96VU2	Q6A4K7
Q96VU2_LENED	Q6A4K7_9FUNG
B2ABX7	Q9UW11
B2ABX7_PODAN	Q9UW11_9FUNG
A4RPH6	Q9P8Q8
A4RPH6_MAGGR	Q9P8Q8_9FUNG
	BOFEV8
	BOFEV8_9FUNG

Еще в одних других формах осуществления семейство вариантов целлюлазных полипептидов, обладающих улучшенной термостойкостью, включает приведенные в нижеследующей таблице, имеющие замену C→S, G→S или A→S. Кроме того, полипептиды, обладающие 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичностью последовательности с любой из приведенных ниже последовательностей, имеющих замены, идентифицированные в нижеследующей таблице, и обладающие целлюлазной активностью и термостойкостью, также охвачены изобретением.

Выравнивание группирования аминокислотного каркаса Н. jecorina CBH II Cys311 на белковые последовательности, обладающие самой высокой идентичностью Н. jecorina CBH II. Показаны остатки в положении, эквивалентном 311, полужирным шрифтом и подчеркиванием. Последовательности рекомбинантных Н. insolens и Р. chrys CBH II, исследованных в данной работе, обозначены как Н. inso и Р. chrys. Пятьдесят четыре из 250 наиболее идентичных последовательностей было исключено вследствие избыточности (то есть точечных мутантов для структурных исследований или >95% идентичных изоформ). Идентифицирован номер по каталогу для целлюлазы, и соответствующая последовательность включена в данную заявку посредством ссылки в виде прямого копирования из номера по каталогу базы данных. Последовательности, соответствующие номерам по каталогу, указаны как SEQ ID NO:79-106. Остаток, подчеркнутый жирным шрифтом (например, С, А или G), заменен S. Номер в скобках, следующий за идентифицированной последовательностью, соответствует SEQ ID NO:)

Для целей изобретения полипептид по изобретению проявляет улучшенную термостойкость по сравнению с соответствующим родительским полипептидом, если он имеет T₅₀, которое по меньшей мере примерно на 4°С или по меньшей мере примерно на 9°С выше, чем для родительской целлюлазы, или целлобиогидролаза имеет Т₅₀ от примерно 4°С до примерно 30°С или на любое количество между ними выше, или Т₅₀ от примерно 9°С до примерно 30°С или на любое количество между ними выше по сравнению с родительской целлобиогидролазой. Т₅₀ представляет собой температуру, при которой модифицированный или природный фермент сохраняет 50% его остаточной активности после предварительной инкубации в течение 15 минут, и определенной с помощью анализа, подробно описанного в приведенных ниже Примерах, или как известно в данной области техники.

Модифицированные целлобиогидролазы или целлюлазы по изобретению могут иметь T₅₀, которое от примерно 4°С до примерно 30°С или на любой интервал между ними выше, чем для соответствующей родительской целлобиогидролазы (например, SEQ ID NO:2, 4 или 6), от примерно 5°С до примерно 20°С или на любой интервал между ними выше, от примерно 8°С до примерно 15°С или на любой интервал между ними выше или от примерно 9°С до примерно 15°С или на любой интервал между ними выше. Например, модифицированная целлюлаза может иметь Т₅₀, которое по меньшей мере примерно на 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30°С выше, чем для соответствующей родительской целлобиогидролазы.

Варианты, идентифицированные в данной заявке, можно также использовать для создания химерных целлобиогидролаз. Например, SCHEMA использована ранее для создания семейств сотен активных химер ферментов β-лактамазы и цитохрома Р450. SCHEMA использует данные белковой структуры для определения границ непрерывных аминокислотных ″блоков″, которые минимизируют <Е>, библиотечное среднее число контактов боковых цепей аминокислот, когда блоки обмениваются между различными родителями. Показано, что вероятность того, что химера β-лактамазы является уложенной и активной, связана обратной связью со значением Е для этой последовательности. Алгоритм RASPP (Recombination as Shortest Path Problem, рекомбинация как кратчайший путь к решению проблемы) использовали, чтобы идентифицировать границы блоков, которые минимизируют <E> относительно библиотечного среднего числа мутаций, <m>. Более 20% ~500 уникальных химер, охарактеризованных из коллекции β-лактамаз, состоящих из 8 блоков от 3 родителей (3⁸=6561 возможных последовательностей), были каталитически активными. С помощью подобного подхода было получено семейство химер от 3 родителей, 8 блоков цитохрома Р450, содержащее более чем 2300 новых каталитически активных ферментов. Химеры из этих коллекций характеризовались высоким числом мутаций, 66 и 72 аминокислоты в среднем от ближайшего родителя, соответственно. Таким образом, программа SCHEMA/RASPP обеспечила разработку семейств химер, обладающих значительным разнообразием последовательностей и заметной долей функциональных членов.

Также показано, что термостойкости химер SCHEMA могут быть предсказаны на основании данных стабильности последовательности из малой выборки последовательностей. Моделированные данных термической инактивации методом линейной регрессии для 184 химер цитохрома Р450 показало, что блоки SCHEMA вносили аддитивный вклад в термостойкость. С помощью этой модели более 300 химер было предсказано как термостойкие, и все 44, которые были протестированы, были более стабильны, чем наиболее стабильный родитель. Было установлено, что всего лишь 35 измерений термостойкости можно использовать для предсказания наиболее термостойких химер. Кроме того, термостойкие химеры Р450 проявляли уникальные профили активности и специфичности, демонстрируя, что химерогенез может привести к дополнительным полезным свойствам ферментов. В данной заявке рекомбинация ферментов СВН II по SCHEMA может создать химерные целлюлазы, которые активны на целлюлозе, набухающей в фосфорной кислоте (PASC), при высоких температурах, в течение пролонгированных периодов времени и в широких диапазонах рН.

Используя способы, раскрытые в данной заявке, был создан ряд химерных полипептидов, обладающих целлобиогидролазной активностью, обладающих улучшенными характеристиками по сравнению с родительскими белками СВН II дикого типа.

Разнообразное семейство новых ферментов СВН II был сконструировано путем обмена блоков последовательности из трех грибных ферментов СВН II. Двадцать три из 48 химерных последовательностей, отобранных из данной серии, секретировались в активной форме S. cerevisiae, и пять имели период полураспада при 63°С, который был выше, чем у самого стабильного родителя. Учитывая, что данная 48-членная серия образцов составляет менее 1% возможных суммарно 6561 последовательностей, авторы изобретения предсказывают, что данная коллекция химер уже содержит сотни активных термостойких ферментов СВН II, число, которое значительно превышает примерно двадцать грибных ферментов СВН II в базе данных CAZy.

Подход использования данных по стабильности последовательности серии образцов для идентификации блоков, которые вносят положительный вклад в термостойкость химеры, оценивали в результате обнаружения того, что все 10 каталитически активных химер во второй серии оценивания СВН II были более термостойкими, чем наиболее термостойкий родитель, естественно термостойкий СВН II из термостойких грибов, Н. insolens. Это открытие, таким образом, дополнительно позволило создать суммарно 33 новых фермента СВН II, которые экспрессируются в каталитически активной форме в S. cerevisiae, 15 из которых являются более термостойкими, чем наиболее стабильный родитель, из которого они были сконструированы. Эти 15 термостойких ферментов являются различными по последовательности, отличающимися друг от друга и от их ближайших природных гомологов более чем по 94 и 58 положениям аминокислот, соответственно.

Анализ термостойкости химер СВН II в комбинированном образце и в серии оценок показывает, что четыре идентифицированных термостабилизирующих блока, В1Р1, В6Р3, В7Р3 и В8Р2, вносят кумулятивный вклад в термостойкость, когда присутствуют в одной и той же химере. Четыре из пяти химер из серии образцов, которые являются более термостойкими, чем Н. insolens СВН II, содержат два или три из этих термостабилизирующих блоков (Таблица 1). Десять дополнительных членов этой серии оценок, два из которых более стабильны, чем фермент Н. insolens, содержат по меньшей мере два стабилизирующих блока, где пять или шесть термостойких химер в этой группе содержат либо три, либо четыре стабилизирующих блока.

Изобретение демонстрирует, что стабилизирующие блоки можно перекомбинировать, чтобы создать новые высоко стабильные, активные целлюлазы. Регрессионная модель стабильности предсказывает, что библиотека СВН II программы SCHEMA содержит 2026 химер, которые более стабильны, чем наиболее стабильный родительский фермент. Эти химеры являются разнообразными и отличными от нативных целлюлаз: они отличаются о т родителей примерно на 8 и 72 мутации (в среднем на 50) и друг от друга в среднем на 63 мутации. Суммарно 33 гена из этой серии было синтезировано и экспрессировано в S. cerevisiae: было обнаружено, что каждый из этих СВН II более стабилен, чем наиболее стабильная родительская целлюлаза из термофильного гриба Н. insolens, как измерено либо на основании ее полураспада, либо на основании ее инактивации при 63°С или Т₅₀. Уменьшение сложности последовательности путем создания химер только из восьми блоков дало возможность создания модели стабильности последовательности и идентификации одного высоко стабилизирующего блока последовательности. За счет тестирования только десяти аминокислотных замен в этом блоке была идентифицирована единственная высоко стабилизирующая замена. Очень большой стабилизирующий эффект замены C313S (в отношении последовательности SEQ ID NO:6; C314S, SEQ ID NO:2 и 0311S, SEQ ID NO:4), наблюдаемый во всех химерах и в нативных ферментах СВН II Р. chrysosporium, Н. insolens и Н. Jecorina, позволил предположить, что мутация любого остатка в данном положении на Ser может стабилизировать любое семейство 6 целлюлаз, в которое она введена.

Минимизация числа разрушенных контактов при рекомбинации (Фиг.2С) дает возможность аппроксимировать блоки как несвязанные единицы, которые вносят независимый вклад в стабильность всего белка, приводя, таким образом, к кумулятивным или даже аддитивным вкладам в термостойкость химеры. Для рекомбинации данного фермента СВН II алгоритм SCHEMA был эффективен при минимизации таких разрушенных контактов: если в кристаллической структуре родительского СВН II Н. insolens определено суммарно 303 межблочных контакта, дизайн СВН II библиотеки SCHEMA приводит в результате только к 33 потенциальным разрушенным контактам. С учетом того, что фермент СВН II родителей не характеризуется очевидными структурными субдоменами, и только четыре из восьми блоков (1, 5, 7 и 8) напоминают компактные структурные единицы или модули, низкое число разрушенных контактов демонстрирует, что алгоритм SCHEMA/RASPP эффективен для случаев, в которых число блоков оказывается более высоким, чем число структурных подразделений. Как наблюдали ранее для химер β-лактамазы и цитохрома Р450, низкие значения Е были предсказательными для укладки и активности химер. Хотя это не использовано в данной заявке, данное отношение должно быть значимым для конструирования серий химерных образцов, которые содержат высокую долю активных членов.

В изобретении также использована химера, чтобы определить, можно ли улучшить стабильность рН в ферментах СВН II. Если удельная активность Н. jecorina СВН II резко снижается, когда рН повышается выше оптимального значения 5, HJPlus, созданный путем замещения стабилизирующих блоков на наиболее промышленно релевантном ферменте Н. jecorina СВН II, сохраняет значительно более высокую активность при этих более высоких рН (Фиг.4). Термостойкие химеры 11113132 и 13311332, а также родительские целлюлазы Н. insolens и С. thermophilum СВН II имеют даже более широкие профили рН/активности, чем HJPlus. Узкий профиль рН/активности Н. jecorina СВН II считают связанным с депротонированием нескольких пар карбоксил-карбоксилат, которое дестабилизирует белок выше рН ~6. Замещение родителя 3 в блоке 7 в HJPlus изменяет аспартат 277 на гистидин, элиминируя пару карбоксил-карбоксилат между D277 и D316 (блока 8). Замещение D277 положительно заряженным гистидином может предотвратить дестабилизирующее отталкивание зарядом при некислом рН, давая возможность HJPlus сохранять активность при более высоком рН, чем Н. jecorina СВН II. Даже более широкие профили рН/активности двух остальных термостойких химер и родительских ферментов СВН II Н. insolens и С.thermophilum может быть следствием отсутствия кислых остатков в положениях, соответствующих паре карбоксил-карбоксилат Е57-Е119 HJPlus и Н. jecorina СВН II.

HJPlus проявляет как относительно высокую удельную активность, так и высокую термостойкость. На фиг.5 показано, что эти свойства приводят к хорошим характеристикам в экспериментах по долговременному гидролизу: HJPlus гидролизовал целлюлозу при температурах на 7-15°С выше, чем родительские ферменты СВН II, а также обладал значительно повышенной долговременной активностью относительно всех родителей при их температурном оптимуме, улучшая Н. jecorina CBH II в 1,7 раза. С учетом того, что удельная активность химеры HJPlus меньше, чем у родителя Н. jecorina CBH II, эту повышенную долговременную активность можно считать следствием способности термостойкой HJPlus к сохранению активности при оптимальных температурах гидролиза в течение более длительного времени реакции.

Две другие термостойкие химеры имели общий с HJPlus широкий температурный диапазон. Это наблюдение подтверждает положительную корреляцию между t_1/2 при повышенной температуре и максимумом рабочей температуры, и позволяет предположить, что многие термостойкие химеры среди 6561 последовательностей химер CBH II будут также способны к расщеплению целлюлозы при повышенных температурах. Хотя эта способность к гидролизу аморфного субстрата PASC при повышенных температурах хорошо предсказывает потенциальную пользу термостойких химер грибного CBH II, исследования с более проблемными кристаллическими субстратами и субстратами, содержащими лигнин, обеспечат более полную оценку релевантности этих новых семейств фермента CBH II для применений при расщеплении биомассы.

В большинстве процессов преобразования биомассы используют смеси грибных целлюлаз (прежде всего CBH II, целлобиогидролазы класса I (CBH I), эндоглюканаз и β-глюкозидазы) для достижения высоких уровней гидролиза целлюлозы. Создание разнообразной группы термостойких химер фермента CBH II является первой стадией в построении материального запаса стабильных, высокоактивных целлюлаз, из которых можно готовить смеси ферментов и оптимизировать для конкретных применений и исходного сырья.

″Пептидный сегмент″ относится к участку или фрагменту большего полипептида или белка. Пептидный сегмент необязательно сам обладает собственной функциональной активностью, хотя в некоторых случаях пептидный сегмент может соответствовать домену полипептида, где этот домен обладает своей собственной биологической активностью. Пептидным сегментом, обусловливающим стабильность, является пептидный сегмент, находящийся в полипептиде, который стимулирует стабильность, функцию и укладку по сравнению с родственным полипептидом, в котором отсутствует этот пептидный сегмент. Пептидным сегментом, обусловливающим дестабилизацию, является пептидный сегмент, который идентифицирован как вызывающий утрату стабильности, функции или укладки, когда он присутствует в полипептиде.

″Слитый″, ″оперативно сцепленный″ и ″оперативно связанный″ используют в данной заявке взаимозаменяемо для широкой ссылки на химическое или физическое сочетание двух доменов или пептидных сегментов, отличающихся во всем остальном, где каждый домен или пептидный сегмент при оперативном сцеплении может обеспечить функциональный полипептид, обладающий желаемой активностью. Домены или пептидные сегменты могут быть соединены посредством пептидных линкеров таким образом, что они являются функциональными, или могут быть слиты посредством других промежуточных соединений или химических связей. Например, два домена могут составлять часть одной и той же кодирующей последовательности, где полинуклеотиды находятся в одной рамке считывания, так что этот полинуклеотид при транскрипции кодирует единую мРНК, которая при трансляции включает оба домена в виде единого полипептида. Альтернативно оба домена могут экспрессироваться по отдельности в виде индивидуальных полипептидов, и их сливают друг с другом, используя химические способы. Типично кодирующие домены сцеплены ″в рамке″ либо непосредственно, либо разделены пептидным линкером, и кодируются в виде единого полипептида. Различные кодирующие последовательности для пептидных линкеров и пептида известны в данной области техники.

″Полинуклеотид″ или ″нуклеиново-кислотная последовательность″ относится к полимерной форме нуклеотидов. В некоторых случаях полинуклеотид относится к последовательности, которая не является непосредственно примыкающей к любой из кодирующих последовательностей, к которой она непосредственно примыкает (либо на 5′ конце, либо на 3′ конце) в природном геноме организма, от которого она имеет происхождение. Этот термин, таким образом, включает, например, рекомбинантную ДНК, которую встраивают в вектор; в автономно реплицирующуюся Плазмиду или вирус; либо в геномную ДНК прокариота или эукариота, либо которая существует в виде отдельной молекулы (например, кДНК) независимо от других последовательностей. Нуклеотиды по изобретению могут представлять собой рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или модифицированные формы любого нуклеотида. Полинуклеотиды, как используют в данной заявке, относятся среди прочего к одно- и двунитевой ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двунитевых участков, одно- и двунитевой РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двунитевых участков, к гибридным молекулам, содержащим ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми или, более типично, двунитевыми или представлять собой смесь одно- и двунитевых участков. Термин полинуклеотид охватывает как геномную ДНК или РНК (в зависимости от организма, то есть РНК геном вирусов), так и мРНК, кодируемую геномной ДНК, и кДНК.

″Нуклеиново-кислотный сегмент,″ ″олигонуклеотидный сегмент″ или ″полинуклеотидный сегмент″ относится к участку большей полинуклеотидной молекулы. Полинуклеотидный сегмент необязательно должен соответствовать кодируемому функциональному домену белка; однако, в некоторых случаях сегмент кодирует функциональный домен белка. Полинуклеотидный сегмент может составлять примерно 6 нуклеотидов или более в длину (например, 6-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400 или более нуклеотидов в длину). Пептидный сегмент, обусловливающий стабильность, может кодироваться полинуклеотидным сегментом, обусловливающим стабильность, где этот пептидный сегмент стимулирует стабильность, функцию или укладку по сравнению с полипептидом, в котором отсутствует этот пептидный сегмент.

″Химера″ относится к комбинации по меньшей мере двух сегментов по меньшей мере двух различных родительских белков. Как понятно специалисту в данной области техники, сегменты необязательно действительно происходят от каждого из родителей, то есть представляют собой конкретную последовательность, которая является релевантной, а не сами по себе физические нуклеиновые кислоты. Например, химерные грибные целлобиогидролазы класса II (целлюлазы СВН II) будут иметь по меньшей мере два сегмента от двух различных родительских полипептидов СВН II. Эти два сегмента соединены таким образом, что приводят в результате к новому полипептиду, обладающему целлюлазной активностью. Иными словами, белок не будет химерой, если он имеет идентичную последовательность любому из полноразмерных родителей. Химерный полипептид может содержать более чем два сегмента от двух различных родительских белков. Например, для каждой конечной химеры или библиотеки химер может быть 2, 3, 4, 5-10, 10-20 или более родителей. Сегмент каждого родительского полипептида может быть очень коротким или очень длинным, где сегменты могут иметь диапазон длины непрерывных аминокислот от 1 до 90%, 95%, 98% или 99% всей длины белка. В одной форме осуществления минимальная длина составляет 10 аминокислот. В одной форме осуществления единый кроссоверный сайт определен для двух родителей. Положение кроссовера определяет, где останавливается аминокислотный сегмент одного родителя и где начинается аминокислотный сегмент следующего родителя. Таким образом, простая химера будет иметь только одно положение кроссовера, где сегмент перед этим положением кроссовера будет принадлежать одному родителю, а сегмент после этого положения кроссовера будет принадлежать второму родителю. В одной форме осуществления химера имеет более чем одно положение кроссовера, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-30 положений кроссовера или более. Ниже обсуждается, как эти положения кроссовера называют и определяют. В форме осуществления, где имеется два положения кроссовера и два родителя, будет первый непрерывный сегмент от первого родителя, за которым следует второй непрерывный сегмент от второго родителя, за которым следует третий непрерывный сегмент от первого родителя. Непрерывный подразумевают как означающий, что прерывание сегментов не происходит. Эти непрерывные сегменты соединены с образованием непрерывной аминокислотной последовательности. Например, химера СВН II от Humicola insolens (далее в данной заявке ″1″) и Н. jecori (далее в данной заявке ″2″) с двумя кроссоверами в положениях 100 и 150 может иметь первые 100 аминокислот от 1, за которыми следуют следующие 50 от 2, за которыми следуют остальные аминокислоты от 1, где все они соединены в одну непрерывную цепь аминокислот. Альтернативно химера СВН II может иметь первые 100 аминокислот от 2, за которыми следуют следующие 50 от 1, за которыми следуют остальные от 2. Как понятно специалисту в данной области техники, существуют как варианты, так и точные последовательности химер. Таким образом, не 100% каждого сегмента обязательно должно присутствовать в конечной химере, если она является вариантом химеры. Количество, которое может быть изменено, либо посредством дополнительных остатков, либо удаления или изменения остатков, будет определяться так, как определено термином вариант. Конечно, как понятно специалисту в данной области техники, приведенное выше обсуждение применимо не только к аминокислотам, но также к нуклеиновым кислотам, которые кодируют аминокислоты.

Кроме конкретных вариантов, в изобретении описаны варианты, которые можно использовать для создания химер СВН II. Библиотеку направленной рекомбинации SCHEMA использовали для создания ферментов целлобиогидролаз на основе особенно хорошо изученного члена этого семейства разнообразных ферментов, и более конкретно ферментов целлобиогидролаз II: Н. insolens является родителем ″1″ (SEQ ID NO:2), H. jecorina является родителем ″2″ (SEQ ID NO:4), и С. thermophilum является родителем ″3″ (SEQ ID NO:6). SCHEMA представляет собой способ на компьютерной основе для предсказания того, какие фрагменты гомологичных белков могут рекомбинировать, не влияя на структурную целостность белка (см., например, Meyer et al., (2003) Protein Sci., 12:1686-1693). С помощью этого компьютерного подхода идентифицировали семь точек рекомбинации в родительских белках СВН II, что дало возможность создания библиотеки химерных полипептидов СВН II, где каждый полипептид содержит восемь сегментов. Химеры с более высокой стабильностью являются идентифицируемыми путем определения аддитивного вклада каждого сегмента в общую стабильность, либо путем использования линейной регрессии данных по стабильности, либо основываясь на консенсусном анализе MSA уложенных белков по сравнению с развернутыми. Рекомбинация SCHEMA гарантирует, что химеры сохраняют биологическую функцию и проявляют высокое разнообразие последовательности за счет сохранения важных функциональных остатков при обмене толерантных остатков.

Таким образом, как проиллюстрировано различными формами осуществления данной заявки, в изобретении предложены полипептиды СВН II, содержащие химеры родительских доменов, из которых родительская цепь полученной в результате химерной кодирующей последовательности может быть модифицирована таким образом, что содержит замену C→S, как описано выше. В некоторых формах осуществления полипептид содержит химеру, имеющую множество доменов от N- до С-конца из различных родительских белков СВН II: (сегмент 1)-(сегмент 2)-(сегмент 3)-(сегмент 4)-(сегмент 5)-(сегмент 6)-(сегмент 7)-(сегмент 8);

где сегмент 1 включает аминокислотные остатки от примерно 1 до примерно x₁ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 2 составляют аминокислотные остатки от примерно x₁ до примерно x₂ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 3 составляют аминокислотные остатки от примерно x₂ до примерно x₃ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 4 составляют аминокислотные остатки от примерно x₃ до примерно x₄ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 5 составляют аминокислотные остатки от примерно x₄ до примерно x₅ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 6 составляют аминокислотные остатки от примерно x₅ до примерно x₆ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 7 составляют аминокислотные остатки от примерно х₆ до примерно х₇ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); и сегмент 8 составляют аминокислотные остатки от примерно х₇ до примерно х₈ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NQ:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″);

где: x₁ представляет собой остаток 43, 44, 45, 46 или 47 SEQ ID NO:2, или остаток 42, 43, 44, 45 или 46 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₂ представляет собой остаток 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:2, или остаток 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₃ представляет собой остаток 113, 114, 115, 116, 117 или 118 SEQ ID NO:2, или остаток 110, 111, 112, 113, 114, 115 или 116 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₄ представляет собой остаток 153, 154, 155, 156 или 157 SEQ ID NO:2, или остаток 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 или 156 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₅ представляет собой остаток 220, 221, 222, 223 или 224 SEQ ID NO:2, или остаток 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₆ представляет собой остаток 256, 257, 258, 259, 260 или 261 SEQ ID NO:2, или остаток 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 или 260 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₇ представляет собой остаток 312, 313, 314, 315 или 316 SEQ ID NO:2, или остаток 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315 или 318 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; и x₈ представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий С-концу полипептида, имеющего последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.

Используя приведенные выше соотношения доменов, был создан ряд химерных структур, которые приведены в таблице 1.

1588 последовательностей химер СВН II, для которых предсказаны более высокие значения T₅₀, чем измеренное значение Т₅₀ 64,8°С для родительского СВН II Н. insolens

31313232	13132231	13212231	21113231	2211233	33211132	22223232	32123131
31323333	11221233	13331133	21133232	2122213	33211131	31213132	11221333
11212133	33123232	13232232	22221133	3233313	12311232	22223231	11211231
31313231	33123231	13232231	21133231	3233313	12321333	22322232	11231232
31333232	21311333	22121133	23211232	2213233	33231132	31213131	11231231
11232133	21331333	33223232	23221333	2213233	12311231	31312132	33123332
31333231	32213332	23111232	23211231	3331333	33231131	22322231	33123331
21323112	32213331	23121333	23231232	3331333	12331232	31312131	31321232
21323111	32312332	33223231	11311333	3333333	12331231	31233132	31321231
32113332	21211133	33322232	23231231	3333333	23122232	31233131	33122132
32113331	32312331	23111231	21122133	3321313	23122231	31332132	33122131
31223133	13321(12	33322231	11331333	3321313	11113232	31332131	12123232
21111133	32233332	23131232	11211133	3331213	11123333	23321133	12123231
31322133	13321111	23131231	11231133	3331213	11113231	23222232	32121332
32133332	32233331	11323112	33113132	1231323	11133232	23222231	32121331
32133331	32332332	11323111	33113131	1232333	12221133	11213232	21323133
21131133	21231133	11111133	33133132	3323313	11133231	11223333	13122232
32112132	32332331	11131133	33133131	1231323	31111332	11213231	13122231
32112131	32121232	32221232	31321133	3323313	31111331	11312232	22113132
32132132	32121231	32221231	31222232	3333213	31131332	11322333	22113131
32132131	13313133	22313232	31222231	3333213	13211232	11312231	22133132
21321312	32212132	22323333	12123133	1233323	31131331	11233232	22133131
33112332	32212131	22313231	32111132	1233323	13221333	11233231	23113332
21321311	13333133	22333232	13113232	3231133	13211231	11332232	23113331

33112331	32232132	22333231	13123333	3231133	13231232	11332231	23133332
11223233	32232131	31122232	32111131	3233133	22212332	31211332	23133331
33132332	33212332	31122231	13113231	3233133	13231231	31211331	12212332
11322233	33212331	11321312	32131132	1222313	22212331	31231332	21311232
33132331	22123133	11321311	13133232	1232213	11122133	31231331	12212331
31211232	33232332	22223133	32131131	3111333	22232332	12112332	21321333
31221333	33232331	22322133	13133231	3111333	22232331	31323232	21311231
31211231	23113232	23213232	33111332	3113333	33321232	12112331	12232332
21313333	23123333	23223333	33111331	3221113	33321231	11222133	21331232
31231232	23113231	23213231	33131332	1321323	23323133	31323231	12232331
31231231	23133232	23312232	11321233	3113333	31213332	12132332	21331231
21221112	23133231	23322333	33131331	1322333	31213331	12132331	23112132
21333333	11121112	23312231	13122133	3221113	31312332	321233.3	23112131
21221111	12311133	23233232	12111232	1321323	31312331	32123331	23132132
12112232	11121111	11313333	12121333	1331223	31233332	21121133	23132131
12122333	12212232	23233231	12111231	1332233	31233331	32122132	32223332
1211223	12222333	23332232	12131232	13312231	31332332	32122131	2211133
1213223	12212231	23332231	12131231	32231132	31332331	33122332	3222333
1213223	2:1321233	11221112	32313332	13233232	31121232	33122331	3232233
2121313	12331133	11333333	32313331	32231131	31121231	31221232	2211133
2131213	12232232	11221111	21311133	13233231	22321133	31221231	2122113
1332311	12232231	23222133	21212232	13332232	22222232	21313232	3232233
1332311	13311333	11213133	21222333	13332231	31212132	21323333	2213133
2123313	23122133	11312133	32333332	33211332	22222231	21313231	2213133
2133213	13331333	11233133	21212231	33211331	31212131	21333232	1332313
3212323	11113133	11332133	32333331	33231332	31232132	21333231	322Z213
3212323	11133133	22211232	21331133	33231331	31232131	12122232	3222213
1311113	32223232	22221333	21232232	22122232	23311232	12122231	3331113
1313113	22111232	22211231	21232231	31112132	23321333	22113332	3331113
1232111	22121333	22231232	32213132	22122231	23311231	22113331	3322233
1232111	32223231	22231231	32213131	31112131	23331232	21223133	3322233
3312223	32322232	31323133	32312132	31132132	23331231	21322133	3333113
3312223	22111231	21112232	32312131	33323232	21123133	22133332	3333113
2121133	32322231	21122333	32233132	31132131	23221133	22133331	2312323
1332131	22131232	21112231	32233131	13222133	11311133	13121133	2312323
1332131	22131231	21132232	32332132	33323231	11212232	22112132	1232113
2123133	13211133	21132231	32332131	12211232	11222333	22112131	1222223
1112311	13231133	32113132	33213332	12221333	11212231	22132132	1222223
1231313	11323312	32113131	33213331	12211231	11331133	22132131	1331123
1112311	11323311	11211333	33312332	12231232	11232232	33313132	1332133
2132323	33321133	32133132	33312331	12231231	11232231	33313131	1331123
1233313	33222232	32133131	33233332	23121133	31223232	23112332	2221333
1331333	33222231	11231333	33233331	11112232	21111232	23112331	1333123
3221233	11111333	33113332	33332332	11122333	21121333	33333132	2221333
3221233	11131333	33113331	33332331	11112231	31223231	33333131	2231233
1322111	11223112	33133332	33121232	11132232	31322232	23132332	1333123
1333333	11223111	11323233	33121231	32321232	21111231	23132331	2231233

1322111	11322112	33133331	33212132	11132231		31322231	21211232		1112313
3223233	11322111	31311232	33212131	32321231		21131232	21221333		2223333
3223233	13321233	31321333	12213232	31123232		21131231	21211231		2223333
2211323	22213232	31311231	12223333	31123231		32122332	21231232		2233233
2212333	22223333	31331232	12213231	22323133		32122331	21231231		2233233
2211323	22213231	31331231	12312232	33221232		13123133	12323133		2212123
2213323	22312232	21321112	12322333	33221231		33111132	32311132		3111113
2213323	22322333	33112132	33232132	23313232		33111131	13313232		2212123
1321313	22312231	21321111	12312231	23323333		33131132	13323333		3111113
1331213	22233232	33112131	33232131	23313231		33131131	32311131		3113113
1323313	22233231	12113232	12233232	23333232		21213232	13313231		3113113
1333213	22332232	12123333	12233231	23333231		21223333	32222332		1322113
1112131	22332231	12113231	12332232	11321112	21213231			32222331	2221213
1231133	31121133	33132132	12332231	11321111	21312232			32331132	2221213
1112131	11221312	33132131	32211332	23223133	21322333			13333232	2223213
2212213	11221311	12133232	32211331	23322133	21312231			32331131	2223213
1233133	22222133	12133231	23123133	11313133	21233232			13333231	2321233
3332313	23311133	32111332	32231332	11333133	21233231			33311332	2321233
2311223	23212232	32111331	32231331	22311232	21332232			33311331	2323233
3312233	23222333	31221133	32323232	22321333	21332231			33331332	2323233
2311223	23212231	32131332	12222133	22311231	12121133			22123232	1111123
1111333	23331133	21313133	32323231	31212332	13111232			33331331	1112133
2313223	11213333	32131331	31112332	31212331	13121333			31113132	1111123
2313223	23232232	21333133	31112331	22331232	13111231			22123231	1113123
1113333	11312333	12122133	13311133	22331231	32313132			31113131	1113123
1221113	23232231	13112232	31132332	31232332	32313131			31133132	3131333
2122123	11233333	13122333	13212232	31232331	13131232			31133131	3131333
1223113	11332333	13112231	31132331	21113232	22112332			13223133	3133333
1321133	11121233	13132232	13222333	21123333	13131231			13322133	3133333
2213113	22331331	13111331	33323132	33321132	22121132			11311132	1132113
3322333	21113332	13131332	33323131	33321131	22121131			11311131	1132113
2311133	21113331	13131331	23122332	11111332	23121332			11222332	1132313
3322333	21133332	21212132	23122331	11111331	23121331			11222331	1132313
3332233	22211132	21212131	11113332	11131332	11111132			11331132	1132133
2311133	21133331	21232132	11113331	11131331	11111131			11331131	1132133
3332233	22211131	21232131	11133332	13321232	11131132			21121332	1122113
2313133	22231132	12313332	12211132	13321231	11131131			21121331	1122113
2313133	22231131	12313331	11133331	22223332	22323332			13123132	2132113
3322213	23211332	12333332	12211131	22223331	22323331			13123131	2132113
3322213	23211331	12333331	21221232	22322332	22223132			21223332	1332113
1222323	23231332	33121132	21221231	22322331	22223131			21223331	1332113
1222323	23231331	33121131	12231132	31121132	22322132			21322332	1112113
1232223	21112132	12213132	12231131	31121131	22322131			21322331	1112113
1232223	21112131	12213131	13211332	22222132	23223332			12121132	1132333
3222133	21132132	12312132	13211331	22222131	23223331			12121131	1132333
3222133	23323232	12312131	13231332	23311132	23322332			13121332	1122313

2231333	21132131	21223232	13231331	23311131	23322331	13121331	1122313
2231333	23323231	21223231	11112132	23222332	11313332	21222132	1132213
2233333	11323133	21322232	11112131	23222331	11313331	21222131	1132213
2233333	22321232	12233132	11132132	23331132	11333332	12323332	1122133
3112233	31311132	21322231	32321132	11213332	11333331	12323331	1122133
3112233	22321231	12233131	13323232	23331131	23222132	12223132	2132313
1332113	31311131	12332132	11132131	11213331	23222131	12223131	2132313
1322223	31222332	12332131	32321131	11312332	11213132	12322132	2132133
1322223	31222331	13213332	13323231	11312331	11213131	12322131	2132133
2221313	31331132	13213331	33321332	11233332	11312132	13223332	2122113
2221313	31331131	13312332	33321331	11233331	11312131	13223331	2122113
2231213	12113132	13312331	31123132	11332332	11233132	13322332	1332313
2231213	12113131	13233332	31123131	11332331	11233131	13322331	1332313
2223313	21123232	13233331	33221132	11121232	11332132	13222132	1232113
2223313	21123231	13332332	33221131	11121231	11332131	13222131	1232113
2233213	12133132	13332331	23313132	31323332	22221332	12221332	1332133
2233213	12133131	13121232	12321232	11212132	22221331	12221331	1332133
2321333	13113332	13121231	23313131	31323331	31323132	23121132	1112313
2321333	13113331	32323132	12321231	11212131	31323131	23121131	1112313
2331233	13133332	32323131	23333132	11232132	21122332	11122332	1322113
2331233	13133331	22122332	23333131	11232131	21122331	11122331	1322113
2323333	23221232	22122331	11123232	31223132	11211332	22323132	1112133
2323333	23221231	33323332	11123231	21111132	11211331	22323131	1112133
2333233	11311232	13212132	31121332	31223131	11231332	23323332	2332113
2333233	11321333	33323331	31121331	31322132	11231331	23323331	2332113
2312123	11311231	13212131	13221232	21111131	11323232	23223132	1122333
2312123	11331232	13232132	13221231	31322131	11323231	23223131	1122333
2321213	11331231	13232131	22311132	21131132	31321332	23322132	1132233
2321213	1311213:2	12211332	22311131	21131131	31321331	23322131	1132233
2323213	13112131	12211331	22222332	11223232	12123332	11313132	1122213
2323213	13132132	12231332	22222331	11223231	12123331	11313131	1122213
2221133	13132131	12231331	22331132	11322232	31221132	11333132	2112113
2221133	12111332	33223132	22331131	11322231	31221131	11333131	2112113
1112113	12111331	23111132	23311332	31221332	21313132	22321332	2132333
2223133	11221133	33223131	23311331	31221331	21313131	22321331	2132333
2223133	12131332	33322132	23331332	21313332	21333132	21123332	2122313
2232323	12131331	23111131	23331331	21313331	21333131	21123331	2122313
3131313	33123132	33322131	21113132	21333332	12122132	22221132	2132213
2232323	33123131	12323232	21113131	21333331	12122131	22221131	2132213
3131313	21212332	12323231	21133132	12122332	13132332	23221332	1312113
2111233	21212331	23131132	21133131	12122331	13122331	23221331	1312113
2111233	21232332	23131131	23211132	21213132	11221232	11311332	2122133
3133313	21232331	11112332	23211131	21213131	11221231	11311331	2122133
3133313	32121132	11112331	23231132	21312132	21311332	21122132	1232313
2113233	13123232	11132332	23231131	21312131	21311331	21122131	1232313
2113233	32121131	32321332	11212332	21233132	21331332	11331332	1332333

2322323	13123231	11132331	11212331	21233131	21331331	11331331	1332333
2322323	33121332	32321331	11232332	21332132	21211132	11211132	1322313
2332223	33121331	31123332	11232331	21332131	21211131	11211131	1322313
2332223	12213332	31123331	31223332	13111132	21231132	11231132	1332213
1131323	12213331	32221132	21111332	13111131	21231131	11231131	1332213
1132333	12312332	13223232	31223331	13131132	13313132	31321132	1232133
1131323	12312331	32221131	31322332	13131131	13313131	31321131	1232133
1133323	12233332	13223231	21111331	21211332	13333132	12123132	1112333
1133323	12233331	13322232	31322331	21211331	13333131	12123131	1112333
3131133	12332332	13322231	21131332	21231332	22123132	13123332	1222113
3131133	12332331	22313132	21131331	21231331	22123131	13123331	1222113
3133133	23113132	22313131	31222132	12313132	23123332	11321232	1322133
3133133	121212:32	22333132	31222131	12313131	23123331	11321231	1322133
1211333	23113131	33221332	23321232	21323232	12311132	13122132	1112213
1211333	12121231	22333131	23321231	21323231	12311131	13122131	1112213
1122313	23133132	33221331	13113132	12333132	12222332	12121332	2332313
1132213	23133131	23313332	13113131	12333131	21321232	12121331	2332313
1213333	32323332	23313331	13133132	13313332	12222331	21311132	2232113
1213333	12212132	31122132	13133131	13313331	21321231	21311131	2232113
2222123	32323331	23333332	11321133	13333332	12331132	21222332	2332133
3121113	12212131	31122131	11222232	13333331	12331131	21222331	2332133
2222123	21321133	23333331	11222231	22123332	13311332	21331132	2112313
3121113	21222232	23213132	21213332	22123331	13311331	21331131	2112313
3123113	21222231	12221232	21213331	13213132	23122132	12223332	2322113
3123113	12232132	23213131	21312332	13213131	23122131	12223331	2322113
1211213	12232131	23312132	21312331	13312132	13331332	12322332
1211213	13212332	12221231	21233332	13312131	13331331	12322331
2112223	13212331	23312131	21233331	13233132	11113132	23123132
2112223	13232332	23233132	21332332	13233131	11113131	23123131
1213213	13232331	23233131	12111132	13332132	11133132	12222132
1213213	32223132	23332132	21332331	13332131	11133131	12222131
1311233	22111132	23332131	12111131	12311332	22121332	13311132
1311233	32223131	22311332	21121232	12311331	22121331	13311131
1313233	32322132	22311331	21121231	22122132	13211132	13222332
1313233	22111131	11122232	12131132	22122131	13211131	13222331
3212313	32322131	22331332	12131131	12331332	13231132	13331132
1121123	22131132	11122231	13111332	12331331	13231131	13331131

Ссылаясь на приведенную выше таблицу, каждая цифра относится к домену химерного полипептида СВН II. Номер обозначает родительскую цепь, от которой этот домен имеет происхождение. Например, химерный полипептид СВН II, имеющий последовательность 12111131, указывает на то, что этот полипептид включает последовательность от N-конца к С-концу: аминокислоты от примерно 1 до x₁ SEQ ID NO:2 (″1″), сцепленные с аминокислотами от примерно x₁ до x₂ SEQ ID NO:4 (″2″), сцепленными с аминокислотами от примерно x₂ до примерно x₃ SEQ ID NO:2, сцепленными с аминокислотами от примерно x₃ до примерно x₄ SEQ ID NO:2, сцепленными с аминокислотами от примерно x₄ до примерно x₅ SEQ ID NO:2, сцепленными с аминокислотами от примерно x₅ до примерно x₆ SEQ ID NO:2, сцепленными с аминокислотами от примерно х₆ до x₇ SEQ ID NO:6 (″3″), сцепленными с аминокислотами от примерно х₇ до x₈ (например, с С-концом) SEQ ID NO:2.

В некоторых формах осуществления полипептид СВН II имеет химерную сегментную структуру, выбранную из группы, состоящей из: 11113132, 21333331, 21311131, 22232132, 33133132, 33213332, 13333232, 12133333, 13231111, 11313121. 11332333, 12213111, 23311333, 13111313, 31311112, 23231222, 33123313, 22212231, 21223122, 21131311, 23233133, 31212111 и 32333113.

В некоторых формах осуществления полипептид обладает улучшенной термостойкостью по сравнению с полипептидом дикого типа SEQ ID NO:2, 4 или 6. Активность полипептида может быть измерена с любым из субстратов или их комбинацией, как описано в примерах. Как очевидно специалисту в данной области техники, другие соединения в пределах класса соединений, примеры которых приведены и обсуждены в примерах, можно тестировать и использовать.

В некоторых формах осуществления полипептид может иметь различные изменения аминокислотной последовательности по отношению к референсной последовательности. Эти изменения могут представлять собой замену, делецию или инсерцию одной или более чем одной аминокислоты. Где изменение представляет собой замену, эта замена может представлять собой консервативную, неконсервативную замену или комбинацию консервативных и неконсервативных замен. Например, химера может содержать замену C→S в С314 SEQ ID NO:2 или С311 SEQ ID NO:4.

Таким образом, в некоторых формах осуществления полипептиды могут включать общую структуру от N-конца к С-концу: (сегмент 1)-(сегмент 2)-(сегмент 3)-(сегмент 4)-(сегмент 5)-(сегмент 6)-(сегмент 7)-(сегмент 8),

где сегмент 1 содержит аминокислотный остаток от примерно 1 до примерно x₁ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″) и имеет 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 2 составляют аминокислотные остатки от примерно x₁ до примерно x₂ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 3 составляют аминокислотные остатки от примерно x₂ до примерно x₃ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 4 составляют аминокислотные остатки от примерно x₃ до примерно x₄ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 5 составляют аминокислотные остатки от примерно x₄ до примерно x₅ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 6 составляют аминокислотные остатки от примерно x₅ до примерно х₆ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; сегмент 7 составляют аминокислотные остатки от примерно x₆ до примерно x₇ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен; и сегмент 8 составляют аминокислотные остатки от примерно x₇ до примерно x₈ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″), и он имеет примерно 1-10 консервативных аминокислотных замен;

где x₁ представляет собой остаток 43, 44, 45, 46 или 47 SEQ ID NO:2, или остаток 42, 43, 44, 45 или 46 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₂ представляет собой остаток 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:2, или остаток 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₃ представляет собой остаток 113, 114, 115, 116, 117 или 118 SEQ ID NO:2, или остаток 110, 111, 112, 113, 114, 115 или 116 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₄ представляет собой остаток 153, 154, 155, 156 или 157 SEQ ID NO:2, или остаток 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 или 156 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₅ представляет собой остаток 220, 221, 222, 223 или 224 SEQ ID NO:2, или остаток 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₆ представляет собой остаток 256, 257, 258, 259, 260 или 261 SEQ ID NO:2, или остаток 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 или 260 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₇ представляет собой остаток 312, 313, 314, 315 или 316 SEQ ID NO:2, или остаток 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315 или 318 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; и x₈ представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий С-концу полипептида, имеющего последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, и где химера имеет алгоритм, представленный в таблице 1, и где химера содержит замену C→S, соответствующую С314 SEQ ID NO:2 или 0311 SEQ ID NO:4.

В некоторых формах осуществления число замен может составлять 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 или 10, или большее число аминокислотных замен (например, 10-20, 21-30, 31-40 и тому подобное число аминокислотных замен).

В некоторых формах осуществления функциональные полипептиды СВН II могут обладать целлюлазной активностью параллельно с повышенной термостойкостью, как, например, для определенного субстрата, обсуждаемого в примерах, а также обладает уровнем идентичности аминокислотной последовательности с референсной целлобиогидролазой или ее сегментами. Референсный фермент или сегмент может быть дикого типа (например, встречающийся в природе) или представлять собой сконструированный фермент. Таким образом, в некоторых формах осуществления полипептиды по изобретению могут содержать общую структуру от N-конца к С-концу:

где сегмент 1 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от примерно 1 до примерно x₁ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 2 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от x₁ до примерно x₂ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 3 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от x₂ до примерно x₃ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 4 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от x₃ до примерно x₄ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 5 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от примерно x₄ до примерно x₅ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 6 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от x₅ до примерно x₆ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); сегмент 7 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от x₆ до примерно x₇ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″); и сегмент 8 содержит последовательность, которая по меньшей мере на 50-100% идентична аминокислотным остаткам от х₇ до примерно x₈ SEQ ID NO:2 (″1″), SEQ ID NO:4 (″2″) или SEQ ID NO:6 (″3″);

где x₁ представляет собой остаток 43, 44, 45, 46 или 47 SEQ ID NO:2, или остаток 42, 43, 44, 45 или 46 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₂ представляет собой остаток 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:2, или остаток 68, 69, 70, 71, 72, 73 или 74 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₃ представляет собой остаток 113, 114, 115, 116, 117 или 118 SEQ ID NO:2, или остаток 110, 111, 112, 113, 114, 115 или 116 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₄ представляет собой остаток 153, 154, 155, 156 или 157 SEQ ID NO:2, или остаток 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155 или 156 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₅ представляет собой остаток 220, 221, 222, 223 или 224 SEQ ID NO:2, или остаток 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222 или 223 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₆ представляет собой остаток 256, 257, 258, 259, 260 или 261 SEQ ID NO:2, или остаток 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259 или 260 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; x₇ представляет собой остаток 312, 313, 314, 315 или 316 SEQ ID NO:2, или остаток 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315 или 318 SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6; и x₈ представляет собой аминокислотный остаток, соответствующий С-концу полипептида, имеющего последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, и где химера имеет алгоритм, представленный в таблице 1, и где химера содержит замену C→S, соответствующую С314 SEQ ID NO:2 или С311 SEQ ID NO:4.

В некоторых формах осуществления каждый сегмент химерного полипептида может обладать по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или большей идентичностью последовательности по сравнению с референсным сегментом, указанным для каждого из (сегмент 1), (сегмент 2), (сегмент 3), (сегмент 4), (сегмент 5), (сегмент 6), (сегмент 7) и (сегмент 8) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.

В некоторых формах осуществления варианты полипептидов могут обладать улучшенной термостойкостью по сравнению с ферментативной активностью полипептида дикого типа SEQ ID NO:2, 4 или 6, и где содержит замену C→S, соответствующую С314 SEQ ID NO:2 или С311 SEQ ID NO:4.

Химерные ферменты, описанные в данной заявке, могут быть получены в различных формах, таких как лизаты, грубые экстракты или изолированные препараты. Полипептиды можно растворять в подходящих растворах; готовить в виде порошков, таких как ацетоновый порошок (со стабилизаторами или без стабилизаторов); либо готовить в виде лиофилизатов. В некоторых формах осуществления полипептид может представлять собой изолированный полипептид.

В некоторых формах осуществления полипептиды могут находиться в форме наборов. Ферменты могут находиться в растворимой форме, например, в виде растворов в лунках микротитрационных планшетов, либо иммобилизованы на субстрате. Субстрат может представлять собой твердый субстрат или пористый субстрат (например, мембрану), который может состоять из органических полимеров, таких как полистирол, полиэтилен, полипропилен, полифторэтилен, полиэтиленокси и полиакриламид, а также из их сополимеров и привитых сополимеров. Твердый носитель может быть также неорганическим, таким как стекло, кремнезем, стекло с контролируемым размером пор (CPG), обращенно-фазовый кремнезем или металл, такой как золото или платина. Конфигурация субстрата может представлять собой форму шариков, сфер, частиц, гранул, геля, мембраны или поверхности. Поверхности могут быть плоскими, по существу плоскими или не плоскими. Твердые носители могут быть пористыми или непористыми, и могут обладать набухающими или не набухающими свойствами. Твердый носитель может иметь конфигурацию лунки, выемки или другого контейнера, сосуда, оборудования или положения. Множество носителей может иметь конфигурацию на матрице различных положений с электронной адресацией для робототехнической доставки реагентов или способов обнаружения и/или инструментов.

В изобретении также предложены полинуклеотиды, кодирующие сконструированные полипептиды СВН II, раскрытые в данной заявке. Полинуклеотиды могут быть оперативно сцеплены с одной или более чем одной гетерологичной регуляторной или контролирующей последовательностью, которая контролирует экспрессию гена, чтобы создать рекомбинантный полинуклеотид, способный к экспрессии экспрессируемого полипептида. Экспрессионные конструкции, содержащие гетерологичный полинуклеотид, кодирующий химеру СВН II, можно вводить в соответствующие клетки-хозяева для экспрессии полипептида.

С учетом знания конкретных последовательностей химерных ферментов СВН II (например, сегментной структуры химерного СВН II) полинуклеотидные последовательности будут очевидны специалисту в данной области техники на основании аминокислотной последовательности сконструированных химерных ферментов СВН II. Знание кодонов, соответствующих различным аминокислотам, в сочетании со знанием аминокислотной последовательности полипептидов дает возможность специалистам в данной области техники получать различные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды по изобретению, таким образом, в изобретении рассмотрены все до единой возможные вариации полинуклеотидов, которые могут быть получены путем подбора комбинаций на основании возможных выборов кодонов, и все такие вариации следует считать конкретно раскрытыми для любого из полипептидов, описанных в данной заявке.

В некоторых формах осуществления полинуклеотиды кодируют полипептиды, описанные в данной заявке, но обладают примерно 80% или большей идентичностью последовательности, примерно 85% или большей идентичностью последовательности, примерно 90% или большей идентичностью последовательности, примерно 91% или большей идентичностью последовательности, примерно 92% или большей идентичностью последовательности, примерно 93% или большей идентичностью последовательности, примерно 94% или большей идентичностью последовательности, примерно 95% или большей идентичностью последовательности, примерно 96% или большей идентичностью последовательности, примерно 97% или большей идентичностью последовательности, примерно 98% или большей идентичностью последовательности или примерно 99% или большей идентичностью последовательности на нуклеотидном уровне с референсным полинуклеотидом, кодирующим варианты полипептидов или химерные полипептиды СВН II, имеющие замену C→S, как описано выше (например, где полипептид или химера содержит замену C→S, соответствующую С314 SEQ ID NO:2 или С311 SEQ ID NO:4).

В некоторых формах осуществления изолированные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, можно подвергать разнообразным манипуляциям, чтобы обеспечить экспрессию полипептида. Манипуляции с изолированным полинуклеотидом перед его вставкой в вектор могут быть желательными или необходимыми в зависимости от экспрессионного вектора. Способы модификации полинуклеотидов и нуклеиново-кислотных последовательностей с использованием методов рекомбинантных ДНК хорошо известны в данной области техники. Руководство приведено в Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; и в Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, обновления до 2007.

В некоторых формах осуществления полинуклеотиды оперативно сцеплены с контролирующими последовательностями для экспрессии полинуклеотидов и/или полипептидов. В некоторых формах осуществления контролирующая последовательность может представлять собой соответствующую промоторную последовательность, которая может быть получена из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, либо гомологичные, либо гетерологичные для клетки-хозяина. Для бактериальных клеток-хозяев подходящие промоторы для направления транскрипции нуклеиново-кислотных конструкций по настоящему изобретению включают промоторы, полученные из lac оперона Е. соli, генов xylA и xylB Bacillus subtilis, генов утилизации ксилозы Bacillus megatarium (например, Rygus et al. (1991) Appl. Microbiol. Biotechnol. 35:594-599; Meinhardt et al., (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:343-350), прокариотического гена бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., (1978) Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), а также промотор tac (DeBoer et al., (1983) Proc. Natl Acad. Sci. USA 80:21-25). Различные подходящие промоторы описаны в ″Useful proteins from recombinant bacteria″ в Scientific American, 1980, 242:74-94; и в Sambrook et al., см. выше.

В некоторых формах осуществления контролирующая последовательность может также представлять собой соответствующую последовательность терминации транскрипции, последовательность, распознаваемую клеткой-хозяином для терминации транскрипции. Терминаторная последовательность оперативно сцеплена с 3′ концом нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей полипептид. Можно использовать любой терминатор, который является функциональным в выбранной клетке-хозяине.

В некоторых формах осуществления контролирующая последовательность может также представлять собой соответствующую лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, который важен для трансляции клеткой-хозяином. Эта лидерная последовательность оперативно сцеплена с 5′ концом нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей полипептид. Можно использовать любую лидерную последовательность, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине.

В некоторых формах осуществления контролирующая последовательность может также представлять собой участок, кодирующий сигнальный пептид, который кодирует аминокислотную последовательность, сцепленную с амино-концом полипептида, и направляет кодируемый полипептид в секреторный биохимический путь клетки. 5′ конец кодирующей последовательности нуклеиново-кислотной последовательности может естественно содержать участок, кодирующий сигнальный пептид, естественно сцепленный в рамке считывания трансляции с сегментом кодирующей области, который кодирует секретируемый полипептид. Альтернативно 5′ конец кодирующей последовательности может содержать участок, кодирующий сигнальный пептид, который является чужеродным для кодирующей последовательности. Чужеродный участок, кодирующий сигнальный пептид, может требоваться, где кодирующая последовательность естественно не содержит участок, кодирующий сигнальный пептид. Эффективными участками, кодирующими сигнальный пептид, для бактериальных клеток-хозяев могут быть участки, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов для мальтогенной амилазы Bacillus NCIB 11837, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, нейтральных протеаз Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis. Дополнительные сигнальные пептиды описаны Simonen and Palva, (1993) Microbiol Rev 57:109-137.

Далее изобретение направлено на рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий сконструированный вариант полипептида или химерный полипептид СВН II, и один или более чем один участок регуляции экспрессии, такой как промотор и терминатор, точка начала репликации и т.д., в зависимости от типа хозяев, в которых их вводят. При создании экспрессионного вектора кодирующую последовательность располагают в векторе таким образом, что кодирующая последовательность оперативно сцеплена с соответствующими контролирующими последовательностями для экспрессии.

Рекомбинантный экспрессионный вектор может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который можно удобно подвергать методам рекомбинантных ДНК, и который может вызывать экспрессию полинуклеотидной последовательности. Выбор вектора типично зависит от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую нужно вводить этот вектор. Векторы могут представлять собой линейные или замкнутые кольцевые плазмиды.

Экспрессионный вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, то есть вектор, который существует в виде экстрахромосомной молекулы, репликация которой независима от хромосомной репликации, например, плазмиду, экстрахромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. Предпочтительно вектор может быть таким, который при введении в клетку-хозяина интегрирует в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую он интегрирован. Кроме того, можно использовать один вектор или плазмиду, либо два или более чем два вектора или две плазмиды, которые вместе содержат суммарную ДНК для введения в геном клетки-хозяина, либо транспозон.

В некоторых формах осуществления экспрессионный вектор по изобретению содержит один или более чем один селективный маркер, который дает возможность легко обнаружить трансформированные клетки. Селективный маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоциду или вирусу, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и тому подобное. Примерами бактериальных селективных маркеров являются гены dal от Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин, канамицин, хлорамфеникол (пример 1) или устойчивость к тетрациклину. Другие полезные маркеры очевидны специалисту в данной области техники.

В другой форме осуществления в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид, кодирующий вариант полипептида или химерный полипептид СВН II, где полинуклеотид оперативно сцеплен с одной или более чем одной контролирующей последовательностью для экспрессии полипептида в клетке-хозяине. Клетки-хозяева для использования при экспрессии полипептидов, кодируемых экспрессионными векторами по изобретению, хорошо известны в данной области техники и включают, но не ограничены ими, бактериальные клетки, такие как Е. coli и Bacillus megaterium; эукариотические клетки, такие как клетки дрожжей, клетки СНО и тому подобное, клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как СНО, COS, BHK, 293 и клетки меланомы Боуэса; а также клетки растений. Другие подходящие клетки-хозяева будут очевидны специалистам в данной области техники. Соответствующие культуральные среды и условия выращивания для вышеописанных клеток-хозяев хорошо известны в данной области техники.

Варианты полипептидов или химерные полипептиды СВН II по изобретению могут быть получены путем использования способов, хорошо известных в данной области техники. Полинуклеотиды можно синтезировать с помощью рекомбинантных методов, таких как предложено в Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; и Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, обновления до 2007. Полинуклеотиды, кодирующие ферменты, или праймеры для амплификации могут быть также получены стандартными твердофазными способами в соответствии с известными способами синтеза, например, используя фосфорамидитный метод, описанный Beaucage et al., (1981) Tet Lett 22:1859-69, или метод, описанный Matthes et al., (1984) EMBO J. 3:801-05, например, как типично практикуют при автоматизированных способах синтеза. Кроме того, по существу любая нуклеиновая кислота может быть получена из любого из разнообразных коммерческих источников, таких как The Midland Certified Reagent Company, Midland, TX, The Great American Gene Company, Ramona, CA, ExpressGen Inc. Chicago, IL, Operon Technologies Inc., Alameda, CA, и многих других.

Сконструированные ферменты, экспрессированные в клетках-хозяевах, можно выделить из клеток или из культуральной среды, используя любой один или более чем один из хорошо известных методов очистки белка, включая среди прочего обработку лизоцимом, соникацию, фильтрование, высаливание, ультрацентрифугирование, хроматографию и аффинное разделение (например, антитела, связанные с субстратом). Подходящие растворы для лизиса и высокоэффективной экстракции белков из бактерий, таких как Е. coli, имеются в продаже под торговым названием CelLytic BTM от Sigma-Aldrich St. Louis МО.

Хроматографические методы выделения полипептидов включают среди прочего хроматографию с обращенной фазой, высокоэффективную жидкостную хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-электрофорез и аффинную хроматографию. Условия очистки конкретного фермента будут зависеть отчасти от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность, молекулярная масса, молекулярная форма и т.д., и будут очевидны специалистам в данной области техники.

Описания направленной рекомбинации SCHEMA и синтеза химерных полипептидов приведены в примерах данной заявки, а также в Otey et al., (2006), PLoS Biol. 4(5):e112; Meyer et al., (2003) Protein Sci., 12:1686-1693; заявке на патент США №12/024515, поданной 1 февраля 2008; и заявке на патент США №12/027885, поданной 7 февраля 2008; такие ссылки полностью включены в данную заявку посредством ссылки.

Как обсуждено выше, полипептид можно использовать в ряде областей применения, таких как среди прочего создание биотоплива, расщепление целлюлозы и тому подобное.

Приведенные ниже примеры подразумевают дополнительное объяснение, но не ограничение приведенного выше описания или прилагаемой формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

Конструирование экспрессионной плазмиды СВН II. Родительские и химерные гены, кодирующие ферменты СВН II, клонировали в дрожжевом экспрессионном векторе YEp352/PGK91-1-αss (Фиг.6). Последовательности ДНК, кодирующие родительские и химерные каталитические домены СВН II, конструировали со сдвигом кодонов для S. cerevisiae, используя программное обеспечение GeneDesigner (DNA2.0), и синтезировали с помощью DNA2.0. Гены каталитического домена СВН II расщепляли Xhol и Kpnl, лигировали в векторе между сайтами Xhol и Kpnl и трансформировали в E. coli XL-1 Blue (Stratagene). Гены СВН II секвенировали, используя праймеры: CBH2L (5′-GCTGAACGTGTCATCGGTTAC-3′ (SEQ ID NO:9) и RSQ3080 (5′-GCAACACCTGGCAATTCCTTACC-3′ (SEQ ID NO:10)). Родительские и химерные конструкции СВН II с С-концевым His₆ были получены путем амплификации гена СВН II с прямым праймером CBH2LPCR (5′-GCTGAACGTGTCATCGTTACTTAG-3′ (SEQ ID NO:11)) и обратными праймерами, комплементарными соответствующему гену СВН II с выступающим концом Hise и стоп-кодонами. Продукты ПЦР лигировали, трансформировали и секвенировали, как описано выше.

Экспрессия фермента СВН II в S. cerevisiae. Штамм S. cerevisiae YDR483W BY4742 (Mata his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 ΔKRE2, ATCC No. 4014317) делали компетентным, используя набор для трансформации дрожжей EZ Yeast II (Zymo Research), трансформировали плазмидной ДНК и высевали на синтетический агар без урацила. Колонии собирали в 5 мл ночные культуры синтетической среды с декстрозой и казаминовыми кислотами (SDCAA) (20 г/л декстрозы, 6,7 г/л дрожжевых азотистых оснований Difco, 5 г/л казаминовых кислот Bacto, 5,4 г/л Na₂HPO₄, 8,56 г/л NaH₂PO₄·H₂O) с добавлением 20 мкг/мл триптофана и выращивали в течение ночи при 30°С, 250 об/мин. 5 мл культуры наращивали в 40 мл SDCAA в 250 мл колбах Tunair (Shelton Scientific) и встряхивали при 30°С, 250 об/мин в течение 48 часов. Культуры центрифугировали, и супернатанты концентрировали до 500 мкл, используя ячейку для ультрафильтрации Amicon, оборудованную мембраной 30-кДа ПЭС (полиэфирсульфон), для использования в анализах t_1/2. Концентрированные супернатанты доводили до 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и 0,02% NaN₃. HiS₆-меченые белки СВН II очищали, используя спин-колонки Ni-NTA (Qiagen) согласно протоколу изготовителя, и белки обменивали в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8, используя обессоливающие колонки Zeba-Spin (Pierce). Концентрацию белка определяли, используя реагент для белков Кумасси-плюс Pierce, с БСА в качестве стандарта. Анализ с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ проводили путем нанесения либо 20 мкл концентрированного супернатанта культуры, либо примерно 5 мкг очищенного фермента СВН II на гель с 7,5% Трис-HCl (Biorad) и окрашивания безопасным красителем SimplyBlue (Invitrogen). Супернатанты или очищенные белки СВН II обрабатывали EndoH (New England Biolabs) в течение 1 ч при 37°С в соответствии с инструкциями изготовителя. Активность фермента СВН II в концентрированных супернатантах дрожжевой культуры измеряли путем добавления 37,5 мкл концентрированного супернатанта культуры к 37,5 мкл PASC и инкубации в течение 2 ч при 50°С. Образовавшиеся эквиваленты восстанавливающего сахара определяли с помощью анализа Шомоди-Нельсона, как описано ниже.

Измерения периода полураспада, удельной активности, рН-активности и долговременного гидролиза целлюлозы. Готовили целлюлозу, набухшую в фосфорной кислоте (PASC). Для усиления активности фермента СВН II на субстрате PASC предварительно инкубировали при концентрации 10 г/л с 10 мг/мл эндоглюканазы A. niger (Sigma) в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8 в течение 1 ч при 37°С. Эндоглюканазу инактивировали нагреванием при 95°С в течение 15 минут, PASC дважды промывали 50 мМ ацетатным буфером и ресуспендировали при 10 г/л в деионизованной воде.

Значения t_1/2 фермента СВН II измеряли путем добавления концентрированного супернатанта экспрессионной культуры СВН II к 50 мМ ацетату натрия, рН 4,8 при концентрации, дающей А₅₂₀ 0,5, как измерено в анализе восстанавливающего сахара Шомоди-Нельсона после инкубации с обработанной PASC, как описано выше. 37,5 мкл смесей фермент СВН II/буфер инактивировали в водяной бане при 63°С. После инактивации добавляли 37,5 мкл PASC, обработанной эндоглюканазой, и проводили гидролиз в течение 2 ч при 50°С. Реакционные супернатанты фильтровали через планшеты Multiscreen HTS (Millipore). Значения анализа Шомоди-Нельсона log(A₅₂₀), полученные с использованием считывающего устройства для планшетов SpectraMax (Molecular Devices), скорректированные на фоновое поглощение, наносили на график против времени, и периоды полураспада фермента СВН II получали на основании линейной регрессии, используя Microsoft Excel.

Для измерений удельной активности очищенный фермент СВН II добавляли к PASC до получения конечного объема реакции 75 мкл 25 мМ ацетат натрия, рН 4,8, с 5 г/л PASC и концентрации фермента СВН II 3 мг фермента/г PASC. Инкубация происходила в течение 2 ч в 50°С водяной бане, и определяли концентрацию восстанавливающего сахара. Для измерений профиля рН/активности очищенный фермент СВН II добавляли при концентрации 300 мкг/г PASC в объеме реакции 75 мкл. Реакционные смеси забуферивали 12,5 мМ цитратом натрия/12,5 мМ фосфатом натрия, проводили в течение 16 ч при 50°С и определяли восстанавливающий сахар. Измерения долговременного гидролиза целлюлозы проводили с объемами 300 мкл 1 г/л обработанной PASC в 100 мМ ацетате натрия, рН 4,8, 20 мМ NaCl. Очищенный фермент СВН II добавляли при 100 мкг/г PASC, и реакции проводили в водяных банях в течение 40 ч перед определением восстанавливающего сахара.

Пять родительских генов-кандидатов, кодирующих ферменты СВН II, были синтезированы со сдвигом кодонов для S. cerevisiae. Все пять содержали идентичные N-концевые кодирующие последовательности, где остатки 1-89 соответствуют целлюлозосвязывающему модулю (СВМ), гибкий линкерный участок и пять N-концевых остатков каталитического домена Н. jecorina. Два из ферментов-кандидатов СВН II от Humicola insolens и Chaetomium thermophilum секретировались из S. cerevisiae при значительно более высоких уровнях, чем три другие от Hypocrea jecorina, Phanerochaete chrysosporium и Talaromyces emersonii (Фиг.1). Поскольку полосы в ДСН-ПААГ геле для трех слабо экспрессирующихся родителей-кандидатов был трудно увидеть, проводили анализы активности, в которых концентрированные супернатанты культуры инкубировали с целлюлозой, набухшей в фосфорной кислоте (PASC), чтобы подтвердить присутствие активной целлюлазы. Значения для образовавшегося восстанавливающего сахара, представленные на Фиг.1, подтвердили присутствие активного СВН II в концентрированных супернатантах культуры S. cerevisiae для всех ферментов за исключением СВН II Т. emersonii. Последовательности Н. insolens и С. thermophilum были выбраны для рекомбинации с наиболее промышленно релевантным ферментом грибов СВН II из Н. jecorina. Идентичности соответствующих последовательностей каталитических доменов составляют 64% (1:2), 66% (2:3) и 82% (1:3), где Н. insolens является родителем 1, Н. jecorina является родителем 2 и С. thermophilum является родителем 3. Эти соответствующие каталитические домены содержат 360, 358 и 359 аминокислотных остатков.

Экспрессию гетерологичного белка в мицелиальном грибе Н. jecorina, организме, чаще всего используемом для продуцирования целлюлаз для промышленных применений, значительно более труднодоступна, чем в Saccharomyces cerevisiae. Наблюдаемая секреция СВН II Н. jecorina из S. cerevisiae мотивировала выбор гетерологичного хозяина. Чтобы минимизировать избыточное гликозилирование, которое, как сообщили, снижает активность рекомбинантных целлюлаз, рекомбинантные гены СВН II экспрессировали в штамме dKRE2 S. cerevisiae с дефицитом гликозилирования. Ожидают, что данный штамм присоединяет олигомеры маннозы меньшего размера к обоим сайтам N-связанного и O-связанного гликозилирования, чем штаммы дикого типа, что ближе всего напоминает гликозилирование нативно продуцируемого фермента СВН II Н. jecorina. Анализ белков СВН II в электрофорезе ДСН-ПААГ, как с обработкой, так и без обработки EndoH для удаления структур с высоким содержанием маннозы, показал, что обработка EndoH не увеличивает электрофоретическую подвижность ферментов, секретируемых из этого штамма, что подтверждает отсутствие разветвленных маннозных группировок, которые штаммы S. cerevisiae дикого типа присоединяют к сайтам гликозилирования в рекомбинантных белках.

Высокое разрешение структуры Н. insolens (pdb entry 1ocn) использовали в качестве матрицы для SCHEMA, чтобы идентифицировать контакты, которые могли бы быть разрушены при рекомбинации. Алгоритм RASPP выдал четыре библиотеки-кандидата, где для каждой значение <E> было ниже 15. Все библиотеки-кандидаты имели более низкое значение <Е>, чем ранее сконструированные библиотеки химер, что позволяет предположить, что приемлемая доля уложенных, активных химер может быть получена для относительно высокого значения <m>. Разнообразие химерных последовательностей было увеличено до максимума за счет выбора границ блоков, приводящего к самому высокому значению <m> = 50. Блоки для данного дизайна проиллюстрированы на Фиг.2В и подробно описаны в таблице 2.

Каталитический домен СВН II Н. insolens имеет α/β бочковидную структуру, в которой восемь спиралей определяют периметр бочонка, а семь параллельных β-складок образуют активный центр (Фиг.2А). Две протяженные петли образуют крышу над активным центром, создавая туннель, через который проходят целлюлозные цепи субстрата в процессе гидролиза. Пять из семи границ блоков попадают между элементами вторичной структуры, тогда как блок 4 начинается и заканчивается в середине следующих друг за другом α-спиралей (Фиг.2А, 2В). Большинство межблочных контактов боковых цепей встречается между блоками, которые являются примыкающими в первичной структуре (Фиг.2С).

Серия образцов из 48 химерных генов была сконструирована в виде трех групп по 16 химер, имеющих пять блоков от одного родителя и три блока либо от одного, либо от обоих остальных двух родителей (таблица 3); последовательности были выбраны так, чтобы выровнять присутствие каждого родителя в положении каждого блока. Соответствующие гены были синтезированы и экспрессированы.

Таблица 3:
Последовательности серии образцов химер ферментов СВН II
Неактивные	Активные
13121211	11332333
12122221	21131311
33332321	31212111
33321331	22232132
21322232	33213332
21112113	23233133
31121121	13231111
32312222	12213111
23223223	31311112
31313323	11113132
32121222	13111313
12121113	21311131
22133222	11313121
33222333	21223122
11131231	22212231
11112321	23231222
12111212	32333113
31222212	12133333
22322312	13333232
12222213	33123313
12221122	21333331
22212323	23311333
23222321	33133132
32333223
33331213

Двадцать три из серии 48 образцов концентрированных супернатантов культуры S. cerevisiae проявляли гидролитическую активность в отношении PASC. Эти результаты позволяют предположить, что тысячи из 6561 возможных химерных последовательностей СВН II (см., например, таблицу 1) кодируют активные ферменты. 23 активные химеры СВН II серии образцов проявляют значительное разнообразие последовательностей, отличающихся от ближайшей родительской последовательности и друг от друга по меньшей мере 23 и 36 аминокислотными заменами, и не менее 54 и 123, соответственно. Их средний уровень мутаций <m> составляет 36.

Поскольку авторами Meyer et аl. обнаружены корреляции между Е, m и вероятностью того, что химера является уложенной и активной, был проведен анализ, существуют ли подобные корреляции для серии образцов химер СВН II. Количество активности фермента СВН II в концентрированных супернатантах экспрессионных культур, измеренное путем количественного определения активности на PASC, коррелировало с интенсивностью полос СВН II в ДСН-ПААГ гелях (Фиг.1). Как для родительского СВН II Н. jecorina, активность можно было обнаружить для некоторых химер СВН II с необнаружимыми полосами в геле. Химер СВН II, представленных полосами в геле, но с отсутствием активности, не наблюдали. Вероятность того, что химера СВН II секретируется в активной форме, была связана обратной связью как с Е, так и с m (Фиг.3).

Периоды полураспада термической инактивации (t_1/2) измеряли при 63°С для концентрированных супернатантов культур родительского и активных химерных ферментов СВН II. Периоды полураспада для СВН II родителей Н. insolens, Н. jecorina и С.thermophilum составляли 95, 2 и 25 минут соответственно (таблица 1). Активные химеры серии образцов проявляли более широкий диапазон периодов полураспада, от менее 1 минуты до более 3000. Пять из 23 активных химер имели периоды полураспада выше, чем наиболее термостойкий родительский СВН II Н. insolens.

При попытке конструирования предсказательной количественной модели для периода полураспада химеры СВН II было использовано пять различных алгоритмов, моделирующих данные линейной регрессии (таблица 4). Каждый алгоритм использовали для конструирования модели, связывающей составы блоков каждой химеры серии образцов СВН II и родителей с log(t_1/2). С помощью этих моделей получили взвешенные значения термостойкости, которые количественно определяли вклад блока в log(t_1/2). Для всех пять алгоритмов моделирования этот процесс повторяли 1000 раз с двумя случайно выбранными последовательностями, исключенными из каждого вычисления, так что каждый алгоритм давал 1000 взвешенных значений для каждого из 24 блоков. Среднее и стандартное отклонение (SD) вычисляли для взвешенной термостойкости каждого блока. Предсказательную точность каждого алгоритма модели оценивали путем измерения, насколько хорошо каждая модель предсказывала значения t_1/2 двух исключенных последовательностей. Корреляция между измеренными и предсказанными значениями для 1000 итераций алгоритма является баллом перекрестной проверки достоверности модели для алгоритма. Для всех пяти моделей баллы перекрестной проверки достоверности (X-val) были меньшими или равными 0,57 (таблица 4), что показывает, что моделирование линейной регрессии неприменимо для данной малой серии данных t_1/2 23 химер для количественного предсказания периода полураспада химеры СВН II.

Таблица 4:
Значения перекрестной проверки достоверности для применения 5 алгоритмов линейной регрессии к баллам стабильности блоков химер фермента СВН II. Сокращения алгоритма: гребневая регрессия (RR), частичная регрессия методом наименьших квадратов (PLSR), регрессия методом опорных векторов (SVMR), регрессия с линейным программированием методом опорных векторов (LPSVMR) и повышающая регрессия с линейным программированием (LPBoostR).
Метод	Гребневая	PLS	SVMR	LSVM	LPBoost
X-val	0,56	0,55	0,50	0,42	0,43

Моделирование линейной регрессии использовали для качественной классификации блоков как стабилизирующих, дестабилизирующих или нейтральных. Влияние каждого блока на термостойкость химеры характеризовали, используя балльную систему, которая основана на вкладе в термостойкость, определенном с помощью каждого из алгоритмов регрессии. Для каждого алгоритма блоки с взвешенным значением термостойкости более 1 SD выше нейтрального оценивали ″+1″, блоки в пределах 1 SD нейтрального оценивали как ноль, и блоки на 1 или более SD ниже нейтрального оценивали как ″-1″. ″Балл стабильности″ для каждого блока получали путем суммирования баллов стабильности 1, 0, -1 от каждой из пяти моделей. В таблице 5 суммированы баллы для каждого блока. Блок 1/родитель 1 (В1Р1), В6РЗ, В7РЗ и В8Р2 были идентифицированы как обладающие самыми высокими стабилизирующими эффектами, тогда как было обнаружено, что В1РЗ, В2Р1, ВЗР2, В6Р2, В7Р1, В7Р2 и В8РЗ являются наиболее сильно дестабилизирующими блоками.

Таблица 5:
Результаты качественной классификации блоков, полученные с помощью пяти алгоритмов линейной регрессии для серии образцов химер фермента СВН II. Балл +1 обозначает блок с взвешенной термостойкостью (отвлеченной мерой для вклада блока в термостойкость химеры) выше, чем одно стандартное отклонение выше нейтрального значения (стабилизирующий), балл 0 обозначает блок с взвешенным значением в пределах одного стандартного отклонения от нейтрального, и -1 обозначает блок с взвешенным значением более чем на одно стандартное отклонение ниже нейтрального (дестабилизирующий).
Гребневая		PLS	S\*R	LSVM	LPBoost	Сумма
Блок
В1Р1	1	0	1	1	0	3
B1R2	0	0	0	-1	0	-1
В1Р3	-1	0	-1	-1	-1	-4
В2Р1	-1	0	0	-1	-1	-3
В2Р2	1	0	0	0	0	1
B2R3	1	0	0	0	0	1
В3Р1	1	0	1	0	0	2
В3Р2	-1	0	-1	-1	-1	-4
B3R3	1	0	1	0	0	2
В4Р1	0	0	0	0	0	0
В4Р2	0	0	0	0	0	0
B4R3	0	0	0	-1	0	-1
В5Р1	0	0	0	0	0	0
В5Р2	0	0	0	0	-1	-1
B5R3	-1	0	0	-1	0	-2
В6Р1	1	0	0	-1	-1	-1
В6Р2	-1	0	-1	-1	-1	-4
B6R3	1	1	1	1	1	5
В7Р1	-1	0	-1	-1	-1	-4
В7Р2	-1	0	-1	-1	-1	-4
В7Р3	1	0	1	1	1	4
В8Р1	1	0	1	-1	0	1
В8Р2	1	0	1	1	0	3
В8Р3	-1	0	-1	-1	-1	-4

Вторую серию генов, кодирующих химеры фермента СВН II, синтезировали с целью проверки достоверности предсказанных стабилизирующих блоков и идентификации целлюлаз, более термостойких, чем наиболее термостойкий родитель. В 24 химерах, включенных в данную серию проверки (таблица 6), отсутствовало семь блоков, предсказанных как наиболее дестабилизирующие, и они были обогащены четырьмя наиболее стабилизирующими блоками, где присутствие было смещено в направлении баллов более высокой стабильности.

Кроме того, была сконструирована химера ″HJPlus″ 12222332 путем замены предсказанных наиболее стабилизирующих блоков в ферменте СВН II Н. jecorina (родитель 2).

Таблица 6:
Последовательности 24 химер фермента СВН II серии проверки достоверности, девять из которых экспрессировались в активной форме
Неактивные	Активные
12122132	12111131
12132332	12132331
12122331	12131331
12112132	12332331
13122332	13332331
13111132	13331332
13111332	13311331
13322332	13311332
22122132	22311331
22322132
22311332
23111332
23321131
23321332
23321331

Концентрированные супернатанты экспрессионных культур S. cerevisiae для девяти из 24 химер серии проверки достоверности, а также химеры HJPlus, проявляли активность в отношении PASC (таблица 6). Из 15 химер, для которых активность не была обнаружена, девять содержали блок В4Р2. Из 16 химер, содержащих В4Р2 в первоначальной серии образцов, только одна проявляла активность в отношении PASC. Суммируя обе серии химер и HJPlus, только две из 26 химер, характеризующихся В4Р2, были активными, что указывает на то, что данный конкретный блок является в высокой степени разрушительным для экспрессии активной целлюлазы в S. cerevisiae.

Были проверены стабильности 10 функциональных химерных ферментов СВН II из серии проверки достоверности. Поскольку стабильные ферменты уже имели периоды полураспада более 50 часов, остаточную гидролитическую активность в отношении PASC после 12-часовой термической инактивации при 63°С использовали как меру для предварительной проверки. Эта 12-часовая инкубация приводила к измеримому снижению активности наиболее термостойкой химеры серии образцов, 11113132, и полностью инактивировала наиболее термостойкий родительский СВН II Н. insolens. Все десять функциональных химер серии проверки достоверности сохранили более высокую долю своей активности, чем наиболее стабильный родительский СВН II Н. insolens.

Проанализировали активности отобранных термостойких химер с использованием очищенных ферментов. Родительские ферменты СВН II и три термостойкие химеры, наиболее термостойкую химеру серии образцов 11113132, наиболее термостойкую химеру серии проверки достоверности 13311332 и химеру HJPlus 12222332 экспрессировали с С-концевыми метками Hiss для очистки и очищали. Для минимизации термической инактивации ферментов СВН II во время теста на активность авторы изобретения использовали более кратковременную двухчасовую инкубацию с субстратом PASC при 50°С, рН 4,8. Как показано в таблице 3, удельные активности родительских и химерных СВН II находились в пределах коэффициента четыре наиболее активного родительского фермента СВН II от Н. jecorina. Удельная активность HJPlus была выше, чем у всех других протестированных ферментов СВН II за исключением СВН II Н. jecorina.

Зависимость от рН целлюлазной активности также важна, поскольку широкий профиль рН/активности дал бы возможность использовать химеру СВН II при более широком диапазоне потенциальных условий гидролиза целлюлозы. Наблюдали, что СВН II Н. jecorina обладает оптимальной активностью в диапазоне рН от 4 до 6, причем вне этих значений активность заметно снижается. ¹⁶ На Фиг.4 показано, что ферменты СВН II Н. insolens и С. thermophilum и все три очищенные термостойкие химеры СВН II имели профили рН/активности, которые являются значительно более широкими, чем у СВН II Н. jecorina. Хотя Liu et al. сообщают оптимальный рН 4 для СВН II С. thermophilum, оптимальный рН рекомбинантного фермента в данной заявке составлял около 7. Нативный СВН II Н. insolens имел широкий профиль рН/активности при максимальной активности около рН 9 и примерно 60% этой максимальной активности при рН 4. Подобно широкий профиль наблюдали для рекомбинантного фермента. Химера HJPlus имела значительно более широкий профиль рН/активности, чем СВН II Н. jecorina, проявляя зависимость от рН, подобную двум другим родительским ферментам СВН II.

Достижение активности при повышенной температуре и сохранение активности в течение пролонгированных интервалов времени являются двумя основными мотивациями для конструирования высоко стабильных ферментов СВН II. Характеристики термостойких химер СВН II при гидролизе целлюлозы тестировали на протяжении диапазона температур в течение 40-часового интервала времени. Как показано на Фиг.5, все три термостойкие химеры проявляли активность на PASC при более высоких температурах, чем родительские ферменты СВН II. Химеры сохраняли активность при 70°С, тогда как СВН II Н. jecorina не гидролизовал PASC выше 57°С, и стабильный фермент Н. insolens не проявлял гидролиза при 63°С. Активность HJPlus в анализе долговременного гидролиза целлюлозы превышала активность всех родителей при их соответствующих оптимальных температурах.

Библиотека СВН II имела меньшие потенциальные прерывания по нескольким причинам. В дополнение к более высокой идентичности родительских последовательностей СВН II, бочковидная топология укладки СВН II ограничивает число контактов большого радиуса действия, которые могут быть разрушены рекомбинацией. Межблочные контакты (тяжелые атомы в пределах 4,5 Å) составляют только 27% (503/1831) всех контактов на карте контактов структуры Н.insolens 1ocn. Когда только учтенные контакты, для которых новые пары остатков возможны в химерах, суммарные межблочные контакты снижены до 23% (68/294). Кроме того, большинство этих взаимодействий происходит между остатками на поверхности белка, и возможность улавливания растворителя дополнительно снижает шансы резко деструктивных взаимодействий между остатками (Фиг.14а). Одно исключение, углубленное взаимодействие между положениями 176 и 256, проиллюстрировано на Фиг.14b. В этом сайте химеры с В6Р2 и либо В5Р1, либо В5Р3 спаривают Met173:Trp253 (большей аминокислотой, чем родительская пара Met176:Phe256 или Leu173:Trp253). Тем не менее, при исследовании родительских кристаллографических моделей стерическое столкновение в данном положении считали невероятным вследствие движения в участке белкового каркаса, которое располагает Trp253, и собственной гибкости боковых цепей Met. Примечательно, что одна охарактеризованная химера соответствует данному паттерну (13333232) и является более стабильной, чем родители (67°С), при приведении в соответствие с регрессионной моделью (68°С).

Другой механизм, посредством которого может происходить спаривание, структурная дивергенция блоков, не зависит от присутствия новых пар остатков на границах блоков, вместо этого, по мере того как дивергируют родительские последовательности, могут дивергировать внутренние структуры блоков, затрудняя модульные пересадки блоков. В случае библиотеки СВН II высокие значения идентичности родительских пар (82%, 66% и 64%) предполагают, что вероятны только минорные отклонения структуры (среднее квадратичное отклонение, RMSD,<1 Å). Эту возможность можно оценить путем сравнения кристаллографических структур для СВН II H.insolens и H.jecorina (у СВН II C. therinophilum отсутствует кристаллическая структура, но он на 82% идентичен Н. insolens). Выравнивания блоков из структур для каждого родителя (1ocn и 1cb2) создает низкие значения RMSD альфа-углерода (RMSD 0.5, 0.5, 0.6, 0.5, 0.3, 0.7, 0.3 и 0.4 Å). Блоки Н. jecorina, наложенные на Н. insolens, проиллюстрированы в дополнении к Фиг.5 с.Для проверки контекст-зависимых эффектов была проведена структурная рекомбинация in silico со сплайсингом каждого выровненного блока на структуре противоположного хозяина. Возможно сконструировать структурные модели без столкновений (альфа-атомы углерода на расстоянии более 3 Å) для всех химер с заменой одного блока (например, 11112111 или 22122222), за исключением минорного столкновения (2,65 Å) при использовании В7Р2 (11111121) вследствие инсерции Asn между блоками 6 и 7 (Фиг.14D).

Следующие эксперименты были проведены, чтобы определить вклады различных блоков/сегментов в стабильность химеры и улучшенную термостойкость и/или рН стабильность. Родительские и химерные гены, кодирующие ферменты СВН II, клонировали в дрожжевом экспрессионном векторе YEp352/PGK91-1-αss и экспрессировали в синтетической среде с декстрозой и казаминовыми кислотами (SDCAA). Для анализов активности на Avicel супернатанты дрожжевых культур на среде с пептоном и декстрозой (YPD) доводили до 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и 0,02% NaN₃ и использовали без концентрирования. Ферментативную активность СВН II в концентрированных супернатантах дрожжевых культур на SDCAA измеряли путем добавления разведении концентрированного супернатанта культуры в 37,5 мкл PASC и 225 мкл 50 мМ ацетата натрия, рН 4,8 и инкубации в течение 2 ч при 50°С. Эквиваленты образовавшегося восстанавливающего сахара определяли с помощью анализа Шомоди-Нельсона.

Значения T₅₀ фермента СВН II измеряли путем добавления концентрированного супернатанта экспрессионной культуры в SDCAA к 50 мМ ацетату натрия, рН 4,8, при концентрации, дающей А₅₂₀ 0,5 при измерении в анализе на восстанавливающий сахар Шомоди-Нельсона после инкубации с PASC, обработанной эндоглюканазой. Смеси 200 мкл фермента СВН II/буфера инкубировали в водяной бане при интересующей температуре в течение 10 минут. После инкубации добавляли 37,5 мкл PASC, обработанной эндоглюканазой, и 62,5 мкл 50 мМ ацетата натрия, и гидролиз проводили в течение 2 ч при 50°С. температуру инкубации, при которой фермент терял половину своей активности, определяли путем линейной интерполяции значений А₅₂₀ анализа Шомоди-Нельсона, нанесенных на график против температуры.

Для измерений долговременного гидролиза Avicel PH101 (Fluka) 0,3 мкг очищенного СВН II инкубировали с 3 мг Avicel в 270 мкл 50 мМ ацетата натрия, рН 4,8, в пробирках для ПЦР, помещенных в водяную баню, в течение 16 часов. Пробирки охлаждали в водяной бане комнатной температуры в течение 10 минут, центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут, и супернатанты отбирали на анализ восстанавливающего сахара.

Для оценки активности СВН II в супернатантах экспрессионных культур в YPD объемы супернатантов в диапазоне от 2 мл до 40 мл добавляли к 800 мкл 33 мг/мл Avicel, суспендированного в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8, в конических пробирках. Ферментам СВН II давали возможность связаться с Avicel при 4°С в течение одного часа, центрифугировали при 2000 g в течение 2 минут и дважды промывали 50 мМ ацетатом натрия, рН 4,8. После второй промывки СВН II-связанный Avicel ресуспендировали в 2,75 мл натрийацетатного буфера, делили на аликвоты по 270 мкл и инкубировали при 50°С в течение 2,5 часов. Центрифугирование и анализ восстанавливающего сахара проводили, как описано выше.

Пакет программ линейной регрессии в Mathematica использовали для приведения в соответствие данных Т₅₀ химер СВН II с 17-параметрической аддитивной моделью блока и также использовали для анализа перекрестной проверки достоверности. Эффекты блока сообщают относительно референсного состояния родителя 1 (Н. insolens СВН II) с 16 параметрами, представляющими замену каждого из 8 блоков блоками от родителей 2 и 3.

Значения T₅₀, определенные в данной заявке как температура, при которой фермент теряет 50% его активности во время десятиминутной инкубации, были определены для трех родительских целлобиогидролаз, 33 активных химер СВН II из предшествующих экспериментов и 18 дополнительных химер, предсказанных качественным моделированием стабильности как находящиеся среди наиболее термостойких, то есть не содержащие ни одного из 7 предсказанных дестабилизирующих блоков и содержащие либо 3, либо 4 из 4 предсказанных стабилизирующих блоков. Последовательности всех химер в количестве 51 приведены в таблице 8. Повторное культивирование и повторное концентрирование всех предсказанных термостойких химер, ранее классифицированных как несекретируемые, дало возможность получения достаточных количеств СВН II 12112132, 13111132 и 13322332 для определения Тбо. Полная серия значений Т₅₀ для химер и родительских СВН II приведена в таблице 8. Аминокислотные последовательности для всех этих СВН II показаны в таблице 7. Все предсказанные протестированные термостойкие химеры в количестве 31 имели значения Т₅₀ более чем на два градуса выше, чем наиболее термостойкий родительский фермент (64,8°С). В таблице также идентифицирован остаток Cys в блоке/домене 7, который может быть мутирован на Ser для получения повышенной термостойкости. Соответственно, в изобретении предложен полипептид любой из нижеследующих последовательностей, где подчеркнутый/выделенный курсивом/выделенный полужирным шрифтом Cys заменен остатком Ser, и где полученный в результате полипептид обладает улучшенной термостойкостью по сравнению с ферментом дикого типа.

Таблица 7:
Аминокислотные последовательности родительских и химерных каталитических доменов СВН II, представленных в таблице 8. В таблицу также включен каталитический домен СВН II Р. chrysosporium. Все рекомбинантные СВН II имеют общий N-концевой СВМ и линкер от нативного СВН II Н. jecorina,

Таблица 8:
Значения Т50 (°С) двух независимых повторов для родительских СВН II, 23 химер СВН II первоначальной серии образцов и предсказанных термостойких химер СВН II. 18 химер, синтезированных для данной работы, обозначены звездочками впереди.
Химеры серии образцов и родители				Предсказанные термостойкие химеры
Последовательность	Т50(1)	T50(2)	Среднее Т50	Последовательность	T50(1)	T50(2)	Среднее Т50
32333113	52	51	51,5	12332331	66,5	67	66,8
13111313	56	53,5	54,8	*13112332	67	67	67

11313121	55	55,5	55,3	22311331	68	68	68
21131311	57,5	57	57,3	*12111332	68	68	68
31212111	59	58	58,5	*12112332	68,5	67,5	68
Родитель 2	60	58	59	12131331	68,5	69	68.8
23233133	61	61	61	*12131332	70	67,5	68,8
31311112	60	62	61	*12332332	69	69	69
22212231	63	61	62	12111131	70	68,5	69,3
13231111	63	6,5	63,3	12311332	70	69	69,5
12213111	63	63,5	63,3	13332331	70	69	69,5
Родитель 3	63,5	64,5	64	12132331	70,5	69	69,8
12133333	64	64	64	*12132332	70,5	69	69,8
Родитель 1	64	65,5	64,8	*13332332	69,5	70	69,8
33133132	65	66	65	12112132	71	68,5	69,8
11332333	64,5	66	65,3	13322332	71	68,5	69,8
23311333	65	66	65,5	*13131332	70	70	70
33213332	66	66	66	*12331332	71	69	70
13333232	67,5	67	67,3	*13312332	70	70	70
22232132	68	68	68	*11113332	69,5	70,5	70
11113132	71,5	71	71,3	*13113132	70,5	69,5	70
21333331	73,5	75,5	74,5	*11112132	70,5	70	70,3
21311131	75,5	75,5	75	*12113132	70,5	70,5	70,5
				*13132332	69,5	71,5	70,5
				*11111132	71	70,5	70,8
				13331332	72	70	71
				*13111132	72	69,5	71,3
				*12222132	72,5	70	71,3
				12222332	72	69,5	71,3
				13311332	71	71,5	71,7
				13311331	73,5	72,5	73

Применение линейной регрессии к данным последовательности - стабильности привело в результате к десятипараметрической модели, которая соответствует наблюдаемым значениям Т₅₀ с R²=0,88 (Фиг.8). Чтобы лучше оценить предсказательную способность регрессионной модели вне испытательной серии, была проведена одиннадцатикратная проверка достоверности, которая привела в результате к R² 0,57, где удаление двух резко отклоняющихся значений (11313121 и 22222222) повышает достоверность перекрестной проверки R² до 0,76. В регрессионной модели использован наиболее стабильный родитель 1 (Н. insolens) в качестве референсного значения Т₅₀, и она включает девять дополнительных элементов, имеющих значение р ≤ 0,1. Параметры модели (таблица 9) показывают, что единственный блок, блок 7 от родителя 3 (В7Р3), вне всяких сомнений вносит самый сильный вклад в термостойкость химер относительно СВН II Н. insolens. Этот блок от СВН II С. thermophilum вносит вклад примерно 8,5°С в стабильность химер, которые его содержат. Было обнаружено, что два из 8 остальных блоков со значениями р ≤ 0,1 вносят меньшие вклады в стабильность, 1,2°С и 2,7°С, тогда как другие шесть снижают стабильность.

Таблица 9:
Параметры и значения р модели линейной регрессии Т50. Значения параметров с р ≤ 0,1, используемые для вычисления соответствия регрессионной кривой Фиг.1, выделены полужирным шрифтом. Эффекты блоков представлены относительно референсного значения родителя 1 (СВН II Н. insolens) с 16 параметрами, представляющими замену каждого из 8 блоков от родителей 2 и 3.
Блок	Параметр Значение	Значение р
Родитель 1	62,8	0,00
В12	-0,9	0,35
В13	-3,5	0,00
В22	-1,7	0,06
В23	-1,1	0,25
В32	0,5	0,68
B33	1.2	0,10
В42	2,7	0,05
В43	0,0	0,99
В52	-1,3	0,10
В53	-0,6	0,50
В62	-3,5	0,02
В63	-0,7	0,37
В72	-3,8	0,05
В73	8,5	0,00
В82	0,0	1,00
В83	-5,6	0,00

Выравнивание последовательностей В7Р1 и В7Р3 (Фиг.10) показывает, что блок 7 различается на 10 из 56 положений аминокислот в ферментах Н. insolens и С. thermophilum. В генетическом фоне химеры с самым высоким значением T₅₀, 21311131, каждый остаток в В7Р3 (сегмент 7 родителя 3 (SEQ ID NO:6)) был индивидуально мутирован до соответствующего остатка в В7Р1 (сегмент 7 родителя 1 (SEQ ID NO:2)), и определены значения Т₅₀ для каждого из полученных точечных мутантов. Мутация, S313C, значительно изменяла термостойкость химеры: данная одиночная мутация снижала Т₅₀ 21311131 примерно на 10°С (Фиг. 11).

Для изучения эффекта обратной мутации в различных генетических фонах гены для родительских СВН II Н. insolens и H. jecorina, кодирующие замену C313S (C314S в Н. insolens и C311S в Н. jecorina) были сконструированы, экспрессированы, и определены значения Т₅₀ ферментов. Также количественно определяли стабильности химер 11111131 и 22222232, в которых стабилизирующий блок В7Р3 заменен с образованием ферментов дикого типа Н. insolens и Н. jecorina. Как замена блока В7Р3, так и точечная мутация Cys-Ser значительно стабилизировала родительские СВН II; самым высоким эффектом было ~8°С повышение Т₅₀ для СВН II H. jecorina, содержащего замену C311S (Фиг.12). Мутацию Cys-Ser также тестировали в двух химерах, 31311112 и 13231111, которые не содержат В7Р3, а также в гомологичном СВН II (от Phanerochaete chrysosporium), который отсутствовал в рекомбинантной серии родителей. Каталитический домен СВН II Р. chrysosporium только на 55-56% идентичен каталитическим доменам родительских СВН II. Все эти ферменты стабилизировались в результате замены Cys-Ser; СВН II Р. chrysosporium был значительно стабилизирован на 10°С (Фиг.13).

Восемь из термостойких химер СВН II и родительских ферментов, содержащих эквивалентную мутацию C313S, были мечены His6-меткой и очищены таким образом, чтобы можно было определить их удельные активности. Как показано в таблице 10А, удельные активности, которые измеряли на аморфной целлюлозе (PASC) при 50°С, для этих химер и нативных ферментов, содержащих мутацию Cys-Ser, сходны с таковыми для родителей дикого типа. Таким образом, повышенная термостойкость осуществляется не за счет удельной активности.

Таблица 10А:
Значения удельной активности (мкг эквивалент восстанавливающего сахара глюкозы/(мкг фермента СВН II × мин × 102)) для нативного СВН II, точечного мутанта и отобранных термостойких химер СВН II. Усы показывают стандартные ошибки, где стандартную ошибку определяют как стандартное отклонение/квадратный корень (n) для трех повторов. 2-часовая реакция, 3 мг фермента/г PASC, 50°С, 25 мМ ацетат натрия, рН 4,8.
Фермент СВН II	Удельная активность мкг восстанавливающего сахара/(мкг фермента × мин) × 102
Humicola insolens (Родитель 1)	5,3 +/- 0,5
Hypocrea jecorina (Родитель 2)	8,4 +/- 0,4
Chaetomium thermophilum (Родитель 3)	4,8 +/- 0,3
Phanerochaete chyrsosporium	7,7 +/- 0,3

Humicola insolens C314S				5,3 +/- 0,9
Hypocrea jecorina C311S				7,8 +/- 0,5
Phanerochaete chyrsosporium C311S				8,5 +/-0,1
HJPlus (Химера 12222332)				9,6 +/- 0,8
Химера 13111132				8,5 +/- 0,3
Химера 22222232				7,7 +/- 0,3
Химера 13311332				6,8 +/-0,6
Химера 13311331				6,2 +/- 0,3
Химера 11111131				6,1 +/-0,9
Химера 13112332				5,6 +/- 0,4
Химера 21311131				5,5 +/- 0,3
Химера 11113132				5,3 +/-0,5
Химера 21333331				3,8 +/- 0,4
Таблица 10 В:
суммарная активность в супернатантах как синтетической (SDCAA), так и богатой (YPD) среды экспрессионной культуры для СВН II дикого типа Н. jecorina и Н. insolens, точечного мутанта C313S и СВН II с заменой блока В7Р3. Представленные значения представляют собой значения анализа активности мкг глюкозы/мл целлюлазы на мл эквивалент супернатанта экспрессионной культуры СВН II, добавленного в анализ целлюлазной активности. Для культур SDCAA использовали концентрированные супернатанты культуры SDCAA, и измеряли активность в отношении целлюлозы, набухшей в фосфорной кислоте (1 мг/мл), при 50°С в течение 100 минут в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8. Супернатант YPD СВН II концентрировали путем связывания с Avicel и измеряли активность в отношении Avicel (15 мг/мл) при 55°С в течение 150 минут в 50 мМ ацетате натрия, рН 4,8.
CBHII	SDCAA(1)	SDCAA (2)	SDCAA Среднее		YPD (1)	YPD (2)	YPD Среднее
H. jecorina	19	17	18		0,4	0,4	0,4
H. jeco C3HS	50	43	47		6,1	5,6	5,9
H. jeco B7P3	35	33	34		3,9	3,6	3,8
Н. insolens	73	83	78		6,2	6,0	6,1
H. insoC314S	100	97	98		8,8	8,0	8,4
Н. inso В7Р3		42	40		4,4	4,1	4,2

Затем те же восемь термостойких химер (Т₅₀ на 2-10°С выше, чем для наиболее стабильного родителя) тестировали на активность на кристаллической целлюлозе в течение 16-часовой инкубации на протяжении диапазона температур, включающего температуры, где родительские ферменты проявляют малую активность или не проявляют никакой активности. На Фиг.9а показано, что 7 из 8 протестированных термостойких химер обладали максимальной активностью в отношении Avicel при 60-65°С, причем все 8 химер сохраняли активность при 70°С, самой высокой тестируемой температуре. Напротив, три родительские СВН II проявляют максимальную активность при 50°С и полностью или почти полностью неактивны при 70°С. Кроме того, семь химер с повышенными оптимальными температурами активности гидролизуют значительно большее количество Avicel, чем любой из родительских ферментов СВН II. Как показано на Фиг.9b, подобное поведение наблюдают для родителей Н. insolens и Н. jecorina, содержащих точечную мутацию Cys-Ser. Точечная мутация Cys-Ser также повышала гидролиз Avicel и максимальную рабочую температуру для СВН II Р. chrysosporium. Замена блока РЗВ7, которую осуществляли в родителях Н. insolens и Н. jecorina, повышала как рабочую температуру, так и гидролиз СВН II Н. insolens, но, несмотря на повышение максимальной рабочей температуры, не улучшала общий гидролиз целлюлозы ферментом Н. jecorina.

Низкую (менее 1 мг/л) секрецию СВН II Н. jecorina дикого типа из гетерологичного хозяина экспрессии S. cerevisiae. Мутация C311S в ферменте СВН II Н. jecorina дикого типа значительно повышает суммарную секретируемую активность СВН II (таблица 11). В синтетической среде (SDCAA) замены C311S и В7Р3 повышают суммарную секретируемую активность СВН II Н. jecorina в два раза, тогда как в богатой среде (YPD) повышение активности является десятикратным. Для родительского СВН II Н. insolens, который экспрессируется на значительно более высоких уровнях, чем два других родительских СВН II, мутация C314S повышала секретируемую активность примерно в 1,5 раза, тогда как замена блока В7Р3 снижала ее. Поскольку дикий тип и мутанты Cys-Ser Н. insolens и Н. jecorina все обладают сходными удельными активностями (таблица 10), увеличение суммарной секретируемой целлюлазной активности является результатом улучшенной секреции функционального фермента. Наблюдается корреляция между секрецией гетерологичного белка S. cerevisiae и стабильностью белка, что позволяет предположить, что повышенная секреция мутанта Cys-Ser СВН II может отражать его более высокие стабильности.

Таблица 11:
Значения удельной активности (мкг эквивалент восстанавливающего сахара глюкозы/(мкг фермента СВН II × мин × 102)) для нативного СВН II, точечного мутанта и отобранных термостойких химерных СВН II. Усы показывают стандартные ошибки, где стандартную ошибку определяют как стандартное отклонение/квадратный корень (n) для трех повторов. 2-часовая реакция, 3 мг фермента/г PASC, 50°С, 25 мМ ацетат натрия, рН 4,8.
Фермент СВН II	Удельная активность мкг восстанавливающего сахара/(мкг фермента × мин) × 102

Humicola insolens (Родитель 1)	5,3 +/- 0,5
Hypocrea jecorina (Родитель 2)	8,4 +/- 0,4
Chaetomium thermophilum (Родитель 3)	4,8 +/- 0,3
Phanerochaete chyrsosporium	7,7 +/- 0,3
Humicola insolens C314S	5,3 +/- 0,9
Hypocrea jecorina C311S	7,8 +/- 0,5
Phanerochaete chyrsosporium C311S	8,5 +/- 0,1
HJPlus (Химера 12222332)	9,6 +/- 0,8
Химера 13111132	8,5 +/- 0,3
Химера 22222232	7,7 +/- 0,3
Химера 13311332	6,8 +/- 0,6
Химера 13311331	6,2 +/- 0,3
Химера 11111131	6,1 +/- 0,9
Химера 13112332	5,6 +/- 0,4
Химера 21311131	5,5 +/- 0,3
Химера 11113132	5,3 +7- 0,5
Химера 21333331	3,8 +/- 0,4

Для моделирования мутации Cys-Ser использовали высокое разрешение кристаллической структуры СВН II Н. insolens 1ocn. Сначала оптимизировали сеть водородных связей с помощью REDUCE. Было предсказано, что Cys314 образует водородную связь с карбонилом Pro 339. Для подтверждения этого предсказания укладку боковых цепей оптимизировали, используя платформу моделирования SHARPEN. Предсказано, что Ser314 осуществляет взаимодействия, подобные Cys314, приводящие в результате к более сильному водородному связыванию и более благоприятной геометрии (Фиг.14).

Ряд эффектов может объяснить, почему мутация Cys-Ser стабилизирует широкий ряд СВН II, включая нативные СВН II и химеры. Cys и Ser являются подобными (хотя не изостерическими), и эти две аминокислоты доминируют в выравниваниях последовательностей в этом положении по сравнению с другими альтернативами. Схемы водородного связывания для этого остатка являются структурными элементами (амид Gly316 и карбонил Pro339), и поэтому менее вероятно зависят от вариаций третьесторонних аминокислот. Кроме того, непосредственно примыкающие боковые цепи для этого кармана (Asn283, Pro339, Phe345) являются консервативными среди всех четырех исследованных нативных целлюлаз СВН II.

Высокое разрешение (1.3 Å) кристаллической структуры Н. insolens (pdb entry 1ocn6) показывает, что Cys314 составляет часть сети водородных связей (Фиг.15). Повышенная способность к водородному связыванию Ser относительно Cys может позволить предположить роль более сильных взаимодействий водородного связывания в стабилизации. Кристаллическая структура также позволяет предположить, что Ser может быть предпочтительным по стерическим причинам. Конкретно, когда боковая цепь Cys заново строится с каноническими углами связей, наклон 6° исчезает, и Cys проталкивается ближе к карбонилу Pro339, создавая неблагоприятное стерическое взаимодействие.

Выравнивание 196 белковых последовательностей, обладающих самой высокой идентичностью с СВН II Н. jecorina. Пятьдесят четыре из 250 наиболее идентичных последовательностей было исключено из выравнивания вследствие избыточности (то есть точечных мутаций для структурных исследований или более 95% идентичных изоформ). Существует предпочтительный сдвиг в направлении Ser311: 158 последовательностей имеет Ser, 20 имеет Ala, 10 имеет Cys, 5 имеет делецию, и 3 имеет Gly. Однако существует 42 других положения, где наиболее частый выбор осуществляется более чем с двукратной частотой аминокислоты Н. jecorina.

Большой стабилизирующий эффект мутации Cys-Ser создает возможность, что Ser в данном положении является глобальным показателем термостойкости нативной целлюлазы. Однако Т₅₀ 64,8°С для СВН II Н. insolens, который характеризуется Cys в данном положении, является более высокой, чем для СВН II С.thermophilum (64,0°C), указывая на то, что Ser является не единственной детерминантой стабильности.

Термостойкость является не единственным свойством, представляющим интерес для промышленных целлюлаз. Важны также удельная активность, изменения в связывании целлюлозы и эффекты на экспрессию и ингибирование продуктом. Представленные в данной заявке химеры и данные демонстрируют, что рекомбинация образует химеры СВН II, улучшенная термостойкость которых происходит не за счет удельной активности, измеренной в анализах кратковременного (например, 2-часового) гидролиза целлюлозы. Подобные наблюдения были сделаны для СВН II, содержащих термостабилизирующую мутацию Cys-Ser. В анализах долговременного гидролиза несколько из химер СВН II и все три протестированных мутанта Cys-Ser СВН II гидролизовали большее количество целлюлозы, чем нативные СВН II. Данное лучшее качество, вероятно, является результатом обладания удельной активностью, сравнимой с родительскими СВН II, параллельно с более высокой термостойкостью, которая позволяет ферменту продолжать функционировать в течение более длительного времени при повышенных температурах, поскольку эти анализы проводили с равными количествами очищенного родительских ферментов, химерных ферментов и мутантов Cys-Ser, наблюдаемые улучшения высокотемпературного гидролиза не являются результатом повышенной секреции из хозяина экспрессии S. cerevisiae. Следовательно, доказано, что термостойкие химеры и мутанты Cys-Ser могут быть полезными компонентами препаратов ферментов для расщепления целлюлозы.

Хотя проиллюстрированы и описаны различные конкретные формы осуществления, понятно, что можно произвести различные изменения без отклонения от сущности и объема изобретения.

Claims (9)

1. Рекомбинантный полипептид, включающий последовательность SEQ ID NO: 2, содержащую C314S; SEQ ID NO: 4, содержащую C311S; SEQ ID NO: 12, содержащую C310S; SEQ ID NO: 19, содержащую C313S; SEQ ID NO: 21, содержащую C312S; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 108 или SEQ ID NO: 109, где вышеуказанный полипептид обладает целлюлазной активностью и улучшенной термостойкостью по сравнению с соответствующим родительским (дикого типа) белком, не имеющим мутации С→S.

2. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.1, где полипептид обладает целлюлазной активностью и улучшенной термостойкостью по сравнению с соответствующим родительским белком.

3. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.2.

4. Клетка-хозяин для получения полипептида по п.1, содержащая полинуклеотид по п.2.

5. Клетка-хозяин для получения полипептида по п.1, содержащая вектор по п.3.

6. Ферментный препарат, обладающий целлюлазной активностью, содержащий функциональное количество полипептида по п.1.

7. Ферментный препарат, обладающий целлюлазной активностью, содержащий указанный полипептид, продуцированный клеткой-хозяином по п.4.

8. Способ обработки биомассы, содержащей целлюлозу, включающий приведение биомассы в контакт с полипептидом по п.1.

9. Способ обработки биомассы, содержащей целлюлозу, включающий приведение биомассы в контакт с ферментным препаратом по п.6.

Images