RU2465282C2 - Combined therapy with using alpha5beta1 antagonists - Google Patents
Combined therapy with using alpha5beta1 antagonists Download PDFInfo
- Publication number
- RU2465282C2 RU2465282C2 RU2008141706/10A RU2008141706A RU2465282C2 RU 2465282 C2 RU2465282 C2 RU 2465282C2 RU 2008141706/10 A RU2008141706/10 A RU 2008141706/10A RU 2008141706 A RU2008141706 A RU 2008141706A RU 2465282 C2 RU2465282 C2 RU 2465282C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- disease
- cancer
- cells
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Область изобретенияField of Invention
Представленное изобретение относится к использованию антагонистов VEGF и антагонистов альфа5бета1 для лечения рака и подавления ангиогенеза и/или подавления проницаемости сосудов, включая ненормальный ангиогенез при некоторых заболеваниях. Представленное изобретение также относится к использованию агонистов VEGFR и агонистов альфа5бета1 для повышения ангиогенеза и сосудистой проницаемости. Представленное изобретение также относится к антителам против альфа5бета1, включающим их составам и наборам и способам их изготовления и применения.The present invention relates to the use of VEGF antagonists and alpha5beta1 antagonists for treating cancer and suppressing angiogenesis and / or suppressing vascular permeability, including abnormal angiogenesis in certain diseases. The presented invention also relates to the use of VEGFR agonists and alpha5beta1 agonists to increase angiogenesis and vascular permeability. The presented invention also relates to antibodies against alpha5beta1, including their compositions and kits and methods for their manufacture and use.
Уровень техники изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Признана важная роль VEGF-A в патологическом и непатологическом ангиогенезе. Введение VEGF в моделях in vivo вызывает сильный ангиогенный ответ (Plouet, J et al., (1989) EMBO J. 8:3801-3808; Leung, D.W., et al., (1989) Science 246:1306-1309). Потеря одного аллельного гена VEGF-A приводит к повышению эмбриональной смертности у мышей (Carmeliet, P., et al., (1996) Nature 380:435-439; Ferrara, N et al., (1996) Nature 380:439-442). VEGF также известен в качестве фактора сосудистой проницаемости в связи с его способностью вызывать кровоизлияния (Senger, D.R. et al., (1995) Science 219:983-985; Dvorak, H.F., et al., (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039). Таким образом VEGF-A вовлечен в ангиогенез на этапе развития, воспроизводства и костный ангиогенез, в дополнение к другим непатологическим видам ангиогенеза.The important role of VEGF-A in pathological and non-pathological angiogenesis is recognized. The introduction of VEGF in in vivo models elicits a strong angiogenic response (Plouet, J et al., (1989) EMBO J. 8: 3801-3808; Leung, D.W., et al., (1989) Science 246: 1306-1309). The loss of one VEGF-A allelic gene leads to increased embryonic mortality in mice (Carmeliet, P., et al., (1996) Nature 380: 435-439; Ferrara, N et al., (1996) Nature 380: 439-442 ) VEGF is also known as a vascular permeability factor due to its ability to cause hemorrhage (Senger, DR et al., (1995) Science 219: 983-985; Dvorak, HF, et al., (1995) Am. J. Pathol. 146: 1029-1039). Thus, VEGF-A is involved in angiogenesis at the developmental stage, reproduction and bone angiogenesis, in addition to other non-pathological types of angiogenesis.
VEGF-A связывается с двумя рецепторными тирозинкиназами (РТК), VEGFR-1 (Flt-1) и VEGFR-2 (KDR, Flk-1). Обычно считается, что VEGFR-2 является основным медиатором митогенных, ангиогенных и увеличивающих проницаемость действий VEGF-A. В феврале 2004 US Food and Drug Administration (FDA) одобрила бевацизумаб, гуманизированные моноклональные антитела против VEGF (фактора роста эндотелия сосудов)-A, для лечения метастатического рака кишечника в сочетании с основанными на 5-фторурациле (ФУ) режимами химиотерапии. Впоследствии FDA одобрила пегаптиниб, аптамер, который блокирует изоформу VEGF-A из 165 аминокислот, для лечения влажной (неоваскулярной) формы связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD).VEGF-A binds to two receptor tyrosine kinases (PTKs), VEGFR-1 (Flt-1) and VEGFR-2 (KDR, Flk-1). It is generally believed that VEGFR-2 is the main mediator of mitogenic, angiogenic and permeability-enhancing actions of VEGF-A. In February 2004, the US Food and Drug Administration (FDA) approved bevacizumab, a humanized monoclonal antibody against VEGF (vascular endothelial growth factor) -A, for the treatment of metastatic colon cancer in combination with 5-fluorouracil (FU)-based chemotherapy regimens. Subsequently, the FDA approved pegaptinib, an aptamer that blocks 165 amino acids of VEGF-A isoform, for treating the wet (neovascular) form of age-related macular degeneration (AMD).
Несмотря на эти достижения, многие пациенты, получающие лечение антагонистами VEGF в конечном счете становятся жертвами своей болезни. Следовательно, имеется потребность в разработке новых медикаментов и способов лечения для лечения заболеваний, которые более не поддаются или только частично поддаются терапии антагонистами VEGF. Также существует потребность в разработке альтернативных и/или лучших способов лечения для лечения рака и осложнившихся заболеваний, вызванных или затрагиваемых ненормальным ангиогенезом.Despite these advances, many patients receiving treatment with VEGF antagonists will ultimately become victims of their illness. Therefore, there is a need to develop new drugs and treatments for treating diseases that are no longer or only partially amenable to therapy with VEGF antagonists. There is also a need for the development of alternative and / or better treatments for the treatment of cancer and complicated diseases caused or affected by abnormal angiogenesis.
Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Представленное изобретение относится к медикаментам и способам лечения пациентов, которые могут получить выгоду от уменьшения ангиогенеза, страдающих от ненормального ангиогенеза и/или страдающих от неоплазии. В соответствии с одним вариантом осуществления представленное изобретение предлагает способ ингибирования ангиогенеза и/или сосудистой проницаемости у субъекта, включающий стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1, одновременно или последовательно. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения, представленное изобретение предлагает способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, причем субъект или ранее реагировал на лечение заболевания антагонистом VEGF, но лишь частично, или уже не реагирует на антагонист VEGF, включающий стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества антагониста альфа5бета1. В соответствии с другим вариантом осуществления, представленное изобретение предлагает способ лечения субъекта, страдающего заболеванием, устойчивым или трудноизлечимым при помощи лечения антагонистом альфа5бета1, самостоятельно или в комбинации с химиотерапией, включающий стадию введения субъекту терапевтически эффективного количества антагониста VEGF.The presented invention relates to medicines and methods for treating patients who may benefit from a reduction in angiogenesis, suffering from abnormal angiogenesis and / or suffering from neoplasia. In accordance with one embodiment, the present invention provides a method of inhibiting angiogenesis and / or vascular permeability in a subject, comprising the step of administering to the subject a therapeutically effective amount of a VEGF antagonist and an alpha5beta antagonist simultaneously or sequentially. In accordance with another embodiment of the invention, the present invention provides a method of treating a subject suffering from a disease, the subject either previously responding to the treatment of the disease with a VEGF antagonist, but only partially or no longer responding to a VEGF antagonist, comprising the step of administering to the subject a therapeutically effective amount of the antagonist alpha5beta1. According to another embodiment, the present invention provides a method of treating a subject suffering from a disease that is persistent or difficult to treat by treatment with an alpha5beta antagonist, alone or in combination with chemotherapy, comprising the step of administering to the subject a therapeutically effective amount of a VEGF antagonist.
Представленное изобретение также касается новых антител против альфа5бета1, наборов и композиций, их включающих, и способов их изготовления или применения. В соответствии с одним из вариантов осуществления новые антитела против альфа5бета1 являются описанными здесь антителами 7H5 или 7H12, или их гуманизированной или химерной формой. В соответствии с другим отдельным вариантом осуществления антитела 7H5 или 7H12 или их химерные или гуманизированные формы могут находиться в форме фрагментов Fab, Fab', F(ab)'2, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv, диатела, полиспецифического антитела и линейного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления новые антитела против альфа5бета1 могут быть конъюгированы с другим объектом, но не ограничиваясь перечисленным, таким как терапевтический препарат, или флуоресцентный краситель, или иной маркер для обнаружения альфа5бета1 у пациентов или в образцах от пациентов. Подобные новые антитела против альфа5бета1 могут быть использованы в различных терапевтических и диагностических методах. Например, такие антитела против альфа5бета1 могут быть использованы при лечении ненормального ангиогенеза, неоплазии, заболеваний глаз и аутоиммунных заболеваний. Подобные антитела могут быть использованы для обнаружения белка альфа5бета1 у пациентов или в образцах от пациентов путем осуществления контакта таких антител с белком альфа5бета1 у пациентов или в образцах пациентов и количественного или качественного определения связанных с белком альфа5бета1 антител против альфа5бета1.The presented invention also relates to new antibodies against alpha5beta1, kits and compositions including them, and methods for their manufacture or use. In one embodiment, the novel anti-alpha5beta1 antibodies are the 7H5 or 7H12 antibodies described herein, or a humanized or chimeric form thereof. According to another particular embodiment, the 7H5 or 7H12 antibodies or their chimeric or humanized forms can be in the form of Fab, Fab ', F (ab)' 2 fragments, Fv single chain (scFv), Fv fragment, diabody, multispecific antibody and linear antibody . In accordance with another embodiment, the new anti-alpha5beta1 antibodies can be conjugated to another object, but not limited to, such as a therapeutic drug, or a fluorescent dye, or other marker for detecting alpha5beta1 in patients or in patient samples. Similar new antibodies against alpha5beta1 can be used in various therapeutic and diagnostic methods. For example, such antibodies against alpha5beta1 can be used in the treatment of abnormal angiogenesis, neoplasia, eye diseases and autoimmune diseases. Such antibodies can be used to detect the alpha5beta1 protein in patients or in patient samples by contacting such antibodies with the alpha5beta1 protein in patients or in patient samples and to quantitatively or qualitatively determine the anti-alpha5beta1 antibodies associated with the alpha5beta1 protein.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления, представленное изобретение предлагает способ лечения рака у субъекта, включающий стадию введения антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1 одновременно или последовательно. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления рак реагирует на терапию антагонистом VEGF. Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ лечения связанной с возрастом дегенерации желтого пятна у субъекта, страдающего от AMD, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1 одновременно или последовательно. По еще одному варианту осуществления предложен способ лечения аутоиммунных заболеваний у субъекта, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антагониста VEGF и антагониста альфа5бета1 одновременно или последовательно.In accordance with yet another embodiment, the present invention provides a method for treating cancer in a subject, comprising the step of administering a VEGF antagonist and an alpha5beta1 antagonist simultaneously or sequentially. In accordance with one preferred embodiment, the cancer responds to therapy with a VEGF antagonist. Another embodiment of the invention is a method of treating age-related macular degeneration in a subject suffering from AMD, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of a VEGF antagonist and an alpha5beta1 antagonist simultaneously or sequentially. In yet another embodiment, a method for treating autoimmune diseases in a subject is provided, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of a VEGF antagonist and an alpha5beta antagonist simultaneously or sequentially.
В одном из вариантов осуществления подвергающемуся лечению субъекту может быть сначала введен антагонист VEGF, а затем проведено лечение антагонистом альфа5бета1. В другом варианте осуществления, субъект подвергается лечению антагонистом VEGF и антагонистом альфа5бета1 одновременно. В соответствии с другим вариантом осуществления субъект подвергается лечению антагонистом VEGF до тех пор, пока субъект не перестанет реагировать на лечение антагонистом VEGF, после чего субъект подвергается лечению антагонистом альфа5бета1. В одном отдельном варианте осуществления субъект подвергался лечению антагонистом VEGF, если рак был неинвазивным или на ранней стадии и подвергался лечению альфа5бета1 антагонистом, когда рак был инвазивным. По другому варианту осуществления субъект, подвергавшийся лечению антагонистом альфа5бета1, имел повышенный уровень альфа5бета1 в пораженной болезнью ткани по сравнению с тканью от субъекта, не страдающего заболеванием. В этом случае способ может далее включать стадию обнаружения альфа5бета1 у субъекта, например в больной ткани после лечения антагонистом VEGF. В соответствии с одним вариантом осуществления инвазивным раком является метастазирующий рак. В соответствии с другим вариантом осуществления, рак на ранней стадии - это рак, излечиваемый вспомогательной терапией (например, химиотерапией или хирургическим удалением).In one embodiment, a VEGF antagonist may be administered first to a subject to treatment and then treated with an alpha5beta1 antagonist. In another embodiment, the subject is treated with a VEGF antagonist and an alpha5beta1 antagonist simultaneously. According to another embodiment, the subject is treated with a VEGF antagonist until the subject no longer responds to treatment with a VEGF antagonist, after which the subject is treated with an alpha5beta1 antagonist. In one particular embodiment, the subject was treated with a VEGF antagonist if the cancer was non-invasive or at an early stage and was treated with an
В одном предпочтительном варианте осуществления субъект, страдающий от болезни, имеет патологию ангиогенеза. В соответствии с другим вариантом осуществления, болезнь выбрана из группы, состоящей из рака, иммунного заболевания или глазного заболевания. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, заболевание выбрано из группы, состоящей из солидной опухоли, метастатической опухоли, опухоли мягких тканей, заболевания, связанного с неоваскуляризацией глаза, воспалительного заболевания, связанного с ненормальным ангиогенезом, заболевания, возникающего после трансплантации субъекту, и заболевания, связанного с ненормальным развитием сосудисто-волокнистой ткани. В соответствии с другим предпочтительным вариантом, болезнь выбрана из группы, состоящей из рака груди (включая метастатический рак груди), рака шейки матки, рака кишечника (включая метастатический рак кишечника), рака легких (включая немелкоклеточный рак легких), не-Ходжкинской лимфомы (NHL), хронического лимфолейкоза, почечноклеточного рака, рака простаты, включая устойчивый к гормонам рак простаты, рака печени, рака головы и шеи, меланомы, рака яичника, мезотелиомы, рака мягких тканей, желудочно-кишечная опухоль стромы, мультиформная глиобластома и множественная миелома. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, болезнь выбрана из группы, состоящей из ретинопатии, вызванной возрастом дегенерации желтого пятна (например, влажной AMD), диабетического отека сетчатки, покраснения радужки, псориаза, воспалительного заболевания почек, гемолитического уремического синдрома, диабетической ретинопатии (например, пролиферативная диабетическая ретинопатия), артрита (например, псориатического артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита), воспалительной болезни кишечника, хронического воспаления, хронического отслоения роговицы, хронического увеита, хронического витрита, корнеального отторжения пересаженной ткани, корнеальной неоваскуляризации, корнеальной неоваскуляризации пересаженной ткани, болезни Крона, миопии, глазной неоваскулярной болезни, болезни Педжета, пемфигоида, полиартрита, пост-лазерной радиальной кератотомии, неоваскуляризации сетчатки, синдрома Шегрена, язвенного колита, отторжения имплантанта, воспаления легких, нефротического синдрома, отека, асцитов, связанных со злокачественными опухолями, удара, ангиофибромы и неоваскулярной глаукомы. В одном из вариантов осуществления, субъекту дополнительно вводится терапевтический препарат, выбранный из группы, состоящей из анти-неопластического препарата, химиотерапевтического препарата и цитотоксического препарата.In one preferred embodiment, the subject suffering from the disease has a pathology of angiogenesis. In accordance with another embodiment, the disease is selected from the group consisting of cancer, immune disease, or eye disease. In accordance with one preferred embodiment, the disease is selected from the group consisting of a solid tumor, a metastatic tumor, a soft tissue tumor, a disease associated with neovascularization of the eye, an inflammatory disease associated with abnormal angiogenesis, a disease that occurs after transplantation to a subject, and a disease, associated with abnormal development of vascular fibrous tissue. In another preferred embodiment, the disease is selected from the group consisting of breast cancer (including metastatic breast cancer), cervical cancer, colon cancer (including metastatic cancer of the intestine), lung cancer (including non-small cell lung cancer), non-Hodgkin’s lymphoma ( NHL), chronic lymphocytic leukemia, renal cell carcinoma, prostate cancer, including hormone-resistant prostate cancer, liver cancer, head and neck cancer, melanoma, ovarian cancer, mesothelioma, soft tissue cancer, gastrointestinal stroma tumor, gliobiform multiforme fins and multiple myeloma. According to another preferred embodiment, the disease is selected from the group consisting of retinopathy caused by age-related macular degeneration (e.g., wet AMD), diabetic retinal edema, redness of the iris, psoriasis, inflammatory kidney disease, hemolytic uremic syndrome, diabetic retinopathy (e.g. , proliferative diabetic retinopathy), arthritis (e.g., psoriatic arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis), inflammatory bowel disease, chronic pricking, chronic exfoliation of the cornea, chronic uveitis, chronic vitritis, corneal rejection of transplanted tissue, corneal neovascularization, corneal neovascularization of transplanted tissue, Crohn’s disease, myopia, ocular neovascular disease, Paget’s disease, pemphigoid, polyarthritis, post-laser neurosurgery, Sjogren’s syndrome, ulcerative colitis, implant rejection, pneumonia, nephrotic syndrome, edema, ascites associated with malignant tumors, ud Macaw, angiofibroma and neovascular glaucoma. In one embodiment, the subject is additionally administered a therapeutic drug selected from the group consisting of an anti-neoplastic drug, a chemotherapeutic drug, and a cytotoxic drug.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения, подвергающийся лечению антагонистом альфа5бета1 субъект страдает от рецидива после лечения антагонистом VEGF или стал невосприимчивым к лечению антагонистом VEGF. В соответствии с другим вариантом осуществления, подвергающийся лечению антагонистом альфа5бета1 и антагонистом VEGF субъект страдает от метастатического рака или ранее подвергался вспомогательной терапии. В одном варианте осуществления, заболевание у являющегося кандидатом пациента является рецидивом, невосприимчивым или устойчивым к химиотерапевтическим препаратам, таким как иринотекан. Примеры таких заболеваний включают, но не ограничены, метастатический рак кишечника, рецидив метастатического рака кишечника, метастатический рак груди, рецидив метастатического рака груди, метастатический рак груди HER2+, адъювантный рак груди, адъювантный рак груди HER2+, метастатический рак поджелудочной железы, адъювантный рак толстой кишки, адъювантный немелкоклеточный рак легких, адъювантный рак прямой кишки, адъювантный немелкоклеточный рак легких, метастатический немелкоклеточный рак легких, метастатический рак яичника, метастатический почечноклеточный рак и адъювантный почечноклеточный рак.According to a preferred embodiment of the present invention, the subject being treated with an alpha5beta1 antagonist suffers from a relapse after treatment with a VEGF antagonist or becomes immune to treatment with a VEGF antagonist. According to another embodiment, a subject being treated with an alpha5beta1 antagonist and a VEGF antagonist is suffering from metastatic cancer or has previously undergone adjuvant therapy. In one embodiment, the disease in the candidate patient is relapse, refractory, or resistant to chemotherapeutic drugs, such as irinotecan. Examples of such diseases include, but are not limited to, metastatic colon cancer, relapse of metastatic colon cancer, metastatic breast cancer, relapse of metastatic breast cancer, metastatic breast cancer HER2 +, adjuvant breast cancer, adjuvant breast cancer HER2 +, metastatic cancer of the pancreas, adjuvant colon cancer , adjuvant non-small cell lung cancer, adjuvant rectal cancer, adjuvant non-small cell lung cancer, metastatic non-small cell lung cancer, metastatic ovarian cancer, metastat cal adjuvant renal cell carcinoma and renal cell carcinoma.
В соответствии с одним вариантом осуществления субъекту, страдающему от описанного здесь заболевания, после лечения антагонистом VEGF проводится поддерживающая терапия, где поддерживающая терапия подразумевает использование антагониста альфа5бета1 самого по себе или после, или одновременно с антагонистом VEGF.In accordance with one embodiment, a subject suffering from the disease described herein is provided with maintenance therapy after treatment with a VEGF antagonist, where maintenance therapy involves using an alpha5beta1 antagonist alone or after, or simultaneously with, a VEGF antagonist.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антагонист VEGF может быть выбран из группы, состоящей из антитела, иммуноадгезина, пептитела, малой молекулы и нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей VEGF при жестких условиях (например, рибозим, siРНК или аптамер). В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антагонист VEGF является антителом. В соответствии с другим вариантом осуществления антитело является моноклональным антителом. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления связывание антител против VEGF с человеческим VEGF может быть полностью ингибировано антителами Avastin®. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антитела против VEGF являются человеческими, гуманизированными или химерными. В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления антителами против VEGF является антитело Avastin®. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против VEGF выбраны из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)'2, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления антагонист VEGF является биспецифическим антителом, которое связывается с VEGF и альфа5бета1 и является антагонистом альфа5бета1.In accordance with one preferred embodiment, the VEGF antagonist can be selected from the group consisting of an antibody, immunoadhesin, peptibody, small molecule and nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid molecule encoding VEGF under stringent conditions (e.g., ribozyme, siRNA or aptamer) . In accordance with one preferred embodiment, the VEGF antagonist is an antibody. In accordance with another embodiment, the antibody is a monoclonal antibody. In accordance with one preferred embodiment of the anti-VEGF antibody binding to human VEGF can be completely inhibited by antibodies Avastin ®. In accordance with one preferred embodiment, the anti-VEGF antibodies are human, humanized, or chimeric. In accordance with one specific embodiment of the anti-VEGF antibody is the Avastin ®. In accordance with another embodiment, anti-VEGF antibodies are selected from the group consisting of Fab, Fab ', F (ab)' 2 , single-chain Fv (scFv), Fv fragment; diabodies and linear antibodies. According to another embodiment, the VEGF antagonist is a bispecific antibody that binds to VEGF and alpha5beta1 and is an alpha5beta1 antagonist.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антагонист альфа5бета1 может быть выбран из группы, состоящей из антитела, иммуноадгезина, пептитела, малой молекулы и нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа5бета1, при жестких условиях.In accordance with one preferred embodiment, the alpha5beta1 antagonist may be selected from the group consisting of an antibody, immunoadhesin, peptibody, small molecule, and nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid molecule encoding alpha5beta1 under stringent conditions.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист альфа5бета1 является антителом. В соответствии с другим вариантом осуществления антитело является моноклональным антителом. В соответствии со следующим вариантом осуществления, моноклональное антитело является химерным антителом, таким как антитело против человеческого альфа5бета1, известное как M200 или F200. В соответствии с одним вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 включают последовательность VH SEQ ID NO:1 и последовательность VL SEQ ID NO:2. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 включают последовательность SEQ ID NO:3 и последовательность SEQ ID NO:4. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 включают последовательность SEQ ID NO:4 и последовательность SEQ ID NO:5. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения связывание антител против альфа5бета1 с человеческим альфа5бета1 может быть полностью ингибировано антителами 7H5 или антителами 7H12. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 являются человеческими, гуманизированными или химерными. В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления антителами против человеческого альфа5бета1 являются антитело 7H5, антитело 7H12 или химерное, или гуманизированное антитело на их основе. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 выбраны из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab)'2, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления антагонист альфа5бета1 является биспецифическим антителом, которое связывает VEGF и альфа5бета1 и является антагонистом VEGF. В соответствии с еще одним вариантом осуществления антагонист анти-альфа5бета1 имеет измененную эффекторную функцию. В соответствии с одним вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 изменены с целью уменьшения или подавления антителозависимого клеточного цитотоксического действия (ADCC) или комплементзависимого цитотоксического действия (CDC) (например, путем изменения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Fc антитела). В соответствии с еще одним вариантом осуществления, антитела против альфа5бета1 были изменены для увеличения периода полужизни в человеческом организме (например путем изменения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей участок Fc антитела).In accordance with one preferred embodiment, the alpha5beta1 antagonist is an antibody. In accordance with another embodiment, the antibody is a monoclonal antibody. According to a further embodiment, the monoclonal antibody is a chimeric antibody, such as an anti-human alpha5beta1 antibody, known as M200 or F200. In accordance with one embodiment, antibodies against alpha5beta1 include the sequence of VH SEQ ID NO: 1 and the sequence of VL SEQ ID NO: 2. In accordance with another embodiment, antibodies against alpha5beta1 include the sequence of SEQ ID NO: 3 and the sequence of SEQ ID NO: 4. In accordance with another embodiment, antibodies against alpha5beta1 include the sequence of SEQ ID NO: 4 and the sequence of SEQ ID NO: 5. According to a preferred embodiment of the invention, the binding of anti-alpha5beta1 antibodies to human alpha5beta1 can be completely inhibited by 7H5 antibodies or 7H12 antibodies. In accordance with one preferred embodiment, antibodies against alpha5beta1 are human, humanized or chimeric. In accordance with one specific embodiment, the anti-human alpha5beta1 antibody is a 7H5 antibody, a 7H12 antibody, or a chimeric or humanized antibody thereof. According to another embodiment, anti-alpha5beta1 antibodies are selected from the group consisting of Fab, Fab ', F (ab)' 2 , single chain Fv (scFv), Fv fragment; diabodies and linear antibodies. According to another embodiment, the alpha5beta1 antagonist is a bispecific antibody that binds VEGF and alpha5beta1 and is a VEGF antagonist. According to yet another embodiment, the anti-alpha5beta1 antagonist has altered effector function. In one embodiment, anti-alpha5beta1 antibodies are modified to reduce or suppress antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC) (for example, by changing the nucleic acid sequence encoding an antibody's Fc protein). According to yet another embodiment, anti-alpha5beta1 antibodies have been modified to increase the half-life in the human body (for example, by changing the nucleic acid sequence encoding the Fc region of an antibody).
В соответствии с одним вариантом осуществления антагонист VEGF или антагонист альфа5бета1 конъюгирован с цитотоксическим препаратом или химиотерапевтическим препаратом. В соответствии с другим вариантом осуществления цитотоксический препарат является радиоизотопом или токсином.In accordance with one embodiment, the VEGF antagonist or alpha5beta1 antagonist is conjugated to a cytotoxic drug or chemotherapeutic drug. In accordance with another embodiment, the cytotoxic drug is a radioisotope or toxin.
Представленное изобретение предлагает композиции, включающие антагонист VEGF, антагонист альфа5бета1 и фармацевтически приемлемый носитель. Представленное изобретение также предлагает изделия, включающие инструкции по обнаружению альфа5бета1 у субъекта, подвергавшегося лечению антагонистом VEGF.The present invention provides compositions comprising a VEGF antagonist, an alpha5beta1 antagonist and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention also provides articles comprising instructions for detecting alpha5beta1 in a subject treated with a VEGF antagonist.
Представленное изобретение также касается применения агонистов VEGFR и агонистов альфа5бета1 для стимуляции ангиогенеза и проницаемости сосудов и композиций, включающих агонисты VEGFR, и агонисты альфа5бета1, и фармацевтически приемлемый носитель. Комбинированная терапия агонистами VEGFR и агонистами альфа5бета1 может быть использована при лечении различных заболеваний, при которых может наступить улучшение при увеличении ангиогенеза и сосудистой проницаемости, включая, например, излечение ран, такое как лечение хронических ран, острых ран и обычных ран.The present invention also relates to the use of VEGFR agonists and alpha5beta1 agonists to stimulate angiogenesis and vascular permeability and compositions comprising VEGFR agonists and alpha5beta1 agonists and a pharmaceutically acceptable carrier. Combination therapy with VEGFR agonists and alpha5beta1 agonists can be used in the treatment of various diseases in which improvement can occur with increased angiogenesis and vascular permeability, including, for example, healing of wounds, such as treatment of chronic wounds, acute wounds and conventional wounds.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
Фигура 1 показывает увеличение популяции экспрессирующих альфа5бета1 клеток стромы после обработки ксенотрансплантированных опухолей HT29 антителами против VEGF, B20-4.1.Figure 1 shows an increase in the population of alpha5beta1 expressing stromal cells after treatment of xenograft HT29 tumors with anti-VEGF antibodies, B20-4.1.
Фигура 2 представляет собой диаграмму, показывающую связывание антител 7H5 и 7Hl2 с клетками HUVEC в исследовании прямого связывания.Figure 2 is a diagram showing the binding of 7H5 and 7Hl2 antibodies to HUVEC cells in a direct binding assay.
Фигура 3 показывает связывание антител 7H5 и 7H12 с клетками HUVEC, но не с клетками RAJI по данным анализа FACS.Figure 3 shows the binding of 7H5 and 7H12 antibodies to HUVEC cells, but not to RAJI cells according to FACS analysis.
Фигура 4 является диаграммой, показывающей адгезию HUVEC к фибронектину в присутствии очищенных моноклональных антител 7H5 и 7H12.Figure 4 is a diagram showing the adhesion of HUVEC to fibronectin in the presence of purified monoclonal antibodies 7H5 and 7H12.
Фигура 5 представляет собой (А) столбчатую диаграмму, демонстрирующую действие 7H5 и 7H12 на развитие клеток HUVEC по общему числу клеток и (В) столбчатую диаграмму, демонстрирующую действие 7H5 и 7H12 на развитие клеток HUVEC по окраске Alamar blue в другом исследовании.Figure 5 is a (A) bar graph showing the effect of 7H5 and 7H12 on HUVEC cell development by the total number of cells; and (B) a bar graph showing the effect of 7H5 and 7H12 on HUVEC cell development by Alamar blue stain in another study.
Фигура 6 представляет собой фотографию миграции клеток HUVEC после обработки 7H5 на 0 ч и 30 ч по сравнению с отрицательным контролем (IgG).Figure 6 is a photograph of the migration of HUVEC cells after treatment with 7H5 for 0 h and 30 h compared with the negative control (IgG).
Фигура 7 представляет собой столбчатую диаграмму, количественно демонстрирующую миграцию клеток HUVEC после обработки 7H5 и 7H12.Figure 7 is a bar graph quantitatively showing the migration of HUVEC cells after treatment with 7H5 and 7H12.
Фигура 8 представляет собой столбчатую диаграмму, демонстрирующую процент клеток HUVEC, экспрессирующих активированную каспазу-3 в исследованиях апоптоза после обработки 7H5 и 7H12.Figure 8 is a bar graph showing the percentage of HUVEC cells expressing activated caspase-3 in apoptosis studies after treatment with 7H5 and 7H12.
Фигура 9 представляет собой столбчатую диаграмму, показывающую активность каспазы 3/7 в клетках HUVEC после обработки 7H5 и 7H12.Figure 9 is a bar graph showing caspase 3/7 activity in HUVEC cells after treatment with 7H5 and 7H12.
Фигура 10 представляет собой диаграмму, демонстрирующую активность 7H12 и/или бевацизумаба на модели заживления раны уха кролика.Figure 10 is a graph showing the activity of 7H12 and / or bevacizumab in a rabbit ear wound healing model.
Фигура 11 демонстрирует результаты лечения антителами против VEGF с дополнением антителами против альфа5бета1 или без них на модели рака груди в виде (А) диаграммы, демонстрирующей средний объем опухоли в группе у подвергавшихся лечению мышей, или (В) график Каплана-Мейера, демонстрирующий процент животных, остающихся в исследовании, как функцию времени. Животные изымались из исследования, когда их опухоли достигали или превышали 1500 мм3.Figure 11 shows the results of treatment with anti-VEGF antibodies with or without anti-alpha5beta1 antibodies on a breast cancer model in the form of (A) a chart showing the average tumor volume in the group of treated mice, or (B) a Kaplan-Meier graph showing the percentage of animals remaining in the study as a function of time. Animals were withdrawn from the study when their tumors reached or exceeded 1,500 mm 3 .
Фигура 12 демонстрирует результаты лечения антителами против VEGF с дополнением антителами против альфа5бета1 или без них на модели рака толстой кишки в виде (А) диаграммы, демонстрирующей средний объем опухоли в группе у подвергавшихся лечению мышей, или (В) график Каплана-Мейера, демонстрирующий процент животных, остающихся в исследовании, как функцию времени. Животные изымались из исследования, когда их опухоли достигали или превышали 1500 мм3.Figure 12 shows the results of treatment with anti-VEGF antibodies with or without anti-alpha5beta1 antibodies on a colon cancer model in the form of (A) a chart showing the average tumor volume in the group of treated mice, or (B) a Kaplan-Meier graph showing the percentage animals remaining in the study as a function of time. Animals were withdrawn from the study when their tumors reached or exceeded 1,500 mm 3 .
Фигура 13 демонстрирует результаты лечения антителами против альфа5бета1 или химиотерапевтическим препаратом на модели рака толстой кишки в виде (А) диаграммы, демонстрирующей средний объем опухоли в группе у подвергавшихся лечению мышей, или (В) график Каплана-Мейера, демонстрирующий процент животных, остающихся в исследовании, как функцию времени. Животные изымались из исследования, когда их опухоли достигали или превышали 1500 мм3.Figure 13 shows the results of treatment with anti-alpha5beta1 antibodies or a chemotherapeutic drug in a colon cancer model in the form of (A) a chart showing the average tumor volume in the group of treated mice, or (B) a Kaplan-Meier graph showing the percentage of animals remaining in the study as a function of time. Animals were withdrawn from the study when their tumors reached or exceeded 1,500 mm 3 .
Фигура 14 демонстрирует график Скэтчарда связывания 125I-7H5 с альфа5бета1 на клеточной линии фибробластов кролика R9ab.Figure 14 shows a Scatchard plot of the binding of 125 I-7H5 to alpha5beta1 on the rabbit R9ab rabbit fibroblast cell line.
Фигура 15 демонстрирует график Скэтчарда связывания 125I-7H12 с альфа5бета1 на клеточной линии фибробластов кролика R9ab.Figure 15 shows a Scatchard plot of the binding of 125 I-7H12 to alpha5beta1 on the rabbit R9ab rabbit fibroblast cell line.
Фигура 16 демонстрирует результаты картирования эпитопов IgG против интегрина альфа5бета1 и исследований конкурентного связывания различных антител против альфа5бета1.Figure 16 shows the results of mapping IgG epitopes against integrin alpha5beta1 and studies of the competitive binding of various antibodies against alpha5beta1.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Не будучи связанными теорией, авторы сделали предположение, что увеличение восстановления популяции клеток стромы может доставлять к больным участкам иные факторы роста сосудов, что может компенсировать потерю активности VEGF у пациентов, подвергавшихся терапии антагонистами VEGF. Воздействие на экспрессирующие альфа5бета1 клетки стромы антителами против альфа5бета1 может приводить к уменьшению числа клеток стромы, таким образом, уменьшая продукцию потенциально компенсирующих факторов сосудистого роста. Альтернативно или дополнительно авторы предположили, что ингибирование взаимодействий между эндотелием и внеклеточным матриксом и частичное ингибирование взаимодействий связывания альфа5бета1 будет увеличивать эффективность лечения антагонистами VEGF путем ингибирования рецидивов ангиогенеза вдоль следов во внеклеточном матриксе, оставленных регрессирующими вследствие лечения антагонистом VEGF сосудами. Таким образом, лечение антагонистами альфа5бета1 одновременно с любым лечением антагонистами VEGF или после него может ингибировать восстановление сосудов после лечения антагонистом VEGF и, следовательно, возобновление неоваскулярного роста.Without being bound by theory, the authors hypothesized that increased recovery of the stromal cell population may deliver other vascular growth factors to the diseased areas, which may compensate for the loss of VEGF activity in patients treated with VEGF antagonists. Exposure of alpha5beta1 expressing stromal cells to anti-alpha5beta1 antibodies can lead to a decrease in the number of stromal cells, thereby reducing the production of potentially compensating vascular growth factors. Alternatively or additionally, the authors suggested that inhibition of the interactions between the endothelium and the extracellular matrix and partial inhibition of alpha5beta1 binding interactions will increase the effectiveness of treatment with VEGF antagonists by inhibiting the recurrence of angiogenesis along the traces in the extracellular matrix left by the regressing vessels resulting from treatment with the VEGF antagonist. Thus, treatment with alpha5beta1 antagonists, simultaneously with any treatment with or after VEGF antagonists, can inhibit vascular repair after treatment with a VEGF antagonist and, consequently, the resumption of neovascular growth.
«Альфа5бета1», или «α5β1», или «a5б1» является интегрином, включающим два различных белка (т.е. субъединицы альфа5 и бета1). Для альфа5бета1 показано, что он связывается с фибронектином, L1-CAM и фибриногеном. Интегрин альфа5бета1 также называют белком очень поздней активации-5, VLA-5, альфа5бета1, CD49e/CD29, рецептором фибронектина, FNR и GPIc-IIa. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления альфа5бета1 является человеческим альфа5бета1.“Alpha5beta1” or “α5β1” or “a5b1” is an integrin comprising two different proteins (ie, alpha5 and beta1 subunits). For alpha5beta1, it has been shown to bind to fibronectin, L1-CAM, and fibrinogen. Integrin alpha5beta1 is also called very late activation protein-5, VLA-5, alpha5beta1, CD49e / CD29, fibronectin receptor, FNR and GPIc-IIa. In a preferred embodiment, alpha5beta1 is human alpha5beta1.
«Альфа5» также известен как CD49e, альфа5, альфа5 субъединица интегрина, альфа субъединица VLA-5, субъединица IC GPIc-IIa и альфа цепь FNR имеет четыре изоформы, получающиеся в результате альтернативного сплайсинга (A-D). Вариации подвергаются цитоплазматические домены белков. Аминокислотные последовательности изоформ человеческого альфа5 могут быть найдены, например, под номерами доступа Genbank X07979, U33879, U33882 и U33880 соответственно."Alpha5" is also known as CD49e, alpha5, integrin alpha5 subunit, VLA-5 alpha subunit, GPIc-IIa IC subunit and FNR alpha chain has four isoforms resulting from alternative splicing (A-D). Variations undergo the cytoplasmic domains of proteins. Amino acid sequences of isoforms of human alpha5 can be found, for example, under access numbers Genbank X07979, U33879, U33882 and U33880, respectively.
«Бета1» также называют CD29, бета1, GPIIa тромбоцитов; бета-цепь VLA; бета-1 цепь интегрина, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 и VLA5B. Аминокислотные последовательности человеческого бета1 могут быть найдены, например под номером доступа Genbank X06256.“Beta1” is also called CD29, beta1, GPIIa platelet; VLA beta chain; beta-1 integrin chain, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 and VLA5B. Amino acid sequences of human beta1 can be found, for example, under Genbank accession number X06256.
Термин «VEGF» или «VEGF-A», как он использован здесь, относится к 165-аминокислотному человеческому фактору роста эндотелиальных клеток сосудов и связанным 121-, 189-, и 206-аминокислотным человеческим факторам роста эндотелиальных клеток сосудов, как описано в Leung et al. Science, 246:1306 (1989), и Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), наряду с встречающимися в природе аллельными и измененными их формами. Термин «VEGF» также относится к VEGF отличных от человека видов, таких как мышь, крыса или примат. Иногда VEGF от определенного вида указывается терминами, такими как hVEGF для человеческого VEGF, mVEGF для мышиного VEGF, и т.п. Термин «VEGF» также используется для обозначения укороченных форм полипептида, включающих аминокислоты от 8 до 109 или от 1 до 109 165-аминокислотного человеческого фактора роста эндотелиальных клеток сосудов. Ссылки на любые подобные формы могут быть обозначены в настоящей заявке, например, как «VEGF (8-109)», «VEGF (1-109)» или «VEGF165». Положения аминокислот в «укороченном» природном VEGF пронумерованы, как они указаны в природной последовательности VEGF. Например, аминокислота в положении 17 (метионин) в укороченном природном VEGF соответствует аминокислоте 17 (метионину) в природном VEGF. Укороченный природный VEGF имеет сродство связывания к рецепторам KDR и FIt-1, сравнимое с природным VEGF. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления VEGF является человеческим VEGF.The term “VEGF” or “VEGF-A,” as used herein, refers to 165 amino acid human vascular endothelial cell growth factor and related 121, 189, and 206 amino acid human vascular endothelial cell growth factors, as described in Leung et al. Science, 246: 1306 (1989), and Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), along with naturally occurring allelic and altered forms thereof. The term “VEGF” also refers to VEGF of non-human species, such as a mouse, rat or primate. Sometimes VEGF from a particular species is indicated by terms such as hVEGF for human VEGF, mVEGF for mouse VEGF, and the like. The term "VEGF" is also used to refer to shortened forms of a polypeptide comprising amino acids from 8 to 109 or from 1 to 109 of 165 165 amino acid human vascular endothelial cell growth factor. References to any such forms may be referred to herein, for example, as “VEGF (8-109)”, “VEGF (1-109)” or “VEGF 165 ”. The amino acid positions in the “shortened” natural VEGF are numbered as indicated in the natural VEGF sequence. For example, the amino acid at position 17 (methionine) in truncated natural VEGF corresponds to amino acid 17 (methionine) in natural VEGF. Shortened natural VEGF has a binding affinity for the KDR and FIt-1 receptors, comparable to natural VEGF. According to a preferred embodiment, VEGF is human VEGF.
Термин «антагонист VEGF» относится к молекуле, способной нейтрализовать, заблокировать, ингибировать, сделать неактивным, уменьшить или помешать действию VEGF, способом, включающим ее связывание с VEGF или одним или более рецепторов VEGF или кодирующими их нуклеиновыми кислотами. Предпочтительно, антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF. Антагонисты VEGF включают антитела против VEGF и их антиген-связывающие участки, полипептиды, которые связываются с VEGF или с рецепторами VEGF и блокируют взаимодействие лиганда с рецептором (например, иммуноадгезины, пептитела), антитела против рецептора VEGF и антагонисты рецептора VEGF, такие как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR, аптамеры, которые связывают VEGF и нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при определенных условиях с последовательностями нуклеиновых кислот, которые кодируют VEGF или рецептор VEGF (например, иРНК). В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF связывается с VEGF и ингибирует VEGF индуцированную пролиферацию эндотелиальных клеток. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с большим сродством, нежели не с VEGF или с не с рецептором VEGF. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления антагонист VEGF связывается с VEGF или рецептором VEGF с Kd между 500 нМ и 1 пМ.The term “VEGF antagonist” refers to a molecule capable of neutralizing, blocking, inhibiting, inactive, decreasing or interfering with the action of VEGF, in a manner comprising binding to VEGF or one or more VEGF receptors or nucleic acids encoding them. Preferably, the VEGF antagonist binds to VEGF or a VEGF receptor. VEGF antagonists include anti-VEGF antibodies and antigen binding sites thereof, polypeptides that bind to VEGF or VEGF receptors and block ligand-receptor interaction (e.g., immunoadhesins, peptibodies), anti-VEGF receptor antibodies and VEGF receptor antagonists such as low molecular weight inhibitors VEGFR tyrosine kinases, aptamers that bind VEGF and nucleic acids that hybridize under certain conditions with nucleic acid sequences that encode VEGF or a VEGF receptor (e.g. mRNA). In accordance with one preferred embodiment, the VEGF antagonist binds to VEGF and inhibits VEGF-induced proliferation of endothelial cells. According to one preferred embodiment, the VEGF antagonist binds to VEGF or the VEGF receptor with greater affinity than not to VEGF or not to VEGF receptor. According to one preferred embodiment, the VEGF antagonist binds to a VEGF or VEGF receptor with a Kd of between 1 μM and 1 pM. According to another preferred embodiment, the VEGF antagonist binds to a VEGF or VEGF receptor with a Kd between 500 nM and 1 pM.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, антагонист VEGF выбран из группы, состоящей из полипептида, такого как антитело, пептитело, иммуноадгезин, низкомолекулярное соединение или аптамер. В предпочтительном варианте осуществления антитело является антителом против VEGF, таким как антитело AVASTIN® или антителом против рецептора VEGF, таким как антитела против VEGFR2 или против VEGFR3. Другие примеры антагонистов VEGF включают VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (сорафениб), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 и KRN-633.According to a preferred embodiment, the VEGF antagonist is selected from the group consisting of a polypeptide, such as an antibody, peptibody, immunoadhesin, a low molecular weight compound or an aptamer. In a preferred embodiment, the antibody is an anti-VEGF antibody such as AVASTIN ® antibody or an anti-VEGF receptor antibody such as an anti-VEGFR2 or against VEGFR3. Other examples of VEGF antagonists include VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (sorafenib), ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258 , AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975 / CT6758 and KRN-633.
Термин «антитело против VEGF» обозначает антитело, способное связываться с VEGF с достаточным сродством и специфичностью. Предпочтительно, антитело против VEGF по изобретению может быть использовано в качестве терапевтического препарата, ориентированного и препятствующего заболеваниям и состояниям, в которые вовлечено действие VEGF. Антитела против VEGF обычно не связываются ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF. Предпочтительными антителами против VEGF являются моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и моноклональные антитела против VEGF A.4.6.1, производимые гибридомой ATCC HB 10709. Более предпочтительно антитела против VEGF являются рекомбинантными гуманизированными моноклональными антителами против VEGF, выработанными в соответствии с Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включая, но не ограничиваясь антителом, известным как бевацизумаб (BV; Avastin®). В соответствии с другим вариантом осуществления, антитела против VEGF, которые могут быть использованы, включают, но не ограничены, антителами, раскрытыми в заявке WO 2005/012359. В соответствии с одним вариантом осуществления, антитела против VEGF включают вариабельные тяжелые и вариабельные легкие участки любого из антител, раскрытых на фигурах 24, 25, 26, 27 и 29 заявки WO 2005/012359 (например, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 и B20.4.1). В другом предпочтительном варианте осуществления, антитело против VEGF, известное как ранибизумаб является антагонистом VEGF, назначаемым при болезнях глаз, таких как диабетическая нейропатия и AMD.The term “anti-VEGF antibody” means an antibody capable of binding to VEGF with sufficient affinity and specificity. Preferably, the anti-VEGF antibody of the invention can be used as a therapeutic drug that targets and prevents diseases and conditions in which the action of VEGF is involved. Antibodies against VEGF usually do not bind to either other VEGF homologues, such as VEGF-B or VEGF-C, or to other growth factors such as P1GF, PDGF or bFGF. Preferred anti-VEGF antibodies are monoclonal antibodies that bind to the same epitope as the anti-VEGF monoclonal antibodies A.4.6.1 produced by the ATCC HB 10709 hybridoma. More preferably, the anti-VEGF antibodies are recombinant humanized anti-VEGF monoclonal antibodies generated in accordance with Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599, including but not limited to the antibody known as bevacizumab (BV; Avastin ®). In accordance with another embodiment, anti-VEGF antibodies that may be used include, but are not limited to, the antibodies disclosed in WO 2005/012359. In accordance with one embodiment, antibodies against VEGF include variable heavy and variable light regions of any of the antibodies disclosed in figures 24, 25, 26, 27 and 29 of application WO 2005/012359 (for example, G6, G6-23, G6-31 , G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 and B20.4.1). In another preferred embodiment, the anti-VEGF antibody known as ranibizumab is a VEGF antagonist prescribed for eye diseases such as diabetic neuropathy and AMD.
Антитело против VEGF «бевацизумаб(BV)», также известное как "rhuMAb VEGF" или "Avastin®", является рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом против VEGF, полученным в соответствии с Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Оно включает мутантные структурные участки человеческого IgG1 и антигенсвязывающие определяющие комплементарность участки мышиного моноклонального антитела против hVEGF A.4.6.1, которое блокирует связывание человеческого VEGF с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть структурных участков, является производным человеческого IgG1, и приблизительно 7% последовательности является производным мышиного антитела A4.6.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 149000 дальтон и гликозилирован. Другие антитела против VEGF включают антитела, описанные в патенте Соединенных Штатов № 6884879 и WO 2005/044853.An anti-VEGF antibody "bevacizumab (BV)", also known as "rhuMAb VEGF" or "Avastin ® ", is a recombinant humanized monoclonal anti-VEGF antibody prepared according to Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599. It includes mutant structural regions of human IgG1 and antigen-binding complementarity determining regions of a murine monoclonal antibody against hVEGF A.4.6.1, which blocks the binding of human VEGF to its receptors. About 93% of the amino acid sequence of bevacizumab, including most of the structural sites, is a derivative of human IgG1, and about 7% of the sequence is a derivative of mouse antibody A4.6.1. Bevacizumab has a molecular weight of approximately 149,000 daltons and is glycosylated. Other anti-VEGF antibodies include those described in United States Patent No. 6884879 and WO 2005/044853.
Антитела против VEGF ранибизумаб или антитела LUCENTIS® или rhuFab V2 являются гуманизированными антителами со сформировавшимся сродством против человеческого фрагмента VEGF Fab. Ранибизумаб производится обычными методами рекомбинантной технологии с помощью экспрессионного вектора для Escherichia coli и бактериального ферментирования. Ранибизумаб не гликозилирован и имеет молекулярную массу приблизительно 48000 дальтон. См. WO98/45331 и US20030190317.Antibodies against VEGF ranibizumab or antibodies LUCENTIS ® or rhuFab V2 are humanized antibodies with a formed affinity against the human fragment of VEGF Fab. Ranibizumab is produced by conventional recombinant techniques using an expression vector for Escherichia coli and bacterial fermentation. Ranibizumab is not glycosylated and has a molecular weight of approximately 48,000 daltons. See WO98 / 45331 and US20030190317.
Термин «антагонист альфа5бета1» относится к любой молекуле, которая ингибирует биологическое действие альфа5бета1. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, молекула антагониста специфически связывает альфа5бета1. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, молекула антагониста связывается с альфа5. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист альфа5бета1 предпочтительно связывается с альфа5бета1 с большим сродством, нежели с интегринами, не являющимися альфа5бета1. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антагонист выбран из группы, состоящей из полипептида, такого как антитело, пептитела, или иммуноадгезина, низкомолекулярного соединения или аптамера, который ингибирует связывание альфа5бета1 с его лигандами (в частности, фибронектином), или нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа5бета1 (например, иРНК, препятствующая экспрессии альфа5). Биологическое действие альфа5бета1 может быть любым из эффектов, их сочетанием или всеми эффектами, выбранными из группы, состоящей из (1) связывания с фибронектином, (2) увеличением миграции клеток на фибронектине, (3) увеличения выживаемости клеток, содержащих альфа5бета1 в присутствии фибронектина, (4) увеличения пролиферации клеток, содержащих альфа5бета1 в присутствии фибронектина, и (5) увеличения образования трубок из клеток, содержащих альфа5бета1 в присутствии фибронектина.The term "alpha5beta1 antagonist" refers to any molecule that inhibits the biological effect of alpha5beta1. In accordance with one preferred embodiment, the antagonist molecule specifically binds alpha5beta1. In accordance with one preferred embodiment, the antagonist molecule binds to alpha5. According to one preferred embodiment, the alpha5beta1 antagonist preferably binds to alpha5beta1 with greater affinity than integrins other than alpha5beta1. In accordance with one preferred embodiment, the antagonist is selected from the group consisting of a polypeptide, such as an antibody, peptibody, or immunoadhesin, a low molecular weight compound or aptamer that inhibits the binding of alpha5beta1 to its ligands (in particular fibronectin), or a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule encoding alpha5beta1 (for example, mRNA that inhibits alpha5 expression). The biological effect of alpha5beta1 can be any of the effects, their combination, or all effects selected from the group consisting of (1) binding to fibronectin, (2) increased cell migration on fibronectin, (3) increased survival of cells containing alpha5beta1 in the presence of fibronectin, (4) increasing the proliferation of cells containing alpha5beta1 in the presence of fibronectin; and (5) increasing the formation of tubes from cells containing alpha5beta1 in the presence of fibronectin.
Примеры антагонистов-антител против альфа5бета1 включают M200 и F200 (WO 2004/089988A2), описанные здесь антитела 7Н5 и антитела 7Н12, и химерные, полностью человеческие и гуманизированные антитела на их основе. Например, антитела М200 и F200 могут быть получены из вариабельных тяжелых и вариабельных легких цепей мышиных антител против человеческого альфа5бета1, IIA1 (Pharmingen, San Diego, Ca). Примеры низкомолекулярных ингибиторов альфа5бета1 включают Ac-PHSCN-NH2 (WO-9822617A1) и (S)-2-[(2,4,6-триметилфенил)сульфонил]-амино-3-[7-бензилоксикарбонил-8-(2-пиридиниламиноэтил)-1-окса-2,7-диазаспиро-(4,4)-нон-2-ен-3-ил]карбониламино]пропионовую кислоту. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, антагонист альфа5бета1 связывается с альфа5бета1, но не связывается с альфаVбета3, альфаVбета5 или альфаVбета1. В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения, антагонист альфа5бета1 связывается с альфа5бета1 с Kd между 1 мкМ и 1 пМ. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения антагонист альфа5бета1 связывается с альфа5бета1 с Kd между 500 нМ и 1 пМ. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления антителом против альфа5бета1 является антитело, которое может конкурировать с антителом 7Н5 или антителом 7Н12 при связывании с альфа5бета1 при исследовании конкурентного связывания. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления, антителом является антитело, связывание которого с альфа5бета1 может быть полностью ингибировано антителами, производимыми гибридомой, депонированной как альфа5/бета1 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421), или гибридомой, депонированной как Альфа5/бета1 7H12.5.1.4 (ATCC No. PTA-7420) 7 марта 2006 г.Examples of anti-alpha5beta1 antibody antagonists include M200 and F200 (WO 2004 / 089988A2), the 7H5 antibodies and 7H12 antibodies described herein, and chimeric, fully human and humanized antibodies based on them. For example, antibodies M200 and F200 can be obtained from the variable heavy and variable light chains of murine antibodies against human alpha5beta1, IIA1 (Pharmingen, San Diego, Ca). Examples of low molecular weight alpha5beta1 inhibitors include Ac-PHSCN-NH2 (WO-9822617A1) and (S) -2 - [(2,4,6-trimethylphenyl) sulfonyl] amino-3- [7-benzyloxycarbonyl-8- (2-pyridinylaminoethyl ) -1-oxa-2,7-diazaspiro (4,4) non-2-en-3-yl] carbonylamino] propionic acid. According to one preferred embodiment of the invention, an alpha5beta1 antagonist binds to alpha5beta1 but does not bind to alphaVbeta3, alphaVbeta5 or alphaVbeta1. According to one preferred embodiment of the invention, an alpha5beta1 antagonist binds to alpha5beta1 with a Kd of between 1 μM and 1 pM. According to another preferred embodiment of the invention, the alpha5beta1 antagonist binds to alpha5beta1 with a Kd of between 500 nM and 1 pM. In accordance with one preferred embodiment, the anti-alpha5beta1 antibody is an antibody that can compete with 7H5 or 7H12 when binding to alpha5beta1 in a competitive binding assay. According to another preferred embodiment, the antibody is an antibody whose binding to alpha5beta1 can be completely inhibited by antibodies produced by a hybridoma deposited as alpha5 / beta1 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421) or a hybridoma deposited as alpha5 / beta1 7H12.5.1.4 (ATCC No. PTA-7420) March 7, 2006
Термин «агонист VEGFR» относится к молекуле, которая может активировать рецептор VEGF или увеличить его экспрессию. Агонисты VEGFR включают, но не ограничены, агонисты-лиганды VEGFR, варианты VEGF, антитела и активные фрагменты.The term "VEGFR agonist" refers to a molecule that can activate the VEGF receptor or increase its expression. VEGFR agonists include, but are not limited to, VEGFR ligand agonists, VEGF variants, antibodies, and active fragments.
Термин «агонист альфа5бета1» относится к молекуле, которая может активировать альфа5бета1 или увеличивать его экспрессию. Агонисты альфа5бета1 включают, но не ограничены, например, лигандные агонисты альфа5бета1.The term "alpha5beta1 agonist" refers to a molecule that can activate alpha5beta1 or increase its expression. Alpha5beta1 agonists include, but are not limited to, for example, alpha5beta1 ligand agonists.
Молекулы, такие как антитела, характеризующиеся связыванием с перекрывающимися или сходными участками цели, могут быть идентифицированы путем проведения исследований конкурентного ингибирования/связывания.Molecules, such as antibodies, characterized by binding to overlapping or similar sites of the target, can be identified by conducting studies of competitive inhibition / binding.
В одном варианте осуществления клетки HUVEC или другие клетки, экспрессирующие альфа5бета1, использованы в исследованиях конкурентного ингибирования, для оценки расположения мест связывания двух антител против альфа5бета1 относительно друг друга был использован FACS. Например, клетки HUVEC могут быть промыты в конической пробирке и осаждены центрифугированием при 100 об/мин в течение 5 мин. Осадок обычно промывался два раза. Затем клетки могут быть ресуспендированы, подсчитаны и сохранены на льду до использования. В лунку может быть добавлено 100 мкл первого антитела против альфа5бета1 (например, начиная с концентрации 1 мкг/мл или более низкой концентрации). Затем в каждую лунку может быть добавлено 100 мкл клеток (например, 20×105 клеток), после чего проводилась инкубация на льду в течение 30 мин. Затем в каждую лунку может быть добавлено по 100 мкл биотинилированных антител против альфа5бета1 (исходный раствор 5 мкг/мл), после чего проведено инкубирование на льду в течение 30 мин. Затем клетки были отмыты и осаждены центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Супернатант был удален. В лунку был добавлен (100 мкл, 1:1000) конъюгированный с R-пикоэритрином стрептавидин (Jackson 016-1 10-084). Затем планшета была завернута в фольгу и инкубирована на льду в течение 30 мин. После инкубирования осадок мог быть промыт и осажден центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок был ресуспендирован и перенесен в микропробирки для анализа FACS.In one embodiment, HUVEC cells or other cells expressing alpha5beta1 were used in competitive inhibition studies, FACS was used to evaluate the location of the binding sites of the two anti-alpha5beta1 antibodies relative to each other. For example, HUVEC cells can be washed in a conical tube and pelleted by centrifugation at 100 rpm for 5 minutes. The precipitate was usually washed twice. Cells can then be resuspended, counted and stored on ice until use. 100 μl of the first anti-alpha5 beta1 antibody can be added to the well (for example, starting at a concentration of 1 μg / ml or lower concentration). Then, 100 μl of cells (e.g., 20 × 10 5 cells) can be added to each well, followed by incubation on ice for 30 minutes. Then, 100 μl of biotinylated anti-alpha5beta1 antibodies (
Термин «ангиогенный фактор или агент» обозначает фактор роста, который стимулирует развитие кровеносных сосудов, например, способствует ангиогенезу, росту клеток эндотелия, стабильности кровеносных сосудов, и/или васкулогенезу и т.д. Ангиогенные факторы включают, но не ограничены, например, VEGF и членами семейства VEGF, P1GF, семейством PDGF, семейством фактора роста фибробластов (FGF), лигандов TIE (ангиопоэтинов), эфрины, Del-1, факторами роста фибробластов: кислым (aFGF) и основным (bFGF), фоллистатином, фактором стимуляции колоний гранулоцитов (G-CSF), фактором роста гепатоцитов (HGF)/рассеивающим фактором (SF), интерлейкином 8 (IL-8), лептином, мидкином, плацентарным фактором роста, тромбоцитарным фактором роста эндотелиальных клеток (PD-ECGF), тромбоцитарным фактором роста, в особенности PDGF-BB или PDGFR-бета, плейотрофином (PTN), програнулином, пролиферином, трансформирующим фактором роста альфа (TGF-alpha), пролиферином, трансформирующим фактором роста бета (TGF-beta), фактором некроза опухолей-альфа (TNF-alpha), фактором роста эндотелия сосудов (VEGF)/фактором проницаемости сосудов (VPF), и т.д. Они также включают факторы, ускоряющие заживление ран, такие как гормон роста, инсулин-подобный фактор роста-I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), CTGF и члены его семейства, и TGF-альфа и TGF-бета. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, таблицу 1, перечисляющую известные онкогенные факторы); и, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).The term "angiogenic factor or agent" refers to a growth factor that stimulates the development of blood vessels, for example, promotes angiogenesis, endothelial cell growth, blood vessel stability, and / or vasculogenesis, etc. Angiogenic factors include, but are not limited to, for example, VEGF and members of the VEGF family, P1GF, the PDGF family, the family of fibroblast growth factor (FGF), TIE ligands (angiopoietins), etherins, Del-1, fibroblast growth factors: acidic (aFGF) and major (bFGF), follistatin, granulocyte colony stimulation factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF) / scattering factor (SF), interleukin 8 (IL-8), leptin, midkine, placental growth factor, platelet growth factor endothelial cells (PD-ECGF), platelet-derived growth factor, in particular PDGF-BB or PD GFR-beta, pleiotrophin (PTN), progranulin, proliferin, transforming growth factor alpha (TGF-alpha), proliferin, transforming growth factor beta (TGF-beta), tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha), vascular endothelial growth factor (VEGF) / vascular permeability factor (VPF), etc. They also include factors that accelerate wound healing, such as growth hormone, insulin-like growth factor-I (IGF-I), VIGF, epidermal growth factor (EGF), CTGF and its family members, and TGF-alpha and TGF-beta . See, for example, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol 53: 217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5 (12): 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (e.g., Table 1 listing known oncogenic factors); and, Sato Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003).
Термин «Kd» или «значение Kd» для антитела против VEGF в соответствии с данным изобретением в одном предпочтительном варианте осуществления измеряется путем исследования связывания радиоактивно меченого VEGF (RIA), проводимого между Fab версией антитела и молекулой VEGF, как описано в следующем измерении, в котором сродство связывания в растворе Fab по отношению к VEGF определяется путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией меченого (125I) VEGF(109) в присутствии серии разведений немеченого VEGF, с последующим захватом связанного VEGF на покрытом антителами против Fab планшете (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Для установки условий для проведения анализа микротитровальные планшеты (Dynex) были покрыты захватывающими антителами против Fab (Cappel Labs) при инкубации в течение ночи с 5 мкг/мл антител в 50 мМ карбонате натрия (pH 9,6), после чего заблокированы 2% (по весу) бычьего сывороточного альбумина в ФСБ в течение от двух до пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°C). В неабсорбирующем планшете (Nunc №269620) 100 пМ или 26 пМ [125I] VEGF(109) было смешано с серией разведений интересующего Fab, например Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Затем интересующий Fab инкубировали в течение ночи; однако инкубация могла продолжаться до 65 часов для того, чтобы убедиться в том, что равновесие достигнуто. Затем смеси были перенесены на захватывающий планшет и инкубированы при комнатной температуре в течение одного часа. Затем раствор был удален, после чего планшет был промыт восемь раз 0,1% Tween-20 в ФСБ. Когда планшеты были высушены было добавлено 150 мкл сцинтилляционной жидкости (MicroScint-20; Packard) на лунку, после чего планшеты были подсчитаны на гамма-счетчике Topcount(Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого из Fab, которые давали связывание, меньше или равное 20% от максимального, были выбраны для использования в исследованиях по конкурентному связыванию. В соответствии с другим вариантом осуществления Kd или значение Kd были измерены с использованием анализов с применением поверхностного плазмонового резонанса с использованием BIAcoreTM-2000 или BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с иммобилизированным hVEGF (8-109), чипами CM5 и ~10 единицами ответа (RU). Вкратце, биосенсорные чипы на карбоксиметилированном декстране (CM5, BIAcore Inc.) были активированы гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Человеческий VEGF был разведен 10 мМ ацетатом натрия, pH 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед введением со скоростью потока 5 мкл в минуту для получения приблизительно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После введения человеческого VEGF был введен 1М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений была введена серия двухкратных разведений Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в ФСБ с добавлением 0,05% Tween 20 (PBST) при 25°C при скорости потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) были вычислены с применением простой модели связывания один к одному Лангмуира (BIAcore Evaluation Software version 3.2) путем одновременной подстановки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (Kd) была вычислена как соотношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Если скорость ассоциации превышает 106 M-1S-1 по данным исследований поверхностного плазмонного резонанса, описанного ранее, скорость ассоциации может быть определена с применением методики гашения флуоресценции, при которой измеряется увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение 295 нм, излучение 340 нм, 16 нм полоса пропускания) при 25°C 20 нМ антитела против VEGF (в форме Fab) в ФСБ, pH 7,2 в присутствии увеличивающихся концентраций короткой формы человеческого VEGF (8-109) или мышиного VEGF по данным измерений с помощью спектрометра, такого как спектрометр, оснащенный stop-flow (Aviv Instruments) или SLM-Aminco спектрофотометр серии 8000 (ThermoSpectronic) с встряхиваемой кюветой. Сходные исследования связывания могут быть проведены для определения Kd Fab или антител против альфа5бета1 с применением в качестве мишени альфа5бета1.The term “Kd” or “Kd value” for an anti-VEGF antibody of the invention in one preferred embodiment is measured by examining the binding of a radiolabeled VEGF (RIA) between the Fab version of an antibody and a VEGF molecule, as described in the following measurement, in wherein the affinity of binding in Fab solution to VEGF is determined by balancing Fab with a minimum concentration of labeled ( 125 I) VEGF (109) in the presence of a series of dilutions of unlabeled VEGF, followed by capture of bound VEGF on coated anti bodies against Fab plate (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881). To establish the conditions for the analysis, microtiter plates (Dynex) were coated with exciting anti-Fab antibodies (Cappel Labs) during incubation overnight with 5 μg / ml antibodies in 50 mM sodium carbonate (pH 9.6), after which 2% were blocked ( by weight) bovine serum albumin in FSB for two to five hours at room temperature (approximately 23 ° C). In a non-absorbent plate (Nunc No. 269620), 100 pM or 26 pM [ 125 I] VEGF (109) was mixed with a series of dilutions of the Fab of interest, for example Fab-12 (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599 ) Then the Fab of interest was incubated overnight; however, incubation could continue for up to 65 hours in order to ensure that equilibrium is achieved. The mixtures were then transferred onto an exciting plate and incubated at room temperature for one hour. The solution was then removed, after which the plate was washed eight times with 0.1% Tween-20 in PBS. When the plates were dried, 150 μl of scintillation liquid (MicroScint-20; Packard) was added per well, after which the plates were counted on a Topcount gamma counter (Packard) for ten minutes. The concentration of each of the Fab, which gave binding less than or equal to 20% of the maximum, were selected for use in studies on competitive binding. In another embodiment, Kd or Kd value was measured using surface plasmon resonance assays using BIAcore ™ -2000 or BIAcore ™ -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25 ° C with immobilized hVEGF (8 -109), CM5 chips, and ~ 10 response units (RU). Briefly, carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIAcore Inc.) were activated with N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) according to the supplier's instructions. Human VEGF was diluted with 10 mM sodium acetate, pH 4.8, to 5 μg / ml (~ 0.2 μM) before administration at a flow rate of 5 μl per minute to obtain approximately 10 response units (RU) of the bound protein. Following the administration of human VEGF, 1M ethanolamine was introduced to block unreacted groups. For kinetic measurements, a series of two-fold dilutions of Fab (from 0.78 nM to 500 nM) was introduced into the FSB with the addition of 0.05% Tween 20 (PBST) at 25 ° C at a flow rate of approximately 25 μl / min. Association rates (k on ) and dissociation rates (k off ) were calculated using a simple one-to-one Langmuir binding model (BIAcore Evaluation Software version 3.2) by simultaneously substituting association and dissociation sensograms. The equilibrium dissociation constant (Kd) was calculated as the ratio k off / k on . See, for example, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293: 865-881. If the association rate exceeds 10 6 M −1 S −1 according to the surface plasmon resonance studies described earlier, the association rate can be determined using the fluorescence quenching technique, which measures the increase or decrease in the fluorescence intensity (excitation 295 nm, radiation 340 nm , 16 nm bandwidth) at 25 °
В использованном здесь значении подвергающийся лечению субъект является млекопитающим (например, человеком, приматом, не являющимся человеком, крысой, мышью, коровой, лошадью, свиньей, овцой, козой, собакой, кошкой и т.д.). Субъект может быть клиническим пациентом, добровольцем клинических испытаний, экспериментальным животным и т.д. У субъекта может подозреваться наличие или иметься риск возникновения рака, иммунного заболевания или любого другого заболевания, характеризующегося патологическим ангиогенезом. Многие способы диагностики рака, иммунных заболеваний или других заболеваний, демонстрирующих ненормальный ангиогенез и клинические картины этих болезней, хорошо известны в данной области. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления подвергающийся лечению субъект является человеком.As used herein, the subject to be treated is a mammal (e.g., a human, non-human primate, rat, mouse, cow, horse, pig, sheep, goat, dog, cat, etc.). The subject may be a clinical patient, a clinical trial volunteer, an experimental animal, etc. The subject may be suspected of having or at risk of developing cancer, an immune disease, or any other disease characterized by pathological angiogenesis. Many methods for diagnosing cancer, immune diseases, or other diseases exhibiting abnormal angiogenesis and clinical presentation of these diseases are well known in the art. In accordance with one preferred embodiment, the subject to be treated is a human.
Термин «ненормальный ангиогенез» применяется, когда новые кровеносные сосуды вырастают или чрезмерно, или неуместно (например, участок, время или начало ангиогенеза являются нежелательными с точки зрения медицины) в состоянии заболевания или таким образом, что он вызывает состояние заболевания. Избыточный, неуместный или неконтролируемый ангиогенез происходит в случае, когда рост нового кровеносного сосуда вносит вклад в ухудшение состояния заболевания или является причиной состояния заболевания, такого как рак, особенно вакуолизированные солидные опухоли и метастатические опухоли (включая рак толстой кишки, легких (особенно мелкоклеточный рак легких), или рак простаты), заболеваний, вызванных неоваскуляризацией глаза, в особенности диабетической слепоты, ретинопатий, преимущественно диабетической ретинопатии или связанной с возрастом дегенерации желтого пятна, хороидальной неоваскуляризации (CNV), диабетического отека желтого пятна, патологической миопии, болезнь Ван Хиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаза, окклюзия вены сетчатки (CRVO), корнеальная неоваскуляризация, неоваскуляризация сетчатки и рубеоз; псориаз, псориатический артрит, гемангиобластома, такая как гемангиома; воспалительные заболевания почек, такие как гломерулонефриты, в особенности мезангиопролиферативный гломерулонефрит, гемолитический уремический синдром, диабетическая нефропатия или гипертензивный нефросклероз; различные воспалительные болезни, такие как артриты, в особенности ревматоидный артрит, воспалительные заболевания кишечника, псориаз, саркоидоз, артериальный артериосклероз и заболевания, происходящие после трансплантации, эндометроз или хроническая астма и более чем 70 других состояний. Новые кровеносные сосуды могут питать пораженные ткани, разрушать нормальные ткани, и, в случае рака, новые сосуды могут позволить клеткам опухоли попасть в круговорот и осесть в других органах (метастазы опухоли). Представленное изобретение рассматривает лечение пациентов, имеющих риск возникновения упомянутых выше заболеваний.The term "abnormal angiogenesis" is used when new blood vessels grow either excessively or inappropriately (for example, the site, time or onset of angiogenesis is undesirable from a medical point of view) in a disease state or in such a way that it causes a disease state. Excessive, inappropriate, or uncontrolled angiogenesis occurs when the growth of a new blood vessel contributes to a worsening condition of the disease or causes a condition of the disease, such as cancer, especially vacuolated solid tumors and metastatic tumors (including cancer of the colon, lung (especially small cell lung cancer ), or prostate cancer), diseases caused by neovascularization of the eye, in particular diabetic blindness, retinopathy, mainly diabetic retinopathy or related with age of macular degeneration, choroidal neovascularization (CNV), diabetic macular edema, pathological myopia, Van Hippel-Lindau disease, histoplasmosis of the eye, retinal vein occlusion (CRVO), corneal neovascularization, retinal neovascularization and rubeosis; psoriasis, psoriatic arthritis, hemangioblastoma, such as hemangioma; inflammatory kidney diseases such as glomerulonephritis, in particular mesangioproliferative glomerulonephritis, hemolytic uremic syndrome, diabetic nephropathy or hypertensive nephrosclerosis; various inflammatory diseases such as arthritis, in particular rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, sarcoidosis, arteriosclerosis and diseases occurring after transplantation, endometrosis or chronic asthma and more than 70 other conditions. New blood vessels can nourish affected tissues, destroy normal tissues, and, in the case of cancer, new vessels can allow tumor cells to go into circulation and settle in other organs (tumor metastases). The present invention contemplates the treatment of patients at risk of the aforementioned diseases.
Другие пациенты, являющиеся кандидатами на получение антител или полипептидов по этому изобретению, имеют или находятся под угрозой развития, ненормального разрастания сосудисто-волокнистой ткани, красных угрей, синдрома приобретенного иммунодефицита, закупорки артерий, атопического кератита, бактериальных язв, болезни Бехчета, переносимых кровью опухолей, обструктивного заболевания сонных артерий, хороидальной неоваскуляризации, хронического воспаления, хронического отслоения сетчатки, хронического увеита, хронического витрита, излишнего ношения контактных линз, отторжения трансплантата роговицы, неоваскуляризации роговицы, неоваскуляризации трансплантата роговицы, болезни Крона, болезни Эйлза, эпидемического кератоконъюктивита, грибковых язв, заражения простым герпесом, заражения опоясывающим герпесом, синдромов повышенной вязкости, саркомы Капоши, лейкемии, дегенерации липидов, болезни Лайма, краевого кератолиза, язвы Мурена, микобактериальных инфекций за исключением проказы, миопии, глазной неоваскулярной болезни, врожденных ямок зрительного нерва, синдрома Ослера-Вебера (Ослера-Вебера-Рандю), остеоартрита, болезни Педжета, воспаления ресничного кружка, пемфигоида, филектенулеза, полиартерита, осложнений после лазерного излучения, заражений простейшими, эластичной псевдоксантомы, птеригия, сухого кератаита, pterygium keratitis sicca, радиальной кератотомии, неоваскуляризации сетчатки, ретролентальной фиброплазии, саркоида, склерита, серповидноклеточной анемии, синдрома Шегрена, солидных опухолей, болезни Старгарта, болезни Стивена Джонсона, высшего лимбического кератита, сифилиса, системной волчанки, краевой дегенерации роговицы, токсоплазмоза, травм, опухолей саркомы Юинга, опухолей нейробластомы, опухолей остеосаркомы, опухолей ретинобластомы, опухолей рабдомиосаркомы, язвенного колита, окклюзии вен, дефицита витамина А и саркоидоза Вегнера, нежелательного ангиогенеза, связанного с диабетами, паразитическими заболеваниями, ненормальным заживлением ран, пост-хирургической гипертрофией, ранениями или травмами, подавлением роста волос, подавлением овуляции и формированием желтого тела, подавлением имплантации и подавлением развития эмбриона in uterus.Other patients who are candidates for antibodies or polypeptides of this invention have or are at risk of developing, abnormal proliferation of vascular fibrous tissue, red acne, acquired immunodeficiency syndrome, clogged arteries, atopic keratitis, bacterial ulcers, Behcet's disease, blood-borne tumors , obstructive carotid artery disease, choroidal neovascularization, chronic inflammation, chronic retinal detachment, chronic uveitis, chronic vitritis, excessive contact lens wear, corneal transplant rejection, corneal neovascularization, corneal neovascularization, Crohn’s disease, Ailes disease, epidemic keratoconjunctivitis, fungal ulcers, herpes simplex infection, herpes zoster infections, high viscosity syndromes, lipoma leukemia, sarcoma leukemia, sarcoma leukemia , regional keratolysis, Muren's ulcer, mycobacterial infections with the exception of leprosy, myopia, ocular neovascular disease, congenital pits of the optic nerve, syn Osler-Weber rum (Osler-Weber-Randu), osteoarthritis, Paget’s disease, ciliary circle inflammation, pemphigoid, phylectenulosis, polyarteritis, complications after laser radiation, infections of protozoa, elastic pseudoxanthoma, pterygium, dry keratitis, pterygitomyceratitis neovascularization of the retina, retrolental fibroplasia, sarcoid, scleritis, sickle cell anemia, Sjogren's syndrome, solid tumors, Starthart's disease, Steven Johnson's disease, higher limbic keratitis, syphilis, systemic lupus erythematosus, marginal degeneration of the cornea, toxoplasmosis, trauma, Ewing's sarcoma tumors, neuroblastoma tumors, osteosarcoma tumors, retinoblastoma tumors, rhabdomyosarcoma tumors, ulcerative colitis, vein occlusion, Vitamin A deficiency and Wegner sarcoidosis, parasitic disease, anemia wound healing, post-surgical hypertrophy, wounds or injuries, suppression of hair growth, suppression of ovulation and corpus luteum formation, suppression of implantation and suppression m development of the embryo in uterus.
Терапия против ангиогенеза полезна при общем лечении отторжения трансплантата, воспаления легких, нефротического синдрома, преэклампсии, выпота в область перикарда, такого как связанный с перикардитами, и плеврального выпота, заболеваний и расстройств, характеризующихся нежелательной проницаемостью сосудов, например, отеком, связанным с опухолями мозга, асцитами, ассоциированными со злокачественными опухолями, синдромом Мейгса, воспалением легких, нефротическим синдромом, экссудативным перикардитом, плевральным выпотом, проницаемостью, связанной с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как постинфарктные состояния, удары и подобное.Anti-angiogenesis therapy is useful in the general treatment of transplant rejection, pneumonia, nephrotic syndrome, preeclampsia, effusion into the pericardial region, such as associated with pericarditis, and pleural effusion, diseases and disorders characterized by undesirable vascular permeability, for example, edema associated with brain tumors , ascites associated with malignant tumors, Meigs syndrome, pneumonia, nephrotic syndrome, pericardial effusion, pleural effusion, permeable Tew associated with cardiovascular diseases, such as postinfarction state, shocks and the like.
Другие зависящие от ангиогенеза заболевания в соответствии с этим изобретением включают ангиофиброму (ненормальное кровотечение из склонных к кровотечению сосудов), неоваскулярной глаукомы (рост кровеносных сосудов в глазу), артериовенозные пороки развития (ненормальное сообщение между артериями и венами), несрастающиеся переломы (переломы, которые не излечиваются), атеросклеротические бляшки (затвердения артерий), пиогенная гранулома (частое патологическое изменение кожи, состоящее из кровеносных сосудов), склеродермия (форма заболевания соединительной ткани), гемангиома (опухоль, состоящая из кровеносных сосудов), трахома (основная причина слепоты в третьем мире), гемофилическая артропатия, слипание сосудов и гипертрофированные шрамы (неправильное формирование шрама).Other angiogenesis-dependent diseases in accordance with this invention include angiofibroma (abnormal bleeding from bleeding vessels), neovascular glaucoma (growth of blood vessels in the eye), arteriovenous malformations (abnormal communication between arteries and veins), non-healing fractures (fractures that cannot be cured), atherosclerotic plaques (hardening of the arteries), pyogenic granuloma (a frequent pathological change in the skin consisting of blood vessels), scleroderma (a form of disease connective tissue), hemangioma (a tumor consisting of blood vessels), trachoma (the main cause of blindness in the third world), hemophilic arthropathy, vascular adhesion and hypertrophic scars (improper scar formation).
Термин «лечение» относится и к терапевтическому лечению, и к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении пациенты включают тех, кто уже имеет расстройство, и тех, у кого расстройство должно быть предотвращено.The term “treatment” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventative measures. Patients in need of treatment include those who already have the disorder and those in whom the disorder should be prevented.
Термины «повторение», «рецидив» или «рецидивный» относятся к возвращению рака или заболевания после клинического определения исчезновения заболевания. Диагностика удаленных метастаз или локального повторного возникновения может считаться рецидивом.The terms “recurrence,” “relapse” or “relapse” refer to the return of a cancer or disease after the clinical definition of the disappearance of the disease. Diagnosis of distant metastases or local recurrence may be considered a relapse.
Термины «невосприимчивый» или «устойчивый» относятся к раку или заболеванию, которое не реагирует на лечение.The terms “immune” or “resistant” refer to a cancer or disease that does not respond to treatment.
Термин «вспомогательная терапия» относится к лечению, проводимому после основного лечения, обычно хирургического. Вспомогательная терапия при раке или заболевании может включать иммунную терапию, химиотерапию, радиотерапию или терапию гормонами.The term "adjuvant therapy" refers to treatment carried out after the main treatment, usually surgical. Supportive therapy for cancer or disease may include immune therapy, chemotherapy, radiotherapy or hormone therapy.
Термин «поддерживающая терапия» относится к запланированному повторному лечению, которое проводится для помощи в поддержании эффектов предшествующей терапии. Поддерживающая терапия часто проводится для поддержания рака в состоянии ремиссии или для удлинения ответа на определенную терапию вне зависимости от прогресса болезни.The term “supportive therapy” refers to a planned re-treatment that is performed to help maintain the effects of prior therapy. Maintenance therapy is often done to maintain cancer in remission or to lengthen the response to a particular therapy, regardless of the progress of the disease.
Термин «инвазивный рак» относится к раку, который распространился за пределы слоя ткани, в котором он начался, в нормальные окружающие ткани. Инвазивный рак может быть или не быть метастатическим.The term “invasive cancer” refers to cancer that has spread beyond the layer of tissue in which it started into normal surrounding tissue. Invasive cancer may or may not be metastatic.
Термин «неинвазивный рак» относится к очень ранней стадии рака или к раку, который не распространяется за пределы ткани, из которой происходит.The term "non-invasive cancer" refers to a very early stage of cancer or to cancer that does not extend beyond the tissue from which it originates.
Термин «выживание без прогрессирования» в онкологии относится к периоду времени в процессе и после лечения, в течение которого рак не растет. Выживание без прогрессирования включает количество времени, в течение которого пациент испытывал полный или частичный ответ, также как и период времени, в течение которого пациент испытывал стабильную болезнь.The term "progression-free" in oncology refers to a period of time during and after treatment during which the cancer does not grow. Progression-free survival includes the amount of time that the patient has experienced a complete or partial response, as well as the period of time that the patient has experienced a stable illness.
Термин «прогрессирующая болезнь» в онкологии может относиться к росту опухоли более чем на 20 процентов с момента начала лечения или по причине увеличения массы опухоли, или по причине распространения опухоли.The term "progressive disease" in oncology may refer to tumor growth of more than 20 percent since the start of treatment, either due to an increase in the mass of the tumor, or due to the spread of the tumor.
Термин «расстройство» обозначает любое состояние, при котором лечение антителами принесет пользу. Например, млекопитающие, страдающие от ненормального ангиогенеза (избыточного, неуместного или неконтролируемого ангиогенеза) или сосудистой проницаемости или нуждающиеся в их профилактике. Это включает хронические и острые расстройства или заболевания, включая патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к обсуждаемому расстройству. Неограничивающие примеры подвергаемых лечению расстройств включают злокачественные и доброкачественные опухоли, нелейкемические и лимфоидные злокачественные опухоли; нейронные, глиальные, астроцитальные, гипоталамические и другие железистые, макрофаговые, эпителиальные, стромальные и бластоцелические расстройства; и воспалительные, ангиогенные и иммунологические расстройства.The term “disorder” refers to any condition in which treatment with antibodies will benefit. For example, mammals suffering from abnormal angiogenesis (excessive, inappropriate or uncontrolled angiogenesis) or vascular permeability or in need of their prevention. This includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that predispose the mammal to the disorder in question. Non-limiting examples of treatable disorders include malignant and benign tumors, non-leukemic and lymphoid malignancies; neuronal, glial, astrocytal, hypothalamic and other glandular, macrophage, epithelial, stromal and blastocele disorders; and inflammatory, angiogenic and immunological disorders.
Термины «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничены, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкемию. Отдельные примеры подобного рака включают рак сквамозных клеток, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак груди, рак кишечника, рак толстой кишки, эндометриальную саркому, саркому слюнной железы, рак почек, рак почечных канальцев, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, печеночная карцинома, рак головы и шеи, рак прямой кишки, рак кишечника, рак легких, включая мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и сквамозную карциному легких, рак сквамозных клеток (например, рак эпителиальных сквамозных клеток), рак простаты, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая желудочно-кишечный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, ретинобластому, астроцитому, текомы, арренобластомы, гепатому, гематологические злокачественные образования, включая неходжкинскую лимфому (NHL), множественную миелому и острые гематологические злокачественные состояния, эндометриальную или внутриматочную карциному, эндометриоз, фибросаркомы, хориокарциному, карциному слюнной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциномы пищевода, карциному печени, карциному прямой кишки, карциному члена, носоглоточную карциному, карциному гортани, саркому Капоши, меланому, карциномы кожи, шванному, олигодендроглиому, нейробластомы, рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркому, карциномы мочевого тракта, карциномы тироида, опухоль Вильма, а также B-клеточную лимфому (включая низкодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL); малую лимфоцитарную (SL) NHL; среднедифференцированную/фолликулярную NHL; диффузную NHL средней степени; высокодифференцированную иммунобластическую NHL; высокодифференцированную лимфобластическую NHL; высокодифференцированную мелкоклеточную NHL с нерасщепленными ядрами; NHL с массированным поражением, лимфому клеток мантии; СПИД-ассоциированную лимфому, болезнь Вандельстрема (макроглобулинемия); хроническую лимфоцитическую лейкемию (CLL); острую лимфобластическую лейкемию (ALL), лейкоз ворсистых клеток; хроническую лейкемию миелобластов; и пост-трансплантационное лимфопролиферационное расстройство (PTLD), также как и ненормальное разрастание сосудов, связанное с факоматозами и синдромом Мейгса.The terms "cancer" and "cancerous" refer to or describe the physiological condition in mammals, which is usually characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. Specific examples of such cancers include squamous cell cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, intestinal cancer, colon cancer, endometrial sarcoma, salivary gland sarcoma, kidney cancer, renal tubular cancer , prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, hepatic carcinoma, head and neck cancer, colorectal cancer, colon cancer, lung cancer, including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma, squamous cell carcinoma etiology (e.g., epithelial squamous cell cancer), prostate cancer, peritoneal cancer, hepatic cell carcinoma, gastric cancer, including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, retinoblastoma, astrocytoma, tekoma, arrenoblastoma, hepatoma, hematologic malignancies, including non-Hodgkin’s lymphoma (NHL), multiple myeloma and acute hematologic malignant conditions, endometrial or intrauterine carcinoma, endometriosis, fibrosarcoma, choriocarcinoma, salivary carcinoma, vulvar cancer, cancer thyroid gland, carcinoma of the esophagus, carcinoma of the liver, carcinoma of the rectum, carcinoma of the penis, nasopharyngeal carcinoma, carcinoma of the larynx, Kaposi’s sarcoma, melanoma, carcinoma of the skin, schwannomas, oligodendroglioma, neuroblastoma, rhabdomyosarcoma, osteogenic sarcoma, cariomyoma, cariomyoma, leukomyocytoma, leiomyocytoma Wilm's tumor, as well as B-cell lymphoma (including low-grade / follicular non-Hodgkin's lymphoma (NHL); small lymphocytic (SL) NHL; medium differentiated / follicular NHL; diffuse NHL moderate; highly differentiated immunoblastic NHL; highly differentiated lymphoblastic NHL; highly differentiated small cell NHL with undigested nuclei; NHL with massive lesion, mantle cell lymphoma; AIDS-associated lymphoma, Wandelstrom disease (macroglobulinemia); chronic lymphocytic leukemia (CLL); acute lymphoblastic leukemia (ALL), nappy cell leukemia; chronic leukemia of myeloblasts; and post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD), as well as abnormal vascular proliferation associated with phacomatoses and Meigs syndrome.
Термин «опухоль», как он использован здесь, относится к неопластическому росту и пролиферации клеток, злокачественному и доброкачественному, и всем предраковым и раковым клеткам и тканям.The term “tumor,” as used herein, refers to neoplastic cell growth and proliferation, malignant and benign, and all precancerous and cancerous cells and tissues.
Термин «анти-неопластическая композиция» или «анти-неопластический препарат» относится к композиции, полезной при лечении рака, включающей не менее одного активного терапевтического фактора, например «противоракового препарата». Примеры терапевтических агентов (противораковых препаратов) включают, но не ограничены, например, химиотерапевтическими препаратами, ингибирующими рост препаратами, цитотоксическими препаратами, препаратами, применяемыми в радиотерапии, препаратами против ангиогенеза, апоптотическими препаратами, противотубулиновыми препаратами, и прочими препаратами для лечения рака, такими как антитела против HER-2, антитела против CD20, антагонист рецептора фактора роста эпидермиса (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (TarcevaTM), ингибиторы тромбоцитарного фактора роста (например, GleevecTM (иматиниб месилат)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), которые связываются с одной или более следующих целей - с рецептором(ами) ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BAFF, BR3, APRIL, BCMA или VEGF, TRAIL/ Apo2 и другими биологически активными и органическими химическими факторами, и т.п. Их сочетания также включаются в данное изобретение.The term “anti-neoplastic composition” or “anti-neoplastic preparation” refers to a composition useful in the treatment of cancer, including at least one active therapeutic factor, for example, “anti-cancer drug”. Examples of therapeutic agents (anti-cancer drugs) include, but are not limited to, for example, chemotherapeutic drugs, growth inhibitory drugs, cytotoxic drugs, drugs used in radiotherapy, anti-angiogenesis drugs, apoptotic drugs, anti-tubulin drugs, and other cancer drugs, such as anti-HER-2 antibodies, anti-CD20 antibodies, epidermal growth factor receptor antagonist (EGFR) (e.g. tyrosine kinase inhibitor), HER1 / EGFR inhibitor (e.g. er lotinib (Tarceva TM ), platelet growth factor inhibitors (e.g. Gleevec TM (imatinib mesylate)), a COX-2 inhibitor (e.g. celecoxib), interferons, cytokines, antagonists (e.g. neutralizing antibodies) that bind to one or more of the following goals - with the receptor (s) ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BAFF, BR3, APRIL, BCMA or VEGF, TRAIL / Apo2 and other biologically active and organic chemical factors, etc. Their combinations are also included in this invention.
Использованный здесь термин «фактор подавления (ингибирования) роста» относится к соединению или составу, который подавляет рост клеток in vitro и/или in vivo. Таким образом, фактором подавления роста может являться фактор, значительно уменьшающий процент клеток, находящихся в S-фазе. Примеры факторов подавления роста включают факторы, которые блокируют ход клеточного цикла (в точке, отличной от S-фазы), такие как факторы, вызывающие остановку G1 и остановку в М-фазе. Классические блокираторы М-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), TAXOL® и ингибиторы топоII, такие как доксорубицин, эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Факторы (агенты), блокирующие G1, также распространяются на блокировку S- фазы, например, ДНК-алкилирующие препараты, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин, мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ara-C. Дальнейшая информация может быть найдена в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Глава 1, озаглавленная "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" авторы Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), в особенности стр. 13.As used herein, the term “growth inhibitory factor” refers to a compound or composition that inhibits cell growth in vitro and / or in vivo. Thus, a factor that significantly reduces the percentage of cells in the S phase can be a factor for suppressing growth. Examples of growth inhibitory factors include factors that block the cell cycle (at a point other than the S phase), such as factors that cause G1 to stop and M phase to stop. Classical M phase blockers include vinca alkaloids (vincristine and vinblastine), TAXOL ® and topoII inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide and bleomycin. G1-blocking factors (agents) also extend to S-phase blocking, for example, DNA-alkylating drugs such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil and ara-C. Further information can be found in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds.,
Термин «цитотоксический препарат (агент)», как он использован здесь, относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Предполагается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, I131, I125, Y90 и Re186), химиотерапевтические препараты и токсины, такие как ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагменты.The term "cytotoxic drug (agent)", as used here, refers to a substance that inhibits or prevents the functioning of cells and / or causes the destruction of cells. The term is intended to include radioactive isotopes (e.g., I 131 , I 125 , Y 90, and Re 186 ), chemotherapeutic drugs, and toxins, such as enzymatically active toxins of bacterial, fungal, plant, or animal origin, or fragments thereof.
Термин «химиотерапевтический препарат» обозначает химическое соединение, применяемое при лечении рака. Примеры химиотерапевтических препаратов включают химические соединения, которые можно использовать для лечения рака. Примеры химиотерапевтических препаратов включают алкилирующие препараты, такие как тиотепа и CYTOXAN® циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан, и пиросульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа, и уредопа; этиленимины и метиленимины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (главным образом буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (а именно криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин a; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлоронафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, оксид гидрооксид мехлоретамина, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевина, такая как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихимицин, в особенности калихимицин гамма1I и калихимицин омега1I (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бифосфонаты, такие как хлодронат; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатин и связанные хромопротеиновые эндииновые антибиотические хромофоры), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, кариномицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN® доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин 2-пирролино-доксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберсидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флюдарабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлюуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитостанол,мепитостан, тестолактон; ингибиторы надпочечников, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; гликозид алдофосфамида; аминолевулиновая кислота; енилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптина; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидаинин; маитанзиноиды, такие как маитанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (в особенности токсин T-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.), ABRAXANETM без кремофора, сконструированная на основе альбумина форма паклитаксела в виде наночастиц (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), и доксетаксел TAXOTERE® (Rhone- Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабин GEMZAR®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE®; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; иринотекан (Camptosar, CPT-11) (включая режим лечения иринотеканом с 5-FU и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая режим лечения оксалиплатином (FOLFOX); ингибиторы PKC-альфа, Raf, H-Ras и EGFR (например, эрлотиниб (TarcevaTM)), которые понижают размножение клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные всех перечисленных выше препаратов.The term “chemotherapeutic drug” means a chemical compound used in the treatment of cancer. Examples of chemotherapeutic drugs include chemical compounds that can be used to treat cancer. Examples of chemotherapeutic drugs include alkylating agents such as thiotepa and CYTOXAN ® cyclophosphamide; alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan, and pyrosulfan; aziridines such as benzodopa, carboxwon, meturedopa, and uredopa; ethyleneimines and methyleneimines, including altretamine, triethylene melamine, triethylene phosphoramide, triethylene thiophosphoramide and trimethyl lomelamine; acetogenins (mainly bullatacin and bullatacinone); camptothecin (including the synthetic analogue of topotecan); bryostatin; callistatin; CC-1065 (including synthetic analogues of adoselesin, carzelesin and biselezin); cryptophycins (namely cryptophycin 1 and cryptophycin 8); dolastatin; duocarmycin (including synthetic analogues, KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobin; pankratistatin; sarcodictin a; spongistatin; nitrogen mustards, such as chlorambucil, chloronaphazine, chlorophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine hydroxide oxide, melphalan, novembicin, fenesterin, prednimustine, trophosphamide, uramustine; nitrosourea such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, and ranimustine; antibiotics such as enediin antibiotics (for example, calichimycin, in particular calichemicin gamma-II and calichimycin omega-II (see, for example, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dynamin, including dinemycin A; bisphosphonates, such as chlodronate; esperamycin; as well as the neocarcinostatin chromophore and associated chromoprotein and endiotic antibiotic chromophores), aclacinomisins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycin, cactinomycin, chrominomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carcinomycin, carinomycin 5-oxo-L-norleucine , ADRIAMYCIN ® doxorubicin (including morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin 2-pyrrolino-doxorubicin and deoxydoxorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomycin, pomymnomycin, oligomycin, pomymnomycin, oligomycin, pomymnomycin, oligomycin, pomenomycin quelamycin, rhodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidine, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimerexate; purine analogues such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine; pyrimidine analogs such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, karmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluuridine, enocytabine, phloxuridine; androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epitostanol, mepostostan, testolactone; adrenal inhibitors such as aminoglutethimide, mitotan, trilostane; a folic acid replenisher such as frolinic acid; Aceglaton; aldophosphamide glycoside; aminolevulinic acid; enyluracil; amsacrine; bestrabucil; bisanthrene; edatrexate; defofamine; demecolcin; diaziquon; elfornithine; elliptin acetate; epothilone; etoglucid; gallium nitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainin; maitanzinoids such as maitanzine and ansamitocins; mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerine; pentostatin; phenamet; pyrarubicin; losoxantrone; podophyllic acid; 2-ethyl hydrazide; procarbazine; PSK ® polysaccharide complex (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxane; rhizoxin; sisofiran; spiro germanium; tenuazonic acid; triaziquon; 2,2 ', 2 "trichlorotriethylamine; trichotecenes (in particular T-2 toxin, verracurin A, roridin A and anguidine); urethane; vindesine; dacarbazine; mannomustine; mitobronitol; mitolactol; pipobromane; gacitosin; arabinoside (Ara"");cyclophosphamide;thiotepa; taxoids such as paclitaxel TAXOL ® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.), Cremophor ABRAXANETM, an albumin-based nanoparticle form of paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), and doxetaxel TAXOTERE ® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); chloranbucil; gemcitabine GEMZAR ® ; 6-thioguanine; mercaptopurine; methotrexate; analogues platinum, such as cisplatin and carboplatin; vinblastine; platinum; etoposide (VP-16); ifosfamide; mitoxantrone; vincristine; vinorelbine NAVELBINE ® ; novantrone; teniposide; edatrexate; daunomycin; aminopterin; CP-xeloda; ibandronate ) (including treatment regimen with irinotecan with 5-FU and leucovorin); RFS 2000 topoisomerase inhibitor; difluoromethylornithine (DMFO); retinoids such as retinoic acid; capecitabine; combretastatin; leucovorin (LV); oxaliplatin, including oxaliplatin treatment regimen (FOLFOX); PKC-alpha, Raf, H-Ras and EGFR inhibitors (e.g., erlotinib (TarcevaTM)) that reduce cell proliferation, and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of all of the above drugs.
Также включены в данное описание противогормональные препараты, которые регулируют или подавляют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные регуляторы рецепторов эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон, и FARESTON-торемифен; ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, который регулирует продукцию эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглютетимид, мегестрол-ацетат MEGASE®, екземестан AROMASIN®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR®, летрозол FEMARA® и анастрозол ARIMIDEX®; антиандрогены, такие как флутамид, нилютамид, бикалютамид, лейпролид, и госерелин; а также троксацитабин (1,3-диоксолан, аналог нуклеозида цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, в особенности ингибирующие экспрессию генов сигнальных путей, вовлеченных в размножение аберрантных клеток, таких как, например, PKC-alpha, Raf и H-Ras; рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF (например, рибозим ANGIOZYME®) и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, такие как вакцины генетической терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN®, и вакцина VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; винорелбин и эсперамицины (см. патент США № 4675187), и фармацевтически приемлемые соли, кислые формы или производные перечисленных выше препаратов.Also included in this specification are anti-hormonal drugs that regulate or suppress the effects of hormones on tumors, such as antiestrogens and selective estrogen receptor regulators (SERMs), including, for example, tamoxifen (including tamoxifen NOLVADEX ® ), raloxifene, droloxifene, 4-hydroxytamoxifen, trioxifen , keoxifene, LY117018, onapriston, and FARESTON-toremifene; aromatase inhibitors that inhibit the enzyme aromatase, which regulates estrogen production in the adrenal glands, such as, for example, 4 (5) -imidazoles, aminoglutethimide, megestrol acetate MEGASE ®, ekzemestan AROMASIN ®, formestane, fadrozole, vorozole RIVISOR ®, letrozole FEMARA ® and Anastrozole ARIMIDEX ® ; antiandrogens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide, and goserelin; as well as troxacitabine (1,3-dioxolane, a cytosine nucleoside analogue); antisense oligonucleotides, in particular inhibiting the expression of signaling pathway genes involved in the propagation of aberrant cells, such as, for example, PKC-alpha, Raf and H-Ras; ribozymes such as an expression inhibitor of VEGF (e.g., ribozyme ANGIOZYME ®) and HER2 expression inhibitor; vaccines such as genetic therapy vaccines, for example ALLOVECTIN ® vaccine, LEUVECTIN ® vaccine, and VAXID ® vaccine; PROLEUKIN ® rIL-2; LURTOTECAN ® topoisomerase 1 inhibitor; ABARELIX ® rmRH; vinorelbine and esperamycins (see US patent No. 4675187), and pharmaceutically acceptable salts, acidic forms or derivatives of the above drugs.
Термин «пролекарство», использованный в данной заявке, относится к предшественнику или производной форме фармацевтически активного вещества (например, низкомолекулярного соединения), которое менее цитотоксично по отношению к пораженным клеткам по сравнению с исходным препаратом и может быть ферментативно активировано или преобразовано в более активную исходную форму. См., например, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) и Stella et al, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Пролекарства в соответствии с данным изобретением включают, но не ограничены, фосфат-содержащими пролекарствами, тиофосфат-содержащими пролекарствами, сульфат-содержащими пролекарствами, пептид-содержащими пролекарствами, модифицированными D-аминокислотой пролекарствами, гликозилированными пролекарствами, β-лактам-содержащими пролекарствами, содержащими возможно замещенный феноксиацетамид пролекарства или содержащими возможно замещенный фенилацетамид пролекарствами, 5-фторцитозином и другими пролекарствами 5-фторуридина, которые могут быть преобразованы в более цитотоксичный свободный препарат. Примеры цитотоксичных препаратов, которые могут быть переведены в форму пролекарства для применения в данном изобретении, включают, но не ограничены описанными выше химиотерапевтическими препаратами.The term “prodrug”, as used herein, refers to a precursor or derivative of a pharmaceutically active substance (eg, a low molecular weight compound) that is less cytotoxic to diseased cells than the parent drug and can be enzymatically activated or converted to a more active parent form. See, for example, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (Ed.), Pp. 247-267, Humana Press (1985). Prodrugs in accordance with this invention include, but are not limited to, phosphate-containing prodrugs, thiophosphate-containing prodrugs, sulfate-containing prodrugs, peptide-containing prodrugs, D-amino acid-modified prodrugs, glycosylated prodrugs, β-lactam-containing prodrugs, possibly containing substituted phenoxyacetamide prodrugs or optionally substituted phenylacetamide prodrugs containing 5-fluorocytosine and other 5-fluoruridine prodrugs which They can be converted to a more cytotoxic free drug. Examples of cytotoxic drugs that can be converted to prodrugs for use in this invention include, but are not limited to the chemotherapeutic drugs described above.
Термин «изолированный», когда использован для описания различных полипептидов, раскрытых здесь, означает полипептид, который был идентифицирован и отделен и/или выделен из клетки или культуры клеток, в которой он экспрессировался. Загрязняющими компонентами в его естественном окружении являются материалы, которые обычно препятствуют диагностическому или терапевтическому применению полипептида и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления полипептид будет очищен (1) до степени, достаточной для получения не менее чем 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом или (2) до гомогенности по данным SDS-PAGE при невосстанавливающих и восстанавливающих условиях с использованием синего Кумасси или, предпочтительно, окраски серебром. Изолированный полипептид включает полипептид in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент естественной среды полипептида не присутствует. Однако обычно изолированный полипептид бывает изготовлен с использованием по меньшей мере одного этапа очистки.The term "isolated" when used to describe the various polypeptides disclosed herein, means a polypeptide that has been identified and isolated and / or isolated from the cell or cell culture in which it is expressed. Contaminating components in its natural environment are materials that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide and may include enzymes, hormones, and other protein or non-protein solutes. In preferred embodiments, the polypeptide will be purified (1) to a degree sufficient to produce at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence using a rotary beaker, or (2) to homogeneity according to SDS-PAGE under non-reducing and reducing conditions using blue Coomassie or, preferably, silver. An isolated polypeptide includes an in situ polypeptide in recombinant cells since at least one component of the natural environment of the polypeptide is not present. However, usually an isolated polypeptide can be made using at least one purification step.
Термин «изолированная» кодирующая полипептид нуклеиновая кислота или иная кодирующая полипептид нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы нуклеиновой кислоты, с которой обычно связана в естественном источнике кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты. Изолированная кодирующая полипептид молекула нуклеиновой кислоты находится в иной форме или окружении, нежели те, в которых она встречается в природе. Изолированная кодирующая полипептид молекула нуклеиновой кислоты таким образом отличается от кодирующей полипептид молекулы нуклеиновой кислоты в природных клетках. Однако изолированные кодирующие полипептид молекулы нуклеиновой кислоты включают кодирующие полипептид молекулы нуклеиновой кислоты, которые обычно экспрессируют полипептид в случае, например, когда молекула нуклеиновой кислоты находится в положении на хромосоме, отличном от положения в естественных клетках.The term "isolated" nucleic acid encoding a polypeptide or other nucleic acid encoding a polypeptide refers to a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule to which it is normally associated in a natural source of a nucleic acid encoding a polypeptide. An isolated polypeptide encoding a nucleic acid molecule is in a different form or environment than those in which it is found in nature. An isolated polypeptide encoding a nucleic acid molecule is thus different from a polypeptide encoding a nucleic acid molecule in natural cells. However, isolated polypeptide-encoding nucleic acid molecules include a polypeptide-encoding nucleic acid molecule, which typically express the polypeptide in the case, for example, when the nucleic acid molecule is in a position on the chromosome other than the position in natural cells.
Термин «управляющие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии оперативно связанных кодирующих последовательностей в определенном организме-хозяине. Управляющие последовательности, подходящие для прокариот, например, включают промотор, возможно последовательность-оператор, и участок связывания рибосомы. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.The term "control sequences" refers to DNA sequences necessary for the expression of operably linked coding sequences in a particular host organism. Control sequences suitable for prokaryotes, for example, include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signals, and enhancers.
Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной», когда она находится в функциональных отношениях с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, предпоследовательность ДНК или секреторная лидерная последовательность оперативно связана с ДНК, кодирующей полипептид, в случае если она экспрессирует препротеин, участвующий в секреции полипептида; промотор или энхансер является оперативно связанным с последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что способствует трансляции. В общем, «оперативно связанные» означает, что последовательности ДНК соединены и непрерывны, и, в случае секреторной лидерной последовательности, непрерывны и находятся в одной фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть прилегающими. Связывание происходит путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, в соответствии с обычной практикой используются синтетические линкеры и адаптеры.A nucleic acid is “operably linked” when it is in functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a DNA presequence or secretory leader sequence is operatively linked to a DNA encoding a polypeptide if it expresses a preprotein involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a sequence if it affects the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is positioned in a manner that facilitates translation. In general, “operably linked” means that the DNA sequences are connected and continuous, and, in the case of a secretory leader sequence, continuous and are in the same reading phase. However, enhancers do not have to be adjacent. Binding occurs by ligation at suitable restriction sites. If such sites do not exist, synthetic linkers and adapters are used in accordance with normal practice.
«Жесткие условия» или «условия высокой жесткости», как описано здесь, могут быть определены как (1) включающие низкую ионную силу и высокую температуру для отмывки, например 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°С; (2) включающие денатурирующий фактор, такой как формамид, в процессе гибридизации, например, 50% (объемных) формамида с 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натриевого фосфатного буфера с pH 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°С; или (3) гибридизация в течение ночи в растворе, который содержит 50% формамида, 5х SSC (0,75 M NaCl, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5х раствор Денхардта, обработанная ультразвуком сперма лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфата декстрана при 42°С с отмывкой 10 минут при 42°С в 0,2х SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) с последующей 10 минутной промывкой при условиях высокой жесткости, состоящей из 0,1 х SSC, содержащего ЭДТА при 55°С.“Stringent conditions” or “high stringency conditions” as described herein can be defined as (1) including low ionic strength and high temperature for washing, for example 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% dodecyl sulfate sodium at 50 ° C; (2) comprising a denaturing factor, such as formamide, during hybridization, for example, 50% (volume) of formamide with 0.1% bovine serum albumin / 0.1% ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM sodium phosphate buffer with pH 6.5 with 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate at 42 ° C; or (3) overnight hybridization in a solution that contains 50% formamide, 5x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5x Denhardt's solution sonicated with salmon sperm (50 μg / ml), 0.1% SDS and 10% dextran sulfate at 42 ° C with washing for 10 minutes at 42 ° C in 0.2x SSC (sodium chloride / sodium citrate) s followed by a 10 minute rinse under high stringency conditions consisting of 0.1 x SSC containing EDTA at 55 ° C.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к приведенным здесь полипептидным последовательностям определяется как процент в обсуждаемой последовательности аминокислотных остатков, идентичных аминокислотным остаткам в сравниваемом полипептиде после выравнивания и, если это необходимо для достижения максимального процента идентичности последовательностей, введения разрывов, причем консервативные замены не считаются частью идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, находящимися в пределах знаний специалиста в данной области техники, например, с использованием общественно доступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для измерения гомологии, включая алгоритмы, требующиеся для достижения максимальной гомологии в пределах полной длины сравниваемых последовательностей. Однако для решаемых здесь задач % идентичности аминокислотных последовательностей были получены с применением компьютерной программы сравнения последовательностей программы ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc, исходный код (таблица 1) был внесен в реестр вместе с документацией пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он был зарегистрирован под регистрационным номером США TXU510087. Программа ALIGN-2 доступна публично через Genentech, Inc., South San Francisco, California. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для использования в операционной системе UNIX, предпочтительно цифровой системе UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей были заданы программой ALIGN-2 и не изменялись.“Percentage (%) of amino acid sequence identity” with respect to the polypeptide sequences given here is defined as the percentage in the sequence of amino acid residues discussed that are identical to the amino acid residues in the compared polypeptide after alignment and, if necessary, to achieve the maximum percentage of sequence identity, introducing gaps, conservative substitutions are not considered part of the sequence identity. Alignment for the purpose of determining the identity of amino acid sequences can be achieved in various ways that are within the knowledge of a person skilled in the art, for example, using publicly available software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Specialists in the art can determine the appropriate parameters for measuring homology, including the algorithms required to achieve maximum homology within the full length of the compared sequences. However, for the tasks to be solved here,% amino acid sequence identity was obtained using the ALIGN-2 computer program for comparing sequences. A computer program for comparing sequences of ALIGN-2 was developed by Genentech, Inc, the source code (table 1) was entered into the registry along with user documentation in U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, where it was registered under US registration number TXU510087. ALIGN-2 is publicly available through Genentech, Inc., South San Francisco, California. The ALIGN-2 program must be compiled for use on a UNIX operating system, preferably a digital UNIX V4.0D system. All sequence comparison parameters were set by the ALIGN-2 program and were not changed.
Аминокислотные последовательности, описанные здесь, являются непрерывными аминокислотными последовательностями, если не указано иное.The amino acid sequences described herein are contiguous amino acid sequences unless otherwise indicated.
Использованный здесь термин «иммуноадгезин» обозначает подобные антителам молекулы, которые сочетают специфичность связывания гетерологичного белка («адгезина») с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. Структурно, иммуноадгезины включают слитую последовательность, состоящую из последовательности аминокислот с желаемой специфичностью связывания, иной по сравнению с участком узнавания и связывания антигена антитела (т.е. являющуюся «гетерологичной»), и последовательностей константных доменов иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно является непрерывной аминокислотной последовательностью, включающей по меньшей мере участок связывания с рецептором или лигандом, таким как VEGFR или фибронектиновый лиганд. Константный участок последовательности иммуноглобулина в иммуноадгезине может быть получен из любого иммуноглобулина, такого как подтипы IgG-1, IgG-2, IgG-3, или IgG-4, IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM. Пептитела, часто содержащие последовательность, полученную путем отбора из последовательностей фагового дисплея, которые специфически связываются с мишенью, и их слияния с Fc частью иммуноглобулина тоже могут быть здесь сочтены иммуноадгезинами.As used herein, the term “immunoadhesin” refers to antibody-like molecules that combine the binding specificity of a heterologous protein (“adhesin”) with the effector functions of the immunoglobulin constant domains. Structurally, immunoadhesins include a fusion sequence consisting of an amino acid sequence with a desired binding specificity different from that of the antibody antigen recognition and binding site (ie, being “heterologous”), and immunoglobulin constant domain sequences. The adhesion portion of an immunoadhesin molecule is typically a continuous amino acid sequence comprising at least a receptor or ligand binding site, such as a VEGFR or fibronectin ligand. The constant portion of the immunoglobulin sequence in the immunoadhesin can be obtained from any immunoglobulin, such as IgG-1, IgG-2, IgG-3, or IgG-4, IgA subtypes (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM . Peptibodies, often containing the sequence obtained by selection from phage display sequences that specifically bind to the target, and their fusion with the Fc portion of the immunoglobulin can also be considered immunoadhesins here.
Термин «антитело» использован в наиболее общем смысле и, в частности, подразумевает, например, единичные моноклональные антитела (включая агонисты, антагонисты и нейтрализующие антитела), композиции антител с многоэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела и фрагменты антител (см. ниже), до тех пор, пока они специфически связываются с нативным полипептидом и/или демонстрируют биологическую или иммунологическую активность согласно данному изобретению. В соответствии с одним вариантом осуществления, антитело связывается с олигомерной формой белка-мишени, например с тримерной формой. В соответствии с другим вариантом осуществления, антитело специфически связывается с белком, это связывание может быть ингибировано моноклональными антителами в соответствии с данным изобретением (например, депонированным антителом согласно данному изобретению и т.п.). Фраза «функциональный фрагмент или аналог» антитела обозначает соединение, имеющее качественную биологическую активность, общую с антителом, с которым оно сравнивается. Например, функциональный фрагмент или аналог антитела согласно данному изобретению может специфически связываться с VEGF или альфа5бета1. В одном варианте осуществления, антитело может предотвратить или значительно уменьшить способность VEGF вызывать размножение клеток.The term “antibody” is used in the most general sense and, in particular, refers to, for example, single monoclonal antibodies (including agonists, antagonists and neutralizing antibodies), antibody compositions with multi-epitope specificity, polyclonal antibodies, single chain antibodies and antibody fragments (see below) , as long as they specifically bind to the native polypeptide and / or exhibit biological or immunological activity according to this invention. In accordance with one embodiment, the antibody binds to an oligomeric form of the target protein, for example a trimeric form. In accordance with another embodiment, the antibody specifically binds to a protein, this binding can be inhibited by monoclonal antibodies of the invention (e.g., a deposited antibody of the invention, etc.). The phrase “functional fragment or analogue” of an antibody refers to a compound having qualitative biological activity common with the antibody with which it is compared. For example, a functional fragment or analog of an antibody of the invention may specifically bind to VEGF or alpha5beta1. In one embodiment, the antibody can prevent or significantly reduce the ability of VEGF to cause cell proliferation.
«Изолированным антителом» является антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонентов его естественной среды. Загрязняющими компонентами его естественного окружения являются материалы, способные препятствовать диагностическому или терапевтическому применению антител, включая ферменты, гормоны и иные белковые или небелковые растворимые вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитела будут очищены (1) до более чем 95% по весу антител, при определении по методу Лоури, и, наиболее предпочтительно, до более чем 99% по весу, (2) до степени, достаточной для получения не менее чем 15 аминокислотных остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности по данным SDS-PAGE при восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания синим Кумасси или, предпочтительно, серебром. Изолированные антитела включают антитела in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент натурального окружения антител не будет присутствовать. Однако обычно изолированные антитела получают с применением по меньшей мере одного этапа очистки.An “isolated antibody” is an antibody that has been identified and separated and / or isolated from components of its natural environment. The polluting components of its natural environment are materials that can interfere with the diagnostic or therapeutic use of antibodies, including enzymes, hormones and other protein or non-protein soluble substances. In preferred embodiments, the antibodies will be purified (1) to more than 95% by weight of antibodies, as determined by the Lowry method, and, most preferably, to more than 99% by weight, (2) to a degree sufficient to produce at least 15 amino acid residues of the N-terminal or internal amino acid sequence using a rotary beaker, or (3) homogeneity according to SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue staining or, preferably, sulfur Br. Isolated antibodies include in situ antibodies in recombinant cells since at least one component of the natural environment of the antibodies will not be present. However, usually isolated antibodies are prepared using at least one purification step.
Основная 4-цепочечная единица антитела является гетеротетрамерным гликопротеином, состоящим из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей (антитело IgM состоит из 5 обычных гетеротетрамерных единиц, наряду с дополнительным полипептидом, называемым цепочкой J, и, таким образом, содержит 10 участков связывания антигена, а секретированные антитела IgA могут полимеризоваться, образуя поливалентные структуры, включающие 2-5 основных 4-цепочечных единиц вместе с J-цепью). В случае IgG, 4-цепочечная единица обычно имеет массу около 150000 дальтон. Каждая цепь L связана с цепью H одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как две цепи H связаны друг с другом одной или более дисульфидных связей, в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая из цепей H и L также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая цепь H имеет на N-конце вариабельный домен (VH), с последующими тремя константными доменами (CH) для каждой из цепей α и γ, и четырьмя константными доменами CH для изотипов μ and ε. Каждая цепь L имеет на N-конце вариабельный домен (VL), с последующим константным доменом (CL) на другом конце. VL находится напротив VH, а CL находится напротив первого константного домена тяжелой цепи CH 1. Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют взаимодействие между вариабельными участками тяжелой и легкой цепей. Спаренные вместе, VH и VL образуют участок связывания антигена. Структура и свойства различных классов антител описаны, например, в Basic and Clinical Immunology. 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.The basic 4-chain unit of an antibody is a heterotetrameric glycoprotein consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains (an IgM antibody consists of 5 conventional heterotetrameric units, along with an additional polypeptide called chain J, and thus contains 10 antigen binding sites, and secreted IgA antibodies can polymerize to form polyvalent structures, including 2-5 basic 4-chain units together with the J-chain). In the case of IgG, the 4-chain unit usually has a mass of about 150,000 daltons. Each L chain is linked to the H chain by one covalent disulfide bond, while two H chains are linked to each other by one or more disulfide bonds, depending on the isotype of the H chain. Each of the H and L chains also has regularly spaced intrachain disulfide bridges. Each H chain has a variable domain (V H ) at the N-terminus, followed by three constant domains (C H ) for each of the chains α and γ, and four constant C H domains for isotypes μ and ε. Each L chain has a variable domain (V L ) at the N-terminus, followed by a constant domain (C L ) at the other end. V L is opposite V H and C L is opposite the first constant domain of the heavy chain C H 1 . It is believed that certain amino acid residues form an interaction between the variable regions of the heavy and light chains. Paired together, V H and V L form the antigen binding site. The structure and properties of various classes of antibodies are described, for example, in Basic and Clinical Immunology. 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and
Цепь L от любого позвоночного вида может быть отнесена к одному из двух четко различаемых типов, называемых каппа и лямбда, на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (СН), иммуноглобулины могут быть отнесены к разным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, имеющих тяжелые цепи, обозначенные соответственно α, δ, γ и μ. Классы γ и α далее подразделяются на подклассы на основе относительно небольших различий в последовательности CH и функции, например у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.The L chain from any vertebrate species can be assigned to one of two clearly distinguishable types, called kappa and lambda, based on the amino acid sequences of their constant domains. Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains (C H ), immunoglobulins can be assigned to different classes or isotypes. There are five classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, which have heavy chains designated respectively by α, δ, γ and μ. The classes γ and α are further subdivided on the basis of relatively small differences in the C H sequence and function, for example, the following subclasses are expressed in humans: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что некоторые сегменты вариабельных доменов имеют значительные различия в последовательностях среди антител. Домен V обеспечивает связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределена в пределах 110-ти аминокислот вариабельных доменов. Вместо этого, участки V состоят из относительно постоянных промежутков, называемых каркасными участками (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками исключительной вариабельности, называемых «гипервариабельные участки», каждый из которых имеет длину 9-12 аминокислот. Каждый из вариабельных доменов природных тяжелых и легких цепей включает четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листа, связанных с тремя гипервариабельными участками, которые формируют петли, соединяя и в некоторых случаях формируя часть структуры бета-листа. В каждой цепи гипервариабельные области удерживаются вместе в непосредственной близости при помощи FR и, вместе с гипервариабельными участками с другой цепи, вносят вклад в формирование антиген-связывающего участка антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляют разнообразные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависящей от антител клеточной цитотоксичности (ADCC).The term "variable" refers to the fact that some segments of the variable domains have significant sequence differences among antibodies. Domain V provides antigen binding and determines the specificity of a particular antibody to a particular antigen. However, the variability is not evenly distributed within the 110 amino acids of the variable domains. Instead, sections V are composed of relatively constant gaps called framework sections (FR) of 15-30 amino acids, separated by shorter sections of exceptional variability, called "hypervariable sections", each of which is 9-12 amino acids in length. Each of the variable domains of natural heavy and light chains includes four FRs, mainly taking the beta-sheet configuration, associated with three hypervariable regions that form loops, connecting and in some cases forming part of the beta-sheet structure. In each chain, the hypervariable regions are held together in close proximity by FR and, together with the hypervariable regions of the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding region of antibodies (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). The constant domains are not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but exhibit a variety of effector functions, such as the participation of an antibody in antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC).
Термин «гипервариабельный участок», используемый здесь, относится к аминокислотным остаткам в антителе, ответственным за связывание антигена. Гипервариабельный участок обычно включает аминокислотные остатки из «участка, определяющего комплементарность» или "CDR" (например, остатки около 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL, и около 31-35B (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в VH (в одном варианте осуществления H1 находится около приблизительно 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в VL, и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в VH; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).The term “hypervariable region”, as used herein, refers to the amino acid residues in an antibody responsible for antigen binding. A hypervariable region typically includes amino acid residues from a “complementarity determining region” or “CDR” (eg, residues of about 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in V L , and about 31- 35B (H1), 50-65 (H2), and 95-102 (H3) in V H (in one embodiment, H1 is about 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) and / or “hypervariable loop” residues (eg, residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) in V L , and 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in V H ; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
Использованный здесь термин «моноклональное антитело» относится к антителам, полученным из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, содержащиеся в популяции, являются идентичными за исключением возможных естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены против одного участка антигена. Более того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты антигена. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела имеют преимущество в том, что они могут быть синтезированы незагрязненными другими антителами. Модификатор «моноклональные» не должен истолковываться как требующий производства антител каким-либо определенным способом. Например, моноклональные антитела, применимые в представленном изобретении, могут быть получены при помощи гибридомной технологии, впервые описанной Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены с применением методов рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических животных или растительных клетках (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с применением технологий, описанных, например, в Clackson et al., Nature. 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), и примерах ниже.As used herein, the term “monoclonal antibody” refers to antibodies obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, that is, the individual antibodies contained in the population are identical except for naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against a single site of antigen. Moreover, in contrast to polyclonal antibody preparations, which include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single antigen determinant. In addition to their specificity, monoclonal antibodies have the advantage that they can be synthesized uncontaminated by other antibodies. The “monoclonal” modifier should not be construed as requiring the production of antibodies in any particular way. For example, monoclonal antibodies useful in the present invention can be obtained using the hybridoma technology first described by Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), or can be obtained using recombinant DNA techniques in bacterial, eukaryotic animals or plants cells (see, for example, US patent No. 4816567). "Monoclonal antibodies" can also be isolated from phage libraries of antibodies using the techniques described, for example, in Clackson et al., Nature. 352: 624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), and the examples below.
Здесь моноклональные антитела также включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенных видов или принадлежащих определенному классу или подклассу, в то время как оставшаяся часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, так же как и фрагменты этих антител, до тех пор, пока они демонстрируют биологическую активность в соответствии с данным изобретением (см. патент США 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела, представляющие интерес в данном изобретении, включают «приматизированные» антитела, включающие антиген-связывающие последовательности вариабельного домена, происходящие от примата, не являющегося человеком (например, обезьян Старого мира, человекообразных обезьян, и т.д.), и человеческие последовательности константных участков.Here, monoclonal antibodies also include “chimeric” antibodies in which a part of the heavy and / or light chain is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies derived from certain species or belonging to a particular class or subclass, while the remaining part of the chain (s) is identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies derived from other species or belonging to another class or subclass of antibodies, as well as fragments of these antibodies, until they demonstrate biological activity in accordance with this invention (see U.S. Patent No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 6851-6855 (1984)). Chimeric antibodies of interest in this invention include primatized antibodies comprising variable-domain antigen binding sequences derived from a non-human primate (eg, Old World monkeys, anthropoid apes, etc.), and human sequences constant sections.
«Интактное» антитело - это антитело, содержащее антиген-связывающий участок, а также CL и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут быть константными доменами природной последовательности (например, человеческими константными доменами исходной последовательности) или вариантом их аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело имеет одну или более эффекторных функций.An “intact” antibody is an antibody containing an antigen binding site, as well as C L and at least constant heavy
«Фрагменты антител» включают части целых антител, предпочтительно антигенсвязывающий или вариабельный участок целого антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, и Fv; диатела, линейные антитела (см. патент США № 5641870, пример 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифичные антитела, собранные из фрагментов антител.“Antibody fragments” include parts of whole antibodies, preferably an antigen binding or variable region of a whole antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2 , and Fv fragments; diabodies, linear antibodies (see US Pat. No. 5,641,870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); single chain antibody molecules; and multispecific antibodies assembled from antibody fragments.
Выражение «линейные антитела» обычно относится к антителам, описанным в Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Вкратце, эти антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые, вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи, образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифичными или моноспецифичными.The expression "linear antibodies" usually refers to the antibodies described in Zapata et al., Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995). In short, these antibodies contain a pair of tandem Fd segments (VH-CH1-VH-CH1), which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen-binding sites. Linear antibodies may be bispecific or monospecific.
Расщепление антител папаином дает два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых фрагментами "Fab", и остаточный фрагмент "Fc", обозначение отражает способность легко кристаллизоваться. Фрагмент Fab состоит из целой L цепи вместе с вариабельным доменом Н цепи (VH), и первым константным доменом одной тяжелой цепи (CH 1). Каждый фрагмент Fab является моновалентным по отношению к связыванию антигена, т.е. имеет единственный участок связывания антигена. Обработка антитела пепсином дает один большой фрагмент F(ab')2, который грубо соответствует двум связанным дисульфидными мостиками фрагментам Fab, имеющим дивалентную антиген-связывающую активность и все еще способным перекрестно сшивать антиген. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab тем, что они имеют несколько дополнительных аминокислотных остатков на С-конце домена CH1, включая один или более цистеиновых остатков из шарнирного участка антитела. Fab'-SH - это использованное здесь обозначение для Fab', в котором один или более цистеиновых остатков константного домена несут свободную тиоловую группу. Фрагменты антител F(ab')2 были изначально получены как пары фрагментов Fab', имеющие шарнирные остатки цистеина между ними. Также известны другие химические соединения фрагментов антител.Papain digestion of antibodies gives two identical antigen-binding fragments, called "Fab" fragments, and the residual "Fc" fragment, the designation reflects the ability to crystallize easily. The Fab fragment consists of an entire L chain together with the variable domain H of the chain (V H ), and the first constant domain of one heavy chain (C H 1 ). Each Fab fragment is monovalent with respect to antigen binding, i.e. has a single antigen binding site. Pepsin treatment of the antibody yields one large F (ab ') 2 fragment, which roughly corresponds to two Fab disulfide-linked bridged fragments having divalent antigen-binding activity and still capable of cross-linking the antigen. Fab 'fragments differ from Fab fragments in that they have several additional amino acid residues at the C-terminus of the
Фрагмент Fc включает С-концевые участки обеих цепей H, связанные вместе дисульфидами. Эффекторные функции антител определены последовательностями в участке Fc, который также является частью, узнаваемой рецепторами Fc (FcR), обнаруженными на некоторых типах клеток.The Fc fragment includes the C-terminal regions of both H chains linked together by disulfides. The effector functions of antibodies are determined by sequences in the Fc region, which is also a part recognized by the Fc receptors (FcR) found on certain types of cells.
"Fv" является минимальным фрагментом антитела, содержащим полный участок узнавания и связывания антигена. Этот фрагмент представляет собой димер, состоящий из одного вариабельного участка тяжелой и одного легкой цепей, находящихся в тесной, нековалентной связи. В результате связывания этих двух доменов образуются шесть гипервариабельных петель (по 3 петли от Н и L цепей), которые содержат аминокислотные остатки, участвующие в связывании антигена, и придают специфичность связывания антигена с антителом. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных к антигену) имеет способность узнавать и связывать антиген, хотя и с более низким сродством по сравнению с целым участком связывания."Fv" is the smallest fragment of an antibody containing the entire antigen recognition and binding site. This fragment is a dimer consisting of one variable region of the heavy and one light chain in a close, non-covalent bond. As a result of the binding of these two domains, six hypervariable loops are formed (3 loops from H and L chains), which contain amino acid residues involved in antigen binding and impart specificity for antigen binding to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv containing only three CDRs specific for an antigen) has the ability to recognize and bind antigen, albeit with a lower affinity compared to the whole binding site.
«Одноцепочечные Fv», также сокращаемые как "sFv" или "scFv", являются фрагментами антител, которые включают домены антител VH и VL, присоединенные к одной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид sFv также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, позволяющий sFv сформировать структуру, требуемую для связывания антигена. Для описания sFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, ниже.“Single chain Fvs”, also abbreviated as “sFvs” or “scFvs,” are antibody fragments that include V H and V L antibody domains joined to the same polypeptide chain. Preferably, the sFv polypeptide also comprises a polypeptide linker between the V H and V L domains, allowing sFv to form the structure required for antigen binding. For a description of sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, below.
Термин «диатела» относится к малым фрагментам антител, получаемым конструированием фрагментов sFv (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (приблизительно 5-10 остатков) между доменами VH и VL, таким образом достигается спаривание доменов V между цепями, а не внутри цепи, что приводит к образованию бивалентного фрагмента, например, фрагмента, имеющего два участка связывания антигена. Биспецифические диатела являются гетеродимерами двух «скрещенных» фрагментов sFv, в которых домены двух антител VH и VL присутствуют в различных полипептидных цепях. Диатела описаны более полно, например, в EP 404097, WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).The term “diabodies” refers to small antibody fragments obtained by constructing sFv fragments (see the previous paragraph) with short linkers (approximately 5-10 residues) between the V H and V L domains, thus pairing the V domains between the chains, and not inside chain, which leads to the formation of a bivalent fragment, for example, a fragment having two antigen binding sites. Bispecific diabodies are heterodimers of two “crossed” sFv fragments in which the domains of two antibodies V H and V L are present in different polypeptide chains. Diabodies are described more fully, for example, in EP 404097, WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
«Гуманизированные» формы нечеловеческих антител (например, антител грызунов) являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческих антител. Главным образом, гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (антителами-реципиентами), в которых остатки гипервариабельного участка реципиента заменены остатками гипервариабельного участка антитела (донорного антитела) от вида, не являющегося человеком, такого как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, имеющего желаемую специфичность, сродство и возможности. В некоторых случаях остатки структурного региона (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся ни в реципиентном, ни в донорном антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения эффективности антитела. Обычно, гуманизированное антитело включает в основном все из по меньшей мере одного, а обычно двух, вариабельных доменов, в которых все или в основном все гипервариабельные петли соответствуют имеющимся в нечеловеческом иммуноглобулине и все или в основном все FR являются FR из человеческой последовательности иммуноглобулина. Гуманизированные антитела могут также включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно от человеческого иммуноглобулина. Для большего количества деталей см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).“Humanized” forms of non-human antibodies (eg, rodent antibodies) are chimeric antibodies that contain a minimal sequence derived from non-human antibodies. Mostly, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibodies) in which the remnants of the recipient’s hypervariable region are replaced by the remnants of the hypervariable region of the antibody (donor antibody) from a non-human species, such as a mouse, rat, rabbit or non-human primate, having desired specificity, affinity and capabilities. In some cases, residues of the structural region (FR) of a human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Moreover, humanized antibodies may contain residues not found in either the recipient or the donor antibody. These modifications are made to further improve antibody performance. Typically, a humanized antibody includes essentially all of at least one, and usually two, variable domains in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to those found in non-human immunoglobulin and all or substantially all FRs are FRs from the human immunoglobulin sequence. Humanitariannet antibodies can also include at least a portion of the constant region of immunoglobulin (Fc), usually from human immunoglobulin. For more details see Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
«Видозависимое антитело» это антитело, которое имеет большее сродство при связывании с антигеном от одного вида млекопитающих, чем с его гомологом от другого вида млекопитающих. Обычно, видозависимые антитела «специфически связываются» с человеческим антигеном (т.е. имеют значение сродства при связывании (Kd) не больше чем 1×10-7 М, предпочтительно не больше чем 1×10-8, и наиболее предпочтительно не более чем 1×10-9 М), но имеют сродство при связывании с гомологом антигена из другого, отличного от человека вида млекопитающих, которое по меньшей мере приблизительно в 50 раз, или по меньшей мере приблизительно в 500 раз, или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз, слабее чем сродство его связывания с человеческим антигеном. Видозависимые антитела могут принадлежать к любому из различных типов антител, определенных выше, но предпочтительно являются гуманизированными или человеческими антителами.A "species-dependent antibody" is an antibody that has a greater affinity for binding to an antigen from one mammalian species than to its homologue from another mammalian species. Typically, species-dependent antibodies “specifically bind” to the human antigen (ie, have a binding affinity (Kd) of not more than 1 × 10 -7 M, preferably not more than 1 × 10 -8 , and most preferably not more than 1 × 10 -9 M), but have an affinity for binding to a homologue of an antigen from another non-human mammalian species, which is at least about 50 times, or at least about 500 times, or at least about 1000 times weaker than the affinity of its binding to the human antigen. Species-dependent antibodies can belong to any of the various types of antibodies defined above, but are preferably humanized or human antibodies.
В таких вариантах осуществления, степень связывания полипептида, антитела, антагониста или композиции с «нецелевым» белком будет менее чем приблизительно 10% от связывания полипептида, антитела, антагониста или композиции с белком, являющимся его непосредственной целью по данным анализа методом активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) или радиоиммунной преципитации (RIA). Что касается связывания полипептида, антитела, антагониста или композиции с молекулой-мишенью, термин «специфическое связывание», или «специфически связывается с», или «специфично» для конкретного полипептида или эпитопа на конкретной полипептидной мишени означает связывание, которое является измеримо отличным от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание может быть измерено, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно является молекулой сходной структуры, которая не имеет связывающей активности. Например, специфическое связывание может быть определено методом конкуренции c контрольной молекулой, которая сходна с мишенью, например, c избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание будет показано, если связывание меченной мишени с зондом будет конкурентно подавлено избытком немеченой мишени. Использованный здесь, термин «специфическое связывание», или «специфически связывается с», или «специфично для» конкретного полипептида или эпитопа на конкретной полипептидной мишени может быть проиллюстрирован, например, молекулой, имеющей Kd по отношению к мишени не менее чем приблизительно 10-4М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-5 М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-6 М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-7 М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-8 М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-9 М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-10 М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-11 М, альтернативно не менее чем приблизительно 10-12 М или лучше. В одном варианте осуществления, термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом конкретного полипептида при отсутствии значительного связывания с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.In such embodiments, the degree of binding of the polypeptide, antibody, antagonist or composition to a “non-target” protein will be less than about 10% of the binding of the polypeptide, antibody, antagonist or composition to a protein that is its direct objective according to analysis by activated fluorescence sorting of cells ( FACS) or radioimmune precipitation (RIA). With regard to the binding of a polypeptide, antibody, antagonist or composition to a target molecule, the term “specific binding” or “specifically binds to” or “specific” for a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide target means a binding that is measurably different from non-specific interactions. Specific binding can be measured, for example, by determining the binding of a molecule compared to the binding of a control molecule, which is usually a molecule of similar structure that does not have binding activity. For example, specific binding can be determined by competition with a control molecule that is similar to the target, for example, with an excess of unlabeled target. In this case, specific binding will be shown if the binding of the labeled target to the probe is competitively suppressed by an excess of unlabeled target. As used herein, the term “specific binding” or “specifically binds to” or “specific for” a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide target can be illustrated, for example, by a molecule having a Kd relative to the target of at least about 10 -4 M, alternatively not less than about 10 -5 M, alternatively not less than about 10 -6 M, alternatively not less than about 10 -7 M, alternatively not less than about 10 -8 M, alternatively not less than about 10 -9 M alternatively not less than about 10 -10 M, alternatively not less than about 10 -11 M, alternatively not less than about 10 -12 M or better. In one embodiment, the term “specific binding” refers to a binding in which a molecule binds to a particular polypeptide or epitope of a particular polypeptide in the absence of significant binding to any other polypeptide or epitope of the polypeptide.
Термин «эффекторные функции» антитела относится к биологическим активностям, приписываемым участку Fc (участку Fc природной последовательности или варианту аминокислотной последовательности участка Fc) антитела и изменяется с изотипом антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание С1q и комплементзависимую цитотоксичность; связывание рецептора Fc; антителозависимую опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности; и активацию В-клеток. Термин «естественная последовательность участка Fc» подразумевает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности участка Fc, обнаруженной в природе. Примеры последовательностей Fc описаны, например, но не ограничены Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).The term "effector functions" of an antibody refers to the biological activities attributed to the Fc region (Fc region of the natural sequence or amino acid sequence variant of the Fc region) of the antibody and varies with the antibody isotype. Examples of antibody effector functions include: C1q binding and complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; negative regulation of cell surface receptors; and B cell activation. The term “natural sequence of an Fc region” means an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of an Fc region found in nature. Examples of Fc sequences are described, for example, but not limited to Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Термин «вариант Fc участка» подразумевает аминокислотную последовательность, которая отличается от природной последовательности участка Fc преимуществом наличия по меньшей мере одной «аминокислотной модификации», описанной в данном изобретении. Предпочтительно, вариант участка Fc имеет не менее одной аминокислотной замены по сравнению с природной последовательностью участка Fc или с участком Fc исходного полипептида, например от приблизительно одной до приблизительно десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных замен в природной последовательности участка Fc или в участке Fc исходного полипептида. В одном варианте осуществления вариант участка Fc, описанного здесь, будет иметь не менее чем приблизительно 80% гомологии, не менее чем приблизительно 85% гомологии, не менее чем приблизительно 90% гомологии, не менее чем приблизительно 95% гомологии, или не менее чем приблизительно 99% гомологии с участком Fc природной последовательности. В соответствии с другим вариантом осуществления, вариант участка Fc, описанного здесь, будет иметь не менее чем приблизительно 80% гомологии, не менее чем приблизительно 85% гомологии, не менее чем приблизительно 90% гомологии, не менее чем приблизительно 95% гомологии, или не менее чем приблизительно 99% гомологии с участком Fc исходного полипептида.The term “Fc region variant” means an amino acid sequence that differs from the natural sequence of the Fc region by the advantage of having at least one “amino acid modification” described in this invention. Preferably, the Fc region variant has at least one amino acid substitution as compared to the natural sequence of the Fc region or the Fc region of the parent polypeptide, for example from about one to about ten amino acid substitutions, and preferably from about one to about five amino acid substitutions in the natural sequence of the Fc region or in the Fc region of the parent polypeptide. In one embodiment, an embodiment of the Fc region described herein will have at least about 80% homology, at least about 85% homology, at least about 90% homology, at least about 95% homology, or at least about 99% homology to the Fc region of the natural sequence. In accordance with another embodiment, an embodiment of the Fc region described herein will have at least about 80% homology, at least about 85% homology, at least about 90% homology, at least about 95% homology, or not less than approximately 99% homology with the Fc region of the parent polypeptide.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» или «гомологии аминокислотной последовательности» по отношению к приведенным здесь полипептидным последовательностям определяется как процент в обсуждаемой последовательности аминокислотных остатков, идентичных аминокислотным остаткам в сравниваемом полипептиде после выравнивания и, если это необходимо для достижения максимального процента идентичности последовательностей, введения разрывов, причем консервативные замены не считаются частью идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения % идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, находящимися в пределах знаний специалиста в данной области техники, например, с использованием общественно доступного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для измерения гомологии, включая алгоритмы, требующиеся для достижения максимальной гомологии в пределах полной длины сравниваемых последовательностей. Однако для решаемых здесь задач % идентичности аминокислотных последовательностей были получены с применением компьютерной программы сравнения последовательностей программы ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана Genentech, Inc, исходный код был внесен в реестр вместе с документацией пользователя в U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он был зарегистрирован под регистрационным номером США TXU510087. Программа ALIGN-2 доступна публично через Genentech, Inc., South San Francisco, California. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для использования в операционной системе UNIX, предпочтительно цифровой системе UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей были заданы программой ALIGN-2 и не изменялись.“Percentage (%) of amino acid sequence identity” or “amino acid sequence homology” with respect to the polypeptide sequences described herein is defined as the percentage in the sequence of amino acid residues discussed that are identical to the amino acid residues in the compared polypeptide after alignment and, if necessary, to achieve the maximum percentage of sequence identity , introducing gaps, and conservative substitutions are not considered part of the identity of subsequent flaxes. Alignment for the purposes of determining the% identity of amino acid sequences can be achieved in various ways that are within the skill of a person skilled in the art, for example, using publicly available software such as BLAST, BLAST-2, ALIGN or Megalign (DNASTAR) software. Specialists in the art can determine the appropriate parameters for measuring homology, including the algorithms required to achieve maximum homology within the full length of the compared sequences. However, for the tasks to be solved here,% amino acid sequence identity was obtained using the ALIGN-2 computer program for comparing sequences. ALIGN-2 sequence comparison software was developed by Genentech, Inc, the source code was entered into the registry along with user documentation in U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, where it was registered under US registration number TXU510087. ALIGN-2 is publicly available through Genentech, Inc., South San Francisco, California. The ALIGN-2 program must be compiled for use on a UNIX operating system, preferably a digital UNIX V4.0D system. All sequence comparison parameters were set by the ALIGN-2 program and were not changed.
Термин «полипептид, включающий участок Fc» относится к полипептиду, такому как антитело или иммуноадгезин (см. определения выше), включающему участок Fc. Лизин, находящийся на С-конце (остаток 477 в соответствии с системой нумерации EU) участка Fc, может быть удален, например, в процессе очистки полипептида или путем рекомбинантного конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Соответственно, композиция, содержащая полипептиды, включая антитела, имеющие участок Fc в соответствии с данным изобретением, может содержать популяции полипептидов, в которых все остатки К447 удалены, полипептидные популяции, в которых не удалено ни одного остатка К447, или полипептидные популяции, имеющие смесь полипептидов, имеющих и не имеющих остатка К447.The term "polypeptide comprising an Fc region" refers to a polypeptide, such as an antibody or immunoadhesin (see definitions above), comprising an Fc region. The lysine located at the C-terminus (residue 477 according to the EU numbering system) of the Fc region can be removed, for example, by purification of the polypeptide or by recombinant construction of a nucleic acid encoding the polypeptide. Accordingly, a composition comprising polypeptides, including antibodies having an Fc region of the invention, may comprise populations of polypeptides in which all K447 residues are deleted, polypeptide populations in which not a single K447 residue is deleted, or polypeptide populations having a mixture of polypeptides with and without a K447 residue.
В пределах настоящей спецификации и формулы изобретения по отношению к остаткам в вариабельном домене (приблизительно, остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) обычно использована система нумерации по Kabat (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). «Система нумерации EU» или «индекс EU» обычно используется при ссылке на остаток в константном участке тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU приведен в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), кратко приведенном здесь в виде ссылки). Если не указано иное, ссылки на номера остатков в вариабельном домене антител подразумевают нумерацию остатков по системе нумерации Kabat. Если не указано иное, ссылки на номера остатков в константном домене антител подразумевают нумерацию остатков по системе нумерации EU.Within the scope of this specification and claims, with respect to residues in the variable domain (approximately 1-107 light chain residues and 1-113 heavy chain residues), a Kabat numbering system (e.g., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest) is commonly used. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). An “EU numbering system” or “EU index” is typically used when referring to a residue in a constant region of an immunoglobulin heavy chain (for example, the EU index is given in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), summarized here by reference). Unless otherwise indicated, references to residue numbers in the variable domain of antibodies mean the numbering of residues according to the Kabat numbering system. Unless otherwise indicated, references to residue numbers in the constant domain of antibodies mean the numbering of residues according to the EU numbering system.
Термины «рецептор Fc» или «FcR» использованы для описания рецептора, который связывается с участком Fc антитела. В одном варианте осуществления FcR согласно данному изобретению связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII, и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, отличающиеся в основном в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в цитоплазматическом домене основанный на тирозине участок активации (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в цитоплазматическом домене основанный на тирозине ингибирующий участок (ITIM) (см. обзорную публикацию M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Термин включает аллотипы, такие как аллотипы FcγRIIIA: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 и/или FcγRIIA-H131. FcR рассматриваются в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Другие FcR, включая те, которые будут обнаружены в будущем, также охватываются здесь термином «FcR». Термин также включает неонатальный рецептор FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).The terms “Fc receptor” or “FcR” are used to describe a receptor that binds to an Fc region of an antibody. In one embodiment, the FcR of the present invention binds an IgG antibody (gamma receptor) and includes receptors of the subclasses FcγRI, FcγRII, and FcγRIII, including allelic variants and alternative splicing forms of these receptors. FcγRII receptors include FcγRIIA ("activating receptor") and FcγRIIB ("inhibitory receptor"), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains. The activating receptor FcγRIIA contains a tyrosine-based activation site (ITAM) in the cytoplasmic domain. The inhibitory receptor FcγRIIB contains in the cytoplasmic domain a tyrosine-based inhibitory site (ITIM) (see review publication M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). The term includes allotypes, such as FcγRIIIA allotypes: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 and / or FcγRIIA-H131. FcRs are reviewed in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Other FcRs, including those that will be discovered in the future, are also covered herein by the term “FcR”. The term also includes the neonatal FcRn receptor, which is responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
Термин «FcRn» относится к неонатальному рецептору Fc (FcRn). FcRn по структуре сходен с главным комплексом гистосовместимости (MHC) и состоит из ∀-цепи, нековалентно связанной с ∃2-микроглобулином. Многочисленные функции неонатального рецептора Fc FcRn рассматриваются в Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn играет роль в пассивной доставке иммуноглобулинов IgG от матери к детенышу и регуляции уровней сывороточного IgG. FcRn может выступать как рецептор реутилизации, связывая и транспортируя пиноцитированные IgG в интактном виде внутрь клеток и через них, позволяя им избегнуть обычного метаболического пути, приводящего к их деградации.The term “FcRn” refers to the neonatal Fc receptor (FcRn). FcRn is structurally similar to the major histocompatibility complex (MHC) and consists of a цепи chain non-covalently linked to ∃2-microglobulin. Numerous functions of the neonatal Fc FcRn receptor are discussed in Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn plays a role in the passive delivery of IgG immunoglobulins from mother to calf and the regulation of serum IgG levels. FcRn can act as a reutilization receptor by binding and transporting pinocytosed IgG intact into and through cells, allowing them to avoid the usual metabolic pathway leading to their degradation.
В WO00/42072(Presta) и Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описаны варианты антител с увеличенным или уменьшенным связыванием с FcR. Содержание этих публикаций приведено здесь в виде ссылки.WO00 / 42072 (Presta) and Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001) describes antibody variants with increased or decreased binding to FcR. The contents of these publications are incorporated herein by reference.
«Домен CH1» человеческого участка Fc IgG (также называемый доменом «С1» или «Н1») обычно имеет протяженность от приблизительно 118 аминокислоты до приблизительно 215 аминокислоты (по системе нумерации EU).The “CH1 domain” of the human IgG Fc region (also called the “C1” or “H1” domain) typically ranges from about 118 amino acids to about 215 amino acids (according to the EU numbering system).
Термин «шарнирный участок» обычно определяется как протяженность от Glu216 до Pro230 человеческого IgG1 (Burton, Molec. Immunol.22: 161-206 (1985)). Шарнирные участки других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG1 при помощи установки первого и последнего оснований цистеина, формирующих связи S-S между тяжелыми цепями в одно положение.The term “hinge region” is usually defined as the length from Glu216 to Pro230 of human IgG1 (Burton, Molec. Immunol.22: 161-206 (1985)). The hinge regions of other IgG isotypes can be aligned with the IgG1 sequence by placing the first and last cysteine bases forming S-S bonds between the heavy chains in one position.
«Нижний шарнирный участок» участка Fc обычно определяется как протяженность оснований непосредственно на С-конце шарнирного участка, т.е. остатки от 233 до 239 участка Fc. В предшествующих работах связывание с FcR обычно приписывалось аминокислотным остаткам в нижнем шарнирном участке участка Fc IgG.The “lower hinge portion” of the Fc portion is usually defined as the length of the bases directly at the C-end of the hinge portion, i.e. residues from 233 to 239 sites Fc. In previous studies, binding to FcR was usually attributed to amino acid residues in the lower hinge region of the IgG Fc region.
«Домен CH2» человеческого участка Fc IgG (также упоминаемый как домен «С2» или «Н2») обычно находится в области от 231 аминокислоты до 340 аминокислоты. Домен CH2 является уникальным в том, что он не является близко спаренным с другим доменом. Вместо этого между двумя доменами СН2 интактной молекулы природного IgG находятся две N-связанные разветвленные углеводные цепочки. Было сделано предположение, что углеводы могут заменять спаривание домена с доменом и способствовать стабилизации домена CH2. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985).The "CH2 domain" of the human IgG Fc region (also referred to as the "C2" or "H2" domain) is usually in the region of 231 amino acids to 340 amino acids. The CH2 domain is unique in that it is not closely paired with another domain. Instead, between the two domains of the CH2 intact natural IgG molecule, there are two N-linked branched carbohydrate chains. It has been suggested that carbohydrates can replace the pairing of a domain with a domain and help stabilize the CH2 domain. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985).
«Домен CH3» (также упоминаемый как домен «С2» или «Н3») включает протяженность остатков на С-конце домена CH2 в участке Fc (т.е. приблизительно от аминокислотного остатка 341 до С-конца последовательности антитела, обычно на аминокислотном остатке 446 или 447 IgG).The “CH3 domain” (also referred to as the “C2” or “H3” domain) includes the extent of residues at the C-terminus of the CH2 domain in the Fc region (i.e., approximately from amino acid residue 341 to the C-terminus of the antibody sequence, usually at the amino acid residue 446 or 447 IgG).
«Функциональный участок Fc» имеет «эффекторные функции» природной последовательности участка Fc. Примеры «эффекторной функции» включают связывание С1q, комплементзависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; зависящую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (т.е. рецепторов В-клеток, BCR), и т.д. Подобные эффекторные функции обычно требуют комбинации участка Fc со связывающим доменом (например, с вариабельным доменом антитела) и могут быть оценены с применением различных анализов, например, как раскрыто в данном описании.A “functional Fc region” has “effector functions” of the natural sequence of the Fc region. Examples of “effector function” include C1q binding, complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC), phagocytosis; negative regulation of cell surface receptors (i.e., B cell receptors, BCR), etc. Such effector functions typically require a combination of the Fc region with a binding domain (e.g., the variable domain of an antibody) and can be evaluated using various assays, for example, as disclosed herein.
«С1q» является полипептидом, который включает сайт связывания участка Fc с иммуноглобулином. С1q вместе с двумя сериновыми протеазами, C1r и C1s, образуют комплекс С1, первый компонент пути комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Человеческий С1q может быть приобретен на коммерческих основаниях, например у Quidel, San Diego, CA.“C1q” is a polypeptide that includes the binding site of an Fc region to an immunoglobulin. C1q, together with two serine proteases, C1r and C1s, form the C1 complex, the first component of the complement dependent cytotoxicity (CDC) pathway. Human C1q can be purchased commercially, for example from Quidel, San Diego, CA.
Термин «домен связывания» относится к участку полипептида, который связывается с другой молекулой. В случае FcR, домен связывания может включать часть его полипептидной цепочки (например, его альфа цепи), которая отвечает за связывание Fc участка. Одним из полезных доменов связывания является внеклеточный домен альфа цепи FcR.The term “binding domain” refers to a portion of a polypeptide that binds to another molecule. In the case of FcR, the binding domain may include a part of its polypeptide chain (for example, its alpha chain), which is responsible for the binding of the Fc region. One useful binding domain is the extracellular domain of the FcR alpha chain.
Антитело или пептитело с вариантом Fc IgG с «измененным» сродством связывания FcR или активностью ADCC имеет увеличенную или уменьшенную способность связывать FcR (например, FcγR или FcRn) и/или активность ADCC по сравнению с исходным полипептидом или с полипептидом, включающим исходную последовательность участка Fc. Вариант Fc, который «демонстрирует улучшенное связывание» с FcR, связывается по меньшей мере с одним FcR с более высоким сродством (то есть с более низким значением Kd или IC50), чем исходный полипептид или IgG Fc с природной последовательностью. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, увеличение связывания по сравнению с исходным полипептидом может быть приблизительно 3-кратным, предпочтительно приблизительно 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, или 500 кратным, или от приблизительно 25% до 1000% улучшения связывания. Вариант полипептида, который «демонстрирует пониженное связывание» с FcR связывается по меньшей мере с одним FcR с более низким сродством (то есть с более высоким значением Kd или IC50), чем исходный полипептид. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, уменьшение связывания по сравнению с исходным полипептидом может быть приблизительно на 40% или более.An antibody or peptibody with an IgG Fc variant with an “altered” FcR binding affinity or ADCC activity has an increased or decreased ability to bind FcR (eg, FcγR or FcRn) and / or ADCC activity compared to the parent polypeptide or to a polypeptide comprising the parent sequence of the Fc region . An Fc variant that "exhibits improved binding" to FcR binds to at least one FcR with a higher affinity (i.e., lower Kd or IC50) than the native sequence Fc polypeptide or IgG. In accordance with some variants of implementation, the increase in binding compared with the original polypeptide can be approximately 3-fold, preferably approximately 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, or 500 times, or from about 25% to 1000 % improvement in binding. A variant of a polypeptide that "shows reduced binding" to FcR binds to at least one FcR with a lower affinity (i.e., with a higher Kd or IC50) than the parent polypeptide. In accordance with some variants of implementation, the decrease in binding compared with the original polypeptide can be approximately 40% or more.
Термин «антителозависимая опосредованная клетками цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой секретированные Ig связываются с рецепторами FcR, присутствующими на некоторых цитотоксичных клетках (например, клетках - естественных киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), позволяя этим цитотоксическим клеткам-эффекторам специфически связываться с несущими антиген клетками-мишенями и впоследствии убивать клетки-мишени при помощи цитотоксинов. Антитела «взводят» цитотоксические клетки и являются абсолютно необходимыми для подобного уничтожения. Основные клетки, являющиеся медиаторами ADCC, клетки NK экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR в гематопоэтических клетках обобщена в таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC интересующей молекулы может быть проведено исследование ADCC in vitro, как описано в патенте США № 5500362 или 5821337 или в Примерах ниже. Применяемые для таких исследований эффекторные клетки включают одноядерные клетки периферической крови (PBMC) и естественные клетки-убийцы (NK). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы может быть исследована in vivo, например на модели на животных, такой как раскрыта в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).The term “antibody-dependent cell mediated cytotoxicity” or “ADCC” refers to a form of cytotoxicity in which secreted Ig binds to FcR receptors present on some cytotoxic cells (eg, natural killer (NK) cells, neutrophils and macrophages), allowing these cytotoxic cells -effects to specifically bind to antigen-carrying target cells and subsequently kill target cells using cytotoxins. Antibodies “cock” cytotoxic cells and are absolutely necessary for such destruction. The main cells that are ADCC mediators, NK cells express FcγRIII only, while monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. The expression of FcR in hematopoietic cells is summarized in table 3 on page 464 in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). In order to evaluate the ADCC activity of the molecule of interest, an in vitro ADCC assay can be performed as described in US Pat. No. 5,500,362 or 5,821,337 or in the Examples below. Effector cells used for such studies include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer cells (NK). Alternatively or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest can be investigated in vivo, for example in an animal model, such as that disclosed in Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
Полипептид, включающий вариант участка Fc, который «демонстрирует увеличенную ADCC» или является медиатором антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности (ADCC) в присутствии человеческих клеток-эффекторов более эффективно, чем полипептид, имеющий Fc IgG дикого типа или исходный полипептид, является значительно более эффективным in vitro или in vivo в качестве медиатора ADCC, если количества полипептида с вариантом участка Fc и полипептида с участком Fc дикого типа (или родительским полипептидом) в исследовании являются практически одинаковыми. Обычно такие варианты определяются с использованием исследований ADCC in vitro, таких как описанные здесь, однако подразумеваются и другие анализы или методы определения активности ADCC, например в модели на животных и т.д. В одном варианте осуществления предпочтительный вариант более эффективен в качестве медиатора ADCC по сравнению с Fc дикого типа (или исходным полипептидом) в приблизительно от 5 до приблизительно 100 раз, например, в приблизительно от 25 до приблизительно 50 раз.A polypeptide comprising an Fc region variant that "exhibits increased ADCC" or is a mediator of antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) in the presence of human effector cells is more effective than a polypeptide having wild-type IgG Fc or the parent polypeptide is significantly more effective in vitro or in vivo as an ADCC mediator, if the amounts of the polypeptide with the variant Fc region and the polypeptide with the wild-type Fc region (or the parent polypeptide) in the study are almost the same vym. Typically, such variants are determined using in vitro ADCC studies, such as those described herein, but other assays or methods for determining ADCC activity are implied, for example in an animal model, etc. In one embodiment, the preferred embodiment is more effective as an ADCC mediator compared to wild-type Fc (or parent polypeptide) about 5 to about 100 times, for example, about 25 to about 50 times.
Термин «комплементзависимая цитотоксичность» или «CDC» относится к лизису клеток-мишеней в присутствии комплемента. Активация классического пути комплемента начинается со связывания первого компонента системы комплемента (C1q) с антителами (соответствующего подкласса), которые связаны с узнаваемым ими антигеном. Для оценки активации комплемента может быть выполнен анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).The term “complement dependent cytotoxicity” or “CDC” refers to the lysis of target cells in the presence of complement. Activation of the classical complement pathway begins with the binding of the first component of the complement system (C1q) to antibodies (corresponding subclass) that are associated with an antigen that they recognize. To evaluate complement activation, a CDC assay can be performed, for example, as described in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
Варианты полипептида с измененными аминокислотными последовательностями участка Fc и уменьшенная или увеличенная способность к связыванию C1q описаны в патенте США № 6194551B1 и WO99/51642. Содержание этих публикаций непосредственно приведено здесь в виде ссылки. См. также Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).Variants of the polypeptide with altered amino acid sequences of the Fc region and a reduced or increased ability to bind C1q are described in US patent No. 6194551B1 and WO99 / 51642. The contents of these publications are hereby incorporated by reference. See also Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Термин «человеческие клетки-эффекторы» обозначает лейкоциты, экспрессирующие один или более FcR и выполняющие эффекторные функции. Согласно одному осуществлению клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют ADCC эффекторные функции. Примеры человеческих лейкоцитов, которые являются медиаторами ADCC, включают одноядерные клетки периферийной крови (PBMC), естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; предпочтительны PBMC и клетки NK. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например из крови или PBMC, как описано здесь.The term "human effector cells" refers to white blood cells expressing one or more FcRs and performing effector functions. In one embodiment, the cells express at least FcγRIII and perform ADCC effector functions. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), natural killer cells (NKs), monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils; PBMC and NK cells are preferred. Effector cells can be isolated from their natural source, for example from blood or PBMC, as described herein.
Методы измерения связывания с FcRn известны (см., например, Ghetie 1997, Hinton 2004), а также описаны в примерах ниже. Связывание с человеческим FcRn in vivo и период жизни связывающихся с человеческим FcRn с высоким сродством полипептидов могут быть изучены, например, на трансгенных мышах или трансфицированных линиях человеческих клеток, экспрессирующих человеческий FcRn, или на приматах, которым введен вариант полипептида Fc. В одном варианте осуществления антитела против альфа5бета1, имеющие измененный Fc IgG в соответствии с изобретением, демонстрировали увеличенное сродство связывания с человеческим FcRn по сравнению с полипептидом, имеющим Fc IgG дикого типа, не менее чем в 2 раза, не менее чем в 5 раз, не менее чем в 10 раз, не менее чем в 50 раз, не менее чем в 60 раз, не менее чем в 70 раз, не менее чем в 80 раз, не менее чем в 100 раз, не менее чем в 125 раз, не менее чем в 150 раз. В определенном варианте осуществления сродство связывания с человеческим FcRn увеличилось приблизительно в 170 раз.Methods for measuring binding to FcRn are known (see, for example, Ghetie 1997, Hinton 2004), and are also described in the examples below. In vivo binding to human FcRn and the life span of high affinity human FcRn binding polypeptides can be studied, for example, on transgenic mice or transfected human cell lines expressing human FcRn, or on primates that have been introduced with an Fc polypeptide variant. In one embodiment, anti-alpha5beta1 antibodies having altered Fc IgG in accordance with the invention showed increased binding affinity for human FcRn compared to a polypeptide having wild-type Fc IgG of at least 2 times, not less than 5 times, not less than 10 times, not less than 50 times, not less than 60 times, not less than 70 times, not less than 80 times, not less than 100 times, not less than 125 times, not less than than 150 times. In a specific embodiment, the binding affinity for human FcRn increased by approximately 170 times.
В одном варианте осуществления EC50 или кажущаяся Kd (при pH 6,0) полипептида для сродства связывания с FcRn была меньше чем 1 мкМ, более предпочтительно менее или равна 100 нМ, более предпочтительно менее или равна 10 нМ. В одном варианте осуществления для увеличенного сродства связывания с FcγRIII (F158; т.е. изотип с низким сродством) EC50 или кажущаяся Kd была менее или равна 10 нМ, а для FcγRIII (V158; изотип с высоким сродством) EC50 или кажущаяся Kd была менее или равна 3 нМ. В соответствии с другим вариантом осуществления, уменьшение связывания антитела с рецептором Fc относительно контрольного антитела (например, антитела Herceptin®) может считаться значительным по отношению к контрольному антителу, если соотношение значений поглощения в средней точке кривых связывания испытуемого антитела и контрольного антитела (например, А450нм(антитело)/А450нм(контрольное антитело)) меньше или равно 40%. В соответствии с другим вариантом осуществления, увеличение связывания антитела с рецептором Fc относительно контрольного антитела (например антитела Herceptin®) может быть сочтено значительным по отношению к контрольному антителу, если соотношение значений поглощения в средней точке кривых связывания испытуемого антитела и контрольного антитела (например, А450нм(антитело)/А450нм(контрольное антитело)) больше или равно 125%. См., например, Пример 16.In one embodiment, the EC50 or apparent Kd (at pH 6.0) of the FcRn binding affinity polypeptide was less than 1 μM, more preferably less than or equal to 100 nM, more preferably less than or equal to 10 nM. In one embodiment, for an increased binding affinity for FcγRIII (F158; i.e., a low affinity isotype), the EC50 or apparent Kd was less than or equal to 10 nM, and for FcγRIII (V158; a high affinity isotype), the EC50 or apparent Kd was less than or equal to 3 nM. According to another embodiment, a decrease in the binding of the antibody to the Fc receptor relative to the control antibody (e.g., Herceptin ® antibodies) can be considered significant relative to the control antibody if the ratio of the absorption values at the midpoint of the binding curves of the test antibody and the control antibody (e.g., A 450nm (antibody) / A 450nm (control antibody) ) less than or equal to 40%. According to another embodiment, an increase in the binding of the antibody to the Fc receptor relative to the control antibody (e.g., Herceptin ® antibodies) can be considered significant relative to the control antibody if the ratio of the absorption values at the midpoint of the binding curves of the test antibody and the control antibody (e.g., A 450nm (antibody) / A 450nm (control antibody) ) is greater than or equal to 125%. See, for example, Example 16.
«Исходный полипептид» или «исходное антитело» является полипептидом или антителом, включающим аминокислотную последовательность, из которой возник измененный полипептид или антитело и с которым производится сравнение измененного полипептида или антитела. Обычно исходный полипептид или исходное антитело не имеет одной или более модификаций участка Fc, описанных здесь, и отличается от измененного полипептида, описанного здесь, по эффекторным функциям. Исходный полипептид может включать природную последовательность участка Fc или участок Fc с уже имеющимися модификациями аминокислотной последовательности (такими как присоединения, делеции и/или замены).A “parent polypeptide” or “parent antibody” is a polypeptide or antibody comprising an amino acid sequence from which an altered polypeptide or antibody is generated and with which a modified polypeptide or antibody is compared. Typically, the parent polypeptide or parent antibody does not have one or more modifications of the Fc region described herein, and differs from the altered polypeptide described herein in effector functions. The parent polypeptide may include the natural sequence of the Fc region or the Fc region with existing modifications of the amino acid sequence (such as additions, deletions and / or substitutions).
Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены при помощи фагового дисплея. Использованный здесь термин «библиотека» относится к множеству последовательностей антител, или фрагментов антител, или нуклеиновых кислот, которые кодируют эти последовательности, последовательности имеют различия в комбинации изменяемых аминокислот, которые были введены в эти последовательности в соответствии со способами изобретения.Antibodies in accordance with this invention can be obtained using phage display. As used herein, the term “library” refers to a plurality of antibody sequences, or antibody fragments, or nucleic acids that encode these sequences, the sequences have differences in the combination of variable amino acids that have been introduced into these sequences in accordance with the methods of the invention.
«Фаговый дисплей» - это методика, с помощью которой варианты полипептидов демонстрируются в виде слитных белков в качестве по меньшей мере части белка оболочки фаговых частиц, например, нитчатого фага. Полезность фагового дисплея заключается в том, что большие библиотеки случайных вариантов белка могут быть быстро и эффективно отсортированы по наличию последовательностей, которые связывают антиген-мишень с высоким сродством. Отображение пептидных и белковых библиотек на фагах применяется для проверки миллионов полипептидов на предмет имеющих конкретные особенности связывания. Методы поливалентных фаговых дисплеев использованы для демонстрации малых случайных пептидов и малых белков путем слияния их или с геном III, или с геном VIII нитевидного фага. Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992) и цитируемые там ссылки. В моновалентном фаговом дисплее протеиновая или пептидная библиотека слита с геном III или его частью и экспрессируется на низких уровнях в присутствии гена III дикого типа, так что фаговые частицы демонстрируют одну копию или не демонстрируют слитных белков. По сравнению с поливалентным фагом авидность уменьшена, так что используется сортировка на основе существенного сродства к лигандам, и фагмидные векторы, которые облегчают манипуляции с ДНК. Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991).A “phage display” is a technique by which variants of a polypeptide are demonstrated as fusion proteins as at least a portion of a membrane protein of phage particles, such as filamentous phage. The usefulness of phage display is that large libraries of random protein variants can be quickly and efficiently sorted by the presence of sequences that bind the target antigen with high affinity. Mapping peptide and protein libraries on phages is used to test millions of polypeptides for specific binding features. Methods of polyvalent phage displays are used to demonstrate small random peptides and small proteins by fusing them with either gene III or gene VIII of the filamentous phage. Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3: 355-362 (1992) and references cited therein. In a monovalent phage display, a protein or peptide library is fused to gene III or part thereof and is expressed at low levels in the presence of wild-type gene III, so that phage particles show one copy or do not show fusion proteins. Compared to polyvalent phage, avidity is reduced, so that sorting based on a significant affinity for ligands, and phagemid vectors that facilitate DNA manipulation are used. Lowman and Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3: 205-0216 (1991).
«Фагмида» - это плазмидный вектор, имеющий бактериальную точку инициации репликации, например ColE1, и копию межгенного участка бактериофага. Фагмида может быть использована с любым известным бактериофагом, включая нитевидные бактериофаги и лямбдоидные бактериофаги. Плазмида также обычно содержит маркер отбора по устойчивости к антибиотикам. Сегменты ДНК, клонированные в эти векторы, могут передаваться как плазмиды. Когда клетки, содержащие эти векторы, снабжаются всеми генами, необходимыми для продукции фаговых частиц, способ репликации плазмид изменяется на репликацию по принципу катящегося кольца для получения копий одной цепи плазмидной ДНК и упаковки фаговых частиц. Фагмиды могут образовывать инфекционные и неинфекционные фаговые частицы. Этот термин подразумевает фагмиды, содержащие ген фагового белка оболочки или его фрагмент, связанный с геном гетерологичного полипептида так, что в результате слияния генов гетерологичный полипептид демонстрируется на поверхности фаговой частицы.A “phagmid” is a plasmid vector having a bacterial origin of replication, such as ColE1, and a copy of the intergenic region of the bacteriophage. The phagemid can be used with any known bacteriophage, including filamentous bacteriophages and lambdoid bacteriophages. The plasmid also usually contains a selection marker for antibiotic resistance. DNA segments cloned into these vectors can be transmitted as plasmids. When the cells containing these vectors are supplied with all the genes necessary for the production of phage particles, the method of plasmid replication is changed to roll ring replication to obtain copies of one strand of plasmid DNA and package phage particles. Phagemids can form infectious and non-infectious phage particles. This term refers to phagmids that contain the gene for the phage coat protein or its fragment associated with the gene of the heterologous polypeptide so that, as a result of gene fusion, the heterologous polypeptide is displayed on the surface of the phage particle.
Термин «фаговый вектор» обозначает двухцепочечную репликационную форму бактериофага, содержащую гетерологичный ген и способную реплицироваться. Фаговый вектор имеет фаговую точку инициации репликации, позволяющую репликацию фага и образование фаговой частицы. Фаг предпочтительно является нитевидным бактериофагом, таким как М13, fl, fd, фагом Pf3 или их производным, или лямбдоидным фагом, таким как лямбда, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, и т.д., или их производным.The term “phage vector” means a double-stranded replication form of a bacteriophage containing a heterologous gene and capable of replicating. The phage vector has a phage replication initiation point, allowing phage replication and the formation of a phage particle. The phage is preferably a filamentous bacteriophage such as M13, fl, fd, Pf3 phage or a derivative thereof, or a lambdoid phage such as lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc., or a derivative thereof.
Ковалентные модификации полипептидов, такие как пептитела, иммуноадгезины, антитела и короткие пептиды, включены в область действия данного изобретения. Один способ ковалентной модификации включает проведение реакции целевых аминокислотных остатков полипептида с органическим модифицирующим реактивом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или с N- или С-концевыми остатками полипептида. Модификация бифункциональными реактивами полезна, например, для создания поперечных сшивок полипептида с водонерастворимой поддерживающей матрицей или поверхностью для применения в способе очистки антител, и наоборот. Обычно используемые сшивающие реагенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, эфиры N-гидроксисукцинимида, например, эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные имидоэфиры, включая дисукцинимидиловые эфиры, такие как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), бифункциональные малемиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан, и реагенты, такие как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат.Covalent modifications of the polypeptides, such as peptibodies, immunoadhesins, antibodies and short peptides, are included within the scope of this invention. One covalent modification method involves reacting the desired amino acid residues of the polypeptide with an organic modifying reagent that is capable of reacting with selected side chains or with the N- or C-terminal residues of the polypeptide. Modification with bifunctional reagents is useful, for example, to create cross-linking of a polypeptide with a water-insoluble support matrix or surface for use in the method of purification of antibodies, and vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters, for example, 4-azidosalicylic acid esters, homobifunctional imido esters, including disuccinimidyl esters, such as 3.3 ' -dithiobis (succinimidyl propionate), bifunctional maleides, such as bis-N-maleimido-1,8-octane, and reagents such as methyl-3 - [(p-azidophenyl) dithio] propioimidate.
Другие модификации включают деамидирование глутаминиловых и аспарагиниловых остатков до соответствующих глутамиловых и аспартиловых остатков, соответственно, гидроксилации пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп сериловых или треониловых остатков, метилирование α-аминогрупп лизиновых, аргининовых и гистидиновых боковых цепей [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], ацетилирование N-концевого амина, амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.Other modifications include the deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, respectively, of hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of hydroxyl groups of seryl or threonyl residues, methylation of the α-amino groups of lysine, arginine and histidine side chains [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetylation of an N-terminal amine, amidation of any C-terminal carboxyl group.
Другие модификации включают конъюгацию с антагонистами токсинов, таких как майтанзин и майтанзиноиды, калихеамицин и другие цитотоксические вещества.Other modifications include conjugation with toxin antagonists such as maytansine and maytansinoids, calicheamicin and other cytotoxic substances.
Другой тип ковалентной модификации полипептидов включает связывание полипептида с одним или с разнообразными непротеиновыми полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилены, способом, изложенным в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 или 4179337.Another type of covalent modification of the polypeptides includes the binding of the polypeptide to one or a variety of non-protein polymers such as polyethylene glycol (PEG), polypropylene glycol or polyoxyalkylene, according to the method described in US patent No. 4640835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337.
Полипептид в соответствии с представленным изобретением может также быть модифицирован, если это принесет пользу, таким образом, чтобы формировать химерную молекулу, включающую полипептид, слитый с другим, гетерологичным полипептидом или аминокислотной последовательностью (например, иммуноадгезины или пептитела).The polypeptide in accordance with the present invention can also be modified, if this is beneficial, so as to form a chimeric molecule comprising a polypeptide fused to another, heterologous polypeptide or amino acid sequence (for example, immunoadhesins or peptibodies).
В одном варианте осуществления, подобные химерные молекулы включают полипептид, слитый с доменом трансдукции белка, который нацеливает полипептид на доставку в различные ткани, а более конкретно через гематоэнцефалический барьер, с применением, например, домена трансдукции белка TAT вируса иммунодефицита человека (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72).In one embodiment, such chimeric molecules include a polypeptide fused to a protein transduction domain that targets the polypeptide to be delivered to various tissues, and more particularly through the blood-brain barrier, using, for example, the transduction domain of the human immunodeficiency virus TAT protein (Schwarze et al. 1999, Science 285: 1569-72).
В другом варианте осуществления, такая химерная молекула включает полипептид, слитый с полипептидом-меткой, который обеспечивает эпитоп, с которым могут селективно связываться антитела против метки. Эпитоп-метка обычно располагается на амино- или карбоксильном конце полипептида. Присутствие подобных помеченных эпитопом форм полипептида может быть обнаружено с применением антител против полипептида-метки. Также присутствие эпитопа-метки позволяет легко очищать полипептид способом аффинной очистки с применением антитела против метки или другого типа аффинной матрицы, которая связывает метку-эпитоп. В уровне техники известны различные полипептиды-метки и соответствующие им антитела. Примеры включают метки поли-гистидин (poly-His) или поли-гистидин-глицин (poly-His-gly); полипептидную метку flu HA и ее антитело 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; метку c-myc и антитела к ней 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 и 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology. 5:3610-3616 (1985)]; метку гликопротеина D вируса простого герпеса (gD) и антитела к нему [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Другие полипептиды-метки включают пептид Flag [Hopp et al., BioTechnology. 6:1204-1210 (1988)]; пептид эпитопа КТ3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид эпитопа α-тубулина [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; и пептидную метку гена белка 10 Т7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6393-6397 (1990)].In another embodiment, such a chimeric molecule comprises a polypeptide fused to a tag polypeptide that provides an epitope to which anti-tag antibodies can selectively bind. The epitope tag is usually located at the amino or carboxyl end of the polypeptide. The presence of such epitope-labeled forms of the polypeptide can be detected using antibodies against the tag polypeptide. Also, the presence of an epitope tag allows the polypeptide to be easily purified by affinity purification using an anti-tag antibody or another type of affinity matrix that binds the tag-epitope. Various label polypeptides and their corresponding antibodies are known in the art. Examples include poly-histidine (poly-His) or poly-histidine-glycine (poly-His-gly) labels; the flu HA polypeptide label and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; the c-myc label and its antibodies 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7, and 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology. 5: 3610-3616 (1985)]; herpes simplex virus glycoprotein D (gD) label and antibodies thereto [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Other tag polypeptides include the Flag peptide [Hopp et al., BioTechnology. 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitope peptide [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; α-tubulin epitope peptide [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; and peptide tag of the 10 T7 protein gene [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6393-6397 (1990)].
В альтернативном варианте осуществления, химерная молекула может включать полипептид, слитый с иммуноглобулином или определенным участком иммуноглобулина. Для бивалентной формы химерной молекулы (например, «иммуноадгезина») подобное слияние может быть проведено с участком Fc молекулы IgG. Слитные Ig согласно данному изобретению включают полипептиды, которые включают приблизительно или только остатки 94-243, остатки 33-53, или остатки 33-52 от человека вместо по меньшей мере одного вариабельного участка в молекуле Ig. В особо предпочтительном варианте осуществления, слитный иммуноглобулин включает шарнирный участок и участки CH2 и CH3 или шарнирный участок и участки CH1, CH2 и CH3 молекулы IgG1. Получение слитных иммуноглобулинов также описано в патенте США № 5428130, от 27 июня 1995 г.In an alternative embodiment, the chimeric molecule may comprise a polypeptide fused to an immunoglobulin or a specific portion of an immunoglobulin. For a bivalent form of a chimeric molecule (for example, “immunoadhesin”), a similar fusion can be performed with the Fc region of an IgG molecule. Fusion Igs of the present invention include polypeptides that comprise approximately or only residues 94-243, residues 33-53, or residues 33-52 from a human, instead of at least one variable region in the Ig molecule. In a particularly preferred embodiment, the fusion immunoglobulin comprises a hinge region and CH2 and CH3 regions, or a hinge region and CH1, CH2, and CH3 regions of an IgG1 molecule. The preparation of fusion immunoglobulins is also described in US Pat. No. 5,428,130, June 27, 1995.
Изобретение предлагает способы и композиции для ингибирования или предотвращения рецидивов роста опухолей или рецидивов роста раковых клеток. В различных вариантах осуществления, рак представляет собой рецидив роста опухолей или рецидив роста раковых клеток в случае, если количество раковых клеток заметно не уменьшилось, или увеличилось, или размер опухоли значительно не уменьшился, или увеличился, или оказываются неудачными попытки дальнейшего уменьшения размера или числа раковых клеток. Определение, являются ли раковые клетки рецидивом роста опухоли или рецидивом роста раковых клеток, проводится in vivo или in vitro любым способом для оценки эффективности воздействия на раковые клетки, известным в области техники. Опухоль, устойчивая к лечению против VEGF, является примером рецидива роста опухоли.The invention provides methods and compositions for inhibiting or preventing relapse of tumor growth or relapse of cancer cell growth. In various embodiments, the cancer is a relapse of the growth of tumors or a relapse of the growth of cancer cells if the number of cancer cells has not markedly decreased, or increased, or the size of the tumor has not significantly decreased, or increased, or attempts to further reduce the size or number of cancer are unsuccessful. cells. The determination of whether the cancer cells are a relapse of the tumor growth or a relapse of the growth of the cancer cells is carried out in vivo or in vitro by any method for evaluating the effectiveness of the effect on cancer cells known in the art. A tumor resistant to treatment against VEGF is an example of a recurrence of tumor growth.
«Эффективное количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции, описанной здесь, соответствует количеству, достаточному для выполнения определенного заявленного назначения. «Эффективное количество» может быть определено эмпирически и при помощи известных способов, относящихся к заявленному назначению.An “effective amount” of a polypeptide, antibody, antagonist, or composition described herein corresponds to an amount sufficient to fulfill a specific stated purpose. An “effective amount” can be determined empirically and using known methods related to the declared purpose.
Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела, полипептида или антагониста согласно данному изобретению, эффективному для «лечения» заболевания или расстройства у млекопитающего (то есть пациента). В случае рака, терапевтически эффективное количество препарата может уменьшать количество раковых клеток; уменьшать размер или вес опухоли; подавлять (т.е. замедлять до некоторой степени или, предпочтительно, останавливать) инфильтрацию рака в периферийные органы; подавлять (т.е. замедлять до некоторой степени или, предпочтительно, останавливать) метастазы опухоли; подавлять, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком. Для того чтобы препарат мог предотвращать рост и/или убивать существующие раковые клетки, он должен быть цитостатическим и/или цитотоксическим. В одном варианте осуществления терапевтически эффективное количество является количеством, подавляющим рост. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество является количеством, которое улучшает выживание пациента без прогрессирования. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество является количеством, которое продлевает срок жизни пациента.The term “therapeutically effective amount” refers to an amount of an antibody, polypeptide or antagonist according to this invention, effective for “treating” a disease or disorder in a mammal (ie, patient). In the case of cancer, a therapeutically effective amount of the drug can reduce the number of cancer cells; reduce the size or weight of the tumor; suppress (i.e. slow down to some extent or, preferably, stop) cancer infiltration into peripheral organs; suppress (i.e. slow down to some extent, or preferably stop) tumor metastases; suppress, to some extent, tumor growth; and / or alleviate to some extent one or more symptoms associated with cancer. In order for the drug to prevent the growth and / or kill existing cancer cells, it must be cytostatic and / or cytotoxic. In one embodiment, the therapeutically effective amount is an amount that inhibits growth. In another embodiment, the therapeutically effective amount is an amount that improves progression-free patient survival. In another embodiment, the therapeutically effective amount is an amount that extends the life of the patient.
В случае лечения ран термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству препарата, эффективному для ускорения или улучшения заживления ран у субъекта. Терапевтическая доза представляет собой дозу, которая демонстрирует терапевтический эффект на пациенте, а субтерапевтическая доза представляет собой дозу, не демонстрирующую терапевтического эффекта на пациенте, подвергающемся лечению.In the case of treatment of wounds, the term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to an amount of a drug effective to accelerate or improve wound healing in a subject. A therapeutic dose is a dose that demonstrates a therapeutic effect on a patient, and a subtherapeutic dose is a dose that does not demonstrate a therapeutic effect on a patient being treated.
Термин «хроническая рана» относится к ране, которая не заживает. См., например, Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994). Хронические раны включают, но не ограничены, например, артериальными язвами, диабетическими язвами, пролежнями, трофическими язвами и т.д. Острая рана может развиться в хроническую рану. Острые раны включают, но не ограничены, ранами, вызванными, например, термическими повреждениями, травмами, хирургией, удалением экстенсивного рака кожи, глубокими грибковыми и бактериальными инфекциями, васкулитами, склеродермией, пемфигоидом, токсическим некрозом эпителия и т.д. См., например, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, опубликовано: 24 октября 2001. Термин «обычная рана» относится к ране, которая подвергается обычному заживлению ран.The term "chronic wound" refers to a wound that does not heal. See, for example, Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130: 489-93 (1994). Chronic wounds include, but are not limited to, for example, arterial ulcers, diabetic ulcers, pressure sores, trophic ulcers, etc. An acute wound can develop into a chronic wound. Acute wounds include, but are not limited to, wounds caused, for example, by thermal damage, trauma, surgery, removal of extensive skin cancer, deep fungal and bacterial infections, vasculitis, scleroderma, pemphigoid, toxic epithelial necrosis, etc. See, for example, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, HealingWell.com, published: October 24, 2001. The term “conventional wound” refers to a wound that undergoes conventional wound healing.
Термин «ингибирующее рост количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции согласно данному изобретению обозначает количество, способное подавлять рост клеток, особенно опухолевых, например, раковых клеток, как in vitro, так и in vivo. Ингибирующее рост количество полипептида, антитела, антагониста или композиции согласно данному изобретению для ингибирования роста неопластических клеток может быть определено эмпирически или известными способами, или как в приведенных здесь примерах.The term "growth inhibitory amount" of a polypeptide, antibody, antagonist or composition according to this invention refers to an amount capable of inhibiting the growth of cells, especially tumor, for example cancer cells, both in vitro and in vivo. A growth inhibitory amount of a polypeptide, antibody, antagonist, or composition of this invention for inhibiting the growth of neoplastic cells can be determined empirically or by known methods, or as in the examples given here.
Термин «цитотоксическое количество» полипептида, антитела, антагониста или композиции согласно данному изобретению обозначает количество, способное вызывать разрушение клеток, в особенности опухолевых, например раковых клеток, как in vitro, так и in vivo. Цитотоксическое количество полипептида, антитела, антагониста или композиции согласно данному изобретению для ингибирования роста неопластических клеток может быть определено эмпирически или известными в области техники способами.The term "cytotoxic amount" of a polypeptide, antibody, antagonist or composition according to this invention refers to an amount capable of causing destruction of cells, especially tumor, for example cancer cells, both in vitro and in vivo. The cytotoxic amount of a polypeptide, antibody, antagonist or composition according to this invention for inhibiting the growth of neoplastic cells can be determined empirically or by methods known in the art.
Термин «аутоиммунное заболевание» здесь означает заболевание или расстройство, имеющее происхождение от собственных тканей индивидуума и направленное против них же или их совместное проявление или симптомы, а также возникающее из-за этого состояние. Примеры аутоиммунных заболеваний или расстройств включают, но не ограничены артритами (ревматоидный артрит, таким как острый артрит, хронический ревматоидный артрит, подагрический артрит, острый подагрический артрит, хронический воспалительный артрит, дегенеративный артрит, инфекционный артрит, артрит Лайма, пролиферативный артрит, псориатический артрит, артрит позвоночника, и юношеский ревматоидный артрит, остеоартрит, ревматоидный артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит, реактивный артрит, и анкилозирующий спондилит), воспалительными гиперпролиферативными болезнями кожи, псориазом, таким как пятнистый псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, дерматитом, включая контактный дерматит, хронический контактный дерматит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, герпетиформный дерматит, и атопический дерматит, связанным с Х-хромосомой синдромом повышенного IgM, крапивницей, такой как хроническая идиопатическая крапивница, включая хроническую аутоиммунную крапивницу, полимиозитом/дерматомиозитом, юношеским дерматомиозитом, токсическим некрозом эпидермиса, склеродермией (включая системную склеродермию), склерозом, таким как системный склероз, рассеянным склерозом (MS), таким как спино-оптический MS, первичный прогрессирующий MS, и MS ремиттирующего течения, прогрессирующий системный склероз, атеросклероз, артериосклероз, болезнь Шарко-Вульпиана, и атактический склероз, воспалительным заболеванием кишечника (IBD) (например, болезнь Крона, колиты, такие как язвенный колит, микроскопический колит, коллагенозный колит, полипозный колит, некротизирующий энтероколит, и трансмуральный колит и аутоиммунные воспалительные заболевания кишечника), гангренозной пиодермией, узловатой эритемой, первичным склерозирующим холангитом, эписклеритом, синдромом дыхательной недостаточности, синдромом расстройства дыхания у взрослых или острым синдром дыхательной недостаточности (ARDS), менингитом, воспалением любого участка сосудистой оболочки глазного яблока, иритом, хороидитом, и аутоиммунным гематологическим расстройством, ревматоидным спондилитом, внезапной потерей слуха, опосредованными IgE заболеваниями, такими как анафилактический, аллергический и атопический риниты, энцефалитами, такими как энцефалит Рамуссена и лимбические энцефалиты и/или энцефалиты ствола мозга, увеитами, такие как передний увеит, острым передний увеит, гранулематозный увеит, негранулематозный увеит, факоантигенный увеит, задний увеит, или аутоиммунный увеит, гломерулонефритом (GN) с нефротическим синдромом или без него, таким как хронический или острый гломерулонефрит, такой как первичный GN, иммуноопосредованый GN, мембранный GN (мембранная нефропатия), идиопатический мембранный GN, мембранный пролиферативный GN (MPGN), включая тип I и тип II, и быстрый прогрессирующий GN, аллергическими состояниями, аллергическими реакциями, экземой, включая аллергическую или атопическую экзему, астмой, такой как бронхиальная астма, и аутоиммунная астма, состояниями, вовлекающими инфильтрацию Т-клеток и хроническими воспалительными ответами, хроническими легочными воспалительными болезнями, аутоиммунными миокардитами, недостаточностью адгезии лимфоцитов, системной красной волчанкой (SLE) или системными красными волчанками, такими как кожная SLE, подострая системная красная волчанка, красная волчанка новорожденных (NLE), распределенная красная волчанка, волчанка (включая нефритную, энцефалитную, педиатрическую, непочечную, дискоидную, алопецическую), юношеским сахарным диабетом (тип I), сахарным диабетом, включая педиатрический инсулин-зависимый сахарный диабет (IDDM), сахарный диабет взрослых (диабет II типа), аутоиммунные диабеты, идиопатический несахарный диабет; иммунными ответами, связанными с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредованными цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулезом, саркоидозом, грануломатозом, включая лимфоматоидный грануломатоз, грануломатоз Вегнера, агранулоцитоз, васкулитидами, включая васкулиты (включая ревматическую полимиаглию и гигантоклеточные артериты (артериты Такаяшу), васкулитами средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и нодозный полиартрит), микроскопическим полиартритом, васкулитами ЦНС, некротизирующими, кожными или аллергическими васкулитами, системными некротизирующими васкулитами, и ANCA-ассоциированными васкулитами, такими как васкулит или синдром Чурга-Штраусса (CSS), временным артритом, апластической анемией, аутоиммунной апластической анемией, положительной анемией Кумба аутоиммунная гемолятическая анемия с неполными тепловыми агглютининами, анемией Даймонда-Блекфена, гемолитической анемией или иммунной гемолитической анемией, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную анемию, болезнь Аддисона, истинную эритроцитарную анемию или аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболеваниями, вовлекающими диапедез лейкоцитов, воспалительными расстройствами ЦНС, синдромами повреждения множественных органов, такими как вторичные после сепсиса, травмы или кровотечения, заболеваниями, опосредованными комплексом антиген-антитело, заболевание базальной мембраны клубочков, синдром противофосфолипидных антител, аллергическими невритами, болезнью Бечета и Бехчета, синдромом Кастлмана, синдромом Гудпастера, синдромом Рейно, синдромом Шегрена, синдромом Стивенса-Джонсона, пемфигоидом, таким как буллезным пемфигоид и пемфигоид кожи, пузырчаткой (включая обыкновенную пузырчатку, листовидную пузырчатку, пемфигоид слизистых оболочек и эритематозную пузырчатку), аутоиммунными полиэндокринопатиями, болезнью или синдромом Рейтера, иммунокомплексными нефритами, опосредованными антителами нефритами, хронической нейропатией, такой как нейропатии IgM или IgM-опосредованные нейропатии, тромбоцитопенией (развивающейся, например, у пациентов с инфарктом миокарда), включая тромбоцитопеническую тромбогемолитическую пурпуру (TTP) и аутоиммуную или иммуно-опосредованную тромбоцитопению, такую как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP), включая хроническую или острую ITP, аутоиммунным заболеванием семенников и яичников, включая аутоиммунные орхиты и оофориты, первичным гипотиреозом, гипопаратиреоидизмом, аутоиммунными эндокринными заболеваниями, включая тиреоидиты, такие как аутоиммунный тиреоидит, болезнь Хашимото, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), или подострым тиреоидит, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, идиопатический гипотиреоидизм, болезнь Грейва, полигранулярными синдромами, такими как аутоиммунные полигранулярные синдромы (или полигранулярные эндокринопатические синдромы), паранеопластическими синдромами, включая нейрологические нейропластические синдромы, такие как миастенический синдром Ламберта-Итона или синдром Итона-Ламберта, синдром «жесткого человека» или «жесткой персоны», энцефаломиелитами, такими как аллергический энцефаломиелит или encephalomyelitis allergica и экспериментаьные аллергические энцефаломиелиты (EAE), злокачественной миастенией, дегенерацией мозжечка, нейромиотонией, опсоклонусом или опсоклоническим миоклоническим синдромом (OMS), и сенсорной нейропатией, синдромом Шихана, аутоиммунным гепатитом, хроническим гепатитом, люпозным гепатитом, гигантоклеточным гепатитом, хроническим активным гепатитом или аутоиммунным хроническим активным гепатитом, лимфоидным промежуточным пневмонитом, облитерирующим бронхиоитом (не трансплантационным) или НВП (неспецифической промежуточной пневмонией), синдромом Гийена-Барре, болезнью Бергера (нефропатией IgA), идиопатической нейропатией IgA, линейным дерматозом IgA, первичным желчным циррозом, пневмоциррозом, аутоиммунным энтеропатическим синдромом, глютеновой болезнью, целиакией, брюшным спру (глютеновой энтеропатией), рефракторным спру, идиопатическим спру, криоглобулинемией, амилотрофическим латеральным склерозом (ALS, болезнь Лу Герига), коронарной болезнью сердца, аутоиммунным заболеванием внутреннего уха (AIED), или аутоиммунной потерей слуха, опсоклоническим миоклоническим синдромом (OMS), полихондритами, такими как рефракторный или рецидивический полихондрит, легочным альвеолярным протеинозом, амилоидозом, склеритом, не-раковым лимфоцитозом, первичным лимфоцитозом, включая моноклональный В-клеточным лимфоцитоз (например, доброкачественную моноклональную гаммопатию и моноклональную гаммопатию неясного значения MGUS) периферической нейропатией, паранеопластическим синдромом, каналопатиями, такими как эпилепсия, мигрень, аритмия, мышечные расстройства, глухота, слепота, периодический паралич и каналопатиями ЦНС, аутизмом, воспалительной миопатией, фокальным сегментальным гломерулосклерозом (FSGS), эндокринной офтальмопатией, увеоретинитом, хориоретинитом, аутоиммунным гепатологическим расстройством, фибромиалгией, множественной эндокринной недостаточностью, синдромом Шмидта, адреналитом, желудочной атрофией, возрастным слабоумием, демиелинирующими заболеваниями, такими как аутоиммунные демиелинирующие заболевания, диабетическая нефропатия, синдром Дресслера, очаговая алопеция, синдром CREST (кальциноз, феномен Рейнальда, нарушение моторики пищевода, склеродактилия и телеангиэктазия), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, смешанный коллагеноз, болезнь Чагаса, ревматическая лихорадка, повторяющийся выкидыш, «легкие фермера», экссудативная многоформная эритема, пост-кардиотомический синдром, синдром Кушинга, легочная аллергия птицеводов, аллергический грануломатозный ангиит, доброкачественным лимфотический ангиит, синдром Альпорта, альвеолитами, такими как аллергический альвеолит и фиброзирующий альвеолит, интерстициальная болезнь легких, трансфузионная реакция, проказой, малярией, лейшманиозом, кипаносомиазом, шистосомиазом, аскаридиазом, аспергиллезом, синдромом Самптера, синдромом Каплана, денге, эндокардитом, эндомиокардиальным фиброзом, легочным фиброзирующим альвеолитом, интерстрциальным фиброзом легких, идиопатическим легочным фиброзом, цистическим фиброзом, эндофтальмитом, эритема elevatum et diutinum, врожденной анемией новорожденных, эозинофильным фасцитом, синдромом Шульмана, синдромом Фелти, филяриозом, циклитом, таким как хронический циклит, гетерологический циклит, иридоциклит или циклит Фукса, пурпура Геноха-Шейнена, заражением вирусом иммунодефицита человека (HIV), заражением эховирусом, кардиомиопатией, болезнью Альцгеймера, заражением парвовирусом, заражением вирусом краснухи, пост-вакцинационными синдромами, врожденным заражением краснухой, заражением вирусом Эпштейна-Барра, свинкой, синдромом Эвана, аутоиммунной недостаточностью половых желез, хореей Сиденхама, пост-стрептококковыми нефритами, облитерирующим тромбоангитом, тиротоксикозом, сухоткой спинного мозга, хориоретинитом, гигантоклеточной полимиаглией, эндокринной офтальмопатией, хроническим аллергическим пневмонитом, сухим кератоконъюктивитом, эпидемическим кератоконъюктивитом, идиопатическим нефритическим синдромом, нефропатии с минимальными изменениями, доброкачественным семейным и ишемическим реперфузионным повреждением, аутоиммунными пораженями сетчатки, воспалением суставов, бронхитами, хронической непроходимостью дыхательных путей, силикозом, молочницей, афтозным стоматитом, артериосклеротическими расстройствами, аспергимиогенезом, аутоиммунным гемолизом, болезнью Бека, криоглобулинемией, контрактурой Дюпюитрена, факоанафилактической эндоофтальмией, аллергическим энтеритом, II типом лепроматозной реакции, идиопатическим лицевым параличом, синдромом хронической усталости, ревматической лихорадкой, болезнью Хаммена-Рича, сенсонейральной потерей слуха, параксизматической гомоглобиноурией, гипогонадизмом, региональным илеитом, лейкопенией, инфекционным мононуклеозом, поперечным миелитом, первичной идиопатической микседемой, нефрозом, симпатической офтальмией, гранулематозным орхитом, панкреатитом, острым полирадикулоневритом, гангренозная пиодермией, подострым тиреоидитом, приобретенной спенической атрофией, бесплодностью по причине наличия антител против сперматозоидов, не-злокачественной тимомой, витилиго, болезнями, связанными с вирусами SCID и Эпштейна-Барра, синдромом приобретенного иммунодефицита (AIDS), паразитическими заболеваниями, такими как лейшмания, синдромом токсического шока, пищевым отравлением, состояниями, вовлекающими инфильтрацию Т-клеток, недостаточностью адгезии лейкоцитов, иммунными ответами, связанными с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредованной цитокинами и Т-лимфоцитами, заболеваниями, вовлекающими диапедез лейкоцитов, синдромом травм множественных органов, заболеваниями, опосредованными комплексом антиген-антитело, заболеваниями основной антигломерулярной мембраны, аллергическими невритами, аутоиммунными полиэндокринопатиями, оофоритами, первичной микседаемой, аутоиммунными атропическими гастритами, симпатической офтальмией, ревматическими заболеваниями, смешанным коллагенозом, нефротическим синдромом, инсулитами, полиэндокринной недостаточностью, периферической нейропатией, аутоиммунным полигранулярным синдромом типа I, идеопатическим гипопаратиреоидизмом взрослых (AOIH), генерализованной аллопецией, дилатационной кардиомиопатией, приобретенный буллезный эпидермолиз (EBA), гемохроматозом, миокардитами, нефротическим синдромом, первичным склерозирующим холангитом, гнойными или негнойными синуситами, острыми или хроническими синуситами, эфимоидный, фронтальный, максиларный и офеноидный синуситы, связанными с эозинофилами расстройствами, такими как эозинофилия, легочная инфильтрационная эозинофилия, синдром эозинофилии-миалгии, синдром Леффлера, хроническая эозинофильная пневмония, тропическая легочная эозинофилия, бронхолегочный аспергиллез, аспергиллома или синдром Кимуры, анафилоксия, серонегативный спондилоартрит, полиэндокринное аутоиммунное заболевание, склерозирующий холангит, склера, эписклера, хронический кожно-слизистым кандидоз, синдром Брутона, временная младенческая гипогаммаглобулинемия, синдром Вискотта-Олдрича, атаксия-телангиэктазия, аутоиммунными расстройствами, связанными с коллагенозом, ревматизмом, нейрологическими заболеваниями, ишемическим реперфузионное расстройством, ответом на понижение кровяного давления, сосудистой дисфункции, ангиэктазии, ранением тканей, сердечнососудистой ишемией, гипералгезией, мозговой ишемией, и болезнями, сопутствующими васкуляризацией, аллергической гиперчувствительностью, гломерулонефритами, реперфузионными повреждениями, реперфузионными повреждениями миокарда или иных тканей, дерматозами с острыми воспалительными компонентами, острыми гнойными менингитами или иными воспалительными расстройствами центральной нервной системы, синдромами, связанными с переливанием гранулоцитов, индуцируемой цитокинами токсичностью, серьезными острыми воспалениями, хроническими трудноизлечимыми воспалениями, пиелитами, пневмоциррозом, диабетической ретинопатией, диабетическим расстройством крупных артерий, внутриартериальной гиперплазией, язвой желудка и двенадцатиперстной кишки, вальвулитом и эндометриозом.The term "autoimmune disease" here means a disease or disorder originating from the individual tissues of the individual and directed against them or their joint manifestation or symptoms, as well as the resulting condition. Examples of autoimmune diseases or disorders include, but are not limited to arthritis (rheumatoid arthritis such as acute arthritis, chronic rheumatoid arthritis, gouty arthritis, acute gouty arthritis, chronic inflammatory arthritis, degenerative arthritis, infectious arthritis, Lyme arthritis, proliferative arthritis, psoriatic arthritis, psoriatic arthritis spinal arthritis, and juvenile rheumatoid arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, deforming arthritis, primary chronic polyarthritis, reactive arthritis, and ankylosing pondylitis), inflammatory hyperproliferative skin diseases, psoriasis such as spotted psoriasis, teardrop psoriasis, pustular psoriasis and nail psoriasis, dermatitis, including contact dermatitis, chronic contact dermatitis, allergic dermatitis, allergic contact dermatitis, herpetiform dermatitis, associated dermatitis, associated dermatitis, dermatitis and associated dermatitis X chromosome syndrome of increased IgM, urticaria, such as chronic idiopathic urticaria, including chronic autoimmune urticaria, polymyositis / dermatomyositis, youth Oske dermatomyositis, toxic epidermal necrosis, scleroderma (including systemic scleroderma), sclerosis, such as systemic sclerosis, multiple sclerosis (MS), such as spinoptic MS, primary progressive MS, and remitting MS, progressive systemic sclerosis, atherosclerosis, atherosclerosis , Charcot-Vulpian disease, and atactic sclerosis, inflammatory bowel disease (IBD) (e.g., Crohn's disease, colitis such as ulcerative colitis, microscopic colitis, collagen colitis, polyposis colitis, necr tyrosing enterocolitis, and transmural colitis and autoimmune inflammatory bowel diseases), gangrenous pyoderma, erythema nodosum, primary sclerosing cholangitis, episiscleritis, respiratory distress syndrome, respiratory distress syndrome in adults or acute respiratory distress syndrome (ARDS), meningitis, inflammation eyeball, iritis, choroiditis, and autoimmune hematologic disorder, rheumatoid spondylitis, sudden hearing loss, mediation IgE diseases such as anaphylactic, allergic and atopic rhinitis, encephalitis, such as Ramussen's encephalitis and limbic encephalitis and / or brain stem encephalitis, uveitis, such as anterior uveitis, acute anterior uveitis, granulomatous uveitis, non-granulomatous uveitis, uveitis, or autoimmune uveitis, with glomerulonephritis (GN) with or without nephrotic syndrome, such as chronic or acute glomerulonephritis, such as primary GN, immuno-mediated GN, membrane GN (non-membrane phropathy), idiopathic membrane GN, membrane proliferative GN (MPGN), including type I and type II, and fast progressive GN, allergic conditions, allergic reactions, eczema, including allergic or atopic eczema, asthma such as bronchial asthma, and autoimmune asthma , conditions involving T-cell infiltration and chronic inflammatory responses, chronic pulmonary inflammatory diseases, autoimmune myocarditis, lymphocyte adhesion failure, systemic lupus erythematosus (SLE) or syst many lupus erythematosus, such as cutaneous SLE, subacute systemic lupus erythematosus, newborn lupus erythematosus (NLE), distributed lupus erythematosus, lupus erythematosus (including nephritis, encephalitis, pediatric, nonrenal, discoid, alopecia), juvenile diabetes mellitus (type I), and diabetes mellitus diabetes, including pediatric insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), adult diabetes mellitus (type II diabetes), autoimmune diabetes, idiopathic diabetes insipidus; immune responses associated with immediate and delayed hypersensitivity, mediated by cytokines and T-lymphocytes, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, including lymphomatoid granulomatosis, Wegner’s granulomatosis, agranulocytosis, vasculitides, including vasculitis (rheumatic arteriomyocytes and arthritis) medium vessels (including Kawasaki disease and nodular polyarthritis), microscopic polyarthritis, central nervous system vasculitis, necrotizing, skin or allergic mi vasculitis, systemic necrotizing vasculitis, and ANCA-associated vasculitis, such as vasculitis or Churg-Strauss syndrome (CSS), transient arthritis, aplastic anemia, autoimmune aplastic anemia, positive Kumba anemia, autoimmune hemolytic anemia, and incomplete anemia hemolytic anemia or immune hemolytic anemia, including autoimmune hemolytic anemia (AIHA), pernicious anemia, Addison's disease, true red blood cell anemia, or apl Asia (PRCA), factor VIII deficiency, hemophilia A, autoimmune neutropenia, pancytopenia, leukopenia, diseases involving leukocyte diapedesis, inflammatory CNS disorders, multiple organ damage syndromes, such as secondary after sepsis, trauma or bleeding, antigen-mediated diseases antibody, glomerular basement membrane disease, antiphospholipid antibody syndrome, allergic neuritis, Becet and Behcet's disease, Castleman’s syndrome, Goodpaste’s syndrome, Rey’s syndrome o, Sjögren’s syndrome, Stevens-Johnson syndrome, pemphigoid such as bullous pemphigoid and pemphigoid skin, pemphigus (including pemphigus foliaceae, pemphigus pemphigus, mucous membrane pemphigoid and erythematous pemphigus fibrosis, nephroimmutociomas, neurologic fibroids, and nephritis, chronic neuropathy, such as IgM neuropathies or IgM-mediated neuropathies, thrombocytopenia (developing, for example, in patients with myocardial infarction), including thrombocytopenic thrombohemolytic purpura (TTP) and autoimmune or immuno-mediated thrombocytopenia, such as idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), including chronic or acute ITP, autoimmune disease of testes and ovaries, hypothyroid syndromes, and hypothyroid syndromes, including including thyroiditis, such as autoimmune thyroiditis, Hashimoto’s disease, chronic thyroiditis (Hashimoto’s thyroiditis), or subacute thyroiditis, autoim moon thyroid diseases, idiopathic hypothyroidism, Grave’s disease, polygranular syndromes such as autoimmune polygranular syndromes (or polygranular endocrinopathic syndromes), paraneoplastic syndromes, including neurological neuroplastic syndromes, such as Lambert-Eaton’s myasthenic syndrome, or Itast syndrome, human "or" harsh person ", encephalomyelitis, such as allergic encephalomyelitis or encephalomyelitis allergica and experimental allergies RP G encephalomyelitis (EAE), myasthenia gravis, a degeneration of the cerebellum, neyromiotoniey, opsoclonus or opsoklonicheskim myoclonic syndrome (OMS), and sensory neuropathy syndrome Sheehan, autoimmune hepatitis, chronic hepatitis, lyupoznym hepatitis, giant cell hepatitis, chronic active hepatitis or autoimmune chronic active hepatitis , lymphoid intermediate pneumonitis, obliterating bronchioitis (non-transplant) or NVP (non-specific intermediate pneumonia), Guillain-B syndrome arre, Berger’s disease (IgA nephropathy), IgA idiopathic neuropathy, IgA linear dermatosis, primary biliary cirrhosis, pneumocirrhosis, autoimmune enteropathic syndrome, celiac disease, celiac disease, abdominal sprue (celiac enteropathy), refractory cirrhosis, cirrhosis, refractory, cystic fibrosis, refractory, cystic fibrosis, refractory, cirrhosis, refractory, (ALS, Lou Gehrig's disease), coronary heart disease, autoimmune disease of the inner ear (AIED), or autoimmune hearing loss, opsoclonic myoclonic syndrome (OMS), polychondritis and, such as refractory or recurrent polychondritis, pulmonary alveolar proteinosis, amyloidosis, scleritis, non-cancerous lymphocytosis, primary lymphocytosis, including monoclonal B-cell lymphocytosis (for example, benign monoclonal gammopathy and monoclonal gamma neuropathy neuropathy, neoplastic neuropathy, neuroplasty, canalopathies such as epilepsy, migraine, arrhythmia, muscle disorders, deafness, blindness, periodic paralysis and CNS canalopathies, autism, inflammation myopathy, focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), endocrine ophthalmopathy, uveoretinitis, chorioretinitis, autoimmune hepatologic disorder, fibromyalgia, multiple endocrine insufficiency, such as nephrotic disease, adrenal gland disease, and diabetic disease Dressler’s syndrome, focal alopecia, CREST syndrome (calcification, Reynald’s phenomenon, violation of motility of the esophagus, sclerodact lia and telangiectasia), male and female autoimmune infertility, mixed collagenosis, Chagas disease, rheumatic fever, recurring miscarriage, "farmer's lungs", exudative erythema multiforme, post-cardiotomy syndrome, Cushing's syndrome, pulmonary pulmonary allergic allergy, benign pulmonary allergy, angiitis, Alport syndrome, alveolitis, such as allergic alveolitis and fibrosing alveolitis, interstitial lung disease, transfusion reaction, leprosy, malaria, lei shmaniozom, kipanosomiazom, schistosomiasis, askaridiazom, aspergillosis syndrome Sumpter, syndrome Kaplan, dengue, endocarditis, endomyocardial fibrosis, pulmonary fibrosing alveolitis interstrtsialnym pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, endophthalmitis, erythema elevatum et diutinum, congenital anemia of newborn, eosinophilic fasciitis, Schulman's syndrome, Felty's syndrome, filariasis, cyclitis, such as chronic cyclitis, heterologous cyclitis, iridocyclitis or Fuchs cyclitis, purpura Genoch a-Scheinen, infection with human immunodeficiency virus (HIV), infection with echovirus, cardiomyopathy, Alzheimer's disease, infection with parvovirus, infection with rubella virus, post-vaccination syndromes, congenital infection with rubella, infection with Epstein-Barr virus, mumps, and Emanoma syndrome glands, Sydenham chorea, post-streptococcal nephritis, thromboangitis obliterans, thyrotoxicosis, spinal cord dryness, chorioretinitis, giant cell polymyaglia, endocrine ophthalmos Opatija, chronic hypersensitivity pneumonitis, dry keratokonyuktivitom, epidemic keratokonyuktivitom, idiopathic nephritic syndrome, minimal-change nephropathy, benign familial and ischemia-reperfusion injury, autoimmune lesions of the retina, inflammation of joints, bronchitis, chronic obstructive airway diseases, silicosis, thrush, aphthous stomatitis, arteriosclerotic disorders, aspergimiogenesis, autoimmune hemolysis, Beck's disease, cryoglobulin ile, Dupuytren's contracture, phacoanaphylactic endoophthalmia, allergic enteritis, type II lepromatous reaction, idiopathic facial paralysis, chronic fatigue syndrome, rheumatic fever, Hammen-Rich disease, sensorineural hemorrhage, paraxinemia pulmonary gonorrhea, hypoxic leukemia, hypoxic leukemia, hypoxic leukemia, hypoxic leukemia, hypoxic leukemia myelitis, primary idiopathic myxedema, nephrosis, sympathetic ophthalmia, granulomatous orchitis, pancreatitis, acute polyrad iculoneuritis, gangrenous pyoderma, subacute thyroiditis, acquired spenic atrophy, sterility due to the presence of antibodies against sperm, non-malignant thymoma, vitiligo, diseases associated with SCID and Epstein-Barr viruses, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), para Leishmania, toxic shock syndrome, food poisoning, conditions involving T-cell infiltration, leukocyte adhesion deficiency, immune responses associated with hypersensitivity an immediate and delayed type, mediated by cytokines and T-lymphocytes, diseases involving leukocyte diapedesis, multiple organ trauma syndrome, diseases mediated by the antigen-antibody complex, diseases of the main antglomerular membrane, allergic neuritis, autoimmune polyendocrinopathic, mycophoriomatous, mycophoriomatous, myoforimouropory, gastritis, sympathetic ophthalmia, rheumatic diseases, mixed collagenosis, nephrotic syndrome, ins lithi, polyendocrine insufficiency, peripheral neuropathy, autoimmune polygranular type I syndrome, ideopathic hypoparathyroidism of adults (AOIH), generalized allopecia, dilated cardiomyopathy, acquired bullous epidermolysis, hemochromatosis, nephritic fibrosis, myocardiomyositis, myocardiomyositis, myocarditis, myocarditis acute or chronic sinusitis, epimoid, frontal, maxillary and ofenoid sinusitis associated with eosinophilic disorders and, such as eosinophilia, pulmonary infiltration eosinophilia, eosinophilia-myalgia syndrome, Leffler’s syndrome, chronic eosinophilia pneumonia, tropical pulmonary eosinophilia, bronchopulmonary aspergillosis, aspergilloma or Kimura’s syndrome, anaphyloxia, seronegative spondylorromatosis, scleral dermatitis, polyenditis, polyenditis, and chronic mucocutaneous candidiasis, Bruton's syndrome, temporary infant hypogammaglobulinemia, Wiskott-Aldrich syndrome, ataxia-telangiectasia, autoimmu disorders associated with collagenosis, rheumatism, neurological diseases, ischemic reperfusion disorder, a response to lowering blood pressure, vascular dysfunction, angiectasia, tissue injury, cardiovascular ischemia, hyperalgesia, cerebral ischemia, and concomitant vascular hypertrophy, vascular hyperflammation injuries, reperfusion injuries of the myocardium or other tissues, dermatoses with acute inflammatory components, acute purulent meningitis or other inflammatory disorders of the central nervous system, syndromes associated with transfusion of granulocytes, toxicity induced by cytokines, severe acute inflammations, chronic intractable inflammations, pyelitis, pneumocirrhosis, diabetic retinopathy of the large intestine arteriosis, hypertension , valvulitis and endometriosis.
Способы лечения рака могут быть оценены по показателям, например, регрессии опухоли, уменьшению веса или размера опухоли, времени прогрессирования, времени выживания, выживанию без прогрессирования, общему показателю ответа, продолжительности ответа, качества жизни, экспрессии и/или активности белка, но не ограничиваясь этими показателями. Поскольку анти-ангиогенные препараты, описанные здесь, нацелены на сосуды опухоли, а не обязательно на сами неопластические клетки, они представляют собой уникальный класс противораковых препаратов и, таким образом, требуют уникальных критериев и определений клинических ответов на препараты. Например, уменьшение опухоли более чем на 50% при 2-мерном анализе является стандартным граничным значением для подтверждения ответа. Однако антагонисты альфа5бета1 и антагонисты VEGF по изобретению могут вызывать подавление распространения метастаз без уменьшения первичной опухоли или могут просто вызывать опухолестатический эффект. Соответственно, могут быть применены подходы к определению эффективности терапии, включая, например, измерение маркеров ангиогенеза в плазме или моче и измерение ответа методом радиологической визуализации.Methods of treating cancer can be evaluated by, for example, tumor regression, reduction in tumor weight or size, progression time, survival time, progression-free survival, overall response rate, response duration, quality of life, expression and / or protein activity, but not limited to these indicators. Since the anti-angiogenic drugs described here are aimed at the vessels of the tumor, and not necessarily at the neoplastic cells themselves, they represent a unique class of anticancer drugs and, therefore, require unique criteria and definitions of clinical responses to the drugs. For example, tumor reduction of more than 50% in a 2-dimensional analysis is the standard boundary value for confirming the response. However, alpha5beta1 antagonists and the VEGF antagonists of the invention can cause inhibition of the spread of metastases without reducing the primary tumor, or can simply cause a tumorigenic effect. Accordingly, approaches can be applied to determine the effectiveness of therapy, including, for example, measuring markers of angiogenesis in plasma or urine and measuring response by radiological imaging.
В зависимости от показаний для лечения и факторов, имеющих значение для дозировки, с которыми медик-специалист в этой области должен быть знаком, антитела по изобретению будут введены в дозировке, являющейся эффективной для лечения симптомов при одновременной минимизации токсичности и побочных эффектов. Для лечения рака, аутоиммунного заболевания или иммунодефицитного заболевания терапевтически эффективная доза может находиться, например, в диапазоне от 50 мг на дозу до 2,5 г/м2. В одном варианте осуществления вводились дозировки от приблизительно 250 мг/м2 до приблизительно 400 мг/м2 или 500 мг/м2. В другом варианте осуществления, дозировка составляет приблизительно 250-375 мг/м2. В еще одном варианте осуществления диапазон дозировок 275-375 мг/м2.Depending on the indications for treatment and the factors relevant to the dosage that a medical professional in this field should be familiar with, the antibodies of the invention will be administered in a dosage that is effective in treating symptoms while minimizing toxicity and side effects. For the treatment of cancer, an autoimmune disease or immunodeficiency disease, a therapeutically effective dose may be, for example, in the range of 50 mg per dose to 2.5 g / m 2 . In one embodiment, dosages of from about 250 mg / m 2 to about 400 mg / m 2 or 500 mg / m 2 are administered. In another embodiment, the dosage is approximately 250-375 mg / m 2 . In yet another embodiment, the dosage range is 275-375 mg / m 2 .
Методы лечения связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (AMD) могут быть оценены, но не ограничены, уменьшением скорости или предотвращением дальнейшей потери зрения. Для лечения AMD эффективность in vivo может быть, например, измерена одним из следующих способов: оценкой среднего изменения лучшей откорректированной визуальной активности (BCVA) от основной линии в течение заданного времени, оценкой относительного числа субъектов, потерявших менее чем 15 символов визуальной активности по сравнению с основной линией в течение определенного времени, оценкой относительного числа субъектов, приобретших число символов визуальной активности, более или равное 15 по сравнению с основной линией в течение определенного времени, оценкой относительного числа субъектов с эквивалентом визуальной активности Снеллена 20/2000 через определенное время, оценкой с помощью опросного листа визуального функционирования NEI, оценкой размера CNV и количества просачивающегося CNV за определенное время по данным флуоресцеиновой ангиографии, и т.п.Therapies for age-related macular degeneration (AMD) can be evaluated, but not limited to, reducing speed or preventing further loss of vision. For the treatment of AMD, in vivo efficacy can be measured, for example, by one of the following methods: estimating the average change in the best corrected visual activity (BCVA) from the baseline over a given time, estimating the relative number of subjects who have lost less than 15 characters of visual activity compared to the main line for a certain time, the assessment of the relative number of subjects who acquired the number of characters of visual activity, more than or equal to 15 compared with the main line for definitely time, by assessing the relative number of subjects with the equivalent of Snellen's visual activity of 20/2000 after a certain time, evaluating with the help of a questionnaire the visual functioning of NEI, estimating the size of CNV and the amount of CNV leaking for a certain time according to fluorescein angiography, etc.
Термин «обнаружение» подразумевается включающим определение присутствия или отсутствия вещества или количественного определения количества вещества. Таким образом, термин относится к использованию материалов, композиций и методов в соответствии с представленным изобретением для качественных и количественных определений. В общем, конкретная методика, применяемая для определения, не является критичной для практического осуществления изобретения.The term “detection” is intended to include determining the presence or absence of a substance or quantifying the amount of a substance. Thus, the term refers to the use of materials, compositions and methods in accordance with the invention for qualitative and quantitative determinations. In general, the particular technique used to determine is not critical to the practice of the invention.
Например, «обнаружение» в соответствии с изобретением может включать: наблюдение присутствия или отсутствия продукта гена альфа5, молекул мРНК или полипептида альфа5; изменение в уровнях полипептида альфа5 или количества, связанного с мишенью; изменения в биологической функции/активности полипептида альфа5. В некоторых вариантах осуществления «обнаружение» может включать обнаружение уровней альфа5 дикого типа (например, уровней мРНК или полипептида). Обнаружение может включать количественное определение изменения (увеличения или уменьшения) любого значения между 10% и 90%, или любого значения между 30% и 60%, или более 100% по сравнению с контролем. Определение может включать количественную оценку изменения любого значения от 2-кратного до 10-кратного, включительно, или более, например 100-кратного.For example, “detection” in accordance with the invention may include: observing the presence or absence of an alpha5 gene product, mRNA molecules, or alpha5 polypeptide; a change in alpha5 polypeptide levels or the amount associated with the target; changes in the biological function / activity of the
Термин «метка», когда он использован здесь, относится к обнаруживаемому соединению или композиции, которая конъюгирована напрямую или опосредованно с антителом. Метка может быть обнаружимой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае энзиматической метки, могут катализировать являющееся обнаружимым химическое изменение субстрата, соединения или состава.The term “label,” as used herein, refers to a detectable compound or composition that is conjugated directly or indirectly to an antibody. The label can be detectable on its own (for example, radioisotope tags or fluorescent tags) or, in the case of an enzymatic tag, can catalyze a detectable chemical change in the substrate, compound or composition.
Новые антитела против альфа5бета1New antibodies against alpha5beta1
Здесь предложены новые антитела, которые могут связывать человеческий альфа5бета1 и конкурентно подавлять связывание антител против альфа5бета1 с человеческим альфа5бета1. В соответствии с одним вариантом осуществления антитела против альфа5бета1 продуцируются гибридомой, выбранной из группы, состоящей из гибридомы, депонированной как Alpha5/beta1 7H5.4.2.8 (ATCC № PTA-7421), и гибридомы, депонированной как Alpha5/beta1 7H12.5.1.4 (ATCC № PTA-7420) в ATCC 7 марта 2006 г. В соответствии с другим вариантом осуществления, антитело продуцируется гибридомой, выбранной из группы, состоящей из гибридомы, депонированной как Alpha5/beta1 7H5.4.2.8 (ATCC № PTA-7421), и гибридомы, депонированной как Alpha5/beta1 7H12.5.1.4 (ATCC № PTA-7420) в ATCC 7 марта 2006 г. В соответствии с еще одним вариантом осуществления, антитело содержит последовательность вариабельного тяжелого (VH) и вариабельного легкого (VL) доменов из антител, продуцируемых гибридомой, депонированной как Alpha5/beta1 7H5.4.2.8 (ATCC № PTA-7421) в ATCC 7 марта 2006 г. В другом варианте осуществления антитело содержит последовательность вариабельного тяжелого (VH) и вариабельного легкого (VL) доменов из антител, продуцируемых гибридомой, депонированной как Alpha5/beta1 7H12.5.1.4 (ATCC № PTA-7420) в ATCC 7 марта 2006 г. Также предполагаются человеческие и химерные формы антител депонированных гибридом.New antibodies are proposed here that can bind human alpha5beta1 and competitively inhibit the binding of anti-alpha5beta1 antibodies to human alpha5beta1. In accordance with one embodiment, antibodies against alpha5beta1 are produced by a hybridoma selected from the group consisting of a hybridoma deposited as Alpha5 / beta1 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421) and a hybridoma deposited as Alpha5 / beta1 7H12.5.1. 4 (ATCC No. PTA-7420) at ATCC March 7, 2006. In accordance with another embodiment, the antibody is produced by a hybridoma selected from the group consisting of a hybridoma deposited as Alpha5 / beta1 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421 ), and hybridomas deposited as Alpha5 / beta1 7H12.5.1.4 (ATCC No. PTA-7420) at ATCC on March 7, 2006. In accordance with yet another embodiment m implementation, the antibody contains a sequence of variable heavy (VH) and variable light (VL) domains of antibodies produced by a hybridoma deposited as Alpha5 / beta1 7H5.4.2.8 (ATCC No. PTA-7421) in ATCC March 7, 2006. In another an embodiment, the antibody comprises a sequence of variable heavy (VH) and variable light (VL) domains from antibodies produced by a hybridoma deposited as Alpha5 / beta1 7H12.5.1.4 (ATCC No. PTA-7420) in ATCC on March 7, 2006. Human is also contemplated. and chimeric forms of antibodies deposited by hybridomas.
В соответствии с одним вариантом осуществления, антитело связывается с человеческим альфа5бета1 с Kd между 500 нМ и 1 пМ. В соответствии с другим вариантом осуществления, антитело не связывает альфаVбета3, или альфаVбета5, или альфаVбета1. В соответствии с другим вариантом осуществления антитело включает последовательность Fc человеческого IgG, например, человеческого IgG1 или человеческого IgG4. В другом варианте осуществления последовательность Fc была модифицирована или изменена другим способом таким образом, что она лишилась эффекторной функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), часто связанной со связыванием с рецепторами Fc (FcR). Существует много примеров изменений или мутаций в последовательностях Fc, которые могут изменить эффекторные функции. Например, WO00/42072 (Presta) и Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описывают варианты антител с улучшенным или ослабленным связыванием с FcR. Содержание этих публикаций особым образом приведено здесь в виде ссылки. Антитело может быть в форме Fab, Fab', F(ab)'2, одноцепочечного Fv (scFv), фрагмента Fv; диатела и линейного антитела. Также, антитело может быть мультиспецифичным антителом, которое связывает альфа5бета1 и является антагонистом альфа5бета1, но также связывает одну или более иных мишеней и подавляет их функцию (например, VEGF). Антитело может быть конъюгировано с терапевтическим агентом (например, цитотоксическим препаратом, радиоизотопом и химиотерапевтическим препаратом) или меткой для обнаружения альфа5бета1 в образцах от пациента или in vivo путем визуализации (например, радиоизотопом, флуоресцентным красителем и ферментом).In accordance with one embodiment, the antibody binds to human alpha5beta1 with a Kd of between 500 nM and 1 pM. According to another embodiment, the antibody does not bind alphaVbeta3, or alphaVbeta5, or alphaVbeta1. According to another embodiment, the antibody comprises an Fc sequence of human IgG, for example, human IgG1 or human IgG4. In another embodiment, the Fc sequence has been modified or altered in another way so that it loses the effector function of antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC), often associated with binding to Fc receptors (FcR). There are many examples of changes or mutations in Fc sequences that can alter effector functions. For example, WO00 / 42072 (Presta) and Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001) describe antibody variants with improved or weakened binding to FcR. The contents of these publications are hereby expressly incorporated by reference. The antibody may be in the form of Fab, Fab ', F (ab)' 2 , single chain Fv (scFv), Fv fragment; diabodies and linear antibodies. Also, the antibody may be a multispecific antibody that binds alpha5beta1 and is an alpha5beta1 antagonist, but also binds one or more other targets and inhibits their function (e.g., VEGF). An antibody can be conjugated to a therapeutic agent (e.g., cytotoxic drug, radioisotope, and chemotherapeutic drug) or a label to detect alpha5beta1 in patient samples or in vivo by imaging (e.g., radioisotope, fluorescent dye and enzyme).
Также предполагаются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против альфа5бета1, экспрессионные векторы, включающие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие один или оба вариабельных домена, и клетки, включающие молекулы нуклеиновой кислоты. Эти антитела могут быть использованы при терапии, описанной здесь, и для определения белка альфа5бета1 в образцах от пациентов (например, FACS, иммуногистохимия (ИГХ), анализ ИФА) или в самих пациентах.Also contemplated are nucleic acid molecules encoding anti-alpha5beta1 antibodies, expression vectors including nucleic acid molecules encoding one or both of the variable domains, and cells including nucleic acid molecules. These antibodies can be used in the therapy described here and for determining alpha5beta1 protein in patient samples (e.g., FACS, immunohistochemistry (IHC), ELISA) or in the patients themselves.
Новые сочетанияNew combinations
Новые сочетания для подавления ангиогенеза и/или сосудистой проницаемости у субъекта, страдающего от заболевания, включают антагонист альфа5бета1 и антагонист VEGF. Антагонист VEGF и антагонист альфа5бета1 могут быть введены в одновременных или последовательных циклах лечения. Подобное комбинированное лечение применимо для лечения болезней, включая те болезни, которые характеризуются ненормальным ангиогенезом и/или сосудистой проницаемостью и страдающие которыми пациенты выиграют от антиангиогенезной терапии. Подобные болезни включают, но не ограничены раком, глазными болезнями и аутоиммунными болезнями. Альтернативно, субъект может подвергаться лечению антагонистом VEGF с последующим введением антагониста альфа5бета1, например лечению антагонистом VEGF до тех пор, пока субъект не перестанет реагировать на лечение антагонистом VEGF, после чего лечение субъекта антагонистом альфа5бета1. В соответствии с одним вариантом осуществления пациент подвергался лечению антагонистом VEGF, когда рак был неинвазивным и антагонистом альфа5бета1, когда рак был инвазивным. Некоторые пациенты, которые имеют повышенные уровни альфа5бета1 изначально или в ответ на терапию антагонистом VEGF относительно не страдающих заболеванием пациентов или контроля, могут быть особенно чувствительны к этому комбинаторному лечению. Предполагаются также комбинации, дополнительно включающие терапевтический препарат (например, антинеопластический препарат, химиотерапевтический препарат, ингибирующий рост препарат и цитотоксический препарат). Например, пациенты, которые должны подвергнуться химиотерапии (например, иринотеканом) и лечению антагонистами альфа5бета1 или которые подвергались химиотерапии и лечению антагонистами альфа5бета1 могут выиграть от терапии антагонистом VEGF. Альтернативно, пациенты, которые подвергались химиотерапии и лечению антагонистами VEGF могут выиграть от терапии антагонистом альфа5бета1. В одном предпочтительном варианте осуществления, антителом против VEGF является антитело Avastin®. В другом предпочтительном варианте осуществления антитела против альфа5бета1 являются описанными здесь антителами против альфа5бета1. Также предполагаются наборы, содержащие антагонист VEGF, антагонист альфа5бета1 и, необязательно, химиотерапевтический препарат.New combinations to suppress angiogenesis and / or vascular permeability in a subject suffering from a disease include an alpha5beta1 antagonist and a VEGF antagonist. The VEGF antagonist and alpha5beta1 antagonist can be administered in simultaneous or sequential treatment cycles. Such combination treatment is applicable for the treatment of diseases, including those diseases that are characterized by abnormal angiogenesis and / or vascular permeability and suffering from which patients will benefit from antiangiogenesis therapy. Similar diseases include, but are not limited to cancer, eye diseases, and autoimmune diseases. Alternatively, the subject may be treated with a VEGF antagonist followed by administration of an alpha5beta antagonist, for example, treatment with a VEGF antagonist until the subject no longer responds to treatment with a VEGF antagonist, after which treatment of the subject with an alpha5beta antagonist. In one embodiment, the patient is treated with a VEGF antagonist when the cancer is non-invasive and an alpha5beta1 antagonist when the cancer is invasive. Some patients who have elevated alpha5beta1 levels initially or in response to VEGF antagonist therapy for non-disease patients or controls may be especially sensitive to this combinatorial treatment. Combinations are also contemplated that further include a therapeutic drug (e.g., an antineoplastic drug, a chemotherapeutic drug, a growth inhibitory drug, and a cytotoxic drug). For example, patients who should undergo chemotherapy (such as irinotecan) and are treated with alpha5beta1 antagonists or who have been treated with chemotherapy and are treated with alpha5beta1 antagonists may benefit from VEGF antagonist therapy. Alternatively, patients who have undergone chemotherapy and treatment with VEGF antagonists can benefit from therapy with an alpha5 beta1 antagonist. In one preferred embodiment, the anti-VEGF antibody is the Avastin ®. In another preferred embodiment, anti-alpha5beta1 antibodies are anti-alpha5beta1 antibodies described herein. Also contemplated are kits comprising a VEGF antagonist, an alpha5beta1 antagonist and, optionally, a chemotherapeutic drug.
Фармацевтические композицииPharmaceutical Compositions
Терапевтические композиции антител, использованные в соответствии с настоящим изобретением, готовятся к хранению путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиента в применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный или на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония, хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкиловые парабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низким молекулярным весом (менее чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин, или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глютамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды, и другие углеводороды, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие препараты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие обратные ионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-протеиновые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEENTM, PLURONICSTM или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Иллюстративные композиции антител, описанные в WO98/56418, непосредственно приведены здесь в виде ссылки. Лиофилизованные препараты, предназначенные для подкожного введения, описаны в WO97/04801. Подобные лиофилизованные препараты могут быть восстановлены при помощи подходящего растворителя до высоких концентраций белка, восстановленные составы могут быть введены подкожно подвергающемуся здесь лечению млекопитающему.The therapeutic antibody compositions used in accordance with the present invention are prepared for storage by mixing an antibody of the desired purity with optional pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) as lyophilized preparations or aqueous solutions. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to the recipient at the dosages and concentrations employed and include buffers such as phosphate, citrate or other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid and methionine; preservatives (such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride, benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; m; low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues); proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other hydrocarbons, including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; salt-forming reverse ions such as sodium; metal complexes (e.g., Zn protein complexes); and / or non-ionic surfactants such as TWEEN ™ , PLURONICS ™ or polyethylene glycol (PEG). The exemplary antibody compositions described in WO98 / 56418 are directly incorporated herein by reference. Lyophilized preparations intended for subcutaneous administration are described in WO97 / 04801. Such lyophilized preparations can be reconstituted with a suitable solvent to high protein concentrations, reconstituted formulations can be administered subcutaneously to the mammal undergoing treatment here.
Описанная здесь композиция может также содержать более одного активного соединения, что необходимо для лечения конкретных показаний, где предпочтительно соединения имеют комплементарные активности, которые не оказывают нежелательного действия друг на друга. Например, может быть желательно также добавление цитотоксического препарата, химиотерапевтического препарата, цитокина или иммуносупрессивного препарата (например, действующего на Т-клетки, такого как циклоспорин или антитело, которое связывает Т-клетки, например, связывающее LFA-1). Эффективное количество подобных других факторов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа заболевания или расстройства, подвергающегося лечению, и иных факторов, описанных выше. Они обычно используются в тех же дозировках и с использованием тех же путей введения, что и описанные выше или приблизительно от 1% до 99% использованной ранее дозировки.The composition described herein may also contain more than one active compound, which is necessary for the treatment of specific indications, where preferably the compounds have complementary activities that do not have undesirable effects on each other. For example, it may also be desirable to add a cytotoxic drug, chemotherapeutic drug, cytokine, or immunosuppressive drug (for example, acting on T cells, such as cyclosporin or an antibody that binds T cells, for example, binding LFA-1). An effective amount of these other factors depends on the amount of antibody present in the composition, the type of disease or disorder being treated, and other factors described above. They are usually used in the same dosages and using the same routes of administration as those described above or from about 1% to 99% of the dosage used previously.
Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, при помощи методик коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы соответственно в коллоидных системах доставки препарата (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или макроэмульсиях. Подобные методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).The active ingredients can also be enclosed in microcapsules obtained, for example, using coacervation or interfacial polymerization techniques, for example, hydroxymethyl cellulose or gelatin microcapsules and polymethylmethacrylate microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (for example, liposomes, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, or macroemulsions. Similar techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Могут быть приготовлены препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые основы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антагонист, эти основы изготовлены в виде сформированных предметов, например, пленок или микрокапсул. Примеры основ для замедленного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат), или поли(винилалканоил)), полилактиды (патент США № 3773919) сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, недеградирующий этилен-винилацетат, деградирующие сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOTTM (вводимые инъекцией микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролид) и поли-D-(-)-3-гидроксибутировая кислота.Slow release formulations may be prepared. Suitable examples of sustained release preparations include semi-permeable bases of solid hydrophobic polymers containing an antagonist, these bases are made in the form of shaped objects, for example, films or microcapsules. Examples of sustained release bases include polyesters, hydrogels (e.g., poly (2-hydroxyethyl-methacrylate), or poly (vinyl alkanoyl)), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and ethyl-L-glutamate, non-degrading ethylene- vinyl acetate, degrading copolymers of lactic and glycolic acids, such as LUPRON DEPOT ™ (injectable microspheres consisting of a copolymer of lactic and glycolic acids and leuprolide acetate) and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid.
Композиции, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это может быть легко достигнуто при помощи фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны.Compositions used for in vivo administration must be sterile. This can be easily achieved by filtering through sterile filtering membranes.
Изделия и наборыProducts and kits
Другой вариант осуществления изобретения это изделие, содержащее материалы, применимые для лечения опухолей, глазных заболеваний и аутоиммунных заболеваний и связанных состояний. Изделие может включать контейнер и этикетку или вкладыш, вставленный или связанный с контейнером. Применимые контейнеры включают, например, бутылки, пузырьки, шприцы, и т.п. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Обычно, контейнер содержит композицию, являющуюся эффективной при лечении состояния и может иметь стерильное отверстие для доступа (например, контейнер может быть мешком для внутривенных вливаний или флаконом, имеющим пробку, проницаемую при помощи иглы подкожного инъектора). По меньшей мере один активный ингредиент в композиции является антагонистом VEGF или антагонистом альфа5бета1, или агонистом VEGFR, или агонистом альфа5бета1 в соответствии с изобретением. Метка или вкладыш в упаковке будет также содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту. Метка или вкладыш могут дополнительно содержать инструкции по введению композиции антител пациенту. Также подразумеваются изделия и наборы, включающие комбинированную терапию, описанную здесь.Another embodiment of the invention is an article containing materials useful for treating tumors, eye diseases, and autoimmune diseases and related conditions. The product may include a container and a label or liner inserted or associated with the container. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, and the like. Containers can be made of various materials, such as glass or plastic. Typically, the container contains a composition that is effective in treating the condition and may have a sterile access opening (for example, the container may be an IV bag or a vial having a plug that is permeable with a hypodermic needle). At least one active ingredient in the composition is a VEGF antagonist or alpha5beta1 antagonist, or a VEGFR agonist, or alpha5beta1 agonist in accordance with the invention. The label or package insert will also contain instructions for administering the antibody composition to the patient. The label or insert may further contain instructions for administering an antibody composition to a patient. Also contemplated are products and kits comprising the combination therapy described herein.
Вкладыши к упаковке относятся к инструкциям, обычно включенным в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях к применению, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предупреждения, касающиеся применения такого терапевтического продукта. В одном варианте осуществления вкладыш в упаковке указывает, что композиция используется для лечения не-ходжкинской лимфомы.Packaging inserts refer to instructions usually included in commercial packages of therapeutic products that contain information about indications for use, use, dosage, administration, contraindications and / or warnings regarding the use of such a therapeutic product. In one embodiment, the package insert indicates that the composition is used to treat non-Hodgkin lymphoma.
Дополнительно, изделие может далее содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может далее содержать другие материалы, желательные с коммерческой или потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.Additionally, the product may further comprise a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. It may further contain other materials desirable from a commercial or consumer point of view, including other buffers, solvents, filters, needles and syringes.
Также предлагаются наборы для различных применений, например для выделения или обнаружения альфа5бета1 и/или VEGF у пациентов, возможно в сочетании с другими изделиями. Для выделения и очистки альфа5бета1 набор может содержать антитела против альфа5бета1, связанные со сферами (например, с сефарозными сферами). Могут быть предложены наборы, включающие антитела для детекции и количественной оценки альфа5бета1 и/или VEGF in vitro, например, в ELISA или вестерн-блот. Как в случае с изделием, набор содержит контейнер и метку или вкладыш в упаковку на контейнере или связанный с ним. Например, контейнер содержит композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело против альфа5бета1 в соответствии с изобретением. Могут быть включены дополнительные контейнеры, содержащие, например, растворители или буферы, контрольные антитела. Метка или вкладыш в упаковке может содержать описание композиции, а также инструкции по предполагаемому применению in vitro или диагностического использования.Kits are also available for various applications, for example, to isolate or detect alpha5beta1 and / or VEGF in patients, possibly in combination with other products. For isolation and purification of alpha5beta1, the kit may contain antibodies against alpha5beta1 linked to spheres (e.g., sepharose spheres). Kits may be provided that include antibodies for the detection and quantification of alpha5beta1 and / or VEGF in vitro, for example, in an ELISA or Western blot. As with the product, the kit contains a container and a label or package insert on the container or associated with it. For example, the container contains a composition comprising at least one anti-alpha5beta1 antibody in accordance with the invention. Additional containers may be included, containing, for example, solvents or buffers, control antibodies. The label or package insert may contain a description of the composition, as well as instructions for the intended in vitro or diagnostic use.
Моноклональные антителаMonoclonal antibodies
Моноклональные антитела могут быть получены, например, с применением методов, основанных на гибридомах, например, как описанные Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены с применением методов, основанных на рекомбинантной ДНК (патент США № 4816567), или могут быть получены методами, описанными здесь в разделе «Примеры». В методе с использованием гибридомы мышь, хомяк или другое подходящее животное-хозяин обычно иммунизируется иммунизирующим препаратом для стимуляции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфически связываются с иммунизирующим препаратом. Альтернативно, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro.Monoclonal antibodies can be obtained, for example, using methods based on hybridomas, for example, as described by Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975), or can be obtained using methods based on recombinant DNA (US patent No. 4816567 ), or can be obtained by the methods described here in the "Examples" section. In a hybridoma method, a mouse, hamster, or other suitable host animal is usually immunized with an immunizing agent to stimulate lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that specifically bind to the immunizing agent. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro.
Иммунизирующий препарат обычно будет включать полипептид или слитный белок из интересующего белка или композицию, включающую белок. Обычно, используются или лимфоциты периферической крови (PBL), если требуются клетки человеческого происхождения, или используются клетки селезенки или лимфатического узла, если в качестве источника желательны млекопитающие, не являющиеся человеком. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией с применением подходящего препарата для слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования клеток гибридомы. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Иммортализованные линии клеток обычно являются трансформированными клетками млекопитающих, в частности, клетками миеломы, имеющими происхождение от грызунов, коров или человека. Обычно используются крысиные и мышиные клетки миеломы. Клетки гибридомы могут быть культивированы в подходящей среде культивирования, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, которые подавляют рост или выживание неслитных иммортализованных клеток. Например, если в исходных клетках отсутствует фермент гипоксантин гуанин фосфорибозил трансфераза (HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), эти вещества предотвращают рост клеток с дефицитом HGPRT.An immunizing preparation will typically include a polypeptide or fusion protein from a protein of interest or a composition comprising a protein. Typically, either peripheral blood lymphocytes (PBLs) are used if cells of human origin are required, or spleen or lymph node cells are used if non-human mammals are desired as a source. The lymphocytes are then fused to an immortalized cell line using a suitable fusion preparation, such as polyethylene glycol, to form hybridoma cells. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103. Immortalized cell lines are typically transformed mammalian cells, in particular myeloma cells derived from rodents, cows or humans. Rat and mouse myeloma cells are commonly used. Hybridoma cells can be cultured in a suitable culture medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of non-transmissible immortalized cells. For example, if the original cells lack the hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT) enzyme, the hybridoma culture medium will usually contain hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium), these substances prevent the growth of HGPRT-deficient cells.
Предпочтительными линиями иммортализованных клеток являются способные эффективно сливаться, поддерживающие стабильную экспрессию высокого уровня антител отобранными продуцирующими антитела клетками и являющиеся чувствительными к среде, такой как среда HAT. Более предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются мышиные линии миеломы, которые могут быть получены, например, из Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California и American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Также была описана продукция человеческих моноклональных антител в клеточных линиях человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы. Kozbor. J. Immunol., 133:3001 (1984): Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63.Preferred lines of immortalized cells are efficiently fused, maintaining stable expression of high levels of antibodies by selected antibody-producing cells and being sensitive to a medium, such as HAT medium. More preferred immortalized cell lines are murine myeloma lines, which can be obtained, for example, from the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. The production of human monoclonal antibodies in the cell lines of human myeloma and mouse-human heteromyeloma has also been described. Kozbor. J. Immunol., 133: 3001 (1984): Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc .: New York, 1987) pp. 51-63.
Культуральная среда, в которой были культивированы клетки гибридомы, может быть исследована на присутствие моноклональных антител, направленных против полипептида. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридом, может быть определена методом иммунопреципитации или при помощи исследований связывания in vitro, таких как радиоиммунный анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Подобные методики и анализы известны в области техники. Сродство связывания моноклональных антител может быть определено, например, анализом Скетчарда по Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980).The culture medium in which the hybridoma cells were cultured can be tested for the presence of monoclonal antibodies directed against the polypeptide. The specificity of binding of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells can be determined by immunoprecipitation or by in vitro binding studies such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Similar techniques and analyzes are known in the art. The binding affinity of monoclonal antibodies can be determined, for example, by Sketchard analysis by Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980).
После идентификации желаемых клеток гибридомы клоны могут быть субклонированы с помощью процедур серийного разведения и выращены с использованием стандартных методов. См. ранее Goding. Подходящая среда культивирования для этой цели включает, например, модифицированную Дульбекко среду Игла и среду RPMI-1640. Альтернативно, клетки гибридомы могут быть выращены in vivo в виде асцитов млекопитающих.After identifying the desired hybridoma cells, the clones can be subcloned using serial dilution procedures and grown using standard methods. See earlier Goding. Suitable culture media for this purpose include, for example, Dulbecco's modified Eagle medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, hybridoma cells can be grown in vivo as mammalian ascites.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть изолированы или очищены из культуральной среды или асцитной жидкости с помощью обычных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, хроматография на сефарозе с белком А, гидроксиапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.Monoclonal antibodies secreted by subclones can be isolated or purified from culture medium or ascites fluid using conventional immunoglobulin purification procedures, such as, for example, protein A Sepharose chromatography, hydroxyapatite, gel electrophoresis, dialysis or affinity chromatography.
Моноклональные антитела могут быть также получены с применением методов с рекомбинантной ДНК, таких как описаны в патенте США № 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела в соответствии с изобретением, может быть быстро изолирована и секвенирована с применением обычных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Клетки гибридомы согласно изобретению являются предпочтительным источником такой ДНК. Будучи изолированной, ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которыми затем трансфицируются клетки-хозяева, такие как клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО), или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Также ДНК может быть модифицирована, например, путем замещения последовательностями, кодирующими человеческие константные домены тяжелой и легкой цепи гомологичных мышиных последовательностей (патент США № 4816567; Morrison et al., см. выше) или путем ковалентного связывания с кодирующей иммуноглобулин последовательностью всего или части кодирующей последовательности пептида, не являющегося иммуноглобулином. Подобный не являющийся иммуноглобулином полипептид может быть замещен на константный домен согласно изобретению или может быть замещен вариабельными доменами антигенсвязывающего сайта антитела в соответствии с изобретением для создания химерного бивалентного антитела.Monoclonal antibodies can also be prepared using recombinant DNA techniques, such as those described in US Pat. No. 4,816,567. DNA encoding the monoclonal antibodies of the invention can be rapidly isolated and sequenced using conventional procedures (for example, using oligonucleotide probes, which are capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies). The hybridoma cells of the invention are a preferred source of such DNA. Once isolated, DNA can be inserted into expression vectors, which are then transfected with host cells, such as monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not otherwise produce immunoglobulin protein, to achieve the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. DNA can also be modified, for example, by substitution by sequences encoding the human constant domains of the heavy and light chains of homologous murine sequences (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra) or by covalent binding to an immunoglobulin coding sequence of all or part of the coding sequences of a non-immunoglobulin peptide. Such a non-immunoglobulin polypeptide may be substituted for the constant domain of the invention or may be substituted with the variable domains of the antigen binding site of an antibody of the invention to create a chimeric bivalent antibody.
Антитела могут быть моновалентными антителами. Методы получения моновалентных антител известны в области техники. Например, один метод включает рекомбинантную экспрессию легкой цепи иммуноглобулина и модифицированной тяжелой цепи. Тяжелая цепь обычно укорочена в любой точке участка Fc для того, чтобы предотвратить поперечное сшивание тяжелых цепей. Альтернативно, важные цистеиновые остатки замещаются другими аминокислотными остатками или подвергаются делеции для предотвращения поперечного сшивания.Antibodies may be monovalent antibodies. Methods for producing monovalent antibodies are known in the art. For example, one method involves recombinant expression of an immunoglobulin light chain and a modified heavy chain. The heavy chain is usually shortened at any point in the Fc region in order to prevent crosslinking of the heavy chains. Alternatively, important cysteine residues are replaced by other amino acid residues or undergo deletion to prevent crosslinking.
Также для получения моновалентных антител применимы методы in vitro. Расщепление антител для получения их фрагментов, в особенности фрагментов Fab, может быть выполнено с применением, но не ограничено способами, известными в данной области техники.In vitro methods are also applicable to obtain monovalent antibodies. The cleavage of antibodies to obtain fragments thereof, in particular Fab fragments, can be performed using, but is not limited to, methods known in the art.
Человеческие и гуманизированные антителаHuman and Humanized Antibodies
Антитела могут быть гуманизированными антителами или человеческими антителами. Гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител являются химерными иммуноглобулинами, иммуноглобулиновыми цепочками или их фрагментами (такими как Fv, Fab, Fab', F(ab')2, или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые обычно содержат минимальную последовательность, происходящую из нечеловеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают человеческие иммуноглобулины (антитела-реципиенты), в которых остатки CDR реципиента заменены на остатки из CDR нечеловеческого вида (донорного антитела), такого как мышь, крыса или кролик, имеющего желаемую специфичность, сродство и возможности. В некоторых случаях основания остова Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизированные антитела могут также включать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте ни в заимствованных последовательностях CDR или остова. Обычно, гуманизированные антитела могут включать в основном все из, по меньшей мере, одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все участки CDR соответствуют аналогам нечеловеческого иммуноглобулина, и все или в основном все из участков FR соответствуют аналогам из консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела предпочтительно также будут включать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Jones et al., Nature. 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).Antibodies can be humanized antibodies or human antibodies. Humanized forms of non-human (e.g., murine) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (such as Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 , or other antigen-binding subsequences of antibodies) that typically contain a minimal sequence derived from inhuman immunoglobulin. Humanized antibodies include human immunoglobulins (recipient antibodies) in which the CDR residues of the recipient are replaced by residues from the CDR of a non-human species (donor antibody), such as a mouse, rat or rabbit, having the desired specificity, affinity and capabilities. In some cases, the bases of the Fv backbone of a human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues. Humanized antibodies may also include residues that are not found in either the recipient antibody or in the borrowed CDR or backbone sequences. Typically, humanized antibodies may comprise essentially all of at least one, and usually two, variable domains in which all or substantially all of the CDR regions correspond to analogues of non-human immunoglobulin, and all or substantially all of the FR regions correspond to analogues from consensus human immunoglobulin sequences. Humanitariannet antibodies will preferably also include at least part of the constant region of immunoglobulin (Fc), usually human immunoglobulin. Jones et al., Nature. 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
Некоторые способы гуманизирования нечеловеческих антител описаны в данной области техники и ниже, в примерах. Обычно, гуманизированное антитело имеет один или более введенных в него аминокислотных остатков из источника, не являющегося человеком. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто упоминаются как «импортные» остатки, которые обычно взяты из «импортного» вариабельного домена. В соответствии с одним вариантом осуществления гуманизация может быть главным образом выполнена по способу Винтера и соавторов (Jones et al., Nature. 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)) путем замены CDR грызуна или последовательностями CDR соответствующих последовательностей в человеческом антителе. Соответственно, подобные «гуманизированные» антитела являются антителами (патент США № 4816567), в которых значительно меньшая, чем целый вариабельный домен человека, часть замещена соответствующей последовательностью из нечеловеческого вида. На практике, гуманизированные антитела обычно являются человеческими антителами, в которых некоторые остатки CDR и возможно некоторые остатки FR замещены остатками с аналогичных участков в антителах грызунов.Some methods of humanizing non-human antibodies are described in the art and below in the examples. Typically, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced into it from a non-human source. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are usually taken from the “import” variable domain. In accordance with one embodiment, humanization can be mainly performed according to the method of Winter and co-authors (Jones et al., Nature. 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature. 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)) by replacing rodent CDRs or CDR sequences of corresponding sequences in a human antibody. Accordingly, such “humanized” antibodies are antibodies (US Pat. No. 4,816,567), in which a much smaller part than the entire human variable domain is replaced by a corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are replaced by residues from similar sites in rodent antibodies.
В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены человеческие антитела. Например, в настоящее время возможно производить трансгенных животных (например, мышей), которые способны, после иммунизации, производить полный набор человеческих антител при отсутствии эндогенной продукции иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция в гене участка соединения тяжелой цепи (JH) в химерных мышах и мутантах зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию эндогенной продукции антител. Передача набора человеческих генов зародышевой линии иммуноглобулина в подобную мышь-мутанта зародышевой линии приводит к продукции человеческих антител при антигенной стимуляции. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immune, 7:33 (1993); патенты США № 5545806, 5569825, 5591669 (все принадлежат GenPharm); 5545807; и WO 97/17852. Альтернативно, человеческие антитела могут быть получены путем введения локусов человеческого иммуноглобулина в трансгенных животных, например, мышей, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. При стимуляции наблюдалась продукция человеческих антител, сильно напоминающая наблюдаемую у человека во всех отношениях, включая перестройку генов, сборку, и представления репертуара антител. Этот подход описан, например, в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016, и в следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995).As an alternative to humanization, human antibodies can be obtained. For example, it is currently possible to produce transgenic animals (e.g., mice) that are capable, after immunization, of producing a complete set of human antibodies in the absence of endogenous immunoglobulin production. For example, it has been described that a homozygous deletion in a gene of a heavy chain (JH) site in mouse chimeric mice and germline mutants results in complete inhibition of endogenous antibody production. Transferring a set of human immunoglobulin germline genes into a similar germline germline mutant mouse results in the production of human antibodies upon antigenic stimulation. See, for example, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immune, 7:33 (1993); US patents No. 5545806, 5569825, 5591669 (all belong to GenPharm); 5,545,807; and WO 97/17852. Alternatively, human antibodies can be obtained by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals, for example, mice in which the endogenous immunoglobulin genes are partially or completely inactivated. During stimulation, production of human antibodies was observed, closely resembling that observed in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly, and presentation of the antibody repertoire. This approach is described, for example, in US patent No. 5545807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5633425 and 5661016, and in the following scientific publications: Marks et al., Bio / Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol 13: 65-93 (1995).
Альтернативно, для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из репертуара генов вариабельных доменов (V) иммуноглобулинов от неиммунизированных доноров может быть использована технология фаговых дисплеев (McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]). В соответствии с одним вариантом осуществления этой методики, последовательности домена V антитела клонируются с сохранением рамки в ген большого или малого белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как М13 или fd, и представлены в виде функциональных фрагментов антител на поверхности фаговой частицы. Фаговые дисплеи могут быть выполнены в различных форматах, например, как описано ниже в разделе Примеров или как рассмотрено, например, в Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Некоторые источники сегментов гена V могут быть использованы для фагового дисплея. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили широкий набор антиоксазолоновых антител из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V генов, полученных из селезенок иммунизированных мышей. Может быть сконструирован набор генов V от неиммунизированных человеческих доноров, после чего антитела против широкого спектра антигенов (включая собственные антигены) могут быть выделены с использованием, по существу, способов, описанных Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См., также патенты США № 5565332 и 5573905.Alternatively, phage display technology (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 [1990]) can be used to obtain human antibodies and in vitro antibody fragments from the repertoire of immunoglobulin variable domain (V) gene immunoglobulins from non-immunized donors. In accordance with one embodiment of this technique, the V domain sequences of an antibody are cloned to a large or small coat protein of a filamentous bacteriophage, such as M13 or fd, into the gene and are presented as functional antibody fragments on the surface of the phage particle. Phage displays can be made in various formats, for example, as described below in the Examples section or as discussed, for example, in Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Some sources of gene V segments can be used for phage display. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) isolated a wide range of antioxazolone antibodies from a small random combinatorial library of V genes derived from spleens of immunized mice. A set of V genes from non-immunized human donors can be constructed, after which antibodies against a wide range of antigens (including native antigens) can be isolated using essentially the methods described by Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). See also US Pat. Nos. 5,565,332 and 5,573,905.
Как обсуждалось ранее, человеческие антитела могут также вырабатываться активированными in vitro B-клетками (см. патенты США 5567610 и 5229275).As previously discussed, human antibodies can also be produced by in vitro activated B cells (see US Pat. Nos. 5,567,610 and 5,229,275).
Человеческие антитела могут также быть получены с применением различных способов, известных в области техники, включая библиотеки фаговых дисплеев. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Также доступны методы изготовления человеческих моноклональных антител Cole et al. и Boerner et al. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol, 147(1): 86-95 (1991).Human antibodies can also be obtained using various methods known in the art, including phage display libraries. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Methods for making human monoclonal antibodies by Cole et al. Are also available. and Boerner et al. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol, 147 (1): 86-95 (1991).
Мультиспецифичные антителаMultispecific antibodies
Мультиспецифические антитела являются моноклональными, предпочтительно человеческими или гуманизированными, антителами, которые имеют специфичность связывания с двумя или более различными антигенами (например, биспецифические антитела имеют специфичность связывания с двумя или более различных антигенов). Например, одна из специфичностей связывания может быть как у антитела против альфа5бета1, другая может быть как у любого другого антигена. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления другой антиген является белком клеточной поверхности, реципиентом или субъединицей рецептора. Например, белок клеточной поверхности может быть клеточным рецептором естественной клетки-киллера. Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления, биспецифическое антитело согласно данному изобретению может связывать альфа5бета1 и VEGF.Multispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized, antibodies that have binding specificity for two or more different antigens (for example, bispecific antibodies have binding specificity for two or more different antigens). For example, one of the binding specificities can be like an anti-alpha5beta1 antibody, the other can be like any other antigen. In accordance with one preferred embodiment, the other antigen is a cell surface protein, receptor, or receptor subunit. For example, a cell surface protein may be a cellular receptor of a natural killer cell. Thus, in accordance with one embodiment, the bispecific antibody of the invention can bind alpha5beta1 and VEGF.
Были описаны примеры методов изготовления биспецифических антител. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелая/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют различную специфичность. Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). По причине случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) потенциально продуцируют смесь из десяти различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы обычно проводится с применением этапов аффинной хроматографии. Сходная процедура раскрыта в WO 93/08829, опубликованном 13 мая 1993, и в Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).Examples of methods for making bispecific antibodies have been described. Traditionally, the recombinant production of bespecifically antibodies is based on the joint expression of two pairs of the heavy / light chain of immunoglobulin, where the two heavy chains have different specificities. Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Due to the random set of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) potentially produce a mixture of ten different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually carried out using the steps of affinity chromatography. A similar procedure is disclosed in WO 93/08829, published May 13, 1993, and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
Вариабельные домены антител с желаемой специфичностью связывания (участками соединения антиген-антитело) могут быть слиты с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Предпочтительно, слияние производится с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, включающей по меньшей мере часть шарнирного участка и участки CH2 и CH3. Предпочтительно, чтобы первый константный участок тяжелой цепи (CH1), содержащий участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовал по меньшей мере в одном продукте слияния. ДНК, кодирующие слитые тяжелые цепи иммуноглобулина и, если это требуется, легкую цепь иммуноглобулина, вставляются в отдельные экспрессионные векторы и совместно трансфицируются в подходящий организм-хозяин. Для более детального описания получения биспецифичных антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).Variable antibody domains with desired binding specificity (antigen-antibody connection sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. Preferably, the fusion is performed with the constant domain of the immunoglobulin heavy chain comprising at least a portion of the hinge region and CH2 and CH3 regions. Preferably, the first constant region of the heavy chain (CH1) containing the region necessary for binding the light chain is present in at least one fusion product. DNAs encoding immunoglobulin fusion heavy chains and, if desired, immunoglobulin light chains are inserted into separate expression vectors and co-transfected into a suitable host organism. For a more detailed description of the preparation of bispecific antibodies, see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
Также были описаны различные способы изготовления и изолирования биспецифических фрагментов антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела могут быть получены с применением лейциновых застежек-молний. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Лейциновые пептиды-застежки из белков Fos и Jun были связаны с фрагментами Fab' двух различных антител путем слияния генов. Гомодимеры антител были восстановлены на участке шарнира для образования мономеров, после чего окислены заново для образования гетеродимеров антител. Этот способ также может быть использован для производства гомодимеров антител. Технология «диател», описанная Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), предложила альтернативный механизм изготовления биспецифических фрагментов антител. Фрагменты содержат VH, соединенный с VL через линкер, который является слишком коротким для того, чтобы позволить спаривание двух доменов одиночной цепи. Соответственно, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены образовывать пары с комплементарными доменами VL и VH другого фрагмента, таким образом образуя два антигенсвязывающих участка. Также была описана другая стратегия изготовления биспецифических фрагментов антител путем использования одноцепочечных димеров Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).Various methods have also been described for the manufacture and isolation of bispecific antibody fragments directly from a recombinant cell culture. For example, bispecific antibodies can be made using leucine zippers. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Fastener leucine peptides from Fos and Jun proteins were linked to Fab 'fragments of two different antibodies by gene fusion. Antibody homodimers were reduced in the hinge region to form monomers, and then reoxidized to form antibody heterodimers. This method can also be used to produce homodimers of antibodies. Datel technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), proposed an alternative mechanism for the preparation of bispecific antibody fragments. Fragments contain VH connected to VL via a linker that is too short to allow pairing of two single chain domains. Accordingly, the VH and VL domains of one fragment are forced to pair with the complementary VL and VH domains of another fragment, thus forming two antigen-binding sites. Another strategy has also been described for making bispecific antibody fragments by using single chain Fv dimers (sFv). See Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).
Также рассматриваются антитела, имеющие более двух валентностей. Например, могут быть получены триспецифические антитела. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).Antibodies having more than two valencies are also contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Гетероконъюгатные антителаHeteroconjugate antibodies
Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Такие антитела были, например, предложены для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения инфекции ВИЧ. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. Предполагается, что антитела могут быть получены in vitro с применением методов, известных в химии синтетических белков, включая методы, вовлекающие поперечно сшивающие препараты. Например, иммунотоксины могут быть сконструированы с использованием реакции обмена дисульфида или путем формирования тиоэфирной связи. Примеры подходящих для этой цели реактивов включают иминотиолят и метил-4-меркаптобутиримидат, и раскрыты, например, в патенте США № 4676980.Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently linked antibodies. Such antibodies have, for example, been proposed for targeting immune system cells to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980) and for treating HIV infection. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. It is contemplated that antibodies can be prepared in vitro using methods known in the chemistry of synthetic proteins, including methods involving cross-linking drugs. For example, immunotoxins can be constructed using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl 4-mercaptobutyrimidate, and are disclosed, for example, in US Pat. No. 4,676,980.
Создание эффекторных функцийCreation of effector functions
Может быть желательно изменить антитело согласно изобретению в отношении его эффекторной функции для улучшения, например, эффективности антитела при лечении рака. Например, в участок Fc может быть введен один или несколько цистеиновых остатков, таким образом делая возможным образование на этом участке дисульфидной связи между цепями. Полученные таким образом гомодимерные антитела могут иметь улучшенную способность к интернализации и/или увеличение комплемент-опосредованного лизиса клеток и антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). См. Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) и Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с увеличенной противоопухолевой активностью могут также быть получены с применением гетеробифункциональных поперечных сшивок, как описано в Wolff et al., Cancer Research. 53: 2560-2565 (1993). Альтернативно, могут быть сконструированы антитела, которые имеют двойные участки Fc и могут таким образом обладать увеличенными способностями к лизису с участием комплемента и ADCC. См., Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).It may be desirable to modify the antibody of the invention with respect to its effector function to improve, for example, the effectiveness of the antibody in the treatment of cancer. For example, one or more cysteine residues can be introduced into the Fc region, thereby making it possible to form a disulfide bond between the chains in this region. The homodimeric antibodies thus obtained may have an improved ability to internalize and / or increase complement-mediated cell lysis and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with increased antitumor activity can also be obtained using heterobifunctional cross-linking, as described in Wolff et al., Cancer Research. 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, antibodies can be constructed that have double Fc regions and can thus have increased complement lysis and ADCC lysis capabilities. See, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).
Для улучшения связывания с FcR (например, FcgammaR, FcRn) могут быть проведены мутации или изменения последовательностей участка Fc. В соответствии с одним вариантом осуществления, антитело согласно данному изобретению имеет по меньшей мере одну измененную по сравнению с нативным IgG или исходным антителом эффекторную функцию, выбранную из группы, состоящей из ADCC, CDC и улучшенного связывания с FcRn. Примеры некоторых полезных специфических мутаций описаны, например, в Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490; и публикации WO00/42072.To improve binding to FcR (e.g., FcgammaR, FcRn), mutations or sequence changes of the Fc region can be performed. In accordance with one embodiment, an antibody of the invention has at least one effector function altered from native IgG or parent antibody selected from the group consisting of ADCC, CDC, and improved binding to FcRn. Examples of some useful specific mutations are described, for example, in Shields, RL et al. (2001) JBC 276 (6) 6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30 (4): 487-490; and WO00 / 42072.
В соответствии с одним вариантом осуществления, мутация рецептора Fc является заменой не менее чем в одном положении, выбранном из группы, состоящей из: 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439 участка Fc по системе нумерации EU.In accordance with one embodiment, the Fc receptor mutation is a replacement in at least one position selected from the group consisting of: 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 or 439 Fc sections according to the EU numbering system.
ИммуноконъюгатыImmunoconjugates
Изобретение также имеет отношение к иммуноконъюгатам, включающим антитело, конъюгированное с цитотоксическим препаратом, таким как химиотерапевтический препарат, токсином (например, имеющим ферментативную активность токсином бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагментом), или радиоактивным изотопом (например, радиоконъюгат).The invention also relates to immunoconjugates comprising an antibody conjugated to a cytotoxic drug, such as a chemotherapeutic drug, a toxin (e.g., having an enzymatic activity of a toxin of a bacterial, fungal, vegetable or animal origin, or a fragment thereof), or a radioactive isotope (e.g., a radio conjugate) .
Химиотерапевтические препараты, применяемые при создании таких иммуноконъюгатов, были описаны выше. Имеющие ферментативную активность токсины и их фрагменты, которые могут быть использованы, включают дифтерийную А-цепь, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А эндотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сакрин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотехены. Для производства радиоконъюгированных антител доступны разнообразные радионуклиды. Примеры включают 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 186Re.Chemotherapeutic drugs used to create such immunoconjugates have been described above. Toxins having enzymatic activity and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragments of diphtheria toxin, endotoxin chain A (from Pseudomonas aeruginosa), ricin chain A, abrin chain A, modestsin chain A, alpha-sacrin, Aleurites fordii proteins, diantin proteins, Phytolaca americana proteins (PAPI, PAPII, and PAP-S), an inhibitor from Momordica charantia, kurtsin, crotin, an inhibitor from Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restricttocin, phenomecin, enomycin and. A variety of radionuclides are available for the production of radioconjugated antibodies. Examples include 212 Bi, 131 I, 131 In, 90 Y, and 186 Re.
Конъюгаты антитела и цитотоксического препарата изготавливаются с применением различных бифункциональных соединяющихся с белком веществ, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как гидрохлорид диметиладипимидата), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как (толиен 2,6-диизосукцинат), и бис-активные фтористые соединения (такие как 1,5-дифторо-2,4-динитробензол). Например, рициновый иммунотоксин может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987). Меченая углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентаацетиловая кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего соединения для конъюгации радионуклеотида с антителом. См., WO94/11026.Antibody and cytotoxic drug conjugates are made using various bifunctional protein-coupled substances, such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolan (IT), bifunctional imidoester derivatives (such as active dimethyl adipid hydrochloride) esters (such as disuccinimyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanine you (such as (
В другом варианте осуществления, антитело может быть конъюгировано с «рецептором» (таким как стрептавидин) для использования при предварительном нацеливании на опухоль, когда пациенту вводится конъюгат антитело-рецептор, затем несвязанный конъюгат удаляется из циркуляции с использованием очищающего препарата, после чего вводится «лиганд» (например, авидин), конъюгированный с цитотоксическим препаратом (например, радионуклеотидом).In another embodiment, the antibody can be conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) for use in pre-targeting a tumor when an antibody-receptor conjugate is administered to a patient, then the unbound conjugate is removed from the circulation using a cleanser, and then the “ligand” is administered "(Eg, avidin) conjugated to a cytotoxic drug (eg, a radionucleotide).
ИммунолипосомыImmunoliposomes
Антитела, раскрытые в данном изобретении могут быть также изготовлены в виде иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитела, изготовлены способами, известными в данной области техники, такими, как описанные в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); и патентах США № 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции описаны в патенте США № 5013556.Antibodies disclosed in this invention can also be made in the form of immunoliposomes. Antibody liposomes are made by methods known in the art, such as those described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); and US patent No. 4485045 and 4544545. Liposomes with increased circulation time are described in US patent No. 5013556.
Применяемые на практике липосомы могут быть получены методом обратного фазового испарения с применением липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин, и ПЭГ-производного фосфатидилэтаноламина (PEG-PE). Липосомы выдавливаются через фильтры с определенным размером пор для получения липосом с желаемым диаметром. Фрагменты Fab' антител по представленному изобретению могут быть конъюгированы в липосомы, как описано в Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982), путем проведения реакции дисульфидного обмена. В липосоме возможно содержится химиотерапевтический препарат (такой как доксорубицин). См. Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989).Practical liposomes can be obtained by reverse phase evaporation using a lipid composition containing phosphatidylcholine, cholesterol, and the PEG derivative of phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposomes are extruded through filters with a defined pore size to obtain liposomes with the desired diameter. Fab 'antibody fragments of the present invention can be conjugated to liposomes as described in Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982), by conducting a disulfide exchange reaction. A chemotherapeutic drug (such as doxorubicin) may be contained in the liposome. See Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81 (19): 1484 (1989).
Фармацевтические композиции антител и полипептидовPharmaceutical compositions of antibodies and polypeptides
Антитела специфически связываются с полипептидами, указанными в данном описании, а также другие молекулы, идентифицированные путем отбора по результатам исследований, описанных в данном изобретении ранее, могут быть назначены для лечения различных расстройств, как описано выше и ниже в форме фармацевтических композиций.Antibodies specifically bind to the polypeptides described in this description, as well as other molecules identified by selection from the studies described in this invention earlier, can be assigned to treat various disorders, as described above and below in the form of pharmaceutical compositions.
Липофектины или липосомы могут быть использованы для доставки полипептидов или антител или композиций в соответствии с данным изобретением в клетки. Когда используются фрагменты антител, предпочтителен наименьший ингибирующий фрагмент, который специфически связывается с доменом связывания белка-мишени. Например, на основе последовательностей вариабельного участка антитела могут быть сконструированы молекулы пептида, которые сохраняют способность связывать белковую последовательность-мишень. Подобные пептиды могут быть синтезированы химически или получены с применением технологий рекомбинантной ДНК, см., например, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993).Lipofectins or liposomes can be used to deliver the polypeptides or antibodies or compositions of this invention to cells. When antibody fragments are used, the smallest inhibitory fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, based on the sequences of the variable region of an antibody, peptide molecules that retain the ability to bind a target protein sequence can be constructed. Such peptides can be synthesized chemically or obtained using recombinant DNA technologies, see, for example, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893 (1993).
Состав, описанный здесь, может также содержать более одного активного соединения, если это необходимо для лечения конкретных симптомов, предпочтительно это соединения, имеющие дополняющую активность, которые не оказывают нежелательного воздействия друг на друга. Альтернативно, или в дополнение, композиция может содержать препарат, который усиливает ее действие, такой как, например, цитотоксический препарат, химиотерапевтический препарат, или рост-ингибирующий препарат. Соответственно, такие молекулы присутствуют в составе в количествах, являющихся эффективными для намеченного назначения.The composition described herein may also contain more than one active compound, if necessary for the treatment of specific symptoms, preferably compounds that have complementary activity that do not have undesirable effects on each other. Alternatively, or in addition, the composition may contain a drug that enhances its effect, such as, for example, a cytotoxic drug, a chemotherapeutic drug, or a growth inhibitory drug. Accordingly, such molecules are present in the composition in amounts that are effective for the intended purpose.
Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, полученные, например, при помощи методик коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки препарата (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или макроэмульсиях. Подобные методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше.The active ingredients can also be enclosed in microcapsules, obtained, for example, using coacervation or interfacial polymerization techniques, for example, hydroxymethyl cellulose or gelatin microcapsules and polymethylmethacrylate microcapsules, respectively, in colloidal drug delivery systems (e.g., liposomes, microbial microspheres, and nanocapsules) or macroemulsions. Similar techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences, see above.
Композиции, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это может быть легко достигнуто при помощи фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны.Compositions used for in vivo administration must be sterile. This can be easily achieved by filtering through sterile filtering membranes.
Могут быть приготовлены препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые основы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, эти основы изготовлены в виде сформированных предметов, например, пленок или микрокапсул. Примеры основ для замедленного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат), или поли(винилалканоил)), полилактиды (патент США № 3773919) сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ этил-L-глутамата, недеградирующий этилен-винилацетат, деградирующие сополимеры молочной и гликолевой кислот, такие как LUPRON DEPOTTM (вводимые инъекцией микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и ацетата лейпролида) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. В то время как полимеры, такие как этилен-винилацетат и молочная кислота-гликолевая кислота, способны высвобождать молекулы в течение более 100 дней, некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткие периоды времени. Когда инкапсулированные антитела остаются в теле в течение долгого времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможных изменениях в иммуногенности. В зависимости от вовлекаемого механизма могут быть разработаны рациональные стратегии для стабилизации. Например, если будет обнаружено, что механизм агрегации заключается в формировании межмолекулярных S-S связей вследствие тио-дисульфидного взаимного обмена, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контроля содержания влаги, применения подходящих добавок и разработки специфических составов полимерного матрикса.Slow release formulations may be prepared. Suitable examples of sustained release preparations include semi-permeable bases of solid hydrophobic polymers containing an antibody, these bases are made in the form of shaped objects, for example, films or microcapsules. Examples of sustained release bases include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate), or poly (vinylalkanoyl)), polylactides (US Pat. No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and γ ethyl-L-glutamate, non-degrading ethylene vinyl acetate, degrading copolymers of lactic and glycolic acids, such as LUPRON DEPOT ™ (injectable microspheres consisting of a copolymer of lactic and glycolic acids and leuprolide acetate) and poly-D - (-) - 3-hydroxybutyric acid. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid are capable of releasing molecules for more than 100 days, some hydrogels release proteins in shorter periods of time. When encapsulated antibodies remain in the body for a long time, they can denature or aggregate as a result of exposure to moisture at 37 ° C, which leads to a loss of biological activity and possible changes in immunogenicity. Rational strategies for stabilization may be developed depending on the mechanism involved. For example, if it is discovered that the aggregation mechanism consists in the formation of intermolecular SS bonds due to thio-disulfide exchange, stabilization can be achieved by modifying sulfhydryl residues, lyophilization from acid solutions, controlling the moisture content, using suitable additives and developing specific polymer matrix formulations.
Диагностическое использование и визуализацияDiagnostic use and visualization
Меченые антитела и их производные и аналоги, которые специфически связываются с полипептидом, могут быть использованы в диагностических целях для обнаружения, диагностики или отслеживания болезней и/или расстройств, связанных с экспрессией, отклонениями экспрессии и/или активностью полипептидов в соответствии с изобретением. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления, антитела в соответствии с данным изобретением могут быть использованы в диагностических исследованиях или визуализующих исследованиях, вовлекающих введение антител субъекту. Изобретение предлагает способ обнаружения отклонений экспрессии полипептида VEGF или альфа5бета1, включающий (а) изучение экспрессии полипептида в клетках (например, в тканях) или жидкостях тела индивидуума с применением одного или более антител в соответствии с данным изобретением и (b) сравнения уровня экспрессии гена со стандартным уровнем экспрессии гена, где увеличение или уменьшение уровня экспрессии исследуемого гена по сравнению со стандартным уровнем экспрессии показательно в отношении отклонений экспрессии.Labeled antibodies and their derivatives and analogs that specifically bind to a polypeptide can be used for diagnostic purposes to detect, diagnose or monitor diseases and / or disorders associated with the expression, expression disorders and / or activity of the polypeptides of the invention. In accordance with one preferred embodiment, the antibodies of the invention can be used in diagnostic studies or imaging studies involving administration of antibodies to a subject. The invention provides a method for detecting abnormalities in expression of a VEGF polypeptide or alpha5beta1, comprising (a) studying the expression of a polypeptide in cells (e.g., tissues) or body fluids of an individual using one or more antibodies of the invention and (b) comparing the level of gene expression with the standard level of gene expression, where an increase or decrease in the level of expression of the test gene compared to the standard expression level is indicative of expression deviations.
Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть использованы для исследования уровней белка в биологическом образце с применением классических иммунологических методов, известных специалистам в данной области техники (например, см. Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Другие основанные на антителах методы обнаружения экспрессии генов белка включают иммунологические исследования, такие как иммуноферментный анализ (ИФА) и радиоиммунный анализ (РИА). Пригодные для анализа с применением антител метки известны в области техники и включают ферментативные метки, такие как оксидазу глюкозы; радиоизотопы, такие как йод (131I, 125I, 123I, 121I), углерод (14C), сера (35S), тритий (3H), индий (115mIn, 113mIn, 112In, 111In), и технеций (99Tc, 99mTc), таллий (201Ti), галлий (68Ga, 67Ga), палладий (103Pd), молибден (99Mo), ксенон (133Xe), фтор (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru; люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцин, и родамин, и биотин.Antibodies in accordance with this invention can be used to study protein levels in a biological sample using classical immunological methods known to specialists in this field of technology (for example, see Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)). Other antibody-based methods for detecting protein gene expression include immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA). Labels suitable for analysis using antibodies are known in the art and include enzymatic labels such as glucose oxidase; radioisotopes such as iodine ( 131 I, 125 I, 123 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 115m In, 113m In, 112 In, 111 In ), and technetium ( 99 Tc, 99m Tc), thallium ( 201 Ti), gallium ( 68 Ga, 67 Ga), palladium ( 103 Pd), molybdenum ( 99 Mo), xenon ( 133 Xe), fluorine ( 18 F) , 153 Sm, 177 Lu, 159 Gd, 149 Pm, 140 La, 175 Yb, 166 Ho, 90 Y, 47 Sc, 186 Re, 188 Re, 142 Pr, 105 Rh, 97 Ru; luminol; and fluorescent labels, such as fluorescein, and rhodamine, and biotin.
Для мечения антител согласно изобретению могут применяться известные в области техники методы. Такие методы включают, но не ограничены, использованием бифункциональных конъюгирующих препаратов (см., например, патенты США №№ 5756065; 5714631; 5696239; 5652361; 5505931; 5489425; 5435990; 5428139; 5342604; 5274119; 4994560; и 5808003; содержание каждого из которых приведено здесь в виде ссылки в полном объеме.Methods known in the art can be used to label antibodies of the invention. Such methods include, but are not limited to, the use of bifunctional conjugating agents (see, for example, US Pat. which are hereby incorporated by reference in full.
Диагностика заболевания или расстройства, связанного с экспрессией или отклонениями экспрессии VEGF и/или альфа5бета1 у животного, предпочтительно млекопитающего, и наиболее предпочтительно человека, может включать этап обнаружения молекул альфа5бета1 и/или VEGF у мелкопитающего. В одном варианте осуществления, после введения антагониста VEGF диагностика включает (a) введение (например, парентерально, подкожно или в внутрибрюшинно) млекопитающему эффективного количества меченого антитела против альфа5бета1; (b) ожидание в течение временного интервала после введения для того, чтобы позволить меченым молекулам преимущественно сконцентрироваться на участках в субъекте, где экспрессируется молекула альфа5бета1 (и позволить концентрации несвязанной меченой молекулы снизиться до фонового уровня); (c) определение фонового уровня; и (d) определение меченой молекулы у субъекта, при этом выявление меченой молекулы у субъекта выше фонового уровня указывает, что субъект имел определенное заболевание или расстройство, связанное с экспрессией или аберрантной экспрессией альфа5бета1. Фоновый уровень может быть определен с помощью различных способов, включая сравнение количества обнаруженной меченой молекулы со стандартным значением, ранее определенным для конкретной системы.Diagnosing a disease or disorder associated with the expression or abnormalities of VEGF and / or alpha5beta1 expression in an animal, preferably a mammal, and most preferably a human, may include the step of detecting alpha5beta1 and / or VEGF molecules in a small-feeding one. In one embodiment, after administration of a VEGF antagonist, the diagnosis comprises (a) administering (eg, parenterally, subcutaneously or intraperitoneally) to the mammal an effective amount of a labeled anti-alpha5beta1 antibody; (b) waiting for a time interval after administration in order to allow labeled molecules to preferentially concentrate on the sites in the subject where the alpha5beta1 molecule is expressed (and to allow the concentration of unbound labeled molecule to drop to the background level); (c) determination of the background level; and (d) determining a labeled molecule in a subject, wherein detecting a labeled molecule in a subject above a background level indicates that the subject has a particular disease or disorder associated with the expression or aberrant expression of alpha5beta1. The background level can be determined using various methods, including comparing the amount of labeled molecule detected with a standard value previously determined for a particular system.
В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления, экспрессия или сверхэкспрессия полипептида альфа5бета1 определяется в диагностических или прогностических исследованиях после введения терапевтического препарата-антагониста VEGF путем оценки уровней альфа5бета1, присутствующего на поверхности клетки (например, путем иммунохимического исследования с применением антител против альфа5бета1). Альтернативно или дополнительно, можно измерить уровни кодирующей полипептид альфа5бета1 нуклеиновой кислоты или мРНК в клетке, например при помощи флуоресцентной гибридизации in situ с использованием основанного на нуклеиновой кислоте зонда, соответствующего кодирующей альфа5бета1 нуклеиновой кислоте или комплементарной ей (FISH; см. WO98/45479 опубликовано в октябре 1998), саузерн блота, нозерн блота, или методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), таких как количественная ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Можно также изучать чрезмерную экспрессию альфа5бета1 путем измерения «слущивающегося» антигена в биологических жидкостях, таких как сыворотка, например, с использованием анализов, основанных на антителах (см. также, например, патент США № 4933294, выданный 12 июня 1990; WO91/05264, опубликованый 18 апреля 1991; патента США 5401638, выданный 28 марта 1995; и Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Помимо перечисленных выше анализов, специалисту-практику доступны различные исследования in vivo. Например, можно подвергнуть клетки в организме млекопитающего обработке антителами, которые возможно помечены обнаружимой меткой, например, радиоактивным изотопом, после чего связывание антител с клетками млекопитающего может быть оценено, например, путем внешнего сканирования радиоактивности или путем анализа биопсии, взятой у млекопитающего, ранее обработанного антителами.In accordance with one specific embodiment, the expression or overexpression of an alpha5beta1 polypeptide is determined in diagnostic or prognostic studies after administration of a VEGF antagonist therapeutic drug by assessing the levels of alpha5beta1 present on the cell surface (e.g., by immunochemical testing using antibodies against alpha5beta1). Alternatively or additionally, it is possible to measure the levels of an alpha5beta1 polypeptide encoding a nucleic acid or mRNA in a cell, for example by in situ fluorescence hybridization using a nucleic acid based probe corresponding to or complementary to an alpha5beta1 nucleic acid (FISH; see WO98 / 45479 published October 1998), Southern blot, Northern blot, or polymerase chain reaction (PCR) methods such as real-time quantitative PCR (RT-PCR). Excessive expression of alpha5beta1 can also be studied by measuring “peeling” antigen in biological fluids such as serum, for example, using antibody-based assays (see also, for example, US Patent No. 4933294, issued June 12, 1990; WO91 / 05264, published April 18, 1991; U.S. Patent 5,401,638, issued March 28, 1995; and Sias et al., J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). In addition to the above analyzes, a variety of in vivo studies are available to the practitioner. For example, you can expose cells in a mammal to an antibody that is possibly labeled with a detectable label, such as a radioactive isotope, after which the binding of antibodies to mammalian cells can be evaluated, for example, by an external scan of radioactivity or by analysis of a biopsy taken from a mammal previously treated antibodies.
Все публикации (включая патенты и патентные заявки), цитированные здесь, введены таким образом в своей полноте в виде ссылок, включая в особенности, предварительную заявку США № 60/784704, поданную 21 марта 2006, предварительную заявку США № 60/785330, поданную 22 марта 2006 г., и предварительную заявку США № 60/871743, поданную 22 декабря 2006 г.All publications (including patents and patent applications) cited herein are hereby incorporated by reference in their entireties, including in particular US provisional application No. 60/784704, filed March 21, 2006, US provisional application No. 60/785330, filed 22 March 2006, and US Provisional Application No. 60/871743, filed December 22, 2006.
Следующие последовательности ДНК были депонированы на условиях Будапештского Соглашения в Американскую Коллекцию Типовых Культур (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, как описано ниже: The following DNA sequences were deposited under the terms of the Budapest Agreement to the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, as described below:
Депонирование было проведено на условиях Будапештского соглашения по международному признанию депозитов микроорганизмов для целей патентных процедур и Правил на основании этого соглашения (Будапештское соглашение). Это гарантирует поддержание жизнеспособной культуры депозитов в течение 30 лет с момента депонирования. Депозиты были сделаны доступными ATCC на условиях Будапештского соглашения и являются субъектом соглашения между Genentech, Inc. и ATCC, которое гарантирует постоянную и неограниченную доступность потомков культуры депозитов для общества с момента выдачи соответствующего патента США или с момента публикации любой патентной заявки США или иностранной, в зависимости от того, что произойдет раньше, и гарантирует доступность потомства для имеющих право доступа, определенное Комиссаром по патентам и торговым маркам в соответствии с 35 U.S.C. 122 и соответствующим ему правилам Комиссара (включая 37 C.F.R. 1.14 со специальной ссылкой на 886 OG 638).The deposit was made under the terms of the Budapest Agreement on the International Recognition of Microorganism Deposits for the Purposes of Patent Procedures and the Rules based on this agreement (Budapest Agreement). This ensures that a viable deposit culture is maintained for 30 years from the date of deposit. Deposits were made available to ATCC under the terms of the Budapest Agreement and are subject to agreement between Genentech, Inc. and ATCC, which guarantees the constant and unlimited accessibility of the descendants of the deposit culture to the public from the moment of granting the corresponding US patent or from the moment of publication of any US or foreign patent application, whichever comes first, and guarantees the availability of offspring for those with the right of access, as defined Commissioner for Patents and Trademarks in accordance with 35 USC 122 and its corresponding Commissioner rules (including 37 C.F.R. 1.14 with special reference to 886 OG 638).
Уполномоченный со стороны, представляющей данную заявку, согласился, что в случае если культура или материал депозита погибнет, или будет потерян, или разрушен в процессе культивирования при приемлемых условиях, материалы будут быстро заменены по извещению на другие такие же. Доступность депонированных материалов не должна быть истолкована как лицензия на использование изобретения в нарушение прав, данных властью любого правительства в соответствии с его патентными законами.The representative of the party submitting this application agreed that if the culture or material of the deposit dies, is lost, or is destroyed during cultivation under acceptable conditions, the materials will be quickly replaced by other ones upon notice. The availability of deposited materials should not be construed as a license to use the invention in violation of the rights granted by the authority of any government in accordance with its patent laws.
Коммерчески доступные реагенты, упоминаемые в Примерах, были использованы в соответствии с инструкциями производителя, если не указано иное. Источником клеток, обозначенных в последующих примерах и в спецификации по номерам доступа ATCC, является Американская Коллекция Типовых Культур, Manassas, VA. Если не указано иначе, настоящее изобретение использует стандартные процедуры технологии рекомбинантной ДНК, такие как те, что описаны здесь выше и в следующих руководствах: Sambrook et al., выше; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.The commercially available reagents referred to in the Examples were used in accordance with the manufacturer's instructions, unless otherwise indicated. The source of cells indicated in the following examples and in the specification for ATCC access numbers is the American Type Culture Collection, Manassas, VA. Unless otherwise indicated, the present invention uses standard recombinant DNA technology procedures, such as those described hereinabove and in the following manuals: Sambrook et al., Above; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc .: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.
В данной спецификации и формуле изобретения слово «содержать» или вариации, такие как «включает» или «включающий», должны пониматься как означающие включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.In this specification and claims, the word “comprise” or variations, such as “includes” or “including”, should be understood to mean the inclusion of the indicated whole or group of whole, but not the exclusion of any other whole or group of whole.
Предшествующее текстовое описание считается достаточным для того, чтобы позволить специалисту в данной области техники осуществить изобретение на практике. Последующие Примеры предложены только для иллюстративных целей и не предполагаются ограничивающими область действия представленного изобретения любым образом. Более того, различные модификации изобретения в дополнение к показанным и описаным здесь будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания и попадают в область действия прилагаемой формулы изобретения.The foregoing text description is considered sufficient to enable a person skilled in the art to practice the invention. The following Examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the presented invention in any way. Moreover, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and fall within the scope of the appended claims.
ПримерыExamples
Пример 1. Восстановление популяции экспрессирующих альфа5бета1 клеток стромы после терапии против VEGFExample 1. The restoration of the population expressing alpha5beta1 stromal cells after therapy against VEGF
Секции ксенотрансплантатов человеческой колоректальной карциномы HT-29, которые были подвергнуты монотерапии антителом против VEGF B20-4.1 в бестимусных мышах, были окрашены на экспрессию антител против альфа5бета1. По сравнению с контрольной группой, обработанной контрольным антителом (антителом против амброзии полыннолистной), в данном исследовании монотерапия B20-4.1 давала среднее время до конечной точки (TTE), которое соответствовало отсутствующей или минимальной активности. Опухоли измерялись два раза в неделю на протяжении 58 дней. Животные были подвергнуты эвтаназии, когда их опухоли достигли объема конечной точки 1000 мм3 или на 58 день, в зависимости от того, что случалось раньше, после чего (TTE) было вычислено для каждой мыши. Результат лечения был определен по проценту задержки роста опухоли (%TGD), определяемому как процентное увеличение в среднем TTE у подвергнутых лечению мышей по сравнению с контрольными, различия считались значащими при 0,01 ≤ P ≤ 0,05, и высокозначимыми при P ≤ 0,01 с использованием анализа Логранка. Среднее значение TTE контрольной группы составляло 20,6 дней. Лечение при помощи монотерапии B20-4.1 давало среднее значение TTE 20,1 дней, что соответствует отсутствию активности.Xenograft sections of human colorectal HT-29 carcinoma that were monotherapy with anti-VEGF B20-4.1 antibody in athymic mice were stained for expression of anti-alpha5beta1 antibodies. Compared to the control group treated with the control antibody (anti-ragweed anti-ragweed antibody), in this study, B20-4.1 monotherapy yielded mean time to end point (TTE), which corresponded to absent or minimal activity. Tumors were measured twice a week for 58 days. Animals were euthanized when their tumors reached the endpoint volume of 1000 mm 3 or on day 58, depending on what happened before, after which (TTE) was calculated for each mouse. The treatment outcome was determined by the percentage of tumor growth inhibition (% TGD), defined as the percentage increase in the average TTE in the treated mice compared to the control, the differences were considered significant at 0.01 ≤ P ≤ 0.05, and highly significant at P ≤ 0 01 using Logrank analysis. The mean TTE of the control group was 20.6 days. Treatment with monotherapy B20-4.1 gave an average TTE of 20.1 days, which corresponds to a lack of activity.
На фигуре 1 показаны секции опухоли, окрашенные антителами против альфа5бета1. Наблюдалось увеличенное восстановление популяции клеток стромы после лечения против VEGF. Эти стромальные клетки были положительными в отношении интегрина альфа5бета1 (светло-зеленое окрашивание).1 shows tumor sections stained with anti-alpha5beta1 antibodies. An increased recovery of the stromal cell population after anti-VEGF treatment was observed. These stromal cells were positive for integrin alpha5beta1 (light green staining).
Пример 2. Антитела против альфа5бета1Example 2. Antibodies against alpha5beta1
Мышам был введен очищенный человеческий альфа5бета1 (Chemicon CC1027). Были выделены клетки плазмоцитомы, экспрессирующие антитела против альфа5бета1 и трансформированы в клеточные линии гибридомы. Две клеточные линии гибридом, обозначенные 7H5.4.2.8 и 7H12.5.1.4, были помещены в ATCC, см. выше. Антитела, полученные из гибридомы 7H5.4.2.8, являлись mIgG2a антителами Каппа (также упоминаемыми здесь как «антитела 7H5»). Антитела, полученные из гибридомы 7H12.5.1.4, являлись mIgG2b антителами Каппа (также упоминаемыми здесь как «антитела 7H12»).Purified human alpha5beta1 (Chemicon CC1027) was administered to mice. Plasmocytoma cells expressing antibodies against alpha5beta1 were isolated and transformed into hybridoma cell lines. Two hybridoma cell lines, designated 7H5.4.2.8 and 7H12.5.1.4, were placed in ATCC, see above. Antibodies derived from 7H5.4.2.8 hybridoma were mIgG2a Kappa antibodies (also referred to herein as “7H5 antibodies"). Antibodies derived from 7H12.5.1.4 hybridoma were Kappa mIgG2b antibodies (also referred to herein as “7H12 antibodies").
Пример 3. Исследования прямого связывания с клетками HUVECExample 3. Direct binding studies with HUVEC cells
Культуры тканей, содержащие растущие человеческие клетки эндотелия пупочной вены (HUVEC), были дважды промыты ФСБ. Клетки были отделены от культурального флакона при помощи 3-4 мл раствора 5 мМ ЭДТА/ФСБ. Клетки были перемешаны со свежей средой для культивирования. Было определено количество клеток в аликвоте смеси. Клетки были центрифугированы и промыты отмывочным буфером (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7,5) один раз. Концентрация клеток была подобрана таким образом, что клетки могли быть высеяны в 25 мкл на лунку на 96-луночные планшеты MSD с высоким связыванием в количестве 25000 клеток на лунку или 4000 клеток на лунку в 384-луночный планшет (Cat #L11XB-1 или #L11XB-2 соответственно, Meso Scale Diagnostics, LLC). Клетки были инкубированы в течение 1 часа при комнатной температуре для того, чтобы произошел захват. Для блокирования лунки в лунку было добавлено 25 мкл базового буфера (30% фетальной телячьей сыворотки (FBS) в TBS (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl) +1 мМ CaCl2/1 мМ MgCl2, pH 7,5), после чего планшет был инкубирован при комнатной температуре от 30 минут до 1 часа.Tissue cultures containing growing human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were washed twice with PBS. Cells were separated from the culture vial using 3-4 ml of a solution of 5 mm EDTA / FSB. The cells were mixed with fresh culture medium. The number of cells in an aliquot of the mixture was determined. Cells were centrifuged and washed with wash buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) once. The cell concentration was chosen so that the cells could be plated at 25 μl per well on 96-well MSD plates with a high binding of 25,000 cells per well or 4000 cells per well in a 384-well plate (Cat # L11XB-1 or # L11XB-2, respectively, Meso Scale Diagnostics, LLC). Cells were incubated for 1 hour at room temperature so that capture occurred. For blocking the wells in the well was added 25 .mu.l of the basic buffer (30% fetal bovine serum (FBS) in TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl) +1 mM CaCl 2/1 mM MgCl 2, pH 7,5), then the plate was incubated at room temperature from 30 minutes to 1 hour.
Была приготовлена серия разведений антител против альфа5бета1 в буфере для анализа (TBS с 1 мМ CaCl2/1 мМ MgCl2, pH 7,2 + 2-4% ФСБ) для получения различных концентраций антител. Лунки были промыты дважды буфером для промывки, после чего остатки жидкости были удалены при помощи впитывающего материала. В лунку было добавлено 25 мкл разведений антител, после чего планшет инкубировали на льду в течение одного часа. Затем лунки были трижды промыты TBS.It was prepared a series of antibodies against alfa5beta1 dilutions in assay buffer (TBS with 1mM CaCl 2/1 mM MgCl 2, pH 7,2 + 2-4% PBS) for obtaining various antibody concentrations. The wells were washed twice with washing buffer, after which the remaining liquid was removed using absorbent material. 25 μl of antibody dilutions were added to the well, after which the plate was incubated on ice for one hour. Then the wells were washed three times with TBS.
25 мкл раствора xmuFc-sulfo-tag с концентрацией 0,5 мкг/мл было добавлено в каждую лунку, после чего планшет инкубировали на льду в течение от 45 минут до одного часа (xmuFc-sulfo-tag представляет собой антитела козы против IgG мыши, номер по каталогу R23-AC-5). Добавляли MSD-SA-tag (номер по каталогу R32-21-AD-5) и инкбуровали на льду от 45 минут до 1 часа. Лунки были трижды промыты TBS. В каждую лунку было добавлено 150 мкл 2х буфера для считывания (4х буфер для считывания MSD, разведенный dH2O до 2х, № по каталогу R92TD-1 (без поверхностно-активных веществ)). Последующий электролюминесцентный (ECL) сигнал был измерен с помощью фотодиодов и выражен в относительных единицах света с использованием сканера MSD (протокол по умолчанию 6000). На фигуре 2 показаны результаты исследований по прямому связыванию с клетками HUVEC. EC50 антитела 7H5 составляла 0,22 нМ. EC50 антитела 7H12 составляла 0,38 нМ.25 μl of a 0.5 μg / ml xmuFc-sulfo-tag solution was added to each well, after which the plate was incubated on ice for 45 minutes to one hour (xmuFc-sulfo-tag is a goat anti-mouse IgG antibody, catalog number R23-AC-5). MSD-SA-tag (catalog number R32-21-AD-5) was added and incubated on ice from 45 minutes to 1 hour. Wells were washed three times with TBS. 150 μl of 2x read buffer was added to each well (4x MSD read buffer diluted with dH 2 O to 2x, R92TD-1 catalog number (no surfactants)). The subsequent electroluminescent (ECL) signal was measured using photodiodes and expressed in relative light units using an MSD scanner (default protocol 6000). Figure 2 shows the results of studies on direct binding to HUVEC cells. The EC50 of the 7H5 antibody was 0.22 nM. The EC50 of the 7H12 antibody was 0.38 nM.
Пример 4. Исследование FACS антител против альфа5бета1Example 4. The study of FACS antibodies against alpha5beta1
Антитела 7H12 или 7H5 были инкубированы или с клетками RAJI (клеточной линией, которая не экспрессирует мРНК альфа5бета1), или с клетками HUVEC (клеточная линия, которая экспрессирует высокие уровни мРНК альфа5бета1) в 100 мкл. Связанные клетки были обнаружены с применением конъюгированных вторичных антител. На фигуре 3 показано при помощи анализа FACS, что 7H12 и 7H5 связываются с клетками HUVEC, но не с клетками RAJI. С использованием тех же методов с синовиоцитами кролика (HIG-82) или клетками макаки-резус (CL-160 фибробласты Macaca mulatta или CRL-1780 клетки эндотелия сетчатки), мы наблюдали связывание 7H12 и 7H5 с клетками кролика или обезьяны.7H12 or 7H5 antibodies were incubated with either RAJI cells (a cell line that does not express alpha5beta1 mRNA) or HUVEC cells (a cell line that expresses high levels of alpha5beta1 mRNA) in 100 μl. Bound cells were detected using conjugated secondary antibodies. Figure 3 shows by FACS analysis that 7H12 and 7H5 bind to HUVEC cells, but not to RAJI cells. Using the same methods with rabbit synoviocytes (HIG-82) or rhesus macaque cells (CL-160 Macaca mulatta fibroblasts or CRL-1780 retinal endothelial cells), we observed the binding of 7H12 and 7H5 to rabbit or monkey cells.
Пример 5. Адгезия клеток к фибронектину в присутствии антител против альфа5бета1Example 5. Adhesion of cells to fibronectin in the presence of antibodies against alpha5beta1
Фибронектин (Sigma F1141 (бычий) или Roche 1080938 (человеческий)) был разведен до 1 мкг/мл в натрий-карбонатном буфере. В 96-луночный планшет NUNC maxisorp было добавлено 100 мкл раствора фибронектина на лунку, после чего планшет был оставлен для связывания при 4°C в течение ночи ((96-луночные иммунологические планшеты NUNC MaxiSorp N/Ster 439454 (VWR 62409-002)). Затем лунки были промыты фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и заблокированы 1% БСА (Sigma A9418) в течение не менее 30 минут. Затем планшеты были промыты три раза ФСБ. В каждую лунку было добавлено 20000 клеток HUVEC, после чего проводилась инкубация с различными концентрациями 7H5 или 7H12 в среде для роста, содержащей 1,4 мМ MgCl2 и 1,4 мМ CaCl2. Затем инкубационная смесь была добавлена к покрытому фибронектином планшету. Приблизительно 20000 клеток в той же среде для роста были добавлены в каждую контрольную лунку без добавления ингибирующих антител.Fibronectin (Sigma F1141 (bovine) or Roche 1080938 (human)) was diluted to 1 μg / ml in sodium carbonate buffer. 100 μl of fibronectin solution per well was added to a 96-well NUNC maxisorp plate, after which the plate was left to bind at 4 ° C overnight ((96-well NUNC MaxiSorp N / Ster 439454 immunological plates (VWR 62409-002)) The wells were then washed with phosphate-buffered saline (FSB) and blocked with 1% BSA (Sigma A9418) for at least 30 minutes, then the plates were washed three times with FSB, and 20,000 HUVEC cells were added to each well, followed by incubation with different concentrations of 7H5 or 7H12 in growth medium containing 1.4 mM MgCl 2 and 1.4 mM CaCl 2. Then incubus Zion mixture was added to the fibronectin coated plate. Approximately 20,000 cells in the same growth medium were added to each control well without adding inhibitory antibodies.
Планшеты были центрифугированы в течение 5 мин при 140 g для синхронизации контакта клеток с субстратом. Клетки были инкубированы в СО2 инкубаторе в течение разных отрезков времени (от 0 до 120 мин). Время инкубации изменялось для каждой клеточной линии. Затем планшеты были промыты ФСБ три раза. Вся жидкость была удалена из ячеек, после чего планшет был заморожен при -80°C. Планшеты были оттаяны при комнатной температуре. В лунки был добавлен буфер CyQuant (Molecular Probes CyQuant C7026), после чего планшет был инкубирован при комнатной температуре в течение 10 мин. Было проведено измерение OD. На фигуре 4 показано, что IC50 антитела 7H5 составила 0,85 мкг/мл (3,44 нМ), а IC50 антитела 7H12 составила 0,7 мкг/мл (4,38 нМ).The plates were centrifuged for 5 min at 140 g to synchronize cell contact with the substrate. Cells were incubated in a CO 2 incubator for different lengths of time (from 0 to 120 minutes). The incubation time varied for each cell line. Then the tablets were washed with FSB three times. All liquid was removed from the cells, after which the plate was frozen at -80 ° C. The tablets were thawed at room temperature. CyQuant buffer (Molecular Probes CyQuant C7026) was added to the wells, after which the plate was incubated at room temperature for 10 minutes. OD measurement was performed. Figure 4 shows that the IC50 of the 7H5 antibody was 0.85 μg / ml (3.44 nM), and the IC50 of the 7H12 antibody was 0.7 μg / ml (4.38 nM).
Пример 6. Исследования размножения с использованием клеток HUVECExample 6. Reproduction studies using HUVEC cells
96-луночные планшеты были покрыты фибронектином (1 мкг/мл) в течение ночи. Затем планшет был промыт ФСБ. В каждую из 96 лунок было добавлено 3000-5000 эндотелиальных клеток (EC), после чего планшет был оставлен для протекания полного прикрепления клеток к лункам. Были добавлены антитела против альфа5 (включая контрольные изотипы). Для каждого условия было использовано 3 лунки. Затем клетки были инкубированы с антителами в течение 1-24 часов. Антитела против интегрина альфа5бета1 были протестированы в нескольких концентрациях (например, 0 мкг/мл, 4 мкг/мл, 16 мкг/мл, 60 мкг/мл 120 мкг/мл).96-well plates were coated with fibronectin (1 μg / ml) overnight. Then the tablet was washed with FSB. 3000-5000 endothelial cells (EC) were added to each of the 96 wells, after which the plate was left to allow complete attachment of cells to the wells. Anti-alpha5 antibodies were added (including control isotypes). For each condition, 3 wells were used. Then the cells were incubated with antibodies for 1-24 hours. Antibodies against integrin alpha5beta1 were tested in several concentrations (for example, 0 μg / ml, 4 μg / ml, 16 μg / ml, 60 μg /
Затем клетки были помечены BrdU путем инкубации их с 2 мкл исходного раствора BrdU (25 мг/мл в ФСБ) в 1 мл среды для культуры тканей (EGM2 + все дополнительные питательные вещества от Clonetics (№ по каталогу CC-4176). После этой инкубации клетки были зафиксированы 4% PFA, обработаны 1 н. HCl в течение 20 мин, несколько раз промыты ФСБ, после чего блокированы 10% козьей сывороткой (ФСБ с 0,2% Тритона) в течение 1-2 часов. Затем клетки были окрашены моноклональными антителами против BrdU (№ по каталогу BD 347580, 1:40) ФСБ с 0,2% Тритона и 5% козьей сыворотки), после чего инкубированы в течение ночи при 44°C. На следующий день клетки были промыты ФСБ 3 раза и инкубированы с конъюгированными с Alexa-594 вторичными антителами против кролика (1:800) при комнатной температуре в темноте в течение 4 часов. Лунки были снова промыты и инкубированы с DAPI (1:10000 в ФСБ) в течение 10 мин. После последней промывки ФСБ общее число клеток в лунке было подсчитано путем фотографирования окрашивания DAPI при 5х. Клетки, которые были положительными по BrdU, на тех же участках были сфотографированы с использованием красного светофильтра. Размножение было оценено как процент клеток, положительных по BrdU на участке. Затем результаты были проанализированы с помощью программы Excel. На фигуре 5А показано общее количество клеток HUVEC через 32 часа при начальном количестве 5000 клеток. На фигуре 5B показано общее количество клеток HUVEC через 24 часа при концентрации антител 20 мкг/мл.The cells were then labeled with BrdU by incubating them with 2 μl of the original BrdU solution (25 mg / ml in PBS) in 1 ml of tissue culture medium (EGM2 + all additional nutrients from Clonetics (catalog number CC-4176). the cells were fixed with 4% PFA, treated with 1N HCl for 20 minutes, washed several times with FSB, and then blocked with 10% goat serum (FSB with 0.2% Triton) for 1-2 hours, then the cells were stained with monoclonal antibodies against BrdU (catalog number BD 347580, 1:40) FSB with 0.2% Triton and 5% goat serum), and then incubated in those Night at 44 ° C. The next day, the cells were washed with FSB 3 times and incubated with Alexa-594 conjugated secondary anti-rabbit antibodies (1: 800) at room temperature in the dark for 4 hours. Wells were washed again and incubated with DAPI (1: 10,000 in PBS) for 10 minutes. After the last FSB wash, the total number of cells in the well was counted by photographing DAPI staining at 5x. Cells that were BrdU positive in the same areas were photographed using a red filter. Reproduction was estimated as the percentage of cells positive for BrdU in the plot. Then the results were analyzed using Excel. Figure 5A shows the total number of HUVEC cells after 32 hours with an initial number of 5000 cells. Figure 5B shows the total number of HUVEC cells after 24 hours at an antibody concentration of 20 μg / ml.
Пример 7. Протокол исследования миграцииExample 7. Migration study protocol
Клетки HUVEC были выращены до образования сплошного слоя в EGM2 с добавлением всех дополнительных питательных веществ от Clonetics (№ по каталогу CC-4176) на 24-луночных планшетах, покрытых 5 мкг/мл фибронектина. Клетки в центре каждой лунки были соскоблены при помощи 2 мкл наконечника пипетки, удаленные соскабливанием клетки были смыты. В различные лунки была добавлена среда для культивирования клеток с контрольным антителом, 7H5 или 7H12. Все тестированные антитела были использованы с концентрацией 20 мкг/мл. Затем клеткам было позволено расти в течение от 1 до 2 дней. За травмированными участками проводилось наблюдение. На фигуре 6 показана фотография миграции клеток HUVEC на 5 мкг/мл фибронектина с 20 мкг/мл антител против альфа5 (7H5) в ECM-2 на 0 часов и на 30 часов. Фигура 7 представляет собой диаграмму % миграции через 30 часов для клеток, обработанных антителами 7H5 или 7H12.HUVEC cells were grown to the formation of a continuous layer in EGM2 with the addition of all additional nutrients from Clonetics (catalog number CC-4176) on 24-well plates coated with 5 μg / ml fibronectin. Cells in the center of each well were scraped off with 2 μl pipette tip, cells removed by scraping were washed off. Cell culture medium with a control antibody, 7H5 or 7H12, was added to different wells. All tested antibodies were used at a concentration of 20 μg / ml. Then the cells were allowed to grow for 1 to 2 days. The injured areas were monitored. Figure 6 shows a photograph of the migration of HUVEC cells at 5 μg / ml fibronectin with 20 μg / ml anti-alpha5 (7H5) antibodies in ECM-2 at 0 hours and 30 hours. Figure 7 is a graph of% migration after 30 hours for cells treated with 7H5 or 7H12 antibodies.
Пример 8. Исследования апоптоза активированных клеток HUVEC с помощью иммуноокрашивания каспазы-3Example 8. Studies of apoptosis of activated HUVEC cells using caspase-3 immunostaining
96-луночные планшеты были покрыты фибронектином (1 мкг/мл) в течение ночи. Планшеты были промыты ФСБ. Затем в каждую из 96 лунок были высеяны 3000-5000 клеток HUVEC и выращены в течение ночи в полной среде (среда EBM-2 (Cambrex CC-3156) с EGM-2 SingleQuots (Cambrex CC-4176)). Если для исследований апоптоза будут использованы мышиные эндотелиальные клетки 2H-11, среда будет средой 50/50 с 10% FBS.96-well plates were coated with fibronectin (1 μg / ml) overnight. The tablets were washed by the FSB. Then, 3000-5000 HUVEC cells were seeded in each of the 96 wells and grown overnight in complete medium (EBM-2 medium (Cambrex CC-3156) with EGM-2 SingleQuots (Cambrex CC-4176)). If mouse endothelial cells 2H-11 are used for apoptosis studies, the medium will be 50/50 medium with 10% FBS.
На следующий день в одном наборе лунок среда была замещена на бессывороточную и проведена инкубация клеток в течение 4-6 часов, чтобы лишить клетки питания и привести их в неразмножающееся состояние. Другой набор лунок поддерживался в полной среде и представлял активно размножающиеся клетки. После 4-6 часов были добавлены антитела (включая контрольные изотипы). Обычно, для каждого состояния были использованы 3 лунки. Затем лунки были инкубированы с антителами в течение 1-48 часов. Антитела против интегрина альфа5бета1 обычно были тестированы в следующих концентрациях: 0 мкг/мл, 4 мкг/мл, 16 мкг/мл, 60 мкг/мл и 120 мкг/мл.The next day, in one set of wells, the medium was replaced with serum-free and the cells were incubated for 4-6 hours to deprive the cells of nutrition and bring them into a non-breeding state. Another set of wells was maintained in complete medium and represented actively proliferating cells. After 4-6 hours, antibodies were added (including control isotypes). Typically, 3 wells were used for each condition. Then the wells were incubated with antibodies for 1-48 hours. Antibodies against integrin alpha5beta1 were usually tested at the following concentrations: 0 μg / ml, 4 μg / ml, 16 μg / ml, 60 μg / ml and 120 μg / ml.
После инкубации клетки были зафиксированы 4% PFA, блокированы 10% козьей сывороткой (ФСБ с 0,2% Тритоном) в течение 1-2 часов, после чего окрашены моноклональным антителом, которое специфически распознает активированную форму Каспазы-3 (например, кроличьим антителом против активной каспазы-3 от Bio Vision, разведенным 1:50 в ФСБ с 0,2% Тритона и 5% козьей сыворотки). Антитела против каспазы-3 и фиксированные клетки были инкубированы при 4°C в течение ночи. На следующий день клетки были промыты ФСБ 3 раза и инкубированы с конъюгированным с Alexa-594 вторичным антителом против кролика (1:800) в течение 4 часов при комнатной температуре в темном месте. Лунки были снова промыты и инкубированы с DAPI (1:10000 в ФСБ) в течение 10 мин. После последней промывки ФСБ, общее число клеток в лунке было подсчитано путем фотографирования окрашивания DAPI при 5х. Клетки, которые давали положительный ответ в исследовании на активную каспазу-3 на тех же участках, были сфотографированы с использованием красного светофильтра. Размножение было оценено как процент клеток, положительных в исследовании на активную каспазу-3 на участке. Затем результаты были проанализированы с помощью программы Excel. На фигуре 8 показано, что 7H5 и 7H12 активно не индуцируют апоптоз.After incubation, the cells were fixed with 4% PFA, blocked with 10% goat serum (PBS with 0.2% Triton) for 1-2 hours, and then stained with a monoclonal antibody that specifically recognizes the activated form of Caspase-3 (for example, rabbit anti-rabbit antibody active caspase-3 from Bio Vision, diluted 1:50 in FSB with 0.2% Triton and 5% goat serum). Caspase-3 antibodies and fixed cells were incubated at 4 ° C overnight. The next day, the cells were washed with FSB 3 times and incubated with Alexa-594 conjugated secondary anti-rabbit antibody (1: 800) for 4 hours at room temperature in a dark place. Wells were washed again and incubated with DAPI (1: 10,000 in PBS) for 10 minutes. After the last FSB wash, the total number of cells in the well was counted by photographing DAPI staining at 5x. Cells that tested positive for active caspase-3 in the same areas were photographed using a red filter. Reproduction was estimated as the percentage of cells positive in the study for active caspase-3 on the site. Then the results were analyzed using Excel. Figure 8 shows that 7H5 and 7H12 do not actively induce apoptosis.
Пример 9. Колометрическое исследование каспазы 3/7 HUVECExample 9. Colometric analysis of caspase 3/7 HUVEC
Были проведены исследования активности каспазы 3/7 с применением антител 7H5 и 7H12 (Анализ на каспазу3/7 Apo-One от Promega, см. Technical Bulletin № 295 для получения инструкций по проведению стандартного анализа в 96 лунках).Caspase 3/7 activity studies were performed using antibodies 7H5 and 7H12 (Caspase 3/7 Apo-One from Promega, see Technical Bulletin No. 295 for instructions on routine analysis in 96 wells).
Обычно, 96-луночные планшеты были покрыты 1 мкг/мл фибронектина в течение ночи. Планшеты были промыты ФСБ. Затем были посеяны 3000-5000 клеток HUVEC на каждую из 96 лунок, после чего выращивались в течение ночи в полной среде (среда EBM-2 (Cambrex CC-3156) с EGM-2 SingleQuots (Cambrex CC-4176)). Если для исследований апоптоза будут использованы мышиные эндотелиальные клетки 2H-11, среда будет средой 50/50 с 10% FBS.Typically, 96-well plates were coated with 1 μg / ml fibronectin overnight. The tablets were washed by the FSB. Then, 3000-5000 HUVEC cells were seeded in each of 96 wells, and then grown overnight in complete medium (EBM-2 medium (Cambrex CC-3156) with EGM-2 SingleQuots (Cambrex CC-4176)). If mouse endothelial cells 2H-11 are used for apoptosis studies, the medium will be 50/50 medium with 10% FBS.
На следующий день в одном наборе лунок среда была замещена на бессывороточную и проведена инкубация клеток, чтобы лишить клетки питания и привести их в неразмножающееся состояние. Другой набор лунок поддерживался в полной среде и представлял активно размножающиеся клетки. После 4-6 часов были добавлены антитела (включая контрольные изотипы). Обычно, для каждого состояния были использованы 3 лунки. Затем клетки были инкубированы с антителами в течение 24-48 часов. Антитела против интегрина альфа5бета1 обычно были тестированы в следующих концентрациях: 0 мкг/мл, 4 мкг/мл, 16 мкг/мл, 60 мкг/мл и 120 мкг/мл.The next day, in one set of wells, the medium was replaced with serum-free and incubated cells to deprive the cells of nutrition and bring them into a non-breeding state. Another set of wells was maintained in complete medium and represented actively proliferating cells. After 4-6 hours, antibodies were added (including control isotypes). Typically, 3 wells were used for each condition. Then the cells were incubated with antibodies for 24-48 hours. Antibodies against integrin alpha5beta1 were usually tested at the following concentrations: 0 μg / ml, 4 μg / ml, 16 μg / ml, 60 μg / ml and 120 μg / ml.
После этого инкубирования в каждую лунку было добавлено 100 мкл реагента на каспазу 3/7 Apo-One, после чего содержимое планшета было подвергнуто осторожному перемешиванию с использованием планшетного шейкера при 300 об/мин в течение 30 секунд. Затем планшет был инкубирован при комнатной температуре от 1 до 8 часов, после чего были сняты данные с использованием планшетного сканера. Была измерена флуоресценция в каждой лунке при возбуждении светом с длиной волны 485 нм и излучении с длиной волны 530 нм.After this incubation, 100 μl of reagent for caspase 3/7 Apo-One was added to each well, after which the contents of the plate were carefully mixed using a plate shaker at 300 rpm for 30 seconds. Then the tablet was incubated at room temperature for 1 to 8 hours, after which the data were recorded using a flatbed scanner. The fluorescence in each well was measured upon excitation by light with a wavelength of 485 nm and radiation with a wavelength of 530 nm.
Флуоресцентный сигнал, возникающий в результате расщепления субстрата каспазы 3/7, означал апоптоз. На фигуре 9 показано, что 7H5 и 7H12 не вызывают активного апоптоза.The fluorescent signal resulting from cleavage of the substrate caspase 3/7, meant apoptosis. The figure 9 shows that 7H5 and 7H12 do not cause active apoptosis.
Пример 10. Изучение образования трубокExample 10. The study of the formation of tubes
Может быть исследована способность антител против альфа5бета1 подавлять образование трубок. Далее приведен пример исследования образования трубок на основе роста клеток HUVEC и исследования формирования трубок, описанного Nakatsu et al. (2003) Microvascular Research 66 (2003) 102-112.The ability of antibodies against alpha5beta1 to inhibit tube formation can be investigated. The following is an example of a tube formation study based on HUVEC cell growth and a tube formation study described by Nakatsu et al. (2003) Microvascular Research 66 (2003) 102-112.
Обычно клетки HUVEC могут быть смешаны с покрытыми детраном микроносителями Cytodex 3 (Amersham Pharmacia Biogech, Piscataway, NJ) в концентрации 400 клеток на микрошарик в 1 мл среды EGF-2. Микрошарики с клетками могут подвергаться осторожному встряхиванию каждые 20 минут в течение 4 часов при 37°С и 5% СО2. После инкубирования, микрошарики могут быть перенесены в культуральный флакон на 25 см2 (BD Biosciences, Bedford, MA) и оставлены на 12-16 ч в 5 мл среды EGМ-2 при 37°СMи 5% СО2. На следующий день микрошарики с клетками могут быть промыты три раза 1 мл EGМ-2 и ресуспендированы при концентрации 200 покрытых клетками частиц/мл в 2,5 мг/мл фибриногена (Sigma, St. Louis, MO). Пятьсот микролитров раствора фибриногена с микрошариками было добавлено к 0,625 единицам тромбина (Sigma) в одной лунке 24-луночного культурального планшета. Фибриноген с микрошариками может образовывать сгустки в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем при 37°С и 5% CO2 в течение 20 минут. В каждую лунку может быть добавлен один миллилитр EGM-2 (содержащей 2% FBS), после чего уравновешен с фибриновым сгустком в течение 30 минут при 37°С и 5% CO2. Среда была удалена из ячейки и заменена 1 мл свежей среды. Приблизительно двенадцать тысяч клеток фибробластов кожи (Detroit 551, ATCC, Rockville, MD) могут быть высеяны на поверхность сгустка. Среда может подвергаться замене через день. Пробы с микрошариками могут отслеживаться в течение 7 дней.Typically, HUVEC cells can be mixed with Cytdex 3 detoxified microcarriers (Amersham Pharmacia Biogech, Piscataway, NJ) at a concentration of 400 cells per bead in 1 ml of EGF-2 medium. Microbeads with cells can be gently shaken every 20 minutes for 4 hours at 37 ° C and 5% CO 2 . After incubation, the beads can be transferred to a 25 cm 2 culture bottle (BD Biosciences, Bedford, MA) and left for 12-16 hours in 5 ml of EGM-2 medium at 37 ° C and 5% CO 2 . The next day, the beads with cells can be washed three times with 1 ml of EGM-2 and resuspended at a concentration of 200 coated cells / ml in 2.5 mg / ml fibrinogen (Sigma, St. Louis, MO). Five hundred microliters of fibrinogen solution with beads was added to 0.625 units of thrombin (Sigma) in one well of a 24-well culture plate. Fibrinogen with microspheres can form clots for 5 minutes at room temperature, and then at 37 ° C and 5% CO 2 for 20 minutes. One milliliter of EGM-2 (containing 2% FBS) can be added to each well and then equilibrated with a fibrin clot for 30 minutes at 37 ° C and 5% CO 2 . The medium was removed from the cell and replaced with 1 ml of fresh medium. About twelve thousand skin fibroblast cells (Detroit 551, ATCC, Rockville, MD) can be seeded onto the surface of the clot. Wednesday can be replaced every other day. Samples with beads can be tracked for 7 days.
Покрытые HUVEC частицы могут быть культивированы в фибриновых гелях при наличии или в отсутствие 500 мкл антител против альфа5бета1 (7H5 и 7H12) на поверхности геля в течение 2-3 дней, после чего перенесены на платформу Nicon Eclipse TE300, снабженного осями в нескольких измерениях и поддерживаться при 37°С и 5% CO2 в течение 72 часов. Финальная концентрация используемых антител может быть вычислена, принимая во внимание объем фибринового геля, т.е. конечная концентрация антител = общий вес антител/объем среды + объем фибринового геля. С использованием программного обеспечения Metamorph можно делать снимки множества частиц каждые 20 минут. Количественная оценка сосудов in vitro может быть произведена с использованием изображений частиц высокого разрешения (например, микроском Olympus IX70 с объективом 4х). Может быть определено количество зачатков на каждой частице по сравнению с необработанным контролем, зачаток сосуда может быть определен как сосуд с длиной, эквивалентной диаметру частицы. Длина зачатка сосуда может быть измерена в условных единицах.HUVEC-coated particles can be cultured in fibrin gels with or without 500 μl of anti-alpha5beta1 antibodies (7H5 and 7H12) on the gel surface for 2-3 days, after which they are transferred to a Nicon Eclipse TE300 platform, equipped with axes in several dimensions and maintained at 37 ° C and 5% CO 2 for 72 hours. The final concentration of antibodies used can be calculated taking into account the volume of the fibrin gel, i.e. final antibody concentration = total antibody weight / volume of medium + volume of fibrin gel. Using Metamorph software, you can capture multiple particles every 20 minutes. In vitro vascular quantification can be done using high resolution particle images (for example, the Olympus IX70 microscope with a 4x lens). The number of primordia on each particle can be determined compared to the untreated control, the primordium of a vessel can be defined as a vessel with a length equivalent to the diameter of the particle. The length of the embryo of the vessel can be measured in arbitrary units.
Пример 11. Исследования комбинирования на моделях опухолей на основе ксенотрансплантатов и аллотрансплантатов. Example 11. Combination studies on tumor models based on xenografts and allografts .
Конкурентное и последовательное назначение терапии антагонистами альфа5бета1 и VEGF может быть оцененено на ксенотрансплантатных/аллотрансплантатных моделях опухолей. Предпочтительно, модели имеют низкий или отсутствующий ответ на монотерапию антагонистом VEGF. Далее приведены примеры моделей, которые могут быть использованы: (a) аллотрансплантат Fo5 у бестимусных голых мышей (опухоль молочной железы, полученная от трансгенной мыши mmtv-Her2) (Finkle, D., et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:2499-2511); (b) ксенотранплатат HT29 у бестимусных голых мышей (человеческая колоректальная линия); и (c) RIP-TbAg (опухоли поджелудочной железы на модели Tg). Лечение может быть назначено внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно. Например, антитела против VEGF могут быть назначены в дозе 10 мг/кг раз в неделю или 5 мг/кг дважды в неделю. Количество вводимого антагониста альфа5бета1, такого как антитело, может быть определено, основываясь на его аффинности и активности. В одном эксперименте антагонист VEGF и антагонист альфа5бета1 могли быть введены по совместному графику в течение 5-6 недель. Альтернативно или дополнительно, антагонист VEGF и антагонист альфа5бета1 могли быть введены последовательно (например, антитела против VEGF в течение трех недель с последующим дозированием антител против альфа5бета1 в течение трех недель).Competitive and sequential administration of therapy with alpha5beta1 and VEGF antagonists can be evaluated in xenograft / allograft tumor models. Preferably, the models have a low or absent response to monotherapy with a VEGF antagonist. The following are examples of models that can be used: (a) Fo5 allograft in nude mice (breast tumor obtained from mmtv-Her2 transgenic mouse) (Finkle, D., et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10: 2499-2511); (b) HT29 xenotransplant in nude mice (human colorectal line); and (c) RIP-TbAg (pancreatic tumors in the Tg model). Treatment may be given intraperitoneally, subcutaneously or intravenously. For example, anti-VEGF antibodies can be administered at a dose of 10 mg / kg once a week or 5 mg / kg twice a week. The amount of alpha5beta1 antagonist administered, such as an antibody, can be determined based on its affinity and activity. In one experiment, a VEGF antagonist and an alpha5beta1 antagonist could be administered on a joint schedule for 5-6 weeks. Alternatively or additionally, a VEGF antagonist and an alpha5beta1 antagonist could be administered sequentially (for example, anti-VEGF antibodies for three weeks, followed by dosing of anti-alpha5beta1 antibodies for three weeks).
Эффективность лечения может быть оценена основываясь, кроме всего прочего, на прогрессировании опухоли, кровоснабжении опухоли, плотности сосудов опухоли, морфологии и/или выживанию. Прогрессирование опухоли может быть измерено, например, по объему опухоли и/или весу опухоли. Для оценки сосудистых изменений, сопутствующих неопластическому прогрессированию, могут быть использованы перфузии ФИТЦ-лецитина, а также окрашивание сосудистых маркеров.The effectiveness of treatment can be evaluated based, inter alia, on tumor progression, tumor blood supply, tumor vascular density, morphology and / or survival. Tumor progression can be measured, for example, by tumor volume and / or tumor weight. To evaluate the vascular changes associated with neoplastic progression, perfusion of FITC-lecithin, as well as staining of vascular markers, can be used.
Пример 12. Модель рака груди человека - MDA-MB231Example 12. The human breast cancer model - MDA-MB231
Самкам голых мышей HRLN были в бок подкожно введены 5×106 клеток рака груди человека (HRLN представляет собой наименование линии). Опухолям позволили расти до тех пор, пока они не достигли среднего размера 80-120 мм3. Затем несущие опухоль мыши были разделены на 4 группы, лечение было начато, когда средний объем опухоли в группе составил приблизительно 100 мм3.5 × 10 6 human breast cancer cells were subcutaneously injected into female flies of HRLN nude mice (HRLN is the name of the line). Tumors were allowed to grow until they reached an average size of 80-120 mm 3 . Then the tumor bearing mice were divided into 4 groups, treatment was started when the average tumor volume in the group was approximately 100 mm 3 .
Объемы опухолей измерялись во время исследований два раза в неделю. Измерение объема опухолей проводилось с использованием стандартного метода с применением штангенциркуля. Моноклональные антитела хомяка против мышиного интегрина альфа5, известные как 10E7, были получены в Genentech. Конечная точка эксперимента была достигнута, когда масса опухоли составляла 1,5 грамма или по истечении 60 дней, в зависимости от того, что случалось раньше. В некоторых случаях наблюдение за реагирующими на терапию проводилось дольше. По достижении конечной точки животные были подвергнуты эвтаназии.Tumor volumes were measured during the studies twice a week. Tumor volume was measured using a standard caliper method. Monoclonal hamster antibodies against mouse integrin alpha5, known as 10E7, were obtained from Genentech. The end point of the experiment was achieved when the tumor mass was 1.5 grams or after 60 days, depending on what happened before. In some cases, response to therapy has been monitored longer. Upon reaching the end point, the animals were euthanized.
Детали лечения описаны ниже.Details of the treatment are described below.
(1) Контрольная группа: были введены контрольные моноклональные антитела против амброзии полыннолистной (10 мг/кг, внутрибрюшинно (вб), раз в неделю).(1) Control group: control monoclonal antibodies against ragweed ragweed (10 mg / kg, intraperitoneally (WB), once a week) were introduced.
(2) Группа единичного препарата против VEGF: введены моноклональные антитела против VEGF B20.4.1 (10 мг/кг, вб, раз в неделю).(2) Single anti-VEGF drug group: monoclonal antibodies against VEGF B20.4.1 (10 mg / kg, wb, once a week) were administered.
(3) Комбинированная группа: B20.41. (10 мг/кг, вб, раз в неделю) и моноклональные антитела хомяка против мышиного интегрина альфа5 10Е7 (10 мг/кг, вб, два раза в неделю).(3) Combined group: B20.41. (10 mg / kg, WB, once a week) and monoclonal hamster antibodies against mouse integrin alpha5 10E7 (10 mg / kg, WB, twice a week).
(4) Группа единичного препарата против интегрина альфа5: моноклональные антитела хомяка против мышиного интегрина альфа5 10Е7 (10 мг/кг, вб, два раза в неделю).(4) Single drug group against integrin alpha5: monoclonal hamster antibodies against mouse integrin alpha5 10E7 (10 mg / kg, wb, twice a week).
Данные контрольной группы:Control group data:
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
Данные группы единичного препарата против VEGF:The data of the group of a single drug against VEGF:
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
Данные группы препарата против VEGF и альфа5бета1: The data of the group of the drug against VEGF and alpha5beta1:
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
Данные группы единичного препарата против интегрина альфа5:The data of the group of a single drug against integrin alpha5:
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
(мм3)Tv
(mm 3 )
Эти предварительные данные показывают ранние признаки комбинированной активности антагонистов альфа5 и VEGF.These preliminary data show early signs of the combined activity of alpha5 and VEGF antagonists.
После окончания исследования были вычислены средние объемы опухоли для каждой группы (фигура 11А). Также были построены диаграммы Каплана-Мейера, показывающие процент животных, остающихся в эксперименте как функцию от времени (фигура 11B). Данные показывают, что антитела против интегрина α5βl увеличивают эффективность антагониста VEGF на модели рака груди.After the study, the average tumor volumes for each group were calculated (Figure 11A). Kaplan-Meyer charts were also constructed showing the percentage of animals remaining in the experiment as a function of time (Figure 11B). The data show that antibodies against integrin α5βl increase the potency of the VEGF antagonist in a breast cancer model.
Пример 13. 7H12 и бевацизумаб на модели заживления раны уха кроликаExample 13.7H12 and bevacizumab in a rabbit ear wound healing model
Новозеландские белые кролики были взвешены и анастезированы изофлюораном. У каждого кролика с внутренней поверхности и по краям обеих ушных раковин была выстрижена шерсть. Оставшаяся шерсть была удалена с операционных полей депилирующим лосьоном. Операционные поля были очищены бетадиновым скрабом с последующим смачиванием спиртом. Круглый 8 мм прокалывающий инструмент для биопсии был использован для получения в каждом ухе раны глубиной до хряща. Лежащий ниже перихондрий был удален при помощи периостального подьемника и тонких ножниц. На каждую рану был помещен адгезивный перевязочный материал Opsite®. После чего кролик был оставлен до выхода из-под наркоза. Ежедневно перевязочный материал Opsite® удалялся, раны осматривались, локально применялось лечение, и накладывался свежий перевязочный материал. Размер раны определялся путем измерения диаметра раны на 0 (немедленно после операции), 7, 10, 14 и 18 день.New Zealand white rabbits were weighed and anesthetized with isofluorane. Each rabbit had a hair trimmed from the inner surface and along the edges of both auricles. The remaining coat was removed from the surgical field with a depilatory lotion. The surgical fields were cleaned with a betadine scrub, followed by wetting with alcohol. A
Группы лечения были следующими:The treatment groups were as follows:
Бевацизумаб (антитело против VEGF) 100 мкл в 30 мкл в каждую рану ежедневно (n=4)Bevacizumab (anti-VEGF antibody) 100 μl in 30 μl in each wound daily (n = 4)
7H12 (антитело против альфа5бета1) 100 мкг в 30 мкл в каждую рану ежедневно (n=4)7H12 (anti-alpha5beta1 antibody) 100 μg in 30 μl per wound daily (n = 4)
Бевацизумаб 100 мкг в 15 мкл и 7H12 100 мкг в 15 мкл в каждую рану ежедневно (n=4)
Трастузумаб (антитело против HER2) 100 мкг в 30 мкл в каждую рану ежедневно (n=3)Trastuzumab (anti-HER2 antibody) 100 μg in 30 μl to each wound daily (n = 3)
Данные показывают, что комбинированная терапия антагонистом VEGF и антагонистом альфа5бета1 имела поразительный эффект на эту модель ангиогенеза по сравнению с препаратами по одному (фиг. 10).The data show that combination therapy with a VEGF antagonist and an alpha5beta1 antagonist had a striking effect on this model of angiogenesis compared to drugs alone (Fig. 10).
Пример 14. Комбинированная терапия антителами против альфа5бета1 и антителами против VEGF при раке кишечникаExample 14. Combination therapy with antibodies against alpha5beta1 and antibodies against VEGF in colon cancer
Самкам мышей HRLN nu/nu было введено 1 мм3 фрагментов опухоли HT29 (опухоль кишечника) подкожно в бок. Опухолям позволили расти до тех пор, пока они не достигли среднего размера 80-120 мм3, после лечения. Затем несущие опухоль мыши были разделены на 4 группы:Female HRLN nu / nu mice were injected with 1 mm 3 of HT29 tumor fragments (intestinal tumor) subcutaneously in the flank. Tumors were allowed to grow until they reached an average size of 80-120 mm 3 after treatment. Then, tumor-bearing mice were divided into 4 groups:
мышейNumber
Измерение объема опухоли проводилось дважды в неделю с применением стандартного метода измерения штангенциркулем. Моноклональные антитела хомяка против мышиного альфа5, известные как 10E7, были получены в Genentech. В качестве контрольного IgG были использованы моноклональные антитела против амброзии полыннолистной. Вес тела был измерен 5 раз в течение первых 2 дней, после этого два раза в неделю до конца исследований. Эксперимент оканчивался при объеме опухоли 1 грамм или на 90 день, в зависимости от того, что наступало раньше. Некоторые реагирующие на лечение животные наблюдались дольше. По достижении конечной точки животные были подвергнуты эвтаназии. Дозировка составляла 10 мл/кг (или 200 мкл на 20 граммовую мышь), объем был подобран в соответствии с весом тела. Для животных, показывающих полную регрессию (CR), в конечной точке ткани с участка имплантации опухоли были собраны и зафиксированы формалином с последующим хранением в 70% EtOH для дальнейшего изучения. Все образцы для заморозки были помещены в криомолд, обернуты в фольгу и быстро заморожены в жидком азоте.Tumor volume was measured twice a week using a standard caliper measurement method. Monoclonal anti-mouse alpha5 hamster antibodies, known as 10E7, were obtained from Genentech. Monoclonal antibodies against ragweed ragweed were used as control IgG. Body weight was measured 5 times during the first 2 days, then twice a week until the end of the study. The experiment ended with a tumor volume of 1 gram or 90 days, depending on what came before. Some treatment-responsive animals were observed longer. Upon reaching the end point, the animals were euthanized. The dosage was 10 ml / kg (or 200 μl per 20 gram mouse), the volume was selected in accordance with body weight. For animals showing complete regression (CR), at the end point of the tissue from the site of implantation, the tumors were collected and fixed with formalin, followed by storage in 70% EtOH for further study. All samples for freezing were placed in a cryomold, wrapped in foil and quickly frozen in liquid nitrogen.
После конечной точки исследования, были вычислены средние объемы опухоли для каждой группы (фигура 12А). Также были построены диаграммы Каплана-Мейера, показывающие процент животных, остающихся в эксперименте как функцию времени (фигура 13B). Данные показывают, что антитело против интегрина α5βl увеличивает эффективность VEGF на модели рака кишечника.After the end point of the study, mean tumor volumes for each group were calculated (Figure 12A). Kaplan-Meyer charts were also constructed showing the percentage of animals remaining in the experiment as a function of time (Figure 13B). The data show that the anti-integrin α5βl antibody increases the effectiveness of VEGF in a model of intestinal cancer.
Пример 15. Антитела против альфа5бета1 и химиотерапия при раке кишечника.Example 15. Antibodies against alpha5beta1 and chemotherapy for bowel cancer.
Самкам мышей HRLN nu/nu было введено 5×106 клеток опухоли HCT116 (опухоль кишечника) подкожно в бок. Опухолям позволили расти до тех пор, пока они не достигли среднего размера 80-120 мм3, после чего была начата терапия. Затем несущие опухоль мыши были разделены на 4 группы:Female HRLN nu / nu mice were injected with 5 × 10 6 HCT116 tumor cells (intestinal tumor) subcutaneously in the flank. Tumors were allowed to grow until they reached an average size of 80-120 mm 3 , after which therapy was started. Then, tumor-bearing mice were divided into 4 groups:
мышейNumber
Измерение объема опухоли проводилось дважды в неделю с применением стандартного метода измерения штангенциркулем. Моноклональные антитела хомяка против мышиного альфа5, известные как 10E7, были получены в Genentech. Вес тела был измерен 5 раз в течение первых 2 дней, после этого два раза в неделю до конца исследований. Эксперимент оканчивался при объеме опухоли 1,5 грамма или на 60 день, в зависимости от того, что наступит раньше. Некоторые реагирующие на лечение животные наблюдались дольше. По достижении конечной точки животные были подвергнуты эвтаназии. Дозировка была 10 мл/кг (или 200 мкл на 20 граммовую мышь), объем был подобран в соответствии с весом тела. 10E7 вводились за 30 минут до введения иринотекана. Для животных, показывающих полную регрессию (CR), в конечной точке ткани с участка имплантации опухоли были собраны и зафиксированы формалином с последующим хранением в 70% EtOH для дальнейшего изучения. Все образцы для заморозки были помещены в криомолд, обернуты в фольгу и быстро заморожены в жидком азоте.Tumor volume was measured twice a week using a standard caliper measurement method. Monoclonal anti-mouse alpha5 hamster antibodies, known as 10E7, were obtained from Genentech. Body weight was measured 5 times during the first 2 days, then twice a week until the end of the study. The experiment ended with a tumor volume of 1.5 grams or on
После конечной точки исследования, были вычислены средние объемы опухоли для каждой группы (фигура 13А). Также были построены диаграммы Каплана-Мейера, показывающие процент животных, остающихся в эксперименте как функцию времени (фигура 13B). Данные показывают, что антитела против интегрина альфа5бета1 не увеличивают эффективность действия химиотерапевтического препарата (иринотекана) на модели рака кишечника, но также и не препятствует действию химиотерапевтического препарата. Наблюдения согласовывались с нашими предположениями о том, что повреждение сосудов, происходящее до лечения антагонистом альфа5бета1, может быть весьма полезным при антиангиогенезе, а в частности при антиангиогенезе в онкологическом окружении. Подобное повреждение сосудов может быть вызвано антагонистом VEGF, таким как антитело AVASTIN®. Сам по себе химиотерапевтический препарат в данной модели не вызывает заметного повреждения сосудов. Должно предполагаться применение всех этих препаратов (антагонист VEGF/антагонист альфа5бета1/химиотерапевтический препарат) одновременно или последовательно таким образом, что антагонист VEGF присутствует и вызывает сосудистые повреждения.After the end point of the study, mean tumor volumes for each group were calculated (Figure 13A). Kaplan-Meier diagrams were also constructed showing the percentage of animals remaining in the experiment as a function of time (Figure 13B). The data show that antibodies against integrin alpha5beta1 do not increase the effectiveness of the chemotherapeutic drug (irinotecan) in the model of intestinal cancer, but also does not interfere with the action of the chemotherapeutic drug. The observations were consistent with our assumptions that vascular damage that occurs before treatment with an alpha5beta antagonist can be very useful in antiangiogenesis, and in particular in antiangiogenesis in an oncological environment. Similar vascular injury may be caused by an antagonist of VEGF, such as AVASTIN ® antibody. The chemotherapeutic drug itself in this model does not cause noticeable vascular damage. The use of all these drugs (VEGF antagonist / alpha5beta1 antagonist / chemotherapeutic drug) should be contemplated simultaneously or sequentially so that the VEGF antagonist is present and causes vascular damage.
Пример 16. Графики Скетчарда для альфа5бета1Example 16. Sketchard Graphics for alpha5beta1
Антитела против альфа5бета1 были йодированы с использованием метода lodogen, радиоактивно меченые антитела были очищены от свободного 125I-Na при помощи гель-фильтрации с применением колонки PD-10. Клетки R9ab, клеточная линия фибробластов кролика (приобретенная у АТСС, No.CCL-193) были высеяны в количестве приблизительно 50000 на лунку в 24-луночные планшеты и инкубированы в течение 48 часов в 5% СO2 при 37°С. Клетки были промыты три раза буфером для связывания (50:50 DMEM/среда F12, содержащая 2% FBS и 50 мМ HEPES, рН 7,2), после чего инкубированы на льду в течение 15 минут. Промытые клетки были инкубированы в течение 4 часов на льду с приблизительно 50 пМ 125I-моноклональных антител против альфа5бета1, содержащих уменьшающиеся концентрации немеченых моноклональных антител против альфа5бета1, разведенные серийно 0,5 мкМ в буфере для связывания в 13 концентрациях, отобранных в трех повторностях. Клетки были промыты три раза буфером для связывания, после чего солюбилизированы 200 мкл лизирующего буфера с SDS (1% SDS, 8 М мочевины, 100 мМ глицина, рН 3,0). Была определена радиоактивность лизатов клеток на гамма-счетчике Wallac Wizard 1470. Данные по связыванию были оценены с использованием программы Genentech «NewLigand», которая использует алгоритм аппроксимации кривой Мансона и Робарда (Munson, P. and Robard, D. (1980) Anal. Biochem. 107: 220-239) для определения сродства связывания антитела и концентрации участков связывания. На фигурах 14 и 15 показано, что в этих исследованиях связывания антитела 7H5 имеют Kd 0,10 нМ, а антитела 7H12 имеют Kd 0,30 нМ соответственно.Antibodies against alpha5beta1 were iodinated using the lodogen method, radioactively labeled antibodies were purified from free 125 I-Na by gel filtration using a PD-10 column. R9ab cells, rabbit fibroblast cell line (purchased from ATCC, No.CCL-193) were seeded at approximately 50,000 per well in 24-well plates and incubated for 48 hours in 5% CO 2 at 37 ° C. Cells were washed three times with binding buffer (50:50 DMEM / F12 medium containing 2% FBS and 50 mM HEPES, pH 7.2), and then incubated on ice for 15 minutes. The washed cells were incubated for 4 hours on ice with approximately 50 pM 125 I-monoclonal antibodies against alpha5beta1 containing decreasing concentrations of unlabeled monoclonal antibodies against alpha5beta1 diluted serially with 0.5 μM in binding buffer in 13 concentrations, taken in triplicate. Cells were washed three times with binding buffer, after which 200 μl of lysing buffer with SDS was solubilized (1% SDS, 8 M urea, 100 mM glycine, pH 3.0). The radioactivity of cell lysates was determined on a Wallac Wizard 1470 gamma counter. Binding data were evaluated using the Genentech NewLigand program, which uses the Manson and Robard curve approximation algorithm (Munson, P. and Robard, D. (1980) Anal. Biochem 107: 220-239) for determining the binding affinity of an antibody and the concentration of binding sites. Figures 14 and 15 show that in these binding studies, 7H5 antibodies have a Kd of 0.10 nM and 7H12 antibodies have a Kd of 0.30 nM, respectively.
Пример 17. Исследования картирования эпитопов/конкурентного связывания IgG против интегрина альфа5бета1Example 17. Studies mapping epitopes / competitive binding of IgG against integrin alpha5beta1
Сначала серия трехкратных разведений IgG против интегрина α5β1 была инкубирована в 96-луночном планшете Nunc Maxisorp, покрытом антигеном - человеческим интегрином α5β1 (1 мкг/мл, R&D) в буфере PBST (ФСБ и 0,5% (вес/объем) БСА, и 0,05% (объемных) Твин 20) в течение 1-2 часов при комнатной температуре, с последующим добавлением 0,3 нМ биотинилированного hIgG1 h7H5.vl (варианта антитела 7H5, полученного Genentech, Inc.), который сначала был определен по субмаксимальному сигналу связывания (50-70%), в течение 15 минут. Затем планшет был промыт 5 раз буфером PBT (ФСБ и 0,05% (объемных) Твин 20). Связанные биотинилированные h7H5.vl hIgG1 были обнаружены при помощи конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена (Pierce), разведенной 1:2500 в буфере PBST, проявленной с помощью субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) в течение приблизительно 5 минут, реакция была прекращена 1,0 М H3PO4, после чего проведены измерения на спектрофотометре при 450 нм. Кривые были подобраны с применением программы подбора кривых с нелинейной регрессией и четырьмя параметрами (Kaleidagraph, Synergy Software).First, a series of three-fold dilutions of IgG against integrin α5β1 was incubated in a 96-well Nunc Maxisorp plate coated with antigen - human integrin α5β1 (1 μg / ml, R&D) in PBST buffer (FSB and 0.5% (w / v) BSA, and 0.05% (volume) Tween 20) for 1-2 hours at room temperature, followed by the addition of 0.3 nM biotinylated hIgG1 h7H5.vl (a variant of the 7H5 antibody obtained by Genentech, Inc.), which was first determined by submaximal binding signal (50-70%), within 15 minutes. The plate was then washed 5 times with PBT buffer (FSB and 0.05% (volume) Tween 20). Bound biotinylated h7H5.vl hIgG1 was detected using streptavidin conjugated horseradish peroxidase (Pierce) diluted 1: 2500 in PBST buffer developed using 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine substrate (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) for approximately 5 minutes, the reaction was terminated with 1.0 M H 3 PO 4 , after which measurements were carried out on a spectrophotometer at 450 nm. Curves were selected using a nonlinear regression curve fitting program with four parameters (Kaleidagraph, Synergy Software).
На фигуре 16 показано, что связанные h7H5.v1 конкурируют с увеличивающимися количествами холодного m7H5. Фактически, кривая конкуренции m7H5 была почти идентичной кривой конкуренции h7H5.v1 (данные не показаны). Холодные m7H12 также конкурировали с биотин-h7H5.vl при связывании с альфа5бета1, демонстрируя, что эпитопы связывания альфа5бета1 h7H5.v1 и m7H12 перекрываются. С другой стороны, контрольное антитело не конкурировало со связанным h7H5.vl.Figure 16 shows that bound h7H5.v1 compete with increasing amounts of cold m7H5. In fact, the m7H5 competition curve was almost identical to the h7H5.v1 competition curve (data not shown). Cold m7H12 also competed with biotin-h7H5.vl for binding to alpha5beta1, demonstrating that the alpha5beta1 binding epitopes of h7H5.v1 and m7H12 overlap. On the other hand, the control antibody did not compete with the bound h7H5.vl.
Claims (37)
антитело против альфа5бета1 по п.1 или 2 и
инструкции по обнаружению альфа5бета1 у субъекта, который подвергался лечению антагонистом VEGF.29. A kit for detecting alpha5beta1 in a subject that has been treated with a VEGF antagonist, containing
an antibody against alpha5beta1 according to claim 1 or 2, and
instructions for detecting alpha5beta1 in a subject who has been treated with a VEGF antagonist.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US78470406P | 2006-03-21 | 2006-03-21 | |
US60/784,704 | 2006-03-21 | ||
US78533006P | 2006-03-22 | 2006-03-22 | |
US60/785,330 | 2006-03-22 | ||
US60/871,743 | 2006-12-22 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012129350/10A Division RU2012129350A (en) | 2006-03-21 | 2012-07-11 | COMBINED THERAPY USING ALPHA 5BETA1 ANTAGONISTS |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2008141706A RU2008141706A (en) | 2010-04-27 |
RU2465282C2 true RU2465282C2 (en) | 2012-10-27 |
Family
ID=42672105
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008141706/10A RU2465282C2 (en) | 2006-03-21 | 2007-03-21 | Combined therapy with using alpha5beta1 antagonists |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2465282C2 (en) |
-
2007
- 2007-03-21 RU RU2008141706/10A patent/RU2465282C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MOULD et al, "Defining the topology of integrin alpha5betal-fibronectin interactions using inhibitory anti-alpha5 and anti-betal monoclonal antibodies. Evidence that the synergy sequence of fibronectin is recognized by the amino-terminal repeats of the alpha5 subunit", J Biol Chem., 1997 Jul 11; 272(28), с.17283-17292. РОЙТ А. и др. ИММУНОЛОГИЯ. Пер. с англ. - М.: Мир, 2000-592 с., с.110-113, 150-159. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2008141706A (en) | 2010-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1989231B1 (en) | Combinatorial therapy involving alpha5beta1 antagonists | |
RU2490277C2 (en) | Novel antibodies | |
JP6051048B2 (en) | Novel anti-α5β1 antibody and use thereof | |
RU2465282C2 (en) | Combined therapy with using alpha5beta1 antagonists |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170322 |