RU2464570C2 - Diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms - Google Patents

Diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms Download PDF

Info

Publication number
RU2464570C2
RU2464570C2 RU2010147074/15A RU2010147074A RU2464570C2 RU 2464570 C2 RU2464570 C2 RU 2464570C2 RU 2010147074/15 A RU2010147074/15 A RU 2010147074/15A RU 2010147074 A RU2010147074 A RU 2010147074A RU 2464570 C2 RU2464570 C2 RU 2464570C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mrna
cervical
gene
ink4a
hprt
Prior art date
Application number
RU2010147074/15A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2010147074A (en
Inventor
Владимир Константинович Боженко (RU)
Владимир Константинович Боженко
Елена Александровна Кудинова (RU)
Елена Александровна Кудинова
Олег Петрович Близнюков (RU)
Олег Петрович Близнюков
Надежда Васильевна Мельникова (RU)
Надежда Васильевна Мельникова
Ольга Владимировна Бурменская (RU)
Ольга Владимировна Бурменская
Original Assignee
Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр рентгенрадиологии" Министерства здравоохранения и социального развития России
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр рентгенрадиологии" Министерства здравоохранения и социального развития России filed Critical Федеральное государственное учреждение "Российский научный центр рентгенрадиологии" Министерства здравоохранения и социального развития России
Priority to RU2010147074/15A priority Critical patent/RU2464570C2/en
Publication of RU2010147074A publication Critical patent/RU2010147074A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2464570C2 publication Critical patent/RU2464570C2/en

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention aims at detecting mRNA expression of the p16(INK4a) gene in cervical tissue samples. A diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms on the basis of detecting p16 gene mRNA in the cervical scraping material with the use of quantitative PCR involves sampling the examined cervical material, analysing p16 mRNA expression as a potential progression marker of cervical dysplastic processes, as well as analysing the mRNA concentration of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT-1) gene. It is combined with evaluating the level of relative mRNA expression of the p16 gene to the level of mRNA expression of HPRT-1. The relation of the level of mRNA expression of the p16 gene to mRNA expression of HPRT-1 more than 93 relative units corresponds with squamous cell carcinoma.
EFFECT: technique enables higher effectiveness of diagnosing premalignant cervical processes.
1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и предназначено для обнаружения экспрессии мРНК гена р16 (INK4a) в образцах ткани шейки матки, полученных путем соскоба, с различной патологией: рак шейки матки, CIN различной степени.The invention relates to medicine, in particular to oncology, and is intended to detect expression of the p16 gene (INK4a) mRNA in cervical tissue samples obtained by scraping with various pathologies: cervical cancer, CIN of various degrees.

Рак шейки матки занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости женщин 15-39 лет в Российской Федерации (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). Установлено, что этиологическим агентом его развития являются вирусы папилломы человека группы «высокого риска заболевания» (ВПЧ 16, 18 и родственные им) (Zur Hausen Н., 1989, 2002). Только у части инфицированных женщин как результат персистенции вируса наблюдается развитие цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN). Пристального внимания заслуживает изучение факторов, способствующих развитию рака шейки матки у данной группы больных. Общеизвестно, что изолированное использование цитологического исследования не позволяет достоверно оценить прогностическую значимость диспластических процессов шейки матки.Cervical cancer occupies the first place in the structure of the oncological incidence of women aged 15-39 in the Russian Federation (Davydov M.I., Axel E.M., 2008). It has been established that the etiological agent for its development is human papilloma viruses of the “high-risk disease” group (HPV 16, 18 and related ones) (Zur Hausen N., 1989, 2002). Only a part of infected women as a result of the persistence of the virus develop cervical intraepithelial neoplasia (CIN). The study of factors contributing to the development of cervical cancer in this group of patients deserves close attention. It is well known that the isolated use of cytological studies does not allow to reliably assess the prognostic significance of cervical dysplastic processes.

Алгоритм обследования и лечения пациенток цервикальными интраэпителиальными неоплазиями тесно связан с выявлением прогностических молекулярно-биологических маркеров предраковых поражений и рака шейки матки.The algorithm for examining and treating patients with cervical intraepithelial neoplasia is closely associated with the identification of prognostic molecular biological markers of precancerous lesions and cervical cancer.

Использование биомаркеров, которые позволяют идентифицировать потенциально опасные группы инфекции ВПЧ, может улучшить точность скрининга рака шейки матки. К ним относят обнаружение мРНК ВПЧ Е6/Е7 (APTIMA), иммуноцитохимическое выявление экспрессии р16 (INK4a), определение ДНК ВПЧ (НС2) для выявления женщин с высоким риском неоплазий шейки матки.Using biomarkers that identify potentially dangerous HPV infection groups can improve the accuracy of cervical cancer screening. These include detection of HPV E6 / E7 mRNA (APTIMA), immunocytochemical detection of p16 expression (INK4a), determination of HPV DNA (HC2) to identify women at high risk for cervical neoplasia.

Сверхэкспрессия ингибитора циклинзависимой киназы p16INK4a (р16) в диспластических клетках эпителия шейки матки указывает на активное присутствие вирусных онкогенов Е7. Несмотря на сильную корреляцию между присутствием вирусных онкогенов Е7 и выраженной экспрессией p16 (INK4a), должны учитываться некоторые морфологические особенности при оценке цитологических препаратов. Так, при наличии цервикальной интраэпителиальной неоплазии в случае прогрессирования дисплазии при иммуноокрашивании с антителами к р16 отмечается постепенное увеличение доли позитивных клеток, начиная с базального и парабазальных слоев. Известно, что при иммуноцитохимическом окрашивании с антителами к р16 позитивное окрашивание выявляется не только в клетках с морфологическими признаками дисплазии, но и в клетках метаплазированного эпителия, что может привести к ложноположительным результатам. В препаратах может наблюдаться спорадическое физиологическое окрашивание неизмененного железистого эпителия шейки матки (P.Samarawardana, D.L. Dehn, M.Singh et al., 2010). Таким образом, из уровня техники известно, что, несмотря на стандартизованное получение монослойного препарата, оценка результатов иммуноцитохимического исследования с антителами к р16 осуществлялась полуколичественным способом.Overexpression of the p16INK4a (p16) cyclin-dependent kinase inhibitor in cervical dysplastic cells indicates the active presence of E7 viral oncogenes. Despite the strong correlation between the presence of E7 viral oncogenes and pronounced expression of p16 (INK4a), some morphological features should be taken into account when evaluating cytological preparations. So, in the presence of cervical intraepithelial neoplasia in the case of progression of dysplasia with immunostaining with antibodies to p16, there is a gradual increase in the proportion of positive cells, starting with the basal and parabasal layers. It is known that in immunocytochemical staining with antibodies to p16, positive staining is detected not only in cells with morphological signs of dysplasia, but also in cells of metaplasized epithelium, which can lead to false-positive results. In the preparations, sporadic physiological staining of the unchanged glandular epithelium of the cervix can be observed (P. Samarawardana, D.L. Dehn, M. Singh et al., 2010). Thus, it is known from the prior art that, despite the standardized preparation of a monolayer preparation, the results of immunocytochemical studies with antibodies to p16 were evaluated in a semi-quantitative manner.

Из описания к патенту US006709832B1 изобретение "Method of early diagnosis of carcinomas" (опубликовано 23.03.2004) известно, что одним из направлений диагностики предраковых процессов и рака шейки матки является определение мРНК белка р16 в материале парафиновых блоков при ретроспективном исследовании диагностического материала. Однако данная методика является инвазивной - на начальном этапе необходимо выполнение биопсии шейки матки с последующим гистологическим исследованием. Учитывая актуальность скрининга рака шейки матки и хорошие показатели известного из уровня техники подхода, заключающегося в количественном анализе экспрессии гена р16, задачей изобретения является расширение арсенала технических средств данного назначения. При этом технический результат заключается в реализации указанного назначения.From the description of patent US006709832B1, the invention “Method of early diagnosis of carcinomas” (published March 23, 2004) is known that one of the directions for the diagnosis of precancerous processes and cervical cancer is the determination of p16 protein mRNA in the material of paraffin blocks in a retrospective study of diagnostic material. However, this technique is invasive - at the initial stage, a biopsy of the cervix with subsequent histological examination is necessary. Given the relevance of cervical cancer screening and good indicators of the prior art approach, consisting in a quantitative analysis of p16 gene expression, the object of the invention is to expand the arsenal of technical means for this purpose. In this case, the technical result consists in the realization of the indicated purpose.

Следовательно, тестирование мРНК гена р16 (INK4a) по материалу соскоба шейки матки с использованием количественной ПЦР может быть использовано в качестве дополнительного маркера для повышения эффективности скрининга рака шейки матки и позволит прогнозировать распространенные поражения шейки матки.Therefore, testing the p16 gene (INK4a) mRNA using cervical scraping material using quantitative PCR can be used as an additional marker to increase the efficiency of cervical cancer screening and will allow prediction of common cervical lesions.

Технический результат достигается благодаря тому, что способ определения мРНК гена р16 (INK4a) в материале соскоба шейки матки с использованием количественной ПНР включает забор исследуемого материала из шейки матки путем соскоба у пациенток с цитологически установленной цервикальной интраэпителиальной неоплазией, что не требует выполнения биопсии и достигается неинвазивным способом получения диагностического материала, анализ экспрессии мРНК гена р16 (INK4a) путем ПЦР как маркера присутствия вирусных онкогенов ВПЧ человека. Причем анализ исследуемого материала включает также анализ концентрации мРНК гена гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT-1). При этом сравнивают уровень экспрессии мРНК р16 (INK4a) с уровнем экспрессии мРНК HPRT-1. Экспрессия последнего осуществляется на достаточно постоянном уровне, что позволяет отнести этот ген к так называемой группе «генов домашнего хозяйства» и определять относительный уровень экспрессии функционально активных генов (в данном случае р16 (INK4a), опираясь на значения экспрессии HPRT-1. Подобный подход является общепринятым и позволяет обеспечить высокую воспроизводимость результатов (Боженко В.К., Васкевич Е.Ф., Чазова Н.Л. и соавт.2009).The technical result is achieved due to the fact that the method of determining the mRNA of the p16 gene (INK4a) in the material of the cervical scraping using quantitative NDP involves the sampling of the test material from the cervix by scraping in patients with cytologically established cervical intraepithelial neoplasia, which does not require biopsy and non-invasive a method of obtaining diagnostic material, analysis of the expression of p16 gene mRNA (INK4a) by PCR as a marker for the presence of human HPV viral oncogenes. Moreover, the analysis of the test material also includes an analysis of the mRNA concentration of the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene (HPRT-1). In this case, the expression level of p16 mRNA (INK4a) is compared with the expression level of HPRT-1 mRNA. The expression of the latter is carried out at a fairly constant level, which allows us to attribute this gene to the so-called group of “housekeeping genes” and determine the relative level of expression of functionally active genes (in this case, p16 (INK4a), based on the expression values of HPRT-1. A similar approach is generally accepted and allows for high reproducibility of results (Bozhenko V.K., Vaskevich E.F., Chazova N.L. et al. 2009).

Осуществление изобретения поясняется следующим примером.The implementation of the invention is illustrated by the following example.

Анализ экспрессии гена p16 (INK4a)Analysis of p16 gene expression (INK4a)

Выделение РНКRNA isolation

Образцы соскобов шейки матки вынимали из раствора для хранения материала, гомогенизировали на приборе (фирма Qiagen, Германия). Выделение РНК проводили согласно инструкции с помощью наборов "RNeasy mini kit" (фирма Qiagen, Германия). Метод основан на лизисе образцов в растворе гуанидинтиоционата сорбции РНК на колонках, отмывках РНК в спиртовых растворах и элюции РНК. Объем образцов после выделения составил 100 мкл.Samples of cervical scrapings were removed from the solution for storing material, homogenized on a device (Qiagen, Germany). RNA isolation was carried out according to the instructions using the RNeasy mini kit (Qiagen, Germany). The method is based on the lysis of samples in a solution of guanidine thiocyanate of RNA sorption on columns, washing of RNA in alcohol solutions and elution of RNA. The volume of samples after isolation was 100 μl.

Проведение обратной транскрипцииReverse transcription

Реакцию обратной транскрипции ставили, используя реактивы фирмы «ЗАО НПФ ДНК-Технология» в объеме 40 мкл (в реакцию брали 33 мкл образца). В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали специфические олигонуклеотиды. Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 30 минут с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 5 минут. Для увеличения объемов образцов после ОТ кДНК разводили в 10 раз в ТЕ-буфере.The reverse transcription reaction was performed using reagents of ZAO NPF DNA-Technology in a volume of 40 μl (33 μl of the sample was taken in the reaction). Specific oligonucleotides were used as primers for reverse transcription. The reaction was carried out at a temperature of 40 ° C for 30 minutes, followed by inactivation of reverse transcriptase at 95 ° C for 5 minutes. To increase sample volumes after RT, cDNA was diluted 10-fold in TE buffer.

Проведение ПЦРPCR

Для постановки ПЦР использовали реактивы фирмы «ЗАО НПФ ДНК-Технология». Праймеры и зонды для ПЦР были подобраны с учетом структур генов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК исследуемых и нормировочных генов. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой на этапе выделения РНК. Контроль отсутствия реакции на геномной ДНК ставили с образцами, не прошедшими реакцию обратной транскрипции, которые разводили в ТЕ-буфере в конечной концентрации, эквивалентной конечной концентрации кДНК. ДНК-зонды, использовавшиеся для детекции продуктов амплификации исследуемых и нормировочных генов, были помечены FAM. Реакции амплификации генов ставили в разных пробирках в двух повторах. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен "горячий старт", который обеспечивался использованием парафина. Оптимальную температуру отжига праймеров и зондов подбирали экспериментально с использованием режима «градиент температур», для всех тест-систем температура была унифицирована и составила 64°С.For PCR, reagents of ZAO NPF DNA-Technology were used. Primers and probes for PCR were selected taking into account the structure of genes in such a way as to exclude annealing of the studied and normalizing genes on the genomic DNA matrix. This made it possible not to use the additional step of processing nucleic acids with DNAase at the stage of RNA isolation. The absence of a reaction on genomic DNA was controlled with samples that did not undergo a reverse transcription reaction, which were diluted in a TE buffer at a final concentration equivalent to the final cDNA concentration. DNA probes used to detect amplification products of the studied and normalization genes were labeled with FAM. Gene amplification reactions were performed in different tubes in duplicate. To increase the sensitivity and specificity of PCR, a "hot start" was used, which was provided by the use of paraffin. The optimum temperature for annealing the primers and probes was selected experimentally using the “temperature gradient” mode; for all test systems, the temperature was unified and amounted to 64 ° C.

Амплификацию осуществляли в режиме "реального времени" в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80°С 30 сек, 94°С 1 мин; 50 циклов - 94°С 10 сек, 64°С 20 сек, использовали приборы "ДТ-322" и "ДТ-964" производства фирмы ЗАО "НПФ ДНК-Технология". Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64°С. Дополнительный контроль прохождения реакции осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле.Amplification was carried out in real-time mode in a volume of 35 μl according to the following program: 1 cycle - 80 ° C for 30 sec, 94 ° C for 1 min; 50 cycles - 94 ° C for 10 seconds, 64 ° C for 20 seconds; the DT-322 and DT-964 devices manufactured by NPF DNA-Technology CJSC were used. The fluorescence level was measured on each cycle at a temperature of 64 ° C. Additional control of the reaction was carried out by electrophoresis in 2% agarose gel.

Для проведения одной реакции ПЦР использовали 10 мкл 2,5Х реакционной смеси; 1 мкл MgCl2 (25 мМ) («Syntol», Россия), 7,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл прямого праймера (10 pmol), 1 мкл обратного праймера (10 pmol) («Syntol», Россия), 0,5 мкл праймера «проба», содержащего флуорофор «Tag man», 5 мкл образца кДНК. В работе использовали следующие праймеры:For one PCR reaction, 10 μl of a 2.5X reaction mixture was used; 1 μl MgCl 2 (25 mM) (Syntol, Russia), 7.5 μl deionized water, 1 μl forward primer (10 pmol), 1 μl reverse primer (10 pmol) (Syntol, Russia), 0, 5 μl of the “sample” primer containing the Tagman fluorophore, 5 μl of cDNA sample. The following primers were used in the work:

Для р16 (INK4a) использовались праймеры:For p16 (INK4a), primers were used:

Ко второму экзону:To the second exon:

Прямой: 5_-CCCTGGCTCTGACCATTCTG-3_·Direct: 5_-CCCTGGCTCTGACCATTCTG-3_

Обратный: 5_-ACCACCAGCGTGTCCAGGAA-3Reverse: 5_-ACCACCAGCGTGTCCAGGAA-3

Для контрольного гена HPRT:For the control HPRT gene:

Прямой: 5'-GCGTTAACTCGGCGTTTCAT иDirect: 5'-GCGTTAACTCGGCGTTTCAT and

Обратный: 5'-GCGCTCAGGTCAAATTCAGAC.Reverse: 5'-GCGCTCAGGTCAAATTCAGAC.

Критический цикл и исходное количество копий кДНК определяли с помощью компьютерной программы «ДТ-96», поставляемой вместе с прибором. Статистический анализ проводился в программе Статистика 6.0. Для оценки относительного содержания мРНК р16 в образцах использовали анализ содержания мРНК референтного гена HPRT-1 в том же образце, характеризующемся низким и стабильным уровнем экспрессии мРНК в клетке. При отношении экспрессии мРНК р16 (INK4a) к мРНК HPRT-1 меньше 1 предполагалось, что экспрессия мРНК р16 (INK4a) в образце практически отсутствует, а при отношении больше 1 - о наличии экспрессии р16 (INK4a) в образце.The critical cycle and the initial number of cDNA copies were determined using the DT-96 computer program supplied with the device. Statistical analysis was carried out in the program Statistics 6.0. To assess the relative content of p16 mRNA in the samples, an analysis of the mRNA content of the HPRT-1 reference gene in the same sample was used, characterized by a low and stable level of mRNA expression in the cell. With a ratio of p16 mRNA expression (INK4a) to HPRT-1 mRNA less than 1, it was assumed that expression of p16 mRNA (INK4a) in the sample was practically absent, and with a ratio greater than 1, the presence of p16 (INK4a) expression in the sample was observed.

Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин Ст х (где х-конкретный ген), получаемых для каждого гена на приборе ПЦР «реального времени» после проведения ПЦР реакции. Определение уровня экспрессии мРНК р16 (INK4a) относительно мРНК HPRT-1 считали методом дельта-дельта Си-ти (ΔΔCt) (Ребриков Д.Н. и соавт.2009).The calculation of the relative expression was carried out on the basis of a comparative assessment of the values of St x (where is the x-specific gene) obtained for each gene on a PCR device "real time" after the PCR reaction. The determination of the expression level of p16 mRNA (INK4a) relative to HPRT-1 mRNA was considered by the delta-delta C-ty (ΔΔCt) method (D. Rebrikov et al. 2009).

[p16] (INK4a)/[HPRT1]=Е-(Ct1-Ct2),[p16] (INK4a) / [HPRT1] = E- (Ct1-Ct2),

гдеWhere

[p16] (INK4a)/[HPRT1] - нормированное по HPRT1 значение экспрессии р16 (INK4a), измеряется в относительных единицах, показывает, сколько копий мРНК р16 (INK4a) приходится на 1 копию HPRT1;[p16] (INK4a) / [HPRT1] - normalized by HPRT1 p16 expression value (INK4a), measured in relative units, shows how many copies of p16 mRNA (INK4a) per 1 copy of HPRT1;

Е - эффективность амплификации, показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение матрицы, поэтому Е=2;E - amplification efficiency, shows the growth of the matrix on each amplification cycle. Theoretically, a matrix doubling occurs on each cycle; therefore, E = 2;

Ct1 - значение порогового цикла в образце для р16 (INK4a);Ct1 is the value of the threshold cycle in the sample for p16 (INK4a);

Ct2 - значение порогового цикла в образце для HPRT1.Ct2 is the value of the threshold cycle in the sample for HPRT1.

Проанализировано 19 образцов соскобов шейки матки больных, из которых с гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком шейки матки (3 случая), cin3 (рак in situ) (6 случаев), cin2 (3 случая), cin 1 (5 случаев) и реактивные изменения (2 случая). Материал получен путем соскоба с шейки матки при комплексном гинекологическом обследовании.We analyzed 19 samples of cervical scrapings of patients, of which with histologically confirmed squamous cell carcinoma of the cervix (3 cases), cin3 (cancer in situ) (6 cases), cin2 (3 cases), cin 1 (5 cases) and reactive changes (2 case). The material was obtained by scraping from the cervix during a comprehensive gynecological examination.

В образцах был проведен анализ экспрессии мРНК гена р16 (INK4a). Было проведено также цитологическое исследование. Критерием достоверности цитологического и молекулярно-генетического методов явились результаты сопоставления с гистологическим исследованием биопсийного и/или операционного материала.An analysis of p16 gene mRNA expression (INK4a) was performed in the samples. A cytological study was also performed. The reliability criterion for cytological and molecular genetic methods was the results of comparison with histological examination of biopsy and / or surgical material.

В таблице 1 представлены полученные данные по количественному анализу мРНК для 19 образцов соскобов шейки матки, а также данные цитологического и гистологического анализов.Table 1 presents the obtained data on the quantitative analysis of mRNA for 19 samples of scrapings of the cervix, as well as cytological and histological analyzes.

Сопоставление результатов цитологического исследования и уровня экспрессии р16 (INK4a) показало, что при реактивных изменениях эпителия шейки матки уровень экспрессии был незначительным и составил 20 и 32 отн. ед.. Повышенная экспрессия мРНК гена р16 (INK4a) наблюдалось при наличии CIN1 - 59±8,81 отн. нд. (М ± SD, где М-среднее, SD -стандартное отклонение), CIN2 67±21.3 отн. ед. или CIN3 147,7±48 отн. ед. Максимальные значения относительного уровня экспрессии р16 (INK4a) были характерны для плоскоклеточного рака - 251,0±37,7 отн. ед.A comparison of the results of the cytological study and the level of expression of p16 (INK4a) showed that with reactive changes in the cervical epithelium, the expression level was insignificant and amounted to 20 and 32 rel. units. Increased expression of p16 gene mRNA (INK4a) was observed in the presence of CIN1 - 59 ± 8.81 rel. nd (M ± SD, where M is the mean, SD is the standard deviation), CIN2 67 ± 21.3 rel. units or CIN3 147.7 ± 48 rel. units The maximum values of the relative level of expression of p16 (INK4a) were characteristic of squamous cell carcinoma - 251.0 ± 37.7 rel. units

Пример 1Example 1

Пациентке Д. 28 лет (образец 11) выполнено цитологическое исследование соскоба шейки матки. Цитологически в соскобе шейки матки диагностирован "CIN2". В материале соскоба соотношение между уровнем экспрессии мРНК р16 (INK4a) и уровнем экспрессии мРНК HPRT-1 составило 93 отн.ед. - установлен диагноз CIN3 (рак in situ), который был подтвержден при гистологическом исследовании.Patient D., 28 years old (sample 11), performed a cytological examination of cervical scraping. Cytologically diagnosed in the cervical scraping "CIN2". In the scraping material, the ratio between the expression level of p16 mRNA (INK4a) and the expression level of HPRT-1 mRNA was 93 rel. - a diagnosis of CIN3 (cancer in situ) was established, which was confirmed by histological examination.

Пример 2Example 2

Пациентке Л. 43 лет (образец 17) при цитологическом исследовании диагностирован "CIN3(рак in situ)". В материале соскоба соотношение между уровнем экспрессии мРНК р16 (INK4a) и уровнем экспрессии мРНК HPRT-1 составило 201 отн.ед. - установлен диагноз плоскоклеточный рак, подтвержденный при гистологическом исследовании.A 43-year-old patient L. (sample 17) was diagnosed with CIN3 (cancer in situ) during a cytological examination. In the scraping material, the ratio between the expression level of p16 mRNA (INK4a) and the expression level of HPRT-1 mRNA was 201 rel. - a diagnosis of squamous cell carcinoma confirmed by histological examination.

Figure 00000001
Figure 00000001

Claims (1)

Способ диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий на основе определения относительного содержания мРНК гена р16 (INK4a) с использованием количественной ПЦР, который включает забор исследуемого материала путем соскоба из шейки матки, его цитологический анализ, отличающийся тем, что при наличии интраэпителиальной неоплазии по цитологическому исследованию проводится также анализ гена гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT-1), при этом сравнивают уровень экспрессии мРНК р16 (INK4a) с уровнем экспрессии мРНК HPRT-1 и, если отношение уровня экспрессии мРНК гена р16 (INK4a) к мРНК HPRT-1 свыше 93 отн. ед., то ставится диагноз CIN3 (рак in situ), а если значение превышает 201 отн. ед. - ставится диагноз плоскоклеточного рака. A method for the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia based on the determination of the relative content of p16 gene mRNA (INK4a) using quantitative PCR, which includes sampling the test material by scraping from the cervix, its cytological analysis, characterized in that in the presence of intraepithelial neoplasia, a cytological study is also carried out gene hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT-1), while comparing the expression level of p16 mRNA (INK4a) with the expression level of mRNA HPRT-1 and, if the level of expression of p16 gene mRNA (INK4a) to HPRT-1 mRNA is over 93 rel. units, then a diagnosis of CIN3 (cancer in situ) is made, and if the value exceeds 201 rel. units - Squamous cell carcinoma is diagnosed.
RU2010147074/15A 2010-11-19 2010-11-19 Diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms RU2464570C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010147074/15A RU2464570C2 (en) 2010-11-19 2010-11-19 Diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2010147074/15A RU2464570C2 (en) 2010-11-19 2010-11-19 Diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010147074A RU2010147074A (en) 2012-05-27
RU2464570C2 true RU2464570C2 (en) 2012-10-20

Family

ID=46231328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010147074/15A RU2464570C2 (en) 2010-11-19 2010-11-19 Diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2464570C2 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2538618C2 (en) * 2012-12-26 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Петрозаводский государственный университет" Differential diagnostic technique for cervical dysplasia and cervical cancer
RU2619739C2 (en) * 2012-05-30 2017-05-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения российской федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России) Method for diagnosis and prediction in case of breast hyperproliferative diseases

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6287775B1 (en) * 1996-03-21 2001-09-11 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Early detection of ovarian carcinoma using p16 gene products
RU2245551C1 (en) * 2004-04-23 2005-01-27 Белохвостов Александр Сергеевич Method for predicting oncological diseases
RU2315312C2 (en) * 2002-08-01 2008-01-20 Мтм Лабораториес Аг Diagnosis method for using a solution

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6287775B1 (en) * 1996-03-21 2001-09-11 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Early detection of ovarian carcinoma using p16 gene products
RU2315312C2 (en) * 2002-08-01 2008-01-20 Мтм Лабораториес Аг Diagnosis method for using a solution
RU2245551C1 (en) * 2004-04-23 2005-01-27 Белохвостов Александр Сергеевич Method for predicting oncological diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SAMARA WARDANA P. et al. pl6(INK4a) is superior to high-risk human papillomavirus testing in cervical cytology for the prediction of underlying high-grade dysplasia // Cancer Cytopathol., 2010, Jun 25, vol. 118(3), pp.146-56, abstract. *
БОЖЕНКО В.К. и др. Исследование экспрессии мРНК маммаглобина А при различной патологии молочных желез. - Вестник РНЦРР, вып.9, статья опубликована 21.12.2009 [найдено 25.07.2011 на сайте https://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v9/papers/ bozhenko_v9.htm]. МАЛЬЦЕВА Л.И. и др. Возможности ранней диагностики рака шейки матки. - Практическая медицина, 2009, №2 [найдено 25.07.2011 на сайте https://mfvt.ru/vozmozhnosti-rannej-diagnostiki-raka-shejki-matki/]. CUSCHIERI К., et al. Human papillomavirus mRNA and pl6 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008 Oct; 17(10):2536-45. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2619739C2 (en) * 2012-05-30 2017-05-17 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения российской федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России) Method for diagnosis and prediction in case of breast hyperproliferative diseases
RU2538618C2 (en) * 2012-12-26 2015-01-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Петрозаводский государственный университет" Differential diagnostic technique for cervical dysplasia and cervical cancer

Also Published As

Publication number Publication date
RU2010147074A (en) 2012-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Costa et al. Factors predicting human papillomavirus clearance in cervical intraepithelial neoplasia lesions treated by conization
Kerr et al. Performance of a branch chain RNA in situ hybridization assay for the detection of high-risk human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma
EP2668290B1 (en) Rnascope® hpv assay for determining hpv status in head and neck cancers and cervical lesions
JP2001526045A (en) Evaluation of human papillomavirus-related diseases
WO2010129941A1 (en) Correlation of hpv e6 and e7 expression with progression of cervical disease
US20140357509A1 (en) Differentiation between transient and persistent high-risk hpv infection by in situ hybridization
del Pino et al. Clinical, colposcopic and pathological characteristics of cervical and vaginal high-grade lesions negative for HPV by Hybrid Capture 2
Carozzi et al. Association of human papillomavirus with prostate cancer: analysis of a consecutive series of prostate biopsies
Reich et al. Possibly carcinogenic HPV subtypes are a cause of HSIL and negative clinical HPV tests–A European prospective single center study
CN104630353A (en) Kit applied to nasopharynx cancer diagnosis, prognosis and treatment effect evaluation
Chu et al. In situ hybridization: Introduction to techniques, applications and pitfalls in the performance and interpretation of assays
Aarnio et al. Diagnostic excision of the cervix in women over 40 years with human papilloma virus persistency and normal cytology
US20110171628A1 (en) Cervical screening algorithms
RU2464570C2 (en) Diagnostic technique for cervical intraepithelial neoplasms
Balbi et al. Role of the association of high-risk HPV identified by real-time PCR in cervical preneoplastic lesions.
Han et al. Aptima HR-HPV testing from Diff-Quick-stained fine-needle aspiration smears of oropharyngeal squamous cell carcinoma
Kim et al. Comparison of FFPE histological versus LBP cytological samples for HPV detection and typing in cervical cancer
Kim et al. HPV E6/E7, hTERT, and Ki67 mRNA RT‐qPCR Assay for Detecting High‐Grade Cervical Lesion with Microscope Slides
Cibas et al. Age-specific detection of high risk HPV DNA in cytologically normal, computer-imaged ThinPrep Pap samples
RU2719581C1 (en) Method for predicting the risk of recurrence in hpv16-positive patients with squamous intraepithelial high-grade disease on the basis of determining the physical status of the virus
CN102559932B (en) Kit for PCR (Polymerase Chain Reaction) detection of high-risk human papillomavirus (HPV)
Rodriguez et al. Concordance between HER-2 status determined by qPCR in Fine Needle Aspiration Cytology (FNAC) samples compared with IHC and FISH in Core Needle Biopsy (CNB) or surgical specimens in breast cancer patients
Wilson et al. The utility of high-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA in situ hybridization in assessing HPV status on cell block
Tabrizi et al. Evaluation of p16INK4a immunostaining for the detection of high-grade changes in cervical cytology
Melo et al. Potential diagnostic techniques for cervical cancer prevention-Review

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20121120

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20140810

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20151120