RU2109290C1 - Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина g и пероксидазы хрена - Google Patents

Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина g и пероксидазы хрена Download PDF

Info

Publication number
RU2109290C1
RU2109290C1 RU96106960A RU96106960A RU2109290C1 RU 2109290 C1 RU2109290 C1 RU 2109290C1 RU 96106960 A RU96106960 A RU 96106960A RU 96106960 A RU96106960 A RU 96106960A RU 2109290 C1 RU2109290 C1 RU 2109290C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
bacteriostatic
conjugate
edta
trilon
stabilizing composition
Prior art date
Application number
RU96106960A
Other languages
English (en)
Other versions
RU96106960A (ru
Inventor
Н.А. Вараксин
Е.Ю. Шалаев
М.Ю. Рукавишников
А.Н. Канев
Original Assignee
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" filed Critical Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority to RU96106960A priority Critical patent/RU2109290C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2109290C1 publication Critical patent/RU2109290C1/ru
Publication of RU96106960A publication Critical patent/RU96106960A/ru

Links

Images

Landscapes

  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения стабильных форм иммунобиологических препаратов, сохряняющих свои специфические характеристики в течение длительного времени. Стабилизирующий состав включает гидролизат протеина, сахарозу, фосфатно-солевой буфер, бактериостатик, бычий сывороточный альбумин, ЭДТА (трилон Б) и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.% : бычий сывороточный альбумин 0,1 - 3,0; сахароза 1,0 - 10,0; гидролизат протеина 1,0 - 5,0; хлористый калий 2,0 - 8,0; ЭДТА (трилон Б) 0,03 - 0,2; бактериастатик 0,01 - 0,02; фосфатно-солевой буфер остальное. В качестве гидролизата протеина используют пептон или желатин, а в качестве бактериостатика - мертиолят. Стабилизатор обеспечивает сохранение биохимических свойств препарата конъюгата анти-IgG и пероксидазы хрена в процессах лиофильного высушивания, последующего хранения и регидратации при комнатной температуре. 1 з. п. ф-лы, 3 табл.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения стабильных форм иммунобиологических препаратов, сохраняющих свои специфические характеристики в течение длительного времени.
Известны способы получения стабилизирующих составов конъюгатов на основе белка A и антивидовых иммуноглобулинов [1, 2, 3]. Составы стабилизаторов включают углеводы в виде сахарозы или лактозы, аминокислоты и БСА.
Недостатком данных стабилизирующих составов является то, что они повышают термостабильность препаратов не более, чем на 60% и таким образом не дают возможность сохранять препараты в течение 1 года. При использовании глюкозы или лактозы в качестве углеводного компонента стабилизатора для получения конъюгатов специфическая активность препаратов снижается уже на первой стадии замораживания - оттаивания на 35-40%.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе белка A и пероксидазы хрена (КГ БА:ПХ), включающий сахарозу (1,3 - 6%, пептон 4 - 12% и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) остальное [4].
Недостатками данного стабилизатора является то, что он хорошо сохраняет препарат КГ БА:ПХ, но не полностью предохраняет конъюгат антииммуноглобулина G и пероксидазы хрена (КГ анти- IgG:ПХ) на стадии лиофильного приготовления, а также не обеспечивает сохранение специфического узнавания иммуноглобулинов после продолжительного хранения сухого препарата при положительных температурах.
Поставлена задача создания стабилизатора такого состава, который обеспечивал бы сохранение биохимических свойств препарата КГ анти-IgG:ПХ в процессах лиофильного высушивания, последующего хранения и регидратации при комнатной температуре.
Поставленная задача решается тем, что стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина G и пероксидазы хрена, включающий гидролизат протеина, сахарозу, фосфатно-солевой буфер и бактериостатик, согласно изобретению, дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин, ЭДТА (трилон Б) и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Бычий сывороточный альбумин - 0,1-3,0
Сахароза - 1,0-10,0
Гидролизат протеина - 1,0-5,0
Хлористый калий - 2,0-8,0
ЭДТА (трилон Б) - 0,03-0,2
Бактериостатик - 0,01-0,02
Фосфатно-солевой буфер - Остальное
Причем в качестве гидролизата протеина используют пептон или желатин, а в качестве бактериостатика - мертиолят.
Сравнение заявляемого стабилизирующего состава с известными аналогами показывает, что отличительные от прототипа признаки проявляют новое, неизвестное ранее свойство, а именно полное сохранение активности препарата КГ анти-IgG: ПХ на стадии лиофилизации и увеличение по сравнению с прототипом и другими аналогами срока его ранениями при положительных температурах как в сухой форме, так и в регидратированном состоянии, что свидетельствует о состоянии предлагаемого технического решения критерию "изобретательский уровень".
Такое сохранение активности конъюгата, вероятно, обусловлено следующими причинами. Во-первых, гидролизат в отличие от нативного протеина содержит короткие пептиды, которые значительно легче и проще вступают во взаимодействия как с гидрофильными, так и с гидрофобными группами на поверхности конъюгата в отличие от громоздких полимерных исходных молекул протеинов. Во-вторых, введение ЭДТА - в форме его растворимой соли трилона Б - известной своими хелатирующими свойствами, защищает геминную группу пероксидазы хрена от повреждающих взаимодействий с ионами тяжелых металлов. В этих взаимодействиях активные ионы металлов замещаются на пассивные к обмену ионы калия при введении соли KCl.
Пример 1. Технология приготовления стабилизирующего состава для получения лиофилизированных препаратов.
Сначала приготавливают гидролизат протеина путем высокотемпературного расщепления 10%-ного раствора пептона по ГОСТ 13805-76 [5] или желатина пищевого по ГОСТ 11293-78 [6] (pH = 7,0) при 135oC в течение 3,5 ч. Гидролизованные пептон и желатин характеризуют по аминокислотному составу, вязкости, а фракционный состав характеризуют методами гель-фильтрации и криоскопии.
Компоненты стабилизатора (сахароза, БСА, гидролизат протеина и KCl) растворяют в фосфатно-солевом буфере при нагревании до 40oC при перемешивании до полного исчезновения осадка. Ко всей массе раствора добавляют требуемое количество трилона Б. В качестве бактериостатика используют мертиолят в количестве 0,01%.
Полученный состав фильтруют через стеклянный фильтр, а затем через фильтр "Millipor" с размерами пор 0,45 мкм.
Фильтрат охлаждают в снежной бане и добавляют в него при перемешивании раствор препарата КГ анти-IgG: ПХ, достигая разведения в 500 - 1000 раз в зависимости от титра конъюгата, определяемого в прямой реакции ИФА со стандартными иммуноглобулинами.
Препарат разливают в ламинарном шкафу по 0,2 мл во флаконы объемом 5 мл, закрывают резиновыми пробками и размещают в металлические кассеты для замораживания. Замораживание препарата во флаконах проводят при температуре прилавка - 60oC в течение 10-12 ч.
Замороженный препарат во флаконах переносят в сублимационную камеру лиофильной установки TG-50, полки которой охлаждены до минус 35oC. Температуру препарата на стадии сублимационного обезвоживания поддерживают ниже температуры его стеклования (-30oC). Средняя скорость нагревания материала на этапе досушивания составляет 6oC/мин, время выдерживания при 27o составляет 10 ч.
Лиофильно высушенный препарат имеет остаточное содержание воды около 1,0 - 2,0 мас.%. Определение проводят по методике [7]. Флаконы с препаратом укупоривают под вакуумом.
Активность конъюгата контролируют на всех этапах приготовления сухой формы: при розливе, замораживании и после лиофилизации. В качестве ИФА тест-системы используют специально отобранные из одной качественной партии комплекты "РекомбиБест анти - ВИЧ 1+2". ИФА выполняют в соответствии с Инструкцией применения указанной тест-системы.
Для обоснования количественного содержания компонентов в стабилизирующем составе приготовлены вышеописанным способом варианты предлагаемого состава (1-6) и состав-прототип (7). Данные приведены в табл. 1.
Пример 2. Исследование сохранения активности конъюгата анти-IgG:ПХ на стадии лиофилизации.
Проведены сравнительные исследования по сохранению активности препарата, содержащего заявляемый стабилизирующий состав с разным количественным содержанием компонентов (составы 1-6) или использующего стабилизатора состав-прототип (состав 7). Данные приведены в табл. 2.
Результаты показывают, что наиболее устойчивыми при замораживании и обезвоживании являются варианты препарата с составами 1 и 2, в одном из которых содержится оптимальное количество гидролизата, а в другом - желатины.
Как следует из результатов табл. 2, все составы обеспечивают сохранение активности конъюгата на стадии лиофильного приготовления и в пределах точности постановки ИФА отличия статистически незначимы.
Пример 3. Исследование активности препарата, содержащего разные варианты стабилизирующих составов, в процессе хранения
Для проверки эффективности действия стабилизаторов при хранении препаратов при положительных температурах закладывают в термостаты 30 флаконов с конъюгатом анти-IgG:ПХ, имеющем различные варианты составов стабилизаторов, и хранят указанные препараты при температуре 4 и 37oC. Результаты приведены в табл. 3. Активность конъюгата анти-IgG:ПХ при хранении определяют в % от сухой формы этого препарата, хранившегося при -20oC ( σ = ± 5%).
Результаты анализа табл. 3 показывают, что при хранении препарата при 4oC в течение 6 мес предлагаемый стабилизирующий состав (N 1 и N 2) имеет более высокие характеристики сохранения препарата, чем состав-прототип. Характеристики становятся статистически значимыми при хранении препарата 2 мес при 37oC. С увеличением времени хранения препарата преимущества заявляемого стабилизатора становятся еще более очевидными.
Следует отметить, что нижние концентрации компонентов стабилизатора определяются минимальной концентрацией гидролизата протеина и сахарозы, необходимых для формирования препарата в форме таблетки с равномерно распределенными порами. Суммарную концентрацию белка и сахарозы подбирают не менее 5%. Верхний предел концентрации нативных протеинов ограничивается их растворимостью в ФСБ.
Минимальная концентрация ЭДТА недостаточно надежно защищает ион железа от примесных ионов в растворе препарата, а максимальная концентрация обеспечивает избыток хелатирующего агента, который связывает частично и активное железо.
Таким образом, экономическая эффективность применения предлагаемого изобретения состоит в следующем. Стабилизирующий состав (1 и 2) на основе гидролизата протеина, сахарозы и ЭДТА (табл. 2) позволяет лиофильно высушивать конъюгат анти-IgG:ПХ без потери активности. При хранении конъюгата анти-IgG:ПХ при 37oC в течение 10 мес заявляемый стабилизирующий состав (табл. 3) обеспечивает сохранение исходной активности на 80%, а прототип - на уровне 50% от исходной активности. Таким образом, по сравнению с прототипом предложенный стабилизирующий состав снижает потери специфической активности препарата в полтора раза при хранении его длительное время (10 мес и более).
Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, медицине и ветеринарии при приготовлении иммунобиологических препаратов.
Источники информации
1. Патент США N 4504579, кл. C 12 Q 1/28, C 12 N 9/96, опубл. 19/6 г. (аналог).
2. Воробьева М.С., Шаламберидзе А.Г., Канев А.Н. и др. Вопросы вирусологии. - 1992, N 2.
3. Naofumi Hanafusa. - Contributions from the Institute of Low Temperature Science. Ser. B, 1972, N 17, p, 1-38 (аналог).
4. Патент Российской Федерации N 2046342, кл. G 01 N 33/535, C 12 N 9/96, опубл. 1995 г. (прототип).
5. ГОСТ 13805-076. Пептон ферментативный. Госстандарт СССР, 1976.
6. ТУ 11293-78. Желатин пищевой. Госстандарт СССР, 1978.
7. МИ 123. 39. 002-88. Методика определения остаточной влажности малых количеств материала. - 1988. 7 с.

Claims (1)

1. Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина G и пероксидазы хрена, включающий гидролизат протеина, сахарозу, фосфатно-солевой буфер и бактериостатик, отличающийся тем, что он дополнительно содержит бычий сывороточный альбумин, ЭДТА (трилон Б) и хлористый калий при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Бычий сывороточный альбумин - 0,1 - 3,0
Сахароза - 1,0 - 10,0
Гидролизат протеина - 1,0 - 5,0
Хлористый калий - 2,0 - 8,0
ЭДТА (трилон Б) - 0,03 - 0,2
Бактериостатик - 0,01 - 0,02
Фосфатно-солевой буфер - Остальное
2. Состав по п.1, отличающийся тем, что в качестве гидролизата протеина используют пептон или желатин, а в качестве бактериостатика - мертиолят.
RU96106960A 1996-04-09 1996-04-09 Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина g и пероксидазы хрена RU2109290C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU96106960A RU2109290C1 (ru) 1996-04-09 1996-04-09 Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина g и пероксидазы хрена

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU96106960A RU2109290C1 (ru) 1996-04-09 1996-04-09 Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина g и пероксидазы хрена

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2109290C1 true RU2109290C1 (ru) 1998-04-20
RU96106960A RU96106960A (ru) 1998-07-20

Family

ID=20179163

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU96106960A RU2109290C1 (ru) 1996-04-09 1996-04-09 Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина g и пероксидазы хрена

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2109290C1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0917879A3 (de) * 1997-11-22 1999-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verbessertes Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen
CN102375056A (zh) * 2010-08-27 2012-03-14 烟台赛尔斯生物技术有限公司 固定生物大分子的稳定剂及其制备方法和应用
CN103063829A (zh) * 2012-12-21 2013-04-24 杭州茂天赛科技有限公司 一种冻存液

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0917879A3 (de) * 1997-11-22 1999-06-09 Boehringer Mannheim Gmbh Verbessertes Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen
CN102375056A (zh) * 2010-08-27 2012-03-14 烟台赛尔斯生物技术有限公司 固定生物大分子的稳定剂及其制备方法和应用
CN103063829A (zh) * 2012-12-21 2013-04-24 杭州茂天赛科技有限公司 一种冻存液
CN103063829B (zh) * 2012-12-21 2015-01-14 杭州茂天赛科技有限公司 一种冻存液

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2671383C (en) Dried composition
US7381796B2 (en) Dried blood factor composition comprising trehalose
JPH0780782B2 (ja) 貯蔵安定で認容性のエリトロポエチン製剤及びその製法
JPH02265984A (ja) 物質の貯蔵
HU190649B (en) Process for the preparation of compositions containing interferon
WO1995010601A1 (en) Methods for preserving recombinant viruses
US10786563B2 (en) Heat-resistant protective agent, room-temperature-preserved live classical swine fever vaccine, and preparation method and application thereof
DK147812B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af et stabilt lyofiliseret urokinasepraeparat
JPH03505334A (ja) 凍結乾燥されたペプチド製剤
RU2109290C1 (ru) Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата антииммуноглобулина g и пероксидазы хрена
JPH09124507A (ja) ウイルスを不活化した静脈内注射可能な免疫血清グロブリンの調製
RU2455014C1 (ru) Способ получения лиофилизированного препарата кровь гемолизированная
KR20220036820A (ko) 실크피브로인 단백질 조성물 및 이의 응용방법
JPH04208228A (ja) インシュリン様成長因子iの乾燥製剤
US7244824B2 (en) Dried blood factor composition comprising trehalose
RU2136313C1 (ru) Стабилизирующий состав для получения референс-сывороток, содержащих igm-антитела
WO1994024273A1 (en) Stable collagenase compositions and methods for their preparation
RU2218934C2 (ru) Препарат интерферона
AU2023232693A1 (en) Composition comprising collagenase, calcium, histidine, and glycine, and method for stabilizing collagenase
RU2046342C1 (ru) Стабилизирующий состав для получения лиофилизированных препаратов на основе конъюгата белка а и пероксидазы хрена
RU2160605C2 (ru) Жидкие композиции, содержащие человеческий хорионический гонадотропин (hcg)
RU2214836C2 (ru) Глобулин противосибиреязвенный лошадиный сухой
CN111103432A (zh) 一种促甲状腺激素受体的冻干辅助制剂及冻干方法
JPS63230085A (ja) 安定なフラクト−スデヒドロゲナ−ゼ組成物