RU2080382C1

RU2080382C1 - Strain of bacterium clostridium acetobutylicum - a producer of normal butyl alcohol and acetone

Info

Publication number: RU2080382C1
Application number: RU9595103597A
Authority: RU
Inventors: Г.П. Лукина; С.К. Абилев; И.К. Любимова; М.А. Великая; И.Е. Ежова; Т.В. Артюшкина
Original assignee: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1995-03-13
Filing date: 1995-03-13
Publication date: 1997-05-27
Also published as: RU95103597A

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology. SUBSTANCE: invention proposes the strain C. acetobutylicum (VKPM B-5359) that is selected by induced mutagenesis and the following mutant clones selection on selective media. Strain C. acetobutylicum S-3716 (VKPM B-5359) accumulates 22.0 g/l solvents including 15.5 g/l n-butanol and 6.5 g/l acetone at fermentation for 36-40 h on medium containing beet-sugar molasses and mineral salts. Carbohydrate conversion to the end products is 40%. EFFECT: enhanced effectiveness of the strain proposed. 1 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма C.acetobutylicum, продуцирующего н-бутиловый спирт и ацетон. The invention relates to the microbiological industry and relates to the production of a new strain of C.acetobutylicum producing n-butyl alcohol and acetone.

Н-бутиловый спирт (н-бутанол) и ацетон применяется в многих отраслях народного хозяйства. В качестве растворителей используются в лакокрасочной промышленности, в производстве синтетической резины, шелка, при экстрагировании фармацевтических препаратов и других отраслях. Используются также в качестве сырья для синтеза ряда органических продуктов, а также в виде жидкого топлива. N-butyl alcohol (n-butanol) and acetone are used in many sectors of the national economy. As solvents are used in the paint and varnish industry, in the production of synthetic rubber, silk, in the extraction of pharmaceuticals and other industries. They are also used as raw materials for the synthesis of a number of organic products, as well as in the form of liquid fuel.

Н-бутиловый спирт и ацетон могут быть получены и химическим способом, однако качество синтетического бутилового спирта, полученного на заводах синтетического каучука невысокие из-за значительного содержания в нем непредельных соединений. В связи с этим, такие спирты не находят применение в ряде отраслей промышленности, например в лакокрасочной, фармацевтической и др. потребность которых в высококачественном н-бутиловом спирте покрывается н-бутанолом, полученным способом микробиологического синтеза. N-butyl alcohol and acetone can also be obtained chemically, however, the quality of synthetic butyl alcohol obtained in synthetic rubber plants is low due to the significant content of unsaturated compounds in it. In this regard, such alcohols do not find application in a number of industries, for example, in paint and varnish, pharmaceutical, etc. whose need for high-quality n-butyl alcohol is covered by n-butanol obtained by microbiological synthesis.

Н-бутиловый спирт, получаемый брожением, представляет собой первичный бутиловый спирт (CH₃-CH₂-CH₂-CHOH), химическая же промышленность, вырабатывающая н-бутанол, получает в процессе синтеза наряду с н-бутиловым спиртом и вторичный бутиловый спирт (CH₃-CHOH-CH₂-CH₃).The n-butyl alcohol obtained by fermentation is primary butyl alcohol (CH ₃ -CH ₂ -CH ₂ -CHOH), while the chemical industry that produces n-butanol receives secondary butyl alcohol along with n-butyl alcohol ( CH ₃ —CHOH — CH ₂ —CH ₃ ).

Известно, что бактерии C.acetobutylicum при сбраживании различных углеродов синтезируют одновременно три целевых продукта: н-бутиловый спирт, ацетон и этиловый спирт, получившие общее название органические растворители, процентное соотношение которых примерно 60:30:10 (соответственно). Это соотношение не является строго постоянным и может значительно варьировать в сторону увеличения выхода того или иного продукта брожения. It is known that the bacteria C.acetobutylicum synthesize three target products simultaneously during the fermentation of various carbons: n-butyl alcohol, acetone and ethyl alcohol, collectively called organic solvents, the percentage of which is approximately 60:30:10 (respectively). This ratio is not strictly constant and can vary significantly in the direction of increasing the yield of a particular fermentation product.

Наиболее ценным из органических растворителей является н-бутиловый спирт. The most valuable of organic solvents is n-butyl alcohol.

Получение повышенного выхода н-бутилового спирта при наименьших затратах было предметом многочисленных исследований и в настоящее время является одной из важных задач ацетоно-бутилового производства. Obtaining an increased yield of n-butyl alcohol at the lowest cost has been the subject of numerous studies and is currently one of the important tasks of acetone-butyl production.

Существующее промышленное производство микробиологического синтеза н-бутилового спирта и ацетона основано на использовании ацетоно-бутиловых бактерий, относящихся к роду Cloctridium. The existing industrial production of microbiological synthesis of n-butyl alcohol and acetone is based on the use of acetone-butyl bacteria belonging to the genus Cloctridium.

На протяжении многих лет основным направлением исследований в нашей стране по интенсификации и удешевлению производства н-бутилового спирта была замена пищевого сырья непищевым с одновременной адаптацией культуры C.acetobutylicum, выделенной еще в 30-е годы [1] Однако и в настоящее время на отечественных предприятиях при получении растворителей микробиологическим способом используют в основном муку злаковых культур. Over the years, the main direction of research in our country to intensify and reduce the cost of production of n-butyl alcohol has been the replacement of food raw materials with non-food with the simultaneous adaptation of C.acetobutylicum culture, isolated in the 30s [1] However, at present, at domestic enterprises when obtaining solvents, the microbiological method mainly uses cereal flour.

Известен штамм C.acetobutylicum [2] который за 66 ч брожения на мучных средах накапливает в культурной жидкости 13,5-15,5 г/л органических растворителей, в том числе н-бутилового спирта 9-10 г/л, ацетона 3,5-4,0 г/л и этанола 1,0-1,5 г/л. A known strain of C.acetobutylicum [2] which accumulates 13.5-15.5 g / l of organic solvents, including n-butyl alcohol 9-10 g / l, acetone 3, in 66 hours of fermentation on flour media 5-4.0 g / l; and ethanol 1.0-1.5 g / l.

Известен способ с использованием штамма C.acetobutylicum АТСС 824, продуцирующего на средах с глюкозой 7,5 г/л н-бутилового спирта и 3,7 г/л - ацетона [3]
Сообщается о штамме 34- II C.acetobutylicum, продуцирующим за 54 ч брожения 9,5 г/л бутанола и 4,6 г/л ацетона [4]
Имеются сообщения о штаммах мутантах C.acetobutylicum накапливающих на мучных средах за 66 ч брожения 9-10 г/л н-бутанола, 4,3-4,9 г/л ацетона и 1,3-1,9 г/л этанола [5]
Общим недостатком перечисленных штаммов-продуцентов н-бутанола и ацетона является невысокий уровень накопления целевых продуктов, а также присутствие третьего продукта этанола, что усложняет технологический процесс выделения конечных продуктов. Кроме того, все эти штаммы требуют добавления в среды пищевого сырья муки или отрубей, а также большое количество минеральных добавок.A known method using the strain of C.acetobutylicum ATCC 824, producing on media with glucose 7.5 g / l of n-butyl alcohol and 3.7 g / l of acetone [3]
Strain 34-II C.acetobutylicum is reported to produce 9.5 g / l butanol and 4.6 g / l acetone in 54 hours of fermentation [4]
There are reports of strains of C.acetobutylicum mutants accumulating on flour media for 66 hours of fermentation 9-10 g / l of n-butanol, 4.3-4.9 g / l of acetone and 1.3-1.9 g / l of ethanol [ 5]
A common drawback of these producer strains of n-butanol and acetone is the low level of accumulation of the target products, as well as the presence of a third ethanol product, which complicates the process of isolating the final products. In addition, all these strains require the addition of flour or bran to the food raw material medium, as well as a large number of mineral additives.

Установленным фактом в исследованиях процесса ацетоно-бутилового брожения является то, что на выход растворителей и долевое соотношение целевых продуктов в значительной степени влияет состав сырья, используемого для брожения. An established fact in studies of the process of acetone-butyl fermentation is that the composition of the raw materials used for fermentation largely affects the yield of solvents and the proportion of the target products.

Так при культивировании на мучных средах различные штаммы C.acetobutylicum синтезируют достаточно высокое общее количество растворителей, которое составляет 18-19 г/л, в том числе 11-12 г г/л и 4-5 г/л ацетона Кроме того, на средах из муки обязательно синтезируется 1,5-2,5 г/л этанола [6 и 7]
Известен способ повышения выхода растворителей при культивировании бактерий C.acetobutylicum на мучных средах за счет предварительного разжижения крахмала рециркулируемой бражкой, содержащей активные амилолитические ферменты. При этом общий выход растворителей достигает 19 г/л, а время брожения сокращается на 9 ч [8]
За рубежом в последние годы, в связи с энергетическим кризисом, появляется большой интерес к получению растворителей методом брожения (США, Канада, АРЕ, ФРГ, Япония, Франция и др.). По имеющимся сведениям из технической литературы (за 1985-1994) н-бутанол и ацетон во многих странах получают синтетическим путем, бродильные производства становятся выгодными, благодаря использованию возобновляемых источников энергии и побочных продуктов (газов брожения).So, when cultivated on flour media, various C.acetobutylicum strains synthesize a rather high total amount of solvents, which is 18-19 g / l, including 11-12 g g / l and 4-5 g / l acetone. In addition, on media 1.5-2.5 g / l ethanol is necessarily synthesized from flour [6 and 7]
There is a method of increasing the yield of solvents during the cultivation of C.acetobutylicum bacteria on flour media by preliminary liquefaction of starch with a recycled mash containing active amylolytic enzymes. In this case, the total yield of solvents reaches 19 g / l, and the fermentation time is reduced by 9 hours [8]
In recent years, in connection with the energy crisis, there has been a great interest in the production of solvents by fermentation (USA, Canada, ARE, Germany, Japan, France, etc.). According to available information from the technical literature (1985-1994), n-butanol and acetone are synthetically produced in many countries, fermentation plants become profitable due to the use of renewable energy sources and by-products (fermentation gases).

Основными направлениями исследований за рубежом являются: конструирование новых штаммов ацетонобутиловых бактерий методами генетической инженерии [9-11] разработка новых технологических приемов по выделению конечных целевых продуктов [12]
Описаны штаммы мутанты C.acetobutylicum (АТСС 39058), продуцирующие на искусственной питательной среде с глюкозой 12-17 г/л растворителей, в том числе 10-12 г/л бутанола и 4,0-5,0 г/л ацетона. Культивирование одного из мутантов на среде с израильским артишоком позволило получить бутанола до 15 г/л [11]
Максимальные известные уровни биосинтеза н-бутилового спирта и ацетона составляют 15,0 г/л и 10/л (соответственно) [11] 14 г/л н-бутанола и 7,6 г/л ацетона [13] и 15,1 г/л н-бутанола и 6,3 г/л ацетона [14] Однако такие результаты получены в лабораторных экспериментах с использованием искусственных сред, экзотических инулиновых субстратов (бугорки земляной груши, георгина, корни цикория и др.) и гидролизатов отходов зерновых производств, которые не нашли промышленного использования.The main areas of research abroad are: the design of new strains of acetone-butyl bacteria by genetic engineering methods [9-11] the development of new technological methods for the isolation of final target products [12]
The C.acetobutylicum mutant strains (ATCC 39058) are described which produce 12-17 g / L solvents, including 10-12 g / L butanol and 4.0-5.0 g / L acetone, on an artificial nutrient medium with glucose. Cultivation of one of the mutants in an environment with an Israeli artichoke made it possible to obtain butanol up to 15 g / l [11]
The maximum known levels of biosynthesis of n-butyl alcohol and acetone are 15.0 g / l and 10 / l (respectively) [11] 14 g / l of n-butanol and 7.6 g / l of acetone [13] and 15.1 g / l of n-butanol and 6.3 g / l of acetone [14] However, such results were obtained in laboratory experiments using artificial media, exotic inulin substrates (pear tubercles, dahlias, chicory roots, etc.) and grain waste hydrolysates, who have not found industrial use.

В нашей стране одним из основных направлений исследований в области ацетонобутилового производства является поиск сырья, заменяющего полностью или частично пищевое сырье, муку. In our country, one of the main areas of research in the field of acetobutyl production is the search for raw materials that replace fully or partially food raw materials, flour.

Наиболее подходящим сырьем для условий отечественного производства и возможностей сырьевой базы является свеклосахарная меласса отход свеклосахарного производства. The most suitable raw material for domestic production conditions and the potential of the raw material base is sugar beet molasses and sugar beet production waste.

Наилучшим продуцентом, растущим на свеклосахарной мелассе, является штамм C. acetobutylicum S [15] выбранный в качестве прототипа. The best producer growing on sugar beet molasses is a strain of C. acetobutylicum S [15] selected as a prototype.

Штамм позволяет получать 11 г/л н-бутанола и 3,4 г/л ацетона на питательной среде, имеющей следующее соотношение компонентов, мас. свеклосахарная меласса (по содержанию сахарозы и редуцирующих веществ) 4,4 (44 г/л), сернокислый аммоний 6х10^-2 (0,6 г/л), суперфосфатная вытяжка (по содержанию P₂O₅ 2,6•10^-2 (0,26 г/л) и углекислый кальций 1,0 (10 г/л). Процесс брожения проходит 42 ч, несброженными в среде остались 0,64% сахаров.The strain allows to obtain 11 g / l of n-butanol and 3.4 g / l of acetone in a nutrient medium having the following ratio of components, wt. sugar beet molasses (according to the content of sucrose and reducing substances) 4.4 (44 g / l), ammonium sulfate 6x10 ^-2 (0.6 g / l), superphosphate extract (according to the content of P ₂ O ₅ 2,6 • 10 ^-2 (0.26 g / l) and calcium carbonate 1.0 (10 g / l). The fermentation process takes 42 hours, 0.64% of sugars remained unfermented in the medium.

Недостатком штамма-продуцента является невысокий выход н-бутанола и низкий выход ацетона, а так же значительное содержание несброженных сахаров. Конверсия углеводов в целевой продукт составила лишь 34% от введенных в среду углеводов. The disadvantage of the producer strain is the low yield of n-butanol and the low yield of acetone, as well as a significant content of unfermented sugars. The conversion of carbohydrates to the target product was only 34% of the carbohydrates introduced into the medium.

Задачей изобретения является создание нового штамма, позволяющего получать высокий выход н-бутанола и ацетона на средах, не содержащих пищевое сырье, и повышение конверсии углеводов в целевые продукты. The objective of the invention is to create a new strain that allows to obtain a high yield of n-butanol and acetone on media that do not contain food raw materials, and increase the conversion of carbohydrates to target products.

Поставленная цель достигается получением нового штамма C.acetobutylicum S-3716 процудента Н-бутанола и ацетона. This goal is achieved by obtaining a new strain of C.acetobutylicum S-3716 of the case of N-butanol and acetone.

Предлагаемый штамм C.acetobutylicum S-3716 позволяет за 36-40 ч получить до 15,5 г/л н-бутанола и до 6,5 г/л ацетона на средах с мелассой и минеральными солями, при этом конверсия углеводов в целевые продукты достигает 40%
Новый штамм получен из штамма C.acetobutylicum S [15] путем индуцированного мутагенеза и последующего отбора мутантных клонов на селективных средах. Отбор мутантов проводился по следующим признакам: устойчивость к повышенным концентрациям бутанола, недостаточность по образованию жирных кислот, устойчивость аллиловому спирту. Все эти признаки прямо или косвенно связаны с биосинтезом бутанола и ацетона.The proposed strain C.acetobutylicum S-3716 allows for 36-40 hours to get up to 15.5 g / l of n-butanol and up to 6.5 g / l of acetone on media with molasses and mineral salts, while the conversion of carbohydrates to target products reaches 40%
The new strain was obtained from the strain C.acetobutylicum S [15] by induced mutagenesis and subsequent selection of mutant clones on selective media. The selection of mutants was carried out according to the following criteria: resistance to increased concentrations of butanol, insufficiency in the formation of fatty acids, resistance to allyl alcohol. All these signs are directly or indirectly associated with the biosynthesis of butanol and acetone.

Споры бактерий C. acetobutylicum S, находящиеся в стеклянной запаяной пробирке, активируют нагреванием в кипящей водяной бане в течение 1 мин и инокулируют в картофельную среду. Через 18 ч брожения при 37^oC бактерии пересевают на полноценную синтетическую среду (ПСС). ПСС имеет следующий состав, г/л: K₂HPO₄ 0,7; KH₂PO₄ 0,7; MgSO₄•7H₂O 0,1; MnSO₄•H₂O 20 мг; FeSO₄•7H₂O 15 мг NaCl 10 мг, глюкоза 20, ацетат аммония 3, дрожжевой экстракт 1, бактотриптон 1, цистеин 0,5. Для получения плотной среды к ПСС добавляют агар концентрации 1,2-1,5%
В ПСС бактерии выращивают до середины логарифмической фазы в анаэробных условиях. Затем добавляют N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанид (МННГ) или этилметансульфонат (ЭМС) в концентрациях 0,2-1% Через 0,5-2 ч бактерии отмывают от питательной среды и от мутагенов.The bacterial spores of C. acetobutylicum S in a glass sealed tube are activated by heating in a boiling water bath for 1 min and inoculated into a potato medium. After 18 hours of fermentation at 37 ^° C, the bacteria are subcultured into a complete synthetic medium (PSS). PSS has the following composition, g / l: K ₂ HPO ₄ 0.7; KH ₂ PO ₄ 0.7; MgSO ₄ • 7H ₂ O 0.1; MnSO ₄ • H ₂ O 20 mg; FeSO ₄ • 7H ₂ O 15 mg NaCl 10 mg, glucose 20, ammonium acetate 3, yeast extract 1, bactotryptone 1, cysteine 0.5. To obtain a solid medium, agar of a concentration of 1.2-1.5% is added to the MSS
In PSS, bacteria are grown to the middle of the logarithmic phase under anaerobic conditions. Then add N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanide (MNNG) or ethyl methanesulfonate (EMC) in concentrations of 0.2-1%. After 0.5-2 hours, the bacteria are washed from the nutrient medium and from the mutagens.

Отмытые от мутагена бактерии высевают на чашки с картофельным агаром или агаризованной ПСС или агаризованной мелассной средой, содержащими бутанол (15-20 г/л) или другие добавки для сбора соответствующих мутантов. Через 72 ч инкубирования в анаэробных условиях отбирали колонии бактерий, выросших на агаризованных средах с наибольшей концентрацией бутанола и излучают способность этих клонов сбраживать мелассные среды, а также уровень их споруляции. Всего исследовано 380 клонов с целью отбора высокопродуктивных форм. Bacteria washed from the mutagen are plated on plates with potato agar or agarized PSS or agarized molasses medium containing butanol (15-20 g / l) or other additives to collect the corresponding mutants. After 72 h of incubation under anaerobic conditions, colonies of bacteria grown on agarized media with the highest concentration of butanol were selected and emit the ability of these clones to ferment molasses media, as well as their sporulation level. A total of 380 clones were examined to select highly productive forms.

Для определения концентрации целевых продуктов в сброженной среде используют газовый хроматограф "Хром-4" с пламенно-ионизационным детектором и колонкой с полисорбом. To determine the concentration of target products in the fermented medium, a Chrom-4 gas chromatograph with a flame ionization detector and a polysorb column is used.

Продуктивность нового штамма в сравнении с штаммом-прототипом представлена в таблице. The productivity of the new strain in comparison with the strain of the prototype is presented in the table.

Новый штамм продуцент н-бутанола и ацетона Clostridium acetobutylicum S-3716 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В 5359. The new strain producing n-butanol and acetone Clostridium acetobutylicum S-3716 is deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms and has a registration number VKPM B 5359.

Штамм Cl. acetobutylicum S-3716 имеет следующие культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки. Strain Cl. acetobutylicum S-3716 has the following cultural-morphological and physiological-biochemical characteristics.

Морфология клеток. Cell morphology.

Молодые вегетативные клетки грамположительные, хорошо подвижные. Клетки бактерий палочковидные одиночные, попарно и цепочками. Размер и форма клеток зависит от возраста культуры. В процессе развития (начальный период) образует длинные цепочки, в дальнейшем распадаются на отдельные клетки. Young vegetative cells are gram-positive, well motile. Bacterial cells are rod-shaped single, in pairs and in chains. The size and shape of the cells depends on the age of the culture. In the process of development (initial period) forms long chains, subsequently decompose into individual cells.

Размер молодых вегетативных клеток: d=1,0-1,2 мкм, l=5-7 мкм. Обладает бациллярном типом спорообразования, форма клеток перед спорообразованием не изменяется. Споры овальные: d=2,5 мкм, 1=3-5 мкм, локализуются в клетке терминально. The size of young vegetative cells: d = 1.0-1.2 microns, l = 5-7 microns. It has a bacillary type of sporulation, the shape of the cells does not change before sporulation. The spores are oval: d = 2.5 μm, 1 = 3-5 μm, are localized in the cell terminally.

Культурно-морфологические признаки на разных средах. Cultural and morphological characters in different environments.

Картофельная среда с глюкозой и агаром. Через 44 ч роста при 36^oC в анаэробных условиях образует круглые с ровными краями колонии диаметром 1,0-2,0 мм. Структура колоний однородная, серовато-белого цвета, не прозрачные, поверхность гладкая, выпуклая, жирно-блестящая.Potato medium with glucose and agar. After 44 h of growth at 36 ^° C under anaerobic conditions, it forms round colonies with smooth edges with a diameter of 1.0-2.0 mm. The structure of the colonies is homogeneous, grayish-white, not transparent, the surface is smooth, convex, greasy-shiny.

Мелассная агаризованная среда с минеральными солями. Через 44 ч роста при 36^oC в анаэробных условиях образует колонии диаметром от 1,0 мм до точечных размеров, серовато-белые, не прозрачные, круглые, края ровные, поверхность гладкая, выпуклая жирно-блестящая.Molasses agar medium with mineral salts. After 44 h of growth at 36 ^° C under anaerobic conditions, it forms colonies with a diameter of 1.0 mm to dot sizes, grayish-white, not transparent, round, the edges are even, the surface is smooth, convex greasy-shiny.

Полноценная синтетическая среда. Full synthetic environment.

Через 44 ч роста при температуре 36^oC в анаэробных условиях образует колонии диаметром от 1,0 мм до 0,5 мм, круглые с ровными краями, беловатого цвета, поверхность гладкая выпуклая, блестящая.After 44 h of growth at a temperature of 36 ^o C under anaerobic conditions it forms colonies with a diameter of 1.0 mm to 0.5 mm, round with smooth edges, whitish in color, the surface is smooth, convex, shiny.

Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.

Гетеротрофный облигатный анаэроб, желатину не разжижает, мясо-пептонный агар (по уколу) разрывает выделяющимися газами брожения. Heterotrophic obligate anaerobic gelatin does not dilute, meat-peptone agar (at an injection) breaks the released fermentation gases.

Отношение к источникам углерода. Relation to carbon sources.

Сбраживает: крахмал, сахарозу, глюкозу, фруктозу, мальтозу, маннит, галактозу, гликоген, рамнозу, декстрин, целлобиозу. Fermentation: starch, sucrose, glucose, fructose, maltose, mannitol, galactose, glycogen, rhamnose, dextrin, cellobiose.

Не сбраживает: ксилозу, раффинозу, дульцит, целит. Not fermented: xylose, raffinose, dulcite, celite.

Отношение к источникам азота. Attitude to nitrogen sources.

Усваивает азот в форме солей аммония (сернокислый и фосфорнокислый). Absorbs nitrogen in the form of ammonium salts (sulfate and phosphate).

Отношение к источником фосфора. Relation to a source of phosphorus.

Усваивает в форме фосфорнокислого аммония и суперфосфата. Absorbs in the form of ammonium phosphate and superphosphate.

Требует присутствия углекислого кальция для поддержания оптимальных значений pH среды в процессе роста. Requires the presence of calcium carbonate to maintain optimal pH values during growth.

Потребность в факторах роста. The need for growth factors.

Необходимым фактором является биотин. Потребность его удовлетворяется поступлением с мелассой. A necessary factor is biotin. His need is satisfied by admission with molasses.

Отношение к температуре. Attitude to temperature.

Растет при температуре от 30 до 37^oC, оптимальная температура 36^oC.It grows at a temperature of 30 to 37 ^o C, the optimum temperature is 36 ^o C.

Отношение к pH среды. Relation to pH.

Растет на средах с pH от 5,8 до 7,0, оптимальное значение pH 6,0-6,5. Величина rH₂ в процессе роста имеет отрицательное значение в пределах от -4,8-6,3.It grows on media with a pH of 5.8 to 7.0, the optimal pH is 6.0-6.5. The value of rH ₂ during the growth process has a negative value ranging from -4.8-6.3.

Штамм хранится в виде спор, заготовленных на жидкой картофельно-глюкозной среде. В запаянных стеклянных пробирках при температуре от +4^oC до комнатных условий. Срок хранения не ограничен. Может храниться также в виде лиофильно-высушенных спор в запаянных пробирках.The strain is stored in the form of spores harvested in liquid potato-glucose medium. In sealed glass tubes at temperatures from +4 ^o C to room conditions. Shelf life is not limited. May also be stored as freeze-dried spores in sealed tubes.

Пример 1. Получение н-бутанола и ацетона с использованием нового штамма-продуцента осуществляют следующим образом:
Штамм C.acetobutylicum S 3716, хранящийся в виде спор в запаянных стеклянных пробирках пастеризуют в кипящей воде 1 мин.Example 1. Obtaining n-butanol and acetone using a new producer strain is as follows:
The strain C.acetobutylicum S 3716, stored as spores in sealed glass tubes, is pasteurized in boiling water for 1 min.

Затем суспензию спор помещают для оживления на картофельно-глюкозную среду. Then the spore suspension is placed for revitalization on a potato-glucose medium.

Питательная среда для оживления имеет следующее соотношение компонентов, мас. картофель 25,0 (250 г/л), глюкоза 5•10^-1 (5 г/л), (NH₄)₂SO₄ 1,5•10^-2 (1,5 г/л), CaCO₃ 2,0•10^-2 (2,0 г/л), pH среды 6,2.The nutrient medium for revitalization has the following ratio of components, wt. potatoes 25.0 (250 g / l), glucose 5 • 10 ^-1 (5 g / l), (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 1.5 • 10 ^-2 (1.5 g / l), CaCO ₃ 2 , 0 • 10 ^-2 (2.0 g / l), pH 6.2.

Приготовленную питательную среду в количестве 0,5 л помещают в бродильную емкость объемом 1 л и стерилизуют при 120^oC в течение 40 мин и охлаждают до температуры 36^oC. Туда же (с соблюдением правил асептики) вносят посевной материал (суспензию спор нового штамма) в количестве 0,01 л (или 2% от объема сбраживаемой среды) и процесс брожения ведут при температуре 36^oC в течение 18-20 ч до получения культуры в экспоненциальной фазе роста.Prepared nutrient medium in an amount of 0.5 l is placed in a fermentation tank with a volume of 1 l and sterilized at 120 ^o C for 40 min and cooled to a temperature of 36 ^o C. Seeding material (suspension of a spore suspension of a new strain is introduced there) ) in an amount of 0.01 l (or 2% of the volume of fermented medium) and the fermentation process is carried out at a temperature of 36 ^o C for 18-20 hours to obtain a culture in the exponential growth phase.

Затем вегетативным посевным материалом засевают ферментационную среду следующего состава, мас. свеклосахарная меласса (по содержанию сахарозы и редуцирующих веществ) 5,5 (55 г/л), (NH₄)₂ SO₄6•10^-2 (0,6 г/л), (NH₄)₂HPO₄1,6•10^-2 (1,6 г/л), CaCO₃ 1,0 (10 г/л), pH среды 6,2.Then, the vegetative inoculum is seeded with a fermentation medium of the following composition, wt. beet sugar molasses (in terms of sucrose and reducing substances) 5.5 (55 g / l), (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 6 • 10 ^-2 (0.6 g / l), (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ 1, 6 • 10 ^-2 (1.6 g / l), CaCO ₃ 1.0 (10 g / l), pH 6.2.

Приготовленную ферментационную среду в количестве 8 л помещают в аппарат для анаэробного сбраживания объемом 10 л и стерилизуют при 0,8 атм в течение 20 мин, затем сразу охлаждают до температуры 36^oC. После этого туда же вносят (с соблюдением правил асептики) вегетативный посевной материал нового штамма в количестве 0,5 л (или 6% от объема сбраживаемой среды) и процесс брожения ведут при температуре 36^oC в течение 36 40 ч до окончания процесса брожения.The prepared fermentation medium in an amount of 8 l is placed in a 10 l anaerobic digestion apparatus and sterilized at 0.8 atm for 20 min, then immediately cooled to a temperature of 36 ^o C. After this, a vegetative inoculum is introduced there (following aseptic rules) the material of the new strain in an amount of 0.5 l (or 6% of the volume of the fermented medium) and the fermentation process are carried out at a temperature of 36 ^o C for 36-40 hours until the end of the fermentation process.

В культуральной жидкости определяют содержание н-бутанола и ацетона методом газовой хроматографии и величину несброженных сахаров, кроме того, в процессе брожения фиксируют (газоанализатором) количество образующихся газов брожения. In the culture fluid, the content of n-butanol and acetone is determined by gas chromatography and the value of unfermented sugars, in addition, during the fermentation process, the amount of fermentation gases generated is fixed (by a gas analyzer).

На выходе общее содержание растворителей в культуральной жидкости составляет 22 г/л, в том числе н-бутилового спирта 15,5 г/л (или 70,45%) и ацетона 6,5 г/л (или 29,55%). При этом выделяется 29,8 г/л газов брожения, в том числе: CO₄ 66% H₂ 34% Конверсия введенных в среду сахаров в образовавшиеся н-бутанол и ацетон достигает 40% что составляет 93% от теоретически возможного выхода.At the output, the total solvent content in the culture fluid is 22 g / l, including n-butyl alcohol 15.5 g / l (or 70.45%) and acetone 6.5 g / l (or 29.55%). In this case, 29.8 g / l of fermentation gases are released, including: CO ₄ 66% H ₂ 34% The conversion of sugars introduced into the medium into the resulting n-butanol and acetone reaches 40%, which is 93% of the theoretically possible yield.

Таким образом, штамм Cl.acetobutylicum S-3716 синтезирует н-бутанола в 1,4 раза, а ацетона в 1,9 раза (или на 20% от общей суммы растворителей) больше, чем штамм-прототип и позволяет получить выход белизны к теоретически возможному. Thus, the strain Cl.acetobutylicum S-3716 synthesizes n-butanol 1.4 times, and acetone 1.9 times (or 20% of the total amount of solvents) more than the prototype strain and allows to obtain a yield of whiteness to theoretically possible.

Литетатура
1. Логоткин И.С. Технология ацетоно-бутилового производства. Пищепромиздат. 1958.Literature
1. Logotkin I.S. Technology of acetone-butyl production. Food Industry Publishing House. 1958.

2. Промышленный регламент на производство растворителей: ацетона, бутанола и этанола способом брожения. ПР 64-35-89, г. Ефремов, 1989. 2. Industrial regulations for the production of solvents: acetone, butanol and ethanol by fermentation. PR 64-35-89, Efremov, 1989.

3. Monot Frederic, Engasser Jean-Mare, Petitdemage Henri. "Regulation of acetonobutanol production in batch and continuous cultures of Clostridium acetobutylicum" "Biotechnol and Bioeng. Symp.", 1983 N 13, p. 207-216. 3. Monot Frederic, Engasser Jean-Mare, Petitdemage Henri. "Regulation of acetonobutanol production in batch and continuous cultures of Clostridium acetobutylicum" "Biotechnol and Bioeng. Symp.", 1983 N 13, p. 207-216.

4. Лукина Г.П. Грачева Л.Н. и др. Сбраживание свеклосахарной мелассы культурой C. acetobutyticum при получении растворителей. Микробиологическая промышленность, 1980, N 3, с. 17-18. 4. Lukina G.P. Gracheva L.N. and others. Fermentation of beet sugar molasses culture C. acetobutyticum upon receipt of solvents. Microbiological industry, 1980, N 3, p. 17-18.

5. Любимова И.К. Великая М.А. и др. Биосинтез растворителей мутантами C. acetobutylicum, устойчивыми к 2-дезокси-Д-глюкозе. Биотехнология, 1993, N 8, c. 10-12. 5. Lyubimova I.K. Great M.A. et al. Biosynthesis of solvents by C. acetobutylicum mutants resistant to 2-deoxy-D-glucose. Biotechnology, 1993, N 8, c. 10-12.

6. Корнеева О.С. Жеребцов Н.А. и др. Роль амилолитических ферментов Clostridium acetobutylicum в биосинтезе растворителей. Биотехнология, 1986, N 3, с. 133-136. 6. Korneeva O.S. Stallions N.A. et al. Role of amylolytic enzymes of Clostridium acetobutylicum in solvent biosynthesis. Biotechnology, 1986, N 3, p. 133-136.

7. Абилев С.К. Любимова И.К. и др. Мутанты анаэробного продуцента Clostridium acetobutylicum, устойчивые к антибиотикам. Биотехнология, 1990, N 4, с. 16-17
8. Авторское свидетельство СССР N 1604852. Способ сбраживания крахмалсодержащей среды для получения ацетона, бутанола и этанола. 1990, с. 12 p 7/00, 7/06.7. Abilev S.K. Lyubimova I.K. et al. Antibiotic resistant mutants of the anaerobic producer Clostridium acetobutylicum. Biotechnology, 1990, N 4, p. 16-17
8. USSR author's certificate N 1604852. A method of fermentation of a starch-containing medium to obtain acetone, butanol and ethanol. 1990, p. 12 p 7/00, 7/06.

9. Патент США N 4521516, 1982, МКИ: C 12 N 1/20,
10. Патент США N 4757010, 1988, МКИ: C 12 N 1/20 C 12 H 7/28.9. US patent N 4521516, 1982, MKI: C 12 N 1/20,
10. US patent N 4757010, 1988, MKI: C 12 N 1/20 C 12 H 7/28.

11. Патент США N 456843, 1986, МКИ: C 12 P 7/16
12. Lemmel S.A. Mutagenesis in Clostridium acetobutylicum. Biotechnol. Lett. 1985, 7 N 10, p. 711-716.11. US patent N 456843, 1986, MKI: C 12 P 7/16
12. Lemmel SA Mutagenesis in Clostridium acetobutylicum. Biotechnol. Lett. 1985, 7 N 10, p. 711-716.

13. Патент США N 4649112, 1987, МКИ: C 12 P 7/40, 7/28,
14. Заявка Франции N 2559160, 1985, МКИ: C 12 P 7/06.13. US patent N 4649112, 1987, MKI: C 12 P 7/40, 7/28,
14. Application of France N 2559160, 1985, MKI: C 12 P 7/06.

15. Лукина Г.П. Ежова И.Е. Гуськова Н.П. Способ повышения выхода н-бутилового спирта в ацетонобутиловом производстве. Микробиологическая промышленность, 1983. N 6, c. 37-38. 15. Lukina G.P. Yezhova I.E. Guskova N.P. A method of increasing the yield of n-butyl alcohol in acetone-butyl production. Microbiological industry, 1983. N 6, c. 37-38.

Claims

The bacterial strain Clostridium acetobutylicum VKPM B-5359 produces n-butyl alcohol and acetone.