PL227130B1 - Zastosowanie inhibitora IL -18 dowytwarzania leku - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku.

Wynalazek niniejszy należy do dziedziny chorób alergicznych. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do leczenia i/lub zapobiegania zaburzeniom związanym z nadwrażliwością występującym w organizmie ludzkim.

Termin „alergia” lub „nadwrażliwość” stosowany jest wtedy, gdy adaptywna odpowiedź odpornościowa pojawia się w postaci niewłaściwej. Reakcje alergiczne lub nadwrażliwości są wynikiem normalnie dobroczynnych w skutkach odpowiedzi odpornościowych, ale czynnych w sposób niewłaściwy wobec obcych antygenów (zazwyczaj makrocząsteczek środowiskowych) i niekiedy powodują odczyny zapalne i uszkodzenie tkanki. W tego rodzaju sytuacjach normalnie nieszkodliwy bodziec środowiskowy, nazywany alergenem, wyzwala odpowiedź odpornościową, która, po ponownej ekspozycji, ulega ponownej aktywacji z generowaniem uszkodzenia patologicznego.

Reakcje nadwrażliwości są szkodliwymi reakcjami odpornościowymi na antygeny zewnątrzpochodne. Istnieje wiele klasyfikacji nadwrażliwości. Niektóre z nich oparte są na czasie potrzebnym dla pojawienia się objawów lub reakcji testów skórnych po ekspozycji na antygen (na przykład, nadwrażliwość typu wczesnego lub nadwrażliwość typu późnego), na typie antygenu (na przykład reakcje na lek), albo na charakterze zaangażowania danego narządu. Klasyfikacje te bywają, na ogół, nadmiernie upraszczane i nie biorą pod uwagę tego faktu, że dojść może do odpowiedzi odpornościowej więcej niż jednego typu i że dla spowodowania uszkodzenia odpornościowego może okazać się niezbędna odpowiedź więcej niż jednego typu. Najpowszechniej stosowaną klasyfikacją jest klasyfikacja następująca:

Typ I lub nadwrażliwość typu wczesnego (nadwrażliwość typu natychmiastowego), jest nadwrażliwością, w której pośredniczy IgE. Zwana jest ona także alergią zwykłą. Reakcje nadwrażliwości typu wczesnego (typu I) wynikają z wiązania zachodzącego między antygenem i IgE na komórkach tucznych lub bazofilach.

Zaburzenia z reakcjami nadwrażliwości typu I zwane są także chorobami atopowymi i należą do nich, na przykład, alergiczny nieżyt nosa, alergiczne zapalenie spojówek, atopowe zapalenie skóry, astma alergiczna zewnątrzpochodna, pokrzywka i anafilaksja układowa. Częstość występowania astmy zwiększyła się znacznie, aczkolwiek przyczyny są w dużym stopniu nieznane. Obecnie, zanotowano znaczny wzrost przypadków reakcji typu I w przypadkach ekspozycji na białka rozpuszczalne w wodzie obecne w produktach lateksowych (takich jak, na przykład, rękawiczki gumowe, ślinochrony dentystyczne, prezerwatywy, przewody do wyposażenia respiratorów, cewniki) zwłaszcza u personelu medycznego i chorych narażonych na kontakt z lateksem oraz dzieci cierpiących na rozszczep kręgosłupa tylny i moczowo-płciowe ubytki porodowe. Pospolitymi reakcjami na lateks są: pokrzywka, obrzęk naczynioruchowy, zapalenie spojówek, nieżyt nosa, skurcz oskrzeli i anafilaksja.

Chorzy na choroby atopowe (włącznie z atopowym zapaleniem skóry) zazwyczaj mają odziedziczoną predyspozycję do wywiązywania się u nich nadwrażliwości, w której pośredniczy przeciwciało IgE, na wdychane lub spożyte substancje (alergeny), nieszkodliwe dla osób nieatopowych. Z wyjątkiem atopowego zapalenia skóry, przeciwciała IgE zazwyczaj pośredniczą w nadwrażliwości.

Typ II lub nadwrażliwość cytotoksyczna wiąże się z działaniami cytolitycznymi, w których pośredniczą przeciwciało, dopełniacz i/lub mechanizmy komórkowe. Celem reakcji typu II jest powierzchnia komórki, a wynikiem uszkodzenie komórki lub jej śmierć. Przeciwciało przeciw związanemu z komórką antygenowi (typ II) powoduje destrukcję komórki przez zaktywowanie dopełniacza lub stymulowanie fagocytozy. Przykładami uszkodzenia komórki, w których przeciwciało reaguje z antygenowymi składnikami komórki, są takie zaburzenia, jak niedokrwistość hemolityczna Coombspozytywna, plamica małopłytkowa wywołana przez przeciwciało, leukopenia, pęcherzyca, pemfigoid, zespół Goodpasture'a i niedokrwistość złośliwa. Reakcje te występują u chorych otrzymujących niezgodne przetoczenia, w chorobie hemolitycznej noworodków i w trombocytopenii noworodkowej, a poza tym mogą one odgrywać rolę w chorobach nadwrażliwości uogólnionej (na przykład, w przypadku liszaju rumieniowatego układowego, SLE).

Mechanizm uszkodzenia najlepiej można zilustrować skutkiem wywieranym na krwinki czerwone. W przypadku niedokrwistości hemolitycznej, krwinki czerwone zostają zniszczone albo w wyniku hemolizy wewnątrznaczyniowej, albo fagocytozy makrofagowej, przeważnie w śledzionie. Badania in vitro wykazały, że w obecności dopełniacza pewne przeciwciała wiążące dopełniacz (na przykład przeciwciała grupowe krwi anty-A i anty-B) powodują szybko zachodzącą hemolizę. Inne (na przykład

PL 227 130 B1 przeciwciała anty-LE) powodują powolną lizę komórek. Jeszcze inne nie uszkadzają komórek bezpośrednio, ale powodują ich przylgnięcie do fagocytów i zniszczenie przez te fagocyty. W przeciwieństwie do tego, przeciwciała Rh na krwinkach czerwonych nie aktywują dopełniacza i niszczą komórki głównie na drodze fagocytozy zewnątrznaczyniowej. Przykładami sytuacji, w której antygen jest składnikiem tkanki, są wczesne ostre (nadostre) odrzuty przeszczepu transplantowanej nerki, wynikające z obecności przeciwciała dla śródbłonka naczyniowego, i zespół Goodpasture'a, wynikający z reakcji przeciwciała z kłębkowym i pęcherzykowym śródbłonkiem błony podstawnej. W eksperymentalnym zespole Goodpasture'a, dopełniacz jest ważnym mediatorem uszkodzenia, ale nie jest jeszcze wyraźnie ustalona rola odgrywana przez dopełniacz we wczesnym ostrym odrzuceniu przeszczepu. Do przykładowych reakcji wynikających z haptenowego sprzęgania z komórkami lub tkankami należą liczne reakcji nadwrażliwości polekowej (na przykład powodowana przez penicylinę niedokrwistość hemolityczna, patrz niżej).

Antyreceptorowe reakcje nadwrażliwości zmieniają czynność komórki w wyniku wiązania się przeciwciała z receptorami błony. Dla wielu chorób (takich jak, na przykład, choroba Erba i Goldflama, choroba Gravesa, cukrzyca insulinoniezależna), doniesiono o obecności przeciwciał dla receptorów błony komórkowej. U niektórych cukrzyków z ekstremalną insulino-niezależnością wykazano obecność przeciwciał dla receptorów insuliny, co zapobiega wiązaniu insuliny z jej receptorem. U pacjentów cierpiących na chorobę Gravesa zidentyfikowano przeciwciało dla hormonu pobudzającego tarczycę (TSH), który stymuluje oddziaływanie TSH na jego receptora, czego wynikiem jest nadczynność tarczycy.

W mechanizmach typu III zaangażowane są przeważnie przeciwciała tworzące z antygenem kompleksy odpornościowe. Krążące kompleksy aktywują dopełniacz, przyłączają się do krwinek czerwonych (które następnie ulegają fagocytozie w śledzionie), opuszczają krążenie i wyzwalają odczyn zapalny w przestrzeniach tkankowych (reakcja Arthusa), albo ulegają fagocytozie dokonywanej przez makrofagi prezentujące antygen, uwalniające cytokiny i aktywujące komórki B i komórki T. IgE, IgA, IgG i IgM, wszystkie one tworzą kompleksy z antygenem. Reakcje typu III są wynikiem odkładania się kompleksów odpornościowych w tkankach, w szczególności w skórze, stawach i nerkach. Przewlekłe zapalenie nerek na tle kompleksów odpornościowych jest odpowiedzialne za większość przypadków zapalenia kłębuszkowego nerek u ludzi. Do stanów, w których kompleksy odpornościowe (IC) grają (jak się wydaje) pewną rolę, należy choroba posurowicza wynikająca z działania surowicy, leków lub antygenu zapalenia wątroby wirusowego; liszaj rumieniowaty układowy, zapalenia stawów reumatoidalne; zapalenie wielu tętnic; krioglobulinemia; zapalenie płuc na tle nadwrażliwości; grzybica kropidlakowa oskrzelowo-płucna; przewlekłe błoniasto-rozplemowe zapalenie kłębuszkowe nerek; oraz związana z tym choroba nerek. Sądzi się, że w przypadku grzybicy kropidlakowej oskrzelowo-płucnej oraz spowodowanej działaniem leku lub surowicy choroby posurowiczej, a także niektórych postaci choroby nerek, reakcja, w której pośredniczy IgE przebiega jako reakcja typu III.

Normalnymi zwierzęcymi modelami reakcji typu III są: miejscowa reakcja Arthusa i eksperymentalna choroba posurowicza. W przypadku reakcji Arthusa (typowo miejscowa reakcja skórna) wpierw zwierzęta poddaje się hiperimmunizacji w celu uzyskania wysokiego poziomu krążących przeciwciał IgG, po czym podaje się im doskórnie niewielką ilość antygenu. Antygen wytrąca się z nadmiarem IgG i aktywuje dopełniacz tak, że szybko (w ciągu 4-6 godzin) pojawia się wysoce zapalne, obrzękłe, bolesne uszkodzenie miejscowe, które może rozwijać się, aż do utworzenia jałowego ropnia zawierającego liczne komórki cechujące się różnokształtnością jąder komórkowych, a w dalszym ciągu, aż do martwicy tkanek. Pod mikroskopem można zaobserwować powodujące martwicę zapalenie naczyń z zamkniętymi światłami tętniczkowymi. Reakcji tej nie poprzedza tego żadna faza zastoju, ponieważ przeciwciało już jest obecne.

Reakcje typu I, II i III powodowane są przez przeciwciała. Reakcje typu IV powodowane są przez limfocyty T.

Nadwrażliwość typu IV, związana z reakcjami, w których pośredniczą komórki, rozwija się, na ogół, w ciągu 12 lub więcej godzin i opiera się na zaktywowanych siateczkach komórek immunokompetentnych. Podstawowym stanem tkanki jest tu odczyn zapalny, a rezultatem tego może stać się przewlekła choroba zapalna. Nadwrażliwość typu IV jest zwana także nadwrażliwością typu późnego (opóźnioną) (typu IV) lub DTH. W reakcjach pośredniczą interleukina 2, interferon γ i inne cytokiny uwalniane przez limfocyty T. W przypadku DTH, limfocyty T reagują z antygenem i uwalniają interleukinę 9, interferon γ i inne cytokiny. Gdy komórki T zostały już uczulone przez wstępną ekspozycję, po wtórnej prowokacji następuje reakcja nadwrażliwości typu późnego, a mianowicie miejscowa odpowiedź

PL 227 130 B1 zapalna, zabierająca 2-3 dni dla rozwinięcia się na poziomie klinicznym. Histologicznie, reakcje te polegają na infiltracji leukocytów T, makrofagów i sporadycznych granulocytów eozynochłonnych. Eksperymentalnie, DTH mogą przenieść limfocyty T, ale już nie surowica, a to oznacza, że nie są tu zaangażowane przeciwciała.

DTH może być wynikiem normalnej, zachodzącej za pośrednictwem komórek, odpowiedzi odpornościowej na zakażenie wirusami, grzybami i pewnymi bakteriami, zwłaszcza Mycobacterium tuberculosis i Mycobacteriun leprae. Jeżeli makrofagi nie są zdolne do zniszczenia strawionych organizmów, mogą ulegać zróżnicowaniu do komórek nabłonkowatych lub do wielojądrzastych komórek olbrzymich. Zbiór takich komórek tworzy ziarniniaka. Niepożądanym skutkiem ubocznym takiej skądinąd ochronnej odpowiedzi odpornościowej jest miejscowe uszkodzenie tkanki. Jednakże, gdy odpowiedź typu DHT nie występuje, lub jest upośledzona, wtedy limfocyty T nie są zdolne do lokalizowania atakującego drobnoustroju i u chorych rozwija się inwazyjna agresywna choroba rozsiana, taka jak gruźlica prosówkowa.

Również reakcją typu IV jest kontaktowe zapalenie skóry spowodowane przez antygeny powiązane z pracą zawodową, a także inne. Powodujące tę chorobę czynniki mają zazwyczaj porównywalnie niską masę cząsteczkową (< 1 kD) i nie są same z siebie immunogenne, natomiast są cząsteczkami wysoce reaktywnymi, wiążącymi się kowalencyjnie ze skórą lub białkami skóry. Uczulająca substancja chemiczna jest znana jako hapten, a białko, z którym się ona wiąże, jako nośnik. Szeroki jest zakres potencjalnych antygenów uczulających. Rozpoznaje się dwie fazy patogenezy: faza indukcji i faza ujawnienia. W fazie indukcji komórki skóry prezentujące antygen, znane jako komórki Langerhansa, wiążą się z kompleksem hapten-białko nośne i prezentują go limfocytom T w połączeniu z antygenem MHC klasy II. Indukcja komórek T może nastąpić nawet po miesiącach ekspozycji na nieznaczne ilości antygenu. Ponowna ekspozycja na odnośny antygen wyzwala fazę ujawnienia, w której komórki efektorowe migrują do skóry, aby spotkać się tam z kompleksem białkowym prezentowanym przez komórki Langerhansa w naskórku, z następującym potem uwolnieniem cytokiny i stanem zapalnym skóry. Diagnozy czynnika zagrażającego dokonuje się w skórnym teście plasterkowym. Podejrzewany kontaktowy czynnik uczulający nanosi się na plecy chorego i pozostawia na 48 godzin. Miejsce reakcji bada się po upływie 2 i 24 godzin. W przypadku odpowiedzi pozytywnej występuje w miejscu testowym odczyn zapalny i stwardnienie. Nadwrażliwość typu późnego stanowi również kluczowy mechanizm determinujący odrzucenie testowych transplantowanych narządów.

Niektóre kliniczne stany, co do których sądzi się, że reakcje typu IV mają dla nich ważne znaczenie, są to: kontaktowe zapalenie skóry, zapalenie płuc na tle nadwrażliwości, odrzucenie aloprzeszczepu, ziarniniaki spowodowane przez organizmy wewnątrzkomórkowe, pewne postacie uczulenia na leki, zapalenie tarczycy oraz zapalenie mózgu i rdzenia po szczepieniu przeciw wściekliźnie. Dowody na te dwa ostatnie stany oparte są na modelach eksperymentalnych, a w przypadku choroby ludzi na pojawieniu się limfocytów w wysięku zapalnym tarczycy i mózgu.

Zapalenie skóry nazywane jest także wypryskiem (egzemą). Związane jest ono z powierzchniowym odczynem skóry, charakteryzującym się histologicznie obrzękiem naskórka, a klinicznie pęcherzykami (w postaci ostrej), słabym przyściennym zaczerwienieniem, obrzękiem, przeciekaniem, tworzeniem strupów, łuszczeniem się, zazwyczaj świądem i liszajowaceniem powodowanym przez drapanie się lub pocieranie.

Często, termin „wyprysk” odnosi się do pęcherzykowego zapalenia skóry, ale niekiedy termin ten jest ograniczony do określania przewlekłego zapalenia skóry. Niektórzy określają także zapalenie skóry jako zapalenie gąbczaste, ponieważ charakterystyczną cechą histologiczną jest gąbczastość (obrzęk śródnaskórkowy).

Kontaktowe zapalenie skóry jest ostrym lub przewlekłym stanem zapalnym, często asymetrycznym lub o dziwnym kształcie, powodowanym przez substancje kontaktujące się ze skórą i powodujące reakcje toksyczne (drażniące) lub alergiczne.

Diagnoza reakcji nadwrażliwości zależy od typu związanej z nią reakcji. Zachodzenie reakcji typu IV można domniemywać wtedy, gdy reakcja zapalna jest scharakteryzowana histologicznie przez okołonaczyniowe limfocyty i makrofagi. Najlepiej dostosowanymi metodami badania nadwrażliwości typu późnego są skórne testy nadwrażliwości typu późnego i testy plasterkowe.

W celu zapobieżenia zaostrzeniu kontaktowego zapalenia skóry, przeprowadza się testy plasterkowe, gdy zapalenie skóry zostało już wyraźnie określone. Domniemywany alergen (we właściwym stężeniu) nanosi się na skórę pod nieabsorbującym przylepcem i pozostawia na 48 godzin. Jeżeli wcześniej dojdzie do pieczenia lub swędzenia, plaster usuwa się. Test pozytywny to rumień z pewnym

PL 227 130 B1 stwardnieniem, oraz, sporadycznie, tworzeniem pęcherzyków. Ponieważ niektóre reakcje nie uwidaczniają się aż do czasu usunięcia plasterków, miejsca te poddaje się ponownej kontroli w godzinach 72 i 96.

Nadwrażliwość może pojawić się także jako reakcja na leki. Zanim daną reakcję przypisze się oddziaływaniu leku, należy uświadomić sobie, że także i placebo może spowodować wystąpienie całego szeregu objawów, a nawet objawów zewnętrznych, takich jak wysypki na skórze. Tym niemniej jednak, reakcje na leki stanowią główny problem medyczny.

W przypadku nietolerancji lekowej, szkodliwa reakcja rozwija się już przy pierwszym podaniu leku. Może to być taka sama reakcja toksyczna, której normalnie można spodziewać się przy wyższych dawkach, albo też może to być nasilenie zwykłych słabych skutków ubocznych (na przykład sedacja przeciwhistaminowa). Idiosynkrazja jest stanem, w przypadku którego reakcja szkodliwa przy pierwszym użyciu leku jest farmakologicznie nieoczekiwana i unikalna.

Do charakterystycznych alergicznych reakcji na leki należą przebiegające za pośrednictwem IgE reakcje pojawiające się jedynie po eksponowaniu chorego na lek (niekoniecznie w celu leczenia) jeden raz, lub więcej razy, bez wypadku. Po wywołaniu nadwrażliwości reakcję można uzyskiwać przez podawanie dawek o wiele mniejszych od dawek terapeutycznych, zazwyczaj poniżej tego poziomu, przy którym otrzymuje się reakcje idiosynkratyczne. Właściwości kliniczne ograniczone są pod względem zakresu ujawniania się. Takie zdarzenia, jak pojawiające się w trakcie terapii lekowej wysypki na skórze (w szczególności pokrzywka), objawy podobne do choroby posurowiczej, niespodziewana gorączka, anafilaksja i płucne nacieki komórkami eozynochłonnymi, zazwyczaj wynikają z nadwrażliwości, a niektóre przypadki z niedokrwistości, małopłytkowości i agranulocytozy. Rzadko, po powtarzanej ekspozycji na leki (takie jak, na przykład sulfonamidy, jodki, penicylina) rozwija się zapalenie naczyń.

Doniesiono, na przykład, o śródmiąższowym zapaleniu nerek (po metycylinie) i o uszkodzeniu wątroby (po halotanie) w okolicznościach zgodnych z rozwojem specyficznej nadwrażliwości.

Najpoważniejszym przykładem nadwrażliwości lekowej jest anafilaksja. Jednakże, najczęściej spotykaną reakcją na leki jest wysypka odropodobna, o nieznanej etiologii. Także, do względnie często zdarzających się konsekwencji alergii polekowej należą gorączka i reakcje pokrzywkowe. W przypadku zastosowania w leczeniu surowic zwierzęcych, komplikację stanowi choroba posurowicza, jednakże obecnie rzadko kiedy używa się surowic zwierzęcych. Mogą też się zdarzyć, zwłaszcza w przypadku leków takich jak penicylina, poważne, o nieznanej patogenezie, objawy podobne do choroby posurowiczej, wprawdzie bez wysokiego poziomu krążącego przeciwciała IgG, ale zazwyczaj stowarzyszone z przeciwciałami IgE.

Reakcje nadwrażliwości polekowej oparte są na zdolności leków typu białek i dużych polipeptydów do stymulowania wytwarzania swoistych przeciwciał z wykorzystaniem prostych mechanizmów immunologicznych. Być może, najmniejszą cząsteczką potencjalnie antygenową jest glukagon o masie cząsteczkowej około 3500. Większość cząsteczek leków jest o wiele mniejsza i nie mogą one same działać jako antygeny. Jednakże, jako hapteny, mogą one wiązać się kowalencyjnie z białkami i powstałe tak koniugaty stymulują produkcję przeciwciał swoistych dla danego leku. Lek, lub jeden z jego metabolitów, reaguje chemicznie z białkiem. Wiązanie z białkiem surowicy, zwykłe dla wielu leków, jest o wiele słabsze i nie ma mocy wystarczającej dla wzbudzenia antygenowości.

Specyficzna reakcję immunologiczna wykazano jedynie dla benzylopenicyliny. Jednakże, lek ten nie wiąże się dostatecznie mocno z białkami tkanek lub surowicy, aby utworzyć kompleks antygenowy. Natomiast główny produkt rozkładu tego leku, a mianowicie kwas benzylopenicylenowy, może łączyć się z białkami tkanek z utworzeniem benzylopenicyloilu (BPO), głównej determinanty antygenowej penicyliny. Z zastosowaniem mechanizmów (które nie są jeszcze dobrze zdefiniowane) tworzy się także, w stosunkowo mniejszych ilościach, szereg mniej istotnych determinant antygenowych. Reakcje nadwrażliwości (I, II, III i IV) najczęściej zachodzą z udziałem determinanty BPO. Przeciwciała IgE dla mniejszych determinant mogą być odpowiedzialne, u niektórych chorych, za anafilaksję i pokrzywkę. Znaleziono przeciwciała IgG dla głównych, ale nie dla mniej znaczących determinant. Mogą one działać jako „przeciwciała blokujące” dla BPO, modyfikując, a nawet zapobiegając reakcji na BPO, podczas gdy brak przeciwciał blokujących IgG dla mniej istotnych determinant może tłumaczyć zdolność tych determinant do indukowania anafilaksji.

Wszystkie penicyliny półsyntetyczne (na przykład amoksycylina, karbenicylina, tykarcylina) potencjalnie reagują krzyżowo z penicyliną tak, że chorzy uczuleni na penicylinę często reagują także i na nie. W mniejszym stopniu reakcje krzyżowe zdarzają się u cefalosporyn. Leczenie cefalosporyną

PL 227 130 B1 powinno zaczynać się z zachowaniem wielkiej ostrożności, jeżeli w wywiadzie chorobowym tego pacjenta zanotowano poważne reakcje (na przykład anafilaksję) na penicylinę.

Zachodzące za pośrednictwem przeciwciała hematologiczne reakcje na leki (cytotoksyczne, typ II) mogą rozwinąć się zgodnie z jednym z trzech różnych mechanizmów. I tak, w przypadku niedokrwistości wywołanej penicyliną, przeciwciało reaguje z haptenem, mocno związanym z błoną komórkową krwinek czerwonych, doprowadzając do aglutynacji i wzmożonego rozkładu krwinek czerwonych. W przypadku indukowanej stybofenem i chinidyną trombocytopenii, lek tworzy ze swym swoistym przeciwciałem rozpuszczalny kompleks. Powstały tak kompleks reaguje następnie z pobliskimi płytkami (komórki docelowe zwane „niewinny widz”, ang. „innocent bystander”) i aktywuje dopełniacza, który pozostaje sam na błonie płytki i powoduje lizę komórki. W niedokrwistościach hemolitycznych innych typów, lek (na przykład metyldopa) zmienia, jak się wydaje, chemicznie powierzchnię krwinek czerwonych, a przez to nie pokrywa antygenu, który indukuje, a następnie poddaje reakcji ze sobą autoprzeciwciało, zazwyczaj o swoistości Rh.

Toksyczno-idiosynkratyczne i anafilaktyczne reakcje są dostatecznie unikalne pod względem rodzaju i czasu tak, że lek zazwyczaj łatwo jest zidentyfikować. Reakcje posurowicze najczęściej powodowane są przez penicyliny, ale sporadycznie odpowiedzialne za nie są także sulfonamidy, hydralazyny, sulfonylomoczniki lub tiazydki. Fotouczulenie jest charakterystyczne dla chlorpromazyny, pewnych środków antyseptycznych występujących w mydłach, sulfonamidów, psoralenów, demeklocykliny i gryzeofulwiny. Należy wstrzymać podawanie wszystkich leków z wyjątkiem tych, które uważa się za absolutnie istotne. Jeżeli domniemywane jest wystąpienie gorączki polekowej, należy wstrzymać podawanie leku najbardziej prawdopodobnego pod tym względem (na przykład allopurynolu, penicyliny, izoniazydu, sulfonamidów, barbituranów, chinidyny). Obniżenie gorączki w ciągu 48 g nasuwa silną sugestię odnośnie danego leku. Jeżeli gorączce towarzyszy granulocytopenia, wtedy bardziej niż alergia prawdopodobna jest toksyczność leku i sytuacja jest o wiele bardziej poważna.

Alergiczne płucne reakcje na leki zazwyczaj są naciekowe, połączone z eozynofilią i mogą być powodowane, między innymi, przez sole złota, penicylinę i sulfonamidy. Najczęściej spotykanym czynnikiem stanowiącym powód ostrej naciekowej reakcji płucnej jest nitrofurantoina. Reakcja jest w tym przypadku alergiczna, ale, zazwyczaj, nie eozynofilowa.

Reakcje wątrobowe mogą być, w pierwszym rzędzie, cholestatyczne (najczęściej zaangażowane w nich są fenotiazyny i laurylosiarczan propionianu erytromycyny) lub hepatokomórkowe (allopurynol, hydantoiny, sole złota, izoniazyd, sulfonamidy, kwas walproinowy i wiele innych). Zwykłą alergiczną reakcją nerkową jest zapalenie nerek śródmiąższowe i najczęściej spowodowane jest ono stosowaniem metycyliny; zresztą bierze się tu pod uwagę także inne środki zabójcze dla drobnoustrojów oraz cymetydynę. Zespół podobny do liszaju rumieniowatego układowego (SLE) mogą wywoływać rozmaite leki, najczęściej hydralazyna i prokainamid. Zespół ten związany jest z pozytywnym testem na przeciwciało przeciwjądrowe i jest względnie łagodny, oszczędzający nerki i centralny układ nerwowy (CNS). Penicylamina może powodować SLE i inne choroby autoimmunizacyjne, najbardziej chorobę Erba i Goldflama (myasthenia gravis).

W roku 1989 opisano aktywność surowiczą wywołaną endotoksyną, indukującą interferon γ (IFN-γ) otrzymaną z mysich komórek śledziony (Nakamura i in., 1989). Ta aktywność surowicza funkcjonowała niejako bezpośredni induktor IFN-γ, ale raczej jako kostymulant razem z IL-2 lub mitogenami. Usiłowanie oczyszczenia tej aktywności z mysiej surowicy poendotoksynowej zaowocowało uzyskaniem wyraźnie jednorodnego białka o 50-55 kDa. Ponieważ inne cytokiny mogą także działać jako kostymulanty dla wytwarzania IFN-γ, niewydolność neutralizujących przeciwciał dla IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 lub TNF pod względem zobojętniania aktywności surowiczej sugerowała, że był to osobny czynnik. W roku 1995 ci sami naukowcy wykazali, że indukowany endotoksyną kostymulant dla wytwarzania IFN-γ obecny był w ekstraktach z wątrób myszy wstępnie kondycjonowanych P. acnes (Okamura i in., 1995). W modelu tym, populacja makrofagów wątrobowych (komórki Browicza-Kupffera, ang. Kupffer cells) rozwija się i u myszy tych staje się letalna niska dawka bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS), która u myszy nie poddanych wstępnemu kondycjonowaniu nie jest letalna. Czynnik ten, wpierw nazwany czynnikiem indukującym IFN-γ (IGIF), a później interleukiną 18 (IL-18), poddano oczyszczaniu, aż do uzyskania jednorodności, do czego użyto 1200 g wątrób mysich po potraktowaniu P. acnes. Zdegenerowanych oligonukleotydów pochodzących z sekwencji aminokwasów oczyszczonej IL-18 użyto do klonowania cDNA mysiej IL-18. IL-18 jest białkiem o 18-19 kDa złożonym ze 157 aminokwasów, nie wykazującym żadnych oczywistych podobieństw do jakiegokolwiek peptydu w bazie danych. W komórkach Browicza-Kupffera i zaktywowanych makrofagach łatwo wykryto

PL 227 130 B1 informacyjny RNA dla IL-18 i interleukiny 12 (IL-12). Rekombinantowe białko IL-18 indukuje IFN-γ silniej niż czyni to IL-12, w sposób oczywisty na osobnym szlaku metabolicznym (Micallef i in. 1996). Podobnie do aktywności surowiczej indukowanej endotoksyną, IL-18 nie indukuje IFN-γ samo z siebie, ale funkcjonuje przede wszystkim jako kostymulant z mitogenami lub IL-2. IL-18 wzmaga namnażanie się komórek T, w sposób oczywisty na szlaku zależnym od IL-2, i wzmaga produkcję cytokiny Th1 in vitro, a także wykazuje synergizm działania w przypadku skombinowania z IL-12 w sensie wzmożonej produkcji IFN-γ (Maliszewski i in., 1990).

Po sklonowaniu formy mysiej, w roku 1996 doniesiono o ludzkiej sekwencji cDNA dla IL-18 (Ushio i in., 1996).

Przez sklonowanie IL-18 z zainfekowanych tkanek i zbadanie ekspresji genu IL-18 odkryto ścisły związek tej cytokiny z chorobą autoimmunizacyjną. U myszy NOD (ang. non-obese diabetic mouse) spontanicznie rozwijają się autoimmunizacyjne zapalenie wysp trzustkowych i cukrzyca, które można przyspieszyć i zsynchronizować przez pojedyncze wstrzyknięcie cyklofosfamidu. Metodą RT-PCR w trzustce myszy NOD, we wczesnych stadiach zapalenia wysp trzustkowych, wykazano obecność mRNA IL-18. Po potraktowaniu cyklofosfamidem poziom mRNA IL-18 szybko podwyższył się i poprzedzał powstawanie mRNA IFN-γ, a w konsekwencji cukrzycy. Jest rzeczą interesującą, że kinetyka ta naśladuje kinetykę mRNA IL-12-p40, czego wynikiem jest ścisła korelacja poszczególnych poziomów mRNA. Klonowanie cDNA IL-18 z RNA trzustki, z następującym po tym sekwencjonowaniem, potwierdziło identyczność z sekwencją IL-18 sklonowaną z komórek Browicza-Kupffera i in vivo wstępnie zaktywowanych makrofagów. Także makrofagi myszy NOD odpowiadały na cyklofosfamid ekspresją genu IL-18, podczas gdy w przypadku makrofagów z myszy Balb/c, potraktowanych równolegle, nie stwierdzono tego. Stąd też, ekspresja IL-18 jest nienormalnie regulowana u autoimmunizacyjnej myszy NOD i jest ściśle związana z rozwojem cukrzycy (Rothe i in., 1997). IL-18 odgrywa potencjalną rolę w immunoregulacji lub w stanach zapalnych przez wzmaganie aktywności czynnościowej ligandu Fas na komórkach Th1 (Conti i in., 1997). Do ekspresji IL-18 dochodzi także w korze nadnerczy i dlatego może być wydzielanym neuroimunomodulatorem, odgrywającym ważną rolę w orkiestrowaniu układu odpornościowego po doznaniu stresującym (Chater, 1986).

In vivo, IL-18 utworzona jest przez rozszczepienie pro-IL-18, a jej aktywność endogenna przejawia się w produkowaniu IFN-γ w P. acnes i letalności, w której pośredniczy LPS. Dojrzała IL-18 wytwarzana jest z jej prekursora z udziałem enzymu konwertującego IL-1p (enzym konwertujący IL-1 β, ICE, kaspaza-1).

Receptor IL-18 składa się z co najmniej dwóch komponentów, współpracujących ze sobą w wiązaniu liganda. W mysich stymulowanych IL-12 komórkach T wykryto miejsca wiążące o wysokim i niskim powinowactwie do IL-18 (Yoshimoto i in., 1998), co nasuwa sugestię obecności wielokrotnego łańcuchowego kompleksu receptorowego. Jak dotychczas, zidentyfikowano dwie podjednostki receptora, obie należące do rodziny receptorów IL-1 (Parnet i in., 1996). Sygnałowa transdukcja IL-18 zachodzi z aktywacją NF-kB (DiDonato i in., 1997).

Obecnie, z moczu ludzkiego wyizolowano rozpuszczalne białko o wysokim powinowactwie do IL-18, a także opisano cDNA ludzki i mysi (Novick i in., 1999; WO 99/09063). Białku dano nazwę „białko wiążące IL-18” (IL-18BP).

IL-18BP nie jest pozakomórkową domeną jednego ze znanych receptorów IL-18, ale wydzielonym białkiem znajdującym się w sposób naturalny w krążeniu. Należy ono do nowej rodziny wydzielanych białek. Do rodziny tej należą także rozmaite białka kodowane przez wirusa ospy o wysokiej homologii do IL-18BP (Novick i in., 1999). Konstytutywna ekspresja IL-18BP zachodzi w śledzionie. Białko to należy do nadrodziny immunoglobulin i ma ograniczoną homologię z receptorem IL-1 typ II. Jego gen zlokalizowano na ludzkim chromosomie 11q13 i w sekwencji genomowej o 8,3 kz nie znaleziono żadnego eksonu kodującego przezbłonową domenę (Novick i in., 1999).

Cztery ludzkie i dwie mysie izoformy IL-18BP, wywodzące się ze splicingu mRNA i znalezione w rozmaitych bibliotekach cDNA, otrzymano na drodze ekspresji, oczyszczono i oceniono pod względem wiązania i neutralizacji zapoczątkowania biologicznych aktywności IL-18 (Kim i in., 2000). Izoforma ludzkiego IL-18BP (IL-18BPa) wykazywała największe powinowactwo do IL-18 przy dużej szybkości zapoczątkowania, małej szybkości kończenia, i stałą dyslokacji [K(d)] wynoszącą 399 pM. IL-18BPc posiada taką samą domenę Ig jak IL-18BPa, z wyjątkiem 29 C-końcowych aminokwasów; K(d) IL-18BPc jest 10-krotnie mniejsza (2,94 nM). Tym niemniej, jednak, IL-18BPa i IL-18BPc neutralizują IL-18 w > 95% przy dwukrotnym nadmiarze molowym. W izoformach IL-18BPb i IL-18BPd brakuje kompletnej domeny Ig i nie mają one zdolności wiązania lub neutralizowania IL-18. Mysie izoformy

PL 227 130 B1

IL-18BPc i IL-18BPd, mające identyczną domenę Ig, także neutralizują > 95% mysiego IL-18 przy dwukrotnym nadmiarze molowym. Jednakże, mysie IL-18BPd, które posiada wspólny z ludzkim IL-18BPa motyw C-końcowy, także neutralizuje ludzką interleukinę IL-18. Modelowanie cząsteczkowe pozwoliło zidentyfikować duże mieszane elektrostatyczne i hydrofobowe miejsce wiązania w domenie Ig IL-18BP, które może być odpowiedzialne za jej wysokie powinowactwo wiązania z ligandem (Kim i in., 2000).

W roku 1998 zaproponowano możliwość udziału ekspresji interleukiny 18 (IL-18) w patogenezie mysiej nadwrażliwości kontaktowej (Xu i in., 1998). Xu i in. zastosowali mysi model nadwrażliwości kontaktowej z oksazolonem jako alergenem kontaktowym i wykazali indukcję ekspresji IL-18 w zmianach chorobowych skóry. Najwyższy poziom aktywacji stwierdzono po upływie 24 godzin od prowokacji alergenem, po czym ekspresja IL-18 stopniowo opadała.

Dalsze doniesienie na temat zdolności IL-18 do indukowania odpowiedzi typu późnego (DTH), niezależnie od IL-18, opublikowali Kitching i in., 2000. Jednakże, rola IL-18 pozostaje niejasna, ponieważ doniesiono także, że IL-18 sama stanowi potencjalnie skuteczny środek leczniczy dla chorych z atopowym zapaleniem skóry (Habu i in., 2001), co było zgodne z wynikami szeregu prób klinicznych nasuwających sugestię, że IFN-γ polepsza objawy zapalenia skóry atopowego (Reinhold i in., 1990; Hanifin i in., 1993).

Wynalazek niniejszy oparty jest na stwierdzeniu, że leczenie myszy przy użyciu inhibitorów IL-18 w modelu nadwrażliwości typu IV prowadzi do osłabienia reakcji nadwrażliwości u zwierzęcia, które to osłabienie widoczne jest w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Wynalazek dotyczy więc zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia i/lub zapobiegania zaburzeniom związanymi z nadwrażliwością typu IV wybraną spośród nadwrażliwości typu późnego i nadwrażliwości kontaktowej, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany spośród białka wiążącego IL-18 (IL-18BP), fuzji IL-18BP z immunoglobuliną i funkcjonalnej pochodnej IL-18BP, która obejmuje co najmniej jedno ugrupowanie, którym jest ugrupowanie glikolu polietylenowego (PEG), przyłączone do jednej lub większej ilości grup funkcyjnych, występujących jako jeden lub więcej łańcuchów bocznych w resztach aminokwasowych.

Korzystnie wytwarzany lek zawiera jeszcze interferon przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego, którym korzystnie jest interferon β.

Korzystnie też lek zawiera jeszcze inhibitor czynnika martwicy nowotworów (TNF) przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego;, korzystnie inhibitorem TNF jest TBP I i/lub TBP II.

Korzystnie też lek zawiera jeszcze środek przeciwzapalny, przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego; korzystnie środkiem przeciwzapalnym jest inhibitor COX.

Korzystnie lek zawiera jeszcze środek przeciwalergiczny przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego.

Korzystnie inhibitor IL-18 stosuje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,001 do 1000 mg/kg masy ciała, albo od 0,01 do 100 mg/kg masy ciała, albo od 0,1 do 10 mg/kg masy ciała, albo w ilości 5 mg/kg masy ciała. Inhibitor IL-18 stosuje się podskórnie, domięśniowo lub miejscowo.

Poniżej przedstawiono opis Figur na rysunkach.

Figura 1 pokazuje, że potraktowanie IL-18BP w trakcie prowokacji chroni przed nadwrażliwością kontaktową (CHS). Myszy uczulono przy użyciu DNFB wprowadzonego na grzbiet w dniu 0 i prowokowano w ciągu dalszych 5 dni na uszach. Obrzmienie uszu mierzono co dzień i wyrażano jako powiększenie się obrzmienia u zwierząt poddanych prowokacji przy użyciu DNFB w porównaniu z uszami zwierząt kontrolnych potraktowanych nośnikiem. Potraktowanie i.p. 250 pg IL-18BP/mysz, codziennie w ciągu 5-8 dni, wyraźnie zmniejszało obrzmienie uszu (A), podczas gdy traktowanie w dniach 0-2 nie okazało się ochronne w tej serii eksperymentów (B) (n = 5 myszy w grupie).

Kwadraty: myszy potraktowane IL18-BP.

Trójkąty: kontrola, to znaczy myszy potraktowane wodnym roztworem chlorku sodu.

Figura 2 pokazuje rozmiary obrzmienia uszu od dnia 5 do dnia 30 po pierwszej prowokacji haptenem w dniu 5 i drugiej prowokacji w dniu 19 w modelu nadwrażliwości typu późnego z układowym podawaniem IL-18BP w dawce 250 pg/mysz/dzień (kwadraty białe) lub nośnik (kwadraty czarne) od dnia 19 do dnia 22.

Figura 3 pokazuje, że IL-18BP chroni przed CHS przez neutralizowanie IL-18. Myszy z wyeliminowaniem IL-18 (KO) i myszy typu dzikiego C57BL/6 porównano pod względem zdolności do opanowywania odpowiedzi w postaci CHS. U myszy z wyeliminowaniem IL-18 rozwija się CHS w odpowiedzi

PL 227 130 B1 na DNFB, aczkolwiek w stopniu mniej zdecydowanym niż u myszy typu dzikiego. Jednakże, nie zaobserwowano żadnego skutku działania IL-18BP u myszy z wyeliminowaniem IL-18, co wskazuje na fakt, że przeciwzapalne działanie IL-18BP w przypadku CHS wynikało z neutralizacji IL-18 (n = 5 myszy w grupie).

Kółka: wodny roztwór chlorku sodu u myszy IL-18 KO.

Romby: IL-18BP u myszy IL-18 KO.

Kwadraty: IL-18BP u myszy typu dzikiego (WT).

Trójkąty: wodny roztwór chlorku sodu u myszy WT.

Figura 4 pokazuje, że IL-18BP nie redukuje naciekania naczyniowego podczas CHS. CHS indukowano u myszy C57BL/6. W celu monitorowania obrzęku wywołanego reakcją CHS wstrzyknięto i.v. barwnik Evans Blue na 2 godziny przed prowokacją przy użyciu DNFB. Myszy uśmiercono po upływie 24 godzin i uszy spreparowano w celu wyekstrahowania barwnika wyciekłego z układu naczyniowego i nagromadzonego w otaczającej tkance. Wyciek naczyniowy oceniano jako ilość barwnika/mg suchej tkanki usznej skorygowaną dla stężenia Evans Blue w surowicy i wyrażoną jako stosunek ilości w uchu myszy poddanych prowokacji do ilości w uchu myszy kontrolnych. Podczas gdy potraktowanie IL-18BP w dniach 4 i 5 zmniejszało obrzmienie do 56% obrzmienia u myszy kontrolnych potraktowanych podłożem (panel lewy, p < 0,01), to nie stwierdzono żadnej wyraźnej różnicy pod względem wycieku naczyniowego między tymi dwiema grupami. Obie grupy wykazywały wyraźnie zwiększone obrzęki, jak to wynika z porównania z nie uczuloną grupą kontrolną (p < 0,05 i p < 0,01). Jako dalsza kontrola, służyły myszy potraktowane 250 pg (nieistotnego tu) białka BSA/zwierzę/dzień. U myszy tych rozwinęła się CHS podobna do zwierząt kontrolnych potraktowanych podłożem (n = 10 myszy w grupie).

Figura 5. Potraktowanie IL-18BP redukuje zapalne wyciekanie z ucha po prowokacji DNFB.

CHS indukowano u myszy C57CL/6 jak opisano. Zwierzęta potraktowano IL-18BP lub podłożem w dniach 4, 5 i 6. Podziałanie IL-18BP spowodowało zmniejszenie obrzmienia do 58% obrzmienia u kontroli otrzymujących podłożem, w dniu 7. Od myszy poddanych prowokacji uśmierconych w dniu 7 pobrano uszy, zgrupowano je (n = 8) i poddano trawieniu enzymatycznemu w celu otrzymania zawiesin pojedynczych komórek. Następnie, komórki scharakteryzowano przez poddanie ich analizie przeprowadzonej metodą FACS, z bramkowaniem na żywe komórki CD45-pozytywne. Liczbę komórek Ταβ, komórek NK, krwinek białych obojętnochłonnych i monocytów/makrofagów znalezionych w preparatach z uszu wyrażono jako procent całkowitej ilości komórek poddanych analizie (wartości górne). Zmniejszenie liczby komórek tych typów po potraktowaniu IL-18BP w stosunku do kontroli otrzymujących podłożem podano jako wartości dolne.

Figura. 6 pokazuje, że aktywacja komórek T zostaje upośledzona po potraktowaniu IL-18BP.

Komórki otrzymane z uszu po prowokacji przy użyciu DNFB poddano ponownej stymulacji, stosując je ₅ w ilości 2 x 10⁵/studzienkę i używając przeciwciała anty-CD3 związanego z płytką. W następującym po tym 24-godzinnym okresie nie dodawano już żadnej ilości IL-18BP. W trzech powtórzeniach zmierzono metodą ELISA wytwarzanie IFN-γ. Komórki otrzymane od myszy potraktowanych IL-18BP wytworzyły jedynie 45% tej ilości IFN-γ, którą wykryto w hodowlach komórek zwierząt kontrolnych potraktowanych podłożem.

Figura 7 pokazuje, że potraktowanie IL-18BP zmniejsza liczbę komórek produkujących IFN-γ, obecnych w naciekach zapalnych z uszu. Preparaty komórkowe sporządzone z uszu po prowokacji przy użyciu DNFB stymulowano z zastosowaniem 50 ng/ml PMA* i 500 ng/ml lonomycyny, w ciągu 4 godzin. Wydzielanie cytokiny zablokowano dodaniem 2 pg/ml brefeldyny A, na ostatnie 2 godziny inkubacji. Następnie, komórki poddano wielokolorowemu barwieniu immunofluorescencyjnemu w celu wykrycia wewnątrzkomórkowego IFN-γ i antygenów powierzchniowych. Potraktowanie IL-18BP zmniejszało ogólną liczbę komórek pozytywnych pod względem barwienia IFN-γ do 78% liczby komórek kontroli potraktowanych podłożem. IFN-γ był wytwarzany przez komórki T CD8 i w mniejszym stopniu przez komórki T CD4. W przypadku komórek NK i komórek Tαβ nie wykryto żadnej obecności IFN-γ.

n.d.: nie wykryto;

*: tetradekanoilooctan forbolu.

Figura 8. Potraktowanie IL-18BP nie upośledza rekrutacji komórek Langerhansa do drenującego węzła chłonnego. Myszom naniesiono pędzlem hapten FITC lub podłożem [aceton/dibutyloftalan (1:1)] odpowiednio, na prawy i lewy bok. Po upływie 24 godzin od pędzlowania pobrano pachwinowe węzły chłonne. Komórki Langerhansa skoniugowane z haptenem można było wykryć metodą FACS

PL 227 130 B1 jako komórki FITC⁺, CD11c⁺ w węźle chłonnym drenującym bok popędzlowany FITC, ale nie w przeciwstronnym węźle chłonnym drenującym bok popędzlowany jedynie podłożem. Udział komórek Langerhansa z haptenem w węźle chłonnym drenującym wynosił 1,2% ogólnej liczby komórek w tym węźle u zwierząt potraktowanych IL-18BP na 24 h i 1 h przed pędzlowaniem. Nie różni się to znacząco od liczby komórek uzyskanych od zwierząt kontrolnych.

(n = 5 węzłów chłonnych drenujących/grupę).

W kontekście niniejszego wynalazku, wyrażenia „zaburzenie związane z nadwrażliwością” i „zaburzenie alergiczne” używane są synonimicznie. Oba te terminy odnoszą się do zaburzeń lub reakcji powodowanych przez niewłaściwą adaptywną odpowiedź odpornościową. Reakcje nadwrażliwości są rezultatem normalnie dobroczynnych w skutkach odpowiedzi odpornościowych, ale czynnych w sposób niewłaściwy wobec obcych antygenów (zazwyczaj makrocząsteczek środowiskowych), co może prowadzić do reakcji zapalnych i uszkodzenia tkanki. W zaburzeniach związanych z nadwrażliwością bodziec normalnie nieszkodliwy, alergen, wyzwala odpowiedź odpornościową, która, po ponownej ekspozycji, ulega ponownej reaktywacji z generowaniem uszkodzenia patologicznego.

Zaburzenia związane z nadwrażliwością typu IV związane są z reakcjami w których pośredniczą komórki i do rozwinięcia się potrzebują, na ogół, 12 lub więcej godzin. Zaburzenia związane z nadwrażliwością typu IV mogą być związane z odczynem zapalnym, a wynikiem tego może być przewlekła choroba zapalna. Nadwrażliwość typu IV nazywana jest także nadwrażliwością typu późnego (opóźnioną) lub DTH. Po uczuleniu komórek T za pomocą wstępnej ekspozycji, po wtórnej prowokacji następuje reakcja nadwrażliwości typu późnego. Reakcją tą jest miejscowa odpowiedź zapalna, wymagająca niekiedy 2-3 dni do rozwinięcia się na poziomie klinicznym.

W korzystnym wykonaniu wynalazku zaburzeniem związanym z nadwrażliwością jest nadwrażliwość typu późnego. Tak więc, wynalazek dotyczy wszelkich rodzajów stanów klinicznych, dla których ważne są reakcje typu IV, takie jak nadwrażliwość kontaktowa typu późnego, zapalenie skóry, kontaktowe zapalenie skóry, zapalenie płuc na tle nadwrażliwości, odrzucenie aloprzeszczepu, ziarniniaki powodowane przez organizmy wewnątrzkomórkowe, niektóre postacie uczulenia na leki, zapalenie tarczycy i zapalenie mózgu i rdzenia po szczepieniu ospy.

DTH może być wynikiem normalnej, przebiegającej za pośrednictwem komórek, odpowiedzi odpornościowej na zakażenie wirusami, grzybami i pewnymi bakteriami, zwłaszcza Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae. Dalszymi czynnikami zewnętrznymi wywołującymi DTH mogą być wydzieliny roślinne, zwierzęce, owadzie i gadzie, oraz antygeny chemiczne lub biochemiczne. Mogą one pochodzić ze źródeł syntetycznych lub naturalnych. Włókna, tkaniny itp. rozmaitych rodzajów, takie jak lateks stosowany w rękawiczkach chirurgicznych, mogą u niektórych osobników zapoczątkowywać reakcję nadwrażliwości, w której pośredniczą komórki T. Zagrażającymi czynnikami zewnętrznymi mogą być czynniki przenoszone przez wodę, takie jak rozpuszczone w niej sole i minerały, z którymi ma się do czynienia, na przykład, w operacjach wytwórczych związanych ze środowiskiem, górnictwem, metalurgią i chemią.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku, zaburzeniem związanym z nadwrażliwością jest kontaktowe zapalenie skóry lub nadwrażliwość kontaktowa. Kontaktowe zapalenie skóry, a więc nadwrażliwość typu IV stanowi reakcję na antygeny powiązane z pracą zawodową lub inne antygeny. Czynniki wywołujące kontaktowe zapalenie skóry mają zazwyczaj porównawczo niewielką masę cząsteczkową (< 1 kD) i same z siebie nie są immunogenne, natomiast są cząsteczkami wysoce reaktywnymi, które wiążą się kowalencyjnie z białkami skóry lub tkanek. Uczulająca substancja chemiczna nazywana jest haptenem, a białko gospodarza, które łączy się z nim, nazywane jest nośnikiem. Znanych jest wiele haptenów wyzwalających kontaktowe zapalenie skóry. W celu wykrycia, czy u danego osobnika będzie się rozwijać zapalenie skory kontaktowe w odpowiedzi na określony uczulacz, domniemywany uczulacz kontaktowy nanosi się na plecy chorego i przykrywa na 48 godzin. Miejsce reakcji sprawdza się po upływie 2 i 24 godzin. W przypadku reakcji dodatniej, w miejscu testowanym występuje odczyn zapalny i stwardnienie.

Nadwrażliwość typu późnego stanowi także kluczowy mechanizm decydujący o odrzuceniu transplantowanych narządów użytych w teście i wynalazek dotyczy także zastosowania inhibitora IL-18 do zapobiegania odrzuceniom przeszczepów.

Termin „inhibitor IL-18” stosowany w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do jakiejkolwiek cząsteczki modulującej wytwarzanie IL-18 i/lub jej działanie w sposób prowadzący do osłabienia, ograniczenia albo częściowego, zasadniczego lub całkowitego zapobieżenia lub zablokowania wytwarzania IL-18 i/lub jej czynności.

PL 227 130 B1

Inhibitorem IL-18 może być antagonista IL-18, który wiąże się z cząsteczką IL-18 z powinowactwem i swoistością wystarczającymi do częściowego lub zasadniczego zneutralizowania IL-18 lub miejsca wiążącego (miejsc wiążących) IL-18 z jej ligandami (takimi jak, na przykład, jej receptory). Antagonista może także hamować szlak sygnałowy IL-18, aktywowany w komórkach poprzez wiązanie IL-18/receptor.

Termin „białko wiążące IL-18” może też być oznaczony skrótem „IL-18BP”. Obejmuje on swym zakresem białka wiążące IL-18 według definicji podanej w WO 99/09063 lub przez Novicka i in. (1999), włącznie z wariantami splicingowymi i/lub izoformami białek wiążących IL-18, według definicji podanej przez Kima i in. (2000), które wiążą się z IL-18. W szczególności, w wykonaniu niniejszego wynalazku użyteczne okazują się ludzkie izoformy a i c IL-18BP. Białka użyteczne w wykonaniu niniejszego wynalazku mogą pochodzić ze źródeł naturalnych, takich jak mocz, albo, korzystnie, można je też wytwarzać na drodze rekombinacji. Ekspresję rekombinacyjną można przeprowadzić w prokariotycznych systemach ekspresyjnych, takich jak E. coli, lub w eukariotycznych (korzystnie pochodzących od ssaków) systemach ekspresyjnych.

Termin „fuzja białkowa” odnosi się do polipeptydu obejmującego IL-18BP lub wirusowego IL-18BP, sprzężonego z innym białkiem, mającym, na przykład, wydłużony czas pozostawania w płynach ustrojowych. Tak więc, IL-18BP lub wirusowy IL-18BP może być w fuzji z immunoglobuliną. Stosowane w niniejszym opisie określenie „pochodne funkcjonalne” oznacza pochodne białek IL-18BP lub wirusowego IL-18BP, które można wytworzyć z wykorzystaniem grup funkcyjnych występujących jako łańcuchy boczne przy resztach albo grupach N- lub C-końcowych z wykorzystaniem sposobów znanych w tej dziedzinie techniki, i które są włączone w zakres niniejszego wynalazku, jeżeli tylko są farmaceutycznie dozwolone, to znaczy nie niszczą aktywności białka, która jest zasadniczo podobna do aktywności IL-18BP, lub wirusowych białek IL-18BP, i nie nadają właściwości toksycznych zawierającym je kompozycjom.

Pochodne te obejmują łańcuchy boczne utworzone z glikolu polietylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i wydłużać czas pozostawiania IL-18BP lub wirusowego IL-18BP w płynach ustrojowych.

Opis sekwencji IL-18BP i jego splicingowych wariantów/izoform można zaczerpnąć z WO 99/ /09063 lub z publikacji Novicka i in. (1999) oraz Kima i in. (2000).

Funkcjonalne pochodne IL-18BP można ze sobą skoniugować, z otrzymaniem polimerów, a to dla polepszenia takich właściwości białka, jak trwałość, okres półtrwania, dostępność biologiczna, tolerowanie przez organizm ludzki lub immunogenność. Dla osiągnięcia tego celu IL-18BP można połączyć z glikolem polietylenowym (PEG). „PEGylowanie” takie można przeprowadzić z wykorzystaniem znanych sposobów postępowania, opisanych, na przykład, w WO 92/13095.

Zgodnie z dalszym korzystnym wykonaniem wynalazku, inhibitor IL-18 stanowi fuzja z immunoglubuliną, a to oznacza, że inhibitor IL-18 jest białkiem sprzężonym, obejmującym całość lub część białka wiążącego IL-18 sprzężonego z całością lub częścią immunoglubuliny. Sposoby otrzymywania białek sprzężonych z immunoglobulinami są dobrze znane w tej dziedzinie techniki i są to takie metody, jakie opisano, na przykład, w WO 01/03737. Specjalista w tej dziedzinie techniki rozumie, że powstałe tak białko według wynalazku zachowuje aktywność biologiczną IL-18BP, a w szczególności zdolność wiązania z IL-18. Sprzężenie takie może być bezpośrednie, albo poprzez krótki łącznik peptydowy, który może być nawet tak krótki, że zawiera na całej swej długości od 1 do 3 reszt aminokwasowych, albo także poprzez łącznik dłuższy, na przykład, o długości 13 reszt aminokwasowych. Łącznikiem takim może być, na przykład, tripeptyd o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met), albo też łącznik może mieć sekwencję o długości 13 aminokwasów:

Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met wprowadzoną między sekwencję IL-18BP a sekwencję immunoglobuliny. Wytworzone w ten sposób białko sprzężone odznacza się polepszonymi właściwościami, takimi jak wydłużony czas pozostawania w płynach ustrojowych (okres półtrwania), zwiększona aktywność właściwa, podwyższony poziom ekspresji, albo też oczyszczanie białka sprzężonego jest ułatwione. Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku, IL-18BP zostaje sprzężone ze stałym regionem cząsteczki Ig. Korzystnie, białko to sprzęga się z regionami łańcucha ciężkiego, takimi jak, na przykład, domeny CH2 i CH3 ludzkiej IgG1. Wytwarzanie specyficznych białek sprzężonych obejmujących IL-18BP i część immunoglobuliny jest opisane, na przykład, w WO 99/09063 (przykład 11). Białka sprzężone mogą być monomeryczne lub multimeryczne, hetero- lub homomultimeryczne.

PL 227 130 B1

Interferony znane są głównie z tego, że wywierają wpływ hamujący na replikację wirusów i namnażanie się komórek. I tak, na przykład, interferon β odgrywa ważną rolę w stymulowaniu odpowiedzi odpornościowych i zapalnych. Mówi się, że interferon p (IFN-β, interferon typu I) odgrywa rolę czynnika przeciwzapalnego.

Tak więc, wytwarzany lek przeznaczony do leczenia zaburzeń związanych z nadwrażliwością typu IV zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, może zawierać kombinację inhibitora IL-18 i interferonu.

Interferony można także skoniugować ze sobą, z otrzymaniem polimerów, w celu polepszenia trwałości białek. Produkt koniugacji interferonu β z poliolem, glikolem polietylenowym (PEG), opisano, na przykład, w dokumencie patentowym WO 99/55377.

Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazku, intereferonem jest interferon β (IFN-β), korzystniej IFN-β 1a.

Korzystnie, inhibitor wytwarzania i/lub działania IL-18 stosuje się z interferonem równocześnie, następczo lub osobno.

Zgodnie z jeszcze innym wykonaniem wynalazku, inhibitor IL-18 stosuje się w kombinacji z antagonistą TNF. Antagoniści TNF wywierają swoje działanie w rozmaity sposób. Po pierwsze, antagoniści mogą wiązać się, lub maskować samą cząsteczkę TNF z powinowactwem i specyficznością dostatecznymi do częściowego lub zasadniczego zneutralizowania epitopu, lub epitopów, TNF odpowiedzialnych za wiązanie się z receptorem TNF (w niniejszym opisie określani są oni jako „antagoniści maskujący”). Takim antagonistą maskującym może być, na przykład, przeciwciało skierowane przeciw TNF.

Alternatywnie, antagoniści TNF mogą hamować szlak sygnałowy TNF aktywowany przez receptor powierzchniowy komórki po związaniu TNF (w niniejszym opisie określani są oni jako „antagoniści sygnałowi”). Obie grupy antagonistów, zastosowane osobno lub łącznie, w kombinacji z inhibitorem IL-18, są użyteczne w leczeniu zaburzeń związanych z nadwrażliwością.

Antagonistów TNF można łatwo zidentyfikować i ocenić metodą rutynowego skriningu kandydatów pod względem ich wpływu in vitro na aktywność natywnego TNF lub linii wrażliwych komórek, na przykład ludzkich komórek B, w przypadku których TNF powoduje namnażanie się ich i wydzielanie immunoglobuliny. W teście takim stosuje się preparat TNF z różnymi rozcieńczeniami kandydującego antagonisty, na przykład od 0,1 do 100 x ilość moli TNF użytego w teście, oraz kontrole bez TNF lub tylko z antagonistą (Tucci i in., 1992).

Korzystnymi antagonistami TNF stosowanymi zgodnie z niniejszym wynalazkiem, są antagoniści maskujący. Spośród antagonistów maskujących korzystne są te polipeptydy, które wiążą się z TNF z wysokim powinowactwem i wykazują niewielką immunogenność. Szczególnie korzystne są cząsteczki rozpuszczalnego receptora TNF oraz neutralizujące przeciwciała przeciw TNF. I tak, na przykład, w niniejszym wynalazku przydatne są rozpuszczalne TNF-RI i TNF-RII. Najbardziej korzystnymi antagonistami według niniejszego wynalazku są skrócone formy tych receptorów, obejmujące domeny pozakomórkowe receptorów lub ich funkcjonalne fragmenty. Skrócone rozpuszczalne receptory TNF typu I i typu II opisane są, na przykład, w dokumencie patentowym EP 914431.

Skrócone formy receptorów TNF są rozpuszczalne i wykryto je w moczu i surowicy jako inhibitorowe względem TNF białka wiążące o 30 kDa i 40 kDa. Nazwane zostały, odpowiednio, TBPI i TBPII (Engelmann i in., 1990). Zgodnie z wynalazkiem, korzystne jest stosowanie inhibitora IL-18 i antagonisty TNF i/lub interferonu równoczesne, następcze lub osobne.

Zgodnie z wynalazkiem, jako antagonistów TNF w kombinacji z inhibitorem IL-18 korzystnie stosuje się TBPI i TBPII. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem można także używać pochodnych, fragmentów, regionów i biologicznie aktywnych segmentów cząsteczek receptora, podobnych pod względem czynnościowym do cząsteczek receptora. Taki biologicznie aktywny równoważnik lub pochodna cząsteczki receptora stanowi część polipeptydu lub sekwencji kodującej cząsteczkę receptora, i ma wystarczającą wielkość i zdolność do wiązania TNF z takim powinowactwem, aby zahamować lub zablokować interakcję ze związanym z błoną receptorem TNF. Zgodnie z dalszym korzystnym wykonaniem wynalazku, jako antagonistę TNF stosuje się ludzki rozpuszczalny TNF-RI (TBPI). Cząsteczki naturalnego i rekombinacyjnego rozpuszczalnego receptora TNF, a także sposoby ich wytwarzania, opisano w EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900. Inhibitor IL-18 i inhibitor TNF można stosować równocześnie, następczo lub osobno.

Zgodnie z dalszym korzystnym wykonaniem wynalazku, lek zawiera jeszcze środek przeciwzapalny, taki jak NSAID (niesterydowy lek przeciwzapalny). W korzystnym sposobie wykonaniu wynalazku,

PL 227 130 B1 w kombinacji z inhibitorem IL-18 stosuje się inhibitor COX, najkorzystniej inhibitor COX-2. Specyficzne inhibitory COX-2 ujawniono, na przykład, w WO 01/00229. Reakcje nadwrażliwości najczęściej leczy się lekami przeciwalergicznymi, takimi jak leki przeciwhistaminowe, Cromolyn®, glukokortykoidy lub leki sympatykomimetyczne.

Zgodnie z dalszym korzystnym sposobem wykonania niniejszego wynalazku, inhibitora IL-18 używa się w ilości mieszczącej się w zakresie od około 0,0001 do 1000 mg/kg masy ciała, albo w zakresie od około 0,001 do 100 mg/kg masy ciała, albo z zakresie od około 0,01 do 10 mg/kg masy ciała, albo w zakresie od około 0,1 do 5 mg/kg masy ciała, albo w zakresie od około 1 do 3 mg/kg masy ciała.

Korzystnie, inhibitor IL-18 według wynalazku stosuje się miejscowo (jako topicum). I tak, na przykład , w przypadku kontaktowego zapalenia skóry, inhibitor IL-18 można nanosić bezpośrednio na zaatakowaną powierzchnię skóry.

Zgodnie z innym wykonaniem wynalazku, inhibitor IL-18 stosuje się układowo, korzystnie podskórnie lub domięśniowo.

Inhibitor IL-18 można tez wykorzystać w terapii genowej dostarczając pacjentowi wektor ekspresyjny zawierający sekwencję kodującą inhibitor IL-18. W celu leczenia i/lub zapobiegania zaburzeniu związanemu z nadwrażliwością, wektor terapii genowej zawierający sekwencję kodującą inhibitor IL-18 można wstrzyknąć, na przykład, bezpośrednio do chorej tkanki, unikając w ten sposób problemów związanych z układowym podawaniem wektorów terapii genowej, takich jak rozcieńczanie wektorów, docieranie do docelowych komórek lub tkanek i nakierowywanie na nie, oraz działań ubocznych. Taki wektor może też służyć do indukowania i/lub wzmagania endogennej produkcji inhibitora IL-18 w komórce normalnie „cichej” pod względem ekspresji inhibitora IL-18, albo w której ekspresja inhibitora dostarcza niewystarczające jego ilości. Wektor może zawierać sekwencje regulatorowe funkcjonujące w komórkach, w których pożądana jest ekspresja inhibitora IL-18. Takie sekwencje regulatorowe mogą być, na przykład, promotorami lub enhancerami. Sekwencję regulatorową można następnie wprowadzić w prawidłowy locus genomu na drodze rekombinacji homologicznej, operatywnie wiążąc sekwencję regulatorowa z genem, którego ekspresja ma być indukowana lub wzmożona. Technologia ta zazwyczaj określana jest jako endogenna aktywacja genu (EGA) i jest opisana, na przykład, w WO 91/09955.

Lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku może mieć postać kompozycji farmaceutycznej, użytecznej pod względem zapobiegania i/lub leczenia zaburzeń związanych z nadwrażliwością typu IV, zawierającej użyty w ilości terapeutycznie skutecznej inhibitor IL-18 i/lub użyty w ilości terapeutycznie skutecznej interferon i/lub użyty w ilości farmaceutycznie skutecznej inhibitor TNF i/lub użyty w ilości farmaceutycznie skutecznej środek przeciwzapalny i/lub użyty w ilości farmaceutycznie skutecznej środek przeciwalergiczny, w szczególności lek przeciwhistaminowy oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny” obejmuje swym zakresem dowolny nośnik, który nie przeszkadza efektywności aktywności biologicznej składnika aktywnego i który nie jest toksyczny dla biorcy, któremu został podany. I tak, na przykład, w przypadku stosowania pozajelitowego, aktywne białko (białka) można sformułować w dawkę jednostkową, przeznaczoną do wstrzyknięcia, w zarobkach takich jak wodny roztwór chlorku sodu, roztwór glukozy, albumina surowicy i płyn Ringera.

Składniki aktywne kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można podawać danemu osobnikowi rozmaitymi sposobami. Do dróg podawania należy podawanie doskórne, przezskórne (na przykład w postaci preparatów do spowolnionego uwalniania), domięśniowe, dootrzewnowe, dożylne, podskórne, doustne, śródczaszkowe, nadoponowe, miejscowe, doodbytnicze i donosowe. Można wykorzystać jakąkolwiek inną, terapeutycznie skuteczną drogę podawania, taką jak, na przykład, wchłanianie poprzez tkankę nabłonkową lub śródbłonkową, albo sposób terapii genowej, w przypadku której choremu podaje się (na przykład poprzez wektor) cząsteczkę DNA kodującego składnik aktywny, doprowadzającą do ekspresji i wydzielenia składnika aktywnego in vivo. Oprócz tego, białko, którego zastosowanie jest przedmiotem wynalazku można stosować łącznie z innymi składnikami, takimi jak farmaceutycznie dozwolone substancje powierzchniowo czynne, zaróbki, nośniki, rozcieńczalniki i podłoża.

W przeznaczeniu do stosowania pozajelitowego (na przykład dożylnego, podskórnego, domięśniowego), białko aktywne można sformułować jako roztwór, zawiesinę, emulsję lub zliofilizowany proszek łącznie z farmaceutycznie dozwolonym pozajelitowym podłożem (takim jak, na przykład, woda, wodny roztwór chlorku sodu, roztwór glukozy) i dodatkami utrzymującymi izotoniczność (takimi jak,

PL 227 130 B1 na przykład mannitol) lub trwałość chemiczną (na przykład konserwanty i bufory). Preparat wyjaławia się powszechnie znanymi sposobami.

Dostępność biologiczną białka według wynalazku można polepszyć przez zastosowanie koniugacji prowadzącej do przedłużenia okresu półtrwania cząsteczki w organizmie ludzkim za pomocą związania cząsteczki z glikolem polietylenowym, jak to opisano w zgłoszeniu patentowym PCT WO 92/13095.

Terapeutycznie skuteczne dawki białka aktywnego będą stanowić funkcję wielu zmiennych, włączając w to typ antagonisty, powinowactwo antagonisty do IL-18, jakąkolwiek resztkową aktywność cytotoksyczną wykazywaną przez antagonistę, stan kliniczny pacjenta (włącznie z celowością utrzymywaniem nietoksycznego poziomu endogennej aktywności IL-18).

„Ilość terapeutycznie skuteczna” jest to ta ilość inhibitora IL-18, która po podaniu go doprowadza do zahamowania biologicznej aktywności IL-18. Zastosowane u danego osobnika dawkowanie, polegające na podawaniu dawek pojedynczych lub wielokrotnych, będzie zmienne, w zależności od szeregu różnych czynników, włączając w to farmakokinetyczne właściwości inhibitora IL-18, drogę podawania, stan chorego i jego charakterystykę (płeć, wiek, masa ciała, zdrowie, rozmiary), zasięg objawów, leczenie prowadzone równolegle, częstotliwość leczenia i pożądany jego skutek. Ustawienie i manipulacja przyjętymi zakresami dawkowania leżą w zakresie możliwości specjalistów, tak jak i in vitro i in vivo metody oznaczania stopnia zahamowania IL-18 u danego osobnika.

Zgodnie z wynalazkiem, inhibitor IL-18 stosuje się w ilości mieszczącej się w zakresie od około 0,001 do 100 mg/kg masy ciała, albo w zakresie od około 0,01 do 10 mg/kg masy ciała, albo w zakresie od około 0,1 do 5 mg/kg masy ciała, albo w zakresie od około 1 do 3 mg/kg masy ciała, albo w ilości około 2 mg/kg masy ciała.

Korzystnym sposobem stosowania leku wytworzonego zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku jest podawanie go drogą podskórną. Innym korzystnym sposobem jest podawanie drogą domięśniową. Korzystne jest także stosowanie miejscowe, w celu naniesienia inhibitora IL-18 bezpośrednio na miejsce jego działania.

Zgodnie z dalszym korzystnym wykonaniem wynalazku, inhibitor IL-18 podawany jest codziennie lub co drugi dzień.

Dla uzyskania pożądanych wyników leczenia, dawki dzienne zazwyczaj podawane są w postaci dawek podzielonych lub jako postacie o spowolnionym uwalnianiu. W drugim lub następnym podaniu można stosować dawki takie same jak początkowe, albo mniejsze lub większe od pierwszej lub poprzedniej przyjętej przez danego osobnika. Drugie lub następne podanie można zastosować podczas trwania choroby lub zanim się ona rozpoczęła.

Inhibitor IL-18 można u danego osobnika stosować zapobiegawczo lub leczniczo przed, jednocześnie lub następczo, z innymi trybami leczenia lub stosowanymi środkami leczniczymi (takimi jak wielokrotne reżimy lekowe), w ilości terapeutycznie skutecznej, w szczególności z interferonem i/lub inhibitorem TNF i/lub innym środkiem przeciwzapalnym, takim jak inhibitor COX, i/lub środkiem przeciwalergicznym. Środki aktywne stosowane jednocześnie z innymi środkami leczniczymi można podawać w tej samej kompozycji lub w innych kompozycjach.

Wszystkie cytowane w niniejszym opisie odnośniki, włącznie z publikacjami w czasopismach lub abstraktami, opublikowanymi lub nie opublikowanymi w U.S.A., lub patentami zagranicznymi, albo jakimikolwiek innymi odnośnikami, są w całości włączone do niniejszego opisu jako odnośniki, włącznie ze wszystkimi danymi, tabelami, figurami i tekstem podanym w przytoczonych odnośnikach. Oprócz tego, do niniejszego opisu włączona jest w całości jako odnośnik pełna treść odnośników cytowanych w odnośnikach przytoczonych w niniejszym opisie.

Odniesienia się do znanych etapów sposobu postępowania, typowych etapów sposobu postępowania, metod znanych lub metod typowych nie jest w żaden sposób uznaniem, że jakakolwiek cecha znamienna, opis lub sposób wykonania niniejszego wynalazku jest ujawniona, przedstawiona lub zasugerowana w odnoszącej się do niego dziedzinie techniki.

Podany powyżej opis konkretnych wykonań wynalazku w tak pełny sposób odsłania ogólny charakter wynalazku, że inne osoby mogą, przez wykorzystanie wiedzy specjalisty w tej dziedzinie techniki (włącznie z treścią przytoczonych w niniejszym opisie odnośników) łatwo modyfikować i/lub adaptować do rozmaitych zastosowań te konkretne wykonania wynalazku z pominięciem zbytecznego eksperymentowania, bez odchodzenia od ogólnego pomysłu niniejszego wynalazku. Stosowana tu frazeologia lub terminologia służą opisowi a nie ograniczaniu, tak, że terminologię lub frazeologię

PL 227 130 B1 w niniejszym opisie specjalista w tej dziedzinie techniki powinien interpretować w świetle wskazówek i informacji przedstawionych w niniejszym opisie, w połączeniu z wiedzą przeciętego specjalisty w tej dziedzinie techniki.

P r z y k ł a d 1

Traktowanie IL-18BP redukuje nadwrażliwość kontaktową

Metody.

We wszystkich poniższych przykładach użyto mysich modeli eksperymentalnie wywołanej nadwrażliwości kontaktowej (CHS). Rozmiary CHS mierzono przez obrzmienie uszu zaistniałe w odpowiedzi na miejscowo zastosowany środek uczulający.

Test obrzmienia uszu myszy, zastosowany do generowania danych przedstawionych na fig. 1-3 (patrz niżej) został już szczegółowo opisany (Garrigue i in., 1994). Mówiąc krótko, myszy uczulono miejscowo za pomocą naniesienia 25 pl 0,5% roztworu 2,4-dinitrofluorobenzenu (DNFB; Sigma Chemical Co.) w mieszaninie acetonu i oliwy (4 : 1) na ogolony brzuch (dzień 0). Po upływie 5 dni, na prawe uszy naniesiono po 20 pl 0,2 DNFB w tym samym nośniku, a na lewe sam tylko nośnik.

Myszy, albo otrzymywały dootrzewnowo (i.p.) codziennie, od dnia 5 do dnia 8, albo 250 pg/ /mysz/dzień rhIL-18BP (rekombinacyjne ludzkie IL-18BP), albo wodny roztwór chlorku sodu w grupie kontrolnej (fig. 1A), albo otrzymywały, w dniach 0-2, IL-18BP (fig. 1B).

Grubość ucha mierzono grubościomierzem czujnikowym Mitutoyo Corp., Kawasaki, Japan) a obrzmienie ucha ustalano przez odjęcie wartości sprzed prowokacji od wartości po prowokacji, i następnie odjęcie jakiegokolwiek obrzmienia poddanego prowokacji przy użyciu nośnika ucha po stronie przeciwnej.

Obrzmienia uszu mierzono w dniach 0, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 16.

Innego modelu użyto do generowania danych przedstawionych na fig. fig. 4-6 (patrz przykłady poniżej). Białko wiążące IL-18 zastosowano do zneutralizowania IL-18 w eksperymentalnie wywołanej nadwrażliwości kontaktowej (CHS) na 2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB). Schemat eksperymentu przedstawiał się następująco:

1. Dzień 1: uczulenie.

pl DNFB [0,5% w mieszaninie acetonu i oliwy (4 : 1)] na ogolony grzbiet.

2. Dzień 5: prowokacja.

pl DNFB (0,2%) na obie, zewnętrzną i wewnętrzną stronę prawego ucha.

pl podłożem na obie, zewnętrzną i wewnętrzną stronę lewego ucha.

3. Dzień 6 i następne: odczyt.

Monitorowanie grubości ucha jako miary odczynu zapalnego.

Wyrażenie punktacji jako zwiększenie obrzmienia (pm) ucha poddanego prowokacji vs. ucho kontrolne.

4. Dzień 6 lub 7: preparowanie uszu do analizy.

W modelu tym, piki obrzmienia między dniem 6 a 7. IL-18 zneutralizowano za pomocą codziennych wstrzyknięć 250 pg IL-18BP (w wodnym roztworze chlorku sodu)/zwierzę, albo podczas uczulania w dniu 0, dniu 1 i dniu 2, albo podczas prowokacji w dniu 4, dniu 5 i dniu 6.

Wyniki.

Odpowiedzi w postaci nadwrażliwości kontaktowej (CHS) są to swoiste wobec haptenu odczyny zapalne skóry, w których pośredniczą komórki T. Większość haptenów wywołuje odpowiedź oligoklonalnych komórek T, złożonych głównie z efektorowych limfocytów T CD8⁺, podczas gdy limfocyty T CD4⁺ grają supresyjną rolę w odpowiedzi CHS (H. Bour i in., 1995; Grabbe i in., 1998). W celu zbadania roli IL-18 w CHS, myszy uczulono naskórnie przy użyciu DNFB, następnie sprowokowano po upływie 5 dni przez naniesienie haptenu na skórę ucha. Wraz z prowokacją haptenową, myszom wstrzyknięto i.p. albo 250 pg/mysz/dzień rhIL-18BP, albo wodny roztwór chlorku sodu. IL-18BP, lub wodny roztwór chlorku sodu jako kontrolę, podawano codziennie w ciągu 3 dni, od dnia 5 do dnia 8 od pierwszego uczulenia DNFB (dzień 0). Prowokacja DNFB w dniu 5 wywoływała wyraźne obrzmienie ucha w obu grupach (fig. 1A). Rozmiary obrzmienia u myszy potraktowanych wodnym roztworem chlorku sodu (trójkąty) były znacznie wyraźniej zaznaczone niż u myszy potraktowanych IL-18BP (kwadraty) i powróciły do prawie normalnego stanu już w dniu 9.

Zmiana obrzmienia uszu zaobserwowana w przypadku leczenia IL-18BP w dniach 0-2 nie była statystycznie znacząca (fig. 1B). Wydaje się, że rytm czasowy stosowania IL-18BP jest czynnikiem ważnym pod względem uzyskiwania dobroczynnego skutku leczenia z użyciem IL-18BP.

PL 227 130 B1

Wnioski.

W tym ustalonym mysim modelu nadwrażliwości kontaktowej/kontaktowego zapalenia skóry, trzydniowe leczenie przy użyciu inhibitora IL-18 wywiera znaczący dobroczynny wpływ na rozmiary obrzmienia/zapalenia wywołanego zastosowaniem haptenu.

P r z y k ł a d 2

Traktowanie IL-18BP redukuje nadwrażliwość kontaktową po drugiej prowokacji

Metody.

Myszy C57BL/6 uczulono za pomocą naskórnego naniesienia 25 pl 0,5% roztworu DNFB na ogolony brzuch (dzień 0). Myszy po raz pierwszy prowokowano przy użyciu 20 pl 0,2% DNFB, na uszy, w dniu 5. W dniu 19, myszy prowokowano po raz drugi DNFB. Obrzmienie uszu mierzono w dniach 0 (uczulenie haptenem), 5 (pierwsza prowokacja haptenem), 6, 7, 8, 9, 12, 14, 16, 19 (druga prowokacja haptenem), 21, 22, 23, 26, 28 i 30. Wartości średnie z SD dla każdej grupy przedstawiono na fig. 2. Myszom podawano i.p. codziennie albo 250 pg/mysz/dzień IL-18BP (n = 5; fig. 2, białe kwadraty), albo wodny roztwór chlorku sodu (n = 5; fig. 2, czarne kwadraty od dnia 19 do dnia 23).

Wyniki.

Jak to pokazano na fig. 2, leczenie przy użyciu IL-18BP znacząco redukowało obrzmienie uszu, w szczególności po drugiej prowokacji haptenem. Stąd też, traktowanie IL-18BP w sposób szczególny nadaje się do leczenia zaburzeń z reakcjami nadwrażliwości, w przypadku których chorzy zazwyczaj powtarzalnie prowokowani są tym samym alergenem i potrzebują leczenia w celu przezwyciężenia reakcji zapalnych wyzwalanych przez czynnik prowokujący.

P r z y k ł a d 3

IL-18BP zabezpiecza przed CHS przez neutralizację IL-18

W celu potwierdzenia, że za zabezpieczenie przed obrzmiewaniem obserwowane w przypadku traktowania IL-18BP odpowiedzialna była neutralizacja IL-18, dokonano porównania ze sobą myszy z niedoborem (KO) IL-19 i myszy typu dzikiego C57BL/6, pod względem ich zdolności do rozwinięcia odpowiedzi CHS. U myszy z niedoborem IL-18 CHS rozwijała się w odpowiedzi na DNFB, aczkolwiek była ona mniej wyraźnie zaznaczona niż u myszy typu dzikiego. Jednakże, nie zaobserwowano żadnego wpływu traktowania IL-18BP u myszy z niedoborem IL-18, jak to uwidoczniono na fig. 3, co wskazuje na fakt, że przeciwzapalne działanie IL-18BP w przypadku CHZ było wynikiem neutralizacji IL-18 (n = 5 myszy w grupie).

P r z y k ł a d 4

IL-18BP nie zmniejsza wycieku naczyniowego

Metody.

Sposobem powyżej opisanym indukowano CHS u myszy C57BK/6. W celu monitorowania obrzęku powodowanego przez reakcję CHS, myszom wstrzyknięto i.v. barwnik Evans Blue na 2 godziny przed prowokacją przy użyciu DNFB. Myszy uśmiercono po upływie 24 godzin i spreparowano uszy w celu wyekstrahowania barwnika wyciekłego z układu naczyniowego i nagromadzonego w otaczającej tkance. Wyciek naczyniowy oceniano jako ilość barwnika/mg suchej tkanki usznej skorygowaną dla stężenia Evans Blue w surowicy i wyrażoną jako stosunek ilości w uchu myszy poddanych prowokacji do ilości w uchu myszy kontrolnych. Aczkolwiek potraktowanie IL-18BPP w dniach 4 i 5 zmniejszało obrzmienie do 56% u myszy kontrolnych potraktowanych podłożem (fig. 4, panel lewy, p < 0,01), nie stwierdzono żadnej wyraźniej różnicy pod względem wycieku naczyniowego między tymi dwiema grupami (fig. 4, panel prawy). Obie grupy wykazywały wyraźnie zwiększone obrzęki, jak to wynika z porównania z nie uczuloną grupą kontrolną (p < 0,05 i p < 0,01). Jako dalsza kontrola służyły myszy potraktowane 250 pg (nieistotnego tu) białka BSA/zwierzę/dzień. U myszy tych rozwinęła się CHS podobna do zwierząt kontrolnych potraktowanych podłożem (n = 10 myszy w grupie).

In vivo test wycieku naczyniowego (Evans Blue)

Zasada: wstrzyknięcie i.v. barwnika Evans Blue i ekstrakcja z tkanki docelowej (ucha).

Dane surowe do oceny:

• krzywa wzorcowa barwnika Evans Blue (OD₆₂₀/ng), • stężenie barwnika Evans Blue we krwi (odpowiednio, OD620/ml lub pg/ml), • masa suchej tkanki uszu (z tej samej i przeciwnej strony, mg), • zawartość barwnika Evans Blue w uszach (z tej samej i przeciwnej strony, odpowiednio OD620/pg lub ng/mg.

PL 227 130 B1

Protokół w połączeniu z CHS indukowaną DNFB:

• w dniu 5 eksperymentalnie indukowanej CHS wstrzyknięcie i.v. 100 μΐ barwnika Evans Blue^a, pozaorbitalnie, na 2 godziny przed poddaniem myszy prowokacji przy użyciu DNFB, • wstrzyknięcie i.p. IL-18BP na 1 godzinę przed prowokacją, • w dniu 6 (24 godziny po prowokacji usznej przy użyciu DNFB) pomiar obrzmienia i uśmiercenie zwierząt, • pobranie próbek krwi i preparatyka jak następuje:

o dodanie 30 μΐ surowicy do 970 μΐ formamidu ( > rozcieńczenie 1/33), o oznaczenie OD przy 620 nm ( > 1 OD₆₂₀ równa się 33 OD₆₂₀/ml), • pobranie uszu z tej samej i z przeciwnej strony i preparatyka jak następuje:

o suszenie w ciągu 24 godzin w temperaturze 80°C, o oznaczenie suchej masy, o posiekanie uszu i ekstrahowanie barwnika przy użyciu 1 ml formamidu, z łagodnym wytrząsaniem w ciągu 24 godzin w temperaturze 55°C, o sączenie w celu usunięcia Derbis^p, napełnienie kuwetek, odstawienie w temperaturze pokojowej (RT) na kilka godzin w celu umożliwienia lipidom wypłynięcia na wierzch.

o oznaczenie OD przy 620 nm.

Wartości do obliczenia:

Wyciek:

zawartość barwnika Evans Blue/masa suchej tkanki (ng/mg)

100 x wyciek eksperymentalny Wyci ek wz gl ę dny : ----wyciek podłożem

Wyniki.

W zasadzie, na zaobserwowane powstawanie w reakcji CHS obrzmienia składają się dwa procesy: wyciekanie płynu z układu naczyniowego do otaczającej tkanki, powodujące powstanie obrzęku, oraz wynaczynienie komórek nacieku zapalnego z naczyń krwionośnych do miejsca uszkodzenia tkanki.

Przy użyciu barwnika Evans Blue jako znacznika wykazano, że pomimo ogólnego zmniejszenia obrzęku, traktowanie IL-18BP nie powoduje zmniejszenia wycieku naczyniowego (fig. 4).

P r z y k ł a d 5

Traktowanie IL-18BP powoduje redukcję wytwarzania IFN-γ po restymulacji przeciwciałem, stwierdzoną w wycieku zapalnym z ucha myszy poddanego prowokacji przy użyciu DNFB

Metody.

Sposobem powyżej opisanym indukowano CHS u myszy C57BL/6. Zwierzęta potraktowano IL-18BP lub nośnikiem w dniach 4-6. Potraktowanie IL-18BP powodowało zmniejszenie obrzmienia do 58% obrzmienia kontroli z nośnikiem, w dniu 7. Myszy uśmiercono w dniu 7, pobrano uszy poddane prowokacji, zgrupowano je (n = 8) i poddano trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek. Komórki scharakteryzowano następnie metodą analizy FACS, z bramkowaniem na żywe komórki CD45-pozytywne. Liczbę komórek Ταβ, komórek NK, krwinek białych obojętnochłonnych i monocytów/makrofagów znalezionych w preparatach z uszu wyrażono jako procent całkowitej ilości komórek poddanych analizie. Obliczono także zmniejszenie liczby komórek tych typów po potraktowaniu IL-18BP w stosunku do kontroli otrzymujących nośnikiem.

W celu zmierzenia produkcji IFN-γ, komórki otrzymane po prowokacji przy użyciu DNFB poddano ponownej stymulacji, używając ich w ilości 2 x 10⁵/studzienkę na płytce ze związanym przeciwciałem anty-CD3. W następującym po tym 24-godzinnym okresie nie dodawano już żadnej ilości IL-18BP. Wytwarzanie IFN-γ zmierzono w trzech powtórzeniach z wykorzystaniem metody ELISA.

^a 7,5 mg/ml barwnika Evans Blue (Σ 2129) w fizjologicznym roztworze NaCl, 100 μ!, i.v.). ^β Preparat próbki sączony przez Whatman 5 μιτι PTFE mesh, # 6984.0350.

PL 227 130 B1

Preparaty komórkowe sporządzone z uszu po prowokacji przy użyciu DNFB stymulowano z zastosowaniem 50 ng/ml PMA* i 500 ng/ml lonomycyny, w ciągu 4 godzin. W ostatnich 2 godzinach inkubacji wydzielanie cytokiny było zablokowane przez dodanie 2 ng/ml brefeldyny A. Następnie, komórki poddano wielokolorowemu barwieniu immunofluorescencyjnemu w celu wykrycia wewnątrzkomórkowego IFN-γ i antygenów powierzchniowych. IFN-γ był wytwarzany przez komórki T CD8 i w mniejszym stopniu przez komórki T CD4. W przypadku komórek NK i komórek Ταβ nie wykryto żadnej obecności IFN-γ.

* : tetradekanoilooctan forbolu.

Otrzymanie zawiesiny pojedynczych komórek.

Enzymatyczne trawienie mysich uszu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek oparto na protokołach podanych przez G. Schulera i R.M. Steinmana (1985) oraz Stingla i in. (1983).

1. pocięcie uszu, zebranie po 5 uszu/preparat,

2. przepłukanie 70% etanolem,

3. rozszczepienie uszu przy użyciu nożyczek, ₁

4. umieszczenie stroną skórną do dołu w 7,5 ml HBSS w temperaturze 37°C, ₂

5. dodanie 5 ml 2,5% Trypsin (10x), do końcowego stężenia 1%,

6. inkubowanie w ciągu 35 minut w temperaturze 37°C,

7. przeniesienie połówek uszu stroną skórną do dołu na sitko nylonowe (filtr komórkowy) umieszczone w 10 ml HBSS/80% FCS na lodzie i łagodne wychwytywanie na sicie komórek z usunięciem ich z matrycy pozakomórkowej,

8. usunięcie sit z dużym debris,

9. przemycie 2 x zimnym HBSS/10% FCS,

10. policzenie komórek.

Analiza FACS.

₃

1. zawieszenie komórek w buforze do barwienia FACS , wszystkie następne etapy przeprowadzane na lodzie,

2. użycie 10⁶ komórek/barwienie,

3. dodanie 1 μg FC-Block, 10 minut,

4. dodanie przeciwciała anty-CD45 w kombinacji z przeciwciałami skierowanym przeciw markerom będącym przedmiotem zainteresowania, po 1 μg każdego, 30 minut.

5. dwukrotne przemycie,

6. zebranie 0,5 x 10⁶ ogółu zdarzeń przez FACS,

7. analiza specyficznych markerów po bramkowaniu na CD45⁺, żywe komórki.

Wyniki

W celu zbadania nacieku zapalnego w miejscu prowokacji, zawiesiny pojedynczych komórek sporządzonych z uszu nie zetkniętych z czynnikiem prowokującym i uszu po prowokacji, poddano analizie metodą FACS, z obramkowaniem na żywe komórki CD⁺ (fig. 5). Wykazano, że komórki CD45+ obecne w uchu nie zetkniętym z czynnikiem prowokującym są to głównie komórki Τ γδ oraz komórki dendrytowe skóry. Naciek zapalny po upływie 24 godzin od prowokacji złożony był z komórek T CD8 i CD4, krwinek białych obojętnochłonnych, monocytów i komórek NK, powiększających około dwukrotnie ogólną liczbę komórek CD45⁺ w uchu. Odpowiednio do zmniejszania obrzmienia, traktowanie IL-18BP redukowało ogólną liczbę leukocytów naciekających miejsce prowokacji. Dotyczyło to wszystkich, różnych typów komórek nacieku zapalnego. W zależności od typu komórek, zmniejszenie to wahało się w zakresie od 20% do 40%. Dalsze charakteryzowanie jakości nacieku otrzymywanego z uszu myszy potraktowanych IL-18BP potwierdziło upośledzenie wytwarzania IFN-γ po restymulacji anty-CD3 (fig. 6). Analiza FACS wykazała, że IFN-γ produkowany był głównie przez komórki T CD8, a w mniejszym zakresie przez komórki T CD4. Interesujące jest to, że komórki NK i komórki Τγδ nie przyczyniają się do wytwarzania IFN-γ (fig. 7).

¹ Płyn Hanksa, zrównoważony roztwór dobranych soli bez Ca^{1 2 3}+ i Mg²+ (GIBCO # 14170.070).

² 2,5% trypsyna/EDTA (10x) (Gibco # 35400-027).

³ 1% albumina surowicy bydlęcej w wodnym roztworze chlorku sodu buforowanym fosforanami.

PL 227 130 B1

P r z y k ł a d 6

IL-18MP nie upośledza rekrutacji komórek Langerhansa

Metoda.

Myszom naniesiono pędzlem hapten FITC (50 μl roztworu 4 mg/ml) lub podłożem [aceton/dibutyloftalan (1 : 1)] odpowiednio, na prawy i lewy bok. Po upływie 24 godzin od pędzlowania pobrano pachwinowe węzły chłonne. Komórki Langerhansa skoniugowane z haptenem można było wykryć metodą FACS jako komórki FITC⁺, CD11c⁺ w węźle chłonnym drenującym bok popędzlowany FITC, ale nie w przeciwstronnym węźle chłonnym drenującym bok popędzlowany jedynie podłożem, (n = 5 węzłów chłonnych drenujących/grupę).

Wyniki.

Migracja komórek Langerhansa (LC) niosących antygen do drenującego węzła chłonnego zależna jest od prozapalnych cytokin IL-1 β i TNF-α i kontrolowana przez kaspazę-1 (Antonopoulos i in., 2001; Kimber i in., 1992). Zgodnie z tym założono, że IL-18 przyczynia się do migracji LC (Cumberbatch i in., 2001). Dlatego też, potraktowanie IL-18BP może upośledzać rekrutację LC, a przez to redukować odpowiedź odpornościową na DNFB w fazie prowokacji. Aby sprawdzić słuszność tej hipotezy, myszom naniesiono pędzlem hapten FITC lub podłożem, odpowiednio, na prawy i lewy bok. Po upływie 24 godzin od pędzlowania pobrano drenujące skórę pachwinowe węzły chłonne i oceniono liczbę komórek FITC⁺/węzeł chłonny. Potraktowanie zwierząt IL-18BP na 24 godziny i na 1 godzinę przed pędzlowaniem nie powodowało zmiany liczby LC z haptenem obecnych w drenującym węźle chłonnym po upływie 24 godzin od pędzlowania (fig. 8). Stąd też, w modelu tym nie stwierdza się większego udziału IL-18 w migracji LC.

P r z y k ł a d 7

IL-18BP redukuje rozmiary nadwrażliwości typu późnego w innym mysim modelu DHT.

Metody.

Nadwrażliwość typu późnego.

Myszy uczula się za pomocą dożylnego wstrzyknięcia 10⁶ limfocytów śledzionowych BALB/c i w dniu 5 poddaje prowokacji, przez wprowadzenie 13 x 10⁶ limfocytów śledzionowych (50 μl PBS) do poduszeczek prawych łap. Kontrolne poduszeczki lewych łap otrzymują 50 μl PBS. Obrzmienie poduszeczek łap prawych oblicza się po kilku dniach przez odjęcie wartości sprzed prowokacji i jakiegokolwiek obrzmienia zmierzonego w poduszeczkach łap lewych od wartości po prowokacji.

W celu przeprowadzenia eksperymentów transferowych, z zawiesin komórek z węzłów chłonnych zwierząt uczulonych przy użyciu limfocytów śledzionowych BALB/c i zwierząt kontrolnych usuwa się komórki B220⁺ i komórki CD⁺ za pomocą inkubacji ze szczurzymi przeciwmysimi B220-FITC i CD9-FITC, z następującym potem rozdzieleniem na kolumnach MACS z paramagnetycznymi mikrokulkami anty-FITC (Miltenyi Biotech, Auburn, California, USA). Wyeluowane, wzbogacone w komórki T CD4⁺ preparaty wstrzykuje się w żyłę ogonową myszy-biorców (2 x 10⁷ komórek/mysz). Po upływie 16 godzin, myszy poddaje się prowokacji przez wstrzyknięcie, do poduszeczek prawych łap, 13 x 10⁶ limfocytów śledzionowych BALB/c (bez krwinek czerwonych), z monitorowaniem obrzmienia w ciągu następnych dni.

Wynik.

Nadwrażliwość typu późnego (DHT) wywoływana jest przez komórki T CD4⁺, z widocznymi skutkami regulacji supresyjnej jeśli chodzi o komórki CD8⁺ (Grabbe i in., 1998). Behawior komórek T CD4⁺ od myszy potraktowanych IL-18BP przebadano w modelu DTH. Zwierzęta C57BL/6 są uczulone przez dożylne wstrzyknięcie i.v. 10⁶ alogenicznych limfocytów śledzionowych BALB/c. Po upływie 5 dni, do poduszeczek prawych łap wstrzykuje się 13 x 10⁶ limfocytów śledzionowych BALB/c, albo razem z 10 mg/kg rekombinacyjnego ludzkiego IL-18BP (i.p.), albo razem z podłożem. Miejscowy odczyn zapalny oznacza się przez zmierzenie obrzmienia poduszeczki łapy po upływie 24 godzin.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania zaburzeniu związanemu z nadwrażliwością typu IV, wybraną spośród nadwrażliwości typu późnego i nadwrażliwości kontaktowej, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany spośród białka wiążącego IL-18 (IL-18BP), fuzji IL-18BP z immunoglobuliną i funkcjonalnej pochodnej IL-18BP, która obejmuje co najmniej jedno ugrupowanie, którym jest ugrupowanie glikolu polietylenowego (PEG), przyłączone do jednej lub większej ilości grup funkcyjnych, występujących jako jeden lub więcej łańcuchów bocznych w resztach aminokwasowych.
2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wytwarzany lek zawiera jeszcze interferon przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że interferonem jest interferon β.
4. 4. Zastosowanie według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienne tym, że lek zawiera jeszcze inhibitor czynnika martwicy nowotworów (TNF) przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że inhibitorem TNF jest TBP I i/lub TBP II.
6. 6. Zastosowanie według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienne tym, że lek zawiera jeszcze środek przeciwzapalny, przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego.
7. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że środkiem przeciwzapalnym jest inhibitor COX.
8. 8. Zastosowanie według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienne tym, że lek zawiera jeszcze środek przeciwalergiczny przeznaczony do stosowania równoczesnego, następczego lub osobnego.
9. 9. Zastosowanie według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienne tym, że inhibitor IL-18 stosuje się w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,001 do 1000 mg/kg masy ciała, albo od 0,01 do 100 mg/kg masy ciała, albo od 0,1 do 10 mg/kg masy ciała, albo w ilości 5 mg/kg masy ciała.
10. 10. Zastosowanie według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, znamienne tym, że inhibitor IL-18 stosuje się podskórnie
11. 11. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienne tym, że inhibitor IL-18 stosuje się domięśniowo.
12. 12. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 1-9, znamienne tym, że inhibitor IL-18 stosuje się miejscowo.