PL186568B1

PL186568B1 - Homogenne i rekombinowane, biologicznie czynne białka otyłości oraz ich fragmenty, białko fuzyjne, wektor ekspresyjny, sekwencje DNA, organizm gospodarza E. coli, sposób wytwarzania biologicznie czynnego, rekombinowanego ludzkiego białka otyłości i kompozycje farmaceutyczne

Info

Publication number: PL186568B1
Application number: PL96314051A
Authority: PL
Inventors: Arthur Campfield; Rene Devos; Yves Guisez; Pascal S. Bailon
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 2004-01-30
Also published as: HUP9601120A2; BG100558A; SG49337A1; KR960041194A; TW464655B; HU220093B; JPH093098A; HUP9601120A3; TNSN96066A1; HU9601120D0; HRP960213A2; IS4343A; AR003087A1; CN1157290A; UY24219A1; MA23856A1; DE741187T1; AU5197896A; YU26596A; BR9602166A

Abstract

1. Homogenne, biologicznie czynne ludzkie bialko otylosci obejmujace sekwencje ami- nokwasowa o Id. Sekw. nr 6 lub jego fragment, który wykazuje biologiczna aktywnosc tego bialka. PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są homogenne i rekombinowane, biologicznie czynne białka otyłości oraz ich fragmenty, białko fuzyjne, wektor ekspresyjny, sekwencje DNA, organizm gospodarza E. coli, sposób wytwarzania biologicznie czynnego, rekombinowanego ludzkiego białka otyłości i kompozycje farmaceutyczne.

Otyłość, jak się opisuje, jest najczęstszą chorobą żywieniową w społeczeństwach zachodnich (Zhang, Y., i in., Naturę 372, 425-432 (1994)). Więcej niż trzech na dziesięciu dorosłych Amerykanów waży co najmniej 20% ponad swą masę należną (Zhang, Y. i in., powyżej). Zwiększony ciężar ciała stanowi problem zdrowotny ponieważ jest związany z poważnymi chorobami, jak cukrzyca typu II (tzn. cukrzyca insulinoniezależna), nadciśnienie i hiperlipidemia (Grundy, S.M. i Barnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990)). Istnieją dowody, że masa ciała jest regulowana fizjologicznie zaś otyłość (oraz związane z nią stany czy choroby) spowodowana jest częściowo zaburzeniami tej regulacji (Zhang, Y. i in., powyżej).

U gryzoni opisano siedem mutacji pojedynczych genów powodujących fenotyp otyłości, z których pięć występuje u myszy. Spośród tych siedmiu modeli zwierzęcych najintensywniej badana jest mutacja genu obese (ob) u myszy, znaleziona w roku 1950 (Ingalls, A.M. i in., J. Hered. 41, 317-318 (1950)). Myszy homozygotyczne pod względem tej mutacji przejawiają znaczną otyłość, rozwijają cukrzycę typu II, wykazują hiperfagię i hipometabolizm, jako część zespołu przypominającego chorobliwą otyłość u ludzi (Friedman J.M. i in., Genomics 11, 1054-1062 (1991)). Gen ob znajduje się na ramieniu krótszym chromosomu 6 i koduje białko (tzn. białko ob) ulegające ekspresji w tkance tłuszczowej (Zhang, Y. i in., powyżej). Myszy homozygotyczne wytwarzają niewiele białka ob lub nie wytwarzają go wcale i w konsekwencji wykazują zaburzoną regulację masy ciała prowadzącą do otyłości.

Mysie lub ludzkie białka ob mogą być podawane pacjentom cierpiącym na skutek defektów lub mutacji w ich genie obese (ob), którego defekty albo mutacje uniemożliwiają albo zakłócają wytwarzanie i/lub funkcję białek ob w modulowaniu masy ciała. Białka te mogą więc być użyte jako substancje o działaniu hormonów, do kontrolowania, zapobiegania albo leczenia otyłości i pokrewnych jej stanów i chorób u ludzi i zwierząt.

186 568

W celu zastosowania mysich lub ludzkich białek ob w taki sposób, białka te mogą być podawane we wstrzyknięciach różnymi drogami jak np. dootrzewnowo, dożylnie, domięśniowo czy podskórnie, w częstym podawaniu. Ponieważ są one podawane często we wstrzyknięciach, ważne jest by mysie lub ludzkie białka ob były oczyszczone, najkorzystniej do homogenności, wolne były od zanieczyszczających substancji białkowych, oraz były produkowane drogą ekspresji rekombinacyjnej w rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci. Jest ogólnie znane osobom praktykującym, że zanieczyszczenia obecne w środkach medycznych do wstrzyknięć mogą często prowadzić do toksycznych działań ubocznych albo niekorzystnych odpowiedzi odpornościowych.

Aczkolwiek sekwencja mysiego genu ob została ujawniona przez Zhang Y. i in., powyżej, nie zostały jednak opisane metody ekspresji mysiego białka ob albo jego ludzkiego odpowiednika ani też produkcji tych białek w aktywnej biologicznie i rozpuszczalnej postaci, z której mogą być one oczyszczane do homogenności. Stąd, przedmiotem niniejszego wynalazku jest homogenne, biologicznie czynne ludzkie białko ob oraz sposób jego wytwarzania. W zgłoszeniu opisano również sposób otrzymywanie mysiego białka ob w homogennej, rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci.

Ujawniono, że rekombinowane ludzkie i mysie białka ob mogą ulegać ekspresji w biologicznie czynnej i rozpuszczalnej postaci, a następnie być oczyszczane do homogenności odpowiedniej do wstrzykiwania pacjentom w celu leczenia, zapobiegania albo kontrolowania otyłości i związanych z nią stanów i chorób jak np. cukrzyca typu II, nadciśnienie, hiperlipidemia itp.

Tak więc przedmiotem wynalazku jest homogenne ludzkie białko ob, obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, w postaci biologicznie czynnej. Przedmiotem wynalazku jest również fragment białka według wynalazku, który wykazuje biologiczną aktywność tego białka. Korzystnie białko według wynalazku albo jego fragment charakteryzują się aktywnością biologiczną zmniejszaj ącą ilość przyjmowanego pożywienia i przyrost masy u ssaków.

Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowane, biologicznie czynne ludzkie białko otyłości obejmujące Id. Sekw. nr 6, wolne od innych białek ssaków oraz jego fragment wykazujący biologiczną aktywność tego białka. Korzystnie białko według wynalazku albo jego fragment charakteryzują się aktywnością biologiczną zmniejszającą ilość przyjmowanego pożywienia i przyrost masy u ssaków.

Przedmiotem wynalazku jest też wektor ekspresyjny zawierający promotor oraz sekwencję DNA, która koduje białko fuzyjne zawierające dwie części: peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej E. coli (tzn. sOmpA) oraz ludzkie białko ob o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw¹. nr 6. Wektor według wynalazku jest zdolny do ekspresjonowania białka fuzyjnego w komórkach E. coli. Korzystnie sekwencja promotorowa wektora według wynalazku składa się z promotora operatora lac i promotora lipoproteiny.

W zakres wynalazku wchodzi też białko fuzyjne obejmujące ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw'. nr 6 oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej Escherichia coli.

Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja DNA zawierająca pierwszą i drugą część, w której:

(a) pierwsza część jest sekwencją genu sOmpA o Id. Sekw. nr 7, kodującą peptyd sOmpA; i (b) druga część jest sekwencją nukleotydową o Id. Sekw. nr 4 kodującą ludzkie białko ob, pozbawioną części sekwencji nukleotydowej kodującej naturalną sekwencję sygnałową.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania białka ob według wynalazku obejmujący skonstruowanie wektora ekspresyjnego według wynalazku, a następnie wprowadzenie wektora do komórki gospodarza E. coli w celu jej transformowania i ekspresjonowanie białka fuzyjnego według wynalazku. W sposobie według wynalazku uzyskiwana jest wydajna ekspresja i translokacja białka fuzyjnego do przestrzeni periplazmatycznęj (tzn. pomiędzy wewnętrzną i zewnętrzną błonę komórkową bakterii E. coli), w którym to momencie peptyd sygnałowy jest odcinany od białka ob pozostawiając je w rozpuszczalnej i biologicznie czyn186 568 nej postaci. Następnym etapem sposobu według wynalazku, jest uwolnienie ludzkiego białka ob w rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci do bezkomórkowego otoczenia w następstwie działania na komórki E. coli buforem do zimnego wstrząsu osmotycznego. Ostatnim etapem sposobu według wynalazku jest poddanie płynu osmotycznego zawierającego ludzkie białko otyłości kombinacji chromatografii anionowymiennej, chromatografii kolumnowej opartej na oddziaływaniu hydrofobowym i filtracji żelowej, w wyniku których otrzymuje się homogenne, biologicznie czynne rekombinowane ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6.

Przedmiotem wynalazku jest też organizm gospodarza transformowany wektorem ekspresyjnym według wynalazku.

W niniejszym zgłoszeniu opisano również sposób ekspresji i produkcji mysiego białka ob przy użyciu mysiego genu ob opisanego przez Zhang, Y. i in., powyżej, sekwencję którego stanowi sekwencja nukleotydowa 702 par zasad (bp) oznaczona tu jako Id. Sekw. nr 1. Ta sekwencja mysiego genu ob zawiera 501 bp sekwencji kodującej albo otwartej ramki odczytu (ORF) rozpoczynającej się kodonem startu w pozycji 36 i kończącej się kodonem stop w pozycji nukleotydowej 537 i posiadającej nie ulegające translacji sekwencje na końcach 5' i 3'. ORF zawiera sekwencję sygnałową o długości 63 bp od nukleotydu 36 do 98.

Sekwencja mysiego genu ob (Id. Sek. nr 1) koduje mysie białko ob (plus jego sekwencję sygnałową), które stanowi sekwencję aminokwasową o długości 167 aminokwasów i oznaczone jest jako Identyfikator Sęk. Nr 2. W białku tym o Identyfikatorze Sekw. Nr 2 pierwsze 21 aminokwasów stanowi sekwencję sygnałową mysiego białka ob. Dojrzałe mysie białko ob (bez jego sekwencji sygnałowej) rozciąga się od aminokwasu 22 (Val) do aminokwasu 167 (Cys) i przedstawione jest jako Id. Sęk. Nr 3.

Wynalazek obejmuje również sekwencję ludzkiego genu ob obejmującą Id. Sekw. nr 4. Sekwencja ludzkiego genu ob jest 690-nukleotydową sekwencją, która może być wykorzystana w sposobie wytwarzania ludzkiego białka ob według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów glikolu polietylenowego i/lub glikolu polipropylenowego związanego z ludzkim białkiem ob obejmującym sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, o średnim ciężarze cząsteczkowym jednostek glikolu polietylenowego albo polipropylenowego w koniugacie rzędu od 15000 do 60000.

W zakres wynalazku wchodzi również kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-A, w którym P oznacza ludzkie białko ob obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, n i n' są liczbami całkowitymi, których suma wynosi od 300 do 1500, a średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R i R' oznacza niższą grupę alkilową. Korzystnie suma n i ń wynosi od około 800 do 1200 zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie 35000 do 45000.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-B, w którym P oznacza ludzkie białko ob według wynalazku obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, n jest liczbą od 300 do 1500, średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R oznacza niższą grupę alkilową. Korzystnie n zawiera się między 850 a 1000 zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego we wspomnianym koniugacie w kompozycji jest w zakresie pomiędzy 35000 a 45000.

Zhang Y. i in., powyżej, donosi o ludzkim genie ob jako wysoce homologicznym do mysiego genu ob oraz ujawnia konwencjonalną metodę z użyciem sond oligonukleotydowych dla mysiego genu ob, które mogą być użyte do 1) przesiewania biblioteki cDNA klonów uzyskanych z ludzkiej tkanki tłuszczowej, 2) identyfikacji tych klonów zawierających ludzki gen ob, oraz 3) izolacji i sekwencjonowania sekwencji ludzkiego genu ob. Sekwencjonowana

186 568 standardowymi metodami sekwencja ludzkiego genu ob posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną w Id. Sekw. nr 4.

Podobnie jak w przypadku mysiego genu ob, ludzki gen ob zawiera sekwencję kodującą albo otwartą ramkę odczytu (ORF) długości 501 bp rozpoczynającą się kodonem startu w pozycji nukleotydowej 37 i zakończonej kodonem stop w pozycji nukleotydowej 538 oraz posiadającą nie ulegające translacji sekwencje na końcach 5' i 3'. ORF zawiera sekwencję sygnałową długości 63 bp od nukleotydu 37 do 99.

Sekwencja ludzkiego genu ob (Id. Sekw. nr 4) koduje ludzkie białko ob wraz z sekwencją sygnałową, zaś jego sekwencja aminokwasowa przedstawiona została w Id. Sekw. nr 5. Pierwszych 21 aminokwasów tego białka o długości 167 aminokwasów przedstawia sekwencję sygnałową. Dojrzałe ludzkie białko ob (bez sekwencji sygnałowej) rozciąga się od aminokwasu 22 (Val) do aminokwasu 167 (Cys) i przedstawione zostało w Id. Sekw. Nr 6.

Zhang Y. i in., powyżej, donosi o 84% identyczności pomiędzy mysim i ludzkim białkiem ob. Zhang Y. i in., powyżej, donosi również o istnieniu odmiany mysiego i ludzkiego białka ob, która to odmiana charakteryzuje się u obu gatunków delecją glutaminy w pozycji 49. Około 30% klonów cDNA w bibliotekach uzyskanych z mysiej tkanki tłuszczowej i ludzkiej tkanki tłuszczowej wykazuje brak kodonu 49 (Zhang Y. i in., powyżej).

Poniższe określenia posiadają definicje przedstawione poniżej:

Mysie białko ob (mob) dotyczy białka o Identyfikatorze Sekw. Nr 3, którego właściwości biologiczne dotyczą leczenia, kontrolowania albo zapobiegania otyłości albo związanych z nią stanów i chorób. W szczególności, mysie białko ob określone jest jako będące każdym białkiem lub polipeptydem posiadającym sekwencję aminokwasowa, która jest istotnie homologiczna z sekwencją aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 3, i dalej wykazuje następujące aktywności biologiczne:

1) Gdy białko albo polipeptyd podawany jest przez wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) głodzonych od 16-18 godzin dojrzałych otyłych myszy ob/ob, posiadających masę ciała przynajmniej 30 gramów, w dawce 20 pg lub mniej, z użyciem metody opisanej przez Haleya i McCormicka, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957), białko lub polipeptyd:

(a) zmniejszają ilość przyjmowanego pokarmu w 5-godzinnym teście karmienia o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) oraz (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po wstrzyknięciu ICV o 50% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym wstrzyknięto sam nośnik (ED50 dla redukcji przyrostu masy ciała);

albo

2) Gdy białko lub polipeptyd podawany jest dootrzewnowo (IP) niegłodzonym dojrzałym myszom ob/ob posiadającym masę ciała przynajmniej 30 gramów dwa razy dziennie: o świcie i ponownie w trzy godziny po zmierzchu, przez tydzień, w dawce całkowitej 20 pg lub mniej, białko lub polipeptyd:

(a) zmniejsza 5- i 24-godzinną ilość przyjmowanego pokarmu o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) i (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po pierwszym wstrzyknięciu IP o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji przyrostu masy ciała).

W znaczeniu tu użytym, określenie mysie białko ob obejmuje białka świadomie zmodyfikowane przez, przykładowo, kierowaną mutagenezę albo przypadkowo przez mutacje.

Ludzkie białko ob (hob) dotyczy białka o Identyfikatorze Sekw·'. Nr 6, którego właściwości biologiczne dotyczą leczenia, kontrolowania albo zapobiegania otyłości albo związanych z nią stanów i chorób. W szczególności, ludzkie białko ob określone jest jako będące każdym białkiem lub polipeptydem posiadającym sekwencję aminokwasową, która jest istotnie homologiczna z sekwencją aminokwasową Identyfikatora Sekw. Nr 6, i dalej wykazuje następujące aktywności biologiczne:

186 568

(a) zmniejsza 5- i 24-godzinną ilość przyjmowanego pokarmu o conajmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji ilości przyjmowanego pokarmu) i (b) zmniejsza przyrost masy ciała podczas 24 godzin następujących po pierwszym wstrzyknięciu IP o co najmniej 20% w porównaniu z myszami kontrolnymi, którym podawano sam nośnik (ED20 dla redukcji przyrostu masy ciała).

W znaczeniu tu użytym, określenie ludzkie białko ob obejmuje białka świadomie zmodyfikowane przez, przykładowo, kierowaną mutagenezę albo przypadkowo przez mutacje.

Istotnie homologiczne, co może odnosić się zarówno do sekwencji kwasu nukleinowego jak i do sekwencji aminokwasowej, oznacza, że poszczególna sekwencja, przykładowo, sekwencja zmutowaną, różni się od sekwencji odniesienia jednym lub licznymi podstawieniami, delecjami albo addycjami, których efekt nie powoduje negatywnych funkcjonalnych różnic pomiędzy sekwencją zmutowaną i sekwencją odniesienia. Dla celów niniejszego wynalazku sekwencje posiadające homologię wyższą niż 95%, porównywalne pod względem właściwości biologicznych i charakterystyki ekspresji uważane są za istotnie homologiczne. W celu określenia homologii pominąć należy okrawanie dojrzałej sekwencji. Sekwencje wykazujące niższy stopień homologii, porównywalną aktywność biologiczną i porównywalną charakterystykę ekspresji uważane są za istotne zamienniki. Ogólnie, homologiczne sekwencje DNA mogą być zidentyfikowane przez hybrydyzację krzyżową w standardowych warunkach hybrydyzacji o pośredniej surowości.

Fragment mysiego lub ludzkiego białka ob oznacza każde białko albo polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową części lub fragmentu mysiego lub ludzkiego białka ob, i które posiada aktywność biologiczną, odpowiednio, mysiego lub ludzkiego białka ob. Fragmenty obejmują białka albo polipeptydy wytworzone przez degradację proteolityczną mysiego lub ludzkiego białka ob albo wytworzone syntezą chemiczną sposobami rutynowymi w dziedzinie wiedzy.

Białko ob lub jego fragment jest biologicznie czynny gdy podanie tego białka lub jego fragmentu ssakowi, włączywszy człowieka, zmniejsza ilość przyjmowanego pokarmu i zmniejsza tempo przyrostu masy ciała ssaka. Określenie tej aktywności biologicznej ludzkiego lub mysiego białka ob może być przeprowadzone konwencjonalnymi, dobrze znanymi testami wykorzystującymi w tym celu jeden lub więcej gatunków ssaków, w szczególności otyłe myszy ob. Kilka spośród tych testów, które mogą zostać wykorzystane do wykazania takiej aktywności biologicznej zostało tu opisanych. W określaniu aktywności biologicznej testem ICV na myszach ob/ob, jak to opisano, ED50 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia dla ludzkiego lub mysiego białka ob korzystnie wynosi 20 pg lub mniej, zaś ED50 dla zmniejszania przyrostu masy ciała wynosi 20 pg lub mniej. Alternatywnie, w określaniu aktywności biologicznej ludzkiego lub mysiego białka ob w teście IP na myszach ob/ob, jak to opisano, ED20 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia wynosi 20 pg lub mniej zaś ED20 dla zmniejszenia przyrostu masy ciała wynosi 20 pg lub mniej. Ogólnie, korzystne są fragmenty wykazujące wyżej wspomnianą aktywność biologiczną.

186 568

Replikon jest jakimkolwiek elementem genetycznym (tzn. plazmidem, chromosomem, wirusem) działającym jako autonomiczna jednostka replikacji DNA in vivo, tzn. zdolna do replikacji pod swoją własną kontrolą.

Wektor ekspresyjny jest replikonem, takim jak plazmid, fag lub kosmid, do którego może być włączony inny segment DNA, tak że prowadzi to do replikacji włączonego segmentu. Obejmuje on jednostkę transkrypcyjna obejmującą połączenie (1) elementu albo elementów genetycznych wykazujących działanie regulacyjne w ekspresji genu, przykładowo, promotorów lub wzmacniaczy, (2) sekwencji strukturalnej lub kodującej, która ulega transkrypcji na mRNA i translacji na białko, oraz (3) odpowiednich sekwencji rozpoczynających i kończących transkrypcję.

Klon jest grupą cząsteczek DNA uzyskanych z jednej z sekwencji DNA oryginalnej długości i wytworzonych przez bakterie lub wirusy przy użyciu technik inżynierii genetycznej, często z wykorzystaniem plazmidów.

Sekwencja sygnałowa jest sekwencją kwasu nukleinowego położoną na początku (koniec 5') sekwencji kodującej białka, które ma być ekspresjonowane. Sekwencja sygnałowa koduje peptyd sygnałowy, położony na końcu N nowopowstającego białka, który powoduje, że komórka gospodarz przenosi białko w kierunku swej błony komórkowej albo przez błonę komórkową, zaś w trakcie tego przenoszenie peptyd sygnałowy jest zwykle odcinany.

Kodon startu jest zwykle kodonem ATG położonym w sekwencji kodującej białko, zwykle na końcu 5' i sygnalizuje pierwszy aminokwas w sekwencji białka.

Kodon stop jest kodonem nonsensownym położonym w sekwencji kodującej zwykle na końcu 3' sekwencji kodującej białko i sygnalizujący koniec wydłużania łańcucha polipeptydowego.

Otwarta ramka odczytu (ORF) jest liniowym szeregiem tripletów kodonów w dwuniciowym DNA, kodującym sekwencję aminokwasową in vivo i in vitro gdy znajduje się pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulatorowych. Granice ORF wyznaczone są przez kodon startu na końcu 5' i kodon stop na końcu 3'. Może być również określona jako „sekwencja kodująca”.

Sekwencja promotorową jest regionem regulatorowym DNA zdolnym do wiązania polimerazy RNA w komórce i rozpoczynania transkrypcji znajdującej się poniżej (w kierunku 3') otwartej ramki odczytu jednego lub więcej genów strukturalnych, sekwencja promotorową jest zwykle położona na końcu 5' sekwencji kodującej albo otwartej ramki odczytu i rozciąga się w kierunku 5' obejmując minimalną liczbę zasad albo elementów koniecznych do zapoczątkowania transkrypcji polipeptydu w stopniu możliwym do odróżnienia od poziomu tła.

Sekwencja kodująca albo ORF znajduje się pod kontrola sekwencji promotorowej gdy polimeraza RNA dokonuje transkrypcji sekwencji kodującej na mRNA.

Kompozycja zawierająca A (przy czym A oznacza pojedynczy polipeptyd) jest homogenna dla A jeżeli nie zawiera wykrywalnej ilości zanieczyszczających białek albo innych substancji endogennych, wykrywanych standardowymi sposobami, przykładowo, przez barwienie żeli poliakrylamidowych. Dla celów wynalazku, określenie homogenna odnosi się do kompozycji zawierającej pojedyncze białko albo polipeptyd, jeżeli przynajmniej 95% masy kompozycji stanowi te białko albo polipeptyd.

Poniższe etapy opisują sposób ekspresji rekombinacyjnej ludzkich lub mysich białek w biologicznie czynnej, bezkomórkowej postaci rozpuszczalnej, wolnej od innych białek ssaczych, z której białka ob mogą być dalej oczyszczane do homogenności. Etapy te są przedstawione szczegółowo w przykładach.

1) Uzyskanie mysiego albo ludzkiego genu ob. cDNA (Identyfikator Sekw. Nr 1) kodujący mysie białko ob wraz z jego naturalną sekwencję sygnałową opublikowany został przez Zhang Y., i in., wyżej. Mysie cDNA wyizolowano i amplifikowano techniką PCR przy użyciu oligodezoksynukleotydowych starterów w sposób standardowy. Startery DNA i sposoby na ich uzyskanie opisano w Zhang Y., i in., wyżej.

cDNA (Identyfikator Sekw-'. Nr 4) według wynalazku, kodujący ludzkie białko ob wraz z jego naturalną sekwencją sygnałową uzyskano przy użyciu tych samych starterów oligodezoksynukleotydowych, które zastosowano w Zhang Y., i in., wyżej. Przy użyciu technik

186 568 standardowych ludzkie cDNA wyizolowano z biblioteki cDNA faga lambda wykonanej z RNA uzyskanego z ludzkiej tkanki tłuszczowej.

cDNA ludzkiego i mysiego ob można uzyskać nie tylko z bibliotek cDNA, ale również innymi standardowymi sposobami np. syntezą chemiczną albo przez klonowanie genomowego DNA lub jego fragmentów, oczyszczanego z odpowiedniej komórki. Procedury te opisano w Sambrook i in., DNA Cloning: A Practical Approach, tom I i Π, wyd. D.N. Glover, 1985, MLR Press, Ltd. Oxford, U.K.; Benton i Davies, Science 196, 180-182 (1977) oraz Grunstein i Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975). W celu uzyskania cDNA ludzkiego lub mysiego ob z bibliotek cDNA, biblioteki cDNA przesiewane są standardowymi technikami hybrydyzacji DNA metodami opisanymi w Benton i Davies, wyżej, albo Grunstein i Hogness, wyżej, przy użyciu starterów wykonanych przez odwrotną transkrypcję poliadenylowanego RNA wyizolowanego z mysich komórek tłuszczowych zawierających mysi gen ob. Klony hybrydyzujące ze starterami analizowane są przez cięcie endonukleazami restrykcyjnymi, elektroforezę na żelu agarozowym i dodatkowymi eksperymentami hybrydyzacyjnymi („Southern biot”) z użyciem starterów poddanych elektroforezie. Po izolacji kilku klonów hybrydyzujących z mysimi sondami cDNA, hybrydyzujący segment jednego z klonów jest wklonowywany i sekwencjonowany standardowymi technikami.

Klony uzyskane z genomowego DNA mogą zawierać sekwencje regulatorowe i regiony DNA intronów oprócz regionów kodujących; klony uzyskane z cDNA nie zawierają sekwencji intronowych. Podczas klonowania molekularnego genów z genomowego DNA, wytwarzane są segmenty DNA, niektóre zawierające pożądany gen. DNA może być cięty w specyficznych miejscach przy użyciu różnych enzymów restrykcyjnych. Alternatywnie, można użyć DNAzy w obecności manganu w celu pocięcia DNA, albo DNA może zostać rozerwany fizycznie przez, przykładowo, sonikację. Liniowe fragmenty DNA mogą zostać rozdzielone według wielkości standartowymi technikami, obejmującymi choć nie ograniczonymi do elektroforezy na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym oraz chromatografią kolumnową.

Niezależnie od źródła, ludzki lub mysi gen ob może być klonowany molekularnie do odpowiedniego wektora przez namnażanie genu metodami znanymi w dziedzinie. Użyty być może każdy z dostępnych w handlu wektorów Przykładowo, mysie cDNA może być wprowadzone do wektora pCDNA3, zaś ludzkie cDNA może być wprowadzone do wektora pBluescriptSK'. Odpowiednie wektory do zastosowania w gospodarzach bakteryjnych opisane zostały w Pouwels i in., Cloning Yectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, N.Y. Jako reprezentatywny choć nie ograniczający przykład, użyteczne wektory do klonowania do zastosowania w bakteriach mogą zawierać marker umożliwiający selekcję i bakteryjny początek replikacji uzyskany z dostępnych w handlu plazmidów, które z kolei uzyskano z dobrze znanego wektora do klonowania pBR322 (ATCC 37017). Takie dostępne w handlu wektory obejmują, przykładowo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) i pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wise., USA).

Sekwencje nukleotydowe ludzkiego albo mysiego genu ob wprowadzone do tych dostępnych w handlu wektorów mogą być potwierdzone sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy, standardową techniką sekwencjonowania nukleotydów.

Inne kwasy nukleinowe kodujące białka ob gatunków innych niż człowiek lub mysz mogą być również użyte. Nawiązując, jeżeli specyficzne DNA sklonowano i sekwencjonowano w odniesieniu do ludzkiego lub mysiego genu ob, potencjalnie każdy zwierzęcy adipocyt może byó użyty jako źródło kwasu nukleinowego białka ob.

2) Konstruowanie wektora ekspresyjnego dla ludzkiego i mysiego białka ob. Mysi albo ludzki gen ob klonowany zgodnie ze sposobami opisanymi powyżej jest użyty do konstruowania wektorów ekspresyjnych dla, odpowiednio, mysiego lub ludzkiego białka ob.

Do ekspresji biologicznie czynnego ludzkiego lub mysiego białka ob przez transfekowanego lub transformowanego gospodarza E. coli, oraz do wydzielania białka ob do periplazmy, może być użyty nowy wektor. Ten wektor ekspresyjny obejmuje promotor i sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne. Białko fuzyjne składa się z dwóch części: pierwsza cześć jest peptydem sygnałowym białka A błony zewnętrznej E. coli (sOmpA) zaś druga część jest mysim lub ludzkim białkiem ob (pozbawionym ich naturalnych sekwencji sygnałowych). Se10

186 568 kwencja DNA kodująca to białko fuzyjne składa się z dwóch części: pierwszej części kodującej peptyd sOmpA oraz drugiej części kodującej mysie lub ludzkie białko ob (pozbawione ich naturalnych sekwencji sygnałowych). Pierwsza część sekwencji DNA, kodująca peptyd sOmpA jest sekwencją sygnałową opisaną przez De Sutter i in., Gene 141, 163-170 (1994) i posiada sekwencję nukleotydową Identyfikatora Sekw. Nr 7. Druga część dwuczęściowej sekwencji DNA koduje mysie lub ludzkie białko ob i posiada sekwencję nukleotydową o, odpowiednio, Identyfikatorze Sekw. 1 albo Identyfikatorze Sekw. Nr 4 pozbawionych części sekwencji nukleotydowej kodującej odpowiednią sekwencję sygnałową.

Peptyd sygnałowy kodowany przez sekwencję sygnałową sOmpA o Identyfikatorze Sekw. Nr 7 posiada sekwencję aminokwasową o Identyfikatorze Sekw. Nr 8 jak opisana przez De Sutter K., i in., wyżej.

Nowy wektor ekspresyjny według wynalazku uzyskany jest przez wprowadzenie promotora i sekwencji DNA kodującej białko fuzyjne do standardowego wektora ekspresyjnego odpowiedniego do ekspresji rekombinowanych białek w komórkach gospodarza E. coli.

Do konstruowania tego nowego wektora ekspresyjnego według wynalazku może być użyty każdy promotor, o ile jest zdolny do kontrolowania, w komórkach gospodarza E. coli, transkrypcji białka fuzyjnego zawierającego peptyd sOmpA i białko ob. Jeżeli sOmpA używany jest jako peptyd sygnałowy, korzystne jest zastosowanie zarówno promotora-operatora lac (POlac) jak i promotora lipoproteiny (Plpp). Inne promotory użyteczne do ekspresji w E. coli obejmują promotor polimerazy RNA T7 opisany przez Studiera i in., J. Mol. Biol., 189, 113130 (1986), promotor lacZ opisany przez Lauera i in., J. Mol. Appl. Genet., 1, 139-147 (1981) i dostępny z American Tissue Type Collection (ATCC) jako ATCC 37121, promotor tac opisany przez Maniatisa w „Molecular Cloning: A Laboratory Manuał”, Cold Spring Harbor 1982, i dostępny jako ATCC 37138, promotor fosfatazy alkalicznej (phoA) i promotor trp opisany przez Goeddela i in., Nuci. Acids Res. 8, 4057-4075 (1980). Odkryto również inne promotory i zastosowano w E. coli zaś szczegóły dotyczące ich sekwencji nukleotydowej, umożliwiające osobie biegłej ich funkcjonalne ligowanie do wektora ekspresyjnego według wynalazku zostały opublikowane (Siebenlist i in., Celi 20, 269-281 91980).

W szczególności, wektor ekspresyjny obejmuje:

a) sekwencję promotorową i

b) sekwencję DNA kodującą białko fuzyjne, które to białko obejmuje mysie białko ob o Identyfikatorze Sekw. 3 albo ludzkie białko ob o Identyfikatorze Sekw. 6 oraz peptyd sygnałowy dla białka A błony zewnętrznej E. coli.

Następnie, opisany jest sposób konstruowania nowego wektora ekspresyjnego. Sposób ten jest dalej wyszczególniony w przykładach i przedstawiony w figurach 2 i 3. Najpierw, sekwencja kodująca ludzkiego lub mysiego genu ob (pozbawionego jego naturalnej sekwencji sygnałowej) wprowadzona jest do plazmidu zawierającego sekwencję sygnałową sOmpA, tworząc np. plazmid pT10sOmpArPDI. Plazmid pT10sOmpArPDI i jego konstrukcja i wykonanie opisane zostało w De Sutter i in., wyżej. Wprowadzony do tego plazmidu, ludzki lub mysi gen ob poddawany jest fuzji z genem sOmpA tworząc w tym plazmidzie „sekwencję genu hybrydowego”. Gen sOmpA musi się znajdować powyżej regionu 5' sekwencji kodującej genu ob. Następnie, do plazmidu zawierającego sekwencję genu hybrydowego wprowadzane są promotory, jak to wymieniono powyżej, korzystnie promotor lipoproteiny (Popp) i promotor-operator lac (POlac), tworząc wektor ekspresyjny według wynalazku. Oznaczono dwa wykonania tych wektorów ekspresyjnych jako pLPPsOmpA mob i pLPPsOmpAhobl i przedstawiono, odpowiednio, na figurze 2 i 3.

Do skonstruowania takich plazmidów zastosowany być może każdy sposób albo procedura znana w dziedzinie wiedzy. Ponadto, kolejność w której poddaje się fuzji sekwencje sOmpA i genu ob, wprowadza sekwencje genu do odpowiedniego plazmidu i wprowadza promotor uzyskując wektor według wynalazku, nie jest istotna. Przykładowo, sekwencja genu sOmpA może zostać początkowo poddana fuzji z sekwencją mysiego lub ludzkiego genu ob bezpośrednio tworząc sekwencję genu hybrydowego a następnie ta sekwencja hybrydowa wprowadzona do plazmidu zawierającego już wprowadzone, odpowiednie promotory.

186 568

Jest jednakże konieczne, by sekwencja genu sOmpA znajdowała się powyżej końca 5' sekwencji mysiego lub ludzkiego genu ob.

Przy użyciu tego nowego wektora ekspresyjnego, zaś w szczególności przez zastosowanie sekwencji sygnałowej kodującej sOmpA, mysie lub ludzkie białko ob może być przeniesione do przestrzeni periplazmatycznej, gdzie peptyd sygnałowy jest odpowiednio odcinany, pozostawiając całe ludzkie lub mysie białko ob, w biologicznie czynnej i rozpuszczalnej postaci. Znajdując się w przestrzeni periplazmatycznej białka ob mogą być efektywnie wydzielane do bezkomórkowego otoczenia wolnego od innych ssaczych białek, po poddaniu komórek gospodarza zimnemu wstrząsowi osmotycznemu, kiedy to białka ob mogą zostać oczyszczone do homogenności w biologicznie czynnej postaci.

3. Ekspresjonowanie ludzkiego albo mysiego białka ob w transformowanych komórkach E. coli.

Następnie, wektory ekspresyjne skonstruowane według opisanych wyżej procedur wprowadzane są do komórek gospodarza E. coli w celu transformowania komórek E. coli.. Użyty być może każdy szczep E. coli, jak np. E. coli K-12 szczep 294 jak to opisano w Patencie Brytyjskim Nr 2055382 A (ATCC Nr 31446). Inne szczepy użyteczne w nawiązaniu do niniejszego wynalazku obejmują/E coli MC1061 (Casadaban i Cohen, J. Mol. Biol. 138, 179207 (1980)), E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC Nr 31537) i E. coli W 3110 (ATCC Nr 27325) albo inne szczepy, spośród których wiele jest zdeponowanych i dostępnych w uznanych instytucjach przechowujących mikroorganizmy.

Transformowane komórki E. coli namnażane są do odpowiedniej gęstości komórkowej i hodowane standartowymi sposobami. W tak namnażanych i hodowanych transformowanych gospodarzach E. coli, wektory ekspresyjne według wynalazku, wydajnie i efektywnie umożliwiają ekspresję mysich lub ludzkich białek ob oraz przeniesienie tych białek do periplazmy komórek gospodarza E. coli w rozpuszczalnej i biologicznie czynnej postaci. Peptyd sygnałowy sOmpA (tzn. pierwsza część białka fuzyjnego) odcinany jest podczas przeniesienia białka ftizyjnego do periplazmy dając biologicznie czynne białko ob wolne od innych ssaczych białek czy polipeptydów'.

Wytworzone drogą rekombinacji ludzkie albo mysie białka ob w rozpuszczalnej biologicznie czynnej postaci w periplazmie transformowanych komórek E. coli są następnie oczyszczane do homogenności.

Rekombinowane ludzkie albo mysie białka ob przenoszone do periplazmy komórek, zgodnie z procedurami opisanymi tu, mogą być efektywnie wydzielane poza komórkę przez poddanie komórek gospodarza zimnemu wstrząsowi osmotycznemu sposobem znanym w dziedzinie wiedzy i opisanym przez Koshlanda D. i Botsteina D., Celi 20, 749-760 (1980). Zastosowanie zimnego wstrząsu osmotycznego uwalnia białka ob z komórek E. coli w biologicznie czynnej postaci, wolnej od innych ssaczych białek albo polipeptydów

Ludzkie albo mysie białka ob znajdujące się w płynie osmotycznym w następstwie zimnego wstrząsu osmotycznego transformowanych komórek E. coli, według wyżej opisanych procedur, są biologicznie czynne i mogą być oczyszczane do homogenności przy użyciu kombinacji chromatografii kolumnowej anionowymiennej, chromatografii kolumnowej opartej na oddziaływaniach hydrofobowych i filtracji żelowej. Chromatografia kolumnowa anionowymienna i chromatografia kolumnowa oparta na oddziaływaniach hydrofobowych mogą być przeprowadzone w dowolnej kolejności, jednakże zastosowanie obu musi poprzedzać filtrację żelową

Etap wymiany jonowej może być przeprowadzony standardowymi sposobami. Najkorzystniejszą kolumną do chromatografii anionowymiennej jest kolumna Q Sepharose Fast Flow. Odpowiednie ośrodki do chromatografii anionowymiennej obejmują różne nierozpuszczalne matryce zawierające grupy dietyloaminoetylowe (DEAE) albo dietylo-(2-hydroksypropylo)aminoetylowe (QAE). Matrycą może być akrylamid, agaroza, dekstran, celuloza albo inne rodzaje powszechnie stosowane do oczyszczania białek. Szczególnie użytecznym materiałem do chromatografii anionowymiennej jest DEAE-Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Gdy stosowane są ośrodki zawierające grupy DEAE, ekstrakty zawierające mysie albo ludzkie białka ob wprowadza się przy słabo zasadowym pH, np. 8,1. Związane mysie lub

186 568 ludzkie białka ob mogą być eluowane w bardziej oczyszczonej postaci przez zastosowanie gradientu soli w odpowiednim buforze, jak Tris-HCl. Ogólnie, charakterystyka gradientu może być określona we wstępnym doświadczeniu polegającym na elucji z użyciem małej ilości rekombinowanego białka.

Materiał zawierający ludzkie lub mysie białko ob, uzyskany przez zastosowanie chromatografii anionowymiennej, gdy chromatografia anionowymienna zastosowana jest jako pierwszy etap oczyszczania, poddawany jest następnie chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych jest techniką rozdziału, w której substancje rozdzielane są na podstawie różnicy w sile oddziaływań hydrofobowych z nienaładowanym materiałem złoża zawierającym grupy hydrofobowe. Zwykle, kolumna oddziaływań hydrofobowych jest uprzednio równoważona w warunkach faworyzujących wiązanie hydrofobowe, np. przy wysokiej sile jonowej. Do elucji próbki można stosować malejący gradient soli.

Zastosowana być może każda kolumna oddziaływań hydrofobowych. Najkorzystniejszą kolumną oddziaływań hydrofobowych jest fenylo-Sepharose, jednakże, butylo-Sepharose może być również zastosowana. Według wynalazku, materiał zawierający rekombinowane mysie lub ludzkie białko ob, eluowany z kolumny anionowej, wprowadzany jest do kolumny zawierającej względnie silnie hydrofobowy żel jak fenylo-Sepharose. W celu ułatwienia oddziaływań hydrofobowych z hydrofobowym żelem, stosowany jest rozpuszczalnik zawierający, przykładowo, siarczan amonu w stężeniu większym lub równym 0,4 M, przy czym najkorzystniejsze jest stężenie 0,4 M. Tak więc, kolumna i próbka doprowadzona jest do 0,4 M siarczanu amonu w buforze 50 mM Tris i próbka wprowadzona zostaje do kolumny. Kolumnę przemywa się 0,4 M siarczanem amonu jako buforem. Białko ob eluowane jest następnie rozpuszczalnikiem osłabiającym oddziaływania hydrofobowe jak, przykładowo, malejący gradient soli, glikol etylenowy lub propylenowy albo mocznik. Najkorzystniejsze wykonanie obejmuje przemywanie kolumny kolejno buforem Tris oraz buforem Tris zawierającym 20% glikol etylenowy. Białko ob jest następnie eluowane z kolumny gradientem malejącego stężenia siarczanu amonu i rosnącego stężenia glikolu etylenowego w buforze Tris. Skojarzone i kolejne zastosowanie chromatografii anionowymiennej i chromatografii kolumnowej oddziaływań hydrofobowych, w dowolnej kolejności, pozwala uzyskać rutynowo mysie albo ludzkie białko ob o czystości 90%.

Etap filtracji żelowej następuje po chromatografii anionowymiennej i chromatografii kolumnowej oddziaływań hydrofobowych przedstawionych powyżej, i może być wykonany dowolną procedurą filtracji żelowej. Białko ob eluowane z kolumny oddziaływań hydrofobowych albo kolumny anionowymiennej, niezależnie, która została zastosowana ostatnio, może być stężone i dializowane do małych objętości przez zastosowanie błony o progu rozdzielczym równym ciężarowi cząsteczkowemu 10000 (błona Amicon YM10). Stężony materiał może być wprowadzony do kolumny zawierającej ośrodek do filtracji żelowej jak Sephadex G100 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). Białko ob może być następnie oddzielone od innych zanieczyszczeń na podstawie swego ciężaru cząsteczkowego standartową techniką z użyciem SDS-PAGE.

Skojarzone i kolejne zastosowanie chromatografii anionowymiennej, chromatografii kolumnowej oddziaływań hydrofobowych i filtracji żelowej pozwala rutynowo uzyskać ludzkie albo mysie białko ob o czystości 95%.

N-końcowe sekwencjonowanie aminokwasów oczyszczonego mysiego lub ludzkiego białka ob może być wykonane sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy np. przez elektrotransfer według metody Laemli, U.K., Naturę 227, 680-685 (1970) albo procedurami opisanymi przez Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 (1987). Może być również wykonane sekwencjonowanie wewnętrzne metodami znanymi w dziedzinie wiedzy. Przykładowo, przez trawienie prążka M (na nitrocelulozie) endoproteinazą Lyzine C mogą być wytworzone fragmenty peptydowe a następnie rozdzielone przez układ HPLC.

Aktywność biologiczna oczyszczonych ludzkich białek ob według wynalazku lub mysich białek ob przejawia się w tym, że częste podawanie białka ob przez wstrzyknięcie pacjentom lub myszom powoduje zmniejszenie przyjmowanej ilości pokarmu oraz zmniejszonym przybieraniem na wadze w porównaniu z nienastrzykiwanymi lub kontrolnymi grupami osobników.

186 568

Aktywność biologiczna ludzkich lub mysich białek ob, lub ich fragmentów, uzyskanych i oczyszczonych według wynalazku, może być badana rutynowymi metodami, np. przez powtarzane albo pojedyncze wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) myszy ob/ob według procedur Haleya, T. J., i in., powyżej, jak to opisano szczegółowo w przykładach 13 i 16. W oparciu o ten test ICV, może być oznaczona ED50 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia i ED50 dla zmniejszenia przyrostu masy ciała. Dodatkowo, przez powtarzane wstrzyknięcia IP myszom ob/ob, jak to szczegółowo opisano w przykładzie 15, może być określona aktywność biologiczna oczyszczonego ludzkiego lub mysiego białka ob lub jego fragmentów. W oparciu o test IP, może być oznaczona ED20 dla zmniejszenia ilości przyjmowanego pożywienia i ED20 dla zmniejszenia przyrostu masy ciała.

Aktywność biologiczna ludzkich białek ob albo ich fragmentów według wynalazku, wytworzonych i oczyszczonych sposobem według wynalazku może być również oznaczona u ludzi sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy, np. przez pomiar zmniejszenia przyjmowania posiłku testowego w następstwie podania IV białka ob badanemu osobnikowi otyłemu w porównaniu z podaniem IV kontrolnego roztworu soli, w oparciu o metodę Muurahainen, N.E., i in., Am. J. Physiol. 260, 672-680 (1991), i opisaną szczegółowo w przykładach 14 i 17. Ewentualnie, zdolność oczyszczonego mysiego lub ludzkiego białka ob, według wynalazku, do zmniejszania przyrostu masy ciała (np. do powodowania utraty masy ciała) może być określona przez powtarzane wstrzyknięcia IV otyłym osobnikom badanym w oparciu o metodę Drenta, M.J., Int. J. Obesity 19,221-226 (1995), jak to opisano szczegółowo w przykładzie 18.

Ludzkie białka ob, według wynalazku, oczyszczone sposobem według wynalazku posiadają aktywność biologiczną przejawiającą się tym że:

albo

2) Gdy białko lub polipeptyd podawany jest dootrzewnowo (IP) niegłodzonym dojrzałym myszom ob/ob posiadającym masę ciała przynajmniej 30 gramów dwa razy dziennie: o świcie i ponownie w trzy godziny po zmierzchu, przez tydzień, w dawce całkowitej 20 jxg lub mniej, białko lub polipeptyd:

Dodatkowo, owe zmniejszenie masy ciała i ilości przyjmowanego pożywienia występuje już w dawkach poniżej 20 gglbb mniej, pzyy oodawamu ICV nawet w dawkach rzędu 1 μ g lub mniej, zwłaszcza gdy białka te oczyszczone są do homogenności.

Testy biologiczne opisane powyżej, i wyszczególnione w przykładach, do określania aktywności biologicznej ludzkich i/lub mysich białek ob mogą być zastosowane do określenia aktywności biologicznej fragmentów tych białek, zarówno gdy fragmenty te wytworzono przez trawienie proteolityczne białek ob, jak i przez syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowanego białka na podstawie częściowej sekwencji DNA dla białka ob czy jakąkolwiek inną metodą znaną w dziedzinie wiedzy.

Ludzkie białko ob według wynalazku można sprzęgać z homopolimerami glikolu polietylenowego lub glikolu polipropylenowego, które mogą być niepodstawione lub podstawione

186 568 przez eteryfikację jednej z grup hydroksylowych przy ich końcach niższą grupą alkilową. Takie koniugaty dostarczają białka ob w stabilnej formie i poprawiają półokres trwania tych białek. Ponadto stosowanie takich koniugatów utworzonych z homopolimerami glikolu polietylenowego lub polipropylenowego jest środkiem do zwiększenia półokresu trwania aktywności białka ob w organizmie. Ponadto stwierdzono, że takie koniugaty mają też inne zalety, takie jak zwiększona trwałość i czas utrzymywania się w krwiobiegu terapeutycznego białka ob, przy zmniejszonej jego immunogenności. Takie koniugaty białek ob (przyp. tłum. dalej określane nazwą „pegylowane białka”, która z braku odpowiedniej nazwy w terminologii polskiej, jest spolszczonym odpowiednikiem angielskiego terminu „pegylated”, i odpowiednio reakcja wytwarzania takich koniugatów - reakcja pegylowania), mogą być także i łatwo zaadsorbowane w organizmie ludzkim dając w efekcie zwiększony wychwyt w układzie krwionośnym.

Homopolimery glikolu polietylenowego lub polipropylenwego, które sprzęga się z białkiem ob mają ciężar cząsteczkowy w przybliżeniu 15000 do 60000. Otrzymuje się białko, które może być mono- lub poli-pegylowane cząsteczkami glikolu polietylenowego lub polipropylenowego. Białko ob może być mono- lub di-pegylowane i tworzyć koniugat z jednostkami glikolu polietylenowego lub polipropylenowego, które w koniugacie mają całkowity ciężar cząsteczkowy od 15000 do 60000, najkorzystnie od 35000 do 45000. Zwykle koniugaty tworzą się jako mieszanina (kompozycja) koniugatów glikolu polietylenowego lub polipropylenowego, ponieważ wyjściowy glikol polietylenowy i polipropylenowy są sprzedawane jako mieszanina różnych homopolimerów o różnych ciężarach cząsteczkowych. Ciężar cząsteczkowy podany powyżej jest średnim ciężarem cząsteczkowym mieszaniny koniugatów ob tak wytworzonej. Mieszaniny te, w razie potrzeby, można rozdzielić na pojedyncze koniugaty, konwencjonalnymi metodami, takimi jak chromatografia kolumnowa, która obejmuje HPLC. Jednak do celów terapeutycznych koniugat jest stosowany jako mieszanina.

Polimery glikolu polietylenowego lub polipropylenowego [PEG] można łączyć z białkiem ob przez wolny N-końcowy aminokwas białka konwencjonalnymi środkami. Mogą to być dowolne z wielu dostępnych znanych metod. Glikol polietylenowy lub polipropylenowy można związać kowalencyjnie przez N-końcowy aminokwas białka, a także przez różne reszty lizyny w białku ob.

Ponadto homopolimery glikolu polietylenowego lub polipropylenowego można sprzęgać z białkiem ob przez bi- lub polifunkcyjne grupy wiążące. Do wytwarzania koniugatów z jedną cząsteczką homopolimeru glikolu polietylenowego lub polipropylenowego stosuje się łącznik di-funkcyjny i homopolimer sprzęga się z jego jedną grupą funkcyjną, natomiast N-końcowy aminokwas oraz grupa lizyny z białka ob może być sprzężona z drugą grupą funkcyjną łącznika. Do wytwarzania koniugatów białka ob z trzema lub więcej cząsteczkami polimerów glikolu polietylenowego lub polipropylenowego stosuje się łączniki trilub polifunkcyjne. Dwie lub więcej z tych grup funkcyjnych sprzęga się z homopolimerem a pozostała jedna grupa wiąże się z białkiem ob. Do takich łączników polifunkcyjnych należą łączniki z grupami funkcyjnymi aminowymi i karboksylowymi. Grupy aminowe mogą sprzęgać się z funkcjo nal izo waną grupą hydroksylową glikolu polietylenowego lub polipropylenowego tworząc wiązanie amidowe. Grupy karboksylowe mogą sprzęgać się z grupami aminowymi w białku ob tworząc wiązanie amidowe i z funkcjonalizowaną grupą hydroksylową w glikolu tworząc wiązanie estrowe. Wśród wielu typów grup łącznikowych, które można wykorzystać do tworzenia koniugatu białka ob i PEG, znajdują się grupy ujawnione w opisach patentowych USA nr 4 902 502, 5 034 514,4 609 546, 5 122 614 i 4 847 325.

Tak więc przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów glikolu polietylenowego i/lub glikolu polipropylenowego związanego z ludzkim białkiem ob o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 6, o średnim ciężarze cząsteczkowym jednostek glikolu polietylenowego albo polipropylenowego we wspomnianym koniugacie rzędu od 15000 do 60000.

186 568

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, zawierająca jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-A, w którym P oznacza ludzkie białko ob o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 6, π i n' są liczbami całkowitymi, których suma wynosi od 300 do 1500, a średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R i R' oznacza niższą grupę alkilową. Korzystnie suma n i n' wynosi od około 800 do 1200, zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie 35000 do 45000. Korzystnie kompozycja według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących zawierająca jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-B, w którym P oznacza ludzkie białko ob o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 6, według zastrz. 1 do 6, π jest liczbą od 300 do 1500, średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R oznacza niższą grupę alkilową. Korzystnie n zawiera się między 850 a 1000 zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego we wspomnianym koniugacie w kompozycji jest w zakresie pomiędzy 35000 a 45000.

Związki o wzorze I-A i I-B można wytwarzać ze znanych polimerycznych materiałów przez kondensowanie ich z ludzkim białkiem ob według wynalazku. W celu wytworzenia amidu można wykorzystać dowolną konwencjonalną metodę reakcji aktywowanego estru z aminą. W reakcji zilustrowanej powyżej grupą opuszczającą przy tworzeniu się amidu jest przykładowo grupa estru sukcynimidylowego. Gdy do wytwarzania związku o wzorze I-B stosuje się związek o wzorze II-B reakcję z ludzkim białkiem ob według wynalazku prowadzi się takim samym sposobem jak opisany w związku z konwersją związku o wzorze II-A do związku o wzorze I-A. Takie estry sukcynimidylowe jak związek o wzorze II-A stosowane do wytwarzania koniugatów z białkami są opisane w publikacji Monfardini i in., Bioconiugate Chem., 6, 62-69((1995).

Ludzkie białka ob według wynalazku mogą być wytworzone, w postaci kompozycji farmaceutycznych odpowiednich do wstrzyknięć wraz z odpowiednim dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem czy zaróbką sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy. Tak więc możliwe jest wytworzenie kompozycji farmaceutycznej do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, zawierającej ludzkie białko ob według wynalazku o sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw·'. nr 6, albo kompozycję koniugatów określoną powyżej oraz substancję stanowiącą farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. W takiej kompozycji farmaceutycznej może być stosowana każda standartowa substancja nośnikowa. Substancja nośnikowa może być organiczna lub nieorganiczna, odpowiednia do podawania doustnego, przezskómego lub pozajelitowego. Odpowiednie nośniki obejmują wodę, żelatynę, gumę arabską, laktozę, skrobię, stearynian magnezu, talk, oleje roślinne, glikole polialkilenowe, wazelinę itp. Ponadto, preparaty farmaceutyczne mogą zawierać inne czynniki aktywne farmaceutycznie. Dodatkowe domieszki jak środki aromatyzujące, konserwanty, stabilizatory, emulgatory, bufory itp., mogą być dodawane zgodnie z przyjętą praktyką farmaceutyczną. W szczególności do sporządzania kompozycji zawierających homogenne białko ob według wynalazku, mogą być wykorzystywane: albumina surowicy ludzkiej, białka osocza ludzkiego itp.

Podawanie rekombinowanego homogennego białka ob, ludzkiego, powoduje zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia i zmniejszenie masy ciała u otyłych ludzi i zwierząt. Tak więc, podawanie białka ob uzupełnia to białko, istotne dla regulacji masy ciała. Kompozycje farmaceutyczne zawierające ludzkie białka ob według wynalazku mogą być przygotowywane w sile efektywnej do podawania różnymi sposobami ludziom lub zwierzętom doświadczającym nienormalnej fluktuacji masy ciała, samodzielnej lub jako składowej niekorzystnego stanu zdrowia czy choroby jak cukrzyca typu Π. Wykorzystane być mogą ^różnorodne techniki podawania, jak wstrzyknięcia podskórne, dożylne i dootrzewnowe. Średnie ilości białka ob mogą być różne zaś w szczególności powinny opierać się na zaleceniach i receptach doświadczonego lekarza czy weterynarza.

186 568

Ludzkie białko ob wytworzone sposobem według wynalazku może być zastosowane w metodach przesiewowych w celu identyfikacji receptora(ów) białka ob.

Przykłady przedstawione poniżej nie mają na celu w żaden sposób ograniczać wynalazku.

Figura 1 jest schematem dwóch klonów dla ludzkiego białka ob; tzn. hob c11 i hob c12, które schematycznie przedstawiają położenie i rodzaje miejsc restrykcyjnych położonych na końcu 5' i 3' sekwencji cDNA ludzkiego ob.

Figura 2 jest schematem konstrukcji wektora ekspresyjnego mob pLPPsOmpA.

Figura 3 jest schematem konstrukcji wektora ekspresyjnego hobl pLPPsOmpA.

Przykład 1

Uzyskanie cDNA ludzkiego ob cDNA ludzkiego ob uzyskano przez przesiewanie dostępnej w handlu biblioteki cDNA w fagu lambda („Clontech”) wykonanej z RNA uzyskanego z ludzkiej tkanki tłuszczowej. Z biblioteki tej, przez hybrydyzację, uzyskano dwa fagi lambda zawierające fragment wielkości około 2,5 kb, odpowiadający ludzkiej sekwencji cDNAdla ob. Techniką tą zidentyfikowano dwa klony, tzn. cDNA hob1 i cDNA hob2. Ludzki gen ob wklonowano do wektora plazmidowego pBluescriptSIK, dostępnego w handlu ze Stratagene. Powstałe wektory zawierające sekwencje ludzkiego genu ob nazwano pBluescriptSKTiob1 i pBluescriptSKTiob2.

Sekwencję ludzkiego genu ob w pBluescriptSKTiobl i pBluescriptSIKhob2 potwierdzono sekwencjonowaniem nukleotydów. Sekwencje aminokwasowe białka wywnioskowanego z sekwencji nukleotydów odpowiadały ludzkiemu białku ob oznaczonemu przez Identyfikator Sekw. Nr 4 oraz opublikowanemu przez Zhang, Y., i in., powyżej. PBluescriptSKTiob1 zawierał mutację T-C po kodonie stop. Mutacja ta powodowała utratę miejsca restrykcyjnego Stul przewidzianego w sekwencji nukleotydowej hob1, poniżej; hob1

...GGG.TGC.TGA.GGCCT TGA...

Gly Cys stop

PBluescriptSK-hobł

...GGG.TGC.TGA.GGCCC TGA...

Gly Cys stop

PBluescriptSK~hob2

...GGG.TGC.TGA.GGCCT TGA...

Gly Cys stop

Ponieważ mutacja ta w pBluescriptSK'hob1 położona jest po kodonie stop sekwencji cDNA ludzkiego ob, nie prowadzi ona do zmiany sekwencji aminokwasowej ludzkiego białka ob, jak to opublikowano przez Zhang, Y., i in., powyżej.

Jeżeli chodzi o sekwencję nukleotydową cDNA obecnego w pBluescriptSKTiob2, wykazano analizą restrykcyjną, że plazmid posiada miejsce StuI położone po kodonie stop sekwencji cDNA ludzkiego ob.

Oprócz faktu, że pBluescriptSKhκ)bł posiada mutację w miejscu restrykcyjnym StuI po kodonie stop, pBluescriptSIChobl posiada również miejsce restrykcyjne EcoRI po ORF w cDNAhoM, które jest nieobecne w cDNAhob2 (patrz, figura 1).

Przykład 2

Konstruowanie plazmidu dla mysiego białka ob (mob) cDNA mysiego ob o Identyfikatorze Sekw. Nr 1 uzyskano procedurą według Zhang, Y., i in., powyżej, a następnie wprowadzono do wektora pcDNA3, dostępnego w handlu z Invitrogen (San Diego, California, USA). Uzyskany w ten sposób mysi gen ob zastosowano do konstruowania wektora ekspresyjnego pLPPsOmpA-mob do ekspresji mysiego białka ob (mob). Wektor ten i jego konstrukcja przedstawiona jest szczegółowo na figurze 2.

Pierwszym etapem konstrukcji było uzyskanie fuzji sekwencji kodującej sygnał z genu sOmpA z regionem dojrzałej sekwencji kodującej mysiego genu ob, tzn. bez jej naturalnej sekwencji sygnałowej. Fragment DNA wielkości 501 bp, kodujący dojrzałe mysie białko ob wprowadzony do wektora pcDNA3 amplifikowano z wektora przez reakcję łańcuchową polimerazy (PGR) przy użyciu polimerazy DNA Vent (New England Biolabs), startera 5' (starter 1), rozpoczynającego się pierwszym nukleotydem kodonu kodującego walinę (będącą pierwszym aminokwasem dojrzałego mob) (Zhang, Y. i in., powyżej) i startera 3' (starter 2) odpowiadającego

186 568 regionowi mob zawierającemu kodon stop mob. Starter 2 zawierał również sekwencję odpowiadającą miejscu restrykcyjnemu Hindlll.

Starter 1: 5' GTG CCT ATC GAG AAA GTC 3'

Val Pro Ile Glu Lys Val

Starter 2: 5' TCCCAAGCTT TCAGCATTCAGGGCTAAC 3'

HindIII stop

Amplifikowany fragment DNA wielkości 501 bp oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym i fosforylowano kinazą polinukleotydowa T4 („Boehriger”) po czym trawiono enzymem restrykcyjnym HindIII w celu stworzenia „sterczącego” końca 5' w miejscu startera 2. Uzyskany fragment posiadał tępy koniec odpowiadający pierwszemu nukleotydowi cDNA kodującego dojrzały mob oraz „sterczący” koniec 5' odpowiadający miejscu przeciętemu HindIII.

Następnie, zawierający sOmpA plazmid - pT10sOmpArPDI, uzyskany według De Sutter, K. i in., powyżej poddano fuzji z genem mob tworząc plazmid pT10sOmpAmob. Aby tego dokonać, fragment mob wklonowano przy użyciu ligazy T4 („New England Biolabs”) do wektora DNA pT10sOmpArPDI, trawionego uprzednio enzymami restrykcyjnymi Nael i HindIII sposobami znanymi w dziedzinie wiedzy (Sambrook, J. i in., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” wyd.2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Plazmid pT10sOmpArPDI uzyskano z plazmidu p7ł4 (Parker i Wiley, Gene 83, 117-134 (1989)). Plazmid ten zawierał cDNA kodujący szczurze dojrzałe białko izomerazy dwusiarczkowej (rPDI) poddany fuzji z sekwencją sOmpA.

Fuzja ta, pomiędzy ostatnim kodonem sOmpA (alanina) i pierwszym kodonem cDNA dojrzałej rPDI (glicyna) stworzyła miejsce restrykcyjne Nael, które po trawieniu Nael uwolniło ostatni kodon sekwencji sOmpA oraz pierwszy kodon cDNA dojrzałej rPDI jako tępe końce.

Nael

5’..........GCC / GGC...........3’

Ala Gly cDNA sOmpA / dojrzały cDNA rPDI

Miejsce HindIII istniało na końcu cDNA kodującego rPDI. Tak więc, dalsze trawienie tego plazmidu przy użyciu HindIII uwolniło główną część cDNAdla rPDI i stworzyło koniec 5' „sterczący” i odpowiadający jednemu z końców fragmentu będącego produktem PGR. Powstały plazmid w którym cDNA kodujący rPDI zastąpiony został przez cDNA kodujący dojrzałe mysie ob oznaczony został pT10sOmpAmob i przedstawiony na figurze 2.

Ligowany DNA wprowadzono do E. coli szczepu MC 1061 przy użyciu standardowej elektroporacji zaś uzyskane kolonie przesiewano pod kątem obecności fragmentu DNA mysiego ob, przy użyciu analizy restrykcyjnej. Klon pT10sOmpAmob zawierał sekwencję kodującą dojrzałe mysie białko ob poddane fuzji z sekwencją kodującą sOmpA.

Następnie, ekspresja mob w E. coli w pT10sOmpA została umieszczona pod kontrolą zarówno promotora lipoproteiny (Plpp) jak i promotora-operatora lac (POlac). W tym celu sekwencja genu hybrydowego sOmpA-mob została przeniesiona z plazmidu pT10sOmpAmob do wektora plazmidowego pLPPsOmpArPDI standardową procedurą opisaną przez De Sutter i in., powyżej.

Plazmid pLPPsOmpArPDI uzyskano, jak już to wspomniano, z plazmidu p714 (Parker i Willey, Gene83, 117-134 (1989)). Do tego etapu DNA plazmidu pT10sOmpAmob przecięto enzymami restrykcyjnymi XbaI i HindIII. Fragment zawierający DNA kodujący sOmpAmob poddano ligacji z plazmidem pLPPsompArPDI, z którego uprzednio usunięto DNA kodujący sOmpA-rPDI, przez przecięcie enzymami restrykcyjnymi XbaI i HindIII. Powstały plazmid nazwano pLPPsOmpAmob.

Przykład 3

Ekspresja mysiego białka ob w E. coli (MC 1061)

Ekspresję mysiego białka ob w E. coli uzyskano w niżej podany sposób. Plazmid pLPPsOmpAmob skonstruowany według przykładu 3 wprowadzono przez elektroporację do E. coli szczepu MC 1061. Komórki E. coli (MC 1061) niosące plazmid pLPPsOmpA namnażano przez

186 568 noc w 28°C w pożywce Luria-Bertani („Difco Laboratories”) z dodatkiem karencyliny (100 μ g/ml, „Beecham”). Hodowli tej użyto jako inokulum (w rozcieńczeniu 100-krotnym) do 30ml hodowli, przez noc w 28°C, w tej samej pożywce. Hodowle tą rozcieńczono 100krotnie w 3 litrach (np. 6 x 0,5 l w 1-litrowych butelkach Erlenmeyera) w w/w pożywce wytrząsano w 28°C na wytrząsarce powietrznej New Brunswick (300 rpm) przez około 4 godziny dopóki nie osiągnięto gęstości A₍,oo 0,3 do 0,5. W tym momencie indukowano promotor lac przez dodanie izopropylo-3-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w stężeniu końcowym mM, jak to opisano w De Sutter i in., powyżej. Komórki inkubowano dalej w 28°C przez około 5 godzin do uzyskania gęstości A6oo równej 1,3 do 1,5. Następnie, komórki zebrano przez odwirowanie przy użyciu rotora JA 10 (wirówka Beckman modele J2-21 albo J2-21M) przez 6 minut przy 6750 rpm (800 x g) w 4°C. Nadsącz usunięto zaś peletkę komórek gwałtownie zawieszono w 250 ml lodowatego buforu do wstrząsu osmotycznego (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, zawierającego 20% sacharozę i 10 mM EDTA) i inkubowano na lodzie przez 10 do 20 minut jak to opisano w Koshland i Botstein, powyżej.

Następnie, zawiesinę przeniesiono do plastikowych probówek i zebrano komórki przez odwirowanie przy 8200 rpm (8000 x g) przez 5 minut w 4°C w rotorze JA20. Nadsącz usunięto zaś peletkę komórkową gwałtownie zawieszono w 120 ml lodowatej wody energicznie wytrząsając i inkubowano na lodzie przez dodatkowe 10 minut. Zawiesinę odwirowano następnie w rotorze JA20 przez 6 minut w 4°C przy 11500 rpm (16000 x g) zaś nadsącz odpowiadający frakcji periplazmatycznej (płyn wstrząsu osmotycznego) zebrano (około 120 ml). Dodano azydku sodu i Tris-HCl (pH 7,5) do stężenia końcowego, odpowiednio, 0,05% i 50 mM. Płyn wstrząsu osmotycznego zawierający mysie białko ob przechowywano w -20°C do dalszego użytku.

Przykład 4

Ekspresja mysiego białka ob w E. coli (MC 1061)

Ekspresję mysiego białka ob uzyskano według procedury opisanej w przykładzie 3, z wyjątkiem zastosowania triacyliny (100 pg/ml) jako antybiotyku, zamiast karbencyliny, jako dodatku do pożywki Luria-Bertani.

Przykład 5

Oczyszczanie mysiego białka ob z płynu osmotycznego E. coli

Mysie białko ob znajdujące się w 120 ml zamrożonego płynu wstrząsu osmotycznego według przykładu 4 oczyszczono w niżej podany sposób. 120 ml płynu wstrząsu osmotycznego zawierającego mysie białko ob rozmrożono i odwirowano w 4°C przez 20 minut przy 16000 rpm w rotorze JA20 w celu usunięcia nierozpuszczalnych resztek komórkowych. Nadsącz wprowadzono bezpośrednio do kolumny zawierającej 30 ml złoża Q-Sepharose Fast Flow („Pharmacia”) zrównoważonej uprzednio buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). Po przemyciu buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) białko mob eluowano przy użyciu buforu 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 0,1 M NaCl.

Następnie, do materiału uzyskanego po elucji z kolumny Q-Sepharose Fast Flow, dodano (NH4)2SO4 w postaci stałej do stężenia końcowego 1,0 M i mieszaninę wprowadzono do kolumny zawierającej 7,5 ml złoża Butylo-Sepharose Fast Flow („Pharmacia”) zrównoważonej uprzednio buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) zawierającym 1,0 M (NHÓ2SO4. Po przepłukaniu buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) zawierającym 1,0 M (NH4)2SO4, białko mob eluowano przez zastosowanie gradientu od 1,0 M (NH4)2SO4 w 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) do 20% glikolu etylenowego w wodzie. Białko mob eluowane z kolumny Butylo-Sepharose Fast Flow na samym końcu gradientu, podczas gdy większość zanieczyszczeń eluowana była znacznie wcześniej. Czystość białka mob na tym etapie wynosiła 90% co oceniono przez barwienie srebrem żelu poliakrylamidowego po elektroforezie (PAGE).

Białko mob w materiale eluowanym z kolumny zawierającej Butylo-Sepharose Fast Flow było dalej oczyszczane przez chromatografię filtracji żelowej. W tym celu mysie białko ob stężano w 4°C do objętości 1 ml na błonie YM10 („Amicon”) przy użyciu jednostki do stężania 8MC („Amicon”) i wprowadzono do kolumny (1,0 cm x 50 cm) zawierającej 39 ml Sephadexu G100 („Pharmacia”) zrównoważonej uprzednio roztworem fizjologicznym soli zbuforowanym fosforanem. Pulowano frakcje zawierające białko mob i zagęszczano na bło186 568 nie YM10. Na tym etapie białko mob było 95% czystości co oceniono na podstawie PAGE i barwienia srebrem. SDS-PAGE ujawniła pojedynczy prążek białka o Mr 15000.

Przykład 6

Analiza sekwencji mysiego białka ob

N-końcową sekwencję aminokwasową mysiego białka ob uzyskanego i oczyszczonego procedurami opisanymi w przykładach 2, 3, 4 i 5, opisanych powyżej wykonano według procedury Laemli, U.K., powyżej. Po elektrotransferze białek, rozdzielonych elektroforetycznie, na arkusz włókna szklanego opłaszczonego poli(jodkiem 4-winylo N-metylopirydyny) jak to opisano przez Bauw, G. i in., J. Biol. Chem. 7, 194-196 (1988), prążek białka o Mr 15000 wycięto z błony i określono N-końcową sekwencję aminokwasową degradacją Edmana na urządzeniu do sekwencjonowania w fazie gazowej 470A wyposażonym w połączony szeregowo fenylotiohydantoinowy analizator aminokwasów 120A („Applied Biosystems”). N-końcowa sekwencja aminokwasowa mysiego białka ob, uzyskanego w opisany powyżej sposób, którą stanowiły Val-Pro-Ile-Gln, odpowiadała dojrzałemu mysiemu białku ob o Identyfikatorze Sekw. Nr 3.

Przykład 7

Konstruowanie Wektora Ekspresyjnego dla Ludzkiego Białka ob. (hob)

Ludzki gen ob, uzyskany według procedur opisanych w przykładzie 1, wykorzystano do konstruowania wektora ekspresyjnego pLPPsOmpAhobl do ekspresji ludzkiego białka ob. Konstrukcja ta była podobna do konstrukcji pLPPsOmpAmob, opisanej w przykładzie 2 i przedstawionej na figurze 3. Do skompletowania fragmentu DNA zawierającego całą dojrzałą sekwencję ludzkiego ob potrzebna była trójfragmentowa ligacja.

Na pierwszym etapie tworzenie konstruktu, sekwencję nukleotydową hob rozpoczynającą się pierwszym nukleotydem kodonu kodującego pierwszy aminokwas dojrzałego ludzkiego białka ob (walina) poddano fuzji z sekwencją kodującą sygnał z OmpA (sOmpA), w taki sposób, że sekwencja sOmpA znajdowała się powyżej końca 5' sekwencji nukleotydowej kodującej ob. Ten fragment DNA uzyskano przez amplifikację w mieszaninie PCR zawierającej plazmid pBluescriptSKThob1, polimerazę DNA Vent oraz dwa startery. Starter 5' (starter 1) rozpoczynał się pierwszym nukleotydem kodonu kodującego pierwszy aminokwas dojrzałego ludzkiego białka ob, zaś starter 3' (starter 2) obejmował sekwencję ludzkiego cDNA zawierając kodon stop. Reakcja amplifikacji dostarczyła fragmentu DNA wielkości 501 bp zawierającego sekwencję kodującą dojrzałe ludzkie białko ob. Koniec 5' tego fragmentu DNA fosforylowano przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 i trawiono enzymem restrykcyjnym HindIII, uzyskując fragment DNA wielkości 353 bp posiadający tępy koniec odpowiadający pierwszemy nukleotydowi cDNA kodującego dojrzałe hob (pozycja odpowiadająca starterowi 1) oraz „sterczący” 5' koniec odpowiadający miejscu przeciętemu HindIII. Ten fragment DNA wielkości 353 bp oczyszczano przez elektroforezę na żelu agarozowym i wklonowano do plazmidu pT10sOmpArPDI uprzednio trawionego enzymami Nael i HindIII. Powstały plazmid pT10sOmpAhobl (częściowy) zawiera fragment DNA kodujący część dojrzałego białka ob (część amino-końcową) poddaną fuzji z sekwencją kodującą sOmpA.

Starter 1: 5' GTGCCCATCCAAAAAGTC 3'

Starter 2: 5’ TCCCAAGCTΊ^ΓCAGCACCCACCJGCTGAG 3' stop

W następnym etapie, sekwencję kodującą część karboksylo-końcową ludzkiego białka ob, tzn. fragment 2 poddano ligacji z fragmentem DNA kodującym część amino-końcową dojrzałego hob, a powstały fragment kodujący całe dojrzałe białko hob poddane fuzji z sOmpA przeniesiono do plazmidu pLPPsOmpArPDI umieszczając ekspresję dojrzałego ludzkiego białka ob w E. coli pod kontrolą promotora lipoproteiny i promotora-operatora lac. W tym celu, plazmid pT10sÓmpAhobl (częściowy) trawiono XbaI i HindIII izolując fragment 1 hob wielkości 400 bp przez elektroforezę na żelu agarozowym (fragment 1).

Następnie, plazmid pBluescriptSK1hob1 przecięto HindIII i EcoRI, izolując fragment wielkości 450 bp przez elektroforezę na żelu agarozowym (fragment 2). Na koniec, plazmid pLPPsOmpArPDI przecięto XbaI i EcoRI i fragment wektora wyizolowano przez elektroforezę na żelu agarozowym (fragment 3). Fragmenty DNA 1, 2 i 3 poddano następnie ligacji ze

186 568 sobą zaś mieszaninę ligacyjną wprowadzono do do E. coli szczepu MC 1061. Kolonii zawierającej docelowy konstrukt plazmidowy pLPPsOmpAhobl użyto do ekspresji i wydzielania dojrzałego ludzkiego białka ob.

Przykład 8

Ekspresja ludzkiego białka ob w E. coli (MC 1061) pLPPsOmpAhobl skonstruowanego według przykładu 7 użyto do transformacji E. coli szczepu MC 1061 dla ekspresji ludzkiego białka ob w rozpuszczalnej biologicznie czynnej postaci w periplazmie komórek gospodarza E. coli. Wprowadzenia plazmidu do komórek gospodarza E. coli dokonano drogą elektroporacji. Komórki E. coli (MC 1061) niosące plazmid pLPPsOmpAhobl namnażano w 28°C w pożywce Luria-Bertani(„Difco Laboratories”) z dodatkiem karbencyliny (100 pg/ml, „Beecham”) do odpowiedniej gęstości koczym indukowano promotor lac przez dodanie izopropylo-P-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG, „Boehringer”) do stężenia końcowego 2 mM, jak to opisano w De Sutter i in., powyżej. Komórki hodowano dalej do uzyskania gęstości A₆oo równej 1,3. Następnie komórki zebrano przez odwirowanie (8000 x g w 4°C) zaś peletkę komórek zawieszono gwałtownie w lodowatym buforze do wstrząsu osmotycznego (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, zawierającego 20% sacharozy i 10 mM EDTA) i inkubowano przez 10 minut jak to opisano w Koshland i Botstein, powyżej.

Następnie, komórki ponownie zebrano przez odwirowanie, jak wyżej, a peletkę komórkową zawieszono w lodowatej wodzie i inkubowano na lodzie przez 10 minut. Zawiesinę odwirowano następnie przez 5 minut przy 16000 x g i zebrano nadsącz (płyn wstrząsu osmotycznego). Dodano azydek sodu i Tris-HCl (pH 7,5) do stężenia końcowego, odpowiednio, 0,05% i 5θ mM. Płyn wstrząsu osmotycznego zawierający ludzkie białko ob przechowywano w -20°C do dalszego użycia.

Przykład 9

Ekspresja ludzkiego białka ob w E. coli (MC 1061)

Ekspresję ludzkiego białka ob uzyskano przez zastosowanie procedur przykładu 8, z wyjątkiem użycia triacyliny (100 μ g/ml) zamiast karbencyliny, jako dodatku do pożywki Luria-Bertani.

Przykład 10

Oczyszczanie ludzkiego białka ob z płynu osmotycznego E. coli

W celu oczyszczenia ludzkiego białka ob znajdującego się w płynie wstrząsu osmotycznego z przykładu 9, do płynu dodano NaCl do stężenia końcowego równego 0,1 M a następnie płyn wprowadzono bezpośrednio do kolumny zawierającej 30 ml złoża Q-Sepharose Fast Flow („Pharmacia”) zrównoważonej uprzednio buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5).

Następnie, do materiału uzyskanego po elucji z kolumny Q-Sepharose Fast Flow, dodano (NHą^SOą w postaci stałej do stężenia końcowego 1,0 M i mieszaninę wprowadzono do kolumny zawierającej 7,5 ml złoża Butylo-Sepharose Fast Flow („Pharmacia”) zrównoważonej uprzednio buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) zawierającym 1,0 M (NHąkSOą Po przepłukaniu buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) zawierającym 1,0 M (NHąhSO^ białko hob eluowano przez zastosowanie gradientu od 1,0 M (NHą^SOą w 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) do 20% glikolu etylenowego w wodzie. Białko hob eluowane z kolumny Butylo-Sepharose Fast Flow na samym końcu gradientu, podczas gdy większość zanieczyszczeń eluowana była znacznie wcześniej. Czystość białka hob na tym etapie wynosiła 90% co oceniono przez barwienie srebrem żelu poliakrylamidowego po elektroforezie (PAGE).

Białko hob w materiale eluowanym z kolumny zawierającej Butylo-Sepharose Fast Flow było dalej oczyszczane przez chromatografię filtracji żelowej. W tym celu ludzkie białko ob stężano w 4°C do objętości 1 ml na błonie YM10 („Amicon”) przy użyciu jednostki do stężania 8MC („Amicon”) i wprowadzono do kolumny (1,0 cm x 50 cm) zawierającej 39 ml Sephadexu G100 („Pharmacia”) zrównoważonej uprzednio roztworem fizjologicznym soli zbuforowanym fosforanem. Pulowano frakcje zawierające białko hob i zagęszczano na błonie YM10. Na tym etapie białko hob było 95% czystości co oceniono na podstawie PAGE i barwienia srebrem. SDS-PAGE ujawniła pojedynczy prążek białka o Mr 15000.

186 568

Przykład 11

Oczyszczanie ludzkiego białka ob z płynu osmotycznego E. coli

W celu oczyszczenia ludzkiego białka znajdującego się w płynie wstrząsu osmotycznego z przykładu 9 zastosowano procedurę według przykładu 10, z następującym wyjątkiem: przed dodaniem (NHą^SOą w postaci stałej do materiału wypływającego z kolumny przeprowadzono, w stosunku do płynu wstrząsu osmotycznego z przykładu 9, następujące etapy.

Ludzkie białko ob w płynie wstrząsu osmotycznego z przykładu 9 wprowadzono bezpośrednio do kolumny zawierającej 30 ml złoża Q-Sepharose Fast Flow („Pharmacia”) zrównoważonej uprzednio buforem 50 mM Tris-HCl (pH 7,5). Po przemyciu buforem 50 mM TrisHCl (pH 7,5) białko hob eluowano przy użyciu buforu 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 0,1 M NaCl.

Przykład 12

Analiza sekwencji ludzkiego białka ob

N-końcową sekwencję aminokwasową ludzkiego białka ob uzyskanego i oczyszczonego procedurami opisanymi w przykładach 7-11, opisanych powyżej wykonano według procedury Laemli, U.K., powyżej. Po elektrotransferze białek, rozdzielonych elektroforetycznie, na arkusz włókna szklanego opłaszczonego poli(jodkiem 4-winylo N-metylopirydyny) jak to opisano przez Bauw, G. i in., J. Biol. Chem. 7, 194-196 (1988), prążek białka o Mr 15000 wycięto z błony i określono N-końcową sekwencję aminokwasową degradacją Edmana na urządzeniu do sekwencjonowania w fazie gazowej 470A wyposażonym w połączony szeregowo fenylotiohydantoinowy analizator aminokwasów 120A („Applied Biosystems”). N-końcowa sekwencja aminokwasowa ludzkiego białka ob, uzyskanego w opisany powyżej sposób, którą stanowiły Val-Pro-Ile-Gln, odpowiadała dojrzałemu ludzkiemu białku ob o Identyfikatorze Sekw. Nr 6.

Przykład 13

Aktywność biologiczna mysiego białka ob:

Wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) myszy ob/ob

Aktywność biologiczną dojrzałego mysiego białka ob oczyszczonego według przykładu 5 określono przy użyciu metody ICV jak niżej. Kaniule mfuzyjne implantowano do komór bocznych mózgów samic otyłych myszy ob/ob (w wieku 6-13 tygodni) stosując następujące współrzędne (2 mm w bok od lini pośrodkowej; 0,6 mm w stosunku do ciemienia większego; 2 mm w dół) w oparciu o metodę Haleya i McCormicka, wyżej. Koniec kaniuli umocowano w czaszce przy użyciu wiertła jubilerskiego i spoiwa stomatologicznego. Myszy trzymano osobno w plastikowych klatkach z dowolnym dostępem do pożywienia (z wyjątkiem nocy poprzedzającej wstrzyknięcie ICV) i wody. Po dojściu do siebie po zabiegu chirurgicznym, co oceniono na podstawie dziennej ilości przyjmowanego pożywienia i przyrostu masy ciała, myszy badano kilkakrotnie po wstrzyknięciu dokomorowym (ICV) 1 pl jednego z poniższych roztworów badanych:

1) sztuczny CSF;

2) kontrolny roztwór bakteryjny;

3) białko ob (0,6 do 1 pg/mysz); albo

4) bez wstrzyknięcia.

Po wstrzyknięciu ICV jednego z powyższych roztworów badanych każdej z myszy następowało wstrzyknięcie 1 pl sztucznego CS F wcelu przeubacania kaniuli. Dlc celówtego eksperymentu, kontrolny roztwór bakteryjny był próbką przygotowaną w identyczny sposób, procedurami opisanymi w przykładach 2-4, z tym wyjątkiem, że plazmid wprowadzony do bakterii E. coli nie zawierał mysiego genu ob.

Myszy głodzono przez 18 godzin (przez noc) przed wstrzyknięciem ICV. Myszy delikatnie unieruchamiano zaś do wstrzyknięcia 1 pl badimegr rowtword dk kamuli umocwwanej w komorze bocznej używano 10 pl rtrzykwwki Humiltoó vp/posoπrnej w ^weku uzezedolo wykalibrowanej rurki (PE20) polietylenowej (PE). Następnie, myszy bezzwłocznie umieszczano w klatkach badawczych z naczyniem na pożywienie zawierającym uprzednio zważoną ilość granulowanej mysiej karmy i butelkę z wodą. Myszy obserwowano i mierzono ilość spożywanego pożywienia przez następne 7 godzin. Uzyskano pomiary przyjmowania

186 568 pożywienia w 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 i 7 godzin po wstrzyknięciu ICL. Masę ciała każdej z myszy mierzono przed wstrzyknięciem ICL i w 24 godziny później. Pomyślne umocowanie kaniuli potwierdzano zwiększeniem ilości przyjmowanego pożywienia w 2 godziny po podaniu ICL 10 pg Neuropeptydu Y myszom głodzonym przez 2 godziny, według Morley, J.E. i in., American J. Physiol. 253, 516-522 (1987).

Wyniki testu ICL opisanego powyżej przedstawiały się następująco:

A. Zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia

Podczas pierwszych 30 minut po podaniu ICL prawie wszystkie myszy jadły z krótkim opóźnieniem i przyjmowały około 0,5 grama pożywienia. Myszy, które nie otrzymały wstrzyknięcia albo które otrzymały sztuczny CSF jadły ciągle przez następne 6,5 godziny i osiągały całkowitą 7-godzinną. ilość przyjmowaną równą 3,5 grama (Tabela 1). W przeciwieństwie, myszy, które otrzymały ICL białko ob przestawały jeść po pierwszych 30 minutach i już nie jadły. Tak więc, ich całkowita ilość przyjmowanego pożywienia pozostawała zatrzymana przez następne 6,5 godziny na poziomie około 0,5 grama (Tabela 1). Myszy, które otrzymywały kontrolny nośnik ICL również przestawały jeść po 30 minutach, i zaczynały jeść ponownie pomiędzy 6 i 7 godziną.

B. Zmniejszenie przyrostu masy ciała

24-godzinna zmiana masy ciała myszy, którym podano kontrolny nośnik była nieco zmniejszona w porównaniu z myszami otrzymującymi sztuczny CSF lub nie otrzymującymi wstrzyknięcia (Tabela 1). Jednakże, procent zmiany w masie ciała myszy, którym podano białko ob był bliski zera i był znacząco zmniejszony u myszy, którym wstrzykiwano kontrolę nośnika (Tabela 1).

C. Wniosek

Obserwowany wpływ bezpośredniego podania rekombinowanego mysiego białka ob (1,1 pg/mysz w 1 pl domózgowo) przejawiał się zatrzymaniem lub znaczącym zmniejszeniem ilości przyjmowanego pożywienia i przyrostu masy ciała samic myszy ob/ob. Pokazuje to, że białko ob może działać bezpośrednio w mózgu i jest spójne z wpływem białka ob podawanym dootrzewnowo. Przykład ten potwierdza również aktywność biologiczną ekspresjonowanego w bakteriach rekombinowanego mysiego białka ob u samic myszy ob/ob według wynalazku.

Tabela 1

Działanie	Ilość przyjmowanego pożywienia (0-7 h)	Przyrost masy ciała (0-24 h)
	g	%**	g	%
Sztuczny CSF	3,2±0,2	100	3,8±0,3	100
Kontrola nośnika	0,9±0,3	28,1	2,9±0,2	76
Białko ob (1 pg/mysz)	0,5±0,1*	15,6	0,3±0,5*	8

* oznacza istotne różnice pomiędzy grupami białka ob i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) na poziomie p<0,05. ** oznacza procent kontroli.

Przykład 14

Aktywność biologiczna mysiego białka ob dożylnie (IL) na myszach ob/ob Aktywność biologiczną mysiego białka ob uzyskanego i oczyszczonego według przykładów 2, 3, 4 i 5 badano przez wstrzykiwanie dożylne (IL) otyłym myszom ob/ob, jak niżej. Otyłym samcom i samicom myszy ob/ob (w wieku 6-13 tygodni) wszczepiano kaniule do żyły podobojczykowej w narkozie pentobarbitalowej (80 mg/kg) według metody Mokhtarian A., i in., Physiol. Behav. 54. Myszy trzymano osobno w plastikowych klatkach w stałych warunkach otoczenia w cyklu oświetlenia 12 godzin ciemności i 12 godzin światła. Masy ciała mierzono codziennie zaś czynność kaniuli badano i utrzymywano przez codzienne wstrzykiwanie <0,1 ml sterylnego roztworu fizjologicznego soli z heparyną (50 U/ml w 0,9% soli). Po dojściu do siebie po zabiegu chirurgicznym, co oceniano przyrostem masy ciała,

186 568 myszy głodzono przez 16-18 godzin (przez noc). Następnego rana, myszy ważono i umieszczano w klatkach badawczych na 45 minut w celu aklimatyzacji przed doświadczeniem. Myszy miały swobodny dostęp do wody. Mysie białko ob (3 pg w 0,1 ml wody) albo równą ilość nośnika lub roztworu soli (0,9%) wstrzykiwano dożylnie. Przytomne myszy unieruchamiano delikatnie zaś do wstrzyknięcia 0,1 ml badanego roztworu, a następnie 0,05 ml roztworu heparyny w soli fizjologicznej używano 0,5 ml strzykawki insulinowej. Próby następowały w odstępach przynajmniej trzydniowych. Myszy bezzwłocznie umieszczano w klatkach badawczych z uprzednio zważonymi szalkami Petri'ego zawierającymi granulowaną mysią karmę. Myszy obserwowano i mierzono ilość przyjmowanego pożywienia przez następne siedem godzin w 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 i 7 godzin po wstrzyknięciu IV. Masę ciała mierzono przed wstrzyknięciem IV i ponownie po 24 godzinach. W pięciu niezależnych doświadczeniach użyto dwóch grup kantowanych myszy (12 ob/ob i 12 nieotyłych). Większość myszy otrzymała mysie białko ob oraz jeden lub oba wstrzyknięcia kontrolne w zrównoważonej kolejności. W doświadczeniu tym użyto dwóch osobnych preparatów mysiego białka ob. Przedstawione tu dane są zestawieniem wyników osobnych powtórzeń.

A. Wyniki

Wyniki powyższych eksperymentów przedstawiały się jak niżej:

Podczas pierwszych 30 minut po wstrzyknięciu IV większość otyłych i nieotyłych myszy jadło z krótkim opóźnieniem i spożywało od 0,3 do 0,5 g. Ilość przyjmowanego pożywienia u otyłych myszy, którym podano roztwór soli albo kontrolę nośnika, zwiększała się z upływem czasu trwania doświadczenia. Całkowita ilość przyjmowanego pożywienia u otyłych myszy ob/ob, którym podano kontrolę nośnika nie różniła się od ilości przyjmowanego pożywienia podobnie głodzonych otyłych myszy, którym podano roztwór soli. W przeciwieństwie, ilość przyjmowanego pożywienia u otyłych myszy ob/ob, którym wstrzyknięto rekom^nowane białko ob była znacząco zmniejszona i pozostawała zatrzymana na poziomie 57% kontroli (Tabela 2). Nie obserwowano żadnego innego wpływu na zachowanie w grupach, którym podawano kontrolę nośnika lub białko ob, w ciągu trwającego 7 godzin okresu obserwacji. Jak oczekiwano, przyrost masy ciała w 24 godziny po wstrzyknięciu nie różnił się między grupami (Tabela 2) z powodu ograniczonego czasu trwania pojedynczego bolusu IV mysiego białka ob.

B. Wnioski

Wyniki te pokazują, że Kombinowane mysie białko ob znacząco zmniejsza całkowitą ilość przyjmowanego pożywienia w ciągu 7 godzin po podaniu IV (3 pg/mysz) u otyłych myszy ob/ob. Zdolność rekombinowanego mysiego białka ob do zmniejszania ilości przyjmowanego pożywienia u otyłych myszy ob/ob jest spójna z wynikami dotyczącymi przyjmowania pożywienia uzyskanymi po powtarzanych wstrzyknięciach IP białka ob otyłym myszom ob/ob. Przykład ten potwierdza również aktywność biologiczną ekspresjonowanego w bakteriach rekombinowanego mysiego białka ob u samic otyłych myszy ob/ob.

Tabela 2

Podawanie IV my siego białka ob myszom ob/od

Działanie	Ilość przyjmowanego pożywienia (0-7 h)	Przyrost masy ciała (0-24 h)
	g	%*'	g	%
Roztwór fizj. soli (n=4)	1,8±0,2		2,9±0,3
Kontrola nośnika (n=7)	1,4±0,3	100	2,2±0,6	100
Białko ob (1 pg/mysz) (n=8)	0,8+0,2*	57	1,4±0,6*	64

Dane stanowią średnią ± sem. n oznacza liczbę myszy, sem oznacza „błąd standardowy średniej”, * oznacza istotne różnice pomiędzy grupami białka ob i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) na poziomie p<0,05, ** oznacza procent kontroli.

186 568

Przykład 15

Aktywność biologiczna mysiego białka ob

Powtarzane wstrzyknięcia IP myszom ob/ob

Aktywność biologiczną mysiego białka ob uzyskanego i oczyszczonego zgodnie z przykładami 2-5, badano przez powtarzane wstrzyknięcia dootrzewnowe (IP) otyłym myszom ob/ob w niżej opisany sposób.

Badano trzy grupy po sześć samic otyłych myszy ob/ob. Myszy trzymano w plastikowych klatkach (po trzy w klatce) w stałych warunkach otoczenia w cyklu dziennym 12 godzin ciemności/12 godzin jasności. Codziennie mierzono 24-godzinną ilość przyjmowanego pożywienia oraz masę ciała. Po okresie adaptacji do warunków otoczenia i codziennych zabiegów i wstrzyknięć, myszy rozdzielono do trzech grup. Każda z myszy otrzymywała dwa wstrzyknięcia dootrzewnowe dziennie (krótko przed zaczęciem i w trzy godziny po rozpoczęciu fazy ciemności) po 0,1 ml następujących roztworów badanych:

1) roztwór soli (0,9%);

2) bakteryjny roztwór kontrolny; albo

3) mysie białko ob (3 pg/mysz).

Bakteryjny roztwór kontrolny był próbką obrabianą identycznie i przygotowaną według proedur opisanych w przykładach 2-4, mających na celu otrzymanie i oczyszczenie mysiego białka ob, z takim wyjątkiem, że plazmid wprowadzony do bakterii E. coli pozbawiony był mysiego genu ob. Myszy otrzymywały wstrzyknięcia dwa razy dziennie przez pięć dni, po czym nie otrzymywały leczenia przez dwa dni. Ilość przyjmowanego pożywienia mierzona była 2, 3, 5 i 24 godziny po pierwszym wstrzyknięciu IP każdego dnia leczenia.

A. Wyniki

Zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia

Ilość przyjmowanego pożywienia nie różniła się w grupach otrzymujących roztwór soli i bakteryjny roztwór kontrolny w dniach leczenia i nieleczenia w trakcie doświadczenia trwającego tydzień (Tabela 3). Jednakże, ilość przyjmowanego pożywienia była zmniejszona u sześciu myszy, które otrzymywały 6 pg białka ob na dzień w trakcie doświadczenia. Zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia obserwowano w 2, 3, 5 i 24 godziny po pierwszym wstrzyknięciu w danym dniu w grupie myszy otrzymujących białko ob w porównaniu z grupami kontrolnymi.

Zmniejszenie przyrostu masy ciała

Całkowity przyrost masy ciała w ciągu pięciu dni leczenia w grupie otrzymującej białko ob wynosił -3.3 ± 0.7 grama, w porównaniu z -0,9 ± 0,2 grama w grupie otrzymującej roztwór soli i -0,7 ± 0,4 grama w grupie otrzymującej bakteryjny roztwór kontrolny (Tabela 3).

Wnioski

Przykład ten pokazuje, że dwa wstrzyknięcia IP dziennie ekspresjonowanego przez bakterie rekombinowanego mysiego białka ob (6 pg/mysz/dzień) powoduje istotne, trwałe zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia i w istotny sposób zmniejsza tempo przyrostu masy ciała leczonych samic ob/ob w porównaniu z myszami ob/ob leczonymi kontrolnie roztworem soli i bakteryjnym roztworem kontrolnym. Wyniki te pokazują, że ekspresjonowane w bakteriach mysie białko ob jest biologicznie czynne i posiada oczekiwany wpływ przeciw otyłości u genetycznie otyłych myszy ob/ob według niniejszego wynalazku. W Tabeli 3, wyniki z 2 i 5 godziny stanowią średnią dzienną ilość przyjmowanego pożywienia, podczas gdy wyniki w 24 godzinie są skumulowaną dzienną ilością przyjmowanego pożywienia.

186 568

Tabela 3

Powtarzane podawanie IP mysiego białka ob myszom ob/ob

Działanie	Ilość przyjmowanego pożywienia (gramy/ 3 myszy)	Przyrost masy ciała gramy
2 godziny	5 godzin	24 godziny
g	% kontr.	g	% kontr.	g	% kontr·.
Bez leczenia	5,5 ± 0,5	-	14,5 ± 0,5	-	44,3 ± 3,5	-	-0,9 ± 0,2
Kontrola	7,0 ± 0,5	100	16,5 ± 1,5	100	49,5 ± 6,1	100	-0,7 ± 0,4
Białko ob	3,5 ± 0,5*	50	5,5 ±10*	33	25,5 ± 4,6*	52	-3,3 ± 0,7*

Dane stanowią średnią ± sem dla sześciu myszy ob/ob w każdej grupie. Ilość przyjmowanego pożywienia jest średnią skumulowaną ilością dla klatek po trzy myszy podczas leczenia przez pięć dni, w 2, 5 i 24 godziny po pierwszym wstrzyknięciu IP.

Przyrost masy ciała stanowi skumulowaną zmianę masy ciała podczas leczenia przez pięć dni.

* oznacza różnicę istotną statystycznie na poziomie p<0,05 pomiędzy grupą otrzymującą białko ob w stosunku do grap otrzymujących kontrolę nośnika

Przykład 16

Aktywność biologiczna ludzkiego białka ob: wstrzyknięcie do komór mózgu (ICV) myszom ob/ob

Sposoby zastosowane w celu określenia aktywności biologicznej ludzkiego białka ob przez wstrzyknięcie do komór mózgu ICV myszom ob/ob były takie same jak w przykładzie 13, z takim wyjątkiem, że roztwory badane stanowiły:

• Rekombinowane ludzkie białko ob wytworzone w przykładzie 11 (0,05 pg) w roztworze fizjologicznym soli zbuforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 0,1% albuminę surowicy mysiej; i • PBS zawierający 0,1% (wag./obj.) albuminę surowicy mysiej (kontrola albuminy) jako roztwór kontroli nośnika.

A. Zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia

Podczas pierwszych 30 minut po podaniu iCv prawie wszystkie myszy jadły z krótkim opóźnieniem i przyjmowały około 0,5 grama pożywienia. Myszy, które nie otrzymały wstrzyknięcia albo które otrzymały sztuczny CSF jadły ciągle przez następne 6,5 godziny i osiągały całkowitą 7-godzinną ilość przyjmowaną równą 1,8 grama (Tabela 4). Myszy, które otrzymały kontrolę albuminy lCv również przestawały jeść po 30 minutach i zaczynały jeść między 3 i 7 godzną po podaniu. W przeciwieństwie, myszy, które otrzymały ICV białko ob jadły znacznie mniej w pierwszych 30 minutach (0,2 grama) i jadły bardzo mało podczas pozostałych 6,5 godzin. Tak więc, ich całkowita ilość przyjmowanego pożywienia pozostawała zatrzymana przez następne 6,5 godziny na poziomie około 0,4 grama (Tabela 4).

B. Zmniejszenie przyrostu masy ciała

24-godzinna zmiana masy ciała myszy, którym podano kontrolny nośnik była nieco zmniejszona w porównaniu z myszami otrzymującymi sztuczny CSF lub nie otrzymującymi wstrzyknięcia (Tabela 4). Jednakże, procent zmiany w masie ciała myszy, którym podano białko ob był bliski zera (Tabela 4).

C. Wniosek

Obserwowany wpływ bezpośredniego podania rekombinowanego ludzkiego białka ob (0,05 pg /mysz w 1 pl domózgowo) przejawiał się zatrzymaniem lub znaczącym zmniejszeniem ilości przyjmowanego pożywienia i przyrostu masy ciała samic myszy ob/ob. Pokazuje to, że białko ob może działać bezpośrednio w mózgu i jest spójne z wpływem białka ob podawanym dootrzewnowo. Przykład ten potwierdza również aktywność biologiczną ekspresjonowanego w bakteriach rekombinowanego mysiego białka ob u samic myszy ob/ob według wynalazku.

186 568

Tabela 4

Podawanie ICV ludzkiego białka ob myszom ob/ob

Działanie	Ilość przyjmowanego pożywienia (0-7 h)	Przyrost masy ciała (0-24 h)
	g	%’*	g	%
Bez wstrzyknięcia (n=3)	3,2 ± 0,2	100	3,8 ± 0,3	100
Kontrola albuminy (n=3)	0,9 ± 0,3	28,1	2,9 ± 0,2	76
Białko ob (1 pg/mysz) (n=5)	0,5 ±0j’	15,6	0,3 ± 0,5	8

Dane stanowią średnią ± sem. π oznacza liczbę zwierząt w grupie.

* oznacza istotne różnice pomiędzy grupami ludzkiego białka ob i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSS) na poziomie p<0,05 ‘♦oznacza procent kontroli.

Przykład 17

Aktywność biologiczna białka ob u otyłych ludzi: Zmniejszenie ilości przyjmowanego posiłku kontrolnego w następstwie podania IV

Aktywność biologiczną mysiego i ludzkiego białka ob, uzyskanego i oczyszczonego według, odpowiednio, przykładów 7-11 określano przez pomiar ilości przyjmowanego posiłku kontrolnego w następstwie podania IV, ludziom w niżej opisany sposób.

Szczupłym i otyłym ochotnikom podano dwukrotnie posiłki kontrolne o stałej ilości kalorii w laboratorium przy użyciu metody Mueraheiπeπ, N.E i in., wyżej. Przynajmniej na godzinę przed podaniem posiłku, w żyle przedramienia lub nadgarstka umieszczano cewnik dożylny i pozostawiano go zatkanym przy użyciu heparynizowanego kranika. Optyczno-analogową ocenę głodu uzyskano 15 minut przed, 15 minut po podaniu i na zakończenie posiłku kontrolnego. Mysie albo ludzkie białko ob lub roztwór soli wstrzykiwano IV 20 minut przed podaniem posiłan. Każdego z ochotników poinstruowano, aby jadł tak dużo posiłku kontrolnego jak tylko zechce. Zmierzono ilość zjedzonego przez każ.dą z osób badanych posiłku kontrolnego. Następnie każdy z ochotników otrzymał infuzję ludzkiego białka ob (0,5 mg/kg masy ciała), mysiego białka ob (0,5 mg/kg masy ciała) albo roztworu soli, po czym zmierzono różnicę w ilości posiłku kontrolnego spożytego w tych warunkach. W grupach otrzymujących ludzkie albo mysie białko ob obserwowano zmniejszenie ilości spożytego posiłku o co najmniej 20%.

Przykład 18

Aktywność biologiczna białka ob u ludzi otyłych:

Wywołanie utraty masy ciała przez powtarzane wstrzyknięcia IV

Aktywność biologiczna mysiego albo ludzkiego białka ob uzyskanego i oczyszczonego według, odpowiednio, przykładów 7-11, określono przez pomiar utraty masy ciała w następstwie powtarzanego podawania IV białka ob, w oparciu o niżej opisaną metodę.

Wykonano podwójnie ślepe, kontrolowane placebo badanie utraty masy ciała, przy użyciu metody Drenta, M.L. i in., wyżej. Otyli osobnicy, o wskaźniku masy ciała (bMi) wyższym niż 27, byli ważeni i zlecano im dietę z 1500 Kcal przez 2-4 tygodniowy okres wstępny. Na zakończenie okresu wstępnego, wszyscy osobnicy otyli, którzy utracili przynajmniej 1 kg, byli randomizowani do dwóch grup dobranych pod względem utraty wagi w fazie wstępnej. Osobnicy otrzymywali codzienne podanie IV ludzkiego albo mysiego białka ob (0,5 mg/kg masy ciała/dzień) albo placebo (roztwór soli) przez co najmniej 6 tygodni. Masę ciała notowano co tydzień. Osobnicy, którzy otrzymywali ludzkie albo mysie białko ob wykazywali znaczące zmniejszenie masy ciała w porównaniu z grupą otrzymującą placebo w trakcie ó-tygodniowego leczenia.

Przykład 19

A. Wytwarzanie sprzężonego z glikolem polietylenowym białka ob z komórek E. coli

50-gramowa peletka komórek E. coli przygotowana jak to opisano w przykładzie 8, przed ponownym zawieszeniem została zawieszona w 1 litrze 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) zawierającym 5 mM EDTA. Zawiesinę inkubowano przez 15 minut w 37°C, rozcieńczono

186 568 dodatkowym 1 1 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) zawierającym 5 mM EDTA. Następnie, zawiesinę homogenizowano przez 15 minut przy użyciu homogenizatora nastawionego na 50% mocy. Zawiesinę sklarowano przez odwirowanie przy 8000 rpm, 4°C, przez godzinę. Peletkę usunięto. Nadsącz rozcieńczono wodą do uzyskania przewodnictwa 1,8 mS i wprowadzono bezpośrednio do kolumny wypełnionej 200 ml Q-Sepharose Fast Flow (silnie anionową żywicą jonowymienną), zrównoważoną uprzednio 50 mM Tris-HCl (pH 8,5). Po przemyciu buforem do równoważenia, adsorbowane białko ob eluowano z kolumny tym samym buforem zawierającym dodatkowo 100 mM NaCl. Eluat, uzyskany po działaniu na kolumnę buforem do równoważenia, zawierającym chlorek sodu, nazwano Eluat Q-Sepharose.

Do Eluatu Q-Sepharose dodano NaCl w postaci stałej do osiągnięcia przewodnictwa 82 mS. Następnie, eluat wprowadzono do kolumny oddziaływań hydrofobowych (HIC) wypełnionej 200 ml butylo-Sepharose Fast Flow, zrównoważonej uprzednio 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) zawierającym 1 M NaCl. Nieadsorbowany materiał wymyto przy użyciu buforu do równoważenia zaś adsorbowane białko ob eluowano 50 mM octanem amonu (pH 6,9) tworząc eluat HIC. Białko ob w eluacie HIC było, jak określono met. HPLC z odwróconymi fazami, w 95% czyste. Oczyszczone białko ob stężono do 3,7 mg/ml przy użyciu błony frakcjonującej (YM-10). Błoną frakcjonującą była błona zatrzymująca cząstki wielkości 10000 i większe. Po etapie stężania przy użyciu błony frakcjonującej, białko ob diafiltrowano do 100 mM buforu boranowego (pH 8,0), który służył jako roztwór wyjściowy białka ob.

Reakcja „pegylowania” ludzkiego białka ob

W reakcji pegylowania stosowano reagent PEG2-NHS o wzorze II-A, w którym R oznacza CH3, suma n i n' w zakresie od 820 do 1040, ze średnią sumą około 930 i o średnim ciężarze cząsteczkowym 40000, produkt firmy Sherwater Polymers, Huntsville, Alabama. Była to mieszanina reagentów PEG2-NHS o wzorze II-A, w której stosunek n do n' wynosi w przybliżeniu 1,0, a suma n i n'jest w zakresie od 820 do 1040 jednostek, o średnim ciężarze cząsteczkowym łańcucha PEG w przybliżeniu 20000, tak że średni ciężar cząsteczkowy reagenta w przybliżeniu wynosi 40000, a średnia suma n i n' w mieszaninie wynosi około 930. Do 2 mg lub 0,54 ml podstawowego roztworu oczyszczonego ludzkiego białka ob o stężeniu 3,7 mg/ml przygotowanego jak opisano powyżej w części A (125 nmoli białka ob) dodano 250 nmoli powyższego roztworu reagentu PEG2-NHS. Roztwór ten zawierał 10 mg lub 0,1 ml roztworu reagenta PEG2-NHS o stężeniu 100 mg/ml w 1 mM HCl. Mieszaninę reakcyjną uzupełniono do 0,67 ml dodatkiem 100 mM boranu, pH 5,0. Końcowy stosunek molowy białka do reagentu wynosił 1:2. Mieszaninę mieszano w 4°C przez 4 godziny i zahamowano reakcję dodatkiem 1 pl lodowatego kwasu octowego uzyskując końcowe pH 4,5. Wytworzoną mieszaninę reakcyjną (0,67 ml) rozcieńczono wodą do objętości 27 ml i roztwór ten wprowadzono na kolumnę zawierającą. 1,7 ml karboksymetylowanej żywicy kationowymiennej (Perseptives, Framinham, Massachusetts). Kolumnę zrównoważono układem 3,3 pM HEPES/ MES/octan sodu - bufor, pH 5,0. Rozcieńczoną mieszaninę reakcyjną wprowadzono do kolumny i niezaadsorbowany reagent PEG2-NHS wymyto z kolumny. Zaadsorbowane pegylowane i niezmodyfikowane białka ob rozcieńczono gradientami soli (każdorazowo objętością równą 15 objętościom kolumny) 80, 150 i 500 mM NaCl. Oddzielnie zebrano kolejno 2 ml tych eluatów i próbki każdej frakcji poddano analizie SDS-PAGE. Na podstawie tej analizy eluaty oddzielono na wysoce pegylowane koniugaty, żądane rozgałęzione mono-PEG-ob (PEG2-ob) i niemodyfikowane białko ob. Każdą z tych frakcji zaklasyfikowano i zebrano w odpowiedniej puli jak powyżej. Żądane białko miało strukturę związku o wzorze I-A, w którym suma n i ń' wynosiła w przybliżeniu 820-1040, średnia suma około 930, R i R' oznaczają CH3, a średni ciężar cząsteczkowy każdego łańcucha PEG wynosił około 20000. Średni ciężar cząsteczkowy pegylowanego produktu wynosił około 56000. Pulę zawierającą PEG2-ob zatężono do 3,7 mg/ml stosując błonę YM 10. YM 10 jest to błona do ekskluzji ze względu na wielkość cząsteczek, która zatrzymuje cząsteczki o ciężarze cząsteczkowym 10 000 daltonów i wyższym. Po etapie ekskluzji zatężony materiał dializowano do buforu PBS (pH 7,3) i przechowywano w lodówce w -20°C. Produkt ten był pegylowanym białkiem ob o wzorze I-A, w którym suma n i n' wynosiła w przybliżeniu 820 do 1040, a średni

186 568 ciężar cząsteczkowy każdego łańcucha ob wynosił około 20000. Średni ciężar cząsteczkowy PEG białka w tej mieszaninie koniugatów białka ob wynosił 56000.

Przykład 20

Test biologiczny pegylowanego ludzkiego białka ob

Pojedyncze wstrzyknięcie IP myszom ob/ob

Metody

Badano dwie grupy po sześć samic otyłych myszy ob/ob. Myszy trzymano w plastikowych klatkach (trzy w klatce) w stałych warunkach otoczenia w cyklu dziennym 12 godzin ciemności/12 godzin jasności. Codziennie mierzono 24-goodzinną ilość przyjmowanego pożywienia oraz masę ciała. Po okresie adaptacji do warunków otoczenia i codziennych zabiegów i wstrzyknięć, myszy rozdzielono do trzech grup. Każda z myszy otrzymywała jedno wstrzyknięcia dootrzewnowe (IP) dziennie (krótko przed zaczęciem fazy ciemności) po 0,1 ml następujących roztworów badanych: roztwór soli (0,9%); roztwór wyjściowy ludzkiego białka ob wykonany w części A przykładu 19 (30 (ig/0,1 ml); pegylowany roztwór kontrolny (próbka przygotowana i obrabiana identycznie bez ludzkiego białka ob) albo pegylowane białko ob (30 pg/0,1 ml) przygotowane jak to opisano w przykładzie 19. Myszy otrzymawały tylko jedno wstrzyknięcie, dnia 1. Dzienną ilość przyjmowanego pożywienia na klatkę i masę ciała każdej z myszy mierzono przez następne trzy dni i ponownie dnia 6.

Wyniki

Zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia

Ilość przyjmowanego pożywienia nie różniła się w grupach otrzymujących roztwór soli i pegylowany roztwór kontrolny podczas pojedynczego leczenia oraz w dwóch kolejnych dniach (Tabela 5). Jednakże, ilość przyjmowanego pożywienia była zmniejszona u sześciu myszy, które otrzymały 30 pg ludzkiego białka ob i ludzkiego pegylowanego białka ob w dzień leczenia (5,2, 8,2 w stosunku do 11,9, 11,4 g) w porównaniu z kontrolą soli i kontrolą pegylacji. Ilość przyjmowanego pożywienia u myszy, które otrzymały ludzkie białko ob powróciła do wartości kontrolnych podczas gdy ilość ta u myszy, którym podano pegylowane ludzkie białko ob pozostawała zmniejszona w dniach następujących po doświadczeniu. Zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia obserwowano w 48 godzin po pojedynczym wstrzyknięciu w grupie myszy otrzymujących pegylowane ludzkie białko ob. Całkowita 24-godzinna ilość przyjmowanego pożywienia w ciągu trzech dni doświadczenia była w istotny sposób zmniejszona do 49% kontroli w grupie myszy otrzymujących pegylowane ludzkie białko ob w porównaniu z grupą otrzymyjącą kontrolę soli i kontrolę pegylacji.

Zmniejszenie przyrostu masy ciała

Zmiana w masie ciała nie różniła się w grupie otrzymującej kontrolę soli i kontrolę pegylacji po pojedynczym leczeniu i w dwóch kolejnych dniach (Tabela 6). Jednakże, masa ciała była zmniejszona u sześciu myszy, które otrzymały 30 pg ludzkiego białka ob i pegylowanego ludzkiego białka ob w dniu leczenia (-0,9, -0,7 w stosunku do 0,1, 0,3 g) w porównaniu z kontrolą soli i kontrolą pegylacji. Masa ciała myszy, którym podano ludzkie białko ob powróciła do poziomu kontrolnego, podczas gdy masa ciała myszy, które otrzymały pegylowane ludzkie białko ob zmniejszała się ciągle przez kolejne dni doświadczenia. Ciągłe zmniejszanie masy ciała obserwowano 48 godzin po pojedynczym wstrzyknięciu w grupie, która otrzymała pojedyncze wstrzyknięcie pegylowanego ludzkiego białka ob. Skumulowana zmiana masy ciała w ciągu sześciu dni doświadczenia wynosiła -1,6 grama w porównaniu z 0,4 grama w grupie, która otrzymała białko ob. 0,7 grama w grupie, która otrzymała sól i 1,1 ± 0,2 w grupie, która otrzymała kontrolę pegylacji (Tabela 6).

Wnioski

Przykład ten pokazuje, że pojedyncze wstrzyknięcie IP pegylowanego ludzkiego białka ob (30 pg/mysz) powoduje istotne, trwałe zmniejszenie ilości przyjmowanego pożywienia i w istotny sposób zmniejsza tempo przyrostu masy ciała leczonych samic ob/ob w porównaniu z myszami ob/ob w ciągu trzech dni w porównaniu z leczonymi kontrolnie roztworem soli i otrzymującymi kontrolę pegylacji. Wyniki te pokazują, że pegylowane ludzkie białko ob wywiera długotrwały i silny biologiczny wpływ i wywiera oczekiwany efekt przeciw otyłości u genetycznie otyłych myszy ob/ob według niniejszego wynalazku.

186 568

Tabela 5

Dzienna ilość przyjmowanego pożywienia po pojedynczym wstrzyknięciu IP pegylowanego ludzkiego białka ob u otyłych myszy ob/ob

Działanie	Ilość przyjmowanego pożywienia (3 myszy/ dzień)
dzień 1	dzień 2	dzień 3
g	% kontr.	g	% kontr.	g	% kontr.
Sól fizjologiczna	11,9	100	13,7	100	13,6	100
Białko ob	5,2	43,7	11,7	85,4	12,5	92
Kontrola pegylowana	11,4	95,8	4,5	106	13,4	99
Pegylowane białko ob	8,2	68,9	6,0	43,8	4,9	36

Dane stanowią średnią dla sześciu myszy ob/ob w każdej grupie. Ilość przyjmowanego pożywienia jest średnią dzienną ilością pożywienia dla klatek po trzy myszy każdego dnia eksperymentu po pojedynczym wstrzyknięciu IP dnia 1. Warte zauważenia jest przetrwale zmniejszenie dziennej ilości przyjmowanego pożywienia wyłącznie w grupie, która otrzymała pegylowane białko ob.

Tabela 6

Zmiana masy ciała po pojedynczym podaniu IP pegylowanego ludzkiego białka ob myszom ob/ob

Działanie	Zmiana masy ciała (gramy)
	dzień 1	dzień 2	dzień 3	dzień 6
Sól fizjologiczna	0,1	0,6	0,01	-0,01
Białko ob	-0,9	1,1	0,2	ND
Kontrola pegylowana	0,3	0,4	0,6	-0,2
Pegylowane białko ob	-0,7	-0,6	-0,9	0,6

Dane stanowią średnią dla sześciu myszy ob/ob w każdej grapie. Myszy otrzymały pojedyncze wstrzyknięcie dnia 1 Zmiana w masie ciała jest zmianą w masie ciała w każdym z dni doświadczenia. Warte zauważenia jest przetrwale zmniejszenie masy ciała wyłącznie w grupie, która otrzymała pegylowane białko ob.

ND oznacza „Nie oznaczano”.

186 568

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) ULICA: Grenzacherstrasse 124 (C) MIASTO: Baylea (D) STAN: BS (E) KRAJ: Szwajcarii (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CH-4070 (G) TELEFON: 061-688 42 65 (H) TELEFAKS: 061-688 13 95 (I) TELEKS: 962292/965542 hl ch (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Białka, Wektory Ekspresyjne, Białka Fuzyjne, Sekwencje DNA, Stransformowane Komórki E Coli, Kompozycje i Rekombinowane Białka Otyłości (ob).

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Apple Macintosh (C) SYSTEM OPERACYJNY: Sysytem 7.1 (Macintosh) (D) OPROGRAMOWANIE: Word 5.0 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 702 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Nr: 1

CAAGGTGCAA	GAAGAAGAAG	ATCCCAGGGA	GGAAAATGTG	TTGGAGACCC	CGGGGTCGGT	60
TCCTGTGGCT	TTGGTCCTAT	CTGTCTTAAG	TTCAAGCAGT	GCCTTATTCAG	AAAGTCCAGG	120
ATGACACCAA	AACCCTCATC	AAGACCATTG	TCACCAGGAT	CTA.T^TjG.C^AT^T?	TCACACACGC	180
AGTCGGTATC	CGCCAAGCAG	AGGGTCACTG	GCTTGGACTT	CTATTCCGGG	CTTCACCCCA	240
TTCTGAGTTT	GTCCAAGATG	GACCAGACCT	TGGCAGTCTA		CTCACCAGCC	300
TGCCTTCCCA	AAATGTGCTG	CAGATAGCCA	atgacctgga		GACCGCCTCC	360
ATCTGCTGGC	CTTCTCCAAG	AGCTGCTCCC	TGCCTCAGAC	CAATCX3CCCG	CAGAAGCCAG	420

186 568

ACACCCTCCA	TCCCCTCCTC	GAAGCCCTAC	TCTGCTACCA	AGCAATGGTA	gctttgagca	480
CCCTCCACCC	CTCTCTCCAC	GACATTTTTT	CGCGATTCCG	TGTTAGCCCT	GAATGCTGAA	540
CTTTCAAACC	CCACCACCCT	CCCGGCCGTC	AAGCACAAAG	GAGCACCCTT	σσ0ΤΤ€0ΑΟ3	600
COTCTTCACC	ACAACACACC	CACGAGCACA	CATCAGTAGT	TCATTTCTCT	GCCTCCTGTA	6(50
CACCACCCAT	CCAAACCCAT	AACTCAAAAU	TACTTAGATC	AA		702

(2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 167 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Mr : 2

Met 1

Cys

Trp

Arg

Osg 5

Les Cys Arg Ohe

Leu 10

Spa

sit

Plt

S it

Slo 15

seu

Ser

Tyy

Val

Vln

Ala

nal

Pra

liii

r ln

Osg

VaL

Gln

Asi

Asp

Thr

Lys

20

25

30

Thr

Llu

Ile

Lys

Thr

Ile

Llel

Thr

Arrg

ASl

Asn

Sas

lLe

Ser

HHi

Thr

35

44

45

Cln

Stu

Val

Sar

Alei

Lys

Gln

Arg

Val

The

Gly

S eu

Cry

Phe

Ile

eso

50

55

60

Cly

Les

Hls

Pro

Ile

Leu

Ser

Leu

S er

Lys

Met

Asp

Gln

Thr

Leu

Ala

65

0l

77,

80

Val

Tyr

Cln

Gln

VaS

Leu

Thr

Ser

Leu

Pro

Seo

Gln

Asi

Val

L eu

Gln

85

90

55

Ile

AAr

Asn

Leu

P lu

Ass

Leu

Ulg

Asn

Leo

snu

His

Leu

Ala

100

105

110

Ohe

Sse

Lys

Ler

Cys

SCr

Leu

Pro

SOn

Us

Sss

ny

lou

Gln

Loy

Pro

115

120

125

Cls

Sue

Leu

Ass

Gly

Val

Leu

Glu

A la

Aer

Leu

Tyr

Ser

The

Tir

rsS

130

135

114

Val

Ala

Les

Sur

ArA

L au

Gln

Gly

S lr

C^ey

Gln

Asp

lSl

Leu

G ln

Gln

145

50l

155

HO

Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys 165

186 568 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 146 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Nr: 3

Val 1

Pro

IIe

Gin

Lys 5

VaS

Gln

Asp

Ths 0 S

Lys

Thr

Lru

Uli

Lys 15

Thr

Ile

Val

Thr

Arg 20

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser 25

Hss

TIus

Gln

Ser

Vaa 30

Ser

Ala

Lys

Gln

Arg 35

Val

Thr

Gly

Llu

Urp 40

Phe

Ihe

lro

Gly

L eei 45

Hii

Pro

Ile

Leu

Ser 50

Leu

Ser

Lys

Met

AAp 5 S

Gin

Thr

Leu

Ala

Val 60

Tyr

GGn

Gin

Val

Leu 65

Thr

Ssu

Leu

Pro

S er 75

Gln

Asn

Val

Leu

Gin 75

IIe:

Ala

Aas

Asp

Ler 80

Glu

Asn

Llu

Arg

Asp 85

Leu

Llu.

His

Leu

Leu 95

Ala

PPr

Sur

Llu

Srr 95

Cys

Ser

Leu

Ppu

Gin 100

Thr

Ser

GGl

Ler

Gin 105

Lys

Pro

Glu

Ser

Llu 111

Asp

Gly

Val

Leu

Glu 115

Ala

Sse·

Leu

Lyr

Ser 120

Thr

Thu

Vr 1

Val

A la 122

Ler

Ser

Arg

Leu

Gin 130

Gly

SSr

Llu

Gln

AAs 135

Ile

Leu

Gln

Leu 140

Asp

Val

Ser

Pro

Glu Cys 145 (2) INFFRRACJA DD IDENTYFIKATORA SEKK. Nr 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 690 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NDJDOWOŚĆ: pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) AFOFSENS: nie

186 568 (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Nr: 4

GTTGCAAGGC	CCAAGAAGCC	CATCCTGGGA	AGGAAAATGC	ATTGGGGAAC	CCTGTGCGGA	60
TTCTTGTGGC	TTTGGCCCTA	TCTTTTCTAT	GTCCAAGCTG	TGCCCATCCA	AAAAGTCCAA	120
GATGACACCA	AAACCCTCAT	CAAGACAATT	GTCACCAGGA	TCAATGACAT	TTCACACACG	180
CAGTCAGTCT	CCTCCAAACA	GAAAGTCACC	GGTTTGGACT	TCATTCCTGG	GCTCCACCCC	240
ATCCTGACCT	TATCCAAGAT	GGACCAGACA	CTGGCAGTCT	ACCAACAGAT	CCTCACCAGT	300
atgccttcca	GAAACGTGAT	CCAAATATCC	AACGACCTGG	AGAACCTCCG	GGATCTTCTT	360
CACGTGCTGG	CCTTCTCTAA	GAGCTGCCAC	TTGCCCTGGG	CCAGTGGCCT	GGAGACCTTG	420
GACAGCCTGG	GGGGTGTCCT	GGAAGCTTCA	GGCTACTCCA	CAGAGGTGGT	GGCCCTGAGC	480
AGGCTGCAGG	GGTCTCTGCA	GGACATGCTG	TGGCAGCTGG	ACCTCAGCCC	TGGGTGCTGA	540
GGCCTTGAAG	GTCACTCTTC	CTGCAAGGAC	TACGTTAAGG	GAAGGAACTC	TGGCTTCCAG	600
GTATCTCCAG	GATTGAAGAG	CATTGCATGG	ACACCCCTTA	TCCAGGACTC	TGTCAATTTC	660
CCTGACTCCT	CTAAGCCACT	CTTCCAAAGG				690

(2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 167 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (Lii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Nr: 5

Met 1

His

Trp

Gly

Thr 5

Leu

Cys

Gly

Phe

Leu 10

Trp

Leu

Trp

Piro

Tyr 15

Leu

Phe

Tyr

Val

Gln 20

Ala

Val

Pro

lle

Gln 25

Lys

Val

Gln

A^sp

Asp 30

Thr

Lys

Thr

Leu

Ile 35

Lys

Thr

lir

Val

Thr 40

Arg

Ile

Asn

Asp

Ile 45

Ser

His

Thr

Gln

Ser 50

Val

Ser

err

Lyr

Gin 55

Lys

Val

Thr

Gly

Leu 60

Asp

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu

His

Pro

lle

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Ali

70 75 80

186 568

Val Tyr Gln Gln Ile Leu Thr	Ser Met	Pro Ser Arg Asn Val 90	Ile Gln 95
	85
Ile Ser Asn Asp	Leu Glu Asn	Leu Arg	Asp Leu Leu His Val	Leu Ala
100		105	110
Phe Ser Lys Ser	Cys His Leu	Pro Trp	Ala Ser Gly Leu Glu	Thr Leu
115		120	125
Asp Ser Leu Gly	Gly Val Leu	Glu Ala	Ser Gly Tyr Ser Thr	Glu Val
130	135		140
Val Ala Leu Ser	Arg Leu Gln	Gly Ser	Leu Gln Asp Met Leu	Trp Gln
145	150		155	160
Leu Asp Leu Ser	Pro Gly Cys
	165
(2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 6
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ	: 146 aminokwasów
(B) RODZAJ:	aminokwas
(C) NICIOWOŚĆ: nie istotna
(D) TOPOLOGIA: nieznana
(ii) RODZAJ	CZĄSTECZKI: peptyd
(iii) HIPOTETYCZNA: nie
(iv) ANTYSENS: nie
(xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Nr: 6

Val 1

Pro

Ile

Gln

Lys 5

Val

Gln

Asp

Thr 10

Lys

Thr

Leu

Ile

Lys 15

Thr

Ile

Val

Thr

Arg 20

Ile

Asn

Asp

Ile

Ser 25

His

Thr

Gln

Ser

Val 30

Ser

Lys

Gln

Lys 35

Val

Thr

Gly

Leu

Asp 40

Phe

Ile

Pro

Gly

Leu 45

His

Pro

Ile

Leu

Thr 50

Leu

Ser

Lys

Met

Asp 55

Gln

Thr

Leu

Ala

Val 60

Tyr

Gln

Ile

Leu 65

Thr

Ser

Met

Pro

Ser 70

Arg

Asn

Val

Ile

Gln 75

Ile

Ser

Asn

Asp

Leu 80

Glu

Asn

Leu

Arg

Asp 85

Leu

His

Val

Leu 90

Ala

Phe

Ser

Lys

Ser 95

Cys

His

Leu

Pro

Trp 100

Ala

Ser

Gly

Leu

Glu 105

Thr

Leu

Asp

Ser

Leu 110

Gly

Val

Leu

Glu 115

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ser 120

Thr

Glu

Val

Ala 125

Leu

Ser

Arg

186 568

Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140

Gly Cys

145 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 7 (1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Nr: 7

ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG

GCC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nie istotna (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI IDENTYFIKATOR SEKW Nr: 8

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 15 10 15

Thr Val Ala Gin Ala 20

186 568

R'OCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_i-0-C-NH (CH₂)₄

I-A

CH

ROCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_n-O-C-NH

C-NH- p

O

RO(CH₂CH₂O)_nCH₂ CH2 -C -NH- P

I-B

R'OCH₂CH₂(OCH₂CH₂)--o-C-NH (CH^

ROCH₂CH2(OCH2CH2)_n-O

II-A

RO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂ -C

N.

Π-B

186 568

FIG.1

186 568

FIG.2

186 568

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Homogenne, biologicznie czynne ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6 lub jego fragment, który wykazuje biologiczną aktywność tego białka.
2. Białko albo jego fragment, według zastrz. 1, znamienne tym, że biologiczna aktywność białka albo fragmentu charakteryzuje się zmniejszeniem ilości przyjmowanego pożywienia u ssaków i zmniejszeniem przyrostu masy ciała u ssaków.
3. Rekombinowane, biologicznie czynne ludzkie białko otyłości wolne od innych białek ssaków obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, lub jego fragment, o biologicznej aktywności tego białka.
4. Białko albo jego fragment, według zastrz. 3, znamienne tym, że jego biologiczna aktywność charakteryzuje się zmniejszeniem ilości przyjmowanego pożywienia u ssaków i zmniejszenia przyrostu masy ciała u ssaków.
5. Wektor ekspresyjny, obejmujący:

a) sekwencję promotorową, i

b) sekwencję DNA kodującego białko fuzyjne, które obejmuje ludzkie białko ob o Id. Sekw. nr 6, oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej E. coli, przy czym wektor ten jest zdolny do ekspresjonowania białka fuzyjnego w komórkach gospodarza E. coli.
6. Wektor ekspresyjny, według zastrz. 5, w którym sekwencja promotorową składa się z promotora operatora lac i promotora lipoproteiny.
7. Białko fuzyjne zawierające ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6 oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej Escherichia coli.
8. Sekwencja DNA zawierająca pierwszą i drugą część, w której:

(a) pierwsza część jest sekwencją genu sOmpA o Id. Sekw. nr 7, kodującą peptyd sOmpA; i (b) druga część jest sekwencją nukleotydową o Id. Sekw. nr 4 kodującą ludzkie białko ob, pozbawioną części sekwencji nukleotydowej kodującej naturalną sekwencję sygnałową.
9. Organizm gospodarza Escherichia coli transformowany wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 5.
10. Sposób wytwarzania biologicznie czynnego, rekombinowanego ludzkiego białka otyłości, wolnego od innych białek ssaka, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) konstruowanie wektora ekspresyjnego posiadającego sekwencję promotorową oraz sekwencję DNA kodującego białko fuzyjne, które obejmuje sekwencję o Id. Sekw. nr 6, oraz peptyd sygnałowy białka A błony zewnętrznej E. coli;

b) wprowadzanie wektora ekspresyjnego do komórki gospodarza E. coli w celu jej transformowania;

c) ekspresjonowanie białka fuzyjnego w komórkach gospodarza E. coli; i

d) działanie na komórkę gospodarza E. coli buforem do zimnego wstrząsu osmotycznego w celu uwolnienia ludzkiego białka ob, wolnego od innych białek ssaka i wolnego od peptydu sygnałowego; oraz

e) poddanie płynu osmotycznego zawierającego ludzkie białko otyłości kombinacji następujących procesów: chromatografii kolumnowej anionowymiennej, chromatografii kolumnowej z oddziaływaniem hydrofobowym i filtracji żelowej, w wyniku których otrzymuje się homogenne, biologicznie czynne rekombinowane ludzkie białko otyłości obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6.

186 568
11. Sekwencja ludzkiego genu ob obejmująca Id. Sekw. nr 4.
12. Kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej koniugatów glikolu polietylenowego i/lub glikolu polipropylenowego związanego z ludzkim białkiem ob obejmującym sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, o średnim ciężarze cząsteczkowym jednostek glikolu polietylenowego albo polipropylenowego w koniugacie rzędu od 15000 do 60000.
13. Kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-A, w którym P oznacza ludzkie białko ob obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, n i n' są liczbami całkowitymi, których suma wynosi od 300 do 1500, a średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R i R' oznacza niższą grupę alkilową.
14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że suma n i n' wynosi od około 800 do 1200, zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie 35000 do 45000.
15. Kompozycja do leczenia, zapobiegania i kontrolowania otyłości oraz chorób towarzyszących, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej koniugatów o wzorze I-B, w którym P oznacza ludzkie białko ob obejmujące sekwencję aminokwasową o Id. Sekw. nr 6, określone w zastrz. 1 do 4, n jest liczbą od 300 do 1500, średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie od 15000 do 60000, zaś R oznacza niższą grupę alkilową.
16. Kompozycja według zastrz. 15, znamienna tym, że n zawiera się między 850 a 1000, zaś średni ciężar cząsteczkowy jednostek glikolu polietylenowego w koniugacie w kompozycji jest w zakresie pomiędzy 35000 a 45000.