NO328554B1

NO328554B1 - Monoklonale ape-antistoffer som er spesifikke for primatiserte humane B7.1- og/eller B7.2-former, samt anvendelse derav og farmasoytiske sammensetninger omfattende slike

Info

Publication number: NO328554B1
Application number: NO19975598A
Authority: NO
Inventors: Nabil Hanna; Darrell R Anderson; Peter Brams; Willaim S Shestowsky
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 2010-03-22
Also published as: AU6331296A; JP4242451B2; WO1996040878A1; CA2223532A1; UY24256A1; EP1914301A1; IL122370A0; YU35996A; US20010024648A1; CN100379855C; ATE384125T1; NO975598L; CN101367877A; SA96170473B1; BR9609035A; US6709654B1; EP0837927A1; KR100496307B1; IL122370A; ZA964547B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonalt ape-antistoff, en primatisert form derav eller et fragment av det monoklonale ape-antistoffet og som har de særtrekk som er angitt i krav 1. Slike ape-antistoffer kan være javaapeantistoffer mot humant B7, dvs. humant B7.1 og humant B7.2, og som fremstilles ved utvelgelse fra fagfremvisningssamlinger og apeheterohybridomaer ved bruk av B-lymfocytter som erholdes fra B7-immuniserte aper.

Oppfinnelsen vedrører dessuten spesifikke primatiserte antistoffer av den type som er forklart ovenfor og som bindes til humant B7, dvs. humant B7.1 og B7.2 og deres tilsvarende aminosyre- og nukleinsyresekvenser.

Foreliggende oppfinnelse vedrører dessuten farmasøytiske blandinger som inneholder slike monoklonale ape-antistoffer eller primatiserte antistoffer som er spesifikke for humant B7.1 og/eller humant B7.2, og deres bruk til fremstilling av immunosuppressive midler som modulerer B7:CD28-banen, f.eks. til behandling av autoimmune forstyrrelser og forebyggelse av organutstøtning.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Man har lenge vært oppmerksom på det kliniske grensesnitt mellom immunologi, hematologi og onkologi. Mange tilstander som behandles av hematologer eller onkologer, har en enten autoimmun eller immunosviktkomponent i sin patofysiologi, og dette har ført til en omfattende bruk av immunosuppressive legemidler av hematologer, mens onkologer har søkt etter immunologiske hjelpestoffer som kan bedre den endogene immunitet mot svulster. Inntil i dag har disse inngrep generelt bestått av ikke-spesifikke former for immunosuppresjon og immunstimulering. I tillegg til at denne type inngrep har en begrenset virkning, har også deres toksisitet i tillegg til deres ikke-spesifisitet, begrenset deres fremgang. Derfor har man søkt etter alternative strategier. En utredning av den funksjonelle rolle av et raskt stigende antall celleoverflatemolekyler har bidratt sterkt til integrasjonen av immunologien i den kliniske hematologi og onkologi. Nærmere 200 celleoverflateantigener er blitt identifisert på celler av immunsystemet og det hematopoetiske system (Schlossman, S.F.; Boumsell, L.; Gilks, J.M.; Harlan, T.; Kishimoto, C.; Morimoto, C; Ritz, J.; Shaw, S.; Silverstein, R.L.; Springer, T.A.; Tedder, T.F.; Todd, R.F.: CD antigens (1993), Blood 83: 879, 1994). Disse antigener representerer både molekyler med begrenset avstamming og mer vidt spredte molekyler som er innblandet i diverse prosesser, bl.a. cellegjenkjenning, adhesjon, induksjon og vedlikehold av proliferasjon, cytokinutsondring, effektorfunksjon og t.o.m. celledød. Forståelsen for de funksjonelle attributter for disse molekyler har ført til nye forsøk på å manipulere immunresponsen. Selv om molekyler som er innblandet i den cellulære adhesjon og antigenspesifikke gjenkjenning, tidligere er blitt vurdert som målmolekyler for terapeutiske immunologiske inngrep, har oppmerksomheten i den senere tid vært fokusert på en undergruppe av celle-flatemolekyler som benevnes ko-stimulatoriske molekyler

(Bretscher, P.: "The two-signal model of lymphocyte activation twenty-one years later", Immunol. Today 13: 73 (1992); Jenkins, M.K.; Johnson, J.G.: "Molecules involved in T-cell co-stimulation", Curr. Opin. Immunol., 5: 351, 1993; Geppert, T.; Davis, L.; Gur, H.; Wacholtz, M.; Lipsky, P.: "Accessory cell signals involved in T-cell activation", Immunol. Rev., 117: 5 (1990); Weaver, C.T.; Unanue, E.R.: "The co-stimulatory function of antigen-presenting cells", Immunol. Today 11: 49 (1990); Stennam, R.M., Young, J.W.: "Signals arising from antigen-presenting cells", Curr. Opin. Immunol. 3: 361 (1991)). Kostimulatoriske molekyler utløser ikke, men muliggjør heller en generering og amplifikasjon av antigenspesifikke T-celleresponser og effektorfunksjoner (Bretscher, P.: "The two-signal model of lymphocyte activation twenty-one years later", Immunol. Today 13: 73 (1992); Jenkins, M.K.; Johnson, J.G.: "Molecules in-

volved in T-cell co- stimulation", Curr. Opin. Immunol. 5: 351 (1993); Geppert, T.; Davis, L.; Gur H.; Wacholtz, M.; Lipsky, P.: "Accessory cell signals involved in T-cell activation", Immunol. Rev. 117: 5 (1990); Weaver, C.T.; Unanue, E.R.: "The co-stimulatory function of antigen-presenting cells", Immunol. Today 11: 49 (1990); Stennam, R.M.; Young, J.W.: "Signals arising from antigen-presenting cells", Curr. Opin. Immunol. 3: 361 (1991); June, C.H.; Bluestone, J.A., Linsley, P.S., Thompson, C.D.: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation", Immunol. Today 15: 321 (1994)).

Forskjellige forskningsgrupper har nylig undersøkt en bestemt kostimulatorisk bane som benevnes B7:CD28, fordi denne spiller en vesentlig rolle ved B- og T-celleaktivering (June, C.H.; Bluestone, J.A.; Linsley, P.S.; Thompson, C.D.: "Role of the CD28 receptor in T-cell activation", Immunol. Today 15: 321 (1994); June, C.H.; Ledbetter, J.A.: "The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen", Annu. Rev. Immunol. 11: 191 (1993); Schwartz, R.H.: "Co-stimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy", Cell 71: 1065 (1992)). Etter at denne ligand:receptor-bane ble oppdaget for fire år siden, har det nå samlet seg opp mange tegn som tyder på at B7:CD28-vekselspill representerer en av de kritiske punkter for opptreden av immunreaktivitet vs. anergi (June, C.H.; Bluestone, J.A.; Linsley, P.S.; Thompson, C.D.: "Role of the CD28 receptor during T-cell activation", Immunol. Today, 15:321 (1994); June, C.H.; Ledbetter, J.A.: "The role of the CD28 receptor during T-cell responses to antigen", Annu. Rev. Immunol. 11: 191 (1993); Schwartz, R.H.: "Co-stimulation of T lymphocytes: The role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy", Cell 71: 1065 (1992); Cohen, J.: "Mounting a targeted strike on unwanted immune responses", (news; comment). Science 257: 751 (1992); Cohen, J.: "New protein steals the show as 'co-stimulator' of T cells", (news; comment). Science 262: 844 (1993)). Spesielt er det beskrevet at humane B7-antigener, dvs. humant B7.1 og B7.2, spiller en kostimulatorisk rolle ved T-celleaktivering.

1. Den kostimulatoriske rolle av B7.1 og B7.2 ved T-celleaktivering

Utarbeidelsen av en fremgangsrik immunrespons er avhengig av en rekke bestemte vekselvirkninger mellom en T-celle og en antigenpresenterende celle. Selv om det vesentlige førs-te trinn i denne prosess er avhengig av at antigenet bindes til T-cellereceptoren, er i sammenheng med MHC klasse II-molekylet (Lane, P.J.L.; F.M. McConnell, G.L. Schieven, E.A. Clark og J.A. Ledbetter (1990): "The Role of Class II Molecules in Human B Cell Activation", The Journal of Immunology 144: 3684-3692), denne vekselvirkning i og for seg ikke tilstrekkelig for å indusere alle hendelsene som er nødvendige for en vedvarende respons på et gitt antigen (Schwartz, R.H. (1990): "A Cell Culture Model for T Lymphocyte Clonal Anergy", Science, 248: 1349; Jenkins, M.K.

(1992): "The Role of Cell Division in the Induction of Clonal Anergy", Immunology Today, 13: 69; Azuma, M.; M. Catabyab, D. Buck, J.H. Phillips og L.L. Lanier (1992): "Invol-vement of CD28 in MHC-unrestricted Cytotoxicity Mediated by a Human Natural Killer Leukemia Cell Line", The Journal of Immunology, 149: 1556-1561; Azuma, M.; M. Catabyab, D. Buck, J.H. Phillips og L.L. Lanier (1992): "CD28 Interaction with B7 Costimulates Primary Allogeneic Proliferative Responses and Cytotoxicity Mediated by Small Resting T Lymphocytes", J. Exp. Med., 175: 353-360).

Innblandingen av visse andre kostimulatoriske molekyler er nødvendig (Norton, S.D.; L. Zuckerman, K.B. Urdahl, R. Shefner, J. Miller og M.K. Jenkins (1992): "The CD28 Ligand, B7, Enhances IL-2 Production by Providing A Costimulatory Signal to T Cells", The Journal of Immunology, 149: 1556-1561). Homodimerene CD28 og CTLA-4 som uttrykkes på T-celler (June, C.H.; J.A. Ledbetter, P.S. Linsley og C.B. Thompson (1990): "Role of the CD28 Receptor in T-Cell Activation", Immunology Today, 11: 211-216; Linsley, P.S.; W. Brady, M. Urnes, L.S. Grosmaire, N.K. Damle og J.A. Ledbetter (1991): "CTLA-4 is a Second Receptor for the B Cell Activation Antigen B7", J. Exp. Med., 174: 561), sammen med B7.1 (CD80) og B7.2 (CD86) som uttrykkes på antigenpresenterende celler, er viktige kostimulatoriske molekylpar som er nødvendige for en vedvarende immunrespons (Azuma, M.; H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits og L.L. Lanier (1993): "Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845-850; Freeman, G.J.; A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman og L.M. Nadler

(1989): "B7, A New Member of the lg Superfamily with Unique Expression on Activated and Neoplastic B Cells", The Journal of Immunology, 143: 2714-2722; Hathcock, K.S.; G. Laslo, H.B. Dickler, J. Bradshaw, P. Linsley og R.J. Hodes

(1993): "Identification of an Alternative CTLA-4 Ligand Costimulatory for T Cell Activation", Science 262: 905-911; Hart, D.N.J.; G.C. Starling, V.L. Calder og N.S. Fernando

(1993): "B7/BB-1 is a Leucocyte Differentiation Antigen on Human Dendritic Cells Induced by Activation", Immunology 79: 616-620). Det kan vises in vitro at fraværet av disse kostimulatoriske signaler fører til en avbrutt T-celleakti-veringsbane og utvikling av en responsmangel på det spesifikke antigen, dvs. til anergi (jfr. f.eks. Harding, F.A.; J.G. McArthur, J.A. Gross, D.M. Raulet og J.P. Allison

(1992): "CD28 Mediated Signalling Co-stimulates Murine T Cells and Prevents Induction of Anergy in T Cell Clones", Nature, 356: 607-609; Gimmi, C.D.; G.J. Freeman, J.G. Gribben, G. Gray og L.M. Nadler (1993): "Human T-Cell Clonal Anergy is Induced by Antigen Presentation in the Absence of B7 Costimulation", Proe. Nati. Acad. Sei., 90: 6586-6590; Tan, P.; C. Anasefti, J.A. Hansen, J. Melrose, M. Brunvand, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter og P.S. Linsley (1993): "Induction of Alloantigen-specific Hyporesponsiveness in Human T Lymphocytes by Blocking Interaction of CD28 with Its Natural Ligand B7/BB1", J. Exp. Med., 177: 165-173). Oppnåelsen av en in vivo-toleranse utgjør en mekanisme for immunosuppresjon og en levedyktig terapi for organtrans-plantatutstøtning og for behandling av autoimmune sykdommer. Dette er blitt oppnådd i eksperimentelle modeller etter administrering av CTLA4-Ig (Lenschow, D.J.; Y. Zeng, R.J. Thistlethwaite, A. Montag, W. Brady, M.G. Gibson, P.S. Linsley og J.A. Bluestone (1992): "Long-Term Survival of Xenogeneic Pancreatic Islet Grafts Induced by CTLA-4Ig", Science, 257: 789-795).

Molekylene B7.1 og B7.2 kan bindes til enten CD28 eller CTLA-4, selv om B7.1 bindes til CD28 med en Kd-verdi på 200 Nm, og til CTLA-4 med en 20 ganger høyere affinitet (Linsley, P.S.; E.A. Clark og J.A. Ledbetter (1990): "T-Cell Antigen CD28 Mediates Adhesion with B Cells by Inter-acting with Activation Antigen B7/BB-1", Proe. Nati. Acad. Sei., 87: 5031-5035; Linsley et al. (1993): "The Role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen", Annu. Rev. Immunol., 11: 191-192; Linesley et al. (1993): "CD28 Engagement by B7/BB-1 Induces Transient Down-Regula-tion of CD28 Synthesis and Prolonged Unresponsiveness to CD28 Signaling", The Journal of Immunology, 150: 3151-3169). B7.2 uttrykkes på aktiverte B-celler og på inter-feroninduserte monocytter, men ikke på hvilende B-celler (Freeman, G.J.; G.S. Gray, CD. Gimmi, D.B. Lomarrd, L.-J. Zhou, M. White, J.D. Fingeroth, J.G. Gribben og L.M. Nadler

(1991): "Structure, Expression and T Cell Costimulatory Ac-tivity of the Murine Homologue of the Human B Lymphocyte Activation Antigen B7", J. Exp. Med., 174: 625-631). B7.2 derimot, uttrykkes som en grunnbestanddel i meget lave mengder på hvilende monocytter, dendrittceller og B-celler, og dens ekspresjon er høyere på aktiverte T-celler, NK-celler og B-lymfocytter (Azuma, M.; D. Ito, H. Yagita, K. Oku-mura, J.H. Phillips, L.L. Lanier og C. Somoza (1993): "B70 Antigen is a Second Ligand for CTLA-4 and CD28", Nature, 366: 76-79). Selv om B7.1 og B7.2 kan uttrykkes på samme type celler, opptrer deres ekspresjon på B-celler med forskjellig kinetikk (Lenschow, D.J.; G.H. Su, L.A. Zuckerman, N. Nabavi, CL. Jellis, G.S. Gray, J. Miller og J.A. Bluestone (1993): "Expression and Functional Significance of an Additional Ligand for CTLA-4", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 11054-11058; Boussiotis, V.A.; G.J. Freeman, J.G. Gribben, J. Daley, G. Gray og L.M. Nadler (1993) : "Activated Human B Lymphocytes Express Three CTLA-4 Counter-receptors that Co-stimulate T-cell Activation", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 11059-11063). Ytterligere analyser av RNA-nivåene har vist at B7.2-mRNA uttrykkes som en grunnbestanddel, mens B7.1-mRNA påvises 4 timer etter en aktive-ring, og de opprinnelig lave mengder B7.1-protein kan ikke påvises før 24 timer etter stimuleringen (Boussiotis, V.A.; G.J. Freeman, J.G. Gribben, J. Daley, G. Gray og L.M. Nadler (1993): "Activated Human B Lymphocytes Express Three CTLA-4 Counter-receptors that Co-stimulate T-Cell Activation", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 11059-11063). CTLA-4/CD28-receptormotstykker kan derfor uttrykkes ved forskjellige tidspunkter etter B-celleaktiveringen.

Den tidsmessig forskjellige ekspresjon av B7.1 og B7.2 tyder på at vekselvirkningen av disse to molekyler med CTLA-4 og/eller CD28 gir forskjellige, men beslektede, signaler til T-cellen (LaSalle, J.M.; P.J. Tolentino, G.J. Freeman, L.M. Nadler og D.A. Hafler (1992): "CD28 and T Cell Antigen Receptor Signal Transduction Coordinately Regulate Interleukin 2 Gene Expression In Response to Superantigen Stimulation", J. Exp. Med., 176: 177-186; Vandenberghe, P.; G.J. Freeman, L.M. Nadler, M.C. Fletcher, M. Kamoun, L.A. Turka, J.A. Ledbetter, C.B. Thompson og C.H. June (1992): "Antibody and B7/BBl-mediated Ligation of the CD28 Receptor Induces Tyrosine Phosphorylation in Human T Cells", The Journal of Experimental Medicine, 175: 951-960). De nøyaktige signaliseringsfunksjoner av CTLA-4 og CD28 på T-cellen er idag ukjent (Janeway, C.A., Jr.; og K. Bottomly (1994): "Signals and Signs for Lymphocyte Responses", Cell, 76: 275-285). Det er imidlertid mulig at et receptorsett gir utgangsstimuleringen for T-celleaktiveringen, mens det andre receptorsett gir et vedvarende signal for å tillate en ytterligere utvikling av banen og en klonal ekspansjon

(Linsley, P.S.; J.L. Greene, P. Tan, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter, C. Anasetti og N.K. Damle (1992): "Coexpression and Functional Cooperation of CTLA-4 and CD28 on Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 176: 1595-1604). Dagens viten støtter hypotesen om to signaler som foreslås av Jenkins og Schwartz (Schwartz, R.H. (1990): "A Cell Culture Model for T Lymphocyte Clonal Anergy", Science, 248: 1349; Jenkins, M.K. (1992): "The Role of Cell Division in the Induction of Clonal Anergy", Immunology Today, 13: 69), som går ut på at det er nødvendig med både et TCR-signal og et kostimulatorisk signal for å oppnå T-cellekspansjon, lymfokinutsond-ring og en fullstendig utvikling av effektorfunksjonen (Greenan, V.; og G. Kroemer (1993): "Multiple Ways to Cel-lular Immune Tolerance", Immunology Today, 14: 573). En sviktende levering av det andre signal fører til at T-cellene blir ute av stand til å utsondre IL-2, og gjør cellen passiv mot antigenet.

Strukturelt inneholder både B7.1 og B7.2 ekstracellulære immunoglobulin-superfamilie V- og C-lignende domener, et hydrofobt transmembranparti og en cytoplasmatisk hale (Freeman, G.J.; J.G. Gribben, V.A. Boussiotis, J.W. Ng, V. Restivo, Jr., L.A. Lombard, G.S. Gray og L.M. Nadler

(1993): "Cloning of B7-2: A CTLA-4 Counter-receptor that Co-stimulates Human T Cell Proliferation", Science, 262: 909). Både B7.1 og B7.2 er sterkt glykosylert. B7.1 er et 44-54 kDa langt glykoprotein som består av en 223 aminosyrer lang ekstracellulær domene, en 23 aminosyrer lang transmembran domene og en 61 aminosyrer lang cytoplasmatisk hale. B7.1 inneholder 3 potensielle protein kinase-fosfory-lasjonsstillinger (Azuma, M.; H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits og L.L. Lanier (1993): "Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845-850). B7.2 er et 306 aminosyrer langt membran-glykoprotein. Det består av et 220 aminosyrer langt ekstracellulært parti, en 23 aminosyrer lang hydrofob transmembran domene og en 60 aminosyrer lang cytoplasmatisk hale (Freeman, G.J.; A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman og L.M. Nadler (1989): "B7, A New Member og the lg Superfamily with Unique Expression on Activated and Neoplastic B Cells", The Journal of Immunology, 143: 2714-2722). Selv om både B7.1- og B7.2-genet finnes i det samme kromosomale parti (Freeman, G.J.; D.B. Lombard, CD. Gimmi, S.A. Brod, L. Lee, J.C Laning, D.A. Hafler, M.E. Dorf, G.S. Gray, H. Reiser, C.H. June, C.B. Thompson og L.M. Nadler (1992): "CTLA-4 and CD28 mRNA are Coexpressed on Most T Cells After Activation", The Journal of Immunology, 149: 3795-3801; Schwartz, R.H. (1992): "Costimulation of T Lymphocytes: The Role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1", i: Selvakumar, A.; B.K. Mohanraj, R.L. Eddy, T.B. Shows, P.C White, C. Perrin og B. Dupont (1992): "Genomic Organization and Chromosomal Location of the Human Gene Encoding the B-Lymphocyte Activation Antigen B7", Immunogenetics, 36: 175-181), har disse antigener ingen høy homologigrad. Den samlede homologi mellom B7.1 og B7.2 er 26%, og mellom murint B7.1 og humant S7 er den 27% (Azuma, M.; H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits og L.L. Lanier (1993): "Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845-850; Freeman, G.J.; A.S. Freedman, J.M. Segil, G. Lee, J.F. Whitman og L.M. Nadler (1989): "B7, A New Member of the lg Superfamily with Unique Expression on Activated and Neoplastic B Cells", The Journal of Immunology, 143: 2714-2722). Selv om en oppstilling av sekvensene for humant B7.1, humant B7.2 og murint B.l viser noen få strekninger med en lengre homologi, er det kjent at alle tre molekyler bindes til humant CTLA-4 og CD28. Dermed finnes det sannsynligvis et felles, dvs. nært homologt, parti som deles av disse tre molekyler, og dette parti kan være enten sammenhengende eller konformasjonelt. Dette parti kan utgjøre bindingsstillingen av B7.1- og B7.2-molekylene til sine receptormotstykker. Antistoffer som dyrkes mot disse epitoper, kan kanske hemme vekselspillet av B7 med receptormotstykket på T-cellen. Antistoffer som kryssreagerer med dette parti på både B7.1- og B7.2-molekyler, ville dessuten muligens ha praktiske fordeler overfor antistoffene som er rettet mot enten B7.1 eller B7 .2.

2. Blokkering av B7/CD28-vekselspillet

Blokkering av B7/CD28-vekselspillet gjør det mulig å indusere en spesifikk immunosuppresjon, med en mulighet for å generere vedvarende antigenspesifikke terapeutiske virkninger. Antistoffer mot enten B7.1 eller B7.2 har vist seg å blokkere T-celleaktiveringen, målt ifølge hemmingen av IL-2-produksjonen in vitro (DeBoer, M.; P. Parren, J. Dove, F. Ossendorp, G. van der Horst og J. Reeder (1992): "Functional Characterization of a Novel Anti-B7 Monoclonal Antibody", Eur. Journal of Immunology, 22: 3071-3075; Azuma, M.; H. Yssel, J.H. Phillips, H. Spits og L.L. Lanier

(1993): "Functional Expression of B7/BB1 on Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 177: 845-850). Imidlertid har forskjellige antistoffer vist seg å ha forskjellige immuno-suppressiv styrke, hvilket kan gjenspeile enten deres affinitet eller epitopspesifisitet. CTLA-4/Ig-fusjonsprotei-net og anti-CD28-Fab'er har vist seg å ha lignende virkninger på nedreguleringen av IL-2-produksjonen.

In vivo-administrering av et oppløselig CTLA-4/Ig-fusjonsprotein har vist seg å hemme T-celleavhengige antistoff-responser i mus (Linsley, P.S.; J.L. Greene, P. Tan, J. Bradshaw, J.A. Ledbetter, C. Anasetti og N.K. Damle (1992): "Coexpression and Functional Cooperation of CTLA-4 and CD28 on Activated T Lymphocytes", J. Exp. Med., 176: 1595-1604; Lin, H.; S.F. Builing, P.S. Linsley, R.O. Wei, CD. Thompson og L.A. Turka (1993): "Long-term Acceptance of Major Histocompatibility Complex Mismatched Cardiac Allografts Induced by CTLA-4-Ig Plus Donor Specific Transfusion", J. Exp. Med., 178: 1801), og dessuten hadde større doser også evnen til å hemme responsen på en andre immunisering, hvilket demonstrerte troverdigheten av denne fremgangsmåte ved behandling av antistoffmediert autoimmun sykdom. I tillegg kunne CTLA-4/Ig forebygge utstøtningen av Langerhans øy-celler i mus ved å direkte hemme vekselspillet mellom T-celler og B7.1/B7.2-antigenpresenterende celler (Lenschow, D.J.; G.H. Su, L.A. Zuckerman, N. Nabavi, CL. Jellis, G.S. Gray, J. Miller og J.A. Bluestone (1993): "Expression and Functional Significance of an Additional Ligand for CTLA-4", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90: 11054-11058). I dette tilfellet oppnådde man en langsiktig donorspesifikk toleranse.

3. Rekombinant fag-fremvisningsteknologi for valg av antistoff

Det er hittil ikke beskrevet noen monoklonale antistoffer som kryssreagerer med både B7.1 og B7.2. Som bemerket, ville slike antistoffer potensielt kunne være meget ønskelige som immunosuppressive midler. Fag-fremvisningsteknologien begynner å erstatte de tradisjonelle metoder ved iso-lasjon av antistoffer som genereres under immunresponsen, fordi det dermed er mulig å bedømme en meget høyere andel av immunutvalget enn hva som er mulig med de tradisjonelle metoder. Dette skyldes til dels en uvirksom PEG-fusjon, kromosomal instabilitet og den store mengde vevkulturer og siling som er forbundet med fremstillingen av heterohybri-domer. Fag-fremvisningsteknnologien avhenger derimot av mo-lekylære teknikker for å potensielt fange inn hele utvalget av immunoglobulin-gener som er forbundet med responsen på et gitt antigen.

Denne teknikk beskrives av Barber et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, 7978-7982 (1991) . Kort sagt PCR-amplifiseres genene for immunoglobulinets tunge kjede, og klones inn i en vektor som inneholder genet som koder for det mindre be-legningsprotein av den filamentøse fag M13, på en slik måte at det dannes et tung kjede-fusjonsprotein. Dette tung kjede-fusjonsprotein innlemmes i M13-fagpartiklen sammen med genene for den lette kjede idet den settes sammen. Hver rekombinante fag inneholder sammen med sitt genom, genene for et forskjellig antistoff-Fab-molekyl, som den fremviser på sin flate. Innen disse samlinger kan over IO<6 >forskjellige antistoffer klones og fremvises. Fagsamlingen strykes på antigenbestrøkne mikroliterbrønner, ikke-spesifikke fager vaskes bort, og de antigenbindende fager elue-res. Genomet fra de antigenspesifikke kloner isoleres, og gen III skjæres ut, således at antistoffet kan uttrykkes i oppløselig Fab-form for ytterligere karakterisering. Så snart man har identifisert et enkelt Fab som en potensiell terapeutisk kandidat, kan dette lett omdannes til et fullstendig antistoff. Et tidligere beskrevet ekspresjonssystem for omdannelse av Fab-sekvenser til fullstendige antistoffer, er IDECs pattedyr-ekspresjonsvektor NEOSPLA. Denne vektor inneholder genene for enten humant gamma 1- eller gamma 4-konstant parti. CHO-celler transfiseres med NEOSPLA-vektorene, og etter amplifikasjon er det blitt beskrevet at man med dette vektorsystem kan oppnå meget høye ekspresjonsnivåer (> 30 pg/celle/dag).

4 . Primatiserte antistoffer

En annen meget effektiv måte å generere rekombinante antistoffer, beskrives av Newman (1992), Biotechnology, 10, 1455-1460. Nærmere bestemt fører denne teknikk til genere-ringen av primatiserte antistoffer som inneholder variable domener fra ape og humane konstante sekvenser.

Denne teknikk modifiserer antistoffer således at de ikke utstøtes antigent etter å ha blitt administrert til mennesker. Denne teknikk er avhengig av en immunisering av synomolge aper med humane antigener eller receptorer. Denne teknikk ble utviklet for å danne høyaffinitets monoklonale antistoffer som er rettet mot humane celleflateantigener.

Antistoffer som genereres på denne måte, er tidligere blitt beskrevet å oppvise humane effektorfunksjoner, ha en nedsatt immunogenisitet og en lang halveringstid i serum. Denne teknologi støtter seg på at selv om synomolge aper fylogenetisk ligner på mennesker, gjenkjenner de fortsatt mange humane proteiner som fremmedproteiner, og starter derfor en immunrespons. Fordi synomolge aper er fylogenetisk nært beslektet med mennesket, har antistoffene som genereres i disse aper, vist seg å ha en høy grads aminosyre-homologi med antistoffene som produseres i mennesker. Etter sekvensiering av javaapers gener for immunoglobulinets variable parti av lett og tung kjede, fant man at sekvensen av hver genfamilie var 85-98% homolog med sitt humane motstykke (Newman et al. (1992), Biotechnology, 10, 1455-1460). Det første antistoff som ble generert på denne måte, nemlig et anti-CD4-antistoff, var 91-92% homologt med kon-senssekvensen for humane immunoglobulin-rammepartier (Newman et al. (1992), Biotechnology, 10, 1458-1460).

Monoklonale antistoffer som er spesifikke for humant B7-antigen, er beskrevet i litteraturen. F.eks. beskriver Weyl et al. Hum. Immunol., 31 (4), 271-276 (1991) epitopkartlegging av humane monoklonale antistoffer mot HLA-B-27 ved bruk av naturlige og muterte antigene varianter. Også Toubert et al., Clin. Exp. Immunol., 82 (1), 16-20 (1990) beskriver epitopkartlegging av et monoklonalt HLA-B27-antistoff, som også reagerer med et 35 kDa langt bakterielt ytre membranprotein. Valle et al., Immunol., 69 (4), 531-535 (1990) beskriver dessuten et monoklonalt antistoff fra underklassen IgGl, som gjenkjenner B7-antigenet når det uttrykkes i aktiverte B-celler og HTLV-l-transformerte T-celler. Toubert et al., J. Immunol., 141 (7), 2503-2509 (1988) beskriver videre en epitopkartlegging av HLA-B27- og HLA-B7-antigener ved bruk av intradomene-rekombinanter som ble konstruert ved å fremstille hybridgener mellom disse to alleler i E. coli.

Noen forskere har funnet at en høy ekspresjon av B7-antigener korrelerer med autoimmune sykdommer. F.eks. beskriver Ionesco-Tirgoviste et al., Med. Interre, 24 (1), 11-17

(1986), en økt B7-antigenekspresjon i insulinavhengig diabetes type 1. Dessuten er det blitt beskrevet en B7-anti-genekspresjon på dermale dendrittceller som ble fjernet fra psoriasis-pasienter (Nestle et al., J. Clin. Invest., 94 (1) , 202-209 (1994)) .

Videre beskrives det i litteraturen en hemming av anti-HLA-B7-alloreaktivt CTL ved bruk av affinitetsrenset opplø-selig HLA-B7 (Zavazava et al., Transplantation, 51 (4), 838-842 (1991)) . Anvendelsen av B7-receptors oppløselige ligand, CTLA-4-Ig, for å blokkere B7-aktiviteten (jfr. f.eks. Lenschow et al., Science, 257, 789, 7955 (1992)) i dyremodeller, og et B7-l-Ig-fusjonsprotein som har evnen til å hemme B7, er også blitt beskrevet.

Det er fra artikkelen Inaba et. al., 1994, J. Exp. Med., Vol. 180, s. 1849-1860 kjent bruk av antistoffer mot B7-1 og B7-2 hvor det beskrives bruk av anti-mus monoklonale antistoffer. Fra artiklene Hathcock et. al., 1994, J. Exp. Med., Vol. 180, s. 631-640; Kuchroo et. al., mars 1995, Cell, Vol. 80, s. 707-718 og Lenschow et. al., mars 1995, J. Exp. Med., Vol. 181, s. 1145-1155 er det også kjent virkningen av B7-molekylene i immunsystemet og den terapeutiske nytteverdien av å blokkere disse molekylene ved hjelp av antistoffer.

SAMMENFATNING OG FORMÅL FOR OPPFINNELSEN

Det er et formål for oppfinnelsen å fremstille og identifi-sere nye monoklonale javaape-antistoffer mot humant B7-antigen, nærmere bestemt mot humant B7.1-antigen og/eller humant B7.2-antigen, av den type som er angitt i krav 1 eller krav 2.

Slike antistoffer kan isoleres, ved å undersøke fag-fremvisningssamlinger og/eller ape-heterohybridomaer ved bruk av B-lymfocytter som erholdes fra aper som er blitt immunisert med humant B7-antigen, dvs. humant B7.1- eller B7.2-antigen.

Slike antistoffer kan også hemme B7/CD86-banen og en B7-stimulering av aktiverte T-celler, hvorved de hemmer IL-2-produksjonen og T-celleproliferasjonen, og dermed virker som effektive immunosuppressiva.

De aktuelle antistoffene kan også hemme antigendrevne responser i donor-miltcellekulturer, f.eks. antigenspesifikke IgG-responser, Il-2-produksjonen og celleproliferasjonen.

Videre kan disse ape-antistoffer og primatiserte former derav brukes f.eks. til fremstilling av medikamenter som immunosuppressiva, dvs. for å blokkere antigendrevne immunresponser, for behandling av autoimmune sykdommer såsom psoriasis, rhaumatoid artritt, systemisk erytematose (SLE), diabetes mellitus type 1, idiopatisk trombocytopenia purpura (ITP), og for å forebygge organutstøtning, hvor slik anvendelse er angitt i krav 14-17 samt krav 20-22.

Det er et ytterligere formål for oppfinnelsen å frembringe farmasøytiske blandinger som inneholder et eller flere monoklonale ape-antistoffer som er spesifikke for humant B7-antigen, dvs. humant B7.1- og/eller humant B7.2-antigen, eller primatiserte former derav, og et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff eller hjelpestoff som angitt i krav 13 og 18-19 samt 24. Disse blandinger skal brukes f.eks. som immunosuppressiva for å behandle autoimmune sykdommer, f.eks. idiopatisk trombocytopenia purpura (ITP) og systemisk lupus erytematose (SLE) for å blokkere antigendrevne immunresponser, og for å forebygge organut-støtning i transplantatmottakere, samt autoimmune sykdommer såsom idiopatisk trombocytopenia purpura (ITP), systemisk lupus erytematose (SLE), diabetes mellitus type 1, psoriasis, rheumatoid artritt, multippel sklerose, aplastisk anemi, og for å forebygge utstøtning i transplantatmottakere .

Det er enda et ytterligere formål for oppfinnelsen å

frembringe transfektanter, f.eks. CHO-celler, som uttrykker i det minste de variable tunge og lette domener av monoklonale ape-antistoffer av den type som er forklart ovenfor og som er spesifikke for humant B7.1- og/eller B7.2-antigen.

Det er et ytterligere formål for oppfinnelsen å frembringe nukleinsyresekvenser som angitt i krav 8 og som koder for de variable tunge og/eller lette domener av monoklonale ape-antistoffer som er spesifikke for humant B7.1- og/eller humant B7.2-antigen, hvor sekvensene kan settes inn i ekspresjonsvektorer som tilrettelegger for ekspresjonen av primatiserte antistoffer som inneholder disse nukleinsyresekvenser.

Definisj oner

De følgende begreper skal defineres, slik at oppfinnelsen kan forstås bedre.

Utarmende antistoff: et antistoff som dreper aktiverte B-celler eller andre antigenpresenterende celler.

Ikke- utarmende antistoff: et antistoff som blokkerer den kostimulatoriske virkning av B7 og de T-celleaktiverende ligander CD28 og CTLA-4. Det anergiserer således, men fjer-ner ikke, den antigenpresenterende celle.

Primatisert antistoff: et rekombinant antistoff som er utviklet således at det inneholder de variable tunge og lette domener av et ape-antistoff, spesielt et antistoff fra en synomolg ape, og som inneholder sekvenser for human konstant domene, fortrinnsvis human immunoglobulin gamma 1-eller gamma-4-konstant domene (eller PE-variant derav). Fremstillingen av slike antistoffer beskrives av Newman et al. (1992): "Primatization of Recombinant Antibodies for Immunotherapy of Human Diseases: A Macaque/Human Chimeric Antibody Against Human CDH", Biotechnology, 10: 1458-1460; og også i USSN 08/379.072. Disse antistoffer beskrives å oppvise en høy homologigrad med humane antistoffer, dvs. 85-98 %, oppvise humane effektorfunksjoner, ha en nedsatt immunogenisitet, og de kan oppvise en høy affinitet for humane antigener.

B7- antigener: B7-antigener omfatter f.eks. humane B7-, B7.1- og B7.2-antigener. Disse antigener bindes til CD28 og/eller CTLA-4. Disse antigener har en kostimulerende rolle ved T-celleaktivering. Disse B7-antigener inneholder dessuten ekstracellulære immunoglobulin-superfamilie V- og C-lignende domener, et hydrofobt transmembrant parti og en cytoplasmatisk hale (jfr. Freeman et al., Science, 262: 909

(1993)), og de er sterkt glykosylert.

Anti- B7- antistoffer: Monoklonale ape-antistoffer eller primatiserte former derav, som spesifikt binder humane B7-antigener, f.eks. humant B7.1- og/eller B7.2-antigen, med en tilstrekkelig affinitet for å blokkere B7:CD28-vekselspillet og dermed å indusere immunosuppresjon.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 viser pMS-vektoren som brukes for å velge ut fremstilte rekombinante immunoglobulin-samlinger mot B7 som fremvises på flaten av en filamentøs fag som inneholder primere på grunnlag av javaape-immunoglobulinsekvensene. Figur 2 viser NEOSPLA-ekspresjonsvektoren som brukes for å uttrykke primatiserte antistoffer ifølge oppfinnelsen som er spesifikke for humant B7.1-antigen. Figur 3 viser anti-B7.1-titere i apeserum som er rettet mot celleflate-B7.1 på transfiserte CHO-celler. Figur 4 viser hemmingen av bindingen av radiomerket SB7.1 med affinitetsrensede SB7.1-antistoffer fra ape, i nærvær av umerket SB7 og Mab L307.4 murint anti-B7.1. Figur 5 viser hemmingen av bindingen av radiomerkede ape-135 og L3707.4 anti-B7.1-antistoffer til B7-positive humane SB-celler ved at de konkurrerer med affinitetsrenset SB7.1. Figur 6 viser hemmingen av bindingen av radiomerket B7-Ig til aktiverte humane perifere blod-T-celler ved at de konkurrerer med umerket SB7.1 murint anti-B7.1 (L307.4) og ape-1127 affinitetsrensede serumantistoffer. Figur 7 viser hemmingen av IL-2-protein i blandede lymfocyttkulturer med affinitetsrensede anti-B7.1-antistoffer fra apeserum. Figur 8a viser aminosyre- og nukleinsyresekvensen for en primatisert form av lett kjede av 7C10, hvis variable område har en sekvens tilsvarende SEQ ID N0:1. Figur 8b viser aminosyre- og nukleinsyresekvensen for en primatisert form av tung kjede av 7C10, hvis variable område har en sekvens tilsvarende SEQ ID NO:2. Figur 9a viser aminosyre- og nukleinsyresekvensen for en primatisert form av lett kjede av 7B6, hvis variable område har en sekvens tilsvarende SEQ ID NO:3. Figur 9b viser aminosyre- og nukleinsyresekvensen for en primatisert form av tung kjede av 7B6, hvis variable område har en sekvens tilsvarende SEQ ID NO:4. Figur 10a viser aminosyre- og nukleinsyresekvensen for en primatisert lett kjede 16C10, hvis variable område har en sekvens tilsvarende SEQ ID NO:5. Figur 10b viser aminosyre- og nukleinsyresekvensen for en primatisert tung kjede 16C10, hvis variable område har en sekvens tilsvarende SEQ ID NO:6.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Som beskrevet ovenfor, vedrører foreliggende oppfinnelse fremstillingen av nye monoklonale ape-antistoffer som spesifikt binder humant B7.1- og/eller humant B7.2-antigen, samt primatiserte antistoffer som er avledet derav som angitt i krav 1. Disse antistoffer har en høy affinitet med humant B7.1 og/eller B7.2, og kan derfor brukes som immunosuppressiva som hemmer B7:CD86-banen.

Fremstillingen av monoklonale ape-antistoffer skal fortrinnsvis utføres ved å undersøke fag-fremvisningssamlinger eller ved å fremstille ape-heterohybridomaer ved bruk av B-lymfocytter som erholdes fra aper som er blitt immunisert med B7 (f.eks. humant B7.1 og/eller B7.2).

Som sagt, omfatter den første fremgangsmåte ved generering av anti-B7-antistoffer rekombinant fag-fremvisningsteknikk. Denne teknikk ble beskrevet i grove trekk ovenfor.

I hovedsak vil dette omfatte syntesen av rekombinante immunoglobulinsamlinger mot B7-antigen som fremvises på flaten av filamentøse fager, og utvalg av fager som utsondrer antistoffer med en høy affinitet for B7.1- og/eller B7.2-antigener. Som nevnt ovenfor, skal det fortrinnsvis utvelges antistoffer som bindes til både humant B7.1 og B7.2. For å utføre en slik metode, har foreliggende oppfinnere satt sammen en ensartet samling for ape-samlinger, som nedsetter muligheten for en rekombinasjon, og som bedrer stabiliteten. Denne vektor, som benevnes pMS, skal beskrives i detalj i det følgende, og vises på Figur 1.

For å tilpasse fag-fremvisning for bruk med javaape-samlinger, inneholder denne vektor spesifikke primere for PCR-amplifikasjon av ape-immunoglobulin-gener. Disse primere baserer seg på javaape-sekvenser som ble erholdt mens man utviklet den primatiserte teknologi og databaser som inneholder humane sekvenser.

Egnede primere beskrives i patentsøknad US08/379.072.

Den andre metode omfatter å immunisere aper, dvs. javaaper, mot humant B7-antigen, fortrinnsvis mot humant B7.1- og B7.2-antigen. Den grunnleggende fordelaktighet av javaaper for generering av monoklonale antistoffer ble beskrevet ovenfor. Nærmere bestemt kan slike aper, dvs. synomolge aper, immuniseres mot humane antigener eller receptorer. De erholdte antistoffer kan brukes ved fremstilling av primatiserte antistoffer ifølge metoden som beskrives av Newman et al., Biotechnology, 10, 1455-1460 (1992), og USSN 08/379.072, innlevert den 25. januar 1995.

Den betydelige fordel av antistoffer som erholdes fra synomolge aper, er at disse aper gjenkjenner fremmedheten av flere humane proteiner, og dermed tilrettelegger for dan-nelsen av antistoffer, hvorav enkelte har en høy affinitet for de ønskede humane antigener, f.eks. humane overflateproteiner og cellereceptorer. Fordi de er fylogenetisk nært beslektet med mennesker, oppviser de dannede antistoffer en høy aminosyre-homologigrad med antistoffene som produseres i mennesker. Som beskrevet ovenfor fant man etter sekvensiering av javaape-genenes immunoglobulin-lett og tungt variabelt parti, at sekvensen for hver genfamilie var 85-88 % homolog med sitt humane motstykke (Newman et al. (1992), Biotechnology, 10, 1455-1460.

I det vesentlige administrerer man humant B7-antigen, f.eks. humant B7.1- og/eller humant B7.2-antigen, til synomolge javaaper, B-celler isoleres fra dyrene, f.eks. kan man ta lymfeknutebiopsier fra dem, og B-lymfocyttene smeltes deretter sammen med KH6/B5-heteromyelomaceller (murine x humane) ved bruk av polyetylenglykol (PEG). Heterohybridomaer som utsondrer antistoffer som binder humant B7-antigen, f.eks. humant B7.1- og/eller humant B7.2-antigen, identifiseres deretter.

Antistoffer som bindes til både B7.1 og B7.2, er ønskelige, fordi disse antistoffer eventuelt kan brukes for å hemme vekselspillet av B7.1 og B7.2, samt av B7, med deres receptormotstykker, dvs. humant CTLA-4 og CD28. Antistoffer mot disse epitoper kan hemme vekselspillet av både humant B7.1 og humant B7.2 med sine receptormotstykker på T-cellen. Dette kan eventuelt gi synergistiske virkninger.

Antistoffer som kun bindes til enten av de humane B7-antigener, nemlig til B7.1-antigen eller til B7.2-antigen, er imidlertid også høyt ønskelige pga. disse molekylers inn-blanding i T-celleaktiveringen, klonal ekspansjon lymfokin-utsondring (IL-2-utsondring) og responsstyrke på antigener. Idet både humant B7.1 og B7.2 bindes til humant CTLA-4 og CD28, er det sannsynlig at det finnes minst ett felles eller homologt parti (muligens en eller flere felles konfor-masjonelle epitoper) som man eventuelt kan dyrke javaape-antistoffer mot.

Foreliggende oppfinnere valgte å immunisere javaaper mot humant B7.1-antigen ved bruk av rekombinant oppløselig B7.1-antigen som ble fremstilt i CHO-celler og renset ved affinitetskromatografi ved bruk av en L307.4-sepharose-affinitetskolonne. Hvilken bestemte kilde som brukes for humant B7-antigen, humant B7.1-antigen eller humant B7.2-antigen, er imidlertid ikke vesentlig, forutsatt at antigenet er tilstrekkelig rent for å forårsake en spesifikk anti-stoffrespons mot det bestemte administrerte B7-antigen og eventuelt mot andre B7-antigener.

Genene for det humane B7-antigen, humant B7.1-antigen (også benevnt CD80) og humant B7.2-antigen (også benevnt CD86) er blitt klonet og sekvensiert, og kan dermed lett fremstilles ved rekombinante metoder.

Fortrinnsvis administreres det humane B7-antigen, det humane B7.1-antigen og/eller det humane B7.2-antigen i oppløse-lig form, f.eks. ved ekspresjon av et B7-, B7.1-eller B7.2-gen hvor man har fjernet de transmembrane og cytoplasmatiske domener og kun har beholdt det ekstracellulære parti, dvs. de ekstracellulære superfamilie V- og C-lignende domener (jfr. f.eks. Grumet et al., Hum. Immunol., 40 (3), s. 228-234, 1994, som beskriver ekspresjonen av en oppløselig form av humant B7, og som i sin helhet er innlemmet heri ved henvisning).

Javaapene skal immuniseres med B7-, B7.1- og/eller B7.2-antigenet, fortrinnsvis en oppløselig form derav, under betingelser som fører til en produksjon av antistoffer som er spesifikke for dem. Det oppløselige humane B7-, B7.1- eller B7.2-antigen skal fortrinnsvis administreres sammen med et hjelpestoff, f.eks. Freunds fullstendige adjuvans (CFA), Alum, Saponin eller et annet kjent hjelpestoff, eller kom-binasjoner derav. Generelt vil dette kreve gjentatte immu-niseringer, f.eks. ved gjentatte injeksjoner, i løpet av flere måneder. F.eks. utførte man en administrering av opp-løselig B7.1-antigen i hjelpestoffer, med boosterimmunise-ringer i løpet av 3-4 måneder, og induserte dermed en produksjon av antistoffer som bandt humant B7.1-antigen, i serum.

Etter immuniseringen samler man B-cellene, f.eks. ved lymfeknutebiopsier som tas fra de immuniserte dyr, og B-lymfocyttene smeltes sammen med KH6/B5-heteromyelomaceller (murine x humane) ved bruk av polyetylenglykol. Fremgangsmåter ved fremstilling av slike heteromyelomaer er kjente, og kan f.eks. finnes i USSN 08/379.072, Newman et al., innlevert den 25. januar 1995, som er innlemmet heri ved henvisning.

Heterohybridomaer som utsondrer antistoffer som binder humant B7, B7.1 og/eller B7.2, identifiseres deretter. Dette kan utføres ved kjente teknikker. Det kan f.eks. bestemmes ved ELISA-undersøkelse eller radioimmunoassay ved bruk av enzym- eller radionuklid-merket humant B7-, B7.1- og/eller B7.2-antigen.

Cellelinjer som utsondrer antistoffer med den ønskede spesifisitet for humant B7-, B7.1- og/eller B7.2-antigen, subklones deretter til monoklonalitet.

Under utviklingen av foreliggende oppfinnelse testet opp-finnerne rensede antistoffer for å bestemme deres evne til å binde oppløselig B7.1-antigen-bestrøkne plater i en ELISA-undersøkelse, antigenpositive B-celler og CHO-transfektomaer som uttrykker humant B7.1-antigen på sin celleflate. I tillegg testet man antistoffene for å bestemme deres evne til å blokkere B-celle/T-celle-vekselspill, målt ifølge IL-2-produksjonen og opptaket av tritiert tymidin i en blandet lymfocyttreaksjon (MLR) idet B7-bindingen ble påvist ved bruk av <125>I-radiomerket oppløselig B7.1 (SB7.1).

Dessuten testet man affinitetsrensede antistoffer fra javaaper for å bestemme deres reaktivitet mot CHO-transfektanter som uttrykte B7.1/Ig-fusjonsproteiner, og mot CHO-celler som produserte humant B7.2-antigen. Disse resultater tydet på at B7.1-immunseraene ble bundet til B7.2-trans-fektomaene. Bindingen av antistoffene til B7.2-antigen kan bekreftes ved bruk av oppløselig B7.2/Ig-reagenser. Som skal beskrives i de følgende eksempler, kan dette utføres ved å fremstille og rense B7.2-Ig fra CHO-transfektomaer i tilstrekkelig store mengder for å fremstille en B7.2-Ig-sepharose-affinitetskolonne. De antistoffer som kryssreagerer med B7.2, vil bindes til B7.2-Ig-sepharose-kolonnen.

Cellelinjer som uttrykker antistoffer som bindes spesifikt til humant B7-antigen, B7.1-antigen og/eller B7.2-antigen, brukes deretter for å klone sekvensene av variabel domene, for fremstilling av primatiserte antistoffer, hovedsaklig som beskrevet i Newman et al. (1992), Biotechnology, 10, 1455-1460; og Newman et al,. USSN 379.072, innlevert den 25. januar 1995. I det vesentlige omfatter dette en ekstraksjon av RNA'et derfra, omdannelse derav til cDNA og amplifikasjon derav ved PCR ved anvendelse av Ig-spesifikke primere. Egnede primere beskrives i Newman et al. (1992), Biotechnology, 10, 1455- 1460, og i USSN 379.072 (jfr. spesielt Figur 1 av USSN 379.072).

De klonede variable gener fra ape innføyes deretter i en ekspresjonsvektor som inneholder humane gener for human tung og lett kjedes konstante partier. Dette utføres fortrinnsvis ved å bruke den patenterte ekspresjonsvektor fra IDEC, Inc., som benevnes NEOSPLA. Denne vektor vises på Figur 2, og inneholder cytomegalovirus-promoter/fremmer, murin betaglobulin-hovedpromoter, SV40-opphav for replikasjon, bovint veksthormon-polyadenylasjonssekvensen, neo-mycin-fosfotransferase-ekson 1 og ekson 2, humant immunoglobulin kappa- eller lambda-konstant parti, dihydrofolat reduktase-genet, humant immunoglobulin gamma 1- eller gamma 4-PE-konstant parti og ledersekvens. Man har funnet at denne vektor fører til et meget høyt ekspresjonsnivå av primatiserte antistoffer etter innlemmelse av ape-variabelt parti-gener og transfeksjon i CHO-celler, etterfulgt av utvalg i G418-holdig medium og metotreksat-amplifikasjon.

F.eks. er det blitt beskrevet at dette ekspresjonssystem fører til primatiserte antistoffer med en høy aviditet (Kd

< 10~<10>M) mot CD4 og andre humane celleflatereceptorer. Videre har man funnet at antistoffene oppviser samme affinitet, spesifisitet og funksjonelle aktivitet som de opp-rinnelige ape-antistoffer. Dette vektorsystem beskrives i det vesentlige i USSN 379.072 og i USSN 08/149.099, innlevert den 3. november 1993. Dette system gir høye ekspresjonsnivåer, dvs. > 30 pg/celle/dag.

Som ble beskrevet ovenfor, har foreliggende oppfinnere valgt fire ledende monoklonale kandidatantistoffer fra ape, som spesifikt binder B7.1-antigenet, og som også kan binde B7.2-antigenet. Disse monoklonale ape-antistoffer benevnes heri 7B6, 16C10 og 7C10.

Som skal beskrives i større detalj i det følgende, ble disse antistoffers evne til å blokkere B-celle/T-celle-vekselspillet bedømt, ifølge målinger av IL-2-produksjon og tritiert tymidininntak i en blandet lymfocyttomsetning for T-cellebindingseksperimenter. For T-celle-binding dyrket man poser med humane perifere blodlymfocytter i 3-6 dager i nærvær av en PHA-stimulator. B7-bindingen ble testet med <125>I-radiomerket oppløselig B7.1. De observerte resultater tyder på at alle disse antistoffer binder B7.1-antigen med en høy affinitet, og virksomt blokkerer B-celle/T-celle-vekselspillet, hvilket observeres ved en nedsatt IL-2-produksjon og en nedsatt proliferasjon av blandede lymfocyttkulturer.

Egenskapene av disse bestemte monoklonale ape-antistoffer skal oppsummeres i det følgende: 1. For å demonstrere ape-antistoffenes evne til å blokkere det fysiske vekselspill mellom CTLA4-Ig, inkuberte man forskjellige konsentrasjoner av ape-anti-B7.1-antistoffene og umerket CTLA4-Ig sammen med radiomerket CTLA4-Ig1125. Resultatene av hemmingsassayet viste at IC50 (den konsentrasjon av hemmer som fører til 50 % hemming) for ape-antistoffene er: 2. Schatchard-analyse viste at de tilsynelatende affini-tetskonstanter (Kd) for ape-antistoffenes binding til B7-Ig-bestrøkne plater var omtrent: 3. Antistoffene ble testet in vitro i et blandet lymfo-cytt-reaksjonsassay (MLR). MLR-undersøkelsen viste at alle fire anti-B7.1-antistoffer hemmer IL-2-produksjonen i forskjellig grad, ifølge de følgende Ibgo-ver- 4. Ape-anti-B7.1-antistoffene ble testet for å bedømme deres evne til å binde B7 på humane perifere blodlymfocytter (PBL). FACS-analyse viste at alle fire ape-antistoffer testet positive. 5. Ape-antistoffene 16C10, 7B6 og 7C10 ble testet for sin Clq-binding ifølge FACS-analyse. Resultatene viste at 7C10-ape-Ig hadde en sterk binding til humant Clq etter inkubasjon med B7.1-transfiserte CHO-celler. 16C10 testet positivt, mens ape-antistoffet 7B6 testet negativt. 6. For å velge en dyremodell for undersøkelse av den pa-tologiske toksisitet, ble ape-antistoffene testet med dyreblod fra forskjellige arter. Man bestemte at apenes anti-B7.1-antistoffer kryssreagerte med humant, sjimpanse- og muligens bavian-blod.

På grunnlag av disse egenskaper virker det som om tre monoklonale ape-antistoffer har de mest fordelaktige egenskaper, nemlig 16C10 og 7C10.

Ved bruk av teknikkene som ble beskrevet ovenfor, og i USSN 08/379.072, har foreliggende oppfinnere klonet de variable partier av 7C10, 7B6 og 16C10, og frembringer aminosyre- og nukleinsyresekvensene for primatiserte former av 7C10-lett kjede, 7C10-tung kjede, 7B6-lett kjede, 7B6-tung kjede, 16C10-lett kjede og 16C10-tung kjede. Disse aminosyre- og nukleinsyresekvenser vises på figurene 8a og 8b, 9a og 9b samt 10a og 10b. DNA- og aminosyresekvensen for humant gamma 1-konstant parti er oppført i 08/379.072.

Som beskrevet ovenfor, uttrykkes disse primatiserte antistoffer fortrinnsvis ved bruk av NEOSPLA-ekspresjonsvektoren som vises på Figur 2, og som i det vesentlige beskrives i USSN 08/379.072 og 08/149.099.

De primatiserte antistoffer skal fortrinnsvis inneholde enten humant immunoglobulin gamma 1- eller gamma 4-konstant parti, idet gamma 4 fortrinnsvis er mutert i to stillinger for å danne gamma 4-PE. Gamma 4-PE-mutanten inneholder to mutasjoner, nemlig en glutamsyre i CH2-partiet som ble innføyd for å eliminere en rest-FCR-binding, og en prolinsubstitusjon i hengselpartiet som skal bedre stabiliteten av den tunge kjedes disulfidbindings-vekselspill (jfr. Alegre et al., J. Immunol. 148, 3461-3468

(1992); og Angel et al., Mol. Immunol. 30, 105-158 (1993).

Om de primatiserte antistoffer skal inneholde gamma 1-, gamma 4- eller gamma 4-PE-konstant parti, er til stor del avhengig av den bestemte målsykdom. Fortrinnsvis danner man utarmende og ikke-utarmende primatiserte IgGl- og IgG4-antistoffer, og tester disse mot forskjellige målsykdommer.

Med den beskrevne binding og de funksjonelle egenskaper av de monoklonale ape-antistoffer ifølge oppfinnelsen, vil disse anti-B7.1-monoklonale antistoffer og primatiserte former derav antakelig vise seg å være godt egnet som terapeutiske midler for å blokkere B7:CD28-vekselspillet og dermed å tilveiebringe immunosuppresjon. Med sin høye affinitet for B7.1-antigen og sin evne til å blokkere B-celle/T-celle-vekselvirkningene ifølge målinger av IL-2-produksjonen og opptak av tritiert tymidin i blandede lymfocyttkulturer, og deres evne til å virksomt hemme antigendrevne responser i donor-miltcellekulturer som ble vist ved nedsatte antigenspesifikke IgG-responser, nedsatt IL-2-produksjon og nedsatt celleproliferasjon, vil disse monoklonale ape-antistoffer og primatiserte former derav sannsynligvis virke som effektive immunosuppressiva som modulerer B7:CD28-banen. Dette er viktig for behandling av mange sykdommer hvor det er terapeutisk ønskelig med en immuno-suppres jon, f.eks. autoimmune sykdommer, for å hemme uønskede antigenspesifikke IgG-responser og også for forebyggelse av organutstøtning og "graft-vs.-host-disease".

De viktigste terapeutiske indikasjoner for anti-B7.1-anti-stof fene ifølge oppfinnelsen omfatter f.eks. autoimmune sykdommer, såsom idiopatisk trombocytopenia purpura (ITP), systemisk lupus erytematose (SLE), diabetes mellitus type 1, multippel sklerose, aplastisk anemi, psoriasis og rheumatoid artritt.

En annen viktig terapeutisk indikasjon for de aktuelle anti-B7.1-antistoffene er forebyggelse av "graft-vs.-host-disease" (GVHD) ved organtransplantasjoner eller ben-margtransplantasjoner (BMT). De aktuelle antistoffene kan brukes for å indusere toleranse hos verten for donor-spesifikke alloantigener, og dermed forenkle innpodingen og nedsette hyppigheten for transplantatutstøtning. I en murin modell av allogeneisk hjertetransplantasjon har man vist at en intravenøs administrering av CTLA4-Ig kan føre til en immunosuppresjon, eller t.o.m. kan indusere toleranse for alloantigenet (Lin et al., J. Exp. Med. 178: 1801, 1993; Torka et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89: 11102, 1992). Det forventes at de primatiserte anti-B7.1-antistoffer vil oppvise en lignende eller sterkere aktivitet.

Antistoffene som fremstilles som beskrevet ovenfor, eller ved likeverdige teknikker, kan renses ved en kombinasjon av affinitets- og størrelsesutelukkende kromatografi for karakterisering i funksjonelle biologiske assayer. Disse assayer omfatter bestemmelsen av spesifisiteten og bindings-affiniteten, samt effektorfunksjonen som forbindes med den uttrykte isotype, f.eks. ADCC, eller komplementfiksering. Slike antistoffer kan brukes som passive eller aktive terapeutiske midler mot et antall humane sykdommer, bl.a. B-celle-lymfom, smittelige sykdommer såsom AIDS, autoimmune og inflammatoriske sykdommer samt transplantasjon. Antistoffene kan brukes enten i sin native form, eller som en del av et antistoff/chelat-, antistoff/legemiddel- eller antistoff/toksin-kompleks. I tillegg kan hele antistoffer eller antistoff-fragmenter (Fab2, Fab, Fv) brukes som av-bildningsreagenser eller som potensielle vaksiner eller im-munogener ved aktiv immunoterapi for generering av anti-idiotypiske responser.

Hvilken mengde antistoff som kan være nyttig for å frembringe en terapeutisk virkning, kan bestemmes ved standard teknikker som er velkjent for fagmannen. Antistoffene vil generelt fremstilles ved standardteknikker innen en farma-søytisk akseptabel buffer, og kan administreres ved hvilken som helst ønsket rute. Fordi antistoffene ifølge oppfinnelsen er meget virksomme og tolereres av mennesker, er det mulig å administrere antistoffene flere ganger for å be-kjempe forskjellige sykdommer eller sykdomstilstander i et menneske.

De aktuelle anti-B7.1-antistoffene (eller fragmenter derav) er nyttige ved indusering av immunosuppresjon, dvs. indusering av en suppresjon av immunsystemet i et menneske eller dyr.

Evnen av de aktuelle antistoffene til å indusere immunosuppresjon er blitt demonstrert i standardtester som brukes med dette formål, f.eks. en blandet lymfocytt-reaksjonstest eller en test som måler hemmingen av T-celleproliferasjonen ifølge tymidinopptaket.

Det faktum at antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige ved indusering av immunosuppresjon, tyder på at de kan være nyttige ved behandling eller forebyggelse av en resistens mot eller utstøtning av transplanterte organer eller vev (f.eks. nyre, hjerte, lunge, benmarg, hud, horn-hinne osv); behandling eller forebyggelse av autoimmune, inflammatoriske, proliferative og hyperproliferative sykdommer, og av kutane manifestasjoner av immunologisk medi-erte sykdommer (f.eks. rheumatoid artritt, lupus erytematose, systemisk lupus erytematose, Hashimotos tyroiditt, multippel sklerose, myastenia gravis, type 1-diabetes, uveitis, nefrotisk syndrom, psoriasis, atopisk dermatitt, kontaktdermatitt og andre eksematøse dermatitter, seboréisk dermatitt, lichen planus, pemfigus, blæret pemfigus, epidermolysis bullosa, urtikaria, angioødem, vaskulitter, erytem, kutan eosinofilia, alopecia areata osv.); behandling av reversibel obstruktiv luftveisykdom, tarmbetennelser og allergier (f.eks. cøliaki, proktitt, eosinofil gastroenteritt, mastocytose, Crohns sykdom og ulcerativ kolitt) og matallergier (f.eks. migrene, rhinitt og eksem).

En fagman vil ved rutinemessig eksperimentering kunne bestemme hvor høy en virksom, ikke-toksisk mengde antistoffer vil være med sikte på å indusere immunosuppresjon. Generelt vil en virksom dose imidlertid ligge i området på ca. 0,05-100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.

Antistoffene (eller fragmenter derav) ifølge oppfinnelsen vil sannsynligvis også være nyttige ved behandling av svulster i pattedyr. Nærmere bestemt vil de sannsynligvis være nyttige ved reduksjon av svulststørrelsen, hemming av svulstveksten og/eller forlengelse av overlevelsestiden av svulstbærende dyr. En fagman vil ved rutinemessig eksperimentering kunne bestemme hvor høy en virksom, ikke-toksisk mengde av de aktuelle anti-B7-antistoffer vil være for behandling av karsinogene svulster. Generelt forventes det imidlertid at en virksom dosering være 0,05-100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et menneske eller et annet dyr ifølge de ovennevnte behand-lingsmetoder, i en mengde som er tilstrekkelig for å virke i terapeutisk eller profylaktisk grad. Slike antistoffer ifølge oppfinnelsen kan administreres til et menneske eller et annet dyr i en konvensjonell doseringsform som fremstilles ved å kombinere antistoffet ifølge oppfinnelsen med et konvensjonelt farmasøytisk akseptabelt bærerstoff eller fortynningsmiddel ifølge kjente teknikker. En fagman vil være klar over at formen og egenskapene av et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff eller tynningsmiddel bestemmes av hvilken mengde aktiv ingrediens som det skal kombineres med, administreringsruten og andre velkjente variabler.

Administreringsruten for antistoffet (eller fragmentet derav) ifølge oppfinnelsen kan være oral, parenteral, ved inhalasjon eller topisk. Begrepet parenteral som brukes her, omfatter intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær, subkutan, rektal eller vaginal administrering. De subkutane og intramuskulære former for parenteral administrering foretrekkes generelt.

Det daglige parenterale og orale doseringsområde for bruk av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ved profylaktisk eller terapeutisk induksjon av immunosuppresjon eller ved terapeutisk behandling av karsinogene svulster, vil generelt ligge i området 0,05-100, fortrinnsvis 0,5-10, mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan også administreres ved inhalasjon. Med "inhalasjon" menes intranasal eller oral inhalasjonsadministrering. Egnede doseringsformer for en slik administrering, såsom en aerosolformulering eller en inhalator med oppmålte doser, kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker. Den foretrukne doseringsmengde som skal brukes for en forbindelse ifølge oppfinnelsen, ligger generelt innen området 10-100 mg.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk. Med topisk administrering menes ikke-systemisk administrering, og dette omfatter påføringen av en forbindelse av et antistoff (eller et fragment derav) ifølge oppfinnelsen eksternt på epidermis, i kinnhulrommet eller inndryp-ping av et slikt antistoff i øret, øyet eller nesen, og hvor antistoffet ikke i noen signifikant grad trenger seg inn i blodstrømmen. Med systemisk administrering menes oral, intravenøs, intraperitoneal eller intramuskulær administrering. Mengden antistoff som er nødvendig for den terapeutiske eller profylaktiske virkning, vil såklart variere med det valgte antistoff, naturen og alvoret av tilstanden som skal behandles og dyret som skal behandles, og bestemmes endelig av den behandlende lege. En egnet topisk dose av et antistoff ifølge oppfinnelsen vil generelt ligge innen området 1-100 mg pr. kg kroppsvekt daglig.

Formuleringer

Mens det er mulig å administrere et antistoff eller et fragment derav for seg selv, foretrekkes det å innlemme det i en farmasøytisk formulering. Den aktive ingrediens kan for en topisk administrering utgjøre 0,001-10 vekt%, f.eks. 1-2 vekt% av formuleringen, selv om den kan utgjøre inntil 10 vekt%, men fortrinnsvis ikke over 5 vekt%, og mer fore-trukket utgjør den 0,1-1 vekt% av formuleringen.

De topiske formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en aktiv ingrediens sammen med et eller flere akseptable bærerstoffer for ingrediensen, og valgfritt også andre terapeutiske ingredienser. Bærerstoffet eller -stoffene må være "akseptable" i den forstand at de er kom-patible med de andre ingredienser i formuleringen, og ikke er skadelige for mottakeren.

Formuleringer som er egnet for en topisk administrering, omfatter flytende eller halvfaste preparater som er egnet for penetrasjon gjennom huden til det sted hvor det er nød-vendig med en behandling, såsom linimenter, losjoner, kremer, salver eller pastaer, og dråper som er egnet for administrering til øyet, øret eller nesen.

Dråpene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være sterile vandige eller oljeaktige oppløsninger eller suspensjoner, og de kan fremstilles ved å oppløse den aktive ingrediens i en egnet vandig oppløsning av et baktericid og/eller fungicid middel og/eller hvilket som helst annet egnet konserveringsmiddel, og de omfatter fortrinnsvis også et overflateaktivt middel. Den erholdte oppløsning kan deretter klarnes ved filtrering og overføres til en egnet beholder, som deretter forsegles og steriliseres i en autoklav eller ved å holde den ved 90-100°C i en halv time. Alternativt kan oppløsningen steriliseres ved filtrering og overføres til beholderen ved en aseptisk teknikk. Eksempler på baktericide og fungicide midler som er egnet for å innlemmes i dråpene, er fenylmerkurinitrat eller -acetat (0,002 %), benzalkoniumklorid (0,01%) og klorheksidinacetat (0,01%). Egnede oppløsningsmidler for fremstilling av en oljeaktig oppløsning omfatter glycerol, fortynnet alkohol og propylenglykol.

Losjoner ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter slike som er egnet for påføring på huden eller øyet. En øyelosjon kan være en steril vandig oppløsning, som valgfritt kan inneholde et baktericid, og den kan fremstilles ved metoder som ligner metodene ved fremstilling av dråper. Losjoner eller linimenter for påføring på huden kan også omfatte et middel som fremskynder tørkingen og avkjøler huden, såsom en alkohol eller aceton, og/eller et fuktemiddel, såsom glycerol, eller en olje, såsom ricinusolje eller arachinolje.

Kremer, salver eller pastaer ifølge foreliggende oppfinnelse er halvfaste formuleringer av den aktive ingrediens for ekstern påføring. De kan fremstilles ved å blande den aktive ingrediens i fint oppdelt eller pulverisert form, for seg selv eller i oppløsning eller suspensjon i et vandig eller ikke-vandig fluidum, ved hjelp av egnet maskineri, på fet eller ikke-fet base. Basen kan omfatte hydrokarboner, såsom hard, bløt eller flytende parafin, glycerol, bivoks, en metallisk såpe; en slimet masse; en olje av naturlig opphav såsom mandelolje, kornolje, arachinolje, ricinusolje eller olivenolje; ullfett eller dens derivater, eller en fettsyre, såsom stearinsyre eller oleinsyre, sammen med en alkohol såsom propylenglykol eller makrogoler. Formuleringen kan innlemme hvilket som helst egnet overflateaktivt middel, såsom et anionisk, kationisk eller ikke-ionisk overflateaktivt middel, såsom sorbitanestere eller polyoksyetylenderivater derav. Suspensjonsmidler såsom naturlige gummier, cellulosederivater eller uorganiske materialer, såsom silikaholdig silisiumdioksyd, og andre ingredienser såsom lanolin, kan også innlemmes.

Anti-B7.1-antistoffene eller fragmentene derav ifølge oppfinnelsen kan også administreres sammen med andre komponenter som modulerer B7:CD28-banen. Slike komponenter omfatter f.eks. cytokiner, såsom IL-7 og IL-10, CTLA4-Ig, oppløselig CTLA-4 og anti-CD28-antistoffer og fragmenter derav.

En fagman vil være klar over at den optimale mengde og tidsrommet mellom de enkelte doser av et antistoff eller

fragment derav ifølge oppfinnelsen vil bestemmes ifølge naturen og utstrekningen av tilstanden som behandles, formen, ruten og stedet for administreringen og av det bestemte dyr som skal behandles, og at slike optima kan bestemmes ved

konvensjonelle teknikker. En fagman vil også forstå at det optimale forløp av behandlingen, dvs. antallet doser av et antistoff eller fragment derav iføle oppfinnelsen som skal gis pr. dag i et bestemt antall dager, kan bestemmes av en fagman ved konvensjonelle bestemmelsestester for behand-lingsforløpet .

Kapselsammensetning

En farmasøytisk blanding ifølge foreliggende oppfinnelse i form av en kapsel fremstilles ved å fylle en standard to-delt hårdgelatinkapsel med 50 mg av et antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen i pulverisert form, 100 mg laktose, 32 mg talkum og 8 mg magnesiumstearat.

Injiserbar parenteral sammensetning

En farmasøytisk blanding ifølge foreliggende oppfinnelse som foreligger i en form som er egnet for administrering ved injeksjon, fremstilles ved å omrøre 1,5 vekt% antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen i 10 vol% propylenglykol og vann. Oppløsningen steriliseres ved filtrering.

Salvesammensetning

Antistoff eller fragment derav

Antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen dispergeres i en liten mengde bærerstoff for å gi et glatt, homogent produkt. Sammenpressbare metalltuber fylles deretter med dispergeringen.

Topisk krem- sammensetning

Antistoff eller fragment derav

"Polawax", bivoksen og lanolinet oppvarmes sammen til 60°C. En oppløsning av metylhydroksybenzoat tilsettes, og man ut-fører homogenisering ved omrøring med høy hastighet. Tempe-raturen får deretter falle til 50°C. Antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen tilsettes deretter og dispergeres gjennom blandingen, og sammensetningen for av-kjøles under omrøring med lav hastighet. Topisk losjon- sammensetning Antistoff eller fragment derav

Metylhydroksybenzoatet og glycerinet oppløses i 70 ml vann ved 75°C. Sorbitanmonolauratet, polysorbat 20 og cetostea-rylalkoholen smeltes sammen ved 75°C, og tilføres til den vandige oppløsning. Den erholdte emulsjon homogeniseres og får avkjøles under kontinuerlig omrøring, og antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen tilsettes i form av en suspensjon i resten av vannet. Hele suspensjonen om-røres inntil den er homogen.

Øyedråpesammensetning

Antistoff eller fragment derav

Metyl- og propylhydroksybenzoatene oppløses i 70 ml renset vann ved 75°C, og den erholdte oppløsning får avkjøles. Antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen tilsettes deretter, og oppløsningen steriliseres ved filtrering gjennom et membranfilter (0,022 porestørrelse) og pakkes aseptisk i egnede sterile beholdere.

Sammensetning for administrering ved inhalasj on

For en aerosolbeholder med en kapasitet på 15-20 ml: bland 10 mg antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen med 0,2-0,5% smøremiddel, såsom polysorbat 85 eller oleinsyre, og disperger blandingen i et drivstoff, såsom freon, fortrinnsvis sammen med (1,2-diklortetrafluoretan) og difluorklormetan, og fyll i en egnet aerosolbeholder som er tilpasset enten en intranasal eller oral inhalasjonsadministrering.

Sammensetning for administrering ved inhalasjon

For en aerosolbeholder med en kapasitet på 15-20 ml: oppløs 10 mg antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen i etanol (6-8 ml), tilsett 0,1-0,2% smøremiddel, såsom polysorbat 85 eller oleinsyre; og disperger det hele i et drivstoff, såsom freon, fortrinnsvis sammen med en kombinasjon av (1,2-diklortetrafluoretan) og difluorklormetan, og fyll på en egnet aerosolbeholder som er tilpasset enten en intranasal eller oral inhalasjonsadministrering.

Antistoffene og de farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige ved parenteral administrering, dvs. subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Sammen-setningene for parenteral administrering vil vanligvis omfatte en oppløsning av et antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen, eller en blanding derav, oppløst i et akseptabelt bærerstoff, fortrinnsvis et vandig bærerstoff. Forskjellige vandige bærerstoffer kan brukes, f.eks. vann, bufret vann, 0,4 % saltvann, 0,3% glycin og lignende. Disse oppløsninger er sterile, og generelt frie for partikkel-formet materiale. Disse oppløsninger kan steriliseres ved konvensjonelle, velkjente sterilisasjonsteknikker. Blandingene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestoffer som er nødvendige for å tilpasse løsningen de fysiologiske betingelser, såsom pH-justerende og bufrende midler osv. Konsentrasjonen av antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen i en slik farmasøytisk formulering kan variere innen vide rammer, dvs. fra under 0,5 vekt%, vanligvis ca. eller minst 1 vekt%, inntil 15 eller 20 vekt%, og velges primært på grunnlag av fluidenes volum, viskositet osv., ifølge den bestemte valgte administreringsform.

En farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen for intramuskulær injeksjon, kan dermed f.eks. fremstilles således at den inneholder 1 ml sterilt bufret vann og 50 mg antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen. På lignende måte kan en farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen for intra-venøs infusjon fremstilles således at den inneholder 250 ml steril Ringers oppløsning og 150 mg antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen. De faktiske metoder ved fremstilling av parenteralt administrerbare blandinger er velkjent, eller vil være åpenbare for fagmannen, og de beskrives i større detalj i f.eks. Remington' s Pharmaceutical Science, 15. utg., Mack Publishing Company, Easton, Penn-sylvania, USA.

Antistoffene (eller fragmentene derav) ifølge oppfinnelsen kan lyofiliseres for lagring, og rekondisjoneres i et egnet bærerstoff før bruk. Denne teknikk har vist seg å være virksom med konvensjonelle immunoglobuliner, og man kan bruke lyofiliserings- og rekondisjoneringsteknikker som er kjent innen faget.

Avhengig av det ønskede resultat kan de farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen administreres for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Ved terapeutisk applika-sjon administreres blandingene til en pasient som allerede lider av en sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig for å kurere eller i det minste delvis stanse sykdommen og dens komplikasjoner. Ved profylaktisk bruk administreres blandingene som inneholder antistoffene ifølge oppfinnelsen eller en blanding derav, til en pasient som ikke enda er syk, for å styrke pasientens motstandsevne.

En enkelt eller flere administreringer av de farmasøytiske blandinger kan utføres, idet doseringsmengden og mønstret velges av den behandlende lege. I hvert tilfelle bør den farmasøytiske blanding ifølge oppfinnelsen levere en tilstrekkelig mengde av de endrede antistoffer (eller fragmenter derav) ifølge oppfinnelsen for å virksomt behandle pa-sienten .

Det bør også merkes at antistoffene ifølge oppfinnelsen kan brukes for utvikling og syntese av enten peptid- eller ikke-peptid-forbindelser (mimetika), som kan være nyttige ved samme terapi som antistoffene. Jfr. f.eks. Saragovi et al., Science, 253, 792-795 (1991).

For å ytterligere illustrere oppfinnelsen frembringes de følgende eksempler.

Eksempel 1

Rekombinante immunoglobulinsamlinger som fremvises på flaten av filamentøse fager, ble først beskrevet av McCafferty et al., Nature, 348: 552-554, 1990, og Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88: 7978-7982, 1991. Med denne teknologi har man isolert høyaffinitets antistoffer fra immune humane rekombinante samlinger (Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 589: 10164-10168, 1992). Selv om fag-frem-visningskonseptet som brukes, ialt vesentlig ligner konsep-tet som beskrives av Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88: 7978-7982, 1991, har man modifisert teknikken ved å bruke en ensartet vektor for ape-samlinger for å nedsette muligheten for rekombinasjon og å øke stabiliteten. Denne vektor, pMS, Figur 1, inneholder en enkelt lac-promo-ter/operatør for en virksom transkripsjon og translasjon av polycistronisk tung og lett kjedet ape-DNA. Denne vektor inneholder to forskjellige ledersekvenser, nemlig omp A

(Movva et al., J. Biol. Chem., 255: 27-29 (1980) for den lette kjede, og pel B (Lei, J. Bact., 109: 4379-4383

(1987) for den tunge kjede Fd. Begge ledersekvenser oversettes til hydrofobe signalpeptider som regulerer utsondringen av klonede produkter av lett og tung kjede ut i det periplasmatiske rom. I det oksydative miljø av periplasma, folder seg de to kjeder, og det dannes disulfidbindinger, for å danne stabile Fab-fragmenter. Vi avledet stammen av vektoren fra fagemidet "Bluescript"

(Stratagene, La Jolla, CA, USA). Den inneholder genet for enzymet beta-laktamase, som gir ampicillinresistens (carbenicillinresistens) til bakterier som inneholder pMS-DNA. Vi avledet, også fra "Bluescript", også opphavet for replikasjonen for flerkopi-plasmidet ColEl og opphavet for replikasjon av den filamentøse bakteriofag fl. Opphavet for replikasjon av fagen fl (det såkalte intragen-parti) signaliserer en initiering av syntesen av enkeltkjedet pMS-DNA, en initiering av kapsiddannelsen, og termineringen av RNA-syntesen, ved virale enzymer. Replikasjonen og sammensetningen av pMS-DNA-kjeder til fagpartikler er avhengig av virale proteiner, som må leveres av en hjelper-fag. Vi har brukt hjelper-fagen VCSM13, som er spesielt godt egnet for dette formål, fordi den også inneholder et gen som koder for kanamycinresistens. Bakterier som er in-fisert med VCSM13 og pMS, kan velges ved å tilsette både kanamycin og carbenicillin til vekstmediet. Bakterien vil endelig fremstille filamentøse fag-partikler som inneholder enten pMS- eller VCSM13-genomer. Innpakkingen av hjelper-fagen er mindre virksom enn for pMS, og fører til en blandet fag-populasjon som inneholder hovedsaklig rekombinante pMS-fager. Endene av fagen plukker opp mindre belegnings-proteiner som er spesifikke for hver ende. Av spesiell interesse er her gen III-produktet, som foreligger i 3-5 kopier i den ene ende av fagen. Gen III-produktet er 406 aminosyrer langt, og er nødvendig for en fag-infeksjon av E. coli via F pili. De første to domener av den tunge kjede, nemlig den variable domene og CHl-domenen, kombinerer med gen III-proteinets karboksyterminale halv-

del. Dette rekombinante pili-protein, som rettes av

pel B-lederen, utsondres til peroplasma, hvor den akkumule-res og danner disulfidbindinger med lett kjede før den innlemmes i fag-belegningen. Dessuten inneholder en annen vektor FLAG-sekvensen, innføyd nedstrøms for gen III. FLAG er et 8 aminosyrer langt peptid som uttrykkes i karboksyende av Fd-proteinet. Vi bruker kommersielt tilgjengelig monoklonalt anti-FLAG M2 både for rensing og påvisning av fag-Fab ved ELISA (Brizzard, Bio Techniques, 16 (4): 730-731

(1994)) .

Etter konstruksjon av vektoren pMS, testet vi dens evne til å fremstille fag-bundet Fab ved bruk av kontroll-antistoff-gener. Vi klonet et anti-tetanustoksin-antistoff (erholdt fra Dr. Carlos Barbas) inn i pMS og transformert "XLI-blue". Vi ko-infiserte våre celler med VCSM13 og genererte en fag som fremviste anti-tetanustoksin-antistoffet. Vi ut-førte effisiens-eksperimenter hvor anti-tetanustoksin-fagen ble slått sammen med en fag som oppviste et irrelevant antistoff, i forholdet 1:100.000. Vi utførte tre vaskeomganger ved å tilføre 50 ^1 av den blandede fag til antigen-bestrøkne (tetanustoksin) polystyrenbrønner. Ikke-klebende fager ble vasket bort, og de fastklebende fager ble eluert med syre. De eluerte fager ble brukt for å infisere en fersk alikvot av XLl-Blue-bakterier, og man tilsatte hjelper-fag. Etter amplifikasjon over natten fremstilte man fager, og renset dem igjen på antigenbestrøkne plater. Etter tre vaskeomganger kunne vi vise at vi fremgangsrikt hadde anriket anti-tetanustoksin-fagen. Fremgangen av denne teknologi er også avhengig av evnen til å fremstille opplø-selige Fab'er for en karakterisering av det endelig rensede produkt. Dette ble oppnådd ved å skjære ut gen III fra pMS-DNA ved bruk av restriksjonsenzymet Nhe I, etterfulgt av en re-ligering. Etter at gen III ble skåret ut, ble Fab'en ikke lenger fremvist på fag-overflaten, men samlet seg opp i det periplasmatiske rom. Lysater ble fremstilt fra bakterier som uttrykte oppløselig Fab, og testet for antigen-spesifisiteten ifølge ELISA. Man påviste store mengder oppløselig Fab.

For å tilpasse fag-fremvisningsteknologien for bruk med javaape-samlinger, utviklet vi spesifikke primere for PCR-amplifikasjon av ape-immunoglobulin-gener. Disse baserte seg på javaape-sekvensen som vi dannet mens vi utviklet "PRIMATIZED"-antistoffteknologien (jfr. USSN 08/379.072) og databaser som inneholdt humane sekvenser (Kabat et al.

(1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. of Health and Human Services, National Institute of Health).

Vi utviklet tre primersett for å dekke amplifikasjonen av javaape-samlingen. Vårt første primersett ble utviklet for amplifikasjon av tung kjede VH- og CH1- (Fd-) domenene. Det bestod av en 3'-CHl-domeneprimer og seks 5'-VH-familiespe-sifikke primere som ble bundet i ramme 1-partiet. Vårt andre primersett, utviklet for å amplifisere hele lambda-kjeden, dekker de mange lambda-kjede-undergrupper. Det består av en 3'-primer og tre 5'-avledede primere som bindes i VL-ramme 1-partiet. Vårt tredje primersett ble utviklet for en amplifikasjon av kappa-kjede-undergruppene. Det består av en 3'-primer og fem VK-ramme 1-primere. Ved bruk av hvert av disse sett ble PCR-parametrene optimert for å er-holde tilstrekkelig sterke signaler fra hvert primerpar for at det ble gjort tilstrekkelig materiale tilgjengelig for å klone samlingen. Vi satte nylig sammen javaape-kombinato-riske samlinger i vår pMS-vektor ved bruk av disse optimer-te PCR-betingelser. Benmargbiopsier ble tatt fra CD4-immune aper, som kilde for immunoglobulin-RNA. Samlingene inneholdt ca. IO<6> elementer, og gjennomgås for tiden ved rensing for å finne spesifikke bindere, på antigenbestrøkne brønner.

Eksempel 2

Utvikling av B7/ CTLA- 4- reagenser

Vi har generert et antall reagenser med det formål å immunisere aper, utvikle bindings- og funksjonelle assayer in vi tro, velge ut heterohybridomaer og gjennomgå fag-samlinger. I Tabell 1 er hver reagens og dens formål oppført. I tilfellet av B7.1 trakk man ut RNA fra SB-cellene og omdannet dette til cDNA ved revers transkriptase. Den første cDNA-kjede ble PCR-amplifisert ved bruk av B7.1-spesif ikke primere og klonet inn i IDECs NEOSPLA-pattedyr-ekspresjonsvektorer. CHO-celler ble transfisert med B7.1-NEOSPLA-DNA, og kloner som uttrykte membranforbundet B7.1, ble identifisert. B7.1-fusjonsproteinet ble generert på lignende måte, unntatt at det PCR-amplifiserte B7.1-gen ble klonet inn i en NEOSPLA-kassettvektor som inneholdt humane CH2- og CH3-immunoglobulin-gener. CHO-celler ble omdannet med B7.1/Ig-NEOSPLA-DNA, og stabile kloner som utsondret B7.1/Ig-fusjonsprotein, ble amplifisert. Generelt ble B7.2 og CTLA4-reagensene generert på samme måte, unntatt at man for B7.2 isolerte RNA'et fra humane miltceller som var blitt stimu-lert i 24 timer med anti-Ig og IL-4, og for CTLA4-konstruk-sjonene var kilden for genene PHA-aktiverte humane T-celler.

Tilgjengeligheten av disse reagenser, sammen med monoklonale antistoffer mot B7.1 (L3074) (Becton Dickinson, 1994) og B7.2 (Fun-1) (Engel et al., Blood, 84, 1402-1407 (1994)) og renset geite- og kanin-antiserum, spesielt utviklet for å påvise ape-Fab-fragmenter, forenkler identifikasjonen av antistoffer som har de ønskede egenskaper.

Eksempel 3

Undersøkelse av immunresponsen i synomolge aper på oppløse-lig og celle forbundet humant Bl. 1

For å bedømme mulighetene for å fremstille ape-antistoffer mot humant B7.1-antigen, renset vi først rekombinant SB7.1 fra CHO-cellemedium ved affinitetskromatografi med en L307.4-sepharose-affinitetskolonne. SB7.1 ble deretter in-jisert sammen med et hjelpestoff til fem voksne synomolge javaaper. Etter et tidsrom på 3-4 måneder med booster-immu-niseringer, ble serum fra apene som var blitt immunisert med SB7.1 eller humane SB-celler, testet for antigenbin-ding.

Serumprøver fra de fem apene som var blitt immunisert med SB7.1, og fra tre ytterligere dyr som var blitt immunisert med B7.1-positive humane SB-celler, ble testet for å bestemme antistofftiteren mot membranforbundet B7.1 som ble uttrykt i transfiserte CHO-celler. Resultatene som er oppsummert på Figur 3, viste at fire av fem aper som var blitt immunisert med affinitetsrenset SB7.1, produserte antistoff titere på over 1:5000. De tre dyrene som var blitt immunisert med SB-celler som inneholdt cellebundet B7.1, uttrykte lavere antistofftitere som varierte fra 1:1400 til 1:2800.

Eksempel 4

Vi renset antistoffer fra seraene fra alle åtte immuniserte aper, ved bruk av SB7.1-sepharose, og testet deretter deres evne til å bindes til 1) SB7.1-bestrøkne plater i en ELISA-undersøkelse; 2) antigenpositive B-celler og 3) B7.1-CHO-transfektomaer. I tillegg ble de bedømt for sin evne til å blokkere B-celle-vekselspill, målt ifølge IL-2-produksjonen og opptaket av tritiert tymidin i en blandet lymfocyttreaksjon (MLR). For T-celle bindingseksperimenter dyrket man humane perifere blodlymfocytter med "buffy coat" i 3-6 dager i nærvær av PHA-stimulator. B7-bindingen ble påvist ved et radioassay ved bruk av 12<5>I-radiomerket oppløselig B7.1 (SB7.1).

Eksempel 5

Direkte binding av ape- antistoffer til radiomerket SB7

<125>I-radiomerket SB7.1 ble testet for sin binding til anti-B7.1-antistoffer med 4, 1 og 0,25 ^g/ml i oppløsning. Resultatene som vises i Tabell 2, tyder på at de fleste antistoffer som ble fremstilt av aper som var blitt immunisert med SB7.1, hadde evnen til å binde det affinitetsrensede <125>I-SB7.1 på en konsentrasjonavhengig måte. For å bedømme spesifisiteten av bindingen til merket SB7.1, utførte man konkurranseeksperimenter med umerket SB7.1 med antistoffene fra to dyr. Affinitetsrensede antistoffer fra apene 1133 og 1144 ble bestrøket på mikrobrønnplater med 400 ng/brønn.

Affinitetsrenset umerket SB7.1 (500 og 100 ng/brønn) ble brukt som konkurrent. Resultatene som vises på Figur 4, demonstrerer at SB7.1-preparater virksomt hemmer <125>I-SB7.1 i å bindes til antistoffene.

Dataen angir de midlere verdier for to tester, og representerer det bundne SB7-I<125> i cpm.

Eksempel 6

Direkte binding av radiomerkede a f f initetsrensede ape- antistoffer til B7+ - celler og hemming med SB7. 1.

Affinitetsrensede og radiomerkede ape-anti-B7.1-antistoffer fra ape-PRI135 ble sammenlignet med radiomerkede L307.4-MAb'er for sin direkte binding til B7-positive humane SB-celler. Som spesifisitetskontroll tilsatte man umerket SB7.1 (0,002-20 ug/ml) for å konkurrere med begge de radiomerkede antistoffer. Vi demonstrerte at ape-antistoffene kan binde celleforbundet B7.1, og at de hemmes med SB7.1, som vist på Figur 5. En hemming på inntil 90% ble observert for SB7.1.

Eksempel 7

Direkte binding av radiomerket B7- Ig- fusjonsprotein til aktiverte T- celler, og hemming med a ffinitetsrensede ape- antistoffer

Humane perifere blod-T-lymfocytter ble aktivert i 3-6 dager og testet for en direkte binding av <125>I-B7.1-Ig. På grunn av oppreguleringen av Fc-receptor på aktiverte humane T-celler, var det nødvendig å på forhånd inkubere cellene med varme-aggregert immunoglobulin fra før immuniseringen for å blokkere Fc-bindingsstillingene før tilsetning av B7.1-Ig til cellene. En bakgrunnskontroll som brukte SP2/0-murine myleomaceller, ble innlemmet i testen for å tillate en ret-telse av bakgrunnsbindingen. Figur 6 viser at hemmingen av <125>I-B7.1-Ig-fusjonsproteinets binding til aktiverte T-celler, ble oppnådd med affinitetsrensede ape-antistoffer ved konsentrasjoner fra 200 til 8 ^g/ml. Umerkede SB7.1- og L307.4-MAb'er som ble brukt som kontroller, hemmet også virksomt B7.1-Ig-fusjonsproteinets cellebinding.

Eksempel 8

Hemming av IL- 2- produksjonen i blandede lymfocyttreaksjoner med ape- anti- B7- antistoffer

En blokkering av CD28/B7-vekselspillet fører til hemming av T-lymfocytters IL-2-produksjon. I eksperimentet som vises på Figur 7, bedømte man affinitetsrensede ape-antistoffer fra to aper som var blitt immunisert med SB7.1 (apene 1137 og 1135) og én ape som var blitt immunisert med B7-positive SB-celler (ape 114 6) for deres evne til å hemme en aktive-ring av humane T-celler i en blandet lymfocyttreaksjon (MLR), målt ifølge hemmingen av IL-2-produksjonen. Resultatene av dette eksperiment viser at affinitetsrensede anti-B7.1-antistoffer fra apene 1146 og 1137 hemmet IL-2-produksjonen når de ble tilsatt i en konsentrasjon på 50 ^g/ml. Antistoffene fra ape 1135 kunne ikke bedømmes ved de to høyeste konsentrasjoner grunnet en mangel på materiale, men gav en signifikant hemming ved lavere konsentrasjoner. Murint MAb L307.4 virket hemmende ved konsentrasjoner på 10 ^g/ml. Andre ape-sera som ble testet ved disse konsentrasjoner, gav negative resultater (dataen ikke vist). Disse resultater viser at minst tre av apene som ble immunisert med oppløselige eller membranbundne former av B7-antigen, produserer B7-blokkerende antistoffer med immunosuppressivt potensial.

Eksempel 9

Undersøkelse av kryssreaktiviteten i Bl. 1- immunisert apeserum med B7. 2- antigen

Antistoffer som ble fremstilt mot B7.1, skal testes for sin kryssreaktivitet med B7.2. Foreløpige resultater med affinitetsrensede B7.1-antistoffer fra B7.1-immune sera, tydet på en binding til B7.2-transfiserte CHO-celler (ikke vist). Disse data bør bekreftes ved bruk av oppløselige B7.2-Ig-reagenser. Vi skal først isolere ytterligere ape-antistoffer fra B7.1-immuniserte dyr ved affinitetskromatografi på B7.1-Ig-sepharose. Deretter skal vi fremstille og rense B7.2-Ig fra CHO-celler, i tilstrekkelige mengder for å fremstille en B7.2-Ig-sepharose-affinitetskolonne. Fra den B7.1-spesifikke antistoffpopulasjon skal vi velge de antistoffer som kryssreagerer med B7.2 ifølge bindingen til B7.2-Ig-sepharosekolonnen. Eventuelle kryssreaktive antistoffer som identifiseres, skal ytterligere karakteriseres ifølge sin direkte binding til både B7.1- og B7.2-transfiserte CHO-celler og ifølge hemmingen av en binding av B7.1-Ig til B7.2-transfiserte celler.

Eksempel 10

Generering av en fag- fremvisningssamling

Rekombinante fag-fremvisningssamlinger genereres fra B7.1-og B7.2-immune aper. Lymfeknute- og benmargbiopsier utføres 7-12 dager etter immuniseringen for å samle RNA-anrikede B-celler og plasmaceller. RNA isoleres fra lymfocyttene ved metoden som beskrives av Chomczynski, Anal. Biochem., 162 (1), 156-159 (1987). RNA omdannes til cDNA ved bruk av en oligo-dT-primer og revers transkriptase. Den første kjede-cDNA deles opp i alikvoter og PCR-amplifiseres ved bruk av de tidligere beskrevne kappa-, lambda- og tung kjede-Fd-region-primersett som ble beskrevet tidligere, og enten Pfu-polymerase (Stratagene, San Diego, USA) eller Taq-polymerase (Promega, Madison, USA). Tung kjede-PCR-amplifiserte produkter samles, spaltes med Xho VSpe I-restriksjonsenzy-mer og klones inn i vektoren pMS. Deretter samles lett kjede-PCR-produktene, spaltes med Sac I/Xba I-restriksjons-enzymer og klones for å danne den rekombinante samling. XLI-Blue-£. coli omdannes med samlings-DNA og super-infise-res med VCSM13 for å gi de fag-fremvisende antistoffer. Samlingen vaskes i fire omganger på polystyrenbrønner som er bestrøket med B7.1- eller B7.2-antigen. Enkelte fag-kloner fra hver vaskeomgang analyseres. pMS-vektor-DNA isoleres, og gen III skjæres ut. Oppløselige Fab-fragmenter genereres og testes i ELISA-undersøkelser for sin binding til B7.1 og B7.2.

Eksempel 11

Karakterisering av fag- Fab- fragmenter

Apenes fag-Fab-fragmenter karakteriseres ifølge sin spesifisitet og sin evne til å blokkere B7.1-Ig- og B7.2-Ig-bindingen til CTLA-4-Ig eller CTLA-4-transfiserte celler. Fag-fragmentene karakteriseres også ifølge sin kryssreaktivitet etter de første fire vaskeomganger på B7-typen som ble brukt for immunisering, for å velge fragmentene med høy affinitet. Fab-fragmenter som identifiseres etter fire vaskeomganger på enten B7.1- eller B7.2-antigen-bestrøkne flater, oppskaleres ved infeksjon, og dyrkes i 24 timers gjæringskulturer av E. coli. Fragmentene isoleres ved Kodak FLAG-binding til en anti-FLAG-affinitetskolonne. Rensede fag-Fab'er testes for sin affinitet ifølge en ELISA-under-søkelse som baserer seg på bindingsmodifisert Scatchard-analyse (Katoh et al., J. Chem. BioEng., 76: 451-454

(1993)) med geite-anti-ape-Fab-antistoffer eller anti-FLAG-MAb som er konjugert med pepperrot-peroksydase. Anti-ape-Fab-reagensene skal absorberes mot human tung kjede-konstant parti-Ig for å fjerne en eventuell kryssreaktivitet med B7-Ig. Kd-verdiene beregnes for hvert fragment etter målinger av den direkte binding til B7.1-Ig- eller B7.2-Ig-bestrøkne plater.

Eksempel 12

Fag- Fab- fragmenters blokkering av CTLA- 4/ B7- bindingen

Fab-fragmentene som blokkerer bindingen av B7-Ig mest virksomt ved de laveste konsentrasjoner, velges som førende kandidater. Utvalget gjøres ved konkurrerende <125>I-B7-Ig<->binding til CTLA-4-Ig eller CTLA-4-transfiserte celler. Andre utvalgskriterier omfatter blokkeringen av en blandet lymfocyttreaksjon (MLR) ifølge hemmingen av 3H-tymidin-opptaket i responderceller (Azuma et al., J. Exp. Med., 177: 845-850; Azuma et al., Nature, 301: 76-79 (1993)) og direkte analyse av IL-2-produksjonen ved hjelp av IL-2-assay-sett. De tre eller fire kandidater som viser seg å være mest virksomme i MLR-hemmingsassayet og CTLA-4-bindings-assayet, velges for kloning inn i den ovenfor beskrevne pattedyr-ekspresjonsvektor, for transfeksjon av CHO-celler og ekspresjon av chimeriske ape/humane antistoffer.

Eksempel 13

Generering av ape- heterohybridomaer

Ape-heterohybridomaer som utsondrer monoklonale antistoffer, genereres utifrå eksisterende immuniserte dyr, hvis serum testet positivt for B7.1 og/eller B7.2. Lymfeknutebiopsier tas fra dyrene som tester positivt for et av, eller begge, antigenene. Metoden for fremstilling av hybrido-maer ligner den anerkjente metode som brukes ved generering av ape-anti-CD4-antistoffer (Newman et al. (1992), Biotechnology, 10, 1455-1460). Fra aper med høye serumtitere fjer-ner man under bedøvelse snitt av ingvinale lymfeknuter. Lymfocyttene vaskes vekk fra vevet og kombinerer med KH6/B5-heteromyelomaceller (Carrol et al., J. Immunol. Meth., 89: 61-72 (1986)) ved bruk av polyetylenglykol (PEG). Hybridomaene velges på H.A.T.-medium og stabiliseres ved gjentatt subkloning i 96-brønners plater.

Monoklonale ape-antistoffer som er spesifikke for B7.1-antigen, testes for sin kryssreaktivitet med B7.2. Ape-anti-B7-antistoffene skal karakteriseres ifølge blokkeringen av B7/CTLA-4-bindingen ved bruk av 12<5>I-B7-Ig-bindingsassayet. Hemmingen av MLR ifølge 3H-tymidin-opptaket og en direkte måling av IL-2-produksjonen brukes for å velge tre kandidater. To kandidater vil fortsette i fase II-undersøkelser og uttrykkes i CHO-celler mens man gjentar alle funksjonelle undersøkelser. For å utvikle en dyremodell for in vivo- f ar-makologi, skal anti-B7-antistoffene testes på celler fra forskjellige dyrearter. Bestemmelsen av en dyremodell vil gjøre det mulig å utføre prekliniske undersøkelser for den valgte kliniske indikasjon.

Eksempel 14

Som beskrevet ovenfor, har man ved bruk av de ovennevnte heterohybridoma-metoder identifisert fire førende ape-anti-

B7.1-antistoffer: 16C10, 7B6 og 7C10. Disse antistoffer ble karakterisert som følger:

For å demonstrere ape-antistoffenes evne til å blokkere den fysiske vekselvirkning mellom CTLA4-Ig, inkuberte man forskjellige konsentrasjoner av ape-anti-B7.1-antistoffer og umerket CTLA4-Ig med radiomerket CTLA4-Ig<1>125. Resultatene av hemmingsassayet viste at IC50 (den konsentrasjon av in-hibitor som fører til 50 % hemming) for ape-antistoffene er:

Scatchard-analyse viste at de tilsynelatende affinitets-konstanter (Kd) for ape-antistoffenes binding til B7-Ig-be-strøkne plater var omtrent:

Antistoffene ble testet in vitro i et blandet lymfocytt-reaks jonsassay (MLR). MLR-undersøkelsen viste at alle fire anti-B7.1-antistoffer hemmer IL-2-produksjonen, i forskjellig grad:

Ape-anti-B7.1-antistoffene ble testet for sin evne til å binde B7 på humane perifere blodlymfocytter (PBL). FACS-analyse viste at alle fire ape-antistoffene testet positive .

Ape-antistoffene 16C10, 7B6 og 7C10 ble testet for sin Clq-binding ifølge FACS-analyse. Resultatene viste at 7C10-ape-Ig hadde en sterk Clq-binding etter inkubasjon med B7.1-transfiserte CHO-celler. 16C10 testet negativ, liksom også ape-antistoffet 7B6.

Eksempel 15

Ved bruk av metodologien for primatiserte antistoffer (USSN 08/379.072, og ved bruk av NEOSPLA-vektorsystemet som vises på Figur 2), klonet man de tunge og lette variable domener av 7C10, 7B6 og 16C10, og primatiserte former derav er blitt fremstilt i CHO-celler ved bruk av NEOSPLA-vektorsystemet. Aminosyre- og nukleinsyresekvensene for den lette og tunge kjede av primatisert 7C10, lette og tunge kjede av primatisert 7B6 og lette og tunge kjede av primatisert 16C10, vises på henholdsvis Figurene 8a, 8b, 9a, 9b, 10a og 10b.

Det forventes at disse primatiserte antistoffer med sin sannsynligvis lave antigenisitet og humane effektorfunksjon, vil være velegnet for bruk som terapeutika. Faktisk har man nylig vist at primatisert 16C10 oppviser en binding til humant Cl9, mens 16C10 ikke bindes dertil.

Claims

1. Monoklonalt apeantistoff, en primatisert form derav eller et fragment av det monoklonale apeantistoffet eller primatiserte form derav som binder til en epitop av humant CD80 antigen og som også blir bundet av et antistoff omfattende lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser valgt fra gruppen bestående av: (a) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 7C10 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2; (b) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 7B6 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4; og (c) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

2. Monoklonalt ape-antistoff, en primatisert form derav eller et fragment av det monoklonale ape-antistoff eller en primatisert form derav ifølge krav 1, som binder til humant CD80 antigen og omfatter lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser valgt fra gruppen bestående av: (a) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 7C10 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2; (b) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 7B6 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4; og (c) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1 eller krav 2, og som omfatter et lettkjede konstant område av en human antistoff lett kjede, og et tungkjede konstant område av en human antistoff tung kjede.

4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 3, hvilket omfatter et tungkjede konstant område valgt fra humant gamma 1 konstant område, humant gamma 4 konstant område og humant gamme 4 PE konstant område.

5. Monoklonalt antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 4 som er et utmagrende antistoff.

6. Monoklonalt antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 4 som er et ikke-utmagrende antistoff.

7. Antistoff-fragment ifølge krav 1 eller krav 2 som er et (Fab')2-, Fab- eller Fv-fragment.

8. Isolert nukleinsyre omfattende nukleotidsekvenser som koder for de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av et antistoff i henhold til krav 1 eller krav 2.

9. Isolert nukleinsyre ifølge krav 8, hvilken omfatter nukleotidsekvenser valgt fra gruppen bestående av: (a) nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2; (b) nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4; og (c) nukleotidsekvensene angitt i SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

10. Dyrket celle som danner et antistoff eller fragment derav i henhold til ethvert av kravene 1-7.

11. Dyrket celle ifølge krav 10, hvilken er et CHO transfektom.

12. Dyrket celle ifølge krav 10, hvilken danner et chime-risk antistoff som binder til humant CD80 antigen og som omfatter et lettkjede konstant område av en human antistoff lett kjede, et tungkjede konstant område av en humant antistoff tung kjede samt variable områder omfattende polypeptidsekvenser valgt fra gruppen bestående av: (a) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 7C10 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 2; (b) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 7B6 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 3 og SEQ ID NO: 4; og (c) de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

13. Farmasøytisk sammensetning som inneholder et antistoff eller fragment derav som binder til humant CD80 antigen ifølge ethvert av kravene 1 til 7.

14. Anvendelse av en sammensetning omfattende minst et antistoff eller fragment derav som binder til humant CD80 antigen ifølge ethvert av kravene 1 til 7, for fremstilling av et medikament til behandling eller forebygging av en sykdom eller lidelse som er valgt fra gruppen bestående av autoimmun sykdom eller lidelse, transplantat-mot-verts-sykdom, avstøtning av et transplantert organ eller vev, infek-sjonssykdom, inflammatorisk sykdom og B-celle-lymfom.

15. Anvendelse ifølge krav 14 for fremstilling av et medikament til behandling eller forebygging av transplantat-mot-vertssykdom eller avstøtning at et transplantert organ eller vev, hvor transplantatet eller det transplanterte organ eller vev er valgt fra nyre, hjerte, lunge, benmarg, hud og kornea.

16. Anvendelse ifølge krav 14, hvor sykdommen eller lidel-sen er valgt fra gruppen bestående av AIDS, Hashimotos ty-roitidis, myasthenia gravis, uveitis, nefrotisk syndrom, atopisk dermatitt, kontakt-dermatitt, seborrhesik dermatitt, eksematøs dermatitt, fotsopp, pemfigus, bulløs pemfigus, epidermolysis bullosa, urtikaria, angiødemer, vaskuli-tides, erytema, kutan eosinofila, alopecia areata, reversibel obstruktiv luftveissykdom, migrene, eksem, rhinitt, andre allergiske tilstander, proliferativ sykdom, tarmin-flammasjon, søliaki, procitis, eosinofilia gastroenteritis, mastocytose, Chrons sykdom og ulcerativ kolitt.

17. Anvendelse ifølge krav 14, hvor den autoimmune lidelse er valgt fra idiopatisk trombocytopenia purpura, lupus ery-tenmatosus, systemisk lupus etytematosus, type 1 diabetes mellitus, rheumatoid artritt, psoriasis, multippel sklerose og aplastisk anemi.

18. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 13, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning inneholder et antistoff eller fragment derav ifølge krav 1, og nevnte antistoff eller fragment binder til en epitop av humant CD80 antigen som også blir bundet av et antistoff omfattende de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 som angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

19. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 13, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning inneholder et antistoff ifølge krav 1, og nevnte antistoff er en primatisert form av et monoklonalt ape-antistoff som binder til en epitop av humant CD80 antigen som også blir bundet av et antistoff omfattende de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 som angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

20. Anvendelse av sammensetning omfattende minst et antistoff eller fragment ifølge ethvert av kravene 1 til 7 for fremstilling av et medikament til behandling eller forebygging av et B-celle-lymfom.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor sammensetningen omfatter minst et antistoff eller fragment ifølge krav 1, og nevnte antistoff eller fragment binder også til en epitop av humant CD80 antigen som også blir bundet av et antistoff omfattende lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 som angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

22. Anvendelse ifølge krav 20, hvor sammensetningen omfatter et antistoff ifølge krav 1, og nevnte antistoff er en primatisert form av det monoklonale apeantistoffet som binder til en epitop av humant CD80 antigen som også blir bundet av et antistoff omfattende lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 som angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

23. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, hvor nevnte antistoff er en primatisert form av et monoklonalt ape-antistoff som binder til en epitop av humant CD80 antigen som også blir bundet av et antistoff omfattende de lett- og tungkjede variabelt område polypeptidsekvenser av antistoff 16C10 som angitt i henholdsvis SEQ ID NO: 5 og SEQ ID NO: 6.

24. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 13 for anvendelse som et immunoundertrykkende middel.