NO324412B1 - Fremgangsmate for fremstilling av differensierte celler fra pattedyrnervestamceller - Google Patents

Fremgangsmate for fremstilling av differensierte celler fra pattedyrnervestamceller Download PDF

Info

Publication number
NO324412B1
NO324412B1 NO19951617A NO951617A NO324412B1 NO 324412 B1 NO324412 B1 NO 324412B1 NO 19951617 A NO19951617 A NO 19951617A NO 951617 A NO951617 A NO 951617A NO 324412 B1 NO324412 B1 NO 324412B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
cells
neurons
egf
neural
differentiated
Prior art date
Application number
NO19951617A
Other languages
English (en)
Other versions
NO951617D0 (no
NO951617L (no
Inventor
Samuel Weiss
Brent A Reynolds
Joseph P Hammang
Edward E Baetge
Original Assignee
Neurospheres Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25513066&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO324412(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Neurospheres Holdings Ltd filed Critical Neurospheres Holdings Ltd
Publication of NO951617D0 publication Critical patent/NO951617D0/no
Publication of NO951617L publication Critical patent/NO951617L/no
Publication of NO324412B1 publication Critical patent/NO324412B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01011—Phosphopyruvate hydratase (4.2.1.11), i.e. enolase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/148—Transforming growth factor alpha [TGF-a]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Fremgangsmåter for å øke antallet neural stamceller som
differensierer til astrocyter, oligodendrocyter eller neuroner
er beskrevet. De omfatter proliferering av Isolerte neural
stamceller i et kulturmedium med en første vekstfaktor for å
danne forløperceller. Forløpercellene blir deretter
differensiert i astrocyter, oligodendrocyter eller neuroner i et
andre kulturmedium, fri for første vekstfaktor, inneholdende
en andre vekstfaktor eller kombinasjon av vekstfaktorer.
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av differensierte celler fra pattedyrnervestamceller.
En fremgangsmåte for preparering av differensierte celler fra forløperceller er beskrevet hvor de isolerte neural stamcellene blir proliferert, in vitro, i kulturmedium inneholdende en vekstfaktor som induserer produksjonen av forløpercellene. Forløpercellene blir deretter differensiert i et andre kulturmedium med en andre vekstfaktor eller kombinasjon av vekstfaktorer (Cattaneo and McKay, Nature, vol. 347, 1990). Den vesentlige fenotypen til de differensierte cellene er avhengig av seleksjon av den andre vekstfaktor eller de andre vekstfaktorer.
Utviklingen av nervesystemet begynner i et tidlig stadium av den føtale utviklingen. Neurogenese, dannelse av nye neuroner, er fullført tidlig i postnatalperioden. Synaptiske koblinger som er involvert i neuralkretser blir kontinuerlig endret i løpet av individets levetid på grunn av synaptisk plastisitet og celledød.
Det første trinnet i neuralutviklingen er celledannelse, som er den nøyaktige temporale og romlige rekkefølgen hvor forløperen eller progenitorcellene prolifererer og differensierer. Prolifererende celler vil gi opphav til neuroblaster, glioblaster og stamceller.
FGF er tidligere blitt beskrevet å stimulere proliferering og differensiering av neuralforløperceller in vitro (Murphy et al, Journal of Neuroscience Research, 25:463-475). Videre er det også tidligere beskrevet proliferering og differensiering av neurale celler avledet fra mus, hvor nevnte celler kan differensiere til astrocytter og neuroner, men ikke til oligodendrocytter (Kitani et al, 1991, In Vitro Cell Dev Biol, 27A:615-624). Det er også kjent at neurale forløperceller kan prolifereres i et medium inneholdende EGF, og at disse cellene kan differensieres til neuroner og astrocytter, men ikke til oligodendrocytter, ved etterfølgende kultivering i et medium fritt for EGF (Mytilineou et al, 1992, Neuroscience Letters, 135:62-66).
Det andre trinnet er en periode med celletype differensiering og migrering når forløpercellene blir neuroner og gliaceller og migrerer til deres endelige posisjoner. Celler som er avledet fra nerverøret (tube) gir opphav til neuroner og gliaceller i sentralnervesystemet (CNS), mens celler avledet fra neural crest gir opphav til celler i det perifere nervesystemet (PNS). Visse faktorerer til stede under utviklingen, så som nervevekstfaktor (NGF), fremmer veksten av neuralceller. NGF blir utskilt av cellene i neural crest og stimulerer utvekst og vekst av neural aksoner.
Det tredje trinnet i utviklingen oppstår når celler erverver spesifikke fenotypiske kvaliteter, så som ekspresjon av spesielle neurotransmittere. Ved dette tidspunktet sender neuronene også utløpere som danner synapser med sine mål. Neuroner blir ikke delte etter differensieringen.
Selektiv celledød oppstår hvor degenerasjon og død av spesifikke celler, fibere og synaptiske koblinger fininnstiller det omfattende kretssystemet i nervesystemet. Denne fininnstillingen fortsetter i løpet av vertens liv. Senere i livet kan selektiv degenerasjon forårsaket av aldring, infeksjon og andre ukjente etiologier føre til neurodegenerative sykdommer.
Nylig har konseptet med neurologisk vevspodning blitt anvendt for behandling av neurologiske sykdommer så som Parkinsons sykdom. Neuralpodninger kan føre til at det ikke lenger er behov for konstant medikamentadministrering, og også at det ikke er behov for kompliserte medikamentleveringssystemer som er nødvendig på grunn av blod-hjerne barrieren. Det er derimot begrensninger i denne teknikken. For det første kan celler anvendt for transplantasjon som bærer celleoverflate molekyler til en differensiert celle fra en annen vert indusere immunreaksjoner hos verten. I tillegg må cellene være i et stadium av utviklingen hvor de har evne til å danne normale neuralkoblinger med nær liggende celler. På grunn av dette har de innledende studiene på neurotransplantasjon vært sentrert rundt anvendelse av føtale celler. Perlow et al., beskriver transplantasjon av føtale dopaminerge neuroner til voksne rotter som kjemisk induserer nigrostriatallesjoner i "Brain grafts reduce motor abnormalities produced by destruction of nigrostriatal dopamine system, "Science 204:643-647 (1979). Disse podningene har vist god overlevelse, aksonal utvekst og signifikant redusert bevegelsesfeil hos vertsdyr. Lindvall et al., i "Grafts of fetal dopamine neurons survive and improve motor function in Parkinson's Disease," Science 257:574:577 (1999), viste at neural transplantasjon av humane føtale mesencefaliske dopaminneuroner kan gjennopprette dopaminsyntesen og lagringen, og redusere rigiditeten og bradykinesi hos pasienter som lider av Parkinsons sykdom. Freed, et al., i "Transplantation in human fetal dopamine cells for Parkinson's Disease, "Arch. Neurol. 47:505-512 (1990) har også vist forbedring hos en pasient som fikk tilført et føtalt transplantat.
Ovennevnte referanser beskriver at føtalt hjernevev fra pattedyr har gode overlevelsesmuligheter ved øyeblikkelig transplantasjon. Den økte evnen til overlevelse av føtale neuroner antas å være forårsaket av den reduserte mottageligheten som føtale neuroner har overfor anoksi enn voksne neuroner, og også på grunn av mangel på celleoverflatemarkører hos føtale celler hvor tilstedeværelsen kan føre til avstøting av transplantert vev fra voksne. Til tross for at hjernen anses som et immunologisk privilegert område kan en viss avstøtning av føtalt vev oppstå. Muligheten for å anvende føtalt vev er derfor begrenset, ikke bare på grunn av avstøtning av føtale vev isolert fra en annen vert, og på grunn av det derved oppståtte behovet for immunsuppresive medikamenter, men også på grunn av etiske problemer ved anskaffelse av føtale vev. Neonatalhjernevev har begrenset kapasitet for overlevelse og CNS neuroner fra voksne pattedyr overlever generelt ikke transplantasjon til hjernen. Til tross for at CNS neuroner fra voksne ikke er gode kandidater for neurotransplantasjon har neuroner fra perifert nervesystem (PNS) fra voksne blitt vist å overleve transplantasjon, og å utøve neurotrofiske og gliotrofiske virkninger på utvikling av vertens neural vev. En kilde for ikke-CNS neural vev for transplantasjon er binyremarg. Adrenale kromaffine celler stammer fra neural cresten slik som PNS neuroner, og mottar synapser og produserer bærer og enzymproteiner som ligner PNS neuroner. Til tross for at disse cellene fungerer på en endokrin måte i intakt adrenal medulla så mister disse cellene i kultur deres kjertel fenotype og utvikler neuraltrekk i kultur i nærvær av visse vekstfaktorer og hormoner (Notter, et al., "Neuronal properties of monkey adrenal medulla in vitro," Cell Tissue Research 244:69-76 (1986)). Når podet inn i pattedyr CNS overlever disse cellene og syntetiserer betraktelige mengder dopamin som kan reagere med dopaminreseptorer i naboliggende områder av CNS.
IUS-PS 4.980.174, fører transplantasjon av monoamin-inneholdende celler isolert fra pinealkjertelen og binyremarg hos voksne rotter inn i frontal cortex hos rotter til bedring av tillært hjelpeløshet, en form for depresjon hos verten. I US-PS 4.753.635 ble kromaffine celler og binyremargvev avledet fra stuter implantert inn i hjernestammen eller ryggmargen til rotter og medførte smertestillelse når implantert vev eller celle ble indusert til å frigi nociceptor interreagerende forbindelser (dvs. catecholaminer så som dopamin). Binyremargceller er blitt autologt podet inn i mennesker, og har overlevd, og ført til svak til moderat forbedring i symptomene (Watts, et al., "Adrenal-caudat transplantation in patients with Parkinson's Disease (PD): 1-year follow-up", Neurology 39 Suppl. 1:127 (1989); Hurtig et al., "Post-mortem analysis of adrenal-medulla-to-caudate autograft in a patient with Parkinson's Disease," Annals og Neurology 25:607-614 [1989]. Adrenalceller oppnår derimot ikke en normal neural fenotype, og har derfor begrenset anvendelse som transplantat når synaptiske koblinger må bli dannet.
En annen vevskilde for neurotransplantasjon er fra cellelinjer. Cellelinjer er udødeliggjorte celler som enten kommer fra transformasjon av normale celler med et onkogen (Cepko, "Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction," Ann. Rev. Neurosci. 12:47-65 (1989) eller ved dyrking av celler med endrede vekstkaraktertrekk in vitro (Ronnett, et al., "Human cortical neuronal cell line: Establishment from a patient with unilateral megalencephaly," Science 248:603-605
(1990)). Slike celler kan bli dyrket i kultur i store mengder for så å anvendes ved mange transplantasjoner. Noen cellelinjer er blitt vist å differensiere ved kjemisk behandling for å uttrykke forskjellige neuronal egenskaper så som neurittdannelse, eksiterbare membraner og syntese av neurotransmittere og reseptorer derav. Ved differensiering fremstår disse cellene å være amitotiske og derfor ikke-cancerøse. Potensialet disse cellene har til å indusere skadelige immunresponser, anvendelse av retroviruser for å udødeliggjøre celler, potensiale for å reversere disse cellene til en amitotisk tilstand og mangel på respons som disse cellene har for normal vekst-inhiberende signaler gjør cellelinjene mindre enn optimale for utstrakt bruk.
0-2A celler er gliaforløperceller som gir opphav in vitro bare til oligodendrocytter og type II astrocyttter. Celler som ved immunfarging in vivo fremstår som 0-2A fenotyper er blitt vist å remyelinere demyelinerte neuroner in vivo. Godfraind et al., J. Cell Biol. 109:2405-2416 (1989). Injeksjon av et stort antall 0-2A celler er nødvendig for tilstrekkelig å remyelinere alle målneuronene in vivo, i det det ser ut som om 0-2A celler (som andre gliacellepreparater) ikke fortsetter å bli delt in situ. Til tross for at O-2A forløpercellene kan bli dyrket i kultur anvender den for tiden eneste tilgjengelige isoleringsteknikken optisk nerve som utgangsmateriale. Dette er en kilde med lavt utbytte som krever et antall rensningstrinn. Det er en ytterligere ulempe at 0-2A cellene isolert ved de tilgjengelige prosedyrene bare har evne til et begrenset antall delinger. Raff Science 243:1450-1455 (1989).
Transformerte 0-2A cellelinjer er uegnede for transplantasjon på grunn av det faktumet at transformasjonsprosessen fører til en genetisk (onkogen) kontrollert celledeling i motsetning til primære cellelinjer eller neural stam- eller forløperceller hvor reguleringen av delingen er i et epigenetisk nivå. Ytterligere potensielle problemer innbefatter manglende stabilitet av cellelinjene over lange tidsperioder, og fravikende mønstre på differensiering eller responser for vekstfaktorer. Goldman Trends Neuro. Sei. 15:359-362(1992).
Den manglende evnen i tidligere teknikk for at transplantatet fullstendig integrerer inn i vertsvevet, og den manglende tilgjengeligheten av celler i ubgrensede mengder fra en pålitelig kilde for podning er kanskje de største begrensningene til neurotransplantasjon.
I lys av ovennevnte mangler ved tidligere metoder for neural celledyrking og transplantasjon så eksisterer det fortsatt et behov innenfor området for en pålitelig kilde med ubegrenset antall celler for neurotransplantasjon som har evne til differensiering til neuroner og gliaceller.
Det er derfor en hensikt ifølge oppfinnelse å tilveiebringe en pålitelig kilde for epigenetiske regulerte celler for transplantasjon med evne til differensiering i neuroner og gliaceller.
Det er en annen hensikt ifølge oppfinnelsen å tilveiebringe en fremgangsmåte for å influere på differensieringen av forløpercellene ved anvendelse av spesifikke vekstfaktorer. Disse og andre hensikter og trekk ifølge oppfinnelsen vil fremkomme for fagfolk innenfor fagområdet ut fra følgende detaljerte beskrivelse og vedlagte krav.
Ingen av de tidligere referansene antas å beskrive foreliggende oppfinnelse og hører ikke inn under tidligere teknikk.
Definisjoner
Betegnelsen "stamcelle" refererer til en udifferensiert celle med evne til proliferasjon og som gir opphav til flere stamceller som har evne til å danne et stort antall forløperceller som igjen kan gi opphav til differensierte, eller differensierbare datterceller.
Betegnelsen "neural stamcelle" (NSC) refererer til stamcellene ifølge foreliggende oppfinnelse, hvor avkommet under hensiktsmessige dyrkningsbetingelser, innbefatter både gliale og neuronale forløperceller.
Betegnelsen "forløper celler" refererer til udifferensierte celler ifølge foreliggende oppfinnelse, avledet fra neural stamceller, i det avkommet under hensiktsmessige betingelser, innbefatter gliale og/eller neuronale forløperceller.
Betegnelsen "oligodendrocytt" refererer til en differensiert gliacelle som danner myelin som omgir aksonene i sentralnervesystemet (CNS). Oligodendrocytter har fenotypen galaktocerebrosid (+), myelin basisk protein (+) og glialt fibrillært surt protein (-)
[GalC(+), MBP(+), GFAP(-)].
Betegnelsen "neuron" refererer til en celle som har en fenotype neurospesifikk enolase (+) eller neurofilament (+) [NSE(+) eller NF(+)].
Betegnelsen "type I astrocytt" refererer til en differensiert gliacelletype med en flat protoplasmisk/fibroblast-lignende morfologi som er GFAP(+), A2B5(-),GalC(-) og
MBP(-).
Betegnelsen "type II astrocytt" refererer til en differensiert gliacelle som utviser en stellat prosess-bærende morfologi av fenotype GFAP(+), A2B5(+), GalC(-) og MBP(-).
Betegnelsen "neuronal forløperceller" refererer til celler som produserer datterceller som under hensiktsmessige betingelser blir eller gir opphav til neuroner.
Betegnelsen "oligodendrocytt forløperceller" refererer til celler som gir opphav til oligodendrocytter. Oligodendrocytt forløpercellene kan ha fenotypen A2B5(+), 04(+)/GalC(-), MBP(-) og GFAP (-) (men er ikke begrenset til denne fenotypen).
Betegnelsen "neurosfære" refererer til en sammenhopning av celler avledet fra neuralstamceller og dyrket in vitro. I det minste noen av cellene er av nestin (+) fenotype. Sammenhopningen består av stamceller og/eller forløperceller og kan eller behøver ikke å innbefatte differensierte celler.
Betegnelsen "forløperceller" refererer til levende celler ifølge foreliggende oppfinnelse som stammer fra neural stamceller proliferert i et dyrkningsmedium inneholdende en vekstfaktor eller -faktorer, og innbefatter både forløper- og stamceller. Forløpercellene blir vanligvis dyrket i form av neurosfærer, men kan utvise differensierte vekstmønstre avhengig av kulturbetingelsene.
Betegnelsen "vekstfaktor" refererer til et protein, peptid eller et annet molekyl som har en vekstfremmende, proliferende, differensierende eller trofisk effekt.
Betegnelsen "donor" refererer til mennesket eller dyret som er kilde for de neurale stamcellene som blir anvendt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.
Fenotypiske karaktertrekk
Neurale stamceller (NSC) er blitt rapportert og deres potensielle anvendelse er blitt beskrevet. (Reynolds og Weiss, Science 255:1707 (1992)). Det har blitt vist at NSC gir opphav til neuroblaster (Reynolds og Weiss, Restorative Neurology & Neuroscience 4:208 (1992)). Det er ikke kjent at NSC også gir opphav til hovedmakrogliacelletyper (astrocytter og oligodendrocytter).
Neuralstamceller kan bli isolert og dyrket ifølge metoden til Reynolds og Weiss (supra). Sistnevnte metode omfatter disseksjon og isolering av postnatalt pattedyr neuralvev, etterfulgt av enzymatisk og mekanisk atskillelse for oppnåelse av en celle suspensjon. Denne celle suspensjonen kan deretter kultiveres som beskrevet i de etterfølgende avsnitt. Epidermal vekstfaktor (EGF)-responsive stamceller blir når dyrket i et definert serumfritt medium, og i nærvær av et mitogen så som EGF eller lignende, indusert til å dele seg og gir opphav til en sammenhopning av udifferensierte celler. Sammenhopningene av cellene er ikke immunreaktive for GFAP, neurofilament (NF), neurospesifikk enolase (NSE) eller MBP. Forløpercellene innenfor sammenhopningen er derimot immunreaktivt for nestin, et intermediært filamentprotein som finnes i udifferensierte CNS celler. Nestinmarkøren ble karakterisert av Lehndahl et al., Cell 60:585-595 (1990), og er inkorporert heri som referanse. De modne fenotypene assosiert med de fire celletypene som kan bli differensiert fra avkommet til forløpercellene er hovedsakelig negative for nestinfenotypen.
Ved kontinuerlig tilstedeværelse av et mitogen, så som EGF eller lignende, fortsetter forløpercellene innenfor neurosfærene å dele seg og resulterer i en økning i størrelse av neurosfærer og antallet udifferensierte celler [nestin(+), GFAP(-), NF(-), NSE(-), MBP(-)]. På dette stadiet er cellene ikke-adherente og danner fritt-flytende sammenhopninger som er karakteristisk for neurosfærer. Dyrkningsbetingelsene kan bli variert slik at mens forløpercellene fortsatt uttrykker nestin fenotypen så danner de ikke karaktertrekkene til neurosfærer. Etter fjerning av mitogenet adherer cellene til substratet (poly-ornithin-behandlet plast eller glass), flater ut og begynner å differensiere til neuroner og gliaceller. På dette stadiet kan kulturmediet inneholde serum så som 0,5-1% føtalt bovint serum (FBS). I løpet av 2-3 dager begynner de fleste eller alle forløpercellene å mangle immunreaktivitet for nestin og begynner å uttrykke de intermediære filamenter spesifikke for neuroner eller for astrocytter som vist ved immunreaktiviteten mot henholdsvis NF og GFAP.
Identifikasjon av neuroner blir oppnådd ved anvendelse av immunreaktivitet for neuron-spesifikk enolase (NSE) og neurofilament proteinene tau-1 og MAP-2. På grunn av at disse markørene er meget pålitelige vil de fortsatt være nyttige for primær identifikasjon av neuroner, men neuroner kan også bli identifisert basert på deres spesifikke neurotransmitter fenotype.
Ved anvendelse av dual-markør immunfluorescens og immunperoksidasemetoder kan differensierte neurosfærekulturer bli analysert for ekspresjon av neurotransmittere, eller i noen tilfeller for enzymer ansvarlig for neurotransmitter syntese. Alternativt kan in situ hybridiseringshistokjemi bli utført ved anvendelse av cDNA- eller RNA-prober spesifikke for peptidneurotransmitter eller neurotransmitter syntetiserende enzym mRNA. Disse teknikkene kan bli kombinert med immunocytokjemiske metoder for å forsterke identifikasjonen av spesifikke fenotyper. Om nødvendig kan antistoffene og molekylære prober angitt ovenfor bli anvendt i Western og Northern blot prosedyrer for å behjelpe celleidentifikasjonen.
Alternativt kan høy ytelses væskekromatografi (HPLC) metoder bli anvendt ved fenotype identifikasjon. HPLC er spesielt nyttig for identifikasjon av et antall små peptid neurotransmittere, og catecholamin og indolamin neurotransmittere. Disse teknikkene er meget sensitive og kan bli anvendt i storskala screenings paradigmer som krever relativt små prøvevolum.
I tillegg til tilstedeværelse av neuroner og astrocytter begynner et stort antall av celler som ikke uttrykker verken intermediære filamenter spesifikke for neuroner eller for astrocytter, å uttrykke markører spesifikke for oligodendrocytter på en korrekt temporal måte. Cellene blir først immunreaktive for 04 (et celleoverflateantigen), galaktocerebrosid (GalC, et myelin glykolipid) og til slutt, myelin basisk protein (MBP). Disse cellene kan også ha en karakteristisk oligodendrocyttmorfologi.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å influere på den relative andel av disse differensierte celletypene ved tilførsel av eksogene vekstfaktorer under forløpercellenes differensieringsstadium.
Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av differensierte celler fra pattedyrnervestamceller, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) proliferering av minst en pattedyrnervestamcelle, isolert fra donorvev hvor vevet ikke stammer fra et humant embryo, i suspensjon i et serum-fritt kulturmedium omfattende EGF som et mitogen som prolifererer nevnte minst en stamcelle for å produsere neurale forløperceller, hvor minst en neural stamcelle responderer på EGF og er i stand til å produsere etterkommere som er i stand til å differensiere til neuroner, astrocyttter og oligodendrocyttter; og
(b) differensiering av de neurale forløperceller ved å fjerne mitogenet og dyrking av nevnte neurale forløperceller i et EGF-fritt differensieringsinduserende kulturmedium for å produsere differensierte celler, hvor nevnte medium inneholder et substrat til hvilket de neurale forløperceller kan feste seg, hvor nevnte medium inneholder en eksogen vekstfaktor valgt fra gruppen bestående av CNTF, bFGF, BDNF og retinsyre.
I en foretrukken utførelsesform er substratet valgt fra gruppen bestående av poly-L-ornitin, kollagen, fibronectin, laminin og matrigel.
I en foretrukken utførelsesform er de differensierte cellene neuroner.
I en foretrukken utførelsesform er de differensierte cellene modne oligodendrocytter.
I en foretrukken utførelsesform er de differensierte cellene astrocytter.
Biologiske virkninger av vekst og trofiske faktorer er generelt formidlet gjennom binding til celleoverflate reseptorer. Reseptorene for et antall av disse faktorene er blitt identifisert og antistoffer og molekylære prober for spesifikke reseptorer er tilgjengelige. Neural stamceller kan bli analysert for tilstedeværelse av vekstfaktorreseptorer ved alle differensieringsstadiene. I mange tilfeller vil identifikasjonen av en spesiell reseptor definere strategien som anvendes i ytterligere differensiering av celler langs spesifikke utviklingsveier ved tilsetning av eksogen vekst eller trofiske faktorer.
Eksogene vekstfaktorer kan bli tilsatt alene eller i forskjellige kombinasjoner. De kan også bli tilsatt i en temporal sekvens (dvs. eksponering for en første vekstfaktor innvirke på ekspresjonen av en andre vekstfaktorreseptor, Neuron 4: 189-201 (1990). Blant vekstfaktorer og andre molekyler som kan bli anvendt for å innvirke på differensieringen av forløpercellene in vitro er sur og basisk fibroblastvekstfaktor (aFGF & bFGF), ciliær neurotrofisk faktor (CNTF, nervefaktor (NGF), hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofin 3 (NT3), neurotrofin 4 (NT4), interleukiner, leukemi inhibitorisk faktor (LIF) cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP), forskolin, tetanustoksin, høye nivåer av kalsium (høy K<+>), amfiregulin, transformerende vekstfaktor-alfa (TGF-_), transformerende vekstfaktor beta (TGF-B), insulin-lignende vekstfaktorer, deksametason (glukokortikoid hormon), isobutyl 3-metylxanthin (IBMX), somatostatin, vekst hormon, retinsyre og blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF). Disse og andre vekstfaktorer og molekyler vil anvendes i foreliggende oppfinnelse.
Eksempler
EKSEMPEL 1
PROPAGERING AV FORLØPERCELLER
Embryonisk dag 14 (El4) CDj albinomus (Charles River) ble avlivet og hjernen og striata ble fjernet ved anvendelse av steril prosedyre. Vevet ble mekanisk dissosiert med en ild-polert Pasteur pipette inn i serum-fritt medium bestående av en 1:1 blanding av Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) og F-12 næringsblanding (Gibco). Cellene ble sentrifugert ved 800 rpm i 5 minutter, supernatanten ble sugd av og cellene resuspendert i DMEM/F-12 medium for opptelling.
Cellene ble suspendert i et serum-fritt medium, referert til som "fullstendig medium", bestående av DMEM/F-12 (1:1) som innbefatter glukose (0.6%), glutamin (2 mM), natriumbikarbonat (3 mM), HEPES (4-[2-hydroksyetyl]-l-piperazinetansulfonsyre) buffer (5 mM) og en definert hormonblanding og en saltblanding (for å erstatte serum) som innbefatter insulin (25 ug/ml), transferrin (100 |ag/ml), progesteron (20 nM), putrescin (60 uM) og seleniumklorid (30 nM) (alle fra Sigma med unntagelse av glutamin (Gibco)). I tillegg inneholder mediet 16-20 ng/ml EGF (renset fra muse submaxillary, Collaborative Research) eller TGF_ (human rekombinant, Gibco). Cellene ble sådd ut ved 0.2 x 10^ celler/ml inn i 75 cm^ vevskulturflasker (Corning) med ikke-substrat forbehandling og hensatt i en inkubator ved 37°C, 100% luftfuktig-het, 95% luft/5% C02.
Når cellene ble proliferert, i løpet av de første 48 timene og innen 3-4 dager in vitro (DIV), dannet de små sammenhopninger, kjent som neurosfærer, som ble løftet av substratet mellom 4-6 DIV.
Etter 7 DIV, ble neurosfærene fjernet, sentrifugert ved 400 rpm i 2-5 minutter og pelleten ble mekanisk dissosiert til individuelle celler med en flammebehandlet glasspasteur pipette i 2 ml fullstendig medium. 1 x 10^ celler ble på ny sådd ut i en 75 cm^ vevskulturflaske med 20 ml EGF-inneholdende fullstendig medium. Proliferasjonen av stamcellene og dannelse av nye neurosfærer ble initiert på nytt. Denne prosedyren kan bli gjentatt hver 6-8 dag.
EKSEMPEL 2
DIFFERENSIERING AV NEUROSFÆRER
Neurosfærer ble differensiert ved anvendelse av følgende metoder. Neurosfærene anvendt for hver metode ble dannet som beskrevet i eksempel 1. Alle neurosfærene som ble anvendt ble passert minst en gang før differensieringen.
Paradigma 1 — Hurtig differensiering av neurosfærer Seks eller åtte dager etter den første passeringen ble neurosfærene fjernet og sentrifugert ved 400 rpm. EGF-inneholdende supernatant ble fjernet og pelleten suspendert i EGF-fritt fullstendig medium inneholdende 1% føtalt bovint serum (FBS).
Neurosfærer (omtrent 0.5-1.0 x 10<*>> celler/brønn) ble sådd ut på poly-L-ornithin-belagte (15 ul/ml) dekkglass i 24 brønn Nuclon (1.0 ml/brønn) kulturskåler. Etter 24 timer i kultur ble dekkglassene overført til 12 brønn (Costar) kulturskåler inneholdende fullstendig medium inneholdende 0,5% FBS. Mediet ble skiftet hver 4-7 dag. Denne differensieringsprosedyren blir referert til som "hurtig differensieringsparadigma" eller
RDP.
Paradigma 2 — Differensiering av dissosierte neurosfærer
Seks til åtte dager etter den første passeringen ble neurosfærene fjernet og sentrifugert ved 400 rpm. EGF-inneholdende medium ble fjernet og pelleten ble suspendert i EGF-fritt fullstendig medium inneholdende 1% FBS. Neurosfærene ble mekanisk dissosiert til enkelt celler med en flammebehandlet Pasteur pipette og sentrifugert ved 800 rpm i 5 minutter. Mellom 0,5 x 10^ og 1.0 x 10^ celler ble sådd ut på poly-L-ornithin-belagte (15 ug/ml) dekkglass i 24 brønn Nuclon (1,0 ml/brønn) kulturskåler. EGF-fritt kulturmedium inneholdende 1% FBS ble skiftet hver 4-7 dag.
Paradigma 3 — Differensiering av enkelt neurosfærer
Neurosfærer ble vasket fri for EGF ved serieoverføringer gjennom utskifting av EGF-fritt medium. En enkelt neurosfære ble sådd ut på poly-L-ornithin-belagte (15 ug/ml) dekkglass i en 24-brønn plate. Kulturmediet som ble anvendt var fullstendig medium med eller uten 1% FBS. Mediet ble skiftet hver 4-7 dag.
Paradigma 4 — Differensiering av enkelt dissosierte neurosfærer Neurosfærer ble vasket fri for EGF ved serieoverføringer gjennom utskifting av EGF-fritt medium. En enkelt neurosfære ble mekanisk dissosiert i et 0,5 ml Eppendorf sentrifugerør og alle cellene ble sådd ut på en 35 mm kulturskål. Fullstendig medium ble anvendt med eller uten 1% FBS.
EKSEMPEL 3
VIRKNING AV VEKSTFAKTORER PÅ NEUROSFÆRE DIFFERENSIERING
Virkninger av CNTF, bFGF, BDNF og retinsyre på neurosfære differensiering ble testet ved anvendelse av differensieringsparadigmene angitt i eksempel 2.
CNTF
Virkningen av CNTF ble analysert i paradigmene 1 og 3. For begge paradigmene ble CNTF tilsatt enten ved begynnelsen av eksperimentet i en konsentrasjon på 10 ng/ml eller daglig i en konsentrasjon på 1 ng/ml.
I paradigma 1 økte tilsetningen av CNTF antall neuron-spesifikke enolase (NSE)-immunreaktive celler i tillegg til antallet tau-1 immunreaktive celler og dette tyder på at CNTF har en virkning på proliferasjonen, overlevelsen eller differensieringen av neuroner. Preliminær testing med antistoffer som gjenkjenner neurotransmitterne GABA og forbindelse P tyder på at det ikke er noen økning i antall celler som inneholder disse proteinene. Dette tyder på at en annen neuronal fenotype blir produsert.
Tre forskjellige antistoffer rettet mot 04, galaktoserebrosid (GalC) og myelinbasisk protein (MBP) ble anvendt for åstudere virkningen av CNTF på oligodendrocytter ifølge paradigma 1. CNTF hadde ingen virkning på antall 04 (+) celler, men det var en økning i antallet GalC(+) og MBP(+) celler sammenlignet med kontrollen. Det ser derfor ut som om CNTF spiller en rolle i modningen av oligodendrocytter.
I et eksperiment ble neurosfærene differensiert som vist i paradigma 1 med unntagelse av at serum aldri ble tilsatt til kulturmediet. I det virkningen av CNTF på neuroner og oligodendrocytter ikke var så tydelig som i nærvær av serum, var det en økning i proliferasjonen på flate, protoplasmiske astrocytter. CNTF vil derfor påvirke astrocytt differensieringen ved forskjellige kulturbetingelser.
I paradgima 3 resulterte tilsetning av CNTF i en økning i antallet NSE(+) celler.
BDNF
Virkningen av BDNF ble testet ved anvendelse av paradigma 3. Det var en økning i antallet NSE(+) neuroner pr. neurosfære. Det var i tillegg en økning i neuronal forgrening og migrering av neuroner bort fra sfæren.
bFGF
Virkningen av bFGF ble testet ved anvendelse av paradigma 2 og 4.1 paradigma 2 ble 20 ng/ml bFGF tilsatt ved begynnelsen av eksperimentet og cellene ble farget 7 dager senere. bGFG økte antallet GFAP(+) celler og antallet NSE(+) celler. Dette tyder på at bFGF har en proliferativ eller overlevende virkning på neuroner og astrocytter.
I paradigma 4 ble 20 ng/ml bFGF tilsatt ved begynnelsen av eksperimentet og analysert 7-10 dager senere. bFGF induserte proliferasjonen til forløpercellene dannet av EGF-responsive stamceller. Det induserte to forskjellige celletyper slik at de delte seg, neuroblaster og biopotensielle forløperceller. Neuroblasten produserte i gjennomsnitt 6 neuroner, mens biopotensielle celler produserte omtrent 6 neuroner og et antall astrocytter.
I tidligere studier ble det oppdaget at ved utsåing ved lav tetthet (2500 celler/cm^) kunne tilsetning av EGF opp til 7 dager in vitro (DIV) initiere proliferasjonen av stam-cellen, men ikke dersom applisert etter 7 DIV. Striatalceller (E14,2500 celler/cm^) ble sådd ut i fravær eller nærvær av 20 ng/ml bFGF. Etter 11 DIV ble kulturene vasket og medium inneholdende 20 ng/ml EGF ble tilsatt. Etter 4-5 DIV i kulturer som ble primet med bFGF inneholdt mer enn 70% av brønnene som ble undersøkt sammenhopninger av prolifererende celler som ble dannet til kolonier med morfologiske og antigene egenskaper som EGF-dannede celler. Kulturer som ikke var blitt primet med bGFG viste ingen EGF-responsiv proliferasjon. Disse funnene tyder på at EGF-responsive stamceller har bFGF reseptorer som regulerer langtidsoverlevelsen.
Retinsyre
Virkningen av retinsyre ved 10"^M ble testet ved anvendelse av paradigma 1. Det var en økning i antallet NSE(+) og tau-l(+) celler som tyder på at retinsyre øker antallet neuroner.
EKSEMPEL 4
SCREENING FOR trkB RESEPTOR PÅ NEURALE STAMCELLER
Ekspresjon av trk-familien av neutrotrofinreseptorer i EGF-dannede neurosfærer ble undersøkt ved Northern blot analyser. Totalt mRNA ble isolert fra mus og rotte striatal EGF-dannede neurosfærer. Både rotte og muse neurosfærer uttrykte høye nivåer av trkB reseptor mRNA, men uttrykte ikke trk eller trkC mRNA. I preliminære eksperimenter ble enkelte EGF-dannede muse neurosfærer sådd ut på poly-L-ornithin belagte dekkglass og dyrket i fravær eller nærvær av 10 ng/ml BDNF. Når undersøkt etter 14-28 dager in vitro inneholdt neurosfærer sådd ut i nærvær av BDNF NSE(+) celler med omfattende og sterkt forgrenede utløpere; godt utviklede NSE(+) celler ble ikke observert i fravær av BDNF. Aktivering av trkB reseptoren på EGF-dannede neurosfærer kan forsterke differensieringen, overlevelsen av og/eller neuritt utveksten fra nettopp dannede neuroner.
EKSEMPEL 5
SCREENING FOR GAP-43 MEMBRAN FOSFOPROTEIN PÅ
NAURALSTAMCELLER
Vekst-assosiert protein (GAP-43) er et nervesystem-spesifikt membran fosfoprotein
som er nedregulert i løpet av utviklingen. GAP-43 var antatt å være neuron-spesifikk, men rapporter viser at dette proteinet kan bli minst forbigående uttrykt i løpet av utviklingen i noen astrocytter, oligodendrocytter og i Schwann-celler. For tiden er rollen til GAP-43 i makroglia ikke kjent. Forbigående ekspresjon av GAP-43 i gliaceller dannet fra EGF-responsive stamceller som stammer fra embryoniske og voksne murine striatum ble undersøkt. Gliacelle (astrocytt og oligodendrocytt) differensiering ble indusert ved utsåing av forløper celler i et medium inneholdende 1% FBS uten EGF. Cellene ble deretter probet med spesifikke antistoffer for GAP-43, nestin, GFAP, 04 og GalC. For å identifisere celler som uttrykker GAP-43 ble antistoffene slått sammen i forskjellige kombinasjoner ved anvendelse av dobbeltmarkør immunfluorescens metoder.
I løpet av de første to dagene etter utsåing var det et lavt til moderat nivå av GAP-43 ekspresjon i nesten alle celler (flat, bipolar og stellar), men innen 3-4 dager etter utsåing var nivået av GAP-43 ekspresjonen begrenset til bipolare og stellate celler. Ved 4 dager var hoveddelen av GAP-43-uttrykkende celler dobbeltmerket med oligodendrocyttmarkørene 04 og GalC til tross for at GFAP og GAP-43 ble ko-uttrykt i et antall celler. En uke etter utsåing uttrykte nesten alle GFAP-uttrykkende astrocytter ikke lenger GAP-43, mens de fleste 04 og GalC-uttrykkende celler fortsatte å uttrykke GAP-43. Ved 7-10 dager begynte disse oligodendrocyttene å uttrykke MBP og miste ekspresjon av GAP-43. EGF-responsive stamceller kan representere et nyttig modellsystem for studering av rollen til GAP-43 i glial og neural utvikling.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av differensierte celler fra pattedyrnervestamceller, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) proliferering av minst en pattedyrnervestamcelle, isolert fra donorvev hvor vevet ikke stammer fra et humant embryo, i suspensjon i et serum-fritt kulturmedium omfattende EGF som et mitogen som prolifererer nevnte minst en stamcelle for å produsere neurale forløperceller, hvor minst en neural stamcelle responderer på EGF og er i stand til å produsere etterkommere som er i stand til å differensiere til neuroner, astrocyttter og oligodendrocyttter; og (b) differensiering av de neurale forløperceller ved å fjerne mitogenet og dyrking av nevnte neurale forløperceller i et EGF-fritt differensieringsinduserende kulturmedium for å produsere differensierte celler, hvor nevnte medium inneholder et substrat til hvilket de neurale forløperceller kan feste seg, hvor nevnte medium inneholder en eksogen vekstfaktor valgt fra gruppen bestående av CNTF, bFGF, BDNF og retinsyre.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at substratet er valgt fra gruppen bestående av poly-L-ornitin, kollagen, fibronectin, larninin og matrigel.
3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at de nevnte differensierte cellene er neuroner.
4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at de nevnte differensierte cellene er modne oligodendrocytter.
5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at de nevnte differensierte celler er astrocytter.
NO19951617A 1992-10-28 1995-04-27 Fremgangsmate for fremstilling av differensierte celler fra pattedyrnervestamceller NO324412B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US96762292A 1992-10-28 1992-10-28
PCT/CA1993/000456 WO1994010292A1 (en) 1992-10-28 1993-10-27 Biological factors and neural stem cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO951617D0 NO951617D0 (no) 1995-04-27
NO951617L NO951617L (no) 1995-04-27
NO324412B1 true NO324412B1 (no) 2007-10-08

Family

ID=25513066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19951617A NO324412B1 (no) 1992-10-28 1995-04-27 Fremgangsmate for fremstilling av differensierte celler fra pattedyrnervestamceller

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP1298202B1 (no)
JP (2) JPH08502652A (no)
KR (1) KR950704476A (no)
AT (2) ATE483795T1 (no)
AU (2) AU5367694A (no)
CA (1) CA2148138C (no)
DE (2) DE69334344D1 (no)
DK (1) DK0669973T4 (no)
ES (1) ES2194016T5 (no)
FI (1) FI952022A0 (no)
NO (1) NO324412B1 (no)
PT (1) PT669973E (no)
RU (1) RU95115822A (no)
WO (1) WO1994010292A1 (no)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981165A (en) * 1991-07-08 1999-11-09 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro induction of dopaminergic cells
US5928947A (en) * 1992-07-27 1999-07-27 California Institute Of Technology Mammalian multipotent neural stem cells
US5849553A (en) * 1992-07-27 1998-12-15 California Institute Of Technology Mammalian multipotent neural stem cells
US6872699B2 (en) 1992-11-13 2005-03-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften, E.V. Truncated Flk-1 receptor protein, methods of use and a recombinant vector containing a nucleotide encoding the truncated Flk-1 protein
US6001654A (en) * 1994-01-28 1999-12-14 California Institute Of Technology Methods for differentiating neural stem cells to neurons or smooth muscle cells using TGT-β super family growth factors
AU3338595A (en) * 1994-07-29 1996-03-04 Dalhousie University Propagation and inducible differentiation of human fetal central nervous system progenitor cells
DE69535300T2 (de) * 1994-09-23 2007-06-06 Neurospheres Holding Ltd., Calgary In-vitro-Musters für ZNS - Funktion und Dysfunktion
JPH10509592A (ja) * 1994-11-14 1998-09-22 ニューロスフィアーズ ホウルディングス リミテッド 神経幹細胞増殖調節
EP0832187A1 (en) * 1995-05-24 1998-04-01 Cellfactors PLC Cell differentiation agents
FR2746109B1 (fr) 1996-03-12 1998-04-17 Rhone Poulenc Rorer Sa Milieu pour la conservation de materiel biologique
US7544511B2 (en) 1996-09-25 2009-06-09 Neuralstem Biopharmaceuticals Ltd. Stable neural stem cell line methods
US5753506A (en) * 1996-05-23 1998-05-19 Cns Stem Cell Technology, Inc. Isolation propagation and directed differentiation of stem cells from embryonic and adult central nervous system of mammals
US6787355B1 (en) 1996-08-26 2004-09-07 Mcgill University Multipotent neural stem cells from peripheral tissues and uses thereof
US6969608B1 (en) 1996-08-26 2005-11-29 Mcgill University Pharmaceuticals containing multipotential precursor cells from tissues containing sensory receptors
US6713247B1 (en) 1996-09-03 2004-03-30 Signal Pharmaceuticials, Inc. Human CNS cell lines and methods of use therefor
CA2216439A1 (en) * 1996-09-25 1998-03-25 Derek Van Der Kooy Pharmaceuticals containing retinal stem cells
EP1011732A4 (en) * 1997-07-04 2002-10-23 Univ Utah Res Found RESTRICTED LINE NEURAL PRECURSORS
US20020123143A1 (en) 1997-08-22 2002-09-05 Jean Toma Multipotent stem cells from peripheral tissues and uses thereof
US5968829A (en) * 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6165783A (en) * 1997-10-24 2000-12-26 Neuro Spheres Holdings Ltd. Erythropoietin-mediated neurogenesis
JP3291698B2 (ja) * 1998-07-24 2002-06-10 スティーブン・カーティン 可変眼鏡用レンズ
US6787356B1 (en) 1998-07-24 2004-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cell expansion system for use in neural transplantation
EP1109887A4 (en) * 1998-07-29 2003-05-21 Layton Bioscience Inc PRODUCTION AND USE OF DOPAMINERGIC CELLS TO TREAT DOPAMINERGIC DEFICIENCIES
SE9804064D0 (sv) * 1998-11-25 1998-11-25 A & Science Invest Ab Medicinal product and method for treatment of conditions affecting neural stem cells or progenitor cells
US6291516B1 (en) 1999-01-13 2001-09-18 Curis, Inc. Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto
AU7263300A (en) * 1999-09-16 2001-04-17 Neurotrophic Bioscience, Inc. Opaminergic neuronal survival-promoting factors and uses thereof
CA2388497A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 Advanced Cell Technology, Inc. Method of producing differentiated progenitor cells by culturing morula or inner cell mass cells
US7544509B2 (en) 2000-01-24 2009-06-09 Mcgill University Method for preparing stem cell preparations
AU3499801A (en) 2000-02-11 2001-08-20 Schepens Eye Res Inst Isolation and transplantation of retinal stem cells
US7115653B2 (en) 2000-03-30 2006-10-03 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6613798B1 (en) 2000-03-30 2003-09-02 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6683108B1 (en) 2000-03-30 2004-01-27 Curis, Inc. Agonists of hedgehog signaling pathways and uses related thereto
US8852937B2 (en) 2000-03-30 2014-10-07 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
EP1318822A4 (en) * 2000-07-27 2006-01-18 Mclean Hospital Corp CELL-IMPLANTATION THERAPY FOR NEUROLOGICAL DISORDERS OR DISEASES
US6908732B2 (en) 2000-10-13 2005-06-21 President & Fellows Of Harvard College Compounds and methods for regulating cell differentiation
US7048934B2 (en) 2001-08-30 2006-05-23 Stem Cell Therapeutics Inc. Combined regulation of neural cell production
AU2002325711C1 (en) 2001-09-14 2008-05-29 Stem Cell Therapeutics Inc. Prolactin induced increase in neutral stem cell numbers and therapeutical use thereof
CA2461290C (en) 2001-09-24 2014-11-25 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of stem cells using zinc finger proteins
CA2470853A1 (en) * 2001-12-13 2003-06-19 Japan Science And Technology Agency Human cell culture medium and culture method
AU2003209259A1 (en) 2002-01-14 2003-07-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Novel mammalian multipotent stem cells and compositions, methods of preparation and methods of administration thereof
EP2532241B1 (en) 2002-02-15 2016-05-11 Cornell Research Foundation, Inc. Myelination of congenitally dysmyelinated forebrains using oligodendrocyte progenitor cells
CA2483311A1 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Philip A. Beachy Modulators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto
WO2004011632A2 (en) * 2002-07-30 2004-02-05 Stem Cell Therapeutics Inc. Oligodendrocyte production from multipotent neural stem cells
AU2003250705A1 (en) * 2002-07-31 2004-02-16 Stem Cell Therapeutics Inc. Method of enhancing neural stem cell proliferation, differentiation, and survival using pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (pacap)
US20040214324A1 (en) 2002-12-09 2004-10-28 Ole Isacson Dopaminergic neurons differentiated from embryonic cells for treating neurodegenerative diseases
US8293488B2 (en) 2002-12-09 2012-10-23 Neuralstem, Inc. Method for screening neurogenic agents
EP1576134B1 (en) 2002-12-09 2013-03-06 Judith Kelleher-Andersson Method for discovering neurogenic agents
US7459152B2 (en) 2003-04-23 2008-12-02 Rush University Medical Center Erythropoietin administration to improve graft survival
WO2005026382A1 (en) 2003-09-12 2005-03-24 Stemcell Technologies Inc. Neural colony forming assay
JP4676442B2 (ja) * 2003-12-02 2011-04-27 セラヴィー バイオサイエンシズ エルエルシー 神経前駆細胞を増殖させるための組成物および方法
US20070269412A1 (en) 2003-12-02 2007-11-22 Celavie Biosciences, Llc Pluripotent cells
AU2005211847B2 (en) 2004-02-13 2011-02-24 Stem Cell Therapeutics Corp. Use of luteinizing hormone (LH) and chorionic gonadotropin (hCG) for proliferation of neural stem cells and neurogenesis
IN2014CN03629A (no) 2004-11-17 2015-09-04 Neuralstem Inc
JP2009509943A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 ステム セル セラピューティクス コーポレイション プロラクチンにより制御される乏突起膠細胞前駆体細胞の増殖
US8143220B2 (en) 2006-03-17 2012-03-27 Stem Cell Therapeutics Corp. Dosing regimens for neural stem cell proliferating agents and differentiating agents for the treatment of neurological disorders
US20110218176A1 (en) 2006-11-01 2011-09-08 Barbara Brooke Jennings-Spring Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
JP2008220205A (ja) * 2007-03-09 2008-09-25 Sumitomo Bakelite Co Ltd 神経幹細胞凝集塊形成用容器、その製造方法、及び神経幹細胞凝集塊の作成方法。
EP2175868B1 (en) * 2007-08-15 2017-12-20 SanBio, Inc. Bone marrow derived cells for use in treating neural degeneration
CA2723382A1 (en) 2008-05-08 2009-11-12 University Of Rochester Treating myelin diseases with optimized cell preparations
EP2379711B8 (en) 2008-12-23 2017-03-22 BOCO Silicon Valley, Inc. Target populations of oligodendrocyte precursor cells and methods of making and using same
EP2380972B1 (en) 2010-04-19 2012-09-19 Technische Universität Dresden Methods and compositions for the expansion of somatic stem cells and progenitor cells
NZ623207A (en) 2010-07-28 2014-12-24 Neuralstem Inc Methods for treating and/or reversing neurodegenerative diseases and/or disorders
JP5867797B2 (ja) * 2011-05-27 2016-02-24 国立大学法人京都大学 ドーパミン産生神経の分化誘導用の細胞培養基材
WO2013010045A1 (en) 2011-07-12 2013-01-17 Biotime Inc. Novel methods and formulations for orthopedic cell therapy
CN104136601A (zh) 2012-02-17 2014-11-05 斯格本斯眼科研究所 人视网膜祖细胞的表型谱
US10450546B2 (en) 2013-02-06 2019-10-22 University Of Rochester Induced pluripotent cell-derived oligodendrocyte progenitor cells for the treatment of myelin disorders
MX2017005186A (es) 2014-10-20 2017-07-26 Neuralstem Inc Celulas madre neurales estables que comprenden un polinucleótido exógeno que codifica un factor de crecimiento y métodos de uso de las mismas.
US9724432B2 (en) 2015-04-30 2017-08-08 University Of Rochester Non-human mammal model of human degenerative disorder, uses thereof, and method of treating human degenerative disorder
WO2017075271A1 (en) * 2015-10-29 2017-05-04 The Regents Of The University Of Claifornia Astrocyte differentiation protocol
JP7457505B2 (ja) 2017-05-10 2024-03-28 ユニバーシティー オブ ロチェスター 神経精神障害を処置する方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ226750A (en) * 1987-10-29 1990-09-26 Amrad Corp Ltd Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene
WO1991002003A1 (en) * 1989-08-04 1991-02-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions; purified preparation of neural progenitor regulatory factor
EP0594669B9 (en) * 1991-07-08 2008-03-19 NeuroSpheres Holdings Ltd. Growth factor-responsive neural progenitor cells which can be proliferated in vitro.

Also Published As

Publication number Publication date
EP1298202B1 (en) 2010-10-06
FI952022A (fi) 1995-04-27
RU95115822A (ru) 1997-03-20
DE69332759T3 (de) 2008-01-24
DE69334344D1 (de) 2010-11-18
ES2194016T3 (es) 2003-11-16
AU703729B2 (en) 1999-04-01
ATE483795T1 (de) 2010-10-15
NO951617D0 (no) 1995-04-27
JP2007014352A (ja) 2007-01-25
EP0669973B2 (en) 2007-04-18
EP0669973A1 (en) 1995-09-06
PT669973E (pt) 2003-06-30
JPH08502652A (ja) 1996-03-26
ATE234353T1 (de) 2003-03-15
DK0669973T3 (da) 2003-07-14
WO1994010292A1 (en) 1994-05-11
DE69332759D1 (de) 2003-04-17
NO951617L (no) 1995-04-27
DE69332759T2 (de) 2003-10-16
EP1298202A2 (en) 2003-04-02
EP0669973B9 (en) 2007-10-10
CA2148138A1 (en) 1994-05-11
EP0669973B1 (en) 2003-03-12
FI952022A0 (fi) 1995-04-27
CA2148138C (en) 2002-01-08
DK0669973T4 (da) 2007-08-27
EP1298202A3 (en) 2003-12-03
KR950704476A (ko) 1995-11-20
ES2194016T5 (es) 2007-11-16
AU4924197A (en) 1998-03-12
AU5367694A (en) 1994-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU703729B2 (en) Biological factors and neural stem cells
US6071889A (en) In vivo genetic modification of growth factor-responsive neural precursor cells
US5750376A (en) In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
US5981165A (en) In vitro induction of dopaminergic cells
US5980885A (en) Growth factor-induced proliferation of neural precursor cells in vivo
US6497872B1 (en) Neural transplantation using proliferated multipotent neural stem cells and their progeny
US5851832A (en) In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny
US6294346B1 (en) Use of multipotent neural stem cells and their progeny for the screening of drugs and other biological agents
US6399369B1 (en) Multipotent neural stem cell cDNA libraries
EP0681477B1 (en) Genetic modification of neural stem cells
EP0783693B1 (en) In vitro models of cns function and dysfunction
US7361505B1 (en) Multipotent neural stem cell compositions
US7166277B1 (en) Remyelination of neurons using multipotent neural stem cell progeny
MXPA97003493A (en) In vitro induction of dopaminergi cells