MXPA99006464A

MXPA99006464A - Transferencia nuclear con celulas donadorasdiferenciales fetales y adultas

Info

Publication number: MXPA99006464A
Application number: MXPA/A/1999/006464A
Authority: MX
Inventors: Robl James; L Stice Steven; Abel Ponce De Leon F; Cibelli Jose; Golueke Paul; Jerry D Joseph
Original assignee: University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus
Priority date: 1997-01-10
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2000-07-01

Abstract

La presente invención se refiere a un método mejorado de transferencia nuclear que implica el transplante de núcleos de células diferenciadas donadoras en oocitos enucleados de la misma especie que las células donadoras. Las unidades de transferencia nuclear resultante sonútiles para multiplicación de genotipos y genotipos transgénicos por la producción de fetos y progenies y para la producción de células de MCIC isogénicas, incluyendo células embriónicas o de soporte isogénicas humanas. La producción de embriones de mamíferos tratados genéticamente o transgénicos, embriones, fetos y progenies de mamíferos tratados genéticamente o transgénicos se facilitan por el método presente dado que la fuente de células diferenciadas de los núcleos donadores puede modificarse genéticamente y propagarse clonalmente.

Description

TRANSFERENCIA NUCLEAR CON CÉLULAS DONADORAS DIFERENCIALES FETALES Y ADULTAS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a procedimientos de clonación en los cuales los núcleos de las células derivadas de células de mamíferos diferenciales fetales o adultas se transplantan en oocitos mamíferos enucleadas de la misma especie como los núcleos donadores. Los núcleos son reprogramados para dirigir el desarrollo de embriones clonados, que se pueden transferir en hembras receptoras para producir fetos y progenies o se usan para producir células de masa celular interna cultivada (MCIC). Los embriones clonados también se pueden combinar con embriones fertilizados para producir embriones quiméricos, fetos y/o progenie. 2. ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN Los métodos para derivar las líneas celulares de soporte embriónicas (SE) in vitro de embriones de ratones de preimplante temprano son bien conocidas. (Ver, v.gr., Evans y otros, Nature, 29:154-156 (1981); Martin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:7634-7638 (1981)). Las células de SE se pueden pasar a un estado no diferenciado, siempre y cuando esté presente una capa alimentadora de células de fibroblastos (Evans y otros, Id.) o una fuente de inhibición de diferenciación (Smith y otros, Dev. Biol., 121:1-9 (1987)).

Previamente se había reportado que las células de SE tienen numerosas aplicaciones. Por ejemplo, se ha reportado que las células de SE se pueden usar como un modelo in vitro para la diferenciación , especialmente para el estudio de genes que se han implicado en la regulación del desarrollo temprano. Las células de SE de ratones dan origen a quimeras de líneas germinales cuando se introducen en embriones de ratones de preimplante, demostrando así su pluripotencia (Bradley y otros, Nature, 309:255-256 (1984)) . En vista de su capacidad de transferir su genoma a la siguiente generación, las células de SE tienen utilidad potencial para la manipulación de líneas germinales de animales de ganado utilizando células de SE con o sin una modificación genética deseada. Además, en el caso de animales de ganado, v.gr. , los ungulados, los núcleos de embriones de ganado de preimplante similares soportan el desarrollo de oocitos enucleados hasta el término (Smith y otros , Biol. Reprod., 40: 1027- 1035 (1989); y Keefer y otros, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994)) . Esto es en contraste de los núcleos de embriones de ratones que más allá de la octava etapa de células después de la transferencia se reporta que no soportan el desarrollo de oocitos enucleados (Cheong y otros, Biol. Reprod., 48: 958 (1993)) . Por lo tanto, las células de SE de animales de ganado son altamente convenientes dado que pueden proveer una fuente potencial de núcleos donadores totipotentes, genéticamente manipulados o de alguna otra manera, para procedimientos de transferencia nuclear.

Algunos grupos de investigación han reportado el aislamiento de líneas celulares embriónicas significativamente pluripotentes. Por ejemplo, Notarianni y otros, J. Reprod. Fert. Suppl., 43:255-260 (1991 ) , reporta el establecimiento de líneas celulares pluripotentes significativamente estables de blastocitos de cerdos y ovejas que exhiben algunas características morfológicas y de crecimiento similares a las de las células en cultivos primarios de masas de células internas aisladas imunoquirúrgicamente de blastocitos de ovejas. También , Notarianni y otros, J. Reprod. Fert. Suppl., 41 : 51 -56 (1990) describe el mantenimiento y diferenciación en el cultivo de líneas celulares embriónicas pluripotentes putativas de blastocitos de cerdos. Gerfen y otros, Anlm. Biotech, 6(1 ): 1 -14 (1995) describe el aislamiento de líneas ce células embriónicas de blastocitos de porcinos. Estas células de SE mantienen establemente en capas alimentadoras de fibroblastos embriónicos de ratones sin el uso de medio condicionado y se reporta que se diferencian en diferentes tipos de células durante el cultivo. Además, Saito y otros, Roux's Arch. Dev. Biol., 201 : 134-141 •(1992) reporta líneas celulares similares a células de soporte embriónicas de bovinos cultivadas que sobrevivieron tres pasajes , pero se perdieron después del cuarto pasaje. Handyside y otros, Roux's Arch. Dev. Biol., 196-185-190 (1987) describe el cultivo de masas de células internas inmunoquirúrgicamente aisladas de embriones de ovejas bajo condiciones que permiten el aislamiento de líneas celulares de SE derivadas de MCI de ratones. Handyside y otros, reporta que bajo dichas condiciones, el ataque de MCI de ovejas, se difunde y desarrolla a áreas de células similares a células de SE y similares al endodermo, pero que después del cultivo prolongado solamente son evidentes las células similares al endodermo. Recientemente, Cherny y otros, Theriogenology, 41 -175 (1994) reportó líneas celulares derivadas de células germinales primordiales de bovinos significativamente pluripotentes mantenidas en cultivos a lago plazo. Estas células, después de aproximadamente siete días en cultivo, produjeron colonias similares a SE que tiñeron positivo para fosfatasa alcalina (AP por sus siglas en inglés), exhibieron la capacidad de formar cuerpos embrioides y se diferenciaron espontáneamente en por lo menos dos tipos de células diferentes. También se reporta que estas células expresaron ARNm para los factores de transcripción OCT4, OCT6 y H ES 1 . Un patrón de la caja homeótica que se piensa que se expresa por las células de SE exclusivamente. También recientemente, Campbell y otros, Nature, 380:64-68 (1996) reportó la producción de corderos vivos después de la transferencia nuclear de células de disco embriónico (DE) cultivadas de embriones de ovinos de nueve días cultivados bajo condiciones que promueven el aislamiento de las líneas celulares de SE en el ratón. Los autores concluyeron que las células de DE de embriones de ovinos de nueve días de edad son totipotentes por la transferencia nuclear y esa totipotencia se mantuvo en el cultivo.

Van Stekelenburg-Hamers y otros, Mol. Reprod. Dev., 40:444-454 (1995), reportó el aislamiento y caracterización de líneas celulares significativamente permanentes de las células de masa celular interna de blastocitos de bovinos. Los autores aislaron y cultivaron MCI de blastocitos de bovinos de 8 ó 9 días de edad bajo diferentes condiciones para determinar cuales células alimentadoras y medios de cultivo son más eficientes para soportar la unión y el desarrollo de células de MCI de bovinos. Concluyeron que la unión y desarrollo de células de MCI cultivadas se aumentó mediante el uso de células alimentadoras de STO (fibroblastos de ratones) (en lugar de células epiteliales del útero de bovinos) y mediante el uso de suero separado con carbón vegetal (en lugar del suero normal) para suplementar el medio de cultivo. Van Stekelenburg y otros reportaron, sin embargo que sus líneas celulares se asemejaron a las células epiteliales más que las células de MCI pluripotentes. Smith y otros, WO 94/24274, publicada el 27 de Octubre de 1994, Evans y otros WO 90/03432, publicada el 5 de Abril de 1990 y Wheeler y otros, WO 94/26889, publicada el 24 de Noviembre de 1994, reportaron el aislamiento, selección y propagación de células de soporte animales las cuales significativamente se pueden utilizar para obtener animales transgénicos. Evans y otros, también reportaron la derivación de células de soporte embriónicas significativamente pluripotentes de especies de porcinos y bovinos las cuales afirmativamente son útiles para la producción de animales transgénicos. Además Wheeler y otros, WO 94/26884, publicada el 24 de Noviembre de 1994, describieron células de soporte que afirmativamente son útiles para la manufactura de ungulados quiméricos y transgénicos. Por lo tanto, basado en lo anterior, es evidente que muchos grupos han intentado producir líneas celulares de SE, v.gr. , debido a su aplicación potencial en la producción de embriones clonados o transgénicos y en el transplante nuclear. El uso de células de masa de célula interna (MCI) unguladas para el transplante nuclear también ha sido reportado. Por ejemplo, Collar y otros, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994) describieron el transplante nuclear de MCI de bovinos por microinyección de las células donadoras aisladas en oocitos maduros enucleados. Collas y otros, describieron el cultivo de embriones in vitro durante siete días para producir quince blastocitos los cuales, al transferir los receptores de bovinos, dieron como resultado cuatro embarazos y dos nacimientos. También. Keefer y otros, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994), describieron el uso de células de MCI de bovinos como núcleos donadores en procedimientos de transferencia nuclear, para producir blastocitos los cuales, al transplantarlos en receptores bovinos, dio como resultado varios descendientes vivos. Además, Sims y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993) , describieron la producción de becerros por transferencia de núcleo de células de MCI de bovinos cultivadas in vitro a corto plazo en oocitos maduros enucleados.

La producción de corderos vivos después de la transferencia nuclear de las células de disco embriónicas cultivadas también se ha reportado (Campbell y otros, Nature, 380:64-68 (1996)) . Además aún , se ha reportado el uso de células embriónicas pluripotentes de bovinos de transferencia nuclear y la producción de fetos quiméricos (Stice y otros, Biol. Reprod., 54-100-1 10 (1996) ; Collas y otros, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994)). Coilas y otros demostraron que las células granulosas (células adultas) podrían utilizarse en un procedimiento de clonación de bovinos para producir embriones. Sin embargo, no hubo demostración de etapas embriónicas tempranas después del desarrollo (etapa de blastocitos) . También, las células de granulosa no se cultivaron fácilmente y se pueden obtener solamente de las hembras. Collas y otros no intentaron propagar las células de granulosa en cultivos o intentó modificar genéticamente estas células. Mientras que las multiplicaciones de los genotipos son posibles usando células embriónicas como donadores, también hay problemas con los métodos actuales. Por ejemplo, mediante los métodos actuales, la clonación embrioide solamente se puede realizar utilizando un número limitado de núcleos donadores embriónicos (menos de 100), o con líneas celulares in vitro. Se desconoce si el genoma embriónico codifica un genotipo superior hasta que el animal clonado se convierte en un adulto. También existen problemas en el área de producción de mamíferos transgénicos. Mediante los métodos actuales, el ADN heterólogo se introdujo en embriones tempranos o líneas de célula embriónicas que se diferencian en varios tipos de células en el feto y se desarrollan eventualmente en un animal transgénico. Sin embargo, varios embriones tempranos se requieren para producir un animal transgénico y, por lo tanto, este procedimiento es muy ineficiente. También, no hay un método sencillo y eficiente para seleccionar un embrión transgénico antes de que para un embrión transgénico entre el transcurso del tiempo y el gasto para colocar los embriones en hembras substituidas. Además, las técnicas que se dirigen a los genes no se pueden lograr fácilmente con procedimientos transgénicos de embriones tempranos. Las células de soporte embriónicas en ratones han permitido a los investigadores seleccionar células transgénicas y realizar la dirección a los genes. Esto permite más ingeniería genética de lo que es posible con otras técnicas transgénicas. Sin embargo, las líneas celulares de soporte embriónicas y otras líneas celulares embriónicas se pueden mantener en un estado no diferenciado que requiere de las capas alimentadoras y/o la adición de citoquinas al medio. Aún si se toman estas precauciones, estas células con frecuencia sufren de diferenciación espontánea y no se pueden usar para producir progenies transgénicas mediante los métodos actualmente disponibles. También, algunas líneas celulares embriónicas se han propagado en una manera que no conduce a los procedimientos de dirigir los genes.

Por lo tanto, sin importar lo que se había reportado previamente en la literatura, existe una necesidad de métodos mejorados para clonar células de mam íferos. OBJETIVOS Y COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la invención proveer métodos novedosos y mejorados para producir células de mam íferos clonadas. Es un objetivo más específico de la invención proveer un método novedoso para clonar células de mamíferos que implica el transplante el núcleo de una célula de mamíferos diferenciada en un oocito enucleado de la misma especie. Es un otro objetivo de la invención, proveer un método para multiplicar mam íferos adultos que se ha probado que tienen superioridad genética u otras características convenientes. Es otro objetivo de la invención proveer un método mejorado para producir mamíferos tratados genéticamente o transgénicos (es decir, embriones, fetos, progenies) . Es un objetivo más específico de la invención proveer un método para producir mamíferos tratados genéticamente o transgénicos mediante el cual se inserta, remueve o modifica un gen deseado en una célula de mamífero diferenciada o núcleo de células antes de usar dichas células diferenciadas o núcleo de células para la formación de una unidad de TN. Es otro objetivo de la invención proveer mamíferos tratados genéticamente o transgénicos (es decir, embriones, fetos, progenies) obtenidos por transplante del núcleo de una célula diferenciada en un oocito enucleado de la misma especie como la célula diferenciada. Es otro objetivo de la invención proveer un método novedoso para producir células de MCIC de mamíferos que implica el transplante o un núcleo de una célula diferenciada en un oocito enucleado de la misma especie que la célula diferenciada. Es otro objetivo de la invención proveer células de MCIC producida por el transplante del núcleo de una célula de mamífero diferenciada en un oocito enucleado de la misma especie como la célula diferenciada. Es un objetivo más específico de la invención proveer un método para producir células de MCIC humanas que implica el transplante del núcleo de una célula humana, v. gr. , una célula adulta humana, en un oocito humano enucleado. Es otro objetivo de la invención utilizar dichas células de MCIC para terapia o diagnóstico. Es uno objetivo específico de la invención usar células de MCIC, incluyendo células de MCIC de humanos y ungulados, para el tratamiento o diagnóstico de cualquier enfermedad en donde el transplante de células, tejidos u órganos es terapéutica o diagnósticamente benéfico. Las células de MCIC se pueden usar dentro de las mismas especies o a través de las especies . Es otro objetivo de la invención utilizar tejidos derivados de embriones de TN , fetos o progenies, incluyendo tejidos de humanos y de ungulados, para el tratamiento o diagnóstico de cualquier enfermedad en donde el transplante de células, tejidos u órganos es terapéutica o diagnósticamente benéfico. Los tejidos pueden utilizarse dentro de la misma especie o a través de la especie. Es otro objetivo específico de la invención utilizar las células de MCIC producidas de acuerdo con la invención para la producción de células, tejidos u órganos diferenciados. Es otro objetivo específico de la invención utilizar células de MCIC producidas de acuerdo con la invención in vitro, v.gr. , para el estudio de diferenciación de células y para fines de análisis, v.gr. , para estudios de fármacos. Es otro objetivo específico de la invención proveer métodos mejorados para terapia de transplante, comprendiendo el uso de células, tejidos u órganos ¡sogénicos o singénicos producidos de células de MCIC producidos de acuerdo con la invención . Dichas terapias incluyen a manera de ejemplo el tratamiento de enfermedad y lesiones incluyendo enfermedad de Parkinson, de H untington, de Alzheimer, de ALS, lesiones de médula espinal, esclerosis múltiples, distrofia muscular, diabetes, enfermedades de h ígado, enfermedades del corazón, reemplazo de cartílago, quemaduras, enfermedades vasculares, enfermedades del tracto urinario, así como para el tratamiento de defectos inmunes, transplante de médula ósea, cáncer, entre otras enfermedades. Es otro objetivo de la invención proveer células de MCIC tratadas genéticamente o transgénicas producidas insertando, removiendo o modificando el gen deseado en una célula de mamífero diferenciada o núcleo de células antes de utilizar el de la célula diferenciada o núcleo de células para la formación de una unidad de TN. Es otro objetivo de la invención utilizar las células de MCIC transgénicas o tratadas genéticamente producidas de acuerdo con la invención para terapia de genes, en particular para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades y lesiones identificados, supra. Es otro objetivo de la invención utilizar células de MCIC producidas de acuerdo con la invención o células de MCIC transgénicas o tratadas genéticamente producidas de acuerdo con la invención como donadores nucleares para transplante nuclear. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención provee un método para clonar un mamífero (v.gr., embriones, fetos, progenies). El método comprende: (i) insertar una célula o núcleo de células de mamífero diferenciada deseada en un oocito de mamífero enucleado de la misma especie que la célula diferenciada o el núcleo de células, bajo condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (TN); (ii) activar la unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta que es mayor que la etapa 2 de desarrollo de la célula; y (iv) transferir la unidad de TN cultivado a un mamífero huésped de manera que la unidad de TN se desarrolla en un feto.

Las células, tejidos y/o órganos de los fetos se utilizan ventajosamente en el área de transplante de células, tejidos y/o órganos. La presente invención también incluye un método para clonar un mamífero tratado genéticamente o transgénico, mediante el cual se inserta, se remueve o modifica un gen deseado en las célula o núcleo de células de mamíferos diferenciados antes de la inserción de la célula o núcleo de células de mamíferos diferenciados en el oocito enucleado. También la presente invención provee mamíferos obtenidos de acuerdo con el método anterior y progenies de estos mamíferos. La presente invención preferiblemente se utiliza para clonar ungulados. En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir células de MCIC. El método comprende: (i) insertar una célula o núcleo de células de mamífero diferenciada deseada en un oocito de mamífero enucleado de la misma especie que la células diferenciadas, bajo condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (TN) ; (¡i) activar la unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar la unidad de transferencia nuclear activada hasta que es mayor que la etapa 2 de desarrollo de células; y (iv) cultivar células obtenidas de la unidad de TN cultivada para obtener células de MCIC.

Las células de MCIC se utilizan ventajosamente en el área de transplantes de células, tejidos y órganos. Con los objetivos anteriores y otros, las ventajas y aspectos de la invención que serán evidentes de aquí en adelante, la naturaleza de la invención puede ser entendida más claramente por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y las reivindicaciones anexas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee procedimientos mejorados para clonar animales por transferencia nuclear o transplante nuclear. La presente solicitud, la transferencia nuclear o transplante nuclear o TN , se utilizan intercambiablemente. De acuerdo con la invención, los núcleos de células derivados de células de mamíferos fetales o adultos diferenciadas se transplantan en oocitos de mamíferos enucleados de la misma especie como los núcleos donadores. El núcleo se reprograma para dirigir el desarrollo de embriones clonados, que se pueden transferir en hembras receptoras para producir fetos y progenies, o se utilizan para producir células de MCIC. Los embriones clonados también se pueden combinar con embriones fertilizados para producir embriones quiméricos, fetos y/o progenies. Los métodos de la técnica anterior han utilizado tipos de células embriónicas en procedimientos de clonación. Estos incluyen trabajo por Campbell y otros (Nature, 380:64-68, 1996) y Stice y otros (Biol. Reprod., 54: 100-1 10, 1996). En ambos de estos estudios, las líneas celulares embriónicas se derivaron de embriones menores a 10 días de gestación. En ambos estudios, las células de SE se mantuvieron en una capa alimentadora para evitar la diferenciación evidente de la célula donadora que será utilizada en el procedimiento de clonación. La presente invención utiliza células diferenciadas. Se esperó que los embriones clonados con núcleos donadores diferenciados pudieran desarrollarse a las etapas embriónica y fetal avanzadas. El dogma científico había sido que solamente los tipos de células embriónicas o no diferenciadas podrían dirigir este tipo de desarrollo. Fue inesperado que un gran número de embriones clonados pudiera producirse a partir de estos tipos de células diferenciadas. También, fue inesperado el hecho de que las líneas celulares embriónicas transgénicas pudieran derivarse fácilmente de embriones transgénicos clonados. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, es posible la multiplicación de genotipos superiores de mamíferos, incluyendo ungulados. Esto permitirá la multiplicación de animales adultos con superioridad genética probada u otras características convenientes. Se acelerará el progreso, por ejemplo, en muchas especies de ungulados importantes. Por la presente invención, potencialmente hay miles de millones de células fetales o adultas que pueden recuperarse y utilizarse en el procedimiento de clonación. Esto potencialmente dará como resultado muchas progenies idénticas en un corto período.

La presente invención también permite la simplificación de los procedimientos transgénicos trabajando con una fuente de células diferenciadas que se puede propagar clonalmente. Esto elimina la necesidad de mantener las células en un estado no diferenciado, por lo tanto, las modificaciones genéticas, tanto de integración aleatoria y dirigidas al gen, se logran más fácilmente. También combinando la transferencia nuclear con la capacidad de modificar y seleccionar estas células in vitro, este procedimiento es más eficiente que las técnicas de embriones transgénicos previas. De acuerdo con la presente invención, estas células pueden propagarse clonalmente sin citoquinas, medio condicionado y/o capas alimentadoras, simplificando y facilitando más el procedimiento transgénico. Cuando se utilizan células transfectadas para los procedimientos de clonación de acuerdo con la invención , se producen embriones transgénicos los cuales pueden desarrollarse en fetos y progenies. También , estos embriones clonados transgénicos pueden usarse para producir líneas celulares de MCIC u otras líneas celulares embriónicas. Por lo tanto, la presente invención elimina la necesidad de derivar y mantener in vitro una línea de células no diferenciada que se conduce a las técnicas de ingeniería genética. La presente invención también se puede utilizar para producir células, fetos o progenies de MCIC que se pueden utilizar, por ejemplo, en transplante de células, tejidos y órganos. Tomando una célula fetal adulta de un animal y usándola en el procedimiento de clonación, se pueden obtener una variedad de células, tejidos y órganos posiblemente de los fetos clonados a medida que se desarrollan a través de la organogénesis. Las células, tejidos y órganos pueden aislarse también de progenies clonados. Este proceso puede proveer una fuente de "materiales" para muchas terapias médicas y veterinarias incluyendo terapia de células y genes. Si las células se transfieren de nuevo en el animal del cual se derivaron las células, entonces se previene el rechazo inmunológico. También, debido a que muchos tipos de células pueden aislarse de estos clones, se pueden usar otras metodologías tales como quimerismo hematopoyético para evitar el rechazo inmunológico entre animales de la misma especie así como entre diferentes especies. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención provee un método para clonar a un mamífero. En general, el mamífero será producido mediante un proceso de transferencia nuclear comprendiendo los siguientes pasos: (i) obtener células de mamíferos diferenciadas deseadas para usarse como una fuente de núcleos donadoras; (ii) obtener oocitos de un mamífero de la misma especie que las células las cuales son la fuente de los núcleos donadores; (iii) enuclear dichos oocitos; (iv) transferir la célula deseada o núcleo de células diferenciado deseado en el oocito enucleado, v.gr., por fusión o inyección, para formar unidades de TN; (v) activar la unidad de TN resultante; (vi) cultivar la unidad de transferencia nuclear activada hasta que se mayor a la etapa 2 de desarrollo de la célula; y (vii) transferir la unidad de TN cultivada a un mamífero huésped de manea que la unidad de TN se desarrolle en un feto. La presente invención también incluye un método para clonar un mamífero tratado genéticamente o transgénico, mediante el cual se inserta, remueve o modifica un gen deseado en la célula o núcleo de células de mamíferos diferenciados antes de la inserción de la célula o núcleo de células de mamíferos diferenciadas en el oocito enucleado. También la presente invención se provee por mamíferos obtenidos de acuerdo con el método anterior y progenies de estos mamíferos. La presente invención preferiblemente se utiliza para clonar ungulados. La presente invención además provee el uso de fetos de TN y progenies de TN y quiméricas en el área de transplante de células, tejidos y órganos. En otro aspecto, la presente invención provee un método para producir células de MCIC. El método comprende: (i) insertar una célula o núcleo de células de mamíferos diferenciada deseada en. un oocito de mamíferos enucleados de la misma especie que la célula o núcleo de células diferenciada, bajo condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (TN); (¡i) activar la unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta que sea mayor a la etapa 2 de desarrollo de la célula; y (iv) cultivar células obtenidas de la unidad de TN cultivada para obtener células de MCIC. Las células de MCIC se utilizan ventajosamente en el área de transplante de células, tejidos y órganos, o en la producción de fetos o progenies, incluyendo fetos o progenies transgénicos. Preferiblemente, las unidades de TN se cultivaran a un tamaño de por lo menos 2 a 400 células, preferiblemente de 4 a 128 células y más preferiblemente de un tamaño de por lo menos a alrededor de 50 células. Las técnicas de transferencia nuclear o técnicas de transplante nuclear se conocen en la literatura y se describen en muchas de las referencias citadas en el Antecedente de la invención. Ver, en particular, Campbell y otros, Theriogenology, 43-181 (1995) ; Collas y otros, Mol. Report Dev., 38:264-267 (1994) ; Keefer y otros, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994) ; Sims y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274 y WO 90/03432, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad . También , las Patentes de E. U .A. Nos. 4,944,384 y 5,057,420 describen procedimientos para transplante nuclear de bovinos. Las células de mamíferos diferenciadas, son aquellas células que pasan la etapa embriónica temprana. Más particularmente, las células diferenciadas son aquellas que por lo menos pasan la etapa de disco embriónico (día 10 de embriogénesis de bovinos). Las células diferenciadas pueden derivarse del ectodermo, mesodermo o endodermo. Las células de mamíferos, incluyendo células humanas, se pueden obtener por métodos bien conocidos. Las células de mamíferos útiles en la presente invención incluyen, a manera de ejemplo, células epiteliales, células neurales, células epidérmicas, queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos, linfocitos (linfocitos B y T), eritrocitos, macrofágos, monocitos, células mononucleares, fibroblastos, células de músculo cardiaco y otras células de músculo, etc. Además, las células de mamíferos usadas para transferencia nuclear pueden obtenerse de diferentes órganos, v.gr., piel, pulmón, páncreas, hígado, estómago, intestino, corazón, órganos reproductivos, vejiga, uretra y otros órganos urinarios, etc. Estos son solo ejemplos de células donadoras adecuadas. Las células donadoras adecuadas, es decir, células útiles en la presente invención, se pueden obtener de cualquier célula u órgano del cuerpo. Esto incluye todas las células somáticas o germinales. Las células del fibroblasto son un tipo de células ideales debido a que se pueden obtener de los fetos en desarrollo y animales adultos en grandes cantidades. Las células de fibroblastos se diferencian algo y, por lo tanto, se consideran previamente como un tipo de células pobre para usarse en procedimientos de clonación. Lo que es más importante, es que estas células pueden propagarse fácilmente in vitro con un tiempo de duplicación rápido y pueden propagarse clonalmente para usarse en el procedimiento que se dirige a los genes. De nuevo, la presente invención es novedosa dado que se utilizan tipos de células diferenciadas. La presente invención es ventajosa debido a que las células pueden propagarse fácilmente, modificarse genéticamente y seleccionarse in vitro. Las fuentes de mamíferos adecuados para oocitos incluyen , ovejas, vacas, cerdos, caballos, conejos, conejillos de la I ndia, ratones, hámster, ratas, primates, etc. Preferiblemente, los oocitos se obtendrán de ungulados y más preferiblemente de bovinos. Los métodos para el aislamiento de oocitos son bien conocidos en la materia. Esencialmente, estos comprenderán el aislamiento de oocitos de los ovarios o tracto reproductor de un mamífero, v.gr. , un bovino. Una fuente fácilmente disponible de oocitos de bovino son los materiales de matadero. Para el uso exitoso de las técnicas tales como ingeniería genética, transferencia y clonación nuclear, los oocitos generalmente deben ser madurados in vitro antes de que se puedan utilizar estás células como células receptoras para transferencia nuclear y antes de que puedan fertilizarse por las células de espermas para desarrollarse en un embrión. Este proceso generalmente requiere recopilar oocitos inmaduros (profase I) de ovarios de mamíferos, v.gr. , ovarios de bovinos obtenidos en un matadero y madurar los oocitos en un medio de maduración antes de la fertilización o enucleación hasta que el oocito obtiene la etapa de metafase I I , la cual en el caso de oocitos de bovinos, ocurre generalmente a alrededor de 18-24 horas después de la aspiración . Para los fines de la presente invención, este tiempo se conoce como el "período de maduración". Como se usa en la presente, para el cálculo de tiempo , "aspiración" se refiere a la aspiración del oocito inmaduro de folículos de ovarios. Adicionalmente, los oocitos en la etapa de metafase I I , que se maduraron in vivo, se han utilizado exitosamente en las técnicas de transferencia nuclear. Esencialmente, los oocitos de metafase I I maduros se recopilan quirúrgicamente de vacas o vaquillas no sobreovuladas o sobreovuladas de 35 a 48 horas después del inicio del estro o después de la inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG , por sus siglas en inglés) u hormona similar. La etapa de maduración del oocito en enucleación y transferencia nuclear se ha reportado que es significativa el éxito de los métodos de TN . (Ver, por ejemplo, Prather y otros, Differentiation, 48, 1 -8, 1991 ) . En general, las prácticas de clonación de embriones de mamíferos exitosas, utilizan el oocito en la etapa de metafase I I como el oocito receptor debido a que se piensa que en esta etapa el oocito puede ser "activada" o se "activa" suficientemente, para tratar el núcleo introducido a medida que lo hace un esperma fertilizante. En animales domésticos y especialmente en ganado vacuno, el período de activación del oocito varía de aproximadamente 16-52 horas, preferiblemente de aproximadamente 28-42 horas después de la aspiración .

Por ejemplo, los oocitos inmaduros pueden lavarse en medio de cultivo de embriones de hámster (MCEH) con pH regulado con H EPES como se describe en Seshagine y otros, Biol. Reprod., 40, 544-606, 1989, y después se colocó en gotas de medio de maduración consistiendo de 50 microlitros de medio de cultivo de tejido (MCT) 199 conteniendo 10% de suero de becerro fetal que contiene gonadotropinas apropiadas como la hormona leutinizante (H L) y hormona de estimulación de folículos (H EF) y estradiol bajo una capa de parafina de peso ligero o silicio a 39°C. Después de un período de maduración de tiempo fijo, el cual varía de aproximadamente 10 a 40 horas y preferiblemente de a alrededor 16-18 horas, serán enucleados los oocitos. Antes de enucleación los oocitos preferiblemente serán retirados y colocados en MCEH conteniendo 1 miligramo por mililitro de hialuronidasa antes de la remoción de células en forma de cúmulos. Esto se puede efectuar por el pipeteo repetido a través de pipetas de orificio muy fino o revolviendo brevemente. Los oocitos separados se tamizaron para cuerpos polares y los oocitos en metafase I I seleccionados , como se determinó por presencia de cuerpos polares, se utilizan para transferencia nuclear. Después sigue la enucleación. La enucleación puede efectuarse por métodos conocidos, tales como se describe en la Patente de E. U .A. No. 4,994,384 que se incorpora aquí por referencia. Por ejemplo, los oocitos en la metafase I I se colocan en MCEH , opcionalmente conteniendo 7.5 microgramos por mililitro de citocalasina B, para la enucleación inmediata o se puede colocar en un medio adecuado, por ejemplo un medio de cultivo de embriones tales como CR1 aa, más 10% de suero de vaca en estro y después es enucleada, preferiblemente no más de 24 horas después y aún más preferiblemente 16- 18 horas después. La enucleación puede lograrse microquirúrgicamente utilizando una micropipeta para remover el cuerpo polar y el citoplasma adyacente. Los oocitos entonces pueden tamizarse para identificar aquellos de los cuales se han enucleado exitosamente. Este tamizado puede efectuarse tiñendo los oocitos con 1 microgramo por mililitro de colorante Hoechst 33342 en MCEH y después observando los oocitos bajo irradiación ultravioleta durante menos de 10 segundos. Los oocitos que se han enucleado exitosamente puede colocarse entonces en un medio de cultivo adecuado, v.gr. , CR 1 aa más 10% de suero. En la presente invención, los oocitos receptores preferiblemente serán enucleados en un tiempo que varía de aproximadamente 10 horas a alrededor de 40 horas después del inicio de la maduración in vitro, más preferiblemente de aproximadamente 16 horas a alrededor de 24 horas después del inicio de la maduración in vitro y aún más preferiblemente de aproximadamente 16-18 horas después del inicio de la maduración in vitro . Se puede transferir entonces una sola célula de mam ífero de la misma especie como el oocito enucleado en el espacio perivitelino del oocito enucleado utilizado para producir la unidad de TN . La célula de mamíferos y el oocito enucleado se usaran para producir las unidades de TN de acuerdo con los métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, las células de SE pueden fusionar por electrofusión. La electrofusión se logra proveyendo un impulso de electricidad que es suficiente para ocasionar una ruptura temporal de la membrana del plasma. Esta ruptura de la membrana de plasma es muy cota debido a que se reforma rápidamente en la membrana. Por lo tanto, si se inducen dos membranas adyacentes para romperse y mediante la reformación de las capas de lípidos entremezcladas, se abrirán canales pequeños entre las dos células. Debido a la inestabilidad termodinámica de dicha abertura pequeña, se alarga hasta que las dos células de SE vuelven una. Se hace referencia a la Patente de E.U.A. No. 4,997,384 por Prather y otros, (incorporada aquí en su totalidad por preferencia) para una discusión adicional de este proceso. Se puede utilizar una variedad de medios de electrofusión incluyendo, v.gr., solución regulada con sacarosa, manitol, sorbitol y fosfato. También se puede lograr la fusión utilizando virus Sendai como un agente fusogénico (Graham, Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 19, 1969). También, en algunos casos (v.gr., con pequeños núcleos donadores) será preferible inyectar el núcleo directamente en el oocito en lugar de utilizar fusión por electroporación. Dichas técnicas se describen en Collas and Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994), incorporada aquí por referencia en su totalidad.

De preferencia, las células y oocitos de mamífero son electrofusionados en una cámara de 500 µm por la aplicación de un pulso eléctrico de 90-120V durante aproximadamente 15 µseg , aproximadamente 24 horas después del inicio de la maduración del oocito. Después de la fusión, las unidades de TN fusionadas resultantes entonces se colocan en un medio adecuado hasta que se activa, v. gr. , medio de CR 1 aa. Normalmente la activación será efectuada un corto tiempo después, normalmente menos de 24 horas después, y de preferencia aproximadamente 4-9 horas después. La unidad de TN se puede activar por métodos conocidos .

Dichos métodos ¡ncluyen , v.gr. , cultivo de la unidad de TN a temperatura sub-fisiológica, en esencia aplicando un choque de temperatura fría a realmente fría a la unidad de TN . Esto puede realizarse más convenientemente cultivando la unidad de TN a temperatura ambiente, que es relativamente fría para las condiciones de temperatura fisiológicas a las cuales se exponen normalmente los embriones. Alternativamente, la activación puede lograrse por la aplicación de agentes de activación conocidos. Por ejemplo, se ha mostrado que la penetración de oocitos por esperma durante la fertilización activa los oocitos de perfusión para dar números mayores de embarazos viables y becerros genéticamente idénticos múltiples después de transferencia nuclear. También, los tratamientos tales como choque eléctrico o químico pueden utilizarse para activar a los embriones de TN después de la fusión . Los métodos de activación de oocitos adecuados son el tema de la Patente de E.U.A. No. 5,496,720 de Susko-Parrish y otros, incorporada aquí por referencia en su totalidad. Adicionalmente, la activación puede efectuarse simultánea o secuencialmente: (i) el incremento de niveles de cationes divalentes en el oocito, y (ii) reducción de la fosforilación de proteínas celulares en el oocito. Esto se efectuará generalmente introduciendo cationes divalentes en el citoplasma de oocitos, v.gr., magnesio, estroncio, bario o calcio v.gr., en forma de un ¡onofero. Otros métodos para incrementar los niveles de cationes divalentes incluyen el uso de choque eléctrico, tratamiento con etanol y tratamientos con quelantes encerrados. Las fosforilación puede reducirse por métodos conocidos, v.gr., por la adición de inhibidores de cinasa, v.gr., inhibidores de serina-treonina cinasa tales como 6-dimetil-aminopurina, estaurosporina, 2-aminopurina y esfingosina. Alternativamente, la fosforilización de proteínas celulares puede inhibirse por introducción de un fosfatasa en el oocito, v.gr., fosfatasa 2A y fosfatasa 2B. En una modalidad, la activación de TN se efectúa exponiendo brevemente la unidad de TN a un medio de TL-HEPES que contiene 5 µM de ionomicina y 1 mg/ml de BSA, seguido por el lavado en TL- H EPES conteniendo 30 mg/ml de BSA dentro de aproximadamente 24 horas después de la fusión y preferiblemente aproximadamente 2 a 9 horas después de la fusión . Las unidades de TN activadas entonces pueden cultivarse en un medio de cultivo in vitro adecuado hasta la generación de células de MCIC y colonias de células. Los medios de cultivo adecuados para cultivados y madurar embriones son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de medios conocidos, que se pueden utilizar para cultivo y mantenimiento de embriones de bovinos, incluyen F-10 de Ham + suero de becerro fetal al 10% (FCS por sus siglas en inglés) , Medio de Cultivo de Tejido-199 (MCT- 199) + 105 de suero de becerro fetal , Tiroides-Albumina-Lactato-Piruvato (TALP), Solución Salina Regula de Fosfato de Dulbecco (PBS) , medio Eagle y Whitten. U no de los medios más comunes utilizados para la recopilación y maduración de oocitos es MCT-199 y 1 a 20% de suplemento de suero incluyendo suero de becerro fetal, suero de recién nacido o suero de vaca estrual , suero de cordero o suero de novillo. Un medio de mantenimiento preferido incluye MCT-199 con sales Earl, 10% de suero de becerro fetal, 0.2 mM de piruvato de Na y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina. Cualquiera de los anteriores puede implicar también el co-cultivo con una variedad de tipos de células tales como células granulosas, células de oviducto, células de BRL y células uterinas y células STO. Otro medio de mantenimiento se describe en la Patente de E. U .A. No. 5, 096, 822 de Rosenkrans, Jr. y otros, que se incorpora aquí por referencia. Este medio de embriones, nombrado CR 1 , contiene las substancias nutricionales necesarias para soportar un embrión. CR1 contiene el L-lactato de hemicalcio en cantidades que varían de 1 .0 mM a 10 mM, preferiblemente 1 .0 mM a 5.0 mM: el L-lactato de hemicalcio es L-lactato con una sal de hemicalcio incorporada en el mismo. El L-lactato de hemicalcio es importante dado que un solo componente satisface los requerimientos principales en el medio de cultivo: (i) el requerimiento de calcio necesario para compactar y la disposición de citoesqueleto; y (i) el requerimiento de lactato necesario para metabolismo y transportar electrones. El L-lactato de hemicalcio también sirve como un mineral valioso y fuente de energía para el medio necesario para la viabilidad de los embriones. Ventajosamente, el medio de CR1 no contiene suero, tal como suero de becerro fetal y no requiere el uso de un co-cultivo de células de animales u otros medios biológicos, es decir, medios que comprenden células animales tales como células de oviducto. Algunas veces los medios biológicos pueden ser desventajosos dado que pueden contener microorganismos o factores traza que pueden ser dañinos para los embriones y que se son difíciles de detectar, caracterizar y eliminar. Los ejemplos de los componentes principales en medio de CR ! Incluyen L-lactato de hemicalcio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, bicarbonato de sodio y una cantidad menor de albúmina de suero de bovino sin ácidos grasos (Sigma A-6003) . Adicionalmente , una cantidad definida de aminoácidos esenciales y no esenciales se puede agregar al medio. CR1 con aminoácidos se conoce por la abreviatura "CR1 aa" . El medio CR 1 preferiblemente contiene los siguientes componentes en las siguientes cantidades: cloruro de sodio -1 14.7 mM cloruro de potasio -3.1 mM bicarbonato de sodio -26.2 mM L-lactato de hemicalcio -5 mM BSA libre de ácido graso -3 mg/ml En una modalidad, la unidad de embriones de TN activados se coloca en medio CR1 aa que contiene 1 .9 mM de DMAP durante aproximadamente 4 horas seguido por un lavado en MCEH y después cultivado en BSA que contiene CR1 aa. Por ejemplo, las unidades de TN activadas pueden transferirse al medio de cultivo de CR 1 aa conteniendo 2.0 mM de DMAP (Sigma) y cultivados bajo condiciones ambientales, v.gr. , aproximadamente 38.5°C, 5% de CO2 durante un tiempo adecuado, v.gr. , aproximadamente de 4 a 5 horas. Después, la unidad o unidades de TN cultivadas preferiblemente se lavan y después se colocan en medio adecuado, v. gr. , medio de CR 1 aa que contiene 10% de FCS y 6 mg/ mi contenido en placas de pozos las cuales preferiblemente contienen una capa alimentadora confluente adecuada. Las capas aiimentadoras adecuadas incluyen , a manera de ejemplo, fibroblastos y células epiteliales, v. gr. , fibroblastos y células epiteliales uterinas derivadas de ungulados, fibroblastos de pollo, fibroblastos de murinos (v.gr. , ratones o ratas) , líneas celulares alimentadoras de STO y S!-m220 y células de BRL. En una modalidad, las células alimentadoras comprenden fibroblastos embriónicos de ratón. La preparación de una capa alimentadora de fibroblastos adecuados se describen en el ejemplo siguiente y están dentro de la experiencia del experto. Las unidades de TN se cultivan sobre la capa alimentadora hasta que las unidades de TN alcanzan un tamaño adecuado para transferirlo a una hembra receptora para obtener células que se pueden usar para producir células de MCIC y colonias celulares. Preferiblemente, estas unidades de TN se cultivaran hasta por lo menos aproximadamente 2 a 400 células, más preferiblemente aproximadamente 4 a 128 células y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 células. El cultivo se efectuará bajo las condiciones adecuadas, es decir, aproximadamente 38.5°C y 5% de CO2; con el medio de cultivo cambiado con el fin de optimizar el crecimiento normalmente aproximadamente cada 2-5 días, preferiblemente aproximadamente cada 3 días. Los métodos para transferencia de embriones y manejo del animal receptor en la presente invención son procedimientos normales usados en la industria de transferencia de embriones. Las transferencias sincrónicas son importantes para el éxito de la presente invención , es decir, la etapa del embrión de TN está en sincronía con el ciclo del estro de la hembra receptora. Esta ventaja y como mantener los receptores se revisan en Siedel, G. E. , J r ("Critica! review of embryo transfer procedures with cattle" in Fertilization and Embrionic Development in Vitro (1981 ) L. Mastroianni, Jr, and J . D. Biggers, ed . , Plenum Pres, New York, página 323) , el contenido de la cual se incorpora aquí por referencia. La presente invención también se puede usar para clonar en mamíferos tratados genéticamente o transgénicos. Como se explicó antes, la presente invención es ventajosa dado que se pueden simplificar procedimientos transgénicos trabajando con una fuente de células diferenciadas que puede propagarse clonalmente. En particular, las células diferenciadas utilizadas para donar núcleos tienen un gen deseado insertado, removido o modificado. Estas células alteradas, diferenciadas genéticamente son las que se utilizan para el transplante nuclear con oocitos enucleados. Cualesquiera métodos para insertar, suprimir o modificar un gen deseado de una célula de mamífero se puede usar para alterar la célula diferenciada que será usada como el donador nuclear. Estos procedimientos pueden remover o parte de un gen y el gen puede ser heterólogo. Se incluye la técnica de recombinación homologa, que permite la inserción, supresión o modificación de un gen o genes en un sitio específico o sitios específicos en el genoma de la célula.

La presente invención , por lo tanto, puede usarse para proveer a mamíferos adultos con los genotipos deseados. La multiplicación de ungulados adultas con superioridad genética probada u otras características convenientes es particularmente útil incluyendo animales , transgénicos o tratados genéticamente y animales quiméricos. Además, las células y tejidos del feto de TN , incluyendo fetos transgénicos y/o quiméricos, se pueden usar en transplantes de células, tejidos y órganos para el tratamiento de numerosas enfermedades, como se describe más adelante en relación con el uso de células de MCIC. Para la producción de células y líneas celulares de MCIC, después de que se obtienen las unidades de TN del tamaño deseado, las células de SE remueven mecánicamente de la zona y después se usan . Esto se efectúa preferiblemente tomando el cúmulo de células que comprende la unidad de TN , el cual normalmente contendrá por lo menos a alrededor de 50 células, lavando dichas células y sembrando en placas las células en una capa alimentadora, v.gr. , células de fibroblasto irradiadas. Normalmente, las células usadas para obtener las células de soporte o las colonias celulares serán obtenidas de la porción más interna de la unidad de TN cultivadas que preferiblemente es de por lo menos 50 células en tamaño. Sin embargo, las unidades de TN de números de células más pequeños o más grandes así como células de otras porciones de la unidad de TN también se pueden utilizar para obtener células de SE y colonias celulares. Las células de SE mantienen en la capa aiimentadora en un medio de crecimiento adecuado, v.gr. , M EM suplementado con 10% de FCS y 0.1 mM de ß-mercaptoetanol (Sigma) y L-glutamina. El medio de crecimiento se cambia tan frecuente como sea necesario para optimizar el crecimiento, v. gr. , aproximadamente cada 2-3 d ías . Este proceso de cultivo da como resultado la formación de las células o las líneas celulares de MCIC. Un experto en la técnica puede variar las condiciones de cultivo según se desea para optimizar el crecimiento de las células de MCIC particulares . También, las células de MCIC de mamíferos tratados genéticamente o transgénicos pueden producirse de acuerdo con la presente invención . Es decir, los métodos descritos antes pueden utilizarse para producir unidades de TN en las cuales se han introducido un gen o genes deseados, o de los cuales se ha removido o modificado todo o parte del gen o genes endógenos. Las unidades de TN tratadas genéticamente o transgénicas pueden utilizarse entonces para producir células de MCIC tratadas genéticamente o transgénicas, incluyendo células humanas. Las células de MCIC resultantes y líneas celulares, preferiblemente células y líneas celulares de MCIC, humanas tienen numerosas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Más especialmente, dichas células de MCIC se pueden utilizar para terapias o transplante de células. Las células de MCIC humanas tienen aplicación en el tratamiento de numerosas condiciones de enfermedad . Las unidades de TN humanas por si mismas también se pueden utilizar en el tratamiento de condiciones de enfermedad .

A este respecto, se sabe que las células de soporte embriónicas (SE) de ratones son capaces de diferenciarse en casi todos los tipos de células, v.gr., células de soporte hematopoyético. Por lo tanto, las células de MCIC humanas producidas de acuerdo con la invención deben tener capacidad de diferenciación similar. Las células de MCIC de acuerdo con la invención serán inducidas para diferenciarse con el fin de obtener los tipos de células deseados de acuerdo con los métodos conocidos. Por ejemplo, las células de MCIC humanas presentes se pueden inducir para diferenciarse en células de soporte hematopoyéticas, células de músculo, células de músculo cardiaco, células de hígado, células de cartílago, células epiteliales, células del tracto urinario, etc., cultivando dichas células en un medio de diferenciación y bajo condiciones que proveen diferenciación celular. El medio y métodos que dan como resultado la diferenciación de células de MCIC se conocen en la técnica dado que son adecuados para las condiciones de cultivo. Por ejemplo, Palacios y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7530-7537 (1995) enseña la producción de células de soporte hematopoyéticas de una línea celular embriónica sometiendo las células de soporte a un procedimiento de inducción que comprende cultivar inicialmente agregados de dichas células en un medio de cultivo de suspensión que carece de ácido retinoico seguido por el cultivo en el mismo medio que contiene ácido retinoico, seguido por la transferencia de los agregados celulares a un substrato que proporciona la unión de células. Además, Pedersen, J. Reprod. Fértil. Dev., 6: 543-552 (1994) es un artículo revisado que hace referencia a numerosos artículos describiendo métodos para diferenciación in vitro de células de soporte embriónicas para producir varios tipos de células diferenciadas incluyendo células hematopoyéticas, músculo, músculo cardiaco, células del nervio, entre otros. Además, Bain y otros, Dev. Biol., 168: 342-357 (1995) enseña la diferenciación in vitro de células de soporte embriónicas para producir células neurales que tienen propiedades neuronales. Estas referencias son ilustrativas de métodos reportados para obtener células diferenciadas de células embriónicas o de soporte. Estas referencias y en partículas las descripciones en la misma que se refieren a los métodos para diferenciación de células de soporte embriónicas se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Por lo tanto, utilizando métodos conocidos y medio de cultivo, un experto en la técnica puede cultivar las células de MCIC presentes, incluyendo células de MCIC tratadas genéticamente o transgénicas, para obtener los tipos de células diferenciadas deseadas, v.gr. , células neurales, células de músculo, células hematopoyéticas, etc. Se pueden utilizar células de MCIC presentes para obtener cualquier tipo de célula diferenciada deseada. Los usos terapéuticos de dichas células humanas diferenciadas no son paralelos. Por ejemplo, las células de soporte hematopoyéticas humanas se pueden utilizar en tratamientos médicos que requieren transplante de médula ósea. Dichos procedimientos se utilizan para tratamientos de muchas enfermedades, v.gr. , cáncer en etapa tardía tales como cáncer de ovario y leucemia, así como enfermedades que comprenden el sistema inmune, tales como SI DA. Se pueden obtener células de soporte hematopoyéticas, v. gr. , fusionando células somáticas adultas de un paciente con cáncer o SI DA, v.gr. , células epiteliales o linfocitos con un oocito enucleado, obteniendo células de MCIC como se describe antes y cultivando dichas células bajo condiciones que favorecen la diferenciación, hasta que se obtienen células de soporte hematopoyéticas. Dichas células hematopoyéticas se pueden usar en el tratamiento de enfermedades incluyendo cáncer y SI DA. Alternativamente, las células somáticas adultas de un paciente con un trastorno neurológico se pueden fusionar con un oocito enucleado, células de MCIC humanas obtenidas de los mismos y dichas células cultivadas bajo condiciones de diferenciación para producir líneas celulares neurales. Las enfermedades específicas que se pueden tratar por transplante de dichas células neuraies humanas incluyen, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ALS y parálisis cerebral, entre otros. En el caso específico de la enfermedad de Parkinson, se ha demostrado que las células neurales del cerebro fetal transplantadas, hacen más conexiones apropiadas con las células circundantes y producen dopamina. Esto puede dar como resultado la inversión a largo plazo de los síntomas de enfermedad de Parkinson. La gran ventaja de la presente invención es que provee un suministro esencialmente sin límite de células humanas isogénicas o singénicas adecuadas para el transplante. Por lo tanto, será obvio el problema significativo asociado con métodos de transplante actuales, es decir, el rechazo del tejido transplantado que puede presentarse debido al rechazo de huésped contra injerto o injerto contra huésped . Convencionalmente, el rechazo se evita o se reduce mediante la administración de fármacos anti-rechazo tales como ciclosporina. Sin embargo, dichos fármacos tienen efectos laterales adversos significativos, v.gr. , inmunosupresión, propiedades carcinogénicos, al igual que son muy costosos. La presente invención debería eliminar, o por lo menos reducir gran parte, la necesidad de los fármacos anti-rechazo. Otras enfermedades y condiciones que se pueden tratar por terapia de células isogénicas incluyen , a manera de ejemplo, daños en la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, diabetes, enfermedades del hígado, es decir, hipercolesterolemia, enfermedades del corazón, reemplazo de cartílago, quemaduras , ulcera de pies, enfermedades gastrointestinales, enfermedades vasculares, enfermedad del riñon , enfermedad del tracto urinario y enfermedades y condiciones relacionadas con la vejez. Esta metodología se puede usar para reemplazar genes defectuosos, v.gr. , genes del sistema inmune defectuoso, genes de fibrosis cística, o para introducir genes lo cual da como resultado la expresión de proteínas terapéuticamente benéficas tales como factores de crecimiento, linfocinas, citoquinas, enzimas, etc. Por ejemplo, el factor de crecimiento derivado del cerebro que codifica el gen se puede introducir en células de MC1C humanas, las células diferenciadas en las células neurales y las células transplantadas en un paciente con enfermedad de Parkinson para retardar la perdida de células neurales durante dicha enfermedad. Previamente, los tipos de células transfectadas con BDN F variaron de células primarias a líneas celulares inmortalizadas, ya sea células derivadas neurales o no neurales (mioblasto y fibroblasto). Por ejemplo, los astrocitos se han transfectado con el gen de BDN F usando vectores retrovirales y las células injertadas en un modelo de ratas de enfermedad de Parkinson (Yoshimoto y otros, Brain Research, 691 :25-36, (1995)) . Esta terapia ex vivo redujo los síntomas similares a los Parkinson en las ratas hasta 45% 32 días después de la transferencia. También, el gen de hidroxilasa de tirosina se ha colocado en los astrocitos con resultados similares (Lundberg y otros, Develop. Neurol., 139-39-53 (1996) y referencias citadas en el mismo). Sin embargo, dichos sistemas ex vivo tienen problemas. En particular, los vectores retrovirales usados actualmente regulan descendentemente in vivo y el transgen solamente se expresa temporalmente (revisión por Mulligan , Science, 260:926-932 (1993)) .

También , dichos estudios usaron células primarias, astrocitos, que tienen un tiempo de vida finito y se replican lentamente. Dichas propiedades afectan adversamente el régimen de transfección e impiden la selección de células transfectadas establemente. Además, es casi imposible propagar una gran población de células primarias dirigidas a los genes que serán usadas en técnicas de recombinación homologas. En contraste, se deberán eliminar las dificultades asociadas con sistemas retrovirales mediante el uso de células de MCIC de mamíferos. Los genes que se pueden introducir en las células de MCIC presentes incluyen, a manera de ejemplo, un factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento neurotrófico derivado de la glia, factor de crecimiento similar a insulina (I y I I) ; neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, factor neurotrófico ciliar, AFT-1 , genes de citoquina (interleucinas, interferones, factores de estimulación de colonias, factor de necrosis tumoral (alfa y beta), etc.) , los genes que codifican enzimas terapéuticas, etc. Además del uso de células de MCIC humanas en el transplante de células, tejidos y órganos, la presente invención también incluye el uso de células que no son humanas en el tratamiento de enfermedades humanas. Por lo tanto, las células de MCIC, fetos de TN y en TN y progenies quiméricas (transgénicas o no transgénicas) de cualquier especie se puede usar en el tratamiento de condiciones de enfermedad en humanos en donde se garantizada el transplante de células, tejidos u órganos. En general, las células, fetos y progenies de MCIC de acuerdo con la presente invención se pueden usar dentro de la misma especie (autológas, singénicas o aloinjertos) o a través de las especies (xenoinjertos). Por ejemplo, las células del cerebro de fetos de TN de bovinos se pueden utilizar para tratar la enfermedad de Parkinson. También, las células de MCIC presentes, preferiblemente células humanas, se pueden usar como un modelo in vitro de diferenciación, en particular para el estudio de genes que están implicados en la regulación de desarrollo temprano. También, las células, tejidos y órganos diferenciados utilizando las células de MCIC presentes se pueden utilizar en estudios de fármacos. Además, las células presentes de MCIC se pueden utilizar como donadores nucleares para la producción de otras células de MCIC y colonias de células. Con el fin de describir más claramente la presente invención , se proveen los siguientes ejemplos. EJEMPLO 1 Aislamiento de cultivos primarios de células de fibroblastos de bovinos embriónicos y adultos de bovinos y porcinos. Los cultivos primarios de fibroblastos de bovinos y porcinos se obtuvieron de fetos (45 días de embarazo para ganado vacuno y 35 días para fetos de cerdos) . Se removieron asépticamente la cabeza, hígado, corazón y tracto alimentario, los fetos se trituraron y se incubaron durante 30 minutos a 37°C en solución de EDT de tripsina precalentada (0.05% de tripsina/O.02% de EDTA; G I BCO, Grand Island, NY) . Las células de fibroblastos se sembraron en placas en placas de cultivo de tejido y se cultivaron en medio alfa-M EM , (BioWhittaker, Walkersville, MD) suplementado con 10% de suero de becerro fetal (FCS) (Hyclone, Logen , UT), penicilina (100 l U/ml) y estreptomicina (50 µl/ml) . Los fibroblastos se desarrollaron y se mantuvieron en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 en aire a 37°C. Las células de fibroblastos adultas se aislaron del pulmón de una vaca (aproximadamente de cinco años de edad). El tejido de pulmón triturado se incubó durante la noche a 10°C en solución de EDTA de tripsina (0.05% de tripsina/0.02% de EDTA; G I BCO, Grand Island, NY). El siguiente día se incubaron el tejido y cualesquiera células disasociadas durante una hora a 37°C en solución de EDTA de tripsina precalentada (0.05% de tripsina/0.02% de EDTA; G I BCO, Grand Island, NY) y se procesaron a través de tres lavados consecutivos e incubaciones de tripsina (una hora) . Las células de fibroblastos se sembraron en placas de cultivo de tejidos y se cultivaron en medio alfa-M EM (BioWhittaker, Walkersville, M D) suplementado con 10% de suero de becerro fetal (FCS) (Hyclone, Logen , UT), penicilina (10 lU/mL) y estreptomicina (50 µl/ml) . Las células de fibroblastos se pueden aislar virtualmente en cualquier momento en el desarrollo, variando de aproximadamente la etapa de disco post-embriónica hasta la vida adulta del animal (bovinos de 12 a 15 días después de la fertilización a 10 a 15 años de edad de los animales) . Este procedimiento también se puede utilizar para aislar fibroblastos de otros mamíferos, incluyendo ratones. Introducción de un gen marcador (ADN heterólogo extraño) en células embriónicas y de fibroblastos adultos. El procedimiento de electroporación siguiente se llevó a cabo para células de fibroblastos embriónicas (ganado vacuno y cerdos) y adultas (ganado vacuno). Los procedimientos de micro-inyección normales pueden utilizarse también para introducir ADN heterólogo en células de fibroblastos, sin embargo, en este ejemplo se uso electroporación debido a que es un procedimiento más fácil . Las placas de cultivo que contienen células de fibroblastos de propagación se incubaron en solución de EDTA de tripsina (0.05% de tripsina/O.02% de EDTA; GI BCO, Grand island , NY) hasta que las células estuvieron en una sola suspensión celular. Las células de SE hicieron girar a 500 x g y se re-suspendieron en 5 millones de células por mi con solución salina regulada con fosfato (PBS) . La construcción del gen reportero contuvo el promotor de citomegalovirus y la beta-galactosidasa, gen de fusión de neomicina fosfotransferasa (beta-G EO) . El gen reporte y las células a una concentración final de 50 µl/ml se agregaron a la cámara de electroporación. Después del impulso de electroporación, las células de fibroblastos se transfirieron de nuevo en el medio de crecimiento (medio alfa-M EM) (BioWhittaker, Walkersville, MD) suplementado con 10% de suero de becerro fetal (FCS) (Hyclone, Logen, UT) , penicilina (100 l U/ml) y estreptomicina (50 µl/ml)) .

El día después de la electroporación, las células de fibroblastos unidas se seleccionaron para la integración estable del gen reportero. Se agregó G418 (400 µg/ml) al medio de crecimiento durante 15 días (escala: 3 días hasta el final del ciclo de vida de las células cultivadas). Este fármaco mata cualquier célula sin el gen beta-GEO, dado que no expresan el gen de resistencia neo. Al final de este tiempo, estuvieron presentes colonias de células transgénicas estables. Cada colonia se propagó independientemente una de la otra. Las células de fibroblastos transgénicas se tiñeron con X-gal para observar la expresión de beta-galactosidasa y se confirmaron positivas para la integración utilizando amplificación de RCP del gen de beta-GEO y se corrieron en gen de agarosa. Uso de células de fibroblastos transgénicas en procedimientos de transferencia nuclear para crear líneas celulares de MCIC y fetos transgénicos. Una línea de células (CL-1) derivada de una colonia de células de fibroblastos embriónicos de bovinos se usó como núcleos donadores en el procedimiento de transferencia nuclear (TN). Los procedimientos generales de TN se describen más adelante. Se maduraron los oocitos del matadero in vitro. Los oocitos se separaron de células en cúmulos y se enuclearon con una micropipeta nivelada a aproximadamente 18 a 20 horas después de la maduración (hpm). La enucleación se confirmó en medio TL-HEPES más Hoechst 33342 (3 µg/ml; Sigma). Las células donadora individuales (fibroblastos) se colocaron en el espacio perivitilino del oocito receptor. El citoplasma de oocitos de bovinos y el núcleo donadores (unidad de TN) se fusionaron utilizando técnicas electrofusión. Un pulso de fusión que consiste de 120 V durante 15 µseg en una cámara con un espacio de 500 µm se aplicó a la unidad de TN . Esto ocurrió a 24 hpm . Las unidades de TN se colocaron en medio CR 1 aa hasta 26 a 27 hpm . El procedimiento general utilizado para activar artificialmente los oocitos se describió antes. La activación de la unidad de TN se inició entre 26 y 27 hpm . En resumen , las unidades de TN se expusieron durante cuatro minutos a ionocimina (5 µM; CalBiochem , La Jolla, CA) en medio TL-H EPES suplementado con 1 mg/ml de BSA y después se lavó durante cinco minutos en medio TL-H EPES suplementado con 30 mg/ml de BSA. Durante el tratamiento con ionomicina, las unidades de TN también se expusieron a 2 mM de DMAP (Sigma) . Después de lavado, las unidades de TN se transfirieron en un microgotero de medio de cultivo CR 1 aa conteniendo 2 mM de DMAP (Sigma) y se cultivaron a 38.5°C, 5% de CO2 durante cuatro a cinco horas. Los embriones se lavaron y se colocaron en medio CR1 aa más 10% de FCS y 6 mg/ml de BSA en cuatro placas de pozo conteniendo una capa alimentadora confluente de fibroblasto embriónico de ratones. Las unidades de TN se cultivaron durante tres días más a 38.5°C y 5% de CO2. El medio de cultivo se cambió cada tres días hasta los días 5 a 8 después de la activación. En este momento los embriones de TN en etapa de blastocitos se pueden utilizar para producir líneas celulares de MCIC y fetos transgénicos de TN (masa de células internas cultivadas). La masa de células internas de estas unidades de TN se puede aislar y sembrar en una capa alimentadora. También, las unidades de TN se transfirieron en hembras receptoras. Los embarazos se abortaron a los 35 días de gestación. Esto dio como resultado dos fetos transgénicos clonados que tienen el gen beta-GEO en todos los tejidos revisados. Por lo tanto, este es un método rápido y fácil para formar líneas celulares de MCIC y fetos transgénicos. Este procedimiento generalmente condujo a las líneas celulares de MCIC y fetos dirigidos al gen. La siguiente tabla resume los resultados de estos experimentos. * 19 líneas fueron positivas para beta-GEO, 2 fueron negativas y una línea se murió antes de la detección de RCP. t Un feto murió y otro se retardó ligeramente en el desarrollo a los 35 días de gestación. Dos fetos recuperados en el día 38 fueron normales. Todos los fetos se confirmaron transgénicos.

EJEMPLO 2 Fetos quiméricos derivados de células de MCIC transgénicas. La línea celular de MCIC transgénica se derivó originalmente de una unidad de TN transgénica (célula diferenciada). Una línea de MCIC derivada de embriones de TN transgénicos (una célula de CL- 1 transferida en un oocito enucleado) se utilizó para producir embriones y fetos quiméricos. Las colonias de células de MCIC transgénicas se disgregaron utilizando 1 -5 mg/ml de pronasa o 0.05% de tripsina/EDTA combinado con los métodos de disgregación mecánica de manera que los cúmulos de cinco o menos células de SE produjeron . La actividad de tripsina o pronasa se inactivo pasando las células a través de múltiples lavados de 30 a 100% de suero de becerro fetal. Las células disgregadas se colocaron en placas de micromanipulación conteniendo el medio TL-H EPES. Los embriones fertilizados también se colocaron en estas placas y se utilizaron herramientas de micromanipulación para producir los embriones quiméricos. Se inyectaron de ocho a diez células de MCIC transgénicas en embriones fertilizados en la etapa 8- 16 de las células. Estos embriones se cultivaron in vitro para la etapa de blastocitos y después se transfirieron en animales receptores. Un total de 6 embriones quiméricos en etapa de blastocitos se transfirieron no quirúrgicamente en dos hembras receptoras. Después de cinco semanas de gestación se recuperaron 3 fetos .

Varios tejidos de los tres fetos, incluyendo células germinales de la gónada (sugiriendo quimeras de líneas germinales), se tamizaran por amplificación de RCP y se hibridizaron con el análisis de manchas Southern de producto amplificado a un fragmento beta-galactosidasa. De los tres fetos, dos fueron positivos para la contribución de las células de MCIC transgénicas. Ambos fetos tuvieron contribución de MCIC transgénico a la gónada. Embriones de TN transgénicos derivados de líneas celulares de MCIC transgénicas. La línea celular de MCIC transgénicas se derivó originalmente de una unidad de TN transgénica (célula diferenciada). Se utilizaron las mismas líneas celulares de MCIC transgénicas para producir embriones de TN . Los procedimientos de TN descritos en el Ejemplo 1 se usaron excepto que las células de MCIC en lugar de las células de fibroblastos se utilizaron como la célula donadora fusionada con el oocito enucleado. Las colonias de células de MCIC transgénicas se disgregaron ya se utilizando 1 -5 mg/ml de pronasa o 0.05% de tripsina/EDTA combinado con métodos de disgregación mecánicos de manera que se produjeron cúmulos de cinco o menos células. La actividad de tripsina o pronasa se inactivo pasando las células a través de múltiples lavados de 30 a 100% de suero de becerro fetal antes de transferir las células en oocitos enucleados. Los resultados e reportan en la Tabla 1 (grupo tercero) . Se produjeron cinco embriones en la etapa de blastocitos.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para clonar un mamífero no humano, que comprende: (i) insertar una célula o núcleo celular de mamífero diferenciado deseado en un oocito de mamífero enucleado de la misma especie que la células o el núcleos de la células diferenciados, bajo condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (TN); (ii) activar la unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar dicha transferencia nuclear activada hasta que es mayor que la etapa 2 de desarrollo de células; y (iv) transferir la unidad de TN cultivada a un mamífero huésped de manera que la unidad de TN se desarrolle en un feto.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende desarrollar el feto a una progenie.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ADN deseado se inserta, se remueve o modifica en la célula o núcleo celular del mamífero diferenciado, resultado en la producción de una unidad de TN genéticamente alterada.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además desarrollar el feto a una progenie.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula o núcleo celular del mamífero diferenciado se deriva de mesodermo.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la célula o núcleo celular de mamífero diferenciado se deriva de ectodermo.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la célula o núcleo celular de mamífero diferenciado se deriva de endodermo.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la célula o núcleo celular de mamífero diferenciado es una célula de fibroblasto o núcleo de células.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la célula o núcleo celular de mam ífero diferenciado proviene de un ungulado.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el ungulado se selecciona del grupo que consiste de bovinos, ovinos, porcinos, equinos, caprinos y búfalos.
1 1 . El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la célula o núcleo celular de mamífero diferenciado es una célula o núcleo celular adulto.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde la célula o núcleo celular de mamífero diferenciado es una célula o núcleo celular embriónico o fetal.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el oocito enucleado se madura antes de la enucleación.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la unidad de transferencia nuclear fusionada se activa por la exposición de ionomicina y 6-dimetilaminopurina.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la microinyección se utilizó para insertar un ADN heterólogo.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la electroporación se utilizó para insertar un ADN heterólogo.
17. Un feto de mamífero no humano obtenido de acuerdo con el método de la reivindicación 1.
18. Una progenie de mamífero no humano obtenida de acuerdo con el método de la reivindicación 2.
19. Una progenie no humana de acuerdo con la descendencia de acuerdo con la reivindicación 18.
20. Un feto de mamífero no humano transgénico obtenido de acuerdo con el método de la reivindicación 3.
21. Una progenie de mamífero no humana transgénica obtenida de acuerdo con el método de la reivindicación 4.
22. Una progenie de mamífero no humano de la descendencia de acuerdo con la reivindicación 21.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además combinar la unidad de TN clonada con un embrión fertilizado para producir un embrión quimérico.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, que además comprende desarrollar el feto a una progenie.
25. Un feto de mamífero no humano obtenido de acuerdo con el método de la reivindicación 23.
26. Una descendencia de mamífero no humano obtenida de acuerdo con el método de la reivindicación 24.
27. Una progenie de mamífero no humano del mamífero de acuerdo con la reivindicación 26.
28. Un método para producir una línea celular de MCIC (masa celular interna cultivada) , que comprende: (i) insertar una célula o núcleo celular de mamífero diferenciado deseado en un oocito de mamífero enucleado de la misma especie que la células o el núcleos de la células diferenciados, bajo condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (TN) ; (ii) activar ia unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar la unidad de transferencia nuclear activada hasta que sea mayor que la etapa 2 de desarrollo de célula; y (¡v) cultivar células obtenidas de la unidad de TN cultivada para obtener una línea celular de MCIC.
29. Una línea celular de MCI obtenida de acuerdo con el método de la reivindicación 28.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde un ADN deseado se inserta, se remueve o modifica en la célula o núcleo celular de mamífero diferenciado, dando como resultado así la producción de una unidad de TN genéticamente alterada.
31 . Una línea celular de MCIC transgénica obtenida de acuerdo con ia reivindicación 30.
32. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la línea celular de MCIC resultante se induce para diferenciarse.
33. Las células de mamíferos diferenciadas obtenidas por el método de la reivindicación 32.
34. Las células diferenciadas humanas obtenidas por el método de la reivindicación 32.
35. Un método de terapia que comprende administrar a un paciente que necesita de la terapia de transplante de células , células diferenciadas isogénicas de acuerdo con la reivindicación 34.
36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la terapia de transplante de células de SE efectúa para tratar una enfermedad o condición selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson , enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, ALS, defectos o lesiones de la médula espinal , esclerosis múltiple, distrofia muscular, fibrosis cística, enfermedad del hígado, diabetes, enfermedad del corazón, defectos o daños lesiones de cartílago, quemaduras, úlceras de pies, enfermedad vascular, enfermedad del tracto urinario, SI DA y cáncer.
37. U n método de terapia que comprende administrar a un paciente humano que necesita de terapia de transplante de células, células xenogénicas diferenciadas de acuerdo con la reivindicación 33.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde las células diferenciadas xenogénicas son células de bovinos.
39. El método de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la terapia de transplante de células de SE efectúa para tratar una enfermedad o condición selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson, enfermedad de H untington , enfermedad de Alzheimer, ALS, defectos o lesiones de la médula espinal , esclerosis múltiple, distrofia muscular, fibrosis cística, enfermedad del hígado, diabetes, enfermedad del corazón, defectos y lesiones de cartílago, quemaduras, úlceras de pies, enfermedad vascular, enfermedad del 'tracto urinario, SI DA y cáncer.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde las células humanas diferenciadas son células hematopoyéticas o células neurales.
41 . El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la terapia es para el tratamiento de enfermedad de Parkinson y las células diferenciadas son células neurales.
42. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la terapia es para el tratamiento de cáncer y las células diferenciadas son células hematopoyéticas.
43. U n método de terapia que comprende administrar a un paciente humano que necesita de terapia de transplante de células , células xenogénicas obtenidas de un feto de acuerdo con la reivindicación 17.
44. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde las células xenogénicas son células de bovinos.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en donde la terapia de transplante de células de SE efectúa para tratar una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson , enfermedad de H untington, enfermedad de Alzheimer, ALS, defectos o lesiones de la médula espinal , esclerosis múltiple, distrofia muscular, fibrosis cística, enfermedad del hígado, diabetes, enfermedad del corazón, defectos o lesiones del cartílago, quemaduras, ulceras de pies, enfermedad vascular, enfermedad del tracto urinario, SI DA y cáncer.
46. Un método de terapia que comprende administrar a un paciente humano que necesita de la terapia de transplante de células, células xenogénicas obtenidas de una descendencia de acuerdo con la reivindicación 18.
47. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde en las células xenogénicas son células de bovinos.
48. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la terapia de transplante de células de SE efectúa para tratar una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson, enfermedad de H untington , enfermedad de Alzheimer, ALS, defectos o lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, fibrosis cística, enfermedad del hígado, diabetes, enfermedad del corazón, defectos o lesiones del cartílago, quemaduras, ulceras de pies, enfermedad vascular, enfermedad del tracto urinario, SIDA y cáncer.
49. Un método de terapia que comprende administrar aun paciente que humano que necesita de la terapia de transplante de células, células transgénicas xenogénicas obtenidas de un feto transgénico de acuerdo con la reivindicación 20.
50. El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde las células xenogénicas son células de bovinos.
51. El método de acuerdo con la reivindicación 49, en donde la terapia de transplante de células de SE efectúa para tratar una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, ALS, defectos o lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, fibrosis cística, enfermedad del hígado, diabetes, enfermedad del corazón, defectos o lesiones del cartílago, quemaduras, ulceras de pies, enfermedad vascular, enfermedad del tracto urinario, SIDA y cáncer.
52. Un método de terapia que comprende administrar a un paciente humano que necesita de terapia de transplante de células, células transgénicas xenogénicas obtenidas de una progenie transgénicas de acuerdo con la reivindicación 21.
53. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde las células transgénicas xenogénicas son células de bovinos.
54. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde la terapia de transplante de células de SE efectúa para tratar una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, ALS, defectos o lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, fibrosis cística, enfermedad del hígado, diabetes, enfermedad del corazón, defectos o lesiones del cartílago, quemaduras, ulceras de pies, enfermedad vascular, enfermedad del tracto urinario, SIDA y cáncer.
55. El método de acuerdo con la reivindicación 28, que además comprende combinar una unidad de TN con un embrión fertilizado para producir una quimera.
56. El método de acuerdo con la reivindicación 55, que además comprende desarrollar la línea celular de MCIC quimérica aun embrión quimérico.
57. Un embrión de mamífero no humano quimérico obtenido de acuerdo con la reivindicación 56.
58. El método de acuerdo con la reivindicación 56, que además comprende desarrollar un embrión quimérico a un feto quimérico.
59. Un feto de mamífero no humano quimérico obtenido de acuerdo con la reivindicación 58.
60. El método de acuerdo con la reivindicación 58, que además comprende desarrollar un feto quimérico a una progenie de mamífero no humana quimérico
61. Una progenie de mamífero no humana quimérica obtenida de acuerdo con la reivindicación 60.
62. El método de acuerdo con la reivindicación 55, en donde un. ADN deseado se inserta, se remueve o modifica en la célula o núcleos celulares mamífero diferenciados dando como resultado así la producción de una unidad de TN genéticamente alterada.
63. El método de acuerdo con la reivindicación 62, que además comprende desarrollar la línea celular de MCIC quimérica a un embrión de mamífero no humano quimérico.
64. Un embrión de mamífero no humano quimérico obtenido de acuerdo con la reivindicación 63.
65. El método de acuerdo con la reivindicación 63, que además comprende desarrollar el embrión quimérico a un feto quimérico.
66. Un feto de mamífero no humano quimérico obtenido de acuerdo con la reivindicación 65.
67. El método de acuerdo con la reivindicación 65, que además comprende desarrollar el feto quimérico a una progenie de mamífero no humano quimérica.
68. La progenie de mamífero no humano quimérica obtenida de acuerdo con la reivindicación 67.
69. Un método para clonar un mamífero no humano, que comprende: (i) insertar una célula o núcleo celular de MCIC de mamífero diferenciado deseado en un oocito de mamífero enucleado de la misma especie que la célula de MCIC diferenciada o el núcleo de células, bajo condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (TN); (ii) activar la unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar la unidad de transferencia nuclear activada hasta que es mayor que la etapa 2 de desarrollo de células; y (iv) transferir la unidad de TN cultivada a un mamífero huésped de manera que la unidad de TN se desarrolle en un feto.
70. El método de acuerdo con la reivindicación 69, que además comprende desarrollar el feto a una progenie.
71. Un feto de mamífero no humano obtenido de acuerdo con el método de la reivindicación 69.
72. Una progenie de mamífero no humano obtenida de acuerdo con el método de la reivindicación 70.
73. Un órgano de mamífero no humano para usarse como un órgano de xenoinjerto, que se obtiene de la progenie de acuerdo con la reivindicación 18.
74. Un órgano de mamífero no humano para usarse como un xenoinjerto de órgano, el cual se obtiene de la progenie de acuerdo con la reivindicación 21.
75. Un órgano de mamífero no humano para usarse como un xenoinjerto de órgano, el cual se obtiene de la progenie de acuerdo con la reivindicación 26.
76. Un órgano de mamífero no humano para usarse como un xenoinjerto de órgano, el cual se obtiene de la progenie de acuerdo con la reivindicación 68.
77. Un órgano de mamífero no humano para usarse como un xenoinjerto de órgano, el cual se obtiene de la progenie de acuerdo con la reivindicación 72. RESUM EN Se provee un método mejorado de transferencia nuclear que implica el transplante de núcleos de células diferenciadas donadoras en oocitos enucleados de la misma especie que las células donadoras. Las unidades de transferencia nuclear resultantes son útiles para la multiplicación de genotipos y genotipos transgénicos por la producción de fetos y progenies, y para la producción de células de MCIC isogénicas, incluyendo células embriónicas o de soporte isogénicas humanas. La producción de embriones de mamíferos tratados genéticamente o transgénicos, embriones, fetos y progenies de mamíferos tratados genéticamente o transgénicos se facilitan por el método presente dado que la fuente de células diferenciadas de los núcleos donadores puede modificarse genéticamente y propagarse clonalmente.