MXPA98003930A - Vacunas contra tumores y procedimiento para su produccion - Google Patents

Abstract

Vacuna contra tumores y procedimiento para su producción. La vacuna contra tumores contiene células tumorales de las que al menos una parte presenta por lo menos un haplotipo MHC-I del paciente en la superficie de la célula y que se cargaron con unoo varios péptidos que se fijan a la molécula de MHC-I, de modo que las células tumorales son reconocidas como extrañas en el contexto con los péptidos del sistema inmune del paciente y desencadenan una respuesta inmune celular. La carga se efectúa en presencia de un policatión tal como polilisina.

Description

VACUNAS CONTRA TUMORES Y PROCEDIMIENTO PARA SU PRODUCCIÓN DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El desarrollo de una vacuna terapéutica sobre la base de células tumorales se basa, especialmente, en las siguientes premisas: existen diferencias cualitativas o cuantitativas entre células tumorales y células normales; el sistema inmune tiene, en principio, la capacidad para reconocer estas diferencias; el sistema inmune puede - mediante la inmuniza-ción específica activa con vacunas - estimularse para reconocer células tumorales con ayuda de estas diferencias y determinar su rechace. Con el fin de provocar una respuesta anti-tumores, deben cumplirse al menos dos premisas: en primer lugar, las células tumorales deben expresar antígenos o neoepítopos que no se presentan en células normales. En segundo lugar, el sistema inmune debe ser activado correspondientemente con el fin de reaccionar ante estos antígenos. Un impedimento esencial en la terapia inmune de tumores es su escasa inmunogenicidad, sobre todo en el ser humano. Esto es sorprendente en la medida en que sería de esperar que el gran número de variaciones genéticas de células malignas debería conducir a la formación de neoepítopos de péptidos que, en el contexto con moléculas MHC-I, son reconocidos por linfocitos T citotóxicos. Recientemente, se descubrieron antígenos asociados a tumores y específicos de tumores que representan neo-epítopos de este tipo y, por consiguiente, deben representar dianas potenciales para un ataque del sistema inmune. El hecho de que, a pesar de ello, el sistema inmune no consiga eliminar tumores que expresen estos reo-epítopos, no debería, por consiguiente, basarse evidentemente en la ausencia de neo--epí opos, sino en que la respuesta inmunológica a estos neo--antígenos es insuficiente. Para la terapia inmune de cáncer sobre una base celular se desarrollaron dos estrategias generales: por una parte, la terapia inmune adoptiva que se' sirve de la expansión in vitro REF: 27243 de linfocitos T reactivos a tumores y su reincorporación en el paciente; por otra parte, la terapia inmune activa que utiliza células tumorales con la esperanza de que con ello se provoquen respuestas inmune nuevas o reforzadas contra antígenos de tumores que conduzcan a una respuesta sistémica del tumor. Vacunas contra tumores sobre la base de la terapia inmune activa se prepararon de diferentes maneras; un ejemplo de ello son células tumorales irradiadas que se mezclaron con adyuvantes inmunoes imulantes , tales como Corynebacterium parvum o Bacillus Calmette Guerin (BCG) con el fin de provocar reacciones inmunes contra antígenos de tumores (Oettgen y Oíd, 1991) . En los últimos años, se utilizaron sobre todo células tumorales genéticamente modificadas para una terapia inmune activa contra el cáncer, incluyéndose en tres categorias los genes extraños introducidos en las células tumorales : Una de ellas utiliza células tumorales que son genéticamente modificadas con el fin de producir citoquinas . La coincidencia local de células tumorales y la señal de citoquina deben establecer un estímulo que desencadene la inmunidad anti -tumores . Una recopilación sobre aplicaciones de esta estrategia se proporciona por Pardoll, 1993, Zatlou- al et al., 1993 y Dranoff y Mulligan, 1995. De células tumorales que fueron genéticamente modificadas con el fin de secretar citoquinas, tales como IL-2, GM--CSF ó IFN-? o con el fin de expresar moléculas co-estimulan-tes, se demostró en modelos experimentales con animales que generan una potente inmunidad anti-tumores (Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1995) . Tn el caso de un hombre que ya presenta una considerable carga de tumores y ha desarrollado una tolerancia contra el tumor, es sin embargo esencialmente más difícil abarcar por completo la cascada de interacciones complejas, de modo que pueda tener lugar una reacción anti--tumores eficaz. La actividad real de vacunas contra tumores secretoras de citoquina para aplicación en el ser humano todavía no ha sido demostrada. Otra categoría de genes con los que son modificadas células tumorales en relación con su empleo como vacunas contra tumores, codifica las denominadas proteínas accesorias (en inglés, "Accessory proteins") ; el objetivo de este método estriba en transfuncionalizar células tumorales en células presentadoras de antígenos ("Neo-APC's") con el fin de dejar que generen directamente linfocitos T específicos de tumores. Un ejemplo para un método de este tipo se describe por Ostrand-Rosenberg, 1994. La identificación y el aislamiento de antígenos de tumores (TA's) o de péptidos derivados de los mismos, por ejemplo por ólfel et al., 1994 a) y 1994 b) ; Carrel et al., 1993, ehmann et al., 1989, Tibbets et al., 1993, o en las socilitudes internaciones publicadas WO 92/20356, WO 94/05304, Wo 94/23031, WO 95/00159 existía la premisa de utilizar antígenos de tumores como inmunogenes para vacunas contra tumores, a saber tanto en forma de proteínas como también de péptidos. Sin embargo, una vacuna contra tumores en forma de antígenos de tumores como tales no es lo suficientemente inmunógena como para desencadenar una respuesta inmune celular, tal como la que se requeriría para la eliminación de células tumorales portadoras de antígeno de tumores; también la co-aplicación de adyuvantes ofrece sólo posibilidades limitadas para reforzar la respuesta inmune (Oettgen y Oíd, 1991) . Una tercera estrategia de la terapia inmune activa para incrementar la eficacia de vacunas contra tumores se basa en células tumorales autólogas xenoginizadas (enajenadas) . La suposición de este concepto se basa en que el sistema inmune reacciona sobre células tumorales que expresan una proteína extraña y en que en el transcurso de esta reacción se provoca también una respuesta inmune contra aquellos antígenos de tumores (TA's) que son presentados por las células tumorales de la vacuna. Por parte de Zatloukal et al., 1993, se proporciona una recopilación sobre estos diferentes métodos en los que células tumorales se enajenan en relación con una inmunogenicidad reforzada mediante la introducción de diferentes genes . Un papel central en la regulación de la respuesta inmune específica lo juega un complejo trimolecular consistente en los componentes receptor antigénico de células T, molécula MHC ("complejo de histocompatibilidad principal") y sus ligandos, que es un fragmento de péptido derivado de una proteína. Las moléculas MHC- I (o las correspondientes moléculas humanas, las HLA's) son receptores de péptidos que permiten, en el caso de una especificidad restrictiva, la fijación de millones de diferentes ligandos. La premisa para ello la representan residuos de péptidos específicos de alelos que presentan los siguientes criterios de especificidad: los péptidos tienen, en función del haplotipo de MHC- I, una longitud definida, por norma general ocho a diez restos de aminoácidos. Típicamente, dos de las posiciones de aminoáci-dos representan los denominados "anclajes" que sólo pueden ser ocupados por un único aminoácido o por restos de aminoácidos con cadenas laterales estrechamente relacionadas. La posición exacta de los aminoácidos de anclaje en el péptido y los requisitos exigidos a sus propiedades varían con los haplotipos de MHC-I. El terminal C de los ligandos de péptidos es a menudo un radical alifático o un radical cargado. Tales residuos de ligandos de péptidos de MHC- I, específicos de alelos, son conocidos hasta ahora, entre otros, para H-2Kd, ?, !fc , ^ ,bD , HLA-A*0201, A*0205 y B*2705. En el marco de la conversión de proteínas dentro de la célula, productos génicos regulares, degenerados y extraños, por ejemplo proteínas virales o antígenos de tumores, se descomponen en pequeños péptidos; algunos de ellos represen-tan ligandos en potencia para moléculas de MHC-I. Con ello, se da la premisa para su presentación por parte de moléculas de MHC y, como consecuencia de ello, el desencadenamiento de una respuesta inmune celular, no habiéndose aclarado todavía en particular la forma en que los péptidos son producidos en la célula en forma de ligandos de MHC-I. Un método que se aprovechó de este mecanismo para el enajenamiento de células tumorales en relación con un refuerzo de la respuesta inmune estriba en tratar células tumorales con productos químicos mutágenos, tales como N--metil-N' -nitrosoguanidina. Esto ha de conducir a que las células tumorales presenten neo-antígenos derivados de variantes mutadas de proteínas celulares, que representan productos génicos extraños (Van Peí y Boon, 1982) . Sin embargo, dado que los sucesos mutágenos están repartidos arbitrariamente por el genoma y, además, es de esperar que células individuales, como consecuencia de diferentes sucesos mutágenos, presenten también diferentes neo-antígenos, este procedimiento es difícil de controlar desde un punto de vista cualitativo y cuantitativo. Otro método enajena células tumorales transfectándolas con genes de una o varias proteínas extrañas, por ejemplo el de una molécula de MHC- I extraña o proteína de MHC de diferente haplotipo que luego aparece con forma en la superficie de la célula (documento EP-A2 0 569 678; Plautz et al., 1993; Nabel et al., 1993). Este método se basa en la suposición antes mencionada de que las células tumorales, cuando son administradas en forma de una vacuna de células completas, son reconocidas como extrañas con ayuda de la proteína expresada o de los péptidos derivados de ella, o de que, en el caso de la expresión de moléculas de MHC- I autólogas, se optimiza la presentación de antígeno de tumores mediante un número incrementado de moléculas de MHC-I sobre la superficie de la célula. La modificación de células tumorales con una proteína extraña puede conducir a que las células presenten en el contexto de MHC péptidos que proceden de la proteína extraña y que la modificación de "propia" a "extraño" tenga lugar en el marco del reconocimiento del complejo MHC-pép-tido. El reconocimiento de una proteína o péptido como extraño tiene como consecuencia de que en el transcurso del reconocimiento inmune se genera una respuesta inmune no sólo contra la proteína extraña, sino también contra los antígenos de tumores propios de las células tumorales. En el transcurso de este proceso se activan las células presentadoras de antígenos (APC's, del inglés Antigen Presenting Cells) que procesan las proteínas presentes en la célula tumoral de la vacuna (inclusive TA's) para dar péptidos y las utilizan como ligandos para sus propias moléculas de MHC-I y MHC-II. Las APC's activadas y cargadas con péptidos se introducen en los nodulos linfáticos, en donde algunos pocos de los linfocitos T no afectados reconocen los péptidos procedentes de TA sobre las APC's y pueden utilizarlos como estímulo para la expan-sión clonal - con otras palabras, para la generación de CTL's y células T cooperadoras específicas de tumores. La presente invención tenía por misión poner a disposición una nueva vacuna contra tumores basada en células tumorales enajenadas, con cuya ayuda se pueda desencadenar una respuesta inmune anti -tumores celular eficaz. En la solución del problema planteado se partió de las siguientes consideraciones: mientras que células del cuerpo normales, no malignas, son toleradas por el sistema inmune, el cuerpo reacciona sobre una célula normal, cuando ésta sintetiza, por ejemplo en virtud de una infección vírica, proteínas extrañas al cuerpo, con un rechazo inmune. El origen de ello estriba en que las moléculas de MHC-1 presentan péptidos extraños que proceden de las proteínas extrañas al cuerpo. Como consecuencia de ello, el sistema inmune registra que ha sucedido algo mdeseado, extraño con esta célula. La célula se elimina, las APC's se activan y se genera una nueva inmunidad específica contra las células que expresan proteínas extrañas . Células tumorales contienen ciertamente los respectivos antígenos de tumores específicos de tumores, pero, como tales, son vacunas insuficientes, ya que, en virtud de su escasa inmunogenicidad, son ignoradas por el sistema inmune. Si, en contra de los métodos conocidos, no se carga una célula tumoral con una proteína extraña, sino con un péptido extraño, entonces son reconocidos como extraños por esta célula, adicionalmente a los péptidos extraños, también los antígenos de tumores propios de la célula. Mediante el enajenamiento con un péptido se ha de poder conseguir que se dirija contra los antígenos de tumores la respuesta inmune celular desencadenada por los péptidos extraños. El origen de la escasa inmunogenicidad de células tumorales no puede ser un problema cualitativo, sino uno cuantitativo. Para un péptido derivado de un antígeno de tumores, esto puede significar que ese péptido sea presentado ciertamente por moléculas de MHC-I, pero en una concentración que es demasiado escasa como para desencadenar una respuesta inmune específica de tumores, celular. Un aumento del número de péptidos específicos de tumores en la célula tumoral debería determinar, por consiguiente, asimismo un enajenamiento de la célula tumoral que conduce al desencadenamiento de una respuesta inmune celular. En contraposición a métodos en los que el antígeno de tumores o el péptido derivado del mismo es presentado sobre la superficie de la célula debido a que fue transfectado con un ADN codificador de la proteína o el péptido correspondientes, tal como se describe en las publica-ciones internacionales WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 y WO 95/00159, debería ponerse a disposición una vacuna que, con una preparación más sencilla, desencadene una respuesta inmune eficaz. Por parte de Mandelboim et al., 1994 y 1995, se propuso incubar células RMA-S con péptisios derivados de antígenos de tumores, con el fin de desencadenar con ello una respuesta inmune celular contra los correspondientes antígenos de tumores propios del paciente. De las células propuestas por Mandelboim et al. para la vacunación de tumores, con la denominación RMA-S (Kárre et al., 1986) se supone que pueden realizar funciones de las APC's. Tienen la particularidad de que sus moléculas de HLA en la superficie de la célula están vacías como consecuencia de un defecto en el mecanismo TAP ("transporte de péptidos antigénicos"; responsable del procesamiento de péptidos y su fijación a moléculas de HLA) ce-lular. Con ello, las células se encuentran a disposición para ser cargadas con un péptido, funcionan por lo tanto igual que vehículos de presentación para el péptido ofrecido desde el exterior. El efecto anti-tumores conseguido se basa en el desencadenamiento de una respuesta inmune contra el péptido presentado sobre las células que es ofrecido al sistema inmune sin un contexto directo con el repertorio antigénico de la célula tumoral. La invención se refiere a una vacuna contra tumores para su administración a un paciente, consistente en células tumorales que, por sí mismas, presentan en el contexto HLA péptidos derivados de antígenos de tumores y de las que al menos una parte presenta por lo menos un haplotipo de MHC-I del paciente en la superficie de la célula, y que se cargaron con uno o varios péptidos a) y/o b) de modo que las células tumorales son reconocidas como extrañas en el contexto con los péptidos del sistema inmune del paciente y desencadenan una respuesta inmune celular, en donde los péptidos a) funcionan como ligandos para el haplotipo de MHC- I que es común al paciente y a las células tumorales de la vacuna, y son diferentes de péptidos que se derivan de proteínas que son expresadas por células del paciente o, b) funcionan como ligandos para el haplotipo de MHC-I que es común al paciente y a las células tumorales de la vacuna, y se derivan de antígenos de tumores que son expresados por células del paciente y se encuentran presentes sobre las células tumorales de la vacuna en una concentración que es mayor que la concentración de un péptido que se deriva del mismo antígeno de tumores que el expresado sobre las células tumorales del paciente. Las moléculas de MHC humanas se designan, en lo que si-gue, de acuerdo con el uso tradicional internacional también como "HLA" (del inglés "Human Leucocyte Antigen", "antígeno de leucocitos humanos") . Por "respuesta inmune celular" se entiende la inmunidad de células T citotóxica que, como consecuencia de la generación de células T CD8 -positivas citotóxicas específicas de tumores y células T cooperadoras CD4 -positivas, determina la destrucción de las células tumorales. El efecto de las vacunas conformes a la invención a base de células tumorales se basa, sobre todo, en que la actividad inmunógena del depósito de antígenos de tumores presente en las células tumorales es reforzada por el péptido. Los péptidos del tipo a) se designan en lo que sigue también como "péptidos extraños" o "xenopéptidss" . En una forma de realización de la invención, las células tumorales de la vacuna son autólogas. En este caso, se trata de células que son tomadas del paciente a tratar, tratadas ex vivo con péptido o péptidos a) y/o b) , eventualmente son inactivadas y después son administradas de nuevo al paciente. (Métodos para la producción de vacunas contra tumores autólogas se describen en el documento WO 94/21808, a cuya divulgación se hace referencia) . En una forma de realización de la invención, las células tumorales son alógenas, es decir no proceden del paciente a tratar. Se da preferencia al empleo de células alógenas, sobre todo cuando juegan un papel consideraciones de economía de trabajo; la producción de vacunas individuales para cada paciente individual es laboriosa y costosa y, además, en pacientes individuales se manifiestan dificultades en el cultivo ex vivo de las células tumorales, de modo que las células tumorales no se obtienen en un número suficientemente grande como para poder producir una vacuna. En el caso de las células tumorales alógenas se ha de tener en cuenta que éstas han de estar adaptadas al subtipo HLA del paciente. En el caso del empleo de péptidos extraños de la categoría a) , se trata, en el caso de células tumorales alógenas, de células de una o varias líneas de células, de las que al menos una línea de células expresa al menos uno, preferentemente varios antígenos de tumores que son idénticos con los antígenos de tumores del paciente a tratar, es decir la vacuna contra tumores se adapta a la indicación del tumor del paciente. Con ello se garantiza que la respuesta inmune celular desencadenada por péptidos extraños presentados por MHC- I sobre las células tumorales de la vacuna, que conduce a la expansión de CTL's y células T cooperadoras 'específicas del tumor, se dirija también contra las células tumorales del paciente, ya que éstas expresan el mismo antígeno de tumores que las células de la vacuna. Por ejemplo, si se ha de tratar una paciente con la vacuna contra tumores conforme a la invención, que padece de metástasis de cáncer de mama, que presentan una mutación Her2/neu (Allred et al., 1992; Peopoles et al., 1994; Yoshino et al., 1994 a); Stein et al., 1994; Yoshino et al., 1994 b) ; Fisk et al., 1995; Han et al., 1995), se emplean como vacunas células tumorales alógenas adaptadas al haplotipo de HLA del paciente que, asimismo, expresan la Her2/neu mutada como antígeno de tumores. En los últimos tiempos se aislaron numerosos antígenos de tumores y se explicó su relación con una o varias enfermedades de cáncer. Otros ejemplos para antígenos de tumores de este tipo son ras (Fenton et al., 1993; Gedde Dahl et al., 1992; Jung et al., 1991; Morishita et al., 1993; Peáce et al., 1991; Skipper et al., 1993), antígenos de tumores MAGE (Boon et al., 1994; Slingluff et al., 1994; van der Bruggen et al., 1994; documento WO 92/20356) ; una recopilación sobre diversos antígenos de tu-mores se proporciona además de ello, por Carrel et al., 1993. En la Tabla se proporciona una perspectiva sobre antígenos de tumores conocidos, utilizables en el marco de la invención, y péptidos derivados de los mismos. Los antígenos de tumores del paciente se determinan, por lo general, en el transcurso de la preparación de la diagnosis y el plan de terapia con métodos estándares, por ejemplo con ayuda de análisis basados en CTL's con especificidad para el antígeno de tumores a determinar. Análisis de este tipo se describieron, entre otros, por Hérin et al, 1987; Coulie et al., 1993; Cox et al., 1994; Rivoltini et al., 1995; Ka akami et al . , 1995; así como en el documento WO 94/14459; de estas citas bibliográficas se pueden deducir también diferentes antígenos de tumores o epítopos de péptidos derivados de los mismos. Antígenos de tumores que se manifiestan sobre la superficie de la célula pueden detectarse también con inmunoanálisis a base de anticuerpos. Cuando los antígenos de tumores son enzimas, por ejemplo tirosinasas, éstas pueden detectarse con análisis enzimáticos. En otra forma de realización de la invención puede utilizarse una mezcla de células tumorales autólogas y alógenas como material de partida para la vacuna. Esta forma de realización de la invención pasa a emplearse particularmente cuando los antígenos de tumores expresados por el paciente son desconocidos o están caracterizados sólo de manera incompleta, y/o cuando las células tumorales alógenas expresan sólo una parte de los antígenos de tumores del paciente. Mediante la incorporación por mezcladura de células tumorales autólogas, tratadas con el péptido extraño, se garantiza que al menos una parte de las células tumorales de la vacuna contenga un número lo más grande posible de antígenos de tumores propios del paciente. En el caso de las células tumorales alógenas, se trata de células que coinciden en uno o varios haplotipos de MHC- I con el paciente. Los péptidos del tipo a) y b) se definen, de manera co-rrespondiente al requisito de fijarse a una molécula de MHC- I, en relación con su secuencia por el subtipo HLA del paciente al que se le ha de administrar la vacuna. La determinación del subtipo HLA dei paciente representa, por consiguiente, una de las premisas esenciales para la elección o construcción de un péptido adecuado. En el caso de emplear ia vacuna contra tumores conforme a la invención en forma de células tumorales autólogas, el subtipo HLA se deduce automáticamente por la especificidad de la molécula de HLA genéticamente determinada en el paciente. El subtipo HLA del paciente se puede determinar con métodos estándares, tal como el ensayo de micro-linfotoxicidad (ensayo MLC, cultivo de linfocitos mixtos) (Practical Immunol . , 1989). El ensayo MLC se basa en el principio de mezclar linfocitos aislados de la sangre del paciente primeramente con antisuero o un anticuerpo monoclonal contra una determinada molécula HLA en presencia de complemento (C) de conejo. Las células positivas se lisan y absorben un colorante indicador, mientras que las células intactas permanecen sin colorear. Para la determinación del haplotipo HLA de un paciente también se puede recurrir a la RT-PCR (Curr. Prot. Mol. Biol. Capítulos 2 y 15) . Para ello, se extrae sangre de un paciente y de ella se aisla ARN. Este ARN se somete primero a una transcripción inversa, con lo que se forma ADNc del paciente. El ADNc sirve como matriz para la reacción en cadena de poli-mersa con pares de cebadores que determinan específicamente la amplificación de un fragmento de ADN que representa un haplotipo HLA determinado. Si después de la electroforesis en gel de agarosa aparece una banda de ADN, el paciente expresa la correspondiente molécula de HLA. Si la banda no aparece, el paciente es negativo para ella. Para cada paciente son de esperar al menos dos bandas. En el caso de emplear la invención en forma de una vacuna alógena, se utilizan células de las que al menos una parte está adaptada a al menos un subtipo HLA del paciente. Con vistas a una aplicabilidad lo más amplia posible de la vacuna conforme a la invención. se parte convenientemente de una mezcla de diferentes líneas de células que expresan dos o tres de los diferentes subtipos HLA más frecuentemente representados, considerándose par icularmente los haplotipos HLA-A1 y HLA-A2. Con una vacuna a base de una mezcla de células tumorales alógenas, que expresan estos haplotipos, se puede abarcar una amplia población de pacientes; con ello, se * x 13 - puede cubrir aproximadamente el 70% de la población europea (Mackiewicz et al., 1995). La definición de los péptidos utilizados conforme a la invención por parte del subtipo HLA determina a éstos en 5 relación con sus aminoácidos de anclaje y su longitud; posiciones de anclaje y longitud definidas garantizan que los péptidos quepan en el surco de fijación del péptido de las respectivas moléculas de HLA y, por consiguiente, sean presentados sobre la superficie de la célula de las células tumorales formadoras de la vacuna, de modo que las células sean reconocidas como ext añas. Esto tiene como consecuencia que el sistema inmune es estimulado y se crea una reacción inmune celular también contra las células tumorales del paciente. 15 Péptidos que son adecuados en el marco de la presente invención como péptidos extraños conforme a la categoría a) están disponibles en una gran amplitud de banda. Su secuencia se puede derivar de proteínas inmunógenas que se presentan en la naturaleza o de sus productos de degradación celulares, por ejemplo de péptidos víricos o bacterianos o de antígenos de tumores extraños para el paciente. Péptidos extraños adecuados pueden elegirse por ejemplo en base a secuencias peptídicas conocidas por la bibliografía; por ejemplo, con ayuda de los péptidos descritos por 25 Rammensee et al., 1993, Falk et al., 1991, para los más diferentes residuos de HLA, derivados de proteínas inmunógenas de diferente origen que caben en los surcos de fijación de las moléculas de los respectivos subtipos HLA. Para los péptidos que presentan una secuencia parcial de una proteína con actividad inmunógena se puede establecer, con ayuda de las secuencias de polipéptidos ya conocidas o eventualmente todavía a determinar mediante comparación de la secuencia, y teniendo en cuenta los requisitos específicos de HLA, qué péptídos representan candidatos adecuados. Ejemplos de 35 péptidos adecuados se encuentran por ejemplo en Rammensee et al., 1993, Falk et al., 1991 v Rammensee et al., 1995; así como en el documento WO 91/09869 (péptidos de VIH) ; péptidos derivados de antígenos de tumores se describieron, entre otros, en las solicitudes de patente internacionales publicadas WO 95/00159, WO 94/05304. Se hace referencia a la divul-gación de estas citas bibliográficas y a los artículos citados en ellas en relación con péptidos. Candidatos preferidos de xenopéptidos son péptidos cuya inmunogenicidad ya se demostró, es decir péptidos que se derivan de inmunogenes conocidos, por ejemplo proteínas víricas o bacterianas. Péptidos de este tipo muestran, en virtud de su inmunogenicidad, una violenta reacción en el ensayo MLC. En lugar de utilizar los péptidos originales, es decir péptidos que se derivan sin variaciones de proteínas natura-les, pueden, con ayuda de los requisitos mínimos indicados en base a la secuencia de péptidos original, efectuarse variaciones arbitrarias en relación con las posiciones de anclaje y la longitud, en este caso se utilizan por lo tanto, conforme a la invención, péptidos artificiales que han sido desa-rrollados en un ligando de MHC-I de manera correspondiente a los requisitos. Así, por ejemplo partiendo de ligandos H2-Kd Leu, Phe, Glu, Ala, He, Glu, Gly, Phe, He (LFEAIEGFI) pueden modificarse los aminoácidos que no representan aminoácidos de anclaje, con el fin de obtener el péptido de la secuencia Phe Phe He Gly Ala Leu Glu Glu He (FFIGALEEI) ; además, el aminoácido de anclaje He puede ser reemplazado en la posición 9 por Leu. Péptidos que se derivan de antígenos de tumores, es decir de proteínas que son expresadas en una célula tumoral y que no aparecen o sólo lo hacen en una concentración significativamente menor en la correspondiente célula no transformada, pueden utilizarse en el marco de la presente invención como péptidos del tipo a) y/o del tipo b) . La longitud del péptido corresponde preferiblemente a la secuencia mínima de 8 a 10 aminoácidos, necesaria con relación a la fijación a la molécula de MHC-I, con los aminoá-cidos de anclaje necesarios. Eventualmente, el péptido puede estar prolongado también en el C-terminal y/o en el N-terminal, siempre que esta prolongación no perjudique la capacidad de fijación o bien el péptido prolongado sobre la secuencia mínima pueda ser procesado celularmente. En una forma de realización de la invención, el péptido se puede prolongar con aminoácidos cargados negativamente, o en el péptido, a saber en otras posiciones que en los aminoácidos de anclaje, se pueden incorporar aminoácidos cargados negativamente, con el fin de conseguir una unión electrostática del péptido a un policatión, tal como polilisina. Bajo el término "péptidos" caen en el marco de la presente invención, de acuerdo con la definición, también fragmentos de proteínas mayores o proteínas enteras, de las que está garantizado que, después de la aplicación, sean procesados por las APC's para dar péptidos que se adaptan a la molécula de MHC. En esta forma de realización, el antígeno se emplea, por consiguiente, no en forma de un péptido, sino en forma de proteína o fragmento de proteína o como mezcla de proteínas o fragmentos de proteínas. La proteína representa un antígeno o un antígeno de tumores, del que se derivan los fragmentos obtenidos después del procesamiento. Las proteínas o los fragmentos de proteína recogidos por las células se procesan y pueden presentarse después, en el contexto de MHC, a las células inmunoefectoras y, por consiguiente, desencadenar o reforzar una respuesta inmune (Braciale y Braciale, 1991; Kovacsovics, Bankowski y Rock, 1995; York y Rock, 1996) . En el caso de utilizar proteínas o fragmentos de proteínas, la identidad del producto final procesado se puede detectar mediante análisis químico (degradación de Edman o espectroscopia de masas de fragmentos procesados; véase el artículo resumido de Rammensee et al., 1995, así como la bibliografía original en él citada) o ensayos biológicos (capacidad de las APC's para la estimulación de células T que son específicas para los fragmentos procesados) . La elección de candidatos de péptidos en relación con su adecuidad como péptidos extraños se efectúa, en principio, en varias etapas: en general, los candidatos se someten a ensa-yo, convenientemente en ensayos en serie, primeramente en un ensayo de fijación de péptidos en cuanto a su capacidad de fijación a una molécula de MHC-I. Un método de examen adecuado es por ejemplo el análisis FACS basado en la citometría de flujo (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage™ User's Guide, 1994; CELL Quest™ User's Guide, 1994) . En este caso, el péptido se marca con un colorante de fluorescencia, por ejemplo con FITC (isotiocianato de fluoresceína) y se aplica sobre células tumsrales que expresan la respectiva molécula de MHC-I. Células individuáles son excitadas durante su paso por un láser de una longitud de onda determinada; se mide la fluorescencia emitida, que es función de la cantidad de péptido fijada a la célula. Otro método para la determinación de la cantidad de péptido fijada es la mancha Scatchard. Para ello se utiliza el péptido que está marcado con I125 o con iones de metales de tierras raras (por ejemplo europio) . Las células se cargan a 4°C con diferentes concentraciones definidas de péptido durante 30 a 240 min. Para la determinación de la interacción inespecífica del péptido con las células se añade a algunas muestras un exceso de péptido no marcado que impide la interacción específica del péptido marcado. A continuación, se lavan las células con el fin de separar material inespecí- ico asociado a la célula. La cantidad del péptido fijado a la célula se calcula entonces en un contador por centelleo con ayuda de la radiactividad emitida o en un fotómetro adecuado para la medición de la fluorescencia de larga vida.

La valoración de los datos así obtenidos se efectúa según métodos estándares . En una segunda etapa se examinan candidatos con buenas cualidades de fijación en cuanto a su inmunogenicidad.

La inmunogenicidad de xenopéptidos que se derivan de proteínas cuya actividad inmunógena no es conocida, puede someterse a ensayo por ejemplo en el ensayo MLC. Para la presente invención son adecuados péptidos que en este ensayo, que convenientemente se lleva a cabo asimismo en serie con diferentes péptidos, utilizándose convenientemente como patrón un péptido con una actividad inmunógena conocida, provocan una reacción particularmente violenta. Otra posibilidad para el ensayo de candidatos de péptidos que se fijan a MHC-1 en cuanto a su inmunogenicidad consiste en investigar la fijación de los péptidos a células T2. Un ensayo de este tipo se basa en la particularidad de células T2 (Alexander et al., 1989) o células RMA-S (Kárre et al., 1986) de ser defectuosas en el mecanismo de transporte de péptidos TAP y presentar moléculas de MHC- I estables sólo cuando se les aplica péptidos que son presentados en el contexto MHC-I. Para el ensayo se utilizan por ejemplo células T2 o células RMA-S que son transfectadas de manera estable con un gen HLA, por ejemplo con genes HLA-A1 y/o HLA--A2. Si las células se cargan con péptidos que son buenos ligandos de MHC-I, presentándose en el contexto MHC-I de manera que puedan ser reconocidos como extraños por el sistema inmune, este tipo de péptidos determina que las moléculas de HLA aparezcan en una cantidad significativa sobre la superficie de la célula. La detección de las HLA' s sobre la superficie de la célula, por ejemplo mediante anticuerpos monoclonales, permite la identificación de péptidos adecuados (Malnati et al., 1995; Sykulev et al., 1994). También aquí se utiliza convenientemente un péptido patrón con una conocida buena capacidad de fijación a .-'LA ó MHC. En una forma de realización de la invención, una célula tumoral autóloga o alógena de la vacuna puede presentar varios xenopéptidos de diferente secuencia. Los péptidos utilizados pueden diferenciarse en este caso por un lado en el sentido de que se fijan a diferentes subtipos HLA. Con ello, se puede conseguir el que se abarquen varios o todos los subtipos HLA de un paciente o de un mayor grupo de pacientes. La vacuna se administra en forma irradiada. Otra variabilidad eventualmente adicional en relación con los xenopéptidos presentados sobre la célula tumoral puede consistir en que péptidos, que se fijan a un determinado subtipo HLA, se diferencien con relación a su secuencia no determinante para la fijación a HLA, estando derivados por ejemplo de proteínas de diferente origen, por ejemplo de proteínas víricas y/o bacterianas. De una variabilidad de este tipo, que ofrece al organismo vacunado una mayor amplitud de banda de enajenamiento, se puede esperar un refuerzo de la estimulación de la respuesta inmune. En la forma de realización de la invención, en la que la vacuna contra tumores consiste en una mezcla de células tumorales alógenas de diferentes líneas de células así como eventualmente, de forma adicional, células tumorales autólogas, pueden haberse tratado todas las células tumorales con el o los mismos péptidos o las células tumorales de diferente origen pueden presentar también en cada caso diferentes xenopéptidos. En los ensayos llevados a cabo en el marco de la presente invención se utilizó como péptido extraño del tipo a) un péptido vírico de la secuencia Leu Phe Glu Ala He Glu Gly Phe He que se deriva del virus de la influenza hemaglu-tinina y que es un ligando de H2-Kd; los aminoácidos de anclaje están subrayados. Con este péptido vírico que se presenta en la naturaleza en calidad de péptido extraño se produjo una vacuna contra tumores y se sometió a ensayo en un modelo con animales (modelo de melanoma y modelo de carcinoma de colon) . Otro péptido vírico de ia secuencia Ala Ser Asn Glu Asn Met Glu Thr Met, que se deriva de la nucleoproteína del virus de la influenza y que es un ligando del haplotipo HLA-1, H2- -KD (Rammensee et. al .993; los aminoácidos de anclaje están subrayados) se utilizó para la producción de una vacuna contra tumores; el efecto crctectcr de la vacuna se confirmó en otro modelo con melanoma. Se produjo otra vacuna enajenando células tumorales con un péptido extraño de la secuencia Phe Phe He Gly Ala Leu Glu Glu He (FFIGALEEI) . En este caso, se trata de un péptido sintético hasta ahora no conocido en la naturaleza. En la elección de la secuencia se observó que se cumplieran los requisitos en relación con la adecuidad como ligando para la molécula de MHC- I del tipo H2-Kd. La adecuidad del péptido para la creación de una inmunidad antitumores según el con-cepto de la inmunoterapia activa se confirmó en el carcinoma de colon CT-26 de múridos (singénico para la raza de ratones Balb/c) . En otra forma de realización de la invención, la vacuna contra tumores puede contener, además, células tumorales autólogas y/o alógenas, y/o fibroblastos, que están transfectados con genes de citoquinas. En el documento WO 94/21808, así como de Schmidt et al., 1995 (a esta publicación se hace referencia) se describen vacunas contra tumores eficaces que se produjeron mediante el método de transporte de ADN denominado "infección con transferrina" con un vector de expresión de IL-2 (este método se basa en la endocitosis inducida por receptor y utiliza un ligando celular conjugado con un policatión, tal como polilisina, para la complejación de ADN así como un agente endosomolíticamente activo, tal como adenovirus) . Preferiblemente, las células tumorales tratadas con péptidos y las células que expresan citoquina se mezclan en la relación 1:1. Si se mezcla por ejemplo una vacuna de IL-2, que produce 4000 unidades de IL-2 por cada 1 x 106 células, con 1 x 10° células tumorales tratadas con péptidos, la vacuna así obtenida puede emplearse para dos tratamientos, suponiendo un óptimo de dosis de 1000 a 2000 unidades de IL-2 (Schmidt et al., 1995). Mediante la combinación de la vacuna de citoquina con las células tumorales tratadas con péptidos pueden reunirse venta osamente los efectos de estes dos tipos de vacuna.

La elaboración de las células así como la formulación de las vacunas conformes a la invención se efectúa de manera habitual, tal como se describe por ejemplo en Biologic Therapy of Cáncer, 1991, o en el documento WO 94/21808. La invención se refiere, en otro aspecto, a un procedimiento para la producción de una vacuna contra tumores consistente en células tumorales para la administración a un paciente. El procedimiento se caracteriza, conforme a la inven-ción, porque células tumorales, que por sí mismas presentan en el contexto de HLA péptidos derivados de antígenos de tumores y de las que al menos una parte expresa por lo menos un haplotipo MHC- I del paciente, se tratan con uno o varios péptidos, que a) funcionan como ligandos para el haplotipo MHC-I que es común al paciente y a las células tumorales de la vacuna, y son diferentes de péptidos que se derivan de proteínas que son expresadas por células del paciente o que, b) funcionan como ligandos para el haplotipo MHC- I que es común al del paciente y al de las células tumorales de la vacuna, y se derivan de antígenos de tumores que son expresados por células del paciente, incubando las células tumorales con uno o varios péptidos a) y/o b) un tiempo y en una cantidad, en presencia de un poli-catión orgánico, hasta que los péptidos estén fijados a las células tumorales de modo que, en el contexto con las células tumorales del sistema inmune del paciente, son reconocidas como extrañas y desencadenan una respuesta inmune celular. La cantidad de péptido asciende de preferencia de aproximadamente 50 µg hasta aproximadamente 160 µg por cada 1 x 105 a 2 x 107 células. En el caso de emplear un péptido de la categoría b) , la concentración también puede ser mayor. Para estos péptidos es esencial que su concentración en las células tumorales de la vacuna esté incrementada con respecto a la concentración de un pép ido en las células tumorales del paciente, que se deriva del mismo antígeno de tumores, de modo que las células tumorales de la vacuna sean reconocidas como extrañas y desencadenen una respuesta inmune celular. A policationes adecuados pertenecen policationes orgáni-eos homólogos, tales como polilisina, poliarginina, poliorni- ina, o policationes heterólogos con dos o más aminoácidos diferentes cargados positivamente, pudiendo presentar estos policationes una longitud de cadena diferente y, además, policationes sintéticos no peptídicos, tales como polietile-niminas, proteínas fijadoras de ADN naturales de carácter policatiónico, tales como histonas o protaminas, o análogos o fragmentos de las mismas, así como espermina o espermidina. A policationes orgánicos adecuados en el marco de la presente invención pertenecen también lípidos policatiónicos (Felgner et al, 1994; Loeffler et al., 1993; Remy et al., 1994; Behr, 1994) que, entre otros, son adquiribles en el comercio como Transfectam, Lipofectamin o Lipofectin. Como policatión se emplea preferiblemente polilisina (pL) con una longitud de cadena de aproximadamente 30 hasta aproximadamente 300 restos lisina. La cantidad necesria de policatión en relación con el péptido puede determinarse individualmente de forma empírica. En el caso de emplear polilisina y xenopéptidos de la categoría a) , la relación en masa de pL: péptido asciende de preferencia a aproximadamente 1:4 hasta aproximadamente 1:12.

La duración de la incubación asciende, por lo general, a 30 min hasta 4 h. Esta se orienta al instante en el que se ha alcanzado la carga máxima con el péptido; el grado de carga puede vigilarse mediante análisis FACS y, de este modo, determinarse la duración necesaria de la incubación. En otra forma de realización de la invención, la polilisina se emplea al menos en forma parcialmente conjugada. Preferiblemente, una parte de la polilisina se encuentra en una forma conjugada con transferrina (Tf) (conjugado de transferrina-polilisina, TfpL, a este respecto se hace asimismo referencia a la divul ación del documento WO 94/21808) , ascendiendo la relación en masa de pL:TfpL de preferencia a aproximadamente 1:1. En lugar de con transferrina, la polilisina puede conjugarse con otras proteínas, por ejemplo los ligandos celulares descritos en el documento WO 94/21808 como factores de inter-nalización. Eventualmente, el tratamiento de las células tumorales tiene lugar, además, en presencia de ADN. El ADN se encuentra convenientemente en forma de plásmido, preferiblemente en forma de plásmido que está exento de secuencias que codifican proteínas eucarióticas funcionales, es decir en forma de un vector vacío. En calidad de ADN puede utilizarse en principio todo plásmido habitual y funcionalmente adquirible. La cantidad de ADN en relación con el policatión con-jugado eventualmente en parte con una proteína, por ejemplo con pL, TfpL o una mezcla de pL con TfpL, asciende de preferencia de aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 1:5.

La duración de la incubación, la cantidad y el tipo del policatión en relación con el número de las células tumorales y/o la cantidad de péptido, si o en que proporción el policatión o bien con que proteína está ventajosamente conjugado, la ventaja de la presencia de ADN y de su cantidad pueden determinarse empíricamente. Para ello, se varían los distintos parámetros del procedimiento y los péptidos se aplican sobre las células tumorales, en condiciones por lo demás idénticas, y se verifica el grado de eficacia en el que los péptidos se han fijado a las células tumorales. Un método adecuado para ello es el análisis FACS. El procedimiento conforme a la invención se adecúa, además de para el tratamiento de células tumorales, también para el tratamiento de otras células. En lugar de células tumorales pueden cargarse, según el procedimiento conforme a ia invención, con uno o varios péptidos fibroblastos autólogos, es decir propios del paciente, o células de líneas de células de fibroblastos que están adaptadas al subtipo HLA del paciente o que han sido transfectadas con el correspondiente gen MHC- I, péptidos que se derivan de antígenos de tumores que son expresados por las células tumorales del paciente. Los fibroblastos así tratados e irradiados pueden utilizarse como vacuna contra tumores como tales o en mezcla con células tumorales tratadas con péptidos . En otra forma de realización, en lugar de fibroblastos pueden tratarse según el procedimiento conforme a la invención células dendríticas. Las células dendríticas son APC's de la piel; pueden cargarse in vitro a elección, es decir células aisladas del paciente se mezclan in vitro con uno o varios péptidos, derivándose los péptidos de antígenos de tumores del paciente y fijarse a una molécula de MHC-I o a una molécula de MHC-II del paciente. En otra forma de realización, estas células pueden cargarse también in vivo con el péptido. Para ello, los complejos a base de péptido, policatión y eventualmente ADN se inyectan preferiblemente por vía intradermal, ya que en la piel las células dendríticas se encuentran de manera particularmente frecuente. En el marco de la presente invención, el péptido se complejo con TfpL ó pL para la transferencia a células CT-26, y con TfpL y un plásmido no funcional (vector vacío) para la transferencia a células M-3. En el sistema CT-26 se comprobó que la vacuna contra tumores irradiada y enajenada con pép-tido generaba una inmunidad anti -tumores eficaz: el 75% de los ratones inoculados podían eliminar un enfrentamiento con el tumor que, en todos los animales testigos que no recibieron ninguna vacuna o recibieron una vacuna sin el xenopépti-do, conducía a la formación del tumor. En el sistema M-3 se sometió a ensayo el mismo xenopéptido en condiciones que presentaban una restricción todavía mayor para el organismo en relación con la formación de tumores, en un ensayo experimental que está hecho a imagen de la situación en el ser humano. Ratones portadores de metástasis se inocularon con células M-3 xenopeptizadas e irradiadas. El 87,5% de los ratones así inoculados codían eliminar las metástasis, mientras que todos los no tratados y 7 de 8 ratones que habían recibido la vacuna sin el xenopéptido enfermaron de tumores . Además, se comprobó que la magnitud de la respuesta inmune sistémica de la vacuna contra tumores depende del método con el que el péptido se aplica sobre las células tumorales. Si el péptido se administró a las células mediante polilisina/transferrina, el efecto era claramente más acusado que cuando las células se incubaron con el péptido durante 24 h ("impulsos") . También la incorporación por mezcladura coadyuvante del péptido a las vacunas irradiadas era poco eficaz. Mediante la infección con transferrina debería garantizarse una absorción más eficaz del péptido a las células o bien la carga con polilisina/transferrina debería determinar que el péptido permaneciera adherido a la membrana celular y, por consiguiente, sea llevado físicamente a las proximidades de las moléculas de MHC-I y que luego se pudiera fijar a éstas, pudiendo expulsar, en virtud de su fuerte afinidad, péptidos celulares que estén fijados de forma más débil.

Recopilación de las figuras Fig. la: Análisis FACS de células M-3 tratadas con péptidos extraños Fig. Ib: Microfotografías de células M-3 tratadas con péptido FITC Fig. 2 : Curación de ratones DBA/2 portadores de metástasis de melanoma M-3 mediante una vacuna a base de células M-3 cargadas con péptidos extraños Fig. 3a: Titulación de un péptido extraño para la producción de una vacuna contra tumores Fig. 3b: Comparación de una vacuna contra tumores a base de células tumorales cargadas con péptidos extraños con una vacuna contra tumores secretora de IL-2 Fig. 4a: Protección de ratones Balb/c por preinmunización con una vacuna a base de células de carcinoma de colon cargadas con pépticos extraños Fig. 4b: Investigación de la participación de células T en la inmunidad sistémica Fig. 5 : Protección de ratones C57BL/6J por preinmunización con una vacuna a base de células de melanoma cargadas con péptidos extraños En los siguientes ejemplos se utilizaron, si no se indica otra cosa, los siguientes materiales y métodos: La línea de células de melanoma de ratón Cloudman S91 (clon M-3; ATCC n° CCL 53.1) se adquirió de ATCC. La línea de células de melanoma B16-F10 (Fidler et al., 1975) se adquirió de NIH DCT Tumor Depository. La preparación de conjugados de transferrina-polilisina de complejos de transfección con contenido en ADN se efectuó tal como se describe en el documento WO 94/21808. Los péptidos LFEAIEGFI, FFIGALEEI, LPEAIEGFG y ASNENMETM se sintetizaron en un sintetizador de péptidos (modelo 433 A con monitor de retroalimentación, Applied Biosystems, Foster City, Canadá) con empleo de TentaGel S PHB (Rapp, Tübingen) como fase sólida según el método Fmoc (activación con HBTU, Fastmoc8, escala 0:25 mmol) . Los péptidos se disolvieron en TEAA 1 M, pH 7,3 y se purificaron mediante cromatografía inversa en una columna Vydac C 18. Las secuencias se determinaron mediante espectrometría en masa de duración de la trayectoria en un MAT Lasermat (Finnigan, San José, Canadá) . El ensayo de la actividad de la vacuna contra el cáncer en cuanto a su efecto protector contra la formación de metástasis ("modelo con ratones terapéutico"), así como el ensayo en el modelo con ratones profiláctico se llevó a cabo según el protocolo descrito en el documento WO 94/21808, utilizán-dose como modelo con ratones el modelo DBA/2 o el modelo Balb/c.

Ejemplo 1 Análisis FACS comparativo de células M-3 que se trataron con péptido extraño mediante métodos diferentes Para la investigación, que está representada en la fig. 1, el xenopéptido LFEAIEGFI se aplicó sobre células M-3 una vez con complejos de TfpL/ADN ("traslado"; fig. la), las células se incubaron una vez con el péptido ("pulsación"; fig. Ib) y el péptido se incorporó por mezcladura una vez de forma coadyuvante a las células (fig. lc) . Para el traslado se mezclaron 160 µg de xenopéptido LFEAIEGFI marcado con FITC o péptido control no marcado con 3 µg de transferrina-polilisina (TfpL) , 10 µg de pL y 6 µg de psp65 (Boehringer Mannheim, exento de LPS) en 500 µl de tampón HBS. Después de 30 min a la temperatura ambiente, _la solución anterior se añadió a un frasco de cultivo de células T 75 con 1,5 x 106 células M-3 en 20 ml de medio DMEM (FCS al 10%, glucosa 20 mM) y se incubó a 37°C. Después de 3 h, las células se lavaron dos veces con PBS, se separaron por disolución con PBS/?DTA 2 mM y, para el análisis FACS, se resuspendieron en 1 ml de PBS/FCS al 5%. La pulsación de las células con el péptido se llevó a cabo durante 3 h a 37°C con 1 - 2 x 106 células en 20 ml de DMEM con 450 µg de péptido (marcado con FITC o no marcado) .

Para la incorporación por mezcladura coadyuvante se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente, antes del análisis FACS, 10° células separadas por disolución del frasco de cultivo con 100 µg de péptido marcado con FITC en 1 ml de PBS/FCS al 5%. Las células se lavaron después de intercambio de PBC/FCS al 5% y se analizaron otra vez. El análisis FACS se llevó a cabo, según las prescripciones del fabricante, con empleo de un aparato FACS Vantage (Becton Dickinson) , equipado con un láser de argón de 5 W ajustado a 100 mW a 488 nm. El resultado del análisis FACS está representado en las figs. la a lc. La fig. ld muestra microfoto-grafías de células M-3 citocentpfugadas : la imagen superior muestra células que se obtuvieron mediante el complejo ("traslado") y la imagen inferior muestra células que habían sido incubadas ("pulsación") con el péptido. Para la tinción antagonista del núcleo se utilizó DAPI .

Células M-3 que habían sido cargadas con el complejo que contenía el péptido, mostraron un desplazamiento de la fluorescencia en aproximadamente 2 potencias de diez en comparación con células no tratadas o tratadas solamente con polilisina, lo que apunta a una transferencia eficaz del péptido sobre las células mediante el complejo de TfpL/ADN (fig. la). La incubación con péptido (pulsación) era menos eficaz, lo que tiene como resultado un desplazamiento de la fluorescencia en sólo una potencia de diez, que no es prácticamente detectable por microscopía de fluorescencia (fig. ld) . En el caso de la incorporación por mezcladura coadyuvante, el péptido desaparecía de la etapa de lavado (fig. lc) , lo que apunta al hecho de que la fijación del péptido era a lo sumo escasa.

Ejemplo 2 Curación de ratones DBA/2 que presentan metástasis de melanoma con una vacuna a base de células de melanoma cargadas con péptido extraño ("modelo con ratones terapéutico") a) Producción de una vacuna contra tumores a partir de células M-3 160 µg de xenopéptido LFEAIEGFI se mezclaron con 3 µg de transferrina-polilisina (TfpL) , 10 µg de pL y 6 µg de psp65 (exento de LPS) en 500 µl de tampón HBS. Después de 30 min a la temperatura ambiente, la solución anterior se añadió a un frasco de cultivo de células T 75 con 1,5 x 106 células M-3 en 20 ml de medio DMEM (FCS ai 10%, glucosa 20 mM) y se incubó a 37 °C. Después de 3 h, las células se mezclaron con 15 ml de medio de reciente aportación y se incubaron durante una noche a 37°C y a 5% de C02. 4 h antes de la aplicación, las células se irradiaron con 20 Gy. La elaboración de la vacuna se efectuó como se describe en el documento WO 94/21808. b) Eficacia de la vacuna contra tumores Ratones DBA./2 de 6-12 semanas de edad con una metástasis de cinco días (producida por la inyección subcutánea de lo4 células -3 vivas) se trataron dos veces, a intervales de una semana, mediante inyección subcutánea con una vacuna contra tumores (dosis: 105 células/animal). Se encontraban 8 ratones en el experimento. El resultado de los ensayos está, representado en la fig. 2a,- se demostró que se curaron 7 de 8 animales después de la administración de la vacuna que contenían péptido cargado sobre las células tumores mediante complejos de TfpL/ADN. En ensayos comparativos se utilizó una vacuna en la que se habla aplicado sobre las células el péptido LFEAIEGF? (400 µg o 4 mg) mediante incubación (3 h. a 37°C; "pulsación") . De los anímlaes que habían recibido una vacuna con 400 µg de péptido, 3 de 8 quedaron exentos de tumores, y la vacuna a base de células tratadas con 4 mg de péptido sólo curó a 1 de 8 animales. Los testigos eran células M-3 irradiadas solas, asi como células que habían sido cargadas sin péptido con los complejos (en cada caso 1/8 animales quedó exento de tumores) . En el grupo de los animales testigos, a los gue se no se les eometió a ningún tipo de tratamiento, todos los animales desarrollaron tumores. Con el fin de investigar la relevancia, por una parte, del método de producción de las vacunas y, por otra parte, las secuencias d.e péptidos, se llevó a cabo otra serie de ensayos; en estos experimentos se utilizó una variante de las células -3 muy tumorígena. En los ensayos, en los que se ensayó la impor ancia del método de tratamiento, se produjeron vacunas en las que el péptido no se cargó sobre las células mediante polilisina-transferrina, sino que a las células únicamente se incorporó por mezcladura coadyuvante. Para el control con respecto a la secuencia de péptidss, los aminoácidos de anclaje del péptido en las posiciones 2 y 9, a saber fenilalanina e isoleucina, se reemplazaron por prolina o glucina, lo que conducía al péptido Leu Pro Glu Ala He Glu Gly Phe Gly (LPEAIEGFG) ; este péptido carece de la capacidad para la fijación de H2-Kd. La formación de metástasis se controló al menos una vez por semana. El resultado de estos ensayos se puede ver en la fig. 2b. La vacuna, producida por carga de las células con LFEAIEGFI mediante los complejos de TfpL/ADN curó 6 de 8 animales. Por el contrario, 7 de 8 animales desarrollaron tumores que habían obtenido una vacuna a la que se incorporó por mezcladura únicamente a las células el péptido LFEAIEGFI y que consistía en células que fueron cargadas mediante los complejos de TfpL/ADN con el péptido modificado y que no se fija al residuo de HLA. En el grupo testigo, que sólo había sido tratado con células M-3 irradiadas o que no recibió ningún tipo de tratamiento, todos los animales desarrollaron tumores. c) Investigación de la influencia de la cantidad de péptido en la vacuna Se prepararon, tal como se describe en el apartado a) , complejos con contenido en péptidos, que contenían 50, 5 o 0,5 µg del péptido activo LFEAIEGFI y con ellos se cargaron células M-3. Como comparación servía una vacuna de IL-2 que secretaba la dosis óptima de IL-2 (véase el Ejemplo 3) . Con esta vacuna se inocularon ratones DAB/2 que eran portadores de una metástasis de cinco días. La vacuna con 50 µg de péptido curaba 6 de 8 ratones, aquella con 5 µg 4 de 8 , al igual que la vacuna de IL-2, mientras que la vacuna que contenía 0,5 µg sólo curaba 2 de 8 animales. Este ensayo está representado en la fig. 3a.

Ejemplo 3 Comparación de la vacuna con contenido en péptido extraño con una vacuna contra tumores a base de células tumorales secretoras de IL-2 en el modelo con ratones profiláctico En ensayos comparativos se preinmunizaron dos veces, en un intervalo de 1 semana, dos grupos de animales de ensayo (en cada caso 8) por una parte ccn la vacuna descrita en el Ejemplo 2 a) y, por otra parte, con una vacuna a base de células M-3 secretoras de IL-2 (producidas según el protocolo descrito en el documento WO 94/21808, dosis de IL-2, 2000 unidades por animal) . Una semana después de la última vacunación, se establecieron con un número creciente de células tumorales, tumores contralaterales ( "enfrentamiento" ; la dosis se indica en la fig. 3b) . Se demostró que la preinmunización con la vacuna contra tumores de acuerdo con la invención era superior a un tratamiento con la vacuna de IL-2: ratones no afectados, inoculados con la vacuna de IL-2, sólo estaban protegidos frente a una dosis de 105 células vivas muy tumorígenas (M-3-W) . Sin embargo, la capacidad de esta vacuna se había agotado en el caso de un enfrentamiento de 3 x 105 células, mientras que se combatió con éxito una solu-ción con tumores de esta magnitud de animales que habían sido preinmunizados con la vacuna a base de células tumorales cargadas con péptido extraño.

Ej emplo 4 Protección de ratones Balb/c por preinmunización con una vacuna a base de células de carcinoma de colon cargadas con péptido extraño ("modelo con ratones profiláctico") a) Producción de la vacuna C -26 160 µg de xenopéptido LFEAIEGFI ó FFIGALEEI se mezclaron con 12 µg de pL, con 3 µg de transferrina-polilisina más 10 µg de polilisina, y se complejaron durante 30 min a temperatura ambiente en 500 µl de tampón HBS y a continuación se transfirieron a un frasco de cultivo de células T 75 con 1,5 x 106 células CT-26 en 4 ml de medio DMEM (FCS al 10%, glucosa 20 mM) y a continuación se incubó a 37°C y 5% de C02. Después de 4 h, las células se lavaron con PBS, se mezclaron con medio de reciente aportación y se incubaron durante una noche a 37°C y 5% de C02. 4 h antes de la aplicación, las células se irradiaron con 120 Gy. La elaboración de la vacuna se efectuó como se describe en el documento WO 94/21808. b) Ensayo de la actividad de la vacuna contra el cáncer en cuanto a su efecto protector contra el enfrentamiento con CT-26 Ratones Balb/c de 6-12 semanas de edad se vacunaron dos veces, a un intervalo de una semana, por inyección subcutánea (dosis de células: 105/ratón) . Por cada grupo se encontraban en el experimento 8 ratones (o 7 ratones en el ensayo en el que se utilizó pL para la carga de las células) . Una semana después de la última vacunación se establecieron tumores contralaterales con 5 x 104 células CT-26 parenterales. Se llevaron a cabo, tal como se describe en el Ejemplo 2, ensayos comparativos en los que la vacuna se produjo de otra manera que mediante los complejos a base de TfpL/ADN, así como los testigos. El desarrollo del enfrentamiento contra tumores se controló al menos una vez por semana. El resultado para el péptido LFEAIEGFI se puede ver en la fig. 4a; se protegieron 6 de 8 animales. En el caso del péptido FFIGALEEI (no mostrado en la fig. 4a), se protegieron 4 de 8 animales. c) Participación de células T en la actividad de la vacuna contra tumores Con el fin de determinar la participación de células T en la inmunidad sistémica determinada por la vacuna CT-26 se eliminaron, en otro ensayo, 24 h antes de la vacunación, células CD4+ por inyección intravenosa de 500 µg de anticuerpos monoclonales GK1.5 (ATCC TIB 207) y células CD8+ por inyección intravenosa de 500 µg de anticuerpos monoclonales 2.43 (ATCC TIB 210). Un grupo testigo positivo recibió la vacuna sin que se hubieran eliminado células CD4* y células CD8+. El resultado de los ensayos está representado en la fig. 4b: la participación de las células T se demuestra por el hecho de que todos los animales, a los que se había retirado células T, desarrollaban tumores.

Ejemplo 5 Protección de ratones C57BL/6J por preinmunización con una vacuna a partir de células de melanoma cargadas con péptido extraño ("modelo con ratones profiláctico") En este ejemplo se utilizaron como animales de ensayo ratones de la raza C57BL/6J (en cada caso 8 animales por grupo) . Como células de melanoma se utilizaron las células B16-F10 singénicas para la raza de ratón utilizada (NIH DCT Tumor Depository; Fidler et al., 1975). Los animales de todos los grupos de ensayo se vacunaron dos veces, a un intervalo de una semana, por inyección subcutánea de 105 células B16-F10 por ratón: En una serie de ensayos se produjo la vacuna cargando células B16-F10 irradiadas con el péptido de la secuencia ASNENMETM, tal como se describe en el Ejemplo 2 para la vacuna a base de células M-3. En ensayos paralelos se utilizaron como vacuna para la preinmunización células B16-F10 secretoras de IL-2 ó GM-CSF (producidas según el protocolo descrito en el documento WO 94/21808) ; la vacuna producía 1000 unidades de IL-2 o 200 ng de GM-CSF por animal. Un grupo testigo recibía las células B16-F10 irradiadas para la preinmunización y, por lo demás, no tratadas. Una semana después de la última vacunación, se estableció a los animales de ensayo tumores con 1 x 104 células B16--F10 vivas irradiadas y a continuación se vigiló el desarrollo del tumor. El resultado de los ensayos está representado en la fig. 5; las células tumorales cargadas con el péptido extraño mostraban el mejor efecto protector antes de la formación del tumor .

Tabla Secuencia Haplotipo Ant qeno Referencia peptxdica MHC SPSYVYHQF gp70, MuLV Huang y Pardoll, 1996 endógeno FEQNTAQA Kb Connexxn37 Mandelboim, et al . 1994 FEQNTAQP ? Connexm37 Mandelboim, et al 1994 SYFPEITHI ?d JAK1 Rammensee, et al 1995 EADPTGHSY HLA-A1 MAGE- 1 Rammensee, et al. 1995 EVDPIGHLY HLA-A1 MAGE- 3 Rammensee, et al, 1995 YMNGTMSQV HLA-A2+ tirosinasa Rammensee, et al. 1995 HLA-AO201 ML ALLYCL HLA-AO201 tirosmasa Rammensee, et al. 1995 AAGIGILTV HLA-AO201 Melan A/Martl Rammensee, et al. 1995 YL?PGPVTA HLA-AO201 pmel!7/gpl00 Rammensee, et al. 1995 ILDGTATLRL HLA-AO201 pmel!7/gpl00 Rammensee, et al. 1995 SYLZSGlHF HLA-A24 /3-caten?na Robbiins, et al. 1996 Ai:,'NYAQKL DE antígeno T Lili, et al 1992 CKGVNKEYL grande SV-40 QGINNLDNL NLDNLRDYL Tabla (continuación) Secuencia Haplotipo Antíaeno Referencia peptxdica MHC EEKLIWLF HLA-B44 MUM-1 Coulie, et al., 1995 ACDPHSGHFV HLA-A2 CDK4 mutado Wolfel, et al. , 1995 AYGLDFYIL HLA-A24 pl5, función Robbins, et al., 1995 desconocida KTWGQYWQV HLA-A2 gplOO Kawakami y YLEPGPVTA Rosenberg, 1995 HMTEWRHC HLA- -A2 p53 mutado Houbiers, et al., 1993 KYICNSSCM Kd p53 mutado Noguchi, et al., 1994 GLAPPQHEI HLA- -A2 p53 mutado Stuber, et al . , 1994 LLGRNSEEM LLPENNVLSPL HLA-A2 p53 tipo Theobald, et al . , 1995 RMPEAAPPV salvaj e LLGRNSFEV LLGRDSFEV HLA-A2 p53 mutado Theobald, et al., 1995 BIBLIOGRAFÍA Alexander, J. et al., 1989, Immunogenetics 29, 380 Allred, D.C. et al., 1992, J. Clin. Oncol. 10 (4), 599- -605 Behr, J.P., .1994, Bioconjug-Chem. , Sept-Oct, 5(5), 382-9 Biologic Therapy of Cáncer, editores: DeVita, V.T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S.A., Editorial J.B.

Lippincott Company, Filadelfia, Nueva York, Londres, Hagerstown Boon, T., 1993, Spektrum der Wissenschaft (Mayo), 58-66 Boon, T. et al., 1994, Annu. Rev. Immunol . 12, 337-65 Braciale, T.J. y Braciale, V.L., 1991, Immunol . Today 12, 124-129 Carrel, S. y Johnson, J.P., 1993, Current Opinión in Oncology 5, 383-389 Coligan, J.E., Kruisbeek, A.M., Margulies, D.H., Shevach, Falk, K. et al., 1991, Nature 351, 290-296 Coulie, P'.G. et al., 1992, Int. J. Cáncer, 50, 289-297 Coulie, P.G., Lehmann, F., Lethe, B., Hermán, J. , Lurquin, C, Andrawiss, M. y Boon, T. (1995) . Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92, 7976-80 Cox, A.L. et al., 1994, Science 264, 5159, 716-9 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Editores: Ausubel F.M., et al., John Wiley & Sons, Inc. Dranoff, G. et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543 Dranoff, G. y Mulligan, R.C., 1995, Advances in Immuno logy 58, 417 Falk, K. et al., 1991, Nature 351, 290-296 Felgner, J.H. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 Fenton, R.G. et al., 1993, J. Nati. Cáncer Inst . 85, 16, 1294-302 Fisk, B. et al., 1995, J. Exp. Med. 1881, 2109-2117 Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Cell Biology, 1989, vol. 33, editores: Darzynkiewicz, Z. y Crissman, H.A. Gedde Dahl, T. et al., 1992, Hum. Immunol . 33, 4, 266-74 Guarini, A. et al., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1, 57-64 Han, X.K. et al., 1995, PNAS 92, 9747-9751 Manual: FACS Vantage™ User's Guide, Abril 1994, Becton Dickinson Manual: CELL Quest™ Software User's Guide, Junio 1994, Becton Dickinson Hépn M. et al., 1987, Int. J. Cáncer, 39, 390 Hock, H. et al., 1993, Cáncer Research 53, 714-716 Houbiers, J.G., Nij man, H.W., van der Burg, S.H., Drijfhout, J.W. , Kenemans, P. , van de Velde, C.J., Brand, A., Momburg F., Kast, W.M. y Melief, C.J. (1993). Eur. J. Immunol . 23, 2072-7. Huang, A.Y.C. y Pardoll, D.M. (1996) . Proc. Nati. Acad.

Sci. USA 93, 9730-5 Jung, S. et al., 1991, J. Exp. Med. 173, 1, 273-6 Kawakami, Y. et al., 1995, The Journal of Immunol . 154, 3961-3968 K rre, K. et al., 1986, Nature 319, 20 Feb., 675 Kovacsovics Bankowski , M. y Rock, K.L., 1995, Science 267, 243-246 Lehmann, J.M. et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895 Lethe, B. et al., 1992, Eur. J. Immunol . 22, 2283-2288 Lili, N.L., Tevethia, M.J., Hendrickson, W.G. y Tevethia S.S. (1992), J. Exp. Med. 176, 449-57 Loeffler, J.-P. et al., 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618 Mackiewicz, A. et al., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811 Malnati, M.S. et al., 1995, Science 267, 1016-1018 Mandelboim, O. et al., 1994, Nature 369, 5 de Mayo, 67-71 Mandelboim, O. et al., 1995, Nature Medicine 1, 11, 1179-1183 Morishita, R. et al., 1993, J. Clin. Invest. 91, 6, 2580-5 Nabel, G.J. et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311 Noguchi, Y., Chen, Y.T. y Oíd, L.J. (1994) . Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 91, 3171-3175 Oettgen, H.F. y Oíd, L.J., 1991, Biologic Therapy of Cáncer, editores: DeVita, V.T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S.A., Editorial J.B. Lippincott Company, Filadelfia, Nueva York, Londres, Hagerstown, 87-119 Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinión in Immuno logy 6, 722-727 Pardoll, D.M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Practical Immunology, editores: Leslie Hudson y Frank C. Hay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Londres, Edimburgo, Boston, Melbourne Peace, D.J. et al., 1991, J. Immunol . 146, 6, 2059-65 Peoples, G.E. et al., 1994, J. Immunol . 152, 10, 4993-9 Plautz, G.E. et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649 Rammensee, H.G. et al., 1993, Current Opinión in Immuno logy 5, 35-44 Rammensee, H.G., 1995, Current Opinión in Immunology 7, 85-96 Rammensee, H.G., Friede, T. y Stepvanovic, S. (1995).

Immunogenetics 41, 178-228 Remy, J.S. et al., 1994, Bioconjug-Chem. , Nov-Dic. 5(6), 647-54 Rivoltini, L. et al., 1995, The Journal of Immunology 154, 2257-2265 Robbins, P.F., el Gamil, M., Li, Y.F., Topalian, S.L., Rivoltini, L., Sakaguchi, K. , Appella, E., Kawaka mi, Y. y Rosenberg, S.A. (1995). J. Immunol . 154, 5944-50 Robbins y Rosenberg (1996) . J. EXP. MED. 183, 1185-92. Schmidt, W. et al., Mayo 1995, Proc. Nati. Acad. Sci.

USA, 92, 4711-4714 Skipper, J. y Stauss, H.J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-8 Slingluff, C.L. et al., 1994, Current Opinión in Immuno- logy 6, 733-740 Stein, D. et al., 1994, EMBO-Journal, 13, 6, 1331-40 Stuber, G. , Leder, G.H., Storkus, W.T., Lotze, M.T., Modrow, S., Szekely, L., Wolf, H., Klein, E., Karre, K. y Klein, G. (1994). Eur. J. Immunol . 24, 765-768 Sykulev, Y. et al., 1994, Immunity 1, 15-22 Theobald, M., Levine, A.J. y Sherman, L.A. (1995) PNAS 92, 11993-7 Tibbets, L.M. et al., 1993, Cáncer, 15 Ene., vol. 71, 2, 315-321 van der Bruggen, P. et al., 1994, Eur. J. Immunol . 24, 9, 2134-40 Issn: 0014-2980 Van Peí, A. y Boon, T., 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79, 4718-4722 Wólfel, T. et al., 1994 a), Int. J. Cáncer 57, 413-418 Wólfel, T. et al., 1994 b) , Eur. J. Immunol . 24, 759-764 Wólfel, T., Hauer, M. , Schneider, J. , Serrano, M., Wolfel, C, Klehmann Hieb, E., De Plaen, E., Hankeln, T. , Meyer zum Buschenfelde, K.H. y Beach, D. (1995) . Science -69, 1281-4 York, I.A. y Rock, K.L., 1996, Ann. Rev. Immunol . 14, 369-396 Yoshino, I. et al., 1994 a), J. Immunol . 152, 5, 2393-400 Yoshino, I. et al . , 1994 b) , Cáncer Res., 54, 13, 3387-90 Zatloukal, K. et al., 1993, Gene 135, 199-20 Zatloukal, K. et al., 1995, J. Immun. 154, 3406-3419 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención,- es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. - Una vacuna contra tumores para su administración a un paciente, caracterizada porque contiene células tumorales que, por sí mismas, presentan en el contexto HLA péptidos derivados de antígenos de tumores y de las que al menos una parte presenta por lo menos un haplotipo de MHC- 1 del paciente en la superficie de la célula, y que se cargaron con uno o varios péptidos a) y/o b) de modo que las células tumorales son reconocidas como extrañas en el contexto con los péptidos del sistema inmune del paciente y desencadenan una respuesta inmune celular, en donde los péptidos a) funcionan como ligandos para el haplotipo de MHC- I que es común al paciente y a las células tumorales de la vacuna, y son diferentes de péptidos que se derivan de proteínas que son expresadas por células del paciente o, b) funcionan como ligandos para el haplotipo de MHC- I que es común al paciente y a las células tumorales de la vacuna, y se derivan de antígenos de tumores que son expresados por células del paciente y se encuentran presentes sobre las células tumorales de la vacuna en una concentración que es mayor que la concentración de un péptido que se deriva del mismo antígeno de tumores que el expresado sobre las células tumorales del paciente.

2.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 1, caracterizada porque contiene células tumorales autólogas.

3.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 1, caracterizada porque contiene células tumorales alógenas.

4.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 3, caracterizada porque ias células tumorales alógenas son células de una o varias líneas de células que las que ai menos una línea de células expresa al menos uno, preferible -mente varios antígenos de tumores que son idénticos ccn los ar.tí er.os de tumores del cac ente a tratar.

5. - Vacuna contra tumores según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque consiste en una mezcla de células autólogas y alógenas. 6.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido a) se deriva de una proteína inmunógena que se presenta en la naturaleza o de un producto de degradación celular de la misma. 7.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 6, caracterizada porque el péptido a) se deriva de una proteína vírica. 8.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 7, caracterizada porque el péptido se deriva de una proteína del virus de la influenza. 9.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 6, caracterizada porque el péptido a) se deriva de una proteína bacteriana. 10.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido a) se deriva de un antígeno de tumores extraño para el paciente. 11.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido a) es un péptido sintético. 12.- Vacuna contra tumores según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque ias células tumorales se trataron con varios péptidcs de diferente secuencia. 13.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 12, caracterizada porque los péptidos se diferencian en que se fijan a diferentes subtipos HLA. 14.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 13, caracterizada porque los péptidcs se diferencian en relación con su secuencia determinante de la fijación a HLA. 15.- Vacuna contra tumores según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque contiene, además, células tumorales y/o fibroblastos que están transfectados con un gen citoquina. 16.- Vacuna contra tumores según la reivindicación 15, caracterizada porque la citcquma es IL-2 y/o IFN-?. 17.- Vacuna contra tumores según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizada porgue contiene, además, fibroblastos que están cargados con uno o varios péptidos que se derivan de antígenos de tumores que son expresados por pacientes. 18. - Vacuna contra tumores según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizada porque contiene, además, células dendríticas que están cargadas con uno o varios péptidos que se derivan de antígenos de tumores que son expresados por pacientes y que se fijan a una molécula de MHC- 1 o a una molécula de MHC- II. 19.- Procedimiento para la producción de una vacuna contra tumores que contiene células tumorales, para su administración a un paciente, caracterizado porque células tumorales, que por sí mismas presentan en el contexto de HLA péptidos derivados de antígenos de tumores y de las que al menos una parte expresa por lo menos un haplotipo MHC-I del paciente, se tratan con uno o varios péptidos, que a) funcionan como ligandos para ei haplotipo MHC- I que es común al paciente y a las células tumorales de la vacuna, y son diferentes de péptidos que se derivan de proteínas que son expresadas por células del paciente o que, b) funcionan como ligandos para ei haplotipo MHC- I que es común al del paciente y al de ias células tumorales de la vacuna, y se derivan de antígenos de tumores que son expresados por células del paciente, incubando las células tumorales con uno o varios péptidos a) y/o b) un tiempo y en una cantidad, en presencia de un poli-catión orgánico, hasta que los pép idos estén fijados a las células tumorales de modo que, en el contexto con las células tumorales del sistema inmune del paciente, son reconocidas cerno extrañas y desencadenan una respuesta inmune celular. 20.- Procedimiento según la reivindicación 19, caracte-rizado porque, además, células dendríticas se tratan, en presencia de un policatión organice, con uno o varios pép-* , - 43 - tidos, que se derivan de antígenos de tumores que son expresados por pacientes y que se fijan a una molécula de MHC- 1 o a una molécula de MHC- II, y porque las células dendríticas se mezclan con las células tumorales. 5 21.- Procedimiento según la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque como policatión se emplea polilisina. 22.- Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque se emplea polilisina con una longitud de cadena de aproximadamente 30 a aproximadamente 300 restos lisina. 10 23.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque el policatión se emplea en forma al menos parcialmente conjugada. 24.- Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque el policatión está conjugado con transferrina. 15 25.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado porque las células se tratan, además, en presencia de ADN. 26.- Procedimiento según la reivindicación 25, caracterizado porque el ADN es un plásmido. 20 27.- Procedimiento según la reivindicación 25 ,ó 26, caracterizado porque la relación de ADN a policatión, even- tualr.er.te conjugado en parte con una proteína, asciende a aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 1:5. 2 1 . - Procedimiento según una de las reivindicaciones 25 25 a 2"7, caracterizado porque las células tumorales son células de rr.el noma. 29.- Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizad: porque el péptido a) y/o b) se emplea en una cantidad de aproximadamente 50 µg hasta aproximadamente 160 µg per 30 cada 1 x 103 hasta 2 x I07 células. 22.- Empleo del procedimiento según una de las reivindicaciones 19, 21 a 27 y 29 en ibroblastos, empleando uno c vanos péptidos que se derivan de antígenos de tumores que sor. xpresados por pacientes. 35 21.- Empleo del procedimiento según una de las reivindicaciones 19, 21 a 27 y 29 en células dendríticas, empleando uno o varios péptidos que se derivan de antígenos de tumores y que se fijan a una molécula de MHC-1 o de MHC-II del paciente .