MXPA05005921A

MXPA05005921A - Anticuerpos dirigidos a factor de necrosis tumoral y sus usos.

Info

Publication number: MXPA05005921A
Application number: MXPA05005921A
Authority: MX
Inventors: Jane Su Qiaojuan
Original assignee: Abgenix Inc
Priority date: 2002-12-02
Filing date: 2003-12-02
Publication date: 2005-10-19
Also published as: ES2347239T3; EP1578799A2; EP1578799B8; US7285269B2; HK1083023A1; WO2004050683A2; AU2003298816A1; RU2377253C2; WO2004050683A3; US20050049402A1; CN100434440C; AU2003298816C1; ATE472556T1; US8101178B2; WO2004050683A8; US20080187531A1; JP4754219B2; EP1578799B1; EP1578799A4; RU2005116225A

Abstract

Anticuerpos dirigidos al antigeno TNFa y usos de dichos anticuerpos. En particular, anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos al antigeno TNFa. Codificacion de secuencias de nucleotido, y secuencias de aminoacidos comprenden, moleculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, particularmente secuencias que corresponden a secuencias de cadena pesada y ligera contiguas que se extienden por las regions de bastidor y/o regiones de determinacion de complementaridad (CDR's), especificamente de FR1 a FR4 o CD1 a CD3. Hibridomas u otras lineas celulares que expresan dichas moleculas de inmunoglobulina y anticuerpos monoclonales.

Description

ANTICUERPOS DIRIGIDOS A FACTOR DE NECROSIS TUMORAL Y SUS USOS CAMPO

[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos al antxgeno Factor de Necrosis Tumoral de tipo alfa (a continuación TNFa) y usos de estos anticuerpos. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos al antxgeno TNFa y al uso de estos anticuerpos. Aspectos de la invención también se refieren a hibridomas u otras líneas celulares que expresan dichos anticuerpos . Los anticuerpos presentes son útiles como de diagnóstico y como tratamientos para enfermedades asociadas con la actividad y/o sobreproducción de TNFa . ANTECEDENTES

[0002] TNFa se ha demostrado que está involucrado enfermedades infecciosas, desórdenes inmunes, patologías autoinmunes, enfermedad de injerto contra anfitrión (GVHD = graft vs host disease) , caquexia asociada con cáncer y neoplasia/cáncer. Ver, Feldman M. , 2002 at. Rev. I munol . , 2: 364. En particular, los niveles de TNFa se inducen dramáticamente en sepsis gram negativa, choque endotóxico (Ver, Michie y colaboradores, 1989 Br. J. Surg . 76: 670) enfermedad de Crohn y artritis reumatoide . Las implicaciones de TNFa en esta amplia variedad de indicaciones resalta la importancia en desarrollar terapéuticas biológicas específicas dirigidas a esta citocina inflamatoria.

[0003] Varios investigadores reportan la caracterización de anticuerpos monoclonales contra TNFa que neutralizan su actividad in vitro. Ver, Liang CM, y colaboradores, 1986, Bioc em. Biophys Res. Commun. , 137: 847, y Meager A, y colaboradores, 1987 Hybridoma (Hibridoma) 6: 305. Algunos de estos anticuerpos se utilizaron para cartografiar o mapear epítopes de TNFa humano y desarrollar inmunoensayos de enzima y para asistir en la purificación de TNFa recombinante . Ver Fendly BM, y colaboradores, 1987 Hybridoma, 6: 359; Hirai M, y colaboradores, 1987 J. Immunol Methods, 96: 57; Moller A, y colaboradores, 1990 Cytokine, 2: 162; Bringman TS y Aggarwal BB, 1987, Hybridoma, 6: 489. Desafortunadamente, los anticuerpos generados para estos estudios no serán útiles como anticuerpos TNFa neutralizantes terapéuticos para tratar a pacientes humanos ya que se derivaron de especies no humanas y carecen de la especificidad por TNFa.

[0004] Neutralizar antisueros o mAbs a TNPa han mostrado eficacia en mamíferos no humanos al abrogar eventos patofxsiologicos adversos y evitar la muerte después de ataque letal en endotoxemia experimental . Estos efectos se han demostrado en sistemas de modelos de primates no humanos y roedores. Ver, Beutler B, y colaboradores, 1985 Science, 229: 869; Tracey J, y colaboradores, 1987 Nature, 330: 662; Mathison JC, y colaboradores, 1988J Clin. Invest . , 81: 1925; Shimamoto Y, y colaboradores, 1988, Immunol . Lett . , 17: 311; Opal SM, y colaboradores, 1990, J. Infect. Dis., 161: 1148; Silva AT, y colaboradores, 1990, J. Infect. Dis., 162: 454; Hinshaw LB, y colaboradores, 1990, Cire. Shock, 30: 279.

[0005] Actualmente existen diversas formas de anticuerpos de neutralización y se revisan por Feldman. ver, Feldman M, 2002, Nat . Rev. Immunol., 2: 364. Como se describe en esta revisión, una gran cantidad de esfuerzos se ha dedicado a crear un anticuerpo de neutralización que producirá un anticuerpo terapéuticamente conveniente para administración crónica a humanos. Actualmente, proteínas de fusión anticuerpo/TNFR (fdg/TNFR) (Enbrel) han mostrado cierta utilidad, pero son sometidas a prueba por una corta vida media en el suero, lo que lleva a frecuente administración (por ejemplo dos veces a la semana) de la droga. Un anticuerpo terapéutico de neutralización a TNFa para tratamiento crónico excederá el aspecto de vida media (una inyección por 3-4 semanas) siempre que el propio anticuerpo no fuera inmunogénico . Otros han intentado crear anticuerpos de neutralización a TNFa que tienen las características deseadas de baja/sin inmunogenicidad y una vida media típica de sus contrapartes endógenas sin éxito. Ejemplos de estos anticuerpos incluyen quimeras de ratón/humano, tales como Infliximab (cA2 o Remicade) , y el anticuerpo humanizado CDP571 o Adalimumab (D2E7 o Humira) . Estos intentos representan crear anticuerpos terapéuticos neutralizantes que semejan cercanamente sus contrapartes humanas.

[0006] Desafortunadamente, todo el potencial de estas drogas no puede ser logrado debido a su inherente inmunogenicidad potencial, vida media comprometida y/o reducida avidez/afinidad por TNFa. Las respuestas inmunes de huésped inducidas por estos anticuerpos quiméricos pueden llevar a liberación de los anticuerpos de la circulación y hacer inadecuada una administración repetida para terapia debido a la pérdida de eficacia. Estos problemas finalmente reducen el beneficio terapéutico al paciente. También pueden encontrarse problemas adicionales en ajuste de escala y fabricación, utilizando anticuerpos o sus fragmentos, tales como aquellos anticuerpos mencionados.

[0007] De esta manera, por las razones anteriores, existe necesidad en la técnica por proporcionar una alternativa a pacientes en poblaciones clínicamente indicadas en donde TNFa es responsable por la patofisiologia de una enfermedad particular. Anticuerpos monoclonales de neutralización de alta afinidad, totalmente humanos o sus fragmentos, para administración crónica proporcionan las características deseadas de una opción terapéutica no inmunogénica con una vida media adecuada para administración menos frecuente . COMPENDIO

[0008] Modalidades de la invención se refieren a anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente a Factor de Necrosis Tumoral-a y tienen una región que determina la complementaridad de cadena pesada 1 (CDR1 = chain complementarity determining región 1) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Ser Tyr Asp Met His" . Anticuerpos descritos aquí también pueden incluir una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Val lie Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" , una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Pfre Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val", un amino ácido de cadena pesada que comprende la secuencia de amino ácidos mostrada en SEQ ID NO: 70, y un amino ácido de cadena pesada que comprende la secuencia de amino ácidos mostrada en SEQ ID NO: 74.

[0009] Adicionales modalidades incluyen anticuerpos monoclonales humanos que tienen una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CDR1) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg lie Asp Leu Gly" . Los anticuerpos presentes también pueden incluir una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser", una región para determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Leu Gln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr", un amino ácido de cadena ligera que comprende la secuencia de amino ácidos mostrada en SEQ ID NO: 72.

[0010] En otras modalidades, la invención proporciona anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente al Factor de Necrosis Tumoral-a y comprenden una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1(CDR1) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg lie Asp Leu Gly" , una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser" , y una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Leu Gln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr" .

[0011] Todavía adicionales modalidades incluyen anticuerpos monoclonales humanos que tienen una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 1(CDR1) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Ser Tyr Asp Met His", una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Val lie Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" , y una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val » .

[0012] En otras modalidades, la invención incluye anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente al Factor de Necrosis de Tumor-a e incluyen un gen de cadena pesada VH3-33, o sus variantes conservadoras . Anticuerpos aquí descritos también pueden incluir un gen de cadena ligera A30VK1.

[0013] Adicionales modalidades de la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente el Factor de Necrosis de Tumor-a, en donde los anticuerpos comprenden una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 1 (CD 1) correspondiente a la clase canónica 1. Los anticuerpos aquí proporcionados también pueden incluir una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2) que corresponde a la clase canónica 3, una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CDR1) que corresponde a la clase canónica 2, una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2) que corresponde a la clase canónica 1, y una región para determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3) que corresponde a la clase canónica 1.

[0014] En otras modalidades, la invención proporciona anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente a Factor de Necrosis de Tumor-a e incluyen una región de determinación de complementarxdad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Arg Asn Tyr Met Ser" . Los anticuerpos además pueden incluir una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" , una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr" , y un amino ácido de cadena pesada que tiene la secuencia de amino ácidos mostrada en SEQID NO: 50.

[0015] En adicionales modalidades de la invención, anticuerpos monoclonales humanos pueden incluir una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1(CDR1) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala", una región para determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr", una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Gln Gln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr", y un amino ácido de cadena ligera que comprende la secuencia de amino ácidos mostrada en SEQ ID NO: 52.

[0016] En modalidades aún adicionales, la invención incluye anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente a Factor de Necrosis de Tumor-a y tienen una región de determinación de complementarádad de cadena ligera 1(CD 1) que tiene una secuencia de amino ácido de "Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala" , una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Gly Ala Ser He Arg Ala Thr" , una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Gln Gln Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr", una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Arg Asn Tyr Met Ser" , una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2) que tiene una secuencia amino ácidos de "Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" , y una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3) que tiene una secuencia de amino ácidos de "Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr" .

[0017] En otras modalidades, la invención proporcionar anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente a Factor de Necrosis de Tumor-a y tienen un gen de cadena pesada VH3-53 o su variante conservadora. Los anticuerpos presentes también pueden incluir un gen de cadena ligera L2VK3.

[0018] En modalidades adicionales, la invención incluye anticuerpos monoclonales humanos que ligan específicamente al Factor de Necrosis de Tumor-a, en donde los anticuerpos comprenden una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 1 (CDR1) que corresponde a la clase canónica 1. Los presentes anticuerpos también pueden incluir una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CD 2) que corresponde a la clase canónica 1, una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CDR1) que corresponde a la clase canónica 2, una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2) que corresponde a la clase canónica 1, y una región para determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3) corresponde a la clase canónica 3.

[0019] La invención además proporciona métodos para ensayar el nivel de factor de necrosis de tumor alfa(TNFa) en una muestra de paciente, que comprende contactar un anticuerpo anti-TNFa con una muestra biológica de un paciente y detectar el nivel de enlace entre el anticuerpo y TNFa en la muestra. En más modalidades especificas, la muestra biológica es sangre.

[0020] En otras modalidades, la invención proporciona composiciones que incluyen un anticuerpo o su fragmento f ncional , y un portador f rmacéuticamente aceptable .

[0021] En modalidades aún adicionales de la invención se incluyen métodos para tratar efectivamente un animal que sufre de una enfermedad neoplásica, incluyendo seleccionar un animal que requiere de tratamiento para la enfermedad neoplásica, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal totalmente humano que liga específicamente al factor de necrosis de tumor alfa (TNFa) .

[0022] Enfermedades neoplásicas tratables pueden cáncer de pecho, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer pancreático y cáncer de próstata.

[0023] Adicionales métodos de la invención se refieren a tratar efectivamente una enfermedad inflamatoria inmuno-mediada . Estos métodos incluyen seleccionar un animal que requiere tratamiento para una condición inflamatoria, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal totalmente humano, en donde el anticuerpo liga específ camente a factor de necrosis de tumor alfa (TNFa) . Enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas tratables incluyen artritis reumatoide, glomerulonefritis , aterosclerosis , soriasis, restenosis, enfermedad autoinmune, enfermedad de Crohn, reacciones injerto-huésped, choque séptico, caquexia, anorexia, espondilitis anquilosante y .esclerosis múltiple.

[0024] Modalidades adicionales de la invención incluyen métodos para inhibir apoptosis inducida por factor de necrosis de tumor alfa (TNFa) en un animal. Estos métodos incluyen seleccionar un animal que requiere de tratamiento para apoptosis inducida por TNFa, y administrar al animal una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal totalmente humano, en donde el anticuerpo específicamente liga a TNFa.

[0025] Adicionales modalidades de la invención incluyen el uso de un anticuerpo en la preparación de medicamento para el tratamiento de enfermedad neoplásica en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal liga específicamente a factor de necrosis de tumor (TNFa) . Enfermedades neoplásicas tratables pueden incluir cáncer de pecho, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer pancreático y cáncer de próstata.

[0026] Adicionales usos de los anticuerpos presentes pueden ser para la preparación de un medicamento para el tratamiento efectivo de enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal liga específicamente a factor de necrosis de tumor (TNFa) . Enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas tratables pueden incluir artritis reumatoide, glomerulonefritis , aterosclerosis , soriasis, restenosis, enfermedades autoinmune, enfermedad de Crohn, reacciones inj erto-huésped, choque séptico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple.

[0027] En modalidades aún adicionales, los anticuerpos aquí descritos pueden utilizarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento efectivo de apoptosis inducida por factor de necrosis de tumor en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal liga específicamente al factor de necrosis de tumor (TNFa) .

[0028] Modalidades de la invención aquí descrita se refieren a anticuerpos monoclonales que ligan TNFa y afectan la función de TNFa. Otras modalidades se refieren a anticuerpos anti-TNFa totalmente humanos y preparaciones de anticuerpos anti-TNFa con propiedades deseables de una perspectiva terapéutica, incluyendo fuerte afinidad de enlace para TNFa, la capacidad por neutralizar TNFa in vi tro e in vivo, y la capacidad por inhibir apoptosis inducida por TNFa.

[0029] En una modalidad preferida, los anticuerpos aquí descritos ligan a TNFa con muy altas afinidades (Kd) . Por ejemplo, un anticuerpo humano, de conejo, de ratón, quimérico o humanizado que es capaz de ligar TNFa con una Kd menor que, pero no limitada a, 10~7, 10"8, 10"9, 10"10, 10"11, 10"12, 1CT13 o 10"14 M, o cualquier intervalo o valor ahí. El anticuerpo de conejo R014, aquí descrito, posee una afinidad medida en el intervalo de ÍCT13 (fM) . Se mostró que los anticuerpos 299 V.l y 299 V.2 poseen afinidades en el intervalo 10~13 o bajo 10"12 (M) . Medidas de afinidad y/o avidez pueden medirse por KinExAXMR y/o BIACORER, como se describe aquí .

[0030] De acuerdo esto, una modalidad aquí descrita incluye anticuerpos aislados, o fragmentos de estos anticuerpos, que ligan a TNFa. Como se conoce en la técnica, los anticuerpos pueden ventajosamente ser por ejemplo anticuerpos monoclonales , quiméricos y/o totalmente humanos. Modalidades de la invención aquí descrita también proporcionan células para producir estos anticuerpos .

[0031] Otra modalidad de la invención es un anticuerpo totalmente humano que liga a TNFa y comprende una secuencia de amino ácido de cadena pesada que tiene la región de determinación de complementaridad (CDR = complementarity determining región) con una de las secuencias mostradas en las Tablas 31-34. Se nota que determinaciones de CDR pueden lograrse fácilmente por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ver por ejemplo, Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico) , Quinta Edición, Publicación NIH 91-3242, Bethesda MD

[1991], vols . 1-3.

[0032] Todavía otra modalidad es un anticuerpo que liga a TNFa y comprende una secuencia de amino ácidos de cadena ligera que tiene una CDR que comprende una de las secuencias mostradas en las Tablas 32 y 34. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal totalmente humano .

[0033] Una modalidad adicional es un anticuerpo que liga a TNFa y comprende una secuencia de amino ácidos de cadena pesada que tiene una de las secuencias CDR mostrada en las Tablas 31 y 33 y una secuencia de amino ácidos de cadena ligera que tiene una de las secuencias CDR mostrada en las Tablas 32 y 34. En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

[0034] Otra modalidad de la invención es un anticuerpo totalmente humano que liga a otros miembros de la familia TNFa incluyendo pero no limitados a TNFbeta. Una modalidad adicional aquí es un anticuerpo que compite en forma cruzada para ligar con TNFa con los anticuerpos totalmente humanos de la invención.

[0035] Se apreciará que modalidades de la invención no se limitan a ninguna forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. Por ejemplo, el anticuerpo anti-TNFa puede ser un anticuerpo de longitud íntegra (por ejemplo que tiene una región Fe humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab1 o F(ab')2) . Además, el anticuerpo puede fabricarse a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o de una célula producida en forma xecombinante que se ha transformado o transíectado con un gen o genes que codifican el anticuerpo.

[0036] Otras modalidades de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican cualquiera de los anticuerpos aquí descritos, vectores que tienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican anticuerpos anti-TNFa o una célula huésped transformada con cualquiera de estas moléculas de ácido nucleico. Además, una modalidad de la invención es un método para producir un anticuerpo anti-TNFa al cultivar células huésped ba o condiciones en donde una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo seguido por recuperación del anticuerpo.

[0037] Una modalidad adicional presente incluye un método para producir anticuerpos de alta afinidad a TNFa al inmunizar un mamífero con TNFa humano o su fragmento y una o más secuencias ortólogas o sus fragmentos .

[0038] Otras modalidades se basan en la generación e identificación de anticuerpos aislados que ligan específicamente a TNFa. TNFa se expresa a niveles elevados en enfermedades neoplásicas, tales como tumores y otras enfermedades inflamatorias . La inhibición de la actividad biológica de TNFa puede evitar la inflamación y otros efectos deseados, incluyendo apoptosis inducida por TNFa.

[0039] Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnosticar enfermedades o condiciones en donde un anticuerpo preparado como aquí se describe, se utiliza para detectar el nivel de TNFa en una muestra de paciente. En una modalidad, la muestra de paciente es sangre o suero de sangre. En modalidades adicionales, se presentan métodos para identificación de factores de riesgo, diagnóstico de enfermedad y las fases de esa enfermedad, que involucran la identificación de la sobre-expresión de TNFa utilizando anticuerpos anti-TNFa.

[0040] Otra modalidad de la invención incluye un método para diagnosticar una condición asociada con expresión de TNFa en una célula al contactar la célula con un anticuerpo anti-TNFa, y posteriormente detectar la presencia de TNFa. Condiciones preferidas incluyen pero no están limitadas a enfermedades neoplásicas incluyendo sin limitación, tumores, cánceres, tales como cáncer de pecho o de ovarios, de estómago, de endometrio, de glándula salival, de pulmón, de riñon, de colon, colorectal, tiroide, pancreático, de próstata y de vejiga. En otra modalidad, un anticuerpo anti-TNFa puede utilizarse para diagnosticar una condición inflamatoria incluyendo pero no limitada a aterosclerosis , restenosis, enfermedad autoinmune, enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas (IMIDs) incluyendo pero no limitadas a artritis reumatoide, soriasis, uveitis (por ejemplo, infantil y seronegativa) , lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunes tales como penfigus y glomerulonefritis , hipertiroidismo congénito (CH) , hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) tal como hipersensibilidad de contacto, sarcoidosis, enfermedad de Behcet, artritis crónica, artritis psoriácica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Still en adulto, enfermedad de Sjógren primaria, escleroderma, arteritis de células gigantes, síndrome de SAPHO, cirrosis biliar primaria (PBC = primary biliary cirrhosis) , sarcoidosis, síndromes mielodisplásticos , síndrome de Wegener y otras vasculitis, malignidades hematológicas , desórdenes cocleovestibulares , síndrome de activación de macrófagos, asma, enfermedad de pulmón intersticial, Hepatitis C, fibrosis pulmonar, inducción de ovulación, síndromes mielodisplásticos, enfermedad de Crohn, reacciones de injerto-huésped, choque séptico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. Otras condiciones de pueden diagnosticar los anticuerpos se describen en la patente de los E.U.A. No. 6,090,382 otorgada a Salfeld y colaboradores, y en la patente de los E.U.A. No. 5,436,154 otorgada a Barbanti, y colaboradores.

[0041] En otra modalidad, la invención incluye un equipo de ensayo para detectar TNFa y miembros de la familia de TNFa en tejidos de mamíferos o células para supervisar enfermedades neoplásicas o condiciones inflamatorias . El equipo incluye un anticuerpo que liga a TNFa y medios para indicar la reacción del anticuerpo con TNFa, de estar presente. De preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En una modalidad, el anticuerpo que liga a TNFa está etiquetado. En otra modalidad, el anticuerpo es un primer anticuerpo no etiquetado y el equipo además incluye medios para detectar el primer anticuerpo. En una modalidad, los medios incluyen un segundo anticuerpo etiquetado que es una anti-inmunoglobulina . De preferencia, el anticuerpo se etiqueta con un marcador seleccionado del grupo que consiste de un fluorocromo, una enzima, un radioníclido y un material radiopaco.

[0042] Otras modalidades de la invención incluyen composiciones farmacéuticas que tienen una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-TNFa en mezcla con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Todavía en otras modalidades, el anticuerpo anti-TNFa o su fragmento, se conjuga con un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser por ejemplo una toxina o un radioisótopo. De preferencia, estos anticuerpos pueden emplearse para tratamiento de enfermedades, incluyendo por ejemplo tumores, cánceres, tales como cáncer de pecho, de ovarios, de estómago, de endometrio, de glándula salival, de pulmón, de riñon, de colon, colorectal, tiroide, pancreático, de próstata y de vejiga, así como otras condiciones inflamatorias incluyendo pero no limitadas a aterosclerosis, restenosis, enfermedad autoinmune, enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas (IMIDs) incluyendo pero no limitadas a artritis reumatoide, soriasis, uveitis (por ejemplo infantil y seronegativa) , lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunes tales como penfigus y glomerulonefritis , hipertiroidismo congénito (CH) , hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) tales como hipersensibilidad de contacto, sarcoidosis, enfermedad de Be cet, artritis crónica, artritis soriácica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Still en adulto, enfermedad de Sjogren primaria, escleroderma, arteritis de célula gigante, síndrome de SAPHO, cirrosis biliar primaria (PBC) , sarcoidosis, síndromes mielodisplásticos , síndromes de Wegener y otros vasculitis, malignidades hematológicas , desórdenes cocleovestibulares, síndrome de activación macrófago, asma, enfermedad de pulmón intersticial, Hepatitis C, fibrosis pulmonar, síndromes mielodisplásicos de inducción de ovulación, enfermedad de Crohn, reacciones de injerto-huésped, choque séptico, caquexia, anorexia, y esclerosis múltiple. Otras condiciones que pueden tratar los anticuerpos se describen en la patente de los E.U.A. No. 6,090,382 otorgada a Salfeld y colaboradores, y la patente de los E.U.A. No. 5,435,154 otorgada a Barbanti, y colaboradores .

[0043] Todavía otra modalidad incluye métodos para tratar enfermedades o condiciones asociadas con la expresión de TNFa en un paciente, al administrar al paciente una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-TNFa . El método puede realizarse in vivo y el paciente de preferencia es un paciente humano . En una modalidad preferida, el método se refiere al tratamiento de tumores, tumores, cánceres, tales como cáncer de pecho, de ovarios, de estómago, de endometrio, glándula salival, de pulmón, de riñon, de colon, colorectal, tiroide, pancréatico, próstata y de vejiga. Todavía en otra modalidad, la condición inflamatoria incluye pero no está limitada a aterosclerosis , restenosis, enfermedad autoinmune, enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas (IMlDs) incluyendo pero no limitadas a artritis reumatoide, soriasis, uveitis (por ejemplo, infantil y seronegativa) , lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunes tales como penfigus y glomerulonefritis , ipertiroidismo congénito (CH) , hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) tal como hipersensibilidad de contacto, sarcoidosis, enfermedad Behcet, artritis crónica, artritis soriácica, espondilitis alquilosante, enfermedad de Still en adulto, enfermedad de Sjógren primaria, escleroderma, arteritis de células gigantes, síndrome de SAPHO, cirrosis biliar primaria (PBC) , sarcoidosis, síndromes mielodisplásicos, síndrome de Wegener y otras vasculitis, malignidades hematológicas , desórdenes cocleovestxbulares, síndromes de activación de macrófago, asma, enfermedad de pulmón intersticial, Hepatitis C, fibrosis pulmonar, inducción de ovulación, síndromes mielodisplásticos , enfermedad de Crohn, reacciones de injerto-huésped, choque séptico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. Otras condiciones que pueden tratar los anticuerpos se describen en la patente de los E.U.A. No. 6, 090,382 otorgada a Salfeld y colaboradores, y en la patente de los E.U.A. No. 5,436,154 otorgada a Barbanti, y colaboradores .

[0044] En otra modalidad, la invención proporciona un artículo de manufactura que incluye un recipiente . El recipiente incluye una composición que contiene un anticuerpo anti-TNFa, un inserto de paquete o etiqueta que indica que la composición puede utilizarse para tratar enfermedades neoplásica o inflamatoria caracterizada por sobreexpresion de TNFa.

[0045] En algunas modalidades, el anticuerpo anti-TNFa se administra a un paciente, seguido por administración de un agente de liberación para retirar el anticuerpo que circula en exceso de la sangre .

[0046] En algunas modalidades, los anticuerpos anti-TNFa pueden modificarse para mejorar su capacidad para fijar complemento y participar en citotoxicidad dependiente de complemento (CDC = complement-dependent cytotoxicity) . En una modalidad, pueden modificarse anticuerpos anti-TNFa tales como por substitución de amino ácidos, para alterar su liberación del cuerpo. En forma alterna, algunas otras substituciones de amino ácidos pueden frenar la liberación del anticuerpo del cuerpo .

[0047] Otra modalidad adicional es el uso de un anticuerpo anti-TNFa en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades tales como enfermedades neoplásicas y condiciones inflamatorias . En una modalidad, las enfermedades neoplásicas incluyen tumores y cánceres, tales como de pecho, de ovarios, de estómago, endometrio, glándula salivares, de pulmón, de riñon, de colon, colorectal, tiroides, pancréatico, de próstata y de vejiga. En otra modalidad, la condición inflamatoria incluye, pero no está limitada a, aterosclerosis , restenosis, enfermedad autoinmune, enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas (IMIDs) incluyendo pero no limitadas a artritis reumatoide, psoriasis, uveitis (por ejemplo, infantil y seronegativa) , lupus y otras enfermedades mediadas por complejos inmunes tales como penfigus y glomerulonefritis , hipertiroidismo congénito (CH) , hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) tales como hipersensibilidad de contacto, sarcoidosis, enfermedad de Behcet, artritis crónica, artritis soriácica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Still en adulto, enfermedad de Sjógren primaria, escleroderma, arteritis de células gigantes, síndrome SAPHO, cirrosis biliar primaria (PBC) , sarcoidosis, síndromes mielodisplásicos , síndrome de Wegener y otras vasculitis, malignidades ematológicas, desordenes cocleovestibular, síndrome de activación de macrófago, asma, enfermedad pulmonar intersticial, Hepatitis C, fibrosis pulmonar, inducción de ovulación, síndromes mielodisplásicos, enfermedad de Crohn, reacciones de injerto-huésped, choque séptico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. Otras condiciones que pueden tratar los anticuerpos se describen en la patente de los E.U.A. No. 6,090,382 otorgada a Salfeld y colaboradores, y en la patente de los E.U.A. No. 5,436,154 otorgada a Barbanti y colaboradores . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0048] La Figura 1 es una gráfica de barras que ilustra el efecto que diversos anticuerpos de enlace anti-TNFa humanos, derivados de hibridoma tienen al neutralizar apoptosis de células inducida por TNFa en células WM 266 de humanos. La gráfica muestra actividad de caspasa como una medida de apoptosis inducida por TNFa.

[0049] La Figura 2 es una gráfica de puntos que compara el enlace de antxgeno limitado de anti-TNFa entre anticuerpos en sobrenadantes de cultivo de células B al de un anticuerpo de control (4.17 IgG2) sobre un intervalo de concentración. Los triángulos representan los ciónos sobrenadantes de cultivo de células B, y los bloques representan Anticuerpo Bar (4.17 IgG2) . Ciónos sobrenadantes de cultivo de célula B con puntos sobre la curva de anticuerpo de barras, están en rango porque tienen afinidad potencialmente superior.

[0050] La Figura 3 es una gráfica de barras representativa que compara la efectividad de diversos sobrenadantes de cultivo de células B XENOMAXMR, para inhibir la apoptosis de células inducidas por TNFa en células MCF-7 humanas.

[0051] La Figura 4 es una gráfica de puntos representativa, que muestra comparaciones de potencia calculada para neutralización de apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas por sobrenadantes de cultivo de células B XENOMAXMR. Los triángulos representan la potencia de sobrenadantes de cultivo de células B, mientras que los cuadrados representan la potencia de un control de barra, 3.2 JgG2.

[0052] La Figura 5 es una gráfica de líneas de reactivos anti-TNF que ligan TNF humano soluble expresado por E. coli por ELISA.

[0053] La Figura 6 es una gráfica de lineas de reactivos anti-TNF que ligan y realizan reacción cruzada con TNF de simio macaco cynomolgus soluble expresado E. coli por ELISA.

[0054] La Figura 7 es una gráfica de líneas representativa que muestra un ejemplo de curvas de titulación de anticuerpo anti-TNFa de neutralización utilizadas para generar valores IC50. Reactivos anti-TNFa se pre-incubaron con 100 pg/ml de TNFa por 1 hora a 37 grados C. La neutralización se ensayó utilizando células MCF-7 y detectó como una proporción de yoduro de propidio y tinción Heochst 33342.

[0055] La Figura 8 es una gráfica de líneas representativa que muestra un ejemplo de curvas de titulación de reactivos anti-TNFa de neutralización utilizadas para generar valores IC50. Anticuerpos anti-TNFa se pre-incubaron con 100 pg/ml de TNFa por 18 horas a 37 grados C. Se ensayó la neutralización utilizando células MCF-7 y detectó como una proporción de yoduro de propidio y tinción de Heochst 33342.

[0056] La Figura 9 es una gráfica de barras que muestra los valores IC50 promedio para neutralización anti-TNFa. Los cálculos de neutralización e ICS0 se realizaron como se describe en la breve descripción de la Figura 8. [0057 ] La Figura 10 es una gráfica de barras que muestra los valores ICS0 promedio para neutralización anti-TNFa. Se realizó neutralización en células de WM266 humano y la actividad de caspasa se midió como una indicación de apoptosis inducida por TNFa. Cálculos ICS0 de anticuerpo se realizaron como se describe en la breve descripción de la Figura 7.

[0058] La Figura 11 es una gráfica de lineas que representa un ensayo de sangre íntegra para inhibición de inducción de IL-8 por TNF, medida por ELISA. Se emplearon curvas de titulación para generar valores IC50. [ 0059] La Figura 12 es una gráfica de líneas representativa de la inhibición in-vivo de falla hepática inducida por TNFa utilizando reactivos anti-TNF. Lesión al hígado inducida por TNFa y D-GaIN se estimó al medir actividades de enzimas de suero de alanina aminotransferasa (ALT) . Se emplearon curvas de titulación para generar valores IC50. [ 0060] La Figura 13 es una gráfica de línea representativa de la inhibición in-vivo de IL-6 inducido por TNFa utilizando reactivos anti-TNF y medido por ELISA . Se emplearon curvas de titulación para generar valores ICS0.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0061] Modalidades de la invención aquí descritas se refieren a anticuerpos monoclonales que ligan a TNFa. En algunas modalidades, los anticuerpos ligan a TNFa y afectan la función de TNFa. Otras modalidades proporcionan anticuerpos anti-TNFa humanos completos y preparaciones de anticuerpos anti-TNFa con propiedades convenientes desde una perspectiva terapéutica, incluyendo fuerte afinidad de enlace para TNFa, la capacidad por neutralizar TNFa in vitro, la capacidad por inhibir lesión hepática inducida por TNFa in vivo, y la capacidad por inhibir producción de IL-6 inducida por TNFa in vivo.

[0062] De acuerdo con esto, modalidades de la invención incluyen anticuerpos aislados, o fragmentos de esos anticuerpos, que ligan a TNFa. Como se conoce en la técnica, los anticuerpos pueden ser ventajosamente anticuerpos monoclonales totalmente humanos. Modalidades de la invención también proporcionan células para producir estos anticuerpos.

[0063] Además, modalidades de la invención permiten utilizar estos anticuerpos como una herramienta de diagnóstico o para tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, modalidades de la invención proporcionan métodos y anticuerpos para inhibir expresión de TNFa asociada con enfermedades infecciosas, desórdenes inmunes, patologías autoinmunes, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) , neoplasia, caquexia asociada con cáncer, sepsis gram negativa, choque endotóxido, enfermedad de Crohn, y artritis reumatoide. De preferencia, los anticuerpos se emplean para tratar cánceres, tales como de pecho, de ovarios, de estómago, de endometrio, de glándula salivar, de pulmón, de riñon, de colon, colorectal, tiroide, pancreático, próstata y de vejiga, así como otras condiciones inflamatorias, incluyendo pero no limitadas a artritis reumatoide, glomerulonef itis , aterosclerosis , soriasis, trasplantes de órganos, restenosis y enfermedades autoinmunes . En asociación con dicho tratamiento, artículos de manufactura incluyen anticuerpos como se describe aquí se proporcionan. Adicionalmente , un equipo de ensayo que anticuerpos como se describe aquí se proporciona para supervisar tumores y condiciones inflamatorias .

[0064] Adicionalmente, los ácidos nucleicos aquí descritos y fragmentos y variantes de los mismos, pueden emplearse a manera de ejemplo no limitante, (a) para dirigir la biosíntesis de las proteínas correspondientes codificadas, polipéptidos , fragmentos y variantes como productos de genes recom inantes o heterólogos, (b) como sondas para detección y cuantificación de los ácidos nucleicos aquí descritos, (c) como plantillas de secuencia para preparar moléculas antimensajero y semejantes. Estos usos se describen más completamente en la siguiente descripción.

[0065] Aún más, las proteínas y polipéptidos aquí descritos, y sus fragmentos y variantes, pueden emplearse en formas que incluyen (a) servir como un inmunogeno para estimular la producción de un anticuerpo anti-TNFa, (b) un antígeno de captura en un ensayo inmunogénico para dicho anticuerpo, (c) como un blanco para supervisión de substancias que ligan a un polipéptido TNFa aquí descrito, y (d) un objetivo o blanco para un anticuerpo específico de TNFa, tal que el tratamiento con el anticuerpo afecta la función molecular y/o celular mediada por el blanco.

[0066] Adicionales modalidades, características y semejantes respecto a los anticuerpos anti-TNFa se proporcionan en detalle adicional a continuación. Listado de Secuencia

[0067] Las secuencias de amino ácidos y nucleótido región variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos anti-TNFa humanos representativos, se proporcionan en el listado de secuencia, los contenidos de los cuales se resumen en la Tabla 1 a continuación . (1) Tabla 1 mAb ID Secuenci SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucieótidos que 1 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 2 coditica la región variable de la cadena pesada 2 Secuencia de amino ácidos que 3 coditica la región variable de cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 4 coditica la región variable de cadena ligera Secuencia de nucieótidos que 5 15 coditica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 6 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 7 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 8 coditica la región variable de cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 9 coditica la región variable de la cadena pesada secuencia de amino ácidos que 10 coditica la región variable de la cadena pesada 5 Secuencia de nucleótidos que 11 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 12 coditica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 13 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 14 coditica la región variable de la cadena pesada 28 Secuencia de nucleótidos que 15 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 16 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 17 0k/69g coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 18 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 19 coditica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 20 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 21 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 22 coditica la región variable de la cadena pesada 95 Secuencia de nucleótidos que 23 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 24 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 25 123 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 26 coditica la región variable de la cadena pesada mA ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 27 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 28 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 29 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 30 coditica la región variable de la cadena pesada 131 Secuencia de nucleótidos que 31 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 32 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 33 145/140g coditica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 34 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 35 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 36 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 37 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 38 coditica la región variable de la cadena pesada 148 Secuencia de nucleótidos que 39 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 40 codifica la región variable de la cadena ligera rnAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 41 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 42 codifica la región variable de la cadena pesada 234 Secuencia de nucleótidos que 43 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 44 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 45 250 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 46 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 47 codifica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 48 codifica ia región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 49 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 50 coditica la región variable de la cadena pesada 263 Secuencia de nucleótidos que 51 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 52 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 53 269 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 54 codifica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 55 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 56 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 57 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 58 codifica la variable de la cadena pesada 280 Secuencia de nucleótidos que 59 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 60 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 61 282 codifica la región variable de la cadena pesada itiAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de amino ácidos que 62 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 63 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 64 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 65 codilica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 66 codifica la región variable de la cadena pesada 291 Secuencia de nucleótidos que 67 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 68 codifica la región variable de la cadena ligera, mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 69 codilica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 70 codifica la región variable de la cadena pesada 299 i Secuencia de nucleótidos que 71 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 72 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 73 299v2 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 74 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 71 coditica la región variable de la cadena ligera itlAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de amino ácidos que 72 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 75 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 76 coditica la región variable de la cadena pesada 313 Secuencia de nucleótidos que 77 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 78 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 79 R014 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácido que 80 coditica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 81 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 82 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 83 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácido que 84 coditica la región variable de la cadena pesada 1.1 Secuencia de nucleótidos que 85 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácxdos que 86 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 87 2.1 coditica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 88 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 89 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 90 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 91 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 92 coditica la región variable de la cadena pesada 2.2 Secuencia de nucleótidos secuencia 93 que coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 94 coditica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 95 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 96 coditica la región variable de la cadena pesada 2.3 Secuencia de nucleótidos que 97 coditica la región variable la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 98 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 99 2.4 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 100 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 101 coditica la región variable de la cadena ligera itiAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de amino ácidos que 102 coditica ia región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 103 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 104 coditica la región variable de la cadena pesada 2.5 Secuencia de nucleótidos secuencia 105 que coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 106 coditica la región variable de ia cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 107 2.6 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 108 coditica la región the variable región ot tñe de la cadena pesada chain itiAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de nucleótidos secuencia 109 que codifica ia región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 110 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 111 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 112 codilica la región variable de la cadena pesada 2.7 Secuencia de nucleótidos que 113 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 114 codilica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 115 2.8 codifica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 116 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 117 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 118 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 119 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia amino que codifica la 120 región variable de la cadena pesada 2.9 Secuencia de nucleótidos que 121 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 122 codifica la región variable la cadena ligera iriAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 123 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 124 codifica la región variable de la 2.10 cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 125 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia amino que codifica la 126 región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 127 2.13 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 128 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 129 codifica la región variable de la cadena ligera iriAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de amino ácidos que 130 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 131 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 132 codifica la región variable de la cadena pesada 2.14 Secuencia de nucleótidos que 133 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 134 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 135 2.15 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 136 codifica la región variable de la cadena pesada iriAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de nucleótidos que 137 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 138 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 139 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 140 coditica la región variable de la cadena pesada 2.16 Secuencia de nucleótidos que 141 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 142 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 143 2.17 coditica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 144 coditica ia región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 145 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 146 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 147 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de. amino ácidos que 148 coditica la región variable de la cadena pesada 2.18 Secuencia de nucleótidos que 149 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 150 coditica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 151 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 152 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 153 coditica la región variable de la cadena ligera lambda 2.19 Secuencia de amino ácidos que 154 coditica la región variable de la cadena ligera lambda Secuencia de nucleótidos que 155 coditica la región variable de la cadena ligera kappa Secuencia de amino ácidos que 156 coditica la región variable de cadena ligera kappa Secuencia de nucleótidos que 157 2.21 coditica la región variable de la cadena pesada itlAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de amino ácidos que 158 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 159 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 160 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 161 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 162 codifica la región variable de la cadena pesada 3.1 Secuencia de nucleótidos que 163 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 164 codifica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 165 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 166 coditica la región variable de la cadena pesada 3.2 Secuencia de nucleótidos que 167 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 168 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 169 3.4 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 170 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 171 codifica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 172 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 173 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 174 codiiica la región variable de la cadena pesada 3.5 Secuencia de nucleótidos que 175 codiiica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 176 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 177 3.6 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 178 codiiica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 179 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 180 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 181 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 182 codifica la región variable de la cadena pesada 3.8 Secuencia de nucleótidos que 183 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 184 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 185 3.9 codifica la región variable de la cadena pesada mft.b ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 186 codifica ia región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 187 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 188 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 189 codilica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 190 codilica la región variable de la cadena pesada 4.3 Secuencia de nucleótidos que 191 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 192 codilica la región variable de ia cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 193 codi±ica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 194 codifica la región variable de la cadena pesada 4.4 Secuencia de nucleótidos que 195 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 196 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 197 4.7 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 198 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 199 codifica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 200 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 201 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 202 codifica la región variable de la cadena pesada 4.8 Secuencia de nucleótidos que 203 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 204 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 205 4.9 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 206 codifica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 207 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 208 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 209 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 210 codifica la región variable de la 4.10 cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 211 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 212 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 213 4.11 codifica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 214 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucieótidos que 215 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 216 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucieótidos que 217 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 218 codifica la región variable de la cadena pesada 4.12 Secuencia de nucieótidos que 219 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 220 coditica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 221 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 222 codifica la región variable de la cadena pesada 4.13 Secuencia de nucleótidos que 223 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 224 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 225 4.14 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 226 codifica la región variable la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 227 codifica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 228 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 229 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 230 codifica la región variable de la cadena pesada 4.15 Secuencia de nucleótidos que 231 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 232 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 233 4.16 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 234 coditica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 235 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 236 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 237 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 238 codifica la región variable de la cadena pesada 4.17 Secuencia de nucleótidos que 239 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 240 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 241 4.18 codifica la región variable de la cadena pesada irtAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de amino ácidos que 242 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 243 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 244 codilica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 245 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 246 codifica la región variable de la cadena pesada 4.19 Secuencia de nucleótidos que 247 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 248 codifica la región variable de la cadena ligera itiAb ID Secuencia SEQ ID NO : No . : Secuencia de nucleótidos que 249 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 250 coditica la región variable de la cadena pesada 4.20 Secuencia de nucleótidos que 251 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 252 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 253 4.21 coditica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 254 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 255 codifica la región variable de la cadena ligera mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de amino ácidos que 256 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 257 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 258 coditica la región variable de la 4.22 cadena pesada Secuencia de nucleótidos que 259 coditica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 260 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de nucleótidos que 261 4.23 codifica la región variable de la cadena pesada Secuencia de amino ácidos que 262 coditica la región variable de la cadena pesada mAb ID Secuencia SEQ ID NO: No. : Secuencia de nucleótidos que 263 codifica la región variable de la cadena ligera Secuencia de amino ácidos que 264 codifica la región variable de la cadena ligera Definiciones

[0068] A menos de que de otra forma se definan, los términos científicos y técnicos aquí empleados tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Además, a menos que de otra forma se requiera por el contexto, términos en singular deberán incluir pluralidades y términos plurales deberán incluir los singulares . En general, las nomenclaturas se utilizan en conexión con y las técnicas de cultivo de células y de tejido, biología molecular y química de proteínas y oligo- o poli nucleótidos e hibridización aquí descritas son aquellas bien conocidas y comúnmente empleadas en la especialidad. Técnicas estándar se emplean paras ADN recombinante , síntesis de oligo nucleótidos y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo electroporación, lipofección) .

Técnicas de purificación y reacciones enzimáticas se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la especialidad o como se describe aquí . Las anteriores técnicas y procedimientos en general se realizan de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más especificas que se citan y discuten a través de la presente especificación. Ver por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio) (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ) . Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química de medicina y farmacéutica aquí descritas son aquellos bien conocidas y comúnmente empleadas en la especialidad. Técnicas estándar se emplean para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes .

[0069] Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos a menos de que de otra forma se indiquen, se entenderá que tengan los siguientes significados :

[0070] El término "TNFa" se refiere a la citoquina, a Factor de Necrosis de Tumor-alfa (Pennica, D. y colaboradores, 1984, Nature 312: 724-729). TNFa también se conoce en la técnica como cachectina.

[0071] El término "neutralización" cuando se refiere a un anticuerpo, se refiere a la capacidad del anticuerpo para eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antigeno objetivo al cual se liga. De acuerdo con esto, un anticuerpo anti-TNFa de "neutralización" es capaz de eliminar o reducir significativamente una función efectora, tal como actividad TNFa.

[0072] El término "polinucleótido aislado" como se emplea aquí, habrá de significar un polinucleótido de origen genómico, cADN o sintético o alguna combinación de estos, que por virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no se asocia con todo o una porción de un polinucleótido en donde el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) se enlaza operativamente con un polinucleótido que no está enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

[0073] El término "proteína aislada" como se refiere aquí significa una proteína de cADN, ARN recombinante o de origen sintético o alguna combinación de estos, que por virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteina aislada" (1) no está asociada con proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de diferente especie, o (4) no ocurre en la naturaleza .

[0074] El término "polipéptido" se emplea aquí como un término genérico para referirse a una proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos . Por lo tanto, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies del género de polipéptidos . Polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como moléculas anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y vice versa, así como sus fragmentos y análogos.

[0075] El término "de origen natural" como se emplea aquí, al ser aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por los humanos en el laboratorio o de otra forma, es de origen natural .

[0076] El término "enlazado operativamente" como se emplea aquí, se refiere a posiciones de componentes descritos de manera tal que estén en relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Por ejemplo, una secuencia de control "enlazada operativamente" a una secuencia de codificación se conecta de manera tal que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control .

[0077] El término "secuencia de control" como se emplea aqui, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales se conectan. La naturaleza de estas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control en general incluyen promotor, sitio de enlace ribosomal y secuencia de terminación de transcripción; en eucariotas, en general dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción.

El término "secuencias de control" se pretende que incluya como mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para expresión y procesamiento y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo secuencias líder y secuencias de socios de fusión.

[0078] El término "polinucleótido" como se refiere aquí, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o deoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de una sola y doble hebra de ADN.

[0079] El término "oligonucleótido" referido aquí incluye a nucleótidos de origen natural y modificados enlazados en conjunto por enlaces oligonucleótidos de origen natural y de origen no natural. Oligonucleótidos son un sub-conjunto de polinucleótido que generalmente comprende una longitud de 200 bases o menos. De preferencia, oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y más preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos usualmente son de una sola hebra, por ejemplo para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble hebra, por ejemplo para uso en la construcción de un gen mutante. Oligonucleótidos ya pueden ser oligonucleótidos mensajero o anti-sentido.

[0080] El término aquí referido "nucleótidos de origen natural" incluye deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleótidos modificados" aquí referido incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o substituidos y semejantes. El término "enlaces oligonucleótido" aquí referido, incluye enlaces oligonucleótido tales como fósforotioato, fósforoditioato, fósforoselenoato, fósforodiselenoato, fósforoanilotioato, fósforoaniladato, fósforoamidato y semejantes. Ver por ejemplo, LaPlanche y colaboradores, Nucí. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein y colaboradores, Nucí. Acids Rea. 16:3209 (1988); Zon y colaboradores, Anti -Cáncer Drug Design (Diseño de Drogas Anticáncer) 6:539 (1991) ; Zon y colaboradores, Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach (Oligonucleótidos y Análogos: Un Enfoque Práctico) , p . 87-108 (F. Eckstein, Ed. , Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec y colaboradores, en la patente de los E.U.A. No. 5,151,510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990) . Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para detección, si se desea.

[0081] El término "hibridización selectiva" se refiere aquí a medios para ligar en forma detectable y específica. Polinucleótidos, oligonucleótidos y sus fragmentos hibridizan selectivamente a hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridización y lavado que minimizan cantidades apreciables de enlace detectable con ácidos nucleicos no específicos. Pueden emplearse condiciones altamente severas para lograr condiciones de hibridización selectivas como se conoce en la técnica y discute aquí. En general, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos o fragmentos de anticuerpo y una secuencia de ácidos nucleicos de interés será cuando menos 80%, y más típicamente de preferencia con homologías crecientes de al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%.

[0082] Dos secuencias de amino ácidos son "homologas" si hay identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que 85% de los amino ácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para máxima correspondencia. Se dejan espacios (en cualquiera de las dos secuencias que se acoplan) para llevar al máximo la correspondencia; longitudes de espacio de 5 o menos se prefieren con 2 o menos más preferido. En forma alterna y preferible, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivado de estas de al menos aproximadamente 30 amino ácidos de longitud) son homologas como se usa este término, si tienen una calificación de alineamiento de cuando más 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando este programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalidad de espacio de 6 o mayor. Ver Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure (Atlas de Secuencia y Estructura de Proteínas) , pp . 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (Fundación de Investigación Bioquímica Nacional) (1972)) y Suplemento 2 a este volumen, p . 1-10. Las dos secuencias o sus partes son más preferiblemente homologas si sus amino ácidos son mayores que o iguales a 50% idénticos cuando se alinean en forma óptima utilizando el programa ALIGN.

[0083] El término "corresponde a" se emplea aquí para significar que una secuencia de polinucleótidos es homologa (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada en evolución) a todo o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos sea idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia.

[0084] En distinción por contraste, el término "complementario a" se emplea aquí para significar que la secuencia complementaria es homologa a todo o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA" .

[0085] Los siguientes términos se emplean para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótidos o amino ácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "por ciento de identidad de secuencia" y "substancial identidad". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, empleada como base para una comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo como un segmento de un cADN de longitud integra o secuencia de gen dada en un listado de secuencia o puede comprender un cADN completo o secuencia de gen. En general, una secuencia de referencia es cuando menos de 18 nucleótidos o 6 amino ácidos de longitud, f ecuentemente al menos 24 nucleótidos u 8 amino ácidos de longitud, y a menudo al menos 48 nucleótidos o 16 amino ácidos de longitud. Ya que dos secuencias de polinucleótidos o amino ácidos pueden cada una (1) comprender una secuencia (es decir una porción de la secuencia de polinucleótido o amino ácido completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) además puede comprender una secuencia que es divergente entre dos secuencias de polinucleótidos o amino ácidos, típicamente se realizan comparaciones de secuencia entre dos (o más) moléculas al comparar secuencias de las dos moléculas sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similaridad de secuencia. Una "ventana de comparación" como se emplea aquí, se refiere a un segmento conceptual de al menos aproximadamente 18 posiciones de nucleótido contiguas o aproximadamente 6 amino ácidos en donde la secuencia de polinucleótidos o secuencia de amino ácidos se compara con una secuencia de referencia de cuando menos 18 nucleótidos contiguos o secuencia de 6 amino ácidos y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede incluir adiciones, eliminaciones, substituciones, y semejantes (es decir espacios) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. Alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch J". Mol.

Biol . 48:443 (1970), por investigación del método de similaridad de Pearson y Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, PASTA, y TFASTA en el programa Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), paquetes de soporte lógico GENEWORKS" o MACVECTOR* ) , o por inspección y se elige el mejor alineamiento (es decir, que resulta en el por ciento más alto de homología sobre la ventana de comparación) generado por los diversos métodos .

[0086] El término "identidad de secuencia" significa que las dos secuencias de polinucleótidos o amino ácidos son idénticas (es decir, en una base de nucleótido-por-nucleótido o residuo-por-residuo) sobre la ventana de comparación. El término "por ciento de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias alineadas en forma óptima sobre la ventana de comparación, determinar el número de posiciones en las cuales el residuo base de ácido nucleico idéntico (por ejemplo, A, T, C, G, U o l) o amino ácido ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones correspondientes, dividir el número de posiciones correspondientes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicar el resultado por 100 para dar el por ciento de identidad de secuencia. Los términos "identidad substancial" como se emplea aquí, denota una característica de una secuencia de polinucleótidos o amino ácidos, en donde el polinucleótido o amino ácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia cuando menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más preferible al menos 99 por ciento de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 amino ácidos) , frecuentemente sobre una ventana de al menos 24-48 nucleótidos (8-6 amino ácidos) de posiciones, en donde el por ciento de identidad de secuencia se calcula al comparar la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir eliminaciones o adiciones que totalizan 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia frente a la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un sub-conjunto de una secuencia más grande.

[0087] Como se emplea aquí, los veinte amino ácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Inmmunology - A Synthesis (Inmunología - Una Síntesis) (2a Edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds . , Sinauer Associates, Sunderland, Mass (1991)).

Estereoisómeros (por ejemplo D-amino ácidos) de los veinte amino ácidos convencionales, amino ácidos no naturales tales como amino ácidos alfa, alfa-disubstituidos, N- alquil amino ácidos, ácido láctico y otros amino ácidos no convencionales, también pueden ser componentes convenientes para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de amino ácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, épsilon-N,N,N-trimetil-lisina, épsilon-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, delta-N-metilarginina, y otros amino ácidos e imino ácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina) . En la notación de polipéptido aquí empleada, la dirección a mano izquierda es la dirección amino terminal y la dirección a mano derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con uso y convención estándar.

[0088] Similarmente, a menos de que de otra forma se especifique, la secuencia de polinucleótidos de extremo a mano izquierda o de una sola hebra es el extremo 51 ; la dirección a mano izquierda de las secuencias polinucleotido de doble hebra se refiere como la dirección 51. La dirección de adición 5 ' a 31 de transcripciones ARN nacientes, se refiere como la dirección de transcripción; regiones de secuencia en la hebra ADN tienen la misma secuencia que ARN y que están 5 ' al extremo 51 de la transcripción de ARN, se refieren como "secuencias corriente arriba", regiones de secuencia en la hebra ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que son 3 ' al extremo 3 ' de la transcripción ARN, se refieren como "secuencias corriente abajo".

[0089] Como se aplica a polipéptidos , el término "identidad substancial" significa que dos secuencias péptido, cuando se alinean en forma óptima, tales como por los programas GAP o BESTFIT utilizando las ponderaciones o pesos de separación pre-definidas , comparten cuando menos 80 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferible al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y más preferible al menos 99 por ciento de identidad de secuencia. De preferencia, posiciones de residuo que no son idénticas difieren por substituciones de amino ácido conservadores. Substituciones de amino ácido conservadores se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales hidroxil alifático es serina y treonina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de amino ácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de substitución de amino ácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina .

[0090] Como se discute aquí, variaciones menores en las secuencias de amino ácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, se contemplan abarcadas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de amino ácidos mantengan cuando menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, 90%, 95% y en particular 99% de identidad de secuencia a los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina aquí descritas. En particular, se contemplan reemplazos de amino ácidos conservadores . Reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de amino ácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Amino ácidos genéticamente codificados en general se dividen en familias: (1) acídico=aspartato, glutamato; (2) básico=lisina, arginina, histidina; (3) ñopo!ar=alaniña, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar sin carga=glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias más preferidas son: serina y treonina como una familia hidroxi-alif tica; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptofano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un amino ácido con un amino ácido estructuralmente relacionado, no tenga un efecto substancial en la función de enlace o propiedades de la molécula resultante, en especial si el reemplazo no involucra un amino ácido dentro de un sitio de marco. Ya sea que un cambio en amino ácido resulta en un péptido funcional puede determinarse fácilmente al ensayar la actividad específica del derivado polipéptido. Se describen ensayos en detalle aquí . Fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos ocurren cerca de fronteras de dominios funcionales. Dominios estructurales y funcionales pueden ser identificados por comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o amino ácidos en bases de datos de secuencia públicas o de propiedad. De preferencia, métodos de comparación computarizados se emplean para identificar motivos de identidad de secuencia o dominios de conformación de proteína pronosticada que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tri-dimensional conocida, se conocen. Bowie y colaboradores, Science 253:164 (1991). De esta manera, los ejemplos anteriores demuestran que aquellos con destreza en la especialidad pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden emplearse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con los anticuerpos aquí descritos .

[0091] Sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de enlace para formar complejos de proteína, (4) alteran la afinidad de enlace y (4) confieren o modifican otras propiedades físico químicas o funcionales de estos análogos. Análogos pueden incluir diversas mute nas de una secuencia diferente a la secuencia de péptidos de origen natural. Por ejemplo, sustituciones de aminoácidos sencillas o múltiples (de preferencia sustituciones de aminoácidos conservadores) pueden realizarse en la secuencia de origen natural (de preferencia en la porción del polipéptido fuera del o los dominios que forman los contactos intermoleculares . Una sustitución de aminoácidos conservadores no deberá cambiar substancialmente las características estructurales de la secuencia padre (por ejemplo un amino ácido de reemplazo no deberá tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia padre, o romper otros tipos de estructuras secundarias que caracterizan a la secuencia padre) . Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la especialidad se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Proteínas, estructuras y principios moleculares) (Creighton, Ed. , W. H. Ereeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (Introducción a estructura de proteínas) (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); y Thornton y colaboradores Nature 354:105 (1991) .

[0092] El término "fragmento polipéptido" como se emplea aquí, se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación terminal carboxi y/o terminal amino pero en donde la secuencia de amino ácidos restante es idéntica con las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural reducida, por ejemplo de una secuencia cADN de longitud íntegra. Fragmentos típicamente son al menos de 5, 6, 8, 10 aminoácidos de largo, de preferencia al menos 14 aminoácidos de largo, más preferiblemente cuando menos 20 aminoácidos de largo, nsualmente al menos 50 aminoácidos de largo y aún más preferible cuando menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" como se emplea aguí, se refiere a polipéptidos que están constituidos de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos reducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades : (1) enlace específico a un TNFa, bajo condiciones de enlace convenientes, (2) capacidad de bloquear enlace TNFa apropiado, o (3) habilidad por inhibir actividad al TNFa. Típicamente, análogos polipéptidos comprenden una sustitución de aminoácidos conservadores (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia de eje natural. Análogos típicamente son de al menos 20 aminoácidos de largo, de preferencia cuando menos 50 amino ácidos de largo o más largos, y a menudo pueden ser tan largos como un polipéptido de origen natural de longitud íntegra.

[0093] Análogos péptidos se emplean comúnmente en la industria farmacéutica como drogas no péptido, con propiedades análogas a aquellas del péptido plantilla. Estos tipos de compuestos no péptido se denominan "péptidomiméticos " o "péptido miméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); "Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); and Evans y col. J. Med. Chem. 30:1229 (1987) . Estos compuestos a menudo se desarrollan con el auxilio de modelación molecular computarizada. Los péptidomiméticos que son estructuralmente similares a péptido terapéuticamente útiles pueden emplearse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los péptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica (tal como el cuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces péptido reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste de ~-CH2NH-^, --CH2S--, - -CH2-CH2-- , --CH=CH-- (cis y trans) , --C0CH2--, - -CH (OH) CH2- - , y -CH2S0--, los métodos bien conocidos en la especialidad. Una sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo D-lisina en lugar de L-lisina) puede emplearse para generar más péptido estables. Además, péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso substancraímente idéntica, pueden generarse por métodos conocidos en la especialidad (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992); por ejemplo por adición de residuo cisterna internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido.

[0094] "Anticuerpo" o "péptido (s) anticuerpo" se refieren a un anticuerpo intacto, o a su fragmento de enlace, que compite con el anticuerpo intacto para enlace especifico. Fragmentos de enlace se producen por técnicas de ADN recombinante , o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos . Fragmentos de enlace incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, y anticuerpos de una sola cadena. Un anticuerpo diferente a un anticuerpo "biespecífico " o "bifuncional " se entiende que tiene cada uno de sus sitios de enlace idénticos . Un anticuerpo substancialmente inhibe la adhesión del receptor con un contra receptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor ligado al contra receptor por al menos aproximadamente 20%, 40%, 60% o 80%, y más usualmente mayor que aproximadamente 85% (como se mide en un ensayo de enlace competitivo in vi tro) .

[0095] El término "epítope" incluye cualquier determinante de proteina capaz de enlace específico con una inmunoglobulina o receptor de célula T. Determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos químicamente de superficie activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Un anticuerpo se elige que liga específicamente un antígeno cuando la constante de disociación es _< 1 µ?, de preferencia < 100 nM y más preferiblemente ^ 10 nM.

[0096] El término "agente" se emplea aquí para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macro molécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos .

[0097] "Activo" o "actividad" respecto a un polipeptido TNFa se refiere a una porción de un polipeptido TNFa que tiene actividad biológica o inmunológica de un polipeptido TNFa nativo. "Biológico" como se emplea aquí, se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipeptido TNFa nativo. Una actividad biológica TNFa preferida incluye por ejemplo apoptosis inducida por TNFa.

[0098] "Mamífero" cuando se emplea aquí, se refiere a cualquier animal que se considere mamífero. De preferencia, el mamífero es un humano.

[0099] La digestión de anticuerpos con la enzima papaína, resulta en dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, conocidos como fragmentos "Fab" y un fragmento "Fe" que no tiene actividad de enlace de antígeno pero tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, resulta en el fragmento F(ab')2 en donde los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen enlazados y comprenden dos sitios de enlace de antígeno. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad por entrelazar el antígeno.

[0100] "Fv" cuando se emplea aquí, se refiere a un fragmento mínimo de un tipo que retiene tanto sitios de reconocimiento de antígeno como sitios de enlace de antígeno .

[0101] "Fab" como se emplea aquí, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

[0102] El término "mAb" se refiere anticuerpo monoclonal .

[0103] La descripción de la secuencia de anticuerpo XENOMAX® se codifica como sigue: "AB"-se refiere a anticuerpo, "TNFa"- se refiere a especificidad del anticuerpo, "X" se refiere a derivado de XENOMOUSE®, "Gl"- se refiere a isotipo IgGl o "G2" se refiere al isotipo IgG2 , los últimos tres dígitos se refieren al numero de células sencillas del cual se derivó el anticuerpo, por ejemplo: AB-TNFa-XGl-015.

[0104] El término "SC" se refiere una sola célula y un anticuerpo derivado de XENOMAX® particular puede referirse a un SC seguido por tres dígitos o solo tres dígitos, con referencia al número de una sola célula del cual se deriva aquí el anticuerpo.

[0105] La descripción de secuencias de anticuerpo derivadas de hibridoma se codifica como sigue: "AB"- se refiere a anticuerpo, "TNFa"- se refiere a especificidad de enlace de anticuerpo, "X" se refiere a derivado de XENOMOUSE®, "Gl"- se refiere a isotipo IgGl o "G2" se refiere a isotipo IgG2, "K" se refiere a kappa, "L" se refiere a lambda, los últimos tres dígitos se refieren al clon del cual se derivó el anticuerpo, por ejemplo: AB-TNFa-XG2K-4.17.

[0106] "Liposoma" cuando se utiliza aquí, se refiere a una pequeña vesícula que puede ser útil para administro de drogas que puede incluir el polipéptido TNFa de la invención o anticuerpos de este polipéptido TNFa a un mamífero.

[0107] "Etiqueta" o "etiquetado" como se emplea aquí se refiere a la adición de una porción detectable a un polipéptido, por ejemplo una radio etiqueta, etiqueta fluorescente, quimio luminiscente de etiqueta enzimática, etiquetado o un grupo biotinilo. Radioisótopos o radionúclidos pueden incluir 3H, 14C, 1SN, 35S, 90Y, "Te, 11:LIn, 1 5I, 131I, etiquetas fluorescentes pueden incluir drogamina, lantamida, fósforos o FITC y etiquetas enzimáticas pueden incluir peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina .

[0108] El término "agente o droga farmacéutica" como se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos de química se utilizan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica por el Dictionary oí Chemical Terms (El diccionario de Ed McGraw-Hill de Términos Químicos) (Parker, S., Ed. , McGraw-Hill, San Francisco (1985) ) .

[0109] Como se emplea aquí, 11 substancialmente puro" significan una especie de objeto es la especie predominante presente (es decir en una base molar, es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y de preferencia una fracción substancialmente purificada es una composición en donde la especie de objeto comprende al menos aproximadamente 50% (en una base molar) adecuada a las especies macro moleculares presentes. En general, una composición substancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80% de todas las especies macro moleculares presentes en la composición, más preferible más de aproximadamente 85%, 90%, 95%, y 99%. M s preferiblemente, las especies objeto se purifican a homogeneidad esencial (especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una sola especie macro molecular.

[0110] El término "paciente" incluye sujetos humanos y veterinarios .

[0111] El término " SLAM® " se refiere al "Método de anticuerpo de linfocito selecto" (Selected Lymphocyte Antibody Method" (Babcook y colaboradores, (Babcook y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, i93:7843-7848 (1996), y Schrader, Patente de los E.U.A. No. 5, 627, 052) .

[0112] El término "XENOMAX® " se refiere al uso del "Método de anticuerpo de linfocito selecto" (Selected Lymphocyte Antibody Method" (Babcook y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sel. USA, i93 : 7843-7848 (1996), cuando se utiliza con animales XENOMOUSE®. Estructura de Anticuerpo

[0113] La unidad estructural de anticuerpo básica, se conoce que comprende tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadena polipéptido, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos primordialmente responsables por reconocimiento de antígeno. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante primordialmente responsable por la función efectora. Cadenas ligeras humanas se clasifican como las cadenas ligeras kappa y lambda. Cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo de anticuerpo como Ig , IgD, IgA, y IgE, respectivamente. En cadenas ligeras y pesadas, la región es variable y constante se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye la región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Ver en general, Fundamental Immunology (Inmunología Fundamental) capitulo 7 (Paul, . , ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de enlace de anticuerpo .

[0114] De esta manera, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de enlace. Excepto en anticuerpos disfuncionales o muy específicos, los dos sitios de enlace son los mismos .

[0115] Las cadenas todas exhiben la misma estructura general de regiones de bastidor (FR framework regions) conservadas en forma relativa unidas por tres regiones hiper variables, también denominadas regiones determinantes de complementa idad o CDRs . Las CDRs de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones de bastidor, permitiendo enlace a un epitope especifico. De N-terminal a C-terminal, ambas cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR . La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteíns of Immunological Interest (Secuencias de Proteína de Interés Inmunológico) (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), or Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia y colaboradores Tlature 342:878-883 (1989) .

[0116] Un anticuerpo biespecifico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de enlace diferentes . Anticuerpos biespecíficos pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridoma o enlace de fragmento Fab1. Ver por ejemplo Songsivilai y Lachmann Clin. Exp . Immunol . 79:315-321 (1990), Kostelny y colaboradores J". Immunol. 148:1547-1553 (1992) . La producción de anticuerpos biespecificos pueden ser un proceso relativamente intenso en mano de obra en comparación con una producción de anticuerpos convencionales y rendimientos y grado de pureza en general son menores para anticuerpos biespecificos . Anticuerpos biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tienen un solo sitio de enlace (por ejemplo, Fab, Fab', y Fv) . Anticuerpos Humanos y Humanización de Anticuerpos

[0117] Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones murina o de rata variables y/o constantes. La presencia de estas proteínas derivadas de rata o murinas puede llevar a la liberación rápida de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente . A fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de rata o murinos, pueden generarse anticuerpos totalmente humanos a través de la introducción de la función de anticuerpo humano en un roedor, de manera tal que el roedor produzca anticuerpos totalmente humanos .

[0118] Un método para generar anticuerpos totalmente humanos es a través del uso de cepas XENOMOUSE® de ratones que se han sometido a ingeniería para contener fragmentos de configuración de línea germinal con tamaño de 245 kb y 190 kb del sitio de cadena pesada de humano y sitio de cadena ligera kappa. Ver Green y colaboradores Nature Genetics 7:13-21 (1994). Las cepas XENOMOUSE® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) .

[0119] La producción de XENOMOUSE® se discute adicionalmente y delinea en las solicitudes de Patente de los E.U.A. No. de Serie 07/466,008, presentada en enero 12, 1990, 07/610,515, presentada en noviembre 8, 1990, 07/919,297, presentada en julio 24, 1992, 07/922,649, presentada en julio 30, 1932, presentada en 08/031,801, presentada en marzo 15, 1993, 08/112,848, presentada en agosto 27, 1993, 08/234,145, presentada en abril 28, 1994, 08/376,279, presentada en enero 20, 1995, 08/430,938, presentada en abril 27, 1995, 08/464,584, presentada en junio 5, 1995, 08/464,582, presentada en junio 5, 1995, 08/463,191, presentada en junio 5, 1995, 08/462,837, presentada en junio 5, 1995, 08/486,853, presentada en junio 5, 1995, 08/485,857, presentada en junio 5, 1995, 08/486,859, presentada en junio 5, 1995, 08/462,513, presentada en junio 5, 1995, 08/724,752, presentada en octubre 2, 1996, y 08/759,620, presentada en diciembre 3, 1996 y en las Patentes de los E.U.A. Nos. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, y 5,939,598 y las Patentes Japonesas Nos. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, y 3 068 507 B2. Ver también Méndez y colaboradores Naiure Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) . Ver también la Patente Europea No. EP 0 463 151 Bl, otorgamiento publicado en junio 12, 1996, Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/02602, publicada en febrero 3, 1994, Solicitud de Patente Internacional No. WO 96/34096, publicada en octubre 31, 1996, WO 98/24893, publicada en junio 11, 1998, WO 00/76310, publicada en diciembre 21, 2000. La descripción de cada una de las anteriormente citadas patentes, solicitudes

[0120] En un enfoque alterno, otros incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque "minisitio" . En el enfoque minisitio, un sitio iG exógeno se imita a través de la inclusión de piezas (génesis individuales) del sitio Ig. De esta manera, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) , se forman en una construcción para inserción en un animal . Este enfogue se describe en la Patente de los E.U.A. No. 5,545,807 otorgada a Surani y colaboradores y en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, y 6,255,458 otorgadas cada una a Lonberg y Kay, las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,591,669 y 6,023,010 otorgadas a Krimpenfort y Berns, las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,612,205, 5,721,367, y 5,789,215 otorgadas a Berns y colaboradores, y la Patente de los E.U.A. No. 5,643,763 otorgada a Choi y Dunn, y las solicitudes de patente de los E.U.A. de GenPharm No. de Serie 07/574,748, presentada en agosto 29, 1990, 07/575,962, presentada en agosto 31, 1990, 07/810,279, presentada en diciembre 17, 1991, 07/853,408, presentada en marzo 18, 1992, 07/904,068, presentada en junio 23, 1992, 07/990,860, presentada en diciembre 16, 1992, 08/053,131, presentada en abril 26, 1993, 08/096,762, presentada en julio 22, 1993, 08/155,301, presentada en noviembre 18, 1993, 08/161,739, presentada en diciembre 3, 1993, 08/165,699, presentada en diciembre 10, 1993, 08/209,741, presentada en marzo 9, 1994. Ver también la Patente Europea No. 0 546 073 Bl, las solicitudes de patente internacionales Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, O 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, W096/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y la Patente de los E.U.A. No. 5,981,175. Ver ademas Taylor y colaboradores, 1992, Chen y colaboradores, 1993, Tuaillon y colaboradores, 1993, Choi y colaboradores, 1993, Lonberg y colaboradores 1., (1994), Taylor y colaboradores, (1994) , y Tuaillon y colaboradores, (1995) , Fishwild y colaboradores, (1996) .

[0121] Kirin también ha demostrado que la generación de anticuerpos humanos de ratones en los que, a través de fusión de micro células, grandes piezas de cromosomas o cromosomas completos se han introducido. Ver las solicitudes de patente Europeas Nos. 773 288 y 843 961.

[0122] Respuestas de anticuerpo anti-ratón humano (HMA = Human anti-mouse antibody) han llevado a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o de otra forma humanizados. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina, se espera que ciertas respuestas de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA = human anti-chimeric antibody) serán observadas, particularmente en utilizaciones crónicas o de múltiples dosis del anticuerpo. De esta manera, sería conveniente el proporcionar anticuerpos totalmente humanos contra TNFa a fin de iniciar consideraciones y/o efectos de la respuesta HAMA o HACA . Terapéuticos de Anticuerpo

[0123] Como se discute aquí, la función del anticuerpo TFNa parece importante cuando menos una porción de su modo de operación. Por función, se entiende, a manera de ejemplo, la actividad del anticuerpo TNFa en operación con TNFa. De acuerdo con esto, en ciertos aspectos, puede ser conveniente en conexión con la generación de anticuerpos como candidatos terapéuticos contra TNFa, que los anticuerpos sean capaces de fijar complemento y participar en CDC. Hay una cantidad de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo sin limitación los siguientes: IgM murino, IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 murino, IgM humano, IgGl humano, e IgG3 humano. Se apreciará que los anticuerpos que se generan, no requieren poseer inicialmente dicho isotipo sino más bien, el anticuerpo como se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede ser conmutado de isotipo posteriormente utilizando técnicas convencionales que son bien conocidas en la especialidad. Estas técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 4,816,397), técnicas de fusión célula-célula (ver por ejemplo las patentes de los E.U.A. Nos. 5,916,771 y 6,207,418), entre otras.

[0124] En la técnica de fusión célula-célula, un mieloma u otra línea celular se prepara, que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y otro mieloma u otra linea celular se prepara, que posea la cadena ligera. Estas células, posteriormente pueden fusionarse y una línea celular que expresa un anticuerpo intacto puede ser expresada.

[0125] A manera de ejemplo, el anticuerpo TNFa discutido aquí es un anticuerpo anti-TNFa lgG2 humano. Dicho anticuerpo que posee el enlace deseado a la molécula TNFa, puede ser conmutado fácilmente de isotipo para generar un IgM, humano, IgGl, o isotipo TgG3 humano mientras que aún posee la misma región variable (que define la especificidad de anticuerpo y algo de su afinidad) . Dicha molécula luego será capaz de fijar el complemento y participar en CDC .

[0126] De acuerdo con esto, conforme se generan cantidades de anticuerpo que satisfacen atributos "estructurales" deseados como se discutió anteriormente, en general puede proporcionarse con al menos ciertos de los atributos "funcionales" deseados a través de conmutación de isotipo. Diseño y Generación de Otros Terapéuticos

[0127] De acuerdo con la presente invención y con base en la actividad de los anticuerpos que se producen y caracterizan aquí con respecto a TNFa, se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de porciones de anticuerpo. Dichas modalidades incluyen, sin limitación, terapéuticos de anticuerpo avanzados, tales como anticuerpos bi-específieos, inmuno toxinas y terapéuticos radio etiquetados, generación de terapéuticos de péptido, terapias de genes, particularmente intra cuerpos, terapéuticos anti mensajero y pequeñas moléculas.

[0128] En conexión con la generación de terapéuticos de anticuerpos avanzados, en donde la fijación de complemento es un atributo deseable, puede ser posible el hacer a un lado la dependencia de complemento para exterminar células a través del uso de biespecificos , inmunotoxinas y radio etiquetas, por ej emplo .

[0129] Por ejemplo, en conexión con anticuerpos biespecificos , pueden generarse anticuerpos biespecificos que comprenden (i) dos anticuerpos uno con una especificidad a TNFa y otro con una segunda molécula que se conjugan en conjunto, (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena específica a TNFa y una segunda cadena específica a una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de una sola cadena que tiene especificidad a TNFa y la otra molécula. Estos anticuerpos biespecíficos pueden generarse utilizando técnicas que son bien conocidos; por ejemplo en conexión con (i) y (ii) ver por e emplo, Fanger y claboradores Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, arriba y en conexión con (iii) ver por ejemplo, Traunecker y colaboradores, Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992) . En cada caso, la segunda especificidad puede hacerse a los receptores de activación de cadena pesada, incluyendo sin limitación CD16 o CD64 (ver por ejemplo, Deo y colaboradores, 18:127 (1997)) o CD89 (ver por ejemplo, Valerius y colaboradores, Blood 90:4485-4492 (1997)) . Anticuerpos biespecíficos preparados de acuerdo con lo anterior probablemente exterminarán células que expresan TNFa.

[0130] En conexión con inmunotoxinas , pueden modificarse anticuerpos para actuar como inmunotoxinas utilizando técnicas que son bien conocidas en la especialidad. Ver por ejemplo Vitetta Immunol Today 14:252 (1993) . Ver por ejemplo también la Patente de los E.U.A. No. 5,194,594. En conexión con la preparación de anticuerpos radio etiquetados estos anticuerpos modificados también pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en la especialidad. Ver por ejemplo Junghans y colaboradores, in Cáncer Chemotherapy and Biotherapy (Quimioterapia y Bioterapia de Cáncer) 655-686 (2d edición, Chafner and Longo, eds . , Lippincott aven (1996) ) . Ver también las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, y 5,697,902. Cada una de las inmunotoxinas y moléculas radio etiquetadas probablemente exterminarán células que expresan TWFa. Preparación de Anticuerpos

[0131] Anticuerpos, como se describe aquí, se preparan a través de la utilización de la tecnología XENOMOUSE® como se describe a continuación. Estos ratones, luego son capaces de producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina humana y son deficientes en la producción de moléculas de anticuerpos de inmunoglobulina murina. Tecnologías utilizadas para lograr lo mismo se describen en las patentes y solicitudes y referencias descritas en la presente sección de antecedentes. En particular sin embargo, una modalidad preferida de producción transgenxca de ratones de anticuerpos se describen en la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 08/759,620, presentada en diciembre 3, 1996 y en las solicitudes de Patente Internacionales Nos. WO 98/24893, publicado en junio 11, 1998 y WO 00/76310, publicada en diciembre 21, 2000. Ver también Méndez y colaboradores, IVature Genetics 15:146-156 (1997) .

[0132] A través del uso de esta tecnología, anticuerpos monoclonales totalmente humanos a una variedad de antigenos de han producido. Esencialmente, líneas XENOMOUSE® de ratones se inmunizan con un antígeno de interés (por ejemplo TNFa) , células linfáticas (tales como células B) se recuperan de los ratones que expresan anticuerpos, y las líneas celulares recuperadas se fusionan a una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Estas líneas celulares de hibridoma se supervisan y eligen para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos al antígeno de interés . Aquí se proporcionan métodos para fusión de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos a TNFa. Aún más, que se proporciona caracterización de los anticuerpos producidos por dichas líneas celulares, incluyendo análisis de secuencia de nucleotidos de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de estos anticuerpos .

[0133] En forma alterna, en lugar de estar fusionadas a células de mieloma para generar mielomas, las células recuperadas, aisladas de las líneas de ratones XENOMOUSE® inmunizadas, se supervisan más para reactividad contra el antígeno inicial, de preferencia proteina TNFa. Esta supervisión incluye ELISA con proteina TNFa, un ensayo de competencia con anticuerpos conocidos que ligan el antigeno de interés, desnaturalización in vitro de apoptosis inducida por TNFa y enlace in vitro a células CHO transfectadas en forma transitoria que expresan TNFa de longitud integra. Células B sencillas que secretan anticuerpos de interés luego se aislan utilizando un ensayo de placa hemolítica especifica del TNFa (Babcook y colaboradores, Proc. Nati.

Acad. Sci. USA, ±93 : 7843-7848 (1996)). De preferencia células blanco para lisis son células de glóbulos rojos de oveja (SRBCs = sheep red blood cells) revestidas con antigeno TNFa. En la presencia de un cultivo de células B que secretan la inmunoglobulina de interés y complemento, la formación de una placa indica lisis mediada por TNFa específica de las células objetivo. Las células de plasma especificadas de antígeno sencillas en el centro de la placa pueden aislarse y la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo se aisla de la célula de plasma sencilla. Utilizando PCR transcriptasa inversa, el ADN que codifica la reacción variable del anticuerpo secretado puede ser clonado. Este ADN clonado luego puede ser insertado adicionalmente en un vector de expresión conveniente, de preferencia un cartucho de vector tal como un ADNpc, más preferiblemente dicho vector de ADNpc que contiene los dominios constantes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina . El vector generado no puede ser transfectado en células huésped, de preferencia células CHO y cultivado en medio nutriente convencional como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Aquí, se describe el aislamiento de múltiples células de plasma sencillas que producen anticuerpos específicos a TNFa. Además, el material genético que codifica la especificidad del anticuerpo anti-TNFa se aisla, e introduce en un vector de expresión conveniente que luego se transfecta en células huésped.

[0134] En general, anticuerpos producidos por las líneas anulares anteriormente mencionadas que poseen cadenas pesadas IgGl o IgG2 totalmente humanas con cadenas ligeras kappa humana. Los anticuerpos poseen altas afinidades, típicamente poseen Kd's desde aproximadamente 10'9 a aproximadamente 1CT13 M, cuando se mide ya sea por la fase sólida y fase de solución.

[0135] Como se apreciará, anticuerpos anti-TNFa pueden expresarse en líneas celulares diferentes a líneas celulares de hibridomas . Secuencias que codifican anticuerpos particulares pueden utilizarse para transformación de una célula huésped de mamífero conveniente. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo por ejemplo empacar el polinucleótido en un virus (en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector) o por procedimientos de transfeccion conocidos en la especialidad, como se ejemplifica por las patentes de los E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, y 4,959,455. El procedimiento de transformación empleado depende del huésped a transformar. Métodos para introducir polinucleótidos heterologos en células de mamíferos son bien conocidos en la especialidad e incluye transfeccion mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polibreno, fusión de protoplasto, eletroporacion, encapsulacion del o los polinucleótidos en liposomas y micro inyección directa de ADN en núcleos .

[0136] Líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC = American Type Culture Collection) , incluyendo pero no limitados a o en células de ovario de hámster chino (CHO = Chínese hámster ovary) células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK = baby hámster kidney) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2) , y una cantidad de otras líneas celulares. Líneas celulares de preferencia particular se eligen a través de determinar que líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de enlace TNFa consecutivas .

[0137] Anticuerpos anti-TNFa son útiles en la detección de TNFa en muestras de pacientes y de acuerdo con esto son útiles como diagnóstico para estado de enfermedad como se describe aquí. Además, con base en su capacidad para entrelazar en forma significante la actividad de TNFa (como se muestra en los ejemplos a continuación) anticuerpos anti-TNFa tendrán efectos terapéuticos para tratar síntomas y condiciones que resultan de TNFa. En modalidades específicas, los anticuerpos y métodos presentes se refieren al tratamiento de síntomas que resultan de TNFa incluyendo: fiebre, dolor muscular, letargía, dolor de cabeza, náusea e inflamación. Adicionales modalidades, involucran el utilizar los anticuerpos y métodos aquí descritos para tratar: caquexia, anorexia, enfermedades reumáticas tales artritis, enfermedades inflamatorias tales como enfermedad de Crohn y enfermedades auto inmunes tales como soriasis, rechazo de injerto-huésped y choque séptico . Administración Terapéutica y Formulaciones

[0138] Anticuerpos TNFa biológicamente efectivos como se describe aquí, pueden emplearse en una preparación o formulación farmacéutica estéril para reducir el nivel de TNFa en suero, de esta manera tratando efectivamente condiciones patológicas en donde, por ejemplo TNFa en suero es anormalmente elevado. Anticuerpos anti-TNFa de preferencia poseen afinidad adecuada para suprimir potencialmente TNFa dentro del intervalo terapéutico objetivo, y de preferencia tienen una duración adecuada de acción para permitir dosificación infrecuente. Una duración prolongada de acción permitirá programas de dosificación menos frecuente y más convenientes por rutas parenterales alternas tales como inyección intramuscular o subcutánea.

[0139] Cuando se utiliza para administración in vivo, la formulación de anticuerpo debe ser estéril. Esto se logra fácilmente por ejemplo por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de liofilización y reconstitución. El anticuerpo ordinariamente se almacenará en forma liofilizada o en solución. Composiciones de anticuerpo terapéuticas en general se colocan en un recipiente que tiene una compuerta de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o ampolleta que tiene un adaptador que permite recuperación de la formulación, tal como un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

[0140] La ruta de administración de anticuerpo de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral , intramuscular, intraocular, intraarterial, intratecal, por inhalación o intralesion, o por sistemas de liberación sostenida, como se anota a continuación. El anticuerpo de preferencia se administra continuamente por infusión o por inyección de bolo.

[0141] Una cantidad efectiva de anticuerpo a emplearse terapéuticamente, dependerá por ejemplo de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración y la condición del paciente. De acuerdo con esto, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la ruta de administración según se requiere para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el medico administrará anticuerpo hasta que se alcance la dosis que logre el efecto deseado . El avance de esta terapia se supervisa fácilmente por ensayos convencionales o por los ensayos aquí descritos .

[0142] Anticuerpos como se describe aquí, pueden prepararse en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable . Esta composición terapéutica puede ser administrada intravenosamente o a través de la nariz o el pulmón, de preferencia como un aerosol en polvo (liofilizado) o líquido. La composición también puede ser administrada parenteralmente o subcutáneamente según se desee. Guando se administra sistémicamente, la composición terapéutica deberá ser estéril , libre de pirógenos y una solución parenteralmente aceptable que tiene debida consideración para pH, y su tonicidad y estabilidad. Estas condiciones se conocen por aquellos con destreza en la especialidad. Brevemente, formulaciones de dosificación de los compuestos aquí descritos se preparan para almacenamiento o administración por mezclado de un compuesto que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes y estabilizantes fisiológicamente aceptables. Estos materiales no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen amortiguadores tales como TRIS HC1, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menos que aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas tales como albúmina de suero, gelatina, o immunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidinona; amino ácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar, alcoholes tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como surfactantes de sodio y/o no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol .

[0143] Composiciones estériles para inyección pueden formularse de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional como se describe en Rernington: The Science and Pracíice of Pharmacy (Ciencia y Práctica de Farmacia) (20th edición, Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)). Por ejemplo disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal de origen natural como ajonjolí, cacahuate o semillas de algodón o un vehículo graso sintético como etil oleato o semejantes, puede ser deseable. Amortiguadores, conservadores, antioxidantes y semejantes pueden incorporarse de acuerdo con la práctica farmacéutica aceptada.

[0144] Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, estas matrices están en la forma de artículos o micro cápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por Langer y colaboradores, J". Biomed Mater. Res., (1981) 15:157-277 y Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o poli (vinilalcohol ) ) , polilactidas (Patente de los E.U.A. No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y colaboradores, Biopolymers, (Biopolímeros) (1983) 22:547-556) , etilen-vinil acetato no degradable (Langer y colaboradores, arriba) , copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON Depot™ (micro esferas inyectables compuestas por ácido láctico, ácido glicólico y leuprolido acetato) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988).

[0145] Mientras que polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico ácido glicólico permiten liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos . Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo por largo tiempo, pueden desnaturalizarse y agregarse como resultado de exposición a humedad a 37 grados C, resultando en pérdida de actividad biológica y cambios posibles en inmunogenicidad . Estrategias racionales pueden diseñarse para solubilizacion de proteínas dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es formación de enlace S-S intermoleculares a través de intercambio disulfuro, puede lograrse estabilización al modificar residuos sulfhidrilo, y utilizar a partir de soluciones acídicas, controlar el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz de polímeros específicas.

[0146] Composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendido en formulaciones convenientes capaces de mantener cristales en suspensión. Estas preparaciones, cuando se inyectan subcutánea o intraperitonealmente pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos atrapados liposomalmente . Liposomas que contienen dichos anticuerpos se preparan por métodos conocidos per se: Patente de los E.U.A. No. DE 3,218,121; Epstein y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; H ang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de los E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324.

[0147] La dosis de la formulación de anticuerpo por un paciente en particular, se determinará por el médico a cargo tomando en consideración factores varios conocidos que modifican la acción de drogas incluyendo la severidad y tipo de la enfermedad, pero corporal, sexo, dieta, hora y ruta de administración, otros medicamentos y otras factores clínicos relevantes. Dosis terapéuticamente efectivas pueden determinarse ya sea por métodos in vi tro o in vivo.

[0148] Una cantidad efectiva de los anticuerpos, aquí descritos, a emplearse terapéuticamente, dependerá por ejemplo de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración y condición del paciente. De acuerdo con esto, se prefiere que el terapeuta titule la dosis y modifique la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.001 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Típicamente, el clínico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. El avance de esta terapia se supervisa fácilmente por ensayos convencionales o como se describe aquí .

[0149] Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con las composiciones y métodos presenten se administrarán con portadores excipientes de otros agentes convenientes que se incorporan en las formulaciones para proporcionar mejorada transferencia, suministro, tolerancia y semejantes. Estas formulaciones incluyen por ejemplo polvo, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin™) , conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite-enagua y agua-en-aceite, emulsiones de Carbowax (polietilen glicoles de diversos pesos moleculares) , geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores pueden ser apropiadas en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y sea tolerable con la ruta de administración. Ver también Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development : the need for preclinical guidance" (Desarrollo de excipientes farmacéuticos: la necesidad por guía pre-química) Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), ang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals" (Liofilizacion y desarrollo de productos farmacéuticos con proteínas sólidas) Int. J. Pharm. 203 (1-2) : 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts" (Lípidos, drogas lipofilicas y suministro de droga oral-en músculos conceptos emergentes) J Pharm Sci. 89(8) :967-78 (2000) , Powell y colaboradores, "Compendium of excipients for parenteral formulations" (Compendio de excipientes para formulaciones parenterales) PDA J" Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas a i para información adicional referentes a formulaciones de excipientes y portadores bien conocidos para los químicos farmacéuticos .

[0150] Se espera que los anticuerpos aquí descritos tendrán efecto terapéutico en el tratamiento de síntomas y condiciones que resultan de TNFa. En modalidades especificas, los anticuerpos y métodos presentes se refieren al tratamiento de síntomas que resultan de TNFa incluyendo: fiebre, dolor muscular, letargía, dolor de cabeza, náusea e inflamación. Adicionales modalidades involucran y utilizan los anticuerpos y métodos aquí descritos para tratar: cachexia, anorexia, enfermedades reumáticas tales como artritis, enfermedades inflamatorias tales como enfermedad de Crohn, enfermedades auto-inmunes, tales como soriasis, reacciones de injerto-huésped y choque séptico . EJEMPLOS

[0151] Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y resultados doblados, se proporcionan para propósitos administrativos solamente y no habrán de considerarse como limitante antes las presentes enseñanzas . EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE AN ÍGENO Preparación de Antigeno TNFa-KLH para Inmunización de Animales XENOMOUSE®

[0152] TNFa humano recombinante se obtiene de R&D Systems (Minneapolis , M Cat . No. 210-TA/CF) . El antigeno TNFa-KLH empleado en la inmunización de animales XENOMOUSE®, se preparan como sigue: TNF-alfa humano (200 g) (R&D) se mezcla con 50 Fg de hemocianina de erizo de mar (KLH; Pierce, Rockford, IL) a un volumen final de 165 µL utilizando agua destilada. 250 RI de amortiguadores de conjugación (0.1M MES, 0.9M NaCl, pH 4.7) se agrega y TNFa y KLH se entrelazan por la adición de 25 ¿ÍL de 10 mg/mL de solución de hidrocloruro de l-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, Pierce, Rockford, IL) . El conjugado se incuba por 2 horas a temperatura ambiente y el EDC sin reaccionar se retira por centrifugación a través de un filtro de 1 kDa (Centrifugal filter; Millipore, Bedford, MA) utilizando PBS pH 7.4. Preparación de Antígeno TNFa-TCE para Inmunización de Animales XENOMOUSE®

[0153] TNFa humano se genera en forma recombinante como una proteína de fusión en bastidor o marco con un epítope de célula T universal T-cell (TCE) (J. Immunol 1992 148(5) :1499) para Inmunización de Animales XENOMOUSE®.

[0154] TNFa humano se clona a partir de células mononucleares periféricas humanas (PBMCs) . ARNm (mRNA) se aisla de hPBMC 1 s purificado y cADN se genera por transcripción inversa. TNFa humano se amplifica específicamente por PCR y clona en marco con un epítope de células T universal (TCE) derivado de toxina de tétano en el vector de expresión GEX (Amersham Pharmacia) . La proteína de fusión se expresa en E. Coli, purifica en perlas de Glutationa Sepharose (CAT# 17-0756-01, Amersham Pharmacia) , escinde con trombina (Sigma) y eluye como se describe por el fabricante (Amersham Pharmacia) . EJEMPLO 2 GENERACION DE ANTICUERPO Immunización

[0155] Anticuerpos monoclonales humanos contra TNFa humano se desarrollaron al inmunizar secuencialmente ratones XENOMOUSE® (XENOMOUSE® XMG2L3 o 3B-3L3 Abgenix, Inc. Fremont, CA) .

[0156] Para generar hibridomas, cohortes de ratones XMG2L3 y 3B-L3 XENOMOUSE® se inmunizaron con TNFa solo y TNFa con CPG por la planta de la pata. La inmunización fue con 10 ^g de antigeno en una mezcla 1:1 v/v con TITERMAX GOLD® (Sigma, Oakville, ON) por ratón. Se realizaron cuatro refuerzos subsecuentes con 10 µ< de antígeno en mezcla con alumbre (Sigma, Oakville, ON) , adsorbido durante la noche por ratón, seguido por una inyección con TNFa en TITERMAX GOLD®, una inyección con alumbre y luego un refuerzo final de 10 /xg de TNFa en PBS por ratón.

[0157] Cohortes que reciben TNFa con CPG primero se inmunizaron con TNFa y TITERMAX GOLD® como con anterioridad, los siguientes seis refuerzos fueron con TNFa absorbido en alumbre como se estableció previamente junto con CPG. El refuerzo final fue con TNFa en PBS y CPG. En particular, se inmunizaron animales los días 0, 3, 9, 16, 21, 25, 30 y 35. Los animales fueron sangrados los días 28 y 39 para obtener sueros para cosecha de selección como se describe a continuación.

[0158] Para generar mAbs por XENOMAX®, cohortes de ratones XMG2 XENOMOUSE® se inmunizaron con TNFa por la planta de la pata (FP) , TNFa-KLH (como se prepara en el Ejemplo 1) mediante base de la cola por inyección subcutánea o intraperitoneal (BIP) , o con TNFa-TCE (como se prepara en el Ejemplo 1) o mediante base de la cola por inyección subcutánea e intraperitoneo . Para inmunizaciones en la planta de la pata de TNFa la inmunización inicial fue con 2 µ de antígeno mezclado 1:1 v/v con TITERMAX GOLD® por ratón. Cuatro refuerzos subsecuentes se realizaron con 2 µg de antígeno en mezcla con alumbre (Sigma, Oakville, ON) , adsorbido durante la noche por ratones, seguido por una inyección con TNFa en TITERMAX GOLD®, una inyección con alumbre y luego un refuerzo final de 2 µg de TNFa en PBS por ratón. En particular, los animales se inmunizaron los días 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24. Los animales fueron sangrados los días 19 para obtener sueros para selección de cosecha como se describe a continuación.

[0159] La inmunización inicial BIP con 2 o 5 /¿g de TNFa-KLH o TNFa-TCE respectivamente se mezcló 1:1 v/v con adyuvante Completo de Freund (CFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón. Subsecuentes refuerzos se hicieron primero con 2 o 5 /¿g de antígenos respectivamente y mezcla 1:1 v/v con adyuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma, Oakville, ON) por ratón seguido por un refuerzo final en PBS por ratón. Los animales se inmunizaron los días 0, 14, 28, 42, 56, y el día 75 o 93 (refuerzo final) Los animales se sangraron el día 63 para obtener sueros para selección de cosecha como se describe a continuación.

[0160] Para generar anticuerpos monoclonales hTNFa de conejo por SLAM, una cohorte de conejos blancos Nuevo Zelandeses se inmunizó como sigue . Un refuerzo primario que consiste de 250 µg de TNFa-TCE, emulsificado 1:1 v/v con adyuvante Completo de Freund (CFA) , se suministró subcutáneamente en cuatro sitios sobre la parte dorsal del cuerpo del conejo. Estos fueron seguidos por 3 inmunizaciones con 125 µg de TNFa-TCE emulsificado 1:1 v/v con adyuvante incompleto de Freund (IFA) intramuscularmente mediante las patas traseras. Cada uno de los refuerzos estuvieron separados por 21 días . Los animales se sangraron antes de la cuarta inmunización para serología, ver Tabla 9 a continuación. Selección de animales para recolecta

[0161] Títulos de anticuerpo hTNFa se determinaron por ELISA. hTNFa se revistió en placas de 96 pozos de poliestireno con enlace universal de Costar Labcoat (Corning, Acton, MA) durante la noche a cuatro grados . La solución que contiene TNFa sin ligar se retira y las placas fueron tratadas con UV (365 nm) por 4 minutos (4000 microjoules) . Las placas se lavaron 5 veces con dH20. Sueros de XENOMOUSE® de los animales inmunizados con TNFa, o animales XENOMOUSE® sin exposición previa a tratamiento o terapia, se titularon en leche al 2%/PBS a diluciones de 1:2 en duplicado a partir de una dilución inicial de 1:100. El último pozo se dejó en blanco. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Una peroxidasa de rábano picante específica de IgG Fe antihumano-cabra (HRP, Pierce, Rockford, IL) anticuerpo conjugado se agrega a una concentración final de 1 µg/mL por 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Las placas se revelaron con la adición de substrato cromogénico de TMB (Gaithersburg, MD) por 30 minutos y se detuvo ELISA por adición de ácido fosfórico 1 M. El título específico de animales XENOMOUSE® individuales se determinó a partir de la densidad óptica a 450 nm y se ilustra en las Tablas 2 a 8. El título representa la dilución reciprocal de suero y por lo tanto entre más alto el número mayor será la respuesta humoral a hTNFa .

[0162] Títulos anti-TNFa conejos se determinaron como con anterioridad, pero para detección de anticuerpo primario, un reactivo de peroxidasa de rábano picante específica de cadena ligera y pesada IgG anti conejo- cabra (HRP, Pierce, Rockford, IL) se empleó en lugar de reactivo anti-humano. Ver Tabla 9. Tabla 2 Ratones FP, 3B-3L3, hTNFa Gl klambda

[0163] Todos los animales XENO OUSE® en la Tabla 2 se seleccionaron para recolectar y generar hibridomas . Tabla 3 Ratones FP, 3B-3L3, hTNFa+CpG Gl klambda Título ID de Ratón Día 28 Día 39 N643-8 19, 000 70, 000 N651-9 24, 000 75, 000 N673-7 19, 000 60, 000 N713-7 750 6, 000 N732-6 80 450

[0164] Todos los animales XENO OUSE® en la Tabla 3 se seleccionaron para recolectar generación de hibridomas . Tabla 4 Ratones FP, XMG2L3 , hTNFa G2 klambda Título ID de Ratón Día 28 Día 39 N668-1 50, 000 - N668-2 40,000 - N668-3 22, 000 - N668-7 150, 000 175, 000 N670-1 22, 000 24, 000 N676-6 55, 000 73 , 000 N677-3 110, 000 150, 000

[0165] Todos los animales XENOMOUSE® en la Tabla 3 se seleccionaron para recolecta y generación de hibridomas .

Tabla 5 Ratones FP,XMG2L3, hTNFa+CpG} G2 klambda

[0166] Todos los animales XENOMOUSE® en la Tabla 5 se seleccionaron para recolecta y generación de hibridomas . Tabla 6 Ratones FP, XMG2 , hTNFa IgG2/K Título ID de Ratón Día 17 0651-1 186 0651-2 816 0651-3 388 0651-4 260 0651-5 1342 0651-6 373 0651-7 314 0651-8 < 100 @ OD 0.666 0651-9 588 0651-10 163

[0167] Animales XENOMOUSE® (0651-2, 0651-3, 0651-5 y 0651-9) se seleccionaron para recolectar ???????® con base en los datos de serología en la Tabla 6. Tabla 7 Ratones BIP, XMG2 , hTNFa-KLH IgG2/K Título ID de Ratón Día 63 0797-1 1999 0797-2 2586 Título ID de Ratón Día 63 0797-3 1885 0797-4 >6400 @ 0D 2.074 0797-5 1492 0797-6 4325 0797-7 >6400 @ OD 3.294 0797-8 1314 0797-9 3329 0797-10 4829

[0168] Animales XENOMOUSE® (0797-4, 0797-6, 0797-7 y 0797-10) se seleccionaron para recolectar ???0???® con base en los datos de serología en la Tabla 7. Tabla 8 Ratones BIP, XMG2 , hTNFa-TCE IgG2/K Título ID de Ratón Día 63 0796-1 2677 0796-2 5197 0796-3 3143 0796-4 >6400 @ 0D 2.034 Título ID de Ratón Día 63 0796-5 1055 0796-6 221 0796-7 >6400 @ 0D 2.017 0796-8 >6400 @ OD 2.066 0796-9 2145 0796-10 4364

[0169] Animales XENOMOUSE® (0796-2, 0796-4, 0796-7, 0796-8 y 0796-10) se seleccionaron para recolectar XENOMAX® con base en los datos de serología en la Tabla 8. Tabla 9

[0170] Sangre de conejos IPI-5 se recolecta para generar anticuerpos monoclonales de conejo por SLAM, EJEMPLO 3 GENERACIÓN DE ANTICUERPOS TNFa ANTI-HUMANOS Generación de anticuerpos Anti-hTJSTFalfa de Hibridoma.

Recuperación de linfocltos, aislamientos de células B, fusiones y generación de hibridomas

[0171] Ratones inmunizados se sacrificaron por dislocación cervical y los nodos linfáticos se recolectaron y reunieron de cada cohorte. Las células linfoides se disociaron por molienda en DMEM para liberar las células de los tejidos y las células se suspendieron en DMEM. Las células se contaron y 0.9 mL de DMEM por 100 millones de linfocitos se agregaron a los granulos celulares para resuspender las células suavemente pero en forma completa. Utilizando 100 ¿L de CD90+ perlas magnéticas CD90+ por 100 millones de células, las células se etiquetaron al incubar las células con perlas magnéticas a 4 grados C por 15 minutos . La suspensión celular magnéticamente etiquetada contiene hasta 108 de células positivas (o hasta 2x10S total de células) se cargó en una columna LS+ y la columna se lavó con DMEM. El efluente total se recolectó como la fracción negativa de CD90 (la mayoría de estas células son células B) .

[0172] Células de mieloma P3 y células de nodo linfático enriquecido con células B se combinaron en una proporción de 1:1 (mieloma: nodos linfáticos) en un tubo cónico de 50 mL en DMEM. Las células combinadas se centrifugaron a 800xg (2000 rpm) por 5-7 min. y el sobrenadante se retiró inmediatamente de los gránulos resultantes . Dos a cuatro mL de solución de Pronase (CalBiochem, Cat . #53702; 0.5 mg/mL en PBS) se agregan a las células para resuspender los gránulos celulares suavemente. El tratamiento con enzimas se dejó que avance por no más de dos minutos y la reacción se detuvo por la adición de 3-5 mL de FBS. Suficiente solución de ECF se agrega para llevar el volumen total a 40 mL y la mezcla se centrifuga a 800xg (2000 rpm) por 5-7 min. El sobrenadante se retira y los gránulos celulares se resuspenden con un pequeño volumen de solución ECF seguido por suficiente solución EGF para hacer un volumen total de 40 mL. Las células se mezclaron bien y contaron, luego centrifugaron a 800xg (2000 rpm) por 5-7 min. El sobrenadante se retira y las células se resuspenden en un pequeño volumen de la solución de ECF. Suficiente solución ECF adicional se agrega para ajustar la concentración a 2 x 10s células/mL.

[0173] Las células luego se colocaron en un generador de fusión Electro-Celular (ECF = Electro-Cellular-Fusión) (Modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA) y fusionaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de ECF, las suspensiones celulares se retiraron cuidadosamente de la cámara de fusión bajo condiciones estériles y transfirieron a un tubo estéril que contiene el mismo volumen de medio de Hibridoma en DMEM. Las células se incubaron por 15-30 minutos a 37 grados C, luego centrifugaron a 400xg (1000 rpm) por cinco minutos . Las células se resuspendieron suavemente en un pequeño volumen de medio 1/2 HA (1 botella de 50X HA de Sigma, Cat . #A9666 y 1 litro de medio de Hibridoma) y el volumen se ajusto apropiadamente con un medio más 1/2 HA (con base en 5X106 células B por placa de 96 pozos y 200 L por pozo) . Las células se mezclaron bien y transfirieron por pipeta a placas de 96 pozos y se dejó que crecieran. El día 7 o 10, la mitad del medio se retiró y las células se re-alimentaron con medio 1/2 HA. Selección de anticuerpos candidato por ELISA

[0174] Después de 14 días de cultivo, sobrenadante de hibridomas se supervisaron por anticuerpos monoclonales específicos de TNFa. Las placas de ELISA (Fisher, Cat. No. 12-565-136) se revistieron con 50 ^L/pozo de TNFa (2 µg/mL) en amortiguador de revestimiento (amortiguador carbonato 0.1 M, pH 9.6, NaHC03 8.4 g/L) , luego incubaron a 4 grados C durante la noche . Después de incubación las placas se lavaron con amortiguadores de lavado (0. 05% T een 20 en PBS) 3 veces. 200 ¿L/pozo de amortiguador de bloqueo (0.5% BSA, 0.1% Tween 20, 0.01% Thimerosal en lx PBS) se agregaron y las placas se incubaron a temperatura ambiente por 1 hora. Después de incubación las placas se lavaron tres veces con amortiguador de lavado. 50 /¿L/pozo de sobrenadante de hibridoma y controles positivo y negative se agregaron y las placas se incubaron a temperature ambiente por 2 horas .

[0175] Después de incubación, las placas se lavaron tres veces con amortiguador de lavado. 100 iL/pozo de anticuerpo de detección anti-huIgGfc-HRP cabra (Caltag, Cat . #H10507) , anti-hlg kappa-HRP cabra (Southern Biotechnology, Cat. # 2060-05) y anti-hlg lambda cabra (Southern Biotechnology, Cat. # 2070-05) se agregaron y las placas se incubaron a temperature ambiente por 1 hora. Después de incubación las placas se lavaron tres veces con amortiguador de lavado. 100 µ?,/???? de TMB (BioFX Lab. Cat. #TMSK- 0100-01) se agregaron y las placas se revelaron por aproximadamente 10 minutos (hasta que los pozos de control negativo apenas empezaron a mostrar color) , luego 50 L/pozo de solución de parada (TMB Stop Solution (BioFX Lab. Cat. #STPR-0100-01) se agregaron y las placas leyeron en un lector de placas de ELISA a longitud de onda de 450 nm. El número de pozos positivos está presente en la Tabla 10. Tabla 10 Grupo # hlgG/hkappa hlgG/hlambda Total # posi ivo Fusión 1+2 (3B- 9 9 18 3L3) Fusión 3+4 21 12 33 (xgm2L3 ) Supervisión secundaria para determinar el isotipo y uso de cadena ligera para los sobrenadantes de hibridoma anti-TNFa utilizando Luminex

[0176] La plataforma Luminex es una tecnología basada en perlas fluorescentes que permite realizar múltiples ensayos al mismo tiempo. El lector Luminex es capaz de evaluar eventos de señalización positivos en diferentes micro esferas codificadas. Esto permite revestir cada perla por separado, luego mezclar las micro esferas diferencialmente revestidas en conjunto y luego en una etapa ensayar enlace de anticuerpos con cada una de las diferentes microesferas . Para anticuerpos de isotipo, se revistieron micro esferas de manera tal que cada perla fuera capaz de ligar específicamente un isotipo de cadena pesada o cadena ligera particular. Las micro esferas luego se mezclaron en conjunto y el sobrenadante de hibridoma por cada anticuerpo se agregó. Después de una incubación de 20 minutos, las micro esferas se lavaron, y un anticuerpo ligado se detectó utilizando un anticuerpo secundario etiquetado en forma fluorescente. Las micro esferas luego se leyeron utilizando el lector Luminex. La Tabla 10 muestra número de cada isotipo que se encuentra para los diferentes grupos de fusión. Neutralización de ensayos de apoptosis en Neutralización de TNFa por anticuerpos anti-TNFa de hibridoma

[0177] 47 anticuerpos de hibridoma anti-TNFa se ensayaron por su habilidad para neutralizer el efecto biológico de apoptosis inducida por TNFa en células WM 266.4 de humano. IgG primero se enriqueció de cada sobrenadante de hibridoma por purificación en Swell-Gel protein A (Pierce) , y luego eluyó, neutralizó, y cuantificó. 20,000 células WM 266.6 se revistieron en la placa de 96 pozos en medio completo (RPMI1640/10% FBS/Gln/P/S) e incubaron a 37 grados C/10%C02 durante la noche. Se retiran medio y 50 /iL de anticuerpos de prueba y TNFa (pre-incubado por 30' a temperatura ambiente) se agrega en medio libre de suero (RPMI1640/Gln/P/S) . 50 ^L placas de ciclohexamida se incubaron durante la noche como con anterioridad bajo las siguientes condiciones de ensayo final: V=100 /xL, ciclohexamida = 6 /¿g/mL, TNFa = 600 pg/mL = 11.4 pM como un trímero, concentraciones de anticuerpo de prueba varían como se describió. 100 L de amortiguador Caspasa y 0.3 /xL de substrato Caspasa (APO-ONE, Promega) se agregaron a cada pozo.

[0178] La actividad de Caspasa se determina en un lector de placas Víctor Wallac con la longitud de onda de excitación @ 485 nm y la longitud de onda de emisión @ 530 nm. Un ejemplo de la neutralización de apoptosis por anticuerpos derivados de hibridoma se proporciona en la Figura 1. La Figura 1 ilustra gráfica de barras que ilustra el efecto que diversos anticuerpos TNFa tienen en neutralizar la apoptosis en células WM 266.4 humanas. Un control (pos) muestra la inducción de apoptosis por TNFa en la presencia de solo ciclohexamida . Otro control muestra inhibición de apoptosis por anticuerpo anti-hTNFa de ratón 6 nM (R&D) . El eje Y representa la cantidad relativa de actividad de caspasa 3/7, como una indicación de la apoptosis inducida por TNFa. Como ilustra la figura 1, anticuerpos, incluyendo 3.2, 3.7 y 4.17 fueron muy potentes para neutralizar apoptosis inducida por TNFa a 3nM. Neutralización de apoptosis por ensayo de incorporación de yoduro de propidio

[0179] Los 47 sobrenadantes de anticuerpo de hibridoma anti-hTNFa se ensayaron adicionalmente por su habilidad para neutralizer el efecto biológico de apoptosis inducida por TNFa en células CF-7 en humano.

Placas de 96 pozos se sembraron a 5000 células/pozo, 200-pozo con DMEN libre de rojo fenol + 10% FCS . Las células se incubaron durante la noche a 37 grados C + 5%C02. En cada placa, se ensayó una titulación de anticuerpo de hibridoma (cuantificación por ELISA de captura, como se describe en el Ejemplo 2, y compara con una curva de control estándar Ab) fue junto con control 014 de conejo Ab de 10 g/mL a una concentración final de 0.005 ng/mL (titulado 1:5) en medio de apoptosis (2.5% FCS, 5 µg/mL CHX en DME rojo libre de fenol) , en triplicado a una concentración constante de 100 pg/mL (1.9 pM como un trímero) de TNFa. Placas de seis pozos con TNFa solo y seis pozos con medio de apoptosis solo, también se incluyeron. TNFa anticuerpo de neutralización se +/-se pre-incubó por 1 hora a 37°C + 5%C02. 200^L de anticuerpo y luego se transfirió a las células e incubo durante la noche a 37 grados C + C025% .

[0180] Se obtuvieron células con 0.5 //g/mL de PI y 2.5 µg /mL de Heochst 33342 por una hora. El por ciento de apoptosis se determina al contar el número de células muertas (PI +ve) y dividir por el número total de células (Heochst +ve) . La capacidad de anticuerpos derivados de anti- NFa humano de hibridoma, para neutralizado por apoptosis inducida por TNFa de células MCF-7 se mide por absorción de yoduro de propidio con una proporción del número de células totales por tinción de Heochst 33342. mAb de conejo derivado SLA 014, así como diversos otros mAbs de humanos incluyendo 3.2, 4.17 y 3.7, fueron muy potentes para neutralizar apoptosis inducida por TNFa de células MCF-7. Conmutación de Isotipo y expresión de hibridomas IgG2 4.17 y 3.2

[0181] mAR se extrajo de los hibridomas 4.17 y 3.2. PCR transcriptasa inversa se condujo para generar cADN. El cADN que codifica las cadenas pesada y ligera variables se amplificó específicamente utilizando PCR. La región de cadena pesada variable se clonó en un vector de expresión IgGl . Este vector se generó al clonar el dominio constante de IgGl humano en el sitio de clonación múltiple de pcADN3. l+/Higro (Invitrogen, Burlington, ON) . La región de cadena ligera variable se clonó en un vector de expresión IgK o Iglambda. Estos vectores se generaron al clonar el dominio constante de IgK humana o Iglambda en el sitio de clonación múltiple de pcADN . l+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON) . Los vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera luego se co-lipofectaron en un plato de 60 mm de 293 células de riñon embrionario humano 70% confluente y las células transfectadas se dejó que secretaran un anticuerpo recombinante con especificidad idéntica como la célula de plasma original por 24-72 horas. El sobrenadante (3 mL) se recolectó de las 293 células HEK y la secreción de un anticuerpo intacto se demostró con un ELISA emparedado para detectar específicamente IgG humano. La especificidad se estimó a través de enlace del anticuerpo recombinante a TNFa utilizando ELISA. Generación de Anticuerpos Anti-hTNFalfa por XENOMAX™ Cultivo y selección de células B

[0182] Células B de los animales se recolectaron y cultivaron. Aquellas que secretan anticuerpos específicos de TNFa se aislaron como se describe en Babcook y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996) . Se empleó ELISA para identificar pozos específicos de TNFa primarios. Aproximadamente 18 millones de células B se cultivaron de animales XENOMOUSEMR en 480 placas de 96 pozos a 500 o 150 células/pozo, y se supervisaron en TNFa para identificar los pozos específicos de antígeno. 3,825 pozos mostraron ODs significativamente sobre el fondo, una muestra representativa de los cuales se ilustra en la Tabla 11. Células B de conejo también se supervisaron por la habilidad para secretar anticuerpos anti-TNFa y los positivos se ensayaron como se describe a continuación .

Tabla 11 (CONT.) Tabla 11 Normalización de concentraciones de anticuerpo específicas de antlgeno

[0183] Utilizando un método ELISA, se normalizaron sobrenadantes para concentración de anticuerpo especifico de antígeno. Utilizando un anticuerpo anti-obj etivo (TNFa) de concentración conocida titulado para en paralelo, puede generarse una curva estándar y la cantidad de anticuerpo específico de antígeno en el sobrenadante puede compararse al estándar y determinar su concentración, ver Tabla 12 a continuación . Tabla 12 * Puntos de datos fuera de la región lineal de lector ELISA se excluyeron.

Ensayo de antígeno limitado

[0184] El análisis de antígeno limitado es un método que da intervalo de afinidad a los anticuerpos específicos de antígeno preparados en sobrenadantes de cultivo de células B respecto a todos los otros anticuerpos específicos de antígeno. En la presencia de un muy bajo revestimiento de antígeno, solo los anticuerpos de más alta afinidad deberán ser capaces de ligar a cualquier nivel detectable en equilibrio. (Ver, por ejemplo la Publicación PCT WO/03048730A2 con título "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING" (IDENTIFICACIÓN DE MOLÉCULAS DE ALTA AFINIDAD POR SUPERVISIÓN DE DILUCIÓN LIMITADA) publicada en junio 12 , 2003) .

[0185] TNFa biotinilada se liga a placas de estreptavidina a tres concentraciones; 1 ng/mL, 0.1 ng/mL y 0.01 ng/mL por 1 hora a temperatura ambiente en placas de cultivo de 96-pozos. Cada placa se lavó 5 veces con dH20, antes QUe 45 ^L de leche al 1% en PBS con azida de sodio a 0.05% se agregARON a la placa, seguido por 5 µL de sobrenadante de células B agregada a cada pozo. Después de 18 horas a temperatura ambiente en un agitador, las placas de nuevo se lavaron 5 veces con dH20. A cada pozo se agregan 50 /¿L de Gt anti-Humano (Fe) -HRP a 1 /g/mL. Después de 1 hora a temperatura ambiente, las placas de nuevo se lavaron 5 veces con dH20 y 50 µ?? de substrato TMB se agregaron a cada pozo. La reacción se detuvo por la adición de 50 µ!> de ácido fosfórico 1M a cada pozo y las placas se leyeron a longitud de onda de 450 nra para dar los resultados mostrados en la Tabla 13. Tabla 13 Concentraciones de revestimiento Pozo Tamiz l1 (OD) 1 ng/ml 0.1 ng/ml 0.1 ng/ml 401A7 2.92 1.94 0.33 0.19 433F4 2.96 1.12 0.24 0.20 337E7 2.53 0.97 0.47 0.19 164C7 1.97 0.81 0.24 0.16 356B4 2.87 0.69 0.17 0.15 402A4 2.33 0.61 0.35 0.18 286B9 2.56 0.32 0.32 0.27 203A2 2.33 0.23 0.15 0.19 286G8 2.06 0.21 0.19 0.19 286F11 2.93 0.18 0.23 0.19 286D12 0.78 0.18 0.21 0.25 286G1 0.82 0.17 0.16 0.18 286C4 0.75 0.17 0.17 0.19 286G6 0.97 0.16 0.18 0.14 Concentraciones de revestimiento Pozo Tamiz 1' (OD) 1 ng/ml 0.1 ng/ml 0.1 ng/ml 287D1 0.58 0.16 0.19 0.16 Análisis de antígeno limitado

[0186] Se prepararon sobrenadantes de cultivo de células B que tienen concentraciones de anticuerpo específico de antígeno en el intervalo de 10 ng/mL tol 000ng/mL. Los resultados generados del análisis de antígeno limitado se compararon a una titulación de anticuerpo derivado de 4.17 hibridoma . En este ensayo muchos de los anticuerpos no fueron capaces de dar enlace detectable, sin embargo hubo una cantidad de pozos incluyendo 401A7 y 433F , que fueron claramente superiores como se mide por O.D. a los otros sobrenadantes de cultivo y anticuerpos recombinantes a todas las concentraciones (Tabla 13) . Los ciónos restantes se analizaron adicionalmente al combinar los datos de alto contenido de antígeno que miden concentración de anticuerpo específica (ver anteriormente para detalles) y la salida de antígeno limitada. De esta manera, fue posible el comparar anticuerpos en sobrenadantes de cultivo de células B con aquello de anticuerpo de control sobre un intervalo de concentración como se ilustra en la Figura 2. La Figura 2 es una gráfica de puntos que compara el enlace de antígeno limitado de anti-TNFa entre anticuerpos en sobrenadantes de cultivo de células B con el de un anticuerpo de control (4.17 IgG2) sobre un intervalo de concentración. Los triángulos representan los ciónos sobrenadantes de cultivo de célula B, y los bloques representan Anticuerpo Bar (4.17 IgG2) . Los ciónos de sobrenadante de cultivo de célula B con puntos sobre la curva de anticuerpo de barra están en el rango que tienen afinidad potencialmente superior. Neutralización de apoptosis por ensayo de incorporación de yoduro de propidio

[0187] Todos los 1455 anticuerpos anti-hTNFa identificados de sobrenadantes de pozos de cultivo de células B de ratones inmunizados en la planta de la pata, se ensayaron adicionalmente por su habilidad para neutralizar el efecto biológico de apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7. Además, después de análisis de antígeno limitado de todo los 2,370 anti-hTNFa identificados de animales inmunizados BIP, 145 anticuerpos que tienen la calificación cinética más alta se analizaron adicionalmente para neutralización de actividad de TNFa. Placas de 96 pozos se sembraron a 5000 células MCF-7/????, 200 ^L/pozo con DMEM libre de rojo fenol ·+ 10% FCS . Placas se incubaron durante la noche a 37 grados C + C02 5%. En cada placa el sobrenadante de anticuerpo de cultivo de célula B se ensaya junto con los anticuerpos de hibridoma anti-TNFa neutralizantes más potentes, 4.17 y 3.2 y/o control de conejo 014 en medio de apoptosis (FCS 2.5%, 5 9/t??? CHX en DMEM libre de rojo fenol) , a una concentración constante de 100 pg/mL (1.9 pM como un trímero) de TNFa. Pozos replicados con TNFa en medio de apoptosis y pozos con medio de apoptosis solos se incluyeron como controles. TNFa +/- muestra de prueba se pre-incubaron por 1 hora a 37 grados C + 5% C02. 200 µ?? TNFa +/- se transfirieron a células e incubaron durante la noche a 37 grados C + C025% .

[0188] Se tiñeron células con 0.5 /g/mL de PI y 2.5 //g/mL de Heochst 33342 por una hora. El porcentaje de apoptosis se determinó al contar el número de células muertas (PI +ve) y dividió por el número total de células (Heochst +ve) . Se ilustra un ejemplo en la Figura 3 que muestra una gráfica de barras representativa que compara la efectividad de diversos sobrenadantes de cultivo de células B XEN0MAXMR para inhibir apoptosis de células inducida por TNFa en células MCF-7 humanas. Una cantidad de sobrenadantes de pozos de cultivo de célula B mostraron la capacidad por neutralizar apoptosis inducida por TNFa. Estos sobrenadantes incluyen: 164C7, 179B1, 401A7, 410B1, 439A3 y 460A12.

Determinación de potencia de neutralización de apoptosis inducida por TNFa por anticuerpos anti-hTNFa en soluciones policlonales

[0189] Utilizando las concentraciones extrapoladas de anticuerpos específicos de antígeno en sobrenadantes de cultivo de células B policlonales, se calculó la potencia aparente de neutralización de apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7. Al realizar el ensayo en paralelo con un reactivo antiobjetivo estándar, en este caso el anticuerpo de hibridoma 3.2 IgG2, fue posible establecer una barra de potencia y buscar anticuerpos con superior potencial que el estándar.

[0190] Un ejemplo de las comparaciones de potencia calculadas paras neutralización de apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 se ilustra en la Figura 4. La Figura 4 es una gráfica de puntos representativa que muestra comparaciones de potencia calculadas para neutralización de apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 humanas por sobrenadantes de cultivo de células B XENOMAXMR. Los triángulos representan la potencia del sobrenadante de cultivo de células B, mientras que los cuadrados representan la potencia de un control de barra 3.2 IgG2. Una cantidad de sobrenadantes de cultivo de células B mostró mayor neutralización de apoptosis inducida de TNFa a menores concentraciones de anticuerpo anti-TNFa que la curva estándar de control 3.2 indicando mayor potencia. Inhibición de Enlace TNFa a p55 (TNFa Receptor I) por Anticuerpos de Conejo

[0191] Anticuerpos de neutralización anti-TNFa de conejo se encontraron al examinar si o no los anticuerpos de los sobrenadantes de cultivo de célula B fueron capaces de inhibir enlace TNFa a su receptor p55. Se llevó el siguiente procedimiento, placas de microtitulación de 96 pozos se revistieron durante la noche con TNFa. Al día siguiente, las placas se lavaron e incubaron -+/- anticuerpos anti-TNFa por 1 hora. Biotina-p55 luego se proyecta para fijar en las placas por 1 hora, lavó con agua y p55 ligado se detecta utilizando esterpavidina-HRP . Las placas luego se lavaron y revelaron como se realiza con otros ELISA descritos anteriormente. Anticuerpos que inhiben el enlace de p55 se denominaron neutralizantes, ver Tabla 14. Tabla 14 Abs Ensayo 1 Ensayo 2 9C10 0.32 1.26 10G8 0.23 0.59 Abs Ensayo 1 Ensayo 2 11Al 0.52 0.55 7A4 0.08 0.39 6A1 0.4 0.42 4A11 0.67 0.56 2Al2 0.37 1.19 6AS 0.29 0.92 TNFa solo 0.3 0.97 Ensayo de Placa Hemolítica Específico de TNFa

[0192] Una cantidad de reactivos especializados se emplean para conducir este ensayo. Estos reactivos se prepararon como sigue. Biotlnilación de Glóbulos Rojos de Oveja (SRBC = Sheep Red Blood Cells)

[0193] SRBCs se almacenaron en medio RPMI como un material al 25%. Un granulado de células empacadas SRBC de 250 µ?,, se obtuvo al hacer alícuotas de 1.0 mL de SRBC a un tubo eppendorf fresco. El SRBC se granuló con un pulso de giro a 8000 rpm (6800 rcf) en microcentrífuga, se retiró el sobrenadante, el granulado re- suspende en 1.0 mL PBS a pH 8.6, y se repite la centrifugación. El ciclo de lavado se repite 2 veces, luego el granulado SRBC se transfiere a un tubo falcon de 15-mL y constituye a 5 mL con PBS pH 8.6. En un tubo falcon de 50 mL separado, 2.5 mg de Sulfo-NHS biotina se agregan a 45 mL de PBS con pH 8.6. Una vez que la biotina se disolvió completamente, los 5mL de SRBCs se agregan y el tubo se gira a RT por 1 hora . Los SRBCs se centrifugan a 3000 rpm por 5 minutos y se retira el sobrenadante. Los SRBCs biotinilados se transfirieron a un tubo eppendorf y lavan 3 veces, como con anterioridad pero con PBS pH 7.4 y luego constituyente hasta 5 mL con medio de células inmunes (RPMI 1640) en un tubo falcon de 15 mL (material B-SRBC al 5%) . El material se almacenó a 4 grados C hasta que se requiere. Revestimiento de Estreptavidina (SA) de B-SRBC

[0194] 1 mL del material B-SRBC al 5% se transfiere a un tubo eppendorf fresco. Las células B-SRBC se lavaron 3 veces como con anterioridad y resuspendieron en 1.0 mL de PBS a pH 7.4, para dar una concentración final de 5% (v/v) . 10 /¿L de una solución de material estreptavidina 10 mg/mL (CalBiochem, San Diego, CA) se agregan y el tubo se mezcla y gira a RT por 20 minutos. La etapa de lavado se repite y SA-SRBC se re-suspende en 1 mL de PBS a pH 7.4 (5% (v/v)) . Revestimiento TNFa Humano de SA-SRBC

[0195] SA-SRBCs se revisten con TNFa biotinilado a 10 /ig/mL, mezclan y giran a RT por 20 minutos . SRBC se lava dos veces con 1.0 mL de PBS a pH 7.4 como con anterioridad. SRBC revestido con TNFa se re- suspende en RPMI (+10% FCS) a una concentración final de 5% (v/v) . Determinación de la Calidad de TNFa -SRBC por Inmuno-fluorescencia (IF)

[0196] 10 zL de SA-SRBC al 5% y 10 /¿L de SRBC revestido con TNFa al 5%, cada uno se agregaron a un tubo eppendorf de 1.5 mi fresco separado que contiene 40 /iL de PBS . Un anticuerpo anti-TWFa humano de control se agrega a cada muestra de SRBCs a 45 µg/mL. Los tubos se giraron a RT por 25 minutos, y las células luego se lavaron tres veces con 100 µ? de PBS. Las células se re- suspendieron en 50 µL de PBS e incubaron con anticuerpo IgG Fe Gt-anti Humano 40 /g/mL de conjugado con Alexa488 (Molecular Probes, Eugene, OR) . Los tubos se giraron a RT por 25 minutos y luego lavaron con 100 L de PBS y las células re- suspendieron en 10 L de PBS. 10 µL de las células teñidas se proyectaron para fijar sobre un porta-objetos de microscopio de vidrio limpio, cubierto con un cubre-objetos de vidrio, se observaron bajo luz fluorescente y calificaron en escala arbitraria de 0-4. Preparación de células de plasma

[0196] Los contenidos de un solo pozo de microcultivo previamente identificado por diversos ensayos que contiene un clon de células B que secretan la inmunoglobulina de interés, se recolectaron. Utilizando un equipo pipetman de 100-1000 µ??, los contenidos del pozo se recuperaron al agregar RPMI a 37 grados C (FCS 10%) . Las células se re-suspendieron mediante transferencia con pipeta, y luego transfirieron a un tubo eppendorf de 1.5 mL fresco (volumen final aproximadamente 500-700 ^L) . Las células se centrifugaron en una microcentrifuga a 2500 rpm (600 ref) por 1 minuto a temperatura ambiente, luego el tubo se giró 1800 grados y centrifugó de nuevo por 1 minuto a 2500 rpm. El medio congelado se retira y las células inmunes resuspenden en 100iL RPMI (10% FCS), luego centrifugan. Este lavado con (10% ECS) se repite y las células se re-suspenden en 60 /¿L de RPMI (10% FCS) y almacenan en hielo hasta que estén listas para uso. Ensayo de Placas

[0198] Porta-objetos de vidrio de 5.08 x 7.62 cm (2 3 pulgadas) se prepararon con anticipación con bordes de silicona y se dejó que curaran durante la noche a RT. Antes de utilizar los porta-objetos se trataron con aproximadamente 5 L de SigmaCoat (Sigma, Oakville, ON) aplicado uniformemente sobre la superficie de vidrio, se dejan secar y luego limpian vigorosamente. A una muestra de 60 ^L de células se agregan 60 /xL cada uno de SRBC revestido con TNFa (material al 5% v/v) , complemento 4x de conejillo de Indias (Sigma, Oakville, ON) preparado en RPMI (10% FCS) , y material de suero mejora 4x (1:150 en RPMI (10% FCS)) . La mezcla -) se aplica (10-15 /¿L) en los porta-objetos preparados y las aplicaciones se cubrieron con aceite de parafina sin diluir. Los portaobjetos se incubaron a 37 grados C por un mínimo de 45 minutos . Resultados de Ensayo de Placas

[0199] Glóbulos rojos de oveja revestidos con TNFa se emplearon para identificar células de plasma específicas de antígeno de los pozos (ver Tabla 15) . Tabla 15 mAb ID Numero de Numero de Células Células Sencillas Sencillas Seleccionadas 1 7 23 69 10F1 12 92 11?8 12 128 27?9 12 148 44G7 12 116 101F1 8 140 103H1 12 25 107A6 11 13 mÁb ID Número de Número de Células Células Sencillas Sencillas Seleccionadas 107G12 12 1 164C7 8 291 203A2 12 299 337E7 5 280 01A7 8 261 402G10 12 249 410F1 12 311 433F4 9 230 460A12 12 268 Expresión de Anticuerpos anti-TNFa Recombinantes

[0200] Después de aislamiento de las células de plasma sencillas, el mA N se extrae y se conduce PCR de transcriptasa inversa para generar cADN que codifica las cadenas pesada y ligera variables. La región de cadena pesada variable humana se clona y conmuta de isotipo en un vector de expresión IgGl . Este vector se genera al clonar el dominio constante de IgGl humano en el sitio de clonación múltiple de pcADN3 l+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON) . La región de cadena ligera variable humana se clona en un vector de expresión IgK. Estos vectores se generaron al clonar el dominio constante de IgK humano en el sitio de clonación múltiple de pcADN3. l+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON) . Los vectores de expresión de cadena pesada y cadena ligera luego se co-lipofectaron en un plato de 60 mm de 293 células de riñon embrionario humano 70% confluentes y las células transfectadas se dejó que secretaran un anticuerpo recombinante con la especificidad idéntica que las células de plasma original por 24-72 horas. El sobrenadante (3 mL) se recolecta de las 293 células HEK y la secreción de un anticuerpo intacto se demuestra con un ELISA emparedado para detectar específicamente IgG humano (Tabla 16) . La especificidad se estima a través de enlace del anticuerpo recombinante a TNFa utilizando ELISA. Tabla 16 ID de Título Sobrenadante Anticuerpo Enlace de total antígeno 11A8 >1 : 64 >1 : 64 27A9 1:16 1 : 64 103H1 >1 :64 1:64 107A6 >1 :64 >1:64 107G12 >1 : 64 >1:64 ID de Título Sobrenadante Anticuerpo Enlace de total antígeno 164C7 >1:64 >1:64 203A2 >1:64 >1:64 401A1 >1 : S4 >1 : 64 402G10 >1 : 64 >1:64

[0201] Las pruebas ELISA de secreción se realizaron como sigue . Placas de control se revistieron con IgG H+L anti-humano cabra 2 mg/mL durante la noche para placas de enlace, hTNFa se reviste sobre placas de 96 pozos de Poliestireno para Enlace Universal Costar Labcoat y mantienen durante la noche a 4 grados C. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Anticuerpos recombinantes se titularon 1:2 por 7 pozos para el sobrenadante de mini-lipofección sin diluir. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Un anticuerpo conjugado H P específico de IgG Fe anti-humano cabra se agregó a una concentración final de Ig/mL por 1 hora a RT para la secreción y los dos ensayos de enlace. Las placas se lavaron cinco veces con dH20. Las placas se revelaron con la adicion de TMB por 30 minutos y el ELISA se detuvo por adición de ácido fosfórico 1 M. Cada placa de ELISA se analiza para determinar la densidad óptica de cada pozo a 450 nm.

[0202] Genes de anticuerpo conejo se rescataron, clonaron y expresaron como con anterioridad, pero se clonaron en vectores que contienen regiones constantes kappa o constantes pesada IgGl de conejo. Células del pozo 7A4 (Tabla 14) se aislaron, clonaron y expresaron como un anticuerpo de conejo completo, R014 (AB- TNFa-R014) . Purificación de Anticuerpos Anti-TNFa Recombinantes

[0203] Para una producción a mayor escala, vectores de expresión de cadena pesada y ligera (2.5 µg de cadena/plato) se lipofectaron en diez platos de 100 mm que fueron 70% confluentes con 293 células HEK. Las células transfectadas se incubaron a 37 grados C por 4 días, el sobrenadante (6 mL) se recolecta y reemplaza con 6 mL de medio fresco. El día 7, el sobrenadante se retira y recolecta con la cosecha inicial (120 mi total de 10 placas) . Cada anticuerpo se purifica del sobrenadante utilizando cromatografía de afinidad de Proteína-A Sepharose (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) (1 mL) . El anticuerpo se eluye de la columna de Proteína-A con 500 mL de Glicina 0.1 M pH 2.5. El eluato se dializa en PBS pH 7.4 y esteriliza en filtro. El anticuerpo se analiza por SDS-PAGE no reductor, para estimar la pureza y rendimiento. La concentración también se mide por análisis UV a OD 250. EJEMPLO 4 ENLACE DE ANTICUERPOS ANTI-TNFa A TNFa TRANSMEMBRANA

[0204] Tanto TNFa soluble como ligado a membranas puede interactuar con receptores TNFa y contribuir a efectos pro-inflamatorios TNFa. Por lo tanto, lo importante es establecer si 299v2 y 263 pueden ligar efectivamente a TNFa ligado a membrana, además de la versión soluble de la molécula. Para este objetivo, células CHO transfectadas con TNFa se emplearon así como células T activadas .

[0205] El enlace de reactivos anti-TNFa a TNFA mutante transmembrana expresado en la superficie de células CHO, se midió. Específicamente, anticuerpos de hibridoma lambda y kappa IgG2 cuantificados asi como hibridoma conmutado de isotipo y anticuerpos recombinantes IgGl derivado de XENOMAXMR se ensayaron por su capacidad para ligar TNFa de transmembrana expresado en la superficie de células de ovario de hámster chino, CHO's TNFa cADN. cADN TNFa se muta en diversas posiciones para evitar la expresión de TNFa en la superficie de las células . El cADN luego se clona en un vector de expresión. Células CHO se transfectan y células de expresión estables se colocan bajo selección de droga para generar una línea celular de DTNFa. Anticuerpos Anti-TNFa, asi como Etanercept, se titularon y agregaron a células CHO DTNFa en hielo por 1 o 18 horas . Las células se cosecharon en PBS frío y un IgG humano o anti-conejo biotinilado secundario se incuba adicionalmente en hielo por 10 minutos, lava y un anticuerpo etiquetado SA-PE terciario se agrega en hielo por 10 minutos adicionales. Clasificación celular activado por fluorescencia (FACS = fluorescence activated cell sorting) se utiliza para determinar perfiles de enlace y tinción con anticuerpos a diversas concentraciones .

[0206] A bajas concentraciones, los anticuerpos humanos, así como un Infliximab quimérico y R014 de conejo, ligaron la forma transmembrana de TNFa en células, mientras que Etanercept claramente mostró una señal de enlace inferior. 299v2, 263, Infliximab, Adalimumab y Etanercept se incubaron 18 horas a 4 grados C en las células DTNF-CHO a 0.1 xg/mL. Con referencia a los anticuerpos monoclonales , 299v2 y adalumimab aparentemente tiñeron menos que 263 e infliximab. Los datos resultantes sugieren que efectos mediados por Fe tales como citotoxicidad dependiente de anticuerpo (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC = antibody-dependant cellular cytotoxicity) habrán de observarse en células que expresan TNFa de transmembrana. Una cantidad de los anticuerpos generados pueden tener efectos mediados de Fe más potentes que Infliximab y Etanercept . Esto puede ser de beneficio particular para el tratamiento de enfermedades en donde TNFa de superficie celular puede jugar un papel pato-fisiológico tal como Crohn o soriasis .

[0207] Para el tratamiento de indicaciones de enfermedad en donde formas solubles de TNFa pueden mediar la mayoría de los estados de enfermedad, un anticuerpo con función efectora mediada por Fe bajo puede ser conveniente. Esto puede lograrse al expresar el anticuerpo anti-TNFa como un isotipo IgG2 o IgG .

[0208] El ligar reactivos anti-TNFa para activar PBMC, también se midió. PBMCs se aislan de un donador normal e incuban con un anticuerpo anti-CD3 para activar células T. La activación de células T implica expresión de TNFa de superficie de TNFa ligada a membrana. La capacidad de que los reactivos anti-TNFa liguen a TNFa ligada a membrana, de nuevo se estima a diversas concentraciones por análisis FACS, dando compuerta en linfocitos en base a dispersión de luz y utilizando un anticuerpo secundario igG anti-humano conjugado PE. Los datos de tinción resultantes indican que todos los anticuerpos monoclonales 299v2, 263, Infliximab y adalumimab tiñieron linfocitos después de activación de células T, mientras que Etanercept no. Ningún anticuerpo anti-TNFa tiñó linfocitos si no se sometieron a activación de células T. EJEMPLO 5 ENSAYOS DE ENLACE DE EPÍTOPE Cartografía de epítope de anticuerpos anti-TNFa

[0209] Lo siguiente describe el método empleado para cartografía de epítopes de anticuerpos anti TNFa. Proteínas TNFa quiméricas, utilizando TNFa humano y de ratón, se construyeron y expresaron. Un alineamiento de TNFa de humano y de ratón se proporciona en la Tabla 17. Tabla 17 Humano : WSSSRTPSDKPVAHWANPQAEGQLQWLNRRANA Ratón : LRSSSQNSSDKPVAHWANHQVEEQLEWLSQRANA Humano : LLANGVELRDNQL PSEGLYLIYSQVLFKGQGCP Ratón : LLANGMDLKDNQLWPADGLYLVYSQVLFKGQGCP Humano : STHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRE Ratón : DY-VLLTHTVSRFAISYQEK NLLSAVKSPC KD Humano : TPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINR Ratón : TPEGAELKPWYEPIYLGGVFQLEKGDQLSAEVNL Humano: PDYLDFAESGQVYFGIIAL SEQ ID NO: 265 Ratón: PKYLDFAESGQVYFGVIAL SEQ ID NO: 266

[0210] Sitios de escisión de restricción comunes en genes TNFa-a humano y murinos se utilizaron para construcción de proteínas quiméricas TNFa de fusión en marco. Siete construcciones se realizaron: TNFa humano, TNFa ratón, H/M Bgll, M/H Bgll, H/M HincII, H/M PvuII, M/HPvul'I . Todas las proteínas se expresaron y secretaron en niveles detectables medidos por ensayo de ELISA utilizando anticuerpos policlonales contra TNFa de humano y ratón. Proteínas TNFa quiméricas: los puntos de unión de amino ácidos están en las posiciones: Bgll-36/37, HincII-90/92 , PvuII-124/126. La diferencia en un amino ácido en los últimos dos casos se debe a la ausencia del residuo histidina en la posición 73 en la secuencia TNFa murina. Un ejemplo de anticuerpos anti-TNFa que ligan estas proteínas por ELISA se da en la Tabla 18. Tabla 18 ConsAn i- Anti- 3.2 Ab 3.7 Ab 4.17 Residuos trucción Ratón Humano Ab Humano Cabra Cabra H-TNFa + +++ + + + 1-157 M TNFa + + - - - None H/ BgII ++++ +++ - - + 1-36 1-36 ConsAnti- Anti- 3.2 Ab 3.7 Ab 4.17 Residuos trucción Ratón Humano Ab Humano Cabra Cabra /HuBgII + +++ - + - 36-157 36-157 Hu/M + +++ + - + 1-125 Pvull /Hu ++ + - - - 125-157 Pvull Hu/M + ++++ ++ - ++ 1-91 Hin C 11 1-91

[0211] A fin de definir el sitio de enlace para diferentes anticuerpos, se mutó una cantidad de residuos de hTNFa utilizando mutagénesis dirigida de sitio. Un panel de anticuerpos se supervisó para enlace por un ensayo ELISA. Residuos humanos se reemplazaron con los residuos murinos en las posiciones 27, 31, y 131. Se eliminó histidina en la posición 73, un ejemplo se ilustra en la Tabla 1 .

Tabla 19

[0212] Como se ilustra por la Tabla 19, el sitio de enlace de 014 conejo, 4.17, SC291, SC299 y SC313 se localizan en los primeros 36 residuos amino ácidos de TNFa humano. Los amino ácidos 31-35 se han mostrado que están involucrados en reconocimiento de receptor y disparo de respuesta biológica (Jones, E. ?. , Stuart, D.I., y Walker, NPC, (1992) en Tumor Necrosis Factors : Structure, Function and Mechanism of Action (Factores de Necrosis de Tumor: Estructura, Función y Mecanismo de Acción) (Aggarwal, B. B., y Vilcek, J. , eds) pp 93-127, Marcel Dekker, Inc., New-York, un cambio no conservador de Arg31 se introduce para adicional cartografía de epitope. El cambio de amino ácido sencillo en la posición 31 se muestra que desprende el enlace de SC291, SC299 y SC313 completamente, mientras mAb 4.17 pierde solo 80% de su actividad de enlace, un cambio adicional en la posición 27 se requiere para el bloqueo de la actividad de 4.17.

[0213] El sitio de enlace de MAb 3.2. se encuentra entre los residuos 1-91. Aunque el reemplazo de Gln27 y Arg31 no afecta su enlace a TNFa humano, el extremo N parece ser necesario por su actividad de enlace. El epitope Mab 3.7 se encuentra entre los residuos 36-157.

[0214] Ninguna de las quimeras puede ser neutralizada utilizando anticuerpos monoclonales SC250, SC263, SC269, SC282, SC283 e Infliximab. Todos estos anticuerpos son altamente específicos para TNFa humano, y su epitope es una constelación de residuos ubicados en una posición diferente, no contigua del polipéptido TNFa. Gln27, Arg31, His73 y Argl31 no se involucran en el sitio de enlace de neutralización.

[0215] La Tabla 20 resume los resultados de cartografía de epítope adicional realizada en 299v2,263, etanercept, infliximab y Adalimumab. Como se demuestra en la Tabla 20, 299v2, etanercept, y adalimumab ligan a las proteínas quiméricas que contienen la región de TNF humano entre aa 1 y aa 36, mientras que 263 e infliximab no ligan ninguna de las proteínas quiméricas . Todos los anticuerpos anti-TNF ligan a TNF humano, pero ninguno a TNF murino . Estos resultados indican que las regiones de enlace de 299v2, etanercept, y adalimumab están más probablemente comprendidas dentro de los primeros 36 aa de TNF, mientras que aquellos de 263 e infliximab están dispersos sobre toda la molécula. Todos los anticuerpos anti-TNF ligan regiones sensibles a desnaturalización de proteína, indicando que sus regiones de enlace son conformacionales .

Tabla 20

[0216] Los receptores de TNFa p75-hFc y p55- Fc (número de Catálogo 372-RI-050 y 372-RI/CF de R&D) se analizaron adicionalmente para enlace a proteínas TNFa como se ilustra en la Tabla 21. Tabla 21 Residuos de amino Construcciones p55-hFc p75s- Fc ácidos humanos Hu TNFa ++ ++ 1-157 Hu/MbgII ++ ++ 1-36 /HuBgII - - 36-157 Hu/M Pvull + ++ 1-125 Hu/ Hin C 11 ++ ++ 1-91 Residuos de amino Construcciones p55- Fc p75s-hFc ácidos humanos /Hu Hin CII ++ ++ 91-157 EJEMPLO 6 REACTIVIDAD CRUZADA DE ENLACE TNFa ANTI-MACACO Enlace a TNFa recombinante soluble de humano y de mono

[0217] Anticuerpos anti-TNFa también se probaron por su habilidad para ligar a TNFa recombinante soluble. TNFa humano y de mono (macaco cynomolgous) se expresaron en E. coli como proteínas de fusión con GST. El enlace se estimó por ELISA. 299v2, 263, etanercept, infliximab, y adalumimab ("anticuerpos anti-TNFa") se incubaron en placas de 96 pozos revestidas durante la noche con 0.5 ^g/ml de GST-TNFa humano, 2 /¿g/ml de GST-TNFa de mono y 10 ig/ml de GST. Anticuerpo ligado se detectó utilizando un anticuerpo IgG anti-humano cabra conjugado HRP . Los resultados mostraron que los anticuerpos anti-TNFa todos se ligan a TNFa humano con una similar respuesta de dosis (Figura 5) . Anticuerpos anti-TNFa ligan de manera diferente a TNFa de mono. Mientras que 299v2, etanercept, y adalumimab se ligan a TNFa de macaco cynomolgus en una forma similar, 263 e infliximab no parecen ligar a TNFa de macaco cynomolgous (Figura 6) .

EJEMPLO 7 ANÁLISIS DE CINÉTICA

[0218] las medidas cinéticas de los anticuerpos anti-TNFa se evaluaron utilizando las tecnologías KmExAMR y BIACOREMR. El método KinExAMR involucra determinación con base en solución de medidas de afinidad formal al equilibrio. Para medir las cinéticas de enlace de cada anticuerpo anti-TNFa humano se realizaron dos experimentos en réplicas de tres. En ambos experimentos, se tituló una concentración conocida de antigeno y una concentración de anticuerpo diferente se agrega a cada titulación de antígeno y se deja que alcance el equilibrio de enlace. Para determinar las medidas de Kd en TNFa humano, Kd se calcula utilizando una concentración de sitio de enlace TNFa molar de un trímero (52.5 kDa) , ver Tabla 22, o tres monómeros (17.5 kDa) , ver Tabla 23. los resultados se analizaron por análisis de curva dual . Mediciones cinéticas para el anticuerpo R014 de conejo se realizaron esencialmente como con anterioridad, sin embargo el método de concentración de antígeno conocido se realiza utilizando la concentración de anticuerpo conocida para calcular Kd. Además, para negar la posibilidad de efectos de avidez, fragmentos Fab se generaron por escisión de papaína y el análisis de cinética se repitió (ver Tabla 24) .

[0219] Constantes cinéticas adicionales también se calcularon a partir de datos BIACOREME utilizando los métodos descritos en su literatura de producto. Una constante de velocidad de asociación (ka) es el valor que representa la fuerza (extensión) de enlace de un anticuerpo con antígeno objetivo como se calcula con base en cinéticas de reacción de antígeno-anticuerpo . Una constante de velocidad de disociación (kd) es el valor que representa la fuerza (extensión) de disociación de este anticuerpo monoclonal a partir de antígeno objetivo como se calcula con base en cinéticas de reacción de antígeno-anticuerpo . La constante de disociación (Kd) es el valor que se obtiene al dividir el valor de la constante de velocidad de disociación (kd) de la constante de velocidad de asociación (ka) , ver Tabla 25. Tabla 22 Ab Ka (M) Alto Kd (M) Bajo Kd (M) % de Error 299 VI 6.3 e-13 9.2 e-13 4.3 e-13 4.99 299v2 1.07 e-12 SD=0.48 (n=5) 263 3.73 e-12 SD=1.06 (n=4) 3.2 4.77 e-12 7.6 e-12 2.43 e-12 4.7 p75-hFc* 4.10 e-13 SD=0.15 (n=4) >5% ** Infliximab 4.70 e-12 6.90 e-12 2.93 e-12 5.45 Adulimumab 3.90 e-12 6.87 e-12 1.64 e-12 5.77 * Una construcción p75-hFc (R&D Systems) similar a etanercept (Enbrel) se utiliza en estos estudios. Cuando se utiliza etanercept se obtuvieron resultados similares (datos no mostrados) . ** Cada experimento tuvo errores entre 6-7%. Tabla 23 * Una construcción Ap75-hFc (R&D Systems) similar a etanercept (Enbrel) se utiliza en estos estudios. Cuando se utiliza etanercept se obtuvieron resultados similares (datos no mostrados) . ** Cada experimento tuvo errores entre 6-7%.

Tabla 24 Tabla 25

[0220] La afinidad de enlace de 299v2 para TNFa de macaco cynomologus también se midió, ya que este anticuerpo se ha encontrado capaz de ligar TNFa de mono en un ELISA. El método KinExA también se utiliza para medir la Ka que describe esta afinidad de enlace. 299v2 ligado a TNFa de mono con una afinidad de 626 pM, considerando TNFa como un monómero, que por lo tanto es aproximadamente 200 veces menor que la afinidad para TNFa humano . EJEMPLO 8 CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-HTFNa IN VITRO.

Inhibición de apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 de humano.

[0221] Hibridomas kappa y lambda IgG2 se cultivaron a granel, purificaron y cuantificaron como se describió previamente . Anticuerpos recombinantes IgGl derivados de XENOMAXMR e hibridoma conmutado de isotipo, se expresaron, purificaron y cuantificaron, como se describió previamente. Los anticuerpos se ensayaron adicionalmente por su habilidad para neutralizar el efecto biológico de apoptosis inducida por TNFa en células MCF-7 de humano. Placas de 96 pozos se sembraron a 5000 células de MCF-7/????, 200 /¿L/pozo con DMEM libre de rojo fenol + FCS al 10%. Las placas se incubaron durante la noche a 37 grados C + C02- al 5%. En cada placa, se ensayó una titulación de cada anticuerpo, en concentraciones finales de 0.005 ng/ml a 10 ig/ml. Reactivos anti-TNF se diluyeron en medio de apoptosis (2.5% FCS, 5^g/mL CHX en DMEM libre de rojo fenol), en triplicado o hasta réplicas de seis, a una concentración constante de 100 pg/mL (1.9 p como un trímero) de TNFa. Placas de 6 pozos con TNFa solo en medio de apoptosis y placas de 6 pozos con medio de apoptosis solo también se incluyeron. TNFa +/-anticuerpo de neutralización se pre-incuba por 1 hora o por 18 horas a 37 grados C + CO2-200 µ?, al 5% TNFa +/-anticuerpo de neutralización se transfiere a células e incubaron durante la noche a 37 grados C + C02 al 5%

[0222] Células se tiñieron con 0.5 xg/mL de PI y 2.5 jug/mL de Heochst 33342 por una hora. Por ciento de apoptosis se determina al contar el número de células muertas (PI +ve) y dividir el número total de células (Heochst + ve) . Se ensayó la neutralización utilizando células MCF-7 y detectó como una proporción de yoduro de propidio y tinción de Heochst 33342. Un ejemplo de curvas de titulación de anticuerpo de neutralización utilizadas para generar valores ICS0 por ajuste de curva de cuatro parámetros , se proporciona en las Figuras 7 y 8, como gráficas de líneas.

[0223] Resultados mostrados en la Tabla 26 son los promedios de datos que se obtienen de diferentes experimentos de inhibición in vi tro de apoptosis inducida por TNF en células MCF-7 a un punto en tiempo de pre-incubación de anticuerpo de 1 hora o 18 horas con TNF.

La pre-incubación de 18 horas más larga puede permitir que se vean más claramente las diferencias de afinidad, ya que el enlace de anticuerpo-antígeno está más cerca del equilibrio. 299v2 demostró que los más bajos IC50s de cualquiera de mAbs totalmente humanos así como Infliximab. Una correlación fuerte entre potencia de neutralización y afinidad también se observa. Tabla 26

[0224] Un ejemplo de los valores ICS0 promedio para neutralización anti-TNFa de apoptosis representa en la Figura , una gráfica de barras . Como indica la Figura 9, todos los anticuerpos son neutralizantes potentes de apopotisis inducida por TNFa. En particular, el anticuerpo 299v2 parece tener una mejor potencia promedio que Infliximab, Adalimumab o Etanercept.

[0225] La Tabla 27 muestra la inhibición de apoptosis inducida por TNF en células MCF-7 por mAb R014 de conejo después de 1 hora de pre-incubación con TNF. Tabla 27 * número de experimentos Inhibición de apoptosis inducida por TNFa en células M 266.4 humanas.

[0226] Hibridomas kappa y lambda IgG2 se cultivaron a granel, purificaron y cuantificarón como se describió anteriormente. Anticuerpos recombinantes IgGl derivado de XENOMAXMR e hibridoma conmutado de isotipo se expresaron, purificaron y cuantificaron como con anterioridad. ¦ Los anticuerpos se ensayaron adicionalmente por su habilidad para neutralizar el efecto biológico de apoptosis inducida por TNFa en células WM 266.4 humano. 20,000 células WM266.6 se cubrieron en placas de 96-pozos en medio completo (RPMI1640/10%FBS/Gln/P/S) e incubaron a 37 grados C /C02 10% durante la noche. El medio se retiró y 50 /xL de anticuerpos de prueba más TNFa (pre-incubado por 30 minutos a temperatura ambiente) se agregan en medio libre de suero (RPMI1640/Gln/P/S) . Placas de 50 µ??, de ciclohexamidas se incubaron durante la noche como las condiciones de ensayo finales anteriores: V = 100 ¿L, ciclohexamida = 6 //g/mL, TNFa = 600 pg/mL = 11.4 pM como un trímero. Las concentraciones de anticuerpo de prueba se varían como se describió. 100 µL de amortiguador Caspase y 0.3 /¿L de substrato Caspasa (???-???, Promega) se agregaron por pozo. Se determinó la actividad Caspase en Víctor Wallac; longitud de onda de excitación @ 485 nm; longitud de onda de emisión @ 530nm. Un ejemplo de la habilidad de los anticuerpos para neutralizar apoptosis se ilustra en la Figura 10. La Figura 10 es una gráfica de barras que muestra los valores promedio de IC50 para neutralización de anti-TNFa. La neutralización se realiza en células WM266 de humano y actividad de caspase se mide como una indicación de apoptosis inducida por TNFa. Se realizaron cálculos de 1CS0 de anticuerpo como se describe en la breve descripción de la Figura 7.

[0227] Un control muestra inducción de apoptosis por TNFa y ciclohexamida sola. Otros controles incluyen Ab 014 de conejo así como Infliximab y p75-hFc (R&D) , como un substituto de Etanercept . La gráfica muestra actividad de caspasa como una medida de apoptosis inducida por TNFa. Como puede verse en la Figura 10, los anticuerpos SC299V1 y SC299V2 son consistentemente similares entre sí y además de R014, 263 y probablemente 234, son más potentes que Infliximab y p75-hFc. 4.17 IgG2, SC282 y 3.2 IgG2 fueron más potentes que p75-hFc. También como se indicó por la Figura 10, todos los anticuerpos son neutralizadores potentes de apoptosis inducida por TNFa. Inhibición de producción de IL8 inducida por TNFa en sangre entera de humano.

[0228] Cultivos de sangre entera humana reproducen condiciones de ocurrencia natural de relevancia clínica que pueden no estar presentes en cultivos celulares o en animales experimentales . Se utilizaron cultivos de sangre entera para estimar la eficacia de anticuerpos anti-TNFa para neutralizar producción de IL-8 inducida por TNFa. Se obtuvo sangre entera de donadores normales por venipuntura, recolectada en tubos de EDTA, y revestida en placas de 96 pozos. Se diluyeron anticuerpos anti-TNFa en medio RPMI y mezclaron con la sangre entera. Un anticuerpo IgGl humano irrelevante se utilizó como control. Esto fue seguido por la adición de TNFa (concentración final 100 pg/ml, correspondiente a 1.9 pM considerando TNFa como un trímero) . Las placas luego se incubaron por 6 horas a 37 grados C. Después de incubación, Tritón X-100 se agrega a los cultivos a una concentración final de 0.5% v/v para provocar lisis celular. Se midió producción IL-8 por ELISA. Para expresar resultados, IL-8 inducido por TNFa en la presencia del control de IgGl se ajustó como 100%. La Tabla 28 reporta IC50s para los anticuerpos anti-TNFa calculado utilizando curvas de inhibición (Figura 11) . 299v2 y el substituto de Etanercept demostraron las más bajas IC50s y más altas potencias. Tabla 28 * Construcción Ap75-hFc (R&D Systems) similar a etanercept (Enbrel) se utilizó en estos estudios. Cuando etanercept se utilizó, se obtuvieron resultados semejantes (datos no mostrados) . Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo

[0229] Anticuerpos Anti-TNFa se ensayaron para determinar su capacidad para soportar el exterminio de células CHO transfectadas con TNFa mediado por PBMCs, primordialmente por células NK. Brevemente, PBMCs humanas se obtuvieron de un donador normal y re-suspendieron a una concentración calibrada de manera tal que agregado a las células efectoras, producirán unas proporciones 1:100 células efectoras/obj etivo . Al mismo tiempo, células CHO transíectadas TNFa que expresan en forma estable TNFa ligado a membrana, se etiquetaron con el colorante de membrana PKH-26. Células CHO luego se sembraron en platos de 96 pozos en triplicado con o sin 5 µg/ l de anticuerpos. Después de una incubación de 30 minutos, se agregaron células efectoras, y la reacción ADCC se dejó que ocurriera durante la noche a 37 grados C. En este punto, se recolectaron muestras triplicadas, tiñeron con el colorante TOPO-3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y analizaron por FACS . Las proporciones del número de PKH-26 y células doble positivas TOPO-3 (células objetivo muertas) contra células positivas PKH-26 (células objetivo vivas) se calculó y utilizó para expresar resultados como porcentaje. Los resultados indican que los anticuerpos monoclonales tienen la capacidad por soportar ADCC a la variancia notable con p75-hFc, que se utilizó como substituto de etanercept (Tabla 29) .

Citotoxicidad Dependiente de Complemento

[0230] Anticuerpos anti-TNFa también se ensayaron por la capacidad para fijar complemento y de esta manera mediar el exterminio de células CHO transfectadas con TNFa. Brevemente, células CHO se sembraron a 125000/pozos en placas de 96-pozos y agregaron con 5 µg/ml de anticuerpo en duplicado. Después de 3 horas de incubación en hielo, complemento de conejo se agrega a una concentración final de 10% y la reacción CDC se deja que ocurra por 30 minutos a temperatura ambiente. En este punto, las células se tiñieron con 0.5 xg/ml de PI y 2.5 /¿g/ml de Heochst 33342 por 1 hora y contaron utilizando Autoscope. Los experimentos se realizaron en triplicado. Se calcularon resultados y expresaron como se describió anteriormente para el ensayo de apoptosis inducida por TNFa. Como en el caso de ADCC, los resultados indican que los anticuerpos monoclonales tienen la capacidad por incitar CDC a la variancia con p75-hFc, que se utiliza como substituto de Etanercept (Tabla 29) . Tabla 29 ADCC (%) CDC (%) IG Ctrl 2 + 2 2 + 0 299v2 16 + 5 9 + 1 ADCC (%) CDC (%) 263 10 + 5 17 + 0 Infliximat» 15 + 5 12 + 2 Adalimumab 8 + 4 12 + 1 p75-hFc* 2 + 1 2 + 2 ** Una construcción Ap75-hFc (R&D Systems) similar a Etanercept (Enbrel) se utilizó en estos estudios. EJEMPLO 9 CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-HTNFa IN VIVO Inhibición de lesión hepática inducida por TNFa en ratones

[0231] para probar si anticuerpos TNFa antihumano neutralizan TNFa humano in vivo, se estudió la capacidad de anticuerpos TNFa anti-humano para proteger contra la lesión hepática inducida por TNFa humano y administración D-galactosamina (D-GaIN) en ratones (Lehmann V y colaboradores, J. Exp. Med. , 1387 165 (3) : 657-63) . La administration de TNFa con D-GaIN induce lesión de hígado fulminante que semeja la lesión de hígado inducida por LPS y D-GaIN, caracterizada por una muerte apoptósica muy difundida de hepatocitos, finalmente resultando en choque y letalidad. El tratamiento de D-GaIN hace a los ratones 100-1000 más sensibles a los efectos letales de lipopolisacárico (LPS) así como TNFa murina (Lehmann V, y colaboradores, J. Exp. Med. , 1987 165 (3) : 657-63) . La lesión de hígado apoptósica inducida por LPS y D-GaIN se ha mostrado que depende de TNFa producida endógenamente (Leist M, y colaboradores, Am. J Pathol . , 1995, 146 (5) : 1220-34) . También se ha demostrado que esta lesión de hígado depende exclusivamente de señalización de TNFa secretada a través del receptor p55 (Nowak M, y colaboradores, Ara. J". Physiol. 2000, 278 (5) :R1202-9) , sugiriendo que D-GaIN también sensibiliza los efectos letales de TNFa humano, que en ratones liga solo al receptor TNFa p55. La lesión al hígado inducida por hTNFa y D-GaIN se estima al medir la actividad de enzima en suero de alanina aminotransferasa (ALT) .

[0232] Los experimentos se realizaron como se describe. Ratones hembra Balb/c de 8 a 10 semanas, que pesan aproximadamente 20 g, se obtuvieron de Charles River Laboratories. 8-10 ratones por grupo se emplearon. La dosis y ruta de administración así como el tiempo para medir los niveles ALT en el suero se definieron en los experimentos preliminares. Se inyectaron ratones con D-GalN (Sigma) (900 mg/kg, ip) 90 minutos antes de TNF humano (R&D Systems) (1 /ig/ratón, iv) . La administración intravenosa de 1 /¿g/ratón de TNF resultó en niveles de circulación de TNF de 19 nM (considerando TNF como un trímero) . El daño de hepatocitos se estimó 6 horas después de administración de TNF/GaIN al medir ALT utilizando un equipo de diagnóstico comercial (Sigma) . Para comparar la capacidad de 299v2, 263, Etanercept, Adalimumab e infliximab para inhibir TNFa in vivo, se realizaron experimentos de respuesta a dosis al inyectar reactivos anti-TNF (1-10 i.v. /xg/ratón) 90 minutos antes de TNF (1 ^g/ratón, iv) . Los ratones de control recibieron salino antes que TNF. Se expresaron datos como % de control y se generaron curvas de neutralización (Figura 12) . Se calcularon lC50s utilizando una curva de ajuste de cuatro parámetros. La Tabla 30 muestra los IC50s para los diferentes reactivos anti-TNF promediados a partir de diferentes experimentos . Inhibición de producción de IL-6 inducida por TNFa en ratones

[0233] Como otro enfoque a probar la habilidad de anticuerpos anti-TNFa para inhibir TNFa in vivo, se utilizaron anticuerpos anti-TNFa para bloquear la producción de IL-6 inducida en ratones por humano. TNFa engendran muchas acciones biológicas agudas, incluyendo la inducción de IL-6 (Benigni y colaboradores, J. Immunol . 157:5563, 1996) . 8-10 ratones por grupo fueron empleados . Como se estableció inicialmente en experimentos en el curso del tiempo, la inyección de TNFa humano en ratones provoca un aumento rápido en niveles IL-6 en suero que alcanza un máximo a 2 horas después de inyección. Con base en los resultados de otros experimentos preliminares dirigidos a definir la dosis y ruta de administración de TNFa, se inyectaron ratones intravenosamente con 1 xg/ratón de TNFa humano. Niveles IL-6 se midieron 2 horas después de la administración de TNFa utilizando un equipo ELISA comercial (R&D System) . Experimentos de respuesta de dosis se realizaron al inyectar anticuerpos anti-TNFa (1-10 i.v. 90 minutos antes que TNFa (1 µg/ratón, iv) . Ratones de control recibieron salino antes que TNFa. Se expresaron datos como un por ciento de control y curvas de neutralización se generaron (Figura 13) . IC50s se calcularon utilizando una curva de ajuste de cuatro parámetros. La Tabla 30 muestra los IC50s para los diferentes anticuerpos anti-TNFa promediados a partir de diferentes experimentos . Tabla 30 Potencia In vivo (nM) ALT IL-6 299v2 50 + 4 43 + 1 263 48 + 6 35 + 5 Infliximab 41 + 10 43 + 21 Potencia In vivo (nM) ALT IL-6 Adalimumab 40 + 1 36 + 5 Etanercept 27 + 16 27 + 14 EJEMPLO 10 ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE ANTICUERPOS ANTI-TNPa

[0234] Las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables para los anticuerpos mostrados en la Tabla 1 anterior, se secuenciaron para determinar sus secuencias de ADN. La información de secuencia completa para todos los anticuerpos anti-TNFa, se muestra en el listado de secuencia presentado aquí, incluyendo secuencias de nucleótidos y amino ácidos .

[0235] La Tabla 31 es una tabla que compara diversas regiones de cadena pesada de anticuerpo derivadas de XENOMAXMR a una región de cadena pesada de línea germinal particular. La Tabla 32 es una tabla que compara diversas regiones de cadena ligera de anticuerpo derivado de XENOMAXMR con una región de cadena ligera de linea germinal particular. La Tabla 33 es una tabla que compara diversas regiones de cadena pesada de anticuerpo derivado de hibridoma a una región de cadena pesada de línea germinal particular. La Tabla 34 es una tabla que compara diversas regiones de cadena ligera de anticuerpo derivado de hibridoma con una región de cadena ligera linea germinal particular. Tabla 31. Análisis de Cadena Pesada Xenomax SEQ Célula V FR1 ID Sencilla Pesado/D/J NO: 267 - Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS germinal 74 293 v. 2 VH3-33/D5- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 5/JH6b 70 299 v. 1 VH3-33/D5- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 5/JH6b 38 148 VH3-33/D5- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 5/JH6b 78 313 VH3-33/D5- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 2 /JH6b 6 15 VH3-33/D6- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCARSGFTFS 6/JH6b 22 95 VH3-33/D6- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 19/JH6b 268 - Línea EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS germinal 46 250 VH3-53/D3- EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS 16/JH4b SEQ Célula V FR1 ID Sencilla Pesado/D/J NO: 50 263 VH3-53/D3- EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVS 16/JH4b 54 269 VH3-53/D3- EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASEFTVS 16/JH4b 269 - Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS germinal 58 280 VH3-33/D4- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTVS 17/JH6b 62 282 VH3-33/D4- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTVS 17/JH6b 66 291 VH3-33/D1- QVQLVESGGSWQPGRSLRLSCAASGFTFS 26/JH6b 270 - Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS germinal 42 234 VH3-30/D1- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 26/JH6b 34 140 VH3-30/D1- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 20/JH6b 14 28 VH3-30/D3- QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS 3/JH6b 271 - Línea QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS germinal SEQ Célula V FR1 ID Sencilla Pesado/D/J NO: 18 69 VH4-4/D2- QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIN 2/JH2 272 - Línea QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS germinal 2 2 VH4-31/D1- QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS 20/JH6b 10 25 VH4-31/D1- QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS 20/JH6b 30 131 VH4-31/D1- QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS 20/JH6b 26 123 VH4-31/D1- QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIS 20/JH6b (cont.) Tabla 31. Análisis de Cadena Ligera Xenomax SEQ ID CDR1 FR2 NO : 267 SYGMH WVRQAPGKGLEWVA 74 SYDMH WVRQAPGKGLEWVA 70 SYDMH WVRQAPGKGLEWVA 38 NYDMH WVRQAPGKGLEWVA 78 NHDIH WVRQAPGKGLEWVA SEQ ID CDR1 FR2 NO: 6 SYDIH WVRQAPGKGLEWVA 22 NYDMH WVRQAPGKGLEWVA 268 SNYMS WVRQAPGKGLEWVS 46 SNYMS WVRQAPGKGLEWVS 50 RNYMS WVRQAPGKGLEWVS 54 RNYMS WVRQAPGKGLEWVS 269 SYGMH WVRQAPGKGLEWVA 58 SYGMH WVRQAPGKGLEWVA 62 SYGMH WVRQAPGKGLEWVA 66 NYGIH WVRQAPGKGLEWVA 270 SYGMH WVRQAPGKGLEWVA 42 SYDMH WVRQAPGKGLEWVA 34 SYGMH WVRQAPGKGLEWVA 14 NYGMH WVRQAPGKGLEWVT 271 SYYWS WIRQPAGKGLEWIG 18 HYYWS WIRQPAGKGLEWIG 272 SGGYYWS WIRQHPGKGLEWIG 2 SGGYYWS WIRQHPGKGLEWIG 10 SGGYYWS WIRQHPGKGLEWIG 30 SGGYYWS WIRQHPGKGLEWIG 26 SGGYYWS WIRQHPGKGLEWIG SEQ Célula CDR2 FR3 ID sencilla NO: 267 - VIWYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 74 299 v. 2 VIWSDGSIKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCAR 70 299 v. 1 VIWSDGSIKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 38 148 VIWYDGSIKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAR 78 313 VIWSDGSN YY7ADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 6 15 VIWYDGSIKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 22 95 VIWYDGSIKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYCAR 268 - VIYSGGSTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 46 250 VIYSGDRTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 50 263 VIYSGDRTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 54 269 VIYSGDRTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 269 - VIWYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 58 280 VIWSNGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 62 282 VI SNGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 66 291 VIWSDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 270 - VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 42 234 VISYDGSIKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQVNSLRREDTAVYYCAR 34 140 VISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 14 28 IISYDGSNKYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVT 271 - RIYTSGSTNYNPSLKS RVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR 18 69 RIYPTGSTNYNPSLKS RVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAG 272 - YIYYSGSTYYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTARDTAVYYCAR SEQ Célula CDR2 FR3 ID sencilla NO: 2 2 NIYYSGSTYYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR 10 25 NIYYSGSTYYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR 30 131 NIYYSGSTYYNPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR 26 123 NIYYSGSTYYTPSLKS RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR SEQ ID NO: CDR3 FR4 267 WGQGTTVTVSS 74 EVESAMGGFYYNG DV WGQGTTVTVSS 70 EVESAMGGFYYNGMDV WGQGATVTVSS 38 ETAILRGYYYYDMDV WGQGTTVTVSS 78 EKMATIKGYYYYGMD WGQGTTVTVSS 6 EEQLVRGGYYYYGMDV WGQGTTVTVSS 22 EIAVAGGYYYGLD WGQGTTVTVSS 268 WGQGTLVTVSS 46 GEGGFDY WGQGTLVTVSS 50 GEGGFDY WGQGTLVTVSS 54 GEGGFDY WGQGTLVTVSS 269 WGQGTTVTVSS 58 DNGVYVGYAYYYGMDV WGQGTTVTVSS 62 DNGVYVGYAYYYGMDV WGQGTTVTVSS 66 ELPNSGSYSGYYYYYGMDV WGQGTTVTVSS 270 WGQGTTVTVSS SEQ ID NO: CDR3 FR4 42 EVRSGSYYYYYSMDV WGQGTTVTVSS 34 DQDNWNYYYGMDV WGQGTTVTVSS 14 YYDEWSGYLPG DV WGQGTTVTVSS 271 WGRGTLVTVSS 18 GWSY YFDL WGRGTLVTVSS 272 WGQGTTVTVSS 2 DSNQYNWNDEVYDYGLDV WGQGTTVTVSS 10 DSNQYNWNDEVYDYGLDV WGQGTTVTVSS 30 DSNQYNWNDEVYDYGLDV WGQGTTVTVSS 26 DSNQYNWNDEVYDYGLDV WGQGTTVTVSS Tabla 32. Análisis de Cadena Ligera XENOMAXME SEQ Célula V Kappa/J FR1 ID sencilla NO: 273 - Línea germinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 72 299 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 80 313 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 68 291 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 44 234 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 4 2 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 12 25 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSSLSASVRDRVTITC 32 131 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSALSASVGDRVTITC 8 15 A30VK1/JK4 DIQMTQSPSSLSASIGDRVTITC SEQ Célula V Kappa/J FR1 ID sencilla NO: 24 95 A30VK1/J 4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 40 148 A30VK1/J 4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 28 123 A30V 1/JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 274 - Línea germinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 60 280 A30VK1/JK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 64 282 A30VK1/JK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 16 28 A30VK1/JK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 275 - Línea germinal DWMTQSPLSLPVTLGQPASISC 20 70 A1VK2/JK4 DWMTQSPLSLPVTLGQPASISC 276 - Línea germinal DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC 36 145 A19VK2/JK1 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC 277 - Línea germinal EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC 48 250 L2VK3/J 1 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC 52 263 L2VK3/JK1 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC 56 269 L2VK3/JK1 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC SEQ ID NO: CDR1 FR2 273 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 72 RASQGIRIDLG WYQQKPGKAPKRLIY 80 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 68 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 44 RASQDIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY SEQ ID NO: CDR1 FR2 4 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 12 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAP RLIY 32 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 8 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 24 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 40 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIS 28 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 274 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 60 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 64 RASQGIRNDLG WYQQKPGKAPKRLIY 16 RASQGIRNDLT WYQQKPGKAPKRLIY 275 RSSQSLVYSDGNTYLN WFQQRPGQSPRRLIY 20 RSSQSLVYSDGSTYLN WFQQRPGQSPRRLIY 276 RSSQSLLHSNGYNYLD WYLQKPGQSPQLLIY 36 RSSQSLLHSNGYNYLD WYLQKPGQSPQLLIF 277 RASQSVSSNLA WYQQKPGQAPRLLIY 48 RASQSVTSNLA WYQQKPGQAPRLLIH 52 RASQSVSSNLA WYQQKPGQAPRLLIH 56 RASQSVSSNLA WYQQKPGQAPRLLIH SEQ Célula CDR2 FR3 ID sencilla NO: 273 - AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC SEQ Célula CDR2 FR3 ID sencilla NO: 72 299 7AASTLQS GVPSRFSGSGSGTEFIFTISSLQPEDFASYYC 80 313 7AASSLES GVPSRFSGSGSGPEFTLTISSLQPEDFATYYC 68 291 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 44 234 7AASSLQS GVPSRFSGSGSGPEFTLTISSLQPEDFATYYC 4 2 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 12 25 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 32 131 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 8 15 AASSLQS GVPSRFSGSGSGPEFTLTISSLQPEDFATYYC 24 95 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTVSSLQPEDFATYYC 40 148 AASSLQG GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 28 123 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 274 - AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 60 280 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 64 282 AASSLHS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 16 28 AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC 275 - KVWNWDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 20 70 KVWNWDS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 276 - LGSNRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 36 145 LGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 277 - GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 48 250 GASIRAT GLPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC 52 263 GASIRAT GLPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC SEQ Célula CDR2 FR3 ID sencilla NO: 56 269 GASIRAT GLPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC SEQ ID NO: CDR3 FR4 273 LQHNSYPLT FGGGTKVEIK 72 LQHKSYPLT FGGGTKVEIK 80 LQHNSYPLT FGGGTKVEIQ 68 LQHCCYPLT FGGGTKVEIK 44 LQHNSYPLT FGGGTKVEIK 4 LQHNNYPLT FGGGTKVEIK 12 LQHNSYPLT FGGGTKVEIK 32 LQHKSYPLT FGGGTKVEIK 8 LQHNSYPLT FGGGTKVEIK 24 LQHHSYPLT FGGGTKVQIN 40 LQHNSYPLT FGGGTKVEIK 28 LQHNNYPLT FGGGTKVEIK 274 LQHNSYPWT FGQGTKVEIK 60 LQHNSYPRT FGQGTKVEI 64 LQHNSYPWT FGQGTKVEIK 16 LQHNSFPWT FGQGTKVEIK 275 QGTHWP##LT FGGGTKVEIK 20 MQGSHWPREFT FGGGTKVEIK 276 MQALQTWT FGQGTKVEIK SEQ ID NO: CDR3 FR4 36 MQALQTWT FGQGTKVEIK 277 QQYNNWWT FGQGT VEIK 48 QQYNYWWT FGQGTKVEIK 52 QQYNYWWT FGQGTKVEIK 56 QQYNYWWT FGQGTKVEIK Tabla 33. Análisis de Cadena Pesada de Hibridoma AB-TNFa- XG2 NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 278 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal 2.14 132 VH3-33/D6- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GLIFSSYG H 19/JH6b 2.13 128 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GLIFSNYGMH 2.10 124 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 279 Línea EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS CAAS GFTFSSYAMS germinal 4.23 262 VH3-23/D3- EVQLLESGGGLVQPGGSLRLS CAAS GFTFSSYAMS 22/JH4b 280 Línea EVQLVESGGGLVKPGGSLKLS CAAS G TFSSYSMN germinal NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 2.21 158 VH3-21/D1- EVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAAS GFTFSSYSMN 20/JH6b 281 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal 4.7 198 VH3-33/D6- QVQLVESGGG QPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 19/JH4b 4.11 214 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 282 Línea EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS germinal 3.9 18S VH3-53/-- EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS /JH3b 3.8 182 EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSNNYMH 283 Línea EVQLVQSGAEVKKPGESLKIS CKGS GYSFTSYWIG germinal 2.4 100 VH5-51/D3- EVQLVQSGAEVKKPGESLKIS CKGS GYSFTSDWIG 3/JHSb 284 Línea QVQLVQSGAEV KPGASVKVS CICAS GYTFTSYGIS germinal 3.4 170 VH1-18/D6- QVQLVQSGAEV KPGASV VS C AS GYTFTFYSIT 285 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 2.3 96 VH3-33/D4- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMN 23/JH4b 4.8 202 QVHLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 4.4 194 QVHLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 4.3 190 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 286 Línea EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS germinal 2.17 144 VH3-53/D7- EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYVN 287 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal 4.13 222 222 VH3- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYDMH 30/D4- 17/JH6b 288 Línea QVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAAS GFTFSDYYMS germinal 1.1 94 VH3-11/-- QVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAAS GFTFSDYYMS /JH6b 2.15 140 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAAS GFTFSDYYMS 2.18 148 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLS CAAS GFTFSDYYMS 289 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 4.12 218 VH3-33/D4- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 17/JH6b 4.9 206 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 290 Línea QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS CKAS GYTFTSYGIS germinal 2.6 108 VH1-18/D1- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS CKAS GYTFTSYGIS 7/JH4b 291 Línea EVQLVQSGAEVKKPGESLKIS CKGS GYSFTSYWIG germinal 3.2 166 VH5-51/D7- EVQLVQSGAEVKKPGESLKIS CKTS GYSFTSYWIG 27/JH4b 292 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal 4.16 234 VH3-33/D2- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CTTS GFTFS YGMH 21/JH6b 4.15 230 OQVQLVESGGGWQPGRSLRLS CTTS GFTFSNYGMH 4.14 226 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CTTS GFTFSNYGMH 4.17 238 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CTTS GFTFSNYGMH 293 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal 2.1 88 VH3-33/-- QVQLVESGGDWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSSGMH /JH6b NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 294 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal 2.2 92 VH3-33/D4- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 23/JH4a 295 Linea QVQLQESGPGLVKPSETLSLT CTVS GGSISSYYWS germinal 3.6 178 VH4-59/D6- QVQLQESGPGLVKPSETLSLT CTVS GGSISSYY S 19/JH4b 296 Línea EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAAS GFTFSSYSMN germinal 4.22 258 VH3-48/D1- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS CAAS GFTFSNYGMN 14/JH4b 297 Línea EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS germinal 2.9 120 VH3-53/-- EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS /JH4b 298 Línea QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS CKAS GYTFTGYYMH germinal 3.1 162 VH1-2/D6- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVS CKAS GYTFTGYY H 19/JH6b 293 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 4.19 246 VH3-33/D3- QVQLVSSGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 9/JH6b 4.18 242 QVQLVSSGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 2.8 116 QVQLVSSGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 4.20 250 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 2.7 112 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 300 Línea EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS germinal 2.19 152 VH3-53/-- EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS /JH6b 2.15 136 EVQLVESGGGLIQPGGSLRLS CAAS GFTVSSNYMS 301 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSNYGMH germinal 2.5 104 VH3-33/D3- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYDMH 10/JH6b 3.5 174 QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYDMH 302 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal 4.30 210 VH3-33/D4- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 17/JH5b 303 Línea QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH germinal NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 4.21 254 VH3-33/D6- QVQLVESGGGWQPGRSLRLS CAAS GFTFSSYGMH 19-D7- 27/JHSb NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 2.14 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ERDSSGWYYYG WGQGTTVTVSS WA ADSVKG AEDTAVYYCAR MDV 2.13 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR EGIAVAGPPYY WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR YYGMDV 2.10 WVRQAPGKGLE VIWYDGSIKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ERDSSGWYYYG WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR MDV WVRQAPGKGLE AISGSGGSTYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS WVS ADSVKG AEDTAVYYCAK 4.23 WVRQAPGKGLE AISGSGGSTYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR DYYDSSGYHPF WGQGTLVTVSS VS ADSVKG AEDTAVYYCAK DY WVRQAPGKGLE SISSSSSYIYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS VS ADSVKG AEDTAVYYCA# NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA 2.21 WVRQAPGKGLE SISSSSSYIYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR GGITGTTNYYG WGQGTTVTVSS WVS ADSVKG AEDTAVYYCAR MDV WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 4.7 WVRQAPGKGLE IIWYDGSNEYY RFTISRDNSKNTLFLQMNSLR DPLRIWAGDF WGQGTLVTVSS WVA GDSVKG AEDTAVYYCAR DY 4.11 WVRQAPGKGLE IIWYDGSNEYY RFTISRDNSKNTLFLQMNSLR DPLRIWAGDF WGQGTLVTVSS WVA GDSVKG AEDTAVYYCAR DY WVRQAPGKGLE VIYSG3STYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTMVTVSS VS DSVKG AEDTAVYYCAR 3.3 WVRQAPGKGLE VIYSGGSTYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR GPGAFDI WGQGTMVTVSS WVS DSVKG AEDTAVYYCAR 3.8 WVRQAPGKGLE VIYSGGNTYYA RFTISRDNSKNTLFLQMNSLR GPGAFDI WGQGTMVTVSS WVS DSVKG TEDTAVYYCAR WVRQ PGKGLE IIYPGDSDTRY QVTISADKSISTAYLQWSSLK WGQGTTVTVSS WMG SPSFQG ASDTAMYYCAR 2.4 WVRQMPGKGLE IIYPGDSDTRY QVTISADKSITTAYLQWSSLK SGYGMDV WGQGTLVTVSS WMG SPSFQG ASDTAMYYCAR WVRQAPGQGLE WISAYNGNTNY RVTMTTDTSTSTAYMELRSLR WGQGTTVTVSS WMG AQKLQG SDDTAVYYCAR 3.4 WVRQAPGQGLE WISAYNDNTNY RVTMTTDTSTSTAYMELRSLR TFTSGFDY WGQGTLVTVSS NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WMG AQKLQG SDDTAVYYCAR WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 2.3 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYVQMNSLR ESDYGGNPYFD WGQGTLVTVSS WVA GDSVKG AEDTAVYYCAR Y 4.8 WVRQAPGKGLE VIWHDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ESDYGGYPYFD Y WGQGILATVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCTR 4.4 WVRQAPGKGLE VIWHDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ESDYGGYPYFD Y WGQGILATVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCTR 4.3 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ESDYGGNPYFD Y WGQGTLAAVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR WVRQAPGKGLE VIYSGGSTYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS WVS DSVKG AEDTAVYYCAR 2.17 WVRQAPGKGLE VIYNAGSAYYA RFTISRDNSKNTLFLQMNSLR GTGAFDY WGQGTLVTVSS WVS DSVKG AEDTAVYYCAR WVRQAPGKGLE VIS DGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 4.13 WVRQAPGKGLE IISYDGSIKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ENAVTYGGYYH WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV WIRQAPGKGLE YISSSGSTIYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVS ADSVKG AEDTAVYYCAR 1.1 WIRQAPGKGLE YISRSGSTIYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR SLGGMDV WGQGTTVTVSS NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WVS ADSVKG AEDTAVYYCAR 2.16 WIRQAPGKGLE YISRSGSTIYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR SLGGMDV WGQGTTVTVSS WVS ADSVKG AEDTAVYYCAR 2.18 WIRQAPGKGLE YISRSGSTIYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR SLGGMDV WGQGTTVTVSS WVS ADSVKG AEDTAVYYCAR WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 4.12 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ETTVTKEGYYY WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV 4-9 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFT SRDNSKNTLYLQMNSLR ETTVTKEGYYY WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV WVRQAPGQGLE WISAYNGNTNY RVTMTTDTSTSTAYMELRSLR WGQGTLVTVSS WMG AQKLQG SDDTAVYYCAR 2.6 WVRQAPGQGLE WISAYNVNTNY RVTMTTDTSTNTAYMELRSLR DPITETMEDYF WGQGTLVTVSS WMG AQKLQG SDDTAVYYCAR DY WVRQMPGKGLE IIYPGDSDTRY QVTISADKSISTAYLQWSSLK WGQGTLVTVSS WMG SPSFQG ASDTAMYYCAR 3.2 WVRQMPGKGLE IIYLGDSDTRY QVTISADKSISTAYLQWSSLK SNWGLDY WGQGTLVTVSS WMG SPSFQG ASDTAMYYCAR WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 4.16 WVRQAPGKGLE VIWYDGSIKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR EKDCGGDCYSH WGQGTTVTVSS NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WVA VDSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV 4.15 WVRQAPGKGLE VIWYDGSIKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR EKDCGGDCYSH WGQGTTVTVSS WVA VDSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV 4.14 WVRQAPGKGLE VIWXDGSIKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR EKDCGGDCYSH WGQGTTVTVSS WVA VDSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV 4.17 WVRQAPGKGLE VIWYDGSIKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR EKDCGGDCYSH WGQGTTVTVSS WVA VDSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 2.1 WVRQAPGKGLE IIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR DDYYYGMDV WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 2.2 WVRQAPGKGLE VIWYDGNNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ESDYGGNPYFD Y WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR WIRQPPGKGLE YIYYSGSTNYN RVTISVDTSKNQFSLKLSSVT WGQGTLVTVSS WIG PSLKS AADTAVYYCAR 3.6 WIRQPPGKGLE YFYYSGSTNYN RVTISVDTSKNQFSLKLRSVT DRFTSGWFDY WGQGTLVTVSS WIG PSLKS AADTAVYYCAR WVRQAPGKGLE ISSSSSTIYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WVS ADSVKG DEDTAVYYCAR 4.22 WVRQAPGKGLE YISNSITSKYY RFTISRDNAKNSLYLQMNSLR GPGGFDY WGQGTLVTVSS WVS ADSVKG DVDTAVYHCAR WVRQAPGKGLE VIYSGGSTYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS WVS DSVKG AEDTAVYYCAR 2.9 WVRQAPGKGLE VIYSGGGTYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR GPGSFDY WGQGTLVTVSS WVS DSVKG AEDTAVYYCAR WVRQAPGQGLE WINPNSGGTNY RVTMTRDTSISTAYMELSRLR WGQGTTVTVSS WMG AQKFQG SDDTAVYYCAR 3.1 WVRQAPGQGLE WINPNSGGTNY RVTMTRDTSISTAYMELSRLR APLWTVRSWYY WGQGTTVTVSS WMG AQKFQG SDDTAVYYCAR YGMDV WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 4.19 WVRQAPGKGLE VIWYDGRNKYN RFTISRDNSKNTLNLQMNSLR DLTYYDILGGM WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR DV 4.18 WVRQAPGKGLE VIWYDGRNKYN RFTISRDNSKNTLNLQMNSLR DLTYYDILGGM WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR DV 2.8 WVRQAPGKGLE VIWYDGRNKYN RFTISRDNSKNTLNLQMNSLR DLTYYDILGGM WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR DV 4.20 WVRQAPGKGLE VIWYDGRNKYN RFTISRDNSKNTLNLQMNSLR DLTYYDILGGM WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR DV 2.7 WVRQAPGKGLE VIWYDGRNKYN RFTISRDNSKNTLNLQMNSLR DLTYYDILGGM WGQGTTVTVSS NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA OTA ADSVKG AEDTAVYYCAR DV WVRQAPGKGLE VIYSGGSTYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVS DSVKG AEDTAVYYCAR 2.19 WVRQAPGKGLE VIYSGGSTYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR GEGGMDV WGQGTTVTVSS VS DSVKG AEDTAVYYCAR 2.15 WVRQAPGKGLE VIYSGGSTYYA RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR GEGGMDV WGQGTTVTVSS WVS DSVKG AEDTAVYYCAR WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 2.5 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYH RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ENTMVRGGDYY WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV 3.5 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYH RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR ENTMVRGGDYY WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR YGMDV WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTLVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 4.30 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR SRYGDWGWFDP WGQGTLVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR 4.21 WVRQAPGKGLE VIWYDGSNKYY RFTISRDNSKNTLYLQMNSLR GNRVWAGTRV WGQGTTVTVSS WVA ADSVKG AEDTAVYYCAR TPANWGYYYYG MDV Tabla 34. Análisis de Cadena Ligera de Hibridoma AB- TNFa-XG2K NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 304 Línea germinal QSVLTQPPSVSGAPGQRVTIS C TGSSSNIGAGY DVH 2.4 102 V1-13/JL2 QSLLTQPPSVSGAPGQRVTIS C TGSSSNIGAGY DVH 4.7 200 QSVLTQPPSVSGAPGLRVTIS C TGNSSNIGAGY DVH 305 Línea germinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 4.9 208 A30/JK4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 4.21 256 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 4.20 252 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRHDLG 4.17 240 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 4.16 236 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 2.14 134 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQAIRNDLG 4.15 232 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 3.9 188 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 4.14 228 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 4.13 224 DIQMTQSPSSLSTSVGDRVTI TC RASQGIRNDLG NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 4.12 220 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 2.10 126 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGTRNDLG 3.6 180 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 3.5 176 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 306 Línea germinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGISNYLA 4.23 264 A20/JK3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGISNYLA 307 Línea germinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 4.22 260 A30/JK1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQGIRNDLG 308 Línea germinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RASQSISSYLN 2.16 142 012/JK5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVAI TC RTSQSISSYLN 2.19 156 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RTSQSISSYLN 2.18 150 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RTSQSISSYLN 2.21 160 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC RTSQSISSYLN 309 Línea germinal QSVLTQPPSVSAAPGQ VTIS C SGSSSNIGNNY S 3.1 1S4 V1-19/JL3 QSVLTQPPSMSAAPGQKVTIS C SGSSSNIGNNY S 1.1 86 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTIS C SGSSSNIGNNY VS 310 Línea germinal EIVMTQSPATLSVSPGERATL SC RASQSVSSNLA 3.8 184 L2/JK5 EIVMTQSPATLSVSPGERVTL SC RASQSATSNLA 311 Línea germinal QSVLTQPPSVSAAPGQKVTIS C SGSSSNIGNNY NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA S 2.1 90 V1-19/JL2 QSALTQPPSVSAAPGQKVTIS C SGSSSNIGSNY VS 312 Línea germinal DIQMTQSPSSVSASVGDRVTI TC RASQGISSWLA 2.9 122 L5/JK1 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTI TC RASQGISSWLA 313 Línea germinal EIVMTQSPATLSVSPGERATL SC RASQSVSSNLA 4.11 216 L2/JK4 ETVMTQSPATLSVSPGERATL SC RASQSVISNLA 2.17 1 6 .. EIVMTQSPATLSVSPGERATL SC RASQSVSSNLA 314 Línea germinal EIVMTQSPATLSVSPGERATL SC RASQSVSSNLA 4.18 244 L2/JK3 EIVMTQSPATLSVSPGERATL SC RASQSVTSNLA 2.15 138 EIVMTQSPSTLSVSPGERATL SC RASQSVSSNLA 4.19 248 EIVMTQSPSTLSVSPGERATL SC RASQSVTSNLA 315 Línea germinal QSVLTQPPSASGTPGQRVTIS C SGSSSNIGSNT VN 4.10 212 V1-16/JL3 QSVLTQPPSASGTPGQRVTIS C SGSSSNIGSNT VN 316 Línea germinal SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRSYYAS 2.5 106 V2-13/JL3 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRRYYAS 3.4 172 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRRYYAS 317 Línea germinal SYELTQPPSVSVSPGQTARIT C SGDALPKKYAY 2.19 154 V2-7/JL2 SYELTQPPSVSVSPGQTARIT C SGDALPKKYVY 318 Línea germinal DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC QASQDISNYLN NOMBRE SEQ ID FR1 CDR1 DE NO: CADENA 2.13 130 018/JK5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTI TC QASQDISNYLN 319 Línea germinal SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRSYYAS 2.3 98 V2-13/JL2 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLR1YYAS 2.6 110 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRNYYAS 4.3 192 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRSYYAS 4.8 204 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDILRSYYAS 2.8 118 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRRYYAS 2.2 94 .. SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDSLRSYYAS 4.4 196 SSELTQDPAVSVALGQTVRIT C QGDILRSYYAS 320 línea germinal QSVLTQPPSVSGAPGQRVTIS C TGSSSNIGAGY DVH 3.2 168 V1-13/JL3 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTIS C TGSSSNIGAGY DVH 2.7 114 QSVLTQSPSVSGAPGQRVTIS C TGSSSNIGAGY DVH NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WYQQLPGTAPK GNSNEPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITG QSYDSSLSGSV FGGGTKLTVL LLIY LQAEDEADYYC NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA 2.4 WYQQFPGTAPK GNSNRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITG QSYDSSLSGSV FGGGTKLTVL LLIY LQAEDEADYYC 4.7 WYQQLPGTAPK GNSNRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITG QSYDSSLSGSV FGGGTKLTVL LLIY LQAEDETDYYC WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNSYPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 4.9 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNSYPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 4.21 WYQQKPGKAPK VASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNSYPLT FGGGTKVEIK CLIY LQPEDFATYYC 4.20 WYQQKPGKAPE GASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNSYPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 4.17 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHMSLPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 4.16 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHMSLPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 2.14 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSRSGTEFTLTISS LQHRSYPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFASYYC 4.25 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHMSLPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 3.9 WFQQKPGKAPK AASNFLS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNPYPPRLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFTTYYC NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA 4.14 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHMSLPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 4.13 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQH SYPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 4.12 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNSYPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 2.10 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTVSS LQHNSLPLT FGGGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 3.6 WYQQKPRKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGPEFTLTISS LQHNSYPLT FGGGTKVEIK RLIP LQPEDFATYYC 3.5 WYQQKPRKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGPEFTLTISS LQHNSYPLT FGGGTKVEIK RLIF LQPEDFATYYC WYQQKPGKVPK AASTLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QKYNSAPFT FGPGTKVDIK LLIY LQPEDVATYYC 4.23 WYQQKPGKVPK AASTLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTVSS QMYNSVPFT FGPGTKVDIK FLIY LQPEDVATYYC WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNSYPWT FGQGTKVEIK RLIY LQPEDFATYYC 4.22 WYQQKPGKAPK VASSLQS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQHNSYPWT FGQGTKVEIK CLIY LQPEDFATYYC WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QQSYSTPIT FGQGTRLEIK LLIY LQPEDFATYYC NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA 2.16 WYQQKPGKAPE AASNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QQSSSTLIT FGQGTRLEIK LLIY LQPEDFATYYC 2.19 WYQQKPGKAPE AASNLQR GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QQSSSTLIT FGQGTRLEIK VLIY LQPEDFATYYC 2.18 WYHQKPGKAPE AAFNLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QQSSSTLIT FGQGTRLEIK LLIY LQPEDFATYYC 2.21 WYQQKPGKAPE AAFNLQS GVPSRISGSGSGTDFTLT1SS QQSSSTLIT FGQGTRLEIK LLIY LHPEDFATYYC WYQQLPGTAPK DNNKRPS GIPDRFSGSKSGTSATLGITG GTWDSSLSAGV FGGGTKLTVL LLIY LQTGDEADYYC 3.1 WYQQLPGIAPK DNNKRPS GIPDRFSGSKSGTSATLGITG GTWDSSLSAGV FGGGTKLTVL LLIY LQTGDEADYYC 1.1 WYQQFPGTAPK DNNSRPS GIPDRFSGSKSGTSATLGITG GTWDSSLSAGV FGGGTKLTVL LLIY LQTGDEADYYC WYQQKPGQAPR GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISS QQYNNWPIT FGQGTRLEIK LLIY LQSEDFAVYYC 3.8 WYQQKPGQAPR GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISS QQYNNWPFT FGQGTRLEIK LLIY LQSEDFAVYYC WYQQLPGTAPK DNNKRPS GIPDRFSGSKSGTSATLGITG GTWDSSLSAGV FGGGTKLTVL LLIY LQTGDEADYYC 2.1 WCQQLPRTAPK DNNKRPS GIPDRFSGSKSGTSATLVITG GAWDSSLSAGV FGGGTKLTVL LLIY LQTGDEADYYC NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QQANSFPWT FGQGTKVEIK LLIY LQPEDFATYYC 2.9 WYQQKPGKAPK AASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISS QQA SFPWT FGQGTKVEIK LLIY LQPEDFASYYC WYQQKPGQAPR GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISS QQYNNWPLT FGGGTKVEIK LLIY LQSEDFAVYYC 4.11 WYQQQPGQAPR GASTRAT GFPARFSGSGSGTEFTLTISS QQYNNWPLT FGGGTKVEIK LLIY LQSEDFAVYYC 2.17 WYQQKPGQAPR GASTRAT GIPARFSGSRTGTEFTLTISS QQYNNWPLT FGGGTKVEIK LLIY LQSEDFAVYYC WYQQKPGQAPR GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISS QQYNNWPFT FGPGTKVDIK LLIY LQSEDFAVYYC 4.18 WYQQKPGQAPR GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISS QQYHTWPFT FGPGTKVDIK LLIY LPSEDFAVYYC 2.15 WYQQKPGQAPR GASIRAT GIPARFSGSGSGTEYTLTISS QQYNNWPFT FGPGTKVDIK LLIY LQSEDFAVYYC 4.19 WYQQKPGQAPR GASTRAT GIPARFSGSGSGTEFTLTISS QQYHTWPFT FGPGTKVDIK LLIY LPSEDFAVYYC WYQQLPGTAPK SNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISG AAWDDSLNGPV FGGGTKLTVL LLIY LQSEDEADYYC 4.10 WYQQLPGTAPK SNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISG AAWDDSLNGPV FGGGTKLTVL LLIY LQSEDEADYYC NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA WYQQKPGQAPV GKNNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG NSRDSSGNHLV FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC 2.5 WYQQKPGQAPI GKNNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG NSRDSSGNHLV FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC 3.4 WYQQKPGQAPI GK NRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG NSRDSSGNHLV FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC WYQQKSGQAPV EDSKRPS GIPERFSGSSSGTMATLTISG YSTDSSGNHW FGGGTKLTVL LVIY AQVEDEADYYC 2.13 VÍYQQ SGQAPV EDSKRPS GIPERFSGSSSGTMATLTING YSTDSSGNHW FGGGTKLTVL LVIY AQVEDEADYYC YQQ PGKAPK DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISS QQYDNLPIT FGQGTRLEIK LLIY LQPEDIATYYC 2.13 WYQQKPGKAPK DASNLET GVPSRFSGSGSGTDFTFTISS HQCDNLPH FGQGTRLEIK LLIY LQPEDIATYYC WYQQKPGQAPV GKNNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG NSRDSSGNHW FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC 2.3 WYQQKPGQAPV GKNNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTVTG KSRDSSFNHVT FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC 2.6 WYQQKPGQAPI GKNNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG NSRDSSGNHVT FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC 4.3 WYQQKPGQAPV GKNNRPS GIPDRFSGSSSENTASLTITG KSRDSSFNHVT FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC NOMBRE FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 DE CADENA 4.8 WYQQKPGQAPI GKNNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG KSRDSSYNHVT FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC 2.8 WYQQKPGQAPI GKKNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG KSRDSSGNHVT FGGGTKLTVL WIY AQAEDEADYYC 2.2 YQQRPGQAPV GRNNRPS GIPDRFSGSSSGLTASLTVTG NSRDSSYNHVA FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC 4.4 WYQQKPGQAPV GKNNRPS GIPDRFSGSSSGNTASLTITG KSRDSSYNHVT FGGGTKLTVL LVIY AQAEDEADYYC WYQQLPGTAPK GNSNRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITG QSYDSSLSGSV FGGGTKLTVL LLIY LQAEDEADYYC 3.2 WYQQFPGTAPK GNSNRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITG QSYDSSLSGSV FGGGTKLTVL LLIQ LQAEDEADYYC 2.7 WYQQLPGTAPR GNNNRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITG QSYDSSLSGSV FGGGTKLTVL XiLIY LQAEDEADYYC EJEMPLO 11 DETERMINACIÓN DE CLASES CANÓNICAS DE ANTICUERPOS

[0236] Chot ia, y colaboradores, han descrito estructuras de anticuerpo en términos de "clases canónicas" para las regiones hipervariables de cada cadena inmunoglobulina (J Mol Biol . 1987 Aug 20; 196 (4) :901-17) . Las estructuras atómicas de los fragmentos Fab y VL de una variedad de inmunoglobulinas se analizaron para determinar la relación entre sus secuencias de amino ácidos y las estructuras tridimensionales de sus sitios de enlace de antigeno. Chothia, y colaboradores, se encontró que hubo relativamente pocos residuos que, a través de su empaque, ligan hidrógeno o la capacidad por adquirir usuales conformaciones fi, psi u omega, fueron primordialmente responsables por las conformaciones de cadena principal de las regiones hipervariables . Estos residuos se encontró que ocurren en sitios dentro de las regiones hipervariables y en el marco de hoja beta conservado. Al examinar secuencias de inmunoglobulinas que tienen estructura desconocida, Chothia, y colaboradores, muestran que muchas inmunoglobuinas tienen regiones hipervariables que son similares en tamaño a una de las estructuras conocidas y contienen adicionalmente residuos idénticos en los sitios responsables por la conformación observada .

[0237] Su descubrimiento implica que estas regiones hipervariables tienen conformaciones cercanas a aquellas en las estructuras conocidas . Para cinco de las regiones hipervariables, el repertorio de conformaciones parece estar limitado a un número relativamente pequeño de clases estructurales discretas. Estas conformaciones de cadena principal que ocurren comúnmente de las regiones hipervariables se denominaron "estructuras canónicas". Además, el trabajo por Chothia, y colaboradores, {Nature. 1989 Dec 21-28; 342 (6252) :877-83) y otros (Martin, y colaboradores, J. Mol. Biol . 1996 ??? 15; 263 (5) : 800-15) confirmó que hay un pequeño repertorio de conformaciones de cadena principal para al menos cinco de las seis regiones hipervariables de los anticuerpos .

[0238] Cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente se analizó para determinar la clase canónica para cada uno de las regiones de determinación de complementaridad de anticuerpo (CDRs = complementarity determining regions) . Como se conoce, las clases canónicas solo se han asignado para CD 1 y CDR2 de la cadena pesada de anticuerpo, junto con CDR1 , CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de anticuerpo. Las tablas siguientes (35 y 36) resumen los resultados de los análisis. Los datos de la Clase Canónica están en la forma de *HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, en donde "HCDR" se refiere a la cadena pesada CDR y "LCDR" se refiere a la cadena ligera CDR. De esta manera, por ejemplo, una clase canónica de 1-3-2-1-5 se refiere a un anticuerpo que tiene un HCDR1 que cae en la clase canónica 1, un HCDR2 que cae en la clase canónica 3 , un LCDR1 que cae en la clase canónica 2, un LCDR2 que cae en la clase canónica 1, y un LCDR3 que cae en la clase canónica 5.

[0239] Se hicieron asignaciones a una clase canónica particular en donde hubo 70% o mayor identidad de los amino ácidos en el anticuerpo con los amino ácidos definidos por cada clase canónica. Cuando hubo menos de 70% de identidad, la asignación de clase canónicaes marcada con un asterisco (»*«) para indicar que se hizo el mejor estimado de la clase canónica adecuada, con base en la longitud de cada CDR y la totalidad de los datos. Los amino ácidos definidos por cada anticuerpo pueden encontrarse, por ejemplo, en los artículos por Chothia, y colaboradores referidos anteriormente. Tabla 35 Anticuerpo Clase canónica 3.6 1_1*_2-1-1 2.19 l-l-2*-l-5 3.9 1-1-2-1-* 2.15 1-1-2-1-1 2.17 1-1-2-1-1 2.9 1-1-2-1-1 3.8 1-1-2-1-1 250 1-1-2-1-3 263 1-1-2-1-3 Anticuerpo Clase canónica 269 1-1-2-1-3 69 l-l*-4-l-l 3.4 l-3*-l*-l-5* 2.6 l-3*-2*-l-5* 4.22 l-3*-2-l-l 2.4 l-3*-6-l-5 3.2 l-3*-6-l-5 2.2 l-3-2*-l-5* 2.3 l-3-2*-l-5* 2.5 l-3-2*-l-5* 2.8 l-3-2*-l-5* 4.3 l-3-2*-l-5* 4.4 l-3-2*-l-5* 4.8 l-3-2*-l-5* 15 1-3-2-1-1 28 1-3-2-1-1 95 1-3-2-1-1 148 1-3-2-1-1 2.10 1-3-2-1-1 2.13 1-3-2-1-1 2.14 1-3-2-1-1 2.16 1-3-2-1-1 2.18 1-3-2-1-1 2.21 1-3-2-1-1 Anticuerpo Clase canónica 234 1-3-2-1-1 280 1-3-2-1-1 282 1-3-2-1-1 291 1-3-2-1-1 299vl 1-3-2-1-1 299v2 1-3-2-1-1 3.5 1-3-2-1-1 313 1-3-2-1-1 4.11 1-3-2-1-1 4.12 1-3-2-1-1 4.13 1-3-2-1-1 4.14 1-3-2-1-1 4.15 1-3-2-1-1 4.16 1-3-2-1-1 4.17 1-3-2-1-1 4.18 1-3-2-1-1 4.19 1-3-2-1-1 4.20 1-3-2-1-1 4.21 1-3-2-1-1 4.23 1-3-2-1-1 4.9 1-3-2-1-1 140 1-3-4-1-* 1.1 1-3-5-1-5 2.1 1-3-5-1-5 Anticuerpo Clase canónica 3.1 1-3-5-1-5 4.10 1-3-5-1-5 2.7 1-3-6-1-5 4.7 1-3-6-1-5 2 3-1-2-1-1 25 3-1-2-1-1 123 3-1-2-1-1 131 3-1-2-1-1 EJEMPLO 12 ANÁLISIS DE DOMINIO DE ANTICUERPOS ANTI-TNF-a A TRAVÉS DE ENSAYOS DE EXPRESIÓN Y ENLACE A EPITOPES TNF-a Resultados de Secuenciado/Combinación de Datos

[0240] Las regiones variables (V) de cadenas inmunoglobulinas se codifican por segmentos de ADN de linea germinal múltiples, que se unen en regiones variables funcionales (VHDJH o VKJK) durante la ontogenia de célula B. La diversidad molecular y genética de la respuesta de anticuerpo TNF- a se estudió en detalle. Estos ensayos revelan varios puntos específicos a anti TNF-a. El análisis de 65 anticuerpos individuales específicos a TNF-a produce 13 genes VH de línea germinal, 54 de ellos de la familia VH3 , con 34 de ellos que utilizan el segmento de gen VH3-33. El gen más frecuente, el gen de línea germinal VH3-33 se expresa en 34 de los 65 anticuerpos analizados, y se limita a 2 compartimientos diferentes con vínculo claro con el tipo de cadena ligera involucrada en la unión (Kappa A30 contra L2 o lambda) . La selección de anticuerpos funcionales y combinación mostró que los anticuerpos en la tolva o compartimiento específico expresaron los mismos rearreglos Ig VH y en algunos casos los mismos VHDJH. Además, también se descubrió que pares de cadena H y L se conservaron dentro del grupo. Estos hallazgos sugieren que, para cualquier epítope determinado, solo unos cuantos miembros del repertorio de linea germinal se utilizan para formar el parátope correspondiente, y por cada epítope antigénico un número limitado de genes de cadena-L y -H pueden formar pares para constituir un parátope específico.

[0241] La ubicación de epítopes biológicamente relevantes en TNF-a humano se evalúa por expresión y ensayo de enlace de mAbs específicos para TNF-a humano a un conjunto de moléculas TNF-a quiméricas humano/rató . Los anticuerpos descritos anteriormente caen en 4 grupos de compartimientos principales, todos enlazados a varios sitios cruciales para actividad biológica de hTNF-a. El dominio N-terminal de TNF-a se encuentra involucrado en el enlace de receptor .

[0242] En el primer grupo de anticuerpos, que neutralizan la actividad TNF-a a través de enlace directo a dominio de enlace de receptor TNF-a, todas las secuencias reconocidas en los primeros 36 residuos de la molécula TNF-a secretada. Los resultados mostraron que ambos receptores ligan a la misma región N-terminal. Van Ostade y colaboradores, ((1993) Nature, 361:266-269) reportó que el dominio de enlace receptor P75 se localizó en bucles en la base de la molécula, y que las substituciones amino sencillas en las posiciones 29 y 32 reducen las actividades de enlace con el receptor p75. Anticuerpos en el grupo I (VH3-33/JH6b acoplados con cadena kappa A30/JK4) todos tienen clases canónicas 1-3-2-1-1. Todos los anticuerpos probados exhiben enlace con los primeros 36 residuos, con L sll y Arg31 presentes. Anticuerpos que expresan VH3-33/Jh6b acoplados con lambda como cadena ligera mostraron diferente especificidad.

[0243] Van Ostade y colaboradores ((1991) EMBO 10:827-836) demostraron que mediante mutagenesis aleatoria y dirigida de sitio, la integridad de cuatro regiones de aminoácido 32-34,84-91, 117-119 y 143-148 es importante para mantener la actividad biológica. Anticuerpos que utilizan VH3-33/JH4b acoplado con la cadena kappa L2 se mostró que reconocen diferentes dominios discontinuos de la molécula TNF-a. Estos anticuerpos fueron altamente específicos para TNF-a humano, y su epítope es una constelación de residuos ubicados en diferentes posiciones no contiguas del polipéptido TNF.

[0244] El tercer grupo de anticuerpos incluye anticuerpos que utilizan VH3-33 acoplado a la cadena ligera lambda como mAb 3.2. El sitio de enlace de este grupo se encuentra entre los residuos 1-91. Aunque el reemplazo de Gln27 y arg31 no afecta el enlace a TNF-a humano, el extremo N parece importante por su actividad de enlace. Los resultados se proporcionan a continuación en la Tabla 36. Tabla 36 TNF mAb VH DH JH V J VL JL Clase Epítop Canónica e 3.1 VH1-2 D6-19 JHSb Vl-19 JL3 1-3-5-1-5 1-91 2.6 VH1-18 Dl-7 JH4b V2-13 JL2 l-3*-2*-l-5* 1-125 3.4 VH1-18 D6-19 JH4b V2-13 JL3 l-3*-l*-l-5* 1.1 VH3-11 D3-16 JH6b Vl-19 JL3 1-3-5-1-5 2.16 VH3-11 D3-16 JH6b 012 JK5 1-3-2-1-1 2.18 VH3-11 D3-16 JH6b 012 JK5 1-3-2-1-1 1-125 2.21 VH3-21 Dl-20 JH6b 012 JK5 1-3-2-1-1 4.23 VH3-23 D3-22 JH4b A20 JK3 1-3-2-1-1 TNF mAb VH DH V JK VL JL Clase Epítop Canónica e 4.13 VH3 -30 D4-17 JH6b A30 J 4 1-3-2-1-1 SC234 VH3-30 Dl-26 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 SC140 VH3-30 Dl-20 JH6b A19 JK1 1-3-4-1-* SC28 VH3-30 D3-3 0H6b A30 JK1 1-3-2-1-1 1-157 4.11 VH3-33 D6-19 JH4b 1.2 JK4 1-3-2-1-1 4.19 VH3-33 D3-9 JH6b L2 J 3 1-3-2-1-1 1-157 4.18 VH3-33 D3-9 JH6b L2 JK3 1-3-2-1-1 4.7 VH3-33 D6-19 JH4b VI-13 JL2 1-3-6-1-5 2.8 VH3-33 D3-9 JH6b V2-13 JL2 l-3-2*-l-5* 36-91 2.7 VH3-33 D3-9 JH6b VI-13 JL3 1-3-6-1-5 2.1 VH3-33 JH6 Vl-19 JL2 1-3-5-1-5 2.2 VH3-33 D4-23 JH4a V2-13 JL2 l-3-2*-l-5* 2.5 VH3-33 D3-10 JH6b V2-13 JL3 l-3-2*-l-5* 4.4 VH3-33 D4-23 JH4b V2-13 JL2 l-3-2*-l-5* 1-157 4.3 VH3-33 D4-23 0H4b V2-13 JL2 l-3-2*-l-5* 4.10 VH3-33 D4-17 JH5b Vl-16 JL3 1-3-5-1-5 2.3 VH3-33 D4-23 JH4b V2-13 JL2 l-3-2*-l-5* 4.8 VH3-33 D4-23 JH4b V2-13 JL2 l-3-2*-l-5* 2.13 VH3-33 D6-19 JH6b 018 JK5 1-3-2-1-1 4.20 VH3-33 D3-9 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 TNF VH DH JH V JK VL JL Clase Epítop Canónica e 4.21 VH3-33 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 2.14 "VH3-33 D6-19 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 ¦ 1-36 2.10 VH3-33 D6-19 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 3.5 VH3-33 D3-10 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 4.12 VH3-33 D4-17 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 4.9 VH3-33 D4-17 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 SC280 VH3-33 D4-17 JH6b A30 JK1 1-3-2-1-1 SC282 VH3-33 D4-17 JH6b A30 JK1 1-3-2-1-1 SC291 VH3-33 Dl-26 JH6b A30 J 4 1-3-2-1-1 4.16 VH3-33 D2-21 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 1-36 4.17 VH3-33 D2-21 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 4.14 VH3-33 D2-21 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 4.15 VH3 -33 D2-21 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 1-36 SC299 VH3-33 D5-5 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 SC313 VH3-33 D5-24 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 SC148 VH3-33 D5-5 JH6b A30 J 4 1-3-2-1-1 SC15 VH3-33 D6-6 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 SC95 VH3-33 D6-19 JH6b A30 JK4 1-3-2-1-1 4.22 VH3-48 Dl-14 JH4b A30 JK1 1-3*-2-1-? 3.7 VH3-53 D3-1 JH3 L2 JK4 2.17 VH3-53 D7-27 JH4b L2 JK4 1-1-2-1-1 1-157 2.9 VH3-53 D7-27 0H4b L5 JK1 1-1-2-1-1 TNP xnAb VH DH JH VK JK VL JL Clase Epítop Canónica e 1-125 2.19 VH3-53 Dl-1 JR6 012 JK5 l-l-2*-l-5 2.15 VH3-53 Dl-1 JH6 L2 JK3 V2-7 JL2 1-1-2-1-1 3.8 VH3-53 Dl-14 JH3b L2 JK5 1-1-2-1-1 1-157 3.9 VH3-53 Dl-14 JH3b A30 JK4 1-1-2-1-* SC250 VH3-53 D3-16 JH4b L2 JK1 1-1-2-1-3 1-157 SC263 VH3-53 D3-16 JH4b L2 JK1 1-1-2-1-3 SC269 VH3-53 D3-16 JH4b L2 J 1 1-1-2-1-3 SC69 VH4-4 D2-2 JH2 Al JK4 l-l*-4-l-l SC2 VH4-31 Dl-20 JH6b A30 JK4 3-1-2-1-1 SC25 VH4-31 DI-20 JH6b A30 J 4 3-1-2-1-1 SC131 VH4-31 Dl-20 JH6b A30 JK4 3-1-2-1-1 SC123 VH4-31 Dl-20 JH6b A30 JK4 3-1-2-1-1 1-157 3.6 VH4-59 DS-19 JH4b A30 JK4 l-l*-2-l-l 1-91 3.2 VH5-51 ?7-27 JH4b VI-13 JL3 l-3*-6-l-5 36-91 2.4 VH5-51 D3-3 JH6b Vl-13 JL2 l-3*-6-l-5 EJEMPLO 13 USOS DE ANTICUERPOS ANTI-TNFA Y CONJUGADOS DE ANTICUERPO PARA TRATAMIENTO DE ARTRITIS

[0245] Para determinar los efectos in vivo de tratamiento de anticuerpos anti-TNFa en pacientes humanos con artritis, estos pacientes humanos son inyectados durante una cierta cantidad de tiempo con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-TNFa. En tiempos periódicos durante el tratamiento, los pacientes humanos son supervisados para determinar si se está tratando su artritis .

[0246] Un paciente artrítico tratado con anticuerpos anti-TNFa tiene un menor nivel de síntomas de artritis, incluyendo inflamación, en comparación con pacientes artríticos tratados con anticuerpos de control . Anticuerpos de control que pueden emplearse, incluyen anticuerpos del mismo isotipo que los anticuerpos anti-TNFa probados y además, pueden no tener la capacidad por ligar con antígeno TNFa . EJEMPLO 14 USO DE ANTICUERPOS ANTI-TNFA COMO UN AGENTE DE DIAGNÓSTICO Detección de antígeno TNFa en una muestra

[0247] Puede desarrollarse un ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) para la detección de antígeno TNFa en una muestra. En el ensayo, pozos de una placa de microtitulación, tal como una placa de microtitulación de 96 pozos o una placa de microtitulación de 384 pozos, se adsorben por varias horas con un primer anticuerpo monoclonal totalmente humano dirigido contra el antígeno.

El anticuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de captura para cualquiera de los antxgenos que puedan estar presentes en una muestra de prueba. Los pozos se enjuagan y tratan con un agente de bloqueo tal como proteína de leche o albúmina para evitar adsorción no específica del analito .

[0248] Subsecuentemente, los pozos se tratan con una muestra de prueba que se sospecha contiene el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Dicha muestra puede ser, por ejemplo una muestra de suero de un sujeto que se sospecha tiene niveles de antígeno en circulación que se consideran diagnóstico de una patología.

[0249] Después de enjuagar la muestra de prueba o estándar, los pozos se tratan con un segundo anticuerpo anti-TNFa monoclonal totalmente humano que está etiquetado por conjugación con biotina. El anticuerpo anti-TNFa etiquetado sirve como un anticuerpo de detección. Después de lavar por arrastre el exceso del segundo anticuerpo, los pozos se tratan con él oxida hasta de rábano picante conjugada con avidina (HRP = horseradish peroxidase) y un sustrato cromogénico conveniente . La concentración del antígeno en las muestras de prueba, se determine por comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar .

[0250] Este ensayo de ELISA proporcionan un ensayo altamente especifico y muy sensible para la detección del antigeno TNFa en una muestra de prueba.

Determinación de concentración de antígeno TNFa en pacientes

[0251] Un ELISA emparedado se desarrolla para cuantificar los niveles de TNFa en suero humano. Los dos anticuerpos anti-TNFa monoclonales totalmente humanos del ELISA emparedado, reconocen diferentes epítopes en la molécula TNFa. El ELISA se realize como sigue: 50 µL de anticuerpo anti-TNFa de captura en amortiguador de revestimiento (NaHC03 0.1 M, pH 9.6) a una concentración de 2 µg/mL se reviste en placas ELISA (Fisher) . Después de incubación a 4 grados C durante la noche, las placas se tratan con 200 µL de amortiguador del bloqueo (BSA0.5%, Tween 20 0.1%, Thimerosal 0.01% en PBS) por 1 hora a 25 grados C. Las placas se lavan (3x) utilizando Tween 20 0.05% en PBS (amortiguador de lavado, WB) . Sueros normales o de paciente (clinomics, Bioreclaimation) se diluyen en amortiguador de bloqueo que contiene suero humano 50%. Las placas incuban con muestras de suero durante la noche a 4 grados C, lavan con WB, y luego incuban con 100 µL/pozo de anticuerpo anti-TNFa de detección biotinilado por 1 hora a 25 grados C. Después de lavar, las placas se incuban con HRP-estreptavidina por 15 min, lavan como con anterioridad, y luego tratan con 100 de o-fenilendiamina en H202 (solución de revelado Sigma) para generación de color. La reacción se detiene con 50 µL/pozo de ¾S04 (2M) ir analiza utilizando un lector de placas ELISA a 492 nm. La concentración del antígeno TNFa en placas de suero se calcula por comparación con diluciones de antigeno TNFa purificado utilizando un programa de ajuste de curva de cuatro parámetros . EQUIVALENTES

[0252] La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir a una persona con destreza en la técnica practicar la invención. La descripción y los ejemplos anteriores detallan ciertas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará, sin embargo que no importa que tan detallado puede aparecer lo anterior en texto, la invención puede practicarse en muchas formas y la invención deberá considerarse de acuerdo con las reivindicaciones anexas y cualesquiera de sus equivalentes .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de necrosis tumoral-alfa y comprende una región para determinación de complementaridad 1 (CDR1 = complementarity determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Ser Tyr Asp Met His". 2. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Val lie Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" . 3. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3 = complementar!ty determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val " . 4. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue comprende un aminoácido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70. 5. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un aminoácido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 74. 6. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CD 1 = complementarity determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg He Asp Leu Gly" . 7. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser" . 8. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3 = complementarity determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Leu Gln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr" . 9. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende un aminoácido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 72. 10. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de Necrosis Tumoral-alfa y comprende una región para determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CDR1 complementarity determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de " Arg Ala Ser Gln Gly lie Arg lie Asp Leu Gly" . 11. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser" . 12. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3 = complementar!ty determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Leu Gln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr" . 13. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaradad de cadena ligera 1 (CD 1 = complementar!ty determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Ser Tyr Asp Met His". 14. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Val lie Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" . 15. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende _ una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3 complementarity determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de " Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val " . 16. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de necrosis tumoral-alfa y comprende gen de cadena pesada VH3-33, o su variante conservadora . 17. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende un gen de cadena ligera A30VK1. 18. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de necrosis tumoral-alfa, en donde el anticuerpo comprenden una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 1 (CDR1 = complementarity determining región 1) correspondiente a la clase canónica 1. 19. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que corresponde a la clase canónica 3. 20. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CDR1 = complementarity determining región 1) que corresponde a la clase canónica 2. 21. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que corresponde a la clase canónica 1. 22. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3 = complementar!ty determining región 3) que corresponde a la clase canónica 1. 23. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de necrosis tumoral-añfa y comprende una región para determinación de complementaridad de cadena pesada 1 (CDR1 = complementaráty determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Arg Asn Tyr Met Ser" . 2 . El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2 complementarity determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" . 25. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3 complementarity determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Gly Glu Gly Gly P e Asp Tyr" . 26. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende un aminoácido de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO : 50. 27. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CD 1 complementarity determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala" . 28. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr" . 29. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3 = complementarity determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Gln Gln Tyr AsnTyr Tip Trp Thr" . 30. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende un aminoácido de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ IE NO: 52. 31. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de Necrosis Tumoral-alfa y comprende una región para determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CDR1 = complementarity determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala" . 32. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 2 (CDR2 = complementar!ty determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr" . 33. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3 complementar!ty determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Gln Gln Tyr Asn Tyr Tip Trp Thr" . 3 . El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 1 (CDR1 = complementarity determining región 1) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Arg Asn Tyr Met Ser" . 35. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2 complementarity determining región 2) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly" . 36. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 3 (CDR3 complementarity determining región 3) que tiene una secuencia de aminoácidos de "Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr" . 37. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de necrosis tumoral-alfa y comprende gen de cadena pesada VH3-53, o su variante conservadora . 38. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende un gen de cadena ligera L2V 3. 39. Un anticuerpo monoclonal humano que liga específicamente a factor de necrosis tumoral-alfa, en donde el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 1 (CDR1 complementar!ty determining región 1) correspondiente a la clase canónica 1. 40. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena pesada 2 (CDR2 = complementar!ty determining región 2) que corresponde a la clase canónica 1. 41. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 1 (CDR1 = complementarity determining región 1) que corresponde a la clase canónica 2. 42. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementar!dad de cadena ligera 2 (CDR2 = complementarity determining región 2) que corresponde a la clase canónica 1. 43. El anticuerpo monoclonal humano de conformidad con la reivindicación 42 , caracterizado porque el anticuerpo comprende una región de determinación de complementaridad de cadena ligera 3 (CDR3 = complementarity determining región 3) que corresponde a la clase canónica 3. 44. Un método para ensayar el nivel de factor de necrosis tumoral-alfa (TNFalfa) en una muestra de paciente, que comprende contactar un anticuerpo anti-TNFalfa de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 23 con una muestra biológica de un paciente, y detectar el nivel de enlace entre el anticuerpo y TNFalfa en la muestra. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la muestra biológica es sangre. 46. Una composición, que comprende anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 por la reivindicación 23, o su fragmento funcional, y un portador farmacéuticamente aceptable . 47. El uso de un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 23, en la preparación de medicamento para el tratamiento de enfermedad neoplásica en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal liga específicamente a factor de necrosis tumoral (TNFalfa) . 48. El uso de la reivindicación 47, caracterizado porque la enfermedad neoclásica se eligen del grupo que consiste de: cáncer de pecho, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer del riñon, cáncer de colon, cáncer pancreático, y cáncer de próstata. 49. El uso de un anticuerpo de la reivindicación 1 o la reivindicación 23, en la preparación de medicamento para el tratamiento efectivo de enfermedades inflamatorias e inmuno-mediadas, en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal liga específicamente a factor de necrosis tumoral (TNFalfa) . 50. El uso de la reivindicación 49, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria inmuno-mediada se elige el grupo que consiste de: arthritis reumatoide, glomerulonefritis , ateroesclerosis, psoriasis, restenosis, enfermedad auto inmune, enfermedad de Crohn, reacciones de injerto-huésped, choque séptico, caquexia, anorexia y esclerosis múltiple. 51. Uso de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 23, en la preparación de medicamento para el tratamiento efectivo de apoptosis inducida por factor de necrosis de tumor en un animal, en donde el anticuerpo monoclonal liga específicamente a factor de necrosis tumoral (TNFalfa) .